CZ20014387A3 - Modifikované chimerické polypeptidy se zlepąenými farmakokinetickými vlastnostmi - Google Patents

Description

Modifikované chimérické polýpeptidy se zlepšenými farmakokinetickými vlastnostmi . ’ '

Předkládaný vynález uplatňuje .prioritu z. TJS .prozatímní přihlášky č. 60/138133, podané 8.6.1999. V této přihlášce jsou uvedeny různé citace. Objevy těchto citaci jsou zde uvedeny jako odkazy ve své úplnosti.

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká modifikovaných polýpeptidů- se - ~ zlepšenou farmakokinetikou. Přesněji se předkládaný vynález týká Fltl receptorových polýpeptidů, které byly modifikovány tak, že mají lepší farmakokinetický profil. Předkládaný vynález se také týká způsobů přípravy a použití modifikovaných,polýpeptidů, včetně, například, použití modifikovaných polýpeptidů pro snížení nebo inhibici úniku plasmy a/nebo cévní permeability u savců.

Dosavadní stav techniky ' · , .

Schopnost peptidových ligandů vázat se na buňky a „ták* vyvolávat fenotypové reakce, jako je růst buněk, jejich přežívání-, sekrece produktů buňkami nebo diferenciace, je často zprostředkována transmembránovými receptory na těchto buňkách. Extracelulární doména takových receptorů (t.j. část receptoru vystavená na povrchu buňky) je obvykle nejvíce specifickou částí ..molekuly a dodává proteinu charakteristické vazebné charakteristiky.· Vazba ligandu na extracelulární doménu obvykle vede k přenosu'signálu, kterým se přenáší biologické signály k intracelulárním cílům.

Často je přenos signálu veden přes katalytickou intracelulární doménu. Uspořádání motivů v této katalytické doméně určuje, jej i účinky na potenciální kinasové substráty (Mohammadi et al., 1990, Mol. Cell Biol. 11; 5068-5078; Fantl et al., 1992, Cell, 69: ·

413-413) . Příklady receptorů, které přenášejí signály cestou katalytických intracelulárních domén, zahrnují receptorové tyrosin kinasy,...(.RTK)„,^jako. je Trk rodinajreceptorů, které jsou obvykle omezeny, na buňky nervového systému,,cytokinová rodina receptorů, včetně trojdílného CNTF receptorového komplexu (Stálil and ‘ * Yancopoulos, 1994, J. Neurobio. 25: 1454-1466),, která je také obvykle omezena na buňky nervového systému, receptory spřažené s G-proteinem, jako jsou například ^-adrenergní receptory, které se vyskytují, například, v buňkách srdečního svalu, a multimerní IgE vysoce-afinitní receptor FcepsilonRI, který je lokalizován, například, na.žírných buňkách a na bazofilech (Sutton and Gould, 1993, Nátuře 366: 421-428).

Zdá se, že všechny doposud identifikované receptory podléhají po vazbě ligandu dimerizaci, multimerizaci, nebo některým konformačnim změnám (Schlessinger, J., 1988*, Trend Biochem. Sci., 13: 443-447; Ullrich and Schlessinger,,, 19 9Φ*, Gell 61: .203-212 Schlessinger and Ulrich, 1992, Neuron 9: 383-391) a molekulová interakce mezi dimerizujícími intraóelulárními doménami vede k . aktivaci katalytické funkce. V některých případech, jako například u destičkového růstového faktoru (PDGF), je ligandem dimer, který se váže na dvě receptorové molekuly (Hart et al., 1988, Science, 240: 1529-1531; Heldin, 1989, J. Biol. Chem. 264: 8905-8912), zatímco například u epidermálního růstového faktoru (EGF) je ligandem monomer (Weber et al., 1984, J. Biol. Chem. 259: 14631-14636). V případě Fc RI receptorů existuje ligand, IgE, navázaný na Fc RI ve formě monomeru a je aktivován pouze tehdy, když se na komplex IgE/Fc RI naváže antigen a dojde k zesítění sousedních molekul IgE (Sutton and Gould, 1993, Nátuře 366: 421-428) .

Často ukazuje tkáňová distribuce určitého receptorů ve vyšších organismech na biologickou funkci receptorů. RTK pro některé

růstové a'diferenciační faktory, jako je fibroblastový růstový · faktor (FGF), jsou exprimovány v mnoha tkáních a proto se zdá, že mají néjakouúlohů při růstutk-ání· a-jej ich, udrŽQyání. Členové Trk RTK rodiny (Glass and Yancopoulos, 1993, Trends.in Cell Biol. 3: 262-268) jsou obvykle omezeny na buňky nervového systému a rodina nervového růstového faktoru skládající se z nervového růstového faktoru (NGF), mozkového neurotrofního faktoru (BDNF), neurotrofinu 3 (NT-3) a neurotrofinu-4/5 (NT-4/5), které se váží na Trk rodinu RTK, podporuje diferenciaci růszných skupin neuronů v mozku a na periferii (Lindsay, R.M., 1993, v Neurotrofic Factors, S,E. Loughliii and J;H.Fallon, ed., str. 257-284, Šan Diego, CA, Academie Press) . Fc RI se vyskytuje na velmi omezeném počtu typů buněk, jako jsou žírné buňky a bazofily. Žírné buňky vznikají z pluripotentních hematopoetických kmenových buněk kostní dřeně, ale dozrávají ve tkáních po migraci z krevního řečiště (viz Janeway and Travers, 1996, v Tmmunology, 2. vydání,'M. Robertson and E. Lawrence, ed., str. 1:3-1:4, Current Biology Ltd., London, UK, Publisher), a podílejí se na alergické reakci.

Mnoho studií prokázalo, že extracelulámí· doména receptoru dodává specifické charakteristiky vazby ligandu. Dále, buněčné prostředí, ve kterém je receptor exprimován, může ovlivňovat biologickou reakci vznikající po vazbě ligandu na receptor. Například, když je neuronální buňka exprimující Trk receptor vystavena působení neurotrofinu, který se váže na tento receptor, tak dojde k přežívání buňky a diferenciaci. Když je stejný receptor exprimován fibroblasty, tak vede vystavení působení neurotrofinu k proliferaci fibroblastů (Glass et al., 1991, Cell. 66: 405-413).

Byla identifikována třída buněčných dimerních mitogenů se selektivitou pro cévní endotelové buňky a tato třída byla označena jako cévní endotelovy růstový,faktor (VEGF). VEGF byl přečištěn z

kondicionovaného růstového media krysích gl iontových buněk (Conn et al., (1990) Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 87, str./2628-2632); a z kondicionovaného růstového media folikulárních.,hvězdicpvitých buněk,hovězí hypfýzi (Ferrara and Henzel, 1989, Biochem. Biophys. Res. Comm. 161, str. 851-858 Gozpadorowicz et al.., 1989, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 86, 7311-7315); a z kondicionovaného media z lidských U937 buněk (Connolly, D.T. et al ., 1989, Science, 246: 1309-1312) . VEGF je dimer se zřetelnou molekulovou hmotností přibližně 46 kDa, kde každá podjednotka má zřetelnou molekulovou hmotnost přibližně 23 kDa. VEGF má určitou strukturální podobost s destičkovým růstovým faktorem ( PDG F ) ,- který je mitogenem pro buňky pojivové tkáně, ale který není,mitogenní pro cévní endotelové buňky z velkých cév.

Bylo zjištěno, že membránový tyrosin-kinasový receptor, známý jako Fit, je VEGF receptorem (DeVries, Č.· et al., 1992, ^r Science 255, str. 989-991). Fit receptor specificky váže VEGF, který ... indukuje mitogenesi. O jiné formě VEGF receptoru, označené KDR; je také známo, že váže VEGF a indukuje mitogenesi. Také je známá částečná cDNA sekvence a téměř kompletní proteinová sekvence KDR (Terman, B.I. et al., 1991, Oncogene 6, str. 1677-1683; Terman, B.I. et al., 1992, Biochem Biophys. Res. Comm. 187, str.

1579-1586) .

Persistující angiogenese může způsobovat nebo exacerbovat některá onemocnění, jako je psoriasa, revmatoidní artritida, hemangiomy, angiofibromy, diabetická retinopatie a neovaskulární glaukom. Inhibitor aktivity VEGF by byl účinný v léčbě takových onemocnění a také jiné patologické angiogenese cévní permeability indukované VEGF, jako je vaskularizace nádorů. Předkládaný vynález se týká VEGF inhibitoru, který je založen na VEGF receptoru Fltl.

Únik plasmy, klíčová složka zánětu, se vyskytuje v různých • ··?· · · : .· .3 :

, podskupinách mikrocév. Konkrétně, ve většině orgánů dochází k úniku plasmy specificky ve venulách. Na rozdíl od arteriol

- -á-i kapilár se. venuly.. stávají propustnými^ v reakci na různé zánětlivé mediátóry, jako je histamin/.bradykinin a serotonin. Jednou charakteristikou zánětu je únik plasmy, ke kterému dochází v důsledku mezibuněčných mezer v endotelu venul. Většina experimentálních modelů zánětu naznačuje, že tyto mezibuněčné mezery se vyskytují mezi endotelovými buňkami postkapilárně ve sběrných venulách (Baluk, P. et al., Am. J. Pathol. 1998, 152: 1463-76) . Bylo prokázáno, že některé lektiny mohou být použity pro odhalení lokálních míst .úniku plasmy, mezer v endotelu a finger-like procesů na hranicích endotelových buněk ve venulách v zánětlivéra ložisku {Thurston, G. et al., Am. J. Physiol, 1996,

271: H2547-62). Konkrétně, rostlinné lektiny bylý použity pro vizualizaci morfologických změn v endotelových buňkách v _w zánětlivých venulách krysí průdušnice. Lektiny, jako je konkavalin A a ricin, které se váží lokálně na zánětlivé venuly, ukázaly regiony stěny cévy pod mezerami v endotelu,· které odpovídají regionům uniku plasmy (Thurston G. et al. , Am. J. Physiol, *“1996, 271: H2547-62) .

• Vlastnosti mikrocév jsou dynamické. Chronická zánštlivá onemocnění jsou asociovaná s přestavbou mikrovaskulatury, včetně angiogenese a zvětšování mikrocév. Mikrocévy mohou být také přestaveny tak, že mají abnormální vlastnosti. V myším modelu chronického zánětu dýchacích cest získávají kapiláry dýchacích cest vlastnosti venul, včetně zvětšení průměr cév, zvýšení reaktivity pro von Wilebrandův faktor a zvýšení reaktivity pro P-selektin. Dále, tyto remodelované cévy se stávají propustnými v reakci na zánětlivé mediátóry, zatímco cévy ve stejném lokalizaci v dýchacích cestách normálních myší nikoliv.

Bylo prokázáno, že některé substance snižují nebo inhibují

II# ·· ·· • · 4 ' ♦ ··· · • «Η «i .

cévní' permeabilitu a/nebo unikání plasmy/• Například mystixiny. jsou syntetické polypeptidy, které· ihhibují*unikání 'plasmy bez blokování tyorby endotelových_mezer (Baluk, P. et al ., J. Pharmacol.Exp. Ther. 1998, 284; 693-9). Také agonista beta-2-aďrenergních receptorů formoterol redukuje propustnost mikrocévtím, že inhibuje tvorbu endotelových mezer (Baluk, P. and McDonald, D.M., Am. J. Physiol., 1994, 266:L461-8).

•Angiopoetiny a členy rodiny cévního endotelového růstového faktoru (VEGF) jsou jedinými růstovými faktory, o kterých se soudí,, zej sou specifické pro cévní endotelové buňky. Pokusy s cílenou inaktivací genů u myší ukázaly, že VEGF je nutný pro časná stadia vývoje cév a že pro pozdější stadia remodelování cév je nutný Ang-1.

US patent č. 6011003 , udělený’ 4.1‘. 20'0Ó_te..(Metr'is Therapeutics Limited), popisuje alterovanou,.solubilní'formu .FLT polypeptidu, který-je schopen vazby na VEGÍAaproto máinhibiční efekt na VEGF, kde uvedený polypeptid se skládá’ z pěti nebo méně kompletních imunoglobulinových domén.

US patent č. 5712380, udělený 27.1.1998 (Merck and Co.) popisuje inhibitory cévního endotelového růstového faktoru (VEGF), které jsou buď přirozené, nebo rekombinantně upravené solubilní formy s nebo bez C-koncového transmembránového regionu receptorů pro VEGF.

PCT přihláška č. WO 98/13071, publikovaná 2.4.1998 (Merck and Co.) popisuje techniku genové terapie pro inhibici růstu primárního nádoru a metastas pomocí genového přenosu nukleotidové sekvence kódující solubilní receptorový protein, který se váže na

VEGF.

·'

PCT přihláška č. WO 97/44453, publikovaná 27.11.1997 (Genetech, lne.) popisuje nové chimérické VEGF réceptorové proteiny obsahuj ící., aminokyselinové_sekvence odvozené od receptorů pro cévní endotelový růstový faktor (VEGF) Fltl a KDR, včetně myšího homologu pro lidský KDR receptor FLK1, kde uvedené chimérické VEGF receptorové proteiny se váží na VEGF a antagonizují proliferační a angiogenní aktivity endotelových buněk.

PCT přihláška č. WO 97/13787, publikovaná 17.4.1997 (Toa Gosei Co., Ltd.), popisuje inhibitor VEGF s nízkou molekulovou hmotností použitelný v léčbě onemocnění spojených s neovaskularizací, jako jsou solidní nádory. Polypeptid obsahující první imunoglobulinu podobnou doménu a druhou imunoglobulinu podobnou doménu v extracelulárním regionu VEGF receptorů Fit, ale neobsahující šestou imunoglobulinu podobnou doménu a sedmou imunoglobulinu podobnou doménu vykazuje inhibiění aktivitu, vzhledem k VEGF.

Sharifi, J. et al., 1998, The Quarterly Jour. of Nuel. Med, ’ 42: 242-249, popisují, že v důsledku toho, že monoklonálni protilátky (MAb) jsou bazické proteiny s pozitivním nábojem a savčí buňky mají negativní náboj, mohou elektrostatické interakce mezi nimy vysoké základní interakce vedoucí k nízkému poměru nádor vs. normální orgány. Pro vyřešení tohoto důsledku se výzkumníci pokusili zlepšit klírens mAb pomocí různých metod, jako jsou sekundární činidla, nbeo chemické nebo elektrické modifikace mAb samotných.

Jensen-Pippo et al., 1996, Pharmaceutical Research 13: 102-107, popisují, že pegylace terapeutického proteinu, rekombinantního lidského faktoru stimulujícího kolonie granulocytů (PEG-G-CSF), vede k zvýšení jeho stability a k retenci biologické aktivity in vivo, když je tento protein podán intraduodenálně.

Tsutsumi et al., 1997, Thromb. Haemost. 77: 168-73, popisují pokusy, při kterých byla in vivo trómbopoetická aktivita interleukinu 6 modifikovaného polyethylenglykolem (MPEG-IL-6), ve kterém bylo 54% ze 14 lysinových amino skupin IL-6 vázáno na /EG, srovnávána s aktivitou přirozeného IL-6. ‘

Yang.et al., 1995, Cancer 76: 687-94, popisují, že konjugace polyethylenglykolu na lidský interleukin-2 (IL-2) vede k zisku sloučeniny (polyethylen-glykolem modifikovaného IL-2 (PEG-IL-2)), která si zachovává in vitro a in vivo aktivitu IL-2, ale která má významně prodloužený cirkulační poločas.

R. Duncan and F. Spreafico, Clin. Pharmacokinet. 27: 290-306, 296 (1994) uvádějí přehled snah o zlepšení plasmatického poločasu asparaginasy pomocí konjugace s polyethylenglykolem.

PCT mezinárodní přihláška č. WC 99/03996, publikovaná 28.1.1999 (Regeneron Pharmaceuticals, lne. a The Reagents of The University of California) popisuje modifikované lidské-podpůrné polypeptidy obsahující delece regionů s bazickými aminokyselinami. Je popsáno, že modifikované lidské podpůrné polypeptidy si zachovávají biologickou aktivitu a zároveň mají redukovanou afinitu pro heparin a lepší farmakokinetiku ve zvířecím séru ve srovnání s nemodifikovaným lidským podpůrným polypeptidem.

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález je zaměřen na antagonisty VEGF se zlepšenými farmakokinetickými vlastnostmi. Výhodným provedením je izolovaná molekula nukleové kyseliny kódující fúzní polypeptid schopný vazby na VEGF polypeptid obsahující: (a) nukleotidovou sekvenci kóduj ící složku VEGF receptoru operativně navázanou na (b) nukleotidovou sekvenci kódující multimerizační složku, kde

VEGF receptorová složka je jediná VEGF receptorová složka fúzního polypeptidu a kde se nukleotidová sekvence (a) skládá v podstatě z . ^;ř , nukl oet idové ^sekvence. kódují c í - aminoky sel inovou - -sekvenc i \ I g -domény2 extracelulární domény, první ho VEGF receptoru a..nukloetidově sekvence kódující aminokyselinovou sekvenci Ig domény 3 extracelulární domény druhého VEGF receptoru.

V prvním' provedení je izolovanou nukleotidovou kyselinou prvního VEGF receptoru Fltlí ‘

V dalším provedení je izolovanou nukleotidovou kyselinou druhého VEGF receptoru Fikl.

V ještě dalším provedení je izolovanou nukleotidovou kyselinou druhého VEGF receptoru Flt4 .

V dalším výhodném provedení je nukleotidová sekvence kódující Ig doménu 2 extracelulární domény prvního VEGF receptoru přeď nukleotidovou sekvencí kódující Ig doménu 3 extracelulární domény druhého VEGF receptoru.

V dalším výhodném provedení je nukleotidová sekvence kódující Ig doménu 2 extracelulární domény prvního VEGF receptoru za nukleotidovou sekvencí kódující Ig doménu 3 extracelulární domény druhého VEGF receptoru

Ve výhodném provedení vynálezu obsahuje multimerizační složka imunoglobulinovou doménu.

V jiném provedení je imunoglobulinová doména vybraná ze skupiny zahrnující Fc doménu IgG, těžký řetězec IgG a lehký řetězec IgG.

Mezi výhodná provedení patří izolovaná molekula nukleové «i kyseliny obsahující nukleotidovou' sekvenci kódující modifikovaný Fltl. receptorový fúzní polypeptid, kde'kódující region molekuly -núkleové-kyseliny se..skládá z nukleotidové sekvence vybrané ze skupiny zahrnující:

(a)	nukleotidové sekvence uvedené na obr.	13A-13D;
(b)	nukleotidové sekvence uvedené na obr.	14A-14C;
(c)	nukleotidové sekvence uvedené na obr.	15A-15C;
(d)	nukleotidové sekvence uvedené na obr.	16A-16D;
(e)	nukleotidové sekvence uvedené na obr.	21A-21C;
(f)	nukleotidové sekvence uvedené na obr.	22A-22C;
(g)	nukleotidové sekvence uvedené na obr.	24A-24C; a
(h)	nukleotidové sekvence, které se - v důsledku degenerace

genetického kódu - liší od nukleotidové sekvence (a) , (b) , (c) , (d) , (e), (f) nebo (g) a které kódují molekulu fúzního polypeptidu majícího biologické aktivity Fltl receptorového fúzního polypeptidu. ---../V dalším provedení vynálezu je fúzní polypeptid kódovaný izolovanou molekulou nukleové kyseliny popsanou výše.

Výhodným provedením je přípravek schopný vazby VEGF molekuly za vzniku nefunkčního komplexu obsahujícího multimer fúzního polypeptidu.

Výhodný je také přípravek, ve kterém je multimerem dimer.

V ještě jiném provedení obsahuje přípravek nosič.

Jiným provedením je vektor, který obsahuje molekulu nukleové kyseliny popsanou výše, včetně expresního vektoru obsahujícího popsané molekuly nukleové kyseliny, ve kterých je molekula nukleové kyseliny operativně navázaná na sekvenci řídící expresi.

• · 9 vektor-hostitel pro produkci expresní vektor, ve vhodné

Dalšími provedeními jsou systémy fúzního polypeptidu, které obsahují hostitelské buňce; systémy hostitel-vektor, ve kterých je vhodnou hostitelskou buňkou bakteriální buňka/ kvasinka, hmyzí buňka nebo savčí buňka; systémy hostitel-vektor, ve kterých je vhodnou hostitelskou buňkou E.coli; systémy hostitel-vektor, ve kterých je vhodnou hostitelskou buňkou COS buňka; systémy hostitel-vektor, ve kterých je vhodnou hostitelskou buňkou CHO buňka.

Jiným provedením vynálezu je způsob přípravy fúzního polypeptidu, který zahrnuje kultivaci buněk systému vektor-hostitel za podmínek umožňujících produkci fúzního polypeptidu a odběr takto produkovaného fúzního polypeptidu.

Další provedení zahrnují fúzní polypeptid kódovaný sekvencí nukleové kyseliny uvedené na obr. 10A-10D nebo na obr. 24A-24C, který byl modifikován acetylací nebo pegylací, kde acetylace je provedena s alespoň 100-násobným molárním nadbytkem acetylačního činidla nebo kde je. acetylace provedena š molárním nadbytkem acetylačního činidla v rozmezí od alespoň přibližně 10-násobku do přibližně 100-násobku, nebo kde pegylace je 10K nebo 20 PEG.

Výhodným provedením je způsob pro snížení nebo inhibici úniku plasmy u savců, který zahrnuje podání fúzního polypeptidu posaného výše savci, včetně provedení, ve kterých je savcem člověk a fúzní polypeptidacetylovaný nebo pegylováný.

Dalším provedením je fúzní polypeptid, který se specificky váže na ligand VEGF receptoru, kterým je VEGF.

Výhodným provedením vynálezu je způsob pro blokování růstu krevních cév u člověka, který zahrnuje podání účinného množství fúzního polypeptidu popsaného výše.

Ý 12 · ·

9·9»

Výhodným provedením vynálezu je'také způsob pro inhibici aktivity ligandu VEGF receptoru u člověka, který zahrnuje podání účinného množství fúzního polypeptidu popsaného výše.

Výhodnými provedeními těchto metod jsouta provedení, ve kterých je savcem člověk.

Další provedení způsobů podle předkládaného vynálezu zahrnují způsob pro zmírnění nebo prevenci růstu nádorů u člověka; zmírnění nebo prevenci vzniku otoků u člověka, zejména edernu mozku; zmírnění nebo prevenci vzniku ascitu u člověka, zejména tehdy, když se jedná o ascites spojený s karcinomem ovaria.

Výhodnými provedeními vynálezu jsou fúzní polypeptidy schopné vazby na VEGF polypeptid obsahující (a) složku VEGF receptoru operativně navázanou na (b) multimerizační složku, kde VEGF receptorová složka je jediná VEGF receptorová* složka fúzního polypeptidu a skládá se v podstatě z aminokyselinové sekvence Ig domény 2 extracelulární domény prvního VEGF receptoru a aminokyselinové sekvence Ig domény 3 extracélulární domény druhého VEGF receptoru.

V dalším provedení fúzního polypeptidu je prvním VEGF receptorem Fltl.

V ještě dalším provedení fúzního polypeptidu je druhým VEGF receptorem Fikl.

V ještě dalším provedení fúzního polypeptidu je druhýmm VEGF receptorem Flt4.

Výhodnými provedeními jsou fúzní polypeptidy, ve kterých je aminokyselinová sekvence Ig domény 2 extracelulární domény ··> ·· ► 1 • ···· · · , * · · «

»... ., «, prvního VEGF receptoru před aminokyselinovou sekvencí Ig domény 2 extracelulární domény druhého VEGF receptoru a fúzní polypeptidy, ve kterých je aminokyselinová sekvence Ig domény

..extracelulární domény prvního^; VEGF?'receptoru*'zaT .....

aminokyselinovou sekvencí Ig domény 2 extracelulární domény druhého VEGF receptoru.

V ještě jiném provedení obsahuje multimerizační složka fuzního polypeptidu imunoglobulinovou doménu a sem patří také provedení, ve kterém je imunoglobulinová doména vybrána ze skupiny zahrnující Fc doménu IgG, těžký řetězec IgG a lehký řetězec IgG.

Mezi výhodná provedení patří fúzní.polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci modifikovaného Fltl receptoru, kde aminokyselinová sekvence je vybrána ze skupiny zahrnující:

(a) aminokyselinovou sekvenci uvedenou na obr. 13A-13D; (b)

ami noky s e 1 ino vou	sekvenci	uvedenou	na	obr.	14A-14C;	(C) '
aminokyselinovou	sekvenci	uvedenou	na	obr.	15A-15C;	(d). -
aminokyselinovou	sekvenci	uvedenou	na	obr.	16A-16D;	(e)
aminokyselinovou	sekvenci	uvedenou	na	obr.	21A-21C;	(f)
aminokyselinovou	sekvenci	uvedenou	na	obr.	22A-22C;	a (g)
aminokyselinovou	sekvenci	uvedenou	na	obr.	24A-24C.

Jiným výhodným provedením je způsob pro snížení nebo inhibici úniku plasmy u savce, který zahrnuje podání polypeptidu popsaného výše uvedenému savci.

Jiným výhodným provedením je způsob pro inhibici aktivity ligandu VEGF receptoru u savce, který zahrnuje podání polypeptidu popsaného výše uvedenému savci.

« 4 ·, · • '· 4 > · 4 4 « »· ··

4 4 • f

Popis obrázků na připojených výkresech

Obr. 1. IEF gelová analýza nemodifikovaných a acetylovaných Fltl (1-3 j-~FČ proteinů. Nemodifikovaný Fltl(1-3)-Fč protein není'schopen pronikat gelem v důsledku svého pH >9,3, zatímco acetylováný Fltl(1-3)-Fc protein je schopen prostupovat gelem a dosahuje rovnováhy při pí 5,2.

Obr. 2. Vazba nemodifikovaného Fltl(1-3)-Fc a acetylovaného Fltl(1-3)-Fc proteinu na plotny potažené Matrigelem^R. Nemodifikované Fltl(1-3)-Fc proteiny se výrazně váží na složky extracelulární matrice v Matrigelu^R, zatímco acetylované Fltl(1-3)-Fc proteiny se neváží.

Obr. 3. Vazba nemodifikovaných Fltl(1-3)-Fc proteinů, acetylovaných Fltl(1-3)-Fc proteinů a pegylovaných Fltl(1-3)-Fc proteinů v testu na bázi Biacore. Acetylované (sloupce 13-16), pegylované (sloupce 17-20) a heparinem zpracované Fltl(1-3)-Fc (sloupce 21-24) byly každý schopen úplně kompetovat s Fltl(1-3)-Fc navázaným na Biacore čip o vazbu na VEGF ve srovnání s kontrolními (sloupce 1-4) a irelevantními proteiny (sloupce 5-8). Nemodifikovaný Fltl(1-3)-Fc (sloupce 5-6) jako jediný částečně kompetuje s Fltl(1-3)-Fc navázaným na Biacore čip o vazbu VEGF. Nicméně, promytí navázaných vzorků 0,5 M NaCl (sloupce 7-8) vedlo k zisku vazebného profilu podobného vazebnému profilu modifikovaných forem Fltl(1-3)-Fc, což naznačuje, že nemodifikovaný protein vykazuje nespecifickou vazbu na čip, která může být eliminována promytím roztokem soli.

Obr. 4. Vazba nemodifikovaného Fltl(1-3)-Fc, acetylovaného Fltl(l-3)-Fc a pegylovaného Fltl(l-3)-Fc na VEGF v testu na bázi ELISA. Jak pegylovaný, tak acetylovaný Fltl(1-3)-Fc se

-t >··· · · , • · 1 «· váží na VEGF s afinitami blížícími se nemodifikovanému Fltl(l₇3)-Fc. /

Obr . 5. ' Farmakokinetické prof ily riemódif ikáváněho ” '*^T'

Fltl (1-3)-Fc, 'acetylovaného Fltl(1-3)-Fc a pegylovaného ' Fit i (1-,3)-Fc. Balb/c myším (23-28 g) se podkožní injekcí podaly 4 mg/kg nemodifikovaného, acetylovaného a pegylovaného Fltl(1-3)-Fc. Myším se odebírala krev z ocasu za 1, 2, 4, 6, 24 hodin, 2 dny a 3 dny po injekci proteinu a sérum se testovalo ve standardním ELISA testu určeném pro detekci Fltl (1-3) -Fc proteinu . pro všechny Fltl (1-3)-Fc proteiny bylo mezi 6 hodinami a 24 hodinami. pro různé proteiny byla následující: nemodifikovaný - 0,06 ug/ml - 0,15 ug/ml; acetylovaný - 1,5 ug/ml - 4,0 ug/ml; a pegylováný - přibližně 5 ug/ml.

Obr. 6A-6B. IEF gelová analýza .nemodifikovaných a postupně acetylováných Fltl(1-3)-Fc proteinů) Nemodifikovaný Fltl(1-3)-Fc protein není schopen prostupovat gelem v důsledku svého pH >9,3, zatímco většina postupně acetylovaných Fltl(1-3)-Fc (30-100 násobný nadbytek vzorků) byly schopné migrovat gelem a dosahovaly rovnováhy při pí v rozmezí,od 4,55-8,43, podle stupně acetylace.

Obr. 7. Vazba nemodifikovaného Fltl(1-3)-Fc a postupně acetylovaných Fltl(1-3)-Fc proteinů na plotny potažené Matrigelem^R. Stejně jako irelevantní kontrolní protein nevykazují postupně acetylované Fltl(1-3)-Fc (20 a 30-násobné vzorky) jakoukoliv vazbu na plotnu potaženou Matrigelem⁵*, zatímco neacetylovaný Fltl(1-3)-Fc protein vykazuje významnou vazbu. 10-násobné vzorky vykazují redukovanou vazbu, ale stupeň acetylace není. dostatečný pro úplné blokování vazby na složky extracelulární matrice.

··»· *·

Obr. 8. Vazba nemodifikovaného Fltl(1-3)-Fc a postupně acetylovaného Fltl(1-3)-Fc v testu na bázi Biacore. V sub-stochiometrickém poměru (0,5 ug/ml buď nemodifikovaného Fltl(1-3) nebo“ postupně acetylovaného Fltl(1-3)-Fc vs. 0,2 ug/ml VEGF) není v roztoku dostatek Fltl(1-3)-Fc (nemodifikovaného nebo acetylovaného) pro úplnou vazbu VEGF. Při 1,0 ug/ml, což je přibližně 1:1 stochiometrický poměr, jsou jak nemodifikovaný, tak postupně acetylovaný Fltl(l-3)-Fc lépe schopny kompetovat o vazbu VEGF, ale stále ještě není dostatek Fltl(1-3)-Fc proteinu (nemodifikovaného nebo postupně acetylovaného) pro kompletní saturaci dostupného VEGF. Nicméně, při 5,0 ug/ml, což je několikrát více, než je stochiometrický poměr 1:1, jsou jak Fltl(1-3)-Fc, tak postupně acetylovaný.Fltl(1-3) -Fc proteiny schopny saturovat VEGF, bez ohledu na stupeň acetylace.

Obr. 9. Farmakokinetické profily nemodifikovaného '

Fltl(1-3)-Fc a postupně acetylovaného Fltl(1-3)-Fc. Balb/c myším (23-28 g) se podkožní injekcí podaly 4 mg/kg nemodifikovaného nebo 10, 20, 40, 60 a 100-násobné vzorky postupně acetylovaného Fltl(1-3)-Fc (3 myši pro nemodifikovaný, 10, 20 a 40-násobné vzorky a 2 myši pro 60 a 100-násobné vzorky). Myším se odebírala krev z ocasu za 1, 2, 4, 6, 24 hodin, 2 dny a 3 dny po injekci proteinu a sérum se testovalo v ELISA testu určeném pro detekci Fltl(1-3)-Fc proteinu. pro všechny testované Fltl (1-3)-Fc proteiny bylo 6 hodin, ale C_ma5c byla následující: nemodifikovaný Fltl(1-3)-Fc - 0,06 ug/ml; 10-násobný nadbytek - 0,7 ug/ml; 20-násobný nadbytek - 2,0 ug/ml; 40-násobný nadbytek - 4,0 ug/ml; 60-násobný nadbytek - 2,0 ug/ml; 100-násobný nadbytek - 1,0 ug/ml.

• · · ► ···· ·· ·· • · · · • s · 9

Obr. 10A-10D. Sekvence nukleových kyselin a odvozené aminokyselinové sekvence Fltl(1-3)-Fc.

Obr. 11. Schématický diagram struktury Fltl.

Obr. 12A a 12B. Analýza hydrofilnosti aminokyselinových sekvencí Ig domény 2 a Ig domény 3 Fltl.

Obr. 13A-13D. Sekvence nukleových kyselin a odvozené aminokyselinové sekvence Mutl: Fltl(l-3 )-Fc.

Obr. 14A-14C. Sekvence nukleových kyselin a odvozené aminokyselinové sekvence Mut2: Fltl(2-3 )-Fc.

Obr. 15A-15C. Sekvence nukleových kyselin a odvozené aminokyselinové sekvence Mut3: Fltl(2-3)-Fc.

Obr. 16A-16D. Sekvence nukleových kyselin a odvozené aminokyselinové sekvence Mut4: Fltl(1-3_r ^)-Fc.

Obr. 17. Vazba nemodifikovaného Fltl(1-35-Fc, mutantního Fltl(1-3)-Fc s delecí bazického regionu a mutantního proteinu Fltl(1-3) v testu na bázi Biacore. Při

R — substochiometrickém poměru (0,25 ug/ml Fltl(1-3)-Fc nemodifikovaných, acetylovaných nebo geneticky modifikovaných vzorků vs. 0,1 ug/ml VEGF) je nedostatek Fltl(1-3)-Fc proteinu pro blokování vazby VEGF na Fltl(1-3)-Fc imobilizovaný na Biacore čipu. Při 0,5 ug/ml nemodifikovaných, acetylovaných nebo geneticky modifikovaných Fltl(1-3)-Fc proteinů je stochiometrický poměr přibližně 1:1 a je patrná zvýšená schopnost blokování vazby VEGF na Biacore čip.Při 1,0 ug/ml nemodifikovaných, acetylovaných nebo geneticky modifikovaných Fltl(1-3)-Fc proteinů je

99··

• .» · • '· ·,:*··' ·· ·· • Λ* ♦ · ’· ;· · •· . ί* · ' · *· ·

9 ' · · · · stochiometrický poměr přibližně 10:1 a 'Fltl(1-3)-Fc proteiny jsou schopny blokovat vazbu VEGF na'Biacore čip, ale nejsou rovnocenné. Nemodif ikovaný, acetylovaný a Mutl:Fltl (1-3 _b)'.-Fc jsouv podstatě rovnocenné ve schopnosti blokovat · vazbu VEGF, zatímco'Mut4:FÍtl (1“3_R )-Fc j e· ó něco méně účinný v blokování vazby.

Obr. 18. Vazba nemodifikovaného Fltl(1-3)-Fc,

Mutl:Fltl(1-3 )-Fc, Mut2:Fltl(2-3 )-Fc a Fltl(2-3) mutantních proteinů na plotny potažené Matrigelem^R.

Nemodifikovaný Fltl(1-3)-Fc protein se váže dobře na tyto jamky, Mut3:Fltl(2-3)-Fc protein se váže o něco slaběji a Mutl(2-3 )-Fc protein má nejlepší profil s vazbou slabší než kterýkoliv jiný mutantní protein, Mut4:Fltl(l-3 )-Fc glykosylovaný mutantní protein je v tomto testu pouze o něco lepší. . ' . ů-' , .t

Obr. 19. Vazba nemodifikovaného-Fltl(1/3)-Ěc, Mutl:Fltl(1-3 )-Fc, Mut2:Fltl(2-3 _b)-Fc a Fltí(2-3) mutántriích proteinů v testu na bázi ELISA. Při testovaných koncentracích se váží nemodifikovaný Fltl(1-3)-Fc, Mutl:Fltl(1-3 _b)-Fc,

Mut2:Fltl(2-3 _b)-Fc a Fltl(2-3) mutantní proteiny na VEGF podobně.

Obr. 20. Farmakokinetické profily pro nemodifikovaný Fltl(1-3)-Fc, Mutl:Fltl(1-3 )-Fc, Mut2:Fltl(2-3 )-Fc a Fltl (2-3) mutantní proteiny.C pro všechna tato činidla byly následující: nemodifikovaný Fltl(1-3)-Fc - 0,15 g/ml, 40-násobný molární nadbytek acetylovaného Fltl(1-3)-Fc -1,5 ug/ml; a Mutl:Fltl(1-3 )-Fc - 0,7 ug/ml.

Obr. 21A-21C. Sekvence nukleové kyseliny a odvozená aminokyselinová sekvence modifikovaného Fltl receptoru ·<►··

···· označeného FltlD2.FlklD3.Fc Cl(a).

Obr. 22A-22C. Sekvence nukleové kyseliny a odvozená aminokyselinová sekvence modifikovaného'Fltl receptoru označeného FltlD2.VEGFR3D3.Fc Cl(a). ’ ^:

Obr. 23. Test na extracelulární matrici (ECM). Výsledky tohoto testu ukazují, že FltlD2.FlklD3.Fc Cl(a) a FltlD2,VEGFR3D3.Fc Cl(a). proteiny jsou významně méně lepivé na ECM ve srovnání s Fltl(1-3)-Fc proteinem.

Obr. 24A-24C. Sekvence nukleové kyseliny a odvozená aminokyselinová sekvence modifikovaného Fltl receptoru označeného VEGFR1R2.FC Cl(a).

Obr. 25A-25C. Fosforylační test. Při 1,5 molárním nadbytku buď Fltl(1-3)-Fc, nebo^Fltl(1-3)-Fc(A40) nebo dočasného FltlD2FlklD3.Fc Cl(a) dochází ke kompletní blokádě· ·· receptorové stimulace těchto tří modifikovaných Fltl receptorů ve srovnání s expozicí kontrolnímu mediu. Naopak, dočasný FltlD2VEGFR3D3.Fc Cl(a) nevykazuje při tomto molárním nadbytku žádnou blokádu, ve srovnání s VEGF pozitivní kontrolou. Podobné výsledky jsou uvedeny na obr. 25B, kde jsou modifikován Fit receptory ve 3-násobném molárním nadbytku vzhledem k VEGF165 ligandu. na obr. 25C, kde jsou modifikované Fltl receptory v 6-násobném molárním nadbytku k VEGF165 ligandu, je uvedeno, že dočasný FltlD2VEGFR3D3.Fc Cl(a) částečně blokuje VEGF-165 indukovanou stimulaci buněčných povrchových receptorů.

Obr. 26A-26B. Fosforylační test. Westernová hybridizace na tyrosinu fosforylovaných VEGFR2(Fikl) VEGF165 ligandem ukazuje, že povrchové buněčné receptory nejsou fosforylované ·* 44 4 4 • · - v* • ,4 · • ^4 4 • · 4 «

· ·. . . , . r · expozicí se vzorky, které obsahovaly VEGF165¹ preinkubovaný Λ v 1 a 2-násobném molárním nadbytku ’(obr. 26A) nebo 3- nebo ‘ 4-ňásobném molárním nadbytku (obr. 26B) bud' s dočasný™ FltlB2FlklD3. Fc Cl (a), nebo stabilním FltlD2FlklD3;Fc Cl?a), . nebo s dočasným VEGFR1R2 - Fc Cl (a) Při všech. test ovaných koncentracích modifikovaného Fltl receptoru je patrná kompletní vazba VEGF165 ligandu během preinkubace, což vede k nedetekovatelné stimulaci povrchových buněčných receptoru nevázaným' VEGF ve srovnání s kontrolním mediem.

Obr. 27. MG/R2 buněčný proliferační test. Následující modifikované Fit receptory Fltl(1-3)-Fc, FltlD2FlklD3.Fc Cl(a) a FltlD2VEGFR3D3.Fc Cl(a) a irelevantní receptor označený Tie2-Fc jako negativní kontrola, byly titrováný od 40 nM do 20 pM a byly inkubovány na buňkách po dobu 1 hodiny při 37 °C. Lidský rekombinántní VEGF165 v definovaném^mediu se potompřidal do všech jamek'v koncentraci 1,56 nM. Negativní kontrolní receptor Tie2-Fc' neblokoval proliferaci buněk indukovanou VEGF165 v žádné koncentraci, zatímco FltlD2FlklD3.Fc Cl(a) blokoval 1,56 nM VEGF165 při poloviční maximální dávce 0,8 nM. Fltl(1-3)-Fc a FltlD2VEGFR3D3.Fc Cl(a) byly méně účinné v blokování VEGF165 v tomto testu s poloviční maximální dávkou přibližně 2 nM. VEGF165 sám měl při odečtu absorbanci 1,2 jednotky a pozadí je 0,38 absorbančních jednotek.

Obr. 28. Biacore analýza vazebné stoichiometrie. Vazebná stoichiometrie byla vypočtena jako molární poměr navázaného VEGF165 k zmobilizovanému FltlD2FlklD3.Fc Cl(a) nebo VEGFR1R2FC Cl(a), za použití konverzního faktoru 1000 RU ekvivalentních 1 ng/ml. Výsledky ukazují vazebnou stoichiometrii jedné VEGF165 dimerní molekuly na jednu molekulu FltlD2FlklD3.Fc Cl(a) nebo VEGFR1R2FC Cl(a).

»» · ·» • ♦ 9 9 • · · 9 9 · • 9999 99 9 9 • · 9 9 9 ··· · 9 9 9· ·«·· • 999

Obr. 29 a Obr. 30. Stoichiometrie chromatografie s vylučováním podle velikosti. FltlD2FlklD3.Fc Cl(a) nebo VÉGFŘlŘ2Fc ClTa) v koncentraci '1 hM ‘'{což by mělo být '

1000-krát více než KD interakce FltlD2FlklD3.Fc Cl(a) nebo VEGFR1R2FC Cl(a)/VEGF165) se smísily s různými koncentracemi VEGF165. Po inkubaci se měřily koncentrace volného FltlD2FlklD3.Fc Cl(a) v roztoku. Data ukazují, že adice VEGF165 do roztoku FltlD2FlklD3.Fc Cl (a) zcela blokuje vazbu FltlD2FlklD3.Fc Cl(a) na povrch VEGF165. Tento výsledek ukazuje na vazebnou stoichiometrii jedné molekuly VEGF165 na jednu molekulu FltlD2FlklD3.Fc Cl(a).

Obr. 31. Chromatografie s vylučováním podle velikosti (SEC) za nativních podmínek. Pík 1 představuje komplex FltlD2FlklD3.Fc Cl(a)/VEGF165 a pík 2 představuje nenavázaný VEGF165. Frakce eluované mezi 1,1 a 1,2 ml se-kombinovaly a přidal se guanidinium hydrochlorid (GuHCl) v konečné koncentraci 4,5 M pro disociaci komplexu.

Obr. 32. Chromatografie s vylučováním podle velikosti (SEC) za disociačních podmínek. Pro separování složek komplexu receptor-ligand a pro určení jejich molámího poměru se 50 ul disociovaného komplexu vneslo do Superose 12 PC 3.2/30 uvedené do rovnováhy v 6M GuHCl a provedla se eluce. Pík 1 představuje FltlD2FlklD3.Fc Cl(a) a pík 2 představuje VEGF165.

Obr. 33, 34 a 35. Chromatografie s vylučováním podle velikosti částic (SEC) s detektorem rozptylu světla. Kolona pro chromatografii s vylučováním podle velikosti částic s MiniDawn on-line deetktorem rozptylu světla (Wyatt Technology, Santa Barbara, Califomia) a detektory »· · » · « • · · * ··»· *«· «««· »· ·*··>

refrakterního indexu (RI) (Shimadzu, Kyoto, Japan) se použily pro určení molekulové hmotnosti (mol. hmot.) komplexu 1igand-receptor. Jak je uvedeno na obr. 33, ukazuje elučrií profil dva píky. Pík 1 představuje komplex 1igand-receptor a pík 2 představuje nenavázaný VEGF165Í Mol. hmotnost byla vypočtena z LS a RI signálů. Stejný postup byl použit pro určení molekulové hmotnosti jednotlivých složek komplexu '1igand-receptor. Výsledky těchto pokusů jsou následující: molekulová hmotnost komplexu FltlD2FlklD3.Fc Cl(a)/VEGF165 v píkové pozici je 157300 (obr. 33), molekulová hmotnost VEGF165 v píkové pozici je 44390 (obr. 34) a molekulová hmotnost R1R2 v píku je 113300 (obr. 35).

Obr. 36. Mapování peptidu a analýza glykosylace. Disulfidové struktury a glykosylační místa FltlD2.FlklD3.Fc Cl(a) byly určeny metodou peptidového mapování.,Ve FltlD2.FlklD3.Fc Cl(a) existuje celkem 10 cysteinů; šest z nich náleží k Fc regionu. Cys27 je disulfidové vázán na Cys76. Cysl21 je disulfidové vázán na Cysl82. První dva cysteiny v Fc regionu (Cys211 a Cys214) tvoří intermolekulovou disulfidovou vazbu se stejnými dvěma cysteiny v jiném Fc řetězci. Nicméně, nemůže být stanoveno, zda se disulfidové vazba vyskytuje mezi stejnými cysteiny (Cys211 a Cys211, například), nbeo mezi Cys211 a Cys214. Cys216 je disulfidové vázán na Cys306.

Cys352 je disulfidové vázán na Cys410.

Ve FltlD2.FlklD3.Fc Cl(a) existuje 5 možných N-vázaných glykosylačních míst a tato místa jsou glykosylována v různém stupni. Kompletní glykosylace je pozorována na Asn33, Asnl93 a Asn282. Částečná glykosylace je pozorována na Asn65 a Asnl20. Místa glykosylace na na obr. podtržena.

Obr. 37. Farmakokinetiky Fltlí1-3)-Fc (A40), FltlD2.FlklD3.Fc jl· Λ ' ' , , ·· » ·

A

A

A ·

A AAA « • AAA A ** ···) A « • A «

A A · » A ·

A* ·>, «Α »A • · * · • ♦ ·

A · · • A « »« MM

Cl(a) a VEGFR1R2-Fc Cl(a). Balb/c myším byly injekčně podkožně podány 4 mg/kg Fltl(1-3)-Fc (A40), CHO dočasně exprimující FltlD2.FlklD3.Fc Cl (a) , CHO stabilně exprimující FltlD2.FlklD3.Fc Čl(a) Á CHÓ dočasně exprimující VĚGFŘÍŘ2-Fc Cl(a). Myším byla z ocasu odebírána krev za ~1, 2, 4, 6, 24 hodin, 2 dny, 3 dny a 6 dnů po injekci. Sérum se testovalo pomocí ELISA testu navrženého pro detekci Fltl{í-3)-Fc (A40), FltlD2 .FlklD3 .Fc Cl(a) nebo VEGFR1R2-FC Cl (.a) . T pro Fltl(1-3)-Fc(A40) byl 6 hodin, zatímco T^^ pro přechodný a stabilní FltlD2.FlklD3.Fc Cl(a) a přechodný VEGFR1R2-FC Cl(a) byl 24 hodin. C ) pro Fltl(1-3)-Fc (A40) byla 8 ug/ml, pro oba dočasné (FltlD2.FlklD3.Fc Cl(a) a VEGFR1R2-FC Cl (a)) byla 18 ug/ml a C_mgtx pro stabilní VEGFRlR2-FcCl (a) byla 30 ug/ml. ,

Obr. 38. Farmakokinetiký Fltl'(l-3) -Fc (A40) ; FltlD2 .FlklD3 .Fc Cl(a) a FltD2.VEGFR3R3-FC Cl(a). Balb/c myším bylý'injekčně podkožně podány 4 mg/kg Fltl(1-3)-Fc (A40), CHO dočasně exprimuj ící FltlD2.FlklD3.Fc Cl(a) á CHO dočasně exprimuj ící FltlD2VEGFR3R3-Fc Cl(a). Myším byla z ocasu odebírána krev za 1, 2, 5, 6, 7, 8, 12, 15 a 20 dnů po injekci. Sérum se testovalo pomocí ELISA testu navrženého pro detekci Fltl(1-3)-Fc (A40), FltlD2.FlklD3.Fc Cl(a) nebo FltlD2.VEGFR3R3-FC Cl(a). Fltl(l-3)-Fc (a40) nebyl detekován v séru po 5 dnech, zatímco FltlD2.FlklD3.Fc Cl(a) a FltD2.VEGFR3R3-FC Cl(a) byly detekovatelné i po 15 dnech.

Obr. 39. Schopnost FltlD2.FlklD3.Fc Cl(a) inhibovat růst fibrosarkomu HT-1080 in vivo. Léčba SCID myší každý druhý den nebo 2-krát týdně 25 mg/kg FltlD2.FlklD3.Fc Cl(a) signifikantně snižuje růst podkožních fibrosarkomu HT-1080.

Obr. 40. Schopnost FltlD2.FlklD3.Fc Cl(a) inhibovat růst • ···· · · « · • · · · · ► · · · · · · gliomu C6 in vivo. Léčba SCID myší každý druhý den nebo 2-krát týdně 2,5 mg/kg FltlD2.FlklD3.Fc Cl(a) signifikantně snižuje růst podkožních gliomů C6. '

Obr. 41. Děložní hyperpermeabilita indukovaná’VEGF'” PMSG injikovaný podkožně (5 IU) pro indukci ovulace preburetálním myším samicím způsobil surge of estradiolu po 2 dnech, což nakonec způsobilo indukci VEGF v děloze. Tato indukce způsobila hyperpermeabilitu dělohy a zvýšila obsah kapaliny v děloze. Podkožní injekce fltl(l-3)-Fc (A40), FltD2.FlklD3.Fc Cl(a) a FltlD2.VEGFR3D3.Fc Cl(a) v dávkách 25 mg/kg 1 hodinu po injekci PMSG vedla k přibližně 50% inhibici zvýšení vlhké hmotnosti dělohy.

Obr. 42A-42B. Hodnocení angiogenése v corpus luteum za použití progestéronu jako sledované hodnoty. PMSG byl injikován podkožně (5 IŮ) pro indukci ovulace u prepubertálních myších samic, což vedlo ke vzniku plně funkčního corpus luteum obsahuj ícího hustou síť. krevních cév, kde toto corpus luteum secernovalo do krve progesteron za účelem přípravy dělohy pro implantaci. Indukce angiogenese v corpus luteum vyžaduje VEGF. Klidové koncentrace progesteronu jsou přibližně 5 ng/ml a PMGS může indukovat hodnoty až 25-40 ng/ml. Podkožní injekce Fltl(l-3)-Fc (A40) nebo FltD2.FlklD3.Fc Cl(a) v dávce 25 mg/kg nebo 5 mg/kg 1 hodinu po injekci PMSG vede ke kompletní inhibici indukce progesteronu v den 4.

Podrobný popis vynálezu

V oboru dlouho přetrvávaly problémy při produkci receptorového antagonisty VEGF s farmakokinetickým profilem, který by byl vhodný pro použití antagonisty jako možného terapeutika. Předkladatelé vynálezu zde poprvé popisují chimérický polypeptid schopný antagonizování VEGF, který má. lepší farmakokinetické vlastnosti ve.srovnání s jinými antágonisty VEGF na bázi receptoru? Chimérické polýpéptidy 'pódie^předkládáného vynálezu jsou'tedy prvními molekulami vhodnými pro léčbu, při které je žádoucí dosažení antagónizování VEGF.

J

Předkládaný, vynález poskytuje nové chimérické polypeptidy vytvořené fúzováním modifikované extracelulární vazebné domény pro ligand Fltl recéptoru a Fc regionu IgG.

Extracelulární vazebná doména pro ligand je definována ja část receptoru, která - ve své přirozené konformaci v buněčné membráně - je orientovaná extracelulářně, takže může kontaktovat svůj ligand. Ext racelulariií vazebná' doména pro · ligand neobsahuje hydrofobni‘aminokyseliny asociované s transmembránovou doménou receptoru ani žádné.aminokyseliny ^; asociované s intracelulární doménou receptoru'. Obecně je intracelulárni nebo cytoplasmatičká doména receptoru složena obvykle z pozitivně nabitých nebo polárních aminokyselin )t.j. lysinu, argininu, histidinu, kyseliny glutamové, kyseliny asparagové). Předchozích 15-30, především hydrofobních nebo apolárních aminokyselin (jako je leucin, valin, isoleucin a fenylalanin), tvoří transmembránovou doménu. Extracelulární doména obsahuje aminokyseliny, které předcházejí hydrofobnímu transmembránovému řetězci aminokyselin. Obvykle je transmembránová doména obklopena pozitivně nabitými nebo polárními aminokyselinami, jako je lysin nebo arginin. Von Heijne publikoval podrobná pravidla, která jsou používána odborníky v oboru pro stanovování toho, zda daný receptor náleží k extracelulární, transmembránové nebo intracelulární doméně (viz von Heijne, 1995, BioEssays i

• · • · .. · ·' · · ·

17: 25-30). Alternativně, na Internetu jsou dostupné stránky, jako například . \ ..

http://ulreč3.unii.ch/software/TMPRED_form.html, které umožní i·''odborníkům⁷v proteinové chemii predikci týkající sě proteinových domén.

Předkládaný vynález umožňuje konstrukci molekul nukleové kyseliny kódující chimérické polypeptidy, které jsou vloženy do vektoru, který exprimuje molekuly chimérických polypeptidů po vložení do vhodné hostitelské buňky. Vhodnými hostitelskými buňkami jsou, například, bakteriální buňky, kvasinky, hmyzí buňky a savčí buňky. Jakákoliv metoda známá odborníkům v oboru pro inserci DNA fragmentů do vektoru může být použita pro konstrukci expresních vektorů kódujících chimérické polypeptidové molekuly pod kontrolou, transkripčních/translačních kontrolních signálů..Mezi tyto metody patří rekombinantní DNAa syntetické tectíniky in vitro, a in vivo rekombinace (genetické.rekombinace)(viz Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laborátory Manual, Cold

Spring Harbor Laboratory; Current Protocols in Molecular

Biology, ed. Ausubel et al., Greene Publ. Assoc.,

Wiley-Interscience, NY).

Exprese molekul nukleové kyseliny kódujících chimérické polypeptidové molekuly může být regulována druhou sekvencí nukleové kyseliny tak, že chimérická polypeptidové molekula je exprimována v hostiteli transformovaném rekombinantní DNA molekulou. Například, exprese chimérických polypeptidových molekul, jak je zde popsána, může být řízena jakýmkoliv promotorem/zesilovačem transkripce známým v oboru. Promotory, které mohou být použity pro řízení exprese chimérických polypeptidových molekul, jsou například: dlouhá koncová repetice, jak je popsána v Squinto et al. (1991, Cell 65:

· ²⁷ «Η · ' - ’

1-20); časný promotorový region SV40 (Bernoist and Chambon, 1981; Ňature 290: 304-310), CMV promotor, M-MuLV 5’ koncový 'repetitivní promotor obsažený v 3' dlouhé koncové repetitivní sekvenci viru Rousova sarkomu (Yamamoto et al., 1980, Cell,· (22:^787-797),, promotor herpetické thýmidin kinasy )wagher et al., 1981Proč. Nati. Acad. Sci. USA 78. 144-1445), regulační sekvence metallothioninového genu {Brinster et al., 1982, Nátuře 296: 39-42); prokaryotické expresní vektory; jako je beta-láktamasový promotor (Villa-Kamaroff et al.,

1987, Pro.c. Nati. Acad. Sci. USA 75: 3727-3731), nebo tac promotor (DeBoer et al., 1983, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 80: 21-25, viz též Useful proteins from recombinant bacteria, v Scientific American, 1980, 242: 74-94); promotorové elementy z kvasinek nebo jiných hub, jako je Gal4 promotor, ADH (alkohol dehydrogenasový) promotor, PGK · (fosfoglycerolkinasový) promotor, promotor alkalické. fosfatasy a následující zyířečí transkripční kontrolní: regiony, které vykazují tkáňovou-specificitu a které byly použity u transgenních zvířat: kontrolníregion genu pro elastasu I, který je aktivní v acinárních buňkách slinivky břišní (Swift et al., 1984, Cell, 38: 639-646; Ornitz et al., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50: 399-409; MacDonald, 1987, Hepatology 7: 425-515); kontrolní region insulinového genu, který je aktivní v beta-buňkách slinivky břišní (Hanahan, 1985, Nátuře 315: 115-122), kontrolní region imunoglobulinového genu, který je aktivní v lymfoidních buňkách (Grosschedl et al., 1984, cell 38. 647-658; Adames et al., 1985, Nátuře 318: 533-538; Alexander et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7: 1436-1444), kontrolní region viru myších nádorů mléčné žlázy, který je aktivní v testikulárních, prsních, lymfoidních a žírných buňkách (Leder et al., 1986, Cell 45: 485-495), kontrolní region albuminového genu, který je aktivní v játrech (Pinkert et al., 1987, Genes and Devel.

• · t. . · ·

1268-276) , kontrolní region alfa-fetoproteinového genu, který, je aktivní v játrech' (Krumlauf et al., 1985, Mol. Cell, Biol.·5: 1639-1648; Harnmer et al. , 1987, Science 235: 53-58); kontrolníregion genu pro aífa-l-antitrypsin, který je aktivní v játrech (Kelsey et al., 1987, Genes and devel. 1. 161-171), kontrolní region genu pro beta-globin, který je aktivní v myeloidních buňkách (Mogram et al., 1985, Nátuře 315: 338-340, Kollias et al., 1986, Cell 46: 89-94);

kontrolní region genu pro myelinový bazický protein, který je aktivní v oligodendrocytech v mozku (Readhead et al., 1987, Cell 48: 703-712) ; kontrolní region genu pro lehký řetězec 2 myosinu, který je aktivní v kosterním svalu (Shani, 1985, Nátuře 314: 283-286), a kontrolní region genu pro hormon uvolňující gonadotropin, který je aktivní v hypothalamu (Mason et al., 1986, Science 234: 1372-1378):

Podle předkládaného vynálezu, jsou tedy,,expresní vektory replikovatelné v bakteriálních,nebo eukaryotických hostitelých obsahující nukleové kyseliny kódující chimérické polypeptidy podle předkládaného vynálezu použity pro transfekci hostitele a tak pro řízení exprese takových nukleových kyselin tak, že produkují chimérické polypeptidy, které mohou být potom získány v biologicky aktivní formě. Termín biologicky aktivní formy označuje formy schopné vazby na VEGF.

Expresní vektory obsahující chimérické molekuly nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu mohou být identifikovány třemi obecnými postupy: (a) DNA-DNA hybridizací; (bj podle přítomnosti nebo nepřítomnosti funkce markerového genu; a (c) podle exprese insertovaných sekvencí. V prvním způsobu může být přítomnost cizorodého genu insertováného v expresním vektoru detekována DNA-DNA

« · hybridižací za použití sond-obsahujících sekvence, které jsou homologní se sekvencemi insertováné chimérické polypeptidové molekuly. Ve druhém způsobu může být systém rekombinantňí vektor/hostitel identifikován a^selektován podle přítomnosti nebo nepřítomnosti'některých funkcí ''markerového genu (například podle aktivity thymidin-kinasy, podle resistence na antibiotika, podle transformačního fenotypu, podle tvorby oklusních tělísek v bakuloviru atd.), které jsou způsobeny insercí cizorodých genů do vektoru. Například, když je DNA sekvence pro chimérický polypeptid vložena do vektoru do sekvence markerového genu, tak mohou být rekombinanty obsahující insert identifikovány podle absence funkce markerového genu. Ve třetím způsobu mohou být rekombinantní expresní vektory identifikovány testováním produktu cizorodého genu exprimovaného rekombinantem. Takové testy mohou být založeny, například,’ na fyzikálních nebo funkčních vlastnostech chimérických polypeptidů.

Buňky podle předkládaného vynálezu mohou dočasně, nebo lépe konstitutivně a permanentně, exprimovat chimérické polypeptidy. _r

Chimérické polypeptidy mohou být přečištěny jakoukoliv technikou, která umožňuje následnou tvorbu stabilních, biologicky aktivních chimérických polypeptidů. Například mohou být faktory získány z buněk ve formě solubilních proteinů nebo ve formě inklusních tělísek, ze kterých mohou být extrahovány kvantitativně 8M guanidinium hydrochloridem a dialýzou (viz například Builder et al., US patent č.

5663304). Pro další přečištění faktorů může být použito běžné iontoměničové chromatografie, chromatografie s reverzní fází nebo gelové filtrace.:

• ·· · · · · ··· ··· · · . · · · · ······· ·· ·· · · • · · · · · · · ···· · ·· ·· ····

V jednom provedení vynálezu je nukleotidová sekvence kódující první složku před nukleotidovou sekvencí kódující druhou složku. V jiném provedení vynálezu je nukleotidová sekvence kódující první složku za nukleotidovou sekvenci kódující druhou složku. Mohou být připravena další provedení vynálezu, ve kterých je pořadí první, druhé a třetí složky jiné. Například, pokud je nukleotidová sekvence kódujíc! první složku označena č. 1, nukleotidová sekvence kódující druhou složku označena č.2 a nukleotidová sekvence kódující třetí složku označena č.2, tak může být pořadí složek izolované nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu ve směru 5' - 3' jedno z následujících pořadí: 1,2,3; 1,3,2; 2,1,3; 2,3,1; 3,1,2; nebo 3,2,1.

Předkládaný vynález má také .diagnostické a terapeutické použití. V konkrétních provedeních vynálezu'mohou být způsoby pro detekci aberancí ve funkci nebo expresi chimérických polypeptidů podle předkládaného vynálezu použity pro diagnostiku onemocnění. V jiných provedeních může být úprava chimérických polypeptidů nebo agonisté nebo antagonisté, kteří se váží na chimérické polypeptidy, použita pro léčbu onemocnění. V dalších provedeních jsou chimérické polypeptidy použity jako činidla pro blokování vazby vazebného činidla na cíl.

Způsob podle předkládaného vynálezu může být použit například pro léčbu onemocnění, která jsou charakter!szována cévní permeabilitou, edémem nebo zánětem, jako je edém mozku asociovaný s poraněním, mrtvicí nebo nádorem; edémem asociovaným se záněty jako je psoriasa nebo artritida, včetně revmatoidní artritidy; atsha; generálizováný edém spojený s popáleninami; ascites a pleurální výpotky asociované s nádory, záněty nebo úrazy; chronické záněty dýchacích cest,

-4 • · · 4 4 4 • · · · · 4 · · ·

4 4 4 4

4444 4 44 4

4.-4'

4 4

4 4 ···· syndorm zvýšené propustnosti kapilár; sepse; onemocnění 'ledvin asociované s vyššími ztrátami proteinů; a oční onemocnění, jako je makulární degenerace asociovaná s věkem a diabetická retinopatie.

Analýza aminokyselinové sekvence Fltl(1-3)-Fc ukázala přítomnost neobvykle vysokého počtu (46) bazické aminokyseliny· lysinu. IEF analýza Fltl(1-3)Fc ukázala, že tento protein má pí vyšší než 9,3, což potvrzuje předpoklad, že tento protein je velmi bazický. Předpokládá se, že bazický charakter Fltl(l-3)-Fc způsobuje jeho vazbu na složky mezibunščné hmoty a tato interakce může způsobit extrémně krátký cirkulační sérový poločas Fltl(1-3)-Fc, když je injekčně podán myším. Pro testování této hypotézy byl Fltl(1-3)-Fc protein acetylován na lysinu za účelem redukce této bazicity. Acetylovaný Fltl(Ϊ-3)-Fc byl potom testován v testu popsaném dále.

í ’ ·

Následující příklady ilustrují předkládaný vynález a nijak jej neomezují.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1: Exprese Fltl(1-3)-Fc proteinu v CHO Kl

Za použití standardních technik molekulární biologie (viz např. Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory), Current Protocols in Molecular Biology (ed. Ausubel et al., Greene Publ. Assoc., Wiley-Interscience, NY) , se gen kódující Fltl{l-3)-Fc insertoval do expresního vektoru pEEl4.1 (Lonza Biologics, plc) v mnohotném klonovacím místě za CMV promotorem. CHO Kl buňky se transfektovaly pEE14.1/Fltl(1-3)-Fc DNA konstruktem • · · · ··'..· • · · · « a • · · · · · · . · • · · · · « · · ··.···· za použití lipofektaminu (Gaithersburg, MD). Transfektovane CHO K1 buňky se kultivovaly v bezglutaminovém DMEM (JRH, Kansas City, MO) obsahujícím 25 um methionin sulfoximu (msx) od Sigma lne., St. Louis, MO, a buňky exprimující vysoké' kvantity, rekombinantního proteinu se získaly testováním supernatantů CHO K1 buněk z více než 100 ručně odebraných kolonií izolátů za použití standardního imunotestu, který zachycuje a detekuje lidský Fc. Selektované ručně odebrané kolonie se amplifikovaly za přítomnosti 100 uM MSX a potom se provedlo druhé kolo skríningu amplifikovaných kolonií. Klon s nejvyšší produkcí měl specifickou produktivitu rekombinantního Fltl(l-3)-Fc proteinu 55 pg/buňku/den.

Selektovaný klon byl expandován v T-baňce o objemu 225 cm² (Corning, Acton, MA) a potom se přenesl do 8,5 1 válcových zkumavek (Corning, Acton, MA) za použití buněčného , kultivačního media popsaného výše. Buňky se odstranily z válcových zkumavek pomocí standardní trypsinizace a vnesly se do 3,5 litru suspenzního media. Suspenzní medium se skládalo z bezglutaminového ISCHO media (Irvine Scientific, Santa Ana, CA) obsahujícího 5% fetální hovězí sérum (FBS od Hyclone Labs, Logan, UTj, 100 uM MSX a GS doplněk (JRH Scientific, Kansas City, MO) v 5 1 Cellingen bioreaktoru (New Brunswick Scientific, New Brunswick, NJ) v hustotě 0,3 x 10^s buněk/ml. Poté, co buňky dosáhly density 3,6 x 10^s/ml a adaptovaly se na suspenzi, byly přeneseny do 60 bioreaktoru (ABEC, Allentown, PA) v hustotě 0,5 x 10^s buněk/ml ve 20 1 ISCHO media s 5% fetálním hovězím sérem. Po dnech se do bioreaktoru přidalo dalších 20 1 ISCHO + 5% fetální hovězí sérum. Buňky se nechaly růst po dobu dalších dvou dnů do dosažení konečné hustoty 3,1 x 10^s buněk/ml a konečná koncentrace Fltl(1-3)-Fc při sběru byla 95 mg/ml. Při odběru byly buňky odstraněny filtrací s tangenciálním « ·' ·' · * • · · · t • · · « ; ♦ · ·<«· tokem za použití 0.45 um Prostak. filtrů.(Milliporé, lne., Bedford, MA) . ·..·· ·.

Přiklad Přečištěni Fltl (Í-3j-Fč^přdt“éihůzískaného z CHO' Kl buněk

Fltl(1-3)-Fc protein byl nejprve přečištěn afinitní chromatografií. Kolona s proteinem A byla použita pro navázání, s vysokou specificitou, Fc části molekuly. Tento afinitně přečištěný protein byl potom zahuštěn a nechal se projít SEC-kolonou. Protein byl potom eluován do formulačního pufru. Dále je tento postup popsán podrobně.

Materiály a metody

Všechny chemikálie byly získány od J.T.Baker/. «< ^s Phillipsburg, NJ, s výjimkóÚ/PBSý který byl získán·, jako lOx

- koncentrát od Life Technologies/^áitíiersburg^ ,MD. Protein A Fast Flow a Superdex 2 0 0 příprávký . pryskyřic . byly,, získány od Pharmacia, Piscataway, NJ.'Vybavení a membrány pro zahuštění proteinu byly získány od Millipore, Bedford, MA.

Přibližně 40 1 0,45 um-filtrovaného CHO kondicionovaného media obsahujícího Fltl(1-3)-Fc protein se aplikovalo do 290 ml Protein A Fast Flow kolony (průměr 10 cm), která se uvedla do rovnováhy v PBS. Kolona se promyla PBS obsahujícím 350 mM NaCl a 0,02% CHAPS a navázaný protein se eluoval 20 mM kyseliny citrónové obsahujícími 10 mM Na^HPO^. Jediný pík v eluátu se odebral a jeho pH se zvýšilo na neutrální hodnotu pomocí 1M NaOH. Frakce eluátu se zahustily na přibližně 9 mg/ml za použití 10K regenerovaných celulosových membrán za použití jak filtrace s tangenciálním tokem, tak zahuštění buněk míšením. Pro odstranění agregátů a jiných ·'» ·

'kontaminujících složek se zahuštěný protein aplikoval do kolony naplněné Superdex 200 pryskyřicí (10 cm x 55 cm) a provedla se.eluce PBS’obsahuj ícím 5% glycerol. Hlavní píky se odebraly, sterilně se přefiltrovaly,· rozdělily se do podílů ,a uskladnily se při teplotě -80 °C.

Příklad 3: Acetylace Fltl(1-3)-Fc proteinu mg Fltl(1-3)-Fc proteinu se acetylovaly způsobem popsaným v návodu k použití sulfo-NHS-acetátového modifikačního kitu (Pierce Chemical Co., Rockford, IL, kat. č. 26777).

Příklad 4: Charakterizace acetylovaného Fltl(1-3)-Fc proteinu (a) IEF analýza: Fltl(1-3)-Fc a acetylovaný'Fltl(1-3)-Fc se analyzovaly standardní IEF analýzou. Jak je'uvedeno na obr. 1, Fltl(l-3)-Fc protein není schopen migrovat do gelu a proto musí mít pí vyšší než 9,3, což je nejvyšší pí ve standardu. Nicméně, acetylovaný Fltl(1-3)-Fc je schopen migrovat do gelu a dosahuje rovnováhy při pí přibližně 5,2. Tento výsledek demonstruje, že acetylace významně redukuje pozitivní náboj proteinu a tak jeho pí.

(b) Vazba na složky mezibuněčné hmoty

Pro testování vazby na složky meziuněčné hmoty se Fltl(l-3)-Fc a acetylovaný Fltl(1-3)-Fc testovaly v testu napodobujícím interakce se složkami mezibuněčné hmoty. V tomto testu jsou 96-jamkové tkáňové kultivační plotny potažené Matrigelem (Biocoat MATRIGEL^ 96-jamková plotna s tentou vrstvou matrice, katalog, č. 40607, Becton Dickinson Labware, Bedford, MA) Plotny se inkubovaly se různými koncentracemi Fltl(1-3)-Fc, acetylovaného Fltl(1-3)-Fc nebo rTie2-Fc (irelevantní kontrola) proteinu, které se přidaly do jamek. Plotny se inkubovaly po dobu 1-2 hodin buď při teplotě místnosti, nebo při 37 °C, a potom se detekce navázaných, proteinů provedla pomocí přidání druhé protilátky proti lidskému Fc konjugované s alkalickou fosfatasou do jamek. Nakonec se do jamek přidal substrát pro alkalickou fosfatasu a měřila se optická densita. Obr. 2 ukazuje výsledky tohoto testu. Podobně jako irelevantní kontrolní protein rTie2-Fc, nevykazoval acetylovaný Fltl(1-3)-Fc jakoukoliv vazbu na plotnu potaženou Matrigelem, zatímco neacetylovaný

Fltl(1-3)-Fc protein vykazoval významnou vazbu. Tento výsledek naznačuje, že acetylace bazických aminokyselinových zbytků je účinnou cestou pro interferenci s elektrickými interakcemi, které existují mezi proteiny—s^pozitivním nábojem a negativně nabitými složkami extracelulární hmoty, které se odehrávají in vivo. ·

Příklad 5: Pegylace Fltl(1-3)-Fc proteinu , ·'

Ačkoliv bylo prokázáno, že pegylace (polyethylenglykol = PEG) proteinu zvyšuje jeho účinnost in vivo tím, že zvyšuje jeho stabilitu a biologickou dostupnost za minimalizace imunogenicity (viz odkazy citované výše), je intuitivně nevhodné pegylovat molekuly, které jsou příliš velké pro glomerulámí filtraci s cílem zlepšení jejich farmakokinetických vlastností. Bez vazby na konkrétní teorii předkladatelé vynálezu postulovaly teorii, že pegylace Fltl(1-3)-Fc molekul může zlepšit jejich farmakokinetické vlastnosti, pravděpodobně ne změnou pozitivního náboje nebo snížením pí Fltl(1-3)-Fc, ale spíše fyzikálním odstraněním pozitivního náboje z interakce s extracelulární hmotou. Předkladatelé vynálezu se rozhodli o pokus o zlepšení

6 farmakokinetickýeh vlastností Fltl(1-3)-Fc molekul tak, že naváží řetězec 20K PEG, jak je popsáno dále. ^J

Materiály a metody « ;

Přečištění Fltl(1-3)-Fc získaný z CHO buněk (viz výše) byl použit v následujících pegylačních pokusech.

Funkcionalizované PEG byly získány od Shearwater Polymers, Huntsville, AL; Bicin od Sigma, St. Louis, MO; Superose 6 kolona od Pharmacia, Piscataway, NJ; PBS jako lOx koncentrát od Life Technologies, Gaithersburg, MD; Glycerol od J.T.

Baker, Phillipsburg, NJ; a Bis-Tris přede odlité gely od Novex, CA.

20K PEG řetězce funkcionalizované-amin-speei-fiekýmikoncovými skupinami byly použity v reakčních.pokusech v malém rozsahu, které byly provedeny pro hodnocení různých reakčních podmínek, ve kterých se lišila stoichiometrie PEG:protein. Na základě těchto reakcí a analýzy vzorků na standardní SDS-PAGE reagoval Fltl(l-3)-Fc v koncentraci 1,5 ng/ml při pH 8,1 s 2OK SPA-PEG (PEG-sukcinimidylpropionat) molekulami při molárním poměru PEG:Fltl(1-3)-Fc monomer 1:6. Reakce se nechala probíhat při 8 °C přes noc. Pro počáteční přečištění se reakční produkty aplikovaly do 10 mm x 30 cm Superose 6 kolony uvedené do rovnováhy PBS obsahujícím 5% glycerol. Zdá se, že kolona separovala pegylované Fltl(1-3)-Fc molekuly podle rozsahu pegylace. Byly odebrány frakce odpovídající primárně monopegylováným a dipegylovaným dimerickým

Fltl(1-3)-Fc, jak byly potvrzeny charakterem proužků na redukujících a neredukujících SDS-PAGE gelech. Koncentrace proteinu byla určena měřením absorbance při 280 nm.

Pegylovaný Fltl(1-3)-Fc protein byl sterilně přefiltrován, rozdělen do podílů-a uskladněn při -40 °C.

» ·

Příklad'6: Vazba nemodifikovaného, acetylovaného a pégylovaného Fltl(1-3)-Fc v testu na bázi Biacore

Nemodifikovaný, acetylovaný a pegylovaný Fltl(1-3)-Fc proteiny byly testovány v testu na bázi biacore pro hodnocení jejich schopnosti vazby na Fltl ligand, VEGF. V tomto testu se nemodifikovaný Fltl(1-3)-Fc protein imobilizuje na povrchu Biacore čipu (viz Biacore Instruction Manual, Pharmacia, lne., Piscataway, NJ, kde je uveden standardní postup) a vzorek obsahující 0,2 ug/ml VEGF a buď nemodifikovaný Fltl(1-3)-Fc, acetylovaný Fltl(1-3)-Fc nebo pegylovaný Fltl(1-3)-Fc (vždy při 25 ug/ml) se přelil přes čip potažený Fltl(1-3)-Fc. Pro minimalizaci vlivu nespecifické vazby se navázané- vzorky-promyly Ο76—MhNaClv“-Výjednom vzorku se nemodifikovaný Fltl(1-3)-Fc smísil sheparinem. Heparin je · molekula s negativním nábojem a Fltl(1-3)-Fc protein je molekula s pozitivním nábojem, takže když jsou tyto dvěmolekuly smíseny dohromady, měly by interagovat v důsledku svých příslušných nábojů. Toto v podstatě neutralizuje vlastní pozitivní náboj Fltl(1-3)-Fc, což způsobí, že se molekula chová jako chemicky či geneticky modifikovaná tak, že je je redukován její náboj a její tendence k vazbě prostřednictvím elektrických interakcí. Jak je uvedeno na obr. 3, acetylované (sloupce 13-16), pegylované (sloupce 17-20) a heparinem zpracované Fltl(l-3)-Fc (sloupce 21-24) jsou každý schopen zcela inhibovat s Fltl(1-3)-Fc navázaným na Biacore čip o vazbu VEGF ve srovnání s kontrolním (sloupce 1-4) a irelevantním (slouce 5-8) proteinem. Nemodifikovaný Fltl(1-3)-Fc (sloupce 5-6) pouze částečně soutěžil s Fltl(1-3)-Fc navázaným na Biacore čip o vazbu VEGF.

Nicméně, promytí navázaných vzorků 0,5 M NaCl (sloupce 7-8) vedlo k dosažení vazebného profilu podobného profilu • · · · ·· · ·

- modifikovaných forem Fltl(1-3)-Fc, což naznačuje, že modifikovaný protein vykazuje nespecifickou vazbu na čip, . . která může být eliminována promytím solným roztokem.

•Příklad 7: Vazba nemodifikovaného, acetylovaného a pegylovaného Fltl(1-3)-Fc v testu na bázi ELISA

Nemodifikovaný, acetylovaný a pegylovaný Fltl(1-3)-Fc proteiny byly testovány v testu nabázi ELISA pro hodnocení jejich schopnosti vazby na ligand Fltl receptoru VEGF. Jak je uvedeno na obr. 4, jak pegylovaný, tak acetylovaný Fltl(1-3)-Fc proteiny se mohou vázat na VEGF, což dokazuje, že modifikace proteinu buď pegylací, nebo acetylací, neničí jejich schopnost vázat se na ligand.

Příklad 8: Farmakokinetické analýzy nemodifikovaného ·’

Fltl (1-3) -Fc, acetylovaného Fltl,(,1-3)-Fc a pegylovaného ./,, Fltl(l-3) -Fc . -.λ . .

Pokusy in vivo byly navrženy pro hodnoceni farmakokinetických profilů nemodifikovaného Fltl(1-3)-Fc, acetylovaného Fltl(1-3)-Fc a pegylovaného Fltl(1-3)-Fc proteinu. Balb/c myším (23-28 g; 3 myši na skupinu) se podkožní injekcí podaly 4 mg/kg nemodifikovaného, acetylovaného nebo pegylovaného Fltl(1-3)-Fc. Myším se odebírala krev z ocasu 1, 2, 4, 6, 24 hodin, 2 dny a 3 dny po injekci proteinu. Sérum se testovalo standardním ELISA testem navrženým pro detekci Fltl(1-3)-Fc proteinu. Stručně, test zahrnoval potažení ELISA plotny VEGF, vazbu séra obsahujícího nemodifikovaný, acetylovaný nebo pegylovaný Fltl(1-3)-Fc, a detekci anti-Fc protilátkou navázanou na alkalickou fosfatasu. Jak je uvedeno na obr. 5, Tmax pro všechny Fltl(1-3)-Fc proteiny bylo mezi 6 hodinami a 24 hodinami.

• · ' Cmax pro různé proteiny byly následující: nemodifikovaný: 0,06 ug/ml - 0,15 ug/ml; acetylovaný: 1,5 ug/ml - 4,0 ug/ml; a pegyíovaný: přibližně 5 ug/ml. ' \

Příklad 9: Postupná acetylace Fltl(1-3)-Fc

Pro stanovení toho, jaké minimální množství acetylace je nutné pro eliminaci vazby na složky extracelulární matrice, byl navržen pokus, ve kterém byla provedena postupná acetylace Fltl(1-3)-Fc proteinu za použití postupně se zvyšuj ících molárních nadbytků acetylačního činidla v acetylační reakční směsi. Rozmezí molárních nadbytků bylo následujícího, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 a 100 molů acetylačního činidla na 1 mol Fltl(l-3)-Fc monomeru. Reakce se provedly podle -návodu-dodanéhor-k—sulfo-NHS- acetat—---modifikačnímu kitu (Pierce ChemicalCo., Ročford, IL, kat. č. 26777) . ú’ j · .... Příklad 10: Charakterizace postupně acetylovaného

Fltl(1-3)-Fc (a) IEF analýza: Nemodifikovaný Fltl(l-3)-Fc a postupně acetylovaný Fltl(1-3)-Fc proteiny se analyzovaly standardní IEF analýzou. Jak je uvedeno na obr. 6A-6B, nemodifikovaný Fltl(1-3)-Fc protein není schopen migrovat do gelu v důsledku extrémně vysokého pí (vyššího než 9,3). Nicméně, většina z postupně acetylovaných Fltl(1-3)-Fc vzorků bylo schopno migrovat do gelu a dosahovaly rovnováhy při pí přibližně 4,55 - 8,43, podle stupně acetylace proteinu. Tento výsledek demonstruje, že acetylace může měnit pozitivní náboj proteinu v závislosti na velikosti acetylace a že redukce pí může být řízena ovlivněním stupně acetylace.

• · (b) Vazba postupně acetylovaného Fltl(1-3)-Fc na složky mežibuněčné hmoty

Pro testování vazby na složky meziuněčné hmoty se Fltl(l-3)-Fc a postupně acetylovaný Fltl(l-3)-Fc testovaly v testu popsaném výše napodobujícím interakce se složkami mežibuněčné hmoty. Různé koncentrace nemodifikovaného Fltl(1-3)-Fc, postupně acetylovaného Fltl(l-3)-Fc (vzorky s molárním nadbytkem 10, 20 a 30-násobným) nebo rTie2-Fc (irelevantní kontrola) proteinu se přidaly do jamek. Plotny se inkubovaly po dobu 1-2 hodin bud' při teplotě místnosti, nebo při 37 °C, a potom se detekce navázaných proteinů provedla pomocí přidání druhé protilátky proti lidskému Fc konjugované s alkalickou fosfatasou do jamek. Nakonec se do j amek přidal substrát pro alkalickou fosfatasu a měřila se ¹ optická densita. Obr. 7 ukazuje výsledky tohoto testu.

Podobně jako irelevantní kontrolní prótein rTie2-Fc, nevykazoval postupně acetylovaný·Fltl(1-3)-Fc (20a 30-násobný molární nadbytek) jakoukoliv významnou vazbu na plotnu potaženou Matrigelem, zatímco neacetylovaný Fltl(1-3)-Fc protein vykazoval významnou vazbu. Tato vazba je saturovatelná, což naznačuje, že Fltl(1-3)-Fc protein se může vázat na specifická místa a ne prostřednictvím obecnějších interakcí zprostředkovaných nábojem, které by nebyly saturovatelné. Vzorek s 10-násobným molárním nadbytkem vykazoval redukovanou vazbu, ale stupeň acetylace nebyl dostatečný pro úplný blokvazby na složky mežibuněčné hmoty. Vzorky s 20-násobným a vyšším molárním nadbytkem nevykazovaly žádnou detekovatelnou vazbu, i přes skutečnost, že IEF analýza (obr. 6A a 6B) vzorků s nižším molárním nadbytkem stále měla velký pozitivní náboj. Tento výsledek demonstruje, že není nutné kompletně acetylovat všechny dostupné bazické aminokyseliny pro eliminaci vazby na složky extracelulární • · ·

» · ·· » · .· . · matrice. . ·' '·. ^Λ·.

. ., (c) Vazba postupně acetylováného Fit1(1-3)-Fc v testu na bázi ’ Biacore '

i.

Nemodifikovaný a postupně acetylovaný Fltl(1-3)-Fc proteiny byly testovány v testu na bázi Biacore pro hodnocení jejich schopnosti vazby na Fltl ligand, VEGF. V tomto testu se nemodifikovaný Fltl(l-3)-Fc protein (0,5, 1,0 nebo 5,0 ug/ml) imobilizuje na povrchu Biacore čipu (viz Biacore Instruction Manual, Pharmacia, lne., Piscataway, NJ, kde je uveden standardní postup) a roztok obsahující 0,2 ug/ml VEGF a bud' nemodifikovaný Fltl (1-3)-Fc (v koncentraci 0,5, 1,0 nebo 5,0 ug/ml) nebo 10 různě acetylovaných Fltl(1-3)-Fc (v koncentraci—0 ,-5ι—-1-γΌ- nebo—5t-0—ug/ml·)—scypřeM-lý-přes—ěi-pf^---potažený Fltl (1-3)-Fc. Jak je uvedeno’ria obr . 8-, v- : ,·-·'/ ,, sub-stoichiometrickém poměru (0,5. ug/ml_nemódifikovaňého . γ Fit (1-3) nebo postupně ace tyl ováného' Fltl (1-3 }_;hFc vs.;_; 0,2?' ·.·:· .

ug/ml VEGF) není přítomno dostatečné-množství Fltl(1-3)-Fc (nemodifikovaného nebo postupně acetylováného) v roztoku pro úplnou inhibici vazby VEGF. Při 1,0 ug/ml, což je přibližně stoichiometrický poměr 1:1, jsou jak nemodifikovaný, tak postupně acetylovaný Fltl(l-3)-Fc lépe schopni soutěžit o vazbu VEGF, ale není stále ještě přítomen dostatek

Fltl(i-3)-Fc proteinu (nemodifikovaného nebo postupně acetylováného) pro úplnou vazbu dostupného VEGF. Nicméně, při 5,0 ug/ml, což je několikrát více než je stoichiometrický poměr 1:1, jsou jak Fltl(1-3)-Fc, tak postupně acetylovaný Fltl(1-3)-Fc proteiny schopni vázat VEGF, bez ohledu na stupeň acetylace. Toto jasně demonstruje, že acetylace neovlivňuje schopnost Fltl(1-3)-Fc vázat VEGF.

(d) Fařmakokinetické analýzy postupně acetylovaného Fltl (1-3)-Fc

Pokusy in vivo byly navrženy pro hodnocení farmakokinetických profilů nemodifikovaného Fltl(1-3)-Fc a postupně acetylovaného Fltl(1-3)-Fc proteinu. Balb/c myším (23-28 g) se podkožní injekcí podaly 4 mg/kg nemodifikovaného nebo'vzorků s 10, 20, 40, 60 a 100 násobným molárním nadbytkem postupně acetylovaného Fltl(1-3)-Fc (3 myši pro nemodifikovaný, 10. 20 a 40 násobný molární nadbytek a 2 myši pro 60 a 100-násobný molární nadbytek). Myším se odebírala krev z ocasu 1, 2, 4, 6, 24 hodin, 2 dny a 3 dny po injekci proteinu. Sérum se testovalo standardním ELISA testem navrženým pro detekci Fltl(1-3)-Fc proteinu, jak byl popsán výše. Obr. 9 shrnuje výsledky tohoto pokusu. Tmax pro všechny Fltl(l-3)-Fc proteiny byl 6 hodin, ale Cmax pro různé proteiny byly následující: nemodifikovaný: 0,06 ug/ml;

10-násobný molární nadbytek - 0,7 ug/ml“,' 20-násobný molární nadbytek - 2 ug/ml, 40-násobnýmolární nadbytek - 4 ug/ml, 60-násobný molární nadbytek - 2 ug/ml, 100-násobný molární nadbytek - 1 ug/ml. Tyto výsledky ukazují,.že acetylace nebo pegylace Fltl(1-3)-Fc významně'zlepšuje jeho farmakokinetický profil.

Příklad 11: Konstrukce mutantního Fltl(1-3)-Fc s delecí bazického regionu označeného jako Mutl:Fltl(1-3 _s)-Fc

Na základě zjištění, že acetylovaný Fltl(1-3)-Fc, který má pí nižší než 6, má mnohem lepší farmakokinetiku než vysoce pozitivní nemodifikovaný Fltl(1-3)-Fc (pí > 9,3), se zjišťovalo, zda rozdíly ve farmakokinetice mohou být přisouzeny náboji proteinu, který se váže na negativně nabité složky extracelulární matrice, nebo zda existují specifické regiony na povrchu Fltl(1-3)-Fc proteinu, které tvoří specifická vazebná místa pro.složky extracelulární matrice. Například, ό mnoha proteinech je známo, že mají vazebná místa •· · .·· • · · ► ···· ' · * ·· ···<

► ‘ · / ,1 ► . ·· .*

·.· ···· .43 pro heparin, která se často 'skládáji ze'seskupení bazických zbytků. Někdy se tyto zbytky, vyskytují vseskupení na primární sekvenci proteinu; v literatuře byly identifikovány konsensuální sekvence” pro taková vazebná místa pro heparin. (viz nápř. Hileman et al., 1998, Bioessays 20 (2): 156-67). V jiných případech ukazuje známá krystalická struktura proteinu seskupení pozitivně nabitých zbytků na'povrchu proteinu, ale zbytky pocházejí z různých regionů primární sekvence a dostávají, se do kontaktu pouze po složení proteinu do terciární struktury. Tak je obtížné zjistit, zda je izolovaný aminokyselinový zbytek součástí seskupení bazických zbytků na povrchu proteinu. Nicméně, pokud existuje seskupení pozitivně nabitých aminokyselinových zbytků v primární sekvenci, není neopodstatněné předpokládat, že tyto zbytky jsou si·' prostorově blízké a mohou být proto součástí,'vazebného místa pro mez ibuněčnou hmotu .'-Fltl receptor byl /důkladně zkoumán a byly popsány různé jeho domény (viz například Tánaka et al., 1997, Jpn. J. Cancer Res.'88: 867-876) . Podle.‘sekvencí nukleových kyselin a aminokyselinových; sekvencí : uvedenýchna obr. 10A-10D tohoto vynálezu lze identifikovat signální sekvence pro sekreci, které jsou lokalizované na začátku sekvence a končí glycinem kódovaným nukleotidy 76-78. Zralý protein začíná sekvencí Ser-hys-Leu-Lys, začínající nukleotidem 79 sekvence nukleové kyseliny. Fltl Ig doména 1 je kodovariá nukleotidy 79-393 a končí aminokyselinami Ser-Asp-Thr. Fltl Ig doména 2 je kódovaná nukleotidy 394 až 687 (kódujícími Gly-Arg-Pro až Asn-Thr-Ile) a Fltl Ig doména 3 je kódovaná nukleotidy 688 až 996 (kódujícími Ile-Asp-Val až Asp-Lys-Ala). Je zde přítomna přemosťující aminokyselinová sekvence Gly-Pro-Gly, kódovaná nukleotidy 997-1005, po které následuje nukleotidová sekvence kódující lidský Fc (nukleotidy 1006-1701 nebo aminokyseliny Glu-Pro-Lys až Pro-Gly-Lys-stop).

' % ·· ·· ··· ·

Podrobnější analýza Fltl aminokyselinové sekvence ukázala, že zde existuje seskupení, konkrétně aminokyselinové zbytky 272-281 (KNKRASVRR) obr. 10A-10D, ve kterém je 6 z. 10 aminokyselin bazických. Tato sekvence je lokalizována ve Fltl Ig doméně 3 receptoru (viz obr. 11), ale není sama osobě esenciální pro vazbu VEGF ligandu, ale způsobuje vysokou afinitu vazby pro ligand. Srovnání sekvence Ig domény 3 se sekvencí Ig domény 2 ukazuje, že v tomto regionu je velmi slabá shoda mezi dvěma Ig doménami, a že v doméně 3 existuje přibližně 10 dalších aminokyselin. Analýza profilů hydrofilnosti (MacVector počítačový software) těchto dvou domén jasně ukazuje přítomnost hydrofilního regionu v proteinu (obr. 12A-12B).Tato zjištění ukazují na možnost, že skutečná trojrozměrná konformace Fltl Ig domény 3 umožňuje určitou protrusi, která není přítomná ve Fltl Ig doméně 2.

Pro testování této hypotézy se deletovalo 10 dalších aminokyselin a vzniklý protein se testoval za účelem zjištění toho, zda delece bude příznivě ovlivňovat farmakokinetiku bez narušení afinity receptoru pro VEGF. Tento DNA konstrukt, který byl připraven za použití standardních technik molekulární biologie (viz například Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Sambrook et al., Cold SpringHarbor Laboratory), Current Protocols in Molecular Biology, ed. Ausubel et al., Greene Publ. Assoc., Wiley-Interscience, NY) v savčím expresním vektoru pMT21 (Genetics Institute, lne. Cambridge, MA), je označován jako Mutl:Fltl(1-3 )-Fc.

Mutl:Fltl(1-3 _B)-Fc konstrukt byl získán z Fltl(1-3)-Fc delecí nukleotidů 814-843 (podle obr. 10A-10D), což znamená deleci vysoce bazických 10 aminokyselinových zbytků sekvence Lys-Asn-Lys-Arg-Ala-Ser-Val-Arg-Arg-Arg z Fltl Ig domény 3.

Sekvence konečného DNA konstruktu byla verifikována za ·· · • ♦ · ··« · ···· ·· použitíχΑΒΪ 373A DNA sekveňátoru a Taq Dideoxy Terminátor¹ , Cycíe' Sequěhcing Kitu (Applied Biosystems, lne.;/Poster City', /CA)ň Sekvence Mutl: Fltl (1-3 }-Fc je uvedena na Obr. ;Í3Á-13D.

rt í^-‘Λφΐ' **' ***|**lr ‘ *ιτγ ' . .- 3«2t . .. j —. j — — * ·* ι^τTrn* · r »“ ·*· - f- · τ-'-τι — ·♦-. .4— . , '^4- . ..

Ϊ *··.·'* • *·’> jf» ^ ' · * · · . t · —

Příklad;12: Konstrukce mutantního Fltl(1-3)-Fc s delecí bazického regionu označeného jako. Mut2 :Fltl (2-3 v) -Fc

Druhý deleční mutantní konstrukt, označený Mut2:Fltl(2-3 )-Fč, byl získán z Mutl:Fltl(1-3 _B)-Fc konstruktu delecí

Fltl Ig domény 1 kódované nukleotidy 79-393 (viz obr.

10A-10D); přesněji, nukleotidy 73-78 (TCA GGT) byly změněny ná TCC GGA. Tímto se vložilo restrikční místo (BspEl) bez alterace asociované aminokyselinové sekvence, Ser-Gly. Tento DNA konstrukt, který byl připraven za použití standardních technik molekulární biologie- (vizrnapříkiád' Molecular ~ v i Cloning, A Laboratory Mariual (Sambróok etýal. Cold Springý ' Harbor Laboratory), Currerit Protocóls,iri Molecular Biology, ed. Ausubel et al., Greene Publ. Asšoc., Wiley-Intersciěnce, NY) v savčím expresním vektoru'pMT21 (Genetics Institute, lne. Cambridge, MA), byl také verifikován z hlediska sekvence za použití ABI 373A DNA sekveňátoru a Taq Dideoxy Terminátor Cycle Sequencing Kitu (Applied Biosystems, lne., Poster City, CA). Sekvence Mut2:Fltl(2-3 _b)-Fc je uvedena na Obr. 14A-14C.

Příklad 13: Konstrukce mutantního Fltl(1-3)-Fc s delecí označeného jako Mut3:Fltl(2-3 )-Fc

-* B

Třetí deleční mutantní konstrukt, označený Mut3:Fltl (2-3 _B)-Fc, byl získán stejně jako Mut2:Fltl(2-3 )-Fc konstruk, s tou výjimkou, že Fltl Ig doména 3 byla ponechána intaktní (bazický aminokyselinový region nebyl deletován). Konstrukt byl připr technik molekulární biologie a sekvence konečného konstruktu byla verifikována způsobem popsaným výše. Sekvence mut3.

..-· · .« ’ ····

·· ·«·· fltl)2-3)-fc je uvedena na obr. 15A-15C.·

Příklad .14 : Konstrukce mutantního Fit(1-3)-Fc' s N-glykosylací bazického regionu označeného mut4:Fltl{l-3 ^j-Fc

Byl připraven konstrukt, ve kterém bylo N-glykosylační místo vloženo do středu bazického regionu Fltl Ig domény 3. Tento konstrukt byl označen jako mut4:Fltl(1-3_r_^)-Fc a byl připraven změnou nukleotidů 824-825 z GA na AC, což změnilo kódovaný Arg zbytek (AGA) na Asn zbytek (AAC) (viz obr. 10A-10D). Vzniklá aminokyselinová sekvence je tedy změněna z Arg-Ala-Ser na Asn-Ala-Ser, což odpovídá kanonickému signálu (Asn-Xxx-Ser/Thr) pro adici N-glykosylačního místa v Asn zbytku. Sekvence mut4:Fltl(l-3_R_₌__Nj-Fc je uvedena na dbr. 16A-16D. Příklad 15 : Charakterizace .acetýlovaného jFltl (I-BItFc,'

Mutl:Flt(l-3 )-Fc a mut4:Fltl(1-3 )-Fc mutantů b · .. '··· r- ' · .

(a) Vazba na složky mezibuněčné hmoty

Pro stanovení toho, zda tři modifikované proteiny mají více či méně zlepšené farmakokinetické vlastnosti se 96-jamkové plotny potažené Matrigelem (jak jsou popsané výše) inkubovaly s různými koncentracemi mutantních proteinů a detekovaly se protilátkami proti lidskému Fc konjugovanými s alkalickou fosfatasou. Jak je uvedeno na obr. 18, tanto pokus ukázal, že zatímco nemodifikovaný Fltl(l-3)-Fc protein se dobře váže na tyto jamky, Mut3.Fltl(2-3)-Fc protein se váže o něco slaběji, Mutl:Flt(l-3 _b)-Fc se váže ještě slaběji a mut2:Fltl(2-3 )-Fc protein má nějlepší profil a váže se slaběji než jakýkoliv jiný mutantní protein.

mut4:Fltl(1-3_r_^_n)-Fc glykosylační mutantní protein vykazoval • 9 • · « * ···· 9 pouze marginální benefit v Matrigel těstu. Tyto výsledky potvrzují hypotézu, že lineární sekvence pozitivních aminokyselin může být deletována z,primární sekvence, Což vede ke enížení elektrických interakcí se složkami extracelulární hmoty.

(b) Vazba Mutl:Fit(1-3 )-Fc a mut4:Fltl(l-3„ )-Fc v testu

B K·na bázi Biacore

Nemodifikovaný a acetylovaný Fltl (1-3)-Fc proteiny a geneticky modifikovaný Mutl:Fit(1-3 _b)-Fc a mut4:Fltl(l-3^_ )-Fc proteiny byly testovány v testu na bázi Biacore pro hodnocení jejich schopnosti vazby na Fltl ligand, VEGF. V tomto testu se nemodifikovaný Fltl(1-3)-Fc protein (0,25, 0,5 nebo 1,0 ug/ml) imobilizuje na povrchu Biacore čipu (viz Biacore Instruction Manual, Pharmacia, lne., Piscataway, NJ, kde je.uveden standardní, postup). < , a roztok obsahující 0,1 ug/ml VEGF a buď přečištěný, nebo supernatant COS buněk obsahující nemodifikovaný Fltl(1-3)-Fc (v koncentraci 0,25, 0,5 nebo 1,0 ug/ml), přečištěný acetylovaný Fltl(1-3)-Fc (v koncentraci 0,25, 0,5 nebo 1,0 ug/ml), supernatant COS buněk obsahující Mutl:Flt(l-3 _b)-Fc (v koncentraci 0,25, 0,5 nebo 1,0 ug/ml), nebo supernatant COS buněk obsahující mut4:Fltl(1-3 )-Fc (v koncentraci

0,25, 0,5 nebo 1,0 ug/ml), se přelil přes čip potažený Fltl(1-3)-Fc. Jak je uvedeno na obr. 17, v sub-stoichiometrickém poměru (0,25 ug/ml nemodifikovaného, acetylovaného nebo geneticky modifikovaného vzorku vs. 0,1 ug/ml VEGF) není přítomno dostatečné množství Fltl(1-3)-Fc proteinu v roztoku pro blokování vazby VEGF na Fltl(1-3)-Fc imobilizovaný na Biacore čipu. Při 0,5 ug/ml nemodifikovaného, acetylovaného nebo geneticky modifikovaného Fltl(1-3)-Fc proteinu, což je přibližně stoichiometrický • · ···. · ·» poměr 1:1, je patrna zlepšená schopnost blokovat vazbu VEGF na Biacore čip. Při koncentraci 1,0ug/ml nemodifikovaného, acetylovaného nebo geneticky modifikovaného Fltl(1-3)-Fc ' proteinu, což je přibližně stoichiometrický poměr 10:1, jsou Fltl(1-3)-Fc proteiny schopny blokovat vazbu VEGF na Biacore čip, ale nejsou ekvivalentní.Nemodifikovaný, acetylovaný a Mutl:Fit(1-3 )-Fc jsou v podstatě rovnocenné've své schopnosti blokovat vazbu VEGF, zatímco mut4:Fltl(1-3^_^_ν)-Fc je o něco méně účinný v blokování vazby. Tyto výsledky potvrzují hypotézu, že je možné redukovat nespecifickou vazbu molekuly genetickým odstraněním lineární sekvence predominantně negativně nabitých aminokyselin.

(c) Vazba Mutl:Fltl(1-3 _s)-Fc, Mut2:Fltl (2-3 _q)-Fc,

Mut3 : F111 (1- 3 ) - Fc v testu- na bázi ELISA - - - -

Pro stanovení toho, zda še mohou tři mutantní ..proteiny vázat na Fltl ligand VEGF se. provedly vazebné experimenty, ve kterých se 96-jámové plotny potažené VEGF inkubovaly s · různými koncentracemi příslušného mutantního proteinu a po promytí se úroveň vazby detekovala inkubací s protilátkou proti lidskému Fc konjugovanou s alkalickou fosfatasou a kvantifikovala se kolorimetricky přidáním vhodného substrátu pro alkalickou fosfatasu. Jak je uvedeno na obr. 19, pokus ukázal, že v testovaných koncentracích se mohou všechny mutantní proteiny podobně vázat na VEGF.

Příklad 16: Farmakokinetické analýza acetylovaného Fltl(1-3)-Fc, Mutl:Fltl(1-3 _b)-Fc a nemodifikovaného Fltl(1-3)-Fc

Pokusy in vivo byly navrženy pro hodnocení farmakokinetických profilů nemodifikovaného Fltl(1-3)-Fc,

Mutl:Fltl(1-3 )-Fc a při 40-násobného molárního nadbytku acetylovaného Fltl(1-3)-Fc proteinu. Balb/c myším (25-30 g) se podkožní injekcí podaly 4 mg/kg nemodifikovaného Fltl'(l-3) -Fc, při 40-násobném moíarním nadbytku acetylovaného Fltl(l-3)-Fc a Mutl:Fltl(1-3 _q)-Fc proteinu (vždy 4 myši). Myším se odebírala, krev z ocasu 1, 2, 4, 6, 24 hodin, 2 dny, dny á 5 dnů po injekci proteinu. Sérum se testovalo standardním ELISA testem navrženým pro detekci Fltl(1-3)-Fc proteinu/ který zahrnuje potažení ELISA plotny VEGF, vazbu Fltl(1-3)-Fc a detekci anti-Fc protilátkou navázanou na alkalickou fosfatasú. Jak je uvedeno na obr. 20, byly C pro tato činidla následující: nemodifikovaný Fltl(l-3)-Fc 0,15 ug/ml; při 40-násobném molárním nadbytku acetylovaný Fltl(1-3)-Fc - 1,5 ug/ml; a Mutl:Fltl(1-3 ^)-Fc - 0,7 ug/ml.

Příklad 17: Konstrukce vektoru pro modifikovaný Fltl receptor

Konstrukce modifikované verze Fltl receptoru (též známého jako VEGFRl) byla provedena na základě pozorování, že proteinová sekvence Fltl je značně bazická a proto je pravděpodobné, že se bude vázat na extracelulární hmotu (ECM). Vysoce bazický charakter Fltl pravděpodobně vysvětluje to, proč má nemodifikovaný Fltl(1-3)-Fc (popsaný výše) špatné farmakokinetické vlastnosti, které činí obtížným jeho použití jako terapeutického činidla. Jak bylo popsáno výše, chemicky modifikovaná forma při 40-násobném molárním nadbytku acetylovaného Fltl(1-3)-Fc, která je zde označována jako A40, vykazuje značně vylepšenou farmakokinetiku vzhledem k neacetylovanému Fltl(1-3)-Fc. Proto byly provedeny pokusy o přípravu upravených DNA molekul, které mohou být použity pro rekombinantní expresi modifikovaných forem Fltl receptoru, které by měly lepší farmakokinetický profil Á40 a zároveň by si zachovávaly schopnost vazby VEGF.

Z literatury je známo, že první Ug doména Fltl (která má náboj +5 při neutrálním pH) není zásadní pro těsnou vazbu na VEGF,proto je tato doména deletována. Třetí Ig doména (mající náboj +11) není zásadní pro vazbu, ale dodává vyšší afinitu pro VEGF než druhá Ig doména, takže místo úplného deletování byla nahrazena ekvivalentními doménami receptoru příbuzného Fltl, kterým byl Fikl (též známý jako VEGFR2) a Flt4 (též známý jako VEGFR3) . Tyto chimérické molekuly (označené R1R2 (Fltl.D2.FlklD3.Fc Cl(a) a VEGFR1R2-FC- Cl(a) a VEGFR1R3-Fc~ Cl(a), v příslušném pořadí, kde RI a FltlD2 = Ig doména 2 Fltl (VEGFR1) ; R2 a FlklD3 = Ig doména 3 Fikl (VEGFR2); a R3 a VEGFR3D3 = Ig doména 3 Flt4 (VEGFR3)) mají mnohem menší vazbu na ECM, jak bylo potvrzeno in vitro testem vazby na ECM, jak je popsán dále, mělyznačně zlepšenou farmakokinetiku, jak je popsáno dále. Dále, 'tyto, molekuly byly schopny pevně se vázat na VEGF, jak je popsáno dále, a blokovat fosforylaci přirozeného Fikl receptoru exprimovaného v endotelových buňkách, jak je popsáno dále.· (a) Konstrukce expresního plasmidu pFltl.D2.FlklD3.Fc Cl(a) expresní plasmidy pMT21.Fltl(1-3)-Fc (6519 bp) a pMT21.Fltl(1-3)-Fc (5230 bp) jsou plasmidy, které kódují resistenci na ampicilin a Ig domény 1-3 lidského Fltl a lidského Fltl s navázaným Fc, v příslušném pořadí. Tyto plasmidy byly použity pro konstrukci DNA fragmentu skládajícího se z fúze Ig domény 2 Fltl s Ig doménou 3 Fikl, za použití PCR amplifikace příslušných Ig domén, po které následovalo další kolo PCR pro provedení fúze dvou domén do jediného fragmentu. Pro Ig doménu 2 Fltl byly 5' a 3' amplifikační primery následující:

“· ϊ

5':bsp/fltlD2 {5'-GACTAGCAGTCCGGAGGTAGACCTTTCGTAGAGATG-3') ':Fltld2-Flkld3.as (5'-CGGACTCAGAACCACATCTATGATTGTATTGGT-3') / 5' amplifikační primery kóduj i restrikční místo pro. BspEl enzym před Ig doménou 2 Fltl, které je definované aminokyselinovou sekvencí GRPFVEM (odpovídající aminokyselinám 27-33 obr. 21A-21C). 3' primer kóduje reverzní kompiement 3' konce Fltl Ig domény 2 fúzovaný přímo na 5' začátek Fikl Ig domény 3, s fúzí v místě definovaném jako Fltl (odpovídajícím aminokyselinám 123-126 obr. 21A-21C) a pokračujícím do WLS (odpovídajícím aminokyselinám 127-130 obr. 21A-21C) Fikl.

Pro Ig doménu 3 Fikl byly 5' a 3¹.amplifikační primery následující: , ' ·, ; . ^; :ítTm/í/ . / .' ·· </·. ^; .'// -^L ’ ’ ' ' / i.· -',· >·· ' ' :FltlD2-FlklD3 . s ( 5 ' - ACAATCAÍTAGATGTGGTTCTGAGTCCGTCTCATGG-3 ' )

3’:FlklD3/apa/srf.as (5'-GATAATGCCCGGGCCCTTTTCATGGACCCTGACAAATG-3')

5' amplifikační primer kóduje konec Fltl Ig domény 2 fúzovaný přímo na začátek Fikl Ig domény 3, jak bylo popsáno výše. 3' amplifikační primer kóduje konec Fikl Ig domény 3, definovaný aminokyselinami VRVHEK (odpovídajícími aminokyselinám 223-228 obr. 21A-21C), po kterých následuje přemosťující sekvence, která zahrnuje rozpoznávací sekvenci pro restrikční enzym Srfl, a která kóduje aminokyseliny GPG. Přemosťující sekvence odpovídá aminokyselinám 229-231 obr. 21A-21C.

Po kole PCR amplifikace pro produkci jednotlivých domén

• · · · '·'·'· · 9''

99 9 9 9 9 · · · 9 · ·>· se produkty smísily ve zkumavce a podrobily se dalšímu kolu PCr s primery bsp/fltlD2 a FlklD3/apa/srf.as (popsanými výše) za zisku fúzního produktu. Tento PCR produkt byl potom tráven restrikčními enzymy BspEI 'a Smál a získaný 614’bp fragment' byl subklonován do BspEI až Srfl restrikčních míst vektoru pMT2l/ B2Fc, za zisku plasmidu pMT21/FltlD2.FlkD3.Fc. Nukleotidová sekvence FltlD2-FlklD3 genového fúzního insertu byla verifikována standardní analýzou sekvence. Tento plasmid byl potom tráven restrikčními enzymy EcoRI a Srfl a získaný 702 bp fragment byl přenesen do EcoRI až Srfl restrikčních míst plasmidu pFltl(1-3)B2-Fc Cl(a) za zisku plasmidu pFltlD2.FlklD3.Fc Cl (a) . Kompletní DNA á odvožená aminokyselinová sekvence chimérické molekuly Fit1D2.FlklD3.Fc Cl (a) jsou uvedeny na obr. 21A-21C.

(b) Konstrukce expresního plasmidu pFÍtlD2VEGFRD3Fc Cl(a?

Expresní plasmid pMT21.Fltl(1-3)-Fc (6519 bp) je plasmid, který kóduje resistenci na,ampiciíin a Ig domény 1-3 lidského Fltl receptoru s navázaným Fc. Tento plasmid byl použit pro konstrukci DNA fragmentu obsahujícího Ig doménu 2 Fltl za použití PCR. RNA z buněčné linie HEL921.7 byla použita pro produkci Ig domény 3 Fikl, za použití standardní PCR. Další kolo PCR amplifikace bylo použito pro provedení fúze dvou Ig domén do jediného fragmentu. Pro Ig doménu 2 Fltl byly 5' a 3' amplifikační primery následující:

5':bsp/fltlD2 (5'-GACTAGCAGTCCGGAGGTAGACCTTTCGTAGAGATG-3')

3':FltlD2,VEGFR3D3.as (5'-TTCCTGGGCAAGAGCTGGATATCTATGATTGTATTGGT)

Λ i ’·

5’ amplifikační primer kóduje restrikční místo pro BspEI

9 9 · · · ··*··· 9 9 • 9> 9 · « J ‘9 „ 9 · 9 9 co ··· ·· · · · * —Z —J 9 9999-99 9-9 9 9 9 9

9 9 9 9. 9 9 9 •999 » 99 9 99 9999 enzym před Ig doménou 2 Fltl, které je definované · aminokyselinovou sekvencí GRPFVEM (odpovídající . aminokyselinám 27-33 obr. 21Á-21Č). 3' primer kóduje reverzní komplement'konce Fltl Ig domény 2 fúzovaný přímo ná 5''“ý začátek VEGFR3 Ig domény 3, s fúzí v místě definovaném jako TIID Fltl (odpovídajícím aminokyselinám 123-126 obr.

22A-22C) a pokračujícím do IQLL VEGFR3 (odpovídajícím aminokyselinám 127-130 obr. 22A-22C).

Pro Ig doménu 3 VEGFR3 byly 5’ a 3’ amplifikační primery následující:

5' :R3D3.s (5' -ATCCAGCTGTTGCCCAGGAAGTCGCTGGAGCTGCTGGTA)

- 3':R3D3.as (5'-ATTTTCATGCACAATGACCTCGGTGCTCTCCCGAAATCG)

5' a 3' amplifikační primery odpovídají’sekvenci VEGFR3. 296 bp produkt amplifikace této RT-PCR reakce byl izolován standardními technikami a byl zpracován - druhým kolem PCR.pro přidání vhodných sekvencí pro umožnění fúze FltlD2 s FlklD3 doménami a fúze FlklD3 a Fc domén prostřednictvím GPC můstku (viz dále). Amplifikační primery byly následující:

5': FltlD2.VÉGFR3D3.as (TCATAGATATCCAGCTGTTGCCCAGGAAGTCGCTGGAG)

3': VEGFR3D3/srf.as (GATAATGCCCGGGCCATTTTCATGCACAATGACCTCGGT)

5' amplifikační primer kóduje 3' konec Fltl Ig domény 2 fúzovaný přímo na začátek (5' konec) VEGFR3 Ig domény 3, jak bylo popsáno výše. 3' amplifikační primer kóduje 3' konec VEGFR3 Ig domény 3, definovaný aminokyselinami VIVHEN

Κι ·'·£ ··. . · ' ·· ·»♦· . ·· ·· 54 i · » : i .· ; : · ♦ ·· ,'····/» · ·' · · · · · -i '·,·,♦ ·;·«.' * ·».· ····’, ♦' «· · , ·· ···· (odpovídajícími aminokyselinám 221-226 obr. 22A-221C), po kterých následuje přemosťující sekvence, která zahrnuje rozpoznávací sekvenci pro restrikční enzym Srfl, a která * kóduje-aminokyseliny GPG. Přemosťující-sekvence odpovídá aminokyselinám 227-229 obr . 22A--22C’.'J i

Po jednom kole (pro Fltl Ig doménu 2) nebo dvou kolech (pro Flt4 Ig doménu. 3) PCR amplifikacě pro produkci jednotlivých Ig domén se produkty PCR smísily ve zkumavce a podrobily se dalšímu kolu PCR amplifikaces amplifikačními primery bsp/fltlD2 a VEGFR3D3/srf.as (popsanými výše) za 'zisku fúzního produktu.-Tento PCR produkt byl-potom tráven restrikčními enzymy BspEI a Smál a získaný 625 bp fragment byl subklonován do BspEI až Srfl restrikčních míst vektoru pMT21/Fltl B2.Fc (popsaného výše), za zisku plasmidu pMT21/FltlD2.VEGFR3D3.FC. Nukleotidové sekvence *

FltlD2-VEFR3D3 genového fúzního insertu byla verifikována standardní analýzou sekvence. Tento plasmid byl potom' tráven restrikčními enzymy EcoRI a Srfl a získahý 693 bp fragment byl subklonován do EcoRI až Srfl restrikčních míst plasmidu pFltl(1-3) B2-FC Cl(a) za zisku plasmidu pFltlD2.VEGFR3D3.Fc Cl(a). Kompletní DNA a odvozená aminokyselinová sekvence chimérické molekuly FltlD2.VEGFR3D3.Fc Cl(a) jsou uvedeny na obr. 22A-22C.

Příklad 18: Test vazby na mezibuněčnou hmotu (ECM)

Plotny potažené ECM (Becton Dickinson katalogové č. 35-4607) byly rehydratovány teplým DME doplněným glutaminem (2 mM), 100 U penicilinu, 100 U streptomycinu a 10% BCS po dobu alespoň 1 hodiny před přidáním vzorků. Plotny se potom inkubovaly po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti s různými koncentracemi FltlD2.FlklD3.Fc Cl(a) a FltlD2.VEGFR3D3.Fc

Cl(a) s první hodnotou 10 nM a potom s 2-násobným ředěním v PBs plus 10% BCS. Plotny se potom promýly 3-krát .PBS plus 0,1% Triton-X a inkubovaly se s protilátkou proti lidskému Fc konjugovanou s alkalickou fosfatasou (Promega,*1: 4000 v PBS plus*10% BCS) po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti. Plotny se potom promyly 4-krát PBS s 0,1% Triton-X a přidal se pufr pro alkalickou fosfatasu/pNPP roztok (Sigma) pro vývoj zbarvení. Plotny se odečítaly při I = 405-507 nm. Výsledky tohoto pokusu jsou uvedeny na obr. 23 a demonstrují, že FltlD2.FlklD3.Fc Cl(a) a FltlD2.VEGFR3D3.FcCl(a) proteiny se významně méně váží na ECM ve srovnání s Fltl(1-3)-Fc proteinem.

-Příklad 19: Dočasná exprese FltlD2 .FlklD3 . Fc Cl (a) v CHO-K1 (E1A) buňkách ' '______________' '

Velkoobjemová (2 1) kultura'E.coli DHIOB nesoucích pFltlD2.FlklD3.Fc Cl(a) plasmid'popsaný výše v příkladu 17(a) se kultivovala přes noc v Terrific Broth ’(TB) plus·. 100 ug/ml ampicilinu. Další den se plasmidová DNA extrahovala za použití QIAgen Endofree Megaprep kitu podle návodu výrobce. Koncentrace přečištěné plasmidové DNA se určila standardními technikami za použití UV spektrofotometru a fluorometru. Plasmidová DNA se verifikovala standardním trávením podílů restrikčními enzymy za použití restrikčních enzymů EcoRI plus Notl a Asel. Všechny fragmenty získané trávením restrikčními enzymy měly předpokládanou velikost při analýze na 1% agarosovém gelu.

Ve 14 15 cm Petriho miskách se kultivovaly CHO-K1/E1A buňky v hustotě 4 x 10⁶ buněk/plotnu. Kultivačním mediem bylo Gibco Ham's F-12 doplněné 10% Hyclone fetálním hovězím sérem (FBS), 100 U penicilinu/100U streptomycinu a glutaminem (2 / 56

· · · · • .· · • · · · « · *··* ·· · · * ♦ · • ·. · • · ·.

• ····· mM) .' Následující den byla každá plotna buněk transfektována 6 ug pFltlD2.FlklD3 . Fc Cl (a) plasmidové ‘EŇA za použití Gibco Optimema Gibco Lipofectamine v objemu 12 ml, podle návodu'

- výrobcev-4-hodiny-po -př-i-dání transfékěí-směsi. -k-'buňkám se ··—^· přidalo 12 ml/plotnu Optimem doplněného 10% FBS. Plotny se inkubovaly při teplotě 37 °C v inkubátoru s 5%. CO₂ přes noc. Následující/den se z každé plotny odstranilo medium a přidalo se 25 úl expresního media (Gibco CHO-S-SFM-II doplněné glutaminem (2 mM) a 1 mM natrium-butyrátem) . Plotny se inkubovaly při teplotě 37 °C po dobu 3 dnů. Po 3 dnech inkubace se z každé plotny aspirovalo medium, které se odstředilo při 400 rpm v-odstředivce s houpající se komorou za účelem peletování buněk. Supernatant se dekantoval do sterilních 1 litrových baněk a přečištění exprimovaného proteinu se provedlo způsobem popsaným dále. j__ · -·'/ ; . · r . ýv '

Příklad 20: Konstrukce pVEGFElR2-Fc ’Cl(a) expresního vektoru ' ^; Ϊ ž ' '

·. * · ’ „v s » .* ''

Expresní plasmid pVEGFRlR2-Fc Cl (á)/byl 'konstruován, insercí DNA kódující aminokyseliny SDT (odpovídající aminokyselinám 27-29 na obr. 24A-24Č) mezi Fltld2-Flkld3-Fc Cl(a) aminokyseliny 26 a 27 podle obr. 21A-21C (GG) a odstraněním DNA kódující aminokyseliny GPG odpovídající aminokyselinám 229-231 obr. SDT aminokyselinová sekvence je přirozená pro Fltl receptor a byla vrácena pro snížení pravděpodobnosti heterogenního N-koncového zpracování. GPG (přemosťující sekvence) byla odstraněna, takže Fltl a Fikl Ig domény byly fúzovány přímo jedna na druhou. Kompletní DNA a odvozená aminokyselinová sekvence pVEGFRlR2-Fc Cl(a) chimérické molekuly jsou uvedeny na obr. 24A-24C.

Příklad 21: Kultivace buněk použitá pro produkci modifikovaných Fltl receptorů ·· > · * ř . . ’

«··' -4 · 4 · 4 4 4' 44 • . « /«' ·', 4 ;'4 4 . 4· (a) Kultivace buněk použitá pro produkci

FltlD2.FlklD3.Fc Cl(a)

Proces pro produkci FltlD2.FlklD3.Fc Cl(a) proteinu za použití expresního plasmidu pFltlD2.FlklD3.Fc Cl(a) popsaného výše v příkladu 1 zahrnoval suspenzní kultivaci rekombinántních ovariálních buněk čínského křečka (CHO-K1/E1A), které konstitutivně exprimují proteinový produkt. Buňky se kultivovaly v bioreaktorech a proteinový produkt se izoloval a přečistil afinitní chromatografií a chromatografií s vylučováním podle velikosti. Proces je podrobně popsán dále.

Expanze buněk ___________ . ______________________-· - Dvě konfluentní T-225 cm² zkumavky obsahující-'buněčnou linii exprimující FltlD2.FlklD3.Fc Cl(a) se expandovaly pasážováním buněk do 8- T-225 cm² zkumavek, v mě<3in (GMEM + 10% sérum, GIBCO) a inkubovánímpři 37 °C a5% CO₂. Když bylo dosaženo požadované konfluence (přibližně za 3 až 4 dny), tak se buňky řozvolnily za použití trypsinu. Čerstvé medium se přidalo pro chránění buněk před dalším působením trypsinu. Buňky se odstředily a resuspendovaly se v čerstvém mediu a potom se přenesly do 8 850 cm² válcových zkumavek a inkubovaly še při 37 °C a 5% CO do dosažení konfluence.

Suspenzní kultura v bioreaktorech

Buňky kultivované ve válcovitých zkumavkách se trypsinizovaly pro uvolnění od povrchu a promyly se suspenzí kultivačního media. Buňky se asepticky přenesly do 5 1 bioreaktru (New Brunswick Celligen Plus), kde se kultivovaly ve 3,5 litrové suspenzní kultuře. Suspenzním kultivačním mediem bylo bezglutaminové IS-CHo s nízkým obsahem glukosy (Irvine Scientific), do kterého se přidalo 5% 'fetáini-hovězí sérum- (Hyclone), · GS- doplněk—(Life ' —

Technologies) a 25 uMmethionin sulfoximinu (Sigma). pH se udržovalo na 7,2 pomocí přidávání oxidu uhličitého do dodávaného plynu nebo přidáním kapalného roztoku uhličitanu sodného do bioreaktoru. Koncentrace rozpuštěného kyslíku se udržovala na 30% saturace pomocí přidávání kyslíku nebo dusíku do dodávaného plynu a.teplota se udržovala na 37 °C. Když bylo dosaženo hustoty buněk 4 x 10^s buněk/ml, tak se buňky přenesly do 40 1 bioreaktoru obsahujícího stejné medium a stejné nastavení hodnot. Teplota byla snížena na 34 °C pro zpomalení růstu a zvýšení relativní rychlosti exprese proteinu. . __. ~____ ~ (b) Kultivace buněk použitá pro produkci FltlD2.VEGFR3D3.Fc Cl (a) . Á

Stejný postup jako je postup popsaný výše pro FltlD2,FlklD3.Fc Cl(a) se použil pro produkci FltlD2.VEGFR3D3.Fc Cl(a).

Příklad 22: Odběr a přečištění modifikovaných Fltl receptorů (a) Odběr a přečištění FltlD2.FlklD3.Fc Cl(a)

Proteinový produkt byl asepticky odebírán z bioreaktoru za zachycování buněk za použití Millipore Prostec filtračních modulů s tangenciálním tokem a mechanické pumpy s nízkým střihem (Fristam) . Čerstvé medium se přidalo do bioreaktoru pro nahrazení media odstraněného při filtraci. Přibližně 40 1 získaného filtrátu se potom vneslo do 400 ml kolony ·«·♦ obsahující Protein A Sepharose pryskyřici. (Amersham

Pharmacia). Po vložení se pryskyřice promyla pufrem obsahujícím 10 mM fosforečnan sodný, 500 mM chlorid sodný, pH 7,2, pro odstranění j akýchkoíiv’nenavázaných kontaminujících proteinů. FltlD2.FlklD3.Fc Cl(a) protein se eluoval citrátovým pufrem s pH 3,0. Eluovaný protein se neutralizoval přidáním Tris baze a zmrazil se při -20 °C.

Několik zmrazených šarží FltlD2.FlklD3.Fc Cl(a) proteinu z kroku s Proteinem A se rozmrazilo, smísilo a zahustilo za použití Millipore filtrační membrány s tangenciálním tokem s limitem molekulové hmotnosti (NMWČO) 30 kD. Protein se přenesl do zařízení pro zahuštění buněk (Millipore) a dále se zahustil na 30 mg/ml za použití 30 kD NMWCO membrány. Zahuštěný protein se vnesl--4o-kol.ony_.s_.vylučováním podle _ velikosti částic naplněné Superdex 200 pryskyřicí (Amersham Pharmacia), která byla uvedena ,dó rovnováhy fosfátem ~ pufrovaným salinickým roztokem plus 5% glycerolem. Stejný pufr byl použit pro eluci kolony. Frakce odpovídající FltlD2.FlklD3. Fc Cl (a) dimeru se smísily, sterilně sě přefiltrovaly přes 0,22 mikronový filtr, rozdělily se do podílů a zmrazily se.

(b) Odběr a přečištění FltlD2.VEGFR3D3.Fc Cl(a)

Stejný postup jako je postup popsaný výše pro FltlD2.FlklD3.Fc Cl(a) se použil pro odběr a přečištění FltlD2.VEGFR3D3.Fc Cl(a).

Příklad 23: Fosforylační test pro dočasně exprimovaný VEGFR2 . . Primární lidské endotelové buňky pupečníkové žíly (HUVEC), pasáž 4-6, se nechaly po dobu 2 hodin v bezsérovém DME mediu ·· »··« • ^Ťí-· . · ‘ «-’·'· . 4 • ···:··- · • · ·· · · · .

• · · · • · · · > ’· .- ·· s vysokou koncentrací glukosy. Připravily.se vzorky, obsahující 40 ng/ml (1 nM) lidského VEGF165, což je ligand . pro VEGF receptory Fltl, Fikl a Flt4(VEGFR3), a tyto vzorky se preikubovaly po dobu 1 hodiny při ^epl’ótě’místhósti’s ” různými množstvími Fltl receptorů Fltl(1-3)-Fc, Fltl(1-3)-Fc (A40), FltlD2FlklD3.Fc Cl(a) a FltlD2VEGFR3D3.Fc Cl(a) v bezsérovém DME s vysokou koncentrací glukosy obsahujícím 0,1% BSA. Buňky se na dobu 5 minut vystavily působení vzorků připravených výše +/- VEGF165 a potom se provedla kompletní lýza buněk za použití pufru pro kompletní lýzu buněk. Buněčné lyzáty se imunoprecipitovaly protilátkou namířenou proti C-konci VEGFR2 receptoru. Imunoprecipitovaně lyzáty se vnesly na 4-12% SDS-PAGE Novex gel a potom se přenesly na PVDF membránu za použití standardní techniky. Detekce.

fosforylovaného VEGFR2 byla provedena iraunopřenosem s anti-fosfo-tyrosin mAb označenou 4G10 (UBI). a vývoj se provedl za použití ECL-činidla- (Aňaersham) . -Obr. 25A-25C a 26A-26B ukazují výsledky tohoto pokusu. Obr. 25A-25C ukazují; že detekce westernovým přenosem, VEGFR2ÍFikl) s fosforylovaným tyrosinem pomocí stimulace VEGF16 ligandem ukazuje, že povrchové buněčné receptory jsou fosforylované v různé míře podle toho, který modifikovaný Fltl receptor je použit během preinkubace s VEGF. Jak je vidět na obr. 25A, při 1,5 násobném molárním nadbytku buď Fltl(1-3)-Fc, nebo Fltl(l-3)-Fc (A40) nebo dočasného FltlD2FlklD3.Fc Cl(a) je přítomna kompletní blokáda stimulace receptoru těmito třemi modifikovanými Fltl receptory ve srovnání s působením kontrolního media. Naopak, dočasný FltlD2VEGFR3D3.Fc Cl(a) nevykazuje při tomto molárním nadbytku žádnou významnou blokádu, ve srovnání s pozitivní kontrolou, kterou je VEGF. Podobné výsledky jsou vidět na obr. 25B, kde jsou modifikované Fit receptory ve 3-násobném molárním nadbytku vzhledem k VEGF165 ligandu. Na obr. 25C, kde jsou :5

.. ;5 V : ' i ' '·· .···· modifikované·Fltl receptory v 6-násobném molárním nadbytku vzhledem k VEGF165 ligandu/ blokuje FltlD2VEGFR3D3.Fc Cl(a) částečně stimulaci buněčných povrchových receptoru indukovanou VEGF165. * , ..........

Na obr. 26A-26B ukazuje detekce westernovým přenosem VEGFR2(Flkl) fosforylováného na tyrosinu v důsledku stimulace VEGF165 ligandem, že buněčné povrchové receptory nejsou stimulované vzorky, které mají VEGF165 preinkubovaný s 1 a 2-násobným molárním nadbytkem (obr. 26A) nebo 3 a 4-násobným molárním nadbytkem (obr. 26B) dočasného FltlD2FlklD3.Fc Cl(a), stabilního FltlD2FlklD3.Fc Cl(a) nebo dočasného VEGFR1R2-Fc Cl(a). Při všech testovaných koncentracích modifikovaného Fltl receptoru byla pozorována kompletní vazba VEGF165 ligandu během preinkubace, což vedlo k------nedetekovatelné stimulaci buněčných povrchových receptoru pomocí nenavázaného VEGF165 ve srovnání s působením , kontrolního media. · ’ .

Příklad 24: Test buněčné proliferace

Pro testování buněčné populace byly MG87 buňky stabilně transfektovány expresním plasmidem obsahujícím DNA insert kódující extracelulární doménu VEGFR2(Flkl) fúzovanou na TrkB intracelulární kinasovou doménu, za zisku chimérické molekuly. Důvodem použití TrkB intracelulární kinasové domény místo přirozené VEGFR2(Flkl) intracelulární kinasové domény bylo to, že intracelulární kinasová doména VEGFR2(Fikl) nezpůsobuje silnou proliferační odpověď těchto buněk po stimulaci VEGF165. Je známo, že MG87 buňky obsahující kompletní TrkB receptor mají silnou proliferativní odpověď po stimulaci BDNF, a proto byla Trkb intracelulární kinasová doména použita pro nahrazení intracelulární kinasové domény ·« ·

VEGFR2(Fikl) za účelem získání výhody této proliferační reakce. ' · x 10³ buněk se umístilo do 96-jamkové plotny a buňky se nechaly usadit během 2 hodin při 37 °C. Následující modifikované Fit receptory, Fltl(1-3)-Fc, FltlD2.FlklD3.Fc Cl(a) a FltlD2.VEGFR3D3.Fc Cl(a), a irelevantní receptor Tie2-Fc jako negativní kontrola, se titrovaly od 40 nM do 20 pM a inkubovaly se s buňkami po dobu 1 hodiny při teplotě 37 °C. Lidský rekombinantní VEGF165 v definovaném mediu se potom přidal do všech jamek v koncentraci 1,56 nM. Plotny se inkubovaly po dobu 72 hodin při teplotě 37 °C a potom se přidalo MTS (Owenovo činidlo, Promega) a plotny se inkubovaly po dobu dalších 4 hodin. Nakonec se plotny odečítaly na spektrofotometru při 450/570 nm.-Výsledky tohoto pokusu-g sou uvedeny na obr. 27. Kontrolní receptor Tie2-Fc neblokuje proliferaci buněk indukovanou VEGF165.- v žádné koncentraci, zatímco FltlD2.FlklD3.Fc Cl(a)· blokuje proliferaci při 1,56 nM VEGF165 s polovinou maximální dávky rovnou 0,8 nM.' , Fltl(1-3)-Fc a FltlD2.VEGFR3D3.Fc Cl(a) jsou méně účinné v . blokování VEGF165 v tomto testu, s polovinou maximální dávky rovnou přibližně 2 nM. VEGF165 sám o sobě vede k dosažená absorbance 1,2 jednotek a pozadí je 0,38 absorbančních j ednotek.

Příklad 25: Vazebná stoichiometrie modifikovaných Fit receptorů pro VEGF165 (a) Biacore analýza

Stoichiometrie FltlD2.FlklD3.Fc Cl(a) a VEGFR1R2-Fc Cl(a) interakcí s lidským VEGF165 se určila měřením buď úrovně saturačni vazby VEGF na FltlD2.FlklD3.Fc Cl(a) nebo ·· · ·« ··©· • · · ·« · « i • *·♦· · · · • · · · ··«· ·

VEGFR1R2-FC Cl(a) povrchy nebo měření koncentrace VEGF165 nutné pro kompletní blokování vazný FltlD2.FlklD3.Fc Cl(a) . nebo VEGFR1R2-FC Cl(a) na povrch VEFG BIAcore čipu.

Modifikované Fit receptory FltlD2.FlklD3.Fc Cl(a) a VEGFR1R2-FC Cl(a) byly zachyceny pomocí protilátky specifické pro Fc, která byla nejprve zmobilizována na Biacore čipu (BIACORE) za použití aminových kopulačních činidel. Povrch bez protilátky byl použit jako negativní kontrola. VEGF165 byl injikován v koncentraci 1 nM, 10 nM a 50 nM na

FltlD2.FlklTD3.Fc Cl (a) a VEGFR1R2-Fc Cl (a) povrchy v dávce 10 ul/min po dobu jedné hodiny. Vazebný signál v reálném čase byl měřen a na konci každé injekce byla dosažena saturační vazba. Vazebná stoichiometrie byla vypočtena jako molární poměr navázaného VEGF165 k zmobilizovanému^FltlD2 . FlklD3 . Fc Cl(a) nebo VEGFR1R2-FC Cl(a), za použití konverzního faktoru 1000 RU ekvivalentních 1 ng/ml. Výsledky ukazují na vazebnou stoichiometrii jedné VEGF165 dimérní molekuly na jednu molekulu FltlD2.FlklD3.Fc Cl(a) nebo VEGFR1R2-Fc Cl(a) (obr. 28) .

V roztoku se FltlD2.FlklD3.Fc Cl(a) nebo VEGFR1R2-FC Cl(a) v koncentraci 1 nM (což je koncentrace předpokládané 1000-krát vyšší než KD FltlD2.FlklD3.Fc Cl(a) nebo VEGFR1R2-Fc Cl(a)/VEGF165 interakce) smísily s různými koncentracemi VEGF165. Po jedné hodině inkubace se volný FltlD2.FlklD3.Fc Cl(a) v roztoku stanovil jako vazebný signál na VEGF165-aminovém povrchu. Kalibrační křivka se použila pro konverzi FltlD2.FlklD3.Fc Cl(a) BIAcore vazebného signálu na jeho molární koncentraci. Data ukazují, že přidání 1 nM VEGF165 do roztoku FltlD2.FlklD3.Fc Cl(a) zcela blokují vazbu FltlD2.FlklD3.Fc Cl(a) na VEGF165 povrch. Tento výsledek ukazuje na vazebnou stoichiometrii jedné VEGF165 molekuly na *? · ·· • · 4 ♦ 9 «99 9 . · ·»9» « · > · • 9 9 9 9 ···< 9 . 94 , · • 99<

·· ··«· jednu molekulu FltlD2.FlklD3.FcCl(a) (obr. 29 a obr. 30>. Když se koncentrace FltlD2.FlklD3.Fc Cl(a) vnesla'do grafu jako funkce přidané koncentrace VEGF165, tak byl.sklon lineární části -1,06 pro FltlD2.FÍklĎ3.Fc CiXá) á~-T,07 pro VEGFR1R2-FC Cl(a) . Velikost skionu, velmi blízká minus jedné, ukazovala na vazbu jedné molekuly VEGF165 na jednu molekulu bud FltlD2.FlklD3.Fc Cl(a), nebo VEGFR1R2-FC Cl(a).

(b) Chromatografie s vylučováním podle velikosti částic

FltlD2.FlklD3.Fc Cl(a) se smísil s 3-násobným nadbytkem VEGfl65 a komplex ligand-receptor se přečistil za použití Pharmacia Superose 6 chromatografické kolony s vylučováním podle velikosti částic. Komplex ligand-receptor se potom inkuboval v pufru obsahuj ící m—6M guanidinium.hydro-Chlp.rid pro disociaci do jednotlivých proteinových složek.

FltlD2.FlklD3.Fc Cl(a) se separoval od VEGF165 za použití Superose 6 chromatografické kolony s vylučováním podle velikosti částic eluoyaňé 6M guanidinium chloridem. Pro určení stoichiometrie komplexu se provedlo několi injekcí FltlD2.FlklD3.Fc Cl(a) a VEGF165 a výška píku nebo integrovaná intenzita píku se vnesla do grafu jako funkce koncentrace injikovaného proteinu. Kalibrace se provedla za podmínek identických podmínkám použitým pro separování složek komplexu FltlD2.FlklD3.Fc Cl(a)/VEGF. Kvantifikace složení komplexu FltlD2.FlklD3.Fc Cl(a)/VEGF se provedla podle kalibračních křivek. Výsledky tohoto pokusu jsou uvedeny na obr. 28, který ukazuje, že poměr VEGF165 k FltlD2.FlklD3.Fc Cl(a) v komplexu je 1:1.

Příklad 26: Určení vazebné stoichiometrie komplexu FltlD2.FlklD3.Fc Cl(a)/VEGF165 pomocí chromatografie s vylučováním podle velikosti částic · · ·· · ·'· • * · · ♦ 9 9 9 9 9 9 • ······ ·« • · · · ·

9999 9 99 «

9999

Příprava komplexu FltlD2.FlklD3.Fc Cl(a)/VEGF165

VEGF165 (koncentrace =3,61 mg/mlj 'se smísil s-CHO buňkami dočasně exprimujícími FltlD2.FlklD3.Fc Cl(a) (koncentrace = 0,9 mg/ml) v molárním poměru 3:1 (VEGF165:FltlD2.FlklD3. Fc Cl(a)) a provedla se inkubace přes noc při teplotě 4 °C.

(a) Chromatografie s vylučováním podle velikosti částic (SEC) za nativních podmínek

Pro separování komplexu od nadbytku nenavázaného VEGF165 se 50 ul komplexu vneslo do Pharmacia Superose 12 PC 3.2/30 kolony, která se uvedla do rovnováhy v PBS pufru. Vzorek se eluoval steinvm^pufrem při^průtoku 40 ul/min. při teplotě místnosti. Výsledky této SEC jsou uvedeny na obr.', 31. Pík 1 představuje komplex a pík^: 2'představuje~nenavázaný-.,-VEGFÍ65 . Frakce eluované mezi 1,1 a.1,2 ml se smísily a guanidinium chlorid (GuHCl) se přidal v konečnékoncentraci 4,5/M pro disociování komplexu.

(b) Chromatografie s vylučováním podle velikosti částic (SEC) za disociačních podmínek

Pro separování složek komplexu receptor-ligand a pro určení jejich molárního poměru se 50 ul disociovaného komplexu popsaného výše vneslo do Pharmacia Superose 12 PC 3.2/30 kolony, která se uvedla do rovnováhy pomocí 6M GuHCl a eluovala se stejným roztokem při průtoku 40 ul/min. při teplotě místnosti. Výsledky této SEC jsou uvedeny na obr. 32. Pík 1 představuje FltlD2.FlklD3.Fc Cl(a) a pík 2 představuje VEGF165.

(c) Výpočet stoichiometrie komplexu FltlD2.FlklD3.Fc

Cl (a)/VEGF165

Stoichiometrie komplexu receptor-ligand se určila z plochy 'píku^nebo výšky píku složek’.’ koncentrace VEGFÍ65'nebo FltlD2.FlklD3.Fc Cl(a) odpovídající výšce píku nebo ploše píku,* v příslušném pořadí, se získaly ze standardních křivek pro VEGF165 a FltlD2.FlklD3.Fc Cl(a). Pro získání standardní křivky se 4 různé koncentrace (0,04 mg/ml - 0,3 mg/ml) jedné ze složek injikovaly do Pharmacia Superose 12 PC 3.2/30 kolony, která se uvedla do rovnováhy pomocí 6M GuHCl a eluovala se stejným roztokem při průtoku 40 ul/min. při teplotě místnosti. Standardní křivka se získala sestrojením grafu plocha píku nebo výška píku vs koncentrace proteinu.. Molární poměr VEGF165:FltlD2.FlklD3.Fc Cl(a)_;určený z výsky píku složek byl -1,10 . _____u=_.:-·-------- -----.___________

Příklad 27:Určení vazebné stoichiométrie komplexu

FltlD2.FlklD3.Fc Cl(a)/VEGF165 pomocí chromatografie s. vylučováním podle velikosti částic s on-line detektorem rozptylu světla

Příprava komplexu

VEGF165 se smísil s CHO buňkami dočasně exprimujícími FltlD2.FlklD3.Fc Cl(a) v molárním poměru 3:1 (VEGF165:FltlD2.FlklD3.Fc Cl(a)) a provedla se inkubace přes noc při teplotě 4 °C.

(a) Chromatografie s vylučováním podle velikosti částic (SEC) s on-line detektorem rozptylu světla

Chromatografická kolona s vylučováním podle velikosti částic š Mini-Dawn on-line. detektorem rozptylu světla (Wyatt Technology, Santa Barbara;‘California) a„ detektory indexu · ·

99999

9999 9 99 lomu (RI) (Shimadzu, Kyoto, Japan) se použila pro stanovení molekulové hmotnosti (MW) komplexu receptor-ligand. Vzorky se injikovaly do Superose 12 HR 10/30 kolony, která se uvedla do 'rovnováhy v PBS pufru, á eluóyálýsě stejhým“půfřem při průtoku 0,5 ml/min. při teplotě místnosti. Jak je uvedeno na obr. 33, vykazoval eluční profil dva píky. Pík 1 představuje komplex ligand-receptor a pík 2 představuje nenavázaný VEGF165. Mol. hmot. byla vypočtena z LS a RI signálů. Stejný postup se použil pro stanovení mol. hmot. jednotlivých složek komplexu ligand-receptor. Výsledky těchto měření jsou následující: mol. hmot. komplexu FltlD2.FlklD3.Fc

Cl(a)/VEGF165 v píkové pozici je 157300 (obr. 33), mol. hmot. VEGF165 v píkové pozici je 44390 (obr. 34) a mol. hmot. R1R2 v píku je 113300 (obr . 35).

Tato data ukazují, že stoichiometriekomplexuFltlD2.FlklD3.Fc Cl (a)/VEGF je 1:1;/protože to odpovídá součtu molekulových hmotností pro FltlD2.FlklD3.Fc Cl(a) a VEGf165. Důležité je to, že tato metoda ověřila, že komplex FltlD2.FlklD3.Fc Cl(a)/VEGF165 se skládá z pouze jedné molekuly VEGF165 ligandu a pouze jedné molekuly FltlD2.FlklD3.Fc Cl(a).

Příklad 28: Peptidové mapování FltlD2.FlklD3.Fc Cl(a)

Disulfidové struktury a glykosylační místa v FltlD2.FlklD3.Fc Cl(a) se určily metodou peptidového mapování. V této metodě se protein nejprve štěpil trypsinem. Získané fragmenty se analyzovaly a identifikovaly HPLC společně s hmotnostní spektrometrií, a dále také technikou N-terminálního sekvenování. Redukce trávení trypsinem se použila pro identifikaci fragmentů obsahujících disulfidové vazby. Zpracování produktů trávení trypsinem PNGasou (Glyko,

• · · · · »··

Novato, CA) se použilo pro identifikaci fragmentů s '

N-vázanými glykosylačními místy. Výsledky jsou shrnuty na obr.36.

V FltlD2.FlklD3.Fc Cl(a) existuje celkem 10 cysteinů; 6 z nich je přítomno v Fc regionu. Bylo potvrzeno, že Cys27 je disulfidově vázán na Cys76. Bylo potvrzeno, že Cysl21 je disulfidově vázán na Cysl82. První dva cysteiny v Fc regionu (Cys211 a Cys214) tvoří intermolekulovou dísulfidovou vazbu se stejnými dvěma cysteiny v jiném Fc řetězci. Nicméně, protože tyto dva cysteiny nemohou být od sebe enzymově separovány, nemůže být určeno', zda existuje di sulfidová vazba mezi stejnými cysteiny (například Cys2ll-Cys2Tl), nebo mezi Cys2ll a Cys2l4. Bylo potvrzeno, že Cys216 je disulfidově vázán na Cys306. Bylo potvrzeno, že Cys352 je disulfidově vázán na Cys410. · . >

V FltlD2.FlklD3.Fc Cl(a) existuje 5 potenciálních N-glykosylačních míst. Všech 5 míst je v různém rozsahu glykosylováno. Kompletní glykosylace byla zjištěna na Asn33 (aminokyselinová sekvence NIT), Asnl93 (aminokyselinová sekvence NST), a Asn282 (aminokyselinová sekvence NST). Dále byla zjištěna částečná glykosylace na Asn65 a Asnl20. Místa glykosylace jsou podtržená na obr. 36.

Příklad 29: Farmakokinetická analýza modifikovaných Fit receptorů (a) Farmakokinetická analýza Fltl(1-3)-Fc (A40),

FltlD2.FlklD3.Fc Cl(a) a VEGFR1R2-FC Cl(a)

Balb/c myším (25-30 g) se podkožní injekcí podaly 4 mg/kg Fltl(1-3)-Fc(A40), CHO dočasně exprimujících FltlD2.FlklD3.Fc

Cl(a), CHO stabilně exprimujících FltlD2.FlklD3.Fc Cl(a) a CHo dočasně exprimujících VEGFR1R2-FC Cl(a). Myším se odebírala krev z ocasu 1, 2, 4, 6, 24 hodin, 2 dny, 3 dny a 6 ’dnů. pó‘injekci/ Sérum se testovalo 'v'ELISA: navrženém pro detekci Fltl (1-3)-Fc (A40), FltlD2-.FlklD3.Fc Cl (a) nebo VEGFR1R2-FC Cl(a). ELISA test zahrnuje potažení ELISA plotny VEGF165, vazbu Fltl{l-3)-Fc (A40) , FltlD2.FlklD3.Fc Cl(a) nebo VEGFR1R2-Fc Cl(a) a zobrazení anti-Fc protilátkou navázanou na křenovou peroxidasu. Výsledky tohoto pokusu jsou uvedeny na obr. 37 . 17^^ pro Fltl (1-3)-Fc (A40) byl 6 hodin, zatímco T pro dočasně a stabilně exprimovaný FltlD2.FlklD3.Fc Cl(á) á dočasně exprimovaný FltlD2.FlklD3.Fc Cl (a) byly 24 hodin. C^^ pro Fltl (1-3)-Fc (Α4Ό) byla 8 ug/ml. Pro dočasně exprimované peptidy (FltlD2.FlklD3.Fc Cl (a) a-VEGFR1R2-Fc Cl(a)) byly C. 18 ug/ml a pro stabilně exprimovaný VEGFR1R2-FC Cl (a) byla C^^.30 ug/ml.

(b) Farmakokinetická analýza Fltl (1-3) -Fc(A40)^;, FltlD2.FlklD3.Fc Cl(a) a FltlD2.VEGFR3D3.Fc Cl(a)

Balb/c myším (25-30 g) se podkožní injekcí podaly 4 mg/kg Fltl(1-3)-Fc(A40), CHO dočasně exprimujících FltlD2.FlklD3.Fc Cl(a) a CHO dočasně exprimujících FltlD2.VEGFR3D3.Fc Cl(a). Myším se odebírala krev z ocasu 1, 2, 5, 6, 7, 8, 12, 15 a 20 dnů po injekci. Sérum se testovalo v ELISA navrženém pro detekci Fltl(1-3)-Fc, FltlD2.FlklD3.Fc Cl(a) nebo FltlD2.VEGFR3D3.Fc Cl(a). ELISA test zahrnuje potažení ELISA plotny VEGF165, vazbu Fltl(1-3)-Fc,

FltlD2.FlklD3.Fc Cl(a) nebo FltlD2.VEGFR3D3.Fc Cl(a) a zobrazení anti-Fc protilátkou navázanou na křenovou peroxidasu. Fltl(1-3)-Fc (A40) nemohl být detekován v séru po dnu 5, zatímco FltlD2.FlklD3.Fc Cl(a) a FltlD2.VEGFR3D3.Fc Cl(a) byly detekovatelné po 15 dnech a déle. Výsledky tohoto ·· ·*·· ·· ·· • · · . · · · · rjrt · · · · '· · · · · /v *·····» · · ·· · · pokusu jsou uvedeny na obr. 38. .

Příklad 30: Hodnocení schopnosti FltlD2.FlklD3.Fc Cl(a) inhibovat 'růst* nádorů in vivo ' --- -- r·. . ...

Pro hodnocení schopnosti FltlD2.FlklD3.Fc Cl(a) inhibovat růst nádorů in vivo se použil model, ve kterém je suspenze nádorových buněk implantována podkožně do pravé tlapky samců myší s těžkou kombinovanou imunodeficiencí (SCID). V tomto testu se použily dvě buněčné linie, lidská HT-1080 fibrosarkomová buněčná linie (ATCC přírůstkové č. CCL-121) a krysí C6 gliomová buněčná linie (ATCC přírůstkové č.

CCL-107), které mají značně odlišné morfologické a růstové charakteristiky. První dávka FltlD2 . FlklD3. Fc Cl (.a) (25 mg/kg nebo v dávce uvedené na obr. 39 a 40) se podala v den implantace nádoru. Zvířatům se potom podávaly podkožní injekce Fltl(l-3)-Fc (A40), FltlD2.FlklD3.Fc Cl(a) nbeo vehikula buď každý druhý den (EOD), nebo dvakrát týdně •fc · ' £·»· ' (2x/týdně) po dobu 2 týdnů. Po 2 týdnech se zvířata fixovala, odebraly se nádory a vzorky se zaslepily. Objem nádorů se měřil pomocí měření délky a šířky viditelných podkožních nádorů. Jak Fltl(1-3)-Fc (A40), tak FltlD2.FlklD3.Fc Cl(a) významně redukovaly růst nádorů tvořených HT-1080 a C6 buňkami. Výsledky těchto pokusů jsou uvedeny na obr. 39 a 40.

Příklad 31: Efekt VEGF165 a modifikovaných Fit receptorů na samičí reprodukční systém

Sterotypní charakter cévní přestavby, ke které dochází v děloze a ovariu během reprodukčního cyklu, byl dobře charakterizován, což činí tuto tkáň velmi vhodnou pro testování mechanismů, které regulují angiogenesi, cévní přestavbu a regresi cév. Dále, pokusy s hybridizací ·· ···· ·· <· reprodukčních tkání in šitu poskytly jasné důkazy, že EVGF působí jako mediátor fyziologické angiogenese u zdravých hlodavců, stejně jako u člověka a ostatních primátů (Phillips “et ’ ál7> Γ99Ό; ‘RavindřánátK ět álí;?’1992 ;Shweiki *eť al'. ;' '.....

” 1993;* Kamat 'eť al1995)i Protože jsou cyklická angiogenese a cévní-přestavba význačnými rysy normálních vaječníků a dělohy, není překvapivé, že abnormální růst cév a/nebo dysfunkce cév charakterizují mnohé patologické.stavy, které postihují tyto orgány. Dále, předpokládá se, že tyto patogenní cévní abnormality jsou způsobeny nebo podporovány dysregulovanou expresí jednoho nebo více angiogenních nebo anti-ángiogéňních ‘faktorů, hlavně VEGF.

Například je abnormální angiogenese charakteristická pro polycystická ovaria, endometriosu a karcinom endometria,__a u každého z těchto onemocnění je,VEGF nadměrně exprimován v postižené tkáni (Kamat et al., 1995; Shifren et al., 1996; Guidi et al., 1996; Donnez et al., 1998). Předpokládá se, že nadměrná exprese VEGF hraje patogenní úlohu při vzniku cévní hyperpermeability při ovariálním hyperstimulačním syndromu (McClure et al., 1994; Levin et al., 1998) a preeklampsii (Baker et al., 1995; Sharkey et al., 1996). Dále, VEGF se považuje za faktor permeability odpovědný za produkci ascitu asociovaného s karcinomem ovaria a jinými nádory (Senger et al., 1983; Boocock et al., 1995). Činidla, která účinně neutralizují biologické účinky VEGF, mohou mít terapeutický přínos u výše uvedených a podobných stavů.

Angiogenese a cévní přestavba jsou také charakteristikami implantace blastocysty a vývoje placenty (Findlay, 1986) .

VEGF je silně exprimován jak v maternální lamina decidua, tak v embryonálním trofoblastu, kde se předpokládá, že nejprve stimuluje expanzi a hyperpermeabilitu cévní vaskulatury během periimplantačního období, a potom zprostředkuje tvorbu · mateřských a embryonálních složek placentářní vaskulatury (Schweiki et al., 1993; Cullinan-Bove and Koos, 1993; Chákřábortý'eť al., 1995; Dás et a'll;~T997) /' VEGF’je také ' nutný pro luteální ‘nagiogenés i^ á^s ní spojenou progesteronu nutnou pro přípravu dělohy-pro implantaci (Ferrara et al., 1998). Proto mohou být.činidla irihibující biologické účinky VEGF použitelná jako antikoncepční činidla (tím, že brání implantaci), nebo jako činidla způsobující potraty v časných stadiích gestace. Druhé uvedené použití může být zejména významné při nechirurgickém ukončení ektopickýčh těhotenství.

Ačkoliv je exprese VEGF receptorů omezena zejména na cévní endotel v normální reprodukční tkáni, je Fltl exprimován také trofoblasty v placentě jak lidí, tak jiných zvířat (Clark et al., 1996; He et al., 1999), kde se předpokládá, že se podílí na invazi trofoblástu. Zajímavé je, že jak Fltl, tak KDR (Fikl) jsou exprimovány choriokarcinomovou buněčnou linií BeWo (Charnock-«Toneš et al., 1994), a bylo.prokázáno, že VEGF podporuje syntézu DNA a fosforylaci tyrosinu MAP kinasy v těchto buňkách. Dále, metastazující ovariální karcinomy nejen exprimují vysoké koncentrace VEGF, ale - kromě cévního endotelu - nádorové buňky sami exprimují KDR a/nebo Fltl (Boocock et al., 1995). Tato zjištění naznačují, že VEGF se může nejen zásadně podílet na tvorbě a udržování cévní vaskulatury, ale že alespoň u některých nádorů může mít VEGF samotný autokrinní úlohu a může přímo podporovat přežívání a proliferaci nádorových buněk. Proto mohou mít činidla blokující účinky VEGF zejména výhodné účinky při léčbě nádorů reprodukčních orgánů.

Metody a výsledky • 1 ·· ···· (a) Hodnocení děložní hyperpermeability indukované VEGF ' Séřovy~goňádotřopin březích”Kli’seti' (PMSG) “se podkožní- ***' injekcí (5 ÍU) ápl'il<oval’‘za účelem indukce ovulace- u”-*··*·—· prepubertálních krysích samic. Toto vedlo k vzestupu · estradiolu po 2 dnech, což nakonec způsobilo indukci VEGF v děloze. Je, popsáno, že tato indukce vede k hyperpermeabilitě dělohy a zvyšuje hmotnost dělohy o 6 hodin později a tento účinek může být potenciálně blokován modifikovanými Fit receptory Fltl(1-3)-Fc (A40), FltlD2.FlklD3.Fc Cl(a) a FltlD2 . VĚGFŘ3D3 . Fc Cl (a) . V tomto modelu in vivo je normální hmotnost krysí dělohy přibližně 50 mg a PMSG může indukovat zvýšení hmotnosti na 350 mg. Sušením tkáně se ukáže, že toto navýšení hmotnosti je způsobeno zcela vodou. Podkožní injekce Fltl(l-3)-Fc (A40), FltlD2.FÍklD3.Fc Cl(a) a ,

A _ť . ·

FltlD2 . VEGFR3D3 . Fc Cl (a) v dávce ;25 mg/kg za 1 hodinu, po injekci PMSG vede k přibližně; 50% inhibici zvýšení hmotnosti dělohy. Zvýšení dávky modifikovaných Fit receptorů dále neredukuje zvýšení dělohy, což naznačuje, že v tomto modelu existuje složka nezávislá na VEGF. Výsledky tohoto pokusu jsou uvedeny na obr. 41.

(b) Hodnocení angiogenese v corpus luteum za použití progesteronu jako sledované hodnoty

Sérový gonadotropin březích klisen (PMSG) se podkožní injekcí (5 IU) aplikoval za účelem indukce ovulace u prepubertálních krysích samic. Toto vedlo po 4 dnech k vzniku plně funkčního corpus luteum obsahujího hustou síť cév, která umožňovala sekreci progesteronu do krevního řečiště za účelem přípravy dělohy pro implantaci. Indukce angiogenese v corpus luteum vyžaduje VEGF; blokování VEGF tedy povede k chybění ·· ···· -·· ··

♦. · · · · · · • · · · · · • · · · · · · • · · · · · ·· · · · ···· . nových krevních cév a tak k nedostatku progesteronu secernovaného do krevního řečiště. V tomto modelu in vivo jsou klidové hladiny progesteronu přibližně 5 ňg/ml a pomocí PMSG mohóu’^; být Indukovány' Hodnoty*25-40 ng/ml.~ Podkožní“· · injekce Fltl (í-3^;) -FcHaÁO) nebo FltlD2.FlklD3.Fc Cl (a) v- dávce .25 mg/kg nebo 5 mg/kg 1 hodinu po injekci PMSG vede ke kompletní inhibici indukce progesteronu v den 4. Výsledky tohoto pokusu jsou uvedeny na obr. 42A-42B.

Příklad 33: Farmakokinetické analýzy Fltl(1-3)-Fc (A40): a pegy 1ováného Fit1(1-3)-Fc

Fltl(1-3)-Fc byl PEGylován buď pomocí 10 kD PEG, nebo 20 kD PEG, a byl testován na Balb/c myších pro zjištění jeho farmakokinetického .profilu____Bylo, zjištěno, že obě pegylované formy Fltl(1-3)-Fc mají mnohem lepší farmakokinetické profily než Fltl(l-3)-Fc (A40) , s ve “24 hodinách pro pegylované molekuly oproti € hodinám pro Fltl(1-3)-Fc (A40).

Příklad 34: VEGF165 ELISA pro testování afinity modifikovaných variant Fltl receptorů pM VEGF165 se inkubovalo přes noc při teplotě místnosti s modifikovanými variantami Fltl receptorů v koncentracích od 160 pM do 0,1 pM. Modifikovanými variantami Fltl receptorů použitými v tomto pokusu byly Fltl(1-3)-Fc, Fltl(1-3)-Fc (A40), dočasně exprimovaný FltlD2.FlklD3.Fc Cl(a), dočasně exprimovaný FitlD2.VEGFR3D3.Fc Cl(a), Fltl(1-3_nas)-Fc,

Fltl(1-3 )-Fc a Tie2-Fc. Fltl(1-3 )-Fc je modifikovanou verzí Fltl(1-3)-Fc, ve které je vysoce bazická aminokyselinová sekvence KNKRASVRRR nahrazena sekvencí NASVNGSR, což vede k inkorporaci dvou nových glykosylačních míst a k redukci pěti pozitivních nábojů, oboje s cílem '·· ···· *· ·· ·' ·· ·' · · · · • · · · · '·· · · ^κ· · ·'· · · ' • · · · · · ♦ · · ·· ···· snížení nežádoucích vlivů této sekvence na farmakokinetiku. Fltl(1-3 ' )-Fc je modifikacíve které je jeden argininový .

(R)/zbytek ve stejné bazické aminokyselinové sekvenci změněn na? cystein(C) {KNKRASVRRR ->~ KNKCASVRRR) pro-umožnění pe^lace^a'ťómtó^žbýtkuT^ktérá^může *potom ^yodstínit-bazřeký—region tak, že nemůže vykazovat nežádoucí účinky.na farmakokinetiku. Po inkubaci se roztok přenese na plotnu obsahující zachycovací protilátku pro VEGF165 (RandD). Množství volného VEGF165 se potom určí za použití protilátky pro zobrazení volného VEGF165. Toto ukazuje, že modifikovanou variantou Fltl receptoru s nejvyšší afinitou pro VEGF165 (podle hej nižšího množství' volného VEGF165) byla FltlD2.FlklD3. Fc Cl (a) , potom Fltl(l-3)-Fc a Fltl(l-3)-Fc (A40) a potom Fltl(l-3_R>C)-Fc, Fltl(l-3_KAS)-Fc a FltlD2.VEGFR3D3_.Fc Cl(a). Tie2-Fc neměl žádou afinitu pro

Claims (51)

1. Patentové nároky

   1. Izolovaná molekula nukleové kyseliny kódující fúzní polypeptid schopný vazby na VEGF polypeptid, která obsahuje:

   (a) nukleotidovou sekvenci kódující složku VEGF receptoru operativně navázanou na (b) nukleotidovou sekvenci kódující multimerizačni složku, kde VEGF receptorová složka je jediná VEGF receptorová složka fúzního polypeptidu a kde se nukleotidóvá sekvence (a) skládá v podstatě z nukleotidové sekvence kódující aminokyselinovou sekvenci Ig domény 2 extracelulární domény prvního VEGF receptoru a nukleotidové sekvence kódující aminokyselinovou sekvenci Ig domény 3 extracelulární domény druhého VEGF receptoru. , '
2. 2. Izolovaná nukleotidóvá kyselina podle nároku 1, kde prvním

   VEGF receptorem je Fitl. /
3. 3. Izolovaná nukleotidové kyselina podle nároku 1, kde druhým VEGF receptorem je Fikl.
4. 4. Izolovaná nukleotidové kyselina podle nároku lk, kde druhým VEGF receptorem je Flt4.
5. 5. Izolovaná nukleotidóvá kyselina podle nároku 1, kde nukleotidové sekvence kódující Ig doménu 2 extracelulární domény prvního VEGF receptoru je před nukleotidovou sekvencí kódující Ig doménu 3 extracelulární domény druhého VEGF receptoru.
6. 6. Izolovaná nukleotidové kyselina podle nároku 1, kde nukleotidóvá sekvence kódující Ig doménu 2 extracelulární (upravená sttahái

   9 9999 ·

   9 9 · <

   •999 9 «·domény prvního VEGF receptoru je za nukleotidovou sekvencí kódující Ig doménu 3 extracelulární domény druhého VEGF receptoru. .....’.............

   I»», *imn -Μ» 4- »*· H -π.ι·Η,·β„«
7. 7. Izolovaná nukleotidová kyselina podle nároku 1, kde , multimerizační složka obsahuje imunoglobulinovou doménu.
8. 8. Izolovaná nukleotidová kyselina podle nároku 1, kde imunoglobulinová doména je vybraná ze skupiny zahrnující Fc doménu IgG, těžký řetězec IgG a lehký řetězec IgG.
9. 9. Izolovaná molekula nukleotidové kyseliny obsahující nukleotidovou sekvenci kódující modifikovaný

   Fltl receptorový fúzní polypeptid, kde kódující region molekuly nukleové kyseliny se skládá v podstatě z nukleotidové , ·, sekvence vybrané ze skupiny'zahrnující: _s

   (a) nukleotidové sekvence,·, uvedené na obr. 21A až 21C, (b) nukleotidové sekvence.uvedené na obr. 22A až 2 2C, . (c) nukleotidové sekvence uvedené na obr. 24A až 24C a

   (d) nukleotidové sekvence, která se v důsledku degenerace genetického kódu liší od nukleotidové sekvence (a), (b) nebo (c), a která kóduje molekulu fúzního polypeptidu majícího biologickou aktivitu modifikovaného Fltl receptorového fúzního polypeptidu.
10. 10. Izolovaná molekula nukleotidové kyseliny obsahující nukleotidovou sekvenci kódující modifikovaný Fltl receptorový fúzní polypeptid, kde kódující region molekuly nukleové kyseliny se skládá v podstatě z nukleotidové sekvence vybrané ze skupiny zahrnující:

    (a) nukleotidové sekvence uvedené na obr. 13A až 13C, (b) nukleotidové sekvence uvedené na obr. 14A až 14C, (c) nukleotidové sekvence uvedené na obr. 15A až 15C,

    (upravená str^J». ' j ; * .?

    • . · 9 9 9 9 9 9 • · · · · '· · · ······

    - 78 (d) nukleotidové sekvence uvedené na obr. 16A až 16C a (d) nukleotidové sekvence, která se v důsledku degenerace genetického kódu liší od nukleotidové sekvence (a), (b), (c) nebo (ď)', á~ktera^kóduj e moFekulu fúzního poíypeptidu majícího biologickou aktivitu modifikovaného Fltl receptorového fúzního polýpeptidů.
11. 11. Fúzní polypeptid, který je kódován izolovanou molekulou nukleové kyseliny podle nároku 1, 2, 3, 4, 9 nebo 10.

    11. Prostředek, vyznačující se tím, že je schopný vazby VEGF molekuly za vzniku nefunkčního komplexu obsahujícího multimer fúzního polýpeptidů podle nároku 10.
12. 13. Prostředek podle nároku 11,;'vy z n á č u jící se tím, že multimerem je dimer. >
13. 14. Prostředek podle nároku 13 a nosič. ;
14. 15. Vektor, který obsahuje molekulu nukleové kyseliny podle nároku 1, 2, 3, 4, 9 nebo 10.
15. 16. Expresní vektor obsahující molekulu nukleové kyseliny podle nároku 1, 2, 3, 4, 9 nebo 10, kde molekula nukleové kyseliny je operativně navázaná na sekvenci řídící expresi.
16. 17. Systém vektor-hostitel pro produkci fúzního polýpeptidů, vyznačující se tím, že obsahuje expresní vektor podle nároku 16, ve vhodné hostitelské buňce.
17. 18. Systém hostitel-vektor podle nároku 17, v y z n a č u jící se tím, že vhodnou hostitelskou buňkou je bakteriální buňka, kvasinka, hmyzí buňka nebo savčí buňka.

    i .99 *999 99' 99 > , * * · . 9 '♦ · · ' 9> ^r« 9 (upravena stratus. . : : ; .· .9 <

    - 79
18. 19. Systém hostitel-vektor podle nároku 17, vyzná č u 'jí c í ' se t í m, že vhodnou hostitelskou buňkou je E.

    coli.
19. 20. Systém hostitel-vektor podle nároku 17, vyznačuj í c í s e t í m, že vhodnou hostitelskou buňkou je COS buňka nebo CHO buňka.
20. 21. Způsob přípravy fúzního polypeptidu, vyznačující se tím, že zahrnuje kultivaci buněk systému vektor-hostitel podle nároku 16 za podmínek umožňujících produkci fúzního polypeptidu a odběr takto produkovaného fúzního polypeptidu.--₇--------------------------——_;———
21. 22. Fúzní polypeptid kódovaný,sekvencí nukleové kyseliny uvedené na obr. 10A až.lOD, obr. 21A až 21Č, obr. 22A až 22C nebo na obr. 24A až 24C, který byl modifikován acebylací nebo pegylací.
22. 23. Fúzní polypeptid podle nároku 22, kde modifikací je acetylace.
23. 24. Fúzní polypeptid podle nároku 22, kde modifikací je pegylace.
24. 25. Fúzní polypeptid podle nároku 23, kde acetylace je provedena s alespoň asi 100-násobným molárním nadbytkem acetylačniho činidla.
25. 26. Fúzní polypeptid podle nároku 23, kde acetylace je provedena s molárním nadbytkem acetylačniho činidla v rozmezí ·· ···· (upravená str^ňjj;.

    • · « · · · ·

    - 80 • · · · ·· · ·* ··<

    od alespoň přibližně 10-násobku do přibližně 100-násobku.
26. 27. Fúzní polypeptid podle-nároku 24, kde pegylace je 10K nebo 20K PEG.
27. 28. Způsob pro snížení nebo inhibici úniku plasmy u savců, vyznačující se tím, že zahrnuje podání fúzního polypeptidu podle nároku 11 savci.
28. 29. Způsob podle nároku 28, v y z n a č u j í c í se tím, že savcem je člověk.
29. 30. Způsob podle nároku 29, v y z n a č u j i c i se t í m, že fúzní polypeptid je acetylovaný.—----------,----
30. 31. Způsob podle nároku 29, vy z n a č u j í c í s e . tím, že fúzní polypeptid je pegylovaný.
31. 32. Fúzní polypeptid podle nároku 11, vyznačuj ící se t í m, že se specificky váže na ligand VEGF receptoru, kterým je VEGF.
32. 33. Způsob pro blokování růstu krevních cév u člověka, vyznačující se tím, že zahrnuje podání účinného množství fúzního polypeptidu podle nároku 11.
33. 34. Způsob pro inhibici aktivity ligandu VEGF receptoru u savce, vyznačující se tím, že zahrnuje podání účinného množství fúzního polypeptidu podle nároku 11.
34. 35. Způsob podle nároku 34, vyznačuj ící t í m, že savcem je člověk.

    (upravená ·· ····. ·» ·· • · · · · · · • · · · · . · ·· ····
35. 36. Způsob podle nároku 34, vy z na č u jí c í‘ s e

    t.í m, že se použije pro zmírnění nebo prevenci růstu nádorů tTclóvěka.
36. 37. Způsob podle nároku 34,vyznačující se tí m, že se použije pro zmírnění nebo prevenci vzniku otoků u člověka.
37. 38. Způsob podle nároku 34, vyznačující se t í m, že se použije pro zmírnění nebo prevenci vzniku ascitu u člověka.
38. 39. Způsob podle nároku 37.vyznačujíc í s e__________ tím, že otokem je otok mozku.
39. 40. Způsob podle nároku 38, vyznačující se tím, že ascitem je ascites asociovaný, s karcinomem ovaria.
40. 41. Fúzní polypeptid schopný vazby na VEGF polypeptid, vyznačuj ícísetím,že obsahuje:

    (a) složku VEGF receptorů operativně navázanou na (b) multimerizační složku, kde VEGF receptorová složka je jediná VEGF receptorová složka fúzního polypeptidů a skládá se v podstatě z aminokyselinové sekvence Ig domény 2 extracelulární domény prvního VEGF receptorů a aminokyselinové sekvence Ig domény 3 extracelulární domény druhého VEGF receptorů.
41. 42.

    s e

    Fúzní polypeptid podle nároku 41, vyznačuj tím, že prvním VEGF receptorem je Fltl.

    ící
42. 43. Fúzní polypeptid podle nároku 41, vyznačuj ící se t í m, že druhým VEGF receptorem je Fikl.

    ·· · 4· »··· 44 (upravená straíiá> · í ·* í Ϊ

    -¹- 4 · 4*4 4 · 4 4 4 4 4 * • · 4 4 4 4 4 • 444 · 44 4 44

    - 82 444 ·
43. 44. Fúzní polypeptid podle nároku 41, vyznačuj ící ^T'ť í”m, ’že druhým’ VEGF receptořem jě Frť47~'*'’
44. 45. Fúzní polypeptid podle nároku 41, kde aminokyselinová sekvence Ig domény 2 extracelulární domény prvního VEGF receptoru je před aminokyselinovou sekvéncí Ig domény 3 extracelulární domény druhého VEGF receptoru.
45. 46. Fúzní polypeptid podle nároku 41, kde aminokyselinová sekvence Ig.domény 2 extracelulární domény prvního VEGF receptoru je za aminokyselinovou sekvencí Ig domény 3 extracelulární domény druhého VEGF receptoru.
46. 47. Fúzní polypeptid podlé,nároku 41,- kde multimerizační složka obsahuje imunoglobulinovou doménu.
47. 48. Fúzní polypeptid podle nároku 41kdeimunoglobulinová doména je vybrána ze skupiny zahrnující Fc doménu IgG, těžký řetězec IgG a lehký řetězec IgG.
48. 49. Fúzní polypeptid, který obsahuje v podstatě aminokyselinovou sekvenci modifikovaného Fltl receptoru, kde aminokyselinová sekvence je vybrána ze skupiny zahrnující:

    (a) aminokyselinovou sekvenci uvedenou na obr. 21A až 21C, (b) aminokyselinovou sekvenci uvedenou na obr, (c) aminokyselinovou sekvenci uvedenou na obr,

    22A až 22C a 24A až 24C.
49. 50. Fúzní polypeptid, který obsahuje aminokyselinovou sekvenci modifikovaného Fltl receptoru, kde aminokyselinová sekvence je vybrána ze skupiny zahrnující:

    (a) aminokyselinovou sekvenci uvedenou na obr. 13A až 13D, (b) aminokyselinovou sekvenci uvedenou na obr. 14A až 14C, (upravená střaSii* ·

    - 83 «» ··

    4 · · 4

    4 · · © 4 4 © « © 4 «© ··»· (c) aminokyselinovou sekvenci uvedenou na obr. 15A až 15C a (d) aminokyselinovou sekvenci uvedenou na óbr. 16A až 16D.
50. 51. Způsob pro snížení nebo inhibici úniku plasmy u savce, vyznačující se t i m, že zahrnuje podání fúzního polypeptidu podle nároku 41, 42, 43, 44, 49 nebo 50 savci.
51. 52. Způsob pro inhibici aktivity ligandu VEGF receptoru u savce, vyznačující se tím, že zahrnuje podání účinného množství polypeptidu podle nároku 41, 42, 43, 44, 49 nebo 50 savci.