NO322136B1 - Oligonukleotid, metode for amplifisering av nukleinsyre-malsekvens ved anvendelse av oligonukleotid, samt sett for nukleinsyre-amplifikasjonsreaksjon - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår området molekylærbiologi og nukleinsyrekjemi, nærmere bestemt angår oppfinnelsen oligonukleotid, metode for amplifisering av nukleinsyre-målsekvens ved anvendelse av oligonukleotid, samt sett for nukleinsyre-amplifikasjonsreaksjon. Mer spesifikt angår den metoder og reagenser for å forbedre utbyttet ved nukleinsyre-amplifikasjonsreaksjoner. Oppfinnelsen kan derfor anvendes på områder hvor nukleinsyre-amplifikasjon blir anvendt.

Oppfinnelsen av polymerase-kjedereaksjon (PCR) gjorde in vitro amplifikasjon av nukleinsyre-sekvenser mulig. PCR er beskrevet i U.S.

patenter nr. 4,683,195; 4,683,202; og 4,965,188; Saiki et al., 1985, Science 230:1350-1354: Mullis et ai., 1986, Cold Springs Harbor Symp. Quant. Biol. 51:263-273; og Mullis og Faloona, 1987, Methods Enzymol. 155:335-350. Utvikling og anvendelse av PCR er omfattende beskrevet i litteraturen. For eksempel er en rekke PCR-relaterte emner beskrevet i PCR Technology - principles and applications for DNA amplification, 1989, (ed. H.A.Erlich) Stockton Press, New York; PCR Protocols: A guide to methods and applications, 1990, (ed. M.A. Innis et al.) Academic Press, San Diego; og PCR Strategies, 1995, (ed. M.A. Innis et al.) Academic Press, San Diego. Forhandlere, så som Perkin Eimer (Norwalk, CT), markedsfører PCR-reagenser og publiserer PCR-protokoller.

Etter den originale publikasjon av nukleinsyre-amplifikasjon er

forskjellige primer-baserte nukleinsyre-amplifikasjonsmetoder beskrevet, omfattende, men ikke begrenset til, Ligase Chain Reaction (LCR, Wu og Wallace, 1989, Genomics 4:560-569 og Barany, 1991, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 88:189-193); Polymerase Ligase Chain Reaction (Barany, 1991, PCR Methods and Applic. 1:5-16); Gap-LCR (PCT-patentsøknad publikasjon nr. WO 90/01069); Repair Chain Reaction (Europeisk patentsøknad publikasjon nr. 439,182 A2), 3SR (Kwoh et al., 1989, Proe. Nati. Acad. Sd. UjjA g§:1173-1177; Guatelli et al., 1990, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 87:1874-1878; PCT patentsøknad publikasjon nr. WO 92/0880A) og NASBA (U.S. patent nr. 5,130,238). En oversikt over amplifikasjons-systemer er gitt i Abramson and Myers, 1993, Current Opinion in Biotechnology 4:41-47.

Spesifisiteten ved primer-baserte amplifikasjons-reaksjoner avhenger av spesifisiteten ttl primer-hybridiseringen. Under de forhøyede temperaturer anvendt ved en typisk amplifikasjon, hybridiserer primerene bare til den tilsiktede mål-sekvens. Imidlertid blir amplifikasjons-reaksjonsblandinger typisk satt sammen ved romtemperatur, godt under temperaturen som kreves for å sikre primer-hybridiseringsspesifisitet. Under slike mindre strenge betingelser kan primerene binde ikke-spesifikt til andre bare delvis komplementære nukleinsyre-sekvenser eller til andre primere og initiere syntese av unønskede ekstensjons-produkter, som kan amplifiseres sammen med mål-sekvensen. Amplifikasjon av ikke-spesifikke primer-ekstensjonsprodukter kan konkurrere med amplifikasjon av de ønskede målsekvenser og kan i betydelig grad redusere effektiviteten av amplifikasjonen av den ønskede sekvens.

En hyppig observert type ikke-spesifikt amplifikasjonsprodukt er en templat-uavhengig artifakt av amplifikasjonsreaksjoner betegnet som "primer-dimer". Primer-dimer er et dobbelttrådet fragment hvis lengde typisk er nær summen av de to primer-lengder og synes å forekomme når én primer blir ekstendert over den andre primer. Den resulterende konkatenering danner en uønsket templat som, på grunn av dens korte lengde, blir effektivt amplifisert.

Ikke-spesifikk amplifikasjon kan reduseres ved å redusere dannelse av primer- ekstensjonsprodukter tør begynnelsen av reaksjonen. Ved én metode, betegnet som en "varm-start" protokoll, blir én eller flere kritiske reagenser holdt tilbake fra reaksjonsblandingen inntil temperaturen er hevet tilstrekkelig til å gi den nødvendige hybridiserings-spesifisitet. På denne måten kan reaksjonsblandingen ikke støtte primer-ekstensjon i den perioden hvor reaksjonsbetingelsene ikke sikrer spesifikk primer-hybridtsering.

Manuelle varm-start-metoder, hvor reaksjonsrøréne blir åpnet etter det initielle høytemperatur-inkuberingstrinn og de manglende reagenser tilsatt, er arbeidsintensive og øker risikoen for forurensning av reaksjonsblandingen. Alternativt kan et varmesensitivt materiale, så som voks, anvendes for å separere eller sekvestrere reaksjonskomponenter, som beskrevet i U.S. patent nr. 5,411,876 og Chou et ai, 1992, Nucl. Acids Res. 20(7):1717-1723. Ved disse metoder smelter en høy-temperatur pre-reaksjons-inkubering det varmesensitive materiale, bg lar derved reagensene blandes.

En annen metode for å redusere dannelsen av primer-ekstensjons-produkter før begynnelsen av reaksjonen baserer seg på varmereversibel hemning av DNA-polymerase med DNA-polymerase-spesifikke antistoffer, som beskrevet i U.S. patent nr. 5,338,671. Antistoffene blir inkubert med DNA-polymerasen i en buffer ved romtemperatur før samlingen av reaksjonsblandingen for å tillate dannelse av antistoff-DNA-polymerase-komplekset. Antistoff-hemning av DNA-polymerase-aktivitet blir inaktivert ved en prereaksjons-inkubering ved høy temperatur. En ulempe ved denne metoden er at fremstilling av antistoffer spesifikke for DNA-polymerase er kostbar og tidkrevende, spesielt i store mengder. Videre kan tilsetning av antistoffer til en reaksjonsblanding kreve redesign av amplifikasjonsreaksjonen.

Dannelse av ekstensjonsprodukter før begynnelsén av reaksjonen kan også hindres ved tilsetning til reaksjonsblandingen av et enkelttrådet bindings-protein, som ikke-kovalent binder til primere på en varme-reversibel måte og hemmer primer-ekstensjon ved å forhindre hybridisering.

Ikke-spesifikk amplifikasjon kan også reduseres ved enzymatisk nedbrytning av ekstensjonsprodukter dannet før begynnelsen av reaksjonen ved anvendelse av metodene beskrevet i U.S. Patent nr. 5,418,149. Nedbrytning av ny-syntetiserte ekstensjonsprodukter blir oppnådd ved å innføre

i reaksjonsblandingen dUTP og UNG og inkubere reaksjonsblandingen ved 45-60°C før utførelse av amplifikasjons-reaksjonen. Primer-ekstensjon resulterer i dannelse av uracil-inneholdende DNA, som blir nedbrutt av UNG under pre-amplifikasjonsbetingelser. En ulempe ved denne metode er at nedbrytning av ekstensjonsprodukt konkurrerer med dannelse av ekstensjonsprodukt og eliminering av ikke-spesifikt primer-ekstensjonsprodukt blir sannsynligvis mindre fullstendig. En fordel ved denne metoden er at uracil-inneholdende DNA innført i reaksjonsblandingen som en forurensning fra en tidligere reaksjon også nedbrytes, og metoden reduserer således også problemet med forurensning av PCR av den amplifiserte nukleinsyre fra tidligere reaksjoner.

Konvensjonelle teknikker innen molekylærbiologi og nukleinsyre-kjemi, kjent for fagfolk på området, er fullstendig forklart i litteraturen. Se for eksempel, Sambrook era/., 1989, Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York; Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984); Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames and S.J. Higgins. ed., 1984); og en serie, Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.)

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer kovalent modifiserte oligonukleotid- primere for in vitro amplifikasjon av nukleinsyre-sekvenser. Anvendelse av de modifiserte primere ifølge foreliggende oppfinnelse resulterer

i reduksjon av ikke-spesifikk amplifikasjon, spesielt primer-dimer-dannelse

og/eller samtidig økning i utbyttet av det ønskede mål i forhold til en amplifikasjon utført med umodifiserte primere.

I et aspekt angår oppfinnelsen et oligonukleotid for amplifikasjon av en nukleinsyre-sekvens, som har den generelle struktur:

hvor S-j representerer en første sekvens av nukleotider mellom omtrent 5 og omtrent 50 nukleotider i lengde;

S2 representerer en andre sekvens mellom én og tre nukleotider i lengde;

N representerer et nukleotid som inneholder en purin- eller pyrimidin-base som inneholder et eksocyklisk amin;

R representerer en modifiserende gruppe, hvor R er kovalent bundet til N gjennom det eksocykliske amin og og hvor R har strukturen:

hvor F?i og R2 uavhengig representerer hydrogen, en C1-C1q alkyl-gruppe, en alkoksygruppe, en fenylgruppe, en fenoksygruppe, en substituert fenylgruppe, en naftylgruppe eller en substituert naftylgruppe. Alkylgruppene kan være forgrenet eller uforgrenet.

I en foretrukket utførelsesform er N et modifisert konvensjonelt nukleotid, i hvilket tilfelle N er et modifisert adenosin, cytidin eller guanosin og modifiseringsgruppen er kovalent bundet til det eksocykliske amin i en adenin-, guanin- eller cytosin-base. I en mer foretrukket utførelsesform er N er et modifisert adenosin.

I en foretrukket utførelsesform er R en 2-naftylmetyl-gruppe; en benzyl-gruppe; eller en substituert benzyl-gruppe. Foretrukne substituerte benzyl-grupper har strukturen:

hvor R3 representerer en C-|-Cg forgrenet eller lineær alkyl-gruppe, mer foretrukket en CyC^ forgrenet eller lineær alkyl-gruppe, en metoksy-gruppe eller en nitro-gruppe. Fortrinnsvis er R3 bundet i para-stilling.

I en mer foretrukket utførelsesform er R benzyl, p-metylbenzyl, p- tert-butylbenzyl, p-metoksybenzyl eller 2-naftylmetyl.

Et annet aspekt ved oppfinnelsen angår amplifikasjons-primere som er modifisert ved en foto-labil kovalent binding av en modifiserende gruppe, hvilket resulterer i en delvis eller fullstendig hemning av primer-amplifikasjon. Den foto-labile modifiserende gruppen kan være bundet enten til det eksocykliske amin, som i de modifiserte nukleotider beskrevet ovenfor eller til ring-nitrogenet. I én utførelsesform er minst én nitrobenzyl-gruppe bundet til det eksocykliske amin i en adenin-, guanin- eller cytosin-base i det 3'-terminale nukleotid.

Et annet aspekt ved oppfinnelsen er et par eller sett av primere, hvor minst én av primerene er modifisert som beskrevet ovenfor. Ved en foretrukket utførelsesform er begge medlemmene i et par av primere eller alle medlemmene i et sett av primere, modifisert.

Et annet aspekt ved oppfinnelsen angår metode for amplifikasjon av nukleinsyre-målsekvens som omfatter utførelse av en amplifikasjonsreaksjon ved anvendelse av minst ett oligonukleotid ifølge foreliggende oppfinnelse.

Et annet aspekt ved oppfinnelsen angår metoder for amplifikasjon av en mål-nukleinsyre som omfatter utførelse av en amplifikasjonsreaksjon ved anvendelse av de foto-labile modifiserte primere ifølge foreliggende oppfinnelse, hvor reaksjonsblandingen blir bestrålt med lys tilstrekkelig til å fjerne modifiseringsgruppen og tillate dannelse av primer-ekstensjonsprodukter.

I én utførelsesform av oppfinnelsen blir strålingen utført som et separat trinn, før begynnelse av amplifikasjonsreaksjonen, men etter at reaksjonsblandingen er oppvarmet til en temperatur over omtrent 50°C. I andre utførelsesformer blir strålingstrinnet kombinert med et innledende trinn i amplifikasjonsprosessen, så som det reverse transkripsjonstrinn i en RNA-amplifikasjonsreaksjon eller det innledende denatureringstrinn i en DNA-amplifikasjonsreaksjon.

Et annet aspekt ved oppfinnelsen angår sett for in vitro amplifikasjon av nukleinsyre-sekvenser, hvilke sett omfatter et oligonukleotid ifølge foreliggende oppfinnelse. Settene ifølge foreliggende oppfinnelse kan også omfatte én eller flere amplifikasjonsreagenser, f.eks. en nukleinsyre-polymerase eller -ligase, nukleosidtrifosfatase og egnede buffere.

Kort beskrivelse av tegningene

Figur 1 viser resultatene av amplifikasjoner av HIV-1 RNA utført ved anvendelse av benzylerte primere, som beskrevet i Eksempel 5. Figur 2 viser resultatene av amplifikasjoner av HCV RNA utført ved anvendelse av benzylerte primere, som beskrevet i Eksempel 6. Figur 3 viser resultatene av amplifikasjoner av HCV RNA utført ved anvendelse av primere modifisert med én av tre modifiserende grupper, som beskrevet i Eksémpel 7. Figur 4 viser resultatene av amplifikasjoner av HCV RNA utført ved anvendelse av foto-labile modifiserte primere, som beskrevet i Eksempel 8. Figur 5 viser resultatene av amplifikasjoner av mycobakteriell DNA ved anvendelse av primere modifisert med en benzyl-gruppe og primere modifisert med en p-ferf-butylbenzyl-gruppe, som beskrevet i Eksempel 10. Figur 6 viser et generelt reaksjonsskjema egnet for syntese av benzyl-eller substituert benzyl-modifisert dA kontrollert pore-glass (CPG).

Som en hjelp til å forstå oppfinnelsen er flere betegnelser definert nedenfor.

Betegnelsene "nukleinsyre" og "oligonukleotid" angir polydeoksyribonukleotider (inneholdende 2-deoksy-D-ribose), polyribonukleotider (inneholdende D-ribose) og hvilke som helst andre typer polynukleotid som er et N-glykosid av en purin- eller pyrimidin-base eller modifisert purin- eller pyrimidin-base. Det er intet tilsiktet skille i lengde mellom betegnelsene "nukleinsyre" og "oligonukleotid", og disse betegnelsene vil bli anvendt om hverandre. Disse betegnelsene henviser bare til den primære struktur av molekylet. Disse betegnelsene omfatter således dobbelt- og enkelt-trådet DNA, så vel som dobbelt- og enkelt-trådet RNA.

Betegnelsen "konvensjonell", i forbindelse med nukleinsyre-baser, nukleosider eller nukleotider, angir de som forekommer naturlig i polynukleotidet som beskrives. De fire konvensjonelle (også betegnet som hoved) deoksyribonukleotider i DNA omfatter purin-basene adenin og guanin og pyrimidin-basene cytosin og thymin. De fire konvensjonelle ribonukleotider i RNA omfatter purin-basene adendin og guanin og pyrimidin-basene cytosin og uracil. I tillegg til de konvensjonelle eller vanlige basene ovenfor, forekommer en rekke andre purin- og pyrimidin-derivater, betegnet sjeldne eller mindre baser, i små mengder i noen nukleinsyrer. Som anvendt her angir "ukonvensjonell", i forbindelse med nukleinsyre-baser, nukleosider eller nukleotider, sjeldne eller mindre nukleinsyre-baser, nukleosider eller nukleotider og modifikasjoner, derivater eller analoger av konvensjonelle baser, nukleosider eller nukleotider og omfatter syntetiske nukleotider som har modifiserte base-grupper og/eller modifiserte sukker-grupper (se Protocols for Oligonucleotidé Conjugates, Methods in Molecular Biology, Vol 26, (Sudhir Agrawal, Ed., Humana Press, Totowa, NJ, (1994)); og Oligonucleotides and Analogues, A Practical Approach (Fritz Eckstein, Ed., IRL Press, Oxford University Press, Oxford).

Oligonukleotider kan fremstilles ved en hvilken som helst egnet metode, omfattende for eksempel kloning og restriksjon av passende sekvenser og direkte kjemisk syntese ved en metode så som fosfotriester-metoden ifølge Narang era/., 1979, Meth. Enzymol. 68:90-99; fosfodiester-metoden ifølge Brown et al., 1979, Meth. Enzymol. 68:109-151; dietylfosforamiditt-metoden ifølge Beaucage et al., 1981, Tetrahedron Lett. 22:1859-1862; og den faste bærer-metode ifølge U.S. patent nr. 4,458,066. En oversikt over syntese-metoder er gitt i Goodchild, 1990, Bioconjugate Chemistry 1(3):165-187, inntatt her ved referanse.

Betegnelsen "base-paring", på området også betegnet "Watson-Crick base-paring", angir den velkjente hydrogen-binding av de komplementære base-parene adenin-thymin og guanin-cytosin i en dobbelt-trådet DNA-struktur, adenin-uracil og guanin-cytosin i et RNA/DNA hybrid-molekyl og analog binding av ukonvensjonelle nukleotid-par.

Betegnelsen "hybridisering" angir dannelse av en dupleks-struktur av to enkelt-trådete nukleinsyrer på grunn av komplementær base-paring. Hybridisering kan forekomme mellom fullt komplementære nukleinsyre-tråder eller mellom "i det vesentlige komplementære " nukleinsyre-tråder som inneholder mindre regioner med mismatch. Betingelser under hvilke bare fullt komplementære nukleinsyre-tråder vil hybridisere, er betegnet som "stringente hybridiserings-betingelser" eller "sekvens-spesifikke hybridiserings-betingelser". Stabile duplekser av i det vesentlige komplementære sekvenser kan oppnås under mindre stringente hybridiserings-betingelser; idet graden av mismatch som tolereres kan kontrolleres ved passende justering av hybridiserings-betingelsene. Fagfolk på området nukleinsyre-teknologi kan bestemme dupleks-stabiliteten empirisk ved å ta i betraktning en rekke variabler omfattende for eksempel, lengden og basepar-konsentrasjonen av oligonukleotidene, ionestyrke og hyppighet av ikke-matchende basepar, i henhold til veiledning gitt i litteraturen (se f.eks., Sambrook era/., 1989, Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York; og Wetmur, 1991, Critical Review in Biochem. and Mol. Biol. 26(3/4):227-259).

Betegnelsen "primer" angir et oligonukleotid som kan virke som et initieringspunkt for DNA-syntese under betingelser hvor syntese av et primer-ekstensjonsprodukt komplementært med en nukleinsyre-tråd blir startet, dvs. enten i nærvær av fire forskjellige nukleosid-trifosfater og et ekstensjonsmiddel (f.eks., DNA-polymerase eller revers transkriptase) i en passende buffer og ved en egnet temperatur. Som anvendt her skal betegnelsen "primer" omfatte oligonukleotidene anvendt i ligasjons-medierte amplifikasjonsprosesser, hvor ett oligonukleotid blir "ekstendert" ved ligering til et andre oligonukleotid som hybridiserer i en tilstøtende stilling. Betegnelsen "primer-ekstensjon", som anvendt her, angir således både polymerisering av individuelle nukleosid-trifosfater ved anvendelse av primeren som et initieringspunkt for DNA-syntese og ligering av to primere for å danne et ekstendert produkt.

En primer er fortrinnsvis et enkelt-trådet DNA. Den passende lengde til en primer avhenger av den tilsiktede anvendelse av primeren, men er typisk i området fra 6 til 50 nukleotider. Korte primer-molekyler krever generelt lavere temperaturer for å danne tilstrekkelig stabile hybrid-komplekser med temptaten. En primer trenger ikke reflektere den eksakte sekvens i templat-nukleinsyren, men må være tilstrekkelig komplementær til å hybridisere med templaten.

Design av egnede primere for amplifikasjon av en gitt målsekvens er velkjent på området og er beskrevet i litteraturen referert til her.

Primere kan innføre ytterligere trekk som tillater deteksjon eller immobilisering av primeren, men som ikke endrer den grunnleggende egenskap til primeren, at den virker som et initieringspunkt for DNA syntese. For eksempel kan primere inneholde en ytterligere nukleinsyre-sekvens ved 5'-enden som ikke hybridiserer til mål-nukleinsyren, men som letter kloning av det ekstenderte produkt. Regionen av primeren som er tilstrekkelig komplementær til templaten til å hybridisere, er her betegnet som hybridiserings-regionen.

Betegnelsene "mål", "mål-sekvens", "mål-region" og "mål-nukleinsyre" angir en region eller subsekvens av en nukleinsyre som skal amplifiseres.

Som anvendt her, er en primer "spesifikk" for en målsekvens hvis antallet av mismatch mellom primersekvensen og måisekvensen er mindre enn antallet av mismatch mellom primersekvensen og ikke-målsekvenser som kan være til stede i prøven. Hybridiseringsbetingelser kan velges under hvilke stabile duplekser blir dannet bare hvis antallet av mismatch ikke er større enn antallet mismatch mellom primersekvensen og måisekvensen. Under slike betingelser kan primeren danne en stabil dupleks bare med en målsekvens. Således tillater anvendelse av mål-spesifikke primere under egnede stringente amplifikasjonsbetingelser, spesifikk amplifikasjon av de mål-sekvenser som inneholder mål-primer-bindingssetene. Anvendelse av sekvens-spesifikke amplifikasjonsbetingelser tillater spesifikk amplifikasjon av de målsekvenser som inneholder de eksakt komplementære primer-bindingssetene.

Betegnelsen "ikke-spesifikk amplifikasjon" angir amplifikasjon av andre nukleinsyre-sekvenser enn måisekvensen, hvilket er et resultat av at primere hybridiserer med andre sekvenser enn måisekvensen og deretter tjener som et substrat for primer-estensjon. Hybridisering av en primer til en ikke-målsekvens er betegnet som "ikke-spesifikk hybridisering" og kan forekomme ved pre-amplifikasjonsbetingelser omfattende lavere temperatur og redusert stringens.

Betegnelsen "primer-dimer" angir templat-uavhengig ikke-spesifikt amplifikasjons-produkt som er et resultat av primer-ekstensjoner hvor en annen primer tjener som templat. Selv om primer-dimer ofte synes å være en konkatamer av to primere, dvs. en dimer, forekommer også konkatamerer av mer enn to primere. Betegnelsen "primer-dimer" blir anvendt generisk her for å omfatte templat-uavhengig ikke-spesifikt amplifikasjonsprodukt.

Betegnelsen "reaksjonsblanding" angir en oppløsning inneholdende reagenser som er nødvendige for å utføre en gitt reaksjon. En "amplifikasjons-reaksjonsblanding", som angir en oppløsning inneholdende reagenser som er nødvendige for å utføre en amplifikasjonsreaksjon, inneholder typisk oligonukleotid-primere og en DNA-polymerase eller -ligase i en egnet buffer. En "PCR-reaksjons-blanding" inneholder typisk oligonukleotid-primere, en termostabil DNA-polymerase, dNTP'er og et divalent metallkation i en egnet buffer. En reaksjons-blanding blir angitt som fullstendig hvis den inneholder alle reagenser som er nødvendige for reaksjonen og ufullstendig hvis den bare inneholder en delmengde av de nødvendige reagenser. Det vil forstås av fagfolk på området at reaksjons-komponentene rutinemessig blir lagret som separate løsninger, hver inneholdende en delmengde av de totale komponenter, av hensiktsmessige grunner, lagringsstabilitet eller for å tillate anvendelsesavhengig justering av komponent- konsentrasjoner og at reaksjonskomponentene samles før reaksjonen for å få en fullstendig reaksjonsblanding. Videre vil det forstås av fagfolk på området at reaksjonskomponentene er pakket separat for salg og at nyttige kommersielle sett kan inneholde en hvilken som helst delmengde av reaksjonskomponentene som omfatter de modifiserte primere ifølge foreliggende oppfinnelse.

Modifiserte primere

Amplifikasjons-primere ifølge oppfinnelsen blir modifisert ved kovalent binding av en gruppe til én av de fire nukleotider ved 3'-terminal-enden av primeren. I én utførelsesform består en modifisert primer ifølge foreliggende oppfinnelse av en nukleinsyre-sekvens som har den generelle struktur:

hvor S-| representerer en første sekvens av nukleotider med lengde

mellom omtrent 5 og omtrent 50 nukleotider;

S2 representerer en andre sekvens med lengde mellom én og tre

nukleotider;

N representerer et nukleotid som inneholder en purin- eller pyrimidin-base som inneholder et eksocyklisk amin;

R representerer en modifiserende gruppe, hvor R er kovalent bundet til N gjennom det eksocykliske amin og hvor R har strukturen beskrevet nedenfor.

Som vist i eksemplene blir virkningen av modifikasjonen maksimalisert når modifikasjonen er i det 3-terminale nukleotid. Således inneholder primeren fortrinnsvis et modifisert 3-terminalt nukleotid.

Det modifiserte nukleotid er valgt fra de hvis base inneholder et eksocyklisk amin som er involvert i base-paringen av nukleotidet med det komplementære nukleotid. Typisk er primere DNA inneholdende bare konvensjonelle nukleotider. Av de fire konvensjonelle nukleotid-baser som finnes i DNA, inneholder adenin, guanin og cytosin et eksocyklisk primært amin som er involvert i base-paring med den komplementære base. Ved et foretrukket aspekt ifølge foreliggende oppfinnelse blir primeren modifisert ved binding av en enkel modifiserende gruppe til det eksocykliske amin, idet den erstatter ett av de to hydrogen-atomer i amingruppen som, i den umodifiserte base, kan involveres i base-paring. Strukturene til de modifiserte nukleotider inneholdende henholdsvis en modifisert adenin-, guanin- og cytosin-base, er vist nedenfor.

hvor S representerer sukkergruppen og R representerer modifiseringsgruppen.

Foreliggende oppfinnelse er ikke begrenset til primere bestående av konvensjonelle nukleotider. En hvilken som helst nukleotid-analog hvor base-gruppen inneholder et eksocyklisk primært amin som er involvert i base-paring med en komplementær base er modifiserbar som beskrevet her. Eksempler på ukonvensjonelle nukleotider omfatter 3-metyladenin, 7-metylguanin, 3-metylguanin, 5-metyl-cytosin og 5-hydroksymetyl-cytosin. c

Modifiseringsgruppen begrenser evnen til den modifiserte base til å delta i hydrogenbinding fordi modifiseringsgruppen erstatter ett hydrogenatom. Det gjenværende hydrogenatom kan fortsatt delta i hydrogenbinding. Modifiseringsgruppene kan derfor påvirke både kinetikken og termodynamikken til hybridiseringen. En rekke modifiseringsgrupper kommer i betrakting, som har de følgende egenskaper:

1. griper inn i, men forhindrer ikke, Watson-Crick base-paring av den modifiserte base med den komplementære base; 2. griper inn i, men forhindrer ikke, ekstensjon av den modifiserte primer; og 3. tillater syntese av en tråd komplementær med ekstensjonsproduktet av den modifiserte primer.

Modifiseringsgruppen innvirker sterisk på baseparing og, således på primer-ekstensjon. Den fysiske størrelsen av modifiseringsgruppen innvirker således på graden av innvirkning på hybridisering. Når et modifisert adenosin-eller cytidin-nukleotid blir innført i en dobbelt-trådet nukleinsyre, trenger modifiseringsgruppen frem i det sentrale rom i hoved-fordypningen. Følgelig skulle selv relativt store modifiseringsgrupper forårsake liten sterisk forstyrrelse av dupleks-strukturen. Imidlertid er egnede modifiseringsgrupper ikke så store at hydrogen-binding blir forhindret eller enzymatisk ekstensjon av 3'-hydroksyl-gruppen i primeren blir forhindret. Når det modifiserte guanosin-nukleotid blir innført i en dobbelt-trådet nukleinsyre trenger modifiseringsgruppen frem i den mindre fordypning, hvilket gir mindre rom for størrelsen av modifiseringsgruppen. Følgelig er mindre modifiseringsgrupper foretrukket for binding til en guanin-base.

Primer-ekstensjonsprodukter, som blir anvendt som templater ved påfølgende amplifikasjons-cykler, inneholder den modifiserte base innført av primeren. Modifiseringsgruppen er valgt slik at tilstedeværelsen av den modifiserte base i templaten ikke forårsaker terminering av primer-ekstensjon eller hemning av primer-ekstensjon. Typen av modifiseringsgruppen bør fortrinsvis ikke forårsake mutagene begivenheter hvorved identiteten til den modifiserte base går tapt ved replikasjon av en primer-avledet templat. Virkningen av den modifiserte base i templaten på primer-ekstensjon kan testes rutinemessig ved å følge veiledningen gitt her og i litteraturen (se for eksempel Gniazdowski og Cera, 1996, Chem. Rev. 96:619-634).

Modifiseringsgrupper R, som tilfredsstiller egenskapene ovenfor, er egnet for anvendelse i metodene ifølge foreliggende oppfinnelse. Foretrukne modifiseringsgrupper har strukturen:

hvor R-j og Ftø uavhengig representerer hydrogen, en C-j-Cio alkylgruppe, en alkoksygruppe, en fenylgruppe, en fenoksygruppe, en substituert fenylgruppe, en naftylgruppe eller en substituert naftylgruppe. Alkylgruppene kan være forgrenede eller lineære. Større alkylgrupper, opptil minst C2o- kan også anvendes.

I en foretrukket utførelsesform er R en 2-naftylmetylgruppe; en benzylgruppe; eller en substituert benzylgruppe. Foretrukne substituerte benzyl- grupper har strukturen:

hvor R3 representerer en C-j-Cg forgrenet eller lineær alkylgruppe, mer foretrukket en CrC4 forgrenet eller lineær alkylgruppe, en metoksygruppe eller en nitrogruppe. En C1-C4 forgrenet eller lineær alkylgruppe er metyl, etyl, propyi, butyl, iso-propyl, iso-butyl, tert-butyl og lignende. Metyl og tert-butyl er foretrukne alkylgrupper. Fortrinnsvis er R3 bundet i para-stilling.

Spesielt foretrukne modifiseringsgrupper R er vist nedenfor:

En rekke spesielle modifiseringsgrupper er beskrevet i eksemplene. Generelt kan empirisk valg av en spesielt egnet modifiseringsgruppe fra klassen av forbindelser beskrevet, utføres rutinemessig av fagfolk på området ved å følge veiledningen gitt her. Fortrinnsvis blir anvendeligheten av en spesiell gruppe bestemt empirisk ved anvendelse av de modifiserte primere i en amplifikasjons-reaksjon. Vellykket amplifikasjon indikerer både at den modifiserte base ikke totalt hemmer primer-ekstensjon og at tilstedeværelse av den modifiserte base i en primer-avledet templat ikke forårsaker terminering av primer-ekstensjon. Reduksjon av primer-dimer blir bestemt som beskrevet i eksemplene.

Primere med en foto- labil modifisering

I en alternativ utførelsesform av foreliggende oppfinnelse, blir primere modifisert med én eller flere foto-labile grupper som kan fjernes ved utsettelse for lys etter at reaksjonen har nådd de høy-temperatur-reaksjonsbetingelser som sikrer spesifisitet. Fordi modifiseringsgruppen blir fjernet før primer-ekstensjonen, trenger den modifiserte primer ikke være ekstenderbar før fjernelse av gruppen. Eksempler på fotolabile modifiseringsgrupper som kan anvendes ved fremgangsmåtene ifølge foreliggende oppfinnelse, er beskrevet i Pillai, 1980, "Photoremovable Protecting Groups in Organic Synthesis", Synthesis:1-26.

Fortrinnsvis blir de foto-labile primere ifølge foreliggende oppfinnelse modifisert ved 3'-terminal-nukleotidet ved binding av én eller to onitrobenzyl-grupper:

I primere modifisert ved binding av en enkel nitrobenzylgruppe til det eksocykliske primær amin i en basegruppe, kan det resulterende sekundære amin fortsatt delta i baseparing hvis amin-gruppen er rotert slik at det gjenværende hydrogenatom er orientert mot den komplementære basen. Som beskrevet i eksemplene kan disse primere anvendes ved en amplifikasjon, enten med eller uten fjernelse ved stråling med UV-lys.

Primere modifisert ved binding av to nitrobenzylgrupper til det eksocykliske amin i basen kan ikke ekstenderes. Hemningen er sannsynligvis et resultat av den manglende evnen til den modifiserte base til å underkastes baseparing, som er utelukket på grunn av at begge hydrogenatomene i det eksocykliske amin er erstattet av voluminøse nitrobenzyl-grupper. Anvendelse av primere modifisert med to nitrobenzylgrupper ved en amplifikasjon, hvor reaksjonsblandingen blir utsatt for UV-lys i en tid som er tilstrekkelig til å fjerne nitrobenzylgruppene, og derved tillate at primer-ekstensjon finner sted, er beskrevet i eksemplene.

I en alternativ utførelsesform er modifiseringsgruppen bundet til ring-nitrogenatomet. Primere modifisert ved binding av en nitrobenzylgruppe til ring- nitrogenet i basen kan ikke ekstenderes på grunn av den manglende evnen til den modifiserte base til å gjennomgå baseparing. Fjernelse av nitrobenzyl- gruppene ved utsettelse for UV-lys tillater at primer-ekstensjon finner sted.

Anvendelse av foto-labile primere som ikke kan ekstenderes før modifiseringsgruppen blir fjernet, gir i det vesentlige en "varm-start" amplifikasjon. Primer-ekstensjon er forhindret under de ikke-spesifikke pre-reaksjonsbetingelser. Reaksjonen blir bestrålt og primerene avblokkert bare etter at reaksjonstemperaturen er hevet til en temperatur som sikrer reaksjons-spesifisitet.

Svntese av modifiserte primere

Syntese av de modifiserte primere blir utført ved anvendelse av standard kjemiske metoder velkjent på området. Metoder for innføring av disse modifiseringsgrupper kan deles i fire klasser. 1. Modifiseringsgruppen kan innføres ved anvendelse av et modifisert nukleosid som en DNA-syntese-bærer. 2. Modifiseringsgruppen kan innføres ved anvendelse av et modifisert nukleosid som et fosforamiditt. 3. Modifiseringsgruppen kan innføres ved anvendelse av et reagens under DNA- syntese (f.eks., benzylamin-behandling av ét konvertibelt amiditt når

innført i en DNA-sekvens).

4. Post-syntese-modifisering. Modifiseringsgruppen kan innføres som et reaktivt reagens når det blir bragt i kontakt med syntetisk DNA.

Syntese av spesielle modifiserte primere er beskrevet i eksemplene. Ytterligere modifiserte primere kan syntetiseres ved anvendelse av standard syntese-metoder på analog måte.

Fortrinnsvis blir modifiserte primere syntetisert ved anvendelse av en derivatisert kontrollert pore glass (CPG) syntese-bærer. Et generelt reaksjonsskjema for syntese av derivatisert dA CPG er vist i Figur 6. Spesielle modifiseringsgrupper kan tilsettes ved anvendelse av et passende alkyl-halogenid-, benzyl-halogenid-, substituert benzylhalogenid-, metylnaftyl-halogenid- eller substituert metylnaftyl-halogenid-alkyleringsmiddel. Syntese av benzyl- og p-tert-butylbenzyl-dA CPG beskrevet i eksempler 1 og 2 følger skjemaet vist i Figur 6.

Alkylering av den eksocykliske amino-gruppen kan utføres ved anvendelse av metoder analoge méd metyleringen beskrevet i Griffin og Reese, 1963, Biochim. Acta 68:185-192. Ytterligere syntese-metoder er beskrevet i Aritoma et al., 1995, J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1:1837-1849.

Amplifikasjoner ved anvendelse av modifiserte primere

Metodene ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter utførelse av en primer-basert amplifikasjon ved anvendelse av de modifiserte primere ifølge foreliggende oppfinnelse. Generelt kan de modifiserte primere erstatte umodifiserte primere inneholdende den samme nukleotid-sekvens i en primer-basert amplifikasjon uten noen endring i amplifikasjons-reaksjonsbetingelsene. Fagfolk på området vil selvfølgelig innse at rutinemessig mindre reoptimalisering av reaksjonsbetingelsene kan være fordelaktig ved noen reaksjoner.

I en foretrukket utførelsesform blir de modifiserte primere ifølge foreliggende oppfinnelse anvendt i polymerase-kjede-reaksjonen (PCR). Imidlertid er oppfinnelsen ikke bundet til noe spesielt amplifikasjonssystem. De modifiserte primere ifølge foreliggende oppfinnelse kan anvendes i et hvilket som helst primer-basert amplifikasjonssystem hvor primer-dimer eller ikke-spesifikt amplifikasjonsprodukt kan dannes. Eksempler omfatter amplifikasjonsmetodene beskrevet i referansene angitt ovenfor. Når andre systemer blir utviklet kan disse systemer også ha fordel av praktisering av foreliggende oppfinnelse.

Metodene ifølge foreliggende oppfinnelse er egnet for amplifikasjon av enten DNA eller RNA. For eksempel er amplifikasjon av RNA ved anvendelse av en revers transkripsjon/polymerase kjede-reaksjon (RT-PCR) velkjent på området og er beskrevet i U.S. patent nr. 5,322,770 og 5,310,652, Myers og Gelfand, 1991, Biochemistry 30(31 ):7661 -7666, Young era/., 1993, J. Clin. Microbiol. 3_L(4):882-886 og Mulder et ai, 1994, J. Clin; Microbiol. 32(2):292-300.

Ved en primer-basert amplifikasjon blir primer-ekstensjon typisk utført ved forhøyet temperatur ved anvendelse av et termostabilt enzym så som termostabil DNA-polymerase. Enzymet initierer syntese ved 3-enden av primeren og fortsetter i retning mot 5'-enden av templaten inntil syntesen avsluttes. Rensede termostabile DNA-polymeraser som er nyttige i amplifikasjonsreaksjoner er velkjent på området og omfatter, men er ikke begrenset til, enzymer beskrevet i U.S. patent nr. 4,889,818; U.S. patent nr.

5,079,352; U.S. patent nr, 5,352,600; U.S. patent nr. 5,491,086; WO 91/09950; WO 92/03556; WO 92/06200; WO 92/06202; WO 92/09689; og U.S. patent nr. 5,210,036. En oversikt over termostabile DNA-polymeraser er gitt i Abramson, 1995, i PCR Strategies, (ed. M.A. Innis era/.), s. 39-57, Academic Press, San

Diego.

I en foretrukket utførelsesform, spesielt for amplifikasjon av DNA, blir amplifikasjonen utført véd anvendelse av et reversibelt inaktivert enzym som beskrevet i. Anvendelse av et reversibelt inaktivert enzym, som blir re-aktivert under høy-temperatur-reaksjonsbetingelser, reduserer ytterligere ikke-spesifikk amplifikasjon ved å hemme primer-ekstensjon før begynnelse av reaksjonen. En reversibelt inaktivert termostabil DNA polymerase, utviklet og produsert av Hpffmann-La Roche (Nutley, NJ) og markedsført av Perkin Eimer (Norwalk, CT), er beskrevet i Birch et a/., 1996, Nature 381(6581 ):445-446.

Virkningen av modifiseringsgruppen på evnen til enzymet til å ekstendere primeren avhenger delvis av det spesielle enzym som anvendes og delvis av de valgte reaksjonsbetingelsene. For eksempel er Tth DNA

polymerase mer tolerant når Mn<2+> blir anvendt som det divalente kation, som i noen RNA-amplifikasjoner, heller enn Mg<2+>. Fagfolk vil forstå at ved rutinemessig utvelgelse av en egnet modifiseringsgruppe, må enzymet og reaksjonsbetingelsene komme i betraktning.

Prøve-fremstillingsmetoder egnet for amplifikasjonsreaksjoner er velkjent på området og er fullstendig beskrevet i litteraturen angitt her. Den spesielle metode som anvendes er ikke en kritisk del av foreliggende oppfinnelse. Fagfolk på området kan optimalisere reaksjonsbetingelser for anvendelse ved de kjente prøve-fremstillingsmetoder.

Metoder for analysering av amplifisert nukleinsyre er velkjente på området og er fullstendig beskrevet i litteraturen angitt her. Den spesielle metode som anvendes er ikke en kritisk del av foreliggende oppfinnelse. Fagfolk på området kan velge en egnet analyse-metode avhengig av anvendelsen.

En foretrukket metode for analysering av en amplifikasjonsreaksjon er ved overvåkning av økningen i den totale mengde av dobbelt-trådet DNA i reaksjonsblandingen, som beskrevet i Higuchi era/., 1992, Bio/Technology 10:413-417; Higuchi ef a/., 1993, Bio/Technology 11:1026-1030; europeiske patent-publikasjoner nr. 512,334 og 640,828. Ved denne metoden, her betegnet som "kinetisk PCR", baseres deteksjon av dobbelt-trådet DNA på den økede fluorescens som etidiumbromid (EtBr) og andre DNA-bindingsmerker oppviser når de er bundet til dobbelt-trådet DNA. Amplifikasjonen blir utført i nærvær av merkestoffet. Økningen av dobbelt-trådet DNA etter syntesen av målsekvenser resulterer i en detekterbar økning i fluorescens, som blir overvåket under amplifikasjonn. Metodene tillater således overvåkning av utviklingen i en amplifikasjons-reaksjon.

I kinetisk PCR avhenger den målte fluorescens av den totale mengde av dobbelt-trådet DNA til stede, enten den er et resultat av ikke-spesifikk amplifikasjon eller av amplifikasjon av måisekvensen. Overvåkning av fluorescens tillater måling av økningen av den totale mengde dobbelt-trådet DNA, men økningen som er et resultat av amplifikasjon av måisekvensen blir ikke målt uavhengig av økningen som er et resultat av ikke-spesifikt amplifikasjonsprodukt. De modifiserte primere ifølge foreliggende oppfinnelse er spesielt nyttige i kinetisk PCR fordi de ikke bare reduserer mengden av primer-dimer som dannes, men også forsinker dannelse av detekterbare mengder av primer-dimer. Forsinkelse av primer-dimer-dannelse til etter at en betydelig økning i måisekvensen har skjedd, gjør uavhengig overvåkning av amplifikasjon av målsekvensene mulig og minimaliserer innvirkning av primer-dimer.

Sett

Foreliggende oppfinnelse angår også sett, multibeholder-enheter som omfatter nyttige komponenter for utførelse av foreliggende metode. Et nyttig sett inneholder primere, hvorav minst én er modifisert som beskrevet her, for nukleinsyre-amplifikasjon. Andre eventuelle komponenter for settet omfatter for eksempel et middel for å katalysere syntese av primer-ekstensjonsprodukter, substrat-nukleosid-trifosfater, passende reaksjonsbuffere og instruksjoner for utførelse av foreliggende metode.

Eksemplene ifølge foreliggende oppfinnelse presentert nedenfor er gitt som illustrasjon, av oppfinnelsen.

Eksempel 1

Syntese av primere modifisert med en benzylgruppe

Primere modifisert ved tilsetning av en benzylgruppe ble syntetisert ved én av to prosesser beskrevet nedenfor. Primere modifisert ved 3'-terminal-basen ble syntetisert ved anvendelse av N^-benzyldeoksyadenosin Controlled Pore Glass (CPG) for å initiere DNA-syntesen. Primere modifisert ved en indre base ble syntetisert ved anvendelse av et N^-benzyldeoksyadenosin-fosforamiditt.

De følgende standard forkortelser blir anvendt i eksemplet:

DMAP 4-dimetylaminopyridin

DMF N,N-dimetylformamid

TEA Trietylamin

EDC 1-etyl-3-(3-dimetylaminopropyl)karbodiimid-hydroklorid THF Tetrahydrofuran

DMT 4,4-dimetoksytrityl

LCAA-CPG Langkjede alkylamino kontrollert pore-glass

I. Svntese av N6- benzvldeoksvådenosin CPG

Trinn 1: Syntese av N^benzoyl-NG<->benzyl-S^O-DMT^<*->deoksyadenosin

Til N<6->benzoyl-5'-0-(4,4,-dimetoksytrityl)-2'-deoksyadenosin (657 mg, 1,0 mmol; Aldrich Chemical Co., Milwaukee, W I), ble satt pyridin (10 ml) og blandingen ble tørret ved inndampning under vakuum. Dette ble gjentatt. Det resulterende skum ble oppløst i vannfri DMF (15 ml; Aldrich Chemical Co.,

Milwaukee, Wl) og avkjølt til 5°C. Natriumhydrid (44 mg, 1,1 mmol, 1,1 ekv. 60% dispersjon i olje) ble tilsatt under en argon-atmosfære og omrørt ved romtemperatur i 45 minutter. Benzylbromid (143 pl, 206 mg, 1,2 mmol, 1,2 ekv; Aldrich Chemical Co., Milwaukee, Wl) ble tilsatt over 2 minutter og blandingen ble omrørt natten over ved romtemperatur. Blandingen ble tørret ved inndampning under vakuum, og residuet ble fordelt mellom etylacetat og vann (10 ml hver) og ekstrahert. Den vandige fasen ble ekstrahert påny med etylacetat (10 ml), og de samlede ekstrakter ble tørret over vannfritt magnesiumsulfat, filtrert og inndampet. Råproduktet ble renset ved kolonnekromatografi på silikagel (75 g) ved anvendelse av metanol, trietylamin, metylenklorid (3:0,5:96,5). Fraksjoner inneholdende produktet ble samlet og tørret ved inndampning, hvilket ga det forventede N6-benzoyl-N^-benzyl-5-0-DMT-2'-deoksyadenosin (410 mg, 54%). Strukturen til produktet ble bekreftet vedNMR.

Trinn 2: Succinylering

Til N<6->benzoyl-N<6->benzyl-5'-0-DMT-2'-deoksyadenosinet (295 mg, 0,39 mmol) ble satt pyridin (10 ml), og blandingen ble tørret ved inndampning under høy-vakuum. Dette trinn ble gjentatt. Friskt vannfritt pyridin (10 ml) ble tilsatt sammen med ravsyreanhydrid (200 mg, 2 mmol, 5,0 ekv.) og DMAP (24 mg), og løsningen ble omrørt under en argonatmosfære natten over ved romtemperatur. Mesteparten av oppløsningsmidlet ble fjernet under vakuum og residuet ble fordelt mellom metylenklorid (20 ml) og natriumcitratløsning (20 ml, 0,1 M, pH 5,0) og ekstrahert. Den vandige fasen ble ekstrahert med mer metylenklorid (20 ml) og de samlede ekstrakter ble tørret over vannfritt natriumsulfat, filtrert og tørret ved inndampning. Produktet ble renset ved kolonnekromatografi på silikagel (4,5 g) ved anvendelse av etylacetat, trietylamin, metylenklorid (32:1:67), hvilket ga den forventede 3'-succinat ester,

N<6->benzoyl-N<6->benzyl-3'-0-succinat-5'-0-DMT-2'-deoksyadenosin (247 mg, 74%).

Trinn 3: Derivatisering av CPG

Syrevasket CPG ble fremstilt som følger. LCAA-CPG (1,0 g, LCA00500C, 500 Ångstrom, 88,6 (mol/g; CPG Inc., Fairfield, NJ) ble vasket med dikloreddiksyre i diklormetan (2%, 20 ml) ved periodisk virvling i 20 minutter ved romtemperatur. Syrevasket CPG ble filtrert på en glass-fritte og vasket med diklormetan inntil det var syrefritt. Pulveret ble lufttørret, og deretter tørret under vakuum ved romtemperatur natten over.

Kobling av det modifiserte nukleosid-mellomprodukt til syrevasket CPG

ble utført som følger. Til en oppløsning av N^-Benzoyl-N^-benzyW-O-succinat-5'-0-DMT-2'-deoksyadenosin (170 mg, 0,2 mmol), fremstilt som beskrevet ovenfor, i diklormetan (10 ml) ble satt TEA (100 ul_), og løsningen ble konsentrert til omtrent 5 ml under en argonatmosfære. DMAP (12 mg, 0,1 mmol, 0,5 ekv.), TEA (100 |iL), EDC (384 mg, 2,0 mmol, 10 ekv.) og syre-vasket CPG fra ovenfor ble tilsatt i rekkefølge. Vannfritt pyridin (5 ml) ble tilastt, og blandingen ble forseglet og rystet i 3 dager ved romtemperatur. CPG ble filtrert fra under vakuum og vasket grundig med isopropanol og deretter med diklormetan, lufttørret og deretter tørret under vakuum i 1 time.

Capping av derivatisert CPG ble utført som følger. Til det tørre, derivatiserte CPG ble satt Cap A- og Cap B-løsninger (5 ml hver, eddiksyreanhydrid/ 2,6-lutidin/THF og 10% N-metylimidazol i THF; Glen Research DNA synthesis reagents, Sterling, VA) og blandingen ble rystet i 4 timer ved romtemperatur. CPG ble filtrert fra under vakuum og vasket grundig med isopropanol, deretter diklormetan, lufttørret og deretter tørret under vakuum natten over.

II. Svntese av N6- benzvl- deoksvadenosin- fosforamiditt. -benzoyl-NG-benzyl-S^O-DMT^-deoksyadenosin ble syntetisert som beskrevet ovenfor.

Til N<6->benzoyi-N<6->benzyl-5'-0-DMT-2'-deoksyadenosin (196 mg, 0,26 mmol) i tørr THF (8 ml) ble satt diisopropyletylamin (350 ul, 270 mg, 2,04 mmol, 7,8 ekv.) og 2-cyanoetyl-N,N-diisopropylklorfosforamiditt (161 mg, 0,68 mmol, 2,6 ekv.; Aldrich Chemical Co., Milwaukee, Wl), og blandingen ble omrørt i 30 minutter ved romtemperatur under en argonatmosfære. Oppløsningsmidlet ble fjernet under vakuum og residuet ble fordelt mellom natriumbikarbonat-løsning (5%, 20 ml) og etylacetat (20 ml). Den organiske fasen ble vasket med bikarbonat-løsningen, vann og mettet saltvann (20 ml hver) i rekkefølge, tørret over natriumsulfat, filtrert og inndampet. Residuet ble renset ved kolonnekromatografi på silikagel (4 g) ved anvendelse av aceton/heksan/TEA (34:65:0,7), hvilket ga det ønskede fosforamiditt (248 mg, 100%).

III. DNA- svntese. rensning oa analvse.

Det benzyl-derivatiserte adenosin CPG (25 mg, 1,0 (mol) ble overført til tomme syntese-kolonner (Glen Research, Sterling, VA) og disse ble anvendt for å fremstille oligonukleotider på ABI374 DNA synthesizer (Perkin Eimer, Applied Biosystems Division, Foster City, CA) ved anvendelse av konvensjonelle syntese- og avbeskyttelses-betingelser. Det rå DMT-DNA ble renset og omdannet til 5'-hydroksy-DNA ved standard DMT On/Off HPLC ved anvendelse av en Rainin Pure-DNA-kolonne i et Rainin HPLC-system (Rainin Instrument Co, Woburn, MA). Oligonukleotidene ble analysert ved anvendelse av et ABI kapillar-elektroforese- system (Perkin Eimer, Applied Biosystems Division, Foster City, CA) eller ved denaturerende anion-bytter HPLC-kromatografi på en Dionex Nucleopak kolonne (Dionex Corp, Sunnyvale, CA).

Tilsvarende ble syntese av indre modifiserte primere utført ved anvendelse av umodifisert CPG og det modifiserte fosforamiditt syntetisert som ovenfor.

Eksempel 2

Syntese av primere modifisert med en t- butvl- benzvlaruppe

Foreliggende eksempel beskriver syntese av primere modifisert i 3'-terminal-adenosin med en p-fert-butylbenzylgruppe. De modifiserte primere ble syntetisert i det vesentlige som beskrevet i Eksempel 1, men ved anvendelse av N<6->(p-fert-butylbenzyl)deoksyadenosin-CPG. Syntese av det derivatiserte CPG er beskrevet nedenfor.

Trinn 1: Syntese av N^-benzoyl-N<®->{p-fe/f-butylbenzyl)-5'-0-(4,4'-dimetoksytrityl)-2'-deoksyadenosin

Til N^-benzoyl-5'-0-(4,4'-dimetoksytrityl)-2'-deoksyadenosin (658 mg, 1,0 mmole) ble satt DMF (vannfri, 10 ml) og inndampet til tørrhet. Dette ble gjentatt. Frisk DMF (10 ml) ble tilsatt under en argonatmosfære. Natriumhydrid (44 mg, 60% i olje, 1,1 mmol) ble tilsatt, og blandingen ble omrørt i 0,5 time ved romtemperatur. 4-(fert-butyl)benzylbromid (272 mg, 1,2 mmol) ble tilsatt dråpevis og omrørt ved romtemperatur natten over. Oppløsningsmidlet ble fjernet under vakuum og residuet ble fordelt mellom etylacetat og vann (20 ml hver). Den organiske fasen ble vasket med vann (3 ganger, 20 ml), tørret over vannfritt magnesiumsulfat, filtrert og inndampet til tørrhet. Råproduktet ble renset ved kolonnekromatografi på silikaget (100 g) ved anvendelse av metylenklorid:metanol:trietylamin 96,5:3:0,5, hvilket ga N^-benzdyl-N^ -(p-fe/t-butylbenzyl)-5'-0-(4,4'-dimetoksytrityl)-2'-deoksyadenosin, (229 mg, 28,5%).

Trinn 2: Succinylering.

N6-benzoyl-N6 -(p-fert-butylbenzyl)-5,-0-(4,4'-dimetoksytrityl)-2'-deoksyadenosin (217 mg, 0,27 mmol) ble behandlet med ravsyreanhydrid (135 mg, 5 ekv.) og DMAP (17 mg, 0,5 ekv.) i pyridin (10 ml). Opparbeidelse og kromatografi som beskrevet i Eksempel 1 ovenfor, ga N<®->benzoyl-N<®->(p-fert-butylbenzyO-S^O^^-dimetoksytrityO^^deoksyadenosin-S^O-succinat (199 mg, 82%).

Trinn 3: Derivatisering av CPG

Succinatet (180 mg, 0,2 mmol) fra trinn 2 ovenfor ble behandlet med syre- vasket LCAA-CPG som beskrevet i Eksempel 1. CPG ble cappet og vakuum- tørret, hvilket ga N<6->benzoyl-N<6->(p-fert-butylben2yl)-5,-0-(4,4'-dimetoksytrityO^^deoksyadenosin-S^O-succinat-derivatisert CPG, (1,065 g).

Eksempel 3

Syntese av primere modifisert med en metvlaruppe

Primere modifisert i det 3'-terminale adenosin med en metylgruppe ble syntetisert ved anvendelse av N6-metyl dA CPG (22 mg, 1 umol, Glen Research, Sterling VA). N<6->metyl dA CPG ble plassert i en tom syntese-kolonne og primere ble fremstilt i henhold til standard betingelser for syntese og avbeskyttelse. Primerene ble renset ved anvendelse av DMT On/Off HPLC-prosedyren som beskrevet i Eksempel 1.

Eksempel 4

Svntese av foto- labile modifiserte <p>rimere

Foreliggende eksempel beskriver syntesen av primere modifisert ved det 3'-terminale adenosin med enten én eller to nitrobenzylgrupper. De modifiserte primere ble syntetisert i det vesentlige som beskrevet i Eksempel 1, men ved anvendelse av enten mononitrobenzyl dA CPG eller bis-nitrobenzyl dA CPG.

I. Mononitrobenzvlerte primere

Den.generelle metode for syntese av N<®->benzoyl-N<6->benzyl-2'-deoksyadenosin-derivatisert CPG (se Eksempel 1) ble anvendt for syntese av N<6->benzoyl-N<6->otro-nitrobenzyl-2'-deoksyadenosin-derivatisertCPG, ved anvendelse av orto-nitrobenzylbromid som alkyleringsmiddel. Påfølgende trinn for CPG var identiske med de som er beskrevet i Eksempel 1, med det tillegg at mellomproduktene ble beskyttet mot omgivende lys ved at reaksjonskolbene ble pakket i aluminiumsfolie.

Etter syntesen av det derivatiserte CPG ble primerene syntetisert som beskrevet i Eksempel 1, men ble isolert ved fastfase ekstraksjon ved anvendelse av Nensorb Prep engangskolonner (NEN Research Products Biotechnology Systems, Du Pont Co, Boston MA), ved anvendelse av protokoller som beskrevet av produsenten.

II. Bis- nitrobenzvlerte primere

Bis-nitrobenzyl-deoksyadenosin-CPG ble syntetisert som beskrevet nedenfor. Etter syntesen av det derivatiserte CPG ble primerene syntetisert og renset som beskrevet for nriononitrobenzyl-primerene.

Trinn 1: Syntese av 5'-0-DMT- N<6->bis-orto-nitrobenzyl-2'-deoksyadenosin.

2'-deoksyadenosin-monohydrat (538 mg, 2,0 mmol, Aldrich Chemical, Milwaukee, Wl) ble tørret ved inndampning med vannfri pyridin (2 ganger, 10 ml) under vakuum. Residuet ble oppløst i vannfri DMF (10 ml, Aldrich, Milwaukee, Wl) under en argonatmosfære, og natriumhydrid (88 mg, 2,2 mmol, 1,1 ekv, 60% dispersjon i olje) ble tilsatt og omrørt i 40 min. ved romtemperatur. 2-nitrobenzyl-bromid (710 mg, 3,3 mmol, 1,5 ekv.) ble tilsatt og løsningen ble omrørt i 4 timer ved romtemperatur. DMF ble fjernet ved avdampning under vakuum, og residuet ble fordelt mellom etylacetat og vann (20 ml hver). Den vandige fasen ble ekstrahert med etylacetat (20 ml) og de samlede ekstrakter ble vasket med vann (20 ml) og tørret over magnesiumsulfat, filtrert og inndampet. Råproduktet ble renset ved kolonnekromatografi på silikagel (50 g,

ved anvendelse av 3% MeOH i Ch^C^), hvilket ga 2'-deoksy-N<6->£vs-orto-nitrobenzyladenosin (320 mg, 30%).

Til 2,-deoksy-N6-bis-ofronitrobenzyladenosin (200 mg, 0,518 mmol) ble satt vannfri pyridin (10 ml) og inndampet til tørrhet. Pyridin (10 ml) ble tilsatt, fulgt av 4,4'-dimetoksytritylklorid (900 mg, 2,3 mmol, 4,5 ekv.) og trietylamin (280 mg, 2,76 mmol, 4,0 ekv.), og blandingen ble omrørt ved romtemperatur undér en argonatmosfære i 5 timer. Vann (0,5 ml) ble tilsatt og omrørt i 20 minutter. Blandingen ble fordelt mellom eter og vann (20 ml hver), og den vandige fasen ble ekstrahert påny med eter (20 ml). Ekstraktene ble samlet og vasket med vann (20 ml) og tørret over vannfritt natriumsulfat, filtrert og inndampet. Dette materialet ble renset ved kromatografi på silikagél (4 g, ved anvendelse av 0,7-2,5% metanol i metylenklorid), hvilket ga 5'-0-DMT- N<6->bis-orfo-nitrobenzyl-2'-deoksyadenosin, (121 mg, 33%).

Trinn 2: Succinylering

5'-0-DMT- N<6->bis-orot-nitrobenzyl-2'-deoksyadenosin (121 mg, 0,145 mmol) ble tørret ved inndampning med vannfri pyridin (2 ganger, 3 ml). Pyridin (3 ml), ravsyreanhydrid (58 mg, 0,58 mmol, 4 ekv.) og DMAP (11 mg, katalytisk) ble tilsatt, og løsningen ble omrørt ved romtemperatur i 3 dager. Løsningen ble inndampet i vakuum, og residuet ble fordelt mellom metylenklorid (10 ml) og natriumcitrat-buffer (0,1 M, pH 5,0,10 ml). Den organiske fasen ble tørret over vannfritt natriumsulfat, filtrert og inndampet til tørrhet. Råproduktet ble renset ved kromatografi på silikagel (2 g, ved anvendelse av EtOAc: CH2CI2:TEA, 32:67:1 10 ml, deretter MeOH:CH2CI2,

3:97, 25 ml), hvilket ga et blekgult skum, 5'-0-DMT- N<6->bis-o/to-nitrobenzyl-2'-deoksyadenosin-3'-0-succinat, (138 mg, 99,5%).

Trinn 3: Derivatisering av CPG

Syre-vasket LCAA-CPG ble fremstilt som i Eksempel 1.

Kobling av det modifiserte nukleosid-mellomprodukt til syre-vasket CPG

ble utført som følger. 5'-0-DMT- N<6->bis-orto-nitrobenzyl-2'-deoksyadenosin-3'-O-succinat (37 mg, 0,04 mmol) ble behandlet med TEA (16 (I) i en ravfarvet glass-flaske og inndampet. Til dette residuet ble satt vannfri pyridin (1,5 ml), TEA (2 ul), DMAP (2,4 mg), EDC (76 mg, 0,04 mmol) og syre-vasket LCAA-CPG (200 mg), og blandingen ble rystet på en orbital-blander i tre dager ved romtemperatur. CPG ble filtrert fra under redusert trykk og vasket grundig med isopropanol og deretter med metylenklorid, lufttørret og deretter tørret under vakuum i 1 time.

Capping av det derivatiserte CPG ble utført som beskrevet i Eksempel 1.

Eksempel 5 Amplifikasjoner ved anvendelse av modifiserte primere -

Effekt av oosision av modifisert nukleotid

For å demonstrere virkningen av de modifiserte primere på dannelsen av primer-dimer, ble sammenligninger utført av amplifikasjoner av HIV-1 RNA ved anvendelse av både modifiserte primere og umodifiserte primere. For å bedømme virkningen av posisjonen av det modifiserte nukleotid på reduksjon av primer- dimer, ble i tillegg amplifikasjoner utført ved anvendelse av tre forskjellige oppstrøms modifiserte primere, som bare skilte seg fra hverandre ved lokaliseringen av den modifiserte base.

Mål- nukleinsvre

HIV-1 RNA-templater ble syntetisert ved anvendelse av en HIV-1 RNA-transkripsjonsvektor i det vesentlige som beskrevet i Mulder et ai, 1994, J. Clin. Microbiol. 32(2):292-300.

Primere

Amplifikasjoner ble utført ved anvendelse av både umodifiserte og modifiserte primere. Nukleotid-sekvensene av de umodifiserte primere er vist nedenfor, orientert i 5 - til 3'-retningén. Oppstrøms primer RAR1032MB (SEKV. ID NR: 1) og nedstrøms primer RAR1033MB (SEKV. ID NR: 2) amplifiserer et 175 basepar- produkt svarende til nukleotid-posisjoner 2956 til 3130 i sekvensen av HIV-1- referanse-stammen HXB2 (GenBank accession nr. K03455).

Primer-designeringene ovenfor refererer til de umodifiserte primere. Umodifiserte primere ble biotinylert ved 5'-enden. Modifiserte primere ble syntetisert som beskrevet i Eksempel 1, og besto av de samme nukleotid-sekvenser som de umodifiserte primere, men inneholdt et benzylert adenosin enten i 3'-terminal-stillingen eller i en stilling én eller tre nukleotider oppstrøms for 3Merminus. De modifiserte former for primerene er designert her som følger:

Am<p>lifikasjon

Amplifikasjoner ble utført i 100 pl reaksjonsblandinger inneholdende de følgende reagenser:

100 kopier av HlV-templat-RNA 50 mM Tricin (pH 8,33),

110 mM KOAc,

300 \ iM hver av dATP, dCTP og dGTP,

50 uM dTTP

500 \ iM dUTP,

50 |iM av hver primer,

3,5 mM Mn(OAc)2,

13% Glycerol.

20 enheter av Z05 DNA-polymerase<*> og

2,0 enheter av UNG<**.>

<*> beskrevet i U.S. patent nr. 5,455,170

fremstilt og utviklet av Hoffmann-La Roche og markedsført av Perkin Eimer, Norwalk, CT.

Amplifikasjons-temperatur-cyklisering ble utført i en TC480 DNA thermal cycler (Perkin Eimer, Norwalk, CT) ved anvendelse av den følgende temperatur-profil:

Deteksjon av amplifisert produkt

Tilstedeværelse av amplifisert produkt ble detektert ved gel-elektroforese som følger. Reaksjonsprodukter ble fraksjonert ved anvendelse av en agarose-gel (100 ml 3% NuSieve og 0,5% SeaChem) og 1XTBE (0,089 M Tris, 0,089 M borsyre, 0,0025 M dinatrium EDTA) kjøre-buffer ble anvendt. Etidium-bromid

(0,5 ug/ml) ble tilsatt for å merke eventuelt tilstedeværende DNA. Elektroforese ble utført ved 100 volt i omtrent 1 time. De etidium-bromid-merkede bånd av DNA ble visualisert ved anvendelse av UV-bestråling.

Resultater

Resultatene av den gel-elektroforetiske analyse kan sees i Figur 1. Spor-nummerene som svarer til hver av amplifikasjonene ved anvendelse av kombinasjoner av de umodifiserte og modifiserte primere er vist i tabellen nedenfor. Båndene som svarer til det ønskede HIV produkt er angitt i figuren med en pil. De andre båndene i gelen svarer til ikke-spesifikt amplifikasjonsprodukt og spesielt, primer-dimer.

Fordi dannelse av primer-dimer konkurrerer med dannelse av det ønskede amplifikasjonsprodukt, resulterer reduksjon av primer-dimer typisk i en samtidig økning i mengden av det ønskede produkt som dannes. Således kan virkningen av de modifiserte primere sees ved å sammenligne mengden av primer-dimer dannet i forhold til mengden dannet ved anvendelse av umodifiserte primere og ved å sammenligne mengden av ønsket mål dannet i forhold til mengden dannet ved anvendelse av umodifiserte primere.

En sammenligning av resultatene ved anvendelse av to umodifiserte primere (spor 1) med resultatene ved anvendelse av en enkelt 3'-modifisert primer (spor 2 og 5} og med resultatene ved anvendelse av to 3'-modifiserte primere (spor 6) indikerer at en reduksjon av primer-dimer ble oppnådd ved anvendelse av enten én elter to modifiserte primere. I amplifikasjoner hvor en enkelt 3'-modifisert primer anvendes, sees en liten forskjell i reduksjonen av primer-dimer, hvilket var avhengig av hvilken primer som ble modifisert. Anvendelse av to modifiserte primere (spor 6) resulterte både i den største reduksjon i primer-dimer og en detekterbar økning i mengden av amplifisert mål-sekvens.

Virkningen åv posisjonen av det modifiserte nukleotid sees ved en sammenligning av sporene 6-8. Reduksjonen av primer-dimer oppnådd ved anvendelse av en primer modifisert i nukleotidet i nabostilling til 3'-terminal nukleotidet (spor 7) var ekvivalent med den som ble oppnådd ved anvendelse av en primer modifisert i det 3'-terminale nukleotid (spor 6), mens forbedringen oppnådd ved anvendelse av en primer modifisert i nukleotidet tre baser oppstrøms for det 3'-terminale nukleotid (spor 8) var litt mindre.

Eksempel 6

Ytterligere amplifikasjoner ved anvendelse av. modifiserte primere -

Effekt av posisjon av modifisert nukleotid

For videre å demonstrere virkningen av de modifiserte primere på dannelsen av primer-dimer, ble sammenligninger utført av amplifikasjoner av HCV RNA ved anvendelse av både modifiserte primere og umodifiserte primere, i det vesentlige som beskrevet ovenfor. Amplifikasjoner ble utført ved anvendelse av tre forskjellig modifiserte nedstrøms primere, som skilte seg fra hverandre bare ved lokaliseringen av den modifiserte base.

Mål- nukleinsvre

HCV RNA-templater ble syntetisert ved anvendelse av en HCV RNA-transkripsjonsvektor som beskrevet i Young et al., 1993, J. Clin. Microbiol. 31{4):882-886.

Primere

Amplifikasjoner ble utført ved anvendelse av både umodifiserte og modifiserte primere. Nukleotid-sekvensene i de umodifiserte primere er vist nedenfor, orientert i 5'- til 3'-retningen. Oppstrøms primer ST280A (SEKV. ID NR: 3) og nedstrøms primer ST778AA (SEKV. ID NR: 4) amplifiserer et 240 basepar- produkt fra den 5-utranslaterte region av HCV-genomet.

Primer-designeringene ovenfor refererer til de umodifiserte primere. Modifiserte primere ble syntetisert som beskrevet i Eksempel 1, hvilke besto av de samme nukleotid-sekvenser som de umodifiserte primere, men inneholdt et benzylert adenosin i enten den 3'-terminale stilling eller i en stilling én eller tre nukleotider oppstrøms for 3Merminus. De modifiserte former av primerene er designert her som følger:

Amplifikasjon oa analvse

Amplifikasjoner bie utført i det vesentlige som beskrevet i Eksempel 3, men ved anvendelse av 100 kopier av HCV RNA-templat. Gel-analyse av det amplifiserte produkt ble utført som beskrevet i Eksempel 3.

Resultater

Resultatene av den gel-elektroforetiske analyse sees i Figur 2. Spor-nummerene som svarer tii hver av amplifikasjonene ved anvendelse av kombinasjoner av de umodifiserte og modifiserte primere er vist i tabellen nedenfor. Båndene svarende til det ønskede HCV-produkt er angitt i figuren med en pil. De andre båndene i gelen svarer til ikke-spesifikt amplifikasjonsprodukt og spesielt, primer-dimer.

Fordi dannelse av primer-dimer konkurrerer med dannelse av det ønskede amplifikasjonsprodukt, resulterer en reduksjon i primer-dimer typisk i en samtidig økning av mengden av ønsket produkt som dannes. Således kan virkningen av de modifiserte primere sees både ved sammenligning av mengden av primer-dimer dannet i forhold til mengden dannet ved anvendelse av umodifiserte primere og ved sammenligning av mengden av ønsket mål dannet i forhold til mengden dannet ved anvendelse av umodifiserte primere.

Resultatene oppnådd var tilsvarende de oppnådd fra HIV-amplifikasjonene beskrevet i det foregående eksempel, men ved HCV-amplifikasjonene var økningen av ønsket produkt mer tydelig enn ved HIV-amplifikasjonene. En sammenligning av resultatene ved anvendelse av to umodifiserte primere (spor 1) med resultatene ved anvendelse av en enkelt 3'-modifisert primer (spor 2 og 5) og med resultatene ved anvendelse av to 3'-modifiserte primere (spor 6) indikerer at en reduksjon av primer-dimer ble oppnådd ved anvendelse av enten én eller to modifiserte primere. Anvendelse av to modifiserte primere (spor 6) resulterte i både den største reduksjon av primer-dimer og en betydelig økning i mengden av amplifisert mål-sekvens. Som i det foregående eksempel, sees en liten forskjell i reduksjon av primer-dimer i amplifikasjonene ved anvendelse av en enkelt 3'-modifisert primer, som avhenger av hvilken primer som ble modifisert.

Virkningen av posisjonen av det modifiserte nukleotid sees ved en sammenligning av sporene 6-8. I det vesentlige ekvivalente resultater ble oppnådd ved anvendelse av primere modifisert i det 3Merminale nukleotid (spor 6), nukleotidet tilstøtende det 3'-terminale nukleotid (spor 7) og nukleotidet tre baser oppstrøms for det 3'-terminale nukleotid (spor 8). Disse resultater indikerer at modifiseringsgruppen kan være bundet til hvilket som helst av de fire nukleotider ved 3'-enden av primeren.

Eksempel 7

Am<p>lifikasjoner ved anvendelse av modifiserte <p>rimere -

Virkning av modifiserinasaruppe

For ytterligere å demonstrere virkningen av de modifiserte primere på dannelsen av primer-dimer og for å demonstrere alternative primer-modifikasjoner, ble sammenligninger utført av amplifikasjoner av HCV RNA ved anvendelse av både modifiserte primere og umodifiserte primere, hvor primerene ble modifisert ved tilsetning av én av tre forskjellige modifiseringsgrupper: benzyl-, nitrobenzyl- og metyl-grupper.

Amplifikasjonsresultater ble analysert ved to forskjellige metoder. Ved et sett av sammenligninger ble tilstedeværelse av primer-dimer undersøkt ved gel-elektroforetisk analyse av reaksjonsproduktene. Ved et andre sett av sammenligninger ble dannelsen av primer-dimer overvåket under amplifikasjonen ved anvendelse av de kinetiske PCR-metoder beskrevet ovenfor.

Mål- nukleinsvre

HCV RNA templater ble syntetisert ved anvendelse av en HCV RNA-transkripsjonsvektor som beskrevet i Young et al., 1993, J. Clin. Microbiol. 31(4):882-886.

Amplifikasionsprimere

Amplifikasjoner ble utført ved anvendelse av både umodifiserte og modifiserte primere. De modifiserte primerene besto av de samme nukleotid-sekvenser som de umodifiserte primerene, men ble modifisert ved det 3'-terminale adenosin ved tilsetning av en metylgruppe, en benzylgruppe eller en nitrobenzylgruppe. Primere ble syntetisert som beskrevet i de foregående eksempler. Designeringene for de anvendte primerene er vist nedenfor.

Amplifikasionsreaksioner

Amplifikasjoner ble utført i 100 |il reaksjoner inneholdende de følgende reagenser:

0,20 eller 200 kopier av HCV RNA-templat

50 mM Tricin, pH 8,3; 110 mM KOAc; 3,5 mM Mn(OAc)2; 300 mM av hver dATP, dCTP, dGTP; 50 \ iM dTTP; 500 uM dUTP; 250 nM av hver primer; 20 U rTth*;

2U UNG*; og

13%glycerol.

<*> fremstilt og utviklet av Hoffmann-La Roche og markedsført av Perkin Eimer, Norwalk, CT.

Termal cyklisering av hver reaksjonsblånding ble utført i en GeneAmp® PCR System 9600 thermal cycler (Perkin Eimer, Norwalk, CT) ved anvendelse av den følgende temperaturprofil:

Deteksjon av amplifisert produkt

A. Gel- elektroforese

Tilstedeværelse av amplifisert produkt ble detektert ved gel-elektroforese som følger. Reaksjonsprodukter ble fraksjonert ved anvendelse av en agarose-gel (100 ml 3% NuSieve, 0,5% SeaChem og 0,5 ug/ml etidium-bromid) og 1X TBE (0,089 M Tris, 0,089 M borsyre, 0,0025 M dinatrium EDTA) kjøre-buffer. Elektroforese ble utført ved 100 volt i omtrent 1 time. De etidium-bromid-. merkede bånd av DNA ble visualisert ved anvendelse av UV-bestråling.

B. Deteksjon ved kinetisk PCR

Ved de kinetiske PCR-metoder beskrevet ovenfor, blir et interkalatert farvestoff så som etidiumbromid, som fluorescerer sterkere når det er innført i dobbelt-trådet DNA, satt til PCR. Økning i dobbelt-trådet DNA under amplifikasjonen blir overvåket ved å måle fluorescensen av farvestoffet under reaksjonen. Fordi de kinetiske PCR-metoder bare måler økning i den totale mengde dobbelt-trådet DNA, blir dannelsen av ikke-spesifikt amplifikasjonsprodukt ikke målt uavhengig. For å måle forekomst av ikke-spesifikk amplifikasjon som er et resultat av primer-dimer uavhengig av templat-amplifikasjon, ble reaksjoner utført uten templat-nukleinsyre. Ved slike templat-frie reaksjoner kan enhver økning av dobbelt-trådet DNA tilskrives dannelse av templat-uavhengig, ikke-spesifikt amplifikasjonsprodukt.

De kinetiske PCR-reaksjonsbetingelser var som beskrevet ovenfor, bortsett fra at etidiumbromid ble satt til reaksjonsblandingen i en konsentrasjon på 1 (g/ml. Reaksjonene ble overvåket ved måling av fluorescensen i reaksjonsblandingen som beskrevet i EP 640 828.

Fluorescens-målinger ble normalisert ved dividering med en initiell fluorescens-måling oppnådd under en cyklus tidlig i reaksjonen mens fluorescens-målingene mellom cyklene var relativt konstant. Cyklus-antallet valgt for de initielle fluorescens-målingene var det samme for alle de sammenlignede reaksjoner, slik at alle målingene representerer økninger relativt til samme reaksjons-cyklus. Reaksjons-fluorescens i mål-frie reaksjoner forble relativt konstant inntil primer-dimer ble dannet. I de fleste reaksjonene, hvis tilstrekkelige amplifikasjons-cykler blir utført, blir primer-dimer til slutt detekterbar. Virkningen av de modifiserte primere kan sees fra en sammenligning av antallet cykler utført inntil primer-dimer blir dannet, om i det hele tatt.

Resultater

Resultatene av gel-elektroforetisk analyse sees i Figur 3. Spor-tallene svarende til hver av amplifikasjonene ved anvendelse av umodifisert og tre typer modifiserte primere og 200 kopier, 20 kopier eller 0 kopier av HCV RNA er vist i tabellen nedenfor (spor-tallene er angitt fra venstre til høyre: sporene 1-30 er i den øverste halvpart av gelen; sporene 31-60 er i den nederste halvpart av gelen). I tillegg var molekylvekt-markørertil stede i sporene 1 og 31 ( Hae III digested PhiX 174 RF DNA, New England Bioloabs, Beverly, MA) og i sporene 30 og 60 (Superladder-low, 20 bp ladder, Gen Sura, Del Mar, CA). Båndene svarende til det ønskede spesifikke produkt er angitt i figuren ved en pil <~ 230 bp). De andre båndene i gelen svarer til ikke-spesifikt amplifikasjonsprodukt og, spesielt, primer-dimer.

Resultatene demonstrerer at amplifikasjon ved anvendelse av de modifiserte primere resulterte i en større mengde av amplifisert HCV nukleinsyre enn amplifikasjoner ved anvendelse av de umodifiserte primere. I tillegg resulterte amplifikasjon ved anvendelse av de modifiserte primere i en reduksjon av primer- dimer, i forhold til amplifikasjoner ved anvendelse av de umodifiserte primere.

I de kinetiske PCR-forsøkene ble fluorescensen overvåket gjennom hele reaksjonen. Økningshastigheten av fluorescensen etter at økningen i fluorescens var detekterbar, var omtrent den samme ved alle reaksjonene, hvilket ble vist ved formen av kurven oppnådd ved plotting av fluorescens versus cyklus-nummer (ikke vist). Dette indikerte at de modifiserte primere ikke detekterbart hemmet effektiviteten av hvert amplifikasjonstrinn etter det initielle amplifikasjonstrinn. Reaksjonene skilte seg betydelig fra hverandre ved antall cykler som ble utført før en økning i fluorescens var detekterbar.

For å kvantifisere forskjellene mellom reaksjonene, blir resultatene uttrykt som antall amplifikasjonscykler utført før fluorescensen oversteg et vilkårlig fluorescens-nivå (AFL). AFL ble valgt nær basislinje fluorescens-nivået, men over området av tilfeldige fluktuasjoner i den målte fluorescens, slik at reaksjons- kinetikken ble målt under den geometriske vekstfasen av amplifikasjonen. Akkumulering av amplifisert produkt i senere cykler hemmer reaksjonen og fører til slutt til et reaksjons-platå.

Kinetiske PCR-resultater er oppsummert i tabellen nedenfor. Hver verdi for amplifikasjoner av 20 eller 200 kopier av mål-templat representerer et gjennomsnitt av fem gjentatte amplifikasjoner, med unntak av amplifikasjoner ved anvendelse av benzylerte primere og 20 kopier av målet, som representerer et gjennomsnitt av fire repetisjoner. Hver verdi for amplifikasjoner uten templat representerer et gjennomsnitt på åtte repetisjoner.

To av åtte gjentagelser av amplifikasjoner ved anvendelse av benzylerte primere uten mål til stede, resulterte ikke i primer-dimer-dannelse etter 46 cykler. Gjennomsnitt av de gjenværende seks amplifikasjoner er vist, som representerer et gjennomsnitt betinget av at primer-dimer blir dannet. Det betingede gjennomsnitt er ikke sammenlignbart med de andre verdiene vist på grunn av de strøkne data.

Dataene indikerer at de modifiserte primere tilsynelatende forsinker amplifikasjon av mål-nukleinsyren slik at AFL blir nådd flere cykler senere. Forsinkelsen svarer ikke til en reduksjon i det endelige utbytte av spesifikt amplifikasjonsprodukt. Alle amplifikasjoner av mål-nukleinsyre ble observert å nå et platå innen de 46 cykler anvendt i forsøket og, som vist ved de tilsvarende data fra den gel-elektroforetiske analyse, ble det endelige utbytte øket ved anvendelse av de modifiserte primere.

Dataene indikerer at forsinkelsen i dannelsen av primer-dimer var betydelig større enn forsinkelsen i amplifikasjon av målet. Den fordelaktige virkningen sees klarest ved sammenligning av mål-frie amplifikasjoner og amplifikasjoner av 200 kopier av templat. Ved anvendelse av umodifiserte primere, forekom økningen i fluorescens til AFL bare én cyklus senere i amplifikasjoner uten mål, hvilket indikerer at amplifikasjon av mål ville være vanskelig å skille fra dannelse av primer-dimer. I motsetning forekom, ved anvendelse av modifiserte primere, økningen i fluorescens på grunn av primer-dimer, minst tre cykler senere og, ved anvendelse av benzylerte primere, minst 6 cykler senere, hvis den i det hele tatt forekom. Mål-amplifikasjon kunne således detekteres og skilles fra dannelsen av primer-dimer..

Ved sammenligning av mål-frie amplifikasjoner og amplifikasjoner av 20 kopier av templat, viste virkningen av de modifiserte primere samme mønster av større forsinkelse i fremkomst av primer-dimer enn forsinkelsen i mål-amplifikasjon. Ved anvendelse av umodifiserte primere kunne 20 kopier av templat ikke detekteres. Ved anvendelse av nitrobenzyl- og benzyl-primere, ble dannelsen av primer-dimer forsinket tilstrekkelig til at deteksjon av 20 kopier av templat i dette system kunne skje.

Data fra overvåkning av fluorescensen ved hver amplifikasjonscyklus (data ikke vist), indikerte at generelt var forsinkelsen i primer-dimer-danneise tilstrekkelig til å hindre at primer-dimer-dannelse nådde et platå-nivå innen de 46 cykler. Således syntes de modifiserte primere å forsinke dannelsen av primer- dimer tilstrekkelig til at amplifikasjon av målet kunne være fullført og reaksjonen stanset før et betydelig nivå av primer-dimer blir dannet.

Eksempel 8

Foto- labile primere

For å demonstrere anvendelse av foto-labile modifiserte primere ble amplifikasjoner av HCV RNA utført ved anvendelse av både modifiserte primere og umodifiserte primere. De modifiserte primere ble modifisert ved binding av én eller to nitrobenzylgrupper til det eksocykliske amin i det 3'* terminale adenin.

Amplifikasionsprimere

Primere ble syntetisert som beskrevet i Eksempel 4. Designeringene av de anvendte primerene er vist nedenfor.

Amplifikasionsreaksioner

For hvert primer-par ble reaksjonene utført ved anvendelse av en fortynningsserie av innført mål-konsentrasjon. To grupper reaksjoner, hver omfattende alle kombinasjoner av primer-par og innført mål-konsentrasjon, ble utført og innen hver reaksjonsgruppe ble hver reaksjon inneholdende et gitt primer-par og målkonsentrasjon, utført in duplo. Amplifikasjoner ble utført i 100 ul reaksjonsblandinger inneholdende de følgende reagenser:.

0,10,10<2>, i 03,104 eller 10<5> kopier av HCV RNA-templat 55 mM tricin,

90 mM KOAc,

3 mM Mn(OAc)2,

200 uM hver av dATP, dCTP, dGTP, dTTP,

200 uM dUTP,

250 nM av hver primer,

lOUrTth*.

2 U UNG<*> og

8% glycerol.

<*> fremstilt og utviklet av Hoffmann-La Roche og markedsført av Perkin Eimer, Norwalk, CT.

Termal cyklisering av hver reaksjonsblanding ble utført i en GeneAmp PCR System 9600 thermal cycler (Perkin Eimer, Norwalk, CT) ved anvendelse av den følgende temperatur-profil:

Polerte reaksjonsrør-hetter (Perkin Eimer, Norwalk, CT) ble anvendt overalt. Etter at reaksjonstemperaturen var hevet til 60°C for revers-transkripsjons-trinnet, ble det oppvarmede lokket fjernet fra PCR-brettet i blokken av termale cykler og halvparten av reaksjonsrørene (et komplett sett av duplikat-reaksjonene) ble dekket med aluminumsfolie. Den andre halvparten ble illuminert ved anvendelse av en hånd-holdt UV-lampe som strålte ved 302 nm (UVP model UVM-57, UVP Products, San Gabriel, CA) i ti minutter. Det oppvarmede dekselet ble satt på plass, og amplifikasjonen ble fortsatt.

Resultater

Resultatene av amplifikasjonene ble analysert ved gel-elektroforese som beskrevet ovenfor. Resultatene er angitt i Figur 4. Primerene og templat-kopi-antall anvendt i hver reaksjon er angitt i geten (log av kopi-tallet vist). Båndene svarende tii det ønskede produkt er angitt i figuren. De andre båndene i gelen svarer til ikke-spesifikt amplifikasjonsprodukt og, spesielt primer-dimer.

En sammenligning av det UV-bestrålte sett av reaksjoner viser at anvendelse av de modifiserte primere resulterte i en betydelig reduksjon av primer-dimer, spesielt ved lave kopi-tall.

En sammenligning av det ikke-bestrålte sett av reaksjoner viser at anvendelse av bis-nitrobenzyl-primere resulterte i en fullstendig hindring av amplifikasjon, som forventet. Amplifikasjoner ved anvendelse av mononitrobenzyl- primerene ga ikke bare produkt, men viste en betydelig reduksjon i primer-dimer, hvilket er konsistent med resultatene oppnådd i det foregående eksempel.

Eksempel 9

Amplifikasjoner ved anvendelse av p- te/ f- butvlbenzvl- modifiserte primere

Dette eksempel beskriver amplifikasjon av HCV RNA ved anvendelse av primere modifisert med p-fe/f-butylbenzylgrupper.

Mål- nukleinsvre

HCV RNA-templater ble syntetisert ved anvendelse av en HCV RNA-transkripsjonsvektor som beskrevet i Young era/., 1993, J. Clin. Microbiol. 31(4):882-886.

Primere

Amplifikasjoner ble utført ved anvendelse av modifiserte primere syntetisert som beskrevet i Eksempel 2 ovenfor. Nukleotid-sekvensene i de umodifiserte primere er vist nedenfor, orientert i 5'- til 3'-retningen. De anvendte primerene var modifiserte versjoner av oppstrøms primer ST280A (SEKV. ID NR: 3) og nedstrøms primer ST778AA (SEKV. ID NR: 4). De modifiserte formene av primerene er betegnet her som følger:

Am<p>lifikasjon oa Analvse

Amplifikasjoner ble utført i 100 ul reaksjonsblandingér inneholdende de følgende reagenser:

20, 5, 2,5, 2 eller 0 kopier av HCV-templat RNA

50 mM Tricin (pH 8,33),

110 mM KOAc,

300 mM hver av dATP, dCTP og dGTP,

50 uM dTTP

500 uM dUTP,

50 nM av hver primer,

3,5 mM Mn(OAc)2<

13%glycerol.

20 enheter av xTth DNA polymerase og

8,0 enheter av UNG<*.>

<*> fremstilt og utviklet av Hoffmann-La Roene og markedsført av Perkin Eimer, Norwalk, CT.

Amplifikasjons-temperatur-cyklisering ble utført i en TC480 DNA thermai cycler (Perkin Eimer, Norwalk, CT) ved anvendelse av den følgende temperatur- profil:

Amplifikasjonsproduktene ble analysert ved gel-elektroforese, som beskrevet ovenfor.

Resultater

Amplifikasjoner utført med hvert mål-templat-antall ble replikert som følger: 3 amplifikasjoner ble utført ved anvendelse av 20 kopier av mål-templat, 3 amplifikasjoner ble utført ved anvendelse av 5 kopier av mål-templat, 2 amplifikasjoner ble utført ved anvendelse av 2,5 kopier av mål-templat, 1 amplifikasjon ble utført ved anvendelse av 2 kopier av mål-templat og 23 amplifikasjoner ble utført uten mål til stede. Alle templat-positive amplifikasjoner resulterte i et enkelt bånd på gelen av den forventede mål-størrelse. Ingen av amplifikasjonene resulterte primer-dimer eller annet ikke-spesifikt amplifikasjonsprodukt.

Resultatene kan sammenlignes med de i Eksempel 6 ovenfor, hvor samme HCV-mål ble amplifisert ved anvendelse av de samme primer-sekvenser. En sammenligning av disse resultatene med de i Eksempel 6 indikerer at amplifikasjoner ved anvendelse av p-fert-butylbenzyl-modifiserte primere var betydelig forbedret i forhold til de tilsvarende amplifikasjoner utført med umodifiserte primere.

Ytterligere eksperimenter ble utført hvor HIV-1 RNA ble amplifisert ved

anvendelse av p-fert-butylbenzyl-modifiserte versjoner av primerene beskrevet i Eksempel 5 ovenfor. Amplifikasjonene ble utført i det vesentlige som beskrevet ovenfor. Som med HCV-systemet beskrevet her, resulterte alle HIV-1 templat-positive amplifikasjoner i et enkelt bånd på gelen av den forventede

målstørrelse og ingen av amplifikasjonene resulterte i primer-dimer eller annet ikke-spesifikt amplifikasjonsprodukt.

Disse ytterligere resultater kan sammenlignes med de i Eksempel 5 ovenfor, hvor samme HIV-mål ble amplifisert ved anvendelse av samme primer- sekvenser. En sammenligning av disse resultatene med de i Eksempel 5 ovenfor, indikerer at amplifikasjoner ved anvendelse av p-fert-butylbenzyl-modifiserte primere var betydelig forbedret i forhold til de tilsvarende amplifikasjoner utført med umodifiserte primere.

Eksempel 10

Amplifikasjon av mvcobakteriell DNA

Dette eksempel beskriver en sammenligning av amplifikasjoner av mycobakteriell DNA utført ved anvendelse av umodifiserte og modifiserte primere. Både primere modifisert ved tilsetning av en benzylgruppe til det 3'-terminale nukleotid og primere modifisert ved tilsetning av en p- tert-butylbenzylgruppe til det 3'-terminale nukleotid ble anvendt. Reaksjonene ved anvendelse av umodifiserte primere var i det vesentlige som beskrevet i Tevere et al., 1996, J. Clin. Microbiol. 34(4}:918-923. Amplifikasjoner ble utført ved anvendelse av sputum-prøver i hvilke mycobakterielt DNA var tilsatt i en kjent konsentrasjon for å etterligne infiserte kliniske prøver. Ytterligere amplifikasjoner ble utført ved anvendelse av renset mycobakterielt DNA og ved anvendelse av DNA-frie negative kontroll- prøver.

Prøve- fremstilliha

Sputum-prøver som tidligere var vist å være negative for mycobakterier ved mikroskopi og kultur ble gjort flytende og dekontaminert ved N-acetyl-cystein-NaOH-metoden anbefalt av CDC (Kent og Kubica, 1985, Public Health Mycobacteriology - a guide for the level III laboratory, U.S. Department of

Health and Human Services, Centers for Disease Control, Atlanta, inntatt hér ved referanse). Flytende sputum (100 ul) ble satt til 500 ul av Respiratory Specimen Wash Reagent (10 mM Tris-HCI, 1 mM EDTA, 1% (volum/volum) Triton X-100,0,05% NaN3, pH8,0) og sentrifugert i 10 minutter ved 12,500 x g.

Hver pellet ble resuspendert i 100 ul lyse-reagens (0,05 N NaOH, 1%

(volum/volum) Triton X-100,1 mM EDTA, 0,05% NaN3) og inkubert i 45

minutter ved 60°C. Lysatene ble deretter nøytralisert med 100 [il nøytraliseringsreagens (0,2 M Tris- HCI, 8 mM MgCI2, 0,05% NaN3, pH 7,5).

Samlede sputum-lysater ble dannet ved å blande 80 ut av hver av to separate sputum-lysater. Til hver av 8 samlede sputum-lysater (160 ul hver) ble satt 15 (il av en DNA-iagerbeholdning (2 kopier/pl i en 1:1 blanding av lyse og nøytraliserings-reagenser) renset fra dyrket M. tuberculosis.

Prøver inneholdende renset mycobakterielt DNA (intet sputum) i en kjent konsentrasjon ble fremstilt ved tilsetning av 10 pl av DNA-lagerbeholdningen til 100 ul av en 1:1 blanding av lyse-reagens og nøytraliserings-reagens.

Negative kontroll-prøver (intet DNA) besto av en blanding av 100 pl lyse-reagens og 100 pl nøytraliserings-reagens.

Amplifikasions- primere

Amplifikasjoner ble utført ved anvendelse av primere bestående av de følgende nukleotid-sekvenser:

De følgende primer-par, inneholdende den angitte modifiseringsgruppe bundet til den 3Merminale base, ble anvendt ved amplifikasjonene. Alle modifiserte primere ble syntetisert som beskrevet i de foregående eksempler. Alle primere ble biotinylert ved 5'-enden.

Amplifikasjon

For hver prøve ble amplifikasjonene utført ved anvendelse av det umodifiserte primer-par, KY18 (SEKV. ID NR: 5) og KY75 (SEKV. ID NR: 7) og modifiserte former av primer-parene, KY436 (SEKV. ID NR: 6) og KY75 (SEKV. ID NR: 7).

Amplifikasjonene ble utført i 100 pl reaksjonsblandinger, hver inneholdende 50 pl av én av de tre prøver beskrevet ovenfor og 50 pl av en 2X reagens-blanding, som inneholder de følgende reagenser: 100mMTris-HCI, pH 8,9; 500 nM av hver primer; 200 mM (hver) av dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dUTP); 20 % (volum/volum) glycerol; 10 enheter AmpliTaq(<*>;

6 enheter AmpEraset<*>.

<*> Fremstilt og utviklet av Hoffmann-La Roche og markedsført av Perkin Eimer (Norwalk, CT);

Termal cyklisering av hver reaksjon ble utført i en GeneAmp PCR system 9600 thermal cycler (Perkin Eimer, Norwalk, CT) ved anvendelse av den følgende temperatur-profil:

Pre-reaksjons-inkubering 50°C i 5 minutter;

Amplifikasjonsprodukter ble visualissert ved elektroforese gjennom en 2% Nusieve<®>, 0,5% agarose-gel fulgt av etidiumbromid-merking.

Resultater

Resultatene av den elektroforetiske analyse er vist i Fig. 5. For hver prøve ble produktene fra amplifikasjoner utført med umodifiserte primere

(betegnet "A") og med modifiserte primere (betegnet "B" og "C") kjørt i tilstøtende spor. Båndene svarende til den ønskede mycobakterielle mål-sekvens er angitt med piler. Andre bånd svarer tit ikke-spesifikt amplifikasjonsprodukt; idet de laveste bånd i gelen svarer til primer-dimer.

Spor markert med "M" inneholder en molekylvekt-markør ( Hae lll-kutting av PNX174 DNA).

Ved anvendelse av de umodifiserte primere resulterte amplifikasjoner av renset mycobakterielt DNA i dannelse av primer-dimer. Anvendelse av de modifiserte primer-par øket mengden av ønsket mål til stede og eliminerte i det vesentlige dannelse av detekterbar primer-dimer.

I motsetning til amplifikasjoner av renset DNA, ved anvendelse av de umodifiserte primere, reduserte tilstedeværelse av sputum-lysat i amplifikasjons-reaksjonen, effektiviteten og øket dannelsen av ikke-spesifikt amplifikasjonsprodukt, som vist ved tilstedeværelse av uvedkommende produkt-bånd. Økning av ikke-spesifikt amplifikasjonsprodukt er ikke overraskende, gitt at sputum-lysater inneholder en betydelig mengde humant DNA, som ikke var til stede i amplifikasjonene av renset mycobakterielt DNA. Anvendelse av et av de modifiserte primer-par i amplifikasjoner utført i nærvær av sputum resulterte både i en betydelig økning av mengden av ønsket produkt dannet og en reduksjon av ikke-spesifikk amplifikasjon.

Eksempel 11

Ytterligere syntese av primere modifisert med en benzylgruppe

Primere modifisert ved tilsetning av en benzylgruppe til et terminalt cytosin ble syntetisert i det vesentlige som beskrevet i Eksempel 1, men ved anvendelse av et LCAA-CPG-lenket N<4->acetyl-N<4->benzyl-5'-0-DMT-2'-deoksycytidin fremstilt som beskrevet nedenfor.

4

Trinn 1: Syntese av N -benzyl-2'-deoksycytidin

Til 2'-deoksycytidin-hydroklorid (5,28g, 20 mmol, U.S. Biochemical Corp., Cleveland, OH) ble satt benzylamin (20 ml), og blandingen ble oppvarmet ved 150°C i 3 timer under en argonatmosfære. Løsningen ble konsentrert under vakuum, hvilket ga en viskøs gul olje, som ble fordelt mellom vann (100 ml) og etylacetat (100 ml). Den vandige fasen ble vasket med etylacetat (100 ml) og separert. Den vandige fasén ble konsentrert under vakuum, hvilket ga en gul sirup (13 g), som ble renset ved silikagel-kolonnekromåtografi med 15:1 metylenklorid:metanol som elueringsmiddel, hvilket ga det ønskede produkt (5,8 g, 91,5%), som en farveløs sirup.

4 4

Trinn 2: Syntese av N -acetyl, N -benzyl-2'-deoksycytidin N 4-benzyl-2'-deoksycytidin (2,5g, 7,9 mmol) ble oppløst i 15 ml tørr dimetylformamid (15 ml), eddiksyreanhydrid (8g, 79 mmol, 10 ekv.) ble tilsatt, og blandingen ble omrørt natten over ved romtemperatur. Oppløsningsmidlet og overskudd av eddiksyreanhydrid ble avdampet under vakuum. Produktet ble renset ved kolonnekromatografi med silikagel ved anvendelse av 20:1 metylenklorid:metanol som elueringsmiddel, hvilket ga tittelforbindelsen (1,3 g, 48%). Forbindelsen var meget hygroskopisk og ble lagret tørket ved -20°C.

Trinn 3: Syntese av N<4->acetyl-N<4->benzyl-5'-0-DMT-2'-deoksycytidin.

N4-acetyl-N4-benzyl-2'-deoksycytidin (76 mg, 0,2 mmol) bie oppløst i 1 ml tørr pyridin og DMT-CI (122 mg, 0,2 mmol, 1,0 ekv.) ble tilsatt. Reaksjonsblandingen ble omrørt i 3 timer. Analyse ved TLC viste at noe

utgangsmateriale var tilbake, slik at en ytterligere aliquot av DMT-CI (61 mg, 0,5 eq) ble tilsatt og den resulterende blanding ble omrørt i ytterligere en time, ved hvilket tidspunkt analyse ved TLC viste at reaksjonenen var fullstendig. Reaksjonen ble stanset med 15 ml saltvann-løsning, og den vandige fasen ble ekstrahert med metylenklorid (3X15 ml). De samlede organiske lag ble vasket med saltvann (2X15 ml) og tørret over vannfritt maghesiumsulfat. Oppløsningsmidlet ble avdampet og blandingen ble renset ved silikagel

4 kromatografi ved anvendelse av 50:1 metylenklorid: metanol, hvilket ga N -acetyl-N<4->benzyl- 5'-0-DMT-2'-deoksycytidin (96 mg, 65% utbytte).

Trinn 4: Succinylering

N<4->acetyl- N<4->benzyl- 5'-0-DMT-2<*->deoksycytidin (96 mg, 0,13 mmol) ble oppløst i 2 ml tørr pyridin. Ravsyreanhydrid (100 mg, 1,0 mmol) og dimetylaminopyridin (20 mg) ble tilsatt, og den resulterende blanding ble omrørt ved romtemperatur i tre dager.. Oppløsningsmidlet ble avdampet og residuet ble saminndampet med toluen (3X10 ml). Kloroform (50 ml) ble tilsatt for å oppløse residuet (sonikering ble anvendt for å hjelpe på oppløsning). Kloroform-laget ble vasket med saltvann (3X15 ml) og vann (1 X 15 ml). Det organiske laget ble tørret med vannfritt magnesiumsulfat. Oppløsningsmidlet ble avdampet, hvilket ga 108 mg ren N<4->acetyl-N<4->benzyl-5'-0-DMT-2,-deoksycytidin-3'-0-succinat (97% utbytte).

Trinn 5: Fremstilling av LCAA-CPG-lenket 5'-0-DMT- N<4->acetyl-N<4->benzyl-2'-deoksycytidin-3'-0-succinat

Aktivert CPG ble fremstilt som følger. LCAA-CPG (1,0 g, LCA00500C, CPG Inc., Fairfield, NJ) ble behandlet med trikloreddiksyre i metylenklorid (3%, 10 ml) og ble blandet ved rotasjon på en rotasjonsinndamper (rotovapor, Buchi, Flawil, Switzerland) (ikke vakuum) i 4 timer. Oppløsningsmidlet ble filtrert fra og CPG ble vasket etter hverandre med 9:1 trietylamin:etyldiisopropylamin (3X5 ml), metylenklorid (3X10 ml) og eter (3X10 ml), og deretter tørret under vakuum.

Kobling av det modifiserte nukleosid-mellomprodukt til syrevasket CPG ble utført som følger. Til 1 gram aktivert LCAA-CPG ble satt N 4 -acetyl-N 4-benzyl, 5<4->0-DMT-2'-deoksycytidin-3'-0-succinat (108mg, 0,13mmol), fremstilt som

beskrevet ovenfor, dimetylaminopyridin (20mg) og 5 ml tørr pyridin. Reaksjonsblandingen ble rotert på en rotasjonsinndamper (ikke vakuum) i tre dager. Den overliggende væsken ble filtrert fra og det koblede LCAA-CPG ble vasket sekvesielt med pyridin

(3X5 ml), metylenklorid (3X10 ml) og eter (3X10 ml) og deretter tørret i vakuum.

Capping av LCAA-CPG lenket med N<4->acetyl-N<4->benzyl-5'-0-DMT-2'-deoksycytidin-3'-0-succinat ble utført som følger. Til det derivatiserte CPG ble satt Capping mix reagens A (THF/Lutidin/Ac20 8:1:1, Glen Research DNA synthesis reagents, Sterling, VA) og B (i0% N-metylimidazol i THF, Glen Research) og reaksjonsblandingen ble rotert på en rotasjonsinndamper (ikke vakuum) natten over. Løsningen ble filtrert fra og det koblede LCAA-CPG bie vasket sekvensielt med pyridin (3X5 ml), metylenklorid (3X10 ml), THF (3X10 ml) og eter (3X10 ml) og deretter tørret under vakuum.

Koblings-kapasiteten til det derivatiserte LCAA-CPG ble bestemt ved behandling av 5 mg av produktet med 3% trikloreddiksyre i metylenklorid og mengden av frigjort dimetoksyltrityl-karboniumion ble målt ved UV-spektroskopi. Mengden av nukleosid-derivat knyttet til LCAA-CPG ble funnet å være 19,5 umol/g.

Claims (10)

1. Oligonukleotid, karakterisert ved den generelle struktur: hvor Sf representerer en første sekvens av nukleotider med lengde mellom omtrent 5 og omtrent 50 nukleotider; S2 representerer en andre sekvens med lengde mellom én og tre nukleotider; N representerer et nukleotid som inneholder en purin- eller pyrimidin-base som inneholder et eksocyklisk amin; R representerer en modifiserende gruppe, hvor R er kovalent bundet til N gjennom det eksocykliske amin og hvor R har strukturen: hvor R-j og R2 uavhengig representerer hydrogen, en C-|-Ci0 alkyl-gruppe, en alkoksygruppe, en fenylgruppe, en fenoksygruppe, en substituert fenylgruppe, en naftylgruppe eller en substituert naftylgruppe.

2. Oligonukleotid ifølge krav 1,karakterisert ved at R er en 2-naftylmetylgruppe; en benzylgruppe; eller en substituert benzylgruppe.

3. Oligonukleotid ifølge krav 1 eller krav 2, karakterisert ved at R er en substituert benzylgruppe som har strukturen: hvor R3 representerer en C^- Cq forgrenet eller lineær alkylgruppe, en metoksygruppe eller en nitrogruppe.

4. Oligonukleotid ifølge hvilket som helst av kravene 1-3, karakterisert ved at R3 representerer en Ci -C4 forgrenet eller lineær alkylgruppe, en metoksygruppe eller en nitrogruppe.

5. Oligonukleotid ifølge krav 3 eller krav 4, karakterisert ved at R3 er bundet i para-stilling.

6. Oligonukleotid ifølge hvilket som helst av kravene 1-5, karakterisert ved at N er adenosin.

7. Oligonukleotid ifølge hvilket som helst av kravene 1-6, karakterisert ved at R er valgt fra gruppen bestående av benzyl, p-metylbenzyl, p-fert-butylbenzyl, p-metoksybenzyl, onitrobenzyl og 2-naftylmetyl.

8. Metode for amplifisering av en nukleinsyre-målsekvens, karakterisert ved at den omfatter utførelse av en amplifikasjonsreaksjon ved anvendelse av minst ett oligonukleotid ifølge hvilket som helst av kravene 1-7.

9. Metode ifølge krav 8, karakterisert ved at den er en potymerasekjedereaksjon.

10. Sett for utførelse av en nukleinsyre-amplifikasjonsreaksjon, karakterisert ved at nevnte sett omfatter et oligonukleotid ifølge hvilket som helst av kravene 1 -7.