JP2004532026A - Ｐ４５０単一ヌクレオチド多型バイオチップ分析 - Google Patents

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Abstract

この発明は、Ｐ４５０遺伝子の単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）検出するための方法および組成物関する。好ましい実施態様では、質問プローブの自己伸長が、新規非自己伸長プローブおよび／または方法を使用することによって防止され、これによって最小誤り陽性結果での標的サンプル中のＰ４５０ＳＮＰ検出の特異性および効率を改善する。本発明はこうして、質問プローブの自己伸長を減少させる種々の方法を記載する。加えて、この発明は、１アッセイでのＰ４５０ＳＮＰプローブの独特な集合物、７Ｐ４５０遺伝子のそれぞれの特異的増幅のためのプライマー配列および意図されたｐ４５０遺伝子標的が首尾よく増幅されたか評価すルためのアンプリコンコントロールプローブを提供する。発明はまた、全てここに記載される、発明のアッセイを実行するための種々のアレイプラットフォーム；例えばCodeLink(登録商標）、カートリッジとマルチプレックスアレイ等を記載する。

Description

【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、全般に、新規プローブを使用するＰ４５０遺伝子の単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）の決定のための新規方法および組成物、およびＰ４５０ＳＮＰ検出の特異性および効率を改善する方法を指向する。この発明は、１つのアッセイのＰ４５０ＳＮＰプローブの独特の集合物を提供し、これは種々のアレイプラットフォーム、７つのＰ４５０遺伝子のそれぞれの特異的増幅のためのプライマー配列、およびアンプリコンコントロールプローブ上で実施し、意図されるＰ４５０遺伝子標的が首尾良く増幅されたかいなか評価できる。
【０００２】
発明の背景
体内の薬物代謝の基本的目的は、薬物をより水溶性とし、それにより尿または胆汁中容易に分泌されるようにすることである。薬物を代謝する１つの共通のやり方は、チトクロムＰ４５０酵素による、親分子の官能基の変化（例えば酸化）に関係する。これらの酵素は、肝臓中に卓越して見出される。チトクロムｐ４５０酵素は、多くの薬物代謝経路並びにコレステロール、ステロイドおよび他の重要な脂質、例えばプロスタシクリンおよびトロンボキサンＡ２を作成するために使用される経路に関係する。多くの薬物相互作用は、チトクロムＰ４５０酵素の阻害または誘導の結果である。
【０００３】
哺乳動物チトクロムＰ４５０遺伝子は、内生および外生化合物の酸化的代謝において活性である、ヘムタンパク質のスーパーファミリーをコードする。チトクロムＰ４５０（ＣＹＰという）は現在、アミノ酸類似性に基づいて；４０％より大きい類似性を示すファミリーチトクロム内Ｐ４５０、およびサブファミリー内で５５％より大きい類似性に分類される。チトクロムＰ４５０酵素を、文字「ＣＹＰ」、次いで数字、文字および他の数字によって命名される（例えばＣＹＰ２Ｄ６）。ヒトでは、２０より多い異なるＣＹＰ酵素が存在する。コンパイルの結果、チトクロムＰ４５０ ２Ｃ酵素サブファミリーは、３６の明瞭な遺伝子および偽遺伝子を含み、そして現在までに同定された最大のチトクロムｐ４５０サブファミリーである。哺乳動物チトクロムＰ４５０遺伝子は、転写のレベルで一次的に調節されることが一般に受け入れられ、そして転写を調節する要因について知られる情報はほとんどない。
【０００４】
ｐ４５０酵素には、広範の多型（例えば突然変異）が存在し、これらの多型の多くは、酵素活性の阻害または誘導という結果となる（またはそれと連関する）。これらの多型は頻繁に、人種的集団に発生する。この点についてもっとも詳細に研究されたチトクロムＰ４５０遺伝子は、チトクロムＰ４５０ ２Ｄ６という、デブリイソキンヒドロキシラーゼ遺伝子、およびチトクロムＰ４５０ ３２Ｃ１９であって、これはＳ−メフェントシンヒドロキシラーゼをコードする。種々の他のＰ４５０酵素は、発現レベルの変異を示す。例えば、チトクロムＰ４５０ ３Ａ４という、ヒト肝臓に存在する主要なチトクロムＰ４５０は、タンパク質およびｍＲＮＡレベルの両方で数倍範囲にわたる変化をする。加えて、Ｐ４５０酵素の多くは、バルビツール酸系催眠薬、抗生物質等を含む種々の薬物による誘導の対象となる。
【０００５】
本発明で特に興味深いのは、ＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ１Ｂ１、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ３Ｄ６、ＣＹＰ２Ｅ１およびＣＹＰ３Ａ４である。ＣＹＰ２Ｄ６は、詳細に研究され、というのは、白人のおおむね７ないし１０パーセントはＣＹＰ２Ｄ６によって代謝される薬物の不全代謝者であるからである。通常のＣＹＰ２Ｄ６活性を有する患者は、多量代謝者と呼ばれ、アジア人およびアフリカ系アメリカ人は、白人より不全代謝者である傾向が少ない。不全代謝者は、薬物蓄積およびこの酵素によって代謝された薬物由来の毒性のリスクがある。たった２ないし６パーセントの総肝臓チトクロームＰ４５０がＣＹＰ２Ｄ６であるが、臨床的に有用な投薬のほとんど２５パーセントは、この酵素によって代謝される。ＣＹＰ２Ｄ６基質の不全代謝者は、ＣＹＰ２Ｄ６によって代謝される投薬由来の増加された毒性のリスクがある。逆に、活性メタボライトの形成が薬物作用に必須であるとき、ＣＹＰ２Ｄ６の不全代謝者は、多量代謝者と比較して薬物治療により応答をしめすことができない。約１５パーセントの臨床的に使用される投薬は、ＣＹＰ１Ａ２によって代謝され、そしてそれはタバコおよび他の多環式芳香族炭化水素によって誘導されるＣＹＰのみである。
【０００６】
ＣＹＰ２Ｅ１は、比較的小フラクションの投薬を代謝し（それは、アセトアミノフェノンの代謝において重要な役割を有するが）、それは毒素の活性化および不活性化において重要な役割を演ずる。それはエタノールによって誘導可能であり、そして基本的に小有機性分子を代謝される。
【０００７】
ＣＹＰ３Ａファミリーのメンバーは、ヒトで最も豊富かつ最も臨床的に重要なチトクロム酵素であり、ＣＹＰ３Ａ４は、最も普通の形態であり、そしてほとんどの薬物相互作用に最も広く関係する。ＣＹＰ３Ａ４ファミリーは、小腸に位置し、そして薬物に加えて、また体の内生ステロイドのほとんどを代謝する原因である。
【０００８】
ＣＹＰ２Ｄ６とともにＣＹＰ２Ｃ１９はまた、遺伝的多型を示し、３パーセントの白人および２０パーセントの日本人は該酵素を完全に欠く。これらの個体は、より頻繁かつより重度な不利な効果のリスクにあり、ＣＹＰ２Ｃ１９によって代謝される薬物の減少された排除のためである。
【０００９】
こうして、特定のＰ４５０ ＳＮＰの検出は、診断投薬および分子生物学調査において、およびまた多くの薬物の作用の機構を理解するため重要であり、そして治療的に関連の表現型的変異の直接的原因および／または疾患素因でありそうである。
【００１０】
正確なＳＮＰ検出は、ＳＢＥアッセイの良好な感度を要する。マイクロアレイ上のＳＮＰの高度に平行的なスクリーニング２つの大きなハードルは：１）ＰＣＲによってＳＮＰを横切るＤＮＰ領域を増幅し、反復可能なやり方で複合ヒトゲノム中の単一延期変異を検出する十分な感度および特異性を達成する必要性；および２）２倍体ヒトゲノムのホモ接合およびヘテロ接合アリル変異の間をあいまいでなく区別する可能性、である。アリル特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）プローブでのディファレンシャルハイブリダイゼーションは、マイクロアレイ形式で最も普通に使用される（Pastinen et al., Genome Research 2000）。感度の要求（すなわち低検出限界）は、分析前の特異的核酸配列を指数間数的に増幅することを研究者に可能とする、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）および他の増幅技法の開発によって大きく省略された（レビューのために、Abramson et al., Current Opinion in Biotechnology, 4;41-47(1993)参照）。ＳＮＰ遺伝子座の、オリゴヌクレオチドアレイヘのその後のハイブリダイゼーションによる、マルチプレックスＰＣＲ増幅は、少なくとも何百のＳＮＰを同時的に遺伝子型決定する正確且つ信頼できる方法であることが示された；Wang et al., Science, 280:1077(1988)参照；またSchafer et al., Nature Biotechnology 16:33-39(1998)参照。
【００１１】
対照的に、特異性は、多くの現在利用可能な遺伝子プローブアッセイに問題が残る。プローブと標的の間の分子相補性の程度は、相互作用の特異性を規定する。プローブ、標的およびハイブリダイゼーション媒体の塩の濃度、反応温度、およびプローブの長さの変異は、プローブ／標的相互作用の特異性を変化または影響し得る。
【００１２】
ミスマッチで標的から完全な相補性を有する標的を区別することは、ある状況下では可能であり得るが、これは一般に、伝統的な技法を使用して、非常に困難であり、なぜなら反応条件の小さい変異は、ハイブリダイゼーションを変化させるからである。標準的プローブでのミスマッチ検出のための新規実験的技法は、以下に詳細に規定するように、ＯＬＡ、ＲＣＡ、Ｉｎｖａｄｅｒ（登録商標）、単一塩基伸長（ＳＢＥ）法、アリルＰＣＲ、および競合的プローブ分析を含むがこれらに限定されない。ＳＢＥアッセイでは、ポリヌクレオチドプローブを、支持体に付着させ、そして標的ＤＮＡにハイブリダイズさせる。
【００１３】
一般に、ＳＢＥアッセイのために、プローブセットは、プローブの３’末端のヌクレオチドが標的中のクエリー塩基とマッチまたはミスマッチのいずれかであるように設計される。もし塩基がマッチしハイブリダイズするならば、ＤＮＡポリメラーゼは、４種の標識されたターミネーターヌクレオチドの存在下、１塩基によって、プローブを伸長させるであろう。代替的に、３’塩基がミスマッチであるならば、ＤＮＡポリメラーゼは、プローブを伸長させない。こうして、標的中のＳＮＰまたはクエリー塩基の同一性は、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長されるプローブセットによって決定される。
【００１４】
あるプローブは、内部幹−環構造（internal stem-loop strictires）を形成し、プローブの標的に依存しない自己伸長という結果となり、こうしてＳＮＰ塩基の決定を妨害する誤りの陽性のシグナルを生じる。本発明は、そのような問題に打ち勝つことを目的とする。
【００１５】
よって、１または２以上の患者からのサンプルを評価するための組成物および方法を提供すること、存在する種々のＰ４５０酵素のレベルおよび／または遺伝子型を確認することが本発明の目的である。本発明の更なる目的は、Ｐ４５０ ＳＢＥアッセイの感度および特異性を増加させることである。本発明は、増幅方法の組み合わせ、および標的の不存在下での捕捉プローブの自己伸長を防止するための方法を使用し、それによって誤りの陽性結果の発生を減少させる。
【００１６】
発明の要約
上記概説目的にしたがって、本発明は、ＣＰＹ１Ａ１をコードする核酸のセンス鎖の一部に実質的に相同な、少なくとも１の捕捉プローブを含むアレイを含む固体基質を含むバイオチップであって、少なくとも１の捕捉プローブが、ＣＰＹ１Ａ２をコードする核酸のセンス鎖の第１部分に実質的に相同であり、少なくとも１の捕捉プローブがＣＰＹ１Ｂ１をコードする核酸のセンス鎖の第１部分に実質的に相同であり、少なくとも１の捕捉プローブがＣＰＹ２Ｃ１９をコードする核酸のセンス鎖の第１部分に実質的に相同であり、少なくとも１の捕捉プローブがＣＹＰ２Ｄ６をコードするセンス鎖の第１部分に実質的に相同であり、少なくとも１の捕捉プローブがＣＹＰ２Ｅ１をコードする核酸のセンス鎖の第１部分に実質的に相同であり、そして少なくとも１の捕捉プローブが、ＣＰＹ３Ａ４をコードする核酸のセンス鎖の第１部分に実質的に相同である、バイオチップを提供する。
【００１７】
加えて、本発明は、ＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ１Ｂ１、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｅ１、およびＣＹＰ３Ａ４からなる群より選択される少なくとも１の標的配列中の検出位置のヌクレオチドの同定を決定する方法であって、該方法はＣＰＹ１Ａ１をコードする核酸の第１部分に実質的に相同な少なくとも１の第１捕捉プローブ、ここで該第１捕捉プローブは検出位置に直接隣接し、またはその末端に含み、ＣＰＹ１Ａ２をコードする核酸のセンス鎖の第１部分に実質的に相同な少なくとも１の第２捕捉プローブ、ここで該第２捕捉プローブは検出位置に直接的に隣接し、またはその末端に含み、ＣＰＹ１Ｂ１をコードする核酸のセンス鎖の第１部分に実質的に相同な少なくとも１の第３捕捉プローブ、ここで該第３捕捉プローブは検出位置に直接隣接し、またはその末端に含み、ＣＰＹ２Ｃ１９をコードする核酸のセンス鎖の第１部分に実質的に相同な少なくとも１の第４捕捉プローブ、ここで該第４捕捉プローブは検出部分に直接的に隣接しまたはその末端に含み、ＣＰＹ２Ｄ６をコードする核酸のセンス鎖の第１部分に実質的に相同な少なくとも１の第５捕捉プローブ、ここで該第５捕捉プローブは検出部分に直接的に隣接しまたはその末端に含み、ＣＰＹ２Ｅ１をコードする核酸のセンス鎖の第１部分に実質的に相同な少なくとも１の第６捕捉プローブ、ここで該第６捕捉プローブは検出部分に直接的に隣接しまたはその末端に含み、ＣＰＹ３Ａ４をコードする核酸のセンス鎖の第１部分に実質的に相同な少なくとも１の第７捕捉プローブ、ここで該第７捕捉プローブは検出部分に直接的に隣接しまたはその末端に含み、を含むアレイを提供することを含む方法を提供する。該方法はさらに、少なくとも１の標的配列を、その対応する捕捉プローブにハイブリダイズさせ、ハイブリダイゼーション複合体を形成すること、もしｄＮＴＰが検出位置に完全に相補的であるならば、該ｄＮＴＰが捕捉プローブに付加し、伸長されたプローブを形成するような条件下で、ポリメラーゼおよび、標識を含む少なくとも１のｄＮＴＰを添加すること、当該伸長されたプローブの質問位置ヌクレオチドを決定することを含む。
加えて、本発明は、標的配列中の検出位置のヌクレオチドの同定を決定する方法を提供する。該方法は、捕捉プローブのアレイを含むハイドロゲル層を含む第１表面を有する固体支持体を含むアレイを提供すること、該標的配列を該捕捉プローブの少なくとも１つにハイブリダイズさせハイブリダイゼーション複合体を形成させること、および該検出位置のヌクレオチドを決定することを含む。
【００１８】
加えて本発明は標的配列の検出位置のヌクレオチドの同定を決定する方法を提供する。該方法は、非自己伸長プローブを形成し、その結果非自己伸長プローブの自己伸長が標的の不存在下で起こらないよう修飾された、少なくとも１の伸長プローブを含む第１表面を有する固体支持体を提供すること、（そしてここで、該非自己伸長プローブは質問ヌクレオチド含む）、該標的配列を非自己伸長プローブにハイブリダイズさせ、ハイブリダイゼーション複合体を形成させること、該表面を、伸長酵素および、ハプテンを含む少なくとも１の鎖終結化ヌクレオチドと、該鎖終結化ヌクレオチドが、ハイブリダイゼーション複合体中の非自己伸長プローブの３’末端にすぐに隣接する標的配列の塩基に完全に相補的であるならば、該鎖終結化ヌクレオチドが該非自己慎重プローブに付加され、修飾された伸長プローブを形成するような条件下で接触させること、を含む。加えて本発明は、該修飾された伸長部ローブを、ハプテンの結合パートナーと接触させることを含み、ここで該結合パートナーは標識され、標識の存在を検出し、検出位置のヌクレオチドを決定する。
【００１９】
加えて本発明は、標的配列の検出位置のヌクレオチドの同定を決定する方法であって、ランダムプライマーを使用して該標的ＤＮＡを増幅し、ＤＮＡアンプリコンを生成すること、該ＤＮＡアンプリコンを転写し、ＲＮＡ標的配列を生成すること（インビトロ転写）、少なくとも１の伸長プローブを含む第１表面を有する固体支持体を提供すること、ここで該伸長プローブは、質問ヌクレオチドを含む、該ＲＮＡ標的配列を該伸長プローブにハイブリダイズさせ、ハイブリダイゼーション複合体を生成すること、該表面を修飾された逆転写酵素および、ハプテンを含む少なくとも１の鎖終結化ヌクレオチドと、もし該鎖終結化ヌクレオチドが、該ハイブリダイゼーション複合体中の再設計された伸長プローブの３’末端にすぐに隣接する標的配列の塩基に完全に相補的であるならば、該鎖終結化ヌクレオチドが、該再設計された伸長プローブに付加され、修飾された伸長プローブを形成させる条件下で接触させること、該修飾された伸長プローブを、該ハプテンの結合パートナーと接触させることを含み、ここで該結合パートナーは標識され、該標識の存在を検出し、該検出位置のヌクレオチドを決定する。
【００２０】
加えて本発明は、標的配列の検出位置のヌクレオチドの同定を決定する方法であって、少なくとも１の伸長プローブを含むハイドロゲル層を含む第１表面を有する固体支持体を含む第１表面を有する固体支持体を提供すること、ここで該伸長プローブは、該伸長プローブの３’末端の２塩基以内に質問ヌクレオチドを含む、該標的配列を、該伸長プローブにハイブリダイズさせ、ハイブリダイゼーション複合体を形成すること、該表面を、伸長酵素および、ハプテンを含む少なくとも１の鎖終結化ヌクレオチドと；もし該鎖停止したヌクレオチドが、該ハイブリダイゼーション複合体中の伸長プローブの３’末端にすぐに隣接する標的配列の塩基に完全に相補的であるならば、該鎖終結化ヌクレオチドを該伸長プローブに付加し、修飾された伸長プローブを形成する条件下で接触させること、該修飾された伸長プローブを、該ハプテンの結合パートナーと接触させること、ここで該結合パートナーは標識され、そして該標識の存在を検出し、該検出位置のヌクレオチドを決定する、を含む方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、ＳＢＥ遺伝子型決定反応の２つの異なる構成を示す。図１Ａにおいて、検出位置１０を伴う標的５は、捕捉プローブ２５にハイブリダイズされ、付着リンカー２０を介して固体支持体１５に付着される。該捕捉プローブはまた、ＳＢＥ伸長プローブとして供する。図１Ｂ、検出位置１０を伴う標的５の第１部分は、捕捉プローブ２５にハイブリダイズされ、固体支持体１５に、付着リンカー２０を介して付着される。標的５の第２部分は、「サンドウィッチ型」アッセイのためのＳＢＥ伸長プライマー３０にハイブリダイズされる。
【図２】図２Ａは、典型的な単一塩基伸長（ＳＢＥ）アッセイを示す。図２Ｂは、標的配列の不存在下でいかにプローブの自己伸長が、該捕捉プローブによって形成された幹−環構造のためにＳＢＥ反応で起こり、その結果誤りの陽性結果を生じ得るか示す。
【図３Ａ】図３Ａは、Ｐ４５０多型（ＳＮＰ）および我々のアッセイ設計に含まれる遺伝子のそれぞれについての文献参照を記載するワークシートである。
【図３Ｂ】図３Ｂは、Ｐ４５０多型（ＳＮＰ）および我々のアッセイ設計に含まれる遺伝子のそれぞれについての文献参照を記載するワークシートである。
【図３Ｃ】図３Ｃは、ＣＹＰアリルハプロタイプファミリーを記載するワークシートである。
【図３Ｄ】図３Ｄは、ＣＹＰアリルハプロタイプファミリーを記載するワークシートである。
【図４】図４は、ＣＹＰ２Ｄ６ファミリーにおける遺伝子によって共有される相対的相同性を示す比較表を示す。対応するイントロンおよびエキソン間の比較並びにこれらの％類似性を示す。
【図５】図５は、現在増幅に使用される好ましいＰ４５０ ＰＣＲプライマーリストを示す。所望の標的遺伝子に特異的にプライマーを設計するために、該プライマーの３’末端に特に焦点がある、サブファミリー関連遺伝子に対する塩基対ミスマッチで、領域を選択した。この態様では、アニーリングハイブリダイゼーション特異性および該プライマーの３’末端からのヌクレオチドを伸長するＰＣＲポリメラーゼの区別は、特異性を付与することによる。プライマー設計はさらに、１９ｂｐよりも大きい長さおよびＧＣ含量の観点のバランスおよび対あたりのＴｍを制限する。すべてのプライマー候補を、ＢＬＡＳＴアルゴリズムを、コンパイルされたＰ４５０配列ライブラリー（５７遺伝子）に対して使用して分析し（相同性分析アルゴリズム）、任意の潜在***差反応性プライマー候補を除去する。相同性分析に加えて、プライマー候補をまた、反復性配列のデータベースに対してスクリーニングした。
【図６Ａ】図６Ａは、現在のＰ４５０アッセイのためのチップ上の最終的Ｐ４５０プローブリストである。
【図６Ｂ】図６Ｂは、現在のＰ４５０アッセイのためのチップ上の最終的Ｐ４５０プローブリストである。
【図６Ｃ】図６Ｃは、現在のＰ４５０アッセイのためのチップ上の最終的Ｐ４５０プローブリストである。
【図６Ｄ】図６Ｄは、現在のＰ４５０アッセイのためのチップ上の最終的Ｐ４５０プローブリストである。
【図７】図７は、Beta Validation Performanceデータの要約およびこれらのプローブの識別可能性を示す。
【図８Ａ】図８ＡないしＥは、特定のＳＮＰを同定するために設計されたプローブを示す。
【図８Ｂ】図８ＡないしＥは、特定のＳＮＰを同定するために設計されたプローブを示す。
【図８Ｃ】図８ＡないしＥは、特定のＳＮＰを同定するために設計されたプローブを示す。
【図８Ｄ】図８ＡないしＥは、特定のＳＮＰを同定するために設計されたプローブを示す。
【図８Ｅ】図８ＡないしＥは、特定のＳＮＰを同定するために設計されたプローブを示す。
【図９Ａ】図９ＡないしＢは、ＣＹＰ遺伝子の関連清を示す。
【図９Ｂ】図９ＡないしＢは、ＣＹＰ遺伝子の関連清を示す。
【図１０Ａ】図１０ＡないしＣは、産物アンプリコン特性を要約する。
【図１０Ｂ】図１０ＡないしＣは、産物アンプリコン特性を要約する。
【図１０Ｃ】図１０ＡないしＣは、産物アンプリコン特性を要約する。
【図１１】図１１．ヒトチトクロムＰ４５０遺伝子のためのCodelink（登録商標）SNP Bioarray。
【図１２】図１２．プライマープレートにおけるプライマー対のレイアウト。
【図１３】図１３．マスターミックスおよびサンプルの、ミクロ遠心管への添加。
【図１４】図１４．反応混合物を、チャンバー内へ負荷することティップオリエンテーション。
【図１５】図１５．チャンバーポートへストリップをシールすることのオリエンテーション。
【図１６】図１６．Hybaid Omnislide熱ブロック上のスライド配置。
【図１７】図１７．塩基付加のための自己伸長の防止。プローブの長さを、プローブの３’末端の１または２以上の塩基によって増加させることは、幹−環構造の末端のミスマッチを創出する。ＤＮＡポリメラーゼは、該３’末端がミスマッチであるとき、プローブを伸長させず、そしてゆえに、自己伸長はない。
【図１８】図１８は、ＳＢＥアッセイにおける強い標的依存性自己伸長を示すプローブ配列の例を示す。予測された幹−環は下線を付す。
【図１９】図１９は、なし、１、２、または３つの塩基を、２ＷＩＡＦ−９１３．１１４．Ｔ．Ａプローブの末端に付加する。１塩基の付加は、自己伸長シグナルを減少させるが、標的依存性シグナルを減少させなかった。このプローブは「再び対形成」され、そして正確にＳＮＰ塩基を応答させる（call）。２または３の追加的塩基の付加は、自己伸長を生じる新しい幹−環構造を創出した。追加的塩基が新しい自己伸長体を創出する頻度は、プローブ配列で変化する。該プローブの配列は、以下のとおりである：
【化１】
Figure 2004532026
推定的幹-環構造は下線で示す。２ＷＩＡＦ−９１３．１１４ ．１．Ｔ．Ａ．のミスマッチ３’塩基に注目。
【図２０】図２０は、P450遺伝子ファミリーのための３５このプローブの試みられた再設計からの結果である。不正確にＳＮＰ塩基を応答させた３５個のプローブセットについて、１または２以上の塩基が、自己伸長プローブの３’末端に付加されたとき、２３個（６６％）のＳＮＰ塩基は、そのときの１００％正確に応答させた。Ｐは、応答割合および正確性の産物である。Ｐ＝１は、プローブセットが、そのときの１００％正確にＳＮＰ塩基を応答させることを示す。
【図２１】図２１（Ａ）は、標的配列中の相補的塩基に対応する、標識されたヌクレオチドを取りこむことによる標的依存性伸長を示す。ＸおよびＹは、標的依存性シグナル生成への最小の影響を有する修飾された塩基であり、天然塩基との、これらの塩基対形成能力は、影響されない（Ｂ）。修飾された塩基対Ｘ、Ｙは効率的に、標的依存性伸長を抑制し、これらはお互いと安定的塩基対を形成できないからである。安定性の欠如のため、非伸長および誤りの陽性シグナルが、ＳＢＥアッセイで抑制される。
【図２２】図２２。修飾された核酸を使用し、本発明の好ましい実施態様で使用される新規プローブを合成する。この塩基対は効率的に、標的依存性伸長を抑制し、これらはお互いと安定的塩基対を形成できず、それは熱力学的に、自己折り畳み産物を脱安定化するからである。
【図２３】図２３．ある環外アミン修飾された塩基の例示的構造。
【図２４】図２４．修飾された「ターミネーター型塩基」。（Ａ）において、修飾された「ターミネーター型塩基」Ｚは、標的核酸を結合でき、そしてＳＢＥアッセイにおいて伸張することができる。しかし（Ｂ）において、該修飾された「ターミネーター型塩基」Ｚは、ＤＮＡポリメラーゼを、修飾塩基位置を超えて伸張することから妨げる。こうして、標的依存性プローブ伸長のみがおこり、そして該標的に依存しない伸長が抑制される。
【図２５】図２５．伸長「ターミネーター」塩基の例示的構造。
【図２６】図２６．図２７−２９に使用される修飾された塩基／ヌクレオシドのリスト。
【図２７】図２７．修飾核酸を有するプローブの使用の有効性を示す実験のグラフ。この実験では、プローブ配列５’−ＡＴＡＣＡＣＡＣＡＴＧＴＧＣＡＣＡＣＡＣＡ−３’を使用した。これは、該修飾された塩基がその意図された効果を有することを示す。
【図２８】図２８。プローブ配列５’−ＧＣＣＡＧＧＣＡＡＴＴＴＴＡＴＴＴＧＣであって、また安定的ヘアピンループを形成するものでの実験。これは、修飾された塩基対がその意図された効果を有することを明かに示す。伸長部位（３’末端）に近い修飾された塩基対は、なおより劇的効果を有することができる。
【図２９】図２９．天然の塩基での３つの異なるプローブ配列での実験。任意の標的の不存在下で該プローブはＳＢＥアッセイ中に伸長する。しかし、天然塩基が修飾塩基／ヌクレオシドで置換されたときに、これらのそれぞれの１つからの標的依存性シグナルは、５倍増加する。
【図３０】図３０．捕捉プローブの「幹」領域中の塩基の修飾は、ポリメラーゼ酵素を、幹−環構造への結合から防止することによって、自己伸長を阻害する。
【図３１】図３１．プローブ−標的二重らせんの熱力学的安定性は、ポリメラーゼ酵素活性を可能とし、そして伸長は妥協されない。
【図３２Ａ】図３２（Ａ）ＳＢＥ酵素（ポリメラーゼ）の結合アフィニティを減少させる「幹」領域で使用される修飾されたヌクレオチド塩基。
【図３２Ｂ】図３２（Ｂ）は、幹−環形成プローブのポリメラーゼ伸長を防止するプローブの「幹」構造で使用され得るキラルホスホジエステルアナログを示す。（ａ）結合アフィニティおよび酵素の特異性に貢献する酵素タンパク質との水素結合形成に関係するｐｒｏ−Ｒおよびｐｒｏ−Ｓ非架橋酸素の位置を実証する通常のホスホジエステル結合；および酵素結合を減少させる３つのキラルホスホジエステルアナログ；（ｂ）Ｈ−ホスホネート；（ｃ）ホスホロチオネート；および（ｄ）メチルホスホネート。
【図３３】図３３：プローブの自己伸長を防止するための「オリゴヌクレオチド阻害剤」を使用するＳＢＥアッセイおよびそれによる結果。Ａ：一本鎖ＲＮＡ標的および阻害剤の両方がないＲＣＡ １ＳＮＰチップ上で実施される修飾されたＳＢＥアッセイ。ＡＰＯ Ｅ３２１．Ｔ．Ａ．の誤りの陽性シグナルを、枠付ボックスで示す。Ｂ：一本鎖ＲＮＡを、ＲＣＡ ＳＮＰチップに適用した。ＡＰＯ Ｅ中の誤りの陽性シグナルの強度は、Ａのそれと同じである。Ｃ：一本鎖ＲＮＡ標的、また短いオリゴ阻害剤を、ＲＣＡチップ上に適用し、ＡＰＯ Ｅ３２１の誤りの陽性シグナルは阻害され、そしてシグナルは今、チップ上に存在する他の陽性シグナルに対する強度において類似である。
【図３４】図３４．自己伸長のない、ＳＮＰ遺伝子型決定およびプライマー伸長のためのユニプレックス化標的調製のための方法。方法および修飾された酵素のこの組み合わせは本発明の好ましい実施態様の1つを規定する。
【図３５】図３５．コントロールプローブから取得された結果。ここでＰＣＲや他の増幅技法はＳＮＰ遺伝子型決定のために使用していない。プライマー伸長予備増幅、次いでインビトロ翻訳、それから修飾された逆転写酵素を使用するプローブ伸長を、この方法で使用した。
【図３６】図３６．通常の逆転写酵素を超える、修飾された逆転写酵素の有利性を実証する。修飾された酵素は、自己伸長を排除する。
【図３７】図３７．ＳｕｒＭｏｄｉｃｓ（登録商標）表面上のアミノオリゴヌクレオチドの反応。ここに、ポリマー骨格上の、アシル置換反応の例を示す。
【図３８】図３８．ＳｕｒＭｏｄｉｃｓ（登録商標）Ｇｅｌ Ｍａｔｒｉｘの可能な構造、好ましい実施態様での固体基質上で使用されるポリマー。
【００２２】
発明の詳細な記載
本発明は、種々のＰ４５０酵素の遺伝子型（単一ヌクレオチド多型、またはＳＮＰの存在を含む）を解明するために設計されたプローブの特に有用の組み合わせを含む、バイオチップを含む方法および組成物を指向する。本発明の組成物および方法は、ｐ４５０遺伝子の幾つかの間の独特かつ有利な特異性を提供し、それぞれの関連遺伝子の特異的増幅を可能とする、ＰＣＲプライマー（けれども、当業者によって認識されるであろうように、増幅反応の他の型をまた実施し得る）の使用に基づく。得られるアンプリコンを次いで、Ｐ４５０酵素変異体の識別および検出可能とする、単一塩基伸長（ＳＢＥ）反応の特異性および効率を改善する新規プローブを使用してＳＮＰについて分析し、疾患状態と、薬物特異性および抵抗性の相関を可能とする。
【００２３】
よって、１または２以上の患者由来のサンプルを分析および評価するための組成物および方法を提供すること、存在する種々のＰ４５０酵素のレベルおよび／または遺伝子型を確認することが、本発明の目的である。当業者に認識されるように、該サンプル溶液は、体液（事実上任意の生物であるが、哺乳動物サンプルが好ましく、ヒトサンプルが特に好ましい、血液、尿、血清、リンパ液、唾液、肛門および膣分泌物、汗および***を含むが限定されない）を含むが限定されない任意の数のものを含み得る。当業者に認識されるように、サンプルは、標的およびシグナル増幅であってＰＣＴ／ＵＳ９９／０１７０５に全般に記載されるのもの、例えばＰＣＲ等、増幅反応および以下に概説の両方を含む増幅反応の産物であり得る。当業者に認識されるように、事実上任意の実験的操作が、サンプルについてなし得る。
【００２４】
本発明の組成物および方法は、標的ＤＮＡ配列上のＳＮＰの検出を指向する。用語「標的配列」または「標的核酸」または文法的均等物は、ここで、遺伝子の一部であり得る核酸配列、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡおよびｒＲＮＡを含むＲＮＡ、またはその他を意味する。ここに概説するように、標的配列は、サンプルからの標的配列、または二次的標的、例えばＰＣＲ等のような増幅反応の産物であり得る。より長い配列はより特異的である理解とともに、それは任意の長さであり得る。当業者に認識されるように、相補的標的配列は、多くの形態を取り得る。それは例えば、より大きい核酸配列、すなわち遺伝子またはｍＲＮＡの全部または一部、とりわけプラスミドまたはゲノムＤＮＡの制限フラグメントを含み得る。より十分に以下に概説するように、プローブは標的配列にハイブリダイズするように作成され、サンプルの標的配列中のＳＮＰの存在または不存在を決定する。一般にいって、この用語は、当業者に理解されるであろう。標的配列はまた、異なる標的ドメインを含み得る。例えば、サンプル標的配列の第１標的ドメインは、第１捕捉プローブにハイブリダイズし、第２標的ドメインは、捕捉プローブの一部にハイブリダイズし得るなどである。該標的ドメインは、示されるように隣接または分離され得る。特記しない限り、用語「第１」および「第２」は、標的配列の５’−３’方向について配列の方向を付与することを意味しない。例えば、相補的な標的配列の５’−３’方向を仮定すると、第１標的ドメインは、第２ドメインの５’側または第２ドメインの３’側に位置し得る。
【００２５】
遺伝される単一塩基変化は、一般に、多型またはＳＮＰと言及する。より十分に以下に概説するように、本発明の許容される実施態様は、配列情報が望まれるＳＮＰ（単一ヌクレオチド多型）または複数のＳＮＰを含む標的配列を含み、一般にここに「ＳＮＰ」部位または「ＳＮＰ位置」または「クエリー塩基」または「質問位置」または「検出位置」と言及する。好ましい実施態様では、ＳＮＰ位置は、単一ヌクレオチドであり、けれども、ある実施態様では、それは複数のヌクレオチドを含み得、お互いと連続し、または１または２以上のヌクレオチドによって分離される。ここでいう「複数」は、少なくとも２を意味する。ここで使用するように、捕捉プローブは、「質問位置」を、通常はしかしいつもではなく、３’末端で、または３’末端に向けて含む。
【００２６】
本発明の目的のために、配列は、「完全にマッチの」または「ミスマッチの」としてここに言及する。この文脈では、「ミスマッチ」は、相対的な用語であり、そして特定のＳＮＰ位置の2つの異なるプローブの２つの配列の間の同一性の相違を指摘することを意味することが注意されるべきである。一般に、野生型配列と異なる配列は、ミスマッチと言及する。しかし、および特にＳＮＰの場合には、何が「野生型」を構成するかは決定するのが困難であり得、多重アリルが比較的頻繁に集団中に観察され、こうしてこの文脈での「ミスマッチ」は、標準として1つの配列の人工的適応を要するからである。こうして、この発明の目的のために、配列はここに、野生型配列標準について、「完全なマッチ」または「ミスマッチ」または「突然変異体」として言及する。「ミスマッチ」はときに、また「アリル変異体」と言及する。ここに「アリル変異体」と相互交換的に使用する用語「アリル」は、遺伝子またはその一部の代替的（択一的）形態を言及する。アリルは、相同染色体上の同じ遺伝子座または位置を占める。対象が遺伝子の２つの同一のアリルを有する場合、該対象は該遺伝子またはアリルについて「ホモ接合性」といわれる。対象が遺伝子の2つの異なるアリルを有する場合、該対象は、該遺伝子について「ヘテロ接合性」といわれる。特異的遺伝子のアリルは、単一ヌクレオチド、または幾つかのヌクレオチド中で互いに異なることができ、そしてヌクレチドの置換、欠失、および挿入を含むことができる。遺伝子のアリルはまた、突然変異を含む遺伝子の形態であることができる。用語「遺伝子の多型領域のアリル変異体」は、同じ種の他の個体の遺伝子のその領域に見出される幾つかのヌクレオチド配列の内の１つを有する遺伝子の領域をいう。こうして上記用語は、該用語の全部の意味を誘導する文脈で使用されなければならない。
【００２７】
「核酸」または「オリゴヌクレオチド」または文法的均等物によてここに、一緒に共有連結された少なくとも２つのヌクレオチドを意味する。本発明の核酸は、一般に、ホスホジエステル結合を含むが、ある場合には、前記で概説した通りに、例えばホスホルアミダイト（Beaucage et al., Tetrahedron 49(19):1925(1993) およびそこの引用；Letsinger, J. Org. Chem. 35: 3800(1970); Sprinzl et al., Eur. J. Biochem. 81:579(1977); Letsinger et al., Nucl. Acids Res. 14:3487(1986); Sawai et al., Chem. Lett. 805(1984), letsinger et al., J. Am. Chem. Soc. 110:4470(1988);およびPauwels et al., Chemica Scripta 26:141 91986)）、ホスホロチオエート(Mag et al., Nucleic Acids Res. 19:1437(1991);および米国特許５６４４０４８号）、ホスホルホロジチオエート（Briu et al., J. Am. Chem. Soc. 111:2321(1989)、Ｏ−メチルホスホロアミダイト連結（Eckstein, Oligonucleotide and Analogues: A Practical Approach, Oxford University Press)、およびペプチド核酸骨格および連結（Egholm, J. Am. Chem. Soc. 114:1895(1992);Meier et al., Chem. Int. Ed. Engl. 31;1008(1992); Nielsen, Nature, 365:566(1993); Calsson et al., Nature 380:207(1996)、すべてのそれらは引用により含める））を含む代替的骨格を有し得る核酸アナログが含まれる。他のアナログ核酸は、ロック性核酸（Koshkin et al. J. Am. Chem. Soc.120:13252-3(1998)；陽性骨格(Denpcy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:6097(1995);非イオン性骨格（米国特許５３８６０２３、５６３７６８４、５６０２２４０、５２１６１４１および４４６９８６３号；Kiedrowshi et al., Angew. Chem. Intl. Ed. English 30:423(1991); Letsinger et al., J.Am. Chem. Soc.110:4470(1988)；Letsinger et al., Nucleoside & Nucleotide 13: 1597(1994); Chpter 2 and 3, ASC Symposium Sries 580, ''Carbohydrate Modification in Antisense Research''. Ed. Y.S. Sanghui and P. Dan Cook; Mesmaeker et al., Bioorganic & Medicinal Chem. Lett. 4:395(1994); Jeffs et al., J. Biomolecular NMR 34:17(1994);Tetrahedron Lett.37:743(1996))および非リボース骨格であって、米国特許５２３５０３３および５０３４５０６号、および６および７章の、ASC Symposium Sries 580, ''Carbohydrate Modification in Antisense Research'', Ed. Y.S. Sanghui and P. Dan Cookにを含むものを含む二環式構造のある物を含む。１または2以上の炭素環式糖を含む核酸はまた、核酸の定義に含まれる（Jenkins et al., Chem, Soc. Rev. (1995)pp169-176参照）。いくつかの核酸アナログは、Rawls, C & E News June 2, 1997 page 35に記載される。該定義はまた、「ロック性核酸」を含む。これらの引用の全ては引用によってここに明示的に含ませる。リボースホスフェート骨格のこれらの修飾は、生理学的環境中のそのような分子の安定性および半減期を増加させるためになし得る。
【００２８】
当業者に認識されるように、これらの核酸アナログのすべては、本発明での用途を見出し得る。加えて、天然に存在する核酸およびアナログの混合物を作成できる。代替的に、異なる核酸アナログの混合物、および天然に存在する核酸およびアナログの混合物を作成し得る。
【００２９】
核酸は、特定されるように「一本鎖」または「二本鎖」であり得、または二本鎖および一本鎖配列の両方の部分を含み得る。核酸はゲノムおよびｃＤＮＡの両方のＤＮＡ、ＲＮＡまたはハイブリッドであり得、ここに、核酸はデオキシリボ−およびリボヌクレオチドの任意の組み合わせを含み、そしてウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、イソシトシン、イソグアニン等を含む塩基の任意の組み合わせを含む。好ましい実施態様は、標的配列よりもむしろ、他のプローブに相補的に設計される核酸中のイソシトシンおよびイソグアニンを利用し、これは非特異的ハイブリダイゼーションを減少させるからであり、全般に米国特許５６８１７０２号に記載されるとおりである。ここで使用するように、用語「ヌクレオシド」は、ヌクレオチド並びにヌクレオシドおよびヌクレオチドアナログ、および修飾されたヌクレオシド、例えばアミノ修飾ヌクレオシドを含む。加えて、「ヌクレオシド」は、非天然存在アナログ構造を含む。こうして、例えばそれぞれが塩基を含むペプチド核酸の個々の単位は、ここにヌクレオシドとして言及する。
【００３０】
要すれば、標的配列は、既知の技法を使用して調製する。例えばサンプルを、既知の溶解バッファー、電気泳動等を、必要により精製および／または増幅とともに使用して細胞を溶解するために処理し得、当業者に認識されるとおりである。標的核酸を増幅するための好適な増幅技法は、ＰＣＴＵＳ９９／０１７０５に概説され、ここに引用および以下の概説によって明示的に含める。
【００３１】
標的配列増幅のための全般的技法は、以下に議論する。ここで使用するプライマーまたはプローブは、ここに、標的ＤＮＡの増幅を可能とし、当業界で理解されるとおりである。
【００３２】
標的増幅は、標的配列の増幅（複製）に関係し、その結果標的配列のコピー数が増加する。好適な標的増幅技法は、限定しないが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、アリルＰＣＲ、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、および核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（ＯＬＡ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、Invaider（登録商標）技法、切れやすい（scissile）プライマーを使用すること（CPT)等、以下に定義されるものを含む。
【００３３】
種々の増幅技法は、以下により十分に記載されるようにプライマーまたはプローブの更なる要件を有し得る。プライマー核酸のサイズは、当業者に認識されるように、用途および増幅技法に依存して、一般に５ないし５００ヌクレオチド長で変化し得る。
【００３４】
プライマーおよび標的配列の間の複合体がひとたび形成されると、ときに「増幅酵素」とよばれる酵素を使用してプライマーを修飾する。ここに概説される全ての方法について、酵素はアッセイ中の任意の点、プライマーの添加の前、中、後で添加し得る。酵素の同定は、以下に十分に概説されるように使用される増幅技法に依存する。
【００３５】
好ましい実施態様では、標的増幅技法は、PCRである。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、広く使用され、記載され、そして標的配列を増幅するための熱サイクル化と組み合わせたプライマー伸長の使用に関係する。引用により全体を含ませる、米国特許４６８３１９５および４６８３２０２号およびPCR Essential Data, J. W. Wiley & sons, Ed. C.R. Newton, 1995参照。加えて、本発明で使用できる、ある数のＰＣＲの変形があり、「定量的競合的ＰＣＲ」または「ＱＣ−ＰＣＲ」、「arbitrarily primed PCR」または「ＡＰ−ＰＣＲ」、「イムノＰＣＲ」、「Ａｌｕ−ＰＣＲ」、「ＰＣＲ一本鎖conformational多型」または「ＰＣＲ−ＳＳＣＰ」、「逆転写酵素ＰＣＲ」または「ＲＴ−ＰＣＲ」、「ビオチン捕捉ＰＣＲ」、「vectorette OCR」。「パンハンドルＰＣＲ」、およびとりわけ「ＰＣＲselectｃＤＮＡ subtraction」を含む。ＰＣＲの詳細は周知であり、熱安定性ポリメラーゼ、例えばＴａｑＩポリメラーゼおよび熱サイクリングの使用を含む。よって、ＰＣＲ反応は、少なくとも１のＰＣＲプライマーおよびポリメラーゼを必要とする。
【００３６】
ＳＮＰ遺伝子座のマルチプレックスＰＣＲ増幅と、オリゴヌクレオチドアレイヘの次のハイブリダイゼーションは、正確かつ少なくとも数百のＳＮＰを同時的に遺伝子型決定する信頼できる方法であることが示された；Wang et al., Science, 280:1077(1988)参照；またSchafer et al., Nature Biotechnology 16:33-39(1998)参照。標的ＤＮＡの異なる領域のための異なるプライマーセットに関係するマルチプレックスＰＣＲ反応を、標的ＤＮＡを増幅するために使用できる。好ましい実施態様では、７マルチプレックスＰＣＲ反応を実施し、７つの異なる領域であって、それぞれの領域が標的ＤＮＡの異なるＳＮＰ位置に対応するものを、適当なプライマーセットを使用して増幅する。アンプリコンを貯留し、そして総貯留物を分析のために使用する。こうして、例えば、もし１０ＳＮＰ位置がＰＣＲによって増幅されるならば、７ｘ１０＝７０ＳＮＰ位置が、それぞれの増幅されるＤＮＡサンプルについて同時に質問できる；例えばｐ４５０チップ上で。
【００３７】
さらなる増幅方法は、アリルＰＣＲであり、引用により明示的にここに引用する、Newton et al., Nucl. Acid Res, 17:2503(1989)に記載される。アリルＰＣＲは、もし末端３’ヌクレオチドがミスマッチであるならば、使用されるＤＮＡポリメラーゼは、３’−エキソヌクレアーゼプルーフリーディング活性を欠くことものと推定して、ＰＣＲ反応があまりよく進行しないという事実に基づき、単一塩基識別を可能とする。
【００３８】
好ましい実施態様では、標的増幅技法は、ＳＤＡである。鎖置換増幅（ＳＤＡ）は全般に、すべて引用により明示的にここに全体を含める、Walker et al., Molecular Methods for Virus Detection, Academic Press Inc., 1995中および米国特許５４５５１６６および５１３０２３８号に記載される。全般には、ＳＤＡを以下のように記載し得る。通常ＤＮＡ標的配列である、一本鎖標的核酸を、一般に２５−１００ヌクレオチドの長さであるＳＤＡプライマーと接触させる。ＳＤＳプライマーは標的配列の３’末端の領域に実質的に相補的であり、そして該プライマーはその５’末端に（標的に相補的である領域の外側に）ときにここに「ニッキング酵素」または「ニッキングエンドヌクレアーゼ」として言及する、制限エンドヌクレアーゼのための認識部位である配列を有する。ＳＤＡプライマーを次いで、標的配列にハイブリダイズさせる。該ＳＤＡ反応混合物はまた、ポリメラーゼ（ある「ＳＤＡポリメラーゼ」）および４のデオキシヌクレオシド−トリフォスフェート（またデオキシヌクレオチドまたはｄＮＴＰ、すなわちｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰと呼ばれる）、少なくともその１種は置換または修飾されたｄＮＴＰの混合物を含み；こうしてＳＤＡプライマーは修飾され、すなわち伸長され、修飾されたプライマーを形成し、ときにここに、「新しく合成された鎖」として言及する。置換されたｄＮＴＰを修飾し、その結果それは置換されたｄＮＴＰを含む鎖中の切断を阻害するが、他の鎖の切断を阻害しない。好適な置換ｄＮＴＰの例は、限定しないが、２’デオキシアデノシン５’−Ｏ−（１−チオトリフォスフェート）、５−メチルデオキシシチジン５’−トリフォスフェート、２’−デオキシウリジン５’−トリフォスフェート、および７−デアザ−２’−デオキシグアノシン５’−トリフォスフェートを含む。加えて、ｄＮＴＰの置換は、新しく合成された鎖への取りこみ後に起こり得る；例えばメチラーゼを使用し、合成された鎖にメチル基を付加し得る。加えて、もしすべてのヌクレオチドが置換されるならば、該ポリメラーゼは、５’−＞３’エキソヌクレアーゼ活性を有し得る。しかし、もしすべてより少ないヌクレオチドが置換されるならば、該ポリメラーゼは好ましくは５’−＞３’エキソヌクレアーゼ活性を欠く。使用されるべき、好適な酵素を描くチャートおよびこれらの対応する認識部位および修飾されたｄＮＴＰは、引用により明示的にここに含める米国特許５４５５１６６号に見出される。
【００３９】
よって、ＳＤＡ反応は、特定の順序ではなく、ＳＤＡプライマー、ＳＤＡポリメラーゼ、ニッキングエンドヌクレアーゼおよびｄＮＴＰを要し、その少なくとも１種は修飾される。
【００４０】
一般に、ＳＤＡは熱サイクリングを必要としない。反応の温度は、一般に、非特異的ハイブリダイゼーションを防止するのに十分高いが、特異的ハイブリダイゼーションを可能とするのに十分低いようにセットする；これは一般に、酵素に依存して約３７℃ないし約４２℃である。
【００４１】
好ましい実施態様では、該標的増幅技法は、核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）である。ＮＡＳＢＡは全般に、すべて引用によりここに含める、米国特許５４０９８１８号；Sooknanan et al., Molecular Methods for Virus Detection, Academic Press, 1995のNucleic Acid Sequence-Based Amplification, Ch.12(pp.261-285)；および''Profiting from Gene-based Diagnostics'', CTB International Publishing Inc.N. J. 1996に記載される。ＮＡＳＢＡは、ＴＭＡおよびＱＢＲの両方に非常に類似する。転写仲介性増幅（ＴＭＡ）は全般に、すべて引用によりここに含める、米国特許５３９９４９１、５８８８７７９、５７０５３６５、５７１００２９号に記載される。ＮＡＳＢＡとＴＭＡの間の主要な相違は、ＮＡＳＢＡがＲＮアーゼＨの添加を利用し、ＲＮＡ分解をもたらし、ＴＭＡは、逆転写酵素の固有のＲＮアーゼＨ活性によることである。
【００４２】
一般に、これらの技法を、以下に記載し得る。一本鎖標的核酸、とくにＲＮＡ標的配列（ときにここに、「第１標的核酸」または「第１テンプレート」として言及する）を、第１プライマー、一般にここに「ＮＡＳＢＡプライマー」（「ＴＭＡプライマー」もまた好適であるが）と接触させる。ＤＮＡ標的配列での出発を以下に記載する。これらのプライマーは一般に２５−１００ヌクレオチドの長さを有し、近似的に５０−７５ヌクレオチドのＮＡＳＢＡプライマーが好ましい。第１プライマーは好ましくは、その３’末端に、第１テンプレートの３’末端に実質的に相補的である配列を有するＤＮＡプライマーである。該第１プライマーはまた、その５’末端にＲＮＡポリメラーゼプロモーターを有する（またはその相補物（アンチセンス）、システムの構成に依存して）。該第１プライマーを次いで、該第１テンプレートにハイブリダイズさせ、第１ハイブリダイゼーション複合体を形成する。該反応混合物はまた、逆転写酵素（「ＮＡＳＢＡ逆転写酵素」）および４つのｄＮＴＰの混合物を含み、その結果第１ＮＡＳＢＡプライマーは修飾され、すなわち伸長され、修飾された第１プライマーであってＲＮＡ（第１テンプレート）およびＤＮＡ（新しく合成された鎖）のハイブリダイゼーション複合体を含むものを形成する。
【００４３】
「逆転写酵素」または「ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ」はここでに、ＤＮＡプライマーおよびＲＮＡテンプレートからＤＮＡを合成できる酵素を意味する。好適なＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼは限定しないが、ニワトリ骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素（「ＡＭＶ−ＲＴ」）およびモロニーマウス白血病ウイルスＲＴを含む。増幅反応がＴＭＡであるとき、逆転写酵素はさらにＲＮＡ分解活性を含む。
【００４４】
好ましい実施態様では、「逆転写酵素」は、修飾された逆転酵素（ＲＴ）であって、ここにＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性が排除されたものである。ここに、自己伸長性プローブは、該修飾されたＲＴによっては伸長せず、なぜならこれらはＤＮＡ依存性伸長であり、そしてＲＮＡ標的に結合されたプローブのみが、該ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼによって伸長されるからである。
【００４５】
前列挙の構成要素に加えて、ＮＡＳＢＡ反応はまた、ＲＮＡ分解酵素、またときにここにリボヌクレアーゼとして言及されるものを含み、これはＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡを、一本鎖または二本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡを加水分解することなく、ハイブリダイズする。好適なリボヌクレアーゼは、限定しないが、E. coliおよびウシ胸腺由来のＲＮアーゼを含む。
【００４６】
リボヌクレアーゼ活性は、ハイブリダイゼーション複合体中の第１ＲＮＡテンプレートを分解し、ハイブリダイゼーション複合体の脱会合を生じ、ときに「第２テンプレート」としてここに言及する、第１の一本鎖である新しく合成されたＤＮＡ鎖を残す。
【００４７】
加えて、ＮＡＳＢＡ反応はまた、一般にＤＮＡを含む（プライマーを含むここでのすべてのプローブについて、核酸アナログをまた使用し得るが）第２ＮＡＳＢＡプライマーを含む。この第２ＮＡＳＢＡプライマーはその３’末端に第２テンプレートにの３’末端に、実質的に相補的である配列を有し、そしてまた、機能性プロモーターのためのアンチセンス配列および転写開始部位のアンチセンス配列を含む。こうして、このプライマー配列は、第３ＤＮＡテンプレートの合成のためのテンプレートとして使用されるとき、ＲＮＡポリメラーゼの特異的かつ効率的結合および望まれる部位の転写の開始を可能とする十分な情報を含む。好ましい実施態様は、アンチセンスプロモーターを利用し、そして転写開始部位は、Ｔ’ ＲＮＡポリメラーゼのそれであるが、以下の概説のように他のＲＮＡポリメラーゼプロモーターおよび開始部位をまた使用することができる。
【００４８】
第２プライマーは、第２テンプレートにハイブリダイズし、そしてＤＮＡポリメラーゼ、また「ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ」と呼ばれるものは、また反応物中に存在し、第３テンプレートを合成し（第２の、新しく合成されたＤＮＡ鎖）、２つの新しく合成されたＤＮＡ鎖を含む第２ハイブリダイゼーション複合体を生じる。
【００４９】
最後に、ＲＮＡポリメラーゼの取りこみおよび要求される４つのリボヌクレオシドトリフォスフェート（リボヌクレオチドまたはＮＴＰ）は、ＲＮＡ鎖（第３の、新しく合成され、すなわち本質的に第１テンプレートと同じもの）の合成という結果となる。ときにここに「ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ」として言及するＲＮＡポリメラーゼは、プロモーターを認識し、そして開始部位でのＲＮＡ合成を特異的に開始させる。加えて、ＲＮＡポリメラーゼは好ましくは、ＤＮＡ二重らせんあたりのＲＮＡの幾つかのコピーを合成する。好ましいＲＮＡポリメラーゼは限定しないが、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを含み、そしてファージＴ３、ファージΦＩＩ、サルモネラファージｓｐ６、またはシュードモナスファージｇｈ−１のそれらを含む他のバクテリオファージＲＮＡポリメラーゼを含む。
【００５０】
ある実施態様では、ＴＭＡおよびＮＡＳＢＡを、出発ＤＮＡ標的配列とともに使用する。この実施態様では、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターおよびＤＮＡポリメラーゼ酵素を含む第１プライマーを利用して、プロモーター配列を含む新しく合成される鎖との二本鎖ＤＮＡハイブリッドを生成することが必要である。該ハイブリッドを次いで変成し、そして第２プライマーを付加する。
【００５１】
よって、ＮＡＳＢＡ反応は、特定の順序ではなく、第１ＮＡＳＢＡプライマー、第２ＮＡＳＢＡプライマーであって、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターのアンチセンス配列を含むもの、該プロモーターを認識するＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡ分解酵素、ＮＴＰおよびｄＮＴＰ、さらに以下に概説する検出構成要素を要する。
【００５２】
これらの構成要素は、単一のＤＮＡに重らせんを生成する単一の出発ＲＮＡテンプレートを生じる；しかし、このＤＮＡ二重らせんは、多重ＲＮＡ鎖であって、これらはついで使用して再び反応を開始させ得るものの創出という結果となるから、増幅は急速に進行する。
【００５３】
よって、ＴＭＡ反応は、特定の順序ではなく、第１ＴＭＡプライマー、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターのアンチセンス配列を含む第２ＴＭＡプライマー、該プロモーターを認識するＲＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡ分解活性を有する逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、ＮＴＰおよびｄＮＴＰ、加えて以下に概説する検出構成要素を要する。
【００５４】
これらの構成要素は、単一のＤＮＡ二重らせんを生成する単一の出発ＲＮＡテンプレートを生じさせる；しかし、このＤＮＡ二重らせんは、次いで使用され再び反応を開始させ得る多重ＲＮＡ鎖の創出という結果となるから、増幅は急速に進行される。
【００５５】
好ましい実施態様では、標的増幅技法は、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（ＯＬＡ）、ときにライゲーション連鎖反応（ＬＣＲ）として言及されるものである。該方法は、２つの異なるやり方で稼動することができる；第１実施態様では、たったひとつの標的配列を、ライゲーションのためのテンプレートとして使用し（ＯＬＡ）；代替的には両方の鎖を使用し得る（ＯＬＡ）。オリゴヌクレオチドライゲーション増幅（「ＯＬＡ」ときにここに、ライゲーション連鎖反応（ＬＣＲ）として言及する）は、テンプレートとして標的配列を使用する、単一の長いプローブヘの２つのより小さいプローブのライゲーションに関係する。全般にすべて引用により全体を含ませる、米国特許５１８５２４３、５６７９５２４および５５７３９０７号；ＥＰ０３２０３０８Ｂ；ＥＰ０３３６７３１Ｂ１；ＥＰ０４８９１８２Ｂ１；ＷＯ９０／０１０６９；ＷＯ８９／１２６９６；およびＷＯ８９／０９８３５および米国出願６０／０７８１０２および６０／０７３０１１参照。
【００５６】
ＬＣＲの変形は、「化学的ライゲーション」の種類を利用し、両方ともここに明示的に引用により全体を含ませる、米国特許５６１６４６４および５７６７２５９に概説されるとおりである。この実施態様では、ＬＣＲに類似して、プライマーの対を利用し、ここに、該第１プライマーは、標的の第１ドメインに実質的に相補的であり、そして第２プライマーは、標的の隣接第２ドメインに実質的に相補的である（しかし、ＬＣＲのために、もし「ギャップ」が存在するならば、ポリメラーゼおよびｄＮＴＰを添加し該ギャップを充填し得る）。それぞれのプライマーは、「側鎖」として作用する部分を有し、これは標的配列に結合せず、そして水素結合、塩架橋、ファンデルワールス力等により非共有相互作用する幹構造の一方の半分を作用する。好ましい実施態様は、側鎖としての実質的に相補的な核酸を利用する。こうして、プライマーが標的配列へハイブリダイゼーションすると、該プライマーの側鎖を位置的接近をもたらし、そして、もし側鎖が核酸をまた含むならば、側鎖ハイブリダイゼーション複合体を形成できる。
【００５７】
プライマーの側鎖の少なくとも１つは、活性化されると、化学的架橋または化学的ライゲーションを生じる活性化可能の架橋剤、一般に側鎖に共有付着されるものを含む。該活性化可能の基は、側鎖の架橋を可能とする任意の部分を含み得、そして化学的、光量子的、および熱的に活性化される基を含み、光活性化可能基が好ましい。ある実施態様では、側鎖の１つ上の単一の活性化可能基が、他の側鎖上の官能基との相互作用を介して架橋を生じるのに十分である；代替的態様では、活性化可能基は、それぞれの側鎖上に要する。
【００５８】
ひとたびハイブリダイゼーション複合体が形成され、そして架橋剤が活性化され、その結果プライマーが共有結合すると、該反応は、ハイブリダイゼーション複合体の脱会合を可能とする条件に服し、こうして該標的を自由とし、次のライゲーションまたは架橋のためのテンプレートとして供する。このやりかたでは、シグナル増幅ががおこり、そしてここに概説のように検出することができる。
【００５９】
好ましい実施態様では、標的増幅技法はＲＣＡである。また遺伝子型決定のために使用できるＯＬＡの変形は、「ローリングサークル増幅」またはＲＣＡと呼ばれる。ローリングサークル増幅は、標的にハイブリダイズする単一のプローブを利用し、その結果プローブのそれぞれの末端が互いに隣接的にハイブリダイズする（または、代替的に、介入ヌクレオチドを、ポリメラーゼおよびｄＮＴＰを使用して「充填」できる）。次いで、該プローブの二つの末端がライゲートすると、環状プローブが形成され、また「パドロックプローブ」または「ＲＣＡプローブ」として言及される。次いで、プライマーおよびポリメラーゼが添加され、その結果プライマー配列が伸長する。しかし環状プローブは末端がないので、ポリメラーゼは反復的に該環状プローブを伸長させ、環状プローブのコンカタマーを生じる。そういうものとして、該プローブを増幅する。得られたアンプリコンをアッセイのさらなる使用のために種々のやり方で切断することができる。ローリングサークル増幅は全般に、すべて引用によりその全体を含ませる、Baner et al., (1998)Nuc. Acids Res. 26:5073-5078; Barany, F.(1991)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88; 189-193; Lizardi et al., (1998)Nat.Genet. 19:225-232; Zhang et al., Gene 211:177(1998);およびDaubendiek et al., Nature Biotech. 15:273(1997)に記載される。
【００６０】
好ましい実施態様では、ＲＣＡプローブは、切断部位を含み、その結果ローリングサークル増幅の後または中のいずれかに、該ＲＣＡコンカタマーをアンプリコンに切断し得る。ある実施態様では、これは検出を促進し、なぜなら該アンプリコンは一般により小さく、そして表面上の好ましいハイブリダイゼーション力学を示すからである。当業者に認識されるように、切断部位は、限定しないが、プローブ中の制限部位の使用、リボザイム配列の使用、または核酸切断部分の取りこみを介してある数の形態をとり得る。
【００６１】
好ましい実施態様では、パドロックプローブまたはＲＣＡプローブは制限部位を含む。制限エンドヌクレアーゼ部位は、典型的にはＲＣＡの結果である長いコンカタマーの、表面結合捕捉プローブへより効率的にまたはより速くハイブリダイズするより小さい個々の単位への切断を可能とする。こうして、ＲＣＡに続いて（またはある場合には反応中に）、産物核酸を、適当な制限エンドヌクレアーゼと接触させる。これは産物の、より小さいフラグメントへの切断という結果になる。該フラグメントを次いで、固定化される捕捉プローブとハイブリダイズさせ、検出電極上への産物フラグメントの濃縮という結果となる。
【００６２】
好ましい実施態様では、切断部位は、リボザイム切断部位であり、引用により明示的にここに含まれる、Daubendiek et al., Nature Biotech. 15:273(1997)に全般に記載される通りである。この実施態様では、触媒性ＲＮＡをコードするＲＣＡプローブ、ＮＴＰおおびＲＮＡポリメラーゼを使用することによって、得られたコンカタマーを自己切断することができ、最終的にモノマーアンプリコンを形成する。
【００６３】
好ましい実施態様では、切断を、ＤＮＡ切断試薬を使用して達成する。例えば、当業界で知られるように、切断をもたらすことのできるある数のインターカレーティング部分、例えば光を使用することがある。
【００６４】
こうして、好ましい実施態様では、ＯＬＡ／ＲＣＡを溶液中で実施し、次いでＲＣＡ産物の制限エンドヌクレアーゼ切断。切断された産物を次いで、ここに記載のアレイに適用する。エンドヌクレアーゼ部位の取りこみは、短い、容易にハイブリダイズ可能配列の生成を可能とする。さらに、それぞれのローリングサークルパドロックプローブ配列中の独特な捕捉配列は、アレイ上で平行に分析されるべき核酸配列の広範なセットを可能とし、なぜならそれぞれの配列は、ハイブリダイゼーション特異性に基づいて決定されるからである。
【００６５】
好ましい実施態様では、シグナル増幅技法はＣＰＴである。ＣＰＴ技法は、すべて引用によりその全体を明示的に含ませる、米国特許５０１１７６９、５４０３７１１、５６６０９８８および４８７６１８７号およびＰＣＴ公開出願ＷＯ９５／０５４８０、ＱＯ９５／１４１６、およびＷＯ９５／００６６７および米国出願０９／０１４３０４を含むある数の特許および特許出願に記載されている。ＣＰＴプライマー（またときにここに「切れやすい（scissile）プライマー」として言及する）は、切れやすい結合によって分離される２つのプローブ配列を含む。該ＣＰＴプライマーは標的配列に実質的に相補的であり、そしてこうしてそれにハイブリダイズしハイブリダイゼーション複合体を形成する。切れやすい連結は、標的配列の切断なく、切断され、分離されている２つのプローブ配列を生じる。該２つのプローブ配列をこうして、標的からより容易に脱会合することができ、そして反応を、任意の数のときに反復できる。切断されたプライマーを次いで検出する。「切れやすい連結」によってここに、プローブがハイブリダイゼーション複合体の一部であるとき、すなわち、二本鎖複合体が形成される時、切断されることができる切れやすいプローブ内の連結を意味する。該切れやすい連結は、該切れやすいプローブのみであるがそれがハイブリダイズする配列ではない（すなわち標的配列またはプローブ配列のいずれか）ものを切断し、その結果該標的配列をシグナルの増幅のための反応に再使用し得ることが重要である。
【００６６】
好ましい実施態様では、Invader（登録商標）技法を使用する。Invader（登録商標）技法は、部位特異的態様で核酸を切断する構造特異的ポリメラーゼに基づく。２つのプローブを使用する：ある「インベーダー」プローブおよびある「シグナル化」プローブであって非相補的オーバーラップを有して標的配列に隣接してハイブリダイズするもの。酵素は、「尾部」のその認識のために該オーバーラップで切断し、該「尾部」を放出する。これを次いで検出する。該Invader（登録商標）技法は、すべて引用によりここに包含され米国特許５８４６７１７、５６１４４０２、５７１９０２８、５５４１３１１および５８４３６６９に記載される。
【００６７】
「伸長酵素」によってここに、ＮＴＰの付加によって配列を伸長させる酵素を意味する。当業界で周知のように、広範の好適な伸長酵素であって、そのポリメラーゼが好ましいもの（標的配列およびプレサークル（precircle）プローブの組成に依存して、ＲＮＡおよびＤＮＡの両方）がある。好ましいポリメラーゼは、鎖置換活性を欠き、その結果これらがプローブの末端の必要な塩基のみを付加し、標的化ドメインに相補的であるヌクレオチドを含むようにプローブをさらに伸張させることなく、こうして環形成を防止するものである。好適なポリメラーゼは限定しないが、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノーフラグメント、SEQUENASE1.0およびSEQUENOSE2.0(U.S.Biochemical)、Ｔ５ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼおよび種々のＲＮＡポリメラーゼ、たとえばThermus sp.,またはバクテリオファージ由来のＱベータレプリカーゼを含むＤＮＡおよびＲＮＡの両方のポリメラーゼを含み、またとりわけＳＰ６、Ｔ３、Ｔ４およびＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ使用し得る。
【００６８】
なおより好ましいポリメラーゼは、５’ないし３’エキソヌクレアーゼ活性が本質的になく、プローブがプローブ５’末端を超えて伸長しないことを確保するものである。５’ないし３’エキソヌクレアーゼ活性を欠く例示的酵素は、ＤＮＡポリメラーゼのクレノーフラグメントおよびＤＮＡＰＴａｑポリメラーゼのＳｔｏｆｆｅｌフラグメントを含む。例えばＴａｑＤＮＡポリメラーゼのＳｔｏｆｆｅｌフラグメントは、遺伝的操作のため５’ないし３’エキソヌクレアーゼ活性を欠き、それらはＮ末端２８９アミノ酸を欠く途切れタンパク質の生産という結果となる（例えばLawyer et al., J. Biol. Chem., 264:6427-6437(1989);およびLawyer et al., PCR Meth. Appl., 2:275-287(1993)参照)。類似の突然変異体ポリメラーゼが、T. Maritima、Tsps17、TZ05、ＴｈｔおよびＴａｆに由来するポリメラーゼについて生成された。
【００６９】
前記実施態様では、ポリメラーゼは、それぞれの場合に説明の通りまたはここに概説の通り独特の特徴を有する任意のポリメラーゼであることができ、好ましくは３’エキソヌクレアーゼ活性を欠くもの（３’エキソ−）である。好適なポリメラーゼの例は限定しないが、エキソヌクレアーゼマイナスＤＮＡポリメラーゼＩ大（クレノー）フラグメント、Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、Ｄｅｅｐ ｖｅｎｔ（exo-)、thermosequenase等を含む。加えて、ある実施態様では、一本鎖ＤＮＡを複製するポリメラーゼ（すなわち二本鎖区画を形成するプライマーのない）を使用することができる。
【００７０】
好ましい実施態様では、該ポリメラーゼは、環状ＤＮＡの１００より多いコピーを創出する。より好ましい実施態様では、該ポリメラーゼは、環状ＤＮＡの１０００より多いコピーを創出する；一方最も好ましい実施態様では、該ポリメラーゼは、該テンプレートの１００００より多いコピー、または５００００より多いコピーを創出し、こうして、標的配列を増幅する。
【００７１】
ある種の好ましい実施態様では、末端トランスフェラーゼを使用し、分離標識、例えばビオチンを含むヌクレオチドを、任意の直鎖状分子に付加することができ、それから該混合物を、ストレプトアビジン系により稼動させ、任意の直鎖状核酸を除去し、閉じた環状プローブのみを残す。例えば、ＲＣＡ法におけるように、ゲノムＤＮＡを標的として使用するとき、該ＤＮＡを、種々の技法を使用してビオチニル化し、そして前環（precircle）プローブを添加し、環形成させ得る。環形成されたプローブを、ゲノムDNA上に連鎖させ、該直鎖状非反応前環プローブを、洗い流すことができる。閉じた環プローブを次いで切断し、その結果それらはゲノムDNAから除去され、収集および増幅される。
【００７２】
こうして、前記の増幅方法を使用して、ある数の標的分子を、本発明のアッセイにおいてプローブヘのハイブリダイゼーションのために作成する。一般に、増幅工程をある数のサイクルを可能とするある時間の期間、もとの標的配列のコピー数におよび検出の感度に依存して反復し、サイクルは１ないし数千の範囲、１０ないし１００サイクルが好ましくおよび２０ないし５０サイクルが特に好ましい。以下により十分に概説するように、これらの反応の産物はある数のやり方で検出でき、すべて引用により全体をここに明示的に含める、米国出願０９／４５８５５３、０９／４５８５０１、０９／５７２１８７、０９／４９５９９２、０９／３４４２１７、ＷＯ００／３１１４８、０９／４３９８８９、０９／４３８２０９、０９／３４４６２０、ＰＣＴＵＳ００／１７４２２、０９／４７８７２７に概説される通りである。また、結合リガンドまたはプローブが核酸であるとき、米国特許５５９１５７８、５８２４４７３、５７０５３４８、５７８０２３４および５７７０３６９、米国出願０８／８７３５９８、０８／９１１５８９、ＷＯ９８／２０１６２、ＷＯ９８／１２４３０、ＷＯ９８／５７１５８、ＷＯ００／１６０８９）ＷＯ９９／５７３１７、ＷＯ９９／６７４２５、ＷＯ００／２４９４１、ＰＣＴＵＳ００／１０９０３、ＷＯ００／３８８３６、ＷＯ９９／３７８１９、ＷＯ９９／５７３１９およびＰＣＴＵＳ００／２０４７６に概説される好ましい組成物および技法、および関連材料は、引用により全体をここに明示的に含める。
【００７３】
好ましい実施態様では、増幅技法は、シグナル増幅である。シグナル増幅は、多重シグナル化プローブを生成するか、または多重シグナル化プローブの使用を可能とするための限定された数の標的分子の使用に関係する。シグナル増幅戦略は、ＬＣＲ、ＣＰＴ、Invader（登録商標）、およびサンドウィッチアッセイにおける増幅プローブの使用を含む。
【００７４】
ほとんどの場合に、二本鎖標的核酸を変成し、それらを一本鎖にさせ、以下に記載のプローブのハイブリダイゼーションを可能とする。標的DNAを変性するため、好ましい実施態様は、熱的工程を利用し、一般には約９５℃までの反応の温度をあげることによるが、ｐH変化および他の技法、例えば余分のプローブまたは核酸結合タンパク質の使用をまた使用し得る。
【００７５】
増幅される標的ＤＮＡを次いで、以下に記載の種々の型のプローブと接触させ、ハイブリダイゼーション複合体を形成させる。
【００７６】
「プローブ核酸」によって、標的配列のある部分またはドメインにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを意味する。プローブはまた、「捕捉プローブ」、「ＳＢＥプローブ」または「マイクロアレイプローブ」またはときに、「伸長プローブ」として言及する。プローブがＷＴまたは突然変異体配列に相補的であるかに依存して該プローブは時に、「ＷＴプローブ」または「突然変異体プローブ」として言及し得る。本発明のプローブを、標的配列または標的配列のアンプリコンに相補的であるように設計し、その結果該標的配列および本発明のプローブハイブリダイゼーションが起こる。前記の様に、この相補性は、完全である必要はない；すなわち、標的配列と本発明の捕捉プローブの間のハイブリダイゼーションを妨害する任意の数の塩基対ミスマッチがあり得る。好ましい実施態様では、捕捉プローブは一本鎖である。別の好ましい実施態様では、該捕捉プローブを、以下に記載の用に修飾し、ここで該プローブは、「修飾された捕捉プローブ」または「修飾されたプローブ」として言及する。以下により十分に概説するように、ある実施態様では、該捕捉プローブは追加的塩基（通常は１つの追加的塩基）を含み、自己伸長を防止する。該プローブまたはプライマーを修飾し自己伸長を防止するとき、それはここに、「非自己伸長プローブ」として言及する。
【００７７】
好ましい実施態様では、接触は、バイオチップに付着されたプローブへなされ、そして標的配列に「実質的に相補的」であるように設計され、その結果標的配列と本発明のプローブのハイブリダイゼーションが起こる。以下に概説するように、この相補性は、完全である必要はない；標的配列と本発明の捕捉プローブの間のハイブリダイゼーションを妨害する任意の数の塩基対ミスマッチがあってもよい。しかし、もし突然変異の数が、少なくともストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でさえ、起こることのできないほど大きいならば、該配列は相補的標的配列ではない。こうして、「実質的に相補的」によってここに、捕捉プローブが該標的配列に十分に相補的であり、通常の反応条件、特にここに概説するような高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズすることを意味する。核酸配列の文脈では用語「相補的」は、第２核酸配列への配列関連性を有し、その結果両核酸配列の完全長にわたりワトソンクリック塩基対の完全な整列がある核酸配列を意味する。
【００７８】
種々のハイブリダイゼーション条件を、本発明で使用し得、典型的には、高、中および低ストリンジェンシー条件を含む条件の「ストリンジェンシー」の程度によって分類し得る。例えば引用によりここに含めるManiatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, 1989およびShort Protocols in Molecular Biology, ed Ausubel et al., 参照。ストリンジェント条件は、配列依存性であり、そして異なる状況下で異なる。ストリンジェンシーを、限定しないが、温度、ホルムアミド濃度、塩濃度、かく乱塩濃度ｐＨ、有機溶媒濃度等を含む熱力学的可変である工程パラメーターを変化させることによって制御することができる。これらのパラメーターをまた使用し、米国特許５６８１６９７号に概説されるとおり、非特異的結合を制御し得る。こうしてより高度なストリンジェンシー条件でのある種の工程を実行し、非特異的結合を減少させるのが望ましくあり得る。
【００７９】
Ｔｍは、標的に相補的なプローブの５０％が、平衡で標的配列にハイブリダイズする温度（定義されたイオン強度、ｐＨおよび核酸濃度下での）である（標的配列が過剰に存在するので、Ｔｍで、プローブの５０％が平衡で占められる）。例えば、「最大ストリンジェンシー」は典型的に、約Ｔｍ−５℃（プローブのＴｍの５℃下）に、「高ストリンジェンシー」はＴｍの５−１０℃下、「中程度ストリンジェンシー」はプローブのＴｍの約１０−２０℃下、そして「低ストリンジェンシー」はＴｍの約２０−２５℃下に存在する。いっぱんにハイブリダイゼーション条件は、例えば６ｘＳＳＣまたは６ｘＳＳＰＥを使用する高イオン強度条件で実行する。高ストリンジェント条件下で、ハイブリダイゼーションには、低塩溶液、例えば算出された温度で０．５ｘＳＳＣでの２回洗浄が続く。中度ストリンジェント条件下で、ハイブリダイゼーションには、中塩溶液、例えば２ｘＳＳＣでの２回洗浄が続く。低ストリンジェント条件下で、ハイブリダイゼーションには、高塩溶液、例えば６ｘＳＳＣでの２回洗浄が続く。機能的には、最大ストリンジェンシー条件を使用し、ハイブリダイゼーションプローブとの厳格な同一性またはほとんど厳格な同一性を有する核酸配列を同定し得る；一方高ストリンジェンシー条件を使用し、該プローブとの約８０％またはより多い配列同一性を有する核酸配列を同定する。より長い配列は、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションについての詳細な案内はTijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, '' Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays''(1993)に見出される。
【００８０】
こうして、ストリンジェント条件は、ｐＨ７．０−８．３および短いプローブ（例えば１０ないし５０ヌクレオチド）について温度がすくなくとも約３０℃、長いプローブ（例えば５０ヌクレオチドより長い）について少なくとも約６０℃、塩濃度が、約１．０ナトリウムイオンより低い、典型的には、約０．０１ないし１．０Ｍナトリウムイオン濃度（または他の塩）ものである。
【００８１】
ストリンジェント条件はまた、脱安定化剤、例えばホルムアミドの添加で達成し得る。ハイブリダイゼーション条件はまた、非イオン骨格、すなわちＰＮＡを使用するとき、当業界で知られるように、変化し得る。加えて、架橋剤を、標的結合後、ハイブリダイゼーション複合体の２本の鎖を架橋、すなわち共有付着するために添加し得る。本発明の好ましい実施態様は、アレイ上の「コンペチマー（competimers）」を使用し、非特異的結合を減少させ得る。
【００８２】
こうして、本発明のアッセイを一般に、標的の存在下のみでハイブリダイゼーション複合体の形成を可能とするストリンジェント条件下で稼動させるが、ときおり、より低いストリンジェント条件を使用し得る。例えば、酵素的伸長は、アッセイ選択性が酵素によって増強されるようなより低いストリンジェントハイブリダイゼーション条件を要し得、当業界で一般に理解されるとおりである。本発明の好ましい実施態様での使用される条件の詳細は、以下にさらに記載される。さらに、好ましい条件はアレイを使用し、その結果捕捉プローブは、配列特異的態様で標的ＤＮＡに結合し、そして洗いさられるべき非結合材料を可能とする。
【００８３】
本発明の好ましい実施態様は、ここに記載の単一塩基伸長（ＳＢＥ；ときにまたミニシーケンシングと呼ばれる）アッセイおよびその変形を使用する。一般のＳＢＲアッセイでは、それらの末端塩基のみが異なる２つの捕捉プローブ（野生型（ＷＴ）および突然変異体）を合成し、その結果該２つの捕捉プローブの１つが分析すべき標的配列の「クエリ塩基」または「質問位置」に完全に相補的である。すなわち、該捕捉プローブは、質問またはＳＮＰ塩基を含む。通常のハイブリダイゼーション条件下で、ＷＴおよび突然変異体プローブの両方は、標的配列にハイブリダイズする。しかし、酵素、例えば前定義のリガーゼまたはポリメラーゼは、完全または不完全マッチを区別でき、その結果単一鎖終結化塩基による酵素的伸長（ときに検出のための標識を有する）が、完全な二重らせんが存在するときのみ起こる。すなわち、ＤＮＡポリメラーゼは４つの標識されたターミネーターヌクレオチドの存在下で、完全なハイブリダイゼーションがあるときのみ、１塩基によって捕捉プローブを伸長させることができる。他に、３’塩基ミスマッチが、プライマー伸長を息つかせまたはおもいとどまらせるという結果となる。「ターミネーターヌクレオチド」によって、ヌクレオチドが、さらなる伸長がおこらず、だから１ヌクレオチドのみが付加されるように誘導体化されていることを意味する。好ましい実施態様は、ジデオキシトリフォスフェートヌクレオチド（ｄｄＮＴＰ）を利用し、そして一般に、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ、およびｄｄＴＴＰを含むヌクレオチドのセットを使用し、その少なくとも１つは、好ましくは４つ全部が標識を含む。標識は異なり、または同じであり得、前記のとおりである。ひとたび標識されたヌクレオチドが付加されると、標識の検出が以下に概説のように進行する。全般には、すべて引用によりここに明示的に含める、Sylvanen et al., Genomics 8: 684-92(1990)、米国特許５８４６７１０および５８８８８１９、Pastinen et al., Genomics Res. 7(6):606-14(1997)参照。こうして、標的中のＳＮＰまたはクエリー塩基の同一性を、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長されるプローブセットによって決定する。アッセイのこの型の変形において、プローブは標的のクエリー塩基の１塩基上流の位置で終結する。
【００８４】
ＳＢＥ法の限界は、標的核酸が十分濃度でないならば、反応物中の非伸長プライマーの量が、得られる伸長された標識されたプライマーを大きく超えることである。非伸長プライマーの過剰は、ここに記載のアッセイ中の標識されたプライマーの検出と競合する。よって、ＳＢＥを使用するとき、好ましい実施態様は、ここに概説の非伸長プライマーの除去のための方法を利用する。
【００８５】
この限界に打ち勝つための１つの方法は、熱サイクラーおよび熱安定性ポリメラーゼを使用するアニーリング、プライマー伸長、および熱変性の繰り返しサイクルが、伸長プローブの増幅を可能とするサーモサイクリングミニシーケンシングであり、これは伸長されたプライマーの蓄積という結果となる。例えば、もしもとの非伸長プライマーと標的核酸濃度が１００：１であり、かつ１００熱サイクルおよび伸長を実施するならば、プライマーの多くは伸長するだろう。
【００８６】
当業者に認識されるように、ＳＢＥ系の構成はいくつかの形態をとることができる。ＳＢＥ反応は、溶液中で実施し、それから新しく合成した鎖を、塩基特異的検出可能標識で検出できる。例えばこれらは、伸長プライマーに相補的である捕捉プローブに直接的にハイブリダイズすることができ、そして該標識の存在を次いで検出する。
【００８７】
代替的に、ＳＢＥ反応は表面で起こることができる。例えば標的核酸を、標的の第１表的ドメインにハイブリダイズする第１捕捉プローブを使用して捕捉し得、そして該反応を、第２標的ドメインで進行することができる。該伸長された標識されたプライマーを次いで、第２捕捉プローブに結合させ、そして検出する。
【００８８】
こうして、ＳＢＥ反応は、特定の順序ではなく、伸長プライマー、ポリメラーゼおよび少なくともその１つが標識されているｄＮＴＰを要する。
【００８９】
ＳＢＥに関する以下の引用を、ここに明示的に引用をもって含める：米国出願５６３９６１１、米国出願５８２４４７６、米国出願５９８１１７６、米国出願４８５１３３１、米国出願５８８８８１９、米国出願６００４７４４、米国出願５１３７８０６、米国出願６２８７７７８Ｂ１、米国出願５５８２９７０、米国出願６３０７０３９、米国出願６０１３４３１、米国出願５８４６７１０、米国出願５７１００２８、米国出願６１５３３７９、米国出願５６６５５３９、米国出願６２８７７７８、米国出願５８５６０９２、ＷＯ９２／１５７１２、米国出願４６５６１２７、ＥＰＯ３７１４３７Ｂ１、米国出願５５９５８９０、米国出願６０１５６７５、米国出願５５７８４５８．
【００９０】
多くの現行の利用可能なＳＢＥアッセイで特異性が問題として残る。プローブと標的の間の分子相補性の程度は、相互作用の特性を規定する。ハイブリダイゼーション媒体中のプローブ、標的および塩濃度の、反応温度の、およびプローブの長さの変異は、プローブ／標的相互作用の特異性を変え、または影響し得る。
【００９１】
ＳＮＰの高度に平行的なスクリーニングについて２つの主要なハードルがある（１）再現可能なやり方での複合的ヒトゲノムの単一塩基変異を検出する十分な感度および特異性を達成するための、ＰＣＲによってＳＮＰを横切るりＤＮＡ領域を増幅する必要性、および（２）二倍体ヒトゲノム中のホモ接合性およびヘテロ接合性アリル変異体の間を、あいまいでなく区別する能力。アリル特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）プローブでのディファレンシャルハイブリダイゼーションは、マイクロアレイ形式で最も普通に使用される（引用によりここに明示的に含める、Pastinen et al., Genome Res. 10: 1031-42(2000）。
【００９２】
ＳＢＥアッセイに付随する問題は、アッセイで使用される幾つかのプローブは、「幹−環構造」を形成し、プローブの標的非依存性「自己伸長」という結果となり、こうしてＳＮＰ塩基の識別を妨害する誤りの陽性シグナルを生じる。これらの問題を打ち勝つため、この発明は、ここに記載のいくつかの好ましい実施態様を列挙し、これらは捕捉プローブの新規設計および／または自己伸長を回避するため、ユニプレックス化標的調製および修飾されたポリメラーゼでのプライマー伸長に関係する方法の新規組み合わせの使用に関係する。
【００９３】
すなわち、本発明は、アレイ上のプライマーの自己伸長を防止するための方法を提供する。本発明はまた、修飾されたプライマーを有するアレイを提供する。好ましくは、該プライマーは、ここに記載のように修飾される。ある実施態様では、アレイは、修飾されたヌクレオチドを含むプライマーを含む。修飾されたヌクレオチドは、２−チオチミン、２−アミノアデニン、アミン修飾されたシトシン、アミン修飾されたグアニン、または４−メチルインドールのようなターミネーター塩基のような環外アミン修飾された塩基を含む。本発明ある方法では、修飾されたヌクレオチドは、非自己伸長プローブの幹領域へのポリメラーゼ結合またはタンパク質結合を変え、ここに該修飾されたヌクレオチドが存在する。修飾されたヌクレオチドは、また糖およびフォスフェート修飾を含む。
【００９４】
フォスフェート修飾のある好ましい実施態様は、限定しないが、フォスフォルチオエート、フォスフォルアミデート、メチルフォスフォネート、メチルフォスフォエート、Ｈ−フォスフォネートを含む。
別の好ましい実施態様では、自己伸長を防止するため、短い相補的オリゴヌクレオチドを使用し、これによって自己伸長を阻害する。
本発明の好ましい実施態様での使用の修飾されたヌクレオチドの詳細を、ここに記載する。
【００９５】
ある好ましい実施態様では、捕捉プローブを、それがプローブ中のクエリーＳＮＰ部位の１または２以上の塩基下流で終結するように設計する。一般に、３または４以上の塩基対の幹が、自己伸長のために要求される。下流に付加される塩基はこれらが標的中の塩基に相補的であるが幹−環構造の３’末端でミスマッチであるように設計される。もし幹−環中の塩基の間のミスマッチがあるならば、息つき誘導しおよびＤＮＡポリメラーゼが捕捉プローブを伸長させることから防止するバブルが形成され、こうして誤りの陽性シグナルを生じる。実際上、４またはそれ以上の塩基を付加することは実行可能ではなく、というのは該ＳＮＰ位置はずっと上流であろうし、そして短い二重らせん形成およびポリメラーゼ依存性伸長を、そしてこうして誤りの陽性結果を誘導し得るからである。好ましい実施態様では、ＳＮＰ部位の下流に付加された追加的塩基の数は、１または２または３塩基である。標的依存性伸長は、付加された塩基が標的に相補的であるので、追加的塩基によって影響を受けない。よって、質問位置は、３’末端ヌクレオチドである。代替的に、質問位置は、プライマーの終わりから２番目のヌクレオチドである。
【００９６】
別の好ましい実施態様では、プローブ中のヘアピン構造を脱安定化するために、「修飾された塩基対」を、プローブに取りこませ、これは自己伸長を防止するが、標的ハイブリダイゼーションを妨害しない。そのような修飾された塩基対は、遺伝子治療の適用において前に使用され、ここにその「対」のそれぞれの修飾された塩基は、遺伝子治療に関係する、それぞれの相補的一本鎖核酸中に見出される。そのような修飾された対は、限定しないが（ａ）２−アミノ：２−チオ−Ｔ、（ｂ）２−アミノプリン：２−チオ−Ｔ、（ｃ）６−チオ−Ｃ、（ｄ）２−チオ−Ｃ、（ｅ）疎水性塩基例えば４−メチルインドール、ジフルオロトルエン等を含む。
【００９７】
別の実施態様では、捕捉プローブはプローブの幹領域中の修飾されたホスフェートまたは糖を含み、幹−環構造、そうして誤りの陽性を減少させる。核酸のフォスフェート骨格が核酸−タンパク質相互作用において重要な役割を演じることが当業者に知られる。タンパク質の正に荷電したアミノ酸と負に荷電したフォスフェート骨格の間の静電的相互作用およびフォスフェート酸素とタンパク質の間の水素結合の形成は、特定タンパク質または酵素の、核酸ヘの結合アフィニティに寄与する。この好ましい実施態様では、プローブ骨格のフォスフェートまたは糖環を修飾することによって、ポリメラーゼ酵素の、幹領域についての結合アフィニティを減少させることができ、それによって非特異的ヌクレオチド取りこみの確率を減少させる。そのような修飾は、プローブのクエリー塩基で実施されず、それゆえプローブ−標的二重らせんの熱力学的安定性は変化しない。そのような修飾された核酸の例は以下に記載する。
【００９８】
現行発明では、限定しないがフォスフェート骨格のフォスフォルチオネート、フォスフォルアミデート、メチルフォスフォネートおよびメチルフォスフェート修飾、および糖環上の２’Ｏ−メチル修飾を含むプローブについていくつかの表面荷電修飾を、ここに提唱する。フォスフォロチオネート（硫黄置換）およびフォスフォルアミデート（窒素置換）置換は、荷電分布、疎水性およびフォスフェート骨格と効率的水素結合を形成する酵素の能力を変える。メチルフォスフォネートおよびメチルフォスフェートは、フォスフェート荷電を全く排除し、こうして、酵素のＤＮＡへの結合を全く阻害する（引用によりここに明示的に全体を含めるSmith, SA and McLaughlin, Biochemistry 36:606046-58(1997)およびDartinger et al., Biochemistry 39:55-63(2000)参照）。
【００９９】
なおさらなる好ましい実施態様では、阻害性オリゴヌクレオチドを使用する。本発明は、プローブオリゴヌクレオチド上で平滑末端を創出し相補的な短いオリゴヌクレオチドの使用をなし、そしてプローブの酵素的自己伸長によって生成される誤りのシグナルの生成を防止する。目的のシグナルは、標的の存在下でのみ創出され、そして全ての他の時はシグナルはオフモードのままである（図３３参照）。ＡＰＯＥ３２１．Ｔ．ＡＳＮＰプローブヘの短い相補的ＡＰＯＥ３２１．Ｔ．Ａオリゴは、ＡＰＯＥ３２１．Ｔ．ＡＳＮＰプローブ自己伸長を阻害できる。
【０１００】
別の好ましい実施態様では、技法の組み合わせを使用し、ここに、該組み合わせ結果は自己伸長のための誤りの陽性結果の顕著な減少を生産する。ここに、３つの異なる技法、ＰＥＰ（プライマー伸長予備増幅）、ＩＶＴ（インビトロ転写）、および修飾された逆転写酵素でのプローブ伸長を使用し、これは多重ＰＣＲなく、ＲＣＡＰなく（または他のシグナル増幅技法なく）およびプライマー伸長からの問題なくゲノム幅ＳＮＰ遺伝子型決定を可能とする。該方法は、ＰＥＰ（プライマー伸長予備増幅）反応（米国特許６１８３９５８；Zhang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 89:5847-51(1992)；Casas and Kirkpatrick, Biotechniques, 20:219-25(1996)で知られる）を、ランダムプライマーと実行し、１反応でゲノムＤＮＡを増幅、次いでＩＶＴ反応（もしプライマーの１つがポリメラーゼプロモーター配列を有したら）する。産物、ｃＲＮＡを、修飾された逆転写酵素（ＲＴ）を使用して伸長させるプローブにハイブリダイズさせ、ここに該ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性は排除されている。これは、自己伸長体は、ＲＴによって伸長されないことを意味する。というのは、これらはＤＮＡ依存性伸長であり、そしてＲＮＡ標的に結合されたプローブのみが伸長し、というのはこれらはＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性によるからである。ゆえに、自己伸長は減少する。
【０１０１】
本発明の好ましい実施態様は、前記のようなクエリー塩基への、ＷＴおよび突然変異体プローブを含む捕捉プローブの「アレイ」を含み、これらは、固体支持体に付着または固定化されている。標識の、固体支持体上の空間的配置は、標的との相補的配列を共有するアレイエレメント、すなわち、ＤＮＡ標的中にＷＴまたは突然変異体塩基が存在するか、指摘する。もしＷＴと突然変異体プローブの両方が検出のシグナルを生じるならば、それはＤＮＡサンプル中のヘテロ接合体の存在を指摘する。
【０１０２】
「アレイ」によってここに、アレイ形式の複数のプローブを意味する；アレイのサイズは、アレイの組成および末端使用に依存する。約２つの異なる転移プローブから何千もの多く含むアレイを作成できる。一般に、該アレイは、電極のサイズ、並びにアレイの末端使用に依存して、２から１０００００またはより多く含む。好ましい範囲は、約２ないし約１００００で、約５ないし約１０００が好ましく、および約１０ないし約１００が特に好ましい。加えてそれぞれのアレイはまた、第１染色体コントロールプローブおよび第２染色体コントロールプローブを含む。ある実施態様では、発明の組成物はアレイ形式でなくあり得る；すなわち、ある実施態様では、単一捕捉リガンドを含む組成物をまた作成し得る。加えて、あるアレイでは、異なるまたは同一の組成の、多重基質を使用し得る。こうして例えば、大アレイは、複数のより小さい基質を含み得る。
【０１０３】
よって、前記の様に、本発明は、プローブまたはプライマーが「非自己伸長プローブまたはプライマー」を含む、アレイを提供する。すなわち、アレイのプローブまたはプライマーは、これらがプライマ伸長反応中に自己伸長せず、そうしてＳＢＥアッセイ中の誤りの陽性反応を最小化するように修飾または設計されている。
【０１０４】
好ましい実施態様では、発明は、前記のような非自己伸長可能プライマーを含むアレイを、Ｐ４５０ＳＮＰを含む標的サンプルと接触させる方法を含む。
【０１０５】
本発明の装置は、アレイを含む少なくとも１つの表面を有する基質、そして好ましい実施態様では電極のアレイを記載する。「電極」によってここに、電気的装置に接続されたとき電流または電荷を感じ、そしてそれをシグナルに変換する組成を意味する。代替的には、電極は、溶液中の種にまたはそれから、電圧を印画し、および／または電子を通過させることができる組成として定義できる。好ましい電極は、当業界で既知であり、限定しないが、ある種の金属およびそれらの酸化物であって、金、銅、銀、クロム、チタン、白金、パラジウム、シリコン、アルミニウムを含むもの、金属酸化物電極であって酸化白金、酸化チタニウム、酸化スズ、酸化インジウムスズ、酸化パラジウム、酸化シリコン、酸化アルミニウム、酸化モリブデン（Ｍｏ２Ｏ６）、酸化ランタニウム、および酸化亜鉛および酸化タングステン（ＷＯ３；その両方は透明である）を含むもの；伝導性プラスチック（例えばポリチオフェン、ポリアクリルアミド、ポリアニリン、ポリピロール、および金属浸透ポリマーのようなポリマー）、および炭素（ガラス性炭素電極、グラファイトおよびカーボンペーストを含む）を含む。好ましい電極は、金、シリコン、炭素および金属酸化物電極を含み、特に好ましいのは金である。
【０１０６】
ここに記載の電極は、平面表面として示され、これは該電極の可能な構成のたった１つである。電極の構成は、使用される検出方法で変化する。例えば平面平滑電極は、光学的検出方法のため、または核酸のアレイを作成し、そうして検出の接近可能配置を要するとき、好ましくあり得る。すなわち、それぞれの電極は、１の末端で電極に、および該電極を制御できる装置に付着された相互接続を有し、他の末端上にそれによってそれぞれの電極を独立的に接近可能とする。
【０１０７】
代替的に、電極は記載されるようにポリマー、そして内部表面に結合された核酸を含む管の形態であり得る。これは小体積サンプルに曝露すべき核酸を含む、最大の表面面積を可能とする。
【０１０８】
好ましい実施態様では、ポリマー層を、電極の検出表面上で使用する場合、該電極は、電極とＥＴＭの間または電極と溶媒中の荷電種の間の電気的接触の防止を援助できるポリマーを含む。
【０１０９】
これらの技法の全ては、標的配列の（サンプルの標的配列またはアッセイ中生成された配列）、表面上の捕捉プローブへのハイブリダイゼーションの結果としてのアッセイ複合体の形式による。該アッセイ複合体はさらに、検出標識を含み、複合体形成の検出を援助する。好ましい実施態様では、検出標識は電子転移部分（ＥＴＭ）、または蛍光部分または標的に直接的または間接的に付着された任意の他の標識である。標識および種々の検出系は以下に記載する。
【０１１０】
加えて、本発明は、表面結合アレイの新規特性を利用する新規発明を指向し、非特手基結合を減少する「コンペチマー（competimers）」を使用する。
【０１１１】
核酸アレイは当業界で周知である。そしてある数のやり方で分類できる；整列されたアレイ（例えば区別部位での化学的性質を解析する能力）およびランダムアレイの両方が含まれる。整列されたアレイは限定しないが、フォトリソグラフィー技法（Affymetrix GenChip（登録商標））、スポッティング技法（Synteni and others）、プリンティグ技法(Hewlet Packard and Rosetta)、３次元「ゲルパッド」アレイ等を使用して作成されるものを含む。
【０１１２】
「基質」または「固体支持体」または他の文法的均等物によってここに、核酸の付着または会合のため適当な区別可能な個々の部位を含むよう修飾され得る任意の材料を意味する。当業者に認識されるように、ここに概説される「基質」は、限定しないがシリコン、例えばシリコンウエハー、シリコンジオキシド、シリコンニトライド、ガラス、融合シリカ、修飾シリコン、炭素、ガリウムアルセニド、インジウムホスファイド、アルミニウム、セラミック、ポリイミド、水晶、プラスチック、樹脂、および、ポリメチルメタクリレート、アクリル、ポリブチレン、ポリウレタン、ポリエチレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、ポリスチレンおよび他のスチレンコポリマー、ポリプロピレン、ポリテトラフルオロエチレン、テフロン（登録商標）、ナイロンまたはニトロセルロース等を含むポリマー、多糖類、金属表面例えば超合金、ジルカロイ、スチール、金、銀、銅、タングステン、モリブデウム、タンタル、KOVAR、KEVLER、KAPTON、MYLAR、真鍮、サファイア等を含む広範の材料から作成できる。好ましい実施態様は、利用される試薬に依存して、ガラス、シリコンおよびセラミック材料である。当業者に認識されるように、基質を含む材料は、ここに概説した試薬と両立可能である。
【０１１３】
等業者に認識されるように、核酸プローブを、種々のやり方で固体支持体に付着または固定化することができる。「固定化」および文法的均等物によってここに、核酸プローブと固体支持体の間の会合または結合が、結合、洗浄、分析、および以下に概説されるような除去の条件下で安定であるのに十分であることを意味する。結合は、共有または非共有である。「非共有結合」および文法的均等物によってここに、静電気的、親水性、および疎水性相互作用の１または２以上を意味する。非共有結合に含まれるのは、分子の共有結合、例えば支持体に対するストレプトアビジンおよびビオチニル化プローブのストレプトアビジンヘの非共有結合である。「共有結合」および文法的均等物によってここに、２つの部分、固体支持体およびプローブが、シグマ結合、ｐｉ結合および配位結合を含む少なくとも１つの結合によって付着されることを意味する。共有結合は、プローブと固体支持体の間に直接的に形成でき、または架橋によって、または固体支持体またはプローブのいずれかまたは両方の分子上の特異的反応基の包含によって、形成できる。固定化はまた、共有または非共有相互作用の組み合わせに関係し得る。一般に、プローブはバイオチップへ種々のやり方で付着することができ、当業者に認識される通りである。ここに記載のように、核酸を最初に合成し、次にバイオチップに付着させるか、またはバイオチップ上に直接的に合成することができる。
【０１１４】
好ましい実施態様では、以下に十分に概説するように、基質は、電極、絶縁層、および限定しないが伝導性ポリマー、ポリアクリルアミド、ポリピロール、SurModics（登録商標）ゲルマトリクスを含むポリマー層等を含むある数の異なる層を、プローブの支持体への付着のために含み、引用によりここに明示的に含ませるＷＯ９８／２０１６２およびＷＯ９９／５７３１７に一般に記載されるとおりである。代替的実施態様では、プローブを、マイクロ電極と接触しているポリマーへ付着させる。
【０１１５】
好ましい実施態様では、アレイのオリゴヌクレオチドプローブを付着させるため使用するポリマーは、SurModics（登録商標）ゲルマトリクスである。これはポリマー上へのオリゴヌクレオチドの共有結合を可能とするように誘導体化されている、ポリアクリルアミドに基づくゲルである。例えば、図３７では、アシル置換反応の例を、記載し、活性化されたオリゴヌクレオチドを、それを介してポリマーに付着させることができる。SurModics(登録商標）ゲルマトリクスの構造は、図３８にしめされる。方法およびプラットフォームは、基質、SurModics（登録商標）マトリクスおよびある数のオリゴヌクレオチドプローブを含む、もっとも一般的には基質はガラススライドである。ガラススライドヘ共有結合されるのは、薄いポリアクリルアミドマトリクスである。ポリアクリルアミドは、オリゴヌクレオチド付着基および光架橋基で官能化されている。おおむね２０−３０ヌクレオチドの種々のオリゴヌクレオチドを、AminoLink（登録商標）末端ヌクレオチドとともに標準的フォスフォルアミダイト化学を使用して合成し、これは（ＣＨ２）６−ＮＨ２リンカーを含む。これらのオリゴヌクレオチドを、マトリクス上の区別可能な位置にスポットする。プローブを、AminoLink（登録商標）アミノ基およびマトリックスないに存在するオリゴヌクレオチド付着基との相互作用を介して、マトリクスに共有結合させる。ひとたび形成されると、光架橋アクリルアミドマトリクスと、共有結合されたオリゴヌクレオチドプローブを、サンプルをアッセイすることにおいて使用する。
【０１１６】
この実施態様では、発明のプローブを、修飾Badged IIディスペンスロボット（Packard, Meridian, CT; Motorola Life Sciences, Tempe, AZ）を使用する、活性化（ＭＨＳ）エステル（’’３Ｄ−Ｌｉｎｋスライド；cat#:DN01-0025; Surmodics, Inc.; Eden Prairie, MN)を含むハイドロゲルのフィルムで被覆されたスライド上にアレイ化する。
【０１１７】
「絶縁層」によってここに、実質的に電子を輸送しない材料の層を意味する。好ましくは、絶縁層は、限定しないがセラミック、プラスチック、プリントされた回路ボード材料、ポリマー、金属オキシドまたはニトライド、例えばＳｉＯ２、ＳｉＮｘまたはＡ１０ｘを含む絶縁性材料である。
【０１１８】
好ましい実施態様では、ポリマー層は、限定しないがポリピロール、ポリチオフェン、ポリアニリン、ポリフラン、ポリプリジン、ポリカルバゾール、ポリフェニレン、ポリ（フェニレンビニレン）、ポリフルオレン、ポリインドール、ポリアクリルアミド、アガロースゲル、ポリエチレングリコール、セルラー、ゾルゲル、デンドリマー、金属性ナノ粒子、カーボンナノチューブ、それらの誘導体、それらのコポリマー、およびそれらの組み合わせを含むポリマーを使用し、特定の部位のプローブ濃度の量を増加させる。好ましい実施態様では、該材料は、中性ピロールマトリクスを含む。プローブ負荷容量を増加させるため、多孔性マトリクス、例えばポリアクリルアミド、アガロース、またはゾルゲルが好ましい。これらの実施態様では、プローブ材料を、以下に述べる官能性化学を使用して電極の表面上の支持マトリクス上に付着させる。代替的実施態様では、プローブを、マイクロ電極と接触しているポリマーに付着させる。
【０１１９】
さらに、基質はまた、「バイオチップ」として言及する。「バイオチップ」または文法的均等物によってここに、区別可能なバイオ分子、特に核酸のアレイを含む基質を意味する。
【０１２０】
好ましい基質はまた、プリントされた回路ボード（ＰＣＢ）材料を含む。すべて引用によりその全体を明示的にここに含ませる、米国出願０９／７９６０７７、ＰＣＴＵＳ００／３４１４５．ＰＣＴＵＳ０１／０２６６４、ＰＣＴ／ＵＳ００？３３４９９、ＰＣＴ／ＵＳ００／３３４９７、ＰＣＴＵＳ９９／２３３２４、ＷＯ０１／３４３０２、ＷＯ９８／２０１６２、ＷＯ９８／１１２４３０、ＷＯ００／１６０８９、ＷＯ９９／５７３１７、ＷＯ９９／６７４２５、ＷＯ０１／３５１００、ＷＯ００／６２９３１、ＷＯ０１／０６０１６、ＷＯ０１／０７６６５およびＰＣＴＵＳ０１／０１１５０参照。
【０１２１】
好ましい実施態様では、基質はまた「アレイ位置（array locations）」を含む。よって、本発明は、複数のアレイ位置を有する基質を含む組成物を提供する。「アレイ位置」または「パッド」または「部位」によってここに、共有付着された核酸プローブを含む基質上の位置を意味する。追加的に、本系は、以下にさらに記載するアレイ形式の特定の単一性を見出し、ここでアドレスで呼び出せる検出電極のマトリックスがある（ここに一般に「パッド」、「アドレス」または「マイクロ位置」と言及）。
【０１２２】
ある好ましい実施態様では、該電極は、自己集合単層（self-assembled monolayers,SAM）を含む。「単層」または「自己集合単層」または「ＳＡＭ」によってここに、表面上に自発的に化学吸着された分子の比較的整列された集合を意味し、ここで該分子は、互いに近似的に平行に、そして表面におおむね垂直に方向付けられている。該分子の多数は、表面に固着している官能基、および単層中の隣接分子と相互作用し比較的整列されたアレイを形成する部分を含む。「混合された」単層は、異種性単層を含み、すなわち少なくとも２種の異なる分子が、単層を作成する場合である。ＳＡＭはまた、以下に記載する伝導性オリゴマーを含むことができる。
【０１２３】
ここに概説するように、標的配列結合（例えば、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション）の効率は、配列が検出電極からある距離にあるときに増加し得る。同様に、標的配列を含むバイオ分子の、検出電極ヘの非特異的結合は、単層が存在するときに、一般に減少する。こうして、単層は、電極表面からはなれた配列の維持を容易化する。加えて、この層は、電極とＥＴＭの間または電極と溶媒中の荷電種の間の電気的接触を防止するのを援助する。そのような接触は、サンプル中に存在し得る荷電性種を介する直接的「短回路」または間接的短回路という結果となる。よって、単層は好ましくは電極表面上の斉一層中の完全に堅固につめこまれ、その結果「ホール」の最小が存在する。該単層はこうして、検出電極への溶媒接近可能性を阻止する物理的障壁として供する。
【０１２４】
「伝導性オリゴマー」によってここに、実質的に伝導するオリゴマー、好ましくは線形であって、そのある実施態様では、「分子ワイヤ」として文献中では言及されるものを意味する。「実質的に伝導する」によってここに、１００Ｈｚで電子を移動させることのできるオリゴマーを意味する。一般に、伝導性オリゴマーは実質的に、伝導性オリゴマーのモノマー性単位の間のようなオーバーラップΠ軌道、すなわち共役Π軌道を有するが、該伝導性オリゴマーはまた、１または２以上のシグマ（σ）結合を含みうる。追加的に、伝導性オリゴマーは、会合ＲＴＭから、またはそこから電子を注入または受容するその能力によって、機能的に定義され得る。さらに、伝導性オリゴマーは、ここに定義のような絶縁体よりもより伝導性である。追加的に、発明の伝導性オリゴマーは、自身電子を供与または受容し得る、電気的活性ポリマーから区別されるべきである。他の好ましい実施態様では、単層は、エレクトロコンジット形成種を含む。「エレクトロコンジット形成種」または「ＥＦＳ」によってここに、表面の電子またはＥＴＭの検出を可能とするために一般に絶縁体の単層中で、十分なエレクトロコンジットを生成できる分子を意味する。
【０１２５】
好ましい実施態様では、伝導性オリゴマーは、約１０−６ないし１０４Ω−１ｃｍ−１、好ましくは約１０−５ないし約１０３Ωの間の伝導度Ｓを有し、これらのＳ値は、約２０オングストロームないし約２００オングストロームの範囲の分子について算出されている。以下に記載のように、絶縁体は、約１０−７Ω−１ｃｍ−１またはより低を有し、好ましくは約１０−８Ω−１ｃｍ−１より低い伝導度Ｓを有する。全般には、引用によりここに含めるGardner et al., Sensors and Actuators A 51(1995)57-66参照。
【０１２６】
伝導性オリゴマーに望まれる特性は、高伝導性、合成および本発明の組成物の使用のための有機溶媒および／または水中の十分な溶解性、そして好ましくは、（ｉ）核酸合成中（導電性オリゴマーを含むヌクレオシドが本発明の組成物の合成中の核酸合成機へ添加し得るように）、（ｉｉ）電極への伝導性オリゴマーの付着中、または（ｉｉｉ）ハイブリダイゼーションアッセイ中に、起こる反応への化学的抵抗性を含む。加えて、自己集合単層の形成を促進する伝導性オリゴマーが好ましい。本発明のオリゴマーは、ここに記載のように少なくとも２つのモノマー性サブユニットを含む。以下に十分に記載のようオリゴマーは、ホモまたはヘテロオリゴマーを含みおよびポリマーを含む。
【０１２７】
一般に、ＥＦＳは、以下の質の１または２以上を含む：これらは、例えばアルキル鎖と比較して比較的強固な分子であり得；これらは他の単層形成種（例えばチオール基で金表面に付着されるアルキル鎖は、おおむね４５度で付着されると考えられ、そしてチオールを介して金に付着されるフェニルアセチレン鎖は、９０度角度で落ちると考えられる）と異なるジオメトリーを有して電極表面に付着され得る；これらは堅固に閉じ込められた単層の形成を、例えばアルキル基のような分枝基の包含、または高度に柔軟な種、例えばポリエチレングリコール単位の包含を介し、立体的に妨害または介入する構造を有し得る；またはこれらは活性化されエレクトロコンジットを形成することができる；例えば、光活性化すると表面から選択的に除去し、エレクトロコンジットを残すことのできる光活性化可能種であり得る。
【０１２８】
好ましいＥＦＳは、以下に定義のように伝導性オリゴマー、およびフェニル−アセチレン−ポリエチレングリコール種、並びに不斉ＳＡＭ形成ジスルフィド種、例えば引用によりここに明示的に含ませる１９９９年７月２７日出願の米国出願６０／１４５９１２の図に示されるものを含む。しかし、ある実施態様では、ＥＦＳは伝導性オリゴマーではない。
【０１２９】
当業者に認識されるように、核酸プローブは、種々のやり方で固体支持体に付着または固定化され得る。「固定化」および文法的均等物によってここに、核酸プローブと固体支持体の間の会合または結合が、以下に概説の結合、洗浄、分析および除去の条件下で安定であるにのに十分であることを意味する。結合は、共有または非共有であることができる。「非共有結合」および文法的均等物によってここに、１または２以上の静電的、親水性、および疎水性相互作用を意味する。非共有結合は、分子の共有付着、例えば支持対ヘのストレプトアビジン、およびストレプトアビジンヘのビオチニル化プローブの非共有結合を意味する。「共有結合」および文法的均等物によってここに、２つの部分である固体支持体およびプローブが、シグマ結合、ｐｉ結合および配位結合を含む少なくとも１つの結合によって付着されることを意味する。
【０１３０】
捕捉プローブの、検出表面ヘの付着の方法は、「捕捉結合リガンド」または「捕捉プローブ」の組成および検出表面の組成に依存して、種々のやり方によってなすことができる。直接的または間接的付着を使用できる。間接的付着は、付着リンカーを使用してなす。一般に、両方のやり方は、捕捉プローブ上の官能基、付着リンカーまたはスペーサー、および共有付着のための検出表面を利用する。付着のための好ましい官能基は、アミノ基、カルボキシ基、オキソ基、およびチオール基である。これらの官能基を次いで、直接的または間接的に、ときに「Ｚ」、「リンカー」または「スペーサー」または「アンカー基」としてここに示される、リンカーを使用して付着されれ、当業界で周知である；例えばホモまたはヘテロ双官能リンカーが周知である（引用によりここに含める1994 Pierce Chemical Companyカタログ、クロスリンカーについての技術の部、１５５−２００頁参照）。本発明の実施化で有用な好ましい修飾は、限定しないが−ＯＨ、−ＮＨ２、−ＳＨ、−ＣＯＯＲ（ここでＲ＝Ｈ、低級（Ｃ１−１２）アルキル、アリール、複素環式アルキルまたはアリールまたは金属イオン）、−ＣＮまたは−ＣＨＯを含む。そのような誘導体化プローブの固定化は、官能基例えば−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ２を介する検出表面上ヘのプローブ分子ヘの直接的付着によって達成する。
【０１３１】
本系は、アレイ形式で特別の利用性を見出し、ここでアドレス可能検出電極のマトリックスがある（ここに全般に「パッド」、「アドレス」または「マイクロ位置」と言及する）。
【０１３２】
いくつかのアレイ構成は、ここに記載する。好ましい実施態様では、CodeLink（登録商標）アレイ技法を使用する。CodeLink（登録商標）技法は、生物学的結合部位のアレイを有する基質を含むバイオチップ上の高容量生物学的系反応を可能とするための装置を提供する。１または２以上のアレイを有するハイブリダイゼーションチャンバー、好ましくは親水性、３−次元ゲルからなるアレイを含み、そしてもっとも好ましくは３次元ポリアクリルアミドゲルからなるアレイを含むものを提供し、ここに核酸ハイブリダイゼーションが、目的の標的分子を含む生物学的サンプルを、ゲル上に固定化された相補的オリゴヌクレオチドプローブと反応させることにより実行する。核酸ハイブリダイゼーションアレイは、有利には、プローブアレイ技法を使用して実施し、これは標的一本鎖DNAの、固定化オリゴヌクレオチドプローブヘの結合を利用する。好ましいアレイは、すべて引用によりここに明示的に含める、米国出願０９／４５８５０１、０９／４５９６８５、０９／４６４４９０、０９／６０５７６６、ＰＣＴ／ＵＳ００／３４１４５、０９／４９２０１３、ＰＣＴ／ＵＳ０１／０２６６４、ＷＯ０１／５４８１４、０９／４５８５３３、０９／３４４２１７、ＰＣＴ／ＵＳ９９／２７７７８３、０９／４３９８８９、ＰＣＴ／ＵＳ００／４２０５３およびＷＯ０１／３４２９２に概説されるものを含む。
【０１３３】
さらなる好ましい実施態様では、eSensor（登録商標）アレイ技法を使用する。eSensor（登録商標）技法は、生物学的分子の結合および検出のための表面上の自己集合単層（SAM)を使用する。ＳＡＭは、電極を、電気的活性剤（例えば塩）溶液から保護するアルキル鎖である。標識プローブに当初に結合されている、電気化学的標識（例えばフェロセン）は、電極へ流れ、そして検出シグナルを生産する。例えば、ＷＯ９８／２０１６２、ＰＣＴＵＳ９８／１２４３０、ＰＣＴＵＳ９８／１２０８２、ＰＣＴＵＳ９９／０１７０５、ＰＣＴ／ＵＳ９９／２１６８３、ＰＣＴ／ＵＳ９９／１０１０４、ＰＣＴ／ＵＳ９９／０１７０３、ＰＣＴ／ＵＳ００／３１２３３、米国特許５６２０８５０、６１９７５１５、６０１３４５９、６０１３１７０および６０６５５７３およびここに引用する引用参照。他の好ましい実施態様では、電気的アレイ技法を使用し、以下にさらに記載のとおりである。
【０１３４】
本発明はまた、同時的多重バイオチップ分析を可能とする装置を有する。特に、該装置は、核酸アレイを含む多重カートリッジを保持するように構成され、そしてサンプルの高処理量分析を可能とする。
【０１３５】
「カートリッジ」によってここに、バイオチップのためのカーシングまたはハウジングを意味する。ここに概説するように、そして当業者に認識されるように、該カートリッジは、ある数の構成を有し、そして種々の材料から作成することができる。好適な材料は限定しないｇ、ファイバーグラス、テフロン（登録商標）、セラミック、ガラス、シリコン、マイカ、プラスチック（アクリル、ポリスチレン、およびスチレンおよび他の材料のコポリマー、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブチレン、ポリカーボネート、ポリウレタン、Tefdlon（登録商標）およびそれらの誘導体等を含む）等を含む。特に好ましいカートリッジ材料は、プラスチック（ポリカーボネートおよびポリプロピレンを含む）およびガラスである。
【０１３６】
当業者によって認識されるように、カートリッジは、反応チャンバー、インレットおよびアウトレットポート、熱電気構成要素を含む加熱要素、RFアンテナ、電磁気構成要素、メモリーチップ、シーリング構成要素、例えばガスケット、相互接続を含む電気的構成要素、マルチプレクサー、プロセッサーを含むある数の構成要素を含むことができる。
【０１３７】
該装置は、バイオチップ、同じまたは異なる型のバイオチップを受けるように構成されたカートリッジステーションのある数を含み、種々の型のバイオチップの分析を可能とする。該ステーションは、限定しないがサーモコントローラー、シグナリングシステム、漏れ検出のためのセンサー、英数字ディスプレイ、および検出器を含む広範の種々の構成要素を含むことができる。好ましい実施態様が電気化学的検出による電極を含むバイオチップの使用を含むとき、該装置および／またはステーションは、検出プロセスで使用される装置ボードおよびプロセッサーを含むことができる。バイオ分子のアレイを含むバイオチップカートリッジは、種々のやり方で形成されることができる。例えば、チップは、試薬の導入および除去のためのインレットオヨビアウトレットポートを有する反応チャンバーを含むことができる。加えて、該カートリッジは、マイクロ流体構成勝訴を有するキャップおよび蓋を含むことができ、その結果該サンプルを導入し試薬を添加し、反応をさせ、それから検出のためサンプルを除去することができ、引用によりここに全体を含ませる２００１年７月１１日出願米国出願０９／９０４１７５に詳細に記載される通りである。
【０１３８】
好ましい実施態様では、該カートリッジは、反応チャンバーを含む。一般に、該反応チャンバーは、サンプルの、バイオチップアレイへの接触をもたらす空間および体積を含む。反応チャンバーの体積は、アレイのサイズおよびなされるアッセイに依存して変化することができる。一般に、反応チャンバーは、１ｎＬないし約１ｍＬ、好ましくは約１ないし約２５０μＬ、特に好ましくは約１０ないし約１００μＬの範囲であり得る。ある実施態様では、エアバブルの、反応チャンバーへの導入を避けるため（それは検出を破壊させうる）、反応チャンバーは、導入されるサンプルのサイズよりも小さく、わずかなオーバーフローを可能とし、そうしてエアーが少ないまたはない反応チャンバーを確保する。
【０１３９】
カートリッジの反応チャンバーは、分析されるべきサンプルの導入のためのインレットポートを含む。該インレットポートは、所望により、反応チャンバーからのサンプルまたは試薬の蒸発を防止または減少させるシールを含み得る。好ましい実施態様では、シールは、ピペットまたはシリンジを押すことができるガスケットを含む。該ガスケットは、ゴムまたはシリコンまたは他の好適な材料、例えばセルロースを含む材料であることができる。
【０１４０】
該反応チャンバーは、種々のやり方で構成できる。好ましい実施態様では、該反応チャンバーは、エアバブルまたは他のサンプル不純物の導入または保持を最小化するように構成される。こうして、好ましい実施態様では、該反応チャンバーはさらに、アウトレットポートを含み、エアや過剰のサンプルが反応チャンバーをでていくのを可能とする。こうして流体サンプルは、反応チャンバーに流れ、そしてアレイと接触する。ある実施態様では、該アウトレットポートは、排液貯蔵ウェル、チップまたはカートリッジの外部表面にはけ口をつくり、または、好ましい実施態様では、インレットポートに戻る。こうして例えば好ましい実施態様は、出口ポートがインレットポートへ、好ましくは、負荷の点の上にはけ口をつくる、システムを利用する。例えば、ピペットを使用し、カートリッジに負荷するとき、ピペットのティップは出口ポートの下に伸長し、その結果出口ポートからのエアーは、反応チャンバーに導入されない。加えて、カートリッジハウジングおよびバイオチップの材料は、親水性または疎水性において類似であるように選択し、エアーバブルの創出を回避できる。
【０１４１】
加えて好ましい実施態様では、反応チャンバー／インレットおよび／またはアウトレットポートは所望により、バルブの使用を含む。例えば半透性膜またはフィルターを使用し得、それは優先的に、気体の排出を可能とするがチャンバーないにサンプルを保持する。例えば、多孔性テフロン（登録商標）、例えばGortex（登録商標）は、流体でなくエアーの貫通を可能とする。
【０１４２】
当業界で認識されるように、このやり方で使用し得る種々の反応チャンバー幾何学がある。一般に、インレットポートと反応チャンバーのインターセクションを、小さい隙間口を有するカートリッジの「底」に、反応チャンバーを広げつつ、もたらすことが好ましい。加えて、反応チャンバーの「頂部」もまた狭まる。こうして反応チャンバーのサイズおよび形状について好ましい実施態様は、反応チャンバーの円滑な負荷を可能とする。好ましい実施態様は、鋭いコーナーまたはバブル形成のための点として供する他の構成要素の使用を回避する反応チャンバー幾何学を利用する。
【０１４３】
加えて、ある実施態様では、反応チャンバーは、サンプルの混合を可能とするように構成できる。例えば、サンプルおよび試薬を同時的にまたは別個にチャンバーに導入するとき、インレットポートおよび／または反応チャンバーは、堰、チャンネルまたはサンプルと試薬の混合を最大とする他の構成要素を含む。加えて、以下に概説するように、反応は、混合および／または分離のための磁性ビーズを利用し得る。
【０１４４】
好ましい実施態様では、該カートリッジは、シーリング機構を含み、サンプルまたは試薬の、基質の他の部分上への、特に（電気的検出の場合に）電極相互連結上ヘの漏れを防止する。当業者に認識されるように、これは種々の異なる形態をとりうる。ある実施態様では、アレイを含むバイオチップ基質と、シート、管またはストリップを含むカートリッジの間にガスケットがある。代替的には、使用されるゴムまたはシリコンストリップまたは管があり得る；例えばハウジングは、該ガスケットがはまり、それからハウジング、ガスケットおよびチップが一緒にしまるギザギザまたはチャンネルを含み得る。さらに、ガスケットをカートリッジを付着させるために使用できる接着剤、例えば両面接着剤を使用し得る；例えばシリコン、アクリル、および接着剤の組み合わせを使用し、ガスケットをバイオチップへ付着することができ、これを次いで、ここに記載のようなカートリッジないへ締めることができる。
【０１４５】
ある実施態様では、反応チャンバーおよびバイオチップ基質は、別個のシーリング機構が要されないように構成される。例えば、バイオチップ基質は内部のアレイとともに、反応チャンバーの「半分」として供することができ、反応チャンバーハウジングは、他の「半分」として供することができる。使用される材料に依存して、２つを付着させるための所望の接着剤があり得る。代替的に、基質の両側上のアレイがあるとき、該ハウジングは、基質を包含し得る。
【０１４６】
こうして、これらの実施態様では、反応チャンバーの体積は、カートリッジ中にウェルを形成させその結果バイオチップ基質の添加が、アレイ周辺に反応チャンバーを形成するようにすることによって、または平面カートリッジを使用することおよび規定の深さガスケットを使用することによって、または２つの組み合わせによってセットできる。
【０１４７】
好ましい実施態様では、カートリッジは、キャップまたは蓋を含む。キャップは、それがマイクロ流体構成要素を含むとき、以下に概説されるように機能性であり得る。加えて、キャップは安全目的のため、生物学的材料の漏出または交差汚染を防止するように設計し得る。追加的に、該キャップは取り外し可能に設計できる。当業者に認識されるように、キャップは、種々の構成をとることができる。例えばある実施態様では、該キャップは単にインレットポートをシールし、アッセイ中のサンプルの蒸発を防止することができる。好ましい実施態様では、該キャップは、サンプル取り扱いおよび試薬貯蔵における使用のために追加的要素のある数を含み得る。例えば、種々のマイクロ流体構成要素を、キャップに確立し、最終的に標的検体検出または定量をもたらすサンプル上のある数の操作をもたらすことができる。全般に、すべて引用により含める、ＰＣＴＵＳ００／１０９０３およびそこに概説される引用参照。これらの操作は、細胞取り扱い（細胞濃縮、細胞溶解、細胞除去、細胞分離等）、所望の標的検体の、他のサンプル構成要素からの分離、標的検体上の化学的または酵素的反応、標的検体の検出等を含むことができる。本発明の装置は、サンプル操作、廃液または試薬のための１または２以上のウェル；エレクトロフォレチック分離マトリクスを含むマイクロチャンネル、これらのウェルへおよびそれらの間のマイクロチャンネル（ときにフローチャンネルと称する)；流体移動を制御するバルブ；チップ上ポンプ、例えば電気的浸透性、電気的流体力学的、または電気的力学的ポンプを含むことができる。加えて、ここに概説するように、装置の内部表面の部分は、必要により種々の被覆で被覆し、非特異的結合を減少させ、生物両立性、流動抵抗性等のために、結合リガンドの付着をもたらし得る。これらのマイクロ流体キャップは、種々のやり方で、当業者に認識されるように、作成できる、例えば引用によりここに明示的に含める、ＰＣＴＵＳ００／１０９０３およびそこに概説される引用参照。
【０１４８】
カートリッジのキャップをアッセイの部分として使用するとき、それを、ここに「モジュール」として言及する、１または２以上の種々の構成要素を含むように構成し得、これはその用途に依存しておよびマイクロチャンネルによって要求されるように任意の所定の装置上に存在する。これらのモジュールは限定しないが：サンプルインレットポート；サンプル導入または収集モジュール；細胞取り扱いモジュール（例えば細胞溶解、細胞除去、細胞濃縮、細胞分離または捕捉、細胞成長等）；分離モジュール、例えば電気泳動、ジエレクトロフォレシス、ゲルろ過、イオン交換／アフィニティクロマトグラフィー(捕捉および放出）等；標的検体の増幅を含む（例えば標的検体が核酸であるとき、増幅技法は有用な、限定しないがポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（ＯＬＡ）；鎖置換増幅（ＳＤＡ）、および核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）およびＷＯ９９／３７８１９およびＰＣＴＵＳ／１９８８９に概説される他の技法を含む）、サンプルの化学的または生物学的変化のための反応モジュール、標的検体の化学的、物理的または酵素的切断または変化、または標的の化学的修飾；流体ポンプ（限定しないが、電気的浸透性、電気的流体力学性、または電気的力学的ポンプを含む；流体バルブ；加熱または冷却のための熱的モジュール；アッセイ試薬のための貯蔵モジュール；混合チャンバー；および検出モジュールを含む。
【０１４９】
加えて、カートリッジのキャップと会合されるように、これらのマイクロ流体構成要素はここに記載される一方、当業者に認識される通り、これらのモジュールおよびチャンネル（並びにここに概説の他の構成要素）は、カートリッジまたは装置のいずれかの場所に位置し得る。加えて、巣構成要素は、装置中に存在し得；例えば「オフチップ」ポンプが、装置の１または２以上のステーションないに位置し得る。
【０１５０】
該カートリッジは、少なくとも１つのバイオチップを含み、ある実施態様は、カートリッジあたり１または２以上のバイオチップを利用する。
【０１５１】
標識の検出は、標的配列の存在を指摘する。以下に記載のすべての技法は、捕捉プローブまたはＳＢＥプローブ配列に相補的な配列を含む標的配列のハイブリダイゼーションの結果として、表面上のアッセイ複合体の形成による。
【０１５２】
本発明のアッセイを稼動させる３つの一般的やり方がある。すなわち、ハイブリダイゼーションは、直接的または間接的（サンドイッチタイプ）であることができる。第１の実施態様では、「標的配列」または「標的検体」を標識する；標的配列の結合はこうして、固体指示体の表面に標識を提供する。代替的に第２に実施態様では、非標識標的配列を使用し、そして「サンドイッチ」形式を利用する；この実施態様では、標的配列分子あたり使用される少なくとも２つの結合リガンド；「捕捉」または「アンカー」結合リガンドであって（またここに「捕捉プローブ」として言及し、特に核酸結合リガンドと言及する）これはここに記載のように検出表面に付着されるもの、および可溶性結合リガンド（頻繁にここに「シグナリングプローブ」または「電子移動部分」として言及する）であって標的配列に独立的に結合し、そして少なくとも１つの標識を直接的または間接的に含むものがある。
【０１５３】
別の好ましい実施態様では、検出技法は、すべてここに引用により全体を含ませる、米国出願６０／０７３０１１、米国特許５６８１７０２、５５９７９０９、５５４５７３０、５５９４１１７、５５９１５８４、５５７１６７０、５５８０７３１、５５７１６７０、５５９１５８４、５６２４８０２、５６３５３５２、５５９４１１８、５３５９１００、５１２４２４６、および５６８１６９７に全般に記載される通りである「サンドイッチ」アッセイを含む。サンドイッチアッセイは、プライマーの変化という結果となるが、サンドイッチアッセイは、シグナル増幅技法を考えることができ、というのは、多重シグナル（すなわち標識プローブ）が、単一の標的に結合され、シグナルの増幅をもたらすからである。サンドイッチアッセイを、標的配列が標識を含まないときに；すなわち標識を含む二次的プローブを使用しシグナルを生成するときに使用する。ここに記載のように、サンドイッチアッセイは、一次的標的配列（例えば患者サンプル由来）の検出のために、または前記のような増幅反応の産物を検出するための方法として、使用できることが注意されるべきである。
【０１５４】
種々の検出方法を使用し得、限定しないが、蛍光、リン蛍光、発光、化学発光、電気化学発光、および屈折指数を含む、光学的検出（酸化還元状態が変化におけるスペクトル変化の結果として）；および限定しないが、アムペロメトリー（amperommetry）、ボルタンメトリー、キャパシタンスおよびインピーダンスを含む電気的検出；および限定しないが遷移金属錯体、有機ＥＴＭおよび電極を含む電気化学的検出を含む。電子移動の検出は一般に、電子的に、好ましくは電位差により開始される。電圧はアッセイ複合体に印加される。印加されるで電圧の正確な制御および変化は、定電圧および３つの電極システム（１つの参照、１つのサンプル（または作動）および１つのカウンター電極）または２つの電極システム（１つのサンプルおよび１つのカウンター電極）を介するものである。これは、印加される電圧の、ピーク電圧ヘのマッチングを可能とし、これは一部はＥＴＭの選択（レポーターを使用するとき）および一部は他のシステム構成要素、単層の組成および強度、およびどの参照電極の型を使用するかに依存する。
【０１５５】
ある実施態様では、検出分子を、標的配列の光学的検出を可能とするように構成する。ここに、該検出表面は、前記の捕捉プローブの付着のために好適な任意の表面を含み得る。一般に、標的配列の光学的検出は、「標識として」標的配列上の着色または発光色素を提供することに関係する。好ましい標識は限定しないが、ユーリピウムおよびテルビウムのそれら、フルオレセイン、ローダミン、テトラメチルローダミン、エオシン、エリスロシン、クマリン、メチル−クマリン、ピレン、Malaciteグリーン、スチルベン、Lucifer Yellow、Cascade Blue(登録商標）、Texas Red、１，１’−[１，３−プロパンジイルビス[（ジメチルイミノ−３，１−プロパンジイル]]ビス[４−[（３−メチル−２（３Ｈ）−ベンズオキサゾリルイデン）メチル]]−、テトラヨージド（tetraioide）（これはＹＯＹＯ−１の名前で売られ）、引用により明示的にここに含める、Molecular Probes Handbook by Richard P. Hauglandの第６版に記載されるその他を含む蛍光ランタニド錯体を含む。
【０１５６】
好ましい実施態様では、ストレプトアビジン−Alexaシステムを、検出のために使用する。ここにサンプルを当初に、ビオチニル化プライマーでの増幅により加工し、ビオチニル化アンプリコンを生じさせる。該アレイマトリックスを次いで、これらのビオチニル化アンプリコンと接触させる。アンプリコンの、オリゴヌクレオチドプローブへのハイブリダイゼーションを、蛍光色素、Molecular Probes, Inc.から購入したAlexa色素へコンジュゲートしたストレプトアビジンの付加によって測定する。ビオチン−ストレプトアビジン相互作用のために、該色素は、アレイマトリクスのこれらの区別可能な位置へ局在化し、ここでオリゴヌクレオチドプローブがビオチニル化アンプリコンにハイブリダイズする。すべての他の位置は、ビオチニル化アンプリコンがなく、こうして該色素はない。色素の存在を、任意の種々のやり方で検出し得、そして検出は、自動化データ加工を可能とするため自動化し得る。
【０１５７】
結合後、種々の技法は、蛍光標識によって発される放射の検出を可能とする。これらの技法は、溶液中のまたは光ファイバーに付着された核酸プローブと光ファイバーセンサーを使用することを含む。蛍光を、光電子増幅管または光ファイバーに付着された他の光検出装置を使用して監視する。
【０１５８】
加えて、走査蛍光検出器、例えばMolecualr Dynamicsによって売られるFluorimagerを、固体表面上に配列された修飾された核酸分子の蛍光を監視するために理想的に適合化させる。このシステムの利点は、数千の区別可能な核酸プローブでカバーされるチップを使用して一度に走査できる電子移動プローブの多数である。
【０１５９】
さらに、光ダイオード、CCDカメラ、またはアクティブピクセルシステムを使用し、蛍光標識によって発される放射を画像化し得る。
【０１６０】
これらの方法はまた、直流または交流電流に基づく時間または頻度依存方法、パルス方法、ロックイン技法、ろ過（高通過、低通過、帯域通過）、および時間分解蛍光を含む時間分解技法を含む。
【０１６１】
電気化学的検出のために、標的配列は、電気化学的に活性なレポーター（またここに電子移動部分（ETM)として言及する）例えば以下に規定の遷移金属錯体を含むことができる。ＥＴＭは、核酸、標的配列、または可溶性結合リガンドのいずれかに付着でき、引用によりその全体をここに明示的に含めるＷＯ９８／２０１６２に一般に概説される通りである。
【０１６２】
ひとたびアッセイ複合体が形成されると、ＥＴＭの存在または不存在を、以下に、およびすべて引用によりそれらの全体をここに明示的に含める、米国特許５５９１５７８、５８２４４７３、５７７０３６９、５７０５３４８および５７８０２３４、米国出願０８／９１１５８９、０９／１３５１８３、０９／３０６６５３、０９／１３４０５８、０９／２９５６９１、０９／２３８３５１、０９／２４５１０５および０９／３３８７２６およびＰＣＴ出願ＷＯ９８／２０１６２、ＷＯ００／１６０８９、ＰＣＴＵＳ９９／０１７０５、ＰＣＴＵＳ９９／０１７０３、ＰＣＴＵＳ００／１０９０３およびＰＣＴＵＳ９９／１０１０４に記載される通り検出する。
【０１６３】
用語「電子供与体部分」、「電子受容体部分」および「ＥＴＭ」（または文法的同等品はここに、ある種の条件下で電子移動が可能な分子を言及する。電子供与体および受容体能力は相対的であると理解されうべきであり；すなわちある種の実験条件下で電子を失うことのできる分子は、種々の実験条件下で電子を受容することができる。可能な電子供与体部分および電子受容体部分の数は、非常に大きくそして、電子移動化合物の当業者は、本発明の化合物のある数を利用することができることが理解されるべきである。好ましいＥＴＭは限定しないが、遷移金属錯体、有機ＥＴＭおよび電極を含む。
【０１６４】
好ましい実施態様では、ＥＴＭは遷移金属錯体である。遷移金属は、原子が、電子の部分的または完全なｄ殻を有するものである。本発明の用途のため好適な遷移金属は、限定しないが、カドミウム（Ｃｄ）、銅（Ｃｕ）、コバルト（Ｃｏ）、パラジウム（Ｐｄ）、亜Ｒん（Ｚｎ）、鉄（Ｆｅ）、ルテニウム（Ｒｕ）、ロジウム（Ｒｈ）、オスミウム（Ｏｓ）、レニウム（Ｒｅ）、白金（Ｐｔ）、スカンジウム（Ｓｃ）、チタニウム（Ｔｉ）、バナジウム（Ｖ）、クロム（Ｃｒ）、マンガン（Ｍｎ）、ニッケル（Ｎｉ）、モリブデン（Ｍｏ）、テクネチウム（Ｔｃ）、タングステン（Ｗ）、およびイリジウム（Ｉｒ）を含む。すなわち、第１族遷移金属、白金属（Ｒｕ、Ｒｈ、Ｐｄ、Ｏｓ、ＩｒおよびＰｔ）と、Ｆｅ、Ｒｅ、Ｗ、ＭｏおよびＴｃが好ましい。特に好ましいのは、ルテニウム、レニウム、オスミウム、白金、コバルトおよび鉄である。
【０１６５】
当業界で認識されるように、共リガンドは同じまたは異なることができる。好適なリガンド、２つのカテゴリに分類される：窒素、酸素、硫黄、炭素またはリン原子を使用するリガンド（金属イオンによる）であってコーディネーション原子（一般に文献でシグマ（σ）供与体として言及される）のようなもの、および有機金属リガンド、例えばメタロセンリガンド（一般に文献でｐｉ（Π）供与体として言及され、ここにＬｍとして示す）。好適な窒素供与リガンドは、当業界で知られ、および限定しないがＮＨ２；ＮＨＲ；ＮＲＲ’；ピリジン；ピラジン；イソニコチンアミド；イミダゾール；ビピリジンおよびビピリジンの置換誘導体；テルピリジンおよび置換誘導体；フェナントロリン、特に１，１０−フェナントロリン（ｐｈｅｎと略す）およびフェナントロリンの置換誘導体、例えば４，７−ジメチルフェナントロリンおよびジピリドル（dipyridol）［３，２−ａ：２’，３’−ｃ］フェナジン（ｄｐｐｚと略す）；ジピリドフェナジン；１，４，５，８，９，１２−ヘキサアザトリフェニレン（ｈａｔと略す）；９，１０−フェナントレンキノンジイミン（ｐｈｉと略す；１，４，５，８−テトラアザフェナントレン（ｔａｐと略す）；１，４，８，１１−テトラ−アザシクロテトラデカン（ｃｙｃｌａｍと略す）、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡおよびイソシアニドを含む。縮合誘導体を含む置換誘導体をまた使用し得る。ある実施態様では、ポルフィリンおよびポルフィリンファミリーの置換誘導体を使用し得る。例えばすべて引用によりここに明示的に含めるComprehensive Coordination Chemistry, Ed. Wilkinson et al., PErgammon Press, 1987, Chapter 13.2(pp73-98), 21.1(pp.813-898)and 21.3(pp.915-957)参照。
【０１６６】
遷移金属錯体に加えて、他の有機電子供与体および受容体を、本発明の用途のために核酸に共有付着させ得る。これらの有機分子は限定しないが、リボフラビン、キサンテン色素、アジン色素、アクリジンオレンジ、Ｎ，Ｎ’−ジメチル−２，７−ジアザピレニウムジクロリド（ＤＡＰ２＋）、メチルビオロゲン、エチジウムブロミド、キノン、例えばＮ，Ｎ’−ジメチルアントラ（２，１，９−ｄｅｆ：６，５，１０−ｄ’，ｅ’，ｆ’）ジイソキノリンジクロリド（ＡＤＩＱ２＋）；ポルフィリン（[メソ−テトラキス（Ｎ−メチル−ｘ−ピリジニウム）ポルフィリンテトラクロリド]、バルラミンブルーＢヒドロクロリド、Ｂｉｎｄｓｃｈｅｄｌｅｒの緑；２，６−ジクロロインドフェノール、２，６−ジブロモフェノールインドフェノール；Briliantクレストブルー（３−アミノ−９−ジメチル−アミノ−１０−メチルフェノキシアジンクロリド）、メチレンブルー；NileブルーＡ（アミノアフトジエチルアミノフェノキシアジンサルフェート）、インジゴ−５，５’，７，７’−テトラスルホン酸、インジゴ−５，５’，７−トリスルホン酸；フェノサフラニン、インジゴ−５−モノスルホン酸；サフラニンＴ；ビス（ジメチルグリオキシマト）−鉄（ＩＩ）クロリド；インヅリンスカーレット、中性赤、アントラセン、コロネン(coronene)、ピレン、９−フェニルアントラセン、ルブレン、ビナフチル、ＤＰＡ、フェノチアゼン、フルオルアンセン、フェナントレン、クリセン、１，８−ジフェニル−１，３，５，７−オクタテトラセン、ナフタレン、アセナフタレン、ペリレン、ＴＭＰＤおよびこれらの化合物のアナログおよび置換誘導体を含む。
【０１６７】
特異的ＥＴＭの選択は、使用される電子移動検出の型によって影響を受け、全体に以下に概説の通りである。好ましいＥＴＭは、メタロセンであり、フェロセンが特に好ましい。
【０１６８】
好ましい実施態様では、複数のETMを使用する。
なおさらなる好ましい実施態様では、Xanthon（登録商標）アレイ技法を、使用する。Xanthon技法は、サンプル精製、蛍光の増幅または使用、化学発光または放射性標識なく標的核酸を直接的に検出する電気化学的プラットフォームである。この技法は、可溶性電子移動メディエーターに基づき、表面上の酸化可能グアニン残基の数を定量する。すなわち、標的配列が存在するとき、グアニンの量が増加し、こうして電子移動の増加を生じる (例えば、 An ionic Liquid Form of DNA:Redox-Active Molten Salts of Nucleic Acids. A. M. Leone, S. C. Weatherly, M. E. Williams, R. W.Murray*, H. H. Thorp* J. Am. Chem. Soc., 2001,123,218-222. Mediated electrochemical detection of nucleic acids for drug discovery and clinical diagnostics. N. Popovich IVD Technology, 2001,7,36-42.Oxidation of 7-Deazaguanine : Mismatch-Dependent Electrochemistry and Selective Strand Scission. l. V. Yang, H. H. Thorp* Inorg. Chem., 2001,40,1690-1697. Oxidation Kinetics of Guanine in DNA Molecules Adsorbed to Indium Tin Oxide Electrodes. P. M. Armistead, H. H. Thorp* Anal. Chem., 2001,73,558-564. Proton-Coupled Electron Transfer in Duplex DNA: Driving Force Dependence and Isotope Effects on Electrocatalytic Oxidation of Guanine. S. C. Weather ! y, !. V. Yang, H. H. Thorp* J.Am. Chem. Soc., 2001,123,1236-1237. Effects of Base Stacking on Guanine Electron Transfer:Rate Constants for G and GG Sequences of Oligonucleotides from Catalytic Electrochemistry. M. F.Sistare, S. J. Codden, G. Heimlich, H. H. Thorp* J. Am. Chem. Soc., 2000,122,4742-4749.Electrocatalysis of Guanine Electron Transfer: New Insights from Submillimeter Carbon Electrodes. V.A. Szalai, H. H. Thorp* J. Phys. Chem. B., 2000,104,6851-6859. Electron Transfer in Tetrads:Adjacent Guanines are not Hole Traps in G Quartets. V. A. Szalai, H. H. Thorp* J. Am. Chem. Soc., 2000,122,4524-4525. Kinetics of Metal-Mediated, One-Electron Oxidation of Guanine in Polymeric DNA and Oligonucleotides Containing Trinucleotide Repeat Sequences. l. V. Yang, H. H. Thorp* Inorg. Chem., 2000,39,4969-4976. Modification of Metal Oxides with Nucleic Acids: Detection of Attomole Quantities of Immobilized DNA by Electrocatalysis. P. M. Armistead, H. H. Thorp* Anal.Chem., 2000,72,3764-3770. Electrochemical Detection of Single-Stranded DNA using Polymer-Modified Electrodes. A. C. Ontko, P. M. Armistead, S. R. Kircus, H. H. Thorp* Inorg. Chem., 1999, 38,1842-1846. Electrocatalytic Oxidation of Nucleic Acids at Electrodes Modified with Nylon and Nitrocellulose Membranes. Mary E. Napier and H. Holden Thorp J. Fluorescence, 1999, 9: 181-186. Electrochemical Studies of Polynucleotide Binding and Oxidation by Metal Complexes:effects of Scan Rate, Concentration, and Sequence. M. F. Sistare, R. C. Holmberg, H. H. Thorp* J.Phys. Chem. B, 1999,103,10718-10728. Site-Selective Electron Transfer from Purines to Electrocatalysts : Voltammetric Detection of a Biologically Relevant Deletion in Hybridized DNA Duplexes. Patricia A. Ropp and H. Holden Thorp Chem. and Biol., 1999. Electrochemical Detection of Single-Stranded DNA using Polymer-Modified Electrodes. A. C. Ontko, P. M. Armistead, S. R. Kircus,H. H. Thorp* Inorg. Chem. 1999,38,1842-1846. 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Cyclic Voltammetry Studies of Polynucleotide Binding and Oxidation by Metal Complexes: Homogenouos Electron-Transfer Kinetics.D. H. Johnston, H. H. Thorp* J. Phys. Chem. 1996,100,13837-13843. Electrochemical Measurement of the Solvent Accessibility of Nucleobases Using Electron Transfer Between DNA and Metal Complexes. D. H. Johnston, K. C. Glasgow, H. H. Thorp J. Am. Chem. Soc. 1995,117,89338937.) The aforementioned references are hereby incorporated by reference. The following U. S. Patents also describe the Xanthon technology and are hereby incorporated by reference: U. S.Patent No. 6,180,346, Electropolymerizable Film, and Method of Making and Use Thereof; U. S. Patent No. 6,132,971, Electrochemical Detection of Nucleic Acid Hybridization; U. S. Patent No. 6,127,127,Monolayer and Electrode For Detecting A Label-Bearing Target And Method Of Use Thereof; U. S.Patent No. 5,968,745, Polymer Electrodes for Detecting Nucleic Acid Hybridization and Method of Use Thereof; U. S. Patent No. 5,871,918, Electrochemical Detection of Nucleic Acid Hybridization; U. S.Patent No. 5,171,853, Process of Cleaving Nucleic Acids with Oxoruthenium (IV) Complexes参照。
【０１６９】
電子移動の検出は一般に、電子的に、好ましくは電位差で開始する。電位差をアッセイ複合体に印加する。適用される電位差の正確な制御および変化は、ポテンシオスタットを介しておよび３電極システム（１つは参照、１つはサンプル（または作業）および１つはカウンター電極）または二電極システム（１つはサンプルおよび１つはカウンター電極）のいずれかを介して測定できる。これは印加された電位差の、システムのピーク電位差への適合を可能とし、これあＥＴＭの選択に一部依存（レポーターを使用するとき）および一部は、単層の他のシステム構成要素、組成およびインテグリティ、およびどの型の参照電極を使用するかに依存する。
【０１７０】
核酸ハイブリダイゼーションの新規検出方法を可能とする、電極を含む、電子移動部分を含む核酸を含む、新規組成物を記載する、すべて引用により明示的にここに含める、ＰＣＴ出願ＷＯ９５／１５９７１、ＰＣＴ／ＵＳ９６／０９７６９、ＰＣＴ／ＵＳ９７／０９７３９、ＰＣＴＵＳ９９／０１７０５、ＷＯ９６／４０７１２およびＷＯ９８／２０１６２参照。
【０１７１】
好ましい実施態様では、アンペロンメトリー、ボルタンメトリー、キャパシタンス、およびインピーダンスを含む電気的検出を使用する。好適な技法は限定しないが、電気的重力測定；クーロメトリー（制御電位差クーロメトリーおよび定常電流クーロメトリーを含む）；voltametry（サイクリックvoltametry、パルスvoltametry（通常のvoltametry、方形波voltametry、ディファレンシャルパルスvoltametry、Osteryoung方形波voltametryおよびcoulostaticパルス技法）；ストリッピング分析（アニオヂックストリッピング分析、カチオヂックストリッピング分析、方形波ストリッピングブルタンメトリー）；コンダクタンス測定（電気分解的コンダクタンス、直接分析）；時間依存電気化学分析（クロノアンペロメトリー、クロノポテンシオメトリー、サイクリッククロノポテンシオメトリーおよびアンペロメトリー、ＡＣポログラフィ、クロノガルバメトリー、およびクロノクーロメトリー）；ＡＣインピーダンス測定；キャパシタンス測定；ＡＣボルタメトリー；および光電気化学法を含む。
【０１７２】
好ましい実施態様では、電子移動をモニタリングすることは、アンペロメトリー検出を介する。この検出方法は、電位差を（別個の参照電極と比較して）、目的の標的遺伝子を含有するサンプル中の、核酸コンジュゲート電極および参照（カウンター）電極の間に印加する事に関係する。異なる効率の電子移動は、標的核酸の存在または不存在のサンプルに誘導される；すなわち標的核酸の存在または不存在、その結果標識プローブは、異なる電流を生じることができる。
【０１７３】
アンペロメトリー的に電子移動を測定するための装置は、敏感な電流検出に関係し、そして電位差電圧を制御する手段、通常ポテンシオスタットを含む。この電圧は、標識プローブ上の電子供与複合体の電圧に対する参照で最適化される。可能な電子供与複合体は、先に述べたものを含み、好ましくは鉄、オスミウム、白金、コバルト、レニウム、およびルテニウムの錯体、そして最も好ましくは鉄の錯体である。
【０１７４】
好ましい実施態様では、代替的電子検出様式を利用する。例えばポテンシオメトリック（またはボルタメトリック）測定は、非ファラデー性（非ネット電流フロー）プロセスに関係し、そして伝統的に、ｐＨおよび他のイオンディテクターにおいて利用される。類似のセンサーを使用し、ＥＴＭと電極の間の電子移動を監視する。加えて、絶縁体の（例えば抵抗）および伝導体の（例えばコンダクティビティ、インピーダンスおよびキャｐシタンス）の他の特性は、ＥＴＭと電極の間の電子移動を監視するために使用し得る。最終的に、電流を生成する任意のシステム（例えば電子移動）はまた、小さい磁場を生成し、これはある実施態様で監視し得る。
【０１７５】
好ましい実施態様では、電子移動を、交流（ＡＣ）方法を使用して開始する。理論に縛られることなく、電極に結合されたＥＴＭは、一般に、抵抗器およびコンデンサーを含む回路にわたるＡＣ電位差に類似して応答する。
【０１７６】
代替的に、レポーターのないまたは標識のないシステムを使用する。この実施態様では、２つの検出電極を使用し、標的配列結合の結果としての、キャパシタンスまたはインピーダンスの変化を測定する。一般に、両方引用により明示的に含める、１９９９年１２月９日出願米国出願０９／４５８５３３およびＣＰＴＵＳ００／３３４９７参照。
【０１７７】
この実施態様では、標識のないシステムを使用して、２つの検出電極の表面を、ポリマーマトリクスの層でカバーする。
【０１７８】
標識、例えばETMを使用しないとき、他の開始／検出システムが好ましくあり得る。この実施態様では、固定化プローブ分子とサンプル混合物中の標的分子の間の分子相互作用を、ACインピーダンスを使用して電気的シグナルを検出することによって検出する。他の実施態様では、そのような分子相互作用を、インピーダンススペクトロスコピー、サイクリックボルタンメトリー、ACボルタンメトリー、パルスボルタンメトリー、方形波ボルタンメトリー、ACボルタンメトリー、流体力学モジュレーションボルタンメトリー、コンダクタンス、ポテンシャルステップ方法、ポテンシオメトリック測定、アンペロメトリック測定、電流段階方法、他の定常状態または一過性測定方法、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される電気的または電気化学的検出方法を使用して電気的シグナルを検出することによって検出する。
【０１７９】
本発明の装置のある実施態様では、それぞれの試験電極の電気的インピーダンスを生産するための手段は、Model 1260 Impedance/Gain Phase Analyzer とModel 1287 Electrochamical interface(Solartron Inc., Houston, TX)を使用して達成する。他の電気的インピーダンス測定手段は、限定しないが、電気化学的セル、例えばＡＣブリッジおよびＡＣボルタメトリーに印加されたＤＣ電圧上に重ねたＡＣシグナル摂動を使用する一過性方法を含む。該測定を、すぐに検出または他には有利であるべく決定される電気的シグナル変化を特異的に生産する任意の特定の周波数で実行できる。そのような特定の周波数は、有路異には、周波数生産を確保する走査周波数、例えば電気的シグナルの最大の相違によって決定する。プローブと標的分子の間の分子相互作用の結果としてそれぞれの試験部位電極のインピーダンスの変化を決定する手段は、前記装置のいずれかを使用することによって達成できる。
【０１８０】
以下の例は前記発明を使用する態様をより十分に記載、並びに発明の種々の側面を実施するための完全なベストモードを示すするために供する。これらの例は、この発明の真の範囲を限定する目的に供さず、むしろ例示もくていのため提示することが理解される。ここに引用のすべての引用は、引用により全体を含める。
【０１８１】
実施例
実施例１：ヒト
Ｐ４５０ＳＮＰアッセイ
Ｐ４５０遺伝子の可能な臨床目的の突然変異（アリル）のリストは同定された。図３ＡないしＤのワークシートは、多型（ＳＮＰ）および当初アッセイ計画に取りこまれた遺伝子のそれぞれについての文献引用を記載する。Ｐ４５０アッセイは、所定の個々のＤＮＡサンプル中に存在する選択されたＳＮＰの種々の多型状態（アリル）を区別するように設計される。アッセイプロトコルは、２つの主要なプロセス領域に分解できる；標的調製およびシグナル検出。シグナル検出は、単一塩基伸長（ＳＢＥ）として既知の技法を介して達成する。標的集団は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技法を使用して、もし興味あるならばヒトゲノム領域の特異的増幅に基づく。
【０１８２】
ＰＣＲ技法を介するＤＮＡ増幅は、伸長および増幅のため使用される短いプライマー配列の設計に高度に依存する。Ｐ４５０アッセイのため、これらのプライマー配列の設計における困難性は、緊密に関連するＰ４５０遺伝子ファミリーの性質にある。Ｐ４５０遺伝子の全ては、５０＋遺伝子および２５＋偽遺伝子のスーパーファミリーに属し、そして顕著なレベルの（領域）相同性、特に同じサブファミリー中のそれらを共有し得る（すなわち、サブファミリー２Ｃは、遺伝子２Ｃ８、２Ｃ９、２Ｃ１８、２Ｃ１９等を含む）。同じサブファミリー中の遺伝子メンバーは、同じ染色体上に位置し、そして通常は、イントロンとエキソンの同一数を含む。付着の表は、２Ｄ６ファミリー中の遺伝子によって共有される相対的相同性を例示する（図４参照）。
【０１８３】
目的の標的遺伝子のみに特異的なプライマーを設計するアプローチは、プライマーの特に３’末端に焦点がある遺伝子サブファミリー関連遺伝子に対する塩基対ミスマッチを有する領域を選択することであった。この態様では、アニーリングハイブリダイゼーション特異性と、プライマーの３’末端からヌクレオチドを伸長するＰＣＲポリメラーゼの識別の両方に基づく。プライマー設計は、さらに、１９ｂｐより大きい長さ、およびＧＣ含量と対あたりのＴｍの観点のバランスに限定された。可能ならいつでも、プライマーはまた、３’末端で−ＡＡ−３’またはーＣＡ−３’出終わるように選択され、プライマーダイマー形成を防止する。すべてのプライマー候補を、コンパイル化Ｐ４５０配列ライブラリー（５７遺伝子）に対するＢＬＡＳＴアルゴリズム（相同性分析アルゴリズム）を使用して分析し、任意の潜在的な交差反応性プライマー候補を除去した。相同性分析に加えて、プライマー候補は、また、反復性配列のデータベースに対してスクリーニングした。図５は、増幅のため現在使用されるすべてのＰ４５０プライマーをカテゴリー化する。
【０１８４】
プライマーは、これらの領域が比較的より保存されている原理のため、遺伝子配列のエキソン領域において設計した。多くの場合に、ミスマッチ区別を含むエキソン領域は、離れており、３００−６５００ｂｐの長さで変化するアンプリコンを生じる。このアンプリコン長の分散は、長いＰＣＲ条件のための増幅形式を書き取る。任意の非特異的産物を減少させ、かつ収率を維持するＰＣＲ条件の最適化は、以下の領域に焦点が合った：アニーリング温度、伸長時間、Ｍｇ２＋濃度、プライマー濃度および酵素濃度。ヒトＰ４５０Codelinkプロトコルは、現行の所望のＰＣＲ条件を反映する（以下の実施例２参照）。
【０１８５】
２つの遺伝子、ＣＹＰ２Ｄ６およびＣＹＰ２Ｃ１９は、最大の臨床的興味のものであり、そしてまた、その類縁（relative）サブファミリー遺伝子への最高の相同性を有する。ＣＹＰ２Ｄ６およびＣＹＰ２Ｃ１９プライマーの特異性を評価するため、２Ｄ８、２Ｄ７Ａ、２Ｄ７Ｂおよび２Ｃ９へ特異的なプライマーを設計した。実験を、ゲノムＤＮＡ標的を使用してすべてのプライマーで稼動し（プライマーが作動することを評価するため）、そして次いで標的としてＣＹＰ２Ｄ６およびＣＹＰ２Ｃ１９希釈したアンプリコンとすべてのプライマ−を使用して再増幅した。もし任意の交差種増幅がＣＹＰ２Ｄ６およびＣＹＰ２Ｃ１９のＰＣＲ中に発生したならば、ＣＹＰ２Ｄ６／２Ｃ１９希釈アンプリコンが再増幅するとこれらの交差産物が見られるだろうと思われる。交差増幅が存在する証拠は、２Ｄ６および２Ｃ１９プライマーで観察されず、設計の特異性ヘの信頼を与える。
【０１８６】
単一ＤＮＡサンプルから増幅されたＰ４５０アンプリコンは、すべてのアンプリコンを合わせ、貯留した溶液を精製し（過剰のｄＮＴＰとプライマーの除去）およびＰＣＲ産物のフラグメント化によるＳＮＰ検出のため調製する。完全なプロトコルおよび方法は、実施例２に概説する。ひとたび標的調製を完了すると、方法の次の部分は、単一塩基伸長（ＳＢＥ）を介するシグナル検出である。
【０１８７】
それぞれの単一ヌクレオチド多型の検出を、５’末端上のポリマー表面に結合されたわれわれのプローブの３’末端のＳＢＥを介して達成する。プローブを、ＳＮＰ位置の３’末端またはＳＮＰ＋１との対で設計する。存在する標的への完全なマッチは、ハイブリダイゼーション中に動力学的に好ましく、そして最大のシグナル強度を生じる。ヘテロ接合性突然変異の場合には、対の両方のプローブは、比較的等しい強度を示す。検出の質はしたがって、プローブ設計の特異性および質に依存する。すべての当初プローブ設計を、部ローブ設計ソフトウェア包装、例えば「Peobe Design」を使用して加工する。同一の固定化参照配列を、プライマー設計のため使用されるＩＵＰＡＣ命名法を使用して同定されたＳＮＰと同一の固定化参照配列を、プローブ設計に使用した。
【０１８８】
それぞれのＳＮＰについて、プローブ候補を、両方の配列方向、センスおよびアンチセンスから設計した。方向に加えて、プローブを２つの異なるＴｍのもの、６０℃と７０℃で設計した。ここにプローブ配列が緊密に接近する多重ＳＮＰをオーバーラップさせる場合について、ｄＩＴＰ（デオキシ−イノシントリフォスフェート）をかわりに使用し、ここで多型が、検出される（３’末端で）のと他の位置のプローブ上に存在する。ｄＩＴＰは、結合においてよりストリンジェントでなく、そしてその特定の位置でのミスマッチを可能とする。
【０１８９】
アッセイ分析の信頼性を増加させるため、２型のコントロールプローブを又設計した。１０独特アンプリコンのそれぞれの首尾よい増幅を検出するためのプローブを、保存され、そして検出されるＳＮＰから比較的分離している遺伝子配列（アンプリコンによってカバーされる）上の領域において設計した。もしこれらのアンプリコンコントロールプローブ（ＡＳＰ）の１つがシグナルをもたらさないならば、このアンプリコンによって検出されるＳＮＰは、分析からマスクされ、該アンプリコンがＰＣＲしなかったものと思われる。２Ｄ６がこのアッセイのＳＮＰの近似的に半分を含むから、２Ｄ７Ａ、２Ｄ７Ｂ、および２Ｄ８についての偽遺伝子コントロールプローブ（ＰＣＧ）を設計し、ＰＣＲ反応が特異的で、かつ混合遺伝子種が存在しないことの追加的確認とする。
【０１９０】
すべてのプローブ候補は、実際のチップ確立およびアッセイ試験を介して当初成績スクリーニングの反復を通過させた。突然変異を最良に識別するプローブを選択した（金標準として使用された配列決定データ）。当初成績スクリーニング後、可能な自己伸長のためのバックグラウンド上のシグナルを示すプローブの多くは、１−２塩基オーバーラップの付加で再設計した。図６は、現在のＰ４５０アッセイのための最終的プローブリストを示す。これらのプローブの識別能力についての成績データを図７に要約する。
【０１９１】
実施例２：ヒトＰ４５０Ｃｏｄｅｌｉｎｋプロトコル：発明のチップを稼動させるための好ましいプロトコル（図１１ないし１６参照）
製品説明
CodeLink（登録商標）SNP Bioarrays:Human P450は、チトクロムＰ４５０遺伝子に関連する９６単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）を遺伝子型決定するためのツールである。CodeLink SNP Bioarrays:Human P450は、７ヒトチトクロムＰ４５０遺伝子のサブセットについての一本鎖オリゴヌクレオチドプローブを含む。これらの遺伝子は、ＣＹＰ１Ａ１、１Ａ２、１Ｂ１、２Ｃ１９、２Ｄ６、２Ｅ１および３Ａ４である。４つの独立的アッセイを、それぞれのCodeLink SNP Bioarrays: Human P450上で実施できる。
【０１９２】
成績明細
この産物は、９５％の応答割合（call rate)と９８％の正確性を有する。
貯蔵および取り扱い
受け入れたら、Codelink SNP Bioarrays:HumanP450は、もとの包装では室温で貯蔵すべきである。
Motorola SBE KitおよびUniplex PCRプライマープレートは、−２０℃で貯蔵すべきである。
【０１９３】
製品は限定を使用する
CodeLink SNP Bioarrays:Human P450は、調査用途のみのためであり、そして診断目的のため使用すべきでない。
すべての生物学的標本および材料は、感染を伝達することが可能であり、そして連邦、州および局地的規則にしたがって妥当な警戒で処置すべきである。これらはOSHA Bloodborne Pathogensへの忠実な支持を含む。
血液由来について標準（２９ＣＦＲ１９１０．１０３０）および他のサンプルは、この行為により律される。
警告
この処理のすべての工程の間のサンプル、試薬およびアレイの交差汚染を回避するために訓練が必要である。
微生物汚染を回避する。高微粒子含量の領域を回避する。
【０１９４】
アッセイプロトコル：標的調製および単一塩基伸長（ＳＢＥ）
1.0 始動
1.1 Motorola試薬/キット
CodeLink SNP バイオアレイ : P450 ベータキット, Motorola, Part# 20002
Data Disk CD, Motorola, Part# 20006 P450 ベータPCRプライマープレート, Motorola, Part# 30007
SBE キット, Motorola, Part# 20006
・ ビオチニル化Acycloターミネーターヌクレオチドミックス
・ SBEバッファー
1.2 処方された試薬/キット
Roche Biochemicals
PCR-等級デオキシ-ヌクレオチドセット, Roche Biochemicals, Part# 1969064
Applied Biosystems
GeneAmps（登録商標） XL DNA ポリメラーゼ(3.3X XL バッファー, 25 mM 酢酸マグネシウム (Mg (OAc)2を含む), Applied Biosystems, Par# N808-0187 [400 単位] または Part# N808
0188 [2400 単位]
Life Technologies, Inc. (LTI)
DNアーゼ I 増幅等級 (1 U/uL) は、DNアーゼI 10X バッファー, LTI, Part# 18068-015と同梱されている
Ultrapure ddH20 (ヌクレアーゼフリー), Life Technologies, Inc. (LTI), Part# 15230-170
Aldrich
エチルアルコール,無水 99.5+%, Aldrich, Part# 15,190-4,または均等物
Qiagen QlAquick 8 PCR 精製キット, Qiagen, Part# 28142
Amersham
Thermo Sequenase(登録商標）(酵素のみ), Amersham, Part# E79000Y [1000 単位]またはPart# E79000Z [10,000単位]
Sigma
1 M Tris-cl pH 7.6 ストック溶液, Sigma, Part# T2788
5 M 塩化ナトリウム溶液, Sigma, Part# S5150
20X SSC, Sigma, Part# S6639
Molecular Probes
ストレプトアビジン, Alexa Fluor(登録商標) 532コンジュゲート, Molecular Probes, Part# S-1 1224
Fisher
Tween 20 (ポリオキシエチルフェンソリビタンモノタウレート） 酵素等級, Fisher, Part# BP337-100
1.3 ゲノムDNA (gDNA) サンプル品質
サンプルゲノムDNA (gDNA)は、0.450 mg/mLないし0.300 mg/mLの濃度であるべきである。推奨されるバッファーは 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.0である。OD 260/280 は、1.71および1.79の間であるべきであり、そしてタンパク質濃度は0.9 mg/mg DNAより低いべきである。
【０１９５】
1.4 供給要
ワイヤースライドラック, VWR, Part# 25461-014,または均等物
ミクロ遠心
1. 7 mL マイクロ遠心管およびラック
溶液基礎, 55 mL, 滅菌, VWR, Part# 21007-972, または同等品
マイクロピペット (2 μL, 20 μL, 200μL, 1000μL)
滅菌エアロゾル抵抗性ピペットティップ
広オリフィスティップ, Rainin, Part# HR250W
MicroAmps（登録商標）透明接着性プレートシール, Applied Biosystems, Part# 4306311
15 mL ファルコンチューブ, VWR, Part# 21008-918, または同等品
96-ウェル収集マイクロプレート RB, Qiagen, Part# 19581
0. 2 mL 96-ウェルプレート, Marsh Bio Products, Part# T0296PE
チャンバー除去取りつけ具, Motorola, Part# 100017
パウダーフリー手袋
スライド貯蔵箱
【０１９６】
1.5 ライセンス要
Applied Biosystems or Hoffman-LaRoche and F.Hoffman-LaRoche Ltd.からのＰＣＲ実施のためのライセンス
1.6 設備要
熱サイクラー, Applied Biosystems GeneAmp（登録商標） PCR System 9700, Part# N805-0001
96-ウェルプレート円筒状遠心, Qiagen, Part# 81010
QlAvac 6S, Qiagen, Part# 19503
QlAvacプレートホルダー, Qiagen, Part# 19548
ろ過済みddH2O源, Barnstead または同等品
Hybaid Omnislide Thermal Cycler, Motorola, Part# 600002
Hybaid Omnislide Wash Module, Motorola, Part# 60003
Hybaid Ambient Rack, Motorola, Part# 600074
GenePix（登録商標）4000 Axon Scanner, Motorola, Part# 600000
コンピューター, Motorola, Part# 600001
CodeLink（登録商標）システムソフトウェア:
・ 分析, Motorola, Part# 20004
・ 走査, Motorola, Part# 200003
【０１９７】
1.7 試薬調製
以下の試薬は、アッセイの開始前に調製すべきである。ただし染色溶液はこの限りでない。
標的調製試薬
全ての標的調製に使用される水は、LTIからの超純粋ddH2O (ヌクレアーゼフリー)であるべきである。
2. 5 mM dNTP 溶液
PCR-等級のデオキシヌクレオチドセットを使用して、以下を使用する20mLの溶液を作成:
0.5 mL 100 mM dTTP
0.5 mL 100 mM dATP
0.5 mL 100 mM dGTP
0.5 mL 100 mM dCTP
18 mL の超純粋 ddH2O
5,4 mL アリコートに分割しそしてdNTP ミックスを-20℃で15 mL管中で貯蔵する。
PCR マスターミックス
41 mL (1000 PCR 反応または83 サンプルのために十分) :
20.0 mL 超純粋 ddH20
15.0 mL GeneAmp XL 3.3X バッファー II (使用前に強撹拌する)
2.0 mL Mg (OAc) 2
4.0 mL 2.5 mM dNTP 溶液
5,8 mL アリコートに分割しそして-20℃で貯蔵する( 1 mL過剰があるであろう).
DNアーゼ 1X バッファー
1 mLとするために;
900 μL 超純粋ddH20
100 μL DNアーゼ 10X バッファー
-20℃で貯蔵する。
希釈されたゲノム DNA (gDNA)
60 μLとするために:
58 μL 超純粋 ddH20
2 μL gDNA
【０１９８】
反応後加工試薬
1 L 洗浄溶液を作成するため :
250 mL の 20X SSCを、750 mL のろ過したddH2Oに添加する。
良く混合する.室温で貯蔵し
使用前にHybaid Omnislide Wash Module中で60℃に予備加熱する。
1 L 染色希釈液を作成するため:
918 mL のろ過したddH20と30 mLの5 M NaClと50 mLの1 M Tris-HCl pH 7.6を合わせる。2 mLのTween 20を添加し良く混合する。室温で貯蔵する。
2 mLのストレプトアビジンAlexa希釈液とするため:
100μL の1 M Tris-HCl pH 7.6と、60 μLの 5 M NaClと 1840 pLの超純粋ddH2Oを合わせる。
1 mL ストレプトアビジン Alexa-Fluor 532 コンジュゲートとするため:
1 mL のストレプトアビジンAlexa希釈液を、結晶性ストレプトアビジンAlexa-Fluor 532コンジュゲートを含むバイアルに添加する.反転によって良く混合しそして4℃で貯蔵し、光から保護する。
染色溶液を作成するため:
使用の直前に調製する。
必要とされる染色溶液の体積を、
加工されたスライドの数に基づき（1-10スライドにつき300mL、11-20スライドにつき600mL）決定する。
300 mLの染色溶液のために,300 μLのストレプトアビジンAlexa-Fluor 532コンジュゲートと、
300 mL の染色希釈液を混合する. 600 mLの染色溶液のために、600μL のストレプトアビジン Alexa-Fluor 532コンジュゲート溶液と、600 mL の TNTを混合する。反転により良く混合する。
1 L 脱染色溶液を作成するため:
870 mLのろ過したddH2Oと、30 mLの5 M NaClおよび100 mLの1 M Tris-HCl pH 7.6を合わせる。良く混合し室温で貯蔵する。
【０１９９】
1.8 装置調製
具体的指示のために最初の製造者の使用者マニュアルを参照。
熱サイクラーGeneAmp 9700
以下のPCRプログラムを熱サイクラーに入力する:
a. 94℃で1: 00分
b. 94℃で0 : 30分
c. 68℃で4 : 00分
d. b と cを, 29回全部で30サイクル繰り返す。
e. 72℃で10: 00分
f. 4℃で永久
プログラムはそれが入力された最終工程を完了する後自動的に終わる。
"PCR"としてプログラムをセーブする。
熱サイクラー GeneAmp 9700
以下のプログラムをDNアーゼ標的フラグメント化のため、熱サイクラーに入力する:
a. 37℃で10: 00分
b. 95℃で10: 00分
c. 4℃で永久
プログラムは、それが入力された最終工程を完了する後に自動的に終わる。
プログラムを"フラグメント"としてセーブする。
Hybaid Omnislide熱サイクラー
模擬スライドプログラム型を選択しそして以下のSBE反応プラグラムを熱サイクラーに入力する:
a. 85℃で1 : 00分
b. 85℃で0: 30分
c. 60℃で10: 00分
d. 全部で8サイクルのためにステップｂにさらに7サイクル行く。
プログラムは、入力された最終ステップをそれが完了する後に自動的に終わる。
プログラムを"01"として試みるときにセーブする。
【０２００】
2.0 標的調製
2.1 PCR 反応
それぞれのサンプルのために45 uLのgDNAを近似的に10 ng/μLで必要とする。
それぞれのプライマープレートは、サンプルあたり１２PCR反応で８サンプル収容する。
1. 適当な体積を使用して新しい１．７mLミクロ遠心管中でそれぞれのサンプルについて反応ミックスを調製する。
2. 45 μLの反応ミックスを、それぞれのサンプルのために配置されたプライマープレートにおける１２ウェルレイアウトのそれぞえウェルに等分する（図１２）。
3. 新しいApplied Biosystems接着プレートシールでプレートをシールする。
4. 1000 rpmで１分間遠心分離する。
5. すぐにGeneAmp PCR システム9700中のプレートに置く。セクション１．８で入力したプラグラム''PCR''を稼動させる。
表 1. それぞれのサンプルのためのPCR反応ミックスセットアップ。
【表１】
Figure 2004532026
【０２０１】
2.2 PCR 貯留および精製
QlAquick 8 PCR精製キットを使用し、以下のプロトコルにしたがってプライマーおよびヌクレオチドを、PCR反応物から除去する。
1. PCRプログラム完了の12時間以内に熱サイクラーからプレートを除去する。
2. それぞれのサンプルのPCR反応物（12）を、それぞれのサンプルについて別個の新しい15mLコニカル管を貯留する。(総体積= それぞれの管あたり600μL)。
3.キットに提供される3,000 pLのPBバッファーを、ポールした標的を含む15mLの管のそれぞれに加える。ミックスを良く撹拌する。
4. 収集プレートないQIAvac 6Sバキュームマニフォールド上の新しいQlAquick 8-ウェルストリップを置く。
5. 15mLのコントロール管の全内容物を（あるとき3600mLあるとき9600mL）QlAquick 8-ウェルストリップのウェルの1つに、ハウス圧(150mbar)下でピペッティングする。
6. 他の7サンプルについて反復する。
7. キットに提供される1 mL の PE バッファー をサンプルを含むそれぞれのウェルに添加する。
8. PEバッファー添加を、ウェルあたり2mLの全部について反復する。
9.ハウス圧を切る。
10. 8-ウェル QlAquick トリップおよびスマックを除去しそして多量のペーパータオルをたたき、過剰のPEバッファーを除去する。
１１．写し上の8ウェルQIAquickストリップを置換し、そしてハウス圧を5分間適用し、カラムを乾燥する。カバーを除去する。
１２．新しいＱＩＡｑｕｉｃｋ収集プレートを、プレートホルダー上に置き、そして８ウェルＱＩＡｑｕｉｃｋストリップ下に挿入する。カバーを除去する。
１３．４０μＬのＤＮアーゼ１ｘバッファーをそれぞれのＱＩＡｑｕｉｃｋウェルの中心に添加し、そして室温で1分間インキュベートする。
１４．ハウス圧を1分間つけ、収集プレート中の精製されたＰＣＲ産物を収集する。
注：溶出のために提供されたＥＢバッファーを使用してはならない。
【０２０２】
２．３ ＤＮＡフラグメント化
以下のプロトコルにしたがってＰＣＲ産物を消化する：
１．ＱＩＡｑｕｉｃｋ収集プレートからの精製されたＰＣＲ産物のそれぞれのウェルを、個々のサンプルの完全性および同一性を維持する新しい０．２ｍＬのＭａｒｓｈ９６ウェルプレートに移動する。
２．ＤＮアーゼ１ｘバッファーの新しい１：３００希釈を作成する。
３．１０μＬの希釈されたＤＮアーゼを、精製されたＰＣＲ産物を含むそれぞれのウェルに添加する。
４．すぐに、０．２ｍＬのＰＣＲ９６ウェルプレートを、熱サイクラー上に置き、そしてセクション１．８でプログラムした「フラグメント」プロトコルを稼動する。
注：フラグメント化を停止するためＥＤＴＡを使用してはならない；酵素は熱サイクリング中に熱不活性化する。
サンプルをここに、ＳＢＥ反応のにおける直ちの使用のため用意し、またはＳＢＥ反応のため容易されるまでシールしたプレート注で−２０℃でサンプルを貯蔵する。
【０２０３】
３．０ ＳＢＥ反応
最大１６スライドを、一度にＨｙｂａｉｄ Ｏｍｎｉｓｌｉｄｅ熱サイクラーで稼動することができる。
３．１ ＳＢＥ反応マスターミックスを調製する
１．すべての反応構成要素（酵素を除く）を室温で融解する。これはＰＣＲ産物（もしまえに凍結されているならば）、１０ｘヌクレオチドミックス、ＳＢＥバッファーおよび頂純粋ｄｄＨ２Ｏを含む。
２．試薬を完全に融解するとき、それぞれを完全に強撹拌し、そして反応ミックスを調製する前にマイクロ遠心で１５秒間回転する。
３．ＳＢＥ反応マスターミックスを適当な体積で（酵素を除く）新しい１．７ｍＬマイクロ遠心管に調製する（表２）。体積を稼動するアレイの総数に基づき調節する。（最大２８アレイを、１つの１．７ｍＬ管中で調製できる）
４．酵素を、フリーザーから除去し、そして適当な体積(表２）を添加する。ピペッティングによってウェルを混合する。
５．直ちにすべての試薬を−２０℃にもどす。
６．すべての試薬の添加後、管をおだやかに強撹拌する。１５秒間マイクロ遠心を回転し、サンプルを合わせ、そして任意のバブルまたは泡を除去する。
表２ マスターミックスセットアップＳＢＥ反応
【表２】
Figure 2004532026
【０２０４】
３．２ 個々のＳＢＥ反応物を調製
１．混合および回転後、１３μＬのＳＢＥ反応マスターミックスを、それぞれの清浄で、ラベルされたマイクロ遠心管（図１３）に移動する。
２．２７μＬの精製されたＰＣＲ標的を、それぞれの管に添加する。
３．３ 反応混合物を、フレックスチャンバーに負荷する
フレックスチャンバーの負荷および熱サイクラー上の配置の間の時間は、45分を超えないべきである。スライドは、いずれのときも氷上に配置すべきではない。
１．それぞれのフレックスチャンバーのために、広オリフィスティップ中の４０μＬの反応混合物をアスピレートする（ティップ中にバブルがないのを確保する）。
２．適当なアレイポート上の90度の角度でピペットを配置し、そしてティップがポート上に接着しつつシールを形成するまで、下降圧力を適用する（図１４）。これは該ポートの外部のもれを最小化し、そして導入チャンネルの阻止のリスクを減少する。
３．ピペッターの噴出し特性を使用することなく、ティップからかつアレイチャンバー内にサンプルをゆっくり射出する。アレイ領域を渡り移動する流体を見るであろう。滑らかで、平らな圧力を使用し、充填中の斉一割合を維持する。
４．流体が完全にチャンバーを充填し、かつわずかな過剰が反対のポートに出現した後、圧力を維持しそしてインプットポートからピペットを除去する。
５．フレックスチャンバーを充填し他後、エアーバブルの存在をチェックする。もし任意の大きい（＞１．５ｍｍ）バブルが存在し、または任意のバブルがアレイの中心に出現するならば、該アレイは使用できない。ポート近くの小さいバブルは、成績に影響しないものとする。
【０２０５】
６．この負荷処理を、他のアレイチャンバーとスライドと、新しいティップを使用して、反復する。
注：ミス負荷の事象におけるフレックスチャンバーから流体を引き出すことを試みてはならない。
３．４ フレックスチャンバーをシールする
１．それぞれのスライド上のすべてのフレックスチャンバーが負荷された後、これらはシーリングのための用意ができている。
２．予備カットシーリングティップを選択肢、そして接着面を曝露するためピンセットを使用して裏材を除去する。注意深く取り扱い、該ストリップを、１の末端近くのスライドの端に適用する。ゆっくりと該チップを配置し、その結果それはスライドの１の側上の全４つのポートをカバーする（図１５）。
注：接着は、チャンバーとの最初の接触で、かたくなる。チャンバー上にそれを配置するまえに、シーリングストリップが妥当な方向であることを確保するため、注意を用いる。ミス整列のシーリングストリップを除去することを試みてはならない。かわりに、任意の開いたポートをカバーするために、第２ストリップを配置する。
３．第２ストリップの適用を反復し、すべてのポートがシールされるまで残りの４つのポートおよびそれぞれのスライドをカバーする。
【０２０６】
４．すべてのストリップが適用されたとき、それぞれのポートを、ストリップ上にしっかりと加圧することによって安全にシールする。アレイ自体上に圧力を適用しないよう注意し、というのはこれは体積喪失を生じ得るからである。
３．５ 熱サイクリング
１．５０ｍＬのろ過したｄｄＨ２Ｏを、Ｈｙｂａｉｄ Ｏｍｎｉｓｌｉｄｅ熱サイクラーの熱ブロック周辺のプラスチックチャンバーに加える。
２．それぞれの負荷されそしてシールされたスライド（フレックスチャンバーacing up）を、熱ブロック上に配置する。この工程には、通常使用されるラックを使用しない。スライドを、熱ブロック上直接的に、ブロックあたり８スライドで横たえる（図１６）。
３．熱ブロックの上にカバーを配置し、そしてロックタブをまわすことによってしめる。
４．Ｏｍｎｉｓｌｉｄｅ制御パネル上の「メニュー」ボタンを押す。メニューから「Ｒｕｎ」を選択し、それから「Ｅｎｔｅｒ」を押す。
５．プログラム「０１」（セクション１．８でプログラムした）を入力する。ひとたび「０１」プログラムを選択したら、「Ｅｎｔｅｒ」ボタンを押す。
注：１００の適当なキャリブレーションファクターを、「Ｅｎｔｅｒ」ボタンを押したのちに置換する。
【０２０７】
４．０ 反応後スライド加工
反応後スライド加工工程のために、使用したそれぞれの溶液の体積は、加工されるスライドの数に依存する。１−１０スライドのために、３００ｍＬの指定溶液を使用する。１１−２０スライドのために、６００ｍＬの指定溶液を使用する。
４．１ Ｈｙｂａｉｄ洗浄ステーションを調製する。
注：Ｈｙｂａｉｄ洗浄機のために２つのスリーブおよび１つのラックがスライド加工のために必要となる。
１．スリーブ１を、適当な体積の予め加熱した洗浄溶液で満たす。ステーション中にスリーブを配置し、そして温度を６０℃にセットする。
２．スリーブ２およびラックを、ろ過したｄｄＨ２Ｏ源とともに流しにとり、そして適当体積でスリーブを満たす。
４．２ フレックスチャンバーを除去する
１．プログラム完了の１５分以内に熱サイクラーからスライドを除去する。
注：この工程中にスライドを乾燥させてはならない。もし乾燥に気づいたら、バックグラウンドノイズの増加につながり得るので、発生の記録をする。
２．ここにラックおよびスリーブを配置される、流しにスライドをとる。ろ過したｄｄＨ２Ｏ源をだす（ｄｄＨ２Ｏで満たした５００ｍＬの油差しボトルを、また使用できる）。
【０２０８】
３．パウダーフリー手袋を着用し、スライドをチャンバー除去取りつけ具中に配置する。フレックスチャンバーの除去タブ部分を握り、そしてスライドを安全に保持しつつ、フレックスチャンバータブをゆっくりひきもどし、次いで最初のアレイ領域を曝露させる。
４．直ちに、曝露したアレイ領域を、ろ過したｄｄＨ２Ｏですすぎ、そしてろ過したｄｄＨ２Ｏ流中にチャンバー除去取りつけ具を保持することによって、ＳＢＥ反応溶液をすすぎさる。
５．最初のアレイをリンスしたのち、フレックスチャンバーを引き戻すことを継続し、第２アレイを曝露させ、それから直ちにろ過したｄｄＨ２Ｏでそれをすすぐ。
６．この方法を、４つのアレイが逐次的に曝露され、そしてできるだけ速やかにすすぐまで反復する。これは、アレイ間の交差汚染のリスクを最小にする。
７．フレックスチャンバーを除去した後、スライド全体を、ろ過したｄｄＨ２Ｏですすぎ、次いですぐにそれをＨｙｂａｉｄラック中のスロットに配置し、そして直ちに、ろ過したｄｄＨ２Ｏのスリーブ（スリーブ２）にラックを沈める。
【０２０９】
８．この方法を、それぞれのスライドについて、すべてのスライドが、それらのチャンバーが除去され、そしてラック中に配置されるまで、反復する。
注：第１スライドを、ろ過したｄｄＨ２Ｏに沈め、一方その後のスライドは、それらのチャンバーが除去される。
４．３ スライドの洗浄およびすすぎ
１．ろ過したｄｄＨ２Ｏを有するスリーブ（スリーブ２）からのスライドを含むラックを、洗浄ステーション中に洗浄溶液を含むあらかじめ加熱したスリーブ（スリーブ１）内に配置する。
２．スライドを３０分６０℃でインキュベートする。この時間の間、洗浄スリーブを開け、１０分後ごとにラックを５回上下に移動させることによって洗浄溶液をおだやかに撹拌する。
３．ろ過したｄｄＨ２Ｏの適当な体積で、スリーブ２をすすぎそして満たす。インキュベーションが完了したとき、ラックを洗浄ステーション（スリーブ１）からろ過したｄｄＨ２Ｏ（スリーブ２）まで移転させる。
注意：ラックおよび洗浄ステーションは熱い。注意して取り扱う。
４．両方のスリーブと使用の間の洗浄を使用して、ろ過したｄｄＨ２Ｏ中のスライドのラックを、撹拌でもう２回すすぐ。スリーブ中に、最後のろ過したｄｄＨ２Ｏすすぎ中に、ラックを残す。
スライドを洗浄溶液中でインキュベートしつつ、セクション１．７の希釈支持を使用して、適当な量の染色溶液を調製する。
【０２１０】
４．４ スライドを染色する
注：染色溶液は、加工されるべきスライドのそれぞれのバッチについてあたらしく調製すべきである。
１．利用可能なスリーブ（スリーブ１）を、適当な量の染色溶液で満たす。
２．最後のろ過したｄｄＨ２Ｏ洗浄からのラックを、染色溶液のあるスリーブへ移転させる。
３．スリーブ１（ラックおよび染色溶液を含む）を、洗浄ステーション上の非加熱スロット注に配置する。
４．スライドを、染色溶液中で３０分室温でインキュベートする。この時間の間に、洗浄スリーブを開け、そして１０分ごとにスリーブ内でラックを上下に動かすことによって染色溶液をおだやかに撹拌する。
スライドを染色溶液中インキュベートする一方、適当な量の脱染色溶液を、セクション１．７の希釈指示を使用して調製する。
【０２１１】
４．５ スライドを脱染色する
１．利用可能なスリーブ（スリーブ２）を、適当な量の脱染色溶液で満たす。
２．スライドが、セクション４．４に記載のインキュベーションが完了したとき、スリーブを除去し、そしてそれを流しにとる。
３．ラックを、染色溶液から脱染色溶液へ移転させる。
４．スリーブ（ラックおよび脱染色溶液を含む）を、洗浄ステーション上の非加熱スロット内に配置する。
５．室温で５分間スライドをインキュベートし、そしてもう１回新鮮な脱染色溶液で反復する（スリーブ１）。
４．６ スライドをすすぐ
１．脱染色溶液中での最後のインキュベーション後、スリーブ１を除去し、そしてそれを流しに取る。
２．利用可能なスリーブ（スリーブ２）を、適当な量のろ過したｄｄＨ２Ｏで満たす。脱染色溶液（スリーブ１）からラックを、ろ過したｄｄＨ２Ｏスリーブ（スリーブ２）に移転させる。
３．１Ｌ保証シリンダーを、適当な量のろ過したｄｄＨ２Ｏで満たす。
【０２１２】
４．ラックを保持し、ろ過したｄｄＨ２Ｏでデカントする。直ちに、スリーブを、シリンダーからの水でふたたび満たし、すべてのスライドが完全にカバーされるのを確保する。
５．ろ過したｄｄＨ２Ｏを使用してデカントおよび再び満たす工程をもう３回反復する。最後のろ過したｄｄＨ２Ｏすすぎ中にラックを残す。
４．７ スライドを乾燥する
１．すすいだスライドを、洗浄ラック中のそのスロットから注意深く除去する。洗浄ラックを、ろ過ｄｄＨ２Ｏで満たしたスリーブ中に配置する。
注：スライドは、それらのラベル末端または端のみによって取り扱うべきである。湿ったポリマー基質は、脆弱で容易に損傷する。
２．スライドを空気乾燥する。利用可能ならば、クリーン窒素（非油）の乾燥流が表面上を吹くことができ、乾燥を容易化する。湿ったポリマーの損傷を避けるために、窒素源を、少なくとお６インチスライド表面からはなして保持する。スライドが乾燥したとき、それをワイヤースライドラックに配置する。
３．乾燥処理をそれぞれのスライドについて反復する。
４．すべてのスライドが乾燥したとき、それらを個々に調査する。これらは、塩結晶または水スポットのサインがないべきである。もし塩結晶または水スポットがあるならば、個々のスライドをろ過したｄｄＨ２Ｏですすぎ、そして乾燥する。
５．スライドをスライド貯蔵箱に貯蔵する。
６．スライドを、Ｇｅｎｅｐｉｘ４０００Ａｘｏｎスキャナーで走査する。波長を５３２ｎｍに、そしてＰＭＴを４３０にScaning User ManualのためのCodeLink System Softwareに従いセットする。
【０２１３】
実施例３：多重塩基付加のプローブ
誤りの陽性を生じる幹−環形成プローブによる標的に依存しない自己伸長を、議論する。シグナルの強度は、幹−環構造の安定性におおむね比例的である。約５００プローブの調査は、約１５％が自己伸長シグナルを示すことを指摘した。自己伸長するプローブ配列のいくつかの例は、図１８に示す。ほとんどの場合、取りこまれた塩基は、幹−環構造のすぐに下流のテンプレート配列によって予測されるものである；この結果は、ＤＮＡポリメラーゼは、幹−環構造によって形成される二重らせんを伸長することを強く示唆する。一般に、３またはより多い塩基対の幹が、自己伸長に要求される。
【０２１４】
本発明は、１または２以上の塩基を、自己伸長するプローブの３’末端に付加する単純な戦略を記載する（図１７参照）。ここに使用したプローブは、追加的塩基がプローブ内で自己相補的ではないが、標的に相補的である点で新規である。そのような追加的塩基（複数含む）を付加するとき、それは幹−環構造にそってミスマッチを創出し、それゆえＤＮＡポリメラーゼは、自己アニールプローブを伸長せず、そしてゆえに、誤りの陽性検出は、起こらず、ＳＮＰ塩基の正確な検出を生じる。
【０２１５】
標的依存性検出は、プローブに付加された追加的塩基（複数含む）によって影響を受けず、というのは追加的塩基は標的に相補的であるからである。実際上、３またはより多い塩基を追加するのは実行可能ではない。ＳＮＰ塩基は、プローブの３’末端のずっと上流であり、そしてミスマッチは内部バルグ（Bulge)を創出するであろう。もし内部バルグの下流の短い二重らせんがポリメラーゼによって伸長するならば、ミスマッチは検出されない。
【０２１６】
すべての実験は、実施例１および２で記載のDNAマイクロアレイで実施した。プローブは、スライド上の支持体材料の５’末端に付着されたポリヌクレオチド（一般に１０−４０ｎｔ長）である。ＳＢＥ反応は、バッファー、ハプテン標識したアシクロ(acyclo)ターミネーターヌクレオチドおよびＤＮＡポリメラーゼからなる。標的（目的のＳＮＰを含むＰＣＲ増幅したゲノムＤＮＡ）を、反応物に添加しまたはしなかった。
【０２１７】
図１９は、あるプローブについてのＳＢＥアッセイ結果が、標的の不存在下で強い自己伸長を示すことを示す。単一塩基をプローブの３’末端に付加するとき、標的に依存しないシグナルが、顕著に減少する。標的依存性シグナルは変化せず、これは標的の存在または不存在下でプローブが妥当に機能することを指摘した。２または３以上の塩基の付加は、新しい幹-環構造を創出した；これらのプローブは、予測されたような強い標的に依存しないシグナルを示した。図２０は、P450遺伝子についてレスキューされたプローブのセットの全体成績を示す。不正確な応答を生じた３５プローブセットのうち、プローブに１または２塩基付加することによって修復された２６（６６％）セットが、そのときの１００％正確に応答した。
【０２１８】
実施例４：修飾されたヌクレオチドを有するプローブ
単一塩基伸長（ＳＢＥ）アッセイおよび自己伸長プローブ問題を説明した（図２）。ここにわれわれは、プローブに取りこませるとき、それが折り畳み、および/または安定な二次的構造を形成することから阻害する、修飾された塩基のセットを提示する（図２１および２４）。該修飾された塩基は、それ自体と安定的塩基対を形成しないが、個々の塩基は天然ＤＮＡ／ＲＮＡ塩基とよくハイブリダイズし、非常に安定な非天然塩基対を形成する。そのような塩基対（図２２、２３、２５および２６）は熱力学的に、自己折り畳み構造を脱安定化するが、プローブ−標的二重らせんの安定性に最小の影響を有する。こうして、これらは選択的に、自己折り畳み分子の形成および／または伸長を阻害する。
【０２１９】
例塩基対を図２２に示す。そのような分子は先行技術で使用され、選択的に結合するオリゴ対を生成する（米国出願５９１２３４０およびＰＣＴＷＯ９７／１２８９６；Kytyabin IV, Rhinehart RL, Lukhatanov EA, Gorn VV, Meyer RB Kr., Gamper HB Jr. Biochemistry 1996)27:35(34):11170-6; Woo J, MeyerRB Jr., Gamper HB., Nucleic Acids Res.(1966)1:24(13)2470-5;3;Compagno, D, Lampe JN, Bourget C, Kutyabin IV, Yurchenko L, Lukhtanov EA, Gorn VV, Gamper HB Jr., Touleme JJ., J Biol Chem(1999)19:274(12)8191-8）。
【０２２０】
自己折り畳み構造はまた塩基対中の１または２塩基のみを使用して脱安定化し、これは自己折り畳み分子並びにプローブ−標的二重らせんの安定性を減少させ得る。その場合に、自己折り畳み構造の融解温度は、プローブ−標的二重らせんのそれより実質的に低化することができる。そのような効果を有し得るある例の塩基対／塩基は、限定しないがａ）２−アミノ−Ａ：２−チオ−Ｔ、ｂ）２−アミニプリン：２−チオ−Ｔ、ｃ）６−チオ−Ｇ、ｄ）２−チオ−Ｃ、ｅ）疎水性塩基、例えば４−メチルインドール、ジフルオロトルエン等（Moran, S, Ren RX, Sheils CJ, Rumney S 4th , Kool ET, Niucleic Acids Res(1966)1:24(11):2044-52）、４−チオ−Ｔ（図２２）を含むことができる。
【０２２１】
プライマーダイマー発生へのある解決はまた、自己折り畳み発生へ適用できる。例えば、天然塩基のアナログを有するオリゴヌクレオチドのセットであって、環外アミン位置の修飾を有するものは（図２３）、また自己塩基対形成から阻害される（米国特許６００１６１１、ＰＣＴＷＯ００／０６７７９）。塩基のこの種をまた図２１に記載と同じ様式で使用できる。
【０２２２】
自己折り畳み構造からのシグナルを抑圧するもう１つのやり方は、プローブ−標的二重らせんのみを伸長させることによる。これはＤＮＡポリメラーゼによって複製されないプローブ分子中のある種の修飾を使用することによって達成できる（図２４）。そのやり方、天然のみ、標的鎖をテンプレートとして使用し、こうしてポリメラーゼによって伸長させる。文献で知られるそのような修飾の２，３の既知の例がある（前記および米国特許６００１６１１；Stump MD, Cherry JL, Weiss RB., Nucleic Acids Res.(1999)1:27(23),4642-8参照）。また、そのような修飾は以前、プライマー−ダイマー発生のためにのみ、そしてここで提唱の適用の種類ではなく使用された。例えばＤＮＡテンプレート中に存在するとき、疎水性塩基、４−メチルインドールは、その部位のＤＮＡ重合化を終結させる。この塩基は、「ターミネーター」と呼ばれた。２’−Ｏ−メチルＲＮＡヌクレオシドの取りこみはまた、該残基部位のＤＮＡ重合化を阻害することが示された。これらの型の「ターミネーター」塩基およびヌクレオシドをまた使用し、自己折り畳み分子の伸長を防止し、こうしてプローブ−標的二重らせんからのシグナルを選択的に増強することができる（図２５）。
【０２２３】
実験を、我々の標準的ＳＢＥアッセイを使用して前記ＤＮＡマイクロアレイで実施し、これらの仮説を試験した。修飾なしまたは前議論修飾塩基のいずれかを含むプローブを、オペロンから取得し、そしてアミノ−ＮＨＳエステル化学を使用してゲルスラブに付着させた（Ｇｅｎ３化学）。使用したプローブの配列は、それぞれのグラフのトップに示される（図２７−２９）。すべてのデータは、Ｔｉチャンバー、標準的SBE CYCLEパラメター、４TAMRAヌクレオチド、トリス−ＨＣｌｐＨ８．５プラス１０ｍＭ ＫＣｌ（バッファー）、ＤＭＳＯなし中で稼動されるスライドからである。存在するとき、標的は、６０μＬ体積のアレイあたり１０ｎｇで使用した。データは、「標的なし」アッセイのため８アレイ、および「標的あり」アッセイのため７アレイから合計した。
【０２２４】
結果を、以下のグラフに示し（図２７−２９）、そしてそのような修飾が、標的不存在に対し標的存在下で、何倍もシグナルを増加させ、該仮説が意図されたように実行されたことを提供する。こうして、標的の存在下の自己伸長プローブからのシグナルが、標的不存在下よりもたった３倍より高い（Ｒ＝３．１８）。しかし、工程−環中のＡ：Ｔ塩基対がその修飾されたアナログ塩基対Ｘ：Ｚで置換されたとき、この比率は、ほとんど１０倍に増加する（図２７）。これは明確に、該修飾された塩基対が意図された効果を有することを示す。伸長部位（３’末端）付近ヘの修飾された塩基対の配置は、なおより劇的な影響を有することができる。同様に、幹−環にすぐに隣接するアデノシンがその「ターミネーター型」アナログ４−メチルインドールで置換されたとき、該シグナルは、３倍からほとんど５倍に増加する（図２７）。
【０２２５】
図２８において、標的存在下の自己伸長プローブでのシグナルは、標的の不存在下よりもたった３倍より高いのみである（Ｒ＝２．４２）。しかし、工程−環中の１またはＡ：Ｔ塩基対の一方または両方のいずれかが、これらの修飾されたアナログ塩基対Ｘ：Ｚで置換されたとき、この比率は、ほとんど５倍に増加する。これは明確に、該修飾された塩基対が意図された効果を有することを示す。図２９は、３つの異なるプローブ配列での類似の結果を示す。
【０２２６】
実施例５：ヘアピン構造のための伸長酵素結合を阻害する修飾された幹を有するプローブ
標的ＤＮＡの不存在下、ヘアピン環構造またはパリンドロム的配列のためのヌクレオチドの非特異的取りこみは、単一塩基伸長アッセイにおいてあやまりの陽性結果にしばしばつながることができる。ここに、捕捉プローブの「幹」領域に結合する、酵素の親和性を変化させることによって、標的ＤＮＡの不存在下での非特異的ヌクレオチド取りこみは、減少または排除できる（図３０および３１）。修飾は限定しないが、捕捉プローブの「幹」領域上の、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、キラルホスホジエステルアナログおよびメチルホスフェートを含む。核酸中のホスフェートは、核酸―タンパク質相互作用において決定的な役割を演ずる。正に荷電したアミノ酸と負に荷電したホスフェート骨格の間の静電的相互作用、およびホスフェート酸素とタンパク質の間の水素結合の形成は、結合親和性および酵素の特異性に貢献する（図３２Ｂ（ａ））。「幹」領域のフォスフェートまたは糖環を修飾することによって、我々は酵素の結合親和性を減少させ、非特異的ヌクレオチド取りこみの確率を減少させることができる。修飾は塩基で実施するから、捕捉プローブと標的の間の熱力学的二重らせん安定性は、変化しない（図３０と３１）。
【０２２７】
いくつかの修飾を提唱するがこれらに限定しない。フォスフォロチオエート（硫黄置換）およびホスホロアミデート（窒素置換）は、荷電分布、疎水性、および酵素についての、ホスフェートバックボーンへの効率的水素結合を形成する能力を変化させることができる。メチルフォスフォネートおよびメチルフォスフェートは、フォスフェート荷電を全く排除し、これは該酵素がＤＮＡに結合するのを阻害することができる（図３２Ａと３２Ｂ（ｂないしｄ））。
糖環上の他の修飾をまた、導入することができ、例えば２’−Ｏ−メチルＲＮＡおよびＬＮＡである。
【０２２８】
実施例６：自己伸長を防止する阻害オリゴヌクレオチドの使用
発明は、プローブオリゴヌクレオチド上の平滑末端を創出し、そしてプローブの酵素的自己伸長によって生成される誤りのシグナルの生成を防止する相補的短いオリゴヌクレオチドの使用をなす。目的のシグナルは、標的の存在下でのみ創出され、そして全ての他のときシグナルは、オフモードのままである（図３３参照）。短い相補的ＡＰＯ Ｅ３２１．Ｔ．Ａ．ＳＮＰプローブへの短い相補的ＡＰＯ Ｅ３２１．Ｔ．Ａ．オリゴは、ＡＰＯ Ｅ３２１．Ｔ．Ａ ＳＮＰプローブ自己伸長を阻害できる。ＡＰＯ Ｅ３２１．Ｔ．Ａ．プローブ（５’ＴＡＣＡＣＴＧＣＣＡＧＧＣＡ３’）は、すべての条件下で強い自己伸長誤りのシグナルを生産する強い自己伸長体である。これらの研究のため使用したアッセイは、ＳＢＥ反応のための標的としてゲノム幅一本鎖ＲＮＡを使用することによる修飾されたＳＢＥアッセイであった。
【０２２９】
実施例７：自己伸長を防止するための、技法の組み合わせおよび修飾された逆転写酵素の使用
発明は、多重ＰＣＲなく、ＲＣＡ（または他のシグナル増幅技法）なく、およびプライマー伸長からの問題なく、ゲノム幅ＳＮＰ遺伝子型決定を可能とする、新規方法（３つの異なる技法を含む）に基づく。該方法は、ランダムプライマーでＰＥＰ（プライマー伸長予備増幅）反応（米国特許６１８３９５８；Zhang et al., Proc. Natl. Acad. Sci.89:5847-51(1992); Casas and Kirkpatrick, Biotechniques, 20: 219-25(1996)で既知)を実施し１反応でゲノムＤＮＡを増幅し、次いでインビトロ転写（ＩＶＴ）反応（もしプライマーの１つがポリメラーゼプロモーター配列を有したならば）を増幅する事に関係する。産物、ｃＲＮＡは、ハイブリダイズし、そして該プローブは逆転写酵素（ＲＴ）を使用して伸長される。これは、我々は、ＰＥＰを介してゲノムの複雑性を減少させ、そしてＩＶＴで標的を増幅するであろう意味で、個々のＳＮＰ遺伝子座のＰＣＲと同じ目的を供するであろう。こうして、ＳＮＰ遺伝子座のすべてについて１標的調製（prep)が実施される（我々が発現アッセイでするように）。最終的に、修飾されたＲＴ（ここで、該ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性が排除された）の使用は、自己伸長体がＲＴによって信用されないであろうことを意味し、というのはこれらはＤＮＡ依存性伸長であり、そしてＲＮＡ標的に結合されたプローブのみが存在するからであり、そしてＲＮＡ標的に結合されたプローブのみが伸長するであろうことを意味し、というのはこれらはＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性に依存するからである（図３４参照）。
【０２３０】
この開示はマルチプレックス化ＰＣＲまたは何千ものＰＣＲ反応を必要としないＳＮＰ遺伝子型決定のための新規方法論を提示する。さらに自己伸長問題は顕在せず、というのはこれらの自己伸長体は、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性のみを有するＲＴによって伸長されないであろうからである。
【０２３１】
該アプローチの技術的可能性は、３つの別個の断片において実証された。プライマー伸長予備増幅（ＰＥＰ）の可能性は、多くの分子生物学実験室で実証された。ＩＶＴの可能性は、実証された。ＲＮＡ標的ヘのハイブリダイゼーション後の、アレイ上のＲＴ伸長オリゴプローブの可能性は、実証された(Pastinen, T., et al., (2000)Genome Research, 10:1031-42)。
【０２３２】
この方法は、ユニプレックス化標的調製およびプライマー伸長のためのすべての３つの技法が、他のプライマー伸長技法が服する自己伸長問題によって複雑化しないべく組み合わせられる点で、他の方法から区別される。
【０２３３】
該アプローチの新規性は、我々が修飾されたＲＴを使用してＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性のみを指向するという事実、および我々が、ユニプレックス化標的調製の新しい方法のためにＰＥＰおよびＩＶＴを組み合わせること、およびこれをプライマー伸長のためのオリゴヌクレオチドアレイ上で適用するという事実に基づく。
【０２３４】
戦略的利益は、ＰＣＲのコスト減少、ユニプレックス化標的調製の競合的有利、識別、および自己伸長の排除のためのよりよいデータ信頼性である。
【０２３５】
方法論
工程１
ヒトゲノムＤＮＡおよび、３’末端の８縮重ヌクレオチドおよび５’末端のＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ配列を有するように設計された、プライマーＲＲＮＯＴ７を使用するプライマー伸長。それは配列
【表３】
Figure 2004532026
を有した。このプライマーでのプライマー伸長は、５’末端上にＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ配列を有するヒトＤＮＡのフラグメントを生じるべきである。該アッセイを２μｇのヒトゲノムＤＮＡ、および５単位のAmplitag DNAポリメラーゼ、および１００ｎｇのＲＲＮＯＴ７プライマーで、PCR Amplification Buffer I(Perkin Elmer)を、最終体積の６０μＬで使用して実施した。該反応を、９２℃１分、３７℃２分、５５℃まで１０秒／℃のゆっくりの勾配で４分を、５０サイクルで稼動させた。
【０２３６】
工程２
これらの標準的条件を使用するインビトロ転写：全部で３２５μｇのｃＲＮＡを、２μｇの標準的ヒトゲノムＤＮＡから取得した。ｃＲＮＡをＵＶ吸光を使用して定量し、そしてアガロースゲル上で視覚化した。
【０２３７】
工程３
以下のオリゴヌクレオチドを、１８μＭに希釈し、そして手動でブランクのSurmodicsスライド上にスポットした。第１は非自己伸長体であり、一方第２は自己伸長体であり、というのは、それはそれ自体環にもどるからである。
【表４】
Figure 2004532026
【０２３８】
スライドをブロックし、そして標準的Surmodicsプロトコルにしたがって加工した。追加的に、細菌性オリゴヌクレオチドＹＪＥＫをまたブランクのSurmodicスライド上にスポットおよび加工し、ネガティブコントロールとして供した。
【０２３９】
工程４
２５μｇのｃＲＮＡを、湿潤チャンバーで終夜（１８時間）、３７℃で、５０％ホルムアミド、２ｘＳＳＰＥ中で、オリゴヌクレオチドスポットあたりハイブリダイズさせた。スライドを洗浄および乾燥した。
【０２４０】
工程５
それぞれのハイブリダイズしたプローブを、ｒＴｔｈ ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（Perkin Elmer)を使用して、Ｍｎ２＋とｃｙ５−ｄＵＴＰの存在下、５０℃で２０μＬの最終体積で、５分間、インサイチュで伸長させた。スライドを洗浄、乾燥および６００ＰＭＴでＣｙ５チャンネル（６３５ｎｍ）を使用してAxonスキャナーで走査した。
【０２４１】
結果
ｒＴｔｈ、すなわちＭｎ２＋イオンの存在下ＲＮＡテンプレートがオフでＤＮＡを伸長させるのみである修飾された逆転写酵素の存在下でこのアッセイを実施したのち、自己伸長は、通常は自己伸長する、ＳＮＰオリゴヌクレオチドがオフで観察されなかった（図３５および３６参照）。
【０２４２】
【表５】
Figure 2004532026
【表６】
Figure 2004532026

Claims (48)

  1. （ａ）ＣＰＹ１Ａ１をコードする核酸のセンス鎖の部分に実質的に相同な、少なくとも１つの捕捉プローブ、
    （ｂ）ＣＰＹ１Ａ２をコードする核酸のセンス鎖の第１部分に実質的に相同な、少なくとも１つの捕捉プローブ、
    （ｃ）ＣＰＹ１Ｂ１をコードする核酸のセンス鎖の第１部分に実質的に相同な、少なくとも１つの捕捉プローブ、
    （ｄ）ＣＰＹ１２Ｃ１９をコードする核酸のセンス鎖の第１部分に実質的に相同な、少なくとも１つの捕捉プローブ、
    （ｅ）ＣＰＹ２Ｄ６をコードする核酸のセンス鎖の第１部分に実質的に相同な、少なくとも１つの捕捉プローブ、
    （ｆ）ＣＰＹ２Ｅ１をコードする核酸のセンス鎖の第１部分に実質的に相同な、少なくとも１つの捕捉プローブ、および
    （ｇ）ＣＰＹ３Ａ４をコードする核酸のセンス鎖の第１部分に実質的に相同な、少なくとも１つの捕捉プローブ、
    を含むアレイを含む固体基質を含むバイオチップ。
  2. ＣＰＹ２Ｄ６をコードする当該核酸の当該センス鎖の当該第１部分が、目的の単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）部分に隣接する、請求項１のバイオチップ。
  3. ＣＰＹ２Ｄ６をコードする当該核酸の当該センス鎖の当該第１部分が目的の単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）部分を末端に含む、請求項１のバイオチップ。
  4. 当該アレイがさらに、ＣＹＰ１Ａ１；ＣＹＰ１Ａ２；ＣＹＰ１Ｂ１；ＣＹＰ２Ｃ１９；ＣＹＰ２Ｄ６；ＣＹＰ２Ｅ１およびＣＹＰ３Ａ４からなる群より選択されるタンパク質をコードする核酸のアンチセンス鎖の一部に実質的に相同である少なくとも１つの捕捉プローブを含む、請求項１のバイオチップ。
  5. 当該アレイがさらに、ＣＹＰ偽遺伝子の一部に実質的に相同な少なくとも１つの捕捉プローブを含む、請求項１のバイオチップ。
  6. 当該固体支持体が、ガラス、プラスチック、セラミック、およびＰＣボードからなる群より選択される、請求項１のバイオチップ。
  7. 当該アレイが電極のアレイを含む、請求項１のバイオチップ。
  8. 当該アレイが、ポリマーゲルパッドのアレイを含む、請求項１のバイオチップ。
  9. ＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ１Ｂ１、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｅ１およびＣＹＰ３Ａ４からなる群より選択される少なくとも１の標的配列中の検出位置の、ヌクレオチドの同定を決定する方法であって、当該方法が、
    （ａ）以下のものを含むアレイを提供すること、
    （ｉ）ＣＰＹ１Ａ１をコードする核酸の第１部分に実質的に相同な、少なくとも１つの第１捕捉プローブ、ここで当該第１捕捉プローブがその末端で、検出位置に直接的に隣接するかまたはそれを含む、
    （ｉｉ）ＣＰＹ１Ａ２をコードする核酸のセンス鎖の第１部分に実質的に相同な、少なくとも１つの第２捕捉プローブ、ここで当該第２捕捉プローブはその末端で、検出位置に直接的に隣接するかそれを含む、
    （ｉｉｉ）ＣＰＹ１Ｂ１をコードする核酸のセンス鎖の第１部分に実質的に相同な少なくとも１つの第３捕捉プローブ、ここで当該第３捕捉プローブは、その末端で、検出位置に直接的に隣接するか、それを含む、
    （ｉｖ）ＣＰＹ２Ｃ１９をコードする核酸のセンス鎖の第１部分に実質的に相同な少なくとも１つの第４捕捉プローブ、ここで当該第４捕捉プローブは、その末端で、検出位置に直接的に隣接するか、それを含む、
    （ｖ）ＣＰＹ２Ｄ６をコードする核酸のセンス鎖の第１部分に実質的に相同な少なくとも１つの第５捕捉プローブ、ここで当該第５捕捉プローブは、その末端で、検出位置に直接的に隣接するか、それを含む、
    （ｖｉ）ＣＰＹ２Ｅ１をコードする核酸のセンス鎖の第１部分に実質的に相同な少なくとも１つの第６捕捉プローブ、ここで当該第６捕捉プローブは、その末端で、検出位置に直接的に隣接するか、それを含む、
    （ｖｉｉ）ＣＰＹ３Ａ４をコードする核酸のセンス鎖の第１部分に実質的に相同な少なくとも１つの第７捕捉プローブ、ここで当該第７捕捉プローブは、その末端で、検出位置に直接的に隣接するか、それを含む、
    （ｂ）少なくとも１つの標的配列を、その対応する捕捉プローブにハイブリダイズさせ、ハイブリダイゼーション複合体を形成させること、
    （ｃ）ポリメラーゼおよび、標識を含む少なくとも１つのｄＮＴＰを、もし当該ｄＮＴＰが、検出位置に完全に相補的であるあらば、当該ｄＮＴＰが捕捉プローブに付加し伸長されたプローブを形成するような条件下で添加すること、
    （ｄ）当該伸長されたプローブの質問位置の、ヌクレオチドを決定すること、
    を含む方法。
  10. 標的配列中の検出位置のヌクレオチドの同定を決定する方法であって、
    （ａ）以下のものを含むアレイを提供すること、
    （ｉ）捕捉プローブのアレイを含むハイドロゲル層を含む第１表面を有する固体支持体、
    （ｂ）当該標的配列を、当該捕捉プローブの少なくとも１つにハイブリダイズさせ、ハイブリダイゼーション複合体を形成させること、および
    （ｃ）当該検出位置のヌクレオチドを決定すること、
    を含む方法。
  11. 標的配列中の検出位置のヌクレオチドの同定を決定する方法であって、
    （ａ）少なくとも１つの非自己伸長プローブを含む第１表面を有する固体支持体を提供すること、ここで当該非自己伸長プローブの自己伸長は、当該標的の不存在下で起こらず、かつ、ここで当該非自己伸長プローブは、質問ヌクレオチドを含む、
    （ｂ）当該標的配列を、当該非自己伸長プローブにハイブリダイズさせ、ハイブリダイゼーション複合体を形成させること、
    （ｃ）当該表面を以下のものと、
    （ｉ）伸長酵素、および
    （ｉｉ）ハプテンを含む、少なくとも１つの鎖終結化ヌクレオチド、
    もし当該鎖終結化ヌクレオチドが、該ハイブリダイゼーション複合体中の当該非自己伸長プローブの３’末端にすぐに隣接する標的配列の塩基に完全に相補的であるならば、当該鎖終結化ヌクレオチドが当該非自己伸長プローブに添加され、修飾された伸長プローブを形成するような条件下で接触させること、
    （ｄ）当該修飾された伸長プローブを、当該ハプテンの結合パートナーと接触させること、ここで当該ハプテンは標識されている、および
    （ｅ）当該標識の存在を検出し、当該検出位置のヌクレオチドを決定すること、
    を含む方法。
  12. 当該非自己伸長プローブ中の当該質問ヌクレオチドが、その３’末端の２塩基以内であり、かつここで、当該非自己伸長プローブの自己ハイブリダイズ化構造が形成されるとき、当該３’末端ヌクレオチドが対応する塩基に非相補的である、請求項１１の方法。
  13. 当該質問ヌクレオチドが３’末端ヌクレオチドである、請求項１２の方法。
  14. 当該質問ヌクレオチドが、終わりから２番目の３’末端ヌクレオチドである、請求項１２の方法。
  15. 当該非自己伸長プローブが、少なくとも２つの修飾されたヌクレオチドを含む、請求項１１の方法。
  16. 当該修飾されたヌクレオチドが、環外アミン修飾された塩基である、請求項１５の方法。
  17. 当該修飾されたヌクレオチドがターミネーター塩基である、請求項１５の方法。
  18. 当該環外アミン修飾された塩基が、２−チオチミン、２−アミノアデニン、アミノ修飾されたシトシンおよびアミン修飾されたグアニンからなる群より選択される、請求項１６の方法。
  19. 当該ターミネーター塩基が、４−メチルインドールである、請求項１７の方法。
  20. 当該修飾されたヌクレオチドが、タンパク質結合を変え、そして当該非自己伸長プローブの幹領域中に存在する、請求項１５の方法。
  21. 当該修飾されたヌクレオチドが糖修飾を含む、請求項２０の方法。
  22. 当該修飾されたヌクレオチドが、フォスフェート修飾を含む、請求項２０の方法。
  23. 当該フォスフェート修飾が、フォスフォロチオエート、フォスフォルアミデート、メチルフォスフォネート、メチルフォスフェート、Ｈ−フォスフォネートからなる群より選択される、請求項２２の方法。
  24. 当該非自己伸長プローブの自己伸長が、短い相補的オリゴヌクレオチドによって阻害される、請求項１１の方法。
  25. 標的配列中の検出位置のヌクレオチドの同定を決定する方法であって
    （ａ）ランダムプライマーを使用して該標的ＤＮＡを増幅し、ＤＮＡアンプリコンを生成すること、
    （ｂ）当該ＤＮＡアンプリコンを転写し、ＲＮＡ標的配列を生成すること（インビトロ転写）、
    （ｃ）少なくとも１つの伸長プローブを含む第１表面を有する固体支持体を提供すること、ここで当該伸長プローブは、質問ヌクレオチドを含む、
    （ｂ）当該ＲＮＡ標的配列を、当該伸長プローブにハイブリダイズさせ、ハイブリダイゼーション複合体を形成させること、
    （ｃ）当該表面を、
    （ｉ）修飾された逆転写酵素、および
    （ｉｉ）ハプテンを含む、少なくとも１つの鎖終結化ヌクレオチド
    と、もし当該鎖終結化ヌクレオチドが、該ハイブリダイゼーション複合体中の当該非自己伸長プローブの３’末端にすぐに隣接する標的配列の塩基に完全に相補的であるならば、当該鎖終結化ヌクレオチドが、当該非自己伸長プローブに付加され、修飾された伸長プローブを形成させること、
    （ｄ）当該修飾された伸長プローブを、当該ハプテンの結合パートナーと接触させること、ここで当該結合パートナーは標識される、および
    （ｅ）当該標識の存在を検出し、当該検出位置のヌクレオチドを決定すること、
    を含む方法。
  26. 当該修飾された逆転写酵素のみが、ＲＮＡに結合された伸長プローブを伸長させる、請求項２５の方法。
  27. 当該ハプテンがビオチンである、請求項１１または２５の方法。
  28. 当該結合パートナーがストレプトアビジンである、請求項１１または２５の方法。
  29. 当該結合パートナーがAlexa色素標識されたストレプトアビジンである、請求項１１または２５の方法。
  30. 標的配列中の検出位置のヌクレオチドの同定を決定する方法であって、
    （ａ）少なくとも１つの非自己伸長プローブを含むハイドロゲル層を含む第１表面を有する固体支持体を含む第１表面を有する固体支持体を提供すること、ここで当該非自己伸長プローブの自己伸長が、当該標的の不存在下では起こらず、かつ、ここで当該非自己伸長プローブが質問ヌクレオチドを含む、
    （ｂ）当該標的配列を、当該非自己伸長プローブにハイブリダイズさせ、ハイブリダイゼーション複合体を形成させること、
    （ｃ）当該表面を、
    （ｉ）伸長酵素、および
    （ｉｉ）ハプテンを含む少なくとも１つの鎖終結化ヌクレオチド
    と、当該鎖終結化ヌクレオチドが、該ハイブリダイゼーション複合体中の当該非自己伸長プローブの３’末端にすぐに隣接する標的配列の塩基に完全に相補的であるならば、当該鎖終結化ヌクレオチドが、当該非自己伸長プローブに付加され、修飾された伸長プローブを形成させること、
    （ｄ）当該修飾された伸長プローブを、当該ハプテンの結合パートナーと接触させること、ここで当該結合パートナーは標識される、および
    （ｅ）当該標識の存在を検出し、当該検出位置のヌクレオチドを決定すること、
    を含む方法。
  31. 当該非自己伸長プローブ中の当該質問ヌクレオチドが、その３’末端の２塩基以内にあり、かつここで、当該非自己伸長プローブの自己ハイブリダイズ化構造が形成されるとき、当該３’末端ヌクレチドが、対応する塩基に非相補的である、請求項３０の方法。
  32. 当該質問ヌクレオチドが３’末端ヌクレオチドである、請求項３１の方法。
  33. 当該質問ヌクレオチドが、終わりから２番目の３’末端ヌクレオチドである、請求項３１の方法。
  34. 当該非自己伸長プローブが少なくとも２つの修飾されたヌクレオチドを含む、請求項３０の方法。
  35. 当該修飾されたヌクレオチドが環外アミン修飾された塩基である、請求項３４の方法。
  36. 当該修飾されたヌクレオチドがターミネーター塩基である、請求項３４の方法。
  37. 当該環外アミン修飾された塩基が、２−チオチミン、２−アミノアデニン、アミン修飾されたシトシンおよびアミン修飾されたグアニンからなる群より選択される、請求項３５の方法。
  38. 当該ターミネーター塩基が、４−メチルインドールである、請求項３６の方法。
  39. 当該修飾されたヌクレオチドが、タンパク質結合を変え、かつ、当該非自己伸長プローブが幹領域中に存在する、請求項３４の方法。
  40. 当該修飾されたヌクレオチドが糖修飾を含む、請求項３９の方法。
  41. 当該修飾されたヌクレオチドが、フォスフェート修飾を含む、請求項３９の方法。
  42. 当該フォスフェート修飾が、フォスフォルチオエート、フォスフォルアミデート、メチルフォスフォネート、メチルフォスフェート、Ｈ−フォスフォネートからなる群より選択される請求項４１の方法。
  43. 当該非自己伸長プローブの自己伸長が、短い相補的オリゴヌクレオチドによって阻害される、請求項３０の方法。
  44. 標的配列中の検出位置のヌクレオチドの同定を決定する方法であって、
    （ａ）ランダムプライマーを使用して該標的ＤＮＡを増幅し、ＤＮＡアンプリコンを生成すること、
    （ｂ）当該ＤＮＡアンプリコンを転写し、ＲＮＡ標的配列を生成すること（インビトロ転写）、
    （ｃ）少なくとも１つの伸長プローブを含む第１表面を有する固体支持体を提供すること、ここで当該伸長プローブが質問ヌクレオチドを含む、
    （ｂ）当該ＲＮＡ標的配列を、当該伸長プローブにハイブリダイズさせ、ハイブリダイゼーション複合体を形成すること、
    （ｃ）当該表面を、
    （ｉ）修飾された逆転写酵素、および
    （ｉｉ）ハプテンを含む、少なくとも１つの鎖終結化ヌクレオチド
    と、もし当該鎖終結化ヌクレオチドが、該ハイブリダイゼーション複合体中の当該非自己伸長プローブの３’末端にすぐに隣接する標的配列の塩基に完全に相補的であるならば、当該鎖終結化ヌクレオチドが、当該非自己伸長プローブに付加され、修飾された伸長プローブを形成するような条件下で接触させること、
    （ｄ）当該修飾された伸長プローブを、当該ハプテンの結合パートナーと接触させること、ここで当該結合パートナーは、標識される、および
    （ｅ）当該標識の存在を検出し、当該検出位置のヌクレオチドを決定すること、
    を含む方法。
  45. 当該修飾された逆転写酵素のみが、ＲＮＡに結合された伸長プローブを伸張させる、請求項４４の方法。
  46. 当該ハプテンがビオチンである、請求項３０または４４の方法。
  47. 当該結合パートナーがストレプトアビジンである、請求項３０または４４の方法。
  48. 当該結合パートナーがAlexa色素標識されたストレプトアビジンである、請求項３０または４４の方法。
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