HU223669B1 - Módosított primerek - Google Patents
Módosított primerek Download PDFInfo
- Publication number
- HU223669B1 HU223669B1 HU9800581A HUP9800581A HU223669B1 HU 223669 B1 HU223669 B1 HU 223669B1 HU 9800581 A HU9800581 A HU 9800581A HU P9800581 A HUP9800581 A HU P9800581A HU 223669 B1 HU223669 B1 HU 223669B1
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- primers
- modified
- amplification
- primer
- reaction
- Prior art date
Links
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 210
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 208
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims abstract description 50
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 95
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 61
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 59
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 49
- -1 phenoxy, substituted phenyl Chemical group 0.000 claims description 45
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 41
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 41
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 claims description 32
- 125000001797 benzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])* 0.000 claims description 24
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 20
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 claims description 17
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims description 14
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 claims description 14
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N Purine Natural products N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 9
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 claims description 8
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims description 8
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 claims description 6
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 claims description 6
- 125000004435 hydrogen atom Chemical class [H]* 0.000 claims description 6
- 125000001624 naphthyl group Chemical group 0.000 claims description 6
- 125000000956 methoxy group Chemical group [H]C([H])([H])O* 0.000 claims description 4
- 125000000449 nitro group Chemical group [O-][N+](*)=O 0.000 claims description 4
- 125000003545 alkoxy group Chemical group 0.000 claims description 3
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 claims description 3
- IGFXRKMLLMBKSA-UHFFFAOYSA-N purine Chemical compound N1=C[N]C2=NC=NC2=C1 IGFXRKMLLMBKSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims 1
- 239000013615 primer Substances 0.000 abstract description 303
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 abstract description 9
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Chemical class Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 8
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 abstract description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 85
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 75
- 239000000047 product Substances 0.000 description 69
- 239000002585 base Substances 0.000 description 64
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 56
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 53
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 48
- 239000005289 controlled pore glass Substances 0.000 description 46
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 39
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 34
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 33
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 30
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 28
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 23
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 20
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 18
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 17
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 16
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 16
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 16
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 15
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 15
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 15
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 15
- 125000006502 nitrobenzyl group Chemical group 0.000 description 15
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 14
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 14
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N Argon Chemical compound [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 12
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 11
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 11
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- VHYFNPMBLIVWCW-UHFFFAOYSA-N 4-Dimethylaminopyridine Chemical compound CN(C)C1=CC=NC=C1 VHYFNPMBLIVWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 10
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 10
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 10
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 10
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 10
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 10
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 10
- WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N Acetic anhydride Chemical compound CC(=O)OC(C)=O WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 9
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 description 8
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 8
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 8
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 8
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 description 8
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 description 8
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 7
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 7
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 7
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 7
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 7
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 7
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 7
- AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N Deoxyuridine 5'-triphosphate Chemical compound O1[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 6
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 description 6
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 description 6
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 6
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 6
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 description 6
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 6
- 238000011160 research Methods 0.000 description 6
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 6
- OISVCGZHLKNMSJ-UHFFFAOYSA-N 2,6-dimethylpyridine Chemical compound CC1=CC=CC(C)=N1 OISVCGZHLKNMSJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229960000549 4-dimethylaminophenol Drugs 0.000 description 5
- 102100036337 Dematin Human genes 0.000 description 5
- 101000929217 Homo sapiens Dematin Proteins 0.000 description 5
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 5
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 5
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 5
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 5
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 5
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 5
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 5
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 5
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 5
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 5
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 5
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M sodium hydroxide Inorganic materials [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- FALRKNHUBBKYCC-UHFFFAOYSA-N 2-(chloromethyl)pyridine-3-carbonitrile Chemical compound ClCC1=NC=CC=C1C#N FALRKNHUBBKYCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- HRGUSFBJBOKSML-UHFFFAOYSA-N 3',5'-di-O-methyltricetin Chemical compound COC1=C(O)C(OC)=CC(C=2OC3=CC(O)=CC(O)=C3C(=O)C=2)=C1 HRGUSFBJBOKSML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 4
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- IDDMFNIRSJVBHE-UHFFFAOYSA-N Piscigenin Natural products COC1=C(O)C(OC)=CC(C=2C(C3=C(O)C=C(O)C=C3OC=2)=O)=C1 IDDMFNIRSJVBHE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 150000003838 adenosines Chemical class 0.000 description 4
- WGQKYBSKWIADBV-UHFFFAOYSA-N benzylamine Chemical compound NCC1=CC=CC=C1 WGQKYBSKWIADBV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 4
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 4
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 4
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 4
- KCFYHBSOLOXZIF-UHFFFAOYSA-N dihydrochrysin Natural products COC1=C(O)C(OC)=CC(C2OC3=CC(O)=CC(O)=C3C(=O)C2)=C1 KCFYHBSOLOXZIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 4
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 4
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 4
- 239000012044 organic layer Substances 0.000 description 4
- 229940014800 succinic anhydride Drugs 0.000 description 4
- 230000035322 succinylation Effects 0.000 description 4
- 238000010613 succinylation reaction Methods 0.000 description 4
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 4
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 4
- BMCJATLPEJCACU-UHFFFAOYSA-N tricin Natural products COc1cc(OC)c(O)c(c1)C2=CC(=O)c3c(O)cc(O)cc3O2 BMCJATLPEJCACU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 4
- JBWYRBLDOOOJEU-UHFFFAOYSA-N 1-[chloro-(4-methoxyphenyl)-phenylmethyl]-4-methoxybenzene Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C(Cl)(C=1C=CC(OC)=CC=1)C1=CC=CC=C1 JBWYRBLDOOOJEU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N Guanosine Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 3
- JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA) Chemical compound CCN(C(C)C)C(C)C JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KEAYESYHFKHZAL-UHFFFAOYSA-N Sodium Chemical compound [Na] KEAYESYHFKHZAL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 3
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 3
- 239000012267 brine Substances 0.000 description 3
- 125000000484 butyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 3
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 3
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 3
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 3
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 3
- SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M potassium acetate Chemical compound [K+].CC([O-])=O SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000012312 sodium hydride Substances 0.000 description 3
- 229910000104 sodium hydride Inorganic materials 0.000 description 3
- HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M sodium;chloride;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Cl-] HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Natural products C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 3
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 3
- 238000009281 ultraviolet germicidal irradiation Methods 0.000 description 3
- RJJQAQFECPHEIJ-FILYFMJVSA-N (2R,3S,5R)-5-(6-amino-6-benzyl-8H-purin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-ol Chemical compound N1=CN=C2N([C@@H]3O[C@H](CO)[C@@H](O)C3)CN=C2C1(N)CC1=CC=CC=C1 RJJQAQFECPHEIJ-FILYFMJVSA-N 0.000 description 2
- HNSDLXPSAYFUHK-UHFFFAOYSA-N 1,4-bis(2-ethylhexyl) sulfosuccinate Chemical compound CCCCC(CC)COC(=O)CC(S(O)(=O)=O)C(=O)OCC(CC)CCCC HNSDLXPSAYFUHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JIGQDVLEFZZETB-UHFFFAOYSA-N 1-(2-nitrophenyl)-2-phenylethane-1,2-dione Chemical compound [O-][N+](=O)C1=CC=CC=C1C(=O)C(=O)C1=CC=CC=C1 JIGQDVLEFZZETB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HXBMIQJOSHZCFX-UHFFFAOYSA-N 1-(bromomethyl)-2-nitrobenzene Chemical compound [O-][N+](=O)C1=CC=CC=C1CBr HXBMIQJOSHZCFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MCTWTZJPVLRJOU-UHFFFAOYSA-N 1-methyl-1H-imidazole Chemical compound CN1C=CN=C1 MCTWTZJPVLRJOU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NOIRDLRUNWIUMX-UHFFFAOYSA-N 2-amino-3,7-dihydropurin-6-one;6-amino-1h-pyrimidin-2-one Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1.O=C1NC(N)=NC2=C1NC=N2 NOIRDLRUNWIUMX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FZWGECJQACGGTI-UHFFFAOYSA-N 2-amino-7-methyl-1,7-dihydro-6H-purin-6-one Chemical compound NC1=NC(O)=C2N(C)C=NC2=N1 FZWGECJQACGGTI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FSASIHFSFGAIJM-UHFFFAOYSA-N 3-methyladenine Chemical compound CN1C=NC(N)=C2N=CN=C12 FSASIHFSFGAIJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000002103 4,4'-dimethoxytriphenylmethyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C(*)(C1=C([H])C([H])=C(OC([H])([H])[H])C([H])=C1[H])C1=C([H])C([H])=C(OC([H])([H])[H])C([H])=C1[H] 0.000 description 2
- RYVNIFSIEDRLSJ-UHFFFAOYSA-N 5-(hydroxymethyl)cytosine Chemical compound NC=1NC(=O)N=CC=1CO RYVNIFSIEDRLSJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003109 Disodium ethylene diamine tetraacetate Substances 0.000 description 2
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 2
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 2
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 2
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 2
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N aldehydo-D-ribose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 2
- 239000002168 alkylating agent Substances 0.000 description 2
- 229940100198 alkylating agent Drugs 0.000 description 2
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 2
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012300 argon atmosphere Substances 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N boric acid Chemical compound OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004327 boric acid Substances 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 2
- UHDGCWIWMRVCDJ-ZAKLUEHWSA-N cytidine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-ZAKLUEHWSA-N 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- JXTHNDFMNIQAHM-UHFFFAOYSA-N dichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)Cl JXTHNDFMNIQAHM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000019301 disodium ethylene diamine tetraacetate Nutrition 0.000 description 2
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 2
- 239000011888 foil Substances 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 150000002431 hydrogen Chemical class 0.000 description 2
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 2
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- TWXDDNPPQUTEOV-FVGYRXGTSA-N methamphetamine hydrochloride Chemical compound Cl.CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 TWXDDNPPQUTEOV-FVGYRXGTSA-N 0.000 description 2
- 229940087646 methanolamine Drugs 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- PSHKMPUSSFXUIA-UHFFFAOYSA-N n,n-dimethylpyridin-2-amine Chemical compound CN(C)C1=CC=CC=N1 PSHKMPUSSFXUIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LPICNYATEWGYHI-WIHCDAFUSA-N n-[9-[(2r,4s,5r)-5-[[bis(4-methoxyphenyl)-phenylmethoxy]methyl]-4-hydroxyoxolan-2-yl]purin-6-yl]benzamide Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C(C=1C=CC(OC)=CC=1)(C=1C=CC=CC=1)OC[C@@H]1[C@@H](O)C[C@H](N2C3=NC=NC(NC(=O)C=4C=CC=CC=4)=C3N=C2)O1 LPICNYATEWGYHI-WIHCDAFUSA-N 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 2
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 2
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000005464 sample preparation method Methods 0.000 description 2
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 2
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 2
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 2
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 2
- 125000000999 tert-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WZJWHIMNXWKNTO-VWZUFWLJSA-N (2r,3s,5r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-ol;hydrate Chemical compound O.C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](CO)O1 WZJWHIMNXWKNTO-VWZUFWLJSA-N 0.000 description 1
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- QZNQSIHCDAGZIA-UHFFFAOYSA-N 1-(bromomethyl)-4-tert-butylbenzene Chemical compound CC(C)(C)C1=CC=C(CBr)C=C1 QZNQSIHCDAGZIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UHDGCWIWMRVCDJ-UHFFFAOYSA-N 1-beta-D-Xylofuranosyl-NH-Cytosine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XHBSBNYEHDQRCP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-3-methyl-3,7-dihydro-6H-purin-6-one Chemical compound O=C1NC(=N)N(C)C2=C1N=CN2 XHBSBNYEHDQRCP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 2-deoxy-D-ribose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)CC=O ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 0.000 description 1
- XWKFPIODWVPXLX-UHFFFAOYSA-N 2-methyl-5-methylpyridine Natural products CC1=CC=C(C)N=C1 XWKFPIODWVPXLX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QWTBDIBOOIAZEF-UHFFFAOYSA-N 3-[chloro-[di(propan-2-yl)amino]phosphanyl]oxypropanenitrile Chemical compound CC(C)N(C(C)C)P(Cl)OCCC#N QWTBDIBOOIAZEF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LRSASMSXMSNRBT-UHFFFAOYSA-N 5-methylcytosine Chemical compound CC1=CNC(=O)N=C1N LRSASMSXMSNRBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M Bicarbonate Chemical compound OC([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M Bromide Chemical compound [Br-] CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- XWQUFPWZAHCRIS-ISSFYUFGSA-N C(C1=CC=CC=C1)(=O)C1(C2=NCN([C@H]3C[C@H](O)[C@@H](COC(C4=CC=C(C=C4)OC)(C4=CC=C(C=C4)OC)C4=CC=CC=C4)O3)C2=NC=N1)NCC1=CC=C(C=C1)C(C)(C)C Chemical compound C(C1=CC=CC=C1)(=O)C1(C2=NCN([C@H]3C[C@H](O)[C@@H](COC(C4=CC=C(C=C4)OC)(C4=CC=C(C=C4)OC)C4=CC=CC=C4)O3)C2=NC=N1)NCC1=CC=C(C=C1)C(C)(C)C XWQUFPWZAHCRIS-ISSFYUFGSA-N 0.000 description 1
- UJVLHJWTZINUPP-AGLYMACPSA-N CC(=O)C1(C=CN(C(=O)N1)[C@H]2C[C@@H]([C@H](O2)CO)O)NCC3=CC=CC=C3 Chemical compound CC(=O)C1(C=CN(C(=O)N1)[C@H]2C[C@@H]([C@H](O2)CO)O)NCC3=CC=CC=C3 UJVLHJWTZINUPP-AGLYMACPSA-N 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N Crotonoside Natural products C1=NC2=C(N)NC(=O)N=C2N1[C@H]1O[C@@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N 0.000 description 1
- UHDGCWIWMRVCDJ-PSQAKQOGSA-N Cytidine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-PSQAKQOGSA-N 0.000 description 1
- NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N D-guanosine Natural products C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1C1OC(CO)C(O)C1O NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019687 Lamb Nutrition 0.000 description 1
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 1
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 102000008021 Nucleoside-Triphosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108010075285 Nucleoside-Triphosphatase Proteins 0.000 description 1
- IPSGRRPWHSSCPX-DKPWXRHPSA-N P(O)(N)OC[C@@H]1[C@H](C[C@@H](O1)N1CN=C2C(N)(N=CN=C12)CC1=CC=CC=C1)O Chemical compound P(O)(N)OC[C@@H]1[C@H](C[C@@H](O1)N1CN=C2C(N)(N=CN=C12)CC1=CC=CC=C1)O IPSGRRPWHSSCPX-DKPWXRHPSA-N 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- YSQLKSNQFQQIHO-VWIRTGDQSA-N [(2r,3s,5r)-5-[6-(benzylamino)purin-9-yl]-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxyphosphonamidous acid Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](COP(O)N)O[C@H]1N1C2=NC=NC(NCC=3C=CC=CC=3)=C2N=C1 YSQLKSNQFQQIHO-VWIRTGDQSA-N 0.000 description 1
- LTKCXZGFJFAPLY-OERIEOFYSA-N [1-[(2r,4s,5r)-4-hydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-2-oxopyrimidin-4-yl]azanium;chloride Chemical compound Cl.O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 LTKCXZGFJFAPLY-OERIEOFYSA-N 0.000 description 1
- SWPYNTWPIAZGLT-UHFFFAOYSA-N [amino(ethoxy)phosphanyl]oxyethane Chemical compound CCOP(N)OCC SWPYNTWPIAZGLT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 125000003282 alkyl amino group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001350 alkyl halides Chemical class 0.000 description 1
- 230000029936 alkylation Effects 0.000 description 1
- 238000005804 alkylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N benzene Substances C1=CC=CC=C1 UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AGEZXYOZHKGVCM-UHFFFAOYSA-N benzyl bromide Chemical compound BrCC1=CC=CC=C1 AGEZXYOZHKGVCM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000023732 binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 238000006664 bond formation reaction Methods 0.000 description 1
- 125000006487 butyl benzyl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 235000008504 concentrate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 239000013581 critical reagent Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 229960005215 dichloroacetic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- UXGNZZKBCMGWAZ-UHFFFAOYSA-N dimethylformamide dmf Chemical compound CN(C)C=O.CN(C)C=O UXGNZZKBCMGWAZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HPYNZHMRTTWQTB-UHFFFAOYSA-N dimethylpyridine Natural products CC1=CC=CN=C1C HPYNZHMRTTWQTB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 230000007515 enzymatic degradation Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 229940029575 guanosine Drugs 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 239000013067 intermediate product Substances 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 125000000959 isobutyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000001449 isopropyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000007834 ligase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 1
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 231100000219 mutagenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 1
- PEECTLLHENGOKU-UHFFFAOYSA-N n,n-dimethylpyridin-4-amine Chemical compound CN(C)C1=CC=NC=C1.CN(C)C1=CC=NC=C1 PEECTLLHENGOKU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 125000004433 nitrogen atom Chemical group N* 0.000 description 1
- 238000002414 normal-phase solid-phase extraction Methods 0.000 description 1
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 1
- 239000004533 oil dispersion Substances 0.000 description 1
- 238000002515 oligonucleotide synthesis Methods 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 1
- 125000006503 p-nitrobenzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(=C([H])C([H])=C1[N+]([O-])=O)C([H])([H])* 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 229940083251 peripheral vasodilators purine derivative Drugs 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- XEBWQGVWTUSTLN-UHFFFAOYSA-M phenylmercury acetate Chemical compound CC(=O)O[Hg]C1=CC=CC=C1 XEBWQGVWTUSTLN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 150000004713 phosphodiesters Chemical class 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 150000003141 primary amines Chemical class 0.000 description 1
- 125000001436 propyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 1
- 150000003212 purines Chemical class 0.000 description 1
- 125000000561 purinyl group Chemical group N1=C(N=C2N=CNC2=C1)* 0.000 description 1
- 229940083082 pyrimidine derivative acting on arteriolar smooth muscle Drugs 0.000 description 1
- 150000003230 pyrimidines Chemical class 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 230000000630 rising effect Effects 0.000 description 1
- 150000003335 secondary amines Chemical class 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L succinate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)CCC([O-])=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- WHRNULOCNSKMGB-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran thf Chemical compound C1CCOC1.C1CCOC1 WHRNULOCNSKMGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 201000008827 tuberculosis Diseases 0.000 description 1
- 238000000870 ultraviolet spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Paints Or Removers (AREA)
- Dental Preparations (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Abstract
A találmány nukleinsavszekvencia amplifikálásánál felhasználhatómódosított oligonukleotidokra vonatkozik. A találmány szerintimódosított oligonukleotidok felhasználásával végzett amplifikációsorán kevesebb nem specifikus amplifikációs termék – különösen primerdimer – keletkezik, és egyidejűleg a kívánt amplifikációs termékhozama a módosítatlan oligonukleotidprimerek felhasználásával végzettamplifikációkhoz viszonyítva megnő. ŕ
Description
Találmányunk a molekuláris biológia és nukleinsavkémia tárgykörébe tartozik. Találmányunk közelebbről nukleinsavamplifikációs reakciók kitermelésének javítására szolgáló módszerekre és reagensekre vonatkozik. Ennek megfelelően találmányunk minden olyan területen felhasználható, ahol nukleinsavamplifikáció felhasználásra kerül.
A polimeráz láncreakció (PCR) felfedezése nukleinsavszekvenciák in vitro amplifikációját tette lehetővé. A PCR az alábbi irodalmi helyeken került ismertetésre: [4,683,195; 4,683,202 és 4,965,188 számú USA-szabadalom; Saiki et al., Science 230: 1350-1354 (1985); Mullis et al., Cold Springs Harbor Symp. Quant. Bioi. 57; 263-273 (1986) és Mullis and Faloona, Methods Enzymol. 755; 335-350 (1987)]. A PCR kifejlesztését és alkalmazását az irodalomban széleskörűen tárgyalják. így például PCR-rel kapcsolatos témákat részletesen az alábbi irodalmi helyeken ismertetnek: [PCR Technology - principles and applications fór DNA amplification, (1989), (ed. H. A. Erlich) Stockton Press, New York; PCR Protocols: A guide to methods and applications, (1990), (ed. M. A. Innis et al.) Academic Press, San Diego; és PCR Strategies, 1995, (ed. M. A. Innis et al.) Academic Press, San Diego, CA.]. Kereskedelmi cégek [pl. Perkin-Elmer (Norwalk, CT)] PCR-reagenseket forgalmaznak és PCR-jegyzőkönyveket nyomtatnak ki.
A nukleinsavamplifikációra vonatkozó eredeti közlemények megjelenése óta különböző primeralapú nukleinsavamplifikációs módszereket ismertettek. Ezek közül, példálódzó jelleggel a teljesség igénye nélkül, az alábbiakat soroljuk fel: [Ligásé Chain Reaction (LCR, Wu and Wallace, Genomics 4: 560-569 (1989) és Bárány, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 189-193 (1991); Polymerase Ligásé Chain Reaction (Bárány, PCR Methods and Applic 7; 5-16 (1991); Gap-LCR WO 90/01069 PCT-bejelentés; Repair Chain Reaction 439,182 A2 számú európai közrebocsátási irat; 3SR (Kwoh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1173-1177 (1989); Guatelli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 1874-1878 (1990); WO 92/0880A számú PCT-bejelentés) és NASBA 5,130,238 számú USA-szabadalom.] Az amplifikációs rendszerek átfogó ismertetése az alábbi irodalmi helyen található: Abramson and Myers, 1993, Current Opinion in Biotechnology 4: 41-47.
A primeralapú amplifikációs reakciók specifikussága a primerhibridizáció specifikusságától függ. A tipikus amplifikációknál használt magasabb hőmérsékleteken a primer csak a kívánt target (cél)-szekvenciához hibridizálódik. Az amplifikációs reakcióelegyeket azonban általában szobahőmérsékleten - azaz a primerhibridizációs specifikusság biztosításához szükségesnél lényegesen alacsonyabb hőmérsékleten - készítik el. Kevésbé szigorú körülmények között a primer nem specifikusan más, csupán részlegesen komplementer nukleinsavszekvenciákhoz vagy más primerekhez kötődhet, és nemkívánatos kiterjesztett termékek szintézisét indíthatja be, amelyek a targetszekvenciával együtt amplifikálódhatnak. A nem specifikus primer kiterjesztett termékek amplifikációja a kívánt célszekvencia amplifikációjával versenyezhet, és a kívánt szekvencia amplifikációjának hatékonyságát jelentősen csökkentheti.
A nem specifikus amplifikációs termékek egyik gyakran megfigyelt típusa az amplifikációs reakciók templáttól független képződménye, amelyet „primer dimer”nek neveznek. A primer dimer kétszálú fragmens, amelynek a hossza általában a két primer hosszúsága összegéhez közelálló érték, és általában akkor keletkezik, amikor az egyik primer a másik primeren keresztül kiterjed. A kialakuló kapcsolat nemkívánatos templátot képez, amely - rövid hossza következtében - hatékonyan amplifikálódik.
A nem specifikus amplifikáció oly módon szorítható vissza, hogy a primer kiteijesztett termékek képződését a reakció megkezdése előtt csökkentik. Az egyik módszer - az úgynevezett „forró indításos” (hot-start) módszer - szerint a reakcióelegyhez egy vagy több döntő jelentőségű reagenst csak akkor adnak hozzá, amikor a hőmérséklet a szükséges hibridizációs specifikusság által megkövetelt értéket már elérte. Ezáltal a reakcióelegy a primerkiterjesztést nem segítheti elő abban az időszakban, amikor a reakciókörülmények a specifikus primerhibridizációnak még nem felelnek meg.
A kézi „forró-indításos” módszerek során a reakciócsöveket a kezdeti magas hőmérsékleten végzett inkubációs lépés után kinyitják, és a hiányzó reagenseket hozzáadják. Az eljárás hátránya, hogy munkaigényes, és a reakcióelegy fertőzésének kockázata magas. Alternatív módon a reakciókomponensek elválasztására vagy elkülönítésére hőérzékeny anyagokat (például viaszt) használnak, lásd például 5,411,876 számú USA-szabadalom és Chou et al., 20 (7): 1717-1723 (1992). Ezeknél a módszereknél a magas hőmérsékleten végzett reakció előtti inkubálás hatására a hőre érzékeny anyag megolvad, és a reagensek elegyedését lehetővé teszi.
A primer kiterjesztett termékeknek a reakció megkezdése előtt történő képződésének csökkentésére szolgáló további módszer szerint a DNS-polimeráz hőre reverzibilis gátlását DNS-polimeráz-specifikus antitestekkel végzik el (5 338 671 számú USA szabadalmi leírás). Az antitesteket a reakcióelegy elkészítése előtt valamely pufferben szobahőmérsékleten a DNS-polimerázzal inkubálják, és ily módon antitest-DNS-polimeráz komplexet képeznek. A DNS-polimerázaktivitás antitest által történő gátlását a magas hőmérsékleten végzett reakció előtti inkubációval inaktiválják, A módszer hátránya, hogy a DNS-polimerázzal szemben specifikus antitestek termelése költséges és időigényes, különösen nagyobb mennyiségek esetében. További hátrány, hogy az antitesteknek a reakcióelegyhez történő hozzáadása az amplifikációs reakció újratervezését teszi szükségessé.
A kiterjesztett termékeknek a reakció megkezdődése előtt történő képződése továbbá oly módon gátolható, hogy a reakcióelegyhez egyszálú kötődő fehérjét adnak, amely a primerekhez hőre reverzibilis módon kovalensen kötődik, és a primerkiterjesztést a hibridizáció megakadályozásával gátolja.
HU 223 669 Β1
A nem specifikus amplifikáció továbbá oly módon csökkenthető, hogy a reakció megkezdődése előtt képződött kiterjesztett termékeket az 5 418 149 számú USA-szabadalomban leírt módszerekkel enzimatikusan lebontják. Az újonnan szintetizált kiterjesztett termékek lebontását oly módon végzik el, hogy a reakcióelegyhez dUTP-t és UNG-t adnak, és a reakcióelegyet az amplifikációs reakció elvégzése előtt 45-60 °C-on inkubálják. A primerkiterjesztés uraciltartalmú DNS képződését eredményezi, amelyet az amplifikáció előtti körülmények között az UNG lebont. A fenti módszer hátránya, hogy a kiterjesztett termék lebontása a kiterjesztett termék képződésével versenyez, és a nem specifikus primer kiterjesztett termék kiküszöbölése nem válik teljessé. A módszer előnye, hogy a reakcióelegyhez az előző reakcióból származó szennyezésként hozzáadott uraciltartalmú DNS szintén lebomlik, és ezáltal a PCR-nek a korábbi reakciókból származó amplifikált nukleinsavval történő szennyezésének problémája csökken.
A molekuláris biológia és nukleinsavkémiai hagyományos módszerei a szakember kötelező tudásához tartoznak és az irodalomból jól ismertek. így például az alábbi irodalmi helyekre hivatkozunk: [Sambrook et al., Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York; Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, ed., (1984); Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames és S. J. Higgins. eds., (1984) és egy sorozat, Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.)]
Találmányunk tárgya nukleinsavszekvenciák in vitro amplifikációjánál felhasználható kovalensen módosított oligonukleotidprimerek. A találmányunk szerinti módosított primerek felhasználásával a nem specifikus amplifikáció - különösen a primer dimer képződése - csökken és/vagy a kívánt target kitermelése ezzel egyidejűleg a módosítatlan primerrel végzett amplifikációhoz viszonyítva emelkedik.
Találmányunk tárgya nukleinsavszekvencia amplifikációjánál felhasználható, az (I) vagy (II) általános képletnek megfelelő szerkezetű oligonukleotidprimer (mely képletben
S, jelentése kb. 5 és kb. 50 közötti nukleotidhosszúságú első nukleotidszekvencia;
S2 jelentése 1 és 3 közötti nukleotidhosszúságú második nukleotidszekvencia;
N jelentése valamely exociklikus amint tartalmazó purin- vagy pirimidinbázist magában foglaló nukleotid;
R jelentése valamely módosítócsoport;
mimellett R az exociklikus aminon keresztül kovalens módon kapcsolódik N-hez; és R szerkezete a (III) általános képletnek felel meg, ahol
Rj és R2 jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom, 1-10 szénatomos alkilcsoport, alkoxicsoport, fenilcsoport, fenoxicsoport, helyettesített fenilcsoport, naftilcsoport vagy helyettesített naftilcsoport. Az alkilcsoportok egyenes vagy elágazó láncúak lehetnek.)
Találmányunk előnyös kiviteli alakja szerint N jelentése valamely módosított szokásos nukleotid, amikor is N valamely módosított adenozin, citidin vagy guanozin és a módosítómolekula az adenin-, guaninvagy citozinbázis exociklikus aminjához kovalensen kapcsolódik. A találmány még előnyösebb kiviteli alakja szerint N jelentése valamely módosított adenozin.
A találmány előnyös kiviteli alakja szerint R jelentése 2-naftil-metil-, benzil- vagy helyettesített benzilcsoport. A helyettesített benzilcsoportok a (IV) általános képletnek felelnek meg (ahol R3 jelentése 1-6 szénatomos elágazó- vagy egyenes láncú alkilcsoport, előnyösen 1-4 szénatomos elágazó láncú vagy egyenes láncú alkilcsoport, metoxicsoport vagy nitrocsoport), R3 előnyösen a p-helyzetben kapcsolódik.
R jelentése különösen előnyösen benzil-, p-metil-benzil-, p-tercier butil-benzil-, p-metoxi-benzilvagy 2-naftil-metil-csoport.
Találmányunk tárgya továbbá valamely módosítócsoport fotolabilis kovalens kapcsolódása által módosított amplifikációs primerek; a módosítás a primerkiterjesztés részleges vagy teljes gátlását eredményezi. A fotolabilis módosítócsoport az exociklikus aminhoz (a fentiekben leírt módosított nukleotidok esetében) vagy a gyűrű nitrogénatomjához kapcsolódhat. A találmány egyik kiviteli alakja szerint a 3’-terminális nukleotid valamely adenin-, guanin- vagy citozinbázisa exociklikus aminjához legalább egy nitro-benzil-csoport kapcsolódik.
Találmányunk tárgya továbbá primerpár vagy -készlet, amelynél legalább az egyik primer a fentiekben leírt módon módosítva van. A találmány előnyös kiviteli alakja szerint a primerpár mindkét tagja vagy a primerkészlet valamennyi tagja módosítva van.
Találmányunk tárgya továbbá eljárás nukleinsavamplifikációra oly módon, hogy az amplifikációs reakciót a találmány szerinti módosított primerek felhasználásával végezzük el.
Találmányunk tárgya továbbá eljárás valamely targetnukleinsav amplifikálására oly módon, hogy az amplifikációs reakciót a találmány szerinti fotolabilis módosított primerek felhasználásával végezzük el. Az eljárás során a reakcióelegyet a módosítócsoport eltávolításához és a primer kiterjesztett termékek képződéséhez elegendő fénnyel besugározzuk. Az eljárás egyik kiviteli alakja szerint a besugárzást külön lépésben az amplifikációs reakció megkezdése előtt, azonban a reakcióelegy kb. 50 °C-nál magasabb hőmérsékletre történő felmelegítése után végezzük el. Az eljárás másik kiviteli alakja szerint a besugárzási lépést az amplifikációs eljárás előzetes lépéseivel kombináljuk (például az RNS-amplifikációs reakció fordított transzkripciós lépésénél) vagy a kezdeti denaturálásos lépésnél valamely DNS-amplifikációs reakcióban.
Találmányunk tárgya továbbá nukleinsavszekvenciák in vitro amplifikálásánál felhasználható kit, amely olyan primerpárt tartalmaz, amelynek a tagjai közül legalább az egyik primer a jelen szabadalmi leírásban ismertetett módon módosítva van. A találmány szerinti kit továbbá egy vagy több amplifikációs reagenst (pél3
HU 223 669 Bl dául nukleinsavpolimeráz vagy -ligáz, nukleozidtrifoszfatáz és megfelelő pufferek) tartalmazhat.
A rajzok rövid ismertetése
Az 1. ábrán benzilezett primerek felhasználásával végzett, az 5. példában leírt HIV-l-RNS-amplifikációk eredményeit tüntetjük fel.
Az 2. ábrán benzilezett primerek felhasználásával végzett, az 6. példában leírt HIV-l-RNS-amplifikációk eredményeit tüntetjük fel.
A 3. ábrán három módosítócsoport egyikével módosított primer felhasználásával végzett, a 7. példában leírt HCV-RNS-amplifikációk eredményeit tüntetjük fel.
A 4. ábrán fotolabilis módosított primerek felhasználásával végzett, a 8. példában leírt HCV-RNS-amplifikációk eredményeit tüntetjük fel.
Az 5. ábrán benzilcsoporttal módosított primerek és p-tercier butil-benzil-csoporttal módosított primerek felhasználásával végzett, a 10. példában leírt mikobakteriális DNS-amplifikációk eredményeit tüntetjük fel.
A 6. ábrán benzil- vagy helyettesített benzil-módosított dA szabályozott pórusú üveg (CPG)-szintézisének általános reakciósémáját tüntetjük fel.
A találmány jobb megértésének biztosítása céljából az egyes kifejezések értelmezését az alábbiakban közöljük.
A „nukleinsav” és „oligonukleotid” kifejezés polideoxiribonukleotidokra (2-deoxi-D-ribózt tartalmaznak), poliribonukleotidokra (D-ribózt tartalmaznak) és bármely olyan polinukleotidtípusra vonatkozik, amely valamely purin- vagy pirimidinbázis, vagy módosított purin- vagy pirimidinbázis Nglikozidja. A „nukleinsav” és oligonukleotid” kifejezések a hosszúság tekintetében nem tartalmaznak megkülönböztetést, és e kifejezéseket egymással felcserélhetően alkalmazzuk. Ezek a kifejezések csupán a molekula primer szerkezetére utalnak. így a fenti kifejezések kettős- és egyszálú DNS-eket, valamint kettős- és egyszálú RNS-eket egyaránt magukban foglalnak.
A nukleinsavbázisok, nukleozidok vagy nukleotidok kapcsán használt „szokásos” kifejezés arra utal, hogy ezek a polinukleotidban a természetben fordulnak elő. A DNS négy szokásos (más szóval: fő) deoxiribonukleotidja adenint és guanint (purinbázisok) és citozint és timint (pirimidinbázisok) tartalmaz. Az RNS négy szokásos ribonukleotidja adenint és guanint (purinbázisok) és citozint és uracilt (pirimidinbázisok) tartalmaz. Bizonyos nukleinsavakban a fenti szokásos vagy hagyományos bázisokon kívül kis mennyiségben számos más purin- vagy pirimidinszármazék (úgynevezett ritka vagy mellékes bázisok) is előfordulnak. A „nem szokásos” kifejezésen nukleinsavbázisokkal, nukleozidokkal vagy nukleotidokkal kapcsolatban ritka vagy mellékes nukleinsavbázisok, nukleozidok vagy nukleotidok, valamint szokásos bázisok, nukleozidok vagy nukleotidok módosításai, származékai vagy analógjai, továbbá módosított bázisrészeket és/vagy módosított cukorrészeket tartalmazó szintetikus nukleotidok értendők [Protocols fór Oligonucleotide Conjugates, Methods in Molecular Biology, Vol 26, (Sudhir Agrawal, Ed., Humana Press, Totowa, NJ, (1994); és Oligonucleotides and Analogues,
A Practical Approach (Fritz Eckstein, Ed., IRL Press, Oxford University Press, Oxford].
Az oligonukleotidok bármely megfelelő módszerrel előállíthatok. Ezek közül például az alábbiakat említjük meg: megfelelő szekvenciák klónozása és restrikciója és közvetlen kémiai szintézisek, például a foszfortriészteres módszer [Narang et al., Meth. Enzymol. 68: 90-99 (1979)], foszfodiészteres módszer [Brown et al., Meth. Enzymol. 68: 109-151 (1979)], dietil-foszforamidites módszer [Beaucage et al., Tetrahedron Lett. 22: 1859-1862 (1981)] és a szilárd hordozós módszer (4 458 066 számú USA szabadalmi leírás). A szintézismódszerek összefoglalása az alábbi irodalmi helyen található: [Goodchild, Bioconjugate Chemistry 1 (3): 165-187 (1990)], amely hivatkozásként a jelen szabadalmi leírás részét képezi.
A „bázispárosítás” (az irodalomban más szóval „Watson-Crick-bázispárosítás” kifejezés az adenintimin és guanin-citozin (kettős szálú DNSszerkezetben), adenin-uracil és guanin-citozin (RNS/DNS hibrid molekulában) komplementer bázispárok hidrogénkötéssel történő jól ismert összekapcsolására, és nem szokásos nukleotidpárok analóg összekapcsolására vonatkozik.
A „hibridizáció” kifejezés két egyszálú nukleinsav komplementer bázispárosítás által kialakított duplex szerkezetének képződésére vonatkozik. A hibridizáció teljesen komplementer nukleinsavszálak vagy hibás illeszkedések kis tartományait tartalmazó, „lényegében komplementer” nukleinsavszálak között játszódhat le. Azokat a körülményeket, amelyek mellett csak teljesen komplementer nukleinsavszálak hibridizálódnak, „szigorú hibridizációs körülményeknek” vagy „szekvenciaspecifikus hibridizációs körülményeknek” nevezzük. Lényegében komplementer szekvenciák stabil duplexei kevésbé szigorú hibridizációs körülmények között képezhetők; a hibás illeszkedés megengedett mértéke a hibridizációs körülmények megfelelő beállításával szabályozható. A nukleinsavtechnológiában jártas szakember a duplex stabilitást empirikus úton számos változó (például az oligonukleotidek hossza és bázispár koncentrációja, ionerősség, a hibás illeszkedésű bázispárok előfordulásának gyakorisága) figyelembevételével, az irodalomban megadott útmutatások alapján határozhatja meg [Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York; és Wetmur (1991), Critical Review in Biochem. and Mól. Bioi. 26 (3/4): 227-259].
A „primer” kifejezésen valamely nukleinsavszállal komplementer primer kiterjesztett termék szintézisének megfelelő körülmények között a DNS-szintézis beindítási pontjaként működni képes oligonukleotidek értendők. Ez a folyamat négy különböző nukleozid trifoszfát és valamely kiterjesztőágens (például valamely DNSpolimeráz vagy fordított transzkriptáz) jelenlétében, megfelelő pufferben és megfelelő hőmérsékleten játszódhat le. A jelen szabadalmi leírásban alkalmazott „primer” kifejezés a ligálás által közvetített amplifikációs eljárásoknál felhasznált oligonukleotidekre is kiter4
HU 223 669 Bl jed, amelyek során valamely oligonukleotidet ligálással egy második oligonukleotidhez „kiterjesztünk”, amely szomszédos helyzetben hibridizálódik. Ennek megfelelően a jelen szabadalmi leírásban használt „primerkiterjesztés” kifejezés a prímért a DNS-szintézis iniciációs pontjaként felhasználó egyedi nukleozid trifoszfátok polimerizációjára és két primemek kiterjesztett terméket képező ligálására egyaránt vonatkozik.
A primer előnyösen valamely egyszálú DNS. A primer hosszúsága annak kívánt felhasználásától függ és általában 6-50 nukleotid. Rövidebb primermolekulák a templáttal kialakított megfelelően stabil hibridkomplex-képzéshez általában alacsonyabb hőmérsékletet igényelnek. A primereknek nem kell visszatükröznie a templát nukleinsav pontos szekvenciáját, azonban a templáttal történő hibridizációhoz szükséges mértékben komplementernek kell lennie. Egy adott targetszekvencia amplifikációjához szükséges megfelelő primerek megtervezése az irodalomból jól ismert, és az idézett irodalmi helyeken ismertetésre került.
A primerek további jellemzőket tartalmazhatnak, amelyek a primer kimutatását és rögzítését lehetővé teszik, ugyanakkor azonban a primer alapvető tulajdonságait (azaz DNS-szintézis iniciációs pontjaként működni képes) nem változtatják meg. így például a primerek az 5’-végződésen további nukleinsavszekvenciát tartalmazhatnak, amely a targetnukleinsavhoz nem hibridizálódik, azonban az amplifikált termék klónozását megkönnyíti. A primemek a templáttal megfelelően komplementer tartományát „hibridizálótartomány”-nak nevezzük.
A „target”, „targetszekvencia”, „targettartomány” és „targetnukleinsav” kifejezés az amplifikálandó nukleinsav tartományára vagy alszekvenciájára vonatkozik.
A jelen szabadalmi leírás értelmezése szerint a primer valamely targetszekvenciára abban az esetben „specifikus”, ha a primerszekvencia és a targetszekvencia közötti hibás illeszkedések száma kisebb a primerszekvencia és a mintában jelen levő nemtarget szekvenciák közötti hibás illeszkedések számánál. Megfelelően megválasztott hibridizációs körülmények mellett stabil duplexek csak abban az esetben képződnek, ha a jelen levő hibás illeszkedések száma nem nagyobb a primerszekvencia és targetszekvencia között jelen levő hibás illeszkedések számánál. Ilyen körülmények között stabil duplex csak a targetszekvenciával képződik. így targetspecifikus primerek megfelelően szigorú amplifikációs körülmények között történő felhasználása a targetprimer-kötődési helyeket tartalmazó targetszekvenciák specifikus amplifikációját teszi lehetővé. Szekvenciaspecifikus amplifikációs körülmények alkalmazása a pontosan komplementer primerkötődési helyeket tartalmazó targetszekvenciák specifikus amplifikációját teszi lehetővé.
A „nem specifikus amplifikáció” kifejezés a targetszekvenciától eltérő nukleinsavszekvenciák amplifikációjára vonatkozik. Ezek a targetszekvenciától eltérő szekvenciákhoz hibridizáló prímerekből keletkeznek, és primerkiterjesztés szubsztrátumaként szolgálnak. Valamely primemek egy nemtarget szekvenciához történő hibridizálását „nem specifikus hibridizáció”-nak nevezzük, amely alacsony hőmérsékleten, kevésbé szigorú körülmények mellett, előamplifikációs körülmények között játszódhat le.
A „primer dimer” kifejezés templáttól független nem specifikus amplifikációs termékre vonatkozik. Ez a termék olyan primerkiterjesztésekből származik, amelyeknél egy másik primer szolgál templátként. Bár a primer dimer gyakran két primer kapcsolódása (azaz dimer), kettőnél több primer terméke is előfordulhat. A jelen szabadalmi leírásban használt „primer dimer” kifejezésen általánosan templáttól független nem specifikus amplifikációs termékek értendők.
A „reakcióelegy” kifejezés az adott reakció elvégzéséhez szükséges reagenseket tartalmazó oldatokra vonatkozik. Az „amplifikációs reakcióelegy” az amplifikációs reakció elvégzéséhez szükséges reagenseket tartalmazó oldat, amely általában oligonukleotidprimereket és valamely DNS-polimerázt vagy ligázt megfelelő pufferben tartalmaz. A „PCR-reakció-elegy” általában oligonukleotidprimereket, termostabil DNS-polimerázt, dNTPeket és kétértékű fémkationt tartalmaz megfelelő pufferben. Valamely reakcióelegy abban az esetben „teljes”, ha a reakció elvégzéséhez szükséges valamennyi reagenst tartalmazza, és akkor „nem teljes” ha csupán az összes szükséges reagens valamely alkészletét tartalmazza. A szakember számára nyilvánvaló, hogy a reakciókomponenseket célszerűségi okokból, a jobb tárolási stabilitás biztosítása céljából vagy a komponensek koncentrációinak az adott felhasználástól függő, egyszerű beállítása céljából rutinszerűen különálló oldatok formájában tároljuk, és a teljes reakcióelegyet a reakció felhasználása előtt a reakciókomponensek kombinálásával készítjük el. A szakember számára továbbá nyilvánvaló, hogy a reakciókomponenseket kereskedelmi célokra külön-külön csomagoljuk, és a kereskedelmi forgalomban levő kit a reakciókomponenseknek a találmány szerinti módosított prímért magában foglaló bármely alkészletét tartalmazhatja.
Módosított primerek
A találmány szerinti amplifikációs primerek a 3’végződésen a négy nukleotid egyikéhez kovalensen kapcsolódó csoport által módosítva vannak. Találmányunk egyik kiviteli alakja szerint a találmány szerinti módosított primer a (I) vagy (II) általános képletű szerkezetnek megfelelő nukleinsavszekvenciából áll (mely képletekben
S, jelentése kb. 5 és kb. 50 közötti nukleotidhosszúságú első nukleotidszekvencia;
S2 jelentése 1 és 3 közötti nukleotidhosszúságú második nukleotidszekvencia;
N jelentése valamely exociklikus amint tartalmazó purin- vagy pirimidinbázist magában foglaló nukleotid;
R jelentése valamely módosítócsoport;
mimellett R az exociklikus aminon keresztül kapcsolódik N-hez, és
R a szabadalmi leírásban megadott szerkezetű).
Mint azt a példákban bemutatjuk, a módosítás hatása akkor maximális, ha a 3’-terminális nukleotid van
HU 223 669 Bl módosítva. Ennek megfelelően a primer előnyösen valamely módosított 3’-terminális nukleotidot tartalmaz.
Találmányunk céljaira olyan módosított nukleotid alkalmazható, amelynek a bázisa a nukleotid és a komplementer nukleotid között lejátszódó bázispárképzésben szerepet játszó exociklikus amint tartalmaz. A primerek általában csak szokásos nukleotidokat tartalmazó DNS-ek. A DNS-ben előforduló négy szokásos nukleotidbázis közül az adenin, guanin és citozin a komplementer bázissal történő bázispárképzésben részt vevő exociklikus primer amint tartalmaz. Találmányunk előnyös kiviteli alakja szerint a prímért oly módon módosítjuk, hogy az exociklikus aminhoz egyetlen módosítócsoportot kapcsolunk, az aminocsoport két hidrogénatomja közül az egyiket helyettesítjük; módosítatlan bázis esetében ez a két hidrogénatom képes részt venni a bázispárképzésben. A módosított adenin-, guanin- és citozinbázist tartalmazó módosított nukleotidok szerkezetét a (V), (VI), illetve (VII) általános képletben tüntetjük fel. A képletekben S a cukorrészt és R a módosítócsoportot jelenti.
Találmányunkat azonban nem korlátozzuk szokásos nukleotidokból álló primerekre. Találmányunk szerint a komplementer bázissal történő bázispárképzésben részt vevő exociklikus primer aminocsoportot tartalmazó bázisrésszel rendelkező bármely nukleotidanalóg módosítható. A nem szokásos nukleotidok közül például a 3-metil-adenint, 7-metil-guanint, 3-metil-guanint, 5-metil-citozint és 5-hidroxi-metil-citozint említjük meg.
A módosítócsoport korlátozza a módosított bázist a hidrogénkötésben való részvételben, minthogy a módosított csoport az egyik hidrogénatomot helyettesíti. A maradék hidrogénatom azonban a hidrogénkötés kialakításában való részvételre képes. A módosítócsoportok tehát a hibridizáció kinetikáját és termodinamikáját egyaránt befolyásolhatják. A szóba jövő módosítócsoportok az alábbi tulajdonságokkal rendelkeznek:
1. a módosított bázis és a komplementer bázis közötti
W atson- Crick-bázispár-képződésbe beavatkoznak, azonban nem akadályozzák meg;
2. a módosított primer kiterjesztésébe beavatkoznak, azonban nem gátolják meg; és
3. a módosított primer kiterjesztett termékével komplementer szál szintézisét megengedik.
A módosítócsoport a bázispárképzésbe és ezáltal a primerkiterjesztésbe szterikusan beavatkozik. Ezért a módosítócsoport fizikai tömege a hibridizációba történő beavatkozás mértékét befolyásolja. Ha valamely kettős szálú nukleinsavba módosított adenozin- vagy citidinnukleotidot építünk be, a módosítócsoport a fő barázda központi térközébe behatol. Ennek következtében még viszonylag nagy módosítócsoportok is csupán a duplex szerkezet kis szterikus perturbációját okozzák. Azonban megfelelő módosítócsoportok nem elég nagyok ahhoz, hogy a hidrogénkötés kialakulását vagy a primer 3’-hidroxi enzimatikus kiterjesztését megakadályozzák. Ha valamely kettős szálú nukleinsavba módosított guanozinnukleotidot építünk be, a módosítócsoport a kisebb barázdába behatol, és a módosítócsoport fő tömegének hozzáillesztésében kevesebb tér áll rendelkezésre. Ennek következtében guaninbázis kapcsolásához kisebb módosítócsoportok előnyösek.
A későbbi amplifikációs ciklusokban templátként felhasznált primer ki teq esztett termékek a primer által bevitt módosított bázist tartalmazzák. A módosítócsoportot oly módon választjuk meg, hogy a módosított bázis jelenléte a templátban ne idézze elő a primerkiterjesztés befejeződését vagy a primerkiterjesztés gátlását. A módosítócsoport jellege előnyösen olyan, hogy nem idéz elő mutagén folyamatokat, amelyek során a módosított bázis identitása a printerből leszármaztatott templát replikációjakor elvész. A módosított bázisnak a templátban a primerkiterjesztésre kifejtett hatását az alábbi irodalmi helyen közölt útmutatás alapján rutinszerűen vizsgálhatjuk: [Gniazdowski and Cera, Chem. Rév. 96:619-634(1996)].
A találmányunk szerinti eljárásnál bármely olyan R módosítócsoport felhasználható, amely a fenti tulajdonságokkal rendelkezik. Előnyös módosítócsoportok a (III) általános képletű szerkezetnek felelnek meg (mely képletben R, és R2 jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom, 1-10 szénatomos alkilcsoport, alkoxicsoport, fenilcsoport, fenoxicsoport, helyettesített fenilcsoport, naftilcsoport vagy helyettesített naftilcsoport).
Az alkilcsoportok elágazó- vagy egyenes láncúak lehetnek. Nagyobb szénatomszámú (legalább C20-ig terjedő) alkilcsoportok is felhasználhatók.
Találmányunk előnyös kiviteli alakja szerint R jelentése 2-naftil-metil-, benzil-, vagy helyettesített benzilcsoport. A helyettesített benzilcsoportok előnyösen a (IV) általános képletnek felelnek meg (mely képletben R3 jelentése 1 -6 szénatomos elágazó láncú vagy egyenes láncú alkilcsoport, előnyösen 1-4 szénatomos elágazó láncú vagy egyenes láncú alkilcsoport, metoxicsoport vagy nitrocsöpört).
Az 1-4 szénatomos elágazó láncú vagy egyenes láncú alkilcsoport metil-, etil-, propil-, butil-, izopropil-, izobutil-, tercier butilcsoport stb. lehet. Az alkilcsoportok közül előnyös a metil- és tercier butilcsoport. R3 előnyösen p-helyzetben kapcsolódik.
Különösen előnyös R módosítócsoportok az alábbiak : a (VIII) képletű benzilcsoport, a (IX) képletű pmetil-benzil-csoport, a (X) képletű p-tercier butil-benzil-csoport, a (XI) képletű p-metoxi-benzil-csoport, a (XII) képletű o-nitro-benzil-csoport és a (XIII) képletű 2-naftil-metil-csoport.
Az előnyös módosítócsoportok számos képviselőjét a példában ismertetjük. A konkrét esetben előnyösen alkalmazható módosítócsoport az adott vegyületcsaládból a jelen szabadalmi leírásban megadott általános útmutatás segítségével, a szakember számára rutinmódszerekkel empirikus úton választható ki. Valamely csoport módosítócsoportként való alkalmasságát előnyösen empirikus úton, a módosított primereknek az amplifikációs reakciókban történő felhasználásával határozhatjuk meg. A sikeres amplifikációt az jelzi, hogy a módosított bázis a primerkiterjesztést teljesen nem gátolja, és a módosított bázis jelenléte a primerből leszármaztatott templátban nem okozza a primerkiterjesztés
HU 223 669 Bl befejeződését. A primer dimer csökkenését a példákban leírt módon határozzuk meg.
Fotolabilis módosítást tartalmazó primerek
Találmányunk alternatív kiviteli alakja szerint a primereket egy vagy több, hővel szemben labilis csoporttal módosítjuk, amelyeket fény behatásával eltávolítunk azután, hogy a reakcióelegy a specifikusságot biztosító magas reakció-hőmérsékletet elérte. Minthogy a módosítócsoportot a primerkiterjesztés előtt eltávolítjuk, a módosított primemek a csoport eltávolítása előtt nem kell kiteijeszthetőnek lennie. A találmányunk szerinti eljárásnál felhasználható fotolabilis módosítóágensek például az alábbi irodalmi helyen kerültek ismertetésre: [Pillái „Photoremovable Protecting Groups in Organic Synthesis”, Synthesis: 1-26 (1980)].
A találmányunk szerinti fotolabilis primerek előnyösen a 3’-terminális nukleotidon egy vagy két (XII) képletű o-nitro-benzil-csoport kapcsolódása által vannak módosítva.
A bázisrész exociklikus primer aminocsoportjához kapcsolódó egyetlen nitro-benzil-csoport által módosított primerek esetében a képződő szekunder amin a bázisképzésben még részt képes venni, ha az aminocsoport úgy van elforgatva, hogy a maradék hidrogén a komplementer bázis felé irányul. A példákban leírjuk, hogy ezek a primerek amplifikációban UV fénnyel történő besugárzással végzett eltávolítással vagy anélkül alkalmazhatók.
A bázis exociklikus aminjához két nitro-benzil-csoport kapcsolásával módosított primerek nem terjeszthetők ki. A gátlás oka feltehetően az, hogy a módosított bázis a bázispárképzésben nem képes részt venni, minthogy az exociklikus amin mindkét hidrogénatomját a nagy térkitöltésű nitro-benzil-csoport helyettesíti. Két nitro-benzil-csoporttal módosított primereknek az amplifikációban történő alkalmazása esetén a reakcióelegyet a nitro-benzil-csoportok eltávolításához elegendő ideig UV fénnyel kell kezelni, amikor is a primerkiterjesztés lejátszódik. Ezt a módszert a példákban ismertetjük.
Találmányunk alternatív kiviteli alakja szerint a módosítócsoportot a gyűrű nitrogénjéhez kapcsoljuk. A bázis gyűrűnitrogénjéhez kapcsolódó nitro-benzilcsoporttal módosított primerek nem terjeszthetők ki, mivel a módosított bázis a bázispárképzésben való részvételre nem alkalmas. A nitro-benzil-csoportoknak UV fénnyel végzett besugárzással történő eltávolítása után a primerkiterjesztés lejátszódik.
A módosítócsoport eltávolítása előtt nem kiterjeszthető fotolabilis primerek felhasználása lényegében „forró indításos” (hot-start) amplifikációt tesz lehetővé. A primerkiterjesztés a nem specifikus reakció előtti körülmények között gátolva van. A reakcióelegy besugárzását és a primerekről a blokkolócsoport eltávolítását azután végezzük el, hogy a reakcióelegy hőmérséklete a reakció specifikusságát biztosító értéket elérte.
Módosított primerek szintézise
A módosított primerek szintézisét az irodalomból jól ismert standard kémiai módszerekkel végezzük el. A módosítócsoportok bevitele négy osztályba sorolható:
1. A módosítócsoportot valamely módosított nukleozid felhasználásával visszük be (például DNSszintézis-hordozó).
2. A módosítócsoportot valamely módosított nukleozid (például foszforamidit) felhasználásával visszük be.
3. A módosítócsoportot valamely reagens felhasználásával a DNS-szintézis folyamán visszük be (például valamely átalakítható amidit benzil-aminnal történő kezelése, a DNS-szekvenciába történő beépítéskor).
4. Szintézis utáni módosítás. A módosítócsoportot a szintetikus DNS-sel érintkezésbe hozott reakcióképes ágens formájában visszük be.
A módosított primerek szintézisét a példákban mutatjuk be. További módosított primerek analóg módon standard szintézismódszerek felhasználásával szintetizálhatok.
Módosított primerek szintézisét előnyösen szabályozott pórusú üveg (CPG)-hordozón képezett származékkal végezzük el. A dA CPG-származékkal végzett szintézis általános reakciósémáját a 6. ábrán tüntetjük fel. Előnyös módosítócsoportokat oly módon vihetünk be, hogy alkilezőszerként a megfelelő alkil-halogenideket, benzil-halogenideket, helyettesített benzil-halogenideket, metil-naftil-halogenideket vagy helyettesített metil-naftil-halogenideket alkalmazzuk. A benzilés p-tercier-butil-benzil-dA CPG-szintézisét az 1. és 2. példában leírtak szerint a 6. ábrán feltüntetett módon hajthatjuk végre.
Az exociklikus aminocsoport alkilezését az alábbi irodalmi helyen leírt metilezéssel analóg módszerekkel végezhetjük el: [Griffin and Reese, Biochim. Acta 68: 185-192 (1963)]. További szintézismódszerek az alábbi irodalmi helyen kerültek ismertetésre: [Aritoma et al., J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1: 1837-1849, (1995)].
Módosított primerek felhasználásával végzett amplifikációk
A találmány szerinti eljárás során primeralapú amplifikációt a találmányunk szerinti módosított primerek felhasználásával végzünk el. Általában módosított primereket használhatunk azonos nukleotidszekvenciát tartalmazó módosítatlan primerek helyett, primeralapú amplifikációban, az amplifikációs reakciókörülmények megváltoztatása nélkül. A szakember számára nyilvánvaló, hogy bizonyos reakciók esetében a reakciókörülmények kisebb mértékű rutinszerű újraoptimalizálása előnyös lehet.
Találmányunk előnyös kiviteli alakja szerint polimeráz láncreakcióban (PCR) a találmány szerinti módosított primereket használjuk. A találmányt azonban nem korlátozzuk bizonyos amplifikációs rendszerekre. A találmány szerinti primerek bármely olyan primeralapú amplifikációs rendszerben felhasználhatók, amelyben primer dimer vagy nem specifikus amplifikációs termék keletkezhet. Az amplifikációs módszerek néhány példáját az idézett irodalmi helyek ismertetik. Kifejlesztésre kerülő további módszerek is felhasználhatók a találmány szerinti eljárás gyakorlati megvalósítása során.
A találmány szerinti módszerek DNS vagy RNS amplifikációjára alkalmasak. így például RNS fordított transzkriptáz/polimeráz láncreakció (RT-PCR) felhasz7
HU 223 669 BI nálásával történő amplifikációja az irodalomból jól ismert, és például az alábbi irodalmi helyeken kerültek ismertetésre: [5 322 770 és 5 310 652 számú USAszabadalom, Myers és Gelfand Biochemistry 30 (31): 7661-7666 (1991); Young et al., J. Clin. Microbiol. 37 (4): 882-886 (1993) és Mulder et al., J. Clin. Microbiol. 32(2): 292-300(1994)].
Primeralapú amplifikációban a primerkiterjesztést általában magasabb hőmérsékleten valamely termostabil enzim (például termostabil DNS-polimeráz) felhasználásával végezzük el. Az enzim a szintézist a primer 3 ’-végén iniciálja, és a szintézis befejeződéséig a templát 5’-vége irányában halad előre. Amplifikációs reakciókban felhasználható tisztított termostabil DNS-polimerázok az irodalomból jól ismertek, és példálódzó jelleggel - korlátozás nélkül - az alábbi irodalmi helyeken leírt enzimekre hivatkozunk: 4 889 818 számú USA-szabadalom, 5 079 352 számú USA-szabadalom, 5,352 600 számú USA-szabadalom és 5 491 086 számú USA-szabadalom; WO 91/09950; WO 92/03556; WO 92/06200; WO 92/06202; WO 92/09689 és 5 210 036 számú USA-szabadalom. Termostabil DNS-polimerázok áttekintő jellegű ismertetése az alábbi irodalmi helyen található: [PCR Strategies, (ed. M. A. Innis et al.) 39-57. oldal, Academic Press, San Diego].
Találmányunk előnyös kiviteli alakja szerint - különösen DNS amplifikációja esetén - az amplifikációt reverzibilisen inaktivált enzim felhasználásával, a „The use of a reversibly inactivated enzyme” helyen leírtak szerint végezzük el. A reverzibilisen inaktivált enzimet magasabb hőmérsékleten újraaktiváljuk és az enzim a nem specifikus amplifikációt a reakció megindulása előtt a primerkiterjesztés gátlásával tovább csökkenti. A Hoffmann-La Roche (Nutley, NJ) által kifejlesztett és gyártott és a Perkin-Elmer (Norwalk, CT) által forgalmazott reverzibilisen inaktivált termostabil DNS-polimeráz az alábbi irodalmi helyen került ismertetésre: [Birch et al., Natúré 381 (6581): 445-446(1996)].
A módosítócsoportnak az enzim prímért kiterjesztő képességére kifejtett hatása egyrészről a felhasznált enzimtől, másrészről az alkalmazott reakciókörülményektől függ. így például Tth DNS-polimeráz bizonyos RNS-amplifikációknál Mn2+ kétértékű kation alkalmazása esetén jobban felhasználható, mint Mg2+ alkalmazásakor. A megfelelő módosítócsoport, enzim és reakciókörülmények rutinszerű megválasztása a szakember tudásához tartozik.
Az amplifikációs reakciókban felhasználható mintakészítési módszerek az irodalomból jól ismertek és részletesen ismertetésre kerültek. A megfelelő módszer megválasztása találmányunk szempontjából nem döntő jelentőségű tényező. A szakember a reakciókörülményeket ismert mintakészítési módszerek felhasználásával optimalizálni képes.
Az amplifikált nukleinsav analitikai módszerei az irodalomból jól ismertek és részletesen ismertetésre kerültek. Az alkalmazandó módszer találmányunk szempontjából nem döntő jelentőségű tényező. A szakember a megfelelő analitikai módszert a felhasználástól függően minden további nélkül meg tudja választani.
Az amplifikációs reakció egyik előnyös elemzési módszere szerint a reakcióelegyben a kettős szálú DNS összmennyiségének növekedését nyomon követjük [Higuchi et al., Bio/Technology 10: 413-417 (1992); Higuchi et al., Bio/Technology 77: 1026-1030 (1993); European Patent Publications Nos. 512 334 és 640 828 számú európai közrebocsátási irat]. E módszer során (úgynevezett „kinetikus PCR”) a kettős szálú DNS kimutatása azon alapul, hogy etidium-bromid (EtBr) és más DNS-hez kötődő jelzőanyagok a kettős szálú DNS-hez való kötődéskor fokozott fluoreszcenciát mutatnak. Az amplifikációt ilyen jelzőanyag jelenlétében végezzük el. A targetszekvencia szintéziséből keletkező kettős szálú DNS mennyiségének növekedése a fluoreszcencia kimutatható erősödését eredményezi, amelyet az amplifikáció alatt nyomon követünk. Ennek megfelelően a fenti módszerek az amplifikációs reakció előrehaladásának nyomon követésére alkalmasak.
Kinetikus PCR esetében a mért fluoreszcencia a jelen levő kettős szálú DNS összmennyiségétől függ; ebbe a nem specifikus amplifikációból és a targetszekvencía amplífikációjából származó kettős szálú DNS egyaránt beletartozik. A fluoreszcencia nyomon követése a kettős szálú DNS összmennyisége növekedésének mérését lehetővé teszi ugyan, azonban nem alkalmas a targetszekvencia amplífikációjából származó kettős szálú DNS növekedése és a nem specifikus amplifikációs termékből származó kettős szálú DNS növekedése elkülönített mérésére. A találmányunk szerinti módosított primerek különösen előnyösen alkalmazhatók kinetikus PCR esetében, minthogy nem csupán a képződő primer-dimer mennyiségét csökkentik, hanem a primer-dimer kimutatható mennyiségének képződését is késleltetik. Minthogy a találmányunk szerinti módosított primerek segítségével a primer-dimer képződés a targetszekvencia szignifikáns növekedésének eléréséig csökkenthető, a targetszekvenciák amplifikációja önállóan nyomon követhető és a primer-dimerből származó interferencia minimalizálható.
Kit
A találmány tárgya továbbá a találmányunk szerinti módszer elvégzéséhez szükséges komponenseket tartalmazó kit, multikonténeregység. A találmány szerinti kit nukleinsavamplifikációknál felhasználható primereket tartalmaz, amelyek közül legalább az egyik a találmány szerint módosítva van. A kit adott esetben további komponenseket is tartalmazhat, például primer kiterjesztett termékek szintézisét katalizáló ágenseket, szubsztrát nukleozid trifoszfátokat, megfelelő reakciópuffereket és a módszer végrehajtását ismertető használati utasítást.
Találmányunk további részleteit az alábbi példákban ismertetjük, anélkül, hogy találmányunkat a példákra korlátoznánk. A szakember számára nyilvánvaló, hogy a találmánynak a jelen szabadalmi leírásban ismertetett kiviteli alakoktól eltérő számos foganatosítási módja a példák figyelembevételével kidolgozható, és ezek is találmányunk részét képezik.
HU 223 669 Bl
1. példa
Benzilcsoporttal módosított primerek szintézise Benzilcsoport beépítésével módosított primereket az alábbiakban ismertetésre kerülő két módszer egyikével szintetizálunk. A 3’-terminális bázison módosított primereket DNS-szintézis beindítása céljából N6-benzil-deoxiadenozin szabályozott pórusú üveg (CPG) felhasználásával szintetizálunk. Belső bázison módosított primereket N6-benzil-deoxiadenozin-foszforamidit felhasználásával szintetizálunk.
A példában az alábbi standard rövidítéseket alkal-
| mázzuk: | |
| DMAP | 4-dimetil-amino-piridin |
| DMF | N,N-dimetil-formamid |
| TEA | trietil-amin |
| EDC | l-etil-3-(3-dimetil-amino-propil)-karbo- diimid-hidroklorid |
| THF | tetrahidrofurán |
| DMT | 4,4 ’ -dimetoxi-tritil |
| LCAA-CPG | hosszú láncú alkil-amino szabályozott pórusú üveg. |
I. N6-Benzil-deoxiadenozin CPG-szintézise
1. lépés: N6-benzoil-N6-benzil-5’-O-DMT2 ’-deoxiadenozin szintézise
657 mg (1,0 mmol; Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI) N6-benzoil-5’-0-(4,4 ’ -dimetoxi-tritil)2’-deoxiadenozinhoz 10 ml piridint adunk és az elegyet vákuumban történő bepárlással szárítjuk. Ezt a műveletet megismételjük. A kapott habot vízmentes dimetil-formamidban (15 ml; Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI) oldjuk és 5 °C-ra hűtjük. Argonatmoszférában nátrium-hidridet (44 mg, 1,1 mmol, 1 ekvivalens 60%-os olajos diszperzió) adunk hozzá és szobahőmérsékleten 45 percen át keverjük. Ezután két perc alatt benzil-bromidot (143 pl, 206 mg, 1,2 mmol, 1,2 equiv; Aldrich Chemical Co., Milwaukee, Wl) adunk hozzá és az elegyet szobahőmérsékleten egy éjjelen át keverjük. Az elegyet vákuumban végzett bepárlással szárítjuk, a maradékot 10 ml etil-acetát és 10 ml víz között megosztjuk és extraháljuk. A vizes fázist 10 ml etil-acetáttal újraextraháljuk, az egyesített extraktumokat vízmentes magnézium-szulfát felett szárítjuk, szűrjük és bepároljuk. A nyersterméket 75 g szilikagélen végzett kromatografálással és 3:0,5:96,5 arányú metanol/trietil-amin/metilén-klorid eleggyel végrehajtott eluálással tisztítjuk. A kívánt terméket tartalmazó frakciókat egyesítjük és bepárlással szárítjuk. 40 mg várt N6-benzoil-N6-benzil5’-O-DMT-2’-deoxiadenozint kapunk, kitermelés 54%. A termék szerkezetét NMR segítségével igazoljuk.
2. lépés: szukcinilezés
295 mg (0,39 mmol) N6-benzoil-N6-benzil-5’-ODMT-2’-deoxiadenozinhez 10 ml piridint adunk és az elegyet magas vákuumban végzett bepárlással szárítjuk. Ezt a lépést megismételjük. Ezután 10 ml friss vízmentes piridint, 200 mg (2 mmol, 5,0 ekvivalens) borostyánkősavanhidridet és 24 mg DMAP-t adunk hozzá és az oldatot argonatmoszférában szobahőmérsékleten egy éjjelen át keverjük. Az oldószer nagy részét vákuumban eltávolítjuk és a maradékot 20 ml metilén-klorid és 20 ml nátrium-citrát-oldat (0,1 M, pH
5,0) között megosztjuk és extraháljuk. A vizes fázist 20 ml metilén-kloriddal extraháljuk, az egyesített extraktumokat vízmentes nátrium-szulfát felett szárítjuk, szűrjük és bepárlással szárítjuk. A terméket 4,5 g szilikagélen végzett oszlopkromatografálással és 32:1:67 arányú etil-acetát/trietil-amin/metilén-klorid eleggyel végrehajtott eluálással tisztítjuk. 247 mg várt 3’-szukcinát-észtert, azaz N6-benzoil-N6-benzil-3’-Oszukcinát-5’-O-DMT-2’-deoxiadenozint kapunk, kitermelés 74%.
3. lépés: CPG-származék képzése
Savval mosott CPG-t a következőképpen készítünk. LCAA-CPG-t (1,0 g, LCA00500C, 500 angström, 88,6 (mol/g; CPG Inc., Fairfield, NJ) diklór-ecetsavval diklór-metánban (2%, 20 ml) szobahőmérsékleten 20 percen át időnként végzett rázatással mosunk. A savval mosott CPG-t zsugorított üvegszűrőn szűrjük és diklór-metánnal savmentesre mossuk. A port levegőn szárítjuk, majd vákuumban szobahőmérsékleten egy éjjelen át szárítjuk.
A módosított nukleozid közbenső terméket a következőképpen kapcsoljuk a savval mosott CPG-hez. 170 mg (0,2 mól) a fentiek szerint előállított N6-benzoilN6-benzil-3 ’-O-szukcinát-5 '-O-DMT-2 ’-deoxiadenozin 10 ml diklór-metánnal képezett oldatához 100 μΐ TEA-t adunk és az oldatot argonatmoszférában kb. 5 ml-re bepároljuk. Ezután egymás után az alábbi anyagokat adjuk hozzá: DMAP (12 mg, 0,1 mmol, 0,5 ekv.), TEA (100 μΐ), EDC (384 mg, 2,0 mmol, 10 ekv.) és a fentiek szerint savval mosott CPG. Ezután 5 ml vízmentes piridint adunk hozzá, az elegyet lezáijuk és szobahőmérsékleten 3 napon át rázatjuk. A CPG-t vákuumban szűrjük, előbb izopropanollal, majd diklór-metánnal bőségesen mossuk, levegőn szárítjuk, végül vákuumban 1 órán át szárítjuk.
A származékká alakított CPG befogását a következőképpen végezzük el: a száraz származékká alakított CPG-hez 5-5 ml Cap A és Cap B oldatot adunk (ecetsavanhidrid/2,6-lutidin/THF és 10% N-metil-imidazol tetrahidrofuránban; Glen Research DNS-szintézis-reagensek, Sterling, VA). Az elegyet szobahőmérsékleten 4 órán át rázatjuk. A CPG-t vákuumban szüljük, előbb izopropanollal, majd diklór-metánnal bőségesen mossuk, levegőn szárítjuk és vákuumban egy éjjelen át szárítjuk.
II. N6-Benzil-deoxiadenozin-foszforamidit szintézise
Az N6-benzoil-N6-benzil-5 ’ -O-DMT-2 ’ -deoxiadenozin szintézisét a következőképpen végezzük el:
196 mg (0,26 mmol) N6-benzoil-N6-benzil-5’-ODMT-2’-deoxiadenozin és 8 ml vízmentes tetrahidrofurán oldatához diizopropil-etil-amint (350 μΐ, 270 mg, 2,04 mmol, 7,8 ekv.) és 2-cianoetil-N,N-diizopropilklór-foszforamiditet (161 mg, 0,68 mmol, 2,6 ekv.; Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI) adunk és az elegyet szobahőmérsékleten argonatmoszférában 30 percen át keverjük. Az oldószert vákuumban eltávolítjuk és a maradékot 20 ml 5%-os nátrium-hidrogénkarbonát-oldat és 20 ml etil-acetát között megosztjuk. A szerves fázist egymásután 20-20 ml hidrogén-karbonát-oldattal, vízzel és telített konyhasóoldattal mossuk, nátrium-szulfát felett szárítjuk, szűrjük és bepároljuk.
HU 223 669 Bl
A maradékot 4 g szilikagélen végzett oszlopkromatografálással és 34:65:0,7 arányú aceton/hexán/TEA eleggyel végrehajtott eluálással tisztítjuk. 248 g kívánt foszforamiditet kapunk, kitermelés 100%.
III. DNS-szintézis, tisztítás és analízis
A benzilcsoporttal módosított adenozin-CPG-t (25 mg, 1,0 mól) üres szintézisoszlopokra (Glen Research, Sterling, VA) visszük fel. Ezeket használjuk fel oligonukleotidek készítésére (ABI 374 DNS szintetizátoron (Perkin-Elmer, Applied Biosystems Division, Foster City, CA) szokásos szintézis és védőcsoporteltávolítási körülmények között. A nyers DMT-DNS-t tisztítjuk és 5’-hidroxi-DNS-sé alakítjuk, standard DMT On/Off HPLC segítségével, Rainin-tiszta DNSoszlop felhasználásával, Rainin HPLC-rendszeren (Rainin Instrument Co, Wobum, MA). Az oligonukleotideket ABI kapilláriselektroforézis-rendszer (Perkin-Elmer, Applied Biosystems Division, Foster City, CA) felhasználásával, vagy Dionex Nucleopak oszlopon (Dionex Corp, Sunnyvale, CA) végzett denaturáló anioncserélő HPL-kromatográfíával analizáljuk.
Hasonlóképpen, belsőleg módosított primerek szintézisét módosítatlan CPG és a fentiekben leírt módon szintetizált módosított foszforamidit felhasználásával végezzük el.
2. példa
Tercier butil-benzil-csoporttal módosított primerek szintézise
Ebben példában a 3’-terminális adenozinon p-tercier butil-benzil-csoporttal módosított primerek szintézisét írjuk le. A módosított primerek szintézisét lényegében az 1. példában leírt módon hajtjuk végre, azonban N6-(p-tercier butil-benzil)-deoxiadenozin-CPG-t alkalmazunk. A származékká alakított CPG szintézisét a következőképpen végezzük el.
1. lépés: N6-benzoil-N6-(p-tercier butil-benzil)-5’O-(4,4'-dimetoxi-tritil)-2 ’-deoxiadenozin
658 mg (1,0 mmol) N6-benzoil-5’-0-(4,4’-dimetoxi-tritil)-2’-deoxiadenozinhez 10 ml vízmentes dimetil-formamidot adunk és szárazra pároljuk. Ezt a műveletet megismételjük. Argonatmoszférában 10 ml friss dimetil-formamidot adunk hozzá. Ezután 44 mg (60%os, olajban 1,1 millimol) nátrium-hidridet adunk hozzá és az elegyet szobahőmérsékleten fél órán át keverjük. 272 mg (1,2 millimol) 4-(tercier butil)-benzil-bromidot csepegtetünk hozzá, és a reakcióelegyet szobahőmérsékleten egy éjjelen át keverjük. Az oldószert vákuumban eltávolítjuk és a maradékot 20 ml etil-acetát és 20 ml víz között megosztjuk. A szerves fázist 3 χ 20 ml vízzel mossuk, vízmentes magnézium-szulfát felett szárítjuk, szűrjük és szárazra pároljuk. A nyersterméket 100 g szilikagélen végzett oszlopkromatografálással és 96,5:3:0,5 arányú metilén-klorid/metanol/trietil-amin eleggyel végzett eluálással tisztítjuk. 229 mg N6-benzoil-N6-(p-tercier butil-benzil)-5’-O-(4,4’-dimetoxi-tritil)-2’-deoxiadenozint kapunk, kitermelés 28,5%.
2. lépés: szukcinilezés
217 mg (0,27 millimol) N6-benzoil-N6-(p-tercier buti 1-benzil) - 5 ’ -0-(4,4 ’ -dimetoxi-tritil)-2 ’ -deoxiadenozint ml piridinben 135 mg (5 ekvivalens) borostyánkősavanhidriddel és 17 mg DMAP-vel (17 mg, 0,5 ekvivalens) 10 ml piridinben reagáltatunk. A reakcióelegy feldolgozását és a kromatografálást az 1. példában leírt módon végezzük el. 199 mg N6-benzoil-N6-(p-tercier butil-benzil)-5 ’ -0-(4,4 ’ -dimetoxi-tritil)-2 ’-deoxiadenozin-3 ’ -Oszukcinátot kapunk, kitermelés 82%.
3. lépés: CPG-származék előállítása A 2. lépés szerint előállított szukcinátot (180 mg,
0,2 mmol) az 1. példában leírt módon savval mosott LCAA-CPG-vel reagáltatunk. A CPG-t befogjuk és vákuumban szárítjuk. 1,065 g N6-benzoil-N6-(p-tercier butil-benzil)-5 ’ -0-(4,4 ’ -dimetoxi-tritil)-2 ’ -deoxiadenozin-3 ’-O-szukcinát-CPG-származékot kapunk.
3. példa
Metilcsoporttal módosított primerek szintézise A 3’-terminális adenozinon metilcsoporttal módosított primerek szintézisét N6-metil dA CPG (22 mg, 1 μοί, Glen Research, Sterling VA) felhasználásával végezzük el. A N6-metil dA CPG-t üres szintézisoszlopba helyezzük és a primereket a szintézis és védőcsoport-eltávolítás standard körülményei között készítjük el. A primereket az 1. példában leírt DMT On/Off HPLC-eljárás felhasználásával tisztítjuk.
4. példa
Fotolabilis módosított primerek szintézise Ebben a példában a 3’-terminális adenozinon egy vagy két nitro-benzil-csoporttal módosított primerek szintézisét ismertetjük. A módosított primerek szintézisét lényegében az 1. példában leírtak szerint végezzük el, azonban mononitrobenzil dA CPG-t vagy bisz-nitrobenzilt dA CPG-t alkalmazunk.
I. Mononitrobenzilezett primerek
Az N6-benzoil-N6-orto-nitrobenzil-2 ’-deoxiadenozin-CPG-származék szintézisére az N6-benzoilN6-benzil-2’-deoxiadenozin-CPG-származék szintézisére közölt általános módszert (lásd 1. példa) alkalmazzuk azzal a változtatással, hogy alkilezőszerként ortonitrobenzil-bromidot alkalmazunk. A CPG további lépései az 1. példában leírtakkal azonosak, azzal a további intézkedéssel, hogy a közbenső termékeket a fénytől oly módon védjük meg, hogy a reakcióedényeket alumínium-fóliába csomagoljuk.
A CPG-származék szintézise után a primereket az
I. példában leírt módon szintetizáljuk, azonban a gyártó cég jegyzőkönyveinek segítségével Nensorb Prep oszlopok (NEN Research Products Biotechnology Systems, Du Pont Co, Boston MA) felhasználásával szilárd fázisú extrakcióval izoláljuk.
II. Bisz-nitrobenzilezettprimerek Bisz-nitrobenzil-deoxiadenozin CPG-szintézisét a következőképpen végezzük el. A CPG-származék szintézise után a primerek szintetizálását és tisztítását a mononitrobenzil-primerekre leírt módon végezzük el.
/. lépés: 5 ’-O-DMT-N6-bisz-orto-nitrobenzil-2 ’-deoxiadenozin szintézise
538 mg (2,0 mmol Aldrich Chemical, Milwaukee,
WI) 2’-deoxi-adenozin-monohidrátot vízmentes piri10
HU 223 669 Β1 dinnel (2x10 ml) vákuumban végzett bepárlással szárítunk. A maradékot vízmentes dimetil-formamidban (10 ml, Aldrich, Milwaukee, WI) argonatmoszférában oldjuk, nátrium-hidridet (88 mg, 2,2 mmol, 1,1 ekvivalens, 60%-os olajos diszperzió) adunk hozzá és szobahőmérsékleten 40 percen át keverjük. Ezután 710 mg (3,3 millimól, 1,5 ekvivalens) 2-nitro-benzilbromidot adunk hozzá és az oldatot szobahőmérsékleten 4 órán át keverjük. A dimetil-formamidot vákuumban eltávolítjuk és a maradékot 20 ml etil-acetát és 20 ml víz között megosztjuk. A vizes fázist 20 ml etil-acetáttal extraháljuk, az egyesített extraktumokat 20 ml vízzel mossuk magnézium-szulfát felett szárítjuk, szűrjük és bepároljuk. A nyersterméket 50 g szilikagélen végzett oszlopkromatografálással és 3% metanolt tartalmazó diklór-metánnal végrehajtott eluálással tisztítjuk. 320 mg 2’-deoxi-N6-bisz-orto-nitrobenzil-adenozint kapunk, kitermelés 30%.
200 mg (0,518 mmol) 2’-deoxi-N6-bisz-orto-nitrobenzil-adenozinhoz 10 ml vízmentes piridint adunk és szárazra pároljuk. A maradékhoz 10 ml piridint, majd 900 mg (2,3 mmol, 4,5 ekvivalens) 4,4’-dimetoxi-tritilkloridot és 280 mg (2,76 mmol, 4,0 ekvivalens) trietilamint adunk. A reakcióelegyet szobahőmérsékleten argonatmoszférában 5 órán át keverjük, 0,5 ml vizet adunk hozzá és 20 percen át keverjük. Az elegyet 20 ml éter és 20 ml víz között megosztjuk és a vizes fázist 20 ml éterrel újraextraháljuk. Az extraktumokat egyesítjük, 20 ml vízzel mossuk, vízmentes nátrium-szulfát felett szárítjuk, szűrjük és bepároljuk. A terméket 4 g szilikagélen végzett kromatografálással és 0,7-2,5% metanolt tartalmazó metilén-kloriddal végzett eluálással tisztítjuk. 121 mg 5’-O-DMT-N6-bisz-orto-nitrobenzll-2’-deoxiadenozint kapunk, kitermelés 33%.
2. lépés: szukcinilezés
121 mg (0,145 mmol) 5’-O-DMT-N6-bisz-orto-nitrobenzil-2’-deoxiadenozint 2x3 ml vízmentes piridinnel történő bepárlással szárítunk. Ezután 3 ml piridint, 58 mg (0,58 mmol, 4 ekvivalens) borostyánkősavanhidridet és 11 mg (katalitikus) DMAP-t adunk hozzá és az oldatot szobahőmérsékleten 3 napon át keverjük. Az oldatot vákuumban bepároljuk és a maradékot 10 ml metilén-klorid és nátrium-citrát-puffer (0,1 M, pH 5,0, 10 ml) között megosztjuk. A szerves fázist vízmentes nátrium-szulfát felett szárítjuk, szüljük és szárazra pároljuk. A nyersterméket 2 g szilikagélen végzett kromatografálással tisztítjuk; eluálószerként előbb 10 ml 32:67:1 arányú etil-acetát/diklór-metán/trietil-amin elegyet, majd 25 ml 3:97 arányú metanol/diklór-metán elegyet alkalmazunk. Halványsárga hab alakjában 138 mg 5’-O-DMT-N6bisz-orto-nitrobenzil-2 ’-deoxiadenozin-3 ’-O-szukcinátot kapunk, kitermelés 99,5%.
3. lépés: CPG-származék előállítása
Savval mosott LCAA-CPG-t az 1. példában leírt módon készítünk. A módosított nukleozid közbenső terméknek a savval mosott CPG-hez történő kapcsolását a következőképpen végezzük el: 37 mg (0,04 mmol) 5’-O-DMT-N6-bisz-orto-nitrobenzi 1-2 ’ -deoxiadenozin-3 ’ -O-szukcinátot borostyánszínű üvegedényben 16 ml TEA-val kezelünk és bepároljuk. A maradékhoz 1,5 ml piridint, 2 pl TEA-t, 2,4 mg DMAP-t, 76 mg (0,04 mmol) EDC-t és 200 mg savval mosott LCAA-CPG-t adunk. A reakcióelegyet szobahőmérsékleten orbitális keverőberendezésben 3 napon át rázatjuk. A CPG-t vákuumban szűrjük, előbb izopropanollal, majd metilén-kloriddal bőségesen mossuk, levegőn szárítjuk és vákuumban 1 órán át szárítjuk.
A CPG-származék befogását az 1. példában leírt módon végezzük el.
5. példa
Amplifikálások módosított primerek felhasználásával - módosított nukleotid helyzetének hatása A módosított primereknek a primer dlmer képződésre kifejtett hatásának igazolása céljából módosított és módosítatlan primerek felhasználásával HIV-1RNS-amplifikációkat végzünk el. Ezenkívül, a módosított nukleotid helyzetének a primerdimer-képződés csökkentésére kifejtett hatásának vizsgálata céljából, amplifikációkat végzünk három különböző felfelé irányuló (upstream) módosított primer felhasználásával, amelyek egymástól csak a módosított bázis helyzetében különböznek.
Targetnukleinsav
HIV-l-RNS-templátokat HIV-1-RNS transzkripciós vektor felhasználásával szintetizálunk, lényegében az alábbi irodalmi helyen leírtak szerint: Mulder et al., J. Clin. Microbiol. 32 (2): 292-300, (1994).
Primerek
Az amplifikációkat módosítatlan és módosított primerek felhasználásával végezzük el. A módosítatlan primerek nukleotidszekvenciáját az alábbiakban mutatjuk be, 5’->3’ irányban feltüntetett orientációban. A RAR 1032MB (SEQ ID NO.: 1) felfelé irányuló (upstream) primer és a RAR 1033MB (SEQ ID NO.: 2) lefelé irányuló (downstream) primer a HXB2 HIV-1 referenciatörzs (GenBank-szám K03455) szekvenciája 2956-3130 nukleotid helyzetének megfelelő 175 bázispár terméket amplifikál.
PllV-1 -amplifikáció-primerek
| Primer | Seq. ID NO. | Szekvencia |
| RAR1032MB | 1 | CAATGAGACACCAGGAATTAGATATCAGTACAA |
| RAR1033MB | 2 | CCCTAAATCAGATCCTACATATAAGTCATCCA |
HU 223 669 Β1
A fenti primermegjelölések a módosítatlan primerekre vonatkoznak. A módosítatlan primereket az 5’végén biotinilezzük. A módosított primereket az 1. példában leírt módon szintetizáljuk; ezek a módosítatlan primerekkel azonos nukleotidszekvenciákból állnak, azonban a 3’-terminális helyzetben vagy a 3’ terminustól egy vagy három nukleotidra felfelé irányuló (upstream) helyzetben egy benzilezett adenozint tartalmaznak. A primerek módosított formáinak jelölését az alábbiakban adjuk meg.
Módosított HÍV-1-amplifikáció-primerek
| Primer | Seq ld. NO. | Módosított nukleotid helyzete |
| RAR 103 2MB A1 | 1 | 3’ terminus |
| RAR 103 2MB A2 | 1 | 1 3’ terminustól |
| RAR1032MBA4 | 1 | 3 3’ terminustól |
| RAR1033MBA1 | 2 | 3’ terminus |
Amplifikáció
Az amplifikációt az alábbi reagenseket tartalmazó 100 pl reakcióelegyekben végezzük el:
100 HIV-templát RNS-kópia;
mM tricin (pH 8,33);
llOmMKQAc;
300-300 μΜ dATP, dCTP és dGTP;
μΜ dTTP;
500 μΜ dUTP;
μΜ mindegyik primer;
3,5 mM Mn(OAc)2;
13% glicerin;
egység Z05 DNS-polimeráz*; és 2,0 egység UNG**.
* lásd 5 455 710 számú USA-szabadalom;
** gyártó cs kifejlesztő cég Hoffmann-La Roche, forgalmazó Perkin-Elmer Norwalk CT.
Az amplifikációs hőmérsékletciklust TC480 DNS termikus ciklizátorban (Perkin-Elmer Norwalk CT) az alábbi hőmérsékletprofil felhasználásával végezzük el:
Reakció előtti inkubálás 45 °C, 4 percen át Fordított transzkripció 60 °C, 20 percen át 46 ciklus denaturálás 94 °C, 45 mp-en át kapcsolás/kiterjesztés 60 °Con 45 mp-en át
Végső kiterjesztés 60 °C 7 percen át
Reakció után 10 °C analízisig (rövid időn át)
Amplifikált termék kimutatása
Az amplifikált termék jelenlétét gélelektroforézissel a következőképpen mutatjuk ki. A reakciótermékeket agarózgél (100 ml 3%-os NuSieve és 0,5% SeaChem) és lxTBE (0,089 M Tris, 0,089 M bórsav 0,0025 M dinátrium-EDTA) felhasználásával frakcionáljuk. Mozgó puffért alkalmazunk. A jelen levő DNS megfestésére etidium-bromidot használunk (0,5 pg/ml). Az elektroforézist 100 volt mellett kb. 1 órán át végezzük. Az etidium-bromiddal megfestett DNS-sávokat UVbesugárzással tesszük láthatóvá.
Eredmények
A gélelektroforetikus analízis eredményeit az 1. ábrán tüntetjük fel. A módosítatlan és módosított primerek kombinációit felhasználó amplifikációknak megfelelő pályaszámokat az alábbi táblázatban tüntetjük fel. A kívánt HIV-terméknek megfelelő sávokat az ábrán nyíllal jelöljük. A gélben levő többi sáv a nem specifikus amplifikációs terméknek és - különösen - a primer dimemek felel meg.
| Primerek | Pálya száma | |
| Upstream | Downstream | |
| RAR1032MB | RAR1033MB | 1. |
| RAR1032MBA1 | RAR 1033MB | 2. |
| RAR 1032MB A2 | RAR1033MB | 3. |
| RAR 1032MB A4 | RAR 1033MB | 4. |
| RAR 1032MB | RAR1O33MBA1 | 5. |
| RAR1032MBA1 | RAR1033MBA1 | 6. |
| RAR1032MBA2 | RAR1033MBA1 | 7. |
| 1 RAR 1032MB A4 | RAR1033MBA1 | 8. |
Mivel a primer dimer képződése a kívánt amplifikációs termék keletkezésével versenyez, a primer dimer csökkenése a kívánt termék képződésének egyidejű növekedésével jár együtt. A találmányunk szerinti módosított primerek hatása abból látható, hogy a találmányunk szerinti módszer esetében keletkező primer dimer mennyiségét a módosítatlan primerek felhasználása esetén keletkező primer dimer mennyiségével összehasonlítjuk, valamint a kívánt target keletkező mennyiségét a módosítatlan primer felhasználása esetén kapott kívánt target mennyiségével hasonlítjuk össze.
A két módosítatlan primer felhasználásával kapott eredményeket (1. pálya) az egyetlen 3’ módosított primerrel (2. és 5. pálya) és két 3’ módosított printerrel (6. pálya) nyert eredményekkel összehasonlítva azt találtuk, hogy egy vagy két módosított primer felhasználása esetén a primer dimer csökken. Egyetlen 3’ módosított primer felhasználásával végzett amplifikációk esetén a primer dimer csökkenésében kis különbség mutatkozik, amely a módosított printertől függ. Két módosított primer (6. pálya) felhasználása esetén a primer dimer mennyisége a legnagyobb mértékben csökken és az amplifikált targetszekvencia mennyiségének kimutatott mennyisége a legnagyobb mértékben nőtt.
A módosított nukleotid helyzetének hatása a 6-8. pálya összehasonlításából látható. A 3’-terminális nukleotiddal szomszédos nukleotidon módosított primer felhasználása esetén (7. pálya) a primer dimer csökkenése a 3’-terminális nukleotidon módosított primer (6. pálya) felhasználásakor kapott eredménnyel egyenértékű.
A 3’-terminális nukleotidhoz viszonyítva upstream 3 bázissal elhelyezkedő nukleotidon módosított primer esetében (8. pálya) a javulás valamivel kisebb.
HU 223 669 Β1
6. példa
Módosított primerekkel végzett további amplifikációk - módosított nukleotid helyzetének hatása
A módosított printernek a primer dimer képződésre kifejtett hatásának további igazolása céljából módosított primerek és módosítatlan primerek felhasználásával HCV-RNS-amplifikációkat végzünk, lényegében a fentiekben leírt módon. Az amplifikációkat három különbözőképpen módosított lefelé irányuló (downstream) primer felhasználásával végezzük el, amelyek egymástól csak a módosított bázis helyzetében különböznek.
Targetnukleinsav
HCV-RNS-templátokat szintetizálunk, HCVRNS-transzkriptor vektor felhasználásával [Young et al., J. Clin. Microbiol. 31 (4): 882-886 (1993)].
Primerek
Az amplifikációkat módosítatlan és módosított primerek felhasználásával végezzük el. A módosítatlan primerek nukleotidszekvenciáit az alábbiakban mutatjuk be, 5’—>3’ irányban orientálva. Az ST280A (SEQ ID NO.:
3) felfelé irányuló (upstream) primer és az ST778AA (SEQ ID NO.: 4) lefelé irányuló (downstream) primer egy 240 bázispár terméket a HCV-genom 5’ le nem fordított tartományától amplifikál.
HC V-ampl ifikáció-prim erek
| Primer | Seq ld NO. | Nukleotodszekvencia |
| ST280A | 3 | GCAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTA |
| ST778AA | 4 | GCAAGCACCCTATCAGGCAGTACCACAA |
A fenti primermegjelölések a módosítatlan primerekre vonatkoznak. Az 1. példában leírt módon szintetizált módosított primerek ugyanazokból a nukleotidszekvenciákból állnak, mint a módosítatlan primerek, azonban a 3’-terminális helyzetben vagy a 3’ terminustól felfelé irányuló (upstream) egy vagy három nukleotid helyzetében benzilezett adenozint tartalmaznak. A primerek módosított formáinak jelölése a következő:
Módosított HCV-amplifikációs primerek
| Primer | Seq ld. NO. | Módosított nukleotid helyzete |
| ST280ABA1 | 3 | 3’ terminus |
| ST778AABA1 | 4 | 3 ’ terminus |
| ST778AABA2 | 4 | 3 ’ terminustól 1 |
| ST778AABA4 | 4 | 3 ’ terminustól 1 |
Amplifikáció és analízis
Az amplifikációkat lényegében az 5. példában leírt módon végezzük el, azonban a HCV-RNS-templát 100 kópiáját használjuk. Az amplifikált termék gélanalízisét az, 5. példában leírt módon végezzük el.
Eredmények
A gélelektroforézis-analízis eredményeit a 2. ábrán tüntetjük fel. A módosítatlan és módosított primerek kombinációinak felhasználásával kapott amplifikációknak megfelelő pályaszámokat az alábbi táblázatban tüntetjük fel.
A kívánt HCV-terméknek megfelelő sávokat az ábrán nyíllal jelöljük. A gélben levő többi sáv a nem specifikus amplifikációs terméknek és - különösen - a primer terméknek felel meg.
| Primerek | Pálya száma | |
| Upstream | Downstream | |
| ST280A | ST778AA | 1. |
| ST280A | ST778AABA1 | 2. |
| Primerek | Pálya száma | |
| Upstream | Downstream | |
| ST280A | ST778AABA2 | 3. |
| ST280ABA | ST778AABA4 | 4. |
| ST280ABA1 | ST778AA | 5. |
| ST280ABA1 | ST778AABA1 | 6. |
| ST280ABA1 | ST778AABA2 | 7. |
| ST280ABA1 | ST778AABA4 | 8. |
Minthogy a primer dimer képződése a kívánt amplifikációs termék képződésével versenyez, a primer dimer mennyiségének csökkenése általában a kívánt ter55 mék képződő mennyiségének növekedésével jár együtt. Ennek megfelelően a találmány szerinti módosított primerek hatása oly módon igazolható, hogy egyrészről összehasonlítjuk a képződő primer dimer mennyiségét a módosítatlan primerek felhasználásakor képződő primerdimer-mennyiséggel, másrészről a kí13
HU 223 669 Bl vánt target képződő mennyiségét a módosítatlan primer alkalmazásakor keletkező target mennyiségével hasonlítjuk össze.
A kapott eredmények az előző példában leírt HIVamplifikációk megfelelő értékeihez hasonlóak, azonban HCV-amplifikációk esetében a kívánt termék mennyiségének növekedése nyilvánvalóbb, mint HlV-amplifikációk során. Két módosítatlan primer felhasználásakor kapott eredményeket (1. pálya) egyetlen 3’ módosított primer (2. és 5. pálya) és két 3’ módosított primer (6. pálya) alkalmazásakor nyert eredményekkel összehasonlítva kitűnik, hogy egy vagy két módosított primer felhasználásakor a primer dimer mennyisége egyaránt csökken. Két módosított primer felhasználásakor (6. pálya) a primer dimer mennyiségének csökkenése a legnagyobb mértékű, és ezzel egyidejűleg az amplifikált targetszekvencia mennyisége szignifikánsan emelkedik. Az előző példához hasonlóan egyetlen 3’ módosított primer felhasználásával végzett amplifíkációk során a primer dimer mennyiségének csökkenésében kis különbség mutatkozik, amely a módosított primertől függ.
A módosított nukleotidok helyzetének hatása a 6-8. pálya összehasonlításából látható. A 3’ terminális nukleotidon (6. pálya), a 3’ terminális nukleotiddal szomszédos nukleotidon (7. pálya) és a 3’ terminális nukleotidtól 3 bázissal felfelé irányuló (upstream) nukleotidon (8. pálya) módosított primerek felhasználásakor lényegében egyenértékű eredményeket kapunk. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a módosítócsoport a primer 3’-végén levő négy nukleotid bármelyikéhez kapcsolódhat.
7. példa
Módosított printerekkel végzett amplifíkációk módositócsoport hatása
A módosított primereknek a primerdimerképződésre kifejtett hatásának további igazolása és alternatív primermódosítások bemutatása céljából módosított primerek és módosítatlan primerek felhasználásával HCV-RNS-amplifikációkat végzünk el, amelyek során a primereket az alábbi három különböző módosítócsoport bevitelével módosítjuk: benzil-, nitrobenzilés metilcsoport.
Az amplifikációs eredményeket két különböző módszerrel analizáljuk. Az egyik összehasonlító módszer szerint primer dimerek jelenlétét a reakciótermékek gélelektroforézis-analízisével vizsgáljuk. A másik összehasonlítás értelmében a primer dimer képződését az amplifikáció alatt a fentiekben leírt kinetikus PCR-módszerek alkalmazásával követjük nyomon.
Targetnukleinsav
HCV-RNS-templátokat a Young et al., J. Clin. Microbiol. 31 (4): 882-886 (1993) irodalmi helyen leírtak szerint, HCV-RNS transzkripciós vektor felhasználásával szintetizálunk.
Amplifikációs primerek
Az amplifikációkat módosítatlan és módosított primerek felhasználásával végezzük el. A módosított primerek nukleotidszekvenciája megegyezik a módosítatlan primerekével, azonban a módosított primerek a 3’terminális adenozinon egy metilcsoport, benzilcsoport vagy nitro-benzil-csoport beépítésével módosítva vannak. A primereket az előző példákban leírt módon szintetizáljuk. A primerek jelölését az alábbiakban ismertetjük:
| Primer | Seq Id. NO. | 3’ bázis módosítása |
| ST280A | 3 | módosítatlan |
| ST280AMEA1 | 3 | metil |
| ST280ABA1 | 3 | benzil |
| ST280ANBA1 | 3 | nitrobenzil |
| ST778AA | 4 | módosítatlan |
| ST778AAMEA | 4 | metil |
| ST778AABA1 | 4 | benzil |
| ST778AANBA1 | 4 | nitrobenzil |
Amplifikációs reakciók
Az amplifikációkat az alábbi reagenseket tartalmazó reakcióelegyekben (100 μΐ) végezzük el.
0,20 vagy 200 HCV-RNS-templát-kópia;
mM tricin pH 8,3;
110 mM KOAc;
3,5 mM Mn(0Ac)2;
300-300 μΜ dATP, dCTP és dGTP;
μΜ dTTP;
500 μΜ dUTP;
250 nM mindegyik primerből;
UrTth*;
egység UNG*;
13% glicerin.
* gyártó és kifejlesztő cég Hoffmann-La Roche; forgalmazó Perkin-Elmer Norwalk CT.
Az egyes reakcióelegyek termikus ciklusait GeneAmp® PCR System 9600 termikus ciklizátorban (Perkin-Elmer Norwalk CT), az alábbi hőmérsékletprofil felhasználásával hajtjuk végre:
Reakció előtti inkubálás 45 °C, 4 percen át Fordított transzkripció 60 °C, 24 percen át 46 ciklus denaturálás 94 °C, 30 mp-en át kapcsolás/kiterjesztés 60 °Con 30 mp-en át
Végső kiterjesztés 60 °C 7 percen át
Reakció után 4 °C.
Amplifikált termék kimutatása
A) Gélelektroforézis
Az amplifikált termék jelenlétét gélelektroforézissel a következőképpen mutatjuk ki. A reakciótermékeket agarózgél (100 ml 3% NuSieve, 0,5% SeaChem és 0,5 pg/ml etidium-bromid) és 1 χ TBE (0,089 M Tris, 0,089 M bórsav, 0,0025 M dinátriumEDTA) felhasználásával mozgó pufferben frakcionáljuk. Az elektroforézist 100 volt mellett kb. 1 órán át végezzük. A DNS etidium-bromiddal megfestett sávjait UV-besugárzással tesszük láthatóvá.
B) Kinetikus PCR kimutatása
A fentiekben leírt kinetikus PCR-módszerek során a PCR-hez valamely beépülő színezéket (például etidium-bromid) adunk, amely a kettős szálú DNS-be
HU 223 669 Bl történő beépüléskor erősebben fluoreszkál. A kettős szálú DNS amplifikáció alatt bekövetkező növekedését a reakció alatt bekövetkező színezékfluoreszcencia mérésével követjük nyomon. Mivel a kinetikus PCRmódszerek csak a kettős szálú DNS teljes mennyiségének növekedését mérik, a nem specifikus amplifikációs termék képződése külön nem mérhető. A templát amplifikációtól független primer dimerből származó nem specifikus amplifikáció mérése céljából reakciókat templát nukleinsav nélkül végzünk el. Az ilyen templátmentes reakciók esetében a kettős szálú DNS mindennemű növekedése a templáttól független nem specifikus amplifikációs termék képződésének tulajdonítható.
A fentiekben leírt kinetikus PCR-reakció-körülményeket alkalmazzuk, azzal a változtatással, hogy az etidium-bromidot 1 pg/ml koncentrációban adjuk a reakcióelegyhez. A reakciókat a reakcióelegy fluoreszcenciájának mérésével, a 640 828 számú európai szabadalmi leírásban foglaltak szerint követjük nyomon.
A fluoreszcencia mérését oly módon normalizáljuk, hogy a reakció kezdeti szakaszában levő ciklusban kapott kezdeti fluoreszcenciaméréssel elosztjuk, míg a fluoreszcenciamérések a ciklusok között viszonylag konstansok. Valamennyi összehasonlított reakciónál a kezdeti fluoreszcencia méréséhez ugyanazt a ciklusszámot választjuk meg, így valamennyi mérés ugyanahhoz a reakcióciklushoz viszonyított növekedést fejezi ki. A targetmentes reakcióknál a reakciófluoreszcencia a primer dimer képződéséig viszonylag konstans marad. A legtöbb reakció esetében elegendő amplifikációs ciklus elvégzésekor a primer dimer végül kimutathatóvá válik. A módosított primerek hatását oly módon igazoljuk, hogy a primer dimer adott esetben történő képződéséig elvégzett ciklusok számát összehasonlítjuk.
Eredmények
A gélelektroforézis-analízis eredményeit a 3. ábrán tüntetjük fel. A pályaszámok a módosítatlan primer és három módosított primertípus felhasználásával végzett amplifikációk mindegyikének felelnek meg; az alábbi táblázatban a HCV RNS 200 kópiáját, 20 kópiáját vagy 0 kópiáját tüntetjük fel (a pályaszámok balról jobbra emelkednek: az 1-30. pálya a gél felső felére és a 31-60. pálya a gél alsó felére vonatkozik). Ezenkívül az 1. és 31. pályában (Hae III által emésztett PhiX 174 RF DNS, New England Bioloabs, Beverly, MS) és a 30. és 60. pályában (Superladder-low, 20 bp ladder Gén Sura, Del Mar, CA) molekulatömeg-markerek vannak jelen. A kívánt specifikus terméknek megfelelő sávokat az ábrán nyíllal jelöljük (~ 230 bp). A gélben levő többi sáv nem specifikus amplifikációs terméknek és - különösen - a primer dimemek felel meg.
A 3. ábrán feltüntetett amplifikációs eredmények pályaszámai
| Tcmplátok | Primerek | Pályák |
| 200 | módosítatlan | 2-5. |
| 200 | metilezett | 6-9. |
| 200 | benzilezett | 10-13. |
| Tempiátok | Primerek | Pályák |
| 200 | nitrobenzilett | 14-17. |
| 20 | módosítatlan | 18-21. |
| 20 | metilezett | 22-25. |
| 20 | benzilezett | 26-29. |
| 20 | nitrobenzilezett | 32-35. |
| 0 | módosítatlan | 36-41. |
| 0 | metilezett | 42-47. |
| 0 | benzilezett | 48-53. |
| 0 | nitrobenzilezett | 54-59. |
Az eredmények azt mutatják, hogy módosított primerek felhasználásával végzett amplifikációk nagyobb mennyiségű amplifikált HCV-nukleinsavat eredményeznek, mint a módosítatlan primerek alkalmazásával végrehajtott amplifikációk. Ezenkívül a módosított primerek felhasználásával végzett amplifikációk esetében a primer dimer mennyisége a módosítatlan primerek alkalmazásával végrehajtott amplifikációkhoz viszonyítva csökken.
A kinetikus PCR-teszt során a fluoreszcenciát a reakció folyamán nyomon követjük. Kimutatható fluoreszcencia jelentkezése után a fluoreszcencia növekedésének mértéke hozzávetőlegesen valamennyi reakciónál azonos, amit a fluoreszcencia ciklusszám függvényében történő ábrázolásával nyert görbe alakja igazol (nem mutatjuk be). Ez azt jelzi, hogy a módosított primerek az amplifikáció kezdeti szakasza után az egyes amplifikációs lépések hatékonyságát kimutathatóan nem gátolják. A reakciók a fluoreszcencia kimutatható növekedése előtt végrehajtott ciklusok számában szignifikánsan különböznek.
A reakciók közötti eltérések mennyiségi meghatározása céljából az eredményeket egy önkényesen megválasztott fluoreszcenciaszintet (AFL) meghaladó fluoreszcencia kialakulásáig elvégzett amplifikációs ciklusok számával fejezzük ki. Az AFL-értéket oly módon választjuk meg, hogy az alapvonal fluoreszcenciaszint közelében legyen, azonban a mért fluoreszcenciában fellépő véletlenszerű fluktuációk tartománya fölött helyezkedjék el, és ily módon a reakciókinetikát az amplifikáció geometriai növekedési fázisaiban mérjük.
Az amplifikált termék felhalmozódása a későbbi ciklusokban a reakciót gátolja és végül reakcióplató kialakulásához vezet.
A kinetikus PCR-eredményeket az alábbi táblázatban foglaljuk össze. A targettemplát 20 vagy 200 kópiájának amplifikációira megadott valamennyi érték 5 amplifikációismétlés átlagát képezi, kivéve a benzilezett primerek és 20 targetkópia felhasználásával végzett amplifikációkat, amelyek esetében 4 amplifikációismétlés átlagértékét adjuk meg. A templát nélkül végzett amplifikációk esetében az egyes értékek 8 ismétlés átlagát képezik.
Benzilezett primerrel, jelen levő target nélkül végzett amplifikációk esetében nyolc párhuzamos amplifikáció közül kettőben 46 ciklus végén primer dimer nem képződik. A többi hat amplifikáció átlagát az alábbiakban mutatjuk be, az eredmények a képződő primer di15
HU 223 669 Bl mer kondicionált átlagának felel meg. A kondicionált átlag a törölt adatok miatt a többi értékkel nem hasonlítható össze.
AFL eléréséhez szükséges ciklusok Targetkópiaszám
| Primer | 0 | 20 | 200 |
| Módosítatlan | 35 | 36 | 34 |
| Metil | 39 | 38 | 36 |
| Nitrobenzil | 43 | 40 | 37 |
| Benzil | (43*) | 41 | 37 |
* 2/8 primerdimer-képződést nem mutat.
Az eredmények azt jelzik, hogy a módosított primerek a targetnukleinsav amplifikációját nyilvánvalóan késleltetik, és ezáltal az AFL-t néhány ciklussal később érjük el. Ez a késleltetés nem felel meg a specifikus amplifikációs termék végső kitermeléscsökkenésének. A kísérlet során használt 46 cikluson belül valamennyi targetnukleinsav amplifikációplatót ér el, amelyet a gélelektroforézis-analízis megfelelő adatai bizonyítanak; módosított primerek felhasználása esetén a végső kitermelés emelkedik.
Az eredmények azt mutatják, hogy a primer dimer képződésének késleltetése lényegesen nagyobb, mint a target amplifikációjának késleltetése. A primerek kedvező hatása targetmentes amplifikációk és 200 templátkópia-amplifikáció összehasonlításából világosan kitűnik. Módosítatlan primerek felhasználásakor a fluoreszcenciának az AFL-hez viszonyított növekedése target nélkül végzett amplifikációk esetében csak egy ciklussal később jelentkezik, ami azt jelzi, hogy a targetamplifikáció a primerdimer-képződéstől nehezen különböztethető meg. Ezzel szemben módosított primerek felhasználásakor a primer dimer következtében fellépő fluoreszcencianövekedés legalább 3 ciklussal később jelentkezik és benzilezett primerek felhasználásakor legalább 6 ciklussal később lép fel, ha egyáltalán jelentkezik. így tehát a targetamplifikáció kimutatható és a primerdimer-képződéstől megkülönböztethető.
Targetmentes amplifikációk és 20 templátkópia amplifikációinak összehasonlítása során a módosított primerek a primerdimer-képződést erősebben késleltetik, mint a targetamplifikációt. Módosítatlan primerek felhasználása esetén 20 templátkópia nem volt kimutatható. Nitrobenzil- és benzilprimerek felhasználása esetén a primerdimer-képződés kellőképpen késleltetett ahhoz, hogy ebben a rendszerben 20 templátkópia kimutatható legyen.
Az egyes amplifikációs ciklusoknál fellépő fluoreszcencia nyomon követése (az adatokat nem tüntetjük fel) azt mutatja, hogy a primerdimer-képződés késleltetése általában elegendő ahhoz, hogy a primerdimer-képződést a platószint elérésében 46 cikluson belül megakadályozza. így tehát a módosított primerek a primerdimer-képződést elegendő mértékben késleltetik ahhoz, hogy a targetamplifikáció teljessé váljék, és a reakció szignifikáns primerdimer-szint kialakulása előtt leállítható legyen.
8. példa
Fotolabilis primerek
Fotolabilis módosított primerek felhasználásának bemutatása céljából HCV-RNS-amplifikációkat módosított és módosítatlan primerek felhasználásával végzünk el. A módosított primerek esetében a módosítást oly módon végezzük el, hogy a 3’-terminális adenin exiciklikus aminjához egy vagy két nitrobenzilcsoportot kapcsolunk.
Amplifikációs primerek
A primereket a 4. példában leírtak szerint szintetizáljuk. A felhasznált primerek jelölését az alábbiakban tüntetjük fel.
| Primer | Scq Id. NO. | 3 ’ bázis módosítása |
| ST280A | 3 | módosítatlan |
| 15 239 | 3 | bisznitrobenzil |
| 15 241 | 3 | mononitrobenzil |
| ST778AA | 4 | módosítatlan | |
| 15 240 | 4 | bisznitrobenzil |
| 15 242 | 4 | mononitrobenzil |
Amplifikációs reakciók
Minden primerpár esetében a reakciót input targetkoncentráció hígítássorozatának felhasználásával végezzük el. Két reakciósorozatot hajtunk végre, mindegyikben a primerpár és input targetkoncentráció összes kombinációját felhasználva. Az egyes reakciósorozatokon belül egy adott primerpárt és targetkoncentrációt tartalmazó minden reakciót két ismétlésben hajtunk végre. Az amplifikációkat az alábbi reagenseket tartalmazó reakcióelegyekben (100 pl) végezzük el.
0, 10, 102, 104vagy 105 HCV-RNS-templát-kópia; 55 mM tricin;
mM KOAc;
mM Mn(0Ac)2;
200-200 μΜ dATP, dCTP, dGTP dTTP;
200 μΜ dUTP;
250-250 nM mindegyik primerből; lOUrTth*;
U UNG*; és 8% glicerin.
* gyártó és kifejlesztő cég Hoffmann-La Roche; forgalmazó Pcrkin-Elmer Norwalk CT.
Az egyes reakcioelegyek termikus ciklusait GeneAmp PCR System 9600 termikus ciklizátor (Perkin-Elmer, Norwalk, CT) segítségével az alábbi hőmérsékletprofil felhasználásával végezzük el.
Reakció előtti inkubálás 50 °C, 5 percen át
Fordított transzkripció Kezdeti denaturálás 2 ciklus ciklus
Végső kiterjesztés °C, 30 percen át 95 °C, 1 percen át denaturálás 95 °C, 15 mp-en át kapcsolás/kiterjesztés 60 °Con 20 mp-en át denaturálás 95 °C, 15 mp-en át kapcsolás/kiterjesztés 60 °Con 20 mp-en át °C 10 percen át.
HU 223 669 Bl
Csiszolt reakciócsősapkákat (Perkin-Elmer Norwalk CT) alkalmazunk. Miután a reakció-hőmérséklet a fordított transzkripciós lépésnél a 60 °C-ot elérte, a melegített fedőt a termikus ciklizátor blokkjában levő PCR-tárcáról eltávolítjuk és a reakciócsövek felét (a két ismétlésben végzett reakciók esetében egy teljes készlet) alumíniumfóliával borítjuk. A reakciócsövek másik felét 10 percen át 302 nm kibocsájtású kézi UVlámpával (UVP modell UVM-57, UVP Products, San Gábriel, CA) 10 percen át megvilágítjuk. A melegített fedőt visszahelyezzük és az amplifikációt folytatjuk.
Eredmények
Az amplifikációk eredményeit gélelektroforézissel a fentiekben leírt módon elemezzük. Az eredményeket a 4. ábrán tüntetjük fel. Az egyes reakcióknál felhasznált primereket és a templátkópiaszámot a gélben feltüntetjük (bemutatott másolatszám logaritmusa). A kívánt terméknek megfelelő sávokat az ábrán feltüntetjük. A gélben levő többi sáv nem specifikus amplifikációs terméknek - különösen primer dimer - felel meg.
Az UV-besugárzott reakciók összehasonlítása azt mutatja, hogy módosított primerek felhasználása a primer dimer szignifikáns csökkenését eredményezi, különösen alacsony kópiaszám mellett.
A nem besugárzott reakciók összehasonlítása azt mutatja, hogy bisznitrobenzilprimerek felhasználása mint az várható volt - az amplifikáció teljes gátlását eredményezi. Mononitrobenzilprimerek felhasználásával végzett amplifikációk esetében nem csupán termék keletkezik, hanem a primer dimer szignifikánsan csökken; ez a megállapítás az előző példában kapott eredményekkel összhangban van.
9. példa
Amplifikációk p-tercier butil-benzil módosított primerek felhasználásával
Ebben a példában p-tercier butil-benzil-csoporttal módosított HCV-RNS-amplifikációt ismertetünk.
Targetnukleinsav
HCV-RNS-templátokat a (Young et al., J. Clin. Microbiol. 31 (4): 882-886 (1993) irodalmi helyen leírtak szerint HCV-RNS transzkripciós vektor felhasználásával szintetizálunk.
Primerek
Az amplifikációkat a 2. példában leírt módon szintetizált módosított primerek felhasználásával végezzük el. A módosítatlan primer nukleotidszekvenciáját az alábbiakban mutatjuk be, 5’-+3’ irányban orientálva. Primerként felfelé irányuló (upstream) ST280A (SEQ ID NO.: 3) primer és lefelé irányuló (downstream) ST778AA (SEQ ID NO.: 4) primer módosított változatait alkalmazzuk. A primerek módosított formáinak jelölését az alábbiakban közöljük.
Módosított HC V-amplifikációs primerek
| Primer | Seq Id. NO. | Módosított nukleotid helyzete |
| ST280ATBU | 3 | 3’ terminus |
| ST778AATBU | 4 | 3’ terminus |
Amplifikáció és analízis
Az amplifikációkat az alábbi reagenseket tartalmazó reakcióelegyekben (100 pl) végezzük el.
HCV-templát RNS 20, 5, 2,5, 2 vagy 0 kópia;
mM tricin (pH 8,33); llOmM KOAc;
300-300 μΜ dATP, dCTP és dGTP;
μΜ dTTP;
500 μΜ dUTP;
50-50 nM mindegyik primerből;
3,5 mM Mn(OAc)2;
13% glicerin;
egység rTth DNS-polimeráz; és
8,0 egység UNG*.
* gyártó és kifejlesztő cég Hoffmann-La Roche; forgalmazó Perkin-Elmcr Norwalk CT.
ciklus
Teljes kiterjesztés Reakció után
Az amplifikációs hőmérsékletciklusokat (TC480 DNS termikus ciklizátorban, (Perkin-Elmer Norwalk CT) az alábbi hőmérsékletprofil felhasználásával végezzük el:
Reakció előtti inkubálás 45 °C, 12 percen át UNG inaktiválás 90 °C, 30 mp-en át Fordított transzkripció 60 °C, 20 percen át denaturálás 94 °C, 45 mp-en át kapcsolás/kiterjesztés 60 °Con 70 mp-en át 60 °C, 7 percen át 10 °C az analízis elvégzéséig, (rövid ideig).
Az amplifikációs termékeket a fentiekben leírt módon gélelektroforézissel analizáljuk.
Eredmények
Az amplifikációkat minden targettemplátszám esetében a következőképpen végezzük el: 3 amplifikációt 20 targettemplát-kópia felhasználásával végzünk el; 3 amplifikációt 5 targettemplát-kópia felhasználásával hajtunk végre; 2 amplifikációt 2,5 targettemplát-kópia felhasználásával végzünk el; 1 amplifikációt 2 targettemplát-kópia felhasználásával hajtunk végre; és 23 amplifikációt target nélkül végzünk el. Valamennyi templát-pozitívamplifikáció a gélen a várt targetnagyság egyetlen sávját eredményezi. Primer dimert vagy más nem specifikus amplifikációs terméket egyetlen amplifikáció sem eredményez.
Az eredményeket a 6. példa szerint kapottakkal hasonlíthatjuk össze, amikor is ugyanezt a HCV-targetet amplifikáltuk, ugyanezen primerszekvenciák felhasználásával. A jelen példa eredményeinek a 6. példa szerint nyert értékekkel történő összehasonlítása azt mutatja, hogy a p-tercier butil-benzil-módosított primerek felhasználásával végzett amplifikációk a megfelelő, azonban módosítatlan primer felhasználásával végrehajtott amplifikációkhoz viszonyítva szignifikánsan jobb eredményeket adnak.
További kísérleteket végzünk el, amelyek során HIV-l-RNS-t az 5. példában leírt p-tercier butil-benzil-módosított primerek felhasználásával ampliflkálunk. Az amplifikációkat lényegében a fentiek szerint végezzük el. A HCV-rendszerhez hasonlóan valamennyi HÍV-1 -templát a gélen a várt targetnagyság
HU 223 669 Bl egyetlen sávját eredményezi, míg primer dimert vagy más nem specifikus amplifikációs terméket egyetlen amplifikációban sem kapunk.
A fenti eredményeket az 5. példa szerint nyert értékekkel összehasonlíthatjuk, amelynek során ugyanezt a HIV-targetet ugyanezen primerszekvenciák felhasználásával amplifikáltuk. A jelen példa és az 5. példa eredményeinek összehasonlítása igazolja, hogy p-tercier butil-benzil-módosított primerek felhasználásával végzett amplifikációk során a megfelelő módosítatlan primer alkalmazásával végrehajtott amplifikációkkal összehasonlítva szignifikánsan jobb eredményeket kapunk.
10. példa
Mikobakteriális DNS amplifikációja
Ebben a példában módosítatlan és módosított primerek felhasználásával végzett mikobakteriális DNSamplifikációkat hasonlítunk össze. A 3’-terminális nukleotidon benzilcsoport beépítésével módosított primereket és a 3’-terminális nukleotidon p-tercier butil-benzil-csoport beépítésével módosított primereket alkalmazunk. A módosítatlan primerek felhasználásával végzett reakciók lényegében az alábbi irodalmi helyen kerültek ismertetésre: [Tevere et al., J. Clin. Microbiol 34 (4): 918-923 (1996)]. Az amplifikációkat olyan köpetminták felhasználásával végezzük el, amelyekhez fertőzött klinikai minták utánzása céljából ismert koncentrációban mikobakteriális DNS-t adtunk. Tisztított mikobakteriális DNS és DNS-mentes negatív kontrollminták felhasználásával további amplifikációkat hajtunk végre.
Minták készítése
Mikroszkopikus vizsgálat és tenyésztés által korábban mikobaktériumra negatívnak talált köpetmintákat elfolyósítunk és N-acetil-cisztein-NaOH-módszerrel a
CDC ajánlása szerinti módon megfertőzünk (Kent and Kubica, 1985, Public Health Mycobacteriology - a guide fór the level III laboratory, U.S. Department of Health and Humán Services, Centers fór Disease Control, Atlanta; hivatkozásként a jelen szabadalmi le10 írás részét képezi). 500 μΐ mosóreagenshez (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 1% (v/v) Triton X-100, 0,05% NaN3, pH 8,0) elfolyósított köpetet (100 μΐ) adunk, és 10 percen át 12 500 xg mellett centrifugáljuk. Minden pelletet 100 μΐ lizisreagensben (0,05 N NaOH, 1% (v/v)
Triton X-100, 1 mM EDTA, 0,05% NaN3) újraszuszpendálunk és 45 percen át 60 °C-on inkubálunk. A lizátumot 100 μΐ semlegesítőreagenssel (0,2 M Trisz HCI, 8 mM MgCl2, 0,05% NaN3, pH 7,5) semlegesítjük.
Két különböző köpetlizátumból 80-80 μΐ-t kombi20 nálunk. Nyolc összegyűjtött köpetlizátumhoz (160-160 μΐ) 15 μΐ M. tuberculosistenyészetből tisztított DNS-törzsoldatot adunk (2 kópia/μΐ, 1:1 arányú lizis reagens/semlegesítőreagens elegyben).
Tisztított mikobakteriális DNS-t (köpet nélkül) is25 mert koncentrációban tartalmazó mintákat oly módon készítünk, hogy 10 μΐ DNS-törzsoldatot a lizisreagens és semlegesítőreagens 1:1 arányú elegyéhez (100 μΐ) adunk.
Negatív kontrollminták (DNS nélkül) 100 μΐ lizisrea30 gens és 100 μΐ semlegesítőreagens elegyéből állnak. Amplifikációs primerek
Az amplifikációkat az alábbi nukleotidszekvenciákból álló primerek felhasználásával végezzük el.
| Primerek | Szekvencia |
| KY18 (SEQIDNO.: 5) | 5’-CACATGCAAGTCGAACGGAAAGG-3’ |
| KY436 (SEQ ID NO.: 6) | 5’-TAACACATGCAAGTCGAACGGAAA-’3’ |
| KY75 (SEQ ID NO.: 7) | 5’-GCCCGTATCGCCCGCACGCTCACA-5’ |
Az amplifikációkhoz az alábbi primerpárokat alkalmazzuk, amelyek a 3’-terminális bázishoz kapcsolódva a megjelölt módosítócsoportot tartalmazzák. Valamennyi módosított prímért az előző példákban leírtak szerint szintetizálunk. Az összes prímért az 5’-végén biotinilezzük.
| Primerpár | Primerszekvenciák | Módosítás |
| A | KY18 (SEQIDNO.: 5) | módosítatlan |
| KY75 (SEQ ID NO.: 7) | módosítatlan | |
| B | KY436 (SEQIDNO.: 6) | benzil |
| KY75 (SEQ ID NO.: 7) | benzil | |
| C | KY436 (SEQ ID NO.: 6) | p-terc-butil-benzil |
| KY75 (SEQ ID NO.: 7) | p-terc-butil-benzil |
Amplifikáció
Minden minta esetében az amplifikációkat a KY18 (SEQ ID NO.: 5) és KY75 (SEQ ID NO.: 7) módosítatlan primerpár és a KY436 (SEQ ID NO.: 6) és
KY75 (SEQ ID NO.: 7) módosított primerpár felhasználásával végezzük el.
Az amplifikációkat 100 μΐ reakcióelegyekkel hajt60 juk végre. Mindegyik reakcióelegy 50 μΐ, a megadott
HU 223 669 Β1 három minta egyikét és 50 μΐ, az alábbi reagenseket magában foglaló 2 χ reagens elegyet tartalmaz:
100 mM Trisz-HCl, pH 8,9;
500-500 nM mindegyik primerből;
200-200 μΜ dNTP, (dATP, dCTP, dGTP, dUTP); 20% (v/v) glicerin;
egység AmpliTaq*;
egység AmpErase*.
* gyártó és kifejlesztő ccg Hoffmann-La Rochc; forgalmazó Perkin-Elmer Norwalk CT.
Az egyes reakciók termikus ciklusait GeneAmp PCR system 9600 termikus ciklizátorban (Perkin-Elmer Norwalk CT) az alábbi hőmérsékletprofil felhasználásával végezzük el.
Reakció előtti inkubálás 50 °C, 5 percen át 2 ciklus denaturálás 98 °C, 20 mp-en át, kapcsolás 62 °C-on 20 mpen át, kiterjesztés 72 °C-on 45 mp-en át, ciklus denaturálás 94 °C, 20 mp-en át, kapcsolás 62 °C-on 20 mpen át, kiterjesztés 72 °C-on 45 mp-en át,
Végső kiteijesztés 72 °C kb. 12 órán át (1 éjjelen át).
Az amplifikált termékeket 2% Nusieve®, 0,5% agarózgélen végzett elektroforézissel, majd bromidos megfestéssel tesszük láthatóvá.
Eredmények
Az elektroforetikus analízis eredményeit az 5. ábrán tüntetjük fel. Minden minta esetében a módosítatlan primerrel („A”) és a módosított primerekkel („B” és „C”) elvégzett amplifikációkból származó termékeket szomszédos pályákon futtatjuk. A kívánt mikobakteriális targetszekvenciának megfelelő sávokat nyilakkal jelöljük. Más sávok nem specifikus amplifikációs terméknek felelnek meg; a gélben levő legalacsonyabb sávok a primer dimemek felelnek meg. Az „M” jelzésű pályák a molekulatömeg-markert tartalmazzák (PhiX174 DNS Hae III emésztése).
Módosítatlan primerek felhasználása esetén a tisztított mikobakteriális DNS primer dimer képződését eredményezi. Bármely módosított primerpár felhasználása a kívánt target jelen levő mennyiségét növeli és kimutatható mennyiségű primer dimer képződését lényegében kiküszöböli.
Tisztított DNS amplifikációjával ellentétben módosítatlan primerek felhasználása esetén köpetlizátum jelenléte az amplifikációs reakcióelegyben a hatékonyságot csökkenti és a nem specifikus amplifikációs termék képződését növeli; ezt idegen terméksávok jelenléte mutatja. A nem specifikus amplifikációs termék növekedése nem meglepő, mivel a köpetlizátum szignifikáns mennyiségű humán DNS-t tartalmaz, amely tisztított mikobakteriális DNS amplifikációiban nem volt jelen. A köpet jelenlétében elvégzett amplifikációk esetében bármely módosított primerpár felhasználása a képződő kívánt termék mennyiségének szignifikáns emelkedését és a nem specifikus amplifikáció csökkenését egyaránt eredményezi.
11. példa
Benzilcsoporttal módosított primerek további szintézise
A terminális citozinra benzilcsoport beépítésével módosított primereket lényegében az 1. példában leírt módon szintetizálunk, azonban egy LCAA-CPGkötődő N4-acetil-N4-benzil-5’-O-DMT-2’-deoxicitidint alkalmazunk. Ezt a terméket a következőképpen állítjuk elő.
1. lépés: N4-benzil-2’-deoxieitidin szintézise
2’-Deoxi-citidin-hidrokloridhoz (5,28 g, 20 mmol,
U. S. Biochemical Corp., Cleveland, OH) benzil-amint (20 ml) adunk és a reakcióelegyet 150 °C-on 3 órán át argonatmoszférában melegítjük. Az oldatot vákuumban bepároljuk és a visszamaradó viszkózus sárga olajat 100 ml víz és 100 ml etil-acetát között megosztjuk. A vizes fázist 100 ml etil-acetáttal mossuk és elválasztjuk. A vizes fázist vákuumban betöményítjük. A kapott sárga szirupot (13 g) szilikagéloszlopon végzett kromatografálással és 15:1 arányú metilén-klorid/metanol eleggyel végrehajtott eluálással tisztítjuk. Színtelen szirup alakjában 5,8 g cím szerinti vegyületet kapunk, kitermelés 91,5%.
2. lépés: N4-acetil-N4-benzi 1-2’-deoxieitidin szintézise
2,5 g (7,9 mmol) N’-benzil-2’-deoxicitidint 15 ml vízmentes dimetil-formamidban oldunk, és 8 g (79 mmol, 10 ekvivalens) ecetsavanhidridet adunk hozzá. A reakcióelegyet szobahőmérsékleten egy éjjelen át keverjük. Az oldószert és az ecetsavanhidrid fölöslegét vákuumban bepároljuk. A terméket szilikagélen kromatografáljuk és 20:1 arányú metilén-klorid/metanol eleggyel eluáljuk. 1,3 g cím szerinti vegyületet kapunk, kitermelés 48%. A nagyon higroszkópos terméket szárítva -20 °C-on tároljuk.
3. lépés: N4-acetil-N4-benzil-5’-O-DMT2 ’-deoxieitidin szintézise
122 mg (0,2 mmol, 1,0 ekvivalens) N4-acetilN4-benzil-2’-deoxicitidint 1 ml vízmentes piridinben oldunk és 122 mg DMT-Cl-t (0,2 mmol), 1,0 ekvivalens) adunk hozzá. A reakcióelegyet 3 órán át keverjük. TLC-analízis szerint kevés kiindulási anyag maradt vissza, ezért további aliquot DMT-Cl-t (61 mg, 0,5 ekvivalens) adunk hozzá és az elegyet szobahőmérsékleten további 1 órán át keverjük. Ekkor a reakció TLCanalízis szerint teljesen lejátszódott. A reakciót 15 ml konyhasóoldat hozzáadásával leállítjuk és a vizes fázist 3x15 ml metilén-kloriddal extraháljuk. Az egyesített szerves fázisokat 2x15 ml konyhasóoldattal mossuk, vízmentes magnézium-szulfát felett szárítjuk és az oldószert eltávolítjuk. A maradékot szilikagélen végzett kromatografálással és 50:1 arányú metilén-klorid/metanol eleggyel végrehajtott eluálással tisztítjuk. 96 mg N4-acetil-N4-benzil-5’-O-DMT-2’-deoxicitidint kapunk, kitermelés 65%.
4. lépés: szukcinilezés mg (0,13 mmol) N4-acetil-N4-benzil-5’-ODMT-2’-deoxicitidint 2 ml vízmentes piridinben oldunk. 100 mg (1,0 mmol) borostyánkősavanhidridet és 20 mg dimetil-amino-piridint adunk hozzá. A reakció19
HU 223 669 Β1 elegyet szobahőmérsékleten 3 napon át keverjük. Az oldószert eltávolítjuk és a maradékot 3x 10 ml toluollal bepároljuk. A maradékhoz oldás céljából 50 ml kloroformot adunk (az oldódást ultrahangos besugárzással segítjük elő). A kloroformos réteget 3x15 ml konyhasóoldattal és 1 χ 15 ml vízzel mossuk. A szerves fázist magnézium-szulfát felett szárítjuk és bepároljuk.
108 mg tiszta N4-acetil-N4-benzil-5’-O-DMT2’-deoxicitidin-3’-O-szukcinátot kapunk, kitermelés 97%.
5. lépés: LCAA-CPG-hez kapcsolódó 5 ’-O-DMTN4-acetil-N4-benzil-2 ’-deoxicitidin-3 ’-O-szukcinát előállítása
Aktivált CPG-t a következőképpen készítünk. LCAA-CPG-t (1,0 g, LCA00500C, CPG Inc., Fairfield,
NJ) triklór-ecetsavval metilén-kloridban (3%, 10 ml) kezelünk és forgóbepárlón (rotovapor, Buchi, Flawil, Switzerland) (vákuum nélkül) 4 órán át bepárlunk. Az oldószert eltávolítjuk és a CPG-t egymásután 3 χ 5 ml 9:1 arányú trietil-amin/etil-diizopropil-amin eleggyel, 20 3 χ 10 ml metilén-kloriddal és 3 χ 10 ml éterrel mossuk, majd vákuumban szárítjuk.
A módosított nukleozid közbenső terméket a következőképpen kapcsoljuk a savval mosott CPG-hez. 1 g aktivált LCAA-CPG-hez 108 mg (0,13 mól) a fenti 25 módon készített N4-acetil-N4-benzil-5’-O-DMT2’-deoxicitidin-3’-O-szukcinátot, 20 mg dimetil-amino-piridint és 5 ml vízmentes piridint adunk. A reakcióelegyet rotavaporon (vákuum nélkül) 3 napon át keverjük. A felülúszót leszűrjük és a kapcsolt LCAA5 CPG-t szekvenciálisán 3x5 ml piridinnel, 3x10 ml metilén-kloriddal és 3x10 ml éterrel mossuk és vákuumban szárítjuk.
Az N4-acetil-N4-benzil-5’-O-DMT-2’-deoxicitidin-3’-O-szukcináttal kapcsolt LCAA-CPG befogását 10 a következőképpen végezzük el. A származékká alakított CPG-hez befogó A-reagenst (THF/Lutidin/AC2O 8:1:1, Glen Research DNS-szintézis-reagensek Sterling, VA) és B-reagenst (10% N-metilimidazolTHF-ben, Glen Research) adunk és a reakcióelegyet 15 rotavaporon (vákuum nélkül) egy éjjelen át forgatjuk. Az oldatot szűrjük, a kapcsolt LCAA-CPG-t szekvenciálisán 3 x5 ml piridinnel, 3 x 10 ml metilén-kloriddal, 3 χ 10 ml tetrahidrofúránnal és 3 χ 10 ml éterrel mossuk, majd vákuumban szárítjuk.
A származékká alakított LCAA-CPG megkötőkapacitását oly módon határozzuk meg, hogy 5 ml terméket metilén-kloridban 3% triklór-ecetsavval kezelünk és a felszabadított dimetoxi-tritil-karbóniumion mennyiségét UV-spektroszkópiával mérjük. Az LCAA-CPG-hez kötött nukleozidszármazék mennyisége 19,5 pmol/'g.
SZEKVENCIALISTA (1) ÁLTALÁNOS INFORMÁCIÓ (i) BEJELENTŐ:
(A) NÉV: F. Hoffmann-La Roche AG (B) UTCA: Grenzacherstrasse 124 (C) VÁROS: Basle (D) ÁLLAM: BS (E) ORSZÁG: Svájc (F) POSTAI IRÁNYÍTÓSZÁM (ZIP): CH-4070 (G) TELEFON: 061 688 25 11 (H) TELEFAX: 061 688 13 95 (I) TELEX: 962292/965542 hír eh (ii) TALÁLMÁNY CÍME: Módosított primerek (iii) SZEKVENCIÁK SZÁMA:
(iv) COMPUTER ÁLTAL LEOLVASHATÓ FORMA (A) MÉDIUM TÍPUS: Floppy disk (B) COMPUTER: Apple Macintosh (C) MŰKÖDŐ RENDSZER: System 7.1 (Macintosh) (D) SOFTWARE: Word 5.1 (v) KORÁBBI BEJELENTÉS ADATAI:
BEJELENTÉS SZÁMA: 60-0411127 BEJELENTÉS NAPJA: 20. 03. 97 (2) SEQ ID NO.: 1 INFORMÁCIÓI (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 33 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLSZERKEZET: egyetlen (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: DNS (genom) (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁSA: SEQIDNO.: 1: CAATGAGACA CCAGGAATTA GATATCAGTA CAA (2) SEQ ID NO.: 2 INFORMÁCIÓI (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK
HU 223 669 BI (A) HOSSZÚSÁG: 32 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLSZERKEZET: egyetlen (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: DNS (genom) (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁSA: SEQ ID NO.: 2: CCCTAAATCA GATCCTACAT ATAAGTCATC CA (2) SEQ ID NO.: 3 INFORMÁCIÓI (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 26bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLSZERKEZET: egyetlen (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: DNS (genom) (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁSA: SEQ ID NO.: 3: GCAGAAAGCG TCTAGCCATG GCGTTA (2) SEQ ID NO.: 4 INFORMÁCIÓI (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 28 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLSZERKEZET: egyetlen (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: DNS (genom) (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁSA: SEQ ID NO.: 4: GCAAGCACCC TATCAGGCAG TACCACAA (2) SEQ ID NO.: 5 INFORMÁCIÓI (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 23 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLSZERKEZET: egyetlen (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: DNS (genom) (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁSA: SEQ ID NO.: 5: CACATGCAAG TCGAACGGAA AGG (2) SEQ ID NO.: 6 INFORMÁCIÓI (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 24 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLSZERKEZET: egyetlen (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: DNS (genom) (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁSA: SEQ ID NO.: 6: TAACACATGC AAGTCGAACG GAAA (2) SEQ ID NO.: 7 INFORMÁCIÓI (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 24 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLSZERKEZET: egyetlen (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: DNS (genom) (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁSA: SEQ ID NO.: 7: GCCCGTATCG CCCGCACGCT CACA
HU 223 669 Bl
Claims (10)
- SZABADALMI IGÉNYPONTOK.1. (I) vagy (II) általános képletnek megfelelő általános szerkezetű oligonukleotid (mely képletbenS, jelentése 5 és 50 közötti nukleotidhosszúságú első nukleotidszekvencia;S2 jelentése 1 és 3 közötti nukleotidhosszúságú második nukleotidszekvencia;N jelentése valamely exociklikus amint tartalmazó purin- vagy pirimidinbázist magában foglaló nukleotid;R jelentése valamely módosítócsoport;mimellett R az exociklikus aminon keresztül kovalens módon kapcsolódik N-hez; és R szerkezete a (III) általános képletnek felel meg, ahol R[ és R2 jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom, 1-10 szénatomos alkilcsoport, alkoxicsoport, fenilcsoport, fenoxicsoport, helyettesített fenilcsoport, naftilcsoport vagy helyettesített naftilcsoport).
- 2. Az 1. igénypont szerinti oligonukleotid, amelyben R jelentése 2-naftil-metil-csoport, benzilcsoport vagy helyettesített benzilcsoport.
- 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti oligonukleotid, amelyben R jelentése (IV) általános képletű helyettesített benzilcsoport (mely képletbenR3 jelentése 1-6 szénatomos elágazó láncú vagy egyenes láncú alkilcsoport, metoxicsoport vagy nitrocsoport).
- 4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti oligonukleotid, amelyben R3 jelentése 1 -4 szénatomos elágazó láncú vagy lineáris alkilcsoport, metoxicsoport vagy nitrocsoport.
- 5. A 3. vagy 4. igénypont szerinti oligonukleotid, amelyben R3 a para-helyzethez kapcsolódik.
- 6. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti oligonukleotid, amelyben N jelentése adenozin.
- 7. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti oligonukleotid, amelyben R jelentése benzil-, p-metil-benzil-, p-tercier butil-benzil-, ρ-metoxi-benzil-, o-nitro-benzil- vagy 2-naftil-metil-csoport.
- 8. Eljárás nukleinsav targetszekvencia amplifikálására, azzal jellemezve, hogy az amplifikációs reakciót legalább egy, az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti oligonukleotid felhasználásával végezzük el.
- 9. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy polimeráz láncreakciót hajtunk végre.
- 10. Kit nukleinsavamplifikációs reakció elvégzésére, amely az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti nukleotidot tartalmazza.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US4112797P | 1997-03-20 | 1997-03-20 |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU9800581D0 HU9800581D0 (en) | 1998-05-28 |
| HUP9800581A2 HUP9800581A2 (hu) | 1999-05-28 |
| HUP9800581A3 HUP9800581A3 (en) | 2000-12-28 |
| HU223669B1 true HU223669B1 (hu) | 2004-11-29 |
Family
ID=21914898
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU9800581A HU223669B1 (hu) | 1997-03-20 | 1998-03-16 | Módosított primerek |
Country Status (21)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6001611A (hu) |
| EP (1) | EP0866071B1 (hu) |
| JP (1) | JP2966389B2 (hu) |
| KR (1) | KR100292997B1 (hu) |
| CN (1) | CN1065873C (hu) |
| AT (1) | ATE280177T1 (hu) |
| AU (1) | AU712448B2 (hu) |
| BR (1) | BR9801878B1 (hu) |
| CA (1) | CA2229766C (hu) |
| CZ (1) | CZ291525B6 (hu) |
| DE (1) | DE69827060T2 (hu) |
| DK (1) | DK0866071T3 (hu) |
| ES (1) | ES2230631T3 (hu) |
| HK (1) | HK1012192A1 (hu) |
| HU (1) | HU223669B1 (hu) |
| IL (1) | IL123694A (hu) |
| NO (1) | NO322136B1 (hu) |
| PL (1) | PL190142B1 (hu) |
| RU (1) | RU2159248C2 (hu) |
| TW (1) | TW567188B (hu) |
| UA (1) | UA49843C2 (hu) |
Families Citing this family (185)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6200757B1 (en) * | 1999-01-19 | 2001-03-13 | Dade Behring Inc. | Method for controlling the extension of an oligonucleotide |
| US6509157B1 (en) * | 1999-11-05 | 2003-01-21 | Roche Molecular Systems, Inc | 3 blocked nucleic acid amplification primers |
| PL202358B1 (pl) | 1999-11-17 | 2009-06-30 | Roche Diagnostics Gmbh | Sposób wytwarzania kompozycji magnetycznych cząstek szklanych, magnetyczne cząstki szklane, kompozycja magnetycznych cząstek szklanych, zawiesina z magnetycznymi cząstkami szklanymi, probówka z kompozycją lub zawiesiną magnetycznych cząstek szklanych, zestaw części z tą probówką, zastosowanie kompozycji, zawiesiny i zestawu zawierających magnetyczne cząstki szklane, sposób izolowania materiału biologicznego |
| WO2001044511A2 (en) | 1999-12-15 | 2001-06-21 | Gen-Probe Incorporated | Methods and compositions for detection of mycobacterium avium complex species |
| JP4744053B2 (ja) * | 1999-12-17 | 2011-08-10 | ジェン−プローブ・インコーポレーテッド | マイコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種の核酸増幅および検出 |
| US6664081B2 (en) * | 1999-12-17 | 2003-12-16 | Gen-Probe Incorporated | Nucleic acid amplification and detection of mycobacterium species |
| US7205129B1 (en) * | 2000-02-28 | 2007-04-17 | Qiagen Gmbh | Method for reducing artifacts in nucleic acid amplification |
| AU2001253129A1 (en) * | 2000-04-03 | 2001-10-15 | Biolink Partners, Inc. | Reversible chemical modification of nucleic acids and improved method for nucleic acid hybridization |
| US6548251B1 (en) * | 2000-09-05 | 2003-04-15 | Fidelity Systems, Inc. | Inhibition of molecular and biological processes using modified oligonucleotides |
| US20020031777A1 (en) * | 2000-09-08 | 2002-03-14 | Linda Starr-Spires | Ultra yield amplification reaction |
| US9708358B2 (en) | 2000-10-06 | 2017-07-18 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Massive parallel method for decoding DNA and RNA |
| EP3034627B1 (en) | 2000-10-06 | 2019-01-30 | The Trustees of Columbia University in the City of New York | Massive parallel method for decoding dna and rna |
| ES2254306T3 (es) * | 2000-10-25 | 2006-06-16 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Amplificacion usando cebadores modificados. |
| JP2004532026A (ja) * | 2001-03-30 | 2004-10-21 | アメルシャム・バイオサイエンシーズ・アクチボラグ | Ｐ４５０単一ヌクレオチド多型バイオチップ分析 |
| US6905827B2 (en) | 2001-06-08 | 2005-06-14 | Expression Diagnostics, Inc. | Methods and compositions for diagnosing or monitoring auto immune and chronic inflammatory diseases |
| US7026121B1 (en) | 2001-06-08 | 2006-04-11 | Expression Diagnostics, Inc. | Methods and compositions for diagnosing and monitoring transplant rejection |
| US7235358B2 (en) | 2001-06-08 | 2007-06-26 | Expression Diagnostics, Inc. | Methods and compositions for diagnosing and monitoring transplant rejection |
| WO2002101041A1 (fr) * | 2001-06-12 | 2002-12-19 | Takara Bio Inc. | Procede d'amplification de l'acide nucleique et procede de detection du polymorphisme des nucleotides a l'aide d'un analogue de nucleotide |
| WO2003020983A1 (en) * | 2001-08-30 | 2003-03-13 | Virginia Commonwealth University | Allele specific pcr for genotyping |
| US6617137B2 (en) | 2001-10-15 | 2003-09-09 | Molecular Staging Inc. | Method of amplifying whole genomes without subjecting the genome to denaturing conditions |
| US7297485B2 (en) * | 2001-10-15 | 2007-11-20 | Qiagen Gmbh | Method for nucleic acid amplification that results in low amplification bias |
| US7211382B2 (en) * | 2002-04-09 | 2007-05-01 | Orchid Cellmark Inc. | Primer extension using modified nucleotides |
| JP4457001B2 (ja) * | 2002-05-31 | 2010-04-28 | セクレタリー・デパートメント・オブ・アトミック・エナジー | ドナー／アクセプター部分が相補鎖上となる標的核酸検出のｍｅｔ／ｆｒｅｔに基づく方法 |
| US9487823B2 (en) | 2002-12-20 | 2016-11-08 | Qiagen Gmbh | Nucleic acid amplification |
| US7955795B2 (en) | 2003-06-06 | 2011-06-07 | Qiagen Gmbh | Method of whole genome amplification with reduced artifact production |
| BRPI0408967B8 (pt) | 2003-03-31 | 2021-07-27 | Hoffmann La Roche | kit e métodos para detecção de um ácido nucléico de vários membros do sorogrupo do vírus da encefalite japonesa em uma amostra biológica sob condições de hibridização rigorosas |
| WO2004094986A2 (en) | 2003-04-16 | 2004-11-04 | Handylab, Inc. | System and method for electrochemical detection of biological compounds |
| US7892745B2 (en) | 2003-04-24 | 2011-02-22 | Xdx, Inc. | Methods and compositions for diagnosing and monitoring transplant rejection |
| US7408051B2 (en) | 2004-04-14 | 2008-08-05 | Applera Corporation | Modified oligonucleotides and applications thereof |
| US7517978B1 (en) | 2004-04-14 | 2009-04-14 | Applied Biosystems, Llc | Modified oligonucleotides and applications thereof |
| US7939251B2 (en) | 2004-05-06 | 2011-05-10 | Roche Molecular Systems, Inc. | SENP1 as a marker for cancer |
| WO2006006722A1 (ja) | 2004-07-13 | 2006-01-19 | Takeda Pharmaceutical Company Limited | 細胞機能の調節方法 |
| WO2006029184A2 (en) | 2004-09-08 | 2006-03-16 | Expression Diagnostics, Inc. | Genes useful for diagnosing and monitoring inflammation related disorders |
| WO2006048262A2 (en) * | 2004-11-04 | 2006-05-11 | Roche Diagnostics Gmbh | Classification of acute myeloid leukemia |
| US7842794B2 (en) | 2004-12-17 | 2010-11-30 | Roche Molecular Systems, Inc. | Reagents and methods for detecting Neisseria gonorrhoeae |
| ATE454476T1 (de) * | 2005-04-14 | 2010-01-15 | Applied Biosystems Llc | 3'-modifizierte oligonukleotide mit pseudoisocytosin-nukleobasenderivaten sowie deren anwendungen als primer oder sonden |
| US8067208B2 (en) | 2005-06-30 | 2011-11-29 | Roche Molecular Systems, Inc. | Probes and methods for hepatitis C virus typing using multidimensional probe analysis |
| US11111544B2 (en) | 2005-07-29 | 2021-09-07 | Natera, Inc. | System and method for cleaning noisy genetic data and determining chromosome copy number |
| US11111543B2 (en) | 2005-07-29 | 2021-09-07 | Natera, Inc. | System and method for cleaning noisy genetic data and determining chromosome copy number |
| US9424392B2 (en) | 2005-11-26 | 2016-08-23 | Natera, Inc. | System and method for cleaning noisy genetic data from target individuals using genetic data from genetically related individuals |
| US10083273B2 (en) | 2005-07-29 | 2018-09-25 | Natera, Inc. | System and method for cleaning noisy genetic data and determining chromosome copy number |
| US10081839B2 (en) | 2005-07-29 | 2018-09-25 | Natera, Inc | System and method for cleaning noisy genetic data and determining chromosome copy number |
| WO2007139723A1 (en) | 2006-06-01 | 2007-12-06 | Trilink Biotechnologies | Chemicallymodified oligonucleotide primers for nucleic acid amplification |
| EP2029780A4 (en) * | 2006-06-16 | 2010-03-31 | Pacific Biosciences California | CONTROLLED INITIATION OF A PRIMARY EXTENSION |
| US8334099B2 (en) * | 2006-07-31 | 2012-12-18 | Wanli Bi | Nucleic acid amplification using a reversibly modified oligonucleotide |
| US9045522B2 (en) | 2006-07-31 | 2015-06-02 | Wanli Bi | Nucleic acid amplification using a reversibly modified oligonucleotide |
| US7993832B2 (en) | 2006-08-14 | 2011-08-09 | Xdx, Inc. | Methods and compositions for diagnosing and monitoring the status of transplant rejection and immune disorders |
| EP2102367A2 (en) | 2006-11-09 | 2009-09-23 | XDX, Inc. | Methods for diagnosing and monitoring the status of systemic lupus erythematosus |
| DE112007002932B4 (de) | 2006-12-01 | 2015-08-06 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Vierfarben DNA-Sequenzierung mittels Synthese unter Verwendung von abspaltbaren, reversiblen, fluoreszierenden Nucleotidterminatoren |
| US7893227B2 (en) | 2006-12-05 | 2011-02-22 | Lasergen, Inc. | 3′-OH unblocked nucleotides and nucleosides base modified with non-cleavable, terminating groups and methods for their use in DNA sequencing |
| US7897737B2 (en) | 2006-12-05 | 2011-03-01 | Lasergen, Inc. | 3′-OH unblocked, nucleotides and nucleosides, base modified with photocleavable, terminating groups and methods for their use in DNA sequencing |
| US9938641B2 (en) | 2006-12-18 | 2018-04-10 | Fluidigm Corporation | Selection of aptamers based on geometry |
| DK2574681T3 (en) | 2007-03-28 | 2016-07-04 | Signal Diagnostics | System and method for high-resolution analysis of nucleic acids to detect sequence variations |
| AU2008272421B2 (en) | 2007-07-03 | 2014-09-04 | Genaphora Ltd. | Chimeric primers for improved nucleic acid amplification reactions |
| AU2008283902B2 (en) | 2007-08-06 | 2014-03-13 | Orion Genomics Llc | Novel single nucleotide polymorphisms and combinations of novel and known polymorphisms for determining the allele-specific expression of the IGF2 gene |
| CA2639416C (en) | 2007-09-11 | 2019-12-31 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Diagnostic test for susceptibility to b-raf kinase inhibitors |
| US8455197B2 (en) * | 2007-10-04 | 2013-06-04 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Nucleic acid amplification |
| US20100086914A1 (en) * | 2008-10-03 | 2010-04-08 | Roche Molecular Systems, Inc. | High resolution, high throughput hla genotyping by clonal sequencing |
| EP2207900B1 (en) | 2007-10-19 | 2015-04-29 | The Trustees of Columbia University in the City of New York | Design and synthesis of cleavable fluorescent nucleotides as reversible terminators for dna sequencing by synthesis |
| EP3431615A3 (en) | 2007-10-19 | 2019-02-20 | The Trustees of Columbia University in the City of New York | Dna sequencing with non-fluorescent nucleotide reversible terminators cleavable label modified nucleotide terminators |
| DE102008005667A1 (de) | 2008-01-19 | 2009-07-30 | Olfert Landt | Basenmodifizierte Primeroligomere für die Multiplex-RT-PCR |
| US8911948B2 (en) * | 2008-04-30 | 2014-12-16 | Integrated Dna Technologies, Inc. | RNase H-based assays utilizing modified RNA monomers |
| AU2009242546B2 (en) | 2008-04-30 | 2015-01-22 | Integrated Dna Technologies, Inc. | RNase-H-based assays utilizing modified RNA monomers |
| KR101677772B1 (ko) | 2008-06-11 | 2016-11-18 | 레이저젠, 인코퍼레이티드 | 뉴클레오타이드 및 뉴클레오사이드 그리고 시퀀싱에서의 이들의 이용 방법 |
| ES2620431T3 (es) | 2008-08-04 | 2017-06-28 | Natera, Inc. | Métodos para la determinación de alelos y de ploidía |
| EP2337865B1 (en) * | 2008-10-20 | 2014-11-19 | Roche Diagnostics GmbH | Allele-specific amplification using a primer with a modified nucleotide |
| US10669574B2 (en) | 2008-11-18 | 2020-06-02 | XCR Diagnostics, Inc. | DNA amplification technology |
| US8206929B2 (en) * | 2009-01-07 | 2012-06-26 | Roche Molecular Systems, Inc. | Nucleic acid amplification with allele-specific suppression of sequence variants |
| EP2396429B1 (en) | 2009-02-11 | 2015-05-27 | Orion Genomics, LLC | Combinations of polymorphisms for determining allele-specific expression of igf2 |
| US8409802B2 (en) | 2009-08-14 | 2013-04-02 | Roche Molecular Systems, Inc. | Format of probes to detect nucleic acid differences |
| US20120185176A1 (en) | 2009-09-30 | 2012-07-19 | Natera, Inc. | Methods for Non-Invasive Prenatal Ploidy Calling |
| US9238832B2 (en) | 2009-12-11 | 2016-01-19 | Roche Molecular Systems, Inc. | Allele-specific amplification of nucleic acids |
| US8614071B2 (en) * | 2009-12-11 | 2013-12-24 | Roche Molecular Systems, Inc. | Preferential amplification of mRNA over DNA using chemically modified primers |
| WO2011128096A1 (en) | 2010-04-16 | 2011-10-20 | Roche Diagnostics Gmbh | Polymorphism markers for predicting response to interleukin-6 receptor-inhibiting monoclonal antibody drug treatment |
| US11326208B2 (en) | 2010-05-18 | 2022-05-10 | Natera, Inc. | Methods for nested PCR amplification of cell-free DNA |
| US10316362B2 (en) | 2010-05-18 | 2019-06-11 | Natera, Inc. | Methods for simultaneous amplification of target loci |
| US11332793B2 (en) | 2010-05-18 | 2022-05-17 | Natera, Inc. | Methods for simultaneous amplification of target loci |
| US9677118B2 (en) | 2014-04-21 | 2017-06-13 | Natera, Inc. | Methods for simultaneous amplification of target loci |
| US20190010543A1 (en) | 2010-05-18 | 2019-01-10 | Natera, Inc. | Methods for simultaneous amplification of target loci |
| US11939634B2 (en) | 2010-05-18 | 2024-03-26 | Natera, Inc. | Methods for simultaneous amplification of target loci |
| US11322224B2 (en) | 2010-05-18 | 2022-05-03 | Natera, Inc. | Methods for non-invasive prenatal ploidy calling |
| US11408031B2 (en) | 2010-05-18 | 2022-08-09 | Natera, Inc. | Methods for non-invasive prenatal paternity testing |
| US11332785B2 (en) | 2010-05-18 | 2022-05-17 | Natera, Inc. | Methods for non-invasive prenatal ploidy calling |
| US11339429B2 (en) | 2010-05-18 | 2022-05-24 | Natera, Inc. | Methods for non-invasive prenatal ploidy calling |
| CA3037126C (en) | 2010-05-18 | 2023-09-12 | Natera, Inc. | Methods for non-invasive prenatal ploidy calling |
| US20130143214A1 (en) | 2010-06-04 | 2013-06-06 | Chronix Biomedical | Prostate cancer associated circulating nucleic acid biomarkers |
| WO2012038049A2 (en) | 2010-09-22 | 2012-03-29 | Roche Diagnostics Gmbh | Amplification of distant nucleic acid targets using engineered primers |
| WO2012075005A1 (en) | 2010-12-01 | 2012-06-07 | Berry & Associates, Inc. | Compounds for the synthetic introduction of n-alkyl nucleosides into dna oligonucleotides |
| JP6328934B2 (ja) | 2010-12-22 | 2018-05-23 | ナテラ， インコーポレイテッド | 非侵襲性出生前親子鑑定法 |
| US20120164641A1 (en) * | 2010-12-22 | 2012-06-28 | Roche Molecular Systems, Inc. | Methods and Compositions for Detecting Mutation in the Human Epidermal Growth Factor Receptor Gene |
| JP6153874B2 (ja) | 2011-02-09 | 2017-06-28 | ナテラ， インコーポレイテッド | 非侵襲的出生前倍数性呼び出しのための方法 |
| AU2012236896A1 (en) | 2011-03-25 | 2013-05-16 | Integrated Dna Technologies, Inc. | RNase H-based assays utilizing modified RNA monomers |
| WO2012162429A2 (en) | 2011-05-23 | 2012-11-29 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Dna sequencing by synthesis using raman and infrared spectroscopy detection |
| US9034581B2 (en) | 2011-05-26 | 2015-05-19 | Roche Molecular Systems, Inc. | Compositions and methods for detection of Staphylococcus aureus |
| US20140303008A1 (en) | 2011-10-21 | 2014-10-09 | Chronix Biomedical | Colorectal cancer associated circulating nucleic acid biomarkers |
| ES2413566B1 (es) | 2011-12-14 | 2014-05-20 | Fundación Pública Andaluza Progreso Y Salud | Método de obtención de datos útiles para el diagnóstico y pronóstico de la hipoacusia neurosensorial. |
| US9115394B2 (en) | 2011-12-22 | 2015-08-25 | Roche Molecular Systems, Inc. | Methods and reagents for reducing non-specific amplification |
| KR101545848B1 (ko) * | 2012-04-09 | 2015-08-21 | (주)바이오니아 | 핵산중합효소로 핵산을 검출하는데 사용되는 고민감도 핵산준비방법 |
| CN110343673B (zh) | 2012-06-14 | 2024-04-05 | 生命技术公司 | 用于聚合酶链式反应(pcr)的新型组合物、方法和试剂盒 |
| US9982313B2 (en) | 2012-08-17 | 2018-05-29 | Roche Molecular Systems, Inc. | Compositions and methods for detection of herpes simplex virus 1 and 2 |
| EP2722399A1 (en) | 2012-10-18 | 2014-04-23 | Roche Diagniostics GmbH | Method for preventing high molecular weight products during amplification |
| US9382581B2 (en) | 2012-12-13 | 2016-07-05 | Roche Molecular Systems, Inc. | Primers with modified phosphate and base in allele-specific PCR |
| EP2931922B1 (en) | 2012-12-14 | 2018-10-17 | Chronix Biomedical | Personalized biomarkers for cancer |
| US9828629B2 (en) | 2013-03-15 | 2017-11-28 | Roche Molecular Systems, Inc. | Nucleic acid target identification by structure based probe cleavage |
| WO2014144883A1 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-18 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Raman cluster tagged molecules for biological imaging |
| US20160115541A1 (en) | 2013-05-29 | 2016-04-28 | Chronix Biomedical | Detection and quantification of donor cell-free dna in the circulation of organ transplant recipients |
| CR20160132A (es) | 2013-08-12 | 2016-08-25 | Genentech Inc | Composiciones y método para tratar condiciones asociadas con el complemento |
| US10577655B2 (en) | 2013-09-27 | 2020-03-03 | Natera, Inc. | Cell free DNA diagnostic testing standards |
| US10262755B2 (en) | 2014-04-21 | 2019-04-16 | Natera, Inc. | Detecting cancer mutations and aneuploidy in chromosomal segments |
| US9499870B2 (en) | 2013-09-27 | 2016-11-22 | Natera, Inc. | Cell free DNA diagnostic testing standards |
| EP3055422B1 (en) | 2013-10-09 | 2018-11-14 | Roche Diagnostics GmbH | Methods and compositions for detecting a mutation in the human ezh2 gene |
| ES2925313T3 (es) | 2013-10-09 | 2022-10-14 | Fluoresentric Inc | Método para la detección de secuencias de ácido nucleico diana |
| EP3063272A2 (en) | 2013-10-30 | 2016-09-07 | Green Life Biotech, LLC | Pathogenesis quantification systems and treatment methods for citrus greening blight |
| US10072288B2 (en) | 2013-11-11 | 2018-09-11 | Roche Molecular Systems, Inc. | Detecting single nucleotide polymorphism using overlapped primer and melting probe |
| US9637791B2 (en) | 2013-12-20 | 2017-05-02 | Roche Molecular Systems, Inc. | Multiplexed nucleic acid target identification by strucutre based probe cleavage |
| TWI785472B (zh) | 2014-02-08 | 2022-12-01 | 美商建南德克公司 | 治療阿茲海默症之方法 |
| EP3134541B1 (en) | 2014-04-21 | 2020-08-19 | Natera, Inc. | Detecting copy number variations (cnv) of chromosomal segments in cancer |
| EP3201361B1 (en) | 2014-10-01 | 2020-02-12 | Chronix Biomedical | Methods of quantifying cell-free dna |
| US9745618B2 (en) | 2014-11-19 | 2017-08-29 | Roche Molecular Systems, Inc. | Photoblocked probes and methods for sequential detection of nucleic acids |
| US9920381B2 (en) | 2014-12-02 | 2018-03-20 | Roche Molecular Systems, Inc. | Compositions and methods for detecting MECC-containing methicillin-resistant Staphylococcus aureus |
| US9909169B2 (en) | 2014-12-17 | 2018-03-06 | Roche Molecular Systems, Inc. | Allele-specific amplification of nucleic acids using blocking oligonucleotides for wild type suppression |
| WO2016100049A1 (en) | 2014-12-18 | 2016-06-23 | Edico Genome Corporation | Chemically-sensitive field effect transistor |
| US9618474B2 (en) | 2014-12-18 | 2017-04-11 | Edico Genome, Inc. | Graphene FET devices, systems, and methods of using the same for sequencing nucleic acids |
| US10020300B2 (en) | 2014-12-18 | 2018-07-10 | Agilome, Inc. | Graphene FET devices, systems, and methods of using the same for sequencing nucleic acids |
| US9857328B2 (en) | 2014-12-18 | 2018-01-02 | Agilome, Inc. | Chemically-sensitive field effect transistors, systems and methods for manufacturing and using the same |
| US10006910B2 (en) | 2014-12-18 | 2018-06-26 | Agilome, Inc. | Chemically-sensitive field effect transistors, systems, and methods for manufacturing and using the same |
| US9859394B2 (en) | 2014-12-18 | 2018-01-02 | Agilome, Inc. | Graphene FET devices, systems, and methods of using the same for sequencing nucleic acids |
| ES2961374T3 (es) | 2015-04-24 | 2024-03-11 | Atila Biosystems Incorporated | Amplificación con cebadores de composición de nucleótidos limitada |
| WO2016183106A1 (en) | 2015-05-11 | 2016-11-17 | Natera, Inc. | Methods and compositions for determining ploidy |
| US9970062B2 (en) * | 2015-08-06 | 2018-05-15 | Roche Molecular Systems, Inc. | Compositions and methods for detection of mycobacterium tuberculosis |
| US9382582B1 (en) * | 2015-08-25 | 2016-07-05 | Tracy Hayden | Methods, compositions and kits for enriching for a minor template amplification product in a mixed template amplification reaction |
| LT3402880T (lt) | 2016-01-15 | 2024-03-12 | Thermo Fisher Scientific Baltics Uab | Termofiliniai dnr polimerazės mutantai |
| EP3426805B1 (en) | 2016-03-11 | 2023-11-29 | Roche Diagnostics GmbH | Compositions and methods for detection of zika virus |
| JP6681804B2 (ja) * | 2016-03-30 | 2020-04-15 | 大研医器株式会社 | 変異プライマーの設計方法 |
| WO2017169119A1 (ja) * | 2016-03-30 | 2017-10-05 | 大研医器株式会社 | 変異プライマーの設計方法 |
| WO2017201081A1 (en) | 2016-05-16 | 2017-11-23 | Agilome, Inc. | Graphene fet devices, systems, and methods of using the same for sequencing nucleic acids |
| US10612101B2 (en) * | 2016-05-27 | 2020-04-07 | Roche Molecular Systems, Inc. | Compositions and methods for detection of Mycoplasma genitalium |
| ES2874259T3 (es) | 2016-05-27 | 2021-11-04 | Roche Diagnostics Gmbh | Composiciones y procedimientos para la detección de Trichomonas vaginalis |
| US10934597B2 (en) * | 2016-05-27 | 2021-03-02 | Roche Molecular Systems, Inc. | Compositions and methods for detection of trichomonas vaginalis |
| US20170356025A1 (en) | 2016-06-14 | 2017-12-14 | Roche Molecular Systems, Inc. | Internal control probes for improving pcr assay performance |
| WO2018024562A1 (en) | 2016-08-02 | 2018-02-08 | Roche Diagnostics Gmbh | Helper oligonucleotide for improving efficiency of amplification and detection/quantitation of nucleic acids |
| WO2018067517A1 (en) | 2016-10-04 | 2018-04-12 | Natera, Inc. | Methods for characterizing copy number variation using proximity-litigation sequencing |
| US10793923B2 (en) | 2016-11-09 | 2020-10-06 | Roche Molecular Systems, Inc. | Compositions and methods for detection of BK virus |
| WO2018089942A1 (en) | 2016-11-10 | 2018-05-17 | Slipchip Corporation | Polynucleotides for the amplification and detection of chlamydia trachomatis |
| US20190284618A1 (en) | 2016-11-10 | 2019-09-19 | Talis Biomedical Corporation | Polynucleotides for the amplification and detection of neisseria gonorrhoeae |
| US10011870B2 (en) | 2016-12-07 | 2018-07-03 | Natera, Inc. | Compositions and methods for identifying nucleic acid molecules |
| US20190211377A1 (en) | 2016-12-22 | 2019-07-11 | Roche Molecular Systems, Inc. | Cobra probes to detect a marker for epidemic ribotypes of clostridium difficile |
| WO2018156418A1 (en) | 2017-02-21 | 2018-08-30 | Natera, Inc. | Compositions, methods, and kits for isolating nucleic acids |
| EP3645710A1 (en) | 2017-06-26 | 2020-05-06 | Thermo Fisher Scientific Baltics Uab | Thermophilic dna polymerase mutants |
| US10760137B2 (en) | 2017-07-18 | 2020-09-01 | Roche Molecular Systems, Inc. | Compositions and methods for detection of Babesia |
| US11591645B2 (en) * | 2017-08-31 | 2023-02-28 | Seegene, Inc. | Evaluation of performance of components using a pair of dimer-forming primers |
| WO2019063661A1 (en) | 2017-09-29 | 2019-04-04 | Roche Diagnostics Gmbh | COMPOSITIONS AND METHODS FOR THE DETECTION OF TRICHOMONAS VAGINALIS |
| US12043851B2 (en) | 2018-03-21 | 2024-07-23 | Roche Molecular Systems, Inc. | DNA polymerases for efficient and effective incorporation of methylated-dNTPS |
| US12024738B2 (en) | 2018-04-14 | 2024-07-02 | Natera, Inc. | Methods for cancer detection and monitoring |
| US10450616B1 (en) | 2018-05-09 | 2019-10-22 | Talis Biomedical Corporation | Polynucleotides for the amplification and detection of Chlamydia trachomatis |
| US11332787B2 (en) | 2018-06-29 | 2022-05-17 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Methods and compositions for delivery of molecules and complexes to reaction sites |
| US11525159B2 (en) | 2018-07-03 | 2022-12-13 | Natera, Inc. | Methods for detection of donor-derived cell-free DNA |
| EP3874064A1 (en) * | 2018-10-29 | 2021-09-08 | Cepheid | Exponential base-3 nucleic acid amplification with reduced amplification time using nested overlapping primers |
| WO2020114998A1 (en) | 2018-12-03 | 2020-06-11 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Compositions and methods for detection of candida auris |
| KR102141312B1 (ko) * | 2019-04-19 | 2020-08-04 | 주식회사 제노헬릭스 | 짧은 RNA-primed 제노 센서 모듈 증폭 기반 짧은 RNA 탐지 기법 |
| JP2022531348A (ja) | 2019-05-02 | 2022-07-06 | エフ．ホフマン－ラ ロシュ アーゲー | 鎖分離温度に基づくＤＮＡに対してＲＮＡ標的の優先的／選択的増幅のためのｄＩＴＰの利用 |
| WO2020225231A1 (en) | 2019-05-07 | 2020-11-12 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Compositions and methods for detection of neisseria gonorroheae |
| WO2021013972A1 (en) | 2019-07-25 | 2021-01-28 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Compositions and methods for detection of epstein barr virus (ebv) |
| US10954572B2 (en) | 2019-07-25 | 2021-03-23 | Talis Biomedical Corporation | Polynucleotides for the amplification and detection of Neisseria gonorrhoeae |
| WO2021037399A1 (en) | 2019-08-27 | 2021-03-04 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Compositions and methods for amplification and detection of hepatitis b virus rna, including hbv rna transcribed from cccdna |
| US11441167B2 (en) | 2019-11-20 | 2022-09-13 | Roche Molecular Systems, Inc. | Compositions and methods for rapid identification and phenotypic antimicrobial susceptibility testing of bacteria and fungi |
| US11891662B2 (en) | 2019-12-02 | 2024-02-06 | Talis Biomedical Corporation | Polynucleotides for amplification and detection of human beta actin |
| CN114867871A (zh) | 2019-12-27 | 2022-08-05 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的组合物和方法 |
| US20220356537A1 (en) | 2019-12-31 | 2022-11-10 | Roche Molecular Systems, Inc. | Quantitative pcr screening of inducible prophage from bacterial isolates |
| JP2023516472A (ja) | 2020-03-09 | 2023-04-19 | エフ． ホフマン－ラ ロシュ アーゲー | 重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ｓａｒｓ－ｃｏｖ－２）、インフルエンザａ及びインフルエンザｂを検出するための組成物及び方法 |
| EP4192982A2 (en) | 2020-08-06 | 2023-06-14 | F. Hoffmann-La Roche AG | Compositions and methods for the detection of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (sars-2), influenza a, and influenza b |
| US20240102110A1 (en) | 2020-12-04 | 2024-03-28 | Roche Molecular Systems, Inc. | Compositions and methods for detection of malaria |
| US20220205020A1 (en) | 2020-12-30 | 2022-06-30 | Roche Molecular Systems, Inc. | Compositions and methods for detection of bacteria and fungi associated with bacterial and candida vaginosis |
| WO2022167570A1 (en) | 2021-02-05 | 2022-08-11 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Compositions and methods for detection of human parainfluenza viruses 1-4 (hpiv 1-4) |
| US20220290221A1 (en) | 2021-03-15 | 2022-09-15 | Roche Molecular Systems, Inc. | Compositions and methods for detecting severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (sars-cov-2) variants having spike protein mutations |
| JP2024517835A (ja) | 2021-05-06 | 2024-04-23 | エフ． ホフマン－ラ ロシュ アーゲー | 二重標的アッセイによりデルタ型肝炎ウイルスを検出するための組成物及び方法 |
| WO2023079032A1 (en) | 2021-11-05 | 2023-05-11 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Compositions and methods for detection of malaria |
| WO2023089186A1 (en) | 2021-11-22 | 2023-05-25 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Compositions and methods for detecting vana and/or vanb genes associated with multidrug resistance |
| WO2023104812A1 (en) | 2021-12-09 | 2023-06-15 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Mass based detection of pcr amplicons |
| WO2023109887A1 (zh) | 2021-12-15 | 2023-06-22 | 南京金斯瑞生物科技有限公司 | 一种整合位点的检测方法 |
| WO2024003260A1 (en) | 2022-06-30 | 2024-01-04 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Compositions and methods for detecting lymphogranuloma venereum (lgv) serovars of chlamydia trachomatis |
| WO2024018485A1 (en) * | 2022-07-18 | 2024-01-25 | Haystackanalytics Private Limited | Methods and systems for detection and identification of pathogens and antibiotic resistance genes |
| WO2024042042A1 (en) | 2022-08-24 | 2024-02-29 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Compositions and methods for detecting monkeypox virus |
| WO2024141442A1 (en) | 2022-12-25 | 2024-07-04 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Compositions and methods for detecting carbapenem resistant acinetobacter calcoaceticus-baumannii (crab) |
| WO2024141476A1 (en) | 2022-12-28 | 2024-07-04 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Digital pcr assay designs for multiple hepatitis b virus gene targets and non-extendable blocker oligonucleotides therefor |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4711955A (en) * | 1981-04-17 | 1987-12-08 | Yale University | Modified nucleotides and methods of preparing and using same |
| US5256549A (en) * | 1986-03-28 | 1993-10-26 | Chiron Corporation | Purification of synthetic oligomers |
| US5459255A (en) * | 1990-01-11 | 1995-10-17 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | N-2 substituted purines |
| WO1992001814A2 (en) * | 1990-07-24 | 1992-02-06 | F. Hoffmann-La-Roche Ag | The reduction of non-specific amplification during in vitro nucleic acid amplification using modified nucleic acid bases |
| US5338671A (en) * | 1992-10-07 | 1994-08-16 | Eastman Kodak Company | DNA amplification with thermostable DNA polymerase and polymerase inhibiting antibody |
| EP0691968B1 (en) * | 1993-03-30 | 1997-07-16 | Sanofi | Acyclic nucleoside analogs and oligonucleotide sequences containing them |
| US5599662A (en) * | 1995-02-17 | 1997-02-04 | Hoffmann-La Roche Inc. | Oliconucleotide primers and probes for the detection of HIV-1 |
| US5837442A (en) * | 1995-11-29 | 1998-11-17 | Roche Molecular Systems, Inc. | Oligonucleotide primers for amplifying HCV nucleic acid |
-
1998
- 1998-03-12 EP EP98104461A patent/EP0866071B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-03-12 AT AT98104461T patent/ATE280177T1/de active
- 1998-03-12 ES ES98104461T patent/ES2230631T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-03-12 DK DK98104461T patent/DK0866071T3/da active
- 1998-03-12 DE DE69827060T patent/DE69827060T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-03-13 AU AU58404/98A patent/AU712448B2/en not_active Expired
- 1998-03-16 HU HU9800581A patent/HU223669B1/hu active IP Right Grant
- 1998-03-16 IL IL12369498A patent/IL123694A/xx not_active IP Right Cessation
- 1998-03-16 US US09/039,866 patent/US6001611A/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-03-18 CA CA002229766A patent/CA2229766C/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-03-19 PL PL98325439A patent/PL190142B1/pl unknown
- 1998-03-19 UA UA98031382A patent/UA49843C2/uk unknown
- 1998-03-19 RU RU98105786/04A patent/RU2159248C2/ru active
- 1998-03-19 NO NO19981239A patent/NO322136B1/no not_active IP Right Cessation
- 1998-03-19 CZ CZ1998841A patent/CZ291525B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1998-03-19 CN CN98105627A patent/CN1065873C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1998-03-20 JP JP10090641A patent/JP2966389B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1998-03-20 BR BRPI9801878-7A patent/BR9801878B1/pt not_active IP Right Cessation
- 1998-03-20 KR KR1019980009644A patent/KR100292997B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1998-04-03 TW TW087104213A patent/TW567188B/zh not_active IP Right Cessation
- 1998-12-15 HK HK98113390A patent/HK1012192A1/xx not_active IP Right Cessation
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| HU223669B1 (hu) | Módosított primerek | |
| US6361940B1 (en) | Compositions and methods for enhancing hybridization and priming specificity | |
| US5744308A (en) | Chimera oligonucleotide and its utilization for obtaining transcripts of a nucleic acid | |
| JP3789817B2 (ja) | Ｐｎａ−ｄｎａキメラプローブを用いたテンプレート依存型ライゲーション | |
| AU763948B2 (en) | Hybridization and mismatch discrimination using oligonucleotides conjugated to minor groove binders | |
| JP5558811B2 (ja) | 核酸増幅のための化学的に修飾されたオリゴヌクレオチドプライマー | |
| JP2009017882A (ja) | 標的ハイブリダイゼーション検出のための、プローブおよびクランプのバイナリー組成物ならびに方法 | |
| AU8417391A (en) | Circular extension for generating multiple nucleic acid complements | |
| WO2001053307A1 (en) | 2'-arabino-fluorooligonucleotide n3'→p5'phosphoramidates: their synthesis and use | |
| AU5783899A (en) | Ligation assembly and detection of polynucleotides on solid-support | |
| AU2329497A (en) | Target nucleic acid sequence amplification | |
| JP2013518598A (ja) | ランダム化配列を含むプライマー及び特異的プライマーを用いる核酸の等温増幅並びにその使用 | |
| KR100901392B1 (ko) | 캐리어 핵산에 의한 핵산 증폭 특이성의 증진 | |
| JPH1099088A (ja) | 核酸の増幅方法 | |
| JP2017533733A (ja) | ハイブリダイゼーションプローブおよび方法 | |
| EP1624059A2 (en) | Method of producing nucleic acid molecules with reduced secondary structure | |
| MXPA98002007A (en) | Cebers modify | |
| WO2019150564A1 (ja) | スルホンアミド骨格をもつオリゴヌクレオチドを鋳型として用いたｄｎａ複製法 | |
| CA3242053A1 (en) | A method of capturing crispr endonuclease cleavage products | |
| WO2003072814A2 (en) | Improved method for allele-specific pcr |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| HFG4 | Patent granted, date of granting |
Effective date: 20041012 |