JP2024517835A - 二重標的アッセイによりデルタ型肝炎ウイルスを検出するための組成物及び方法 - Google Patents

Abstract

生物学的試料又は非生物学的試料中のデルタ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）の存在又は非存在を迅速に検出するための方法が記載される。本方法は、増幅する工程、ハイブリダイズする工程、及び検出する工程を実施することを含み得る。さらに、ＨＤＶの検出のために設計された、ＨＤＶリボザイムドメイン及びＨＤＶデルタ型肝炎抗原（ＨＤＡｇ）遺伝子を標的とするプライマー、プローブ、並びにキットが提供される。

Description

本開示は、分子診断の分野に関し、より詳細には、二重標的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）アッセイによるデルタ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）の検出に関する。

デルタ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）は、伝染及び伝播のためのＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）のサテライトであり、世界疾病負荷（ｇｌｏｂａｌ ｂｕｒｄｅｎ）は１５００万～２０００万と推定される。ＨＤＶ粒子は、直径が３５～３７ｎｍであり、ＨＢＶエンベロープに囲まれたリボ核タンパク質複合体を有する。リボ核タンパク質は、環状陰性一本鎖ウイルスＲＮＡゲノム、約１７００ヌクレオチド、及びＨＤＶタンパク質の２つのアイソフォーム（小型及び大型）から構成される。全長ＨＤＶゲノムの系統発生分析は、ＨＤＶを８つの遺伝子型及び多くのサブ遺伝子型に分類した。ＨＤＶ遺伝子型は、遺伝子型全体で２０％～３０％及びサブ遺伝子型内で１５％の特定の地理的分岐及び高い配列多様性を示す。

臨床的には、ＨＢＶ／ＨＤＶ二重感染は、ＨＢＶ感染単独と比較して、肝臓合併症のリスクが高く、死亡率が高い。ＨＤＶ感染によるより高いリスクを管理するために、陽性ＨＤＶ血清学を有する患者がＨＤＶ ＲＮＡ検出による活動性ＨＤＶ感染評価を受けることが推奨される。ＨＤＶ ＲＮＡを検出及び定量するために、社内及び市販の逆転写ポリメラーゼ連鎖反応アッセイのスコアが開発されている。しかしながら、アッセイ間で標準化が不足している。様々なＨＤＶ ＲＮＡ検出アッセイを評価するための国際的な品質管理研究は、１７か国に広がる２８の研究室のうちのわずか１３の研究室（４６．３％）しか適切なＨＤＶ定量化を示し、優れたアッセイ性能を示さなかった（Ｌｅ Ｇａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，２０１６，Ｖｏｌ．６４，Ｎｏ．５，ｐ．１４８３－１４９４に記載されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。）。

堅牢なＨＤＶ定量化に関連する主な課題としては、（ａ）ＨＤＶゲノムの高い遺伝的多様性、（ｂ）時間的及び空間的に偏った収集を伴う限られた数の配列、並びに（ｃ）編集及び組換えと組み合わせた高い突然変異率を有するＨＤＶ生物学が含まれる。したがって、当技術分野では、全てのＨＤＶ遺伝子型及びサブ遺伝子型を検出するための迅速で信頼性が高く、特異的で、高感度の方法が必要とされている。

本発明は、血液、血漿又は血清試料中のＨＤＶを検出及び定量するための逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）二重標的アッセイを開示する。上記のような堅牢なＨＤＶ検出に関連する課題は、ＨＤＶ ＲＮＡゲノム上の高い包括性のためにｉｎ－ｓｉｌｉｃｏで選択された２つのＨＤＶ標的、リボザイムドメイン及びデルタ型肝炎抗原（ＨＤＡｇ）遺伝子標的領域を検出することによって解決された。単一のＨＤＶ標的のみを検出する現在の研究室で開発された市販のＨＤＶアッセイと比較して、本発明における２つの高度に包括的な標的の検出は、１つの標的が急速なウイルス進化のために検出に失敗した場合にＨＤＶを適切に検出及び定量化するための追加の利点を提供することによってこの分野を進歩させた。

本開示の特定の実施形態は、生物学的試料又は非生物学的試料中のＨＤＶの存在又は非存在の迅速な検出、例えば、単一の試験管内でのＲＴ－ＰＣＲによるＨＤＶの多重検出のための方法に関する。実施形態は、増幅する工程及びハイブリダイズ工程を含み得る、少なくとも１つのサイクリング工程を実施することを含むＨＤＶの検出方法を含む。さらに、実施形態は、単一チューブ内のＨＤＶの検出のために設計されたプライマー、プローブ及びキットを含む。検出方法は、リボザイムドメイン及びデルタ型肝炎抗原（ＨＤＡｇ）遺伝子を標的とするように設計されており、これにより、ＨＤＶを単一の試験で検出することが可能になる。

一態様では、試料中のＨＤＶの少なくとも２つの標的核酸を検出するための方法が提供され、（ａ）試料を提供することと、（ｂ）ＨＤＶの少なくとも２つの標的核酸が試料中に存在する場合、試料を少なくとも２つのプライマーセットと接触させて増幅産物を生成することを含む増幅工程を実施することと、（ｃ）ＨＤＶの少なくとも２つの標的核酸が試料中に存在する場合、増幅産物を少なくとも２つのプローブと接触させることを含む、ハイブリダイゼーション工程を実施することと、（ｄ）検出する工程を実施することであって、増幅産物の存在又は非存在を検出することを含み、１つの増幅産物の存在が試料中のＨＤＶの存在を示し、増幅産物の非存在が試料中のＨＤＶの非存在を示し、少なくとも２つのプライマーセット及び少なくとも２つのプローブが、（ｉ）配列番号１～４又は配列番号１～４の任意の組み合わせの核酸配列を含むか又はそれからなるフォワードプライマーと、配列番号５～６の核酸配列又はそれらの組み合わせを含むか又はそれらからなるリバースプライマーとを含む第１のプライマーセット、及び配列番号７～８の核酸配列若しくはその相補体又は配列番号７～８の組み合わせ若しくはそれらの相補体を含むか又はそれらからなる第１のプローブ又は第１のプローブセット、並びに（ｉｉ）配列番号９～１０の核酸配列又はそれらの組み合わせを含むか又はそれらからなるフォワードプライマーと、配列番号１１～１２の核酸配列又はそれらの組み合わせを含むか又はそれらからなるリバースプライマーとを含む第２のプライマーセット、及び配列番号１３～１５の核酸配列若しくはそれらの相補体、又は配列番号１３～１５の任意の組み合わせ若しくはそれらの相補体を含むか又はそれらからなる第２のプローブ又は第２のプローブセットを含む、検出する工程を実施することと、を含む。関連する実施形態では、試料は生物学的試料である。別の関連する実施形態では、生物学的試料は、血液、血漿又は血清である。

更に別の実施形態では、第１のプライマーセットは、第１のプローブ又は第１のプローブセットによって検出される第１の標的核酸の１つ以上の増幅産物を生成し、第２のプライマーセットは、第２のプローブ又は第２のプローブセットによって検出される第２の標的核酸の１つ以上の増幅産物を生成する。一実施形態では、第１の標的核酸は、ＨＤＶリボザイムドメインであり、第２の標的核酸は、ＨＤＶデルタ型肝炎抗原（ＨＤＡｇ）遺伝子である。

別の態様では、試料中のＨＤＶを検出するための方法であって、（ａ）増幅する工程を実施することであって、試料を、ＨＤＶが試料中に存在する場合、ＨＤＶリボザイムドメインに特異的な１つ以上のフォワードプライマー及び１つ以上のリバースプライマーと接触させてリボザイムドメインの増幅産物を生成し、ＨＤＶが試料中に存在する場合、ＨＤＶデルタ型肝炎抗原（ＨＤＡｇ）遺伝子に特異的な１つ以上のフォワードプライマー及び１つ以上のリバースプライマーと接触させてＨＤＡｇ遺伝子の増幅産物を生成することを含む、増幅する工程を実施することと、（ｂ）ハイブリダイズする工程を実施することであって、リボザイムドメイン増幅産物をリボザイムドメインに特異的な１つ以上の検出可能なプローブと接触さること、及びＨＤＡｇ遺伝子増幅産物をＨＤＡｇ遺伝子に特異的な１つ以上の検出可能なプローブと接触させることを含む、ハイブリダイズする工程を実施することと、（ｃ）リボザイムドメイン増幅産物及び／又はＨＤＡｇ遺伝子増幅産物の存在又は非存在を検出することであって、リボザイムドメイン増幅産物若しくはＨＤＡｇ増幅産物のいずれか又は両方の増幅産物の存在が試料中のＨＤＶの存在を示し、リボザイムドメイン増幅産物及びＨＤＡｇ増幅産物の両方の非存在が試料中のＨＤＶの非存在を示し、１つ以上のリボザイムドメインフォワードプライマーが、配列番号１～４、又は配列番号１～４の任意の組み合わせから選択されるヌクレオチド配列を含むか又はそれからなり、１つ以上のリボザイムドメインリバースプライマーが、配列番号５～６又はそれらの組み合わせから選択されるヌクレオチド配列を含むか又はそれからなり、１つ以上の検出可能なリボザイムドメインプローブが、配列番号７～８若しくはそれらの相補体、又は配列番号７～８の組み合わせ若しくはそれらの相補体から選択されるヌクレオチド配列を含むか又はそれからなり、１つ以上のＨＤＡｇ遺伝子フォワードプライマーが、配列番号９～１０又はそれらの組み合わせから選択されるヌクレオチド配列を含むか又はそれからなり、１つ以上のＨＤＡｇ遺伝子リバースプライマーが、配列番号１１～１２から選択されるヌクレオチド配列、又はそれらの組み合わせを含むか又はそれからなり、１つ以上の検出可能なＨＤＡｇ遺伝子プローブが、配列番号１３～１５若しくはそれらの相補体、又は配列番号１３～１５の任意の組み合わせ若しくはそれらの相補体から選択されるヌクレオチド配列を含むか又はそれからなる、リボザイムドメイン増幅産物及び／又はＨＤＡｇ遺伝子増幅産物の存在又は非存在を検出することと、を含む、試料中のＨＤＶを検出するための方法が提供される。

一実施形態では、リボザイムドメイン標的の増幅は、配列番号１～４のヌクレオチド配列を含むか又はそれからなる全てのフォワードプライマー、及び配列番号５～６のヌクレオチド配列を含むか又はそれからなる両方のリバースプライマーを使用することを含み、リボザイムドメイン増幅産物の検出は、配列番号７～８のヌクレオチド配列又はその相補体を含むか又はそれからなる両方の検出可能なプローブを使用することを含む。別の実施形態では、ＨＤＡｇ遺伝子標的の増幅は、配列番号９～１０のヌクレオチド配列を含むか又はそれからなる両方のフォワードプライマー、及び配列番号１１～１２のヌクレオチド配列を含むか又はそれからなる両方のリバースプライマーを使用することを含み、ＨＤＡｇ遺伝子増幅産物の検出は、配列番号１３～１５のヌクレオチド配列又はその相補体を含むか又はそれからなる全ての検出可能なプローブを使用することを含む。一実施形態では、試料は、生物学的試料である。具体的には、生物学的試料は、血液、血漿又は血清である。

他の態様は、５０以下のヌクレオチドを有する、配列番号１～２０から選択されるヌクレオチドの配列若しくはその相補体を含むか、又はそれらからなるオリゴヌクレオチドを提供する。別の実施形態では、本開示は、配列番号１～２０若しくはその相補体の１つと少なくとも７０％の配列同一性（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％若しくは９５％等）を有する核酸を含むオリゴヌクレオチドであって、５０個以下のヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドを提供する。一般に、これらのオリゴヌクレオチドは、これらの実施形態では、プライマー核酸、プローブ核酸等であり得る。これらの実施形態の一定のものでは、オリゴヌクレオチドは、４０個以下のヌクレオチド（例えば、３５個以下のヌクレオチド、３０個以下のヌクレオチド、２５個以下のヌクレオチド、２０個以下のヌクレオチド、１５個以下のヌクレオチド等）を有する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、例えば、未修飾ヌクレオチドと比較して核酸ハイブリダイゼーション安定性を変化させるために、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドは、任意に少なくとも１つの標識部分及び任意に少なくとも１つのクエンチャー部分を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの標識部分及び少なくとも１つのクエンチャー部分は、蛍光部分である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの保存的に修飾された変異を含む。特定の核酸配列の「保存的に修飾された変異」若しくは単に「保存的変異」とは、同一若しくは本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸、若しくは核酸がアミノ酸配列をコードしない場合、本質的に同一の配列を指す。当技術分野の当業者であれば、コードされた配列中の単一のヌクレオチド又は低いパーセント比率のヌクレオチド（典型的には５％未満、より典型的には４％、２％又は１％未満）を変更、付加又は欠失させる個々の置換、欠失又は付加は、修飾がアミノ酸の欠失、アミノ酸の付加、又は化学的に類似したアミノ酸によるアミノ酸の置換をもたらす「保存的に修飾された変異」であることを認識するであろう。

一態様では、増幅は、５’－３’ヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ酵素を用いることができる。したがって、第１及び第２の蛍光部分である標識部分及びクエンチャー部分は、プローブの長さに沿って互いに８ヌクレオチド以内であり得る。別の態様では、リボザイムドメイン及び／又はＨＤＡｇ遺伝子プローブは、二次構造の形成を可能にする核酸配列を含む。そのような二次構造の形成は、一般に、第１の蛍光部分と第２の蛍光部分との間の空間的近接をもたらす。この方法によれば、プローブ上の第２の蛍光部分はクエンチャーであり得る。

一態様では、リボザイムドメイン及びＨＤＡｇ遺伝子プローブは、レポーターとして作用する蛍光色素で標識され得る。プローブはまた、クエンチャーとして作用する第２の色素を有し得る。レポーター色素は、規定された波長で測定され、したがって、増幅されたＨＤＶリボザイムドメイン及びＨＤＡｇ遺伝子標的の検出及び識別を可能にする。インタクトなプローブの蛍光シグナルは、クエンチャー色素によって抑制される。ＰＣＲの増幅工程中、特定の一本鎖ＤＮＡテンプレートへのプローブのハイブリダイゼーションにより、ＤＮＡポリメラーゼの５’－３’ヌクレアーゼ活性による切断をもたらし、レポーター及びクエンチャー色素の分離、及び蛍光シグナルの発生をもたらす。各ＰＣＲサイクルに伴い、切断されたプローブの量は増加し、レポーター色素の累積シグナルはそれに伴って増加する。任意に、１つ以上の追加のプローブ（例えば、内部参照対照又は他の標的化プローブ（例えば、他のウイルス核酸））もまた、リボザイムドメイン及びＨＤＡｇ遺伝子プローブに関連する蛍光色素標識とは独特かつ異なるレポーター蛍光色素で標識され得る。そのような場合、特定のレポーター色素が規定された波長で測定されるので、増幅された標的及び１つ以上の追加のプローブの同時検出及び識別が可能である。

本開示は、個体由来の生物学的試料中のＨＤＶ又はＨＤＶ核酸の存在又は非存在を検出する方法を提供する。これらの方法は、診断試験に使用するために、血清、血漿、全血、肝臓組織又はＨＤＶが存在すると考えられる他の生体物質等の生物学的試料中のＨＤＶ又はＨＤＶ核酸の存在又は非存在を検出するために使用することができる。さらに、ＨＤＶ又はＨＤＶ核酸を検出するために他の試料タイプを評価するために、当業者によって同じ試験を使用してもよい。そのような方法は、一般に、逆転写工程と、増幅する工程、及び検出可能なプローブ結合工程又は色素結合工程のいずれかを含む少なくとも１つのサイクリング工程とを行うことを含む。典型的には、増幅する工程は、核酸分子が試料中に存在する場合、試料を複数対のオリゴヌクレオチドプライマーと接触させて１つ以上の増幅産物を生成することを含み、プローブ結合工程は、増幅産物を増幅産物に特異的な１つ以上の検出可能なプローブと接触させることを含み、色素結合工程は、増幅産物を二本鎖ＤＮＡ結合色素と接触させることを含む。そのような方法はまた、増幅産物への二本鎖ＤＮＡ結合色素の結合の存在若しくは非存在を検出することを含み、結合の存在は試料中にＨＤＶ又はＨＤＶ核酸が存在することを示し、結合の非存在は試料中にＨＤＶ又はＨＤＶ核酸が存在しないことを示す。代表的な二本鎖ＤＮＡ結合色素は、臭化エチジウムである。他の核酸結合色素としては、ＤＡＰＩ、Ｈｏｅｃｈｓｔ色素、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（登録商標）、ＯｌｉＧｒｅｅｎ（登録商標）、並びにＹＯ－ＹＯ（登録商標）及びＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ等のシアニン色素が挙げられる。さらに、そのような方法はまた、増幅産物と二本鎖ＤＮＡ結合色素との間の融解温度を決定することを含み得、融解温度により、ＨＤＶ又はＨＤＶ核酸の存在又は非存在が確認される。

さらなる態様では、ＨＤＶの１つ以上の標的核酸を検出するためのキットが提供される。一実施形態では、試料中のＨＤＶの第１の標的核酸及びＨＤＶの第２の標的核酸を検出するためのキットが提供され、該キットは、（ａ）５’－３’ヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼと、（ｂ）ヌクレオチドモノマーと、（ｃ）ＨＤＶの第１の標的核酸を検出するための第１のプライマーセット及び第１のプローブ又は第１のプローブセットであって、第１のプライマーセット及び第１のプローブ又は第１のプローブセットが、少なくとも、配列番号１～４の核酸配列及び配列番号１～４の任意の組み合わせを含むか又はそれらからなるフォワードプライマーと、少なくとも、配列番号５～６の核酸配列又はそれらの組み合わせを含むか又はそれらからなるリバースプライマーとを含み、第１のプローブ又は第１のプローブセットが、配列番号７～８の核酸配列若しくはそれらの相補体、又は配列番号７～８の組み合わせ若しくはそれらの相補体を含む、ＨＤＶの第１の標的核酸を検出するための第１のプライマーセット及び第１のプローブ又は第１のプローブセットと、（ｄ）ＨＤＶの第２の標的核酸を検出するための第２のプライマーセット及び第２のプローブ又は第２のプローブセットであって、第２のプライマーセット及び第２のプローブ又は第２のプローブセットが、少なくとも、配列番号９～１０の核酸配列又はそれらの組み合わせを含むか又はそれらからなるフォワードプライマーと、少なくとも、配列番号１１～１２の核酸配列又はそれらの組み合わせを含むか又はそれらからなるリバースプライマーとを含み、第２のプローブ又は第２のプローブセットが、配列番号１３～１５の核酸配列若しくはそれらの相補体、又は配列番号１３～１５の任意の組み合わせ若しくはそれらの相補体を含む、ＨＤＶの第２の標的核酸を検出するための第２のプライマーセット及び第２のプローブ又は第２のプローブセットとを含む、増幅試薬を含む。一実施形態では、第１の標的核酸は、ＨＤＶリボザイムドメインであり、第２の標的核酸は、ＨＤＶデルタ型肝炎抗原（ＨＤＡｇ）遺伝子である。さらなる実施形態では、ＨＤＶの１つ以上の標的核酸を検出するためのキットが提供される。キットは、リボザイムドメイン標的及び／又はＨＤＡｇ遺伝子標的の増幅に特異的なリボザイムドメイン及び／又はＨＤＡｇ遺伝子プライマーの複数のセットと、それぞれの増幅産物の検出に特異的な１つ以上の検出可能なリボザイムドメイン及び／又はＨＤＡｇ遺伝子プローブとを含み得る。キットは、ドナー蛍光部分及び対応するアクセプター蛍光部分で既に標識されたプローブを含むことができ、又はプローブを標識するための蛍光部分を含むことができる。キットはまた、ヌクレオシド三リン酸、核酸ポリメラーゼ、及び核酸ポリメラーゼの機能に必要な緩衝液を含み得る。キットはまた、添付文書並びにプライマー、プローブ及びフルオロフォア部分を使用して試料中のＨＤＶの存在又は非存在を検出するための説明書を含み得る。

別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されている意味と同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと同様又は同等の方法及び材料が本主題の実施又は試験で使用され得るが、好適な方法及び材料が以下に記載される。加えて、材料、方法、及び実施例は例示にすぎず、限定であることは意図されない。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、参照によりその全体が援用される。矛盾する場合は、定義をも含む本明細書が優先する。

本発明の１つ以上の実施形態の詳細は、添付の図面及び以下の説明に示されている。本発明の他の特徴、目的及び利点は、図面及び発明を実施するための形態、並びに特許請求の範囲から明らかになるであろう。

図１は、ＨＤＶリボザイムドメイン標的の増幅及び検出に使用されるプライマー及びプローブの、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ ０９８２６１（ＨＤＶ遺伝子型１）に対する相対位置を示す。 図２は、ＨＤＶ ＨＤＡｇ遺伝子標的の増幅及び検出に使用されるプライマー及びプローブの、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ０９８２６１に対する相対位置を示す。 図３は、それぞれ２５、１０、５、２、１及び０．５ＩＵ／ｍＬレベルで２４回反復するＷＨＯ ＨＤＶ ＮＡＴを使用してアッセイ感度を決定するための実施例４に記載された実験の結果を示す。 図４は、ＨＤＶアーマード（ａｒｍｏｒｅｄ）ＲＮＡ（ａｒＲＮＡ）を１００コピー／ｍＬ～１０^１０コピー／ｍＬの濃度で８回反復で試験したアッセイ直線性を決定するために実施例４に記載した実験の結果を示す。 図５は、陽性血漿試料からのＨＤＶ ＲＮＡを２．３Ｅ＋００ＩＵ／ｍＬ～２．３Ｅ＋０５ＩＵ／ｍＬの間で１０倍希釈ごとに３回反復で試験したアッセイ直線性を決定するために実施例４に記載された実験の結果を示す。 図６は、実施例３に記載されるように、リボザイムドメイン及びＨＤＡｇ遺伝子についてｉｎ ｖｉｔｒｏ転写ＨＤＶ遺伝子型１～８配列を使用して二重標的アッセイの包括性を決定するための実施例４に記載される実験の結果を示す。各遺伝子型を１０^３コピー～１０^７コピーの４ｌｏｇ濃度範囲にわたって試験した。

核酸増幅によるＨＤＶ感染の診断は、ウイルス感染を迅速かつ正確に検出するための方法を提供する。試料中のＨＤＶを検出するためのリアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）アッセイを本明細書に記載する。ＨＤＶを検出するためのプライマー及びプローブが提供され、そのようなプライマー及びプローブを含有する製造品又はキットも提供される。他の方法と比較してＨＤＶの検出のためのリアルタイムＰＣＲの感度の上昇、並びに試料の封じ込め及び増幅産物のリアルタイム検出を含むリアルタイムＰＣＲの機能が改善されたことにより、臨床検査室におけるＨＤＶ感染症の日常的な診断のためのこの技術の実施が実現可能になる。

デルタ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）は、ウイルス粒子の形成のためにＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）に依存する感染因子である。ＨＤＶゲノムは、立体配座が環状である約１７００ヌクレオチド長の小さな一本鎖ＲＮＡである。ゲノムＲＮＡは、約７４％の塩基対合を使用して折り畳み、非分枝棒状構造を形成することができる。ＨＤＶゲノムの複製は、ＲＮＡ中間体を含む対称的なローリングサークル機構を介して起こり、抗原として知られる新しいゲノム及び相補的ＲＮＡ種の蓄積をもたらす。古典的なＨＤＶ感染では、ＨＤＶゲノム複製中に感染細胞あたり最大３００，０００コピーのゲノム及び１００，０００コピーの抗ゲノムが蓄積する。ゲノムＲＮＡ環及び抗ゲノムＲＮＡ環は、１７００ヌクレオチド単位長より長い両極性の多量体鎖の生成のためのテンプレートとして作用すると考えられる。これらは、ゲノム及び抗ゲノムの両方に部位特異的リボザイム配列が存在するため、単位長ＲＮＡにプロセシングされる。リボザイム切断後、単位長ＲＮＡを連結して新しい環状ＲＮＡ種を形成する。ＨＤＶはそれ自体のレプリカーゼをコードせず、その宿主内で自律的に複製することができることから、１つ以上の宿主ＲＮＡポリメラーゼはその複製のためにリダイレクトされる（Ｔａｙｌｏｒ ａｎｄ Ｐｅｌｃｈａｔ，Ｆｕｔｕｒｅ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ５：３９３－４０２，２０１０）。

約９００ヌクレオチド長及び抗ゲノム極性の第３のＨＤＶ ＲＮＡ種もまた、古典的ＨＤＶＨＢＶ感染において感染細胞あたり約５００コピーで生成される。このＲＮＡのオープンリーディングフレームは、１９５アミノ酸長のタンパク質をコードし、本開示では小デルタ抗原（Ｓ－ＨＤＡｇ）と呼ばれ、単にＨＤＡｇと呼ばれる。複製中、ｄｓＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼは、ＨＤＡｇの終止コドン中のアデノシンをイノシンに変換する。このアミノ酸変換は、終止コドンがトリプトファンをコードするｍＲＮＡの生成につながり、その結果、大デルタ抗原（Ｌ－ＨＤＡｇ）（Ｔａｙｌｏｒ ａｎｄ Ｐｅｌｃｈａｔ，Ｆｕｔｕｒｅ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ５：３９３－４０２，２０１０）と呼ばれる、Ｃ末端が１９アミノ酸長い第２のウイルスタンパク質種が産生される。

多数の分離株の広範な配列分析は、異なる地理的分布を有する少なくとも８つの異なるクレードにおけるＨＤＶの分類をもたらした。遺伝子型１は世界中で流行しており、他の遺伝子型は世界の様々な地域に固有である。遺伝子型２は、東南アジア、台湾、中国及び日本で見出される。遺伝子型３は、アマゾン川流域に固有のものである。遺伝子型４は、台湾及び日本で見出される。最後に、遺伝子型５～８は、アフリカで流行している。

開示される方法は、リボザイムドメインプライマーの１つ以上の対及び／又はＨＤＡｇ遺伝子プライマーの１つ以上の対を使用して、試料からのＨＤＶリボザイムドメイン核酸標的及びＨＤＶ ＨＤＡｇ遺伝子核酸標的の１つ以上の部分を増幅することを含む少なくとも１つのサイクリング工程を実施することを含み得る。本明細書で使用される場合、「リボザイムドメインプライマー」又は「ＨＤＡｇプライマー」は、それぞれリボザイムドメイン及びＨＤＡｇ遺伝子の核酸配列に特異的にアニーリングし、適切な条件下でそこからＤＮＡ合成を開始するオリゴヌクレオチドプライマーを指す。検討されるリボザイムドメイン又はＨＤＡｇ遺伝子プライマーは各々、各増幅産物の少なくとも一部が標的に対応する核酸配列を含むように、それぞれの標的核酸分子内又はそれに隣接する標的にアニーリングする。１つ以上のリボザイムドメイン核酸及び／又はＨＤＡｇ遺伝子核酸が試料中に存在することを条件として、１つ以上のリボザイムドメイン増幅産物及び／又はＨＤＡｇ遺伝子増幅産物が生成され、したがって、これらの１つ以上の増幅産物の存在が試料中のＨＤＶの存在を示す。増幅産物は、リボザイムドメイン又はＨＤＡｇ遺伝子の１つ以上の検出可能なプローブに相補的な核酸配列を含まなければならない。各サイクリング工程は、増幅工程、ハイブリダイゼーション工程及び検出する工程を含み、試料を、試料中のＨＤＶの存在又は非存在を検出するために、リボザイムドメイン又はＨＤＡｇ遺伝子についての１つ以上の検出可能なプローブと接触させる。

本明細書で使用される場合、「増幅する」という用語は、テンプレート核酸分子の一方又は両方の鎖に相補的な核酸分子を合成するプロセスを指す（例えば、ＨＤＶリボザイムドメイン又はＨＤＶ ＨＤＡｇ遺伝子）。核酸分子を増幅することは、典型的には、テンプレート核酸を変性すること、プライマーの融解温度未満の温度でプライマーをテンプレート核酸にアニーリングすること、及びプライマーから酵素的に伸長して増幅産物を生成することを含む。増幅には、典型的には、デオキシリボヌクレオシド三リン酸、ＤＮＡポリメラーゼ酵素（例えば、Ｐｌａｔｉｎｕｍ（登録商標）Ｔａｑ）並びにポリメラーゼ酵素の最適な活性のための適切な緩衝液及び／又は補因子（例えば、ＭｇＣｌ_２及び／又はＫＣｌ）の存在が必要である。

本明細書で使用される「プライマー」という用語は、当業者に知られており、オリゴマー化合物、主にオリゴヌクレオチドだけでなく、テンプレート依存性ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成を「プライミング」することができる修飾オリゴヌクレオチド、すなわち、例えばオリゴヌクレオチドの３’末端が遊離３’－ＯＨ基を提供し、それによってデオキシヌクレオシド三リン酸が使用され、それによってピロリン酸が放出される３’～５’ホスホジエステル結合を確立するテンプレート依存性ＤＮＡポリメラーゼによって更に「ヌクレオチド」が結合され得ることを指す。したがって、おそらく意図された機能を除いて、「プライマー」、「オリゴヌクレオチド」、又は「プローブ」の間に基本的な違いはない。

「ハイブリダイズする」という用語は、増幅産物への１つ以上のプローブのアニーリングを指す。ハイブリダイゼーション条件は、典型的には、プローブの融解温度より低いが、プローブの非特異的ハイブリダイゼーションを回避する温度を含む。

「５’から３’へのヌクレアーゼ活性」という用語は、典型的には核酸鎖合成に関連し、それによってヌクレオチドが核酸鎖の５’末端から除去される核酸ポリメラーゼの活性を指す。

「熱安定性ポリメラーゼ」という用語は、熱安定性であるポリメラーゼ酵素を指し、該酵素は、テンプレートに相補的なプライマー伸長産物の形成を触媒し、二本鎖テンプレート核酸の変性をもたらすのに必要な時間にわたり高温に曝された場合、不可逆的には変性しない。一般に、合成は各プライマーの３’末端で開始され、テンプレート鎖に沿って５’から３’方向へ進行する。熱安定性ポリメラーゼは、例えば、サーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｌａｖｕｓ）、Ｔ．ルーバー（Ｔ．ｒｕｂｅｒ）、Ｔ．サーモフィルス（Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｔ．アクアティカス（Ｔ．ａｑｕａｔｉｃｕｓ）、Ｔ．ラクテウス（Ｔ．ｌａｃｔｅｕｓ）、Ｔ．ルベンス（Ｔ．ｒｕｂｅｎｓ）、バチルス・ステアロテルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、及びメタノサーマス・フェルビダス（Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｕｓ ｆｅｒｖｉｄｕｓ）から単離される。それにもかかわらず、酵素が補充されるならば、熱安定性でないポリメラーゼをＰＣＲアッセイに使用することもできる。

「その相補体」という用語は、所与の核酸と同じ長さであり、正確に相補的である核酸を指す。

核酸に関して使用される場合の「伸長」又は「延長」という用語は、追加のヌクレオチド（又は他の類似の分子）が核酸に組み込まれる場合を指す。例えば、核酸は、典型的には核酸の３’末端にヌクレオチドを付加するポリメラーゼ等の生体触媒を組み込むヌクレオチドによって任意に伸長される。

２つ以上の核酸配列の状況における「同一」又は「パーセント同一性」という用語は、例えば、当業者に利用可能な配列比較アルゴリズムの１つを使用して、又は目視検査によって測定された最大の一致について、比較又はアラインした場合、同一であるか、又は同一のヌクレオチド特定のパーセンテージを有する２つ以上の配列又は部分配列を指す。パーセント配列同一性及び配列類似性の決定に適した例示的なアルゴリズムは、ＢＬＡＳＴプログラムであり、例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０）“Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ”Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０、Ｇｉｓｈ ｅｔ ａｌ．（１９９３）“Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｄｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎｓ ｂｙ ｄａｔａｂａｓｅ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ ｓｅａｒｃｈ”Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．３：２６６－２７２、Ｍａｄｄｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９６）“Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｎｅｔｗｏｒｋ ＢＬＡＳＴ ｓｅｒｖｅｒ”Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：１３１－１４１、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９７）“Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ ａｎｄ ＰＳＩ－ＢＬＡＳＴ：ａ ｎｅｗ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａｂａｓｅ ｓｅａｒｃｈ ｐｒｏｇｒａｍｓ”Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２、及びＺｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９７）“ＰｏｗｅｒＢＬＡＳＴ：Ａ ｎｅｗ ｎｅｔｗｏｒｋ ＢＬＡＳＴ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ ｏｒ ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ”Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．７：６４９－６５６に記載されており、これらはそれぞれ参照により本明細書に組み込まれる。

オリゴヌクレオチドの文脈における「修飾ヌクレオチド」とは、オリゴヌクレオチド配列のうちの少なくとも１つのヌクレオチドで、オリゴヌクレオチドに所望の特性を提供する異なるヌクレオチドによって置き換えられる変化を指す。本明細書中に記載されるオリゴヌクレオチドにおいて置換され得る例示的な修飾ヌクレオチドとしては、例えば、Ｃ５－メチル－ｄＣ、Ｃ５－エチル－ｄＣ、Ｃ５－メチル－ｄＵ、Ｃ５－エチル－ｄＵ、２，６－ジアミノプリン、Ｃ５－プロピニル－ｄＣ、Ｃ５－プロピニル－ｄＵ、Ｃ７－プロピニル－ｄＡ、Ｃ７－プロピニル－ｄＧ、Ｃ５－プロパルギルアミノ－ｄＣ、Ｃ５－プロパルギルアミノ－ｄＵ、Ｃ７－プロパルギルアミノ－ｄＡ、Ｃ７－プロパルギルアミノ－ｄＧ、７－デアザ－２－デオキシキサントシン、ピラゾロピリミジン類縁体、擬似ｄＵ、ニトロピロール、ニトロインドール、２’－Ｏ－メチルリボーＵ、２’－Ｏ－メチルリボーＣ、Ｎ４－エチル－ｄＣ、Ｎ６－メチル－ｄＡ等が挙げられる。オリゴヌクレオチド中で置換され得る多くの他の修飾ヌクレオチドは、本明細書で言及されるか、又は当技術分野で知られている。特定の実施形態では、修飾ヌクレオチド置換は、対応する修飾されていないオリゴヌクレオチドの融解温度と比較して、該オリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔｍ）を修飾する。更に説明すると、特定の修飾ヌクレオチド置換は、いくつかの実施形態では、非特異的核酸増幅（例えば、プライマーダイマー形成等を最小限に抑える）を減少させ、意図する標的アンプリコンの収率を増加させること等ができる。これらのタイプの核酸修飾の例は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，００１，６１１号に記載されている。これらのタイプの核酸修飾の例は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，００１，６１１号に記載されている。

本開示は、例えば、ＨＤＶリボザイムドメイン核酸配列及び／又はＨＤＶデルタ型肝炎抗原（ＨＤＡｇ）遺伝子核酸配列の一部を増幅することによって、デルタ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）を検出する方法を提供する。ＨＤＶの様々な遺伝子型及びサブ遺伝子型の核酸配列が利用可能である（例えば、遺伝子型１についてはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ０９８２６１、遺伝子型２についてはＡＦ１０４２６４、遺伝子型３についてはＡＢ０３７９４８、遺伝子型４についてはＡＢ１１８８２０、遺伝子型５についてはＡＭ１８３３２６、遺伝子型６についてはＡＭ１８３３３２、遺伝子型７についてはＡＭ１８３３３３、遺伝子型８についてはＡＭ１８３３３０）。具体的には、リボザイムドメイン及びＨＤＡｇ遺伝子核酸分子標的を増幅及び検出するためのプライマー及びプローブが、本開示の実施形態によって提供される。

ＨＤＶの検出のために、リボザイムドメイン及び／又はＨＤＡｇ遺伝子を増幅するためのプライマー及びプローブが提供される。本明細書に例示されるもの以外のＨＤＶ核酸も、試料中のＨＤＶを検出するために使用することができる。例えば、機能的変異体は、日常的な方法を使用して当業者によって特異度及び／又は感度について評価され得る。代表的な機能的変異体は、例えば、本明細書に開示されるＨＤＶ核酸における１つ以上の欠失、挿入及び／又は置換を含み得る。

より具体的には、オリゴヌクレオチドの実施形態はそれぞれ、配列番号１～２０から選択される配列を有する核酸、配列番号１～２０の１つと少なくとも、例えば８０％、９０％、若しくは９５％の配列同一性を有するその実質的に同一の変異体、又は配列番号１～２０の相補体及びその変異体を含む。

一実施形態では、ＨＤＶを含有すると疑われる生物学的試料中のＨＤＶの検出を提供するために、ＨＤＶリボザイムドメイン及びＨＤＡｇ遺伝子プライマー及びプローブの上述のセットが使用される。プライマー及びプローブのセットは、配列番号１～２０の核酸配列を含むか又はそれからなる、リボザイムドメイン又はＨＤＡｇ遺伝子核酸配列に特異的なプライマー及びプローブを含むか又はそれからなり得る。別の実施形態では、リボザイムドメイン及びＨＤＡｇ遺伝子標的に対するプライマー及びプローブは、配列番号１～１５のプライマー及びプローブのいずれかの機能的に活性な変異体を含むか、又はそれからなる。

配列番号１～２０のプライマー及び／又はプローブのいずれかの機能的に活性な変異体は、開示される方法においてプライマー及び／又はプローブを使用することによって同定され得る。配列番号１～２０のいずれかのプライマー及び／又はプローブの機能的に活性な変異体は、記載された方法又はキットにおいて、配列番号１～２０のそれぞれの配列と比較して、同様又はより高い特異性及び感度を提供するプライマー及び／又はプローブに関する。

変異体は、例えば、配列番号１～２０のそれぞれの配列の５’末端及び／又は３’末端における１つ以上のヌクレオチドの付加、欠失又は置換等の１つ以上のヌクレオチドの付加、欠失又は置換によって、配列番号１～２０の配列から変化し得る。上に詳述したように、プライマー（及び／又はプローブ）は化学的に修飾されていてもよく、すなわち、プライマー及び／又はプローブは修飾ヌクレオチド又は非ヌクレオチド化合物を含んでいてもよい。したがって、プローブ（又はプライマー）は修飾オリゴヌクレオチドである。「修飾ヌクレオチド」（又は「ヌクレオチド類縁体」）は、いくつかの修飾によって天然の「ヌクレオチド」とは異なるが、依然として、塩基若しくは塩基様化合物、ペントフラノシル糖若しくはペントフラノシル糖様化合物、リン酸部分若しくはリン酸様部分、又はそれらの組み合わせからなる。例えば、「ヌクレオチド」の塩基部分に「標識」を付着させて、「修飾ヌクレオチド」を得ることができる。「ヌクレオチド」中の天然塩基はまた、例えば、７－デスアザプリンによって置き換えられてもよく、それによっても同様に「修飾ヌクレオチド」が得られる。「修飾ヌクレオチド」又は「ヌクレオチド類縁体」という用語は、本出願において互換的に使用される。「修飾ヌクレオシド」（又は「ヌクレオシド類縁体」）は、「修飾ヌクレオチド」（又は「ヌクレオチド類縁体」）について上に概説したような様式で、いくらかの修飾により天然のヌクレオシドとは異なる。

リボザイムドメイン又はＨＤＡｇ遺伝子核酸配列から核酸分子を増幅する修飾オリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオチド類縁体を含むオリゴヌクレオチドは、例えば、ＯＬＩＧＯ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｉｎｓｉｇｈｔｓ Ｉｎｃ．、コロラド州カスケード）等のコンピュータプログラムを使用して設計することができる。増幅プライマーとして使用されるオリゴヌクレオチドを設計する際の重要な特徴としては、検出（例えば、電気泳動によって）を容易にするための適切なサイズの増幅産物、一対のプライマーのメンバーに対する同様の融解温度、及び各プライマーの長さ（すなわち、プライマーは、配列特異性でアニーリングし、合成を開始するのに十分な長さである必要があるが、オリゴヌクレオチド合成中に忠実度が低下するほど長くはない）が挙げられるが、これらに限定されない。典型的には、オリゴヌクレオチドプライマーは８～５０ヌクレオチド長（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８又は５０ヌクレオチド長）である。例えば、オリゴヌクレオチドプライマーは、最大３０、３５、又は４０ヌクレオチド長であり得る。

プライマーのセットに加えて、本方法は、ＨＤＶの存在若しくは非存在を検出するために１つ以上のプローブを使用し得る。「プローブ」という用語は、合成的又は生物学的に生成された核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）を指し、これは、設計又は選択により、定義された所定のストリンジェンシーの下で、ＨＤＶリボザイムドメイン（標的）核酸及び／又はＨＤＶ ＨＤＡｇ遺伝子（標的）核酸に特異的に（すなわち、優先的に）ハイブリダイズすることを可能にする特定のヌクレオチド配列を含む。「プローブ」は、標的核酸を検出することを意味する「検出プローブ」と呼ぶこともできる。

いくつかの実施形態では、記載されるリボザイムドメイン及びＨＤＡｇ遺伝子プローブは、少なくとも１つの蛍光標識で標識することができる。一実施形態では、リボザイムドメイン及びＨＤＡｇ遺伝子プローブは、ドナー蛍光部分、例えば蛍光色素、及び対応するアクセプター蛍光部分、例えばクエンチャーで標識することができる。一実施形態では、プローブは蛍光部分を含むか又はそれからなり、核酸配列は配列番号７、８、１３、１４及び１５を含むか又はそれからなる。

プローブとして使用されるオリゴヌクレオチドの設計は、プライマーの設計と同様の様式で行うことができる。実施形態は、増幅産物の検出のために単一のプローブ又は一対のプローブを使用することができる。実施形態に応じて、使用するプローブ（複数可）は、少なくとも１種の標識及び／又は少なくとも１種のクエンチャー部分を含み得る。プライマーと同様に、プローブは通常、同様の融解温度を有し、各プローブの長さは、配列特異的ハイブリダイゼーションが起こるのに十分でなければならないが、合成中に正確性が低下するほど長くはない。オリゴヌクレオチドプローブは、一般に１５～３０（例えば、１６、１８、２０、２１、２２、２３、２４、又は２５）ヌクレオチド長である。いくつかの例では、オリゴヌクレオチドプローブは、最大３０、３５、又は４０ヌクレオチド長であり得る。

ＨＤＶ核酸分子を含有するコンストラクトを、宿主細胞内で増殖させ得る。本明細書で使用される場合、宿主細胞という用語は、原核生物及び真核生物、例えば酵母、植物及び動物細胞を含むことを意味する。原核生物宿主には、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、サルモネラ・チフィリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、セラチア・マルセセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）及びバチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）が含まれ得る。真核生物宿主としては、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、Ｓ．ポンベ（Ｓ．ｐｏｍｂｅ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）等の酵母、ＣＯＳ細胞又はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞等の哺乳動物細胞、昆虫細胞、並びにアラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）及びニコチアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）等の植物細胞が挙げられる。コンストラクトを、当業者に一般的に知られている技術のいずれかを使用して宿主細胞に導入することができる。例えば、リン酸カルシウム沈殿、エレクトロポレーション、熱ショック、リポフェクション、マイクロインジェクション及びウイルス媒介核酸移入は、核酸を宿主細胞に導入するための一般的な方法である。さらに、ネイキッドＤＮＡを細胞に直接送達することができる（例えば、米国特許第５，５８０，８５９号及び同第５，５８９，４６６号）。

米国特許第４，６８３，２０２号、同第４，６８３，１９５号、同第４，８００，１５９号及び同第４，９６５，１８８号には、従来のＰＣＲ技術が開示されている。ＰＣＲは、典型的には、選択された核酸テンプレート（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ）に結合する２種のオリゴヌクレオチドプライマーを用いる。いくつかの実施形態において有用なプライマーには、記載されたＨＤＶリボザイムドメイン核酸配列（例えば、配列番号１～６）及びＨＤＶ ＨＤＡｇ遺伝子核酸配列（例えば、配列番号９～１２）内の核酸合成の開始点として作用することができるオリゴヌクレオチドが含まれる。プライマーは、従来の方法によって制限消化物から精製され得るか、又は合成的に生成され得る。プライマーは増幅における最大効率には一本鎖が好ましいが、プライマーは二本鎖であってもよい。二本鎖プライマーは、最初に変性される、すなわち、鎖を分離するために処理される。二本鎖核酸を変性させる１つの方法は、加熱によるものである。

テンプレート核酸が二本鎖である場合、ＰＣＲでテンプレートとして使用され得る前に、二本の鎖を分離することが必要である。鎖分離は、物理的、化学的、又は酵素的手段を含む任意の好適な変性方法によって達成することができる。核酸鎖を分離する１つの方法は、核酸が優位に変性する（例えば、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は９５％を超える変性）まで加熱することを含む。テンプレート核酸を変性させるのに必要な加熱条件は、例えば、緩衝塩濃度、並びに変性される核酸の長さ及びヌクレオチド組成に依存するが、典型的には、温度及び核酸長等の反応の特徴に応じて、約９０℃～約１０５℃の範囲である。変性は、典型的には、約３０秒間～４分間（例えば、１分～２分３０秒、又は１．５分）行われる。

二本鎖のテンプレート核酸が熱により変性された場合、反応混合物を、記載されるリボザイムドメイン及びＨＤＡｇ遺伝子核酸分子上のその標的配列に対する各プライマーのアニーリングを促進する温度まで冷却させる。アニーリングの温度は、通常、約３５℃～約６５℃、（例えば、約４０℃～約６０℃、約４５℃～約５０℃）である。アニーリング時間は、約１０秒～約１分（例えば、約２０秒～約５０秒、約３０秒～約４０秒）であり得る。次いで、ポリメラーゼの活性が促進又は最適化される温度、すなわち、アニーリングされたプライマーから伸長が起こって、テンプレート核酸に相補的な生成物を生成するのに充分な温度に、反応混合物を調節する。温度は、核酸テンプレートにアニーリングされた各プライマーから伸長生成物を合成するのに充分でなくてはならないが、その相補的なテンプレートから伸長生成物を変性させるほど高くすべきではない（例えば、伸長のための温度は、概して、約４０℃～約８０℃（例えば、約５０℃～約７０℃、約６０℃）の範囲である）。伸長時間は、約１０秒～約５分（例えば、約３０秒～約４分、約１分～約３分、約１分３０秒～約２分）であり得る。

ＰＣＲアッセイは、ＨＤＶ核酸、例えばＲＮＡ又はＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を使用することができる。テンプレート核酸は精製される必要はなく、ヒト細胞に含まれるＨＤＶ核酸等の複合混合物の微量画分であり得る。ＨＤＶ核酸分子は、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｐｅｒｓｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ），１９９３，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．）に記載されているもの等の通例の技術によって生物学的試料から抽出され得る。核酸は、任意の数の供給源、例えばプラスミド、あるいは細菌、酵母、ウイルス、細胞小器官、又は植物若しくは動物等の高等生物を含む天然供給源から得ることができる。

オリゴヌクレオチドプライマー（例えば、配列番号１～６及び９～１２）を、プライマー伸長を誘導する反応条件下でＰＣＲ試薬と組み合わせる。例えば、鎖伸長反応物には、一般に、５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．００１％（ｗ／ｖ）ゼラチン、０．５～１．０μｇの変性されたテンプレートＤＮＡ、５０ｐｍｏｌの各オリゴヌクレオチドプライマー、２．５ＵのＴａｑポリメラーゼ、及び１０％ＤＭＳＯ）が含まれる。反応物は、通常、それぞれ１５０～３２０μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、又はそれらの１つ以上の類縁体を含む。

新規に合成された鎖は、反応の後続工程で使用できる二本鎖分子を形成する。鎖分離、アニーリング及び伸長の工程は、標的リボザイムドメイン及び／又はＨＤＡｇ遺伝子核酸分子に対応する所望の量の増幅産物を生成するために必要に応じて頻繁に繰り返すことができる。反応の制限因子は、反応物中に存在するプライマー、熱安定性酵素、及びヌクレオシド三リン酸の量である。サイクリング工程（すなわち、変性、アニーリング、及び伸長）は、好ましくは少なくとも１回繰り返される。検出での使用では、サイクリング工程の数は、例えば、試料の性質に応じる。試料が核酸の複雑な混合物である場合、検出に充分な標的配列を増幅するために、より多くのサイクリング工程が必要となる。一般に、サイクリング工程は少なくとも約２０回繰り返されるが、４０、６０、又は１００回でさえ繰り返され得る。

ＦＲＥＴ技術（例えば、米国特許第４，９９６，１４３号、同第５，５６５，３２２号、同大５，８４９，４８９号、同第６，１６２，６０３号）は、ドナー蛍光部分及び対応するアクセプター蛍光部分が互いに一定の距離内に配置されると、可視化できるか又は他の方法で検出及び／又は定量することができる、２つの蛍光部分間でエネルギー移動が起こるという概念に基づいている。典型的に、ドナーは好適な波長の光照射によって励起されると、アクセプターにエネルギーを移動させる。典型的に、アクセプターは移動されたエネルギーを異なる波長の光照射の形態で再発光する。特定の系では、非蛍光エネルギーは、実質的に非蛍光のドナー部分（例えば、米国特許第７，７４１，４６７号を参照）を含む生体分子を介して、ドナー部分とアクセプター部分との間で移動され得る。

一例では、オリゴヌクレオチドプローブは、ドナー蛍光部分と、蛍光性であってもなくてもよく、光以外の形態で移動されたエネルギーを散逸させる対応するクエンチャーとを含有することができる。プローブがインタクトである場合、エネルギー移動が、典型的には、２つの蛍光部分の間で起こり、その結果、ドナー蛍光部分からの蛍光発光が消光される。ポリメラーゼ連鎖反応の伸長工程中、増幅産物に結合したプローブは、ドナー蛍光部分の蛍光発光がもはやクエンチされないように、例えばＴａｑポリメラーゼの５’から３’へのヌクレアーゼ活性によって切断される。この目的のための例示的なプローブは、例えば、米国特許第５，２１０，０１５号、同第５，９９４，０５６号、及び同第６，１７１，７８５号に記載されている。一般的に使用されるドナー－アクセプター対は、ＦＡＭ－ＴＡＭＲＡ対を包含する。一般的に使用されるクエンチャーは、ＤＡＢＣＹＬ及びＴＡＭＲＡである。一般的に使用されるダーククエンチャーには、ＢｌａｃｋＨｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒｓ（商標）（ＢＨＱ）、（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｎｏｖａｔｏ、Ｃａｌ．）、Ｉｏｗａ Ｂｌａｃｋ（商標）（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈ．，Ｉｎｃ．、Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、Ｉｏｗａ）、ＢｌａｃｋＢｅｒｒｙ（商標）Ｑｕｅｎｃｈｅｒ ６５０（ＢＢＱ－６５０）（Ｂｅｒｒｙ＆Ａｓｓｏｃ．、Ｄｅｘｔｅｒ、Ｍｉｃｈ．）が含まれる。

別の例では、それぞれが蛍光部分を含有する２つのオリゴヌクレオチドプローブは、ＨＤＶ標的核酸配列に対するオリゴヌクレオチドプローブの相補性によって決定される特定の位置で増幅産物にハイブリダイズすることができる。オリゴヌクレオチドプローブが適切な位置で増幅産物の核酸にハイブリダイゼーションすると、ＦＲＥＴシグナルを発生する。ハイブリダイゼーション温度は、約１０秒間～約１分間、約３５℃～約６５℃の範囲であり得る。

蛍光分析は、例えば、光子計数落射蛍光顕微鏡システム（適切なダイクロイックミラー及び特定の範囲での蛍光発光をモニターするためのフィルタを備える）、光子計数光電子増倍管システム、又は蛍光光度計を使用して行うことができる。エネルギー移動を開始するため、又は蛍光体の直接検出を可能にするための励起は、アルゴンイオンレーザー、高強度水銀（Ｈｇ）アークランプ、光ファイバー光源、又は所望の範囲の励起のために適切にフィルタリングされた他の高強度光源を用いて行うことができる。

ドナー蛍光部分及び対応するアクセプター蛍光部分「対応する」に関して本明細書で使用される場合、ドナー蛍光部分の発光スペクトルと重複する吸光度スペクトルを有するアクセプター蛍光部分を指す。アクセプター蛍光部分の発光スペクトルの波長最大値は、ドナー蛍光部分の励起スペクトルの波長最大値よりも少なくとも１００ｎｍ大きくなければならない。したがって、それらの間で効率的な非照射エネルギー移動を行うことができる。

蛍光ドナー部分及び対応するアクセプター部分は、一般に、（ａ）高効率Ｆｏｒｓｔｅｒエネルギー移動、（ｂ）大きな最終ストークスシフト（＞１００ｎｍ）、（ｃ）可能な限り可視スペクトルの赤色部分（＞６００ｎｍ）への発光のシフト；及び（ｄ）ドナー励起波長での励起によって生じるラマン水蛍光発光よりも高い波長への発光のシフトのために選択される。例えば、レーザー線付近のその最大励起波長（例えば、ヘリウム－カドミウム４４２ｎｍ又はアルゴン４８８ｎｍ）、高い吸光係数、高い量子収率、及びその蛍光発光に対応するアクセプター蛍光部分の励起スペクトルとの良好な重複を有するドナー蛍光部分を選択することができる。高い吸光係数、高い量子収率、ドナー蛍光部分の発光とのその励起の良好な重複、及び可視スペクトルの赤色部分（＞６００ｎｍ）の発光を有する対応するアクセプター蛍光部分を選択することができる。

ＦＲＥＴ技術において様々なアクセプター蛍光部分と共に使用することができる代表的なドナー蛍光部分としては、フルオレセイン、ルシファーイエロー、Ｂ－フィコエリトリン、９－アクリジンイソチオシアネート、ルシファーイエローＶＳ、４－アセトアミド－４’－イソチオ－シアナトスチルベン－２、２’－ジスルホン酸、７－ジエチルアミノ－３－（４’－イソチオシアナトフェニル）－４－メチルクマリン、スクシンミル１－ピレンブチレート、及び４－アセトアミド－４’－イソチオシアナトスチルベン－２，２’－ジスルホン酸誘導体が挙げられる。代表的なアクセプター蛍光部分としては、使用されるドナー蛍光部分に応じて、ＬＣ Ｒｅｄ ６４０、ＬＣ Ｒｅｄ ７０５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、リサミンローダミンＢスルホニルクロリド、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、ローダミンｘイソチオシアネート、エリスロシンイソチオシアネート、フルオレセイン、ジエチレントリアミンペンタアセテート、又はランタニドイオンの他のキレート（例えば、ユウロピウム、又はテルビウム）が挙げられる。ドナー蛍光部分及びアクセプター蛍光部分は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（オレゴン州ジャンクションシティ）又はＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（ミズーリ州セントルイス）から得ることができる。

ドナー蛍光部分及びアクセプター蛍光部分を、リンカーアームを介して適切なプローブオリゴヌクレオチドに結合することができる。リンカーアームはドナー蛍光部分とアクセプター蛍光部分との間の距離に影響を及ぼすので、各リンカーアームの長さは重要である。リンカーアームの長さは、ヌクレオチド塩基から蛍光部分までのオングストローム（Å）の距離であり得る。一般に、リンカーアームは約１０Å～約２５Åである。リンカーアームは、国際公開第８４／０３２８５号に記載されている種類のものであってもよい。国際公開第８４／０３２８５号はまた、リンカーアームを特定のヌクレオチド塩基に結合させる方法、及び蛍光部分をリンカーアームに結合させる方法も開示している。

ＬＣ Ｒｅｄ ６４０等のアクセプター蛍光部分を、アミノリンカー（例えば、ＡＢＩ（カリフォルニア州フォスターシティ）又はＧｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（バージニア州スターリング）から入手可能なＣ６－アミノホスホラミダイト）を含有するオリゴヌクレオチドと組み合わせて、例えば、ＬＣ Ｒｅｄ ６４０標識オリゴヌクレオチドを生成することができる。フルオレセイン等のドナー蛍光部分をオリゴヌクレオチドにカップリングするために頻繁に使用されるリンカーとしては、チオ尿素リンカー（ＦＩＴＣ由来、例えばＧｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ又はＣｈｅｍＧｅｎｅ（Ａｓｈｌａｎｄ、Ｍａｓｓ．）製のフルオレセイン－ＣＰＧ）、アミド－リンカー（フルオレセイン－ＮＨＳ－エステル由来、例えば、ＢｉｏＧｅｎｅｘ（Ｓａｎ Ｒａｍｏｎ、Ｃａｌｉｆ．）製のＣＸ－フルオレセイン－ＣＰＧ）、又はオリゴヌクレオチド合成後にフルオレセイン－ＮＨＳ－エステルのカップリングを必要とする３’－アミノ－ＣＰＧが挙げられる。

デルタ型肝炎ウイルスの検出
本開示は、生物学的試料又は非生物学的試料中のデルタ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）の存在又は非存在を検出するための方法を提供する。提供される方法は、試料の汚染、偽陰性、及び偽陽性の問題を回避する。この方法は、複数対のリボザイムドメイン及び／又はＨＤＶデルタ型肝炎抗原（ＨＤＡｇ）遺伝子プライマーを使用して、試料由来のＨＤＶリボザイムドメイン及び／又はＨＤＡｇ遺伝子標的核酸分子の一部を増幅することを含む少なくとも１つのサイクリング工程と、ＦＲＥＴ検出する工程とを実施することを含む。複数のサイクリング工程は、好ましくはサーモサイクラーで実施される。方法は、リボザイムドメイン及び／又はＨＤＡｇ遺伝子プライマー及びプローブを使用してＨＤＶの存在を検出するために実施することができ、ＨＤＶリボザイムドメイン及び／又はＨＤＶ ＨＤＡｇ遺伝子の検出は、試料中のＨＤＶの存在を示す。

本明細書に記載されているように、増幅産物は、ＦＲＥＴ技術を活用する標識されたハイブリダイゼーションプローブを使用して検出され得る。１つのＦＲＥＴフォーマットは、ＴａｑＭａｎ（登録商標）技術を利用して、増幅産物の存在若しくは非存在、したがって、ＨＤＶの存在若しくは非存在を検出する。ＴａｑＭａｎ（登録商標）技術は、例えば、１種の蛍光色素及び１種のクエンチャーで標識された１種の１本鎖ハイブリダイゼーションプローブを利用し、これは蛍光性であってもよく、蛍光性でなくてもよい。第１の蛍光部位が好適な波長の光で励起されると、吸収されたエネルギーはＦＲＥＴの原理に従って第２の蛍光部位に移動される。第２の蛍光部位は、一般的には、クエンチャー分子である。ＰＣＲ反応のアニーリングステップ中、標識されたハイブリダイゼーションプローブは、標的ＤＮＡ（すなわち、増幅産物）に結合し、その後の伸長段階中に、例えばＴａｑポリメラーゼの５’から３’へのヌクレアーゼ活性によって分解される。その結果、蛍光部分とクエンチャー部分とが互いに空間的に分離される。結果として、クエンチャーの非存在下で第１の蛍光部分を励起すると、第１の蛍光部分からの蛍光発光が検出され得る。例として、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）７７００配列検出システム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）は、ＴａｑＭａｎ（登録商標）技術を使用し、試料中のＨＤＶの存在若しくは非存在を検出するための本明細書に記載の方法を実施するのに適している。

ＦＲＥＴと組み合わせた分子ビーコンを使用して、リアルタイムＰＣＲ法を使用した増幅産物の存在を検出することもできる。分子ビーコン技術は、第１の蛍光部位及び第２の蛍光部位で標識されたハイブリダイゼーションプローブを使用する。第２の蛍光部位は一般的にはクエンチャーであり、蛍光標識は典型的にはプローブの各端部に配置される。分子ビーコン技術は、二次構造形成を可能にする配列（例えば、ヘアピン）を有するプローブオリゴヌクレオチドを使用する。プローブ内で二次構造が形成された結果、プローブが溶液中にある場合、両方の蛍光部位が空間的に近接する。標的核酸（すなわち、増幅産物）へのハイブリダイゼーション後、プローブの二次構造が破壊され、蛍光部分が互いに分離され、それにより、適切な波長の光による励起後、第１の蛍光部分の発光を検出することができる。

ＦＲＥＴ技術の別の一般的な形式は、２つのハイブリダイゼーションプローブを利用する。各プローブは、異なる蛍光部分で標識され得、一般に、標的ＤＮＡ分子（例えば、増幅産物）内で互いに近接してハイブリダイズするように設計される。ドナー蛍光部分、例えばフルオレセインは、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）機器の光源によって４７０ｎｍで励起される。ＦＲＥＴの間、フルオレセインは、そのエネルギーをアクセプター蛍光部分、例えばＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）－Ｒｅｄ６４０（ＬＣ Ｒｅｄ６４０）又はＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）－Ｒｅｄ７０５（ＬＣ Ｒｅｄ７０５）に移動する。次いで、アクセプター蛍光部分は、より長い波長の光を発し、これはＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）機器の光学検出システムによって検出される。効率的なＦＲＥＴは、蛍光部分が直接局所的に近接しており、ドナー蛍光部分の発光スペクトルがアクセプター蛍光部分の吸収スペクトルと重複している場合にのみ起こり得る。放出されたシグナルの強度は、元の標的ＤＮＡ分子の数（例えば、ＨＤＶゲノムの数）と相関させることができる。ＨＤＶ標的核酸の増幅が起こり、増幅産物が生成される場合、ハイブリダイズする工程は、プローブ対のメンバー間のＦＲＥＴに基づく検出可能なシグナルをもたらす。

一般に、ＦＲＥＴの存在は、試料中のＨＤＶの存在を示し、ＦＲＥＴの非存在は、試料中のＨＤＶの非存在を示す。しかしながら、不十分な検体収集、輸送遅延、不適切な輸送条件、又はある特定の収集スワブ（アルギン酸カルシウム又はアルミニウムシャフト）の使用はいずれも、試験結果の成功及び／又は精度に影響を及ぼし得る条件である。本明細書に開示される方法を使用すると、例えば４５サイクリングステップ内にＦＲＥＴを検出すると、ＨＤＶに感染していることを示す。

本方法の実施に使用することができる代表的な生物学的試料としては、限定されないが、血液、血漿、血清、肝臓試料、皮膚スワブ、鼻腔スワブ、創傷スワブ、血液培養物、皮膚及び軟部組織感染が挙げられる。生物学的試料の収集及び保存方法は、当業者に知られている。生物学的試料を（例えば、当技術分野で知られている核酸抽出方法及び／又はキットによって）処理してＨＤＶ核酸を放出させることができ、又はいくつかの場合、生物学的試料をＰＣＲ反応成分及び適切なオリゴヌクレオチドと直接接触させることができる。

融解曲線分析は、サイクリングプロファイルに含められ得る追加の工程である。融解曲線分析は、ＤＮＡ二本鎖の半分が一本鎖に分離した温度として定義される融解温度（Ｔｍ）と呼ばれる特徴的な温度でＤＮＡが融解するという事実に基づいている。ＤＮＡの融解温度は、主にそのヌクレオチド組成に依存する。したがって、Ｇ及びＣヌクレオチドが豊富なＤＮＡ分子は、Ａ及びＴヌクレオチドが豊富なＤＮＡ分子よりも高いＴｍを有する。シグナルが失われる温度を検出することにより、プローブの融解温度を決定することができる。同様に、シグナルが発生する温度を検出することによって、プローブのアニーリング温度は決定され得る。それぞれの増幅産物からのリボザイムドメイン及びＨＤＡｇ遺伝子プローブの融解温度（複数可）は、試料中のＨＤＶの存在又は非存在を確認することができる。

各サーモサイクラーを運転している間に、対照試料も同様にサイクルされ得る。陽性対照試料は、例えば、対照プライマー及び対照プローブを使用して、（記載された標的遺伝子の増幅産物以外の）標的核酸対照テンプレートを増幅することができる。陽性対照試料はまた、例えば標的核酸分子を含むプラスミドコンストラクトを増幅することができる。そのようなプラスミド対照は、意図された標的の検出に使用されるのと同じプライマー及びプローブを使用して、内部で（例えば、試料内で）又は患者の試料と並んで実行される別々の試料で増幅することができる。そのような対照は、増幅、ハイブリダイゼーション及び／又はＦＲＥＴ反応の成功又は失敗の指標である。各サーモサイクラー実行はまた、例えば標的テンプレートＤＮＡを欠く陰性対照を含むことができる。陰性対照は汚染を測定することができる。これにより、システム及び試薬が偽陽性シグナルを生じないことが保証される。したがって、対照反応は、例えば、プライマーが配列特異性によりアニールし、伸長を開始する能力、並びにプローブが配列特異性によりハイブリダイズし、ＦＲＥＴが発生する能力を容易に決定することができる。

一実施形態では、本方法は、汚染を回避する工程を含む。例えば、ウラシル－ＤＮＡグリコシラーゼを利用する酵素的方法は、あるサーモサイクラー運転と次のサーモサイクラー運転との間の汚染を低減又は排除するために、米国特許第５，０３５，９９６号、同第５，６８３，８９６号及び同第５，９４５，３１３号に記載される。

ＦＲＥＴ技術と組み合わせた従来のＰＣＲ法を使用して、方法を実践することができる。一実施形態では、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）機器が使用される。以下の特許出願は、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）技術で使用されるリアルタイムＰＣＲを記載している：国際公開第９７／４６７０７号、国際公開第９７／４６７１４号及び国際公開第９７／４６７１２号。

ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）は、ＰＣワークステーションを使用して動作され得、Ｗｉｎｄｏｗ ＮＴオペレーティングシステムを利用し得る。試料からのシグナルは、機械が光学ユニット上にキャピラリを順次配置するときに得られる。ソフトウェアは、各測定の直後にリアルタイムで蛍光シグナルを表示することができる。蛍光取得時間は１０～１００ミリ秒（ｍｓｅｃ）である。各サイクリング工程の後、蛍光対サイクル数の定量的表示を、全ての試料について連続的に更新することができる。生成されたデータは、さらなる分析のために保存され得る。

ＦＲＥＴの代替として、蛍光ＤＮＡ結合色素（例えば、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ又はＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｏｌｄ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ））等の二本鎖ＤＮＡ結合色素を使用して、増幅産物は検出され得る。二本鎖核酸と相互作用すると、このような蛍光ＤＮＡ結合色素は、適当な波長の光での励起後に、蛍光シグナルを発する。また、核酸インターカレート色素等の二本鎖ＤＮＡ結合色素を用いることもできる。二本鎖ＤＮＡ結合色素を使用する場合、増幅産物の存在を確認するために、通常は融解曲線分析を行う。

本開示の実施形態は、１つ以上の市販の機器の構成によって限定されないことが理解される。

製造品／キット
本開示の実施形態は、ＨＤＶを検出するための製造品、組成物若しくはキットを更に提供する。製造品は、適切な包装材料と共に、ＨＤＶを検出するために使用されるプライマー及びプローブを含み得る。ＨＤＶを検出するための代表的なプライマー及びプローブは、ＨＤＶ標的核酸分子（例えば、ＨＤＶリボザイムドメイン及び／又はＨＤＶ ＨＤＡｇ遺伝子）にハイブリダイズすることができる。さらに、キットはまた、固体支持体、緩衝液、酵素、及びＤＮＡ標準等、ＤＮＡ固定化、ハイブリダイゼーション、及び検出に必要な適切に包装された試薬及び材料を含み得る。プライマー及びプローブを設計する方法が本明細書に開示され、増幅してＨＤＶ標的核酸分子にハイブリダイズするプライマー及びプローブの代表的な例が提供される。

製造品はまた、プローブを標識するための１つ以上の蛍光部分を含み得るか、あるいは、キットと共に供給されるプローブは標識化され得る。例えば、製造品は、ＨＤＶリボザイムドメイン及び／又はＨＤＶ ＨＤＡｇ遺伝子プローブを標識するためのドナー及び／又はアクセプター蛍光部分を含み得る。好適なＦＲＥＴドナー蛍光部分及び対応するアクセプター蛍光部分の例は上に提供されている。

製造品はまた、試料中のＨＤＶを検出するためにＨＤＶリボザイムドメイン及び／又はＨＤＶ ＨＤＡｇ遺伝子プライマー及びプローブを使用するための説明書を有する添付文書又は包装ラベルを含むことができる。製造品は、本明細書に開示されている方法を実施するための試薬（例えば、緩衝液、ポリメラーゼ酵素、補因子、又は汚染を防止するための薬剤）を更に含み得る。そのような試薬は、本明細書に記載されている市販の機器のうちの１つに特異的であり得る。

本開示の実施形態は、特許請求の範囲に記載される発明の範囲を限定しない以下の実施例において更に説明される。

以下の実施例及び図は、主題の理解を助けるために提供されており、その真の範囲は、添付の特許請求の範囲に記載されている。本発明の趣旨から逸脱することなく、記載されている手順に修飾が加えられ得ることが理解される。

実施例１
ＨＤＶ遺伝子標的
図１は、ＨＤＶリボザイムドメイン標的の増幅及び検出に使用されるプライマー及びプローブの、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ０９８２６１（ＨＤＶ遺伝子型１）に対する相対位置を示す。図２は、ＨＤＶ ＨＤＡｇ遺伝子標的の増幅及び検出に使用されるプライマー及びプローブの、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ０９８２６１に対する相対位置を示す。

実施例２
ＰＣＲ実験条件
リボザイムドメイン標的又はＨＤＡｇ遺伝子のリアルタイムＰＣＲ検出を、ｃｏｂａｓ（登録商標）６８００／８８００システム（カリフォルニア州プレザントンのＲｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）を使用して行った。増幅試薬の最終濃度を以下に示す：

以下の表は、ＰＣＲ増幅反応に使用される典型的な熱プロファイルを示す：

Ｐｒｅ－ＰＣＲプログラムは、初期変性及びＲＮＡテンプレートの逆転写のための５５°Ｃ、６０°Ｃ及び６５°Ｃでのインキュベーションを含んでいた。３種の温度でのインキュベーションは、より低い温度ではわずかにミスマッチした標的配列（生物の遺伝的変異体等）も転写されるが、より高い温度ではＲＮＡ二次構造の形成が抑制され、したがって、より効率的な転写をもたらすという有利な効果を併せ持つ。ＰＣＲサイクリングを２つの測定に分け、いずれの測定も１段階の設定を適用する（アニーリングと伸長を組み合わせる）。５５℃での最初の５サイクルは、わずかに不一致な標的配列を予備増幅することによって包括性の向上を可能にするが、第２の測定の４５サイクルは、５８℃のアニーリング／伸長温度を使用することによって特異度を高める。

実施例３
材料及び方法
試料：ＨＤＶアーマードＲＮＡ（ａｒＲＮＡ）、市販のＨＤＶ陽性血漿及び血清試料、ＷＨＯ ＨＤＶ ＩＳ標準（ＰＥＩコード番号７６５７／１２）、カスタム収集ヒトボランティアドナーＨＢＶ／ＨＣＶ／ＨＩＶ陰性プール血漿、及びヒトボランティアドナーＨＢＶ／ＨＣＶ／ＨＩＶ陰性プール血清（ＳｅｒａＣａｒｅ）を試験に使用した。ＨＤＶ陽性血清及び血漿試料をＢｏｃａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓから得た。

ＨＤＶ ＲＮＡアッセイ：アッセイ設計のため、ＨＤＶ ＲＮＡゲノム上のリボザイム及びＨＤＡｇ標的領域を選択した（図１及び図２）。ＨＤＶ配列をＧｅｎｂａｎｋからダウンロードし、整列させ、遺伝子型包括的プライマー及びプローブを設計した。０．５ｍＬの試料体積をｃｏｂａｓ（登録商標）６８００ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）で抽出した。抽出した試料を５０μＬで溶出した。２５μＬの試料を、一般的なＲＮＡマスターミックス及び一般的な熱プロファイルをｃｏｂａｓ（登録商標）６８００システムで使用して増幅するために使用した。ＨＤＶアッセイのためにカスタム最適化されたパラメータを有するアルゴリズム試験フレームワーク（ＡＴＦ）ソフトウェアを使用してデータを分析した。

Ｉｎ－ｖｉｔｒｏ ＲＮＡ転写：ＨＤＶ配列（遺伝子型１～８）をＧｅｎｂａｎｋからダウンロードした。リボザイム及びＨＤＡｇ標的にまたがる配列をｐＳＰ６－ポリＡベクター（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）にクローニングした。クローン化配列をＤＮＡ配列決定によって検証した。ＳＰ６プロモーターベースのＭｅｇａＳｃｒｉｐｔ増幅キット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して、クローン化配列を有するプラスミドをｉｎ－ｖｉｔｒｏ転写反応に使用した。Ｉｎ－ｖｉｔｒｏ ＲＮＡ転写物をＭｅｇａＣｌｅａｒキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）によって精製し、ＨＤＶ液滴デジタルＰＣＲアッセイによってコピー数を決定した。

ＨＤＶアッセイ性能研究：アッセイ直線性を、ＨＤＶ ａｒＲＮＡ及びＨＤＶ陽性血漿試料を使用して決定した。ＷＨＯ ＨＤＶ ＮＡＴ標準をキャリブレータとして使用して、ＩＵ／ｍＬで直線性を報告した。線形性データを多項式回帰によって分析した。検出限界（ＬＯＤ）に関するアッセイ感度を、２５、１０、５、２、１及び０．５ＩＵ／ｍＬレベルでそれぞれ２４回反復するＷＨＯ ＨＤＶ ＮＡＴ標準を使用して決定した。ＨＢＶ／ＨＣＶ／ＨＩＶ陰性プール血漿を対照として使用した。ＬＯＤデータをプロビットによって分析した。ＨＢＶ／ＨＣＶ／ＨＩＶ陰性プール血漿及び陰性プール血清の複数の複製物（ｎ＝９２）を使用して、アッセイ特異性を決定した。

Ｉｎ－ｓｉｌｉｃｏ包括性及び排他性：ＨＤＶ二重標的アッセイによってｉｎ－ｓｉｌｉｃｏで検出されたＨＤＶ配列をＧｅｎｂａｎｋからダウンロードし、整列させ、Ｇｅｎｅｉｏｕｓ ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓソフトウェア（ｇｅｎｉｏｕｓ ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）を使用して系統解析（ブートストラップ＝１００）を構築した。排他性のために、ＨＤＶ二重標的アッセイプライマー及びプローブを、局所データベース中のＨＡＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＥＶ、及びＨＩＶ配列との交差反応性について整列させた。

血漿分離カード（ＰＳＣ）：全血をＥＤＴＡ試料収集管に収集した。ＨＤＶアーマード対照、ＨＤＶ血漿、及びＨＤＶ ＷＨＯ ＩＳ等の試料を、指定された濃度で全血にスパイクした。ＰＳＣ試料を調製するために、１４０ｍＬの全血（スパイクインＨＤＶあり又はなし）をスポッティング領域内の１ｃｍ円上にスポットした。試料スポッティング後、ＰＳＣを室温で４時間放置し、次いで４ｇの乾燥剤を含むジップロックバッグ中に保った。分析前に、ＰＳＣを含む全てのバッグを様々な温度（周囲温度、－２０℃、４５℃）で保存した。

実施例４
実験結果
二重標的アッセイの性能をいくつかの手段によって評価した。アッセイ感度の決定は、Ｇａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，２０１６，Ｖｏｌ．６４，Ｎｏ．５，ｐ．１４８３－１４９４（それぞれ２５、１０、５、２、１及び０．５ＩＵ／ｍＬレベルで２４回反復）に記載されるＷＨＯ ＨＤＶ ＮＡＴ標準を使用して実施した。図３は、ヒット率及びプロビットカーブフィットから１．１１ＩＵ／ｍＬであると決定された検出限界（ＬＯＤ）を用いたこの実験の結果を示す。

アッセイ直線性は、２種類の試料を用いて決定した。最初に、ＨＤＶアーマードＲＮＡ（ａｒＲＮＡ）を、１００コピー／ｍＬ～１０^１０コピー／ｍＬの濃度で８回反復で試験した。結果を図４に示す。平均Ｃｔ値は、１０^１０コピー／ｍＬの９．０から１００コピー／ｍＬの３４．９６の範囲であり、８ｌｏｇを超える広い範囲にわたって正確な定量を観察することができた。次に、陽性血漿試料からのＨＤＶ ＲＮＡを、２．３Ｅ＋００ＩＵ／ｍＬ～２．３Ｅ＋０５ＩＵ／ｍＬの間で１０倍希釈ごとに３回反復で試験した。図５に見られるように、平均Ｃｔ値は２０．３８から３６．４９の間の範囲であり、臨床ＨＤＶ試料を用いたＨＤＶの正確な定量を、広い範囲（＞５ｌｏｇ）にわたって観察することができた。

二重標的アッセイの包括性の実験的決定を、実施例３に記載されるように、リボザイムドメイン及びＨＤＡｇ遺伝子についてのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写ＨＤＶ遺伝子型１～８配列を使用して行った。各遺伝子型を１０^３コピー～１０^７コピーの４ｌｏｇ濃度範囲にわたって試験した。結果を図６に示し、多くの実験室で開発されたＨＤＶ試験とは異なり、本発明の二重標的アッセイが８つのＨＤＶ遺伝子型全てを検出することができたことを実証する。Ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ包括性及び排他性試験を実施したところ、結果は、本発明の二重標的アッセイが全てのＨＤＶ遺伝子型（１～８）を検出し得ることを示し、ＨＡＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＥＶ及びＨＩＶは交差反応しないと予測される（データは示さず）。

前述の発明を明確化及び理解するためにある程度詳細に説明してきたが、本開示を読むことにより、本発明の真の範囲から逸脱することなく、形態及び詳細の様々な変更を行うことができることが当業者には明らかであろう。例えば、上述した全ての技術及び装置を、様々な組み合わせで使用することができる。本出願で引用される全ての刊行物、特許、特許出願、及び／又は他の文献は、あたかも各個別の刊行物、特許、特許出願、及び／又は他の文献が全ての目的のために参照により組み込まれることが個別に示されているのと同程度に、全ての目的のためにその全体が参照により組み込まれる。

Claims (18)

1. 試料中のデルタ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）の少なくとも２つの標的核酸を検出するための方法であって、前記方法は、
   （ａ）試料を提供することと、
   （ｂ）ＨＤＶの前記少なくとも２つの標的核酸が前記試料中に存在する場合、前記試料を少なくとも２つのプライマーセットと接触させて増幅産物を生成することを含む、増幅工程を実施することと、
   （ｃ）ＨＤＶの前記少なくとも２つの標的核酸が前記試料中に存在する場合、前記増幅産物を少なくとも２つのプローブと接触させることを含む、ハイブリダイゼーション工程を実施することと、
   （ｄ）前記増幅産物の存在又は非存在を検出することを含む、検出工程を実施することであって、前記増幅産物のうちの１つの存在が前記試料中のＨＤＶの存在を示し、前記増幅産物の非存在が前記試料中のＨＤＶの非存在を示す、検出工程を実施することと、
   を含み、ここで、
   前記少なくとも２つのプライマーセット及び前記少なくとも２つのプローブが、
   （ｉ）配列番号１～４の核酸配列又は配列番号１～４の任意の組み合わせを含む少なくとも１つのフォワードプライマーと、配列番号５～６の核酸配列又はそれらの組み合わせを含む少なくとも１つのリバースプライマーとを含む第１のプライマーセット、及び配列番号７～８の核酸配列若しくはそれらの相補体、又は配列番号７～８の組み合わせ若しくはそれらの相補体を含む第１のプローブ又は第１のプローブセット、並びに
   （ｉｉ）配列番号９～１０の核酸配列又はそれらの組み合わせを含む少なくとも１つのフォワードプライマーと、配列番号１１～１２の核酸配列又はそれらの組み合わせを含む少なくとも１つのリバースプライマーとを含む第２のプライマーセット、及び配列番号１３～１５の核酸配列若しくはそれらの相補体、又は配列番号１３～１５の任意の組み合わせ若しくはそれらの相補体を含む第２のプローブ又は第２のプローブセット、
   を含む、試料中のデルタ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）の少なくとも２つの標的核酸を検出するための方法。
2. 前記ハイブリダイズする工程が、前記増幅産物を、それぞれがドナー蛍光部分及び対応するアクセプター部分で標識された２つ以上のプローブと接触させることを含み、
   前記検出する工程が、前記プローブの前記ドナー蛍光部分と前記アクセプター部分との間の蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）の存在又は非存在を検出することを含み、蛍光の前記存在又は非存在が、前記試料中のＨＤＶの存在又は非存在を示す、請求項１に記載の方法。
3. 前記増幅する工程が、５’－３’ヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ酵素を用いる、請求項１又は２に記載の方法。
4. 前記試料が生物学的試料である、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
5. 前記生物学的試料が、血液、血漿又は血清である、請求項４に記載の方法。
6. 前記第１のプライマーセットが、前記第１のプローブ若しくは前記第１のプローブセットによって検出される第１の標的核酸の１つ以上の増幅産物を生成し、及び／又は前記第２のプライマーセットが、前記第２のプローブ若しくは前記第２のプローブセットによって検出される第２の標的核酸の１つ以上の増幅産物を生成する、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
7. 前記第１の標的核酸が、ＨＤＶリボザイムドメインであり、前記第２の標的核酸が、ＨＤＶデルタ型肝炎抗原（ＨＤＡｇ）遺伝子である、請求項６に記載の方法。
8. 試料中のＤ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）を検出するための方法であって、前記方法は、
   （ａ）増幅する工程を実施することであって、前記試料を、ＨＤＶが前記試料中に存在する場合、ＨＤＶリボザイムドメインに特異的な１つ以上のフォワードプライマー及び１つ以上のリバースプライマーと接触させて前記リボザイムドメインの増幅産物を生成し、ＨＤＶが前記試料中に存在する場合、ＨＤＶデルタ型肝炎抗原（ＨＤＡｇ）遺伝子に特異的な１つ以上のフォワードプライマー及び１つ以上のリバースプライマーと接触させて前記ＨＤＡｇ遺伝子の増幅産物を生成することを含む、増幅する工程を実施することと、
   （ｂ）ハイブリダイズする工程を実施することであって、前記リボザイムドメイン増幅産物を前記リボザイムドメインに特異的な１つ以上の検出可能なプローブと接触させること、及び前記ＨＤＡｇ遺伝子増幅産物を前記ＨＤＡｇ遺伝子に特異的な１つ以上の検出可能なプローブと接触させることを含む、ハイブリダイズする工程を実施することと、
   （ｃ）前記リボザイムドメイン増幅産物及び／又は前記ＨＤＡｇ遺伝子増幅産物の存在又は非存在を検出することであって、前記リボザイムドメイン増幅産物若しくは前記ＨＤＡｇ増幅産物のいずれか又は両方の増幅産物の存在が前記試料中のＨＤＶの存在を示し、前記リボザイムドメイン増幅産物及び前記ＨＤＡｇ増幅産物の両方の非存在が前記試料中のＨＤＶの非存在を示す、リボザイムドメイン増幅産物及び／又はＨＤＡｇ遺伝子増幅産物の存在又は非存在を検出することと、
   を含み、ここで、
   前記１つ以上のリボザイムドメインフォワードプライマーが、配列番号１～４、又は配列番号１～４の任意の組み合わせから選択されるヌクレオチド配列を含み、前記１つ以上のリボザイムドメインリバースプライマーが、配列番号５～６又はそれらの組み合わせから選択されるヌクレオチド配列を含み、１つ以上の検出可能なリボザイムドメインプローブが、配列番号７～８若しくはそれらの相補体、又は配列番号７～８の組み合わせ若しくはそれらの相補体から選択されるヌクレオチド配列を含み、
   前記１つ以上のＨＤＡｇ遺伝子フォワードプライマーが、配列番号９～１０又はそれらの組み合わせから選択されるヌクレオチド配列を含み、前記１つ以上のＨＤＡｇ遺伝子リバースプライマーが、配列番号１１～１２から選択されるヌクレオチド配列、又はそれらの組み合わせを含み、１つ以上の検出可能なＨＤＡｇ遺伝子プローブが、配列番号１３～１５若しくはそれらの相補体、又は配列番号１３～１５の任意の組み合わせ若しくはそれらの相補体から選択されるヌクレオチド配列を含む、試料中のＤ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）を検出するための方法。
9. 前記１つ以上のリボザイムドメインフォワードプライマーが配列番号１～４の４つ全てのヌクレオチド配列を含み、前記１つ以上のリボザイムドメインリバースプライマーが配列番号５～６の両方のヌクレオチド配列を含み、前記１つ以上の検出可能なリボザイムドメインプローブが配列番号７～８の両方のヌクレオチド配列又はその相補体を含む、請求項８に記載の方法。
10. 前記１つ以上のＨＤＡｇ遺伝子フォワードプライマーが、配列番号９～１０の両方のヌクレオチド配列を含み、前記１つ以上のＨＤＡｇ遺伝子リバースプライマーが、配列番号１１～１２の両方のヌクレオチド配列を含み、前記１つ以上の検出可能なＨＤＡｇ遺伝子プローブが、配列番号１３～１５の３つ全てのヌクレオチド配列又はその相補体を含む、請求項８又は９に記載の方法。
11. 前記ハイブリダイズする工程が、前記増幅産物を、それぞれがドナー蛍光部分及び対応するアクセプター部分で標識された検出可能なプローブと接触させることを含み、
    前記検出する工程が、前記検出可能なプローブの前記ドナー蛍光部分と前記アクセプター部分との間の蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）の存在又は非存在を検出することを含み、蛍光の前記存在又は非存在が、前記試料中のＨＤＶの存在又は非存在を示す、請求項８～１０のいずれか１項に記載の方法。
12. 前記増幅する工程が、５’－３’ヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ酵素を用いる、請求項８～１１のいずれか１項に記載の方法。
13. 前記試料が生物学的試料である、請求項８～１２のいずれか１項に記載の方法。
14. 前記生物学的試料が、血液、血漿又は血清である、請求項１３に記載の方法。
15. 試料中のＨＤＶの第１の標的核酸及びＨＤＶの第２の標的核酸を検出するためのキットであって、前記キットが増幅試薬を含み、前記増幅試薬は、
    （ａ）５’－３’ヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼと、
    （ｂ）ヌクレオチドモノマーと、
    （ｃ）ＨＤＶの前記第１の標的核酸を検出するための第１のプライマーセット及び第１のプローブ又は第１のプローブセットであって、
    前記第１のプライマーセット及び前記第１のプローブ又は第１のプローブセットが、少なくとも、配列番号１～４の核酸配列及び配列番号１～４の任意の組み合わせを含むフォワードプライマーと、少なくとも、配列番号５～６の核酸配列又はそれらの組み合わせを含む少なくともリバースプライマーとを含み、前記第１のプローブ又は前記第１のプローブセットが、配列番号７～８の核酸配列若しくはそれらの相補体、又は配列番号７～８の組み合わせ若しくはそれらの相補体を含む、
    ＨＤＶの前記第１の標的核酸を検出するための第１のプライマーセット及び第１のプローブ又は第１のプローブセットと、
    （ｄ）ＨＤＶの前記第２の標的核酸を検出するための第２のプライマーセット及び第２のプローブ又は第２のプローブセットであって、
    前記第２のプライマーセット及び前記第２のプローブ又は前記第２のプローブセットが、少なくとも、配列番号９～１０の核酸配列又はそれらの組み合わせを含むフォワードプライマーと、少なくとも、配列番号１１～１２の核酸配列又はそれらの組み合わせを含むリバースプライマーとを含み、前記第２のプローブ又は前記第２のプローブセットが、配列番号１３～１５の核酸配列若しくはそれらの相補体、又は配列番号１３～１５の任意の組み合わせ若しくはそれらの相補体を含む、
    ＨＤＶの前記第２の標的核酸を検出するための第２のプライマーセット及び第２のプローブ又は第２のプローブセットと、
    を含む、試料中のＨＤＶの第１の標的核酸及びＨＤＶの第２の標的核酸を検出するためのキット。
16. 前記第１の標的核酸が、ＨＤＶリボザイムドメインであり、前記第２の標的核酸が、ＨＤＶデルタ型肝炎抗原（ＨＤＡｇ）遺伝子である、請求項１５に記載のキット。
17. 前記第１のプローブ及び前記第２のプローブ、並びに前記第１のプローブセット及び前記第２のプローブセットが、ドナー蛍光部分及び対応するアクセプター部分で標識されている、請求項１５又は１６に記載のキット。
18. 配列番号１～２０から選択されるヌクレオチドの配列又はその相補体を含むオリゴヌクレオチドであって、５０以下のヌクレオチドを有する、オリゴヌクレオチド。