NO321139B1

NO321139B1 - Farmasoytisk preparat egnet for subkutan, intramuskulaer eller intradermal administrering.

Info

Publication number: NO321139B1
Application number: NO19964081A
Authority: NO
Inventors: Jack Spira; Thomas Osterberg; Lars Widlund; Brita Sjostrom; Marianne Mikaelsson
Original assignee: Biovitrum Ab
Priority date: 1994-03-31
Filing date: 1996-09-27
Publication date: 2006-03-27
Also published as: HU223314B1; US5925739A; DK0772452T3; HUT74918A; MX9604455A; IL113010A0; FI118171B; CA2186126A1; NO964081D0; PL180282B1; NO964081L; HU9602693D0; ATE222770T1; JPH10501522A; NZ283499A; DE69527966D1; FI963871A; FI963871A0; JP3939750B2; AU690666B2

Abstract

En farmasøytisk formulering for subkutan, intramuskulær eller intradermal administrering omfattende koagulasjonsfaktor VIII eller faktor IX og anvendelse derav ved fremstilling av et medikament for behandling av hemofili A eller B. Formuleringen omfatter koagulasjonsfaktor VIII eller faktor IX med en aktivitet på minst 200 IU/ml og et additiv som øker biotilgjengeligheten av faktor VIII eller faktor IX. Tester med faktor VIII gir et terapeutisk nivå av faktor VIII i blodstrømmen i en overraskende lang tidsperiode etter subkutan, intramuskulær eller intradermal administrering. Faktor VIII er passende en høyrenset rekombinant faktor VIII og fortrinnsvis et delesjonsderivat derav som kan anvendes ved fremstilling av et medikament for subkutan administrering.

Description

Oppfinnelsens område

Foreliggende oppfinnelse angår et farmasøytisk preparat egnet for subkutan, intramuskulær eller intradermal administrering. Formuleringen omfatter koagulasjonsfaktor VIII med en aktivitet på minst 500 IU/ml og et additiv som øker den biologiske tilgjengelighet av faktor VIII. Tester med faktor VIII gir et terapeutisk nivå av aktiv faktor VIII i blodstrømmen i en overraskende lang tidsperiode etter subkutan, intramuskulær eller intradermal administrering. Faktor VIII er passende en høyrenset rekombinant faktor VIII, og fortrinnsvis et delesjonsderivat derav, som kan anvendes ved fremstilling av et medikament for subkutan administrering.

Oppfinnelsens bakgrunn

Hemofili er en nedarvet sykdom som har vært kjent i århundrer, men det er kun i de siste fire tiår at det har vært mulig å skjelne mellom de forskjellige former; hemofili A, hemofili B og hemofili C. Hemofili A er den mest hyppige form. Den rammer kun individer av hannkjønn med en hyppighet på 1 eller 2 individer pr. 10 000 levende fødte individer. Syk-dommen er forårsaket av sterkt redusert nivå eller fravær av biologisk aktiv koagulasjonsfaktor VIII (antihemofilifaktor) , som er et protein som vanligvis er til stede i plasma. Den kliniske manifestasjon av hemofili A er en sterk blødnings-tendens, og før behandling med faktor Vlll-konsentrater ble innført, var gjennomsnittsalderen for disse pasienter lavere enn 20 år. Konsentrater av faktor VIII erholdt fra plasma har vært tilgjengelige i ca. tre tiår. Dette har forbedret situa-sjonen for behandling av hemofilipasienter vesentlig og gitt dem mulighet til å leve et normalt liv.

Det er allment anerkjent at alvorligheten av hemofili A og B kan deles i tre kategorier: alvorlig, moderat og mild. Ved alvorlig hemofili A er plasmanivået av faktor VIII-aktiviteten i blodet mindre enn 1 % av det normale plasmanivå. Ved moderat hemofili A er plasmanivået av faktor VIII-aktiviteten i blodet i området fra 1 opp til 4 % av det normale plasmanivå. Ved mild hemofili A er plasmanivået av faktor Vlll-aktiviteten i blodet i området fra 5 opp til 25 % av det normale plasmanivå. Det normale plasmanivå av faktor Vlll-aktivitet i blodet er definert som 1 IU/ml blod. Alvorlig, moderat og mild hemofili B er definert ved de samme plasmanivåer som de gitt for faktor VIII ovenfor. Det refereres her til Inga Marie Nilsson i Hemophilia, Pharmacia Plasma Products, Stockholm, Sverige, s. 2-3, 1994.

Et medikament med et meget stort og labilt molekyl, slik som koagulasjonsfaktor VIII med en molekylmasse på 170 til 300 kDa, gis vanligvis intravenøst fordi disse medika-menter vanligvis oppviser en meget lav biotilgjengelighet på grunn av utilstrekkelig absorpsjon og alvorlig nedbrytning, dersom de gis subkutant, intramuskulært eller intradermalt. Et faktor Vlll-konsentrat oppløst i natriumsitrat og injisert intramuskulært, ga således et maksimalt sirkulasjonsnivå på kun 1,4 % av det normale plasmanivå (Pool et al., New England J. Medicine, vol. 275, nr. 10, s. 547-548, 1966). Undersøkels-ene avslørte dessuten at det ikke var noen signifikant for-skjell på aktiviteten gjenvunnet i sirkulasjonen, uten hensyn til hvorvidt sitrat ble tilsatt til preparatet. I en senere undersøkelse ble faktor VIII med høy renhet administrert intramuskulært til hemofile hunder og frivillige mennesker (Johnson et al., Br. J. Hematology, vol. 21, s. 21-41, 1971). Selv om dosene var mye høyere enn de anvendte av Pool et al., viste verken hundene eller de frivillige mennesker en signifikant økning i plasmafaktor Vlll-nivåer. I realiteten forble plasmafaktor Vlll-konsentrasjonen i de hemofile frivillige mennesker under 1 % av det normale plasmanivå, dvs. at den alvorlige hemofili A vedvarte selv etter administrering i fravær av additiver som øker biotilgjengeligheten.

Forskjellige additiver er blitt foreslått for økning av absorpsjonen av et stort antall farmasøytiske midler, inkludert små molekyler som insulin og peptidfraksjoner av faktor VIII. WO-A-92/01440 angår således anvendelse av di-metyl-å-syklodekstrin for forhøyelse av transmukosa-administrering av insulin med en molekylmasse på ca. 5 800 Da. Informasjon angående transport av små molekyler ved hjelp av ikke-inntrengende metoder, kan ikke overføres til transport av store molekyler til den intravenøse sirkulasjon ved subkutan, intramuskulær eller intradermal administrering. Dette er spesielt tilfelle fordi målet for WO-A-92/01440 er overflødige injeksjoner av (poly)peptider eller proteiner. Før intramuskulær administrering anvendes dessuten fysiologisk salt-løsning for å oppløse peptidfraksjoner av faktor VIII med en molekylmasse fra 1 000 til 20 000 Da (Conte et al., Arzneim.-Forsch./Drug Res., vol. 39(1), nr. 4, s. 463-466, 1989). Eksperimentene angår også her små molekyler som gir en ukjent biotilgjengelighet fordi aktiviteten av peptidfraksjonene av faktor VIII ikke er bestemt.

EP-A-0 522 4 91 angår anvendelse av en vannløselig type av hyaluronsyre i kombinasjon med et vannløselig protein og viser ingen vesentlig farmakologisk aktivitet for å forhøye administrering av et farmakologisk aktivt polypeptid, fortrinnsvis med en molekylmasse lavere enn ca. 20 kDa. Blod-koagulasjonsfaktorer nevnes blant et stort antall polypeptider. Det foreligger dessuten ingen eksempler som viser den mulige virkning av hyaluronsyre på administrering av noen blodkoagulasjonsfaktor, f.eks. ved injeksjon.

JP-A-63-063624 angår anvendelse av kollagen for til-veiebringelse av langsom frigivelse av et uspesifisert legemiddel ved f.eks. subkutan administrering.

JP-A-56-127308 angår emulsjoner inneholdende blod-koagulasjonsf aktor VIII, soyaolje og fosfolipider. Formålet med disse emulsjoner er å eliminere problemene som påtreffes ved konvensjonell parenteral administrering. Emulsjonene administreres derfor oralt, hvilket et vist i flere av eksemplene.

Faktor VIII kan også anvendes for andre terapeutiske formål enn for behandling av hemofili A. WO-A-93/24137 angår således formuleringer inneholdende FVIII ment for intradermal eller topisk administrering som et antiinflammatorisk middel. Formuleringene er ment for lokal administrering til ikke-hemofile menneskelige legemer, og ikke til den intravenøse sirkulasjon hos mennesker som lider av hemofili A. Den terapeutiske virkning er således lokal og ikke systemisk, hvilket fordres for å behandle hemofili A.

Alle for tiden tilgjengelige faktor Vlll-preparater på markedet foreligger som en formulering for intravenøs administrering, og hovedmengden av faktor Vlll-preparatene er stabiliserte med humant serumalbumin.

Store og labile proteiner administreres således vanligvis intravenøst, slik at medikamentet er direkte til-gjengelig i blodstrømmen. Det ville imidlertid være fordel-aktig dersom et medikament kunne administreres subkutant, intramuskulært eller intradermalt, fordi disse administrer-ingsformer er mye lettere å håndtere for pasienten. Dette gjelder spesielt dersom medikamentet må tas regelmessig hele livet, og behandlingen må startes tidlig, allerede under pasientens første leveår.

Beskrivelse av oppfinnelsen

Ved foreliggende oppfinnelse ble det meget overraskende funnet at faktor VIII, som er et meget sensitivt protein, kan administreres subkutant og, i motsetning til all tidligere erfaring, erholdes en bemerkelsesverdig absorpsjon og et overraskende høyt nivå av aktivt faktor Vlll-protein i blodet.

Ved foreliggende oppfinnelse er det således utviklet en formulering som gjør det mulig å administrere faktor VIII subkutant, intramuskulært eller intradermalt, og som gir en stor fordel for alle pasienter med behov for faktor VIII.

Rekombinant faktor VIII SQ indikeres for behandling av klassisk hemofili. Halveringstiden for r-VIII SQ er ca. 12 timer for mennesker ved intravenøs injisering. For profy-laktisk behandling gis 15-40 IU/kg kroppsvekt av faktor VIII tre ganger pr. uke.

En intravenøs injeksjon er vanligvis 5-20 ml. En injeksjon gitt subkutant er fra 0,05 til 1 ml, og konsentrasjonen av faktor VIII må derfor være meget høy i en slik formulering. Dette er mulig å oppnå ved f.eks. den høyrensede rekombinante faktor ifølge foreliggende oppfinnelse i en formulering med et additiv, slik som en hydrolysert gelatin-, hyaluronsyre- og/eller soyaoljeemulsjon. Ved foreliggende oppfinnelse er det således mulig å oppnå en biotilgjengelighet på minst ca. 15 %, fortrinnsvis ca: 30 %, etter subkutan, intramuskulær eller intradermal administrering, sammenlignet med biotilgjengeligheten oppnådd etter intravenøs administrering. Med en spesielt grundig utvelgelse av bestanddelene av formuleringen ifølge foreliggende oppfinnelse, er det mulig å oppnå en biotilgjengelighet på minst 50 %, og til og med 70 %, etter subkutan, intramuskulær eller intradermal administrering, sammenlignet med biotilgjengeligheten oppnådd etter intravenøs administrering.

Oppfinnelsesideen er således en kombinasjon av det funn at faktor VIII kan absorberes i blodstrømmen når den gis i form av en subkutan, intramuskulær eller intradermal farma-søytisk formulering, og at det er mulig å produsere en spesiell formulering som gir den nødvendige økning i biotilgjengelighet i faktor VIII for dette formål.

Foreliggende oppfinnelse angår således et farmasøy-tisk preparat egnet for subkutan, intramuskulær eller intradermal administrering, kjennetegnet ved at den omfatter (i) minst 500 IU/ml av koagulasjonsfaktor VIII, eller et derivat derav med tilsvarende biologisk aktivitet på minst 170 kDa; og (ii) et organisk additiv med evne til å tilveiebringe et plasmanivå av faktor VIII som er minst 1,5 % av det normale plasmanivå i blodet i minst 6 timer etter administrering, det organiske additiv er utvalgt fra soyabønneoljeemulsjoner, hydrolysert gelatin, hydrolysert kollagen, poly(02)hydroksy-etylstivelse, hyaluronsyre, dekstraner, L-histidin og derivater og/eller kombinasjoner derav.

Et terapeutisk nivå ved foreliggende oppfinnelse angår minst 1,5 % av det normale plasmanivå for faktor VIII-aktivitet i blodet. Faktor Vlll-aktiviteten i blodet er passende 2,5 % av det normale plasmanivå og fortrinnsvis minst 4 %.

Med formuleringene ifølge foreliggende oppfinnelse er det mulig å opprettholde et terapeutisk akseptabelt nivå av VIII:C eller IX:C i minst 6 timer, passende mer enn 12 timer, fortrinnsvis mer enn 24 timer og helst mer enn 48 timer. Med optimaliserte formuleringer er det antakeligvis mulig å opprettholde et terapeutisk .akseptabelt nivå av VIII:C eller IX:C i minst 96 timer, og selv mer enn 168 timer. På denne måte kan administreringshyppigheten holdes på et minimum og fremdeles gi den tilsiktede terapeutiske virkning. Formuleringene ifølge foreliggende oppfinnelse kan også være egnede for behandling på forespørsel.

Formuleringene ifølge foreliggende oppfinnelse er anvendbare for behandling av hemofili A eller B, sykdommer som, dersom de er til stede, er fremherskende i hele blod-systemet. En forutsetning for vellykket behandling er således administrering på en slik måte at det oppnås en systemisk virkning. En slik systemisk virkning oppnås ved foreliggende oppfinnelse, i motsetning til andre teknikker hvor lokale, f.eks. antiinflammatoriske virkninger er ønsket.

Formuleringen inneholdende faktor VIII gis fortrinnsvis subkutant.

Faktor Vlll-aktiviteten i formuleringene er minst 500 IU/ml og fortrinnsvis høyere enn 1 000 IU/ml. Det er spesielt foretrukket at faktor Vlll-aktiviteten er høyere enn 1 500 IU/ml i formuleringen, og mest foretrukket at aktiviteten er fra 5 000 til 100 000 IU/ml. Det gitte volum kan være større en 0,01 ml, passende 0,1 til 2 ml, fortrinnsvis 0,25 til 1,5 ml og helst 0,5 til 1 ml. Volumet kan altså være 0,1 til 1 ml.

Faktor VIII kan enten være avledet fra plasma eller fremstilt ved hjelp av rekombinante DNA-teknikker.

Terapeutiske faktor Vlll-konsentrater er inntil i dag fremstilt ved fraksjonering av plasma. Det er imidlertid nå tilgjengelige fremgangsmåter for fremstilling av faktor 8 i cellekultur ved anvendelse av rekombinante DNA-teknikker, som rapportert i f.eks. W. Wood et al., Nature 312, s. 330-37, 1984 og EP-A-160 457.

Faktor Vlll-konsentrater avledet fra humant plasma inneholder mange fragmenterte, fullt aktive faktor Vlll-former (Andersson et al., Proe. Nati. Sei. USA, vol. 83, s. 2979-83, mai 198 6). Den minste aktive form av human faktor VIII har en molekylmasse på 170 kDa og består av to kjeder på 90 kDa og 80 kDa holdt sammen av en metallionbro. Det refereres her til EP-A-197 901. Pharmacia AB, Sverige, har utviklet et rekombinant faktor Vlll-produkt som tilsvarer 170 kDa plasmafaktor VIII-formen i terapeutiske faktor Vlll-konsentrater. Det av-kuttede rekombinante faktor Vlll-molekyl betegnes r-VTII SQ og produseres ved kinesisk hamsterovarie(CHO)celler i en celle-dyrkningsprosess i serumfritt medium.

Strukturen og biokjemien for rekombinant faktor Vin-produkter generelt er beskrevet av Kaufman i Trends in Bio-technology, vol. 9, 1991 og Hematology, 63, s. 155-65, 1991. Strukturen og biokjemien for r-VIII SQ er beskrevet i WO-A-91/09122.

Når faktor VIII er rekombinant kan den enten fore-ligge i sin uforkortede form eller fortrinnsvis som et delesjonsderivat derav. Mer foretrukket er delesjonsderivatet rekombinant faktor VIII SQ (r-VIII SQ). Med delesjonsderivat menes her koagulasjonsfaktor VIII hvori hele eller deler av B-domenet mangler. Faktor Vlll-molekylet, og spesielt r-VIII SQ-molekylet, kan dessuten være kjemisk modifisert, f.eks. ved pegylering, kovalent bundne karbohydrater eller polypeptider, for å forbedre stabiliteten av molekylet in vivo.

Den anvendte faktor VIII ved foreliggende oppfinnelse er høyrenset, dvs. at den har en spesifikk aktivitet på mer enn 5 000 IU/mg protein, og endog mer enn 12 000 IU/mg, og stabiliseres fortrinnsvis uten tilsetning av albumin.

Additiver som øker biotilgjengeligheten av faktor VIII er organiske forbindelser per se, salter derav, emulsjoner eller dispersjoner inneholdende organiske forbindelser per se eller salter derav, f.eks. dispersjoner av polare lipider, eller enhver kombinasjon eller addisjonssekvens derav. Organiske forbindelser per se anvendelige ved foreliggende oppfinnelse er f.eks. aminosyrer, peptider, proteiner og poly-sakkarider. Peptider inkluderer dipeptider, tripeptider, oligopeptider og polypeptider, slik som kollagen og gelatin. Kollagenet og gelatinet er fortrinnsvis hydrolysert. Poly-sakkarider inkluderer f.eks. kitosaner, syklodekstriner, stivelse, hyaluronsyre, dekstraner, cellulose og ethvert derivat, kombinasjoner og/eller addisjonssekvenser derav. Stivelsen er fortrinnsvis hydrolysert. Emulsjonene inkluderer olje-i-vann-emulsjoner med olje som den dispergerte fase og vann-i-olje-emulsjonen med olje som den kontinuerlige fase. Oljen kan være av vegetabilsk eller animalsk opprinnelse eller den kan være syntetisk produsert. Den vegetabilske olje i emulsjonene er passende soyaolje eller saflorolje, eller enhver kombinasjon derav. En foretrukket emulsjon er "Intralipid" solgt av Pharmacia AB, Stockholm, Sverige, som ytterligere inneholder egglecitin. De polare lipider er passende én eller flere fosfolipider eller glykolipider eller enhver kombinasjon derav. Hyaluronsyren er fortrinnsvis

"Healon" solgt av Pharmacia AB Uppsala, Sverige. Dekstranet er fortrinnsvis "Promiten" som inneholder 150 mg/ml av den aktive forbindelsen Dekstran 1, og for øvrig natriumklorid, saltstyre til pH ca. 4,5 og vann for injeksjonsvæske, solgt av Pharmacia AB Uppsala, Sverige.

Additivene som øker biotilgjengeligheten av faktor VIII kan tilsettes til formuleringen før tørking eller ved rekonstitusjon, eller de kan tilsettes til en stabil løsning eller dispersjon inneholdende faktor VIII. En kombinasjon av minst to av de nevnte additiver kan også tilsettes. To eller flere av de nevnte additiver kan dessuten tilsettes i rekke-følge.

Ett eller flere antikoagulasjonsmidler kan også tilsettes til formuleringen i en ikke-terapeutisk mengde. Anti-koagulas jonsmidlene kan f.eks. være glykosaminglykaner som hepariner, heparinfragmenter, heparinderivater eller heparan-sulfat. En foretrukket gruppe av glykosaminglykaner er de lav-molekylære hepariner (LMWH) med en gjennomsnittlig molekylmasse på opp til ca. 10 000 Da, mer foretrukket fra 2 000 opp til 8 000 Da.

Før administrering kan én eller flere vandige løsninger eller dispersjoner tilsettes, i enhver blanding eller rekkefølge, til en formulering ifølge foreliggende oppfinnelse som er en stabil vandig løsning, en dispersjon eller tørket form.

Formuleringen kan også omfatte natrium- eller kalium-klorid, fortrinnsvis i en mengde mer enn 0,1 M.

Assosiasjonen av de tunge og lette kjeder av faktor VIII er avhengig av tilstedeværelse av kalsium (eller andre divalente metallioner). Kalsium ble her tilsatt som kalsiumklorid (CaCl2) , men andre salter, slik som kalsiumglukonat, kalsiumglubionat eller kalsiumgluseptat kan også anvendes, fortrinnsvis i en mengde mer enn 0,5 mM.

En aminosyre anvendes fortrinnsvis for å bufre systemet, og den beskytter også proteinet i den amorfe fase dersom formuleringen frysetørkes. En egnet buffer kan være L-histidin, lysin og/eller arginin. L-histidin er primært blitt valgt på grunn av den gode bufferkapasitet av L-histidin rundt pH 7.

Et ikke-ionisk overflateaktivt middel kan også være til stede i formuleringen og velges da fortrinnsvis fra blokk-kopolymerer, slik som en polyoksamer eller polyoksyetylen-sorbitan-fettsyreester, slik som polyoksyetylen-(20)-sorbitan-monolaurat eller polyoksyetylen-(20)-sorbitanmonooleat. Det ikke-ioniske overflateaktive middel bør, dersom det anvendes, fortrinnsvis være til stede i en mengde høyere enn den kritiske micellekonsentrasjon (CMC). Se Wan og Lee, Journal of Pharm Sei, 63, s. 136, 1974.

Polyoksyetylen-sorbitan-fettsyreesteren anvendes fortrinnsvis i en mengde på mindre enn 0,01 mg/ml.

Monosakkarider, disakkarider eller sukkeralkoholer, fortrinnsvis sukrose, kan tilsettes til denne formulering. Antioksidanter, slik som glutation, acetylcystein, tokoferol, metionin, butylhydroksytoluen og/eller butylhydroksyanisol kan også tilsettes.

Kompleksdannende midler, slik som EDTA og sitronsyre, kan også være til stede i små konsentrasjoner for å stabili-sere faktor Vlll-molekylene dersom de oppviser en sterkere affinitet for destabiliserende metallioner enn for kalsium eller andre divalente metallioner som forbinder kjedene av faktor VIII. Konserveringsmidler, slik som benzylalkohol, fenol, sorbinsyre, parabener og klorkresol, kan dessuten også tilsettes.

Formuleringen omfatter fortrinnsvis L-histidin og sukrose. Forholdet mellom natriumklorid og L-histidin og sukrose i preparatet for frysetørking er fortrinnsvis mer enn 1:1 (vekt:vekt), fortrinnsvis mer enn 2:1 (vekt/vekt).

Formuleringen kan omfatte

i) minst 200 IU/ml faktor VIII, fortrinnsvis minst

1 500 IU/ml av et delesjonsderivat av rekombinant faktor VIII,

ii) minst 0,01 mg/ml av en polyoksyetylen-sorbitan-fettsyreester,

iii) natriumklorid, fortrinnsvis i en mengde på mer enn 0,1 M,

iv) kalsiumsalt, slik som kalsiumklorid eller kalsiumglukonat, fortrinnsvis i en mengde på mer enn 0,5 mM,

v) en aminosyre, slik som L-histidin, i en mengde på mer enn 1 mM,

vi) et additiv som øker biotilgjengeligheten av faktor VIII.

Formuleringen kan foreliggende i en tørket form, fortrinnsvis frysetørke. Før administrering kan det tørkede produkt rekonstitueres med en vandig løsning eller en dispersjon, f.eks. en suspensjon, en liposomal formulering eller en emulsjon.

Formuleringen ifølge foreliggende oppfinnelse kan også være en stabil vandig løsning klar for administrering. Den kan også være en dispersjon, f.eks. en suspensjon, en liposomal formulering eller en emulsjon.

Formuleringen kan lagres i et oksygenredusert miljø, som beskrevet i patentsøknad WO-A-94/26286.

Dataene presentert i eksemplene viser at faktor VIII, og spesielt r-VIII SQ, kan injiseres subkutant og gjenvinnes i en aktiv form intravenøst in vivo. Dette er et meget overraskende funn fordi ingen slik formulering har vært kjent

tidligere.

Eksperimentelt

Materialer og metoder

Fremstilling av rekombinant faktor VIII SQ (r-VIII SQ) ble vesentlig utført som beskrevet i WO-A-91/09122, eksempel 1-3. En DHFR-manglende CHO-cellelinje (DG44N.Y.) ble elektroporert med en ekspresjonsvektor inneholdende r-VIII SQ-genet, og en ekspresjonsvektor inneholdende dihydrofolat-reduktasegenet. Etter seleksjon på selektivt medium ble over-levende kolonier amplifisert ved dyrking i trinnvis økende mengder metotrexat. Supernatant fra de resulterende kolonier ble individuelt screenet for faktor Vlll-aktivitet. Et produksjonsklon ble utvalgt, og denne ble deretter tilpasset til serumfri dispensjonsvekst i et definert medium, og til slutt ble det utviklet en fermenteringsprosess i stor skala. Supernatant ble oppsamlet etter bestemte tidsperioder og ytterligere renset som beskrevet nedenfor.

Det klarede, kondisjonerte medium ble pH-justert og påført en S-sepharose FF-kolonne. Etter vask ble faktor VIII eluert med en saltbuffer inneholdende 5 mM CaCl2.

Immunadsorpsjon ble utført på en immunaffinitetsresin hvor liganden var et monoklonalt antistoff (8A4) rettet mot den tunge kjede av faktor VIII. Før applisering av kolonnen ble S-eluatet behandlet med 0,3 % TNBP og 1 % oktoksynol 9.

Kolonnen ble ekvilibrert, vasket og faktor VIII ble eluert med en buffer inneholdende 0,05 M CaCl2 og 50 % etylen-glykol.

mAb-eluatet ble applisert på en Q-sepharose FF-kolonne, ekvilibrert med elueringsbufferen i immunaffinitets-trinnet. Etter vask ble faktor VIII eluert med 0,05 M L-histidin, 0,6 M natriumklorid, 4 mM kalsiumklorid og pH 6,8.

Q-eluatet ble applisert på en gelfiltreringskolonne (Superdex 200 p.g.). Ekvilibrering og eluering ble utført med en buffer inneholdende L-histidin, natriumklorid og kalsiumklorid. Proteintoppen ble oppsamlet og løsningen ble formulert før frysetørking.

Dette materiale av r-VIII SQ ble erholdt fra det siste rensingstrinn. Faktor Vlll-aktiviteten og konsentrasjonen av de inaktive komponenter ble juster ved fortynning med en passende buffer inneholdende polyetylenglykol (PEG). Løsningen ble deretter sterilfiltrert (0,22 im), overført til utleveringsbeholdere og frysetørket.

Eksempel 1

Rekombinant faktor VIII ble fremstilt ifølge frem-gangsmåten beskrevet under eksperimentelt.

Det frysetørkede preparat inneholdende r-VIII SQ var det følgende pr. ampulle, hvilket ble rekonstituert i 4 ml sterilt vann for injeksjon:

Albino-hannmus med vekt på ca. 30 g og av stamme NMRI, SPF, ble injisert subkutant i nakken med den rekonstitu-erte r-VII SQ-løsning.

Det injiserte volum ved 10 000 IU/kg var 9,4 ml/kg, og ved det høyere dosenivå på 50 000 IU/kg, fem ganger større, 47 ml/kg. Ved placebobehandling ble fysiologisk saltløsning anvendt i en mengde på 9,4 ml/kg.

3-5 minutter før blodprøveuttak ble musene bedøvet intraperitonealt med "Mebumal" (pentobarbital) vet. 60 mg/ml. Det injiserte volum var 9,4 mg/kg, dvs. 0,3 ml pr. mus. Under anestesien ble 0,45 ml blod oppsamlet fra vena cava i plast-sprøyter inneholdende 0,05 ml 0,13 M natriumsitrat. Plasma ble deretter preparert fra det oppsamlede blod ved sentrifugering (8 800 g i 7 minutter) og oppbevart frossent i cryoflex-plast-rør ved -70 °C inntil tidspunktet for bestemmelse av faktor Vlll-aktivitet.

Resultater

1. Endringen av VIII:C i plasma med tiden etter en subkutan dose r-VIII SQ, 10 000 IU/kg, viser det typiske mønsteret for et legemiddel som absorberes fra et subkutant depot (se tabell 1). Det maksimale VIII:C-nivå i plasma observeres ca. 1,5 time etter administrering (se tabell 1). De ekstremt høye doser anvendt i de ovenfor angitte tester ble valgt for å få en virkning som var statistisk signifikant. 2. Absorpsjonen av r-VIII SQ fra et subkutant depot verifiseres ytterligere ved den observerte økning i maksimal konsentrasjon når dosen økes fem ganger. Ingen signifikant effekt ble observert på det erholdte plasmanivå av VIII:C når det subkutane injeksjonsvolum ble endret fra 9,4 til 47 ml/kg, mens dosen av r-VIII SQ ble holdt konstant. VIII:C erholdt i plasma var dessuten i det alt vesentlige ikke avhengig av osmolaliteten av administreringsløsningen. 3. Biotilgjengeligheten av r-VIII SQ etter subkutan (s.c.) administrering hos mus var ca. 10 % av biotilgjengeligheten etter intravenøs (i.v.) administrering, idet den sist-nevnte er 100 % ved definisjon. I de foreliggende tester var dosenivået subkutant det samme som dosenivået intravenøst. Biotilgjengeligheten ble beregnet fra arealet under aktivitets(VIII:C)-tidskurven (AUC). Biotilgjengeligheten etter subkutan administrering kan således beregnes etter den følgende ligning (for data se tabeller 1 og 2): Biotilgjengelighetg.c. = AUCS.C./AUCi.v. • dosei.v./doses.c. (1)

Eksempel 2

Rekombinant faktor VIII ble fremstilt i overensstem-melse med metoden beskrevet under eksperimentelt med de følg-ende unntak: (i) Materialet av r-VIII SQ som ble erholdt fra det endelige rensingstrinn ble fortynnet med en buffer som ikke inneholdt PEG, (ii) r-VIII SQ-løsningen ble ikke fryse-tørket, den ble lagret ved -70 °C.

r-VIII SQ-løsningen hadde følgende sammensetning:

Fortynnet r-VIII SQ-løsning (én del r-VIII SQ-løsning + én del vann, v:v).

r-VIII SQ-løsningen ble fortynnet med sterilt vann for injeksjon (én del r-VIII SQ-løsning + én del vann, v:v) før administrering, når dosen av VIII:C var lavere enn 3 000 IU/kg kroppsvekt.

Cynomolug hunnaper ( Macaca fascicularis) med vekt ca. 3-3,5 kg, ble injisert med r-VIII SQ-løsningen subkutant i det dorsale område. Avhengig av dosen varierte injeksjonsvolumet

mellom ca. 0,2 til 2,0 ml/kg kroppsvekt. Subkutane injeksjoner med enkle doser på 250, 2 500 og 5 000 IU/kg ble administrert. Ved hvert prøveuttak ble 1,8 ml blod oppsamlet i rør inneholdende sitrat som antikoagulasjonsmiddel (0,2 ml). Etter sentrifugering ble plasma separert og nedfrosset i aliquoter

(<60 °C).

Resultater

1. Ifølge resultatene (tabell 4-6) følger plasmakonsentrasjonen, som en funksjon av tiden, det typiske mønster for et legemiddel som absorberes etter subkutan administrering. Den maksimale konsentrasjon av VIII:C observeres ca.

9 timer etter administrering.

2. Det erholdte dose-responsforhold (tabell 7) gir en ytterligere verifisering at det foregår en adsorpsjon av VIII:C i blodstrømmen etter en subkutan injeksjon. 3. Biotilgjengeligheten av r-VIII SQ, etter subkutan administrering hos aper, var ca. 5-10 % (tabell 8). Biotilgjengeligheten var vesentlig uavhengig av dosen av r-VIII SQ.

Eksempel 3

Rekombinant faktor VIII (r-VIII SQ) fra begge de ovenfor beskrevne preparater (eksempler 1 og 2) ble anvendt.

Albino-hannmus med vekt på ca. 30 g og fra stamme NMRI, SPF, ble injisert subkutant i nakken med r-VIII SQ-formuleringen.

Dosen var 10 000 IU/kg og injeksjonsvolumet var ca. 10 ml/kg. 3-5 minutter før blodprøveuttak ble musene bedøvet intraperitonealt med "Mebumal" (pentobarbital) vet. 60 mg/ml. Dosevolumet var ca. 0,3 ml/mus. Under anestesi ble 0,45 ml blod oppsamlet fra vena cava i plastsprøyter inneholdende 0,05 ml natriumsitrat (0,13 M). Plasma ble separert fra blodet ved sentrifugering (8 800 g i 7 minutter) og deretter lagret i Cryoflex plastrør ved -70 °C inntil bestemmelse av faktor Vlll-aktivitet. r-VIII SQ-løsningen i kombinasjon med forskjellige additiver som øker biotilgjengeligheten av faktor VIII (tabell 9), ble administrert subkutant hos mus.

Resultater

Tabell 17

Biotilgjengeligheten av r-VIII SQ etter subkutan administrering hos mus. Den subkutant administrerte r-VIII SQ-løsning inneholdt varierende additiver i konsentrasjonen gitt i tabell 9. VIII.-C i administreringsløsningen var ca. 1 100 IU/ml og dosen var 10 000 IU/kg. Biotilgjengeligheten ble beregnet fra arealet under aktivitets(VIII:C)-tidskurven opp til 48 timer. Biotilgjengeligheten etter subkutan administrering av r-VIII SQ er gitt i prosent av biotilgjengeligheten erholdt ved intravenøs administrering med den samme dose (10 000 IU/kg).

Resultater

1. Resultatene viser at det er mulig å øke biotilgjengeligheten av r-VIII SQ. Det er også vist at en høy plasmakonsentrasjon av aktiv r-VIII SQ erholdes under en mye lengre tidsperiode, opp til mer enn 48 timer, når et additiv som øker biotilgjengeligheten ifølge foreliggende oppfinnelse inkluderes i den subkutant administrerte formulering. Dette sammenlignes med plasmakonsentrasjonen erholdt når en r-VIII

SQ-løsning uten et slikt additiv administreres subkutant. En biotilgjengelighet av aktiv r-VIII SQ på minst 50 % oppnås ved subkutan injeksjon av en løsning inneholdende r-VIII SQ og hydrolysert gelatin eller soyaoljeemulsjon.

Claims

1. Farmasøytisk preparat egnet for subkutan, intramuskulær eller intradermal administrering, karakterisert ved at den omfatter (i) minst 500 IU/ml av koagulasjonsfaktor VIII, eller et derivat derav med tilsvarende biologisk aktivitet på minst 170 kDa; og (ii) et organisk additiv med evne til å tilveiebringe et plasmanivå av faktor VIII som er minst 1,5 % av det normale plasmanivå i blodet i minst 6 timer etter administrering, det organiske additiv er utvalgt fra soyabønneoljeemulsjoner, hydrolysert gelatin, hydrolysert kollagen, poly(0-2)hydroksyetylstivelse, hyaluronsyre, dekstraner, L-histidin og derivater og/eller kombinasjoner derav.

2. Formulering ifølge ethvert av kravene 1, karakterisert ved at nevnte koagulasjonsfaktor VIII er en rekombinant faktor VIII.

3. Formulering ifølge ethvert av kravene 1, karakterisert ved at nevnte derivat av faktor VIII er et rekombinant derivat av faktor VIII med en molekylmasse på minst 170 kDa.

4. Formulering ifølge ethvert av kravene 1 til 3, karakterisert ved at den i tillegg omfatter minst 0,01 mg/ml av polyoksyetylensorbitanfettsyreester, minst 0,1 M natriumklorid, minst 0,5 M kalsiumsalt, og/eller minst 1 mM L-histidin.