BRPI0921429B1 - Formulação farmacêutica liofilizada estável, e, método para preparar um fator liofilizado estável - Google Patents

Abstract

FORMULAÇÃO FARMACÊUTICA LIOFILIZADA ESTÁVEL, E, MÉTODO PARA PREPARAR UM FATOR LIOFILIZADO ESTÁVEL É descrita uma composição do fator VIII (FVIII) formulada de maneira tal que NaCI não está presente na formulação final ou está presente em quantidades traços, que permite uma redução concomitante no tempo de ciclo de liofilização e maior estabilidade do FVIII liofilizado.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

No geral, a invenção diz respeito a uma composição do fator VIII formulada de maneira tal que NaCl não está presente na formulação final ou está presente em quantidades traços, que permite uma redução concomitante no tempo de ciclo de liofilização e maior estabilidade do fator VIII liofilizado.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

Fator VIII (FVIII) é uma proteína encontrada no plasma sanguíneo, que age como um cofator na cascata de reações que levam à coagulação do sangue. Uma deficiência na quantidade da atividade de FVIII no sangue resulta no distúrbio de coagulação conhecido como hemofilia A, uma condição hereditária que afeta principalmente machos. Hemofilia A é atualmente tratada com preparações terapêuticas de FVIII derivado de plasma humano ou fabricado usando tecnologia de DNA recombinante. Tais preparações são administradas tanto em resposta a um episódio de sangramento (terapia em demanda) quanto em intervalos frequentes, regulares para evitar sangramento descontrolado (profilaxia).

FVIII é conhecido por ser relativamente instável em preparações terapêuticas. No plasma sanguíneo, FVIII é normalmente complexado com uma outra proteína plasmática, fator de von Willebrand (vWF), que está presente mo plasma em um grande excesso molar para FVIII e acredita-se que protege FVIII da degradação prematura. Uma outra proteína plasmática circulante, albumina, também pode exercer um papel na estabilização de FVIII in vivo. Preparações de FVIII atualmente comercializadas, desta forma, principalmente dizem respeito ao uso de albumina e/ou vWF para estabilizar FVIII durante o processo de fabricação e durante o armazenamento.

A albumina e vWF usados em preparações de FVIII comercializadas atualmente são derivados de plasma sanguíneo humano, entretanto, e o uso de tal material tem certas desvantagens. Em virtude de um grande excesso molar de albumina comparada ao FVIII ser, no geral, adicionado de maneira a aumentar a estabilidade do FVIII em tais preparações, é difícil caracterizar a proteína FVIII em si nestas preparações. A adição de albumina derivada de humano ao FVIII também é percebida como uma desvantagem com relação às preparações de FVIII recombinantemente produzidas. Isto é em virtude, na ausência de tal albumina adicionada, de o risco teórico de transmitir um vírus poder ser menor em preparações de FVIII recombinantemente produzidas.

Várias tentativas de formular FVIII sem albumina ou vWF (ou com níveis relativamente baixos destes excipientes) foram descritas. Por exemplo, patente U.S. No. 5.565.427 (EP 508 194) de Freudenberg (atribuído por Behringwerke) descreve preparações FVIII que contêm combinações particulares de detergente e aminoácidos, especificamente arginina e glicina, além dos excipientes, tais como cloreto de sódio e sacarose. O detergente, polissorbato 20 ou polissorbato 80, é descrito como estando presente em quantidades entre 0,001 a 0,5 % (v/v), enquanto que arginina e glicina estão presentes em quantidades entre 0,01 a 1 mol/L. Sacarose é descrita como estando presente em quantidades entre 0,1 e 10 %. Exemplo 2 desta patente alega que soluções de (1) 0,75 % de sacarose, 0,4 M de glicina, e 0,15 M de NaCl, e (2) 0,01 M de citrato de sódio, 0,08 M de glicina, 0,016 M de lisina, 0,0025 M de cloreto de cálcio, e 0,4 M de cloreto de sódio não foram estáveis em solução durante 16 horas, enquanto que soluções de (3) 1 % de sacarose, 0,14 M de arginina, 0,1 M de cloreto de sódio e (4) 1 % de sacarose, 0,4 M de glicina, 0,14 M de arginina, 0,1 M de cloreto de sódio, e 0,05 % de TWEEN™. 80 (polissorbato 80) apresentou estabilidade.

A patente U.S. No. 5.763.401 (EP 818 204) de Nayer (determinado por Bayer) também descreve uma formulação de FVIII terapêutica sem albumina, compreendendo 15-60 mM de sacarose, até 50 mM de NaCl, até 5 mM de cloreto de cálcio, 65-400 mM de glicina, e até 50 mM histidina. As seguintes formulações específicas foram identificadas como alegadamente sendo estáveis: (1) 150 mM de NaCl, 2,5 mM de cloreto de cálcio, e 165 mM de manitol; e (2) 1 % de sacarose, 30 mM de cloreto de sódio, 2,5 mM de cloreto de cálcio, 20 mM de histidina, e 290 mM de glicina. Observou-se que uma formulação contendo quantidades maiores de açúcar (10 % de maltose, 50 mM de NaCl, 2,5 mM de cloreto de cálcio, e 5 mM de histidina) alegadamente apresentou fraca estabilidade no estado liofilizado comparado à formulação (2).

A patente U.S. No. 5.733.873 (EP 627 924) de Osterberg (determinado por Pharmacia & Upjohn) descreve formulações que incluem entre 0,01-1 mg/mL de um agente tensoativo. Esta patente descreve formulações tendo as seguintes faixas de excipientes: polissorbato 20 ou 80 em uma quantidade de pelo menos 0,01 mg/mL, preferivelmente 0,02 - 1,0 mg/mL; pelo menos 0,1 M de NaCl; pelo menos 0,5 mM de sal de cálcio; e pelo menos 1 mM de histidina. Mais particularmente, as seguintes formulações específicas são descritas: (1) 14,7, 50, e 65 mM de histidina, 0,31 e 0,6 M de NaCl, 4 mM de cloreto de cálcio, 0,001, 0,02, e 0,025 % polissorbato 80, com ou sem 0,1 % PEG 4000 ou 19,9 mM de sacarose; e (2) 20 mg/mL de manitol, 2,67 mg/mL de histidina, 18 mg/mL de NaCl, 3,7 mM de cloreto de cálcio, e 0,23 mg/mL polissorbato 80.

Outras tentativas de usar concentrações baixas ou altas de cloreto de sódio também foram descritas. A patente U.S. No. 4.877.608 (EP 315 968) de Lee (determinado por Rhone-Poulenc Rorer) descreve formulações com concentrações relativamente baixas de cloreto de sódio, a saber formulações compreendendo 0,5 mM a 15 mM de NaCl, 5 mM de cloreto de cálcio, 0,2 mM a 5 mM de histidina, 0,01 a 10 mM de cloridrato de lisina e até 10 % de açúcar. O “açúcar” pode ser até 10 % de maltose, 10 % de sacarose, ou 5 % de manitol.

A patente U.S. No. 5.605.884 (EP 0 314 095) de Lee (determinado por Rhone-Poulenc Rorer) preceitua o uso de formulações com concentrações relativamente altas de cloreto de sódio. Estas formulações incluem 0,35 M a 2 M de NaCl, 1,5 a 40 mM de cloreto de cálcio, 1 mM a 50 mM de histidina, e até 10 % de um “açúcar”, tais como manitol, sacarose, ou maltose. Uma formulação compreendendo 0,45 M de NaCl, 2,3 mM de cloreto de cálcio, e 1,4 mM de histidina é exemplificada.

Pedido de patente internacional WO 96/22107 de Roser (determinado por Quadrant Holdings Cambridge Limited) descreve formulações que incluem o açúcar trealose. Estas formulações compreendem: (1) 0,1 M de NaCl, 15 mM de cloreto de cálcio, 15 mM de histidina, e 1,27 M (48 %) trealose; ou (2) 0,011 % cloreto de cálcio, 0,12 % histidina, 0,002 % de Tris, 0,002 % de TWEEN™. 80. 0,004 % de PEG 3350, 7,5 % de trealose, e tanto 0,13 % quanto 1,03 % de NaCl.

A patente U.S. No. 5.328.694 (EP 511 234) de Schwinn (determinado por Octapharma AG) descreve uma formulação que inclui 100 a 650 mM de dissacarídeo e 100 mM - 1,0 M de aminoácido. Especificamente, as seguintes formulações são descritas: (1) 0,9 M de sacarose, 0,25 M de glicina, 0,25 M de lisina, e 3 mM de cloreto de cálcio; e (2) 0,7 M de sacarose, 0,5 M de glicina, e 5 mM de cloreto de cálcio.

Outras formulações de FVIII terapêuticas da tecnologia anterior no geral incluem albumina e/ou vWF para o propósito de estabilizar FVIII e, desta forma, não são relevantes para a presente descrição. Embora exista uma literatura extensa focada nos problemas de desenvolvimento da formulação e processo com produtos secos por congelamento, estudos de FVIII seco por congelamento são limitados a um estudo das formulações com base no uso de NaCl como um agente de massa.

Uma complicação principal no desenvolvimento da formulação é a presença de cloreto de sódio na substância de droga de massa que é, no geral, introduzida pelo processo de purificação. Como um resultado do processo de purificação, quantidades grandes e/ou variáveis de cloreto de sódio estão presentes na substância de droga de massa solução. Cloreto de sódio não cristalizado abaixa a temperatura de colapso e pode levar ao produto incapaz de ser fabricado em nenhuma remontagem de um produto elegante. Além disso, o cloreto de sódio amorfo pode comprometer a estabilidade do produto. A presente descrição envolve formulações para secagem por congelamento em que NaCl é removido ou está presente em quantidades traços, que são capazes de manter FVIII estavelmente armazenado por períodos maiores de tempo.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Composições de FVIII da presente descrição são, em uma modalidade, formuladas de maneira tal que NaCl não está presente na formulação final ou está presente em quantidades traços, que permite uma redução concomitante no tempo de ciclo de liofilização e maior estabilidade do FVIII liofilizado.

Em uma modalidade, um formulação farmacêutica liofilizada estável de FVIII é fornecida compreendendo: (a) um FVIII; (b) um ou mais agentes tamponantes; (c) um ou mais antioxidantes; (d) um ou mais agentes estabilizantes; e (e) um ou mais agentes tensoativos; o FVIII compreendendo um polipeptídeo selecionado do grupo que consiste em: a) um polipeptídeo de FVIII recombinante; b) um análogo, fragmento ou variante biologicamente ativo de a); o tampão é composto de um agente de tamponamento de pH em uma faixa de cerca de 0,1 mM a cerca de 500 mM e o pH é em uma faixa de cerca de 2,0 a cerca de 12,0; o antioxidante é em uma concentração de cerca de 0,005 a cerca de 1,0 mg/mL; o agente estabilizante é em uma concentração de cerca de 0,005 a cerca de 20 %; o agente tensoativo é em uma concentração de cerca de 0,001 % a cerca de 1,0 %; a dita formulação excluindo cloreto de sódio (NaCl) ou incluindo somente quantidade traço de NaCl.

Em uma outra modalidade, uma formulação mencionada anteriormente é fornecida em que o agente tamponante é selecionado do grupo que consiste em citrato, glicina, histidina, HEPES, Tris e combinações destes agentes. Em uma modalidade, o agente tamponante é histidina.

Em uma outra modalidade, uma formulação mencionada anteriormente é fornecida em que o pH é na faixa de cerca de 6,0 a cerca de 8,0 ou cerca de 6,5 a cerca de 7.5. Ainda em uma outra modalidade, o agente tamponante é histidina e o pH é cerca de 7,0.

Em uma modalidade, uma formulação mencionada anteriormente é fornecida em que o antioxidante é glutationa. Ainda em uma outra modalidade, o antioxidante é em uma faixa de concentração de cerca de 0,1 a cerca de 0,5 mg/mL. Ainda em uma outra modalidade, o antioxidante é glutationa em uma concentração de cerca de 0,2 mg/mL. Ainda em uma outra modalidade, o agente tamponante é histidina e o pH é cerca de 7,0; e em que o antioxidante é glutationa em uma concentração de cerca de 0,2 mg/mL.

Em uma outra modalidade, uma formulação mencionada anteriormente é fornecida em que um ou mais agentes estabilizantes são selecionados do grupo que consiste em sacarose, trealose, e rafinose, e combinações destes agentes estabilizantes. Em uma modalidade, os agentes estabilizantes são trealose em uma concentração de cerca de 5 % e cloreto de cálcio em uma concentração de cerca de 4 mM. Ainda em uma outra modalidade, os agentes estabilizantes são sacarose em uma concentração de cerca de 5 % e cloreto de cálcio em uma concentração de cerca de 4 mM.

Em uma modalidade, uma formulação mencionada anteriormente é fornecida em que o agente tensoativo é selecionado do grupo que consiste em digitonina, Triton X-100, Triton X- 114, TWEEN-20, TWEEN-80 e combinações destes agentes tensoativos. Ainda em uma outra modalidade, o agente tensoativo é TWEEN-80 em cerca de 0,03 %.

Em uma modalidade, uma formulação mencionada anteriormente é fornecida em que o agente tamponante é histidina em uma concentração de cerca de 25 mM em cerca de pH 7,0; em que o antioxidante é glutationa em uma concentração de cerca de 0,2 mg/mL; em que os agentes estabilizantes são trealose ou sacarose em uma concentração de cerca de 5 % e cloreto de cálcio em uma concentração de cerca de 4 mM.; e em que o agente tensoativo é TWEEN-80 em cerca de 0,03 %.

Ainda em uma outra modalidade, uma formulação mencionada anteriormente é fornecida em que NaCl não é adicionado como um excipiente. Ainda em uma outra modalidade, NaCl está presente em quantidade traço seguindo remoção por diálise ou cromatografia por troca de solvente.

Métodos para preparar um FVIII liofilizado estável são fornecidos na presente descrição. Em uma modalidade, um método para preparar um FVIIII liofilizado estável é fornecido compreendendo as etapas de (a) preparar uma formulação mencionada anteriormente; e (b) liofilizar a formulação da etapa (a). Ainda em uma outra modalidade, o método mencionado anteriormente é fornecido em que estabilidade do FVIII liofilizado é maior comparada a uma formulação de FVIII que é liofilizada na presença de cloreto de sódio.

Em uma outra modalidade, uma formulação farmacêutica liofilizada estável de FVIII é fornecida compreendendo: (a) um FVIII; (b) um ou mais agentes tamponantes; (c) um ou mais antioxidantes; (d) um ou mais agentes estabilizantes; e (e) um ou mais agentes tensoativos; o FVIII compreendendo um polipeptídeo selecionado do grupo que consiste em: a) um polipeptídeo de FVIII recombinante; b) um análogo, fragmento ou variante biologicamente ativo de a); o tampão é composto de um agente de tamponamento de pH em uma faixa de cerca de 0,1 mM a cerca de 500 mM e o pH é em uma faixa de cerca de 2,0 a cerca de 12,0; o antioxidante é em uma concentração de cerca de 0,005 a cerca de 1,0 mg/mL; o agente estabilizante é em uma concentração de cerca de 0,005 a cerca de 20 %; e o agente tensoativo é em uma concentração de cerca de 0,001 % a cerca de 1,0 %.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DAS FIGURAS

Figura 1. Perda de FVIII durante formulação e secagem por congelamento. Barras de erro são erro padrão calculado de determinações em replicata.

Figura 2. Estabilidade no armazenamento de rAHF seco por congelamento em formulações à base de manitol/trealose (Figura 2A) e glicina/trealose (Figura 2B) e raiz quadrada de cinéticas de tempo.

Figura 3. Constantes da taxa para degradação de rAHF seco por congelamento em formulações selecionadas: Estudo de seleção da formulação.

Figura 4. Os efeitos de Glutationa, Histidina, e Hepes na estabilidade de formulações à base de Glicina:Trealose: Perda em processo da atividade e perda da atividade durante 9 meses armazenamento a 25 °C. A formulação “básica” é: rAHF (103 IU/mL), Glicina (8 %), Trealose (2 %), NaCl (200 mM), 10 mM de Tris, 0,025 % de polissorbato 80, 4 mM de CaCh, a pH 7. As outras formulações consistem em formulação “básica” na qual glutationa foi adicionada (0,2 g/L) e tanto tampão Hepes (10 mM), tampão de histidina (50 mM), quanto o agente complexante de ferro Deferoxamine (0,25 mg/L). O processo usado foi essencialmente o mesmo dado na tabela 5.

Figura 5. Constantes da taxa de degradação de rAHF seco por congelamento. Detalhes das formulações e processos são dados na tabelas 5 e 6. Constante da taxa é de raiz quadrada de cinéticas de tempo com tempo em meses. Barras de erro representam erros padrão dados pela análise de regressão.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Definições

Da forma aqui usada, os termos a seguir e variações destes devem ser definidos como se segue, a menos que de outra forma indicado:

A menos que de outra forma definido, todos os termos técnicos e científicos usados aqui têm o mesmo significado comumente entendido por um versado na tecnologia à qual esta invenção pertence. As seguintes referências fornecem uma das habilidades com uma definição geral de muitos dos termos usados nesta descrição: Singleton, et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY (2d ed. 1994); THE CAMBRIDGE DICTIONARY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY (Walker ed., 1988); THE GLOSSARY OF GENETICS, 5a ED, R. Rieger, et al. (eds.), Springer Verlag (1991); e Hale and Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY (1991).

Cada publicação, pedido de patente, patente e outras referências aqui citadas está incorporada pela referência na íntegra até o ponto em que não é inconsistente com a presente descrição.

Nota-se aqui que, da forma usada neste pedido de patente e nas reivindicações em anexo, as formas singulares “um,” “uma,” “o” e “a” incluem referência no plural a menos que o contexto claramente indique o contrário.

Da forma aqui usada, os seguintes termos têm os significados descritos para eles a menos que de outra forma especificado.

O termo “compreendendo,” com relação a um composto peptídeo, significa que um composto pode incluir aminoácidos adicionais tanto no terminal amino quanto carbóxi ou ambos da dada sequência. Certamente, estes aminoácidos adicionais não devem significativamente interferir com a atividade do composto. Com relação a uma composição da presente descrição, o termo “compreendendo” significa que uma composição pode incluir componentes adicionais. Estes componentes adicionais não devem significativamente interferir com a atividade da composição. “Compreendendo” uma vez que diz respeito a uma formulação FVIII exclui cloreto de sódio (NaCl) completamente, ou inclui NaCl somente em quantidades traço.

O termo “farmacologicamente ativo” significa que uma substância então descrita é determinada como tendo atividade que afeta um parâmetro médico ou estado da doença.

Da forma aqui usada os termos “expressar,” “expressando” e “expressão” significam permitir ou fazer com que a informação em um gene ou sequência de DNA se manifeste, por exemplo, produzindo uma proteína ativando as funções celulares envolvidas na transcrição ou tradução de um gene ou sequência de DNA correspondentes. Uma sequência de DNA é expressa em ou por uma célula para formar um “produto de expressão”, tais como uma proteína. O produto de expressão em si, por exemplo, a proteína resultante, também pode ser dito como “expresso.” Um produto de expressão pode ser caracterizado como intracelular, extracelular ou secretado. O termo “intracelular” significa dentro de uma célula. O termo “extracelular” significa fora de uma célula, tais como uma proteína transmembrana. Uma substância é “secretada” por uma célula se ele parecer em medição significativa fora da célula, de algum lugar sobre ou dentro da célula.

Da forma aqui usada um “polipeptídeo” refere-se a um polímero composto de resíduos de aminoácido, variantes estruturais, variantes estruturais que ocorrem naturalmente relacionados, e análogos que ocorrem não naturalmente sintéticos destes ligados por meio de ligações de peptídeo. Polipeptídeos sintéticos são preparados, por exemplo, usando um sintetizador de polipeptídeo automatizado. O termo “proteína” tipicamente refere-se a polipeptídeos grandes. O termo “peptídeo” tipicamente refere-se a polipeptídeos curtos.

Da forma aqui usada um “fragmento” de um polipeptídeo refere- se a qualquer porção de um polipeptídeo ou proteína menor que o polipeptídeo de cadeia completa ou produto de expressão de proteína.

Da forma aqui usada um “análogo” refere-se a qualquer um de dois ou mais polipeptídeos substancialmente similares em estrutura e tendo a mesma atividade biológica, mas pode ter graus variados de atividade, tanto para a molécula inteira quanto para um fragmento deste. Análogos diferem na composição de suas sequências de aminoácidos com base em uma ou mais mutações que envolvem substituição, deleção, inserção e/ou adição de um ou mais aminoácidos para outros aminoácidos. Substituições podem ser conservativas ou não conservativas com base na relação fisicoquímica ou funcional do aminoácido que está sendo substituído e do aminoácido que substitui.

Da forma aqui usada uma “variante” refere-se a um polipeptídeo, proteína ou análogo deste que é modificado para compreender frações químicas adicionais não normalmente uma parte da molécula. Tais frações podem modular a solubilidade, absorção, meia-vida biológica da molécula etc. As frações altemativamente podem diminuir a toxicidade da molécula e eliminar ou atenuar qualquer efeito colateral indesejado da molécula, etc. Frações capazes de mediar tais efeitos são descritos em Remington's Pharmaceutical Sciences (1980). Procedimento para acoplar tais frações a uma molécula são bem conhecidos na tecnologia. Por exemplo e sem limitação, em um aspecto a variante é um fator de coagulação do sangue tendo uma modificação química que confere uma maior meia-vida in vivo à proteína. Em vários aspectos, polipeptídeos são modificados por glicosilação, peguilação, e/ou polisililação. FVIII Aqui, o termo “Fator VIII” ou “FVIII” ou “rAHF” refere-se a qualquer molécula FVIII que tem pelo menos uma porção do domínio B intacto e que apresenta atividade biológica que é associada a FVIII nativo. Em uma modalidade da descrição, a molécula de FVIII é FVIII de cadeia completa. A molécula de FVIII é uma proteína que é codificada pelas sequências de DNA capazes de hibridizar para DNA que codifica FVIILC. Uma proteína como esta pode conter deleções de aminoácido em vários sítios entre ou nos domínios Al- A2-B-A3-C1-C2 (patente U.S. No. 4.868.112). A molécula de FVIII também pode ser um análogo de FVIII nativo em que um ou mais resíduos de aminoácido foram substituídos por mutagênese direcionada ao sítio.

De acordo com a presente descrição, o termo “fator VIII recombinante” (rFVIII) pode incluir qualquer rFVIII, heterólogo ou que ocorre naturalmente, obtido por meio de tecnologia de DNA recombinante, ou um derivado biologicamente ativo destes. Em certas modalidades, o termo engloba proteínas da forma descrita anteriormente e ácidos nucléicos, que codificam um rFVIII da descrição. Tais ácidos nucléicos incluem, por exemplo e sem limitação, genes, pré-mRNAs, mRNAs, variantes polimórficos, alelos, mutantes sintéticos e que ocorrem naturalmente. Proteínas englobadas pelo termo rFVIII incluem, por exemplo e sem limitação, as proteínas e polipeptídeos descritos anteriormente, proteínas codificadas por um ácido nucléico descritas anteriormente, homólogos interespécies e outros polipeptídeos que: (1) têm uma sequência de aminoácidos que tem mais que cerca de 60 %, cerca de 65 %, cerca de 70 %, cerca de 75 %, cerca de 80 %, cerca de 85 %, cerca de 90 %, cerca de 91 %, cerca de 92 %, cerca de 93 %, cerca de 94 %, cerca de 95 %, cerca de 96 %, cerca de 97 %, cerca de 98 % ou cerca de 99 % ou maior identidade de sequência de aminoácidos, sobre uma região de pelo menos cerca de 25, cerca de 50, cerca de 100, cerca de 200, cerca de 300, cerca de 400, ou mais aminoácidos (até a sequência de comprimento completo de 406 aminoácidos para a proteína nativa madura), a um polipeptídeo codificado por um ácido nucléico referenciado ou uma sequência de aminoácidos descrita aqui; e/ou (2) especificamente se ligam a anticorpos, por exemplo, anticorpos policlonais ou monoclonais, gerados contra um imunógeno compreendendo uma sequência de aminoácidos referenciada da forma aqui descrita, um fragmento imunogênico deste, e/ou uma variante conservativamente modificada deste.

Da forma aqui usada, “FVIII endógeno” inclui FVIII que origina do mamífero pretendido para receber o tratamento. O termo também inclui FVIII transcrito de um transgene ou qualquer outro DNA estranho presente no dito mamífero. Da forma aqui usada, “FVIII exógeno” inclui FVIII que não origina do dito mamífero.

A molécula de FVIII existe naturalmente e em preparações terapêuticas como uma distribuição heterogênea de polipeptídeos que surgem de um produto de gene único (ver, por exemplo, Andersson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 2979 2983, Maio 1986). O termo “Fator VIU” da forma aqui usada refere-se a todos tais polipeptídeos, seja derivados de plasma sanguíneo ou produzidos pelo uso de técnicas de DNA recombinante e incluem, mas sem limitações, imitadores de FVIII, conjugados de fc-FVIII, FVIII quimicamente modificado com polímeros solúveis em água e outras formas ou derivados de FVIII. Exemplos comercialmente disponíveis de preparações terapêuticas contendo FVIII incluem as vendidas com o nome registrado de HEMOFIL M e RECOMBINATE (disponível da Baxter Healthcare Corporation, Deerfield, 111, U.S.A.). Outras preparações compreendem principalmente uma única subpopulação de moléculas de FVIII, que não têm a porção do domínio B da molécula.

O material de partida da presente descrição é FVIII, que pode ser derivado de plasma humano, ou produzido por técnicas de engenharia recombinante, conforme descrito nas patentes U.S. No. 4.757.006; patente U.S. No. 5.733.873; patente U.S. No. 5.198.349; patente U.S. No. 5.250.421; patente U.S. No. 5.919.766; EP 306 968.

As moléculas de FVIII usadas para a presente descrição incluem a proteína de cadeia completa, precursores da proteína, subunidades ou fragmentos biologicamente ativos ou funcionais da proteína, e derivados funcionais destes, bem como variantes destes da forma aqui descrita a seguir. Referência a FVIII deve incluir todas as formas potenciais de tais proteínas e em que cada uma das formas de FVIII tem pelo menos uma porção ou toda a sequência de domínio B nativa intacta.

Polinucleotídeos que codificam um rFVIII da descrição incluem, sem limitação, os que (1) especificamente hibridizar em condições de hibridização severas para um ácido nucléico que codifica uma sequência de aminoácidos referenciada da forma aqui descrita, e variantes conservativamente modificados destes; (2) ter uma sequência de ácidos nucléicos que tem mais que cerca de 95 %, cerca de 96 %, cerca de 97 %, cerca de 98 %, cerca de 99 %, ou maior identidade de sequência de nucleotídeos, sobre uma região de pelo menos cerca de 25, cerca de 50, cerca de 100, cerca de 150, cerca de 200, cerca de 250, cerca de 500, cerca de 1000, ou mais nucleotídeos (até a sequência de comprimento completo de 1218 nucleotídeos da proteína madura), a uma sequência de ácidos nucléicos referência da forma aqui descrita.

Polipeptídeos variantes (ou análogos) incluem variantes de inserção, em que um ou mais resíduos de aminoácido são adicionados a uma sequência de aminoácidos de FVIII da descrição. Inserções podem ser localizadas em qualquer um ou ambos os terminais da proteína, e/ou podem ser posicionadas nas regiões internas da sequência de aminoácidos de FVIII. Variantes de inserção, com resíduos adicionais em qualquer um ou ambos os terminais incluem, por exemplo, proteínas de fusão e proteínas incluindo expressões de aminoácido ou outras marcas de aminoácido. Em um aspecto, a molécula de FVIII opcionalmente pode conter um Met N-terminal, especialmente quando a molécula é expressa recombinantemente em uma célula bacteriana, tal como E. coli.

Em variantes de deleção, um ou mais resíduos de aminoácido em um polipeptídeo FVIII da forma aqui descrita são removidos. Deleções podem ser efetuadas em qualquer um ou ambos os terminais do polipeptídeo FVIII, e/ou com remoção de um ou mais resíduos na sequência de aminoácidos FVIII. Variantes de deleção, desta forma, incluem todos os fragmentos de uma sequência de polipeptídeos FVIII.

Em variantes de substituição, um ou mais resíduos de aminoácido de um polipeptídeo FVIII são removidos e substituídos por resíduos alternativos. Em um aspecto, as substituições são de natureza conservativa e substituições conservativas deste tipo são bem conhecidas na tecnologia. Altemativamente, a descrição engloba substituições que também são não conservativas. Substituições conservativas exemplares são descritas em Lehninger, [Biochemistry, 2a Edição; Worth Publishers, Inc., Nova Iorque (1975), pp.71-77] e apresentadas imediatamente a seguir. SUBSTITUIÇÕES CONSERVATIVAS

Altemativamente, substituições conservativas exemplares são apresentadas imediatamente a seguir. SUBSTITUIÇÕES CONSERVATIVAS II

Um polinucleotídeo ou sequência de polipeptídeos “que ocorre naturalmente” é tipicamente de um mamífero incluindo, mas sem limitações, primata, por exemplo, humano; roedor, por exemplo, rato, camundongo, hamster; vaca, porco, cavalo, ovelha ou qualquer mamífero. Os ácidos nucléicos e proteínas da descrição podem ser moléculas recombinantes (por exemplo, heteróloga e que codifica a sequência tipo selvagem ou uma variante desta, ou que ocorre não naturalmente). Polinucleotídeo e sequências de polipeptídeos referências incluem, por exemplo, UniProtKB/Swiss- Prot P00451 (FA8HUMANO); Gitschier J et al., Characterization of the human VIII Factor gene, Nature, 312(5992): 326-30 (1984); Vehar GH et al., Structure of human VIII Factor, Nature, 312(5992):337-42 (1984); e Thompson AR. Structure and Function of the VIII Factor gene and protein, Semin Thromb Hemost, 2003:29;l 1-29 (2002), (referências aqui incorporadas na íntegra).

Da forma aqui usada “derivado biologicamente ativo” ou “variante biologicamente ativa” inclui qualquer derivado ou variante de uma molécula tendo substancialmente as mesmas propriedades funcionais e/ou biológicas da dita molécula, tais como propriedades de ligação e/ou a mesma base estrutural, tais como um espinha dorsal peptídica ou uma unidade polimérica básica.

Da forma aqui usada, “FVIII derivado de plasma” ou “plasmático” inclui todas as formas da proteína encontrada no sangue obtida de um mamífero tendo a propriedade de ativar o caminho da coagulação.

Em vários aspectos, produção de rFVIII inclui qualquer método conhecido na tecnologia para (i) a produção de DNA recombinante por engenharia genética, (ii) introdução de DNA recombinante nas células procarióticas ou eucarióticas, por exemplo e sem limitação, por transfecção, eletroporação ou microinjeção, (iii) cultivar as ditas células transformadas, (iv) expressar rFVIII, por exemplo, constitutivamente ou mediante indução, e (v) isolar o dito rFVIII, por exemplo, do meio de cultura ou coletando as células transformadas, de maneira a (vi) obter rFVIII purificado.

Em outros aspectos, o rFVIII é produzido pela expressão em um sistema de hospedeiro procariótico ou eucariótico adequado caracterizado pela produção de uma molécula de rFVIII farmacologicamente aceitável. Exemplos de células eucarióticas são células de mamíferos, tais como CHO, COS, HEK 293, BHK, SK-Hep, e HepG2.

Ainda em outros aspectos, uma ampla variedade de vetores é usada para a preparação do rFVIII e é selecionada de vetores de expressão eucariótica e procariótica. Exemplos de vetores para a expressão procariótica incluem plasmídeos, tais como, e sem limitação, pRSET, pET, e pBAD, em que os promotores usados nos vetores de expressão procariótica incluem um ou mais de, e sem limitação, lac, trc, trp, recA, ou araBAD. Exemplos de vetores para a expressão eucariótica incluem: (i) para expressão em levedura, vetores, tais como, e sem limitação, pAO, pPIC, pYES, ou pMET, usando promotores, tais como, e sem limitação, AOX1, GAP, GAL1, ou AUG1; (ii) para expressão em células de inseto, vetores, tais como e sem limitação, pMT, pAc5, pIB, pMIB, ou pBAC, usando promotores, tais como e sem limitação PH, plO, MT, Ac5, OpIE2, gp64, ou polh, e (iii) para expressão em células de mamíferos, vetores, tais como e sem limitação pSVL, pCMV, pRc/RSV, pcDNA3, ou pBPV, e vetores derivados de, em um aspecto, sistemas virais, tais como e sem limitação vírus vaccinia, viroses adeno-associadas, vírus da herpes ou retrovirus, usando promotores, tais como e sem limitação CMV, SV40, EF-I, UbC, RSV, ADV, BPV, e β-actina. “Unidade internacional,” ou “IU,” é uma unidade de medição da atividade de coagulação do sangue (potência) de FVIII conforme medido por um ensaio padrão, tais como um ensaio de um estágio. Ensaios de um estágio são conhecidos na tecnologia, tais como os descritos em N Lee, Martin L, et al., A Effect of Predilution on Potency Assays of FVIII Concentrates, Thrombosis Research (Pergamon Press Ltd.) 30, 511 519 (1983). Um outro ensaio padrão é um ensaio cromogênico. Ensaios cromogênicos podem ser adquiridos comercialmente, tais como o Coatest VIII Factor, disponível da Chromogeix AB, Molndal, Sweden.

O termo “recozimento” deve ser usado para indicar uma etapa no processo de liofilização de uma preparação farmacêutica que se submete a liofilização, antes dos estágios de secagem da preparação, em que a temperatura da preparação congelada é aumentada de uma temperatura inferior para uma temperatura superior e então resfriada novamente depois de um período de tempo.

Agentes de massa são as entidades químicas que fornecem estrutura à “torta” ou massa sólida residual de uma preparação farmacêutica depois que ela foi liofilizada e que a protege contra colapso. Um agente de massa cristalizável deve significar um agente de massa da forma aqui descrita que pode ser cristalizado durante liofilização, a não ser cloreto de sódio. HES não está incluído neste grupo de agentes de massa cristalizáveis.

Secagem por congelamento, a menos que de outra forma indicado pelo contexto em que aparece, deve ser usado para denotar a porção de um processo de liofilização em que a temperatura de uma preparação farmacêutica é aumentada de maneira a retirar água da preparação. As etapas de “congelamento” de um processo de liofilização são as etapas que ocorrem antes do estágio de secagem por congelamento. “Liofilização,” a menos que de outra forma indicado, deve referir-se a todo o processo de liofilização, incluindo tanto as etapas de congelamento quanto as etapas de secagem por congelamento.

A menos que de outra forma notado, termos em porcentagem expressam porcentagens em peso/volume e temperaturas são na escala Celsius.

Desenvolvimento da Formulação e Liofilização

De maneira a alcançar máxima estabilidade, as composições de FVIII da presente descrição são, em um aspecto, liofilizadas. Durante liofilização, FVIII é convertido de uma fase aquosa para uma fase sólida amorfa, que acredita-se proteger a proteína da instabilidade química e/ou conformacional. A preparação liofilizada não somente contém uma fase amorfa, mas também inclui um componente que cristaliza durante a liofilização. Acredita-se que a inclusão de um componente como este permite a rápida liofilização da composição FVIII e a formação de uma torta mais elegante (isto é, uma torta com retenção da estrutura da torta e mínimo encolhimento dos lados do recipiente em que ela foi liofilizada). Nas formulações da presente descrição, os agentes estabilizantes foram selecionados para existir em uma fase amorfa do produto liofilizado, enquanto que os agentes de massa (exceto HES) foram selecionados para cristalizar durante congelamento.

Tanto o FVIII quanto o estabilizante são, em um aspecto, dispersos na fase amorfa da torta liofilizada. A massa do estabilizante também é, em um aspecto, grande comparada aos outros excipientes na forma amorfa. Além do mais, a temperatura de transição vítrea aparente (Tg') da fase amorfa é, em um aspecto, relativamente alta durante secagem por congelamento, e a temperatura de transição vítrea (Tg) do sólido é igualmente preferivelmente alta durante armazenamento. Observou-se que a cristalização de cloreto de sódio no produto foi desejável, uma vez que cloreto de sódio amorfo expressa a Tg' da fase amorfa.

De maneira a evitar o colapso da torta de uma composição particular, secagem primária é, em um aspecto, realizada em uma temperatura do produto abaixo da temperatura de transição vítrea aparente do concentrado congelado. Um aumento no tempo de secagem também pode ser requerido para equilibrar uma diminuição em Tg'. Informação adicional sobre liofilização pode ser encontrada em Carpenter, J. F. and Chang, B. S., Liophylization of Protein Pharmaceuticals, Biotechnology and Biopharmaceutical Manufacturing, Procesing and Preservation, K. E. Avis and V. L. Wu, eds. (Buffalo Grove, 111,: Interpharm Press, Inc.), pp. 199 264 (1996), Patentes dos Estados Unidos Nos. 7.247.707, 7.087.723, 6.586.573.

Liofilização é realizada usando técnicas comuns na tecnologia e deve ser otimizada para a composição a ser desenvolvida [Tang et al., Pharm Res. 21:191- 200, (2004) e Chang et al., Pharm Res. 13:243-9 (1996)].

Um ciclo de liofilização é, em um aspecto, composto de três etapas: congelamento, secagem primária, e secagem secundária [A. P. Mackenzie, Phil Trans R Soc London, Ser B, Biol 278:167 (1977)]. Na etapa de congelamento, a solução é resfriada para iniciar a formação de gelo. Além disso, esta etapa induz a cristalização do agente de massa. O gelo sublima no estágio de secagem primária, que é conduzido reduzindo a pressão da câmara abaixo da pressão de vapor do gelo, usando um vácuo e introduzindo calor para promover sublimação. Finalmente, água adsorvida ou ligada é removida no estágio de secagem secundária em pressão da câmara reduzida e em uma temperatura em si elevada. O processo produz um material conhecido como uma torta liofilizada. Daí em diante a torta pode ser reconstituída tanto com água estéril ou diluente adequado para injeção.

O ciclo de liofilização não somente determina o estado físico final dos excipientes, mas também afeta outros parâmetros, tais como tempo de reconstituição, aparência, estabilidade e teor de umidade final. A estrutura da composição no estado congelado procede por meio de várias transições (por exemplo, transições vítreas e cristalizações) que ocorrem em temperaturas específicas e a estrutura pode ser usada para entender e otimizar o processo de liofilização. Tg e/ou Tg' pode fornecer informação a cerca do estado físico de um soluto e pode ser determinada por calorimetria por varredura diferencial (DSC). Tg e Tg' são um parâmetro importante que devem ser levados em consideração na designação do ciclo de liofilização. Por exemplo, Tg' é importante para secagem primária. Além disso, no estado seco, a temperatura de transição vítrea fornece informação a respeito de temperaturas de armazenamento provavelmente aceitáveis para o produto final.

Além da droga ativa, componentes da formulação, em um aspecto, incluem estabilizantes, um agente tensoativo, tampões, e um agente de massa no caso de uma droga de dosagem baixa. Componentes especiais que endereçam a única necessidade da proteína, tais como Ca+ com FVIII, também são incluídos, em vários aspectos. Muitos aditivos, tais como açúcares, glicerol, certos aminoácidos e aminas todos muitos severos como estabilizantes. Estabilidade é frequentemente fracionada em termos de “dinâmicas vítreas” isto é, a formulação deve formar um sólido amorfo 'não reativo', ou vidro, durante a secagem por congelamento, em que a proteína é molecularmente dispersa e acoplada à matriz vítrea imóvel, de maneira tal que mobilidade da proteína e reagentes potenciais sejam muito restritos. Imobilização significa estabilização, pelo menos qualitativamente, uma vez que qualquer processo de degradação irá requerer mobilidade molecular de algum tipo. A matriz vítrea dos concentrados congelados e a fase amorfa seca são caracterizados por suas temperaturas de transição vítrea, Tg' e Tg, respectivamente. Abaixo da temperatura de transição vítrea, mobilidade fica muito limitada e, ao contrário, muito acima da transição vítrea, mobilidade fica suficientemente alta para suportar processos de degradação químicos e físicos rápidos. Como uma regra geral, a temperatura do produto (Tp) durante secagem primária deve ser controlada próximo ou abaixo da Tg ' (Tp< Tg') para evitar colapso de uma matriz amorfa durante secagem por congelamento (isto é, evitar uma mudança física indesejada) e ser mantida abaixo de Tg durante armazenamento para evitar rápida degradação. Entretanto, armazenamento simplesmente abaixo da Tg não necessariamente garante estabilidade aceitável. Dissacarídeos têm propriedades que permitem que eles funcionem tanto como substitutos de água efetivos quanto bons formadores de vidro. Tipicamente, sacarose e trealose são usados como estabilizantes.

Da forma aqui descrita, um agente de massa é um outro excipiente importante em uma proteína formulação. Uma função do agente de massa é fornecer “elegância” e mais importante, proteger o produto de “estourar.” Isto é, no caso de uma droga de dosagem baixa, a concentração da droga pode ser tão pequena que o produto seco resultante, ou torta, tem pouca resistência mecânica. Assim, a transferência do momento do fluxo de vapor de água desintegra a torta e transfere pedaços do produto para for a do frasco na câmara de secagem. Tipicamente, materiais solúveis, facilmente cristalizados com altas temperaturas eutéticas funcionam bem como agentes de massa em virtude de eles serem fáceis de secar no congelamento sem dano devido ao colapso. Manitol e glicina são comumente empregados em produtos farmacêuticos. O agente de massa precisa estar presente como o componente principal para garantir cristalização essencialmente completa.

Formulações e excipientes em geral

Excipientes são aditivos que tanto conferem quanto melhoram a capacidade de fabricação e/ou qualidade final do produto, tais como a estabilidade e distribuição de um produto de droga (p°r exemplo, proteína). Independente do motivo para sua inclusão, excipientes são um componente integral de uma formulação e, desta forma, precisam ser seguros e bem tolerados por pacientes. Para drogas de proteína, a escolha dos excipientes é particularmente importante em virtude de eles poderem afetar tanto a eficácia quanto a imunogenicidade da droga. Assim, as formulações de proteína precisam ser desenvolvidas com seleção apropriada dos excipientes que disponibilizam estabilidade, segurança e comerciabilidade adequados.

Uma formulação liofilizada é, em uma modalidade, pelo menos composta de um ou mais de um tampão, um agente de massa, e um estabilizante. Nesta modalidade, a utilidade de um agente tensoativo é avaliada e selecionada em casos onde agregação durante a etapa de liofilização ou durante reconstituição se toma um problema. Um agente tamponante apropriado é incluído para manter a formulação em zonas estáveis de pH durante a fabricação (por exemplo, diluição, filtração estéril, carga, etc) e depois da reconstituição do produto liofilizado. Uma comparação dos componentes excipientes contemplada para formulações de proteína líquidas e liofilizadas é fornecida na seguinte tabela:

Componentes excipiente de formulações de proteína liofilizada

O principal desafio no desenvolvimento das formulações para proteínas é estabilizar o produto contra o estresse de fabricação, envio e armazenamento. O papel dos excipientes de formulação é fornecer estabilização contra estes estresses. Excipientes também são empregados para reduzir a viscosidade de formulações de proteína de alta concentração de maneira a possibilitar sua distribuição e melhorar a conveniência para o paciente. No geral, estabilizantes podem ser classificados com base nos mecanismos pelos quais eles estabilizam proteínas contra vários estresses químicos e físicos. Alguns estabilizantes são usados para aliviar os efeitos de um estresse específico ou regular uma suscetibilidade particular de uma proteína específica. Outros estabilizantes têm afeitos mais gerais nas estabilidades físicas e covalentes das proteínas. Os estabilizantes descritos aqui são organizados tanto por seu tipo químico quanto seu papel funcional nas formulações. Descrições resumidas dos modos de estabilização são fornecidas na discussão de cada tipo de estabilizante.

Dados os preceitos e guias aqui fornecidos, versados na tecnologia saberão que a quantidade ou faixa de excipiente pode ser incluída em qualquer formulação particular para alcançar uma formulação biofarmacêutica da descrição que é provável de promover retenção na estabilidade do produto biofarmacêutico (por exemplo, uma proteína).

Certamente, um versado na tecnologia perceberá que as concentrações dos excipientes aqui descritas compartilham uma interdependência em uma formulação particular. A título de exemplo, a concentração de um agente de massa é, em um aspecto, menor onde, por exemplo, há uma alta concentração de proteína ou onde, por exemplo, há uma alta concentração de agente estabilizante. Além do mais, um versado na tecnologia perceberá que, de maneira a manter a isotonicidade de uma formulação particular em que não há agente de massa, a concentração de um agente estabilizante pode ser aumentada desta forma (isto é, uma quantidade “tonicificante” de estabilizante pode ser usada). Excipientes comuns são conhecidos na tecnologia e podem ser encontrados em Powell et al., Compendium of Excipientes fir Parenteral Formulations (1998), PDA J. Pharm. Sci. Technology, 52:238-311.

Tampões e agentes tamponantes

A estabilidade de uma formulação de proteína farmacologicamente ativa é normalmente observada como máxima em uma faixa estreita de pH. Esta faixa de pH e estabilidade ideal precisa ser identificada precocemente durante os estudos de pré-formulação. Várias abordagens, tais como estudos de estabilidade acelerada e estudos de seleção calorimétrica, são usadas neste esforço (Remmele R.L. Jr., et al., Biochemistry, 38(16): 5241-7 (1999)). Uma vez que uma formulação é finalizada, a proteína deve ser fabricada e mantida em toda sua meia-vida. Assim, agentes tamponantes são quase sempre empregados para controlar o pH na formulação.

A capacidade tampão das espécies tamponantes é máxima em um pH igual ao pKa e diminui à medida em que o pH aumenta ou diminui deste valor. Noventa porcento da capacidade tamponante existe em uma unidade de pEl de seu pKa. A capacidade tampão também aumenta proporcionalmente com o aumento da concentração de tampão.

Vários fatores precisam ser considerados na escolha de um tampão. Primeiro e principalmente, a espécie tampão e sua concentração precisam ser definidos com base no seu pKa e no pH da formulação desejado. Igualmente importante é garantir que o tampão seja compatível com a proteína e outros excipientes de formulação, e não catalise nenhuma reação de degradação. Um terceiro aspecto importante a ser considerado é a sensação de ardência e irritação que o tampão pode induzir na administração. Por exemplo, sabe-se que citrato causa sensação de ardência na injeção (Laursen T, et al., Basic Clin Pharmacol Toxicol., 98(2): 218-21 (2006)). O potencial para sensação de ardência e irritação é maior para drogas que são administrados por meio das vias subcutâneas (SC) ou intramuscular (IM), onde a solução da droga permanece no sítio por um período de tempo relativamente maior que quando administrado pela via IV onde a formulação é diluída rapidamente no sangue mediante administração. Para formulações que são administradas por infusão IV direta, a quantidade total de tampão (e qualquer outro componente da formulação) precisa ser monitorada. E preciso ser particularmente cuidadoso sobre íons potássio administrados na forma do tampão de fosfato de potássio, que pode induzir efeitos cardiovasculares em um paciente (Hollander-Rodriguez JC, et al., Am. F am. Physician., 73(2): 283-90 (2006)).

Tampões para formulações liofilizadas precisam consideração adicional. Alguns tampões como fosfato de sódio podem cristalizar da fase amorfa da proteína durante congelamento resultante em deslocamentos do pH. Outros tampões comuns, tais como acetato e imidazol podem sublimar ou evaporar durante o processo de liofilização, deslocando assim o pH da formulação durante liofilização ou depois da reconstituição.

Em uma modalidade, o sistema tampão presente nas composições é selecionado para ser fisiologicamente compatível e para manter um pH desejado da formulação farmacêutica. Em uma outra modalidade, o pH da solução é entre pH 2,0 e pH 12,0. Por exemplo, em várias modalidades o pH da solução pode ser 2,0, 2,3, 2,5, 2,7, 3,0, 3,3, 3,5, 3,7, 4,0, 4,3, 4,5, 4,7, 5,0, 5,3, 5,5, 5,7, 6,0, 6,3, 6,5, 6,7, 7,0, 7,3, 7,5, 7,7, 8,0, 8,3, 8,5, 8,7, 9,0, 9,3, 9,5, 9,7, 10,0, 10,3, 10,5, 10,7, 11,0, 11,3, 11,5, 11,7, ou 12,0.

O composto que tampona pH pode estar presente em qualquer quantidade adequada para manter o pH da formulação em um nível predeterminado. Quando níveis apropriadamente baixos de tampão são usados, cristalização e deslocamento do pH podem ser evitados. Em uma modalidade, a concentração que tampona o pH é entre 0,1 mM e 500 mM (1 M). Por exemplo, se for contemplado que o agente de tamponamento de pH é pelo menos 0,1, 0,5, 0,7, 0,8 0,9, 1,0, 1,2, 1,5, 1,7, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, ou 500 mM.

Agentes tamponantes do pH exemplares usados para tamponar a formulação da forma apresentada aqui incluem, mas sem limitações, ácidos orgânicos, glicina, histidina, glutamato, succinato, fosfato, acetato, citrato, Tris, HEPES, e aminoácidos ou misturas de aminoácidos, incluindo, mas sem limitações aspartato, histidina, e glicina. Em uma modalidade da presente descrição, o agente tamponante é histidina.

Estabilizantes e agentes de massa

Em uma modalidade das presentes formulações farmacêuticas, um estabilizante (ou uma combinação de estabilizantes) é adicionado para prevenir ou reduzir agregação induzida por armazenamento e degradação química. Uma solução de névoa ou turva mediante reconstituição normalmente indica que a proteína precipitou ou pelo menos agregou. O termo “estabilizante” significa um excipiente capaz de prevenir agregação, ou degradação química (por exemplo, autólise, desaminação, oxidação, etc.). Em certas modalidades, estabilizantes contemplados incluem, mas sem limitações, sacarose, trealose, manose, maltose, lactose, glicose, rafinose, celobiose, gentiobiose, isomaltose, arabinose, glucosamina, frutose, manitol, sorbitol, glicina, arginina HC1, compostos poli-hidróxi, incluindo polissacarídeos, tais como dextrana, amido, amido hidroxietila, ciclodextrinas, N-metil pirolideno, celulose e ácido hialurônico, cloreto de sódio, cloreto de cálcio [Carpenter et al., Develop. Biol. Standard 74:225, (1991)]. Em uma modalidade da descrição, trealose é usada como um agente estabilizante. Em uma outra modalidade da descrição, sacarose é usada como um agente estabilizante. Nas presentes formulações, o estabilizante é incorporado, em certas modalidades, em uma concentração de cerca de 0,1, 0,5, 0,7, 0,8 0,9, 1,0, 1,2, 1,5, 1,7, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 500, 700, 900, ou 1000 mM. Da mesma maneira, em certas modalidades da descrição, o estabilizante é incorporado em uma concentração de cerca de 0,005, 0,01, 0,02, 0,03, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,5, 0,7, 0,8 0,9, 1,0, 1,2, 1,5, 1,7, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ou 20 % p/v.

Se desejado, as formulações também incluem quantidades apropriadas de agentes que regulam o volume e osmolaridade. Em várias modalidades da descrição, agentes de massa incluem, por exemplo e sem limitação, manitol, glicina, sacarose, polímeros, tais como dextrana, polivinilpirrolidona, carboximetilcelulose, lactose, sorbitol, trealose, ou xilitol. Em uma modalidade, o agente de massa é manitol. O agente de massa é incorporado, em várias modalidades da descrição, em uma concentração de cerca de 0,1, 0,5, 0,7, 0,8 0,9, 1,0, 1,2, 1,5, 1,7, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 500, 700, 900, ou 1000 mM.

Agentes tensoativos

Proteínas têm uma alta propensidade para interagir com superfícies que as tomam suscetíveis a adsorção e desnaturação em interfaces ar-líquido, frasco-líquido, e líquido-líquido (óleo de silicone). Este caminho de degradação foi observado como inversamente dependente da concentração de proteína e resulta tanto na formação de agregados de proteína solúveis e insolúveis ou na perda de proteína da solução por meio de adsorção nas superfícies. Além da adsorção na superfície do recipiente, degradação induzida pela superfície é exacerbada com agitação física, conforme pode ser experimentado durante transporte e manuseio do produto.

Agentes tensoativos são comumente usados em formulações de proteína para prevenir degradação induzida por superfície. Agentes tensoativos são moléculas anfipáticas com a capacidade de proteínas de competir por posições interfaciais (e/ou promover a redobra apropriada de uma molécula de proteína estruturalmente alterada). Porções hidrofóbicas das moléculas de agente tensoativo ocupam posições interfaciais (por exemplo, ar/líquido), enquanto que porções hidrofílicas das moléculas permanecem orientadas no sentido do solvente de massa. Em concentrações suficientes (tipicamente em tomo da concentração micelar crítica do detergente), uma camada da superfície das moléculas de agente tensoativo serve para evitar que as moléculas da proteína adsorvam na interface. Desta forma, degradação induzida pela superfície é minimizada. Agentes tensoativos contemplados aqui incluem, sem limitação, ésteres de ácido graxo de polietoxilados de sorbitano, isto é, polissorbato 20 e polissorbato 80. Os dois diferem somente no comprimento da cadeia alifática que confere caráter hidrofóbico às moléculas, C- 12 e C- 18, respectivamente. Desta maneira, polissorbato- 80 é mais ativo de superfície e tem uma menor concentração micelar crítica que polissorbato-20.

Detergentes também podem afetar a estabilidade conformacional termodinâmica das proteínas. Agentes tensoativos não iônicos são, no geral, usados na estabilização de proteína. Agentes tensoativos iônicos (detergentes) normalmente desestabilizam proteínas. Aqui, novamente, os efeitos de um dado excipiente do detergente serão específicos da proteína. Por exemplo, polissorbatos mostraram reduzir a estabilidade de algumas proteínas e aumentar a estabilidade de outras. Desestabilização de detergente de proteínas pode ser racionalizada em termos das caudas hidrofóbicas das moléculas de detergente que podem comprometer-se em ligações específicas com estados de proteína parcial ou completamente não dobradas. Estes tipos de interações podem causar deslocamento no equilíbrio conformacional no sentido de estados de proteína mais expandidos (isto é, aumentando a exposição das porções hidrofóbicas da molécula de proteína em complemento ao polissorbato de ligação). Altemativamente, se o estado nativo da proteína apresentar algumas superfícies hidrofóbicas, a ligação do detergente ao estado nativo pode estabilizar a conformação.

Um outro aspecto dos polissorbatos é que eles são inerentemente suscetíveis à degradação oxidativa. Frequentemente, como matérias-prima, eles contêm quantidades suficientes de peróxidos para causar oxidação das cadeias laterais de resíduo de proteína, especialmente metionina. O potencial para dano oxidativo que surge da adição de estabilizante enfatiza o ponto que as menores concentrações efetivas de excipientes devem ser usadas nas formulações. Para agentes tensoativos, a concentração efetiva para uma dada proteína dependerá do mecanismo de estabilização.

Agentes tensoativos também são adicionados em quantidades apropriadas para prevenir o fenômeno de agregação relacionada à superfície durante congelamento e secagem [Chang, B, J. Pharm. Sci. 85:1325, (1996)]. Assim, agentes tensoativos exemplares incluem, sem limitação, agentes tensoativos aniônicos, catiônicos, não iônicos, zwiteriônicos e anfóteros incluindo derivados de agentes tensoativos que ocorre naturalmente de aminoácidos. Agentes tensoativos iônicos incluem, mas sem limitações, lauril sulfato de sódio, dioctil sulfossuccinato de sódio e dioctil sulfonato de sódio, ácido quenodeoxicólico, sal de sódio de N-lauroilsarcosina, dodecil sulfato de lítio, sal de sódio do ácido 1-octanossulfônico, colato de sódio hidratado, deoxicolato de sódio e sal de sódio do ácido glicodeoxicólico. Agentes tensoativos catiônicos incluem, mas sem limitações, cloreto de benzalcônio ou cloreto de benzetônio, cloreto de cetilpiridínio monoidratado, e brometo de hexadeciltrimetilamônio. Agentes tensoativos zwiteriônicos incluem, mas sem limitações, CHAPS, CHAPSO, SB3-10, e SB3-12, Agentes tensoativos não iônicos incluem, mas sem limitações, digitonina, Triton X-100, Triton X-114, TWEEN-20, e TWEEN-80. Agentes tensoativos também incluem, mas sem limitações, lauromacrogol 400, estearato de polioxil 40, óleo de rícino hidrogenado de polioxietileno 10, 40, 50 e 60, monoestearato de glicerol, polissorbato 40, 60, 65 e 80, lecitina de soja e outros fosfolipídeos, tais como dioleil fosfatidil colina (DOPC), dimiristoilfosfatidil glicerol (DMPG), dimiristoilfosfatidil colina (DMPC), e (dioleil fosfatidil glicerol) DOPG; éster de ácido graxo de sacarose, metil celulose e carboximetil celulose. Composições compreendendo estes agentes tensoativos, tanto individualmente quanto como uma mistura em diferentes razões são, desta forma, ainda fornecidas. Em uma modalidade da presente descrição, o agente tensoativo é TWEEN-80. Nas presentes formulações, o agente tensoativo é incorporado em uma concentração de cerca de 0,01 a cerca de 0,5 g/L. Em formulações fornecidas, em várias modalidades, o agente tensoativo concentração é 0,005, 0,01, 0,02, 0,03, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 ou 1,0 g/L. Desta maneira, em certas modalidades da descrição, o agente tensoativo é incorporado em uma concentração de cerca de 0,001, 0,002, 0,003, 0,004, 0,005, 0,01, 0,02, 0,03, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,5, 0,7, 0,8 0,9, ou 1,0 % p/v.

Sais

Sais são frequentemente adicionados para aumentar a força iônica da formulação, que pode ser importante para a solubilidade, estabilidade física, e isotonicidade da proteína. Sais podem afetar a estabilidade física das proteínas de uma variedade de maneiras. íons podem estabilizar o estado nativo das proteínas ligando a resíduos carregados na superfície da proteína. Altemativamente, sais podem estabilizar o estado desnaturado ligando-se aos grupos de peptídeo alo longo da espinha dorsal da proteína (-CONH-). Sais também podem estabilizar a conformação nativa da proteína blindando interações eletrostáticas repulsivas entre resíduos em uma molécula de proteína. Sais nas formulações de proteína também podem blindar interações eletrostáticas atrativas entre moléculas de proteína que podem levar a agregação e insolubilidade da proteína. Sais (isto é, eletrólitos) no geral significativamente diminuem a Tg', tomando assim mais difícil, e algumas vezes impossível, secar por congelamento a formulação. Por esta razão, somente sal suficiente para manter a estabilidade estrutural da proteína deve ser incluído na formulação, e normalmente este nível de eletrólito é muito baixo.

Em certas modalidades, a concentração de sal das formulações é entre 0,0 (isto é, nenhum sal), 0,001, 0,002, 0,003, 0,004, 0,005, 0,006, 0,007, 0,008, 0,009, 0,010, 0,011, 0,012, 0,013, 0,014, 0,015, 0,020, 0,050, 0,080, 0,1, 1, 10, 20, 30, 40, 50, 80, 100, 120, 150, 200, 300, e 500 mM. Em uma modalidade da descrição, 0,0 mM de NaCl (isto é, nenhum NaCl) é incluído na formulação. Um versado na tecnologia perceberá que enquanto NaCl é omitido ou removido de acordo com várias modalidades da presente descrição, quantidades traço de NaCl podem estar presentes (isto é, devido às limitações da remoção de NaCl por meio de procedimentos de diálise ou cromatografia). Assim, em várias modalidades, “excluir NaCl” significa que NaCl nunca foi adicionado à formulação, e “quantidade traço de NaCl” significa que NaCl foi removido da formulação (por exemplo, até o ponto possível por diálise, cromatografia por troca de solvente, e similares).

Outros componentes excipientes comuns Aminoácidos

Observou-se que aminoácidos têm uso versátil em formulações de proteína como tampões, agentes de massa, estabilizantes e antioxidantes. Assim, em um aspecto, histidina e ácido glutâmico são empregados para tamponar formulações de proteína na faixa de pH de 5,5 - 6,5 e 4,0 - 5,5 respectivamente. O grupo imidazol da histidina tem um pKa = 6,0 e o grupo carboxila da cadeia lateral de ácido glutâmico tem um pKa de 4,3 que toma estes aminoácidos adequados para tamponamento em suas respectivas faixas de pH. Acido glutâmico é particularmente usado em tais casos. Histidina é comumente encontrada em formulações de proteína comercializadas, e este aminoácido fornece uma alternativa para o citrato, um tampão conhecido por arder na injeção. De maneira interessante, histidina também foi reportada como tendo um efeito estabilizante, com relação à agregação quando usada em altas concentrações tanto em apresentações líquidas quanto liofilizadas (Chen B, et al., Pharm Res., 20(12): 1952-60 (2003)). Histidina também foi observada por outros para reduzir a viscosidade de uma formulação de alta concentração de proteína. Entretanto, no mesmo estudo, os autores observaram maior agregação e descoloração nas formulações contendo histidina durante estudos de congelamento-descongelamento do anticorpo em recipientes de aço inoxidável.

Uma outra nota de atenção com histidina é que ela se submete a fotoxidação na presença de íons metálicos (Tomita M, et al., Biochemistry, 8(12): 5149-60 (1969)). O uso de metionina como um antioxidante em formulações parece promissor; ela tem sido observada como sendo efetiva contra inúmeros estresses oxidativos (Lam XM, et al., /Pharm Sei., 86(11): 1250-5 (1997)).

Em vários aspectos são fornecidas formulações que incluem um ou mais dos aminoácidos glicina, prolina, serina, arginina e alanina mostraram estabilizar proteínas pelo mecanismo de exclusão preferencial. Glicina também é um comumente usada como agente de massa em formulações liofilizadas. Arginina mostrou ser um agente efetivo na inibição da agregação e foi usada em formulações tanto líquidas quanto liofilizadas.

Nas formulações fornecidas, a concentração de aminoácido é entre 0,1, 1, 10, 20, 30, 40, 50, 80, 100, 120, 150, 200, 300, e 500 mM. Em uma modalidade da presente descrição, o aminoácido é glicina.

Antioxidantes

Oxidação de resíduos de proteína surge de inúmeras fontes diferentes. Além da adição de antioxidantes específicos, a prevenção de dano de proteína oxidativa envolve o controle cuidadoso de inúmeros fatores em todo o processo de fabricação e armazenamento do produto, tais como oxigênio atmosférico, temperatura, exposição à luz, e contaminação química. A descrição, desta forma, contempla o uso dos antioxidantes farmacêuticos incluindo, sem limitação, agentes de redução, retiradores de oxigênio/radical livre, ou agentes quelantes. Antioxidantes em formulações de proteína terapêuticas são, em um aspecto, solúveis em água e permanecem ativos em toda a meia-vida do produto. Agentes de redução e retiradores de oxigênio/radical livre funcional separando espécies de oxigênio ativo em solução. Agentes quelantes, tais como EDTA são efetivos ligando contaminantes de metal traço que promovem formação de radical livre. Por exemplo, EDTA foi utilizado na formulação líquida do fator de crescimento de fibroblasto ácido para inibir a oxidação catalisada por íon metálico de resíduos de cisteína. Em uma modalidade da descrição, glutationa está incluída na formulação. Em várias modalidades das formulações aqui fornecidas, a concentração de antioxidante é 0,005, 0,01, 0,02, 0,03, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 ou 1,0 mg/mL.

Além da efetividade de vários excipientes para prevenir a oxidação da proteína, o potencial dos antioxidantes em si de induzir outras mudanças covalentes ou físicas na proteína é de interesse. Por exemplo, agentes de redução podem causar rompimento das ligações de dissulfito intramoleculares, que podem levar a rearranjo de dissulfito. Na presença de íons de metal de transição, ácido ascórbico e EDTA mostraram promover oxidação da metionina em inúmeras proteínas e peptídeos (Akers MJ, e Defelippis MR. Peptides and Proteins as Parenteral Solutions. In: Pharmaceuthical Formulation Development of Peptides and Proteins. Sven Frokjaer, Lars Hovgaard, editors. Pharmaceutical Science. Taylor and Francis, UK (1999)); Fransson J.R., /. Pharm. Sci. 86(9): 4046-1050 (1997); Yin J, et al., Pharm Res., 21(12): 2377-83 (2004)). Tiossulfato de sódio foi reportado por reduzir os níveis de oxidação de metionina induzida por luz e temperatura em rhuMab HER2; entretanto, a formação de um aduto tiossulfato-proteína também foi reportada neste estudo (Lam XM, Yang JY, et al., J Pharm Sci. 86(11): 1250-5 (1997)). Seleção de um antioxidante apropriado é feita de acordo com os estresses específicos e sensibilidade da proteína. Antioxidantes contemplados em certos aspectos incluem, sem limitação, agentes de redução e retiradores de oxigênio/radical livre, agentes complexantes de metal, tais como EDTA, e tiossulfato de sódio.

Ions metálicos

No geral, íons de metal de transição são indesejados em formulações de proteína em virtude de eles poderem catalisar reações químicas físicas e de degradação em proteínas. Entretanto, íons metálicos específicos estão incluídos nas formulações quando eles são co-fatores para proteínas e em formulações de suspensão de proteínas onde eles formam complexos de coordenação (por exemplo, suspensão de zinco de insulina). Recentemente, o uso de íons de magnésio (10-120 mM) foi proposto por inibir a isomerização de ácido aspártico a ácido isoaspártico (WO 2004039337).

Dois exemplos onde íons metálicos conferem estabilidade ou maior atividade em proteínas são deoxirribonuclease humana (rhDNase, Pulmozyme®), e FVIII. No caso de rhDNase, íons Ca+2 (até 100 mM) aumentaram a estabilidade da enzima por meio de um sítio de ligação específico (Chen B, et ah, J P harm ScL, 88(4): 477-82 (1999)). De fato, a remoção de íons de cálcio da solução com EDTA causou um aumento na desaminação e agregação. Entretanto, este efeito foi observado somente com íons Ca ; outros cátions di vai entes Mg , Mn e Zn foram observados por desestabilizar rhDNase. Efeitos similares foram observados em FVIII. Ions Ca e Sr e _1_O —UO I estabilizaram a proteína, enquanto que outros como Mg , Mn e Zn , Cu e Fe desestabilizaram a enzima (Fatothers, A., et al., Int. J. Pharm., 155, 121-131 (1997). Em um estudo separado com FVIII, um aumento significativo na taxa de agregação foi observado na presença de ions Al+3 (Derrick TS, et al., /. Pharm. ScL, 93(10): 2549-57 (2004)).

Conservantes

Conservantes são necessários no desenvolvimento de formulações parenterais de múltiplos usos que envolvem mais que uma extração do mesmo recipiente. Sua função primária é inibir o crescimento microbiano e garantir a estabilidade do produto em toda meia-vida ou termo de uso do produto de droga. Conservantes comumente usados incluem, sem limitação, álcool benzílico, fenol e m-cresol. Embora conservantes tenham uma longa história de uso, o desenvolvimento das formulações de proteína que inclui conservantes pode ser desafiador. Conservantes quase sempre têm um efeito desestabilizante (agregação) nas proteínas, e isto se tomou um fator principal na limitação de seu uso em formulações de proteína de múltiplas dosagem (Roy S, et al., J Pharm ScL, 94(2): 382-96 (2005)). Na prática, conservantes devem ser incluídos na formulação diluente e não incluídos na formulação a ser seca por congelamento.

Atualmente, a maioria das drogas de proteína foi formulada para único uso somente. Entretanto, quando formulações de múltiplas dosagem são possíveis, elas têm a vantagem de possibilitar a conveniência do paciente e maior comerciabilidade. Um bom exemplo é o de hormônio de crescimento humano (hGH) onde o desenvolvimento de formulações conservadas levou à comercialização de canetas de injeção de múltiplos usos mais convenientes. Pelo menos quatro tais dispositivos de caneta contendo formulações conservadas de hGH são atualmente disponíveis no mercado. Norditropin® (líquido, Novo Nordisk), Nutropin AQ® (líquido, Genentech) & Genotropin (liofilizado - cartucho de câmara dupla, Pharmacia & Upjohn) contêm fenol, enquanto que Somatrope® (Eli Lilly) é formulado com m-cresol.

Vários aspectos precisam ser considerados durante o desenvolvimento da formulação de formas de dosagem conservadas. A concentração de conservante efetiva no produto de droga deve ser otimizada. Isto requer teste de um dado conservante na forma de dosagem com faixas de concentração que conferem efetividade antimicrobiana sem comprometer a estabilidade da proteína. Por exemplo, três conservantes foram selecionados com êxito no desenvolvimento de uma formulação líquida para o receptor de interleucina-1 (tipo I), usando calorimetria por varredura diferencial (DSC). Os conservantes foram classificados com base no seu impacto na estabilidade em concentrações comumente usadas em produtos comercializados (Remmele RL Jr, et al, Pharm Res, 15(2): 200-8 (1998)).

O desenvolvimento de formulações líquidas contendo conservantes é mais desafiador que formulações liofilizadas. Produtos secos por congelamento podem ser liofilizados sem o conservante e reconstituídos com um diluente contendo conservante no tempo de uso. Isto encurta o tempo no qual um conservante está em contato com a proteína significativamente minimizando os riscos de estabilidade associados. Com formulações líquidas, a efetividade e estabilidade do conservante tem que ser mantida em toda meia- vida do produto (-18 -24 meses). Um ponto importante para notar é que a efetividade do conservante foi demonstrada na formulação final contendo a droga ativa e todos componentes excipientes.

Alguns conservantes podem causar reações indesejadas de injeção, que é um outro fator que precisa consideração na escolha de um conservante. Em experimentos clínicos que focaram na avaliação de conservantes e tampões em Norditropin, a percepção da dor foi observada como menor em formulações contendo fenol e álcool benzílico quando comparada a uma formulação contendo m-cresol (Kappelgaard A.M., Horm Res. 62 Suppl 3:98-103 (2004)). De maneira interessante, entre o conservante comumente usado, álcool benzílico possui propriedades anestésicas (Minogue SC, e Sun DA., Anesth Analg., 100(3): 683-6 (2005)). Em vários aspectos o uso de conservantes fornece um benefício que supera qualquer efeito colateral.

Métodos de preparação

A presente descrição anda contempla métodos para a preparação de formulações farmacêuticas.

Os presentes métodos compreendem uma ou mais das seguintes etapas: adicionar um agente estabilizante da forma aqui descrita à dita mistura antes da liofilização, adicionar pelo menos um agente selecionado de um agente de massa, um agente que regula a osmolalidade, e um agente tensoativo, cada um dos quais da forma aqui descrita, à dita mistura antes da liofilização.

A prática de reconstituição padrão para material liofilizado é adicionar novamente um volume de água pura ou água estéril para injeção (WFI) (tipicamente, mas não necessariamente, equivalente ao volume removido durante a liofilização), embora soluções diluídas de agentes antibacterianos sejam algumas vezes usadas na produção de produtos farmacêuticos para administração parenteral [Chen, Drug Development and Industrial Pharmacy, 18:1311-1354 (1992)]. Desta maneira são fornecidos métodos para a preparação de composições reconstituídas de FVIII compreendendo a etapa de adicionar um diluente a uma composição liofilizada de FVIII da descrição.

O material liofilizado pode ser reconstituído como uma solução aquosa. Uma variedade de carreadores aquosos, por exemplo, água estéril para injeção, água com conservantes para uso de múltiplas dosagens, ou água com quantidades apropriadas de agentes tensoativos (p°r exemplo, uma suspensão aquosa que contém o composto ativo em mistura com excipientes adequados para a fabricação de suspensões aquosas). Em vários aspectos, tais excipientes são agentes de suspensão, por exemplo, e sem limitação, carboximetilcelulose de sódio, metilcelulose, hidroxipropilmetilcelulose, alginato de sódio, polivinilpirrolidona, goma tragacanto e goma acácia; agentes dispersantes ou umectantes são um fosfatídeo que ocorre naturalmente, por exemplo e sem limitação, lecitina, ou produtos de condensação de um óxido de alquileno com ácidos graxos, por exemplo e sem limitação, estearato de polioxietileno, ou produtos de condensação de óxido de etileno com alcoóis alifáticos de cadeia longa, por exemplo e sem limitação, heptadecaetil-eneoxicetanol, ou produtos de condensação de óxido de etileno com ésteres parciais derivados de ácidos graxos e um hexitol, tais como sorbitol monooleato de polioxietileno, ou produtos de condensação de óxido de etileno com ésteres parciais derivados de ácidos graxos e anidridos de hexitol, por exemplo e sem limitação, sorbitano monooleato de polietileno. Em vários aspectos, as suspensões aquosas também contêm um ou mais conservantes, por exemplo e sem limitação, etil, ou n-propil, p- hidroxibenzoato.

Administração

Para administrar composições a animais humanos ou de teste, em um aspecto, as composições compreendem um ou mais carreadores farmaceuticamente aceitáveis. As frases “farmaceuticamente” ou “farmacologicamente” aceitável referem-se a entidades moleculares e composições que são estáveis, inibem a degradação da proteína, tais como agregação e produtos de clivagem, e além disso não produzem reações alérgicas ou outras adversas quando administrados usando vias bem conhecidas na tecnologia, da forma descrita a seguir. “Carreadores farmaceuticamente aceitáveis” incluem qualquer um e todos os solventes clinicamente usados, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos ou antifungicos, agentes isotônicos e que atrasam a absorção e similares, incluindo os agentes descritos anteriormente.

As formulações farmacêuticas são administradas oralmente, topicamente, transdermicamente, parenteralmente, por jato de inalação, vaginalmente, retalmente, ou por injeção intracraniana. O termo parenteral da forma aqui usada inclui injeções subcutâneas, intravenosa, intramuscular, injeção intracistemal, ou técnicas de infusão. Administração por injeção intravenosa, intradérmica, intramusclar, intramamária, intraperitoneal, intratecal, retrobulbar, intrapulmonar e ou implante cirúrgico em um sítio particular é igualmente contemplado. No geral, composições são essencialmente sem pirogênios, bem como outras impurezas que podem ser nocivas ao receptor.

Administrações únicas ou múltiplas das composições são realizadas com os níveis e padrão de dosagem sendo selecionados pelo médico do tratamento. Para a prevenção ou tratamento da doença, a dosagem apropriada depende do tipo de doença a ser tratada, da forma definida anteriormente, da severidade e curso da doença, seja a droga administrada para propósitos preventivos ou terapêuticos, da terapia prévia, da história clínica do paciente e da resposta à droga e da decisão do médico.

Kits

Como um aspecto adicional, a descrição inclui kits que compreendem uma ou mais composições liofilizadas empacotadas de uma maneira que facilita seu uso para administração aos sujeitos. Em uma modalidade, um kit como este inclui a formulação farmacêutica aqui descrita (por exemplo, uma composição compreendendo uma proteína ou peptídeo terapêutico), empacotada em um recipiente, tais como uma garrafa ou vaso selado, com uma marca afixada ao recipiente ou incluída na embalagem que descreve o uso do composto ou composição na prática do método. Em uma modalidade, a formulação farmacêutica é empacotada no recipiente de maneira tal que a quantidade de espaço no topo no recipiente (p°r exemplo, a quantidade de ar entre a formulação líquida e o topo do recipiente) seja muito pequeno. Preferivelmente, a quantidade de espaço de topo é desprezível (isto é, quase nenhuma). Em uma modalidade, o kit contém um primeiro recipiente tendo uma composição de proteína ou peptídeo terapêutico e um segundo recipiente tendo uma solução de reconstituição fisiologicamente aceitável para a composição. Em um aspecto, a formulação farmacêutica é empacotada em uma forma de dosagem unitária. O kit pode ainda incluir um dispositivo adequado para administrar a formulação farmacêutica de acordo com uma via específica de administração. Preferivelmente, o kit contém uma marca que descreve o uso das formulações farmacêuticas.

Dosagens

O regime de dosagem envolvido em um método para tratar uma condição aqui descrita será determinado pelo médico, considerando vários fatores que modificam a ação de drogas, por exemplo, a idade, condição, peso corporal, sexo e dieta do paciente, da severidade de qualquer infecção, tempo de administração e outros fatores clínicos. A título de exemplo, uma dosagem típica de um FVIII recombinante da presente descrição é aproximadamente 30 IU/kg a 50 IU/kg.

Em um aspecto, formulações da descrição são administradas por um bolo inicial seguido por uma infusão contínua para manter níveis de circulação terapêuticos de produto de droga. Como um outro exemplo, o composto inventivo é administrado como uma dosagem única. Os versados na tecnologia prontamente otimizarão regimes de dosagem e administração efetivos determinados por boas práticas médicas e a condição clínica do paciente individual. A frequência de dosagem depende dos parâmetros farmacocinéticos dos agentes e a via de administração. A formulação farmacêutica ideal é determinada por um versado na tecnologia dependendo da via de administração e dosagem desejada. Ver, por exemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a Ed. (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042) páginas 1435-1712, cuja descrição está aqui incorporada pela referência. Tais formulações influenciam no estado físico, estabilidade, taxa de liberação in vivo, e taxa de depuração in vivo dos agentes administrados. Dependendo da via de administração, uma dosagem adequada é calculada de acordo com peso corporal, área de superfície corporal ou tamanho do órgão. Dosagens apropriadas podem ser determinadas pelo uso de ensaios estabelecidos para determinar dosagens em nível sanguíneo em conjunto com dados dosagem- resposta apropriados. O regime de dosagem final é determinado pelo médico, considerando vários fatores que modificam a ação de drogas, por exemplo, a atividade específica da droga, a severidade do dano e a resposta do paciente, a idade, condição, peso corporal, sexo e dieta do paciente, a severidade de qualquer infecção, tempo de administração e outros fatores clínicos. A medida em que estudos são conduzidos, informação adicional aparecerá com relação aos níveis de dosagem apropriados e duração do tratamento de várias doenças e condições.

Os seguintes exemplos não devem ser limitante, mas somente exemplares das modalidades específicas da descrição.

Exemplo 1 Materiais e Métodos Materiais

Os excipientes usados são grau de reagente analítico. D-manitol, trealose, rafínose, sorbitol e sacarose foram comprados da Pfanstiehl Lab. Inc. Glicina foi obtida de Chattem Chemicals. M-amido hidroxietila, arginina, e alanina foram obtidos de Ajinomoto Co., Inc. Cloreto de sódio, cloreto de cálcio e Tris base foram obtidos de Mallinckrodt Inc. Hepes, L-histidina e Polissorbato-80 foram obtidos de E. M. Science, Tanabe, Co. Inc. e Spectrum Int. Inc., respectivamente. Glutationa reduzida foi obtida da Sigma.

Formulação Preparação

As formulações descritas aqui foram preparadas usando substância de droga de massa (BDS), fornecida por Baxter Healthcare Ltd. O BDS foi composto de 3130 IU/mL de rAHF (isto é, rFVIII); 50 mM de Tris base, 0,4 M de NaCl, 0,1 % de polissorbato-80 (agente tensoativo), 4 mM de CaCl2, pH 7. O CaCl2 e agente tensoativo estão presentes para estabilizar conformação nativa e reduzir perdas de processamento, respectivamente, e pH 7 foi selecionado para estabilidade ideal em solução, embora outros pH's também possam fornecer estabilidade ideal. O BDS foi diluído por água destilada e misturado com vários excipientes para preparar uma série de soluções de formulação e neutralizado a pH 7. Antes da carga em frasco, a proteína contendo soluções de formulação foram filtradas usando 0,22 μ de tamanho de poro obtido da Millipore antes da carga (5 mL) em 30 cc, 20 mm de frascos de tubo tipo I acabados. Os frascos e tampas (Flurotec) foram comprados da Daikyo Seiko.

Secagem por congelamento

Secagem por congelamento foi conduzida em um secador por congelamento Dura-Stop/Dura-Dry ou um LyoStar (FTS). Ambos os secadores por congelamento têm 3 hastes móveis, com área total de 4,0 e 4,6 pés quadrados, respectivamente. Pressão da câmara foi medida usando manómetro de capacitância diferencial (MKS). O produto e temperaturas foram medidos por meio de termopares de liga de cobre e níquel de calibre 30 colocados no centro da base nos frascos, amostrando a temperatura tanto da borda quanto do interior do frasco. Detalhes dos diferentes processos usados são dados nas seções de resultados e discussão apropriados.

Ensaio de potência

O ensaio foi realizado usando um instrumento COAG-A-MATE (Organon Teknika Corp., Durham, NC). A atividade de FVIII foi determinada pelo ensaio de tempo de tromboplastina parcial ativado de um estágio (APTT), usando plasma deficiente em FVIII humano como um substrato e sílica micronizada como um ativador. A potência de FVIII foi determinada testando dois frascos separados por dois analistas diferentes, cada frasco sendo testado em duplicata. Assim, os dados de atividade reportados foram a média das quatro determinações de replicata. O valor médio foi comparado à amostra de valor de potência correspondente armazenada a -70°C e reportada como porcentagem de “-70 °C de controle”. O desvio padrão usual das determinações em replicata foi cerca de 5 %, significando que o erro padrão na média foi cerca de 2,5 %.

Ensaio do teor de água

Os teores de umidade nas tortas secas por congelamento foram determinados por Titulação de Karl Fischer colorimétrica, AF7LC (Fisher Scientific). As amostras secas por congelamento foram suspensas em 2 mL de metanol previamente seco e agitadas por cerca de 5 minutos para garantir que o metanol umidificou todo o pó no frasco e formou uma lama fina. Todos os 2 mL da lama foram rapidamente transferidos no titulador para minimizar a exposição da amostra na atmosfera. Usando o mesmo tipo de frascos e tampas inúmeras corridas em branco foram preparadas somente com metanol, seguindo o mesmo procedimento da forma descrita anteriormente. A quantidade de água nas amostras secas por congelamento foi calculada a partir da diferença dos valores de título da amostra e branco. Cada medição foi repetida três vezes usando três frascos diferentes. Teores de água reportados foram a média das três medições e foram precisos em +0,1 % ou melhor.

Análise térmica

Um TA Instruments Differential Scanning Calorimetry (DSC- 2920) foi usado para medir temperaturas de transição vítrea, Tg, de tortas secas por congelamento e medir a temperatura de transição vítrea do concentrado seco por congelamento em sistemas congelados, Tg' que é normalmente tomado para representar a temperatura ligeiramente menor que a temperatura de colapso, que é a temperatura máxima normalmente recomendada para secagem primária. O DSC foi operado em modo “modulado” em condições “aquecimento total” com uma amplitude de 0,796 °C, um período de 60 segundos, e uma taxa de varredura linear de 2 °C/min. Amostras secas foram manuseadas em uma sacola seca, que foi continuamente lavada com gás nitrogênio seco para manter umidade relativa menor que 2 %. Cerca de 5 - 10 mg de amostras secas por congelamento foram compactadas em discos ~ 3-4 mm de espessura antes da selagem nas panelas de alumínio. Para medições das soluções congeladas, cerca de 50 μL de solução foram transferidos na panela Al DSC e selados. Todas as medições de DSC foram realizadas em uma atmosfera de nitrogênio seco (50 μL/min.). Calibração da temperatura e energia foram feitos de acordo com procedimento padrão usando alta pureza de índio. Transições vítreas foram determinadas como ponto médio da transição dada pelo sinal reverso e são reprodutíveis em cerca de +0,5 °C.

Microscopia da secagem por congelamento

Medições da temperatura de colapso foram realizadas usando microscopia de secagem por congelamento. A amostra é colocada entre duas lâminas de vidro e congelada rapidamente a uma temperatura abaixo de -50 °C. A câmara contendo o amostra é evacuada para ~ 200 mTorr, e o processo de secagem por congelamento é observado por meio de um microscópio em temperaturas de amostra crescente. Secagem por congelamento com retenção da “estrutura da torta” na região seca é observada abaixo da temperatura de colapso. Em uma dada temperatura acima da temperatura de colapso, a perda da estrutura na região seca é observada. Temperaturas de colapso são reprodutíveis em+l°C.

Difração em pó por raios-X

Estudos de difração em pó por raios-X empregaram um Difractômetro em Pó com uma fonte de CuKa (À, = 1,5 4A) que opera em um tubo carregado de 40 kv e 40 mA. As amostras secas por congelamento foram suavemente moídas a um pó fino, aspergidas sobre o suporte de amostra e suavemente prensadas antes da carga. Todas as varreduras foram realizadas em condições ambientes de temperatura e umidade. As amostras foram varridas de 10° a 60° (2D) em uma taxa de varredura de 0,5° /minuto.

Exemplo 2

Uma vez que a variação no nível de NaCl, no geral, não é aceitável, particularmente em um produto comercial, e uma vez que a cristalização de um componente é, no geral, facilitada por maior concentração da do componente com relação aos outros componentes, decidiu-se adicionar NaCl para aumentar o nível para um valor acima do maior nível esperado no processo e suficientemente alto de maneira tal que a cristalização de NaCl durante a etapa de congelamento possa ser possível. Calorímetro por varredura diferencial modulada (MDSC) foi usado para estudar o congelamento de várias concentrações de cloreto de sódio em uma formulação que ainda continha 0,02 % (p/v) de Polissorbato-80, 10 mM de Tris, 4 mM de cloreto de cálcio, e 2 % (p/v) de sacarose. Para este experimento, 200 mM de cloreto de sódio foram usados. Outras concentrações podem ser usadas incluindo, mas sem limitações, as na faixa de 1 mM a 10000 mM, ou 10 mM a 1000 mM ou 100 mM a 500 mM, ou 150 mM a 300 mM para garantir que a completa cristalização do cloreto de sódio ocorreu durante o congelamento.

Em uma modalidade preferida, amostras contendo 200 mM de cloreto de sódio foram usadas, resultando em um valor (Tg') do sólido congelado (-39 °C) que aproximou o Tg' do sistema na ausência de cloreto de sódio (-36 °C), sugerindo que a maioria do cloreto de sódio cristalizou.

Temperaturas de colapso (p°r meio de microscopia de secagem por congelamento) foram em cerca de 1 °C do valor Tg'. Soluções contendo 150 mM ou menos de cloreto de sódio deram valores de Tg' menores que -50 °C, indicando a presença de cloreto de sódio não cristalizado (isto é, cloreto de sódio amorfo). Esta observação foi confirmada em estudos limitados de material seco por congelamento em frascos. Na liofilização, soluções contendo menos que 200 mM de cloreto de sódio apresentaram graus variados de colapso na estrutura da torta, conforme previsto pelos dados de Tg', mas em >200 mM de NaCl, colapso foi evitado e agente de massa cristalino e NaCl resultaram (difração em pó por raios-X).

Exemplo 3

O efeito que diferentes concentrações de rAHF têm na estabilidade de rAHF quando o rAHF é exposto ao estresse em diferentes estágios de secagem por congelamento foi examinado. Duas amostras contendo diferentes concentrações de rAHF, 600 e 60 IU/mL (correspondendo a 150 & 15 μg/mL) foram usadas sem nenhum estabilizante. A composição da formulação para estas amostras foi: 8 % de manitol (agente de massa), 10 mM de tampão Tris, 200 mM de NaCl, 4 mM CaCl2, 0,02 % de Polissorbato-80, pH 7,0. Uma terceira amostra usou uma formulação que empregou 2 % de sacarose como um estabilizante além destes componentes. O processo de secagem usado, descrito na tabela 1, produz temperaturas do produto de cerca de -42 °C, que é suficientemente baixa para evitar colapso na maioria das formulações; embora este processo não fosse otimizado. Tabela 1. Procedimento de congelamento e liofilização para estudos de estabilidade de rAHF preliminares.

O efeito da concentração da proteína na estabilidade em processo de rAHF foi avaliado coletando pequenas alíquotas de cada amostra em cada estágio do processo de secagem por congelamento (conforme descrito na tabela 1) e determinar a atividade de rAHF. Os resultados são sumarizados na tabela 2. Tabela 2. Estabilidade de rAHF durante o processamento e armazenamento do sólido seco por congelamento a 40 °C: Estudo de estabilidade preliminar. Detalhes do processamento da forma dada na tabela 1. Incerteza dada para constantes da taxa é erro padrão fornecido pela análise de regressão. Erro padrão nos dados de % de perda é cerca de 3 %. A constante da taxa, k, é definida pela expressão cinética “tempo de estiramento”, Atividade = (Atividade, - 70 °de controle) • exp(-fc • V t), onde tempo, t, é em meses.

As formulações (amostras B e C) contendo o menor nível de rAHF (60 IU/mL) perderam 35-39 % da potência de rAHF inicial durante o congelamento, enquanto que a formulação (amostra A) contendo o maior rAHF (600 IU/mL) perdeu somente cerca de 3 %. Note que a incerteza nos dados é cerca de 3 %; assim, perda da atividade durante congelamento da alta concentração foi desprezível. Durante o seguinte tratamento térmico e liofilização, a formulação contendo uma maior concentração de rAHF também teve uma menor perda da atividade que a formulação contendo uma menor concentração de rAHF e nenhuma sacarose. Estas observações sugerem que maiores concentrações de rAHF têm um efeito de auto-proteção. A perda da atividade durante a secagem foi significativa (18-24 %) e comparável para todas as formulações. A estabilidade durante o armazenamento foi ligeiramente melhor para a amostra de alta concentração (a) que para a amostra de baixa concentração (B), e muito melhor para a amostra de formulação contendo sacarose (C).

Exemplo 4

Amostras da formulação foram selecionadas para comportamento de estabilidade e secagem por congelamento para identificar formulações preferidas para rAHF. Em uma modalidade, as formulações envolveram várias combinações de agentes de massa (no geral 8 %) e estabilizantes (2 %), embora versados percebam que outras concentrações de agentes de massa e estabilizantes são similarmente adequadas. Nesta mesma modalidade, as formulações usando amido hidroxietila (HES) ou NaCl como agentes de massa usadas nas concentrações de 4 % e 2,3 %, respectivamente, embora novamente, o versado possa perceber que outras concentrações para estes excipientes são similarmente adequadas. Além do mais, todas as formulações incluíram os seguintes excipientes e condições: 220 mM de NaCl, 0,03 % (v/v) de polissorbato-80, 4 mM de CaCl2, 10 mM de tampão TRIS, e pH 7. O ciclo de secagem por congelamento usado nas combinações específicas de estabilizantes e agentes de massa descritos na tabela 3. Tabela 3. Ciclo de secagem por congelamento e formulações para estudos de seleção de estabilidade. Em cada caso o sistema tampão foi: 220 mM de NaCl, 0,03 % (v/v) de polissorbato- 80, 4 mM de CaCl2, 10 mM de tampão Tris, pH 7

Todas as formulações continham 100 IU/mL de rAHF na solução inicial. O menor nível de rAHF foi selecionado em virtude da instabilidade de rAHF poder ser maximizada em uma menor concentração de proteína, assim seguindo avaliação mais fácil das diferenças de estabilidade. A seleção da formulação para identificar a formulação potencial candidata usou dois conjuntos de critérios, (1) características físicas e (2) estabilidade. Características físicas: As características físicas dos produtos secos por congelamento foram julgadas pelos seguintes critérios: (1) a capacidade de secar por congelamento sem colapso para abaixar a umidade residual (normalmente<l %) em tempo razoável, (2) a temperatura de transição vítrea dos sólidos secos por congelamento, (3) a aparência do produto seco por congelamento, e (4) o tempo de reconstituição determinado dissolvendo os conteúdos do frasco em 5 mL de água estéril para injeção. Os resultados da caracterização física são mostrados na tabela 4. Tabela 4. Características físicas das formulações secas por congelamento a partir do estudo de seleção. O termo, “Elegante”, significa secagem por congelamento sem perda significativa da estrutura da torta.

No geral, todos os sólidos secos por congelamento tiveram tempo de reconstituição aceitável. Entretanto, todos tiveram maiores teores de umidade residual e menores temperaturas de transição vítrea que o desejado, especialmente as formulações à base de manitol. Além do mais, dados de difração em pó por raios-X (dados não mostrados) mostraram evidência para picos de manitol hidratados, indicando que algum manitol cristalizou no manitol hidratado, que é difícil de dessolvatar. Além do mais, pelo menos para sistemas contendo manitol, cristalização incompleta de manitol significativamente diminui o Tg da fase amorfa, uma vez que Tg do manitol amorfo é somente cerca de 13 °C.

Estabilidade em-processo: Todas as formulações, exceto manitol/lisina, foram preparadas, filtradas e liofilizadas usando o processo descrito na tabela 3. A estabilidade em-processo foi estimada pela recuperação da potência de rAHF da formulação inicial. A figura 1 sumariza a porcentagem da atividade de rAHF depois do processamento em várias formulações com relação à atividade inicial. A atividade de rAHF na formulação de manitol/glicerol foi essencialmente totalmente perdida (99,8 % de perda); desta forma, dados para esta formulação não são mostrados na figura. A atividade de rAHF nas formulações contendo manitol/sorbitol e glicina/rafinose também sofreu perdas de atividade significativas durante o processamento. A fraca estabilidade em-processo de rAHF em formulações contendo glicerol e sorbitol é atribuída a temperaturas de transição vítrea muito baixas, Tg* ( <-50 °C ) dos sistemas congelados e as Tg s baixas esperadas dos sistemas em secagem secundária. A Tg do sorbitol é -1,6 °C (20) e a para glicerol é ainda menor.

Estabilidade no armazenamento: As amostras secas por congelamento foram colocadas no teste de estabilidade em diferentes temperaturas (-70 °C, 5 °C, 25 °C, 40 °C e 50 °C, 60 °C) para os tempos selecionados. Em cada ponto de tempo, dois frascos de cada amostra foram removidos para ensaio de atividade. A atividade de rAHF em cada ponto de tempo foi normalizada para a atividade de amostras de rAHF controle mantidas a -70 °C. Este procedimento garantiu que variação a longo prazo no ensaio foi cancelada (nenhuma dependência de tempo no ensaio das amostras armazenadas a -70° foi notada). Conforme é comum para a degradação em sólidos amorfos, a degradação seguiu cinéticas de “tempo esticado” e foram completamente consistentes com a equação linear,

em que, P = Atividade de FVIII em tempo t Pθ = Potência inicial de FVIII (= potência do controle a -70 °C) k = Constante da taxa para degradação t= tempo (em meses)

A equação 1 é consistente com a degradação de múltiplos microestados independentes, não em equilíbrio no estado vítreo, cada um com diferentes taxas de degradação. Assim, a constante da taxa (k) determinada a partir da equação 1 representa uma combinação de constantes da taxa de inúmeras configurações de proteína diferentes na matriz liofilizada, cada uma das quais degrada em uma taxa diferente. No geral, espera-se que a equação da taxa envolva o log da atividade sendo linear em tempo aumentado para alguma força menor que unidade, com a força frequentemente sendo !6, mas em casos de níveis baixos de degradação a equação linear (equação 1) é uma aproximação válida. Em muitas amostras a degradação não é mínima e, de fato, os dados preliminares dados na tabela 2, onde a extensão da degradação foram particularmente grandes, não ajustaram a equação 1 bem e requerera a expressão log. Para várias amostras aqui estudadas, um bom ajuste pode ser obtido com a versão log da equação 1, mas a expressão linear, equação 1, realmente ajusta os dados ligeiramente melhor em quase todos os casos. Assim, empiricamente, o uso de equação 1 é aceitável e é razoável comparar constantes da taxa derivadas desta expressão. A adequabilidade da equação 1 na representação dos dados é ilustrada na figura 2 onde a porcentagem da perda da atividade com relação à amostra de controle a -70 °C é disposta em gráfico como uma função da raiz quadrada do tempo para duas formulações de rAHF armazenadas a 25 °C, 40 °C e 50 °C. A linearidade dos resultados dispostos em gráfico foi excelente.

As constantes da taxa de degradação de rAHF nas várias formulações a 25 °C, 40 °C e 50 °C foram obtidas por análise de regressão, usando equação 1, e são comparadas na figura 3. Os resultados mostram que a formulação à base de NaCl foi menos estável que as formulações que não têm NaCl.

Seleção das formulações candidatas finais’. As seguintes formulações foram submetidas a análise adicional devido a suas características preferidas: manitol/arginina, glicina/trealose e manitol/trealose. A formulação manitol/trealose compreende uma modalidade preferida em virtude de ela produzir uma torta elegante e trealose tem uma temperatura de transição vítrea muito alta (-117 °C) e, desta forma, pode ser menos submetida a problemas de temperatura de transição vítrea se água residual foi para aumentar, por exemplo por meio de absorção de água das tampas durante armazenamento. Além disso, manitol é facilmente cristalizável e a falta de cristalização completa tem impactos menos sérios na Tg' que a cristalização incompleta da glicina, um resultado direto de Tg' muito menor para glicina que para manitol.

Oxidação de minimização: Os papéis da glutationa e histidina

Oxidação é um caminho pelo qual produtos rAHF perdem 5 atividade funcional. N-acetil-L-cistina, ácido lipóico, e/ou glutationa reduzida são estabilizantes adequados para uso em uma modalidade preferida da descrição, com glutationa sendo o antioxidante mais efetivo (dados não mostrados). Desta maneira, 0,2 mg/mL de glutationa reduzida foi adicionado às formulações em estudo. Tabela 5. Processo, formulação, e características físicas para formulação à base de Manitob.Trealose com tampão de histidina e antioxidante glutationa.

As formulações estudadas incluíram um ou mais dos seguintes tampões: TRIS, histidina e/ou HEPES.

Embora o pKa da histidina seja muito baixo para tamponamento ideal a pH 7, histidina foi atrativa em virtude de especular-se que histidina deve agir como um quelante de ferro, limitando assim a oxidação catalisada por ferro.

Uma outra vantagem potencial de histidina sobre herpes é sua maior Tg (37 °C) inerente que HEPES (11 °C), contribuindo assim para uma maior temperatura de transição vítrea nas tortas secas por congelamento finais. No geral, percebe-se que a adição de glutationa melhora a estabilidade no armazenamento, com os resultados mostrados na figura 4 sendo típicos. Na figura 4, uma comparação é conduzida com relação à perda no processamento e perda durante 9 meses de armazenamento a 25 °C para quatro formulações de Glicina/Trealose. Degradação em-processo foi essencialmente a mesma para todas as formulações. A formulação “básica”, tanto sem histidina quanto glutationa, foi claramente a menos estável durante o armazenamento, mas as outras três formulações, todas as quais incluíram glutationa, mostraram o mesmo nível de degradação durante armazenamento a 25 °C. Isto é, tanto a formulação “básica” mais o quelante de íon, deferoxamina, quanto a formulação “básica” mais 10 mM de HEPES tiveram a mesma estabilidade que a formulação com histidina.

Uma alternativa de formulação simples: formulações somente com dissacarídeo sem de NaCl

As características de secagem por congelamento e estabilidade das formulações quando o NaCl foi removido foram examinadas. NaCl foi removido do BDS por diálise contra um tampão sem NaCl. O BDS resultante continha, em uma modalidade, quantidade traços de NaCl e em uma outra modalidade, nenhum NaCl. As composições tampão e as composições da formulação, bem como as características físicas dos produtos secos por congelamento, e processo usado são dados na tabela 6.

Mesmo usando o ciclo de secagem por congelamento não otimizado, as formulações de excipiente onde o NaCl foi removido e nenhum NaCl foi adicionado como um excipiente durante a preparação da formulação final antes da liofilização, especialmente a formulação à base de trealose, forneceram produtos com teor de umidade residual extremamente baixo e valores de Tg altos, todos com um processo que foi substancialmente menor que o necessário para formulações onde NaCl foi adicionado como um excipiente (83 horas em função de 113 horas, ver tabelas 5 e 6). Tabela 6. Processo, Formulação, e características físicas para formulações à base de trealose e sacarose sem agente de massa ou NaCl.

A estabilidade no armazenamento de rAHF nas formulações somente com dissacarídeo onde NaCl foi removido do BDS foi comparada com estabilidade em uma formulação onde NaCl foi em um mínimo adicionado ao BDS como um excipiente mostrado na figura 5. Todas as formulações contêm glutationa e histidina e diferem somente na presença de agente de massa (manitol) e NaCl, bem como uma concentração ligeiramente menor de rAHF na formulação somente com dissacarídeo devido à perda (ou diluição) que ocorreu na diálise. As formulações onde o NaCl foi removido e nenhum NaCl foi adicionado ao BDS como um excipiente durante a formulação, secaram por congelamento mais rapidamente que as formulações onde NaCl foi adicionado como um excipiente e resultou em um produto elegante. Adicionalmente, a estabilidade é significativamente melhor sem NaCl, particularmente para a formulação de trealose a 40° e 60 °C. Dado os dados na figura 5, e assumindo o comportamento de Arrhenius, a constante da taxa a 25 °C é 3,0 (vezes em meses) para a formulação contendo NaCl, enquanto que a constante da taxa correspondente para a formulação somente com trealose é 1,44. Esta diferença traduz em um período de 4 anos necessário para a formulação de trealose sem NaCl degradar em 10 %, mas somente 11 meses para a formulação que inclui NaCl para degradar em 10 %. Em resumo, a estabilidade a temperatura ambiente é uma realidade depois da remoção de NaCl por diálise e não adicionando NaCl depois da diálise como uma formulação excipiente, com o resultado que o 5 período de tempo de liofilização é encurtado.

Considerando o exposto anteriormente, em uma modalidade da descrição, uma formulação é fornecida de acordo com a tabela 6.

Claims (17)

1. Formulação farmacêutica liofilizada estável do fator VIII (FVIII), caracterizada pelo fato de que compreende: (a) um FVIII; (b) um ou mais agentes tamponantes selecionados do grupo que consiste em citrato, glicina, histidina, HEPES, Tris e combinações destes agentes; (c) um ou mais antioxidantes selecionados do grupo que consiste em glutationa; (d) um ou mais agentes estabilizantes selecionados do grupo que consiste em sacarose, trealose, e rafinose, e combinações destes agentes estabilizantes; e (e) um ou mais agentes tensoativos selecionados do grupo que consiste em digitonina, Triton X-100, Triton X-114, TWEEN-20, TWEEN-80 e combinações destes agentes tensoativos; o dito FVIII compreendendo um polipeptídeo selecionado do grupo que consiste em: um polipeptídeo de FVIII recombinante; o dito tampão é composto de um agente de tamponamento de pH em uma faixa de 0,1 mM a 500 mM e o dito pH é em uma faixa de 2,0 a 12,0; o dito antioxidante é em uma concentração de 0,005 a 1,0 mg/mL; o dito agente estabilizante é em uma concentração de 0,005 a 20 %; o dito agente tensoativo é em uma concentração de 0,001 % a 1,0 %; e a dita formulação excluindo cloreto de sódio (NaCl) ou incluindo somente quantidade traço de NaCl.

2. Formulação de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o agente tamponante é histidina.

3. Formulação de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o pH é na faixa de 6,0 a 8,0.

4. Formulação de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que o pH é na faixa de 6,5 a 7,5.

5. Formulação de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o agente tamponante é histidina e o pH é 7,0.

6. Formulação de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o antioxidante é em uma faixa de concentração de 0,1 a 0,5 mg/mL.

7. Formulação de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que o antioxidante é glutationa em uma concentração de 0,2 mg/mL.

8. Formulação de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o agente tamponante é histidina e o pH é 7,0; e em que o antioxidante é glutationa em uma concentração de 0,2 mg/mL.

9. Formulação de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que os agentes estabilizantes são trealose em uma concentração de 5 % e cloreto de cálcio em uma concentração de 4 mM.

10. Formulação de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que os agentes estabilizantes são sacarose em uma concentração de 5 % e cloreto de cálcio em uma concentração de 4 mM.

11. Formulação de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o agente tensoativo é TWEEN-80 em 0,03 %.

12. Formulação de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o agente tamponante é histidina em uma concentração de 25 mM em pH 7,0; em que o antioxidante é glutationa em uma concentração de 0,2 mg/mL; em que os agentes estabilizantes são trealose ou sacarose em uma concentração de 5 % e cloreto de cálcio em uma concentração de 4 mM.; e em que o agente tensoativo é TWEEN-80 em 0,03 %.

13. Formulação de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que NaCl não é adicionado como um excipiente.

14. Formulação de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o cloreto de sódio está presente em quantidade traço seguindo remoção por diálise ou cromatografia por troca de solvente.

15. Método para preparar um fator liofilizado estável FVIIII, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (a) preparar a formulação como definida na reivindicação 1; e (b) liofilizar a formulação da etapa (a).

16. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a estabilidade do FVIII liofilizado é maior comparada a uma formulação de FVIII que é liofilizada na presença de NaCl.

17. Formulação farmacêutica liofilizada estável do fator VIII (FVIII), caracterizada pelo fato de que compreende: (a) um FVIII; (b) um ou mais agentes tamponantes; (c) um ou mais antioxidantes; (d) um ou mais agentes estabilizantes; e (e) um ou mais agentes tensoativos; o dito FVIII compreendendo um polipeptídeo selecionado do grupo que consiste em: o m polipeptídeo de FVIII recombinante; o dito agente de tamponamento é histidina em uma concentração de 25mM e dito pH é 7,0; o dito antioxidante é glutationa em uma concentração de 0,2 mg/mL; o dito agente estabilizante é trealose ou sucrose em uma concentração de 5% e cloreto de cálcio em uma concentração de 4 mM e o dito agente tensoativo é TWEEN-80 a 0,03%.

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