ES2325653T3 - Composicion liquida de polipeptidos del factor vii. - Google Patents
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Abstract
Composición líquida, acuosa que comprende (i) Un polipéptido del Factor VII (ii) Un agente adecuado para mantener el pH en el rango de desde aproximadamente 4.0 hasta aproximadamente 8.0; (iii) Un agente seleccionado de la lista de: una sal cálcica, una sal magnésica, o una mezcla de las mismas, donde la concentración de (iii) es al menos 15 mM; y (vii) Un antioxidante.
Description
Composición líquida de polipéptidos del Factor
VII.
La presente invención se refiere a composiciones
líquidas acuosas que contienen polipéptidos del factor VII, y a
métodos para la realización y uso de composiciones de este tipo.
Más particularmente, esta invención se refiere a composiciones
líquidas estabilizadas contra la degradación química y/o
física.
Una variedad de factores implicados en el
proceso de coagulación de la sangre ha sido identificada,
incluyendo el factor VII (FVII), una glicoproteína plasmática. La
hemostasis es iniciada por la formación de un complejo entre el
factor tisular (TF) que se expone a la sangre circulante después de
una herida en la pared del vaso, y el FVIIa está presente en la
circulación en una cantidad correspondiente a aproximadamente el 1%
de la masa proteica del FVII total. El FVII existe en el plasma
principalmente como un zimógeno monocatenario, que es dividido por
FXa en su forma activada bicatenaria, FVIIa. El factor recombinante
VIIa activado (rFVIIa) ha sido desarrollado como un agente
prohemostático. La administración de rFVIIa ofrece una respuesta
prohemostática rápida y altamente eficaz en sujetos hemofílicos con
hemorragias que no pueden ser tratados con otros productos de
factor de coagulación debido a la formación de anticuerpos. También
el sangrado en sujetos con deficiencia del factor VII o sujetos que
tengan un sistema de coagulación normal pero que experimenten un
sangrado excesivo puede ser tratado exitosamente con FVIIa.
Es deseable tener formas de administración del
factor VIIa adecuadas tanto para el almacenamiento como la
administración. Idealmente, el medicamento es almacenado y
administrado como un líquido. De forma alternativa, el producto es
liofilizado, es decir, criosecado, y después reconstruido añadiendo
un diluyente adecuado justo antes del uso por el paciente.
Idealmente, el medicamento tiene estabilidad suficiente para tenerlo
almacenado durante un plazo largo, es decir, más de seis meses.
La decisión de o bien mantener el medicamento
final como un líquido o criosecarlo se basa normalmente en la
estabilidad del medicamento proteico en aquellas formas. La
estabilidad de la proteína puede ser afectada inter alia por
factores tales como fuerza iónica, pH, temperatura, ciclos
repetidos de congelación/descongelación, y exposiciones a fuerzas
de cizallamiento. La proteína activa puede perderse como resultado
de inestabilidades físicas, incluyendo la desnaturalización y
agregación (formación de agregado tanto soluble como insoluble), al
igual que inestabilidades químicas, incluyendo, por ejemplo,
hidrólisis, desamidación y oxidación, por nombrar solamente unos
pocos. Para un examen general sobre la estabilidad de fármacos
proteicos, véase, por ejemplo, Manning, et al.,
Pharmaceutical Research 6:903-918 (1989).
Mientras la incidencia posible de
inestabilidades proteicas es muy apreciada, es imposible predecir
los problemas de inestabilidad particulares de una proteína
particular. Cualquiera de estas inestabilidades puede causar la
formación de un subproducto proteico, o derivado, que tenga una
menor actividad, mayor toxicidad, y/o mayor inmunogenicidad. De
hecho, la precipitación de proteínas puede producir trombosis, no
homogeneidad en la forma y cantidad de dosificación así como
obstrucción de jeringas. Además, modificaciones postraduccionales
tales como por ejemplo, la gamma-carboxilación de
determinados residuos de ácido glutámico en el
N-terminal y la adición de cadenas laterales de
carbohidrato proporcionan sitios potenciales que pueden ser
susceptibles de modificación después del almacenamiento. También,
específico para el factor VIIa, al ser una serina proteasa, puede
ocurrir una fragmentación debido a una autocatálisis (degradación
enzimática). Así, la seguridad y eficacia de cualquier composición
de una proteína está directamente relacionada con su estabilidad. El
mantenimiento de la estabilidad en una forma líquida es
generalmente diferente de una forma liofilizada debido al potencial
inmensamente aumentado del movimiento molecular y en consecuencia
la mayor probabilidad de interacciones moleculares. El mantenimiento
de la estabilidad en una forma concen-
trada es también diferente por la propensión a la formación de agregado ante mayores concentraciones de proteína.
trada es también diferente por la propensión a la formación de agregado ante mayores concentraciones de proteína.
Al realizar una composición líquida se tienen en
cuenta muchos factores. A corto plazo, es decir, menos de seis
meses, la estabilidad líquida depende generalmente de evitar
grandes cambios estructurales, tales como la desnaturalización y
agregación. Estos procesos son descritos en la bibliografía para
varias proteínas, y existen muchos ejemplos de agentes
estabilizantes. Es bien conocido que un agente eficaz para
estabilizar una proteína en realidad actúa para desestabilizar
otra. Una vez que la proteína ha sido estabilizada contra grandes
cambios estructurales, el desarrollo de una composición líquida con
una estabilidad a largo plazo (por ej., más de seis meses) depende
de estabilizar además la proteína a partir de tipos de degradación
específicos para esa proteína. Los tipos más específicos de
degradación pueden incluir, por ejemplo, enlace disulfúrico en
aleatorización, oxidación de determinados residuos, desamidación,
ciclización. Aunque no siempre es posible precisar los tipos de
degradación individual, se han realizado ensayos para controlar los
cambios sutiles para controlar la capacidad de los excipientes
específicos para únicamente estabilizar la proteína de interés.
Además de tener en cuenta la estabilidad, se
seleccionan generalmente excipientes que están aprobados por varias
agencias reguladoras médicas mundiales. Es deseable que el pH de la
composición esté en un rango fisiológicamente adecuado en el
momento de la inyección/infusión, de lo contrario puede producir
dolor y molestias al paciente.
Para un examen general sobre composiciones
proteicas, véase, por ejemplo, Cleland et al.: The
development of stable protein compositions: A closer look at protein
aggregation, deamidation and oxidation, Critical Reviews in
Therapeutic Drug Carrier Systems 1993, 10(4):
307-377; y Wang et al., Parenteral
compositions of proteins and peptides: Stability and stabilizers,
Journal of Parenteral Science and Technology 1988 (Supplement), 42
(2S).
Otras publicaciones de interés respecto a la
estabilización de proteínas son las siguientes: U.S. 20010031721 A1
(productos nacionales americanos) se refiere a composiciones
altamente concentradas, liofilizadas, y del factor líquido IX. U.S.
5,770,700 (Genetics Institute) se refiere a composiciones del
factor líquido IX. WO 97/19687 (Cruz Roja Americana) se refiere a
composiciones líquidas de proteínas plasmáticas, en particular
factor VIII y factor IX. U.S. 4,297,344 describe la estabilización
de factores de coagulación II y VIII, antitrombina III, y
plasminógeno contra el calor añadiendo aminoácidos seleccionados
tales como glicina, alanina, hidroxiprolina, glutamina, y ácido
aminobutirico, y un carbohidrato tal como un monosacárido, un
oligosacárido, o un alcohol de azúcar.
El factor VIIa pasa por diferentes vías
degradativas, especialmente agregación (dimerisación), oxidación y
sección autolítica (recortando la estructura peptídica). Además,
puede ocurrir la precipitación. Muchas de estas reacciones pueden
ser retardadas significativamente eliminando el agua de la
proteína. No obstante, el desarrollo de una composición acuosa para
el factor VIIa tiene las ventajas de eliminar errores de
reconstitución, aumentando de ese modo la exactitud de dosificación,
así como simplificando el uso del producto clínicamente, aumentando
de ese modo la adaptabilidad al paciente. Idealmente, las
composiciones del factor VIIa deberían ser estables durante más de
6 meses sobre una gama amplia de concentraciones de proteínas. Esto
permite una flexibilidad en los métodos de administración.
Generalmente, las formas más altamente concentradas permiten la
administración de volúmenes inferiores, lo que es altamente deseable
desde el punto de vista del paciente. Las composiciones líquidas
pueden tener muchas ventajas sobre productos criosecados en lo que
se refiere a facilitar la administración y el uso.
Hoy, la única composición polipeptídica FVII
comercialmente disponible hecha de recombinación es un producto del
factor FVIIa criosecado que es reconstituido antes del uso;
contiene una concentración del factor VIIa relativamente baja, por
ej., aproximadamente 0,6 mg/ml. Un vial (1,2 mg) de NovoSeven®
(Novo Nordisk A/S, Dinamarca) contiene 1,2 mg del factor VIIa
humano recombinante, 5,84 mg de NaCl, 2,94 mg de CaCl_{2}, 2
H_{2}O, 2,64 mg de GlyGly, 0,14 mg de polisorbato 80, y 60,0 mg de
manitol; es reconstruido a pH 5.5 por 2,0 ml de agua para inyección
(WFI). Una vez reconstituida, la solución de proteínas es estable
para el uso durante 24 horas. Por tanto, actualmente no hay
productos líquidos preparados para el uso o productos concentrados
del factor VII comercialmente disponibles.
Por consiguiente hay una necesidad en la técnica
de métodos para mejorar la estabilidad de los polipéptidos del
factor VII, incluyendo el factor humano VIIa (estabilidad química
y/o física), aumentando la concentración, manteniendo los niveles de
actividad, y suministrando composiciones líquidas adecuadas para el
almacenamiento. Así, es un objeto de esta invención proporcionar
una composición acuosa polipeptídica del factor VII que proporcione
un control aceptable de los productos de degradación química y/o
física tales como la degradación enzimática o productos de
autocatálisis.
Los presentes inventores han descubierto que el
factor VII o análogos del mismo ("polipéptidos del factor
VII"), cuando son formulados en una solución acuosa junto con un
agente tamponador, un antioxidante y una sal cálcica o sal magnésica
o mezcla de las mismas a una concentración de al menos 15 mM, son
estables en el rango de pH desde aproximadamente 4 hasta
aproximadamente 8.
En un aspecto, la presente invención proporciona
una composición líquida acuosa que comprende (i) un polipéptido del
factor VII, (ii) un agente adecuado para mantener el pH en el rango
de desde aproximadamente 4.0 hasta aproximadamente 8.0 y (iii) un
agente seleccionado de la lista de: una sal cálcica, una sal
magnésica, o una mezcla de las mismas; donde la concentración de
(iii) es al menos 15 mM, y un antioxidante.
En formas de realización diferentes, el agente
(iii) está presente en una concentración de al menos
aproximadamente 25 mM, 50 mM, 100 mM, 200 mM, 400 mM, 800 mM, 900
mM, o al menos 1000 mM.
En otra forma de realización, la composición
comprende además (iv) un agente modificador de fuerza iónica.
En formas de realización diferentes el agente
modificador de fuerza iónica es seleccionado de la lista de: una
sal neutra, por ej., cloruro sódico; un aminoácido; o un pequeño
péptido, o una mezcla de al menos dos de dichos agentes
modificantes. En una forma de realización preferida, el agente
modificador de fuerza iónica es cloruro sódico.
En formas de realización diferentes, el agente
(iv) está presente en una concentración de al menos aproximadamente
5 mM, 10 mM, 20 mM, 50 mM, 100 mM, 200 mM, 400 mM, 800 mM, 1000 mM,
1200 mM, 1500 mM, 1800 mM, 2000 mM, o al menos 2200 mM.
En una serie de formas de realización, el agente
(iii) (sal cálcica y/o magnésica) está presente en una
concentración de desde aproximadamente 15 mM hasta aproximadamente
1000 mM, tal como desde aproximadamente
25 mM hasta aproximadamente 1000 mM, desde aproximadamente 50 mM hasta aproximadamente 1000 mM, desde aproximadamente 100 mM hasta aproximadamente 1000 mM, desde aproximadamente 200 mM hasta aproximadamente 1000 mM, desde aproximadamente 300 mM hasta aproximadamente 1000 mM, desde aproximadamente 400 mM hasta aproximadamente 1000 mM, desde aproximadamente 500 mM hasta aproximadamente 1000 mM, desde aproximadamente 600 mM hasta aproximadamente 1000 mM, desde aproximadamente 700 mM hasta aproximadamente 1000 mM; desde aproximadamente 15 mM hasta aproximadamente 800 mM, desde aproximadamente 25 mM hasta aproximadamente 800 mM, desde aproximadamente 50 mM hasta aproximadamente 800 mM, desde aproximadamente 100 mM hasta aproximadamente 800 mM, desde aproximadamente 200 mM hasta aproximadamente 800 mM, desde aproximadamente 300 mM hasta aproximadamente 800 mM, desde aproximadamente 400 mM hasta aproximadamente 800 mM, desde aproximadamente 500 mM hasta aproximadamente 800 mM; desde aproximadamente 15 mM hasta aproximadamente 600 mM, desde aproximadamente 25 mM hasta aproximadamente 600 mM, desde aproximadamente 50 mM hasta aproximadamente 600 mM, desde aproximadamente 100 mM hasta aproximadamente 600 mM, desde aproximadamente 200 mM hasta aproximadamente 600 mM, desde aproximadamente 300 mM hasta aproximadamente 600 mM; desde aproximadamente 15 mM hasta aproximadamente 400 mM, desde aproximadamente 25 mM hasta aproximadamente 400 mM, desde aproximadamente 50 mM hasta aproximadamente 400 mM, o desde aproximadamente 100 mM hasta aproximadamente 400 mM.
25 mM hasta aproximadamente 1000 mM, desde aproximadamente 50 mM hasta aproximadamente 1000 mM, desde aproximadamente 100 mM hasta aproximadamente 1000 mM, desde aproximadamente 200 mM hasta aproximadamente 1000 mM, desde aproximadamente 300 mM hasta aproximadamente 1000 mM, desde aproximadamente 400 mM hasta aproximadamente 1000 mM, desde aproximadamente 500 mM hasta aproximadamente 1000 mM, desde aproximadamente 600 mM hasta aproximadamente 1000 mM, desde aproximadamente 700 mM hasta aproximadamente 1000 mM; desde aproximadamente 15 mM hasta aproximadamente 800 mM, desde aproximadamente 25 mM hasta aproximadamente 800 mM, desde aproximadamente 50 mM hasta aproximadamente 800 mM, desde aproximadamente 100 mM hasta aproximadamente 800 mM, desde aproximadamente 200 mM hasta aproximadamente 800 mM, desde aproximadamente 300 mM hasta aproximadamente 800 mM, desde aproximadamente 400 mM hasta aproximadamente 800 mM, desde aproximadamente 500 mM hasta aproximadamente 800 mM; desde aproximadamente 15 mM hasta aproximadamente 600 mM, desde aproximadamente 25 mM hasta aproximadamente 600 mM, desde aproximadamente 50 mM hasta aproximadamente 600 mM, desde aproximadamente 100 mM hasta aproximadamente 600 mM, desde aproximadamente 200 mM hasta aproximadamente 600 mM, desde aproximadamente 300 mM hasta aproximadamente 600 mM; desde aproximadamente 15 mM hasta aproximadamente 400 mM, desde aproximadamente 25 mM hasta aproximadamente 400 mM, desde aproximadamente 50 mM hasta aproximadamente 400 mM, o desde aproximadamente 100 mM hasta aproximadamente 400 mM.
En una serie de formas de realización el agente
(iv) (agente modificador de fuerza iónica) está presente en una
concentración de desde aproximadamente 5 mM hasta aproximadamente
2200 mM, tal como desde aproximadamente 25 mM hasta aproximadamente
2200 mM, desde aproximadamente 50 mM hasta aproximadamente 2200 mM,
desde aproximadamente 100 mM hasta aproximadamente 2200 mM, desde
aproximadamente 200 mM hasta aproximadamente 2200 mM, desde
aproximadamente 400 mM hasta aproximadamente 2200 mM, desde
aproximadamente 600 mM hasta aproximadamente 2200 mM, desde
aproximadamente 800 mM hasta aproximadamente 2200 mM, desde
aproximadamente 1000 mM hasta aproximadamente 2200 mM, desde
aproximadamente 1200 mM hasta aproximadamente 2200 mM, desde
aproximadamente 1400 mM hasta aproximadamente 2200 mM, desde
aproximadamente 1600 mM hasta aproximadamente 2200 mM, desde
aproximadamente 1800 mM hasta aproximadamente 2200 mM, o desde
aproximadamente 2000 mM hasta aproximadamente 2200 mM; desde
aproximadamente 5 mM hasta aproximadamente 1800 mM, desde
aproximadamente 25 mM hasta aproximadamente 1800 mM, desde
aproximadamente 50 mM hasta aproximadamente 1800 mM, desde
aproximadamente 100 mM hasta aproximadamente 1800 mM, desde
aproximadamente 200 mM hasta aproximadamente 1800 mM, desde
aproximadamente 400 mM hasta aproximadamente 1800 mM, desde
aproximadamente 600 mM hasta aproximadamente 1800 mM, desde
aproximadamente 800 mM hasta aproximadamente 1800 mM, desde
aproximadamente 1000 mM hasta aproximadamente 1800 mM, desde
aproximadamente 1200 mM hasta aproximadamente 1800 mM, desde
aproximadamente 1400 mM hasta aproximadamente 1800 mM, desde
aproximadamente 1600 mM hasta aproximadamente 1800 mM; desde
aproximadamente 5 mM hasta aproximadamente 1500 mM, desde
aproximadamente 25 mM hasta aproximadamente 1400 mM, desde
aproximadamente 50 mM hasta aproximadamente 1500 mM, desde
aproximadamente 100 mM hasta aproximadamente 1500 mM, desde
aproximadamente 200 mM hasta aproximadamente 1500 mM, desde
aproximadamente 400 mM hasta aproximadamente 1500 mM, desde
aproximadamente 600 mM hasta aproximadamente 1500 mM, desde
aproximadamente 800 mM hasta aproximadamente 1500 mM, desde
aproximadamente 1000 mM hasta aproximadamente 1500 mM, desde
aproximadamente 1200 mM hasta aproximadamente 1500 mM; desde
aproximadamente 5 mM hasta aproximadamente 1200 mM, desde
aproximadamente 25 mM hasta aproximadamente 1200 mM, desde
aproximadamente 50 mM hasta aproximadamente 1200 mM, desde
aproximadamente 100 mM hasta aproximadamente 1200 mM, desde
aproximadamente 200 mM hasta aproximadamente 1200 mM, desde
aproximadamente 400 mM hasta aproximadamente 1200 mM, desde
aproximadamente 600 mM hasta aproximadamente 1200 mM, o desde
aproximadamente 800 mM hasta aproximadamente 1200 mM.
En una forma de realización preferida, la
concentración total de agentes (iii) y (iv) es desde
aproximadamente 50 mM hasta aproximadamente 2500 mM, tal como desde
aproximadamente 100 mM hasta aproximadamente 2500 mM, desde
aproximadamente 200 mM hasta aproximadamente 2500 mM, desde
aproximadamente 400 mM hasta aproximadamente 2500 mM, desde
aproximadamente 600 mM hasta aproximadamente 2500 mM, desde
aproximadamente 800 mM hasta aproximadamente 2500 mM, desde
aproximadamente 1000 mM hasta aproximadamente 2500 mM, desde
aproximadamente 1200 mM hasta aproximadamente 2500 mM, desde
aproximadamente 1400 mM hasta aproximadamente 2500 mM, desde
aproximadamente 1600 mM hasta aproximadamente 2500 mM, desde
aproximadamente 1800 mM hasta aproximadamente 2500 mM, o desde
aproximadamente 2000 mM hasta aproximadamente 2500 mM; desde
aproximadamente 50 mM hasta aproximadamente 2000 mM, desde
aproximadamente 100 mM hasta aproximadamente 2000 mM, desde
aproximadamente 200 mM hasta aproximadamente 2000 mM, desde
aproximadamente 400 mM hasta aproximadamente 2000 mM, desde
aproximadamente 600 mM hasta aproximadamente 2000 mM, desde
aproximadamente 800 mM hasta aproximadamente 2000 mM, desde
aproximadamente 1000 mM hasta aproximadamente 2000 mM, desde
aproximadamente 1200 mM hasta aproximadamente 2000 mM, desde
aproximadamente 1400 mM hasta aproximadamente 2000 mM, o desde
aproximadamente 1600 mM hasta aproximadamente 2000 mM; desde
aproximadamente 50 mM hasta aproximadamente 1600 mM, desde
aproximadamente 100 mM hasta aproximadamente 1600 mM, desde
aproximadamente 200 mM hasta aproximadamente 1600 mM, desde
aproximadamente 400 mM hasta aproximadamente 1600 mM, desde
aproximadamente 600 mM hasta aproximadamente 1600 mM, desde
aproximadamente 800 mM hasta aproximadamente 1600 mM, desde
aproximadamente 1000 mM hasta aproximadamente 1600 mM, o desde
aproximadamente 1200 mM hasta aproximadamente 1600 mM.
En una forma de realización, los agentes (iii) y
(iv) están presentes en concentraciones de desde aproximadamente
600 hasta aproximadamente 800 mM de (iii) y desde 0 hasta
aproximadamente 5 mM de (iv); en otra forma de realización, los
agentes (iii) y (iv) están presentes en concentraciones de desde
aproximadamente 300 hasta aproximadamente 500 mM de (iii) y desde
aproximadamente 1100 hasta aproximadamente 1300 mM de (iv); en otra
forma de realización, los agentes (iii) y (iv) están presentes en
concentraciones de desde aproximadamente 100 hasta aproximadamente
300 mM de (iii) y desde aproximadamente 1500 hasta aproximadamente
1900 mM de (iv); en aún otra forma de realización, los agentes (iii)
y (iv) están presentes en concentraciones de desde aproximadamente
50 hasta aproximadamente 150 mM de (iii) y desde aproximadamente
1800 aproximadamente 2300 mM de (iv).
En formas de realización diferentes, la fuerza
iónica de la composición es al menos 50, tal como al menos 75, 100,
150, 200, 250, 400, 500, 650, 800, 1000, 1200, 1600, 2000, 2400,
2800, o al menos 3200.
En formas de realización diferentes la sal
cálcica es seleccionada de la lista de: cloruro cálcico, acetato
cálcico, gluconato cálcico y levulinato cálcico. En formas de
realización diferentes, la sal magnésica es seleccionada de la lista
de: cloruro magnésico, acetato magnésico, sulfato magnésico,
gluconato magnésico, levulinato magnésico y sales de ácidos
fuertes.
En formas de realización preferidas, el agente
(iii) es seleccionado de la lista de: cloruro cálcico, acetato
cálcico, cloruro magnésico, acetato magnésico, sulfato magnésico, o
una mezcla de los mismos; y el agente modificador de fuerza iónica
(iv) es cloruro sódico.
En otra forma de realización la composición
comprende además (v) un agente modificador de tonicidad.
En formas de realización diferentes, el agente
modificador de tonicidad (v) es seleccionado de la lista de: una
sal neutra; un mono-, di- o polisacárido; un alcohol de azúcar; un
aminoácido; o un péptido pequeño, o una mezcla de al menos dos de
dichos agentes modificadores.
En una forma de realización, el agente
modificador de tonicidad (v) está presente en una concentración de
desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 500 mM; desde
aproximadamente 1 hasta aproximadamente 300 mM; desde
aproximadamente 10 hasta aproximadamente 200 mM; o desde
aproximadamente 20 hasta aproximadamente 150 mM.
En otra forma de realización, la composición
comprende además (vi) un surfactante no iónico.
En una forma de realización, el surfactante no
iónico está presente en una cantidad de desde aproximadamente 0,005
hasta aproximadamente 2,0% en peso.
En formas de realización diferentes, el
surfactante no iónico es un polisorbato o un poloxámero o un éter
polioxietileno alquilo; preferiblemente poloxámero 188 o poloxámero
407, o polisorbato 20 o polisorbato 80, o polioxi 23 lauril
éter.
En otra forma de realización la composición
comprende además (vii) un antioxidante. En diferentes formas de
realización, el antioxidante es D- o L-metionina; un
análogo de metionina; un péptido con metionina; ácido ascórbico;
cisteína; un homólogo de metionina, por ej., homocisteina;
glutationa,. En una forma de realización preferida, el antioxidante
es L-metionina. En una forma de realización, el
antioxidante está presente en una concentración de desde
aproximadamente 0,1 hasta aproximadamente 5,0 mg/ml.
En una forma de realización el pH de la
composición es mantenido desde aproximadamente 4.0 hasta
aproximadamente 7.0; tal como desde aproximadamente 4.5 hasta
aproximadamente 7.0; desde aproximadamente 5.0 hasta aproximadamente
7.0; desde aproximadamente 5.5 hasta aproximadamente 7.0; o desde
aproximadamente 6.0 hasta aproximadamente 7.0.
En una forma de realización, el agente adecuado
para tener pH en el rango de desde aproximadamente 4.0 hasta
aproximadamente 8.0 es un agente tamponador seleccionado de la
lista de ácidos y sales de: citrato, acetato, histidina, malato,
fosfato, ácido tartárico, ácido succínico, MES, HEPES, Imidazol,
TRIS, lactato, glicilglicina, PIPES, glicina, o una mezcla de al
menos dos de dichos agentes tamponadores.
En una forma de realización, la concentración
del agente tamponador es desde aproximadamente 1 mM hasta 100 mM;
desde 1 mM hasta aproximadamente 50 mM; desde aproximadamente 1 mM
hasta aproximadamente 25 mM; desde aproximadamente 2 mM hasta
aproximadamente 20 mM; o aproximadamente 10 mM.
En otra forma de realización la composición
comprende además (viii) un conservante. En una forma de realización
el conservante es seleccionado de la lista de fenol, alcohol
bencílico, orto-cresol, meta-cresol,
para-cresol, metil paraben, propil paraben, cloruro
de benzalconio y cloruro de benzatonio.
En una forma de realización, la composición es
isotónica; en otra, es hipertónica. En una forma de realización, la
composición es formulada para la administración farmacéutica. En
una forma de realización, la composición es estable y/o estabilizada
durante al menos 6 meses a 2-8ºC.
En diferentes formas de realización, el
polipéptido del factor VII es el factor humano VIIa; factor humano
recombinante VIIa; un polipéptido relacionado con el factor VII; una
variante de la secuencia del factor VII; o un polipéptido del
factor VII donde la actividad del polipéptido del factor VII y la
actividad del Factor VIIa humano nativo (tipo salvaje FVIIa) es de
al menos aproximadamente 1,25, preferiblemente al menos
aproximadamente 2,0, o 4,0, de la forma más preferida al menos
aproximadamente 8,0, cuando se evalúa en el "ensayo de
proteolisis in vitro" como se describe en la presente
descripción. En una forma de realización, el polipéptido del factor
VII tiene una glicosilación diferente del factor VII humano tipo
salvaje.
En formas de realización diferentes, el
polipéptido del factor VII está presente en una concentración de
desde aproximadamente 0,1 mg/ml hasta aproximadamente 10 mg/ml;
desde aproximadamente 0,5 mg/ml hasta aproximadamente 5,0 mg/ml;
desde aproximadamente 0,6 mg/ml hasta aproximadamente 4,0 mg/ml;
desde aproximadamente 1,0 mg/ml hasta aproximadamente 4,0 mg/mi;
desde aproximadamente 0,1 mg/ml hasta aproximadamente 5 mg/ml;
desde aproximadamente 0,1 mg/ml hasta aproximadamente 4,0 mg/ml;
desde aproximadamente 0,1 mg/ml hasta aproximadamente 2 mg/ml; o
desde aproximadamente 0,1 mg/ml hasta aproximadamente 1,5
mg/ml.
En otro aspecto, la invención también
proporciona un método para preparar una composición líquida acuosa
de un polipéptido del factor VII, que comprende la fase de
suministrar el polipéptido del factor VII en una solución que
comprende (i) un polipéptido del factor VII; (ii) un agente
adecuado para mantener el pH en el rango de desde aproximadamente
4.0 hasta aproximadamente 8.0, (iii) un agente seleccionado de la
lista de: una sal cálcica, una sal magnésica, o una mezcla de las
mismas; donde la concentración de (iii) es al menos 15 mM, y un
antioxidante.
En otro aspecto, la invención también se refiere
al uso de la composición para la preparación de un medicamento para
tratar alteraciones hemorrágicas.
En formas de realización diferentes, el
trastorno de sangrado es seleccionado del grupo que consiste en
hemofilia A, hemofilia b, deficiencia del Factor XI. La deficiencia
del Factor VII, trombocitopenia, enfermedad de von Willebrand,
presencia de un inhibidor del factor de coagulación, cirugía,
hemorragia intracerebral, traumatismo y terapia anticoagulante.
La presente invención es como se define en las
reivindicaciones.
Las composiciones según la presente invención
son útiles como composiciones estables preferiblemente listas para
el uso de polipéptidos del factor VII. Las composiciones son
estables durante al menos seis meses, y preferiblemente hasta 36
meses; cuando son almacenadas a temperaturas que varían de 2º a 8ºC.
Las composiciones son química y/o físicamente estables, en
particular químicamente estables, cuando son almacenadas durante al
menos 6 meses a desde 2º hasta 8ºC.
Por "Estables" se entiende que la
composición, después del almacenamiento durante 6 meses a desde 2
hasta 8ºC retiene al menos el 50% de su actividad biológica inicial
medida por un ensayo de coágulo de primera etapa esencialmente como
se describe en WO 92/15686 (Ejemplo II). En resumidas cuentas, la
muestra que debe evaluarse es diluida en 50 mM Tris (pH 7.5), 0,1%
BSA y 100 \mul son incubados con 100 \mul de plasma deficiente
en factor VII y 200 \mul de tromboplastina C que contiene 10 mM
Ca^{2+}. Los tiempos de coagulación son medidos y comparados con
una curva estándar que usa un estándar de referencia o una
agrupación de plasma humano normal citrado en dilución en
serie.
Preferiblemente, la composición estable retiene
al menos el 80% de su actividad inicial después del almacenamiento
durante 6 meses de 2 a 8ºC.
El término "estabilizado", que puede ser
usado de forma intercambiable con "relativamente estable",
significa que la composición, después del almacenamiento durante al
menos 6 meses de 2 a 8ºC, contiene una cantidad inferior de al menos
uno de los siguientes productos de degradación: (i) productos de
degradación enzimática, (ii) agregados (dimeros, oligómeros,
polímeros), (iii) formas oxidadas, (iv) formas desamidadas, en
relación a la cantidad de producto(s)
de degradación correspondiente(s) contenida en una solución del producto reconstruido NovoSeven®, que ha sido almacenado bajo condiciones similares durante un periodo de tiempo similar.
de degradación correspondiente(s) contenida en una solución del producto reconstruido NovoSeven®, que ha sido almacenado bajo condiciones similares durante un periodo de tiempo similar.
El término "físicamente estable" designa
una composición que permanece visualmente clara. La estabilidad
física de las composiciones es evaluada mediante inspección visual
y la turbiedad después del almacenamiento de la composición a
temperaturas diferentes durante varios períodos de tiempo. La
inspección visual de las composiciones es realizada en una luz
finamente focalizada con un fondo oscuro. Una composición es
clasificada como físicamente inestable cuando muestra turbiedad
visual.
El término "estabilidad física" de
polipéptidos del factor VII se refiere a la formación de agregados
insolubles y/o solubles de formas diméricas oligoméricas y
poliméricas de polipéptidos del factor VII al igual que cualquier
deformación estructural y desnaturalización de la molécula.
El término "químicamente estable" está
destinado a designar una composición que retenga al menos el 50% de
su actividad biológica inicial después del almacenamiento durante 6
meses a desde 2 a 8ºC, medido por un ensayo de coágulo de un solo
paso esencialmente como se describe en WO 92/15686.
El término "estabilidad química" se refiere
a la formación de cualquier cambio químico en los polipéptidos del
Factor VII en el momento del almacenamiento en solución a
condiciones aceleradas. Por ejemplo, están la hidrólisis,
desamidación y oxidación al igual que la degradación enzimática que
producen la formación de fragmentos de polipéptidos del factor VII,
en particular, los aminoácidos que contienen azufre son propensos a
la oxidación con la formación de los correspondientes
sulfóxidos.
Las composiciones comprenden polipéptidos del
factor VII, iones de calcio y/o magnesio, agentes tamponadores, y,
opcionalmente, otros excipientes, que además estabilizan los
polipéptidos del factor VII, incluyendo los agentes modificadores de
fuerza iónica y modificadores de tonicidad. La concentración de
polipéptidos del factor VII varia desde aproximadamente 0,1 hasta
aproximadamente 10 mg/ml.
Como se utiliza en este caso, el término
"agente modificador de fuerza iónica" incluye agentes que
contribuyen a la fuerza iónica de la solución. Los agentes incluyen,
pero no se limitan a, sales neutras, p. ej., cloruro sódico o
cloruro de potasio; aminoácidos; péptidos pequeños (por ej., que
tienen de 2 a 5 residuos aminoácidos tales como por ej., la
glicilglicina), o una mezcla de al menos dos de dichos agentes
modificadores. Un agente preferido es cloruro sódico. Los agentes
modificadores de fuerza iónica están presentes en una concentración
de al menos aproximadamente 5 mM, 10 mM, 20 mM, 50 mM, 100 mM, 200
mM, 400 mM, 800 mM, 1000 mM, 1200 mM, 1500 mM, 1800 mM, 2000 mM, o
al menos 2200 mM.
Como se utiliza en este caso, el término
"modificador de tonicidad" incluye agentes que contribuyen a
la osmolalidad de la solución. Los modificadores de tonicidad
incluyen, pero no se limitan a, aminoácidos; péptidos pequeños (por
ej., que tienen de 2 a 5 residuos de aminoácido); sales neutras;
mono- o disacáridos; polisacáridos; alcoholes de azúcar, o una
mezcla de al menos dos de dichos modificadores. Ejemplos de
modificadores de tonicidad incluyen, pero no se limitan a, cloruro
sódico, cloruro potásico, citrato sódico, sacarosa, glucosa,
glicilglicina y manitol. Normalmente los modificadores están
presentes en una concentración de desde aproximadamente 1 hasta
aproximadamente 500 mM; desde aproximadamente 1 hasta
aproximadamente 300 mM; desde aproximadamente 10 hasta
aproximadamente 200 mM; o desde aproximadamente 20 hasta
aproximadamente 150 mM, dependiendo de los otros ingredientes
presentes. Se pueden usar sales neutras tales como p. ej., cloruro
sódico o cloruro potásico.
Por "sal neutra" se entiende una sal que no
es ni un ácido ni una base cuando es disuelta en una solución
acuosa.
El término "agente adecuado para mantener el
pH en el rango de aproximadamente 4.0 hasta aproximadamente 8.0"
comprende aquellos agentes que mantienen el pH de la solución en un
rango aceptable desde aproximadamente 4.0 hasta aproximadamente
8.0, tal como desde aproximadamente 4.0 hasta aproximadamente 7.0,
desde aproximadamente 4.5 hasta aproximadamente 7.0, desde
aproximadamente 5.0 hasta aproximadamente 7.0, desde
aproximadamente 5.0 hasta aproximadamente 6.5, desde
aproximadamente 5.5 hasta aproximadamente 7.0, desde aproximadamente
5.5 hasta aproximadamente 6.5, desde aproximadamente 6.0 hasta
aproximadamente 7.0, desde aproximadamente 5.0 hasta
aproximadamente 6.0, desde aproximadamente 6.4 hasta
aproximadamente 6.6, o aproximadamente 6.5, desde aproximadamente
5.2 hasta aproximadamente 5.7, o aproximadamente 5.5. El término
pueden ser usado de forma intercambiable con "agente
tamponador". Estos pueden incluir, pero no se limitan a ácidos y
sales de: citrato (sodio o potasio), acetato (amonio, sodio o
calcio), histidina (L-histidina), malato, fosfato
(sodio o potasio), ácido tartárico, ácido succínico, MES, HEPES,
imidazol, TRIS, lactato, glutamato, glicilglicina, PIPE, glicina, o
una mezcla de al menos dos de dichos agentes tamponadores. El rango
de concentración de tampón es elegida para mantener el pH preferido
de la solución. El agente tamponador puede también ser una mezcla
de al menos dos agentes tamponadores donde la mezcla sea capaz de
proporcionar un valor del pH en el rango definido. En formas de
realización alternativas, la concentración de tampón está en el
rango de aproximadamente 1 mM hasta 100 mM; desde aproximadamente 1
mM hasta aproximadamente 50 mM; desde aproximadamente 1 mM hasta
aproximadamente 25 mM; desde aproximadamente 2 mM hasta
aproximadamente 20 mM; o aproximadamente 10 mM.
Opcionalmente, las composiciones pueden también
contener un surfactante o detergente. Los "surfactantes" o
"detergentes" generalmente incluyen aquellos agentes que
protegen la proteína de tensiones inducidas por la interfaz de
aire/solución y tensiones inducidas por la solución/superficie (por
ej., dando como resultado la agregación de la proteína). El
detergente es preferiblemente un detergente no iónico incluyendo,
pero no limitado a polisorbatos (por ej. Tween4), tales como
polisorbato 20 u 80; éteres de polioxietileno alquilo o
poloxámeros, tales como poloxámero 188 o 407, (por ej., polioles
Pluronic®) y otros polímeros en bloque de etileno/polipropileno, o
polietilenoglicol (PEG) tales como PEG8000. La cantidad de
surfactante presente varía desde aproximadamente 0,005 hasta
aproximadamente 2,0%.
Opcionalmente, la composición puede incluir un
antioxidante. Los antioxidantes incluyen, pero no se limitan a,
ácido ascórbico, cisteína, homocisteina, cistina, cisstationina,
metionina, glutationa y otros péptidos que contienen cisteína o
metionina, en particular péptidos con 2 a 5 residuos aminoácidos
donde al menos uno de los residuos es una metionina o residuo de
cisteína; metionina, en particular se prefiere
L-metionina. El antioxidante es incluido en una
concentración de 0,1 a 5 mg/ml, tal como 0,1 a 4, 0,1 a 3, 0,1 a 2,
o 0,5 a 2 mg/ml.
También se puede incluir un conservante en la
composición para retardar el crecimiento microbiano y permitir de
ese modo el paquete de "uso múltiple" de polipéptidos FVII.
Los conservantes incluyen fenol, alcohol bencílico,
orto-cresol, meta-cresol,
para-cresol, metil paraben, propil paraben, cloruro
de benzalconio y cloruro de bencetonio. El conservante es
habitualmente incluido a una concentración de 0,1 a 20 mg/ml
dependiendo del rango de pH y tipo de conservante. Opcionalmente, la
composición también puede incluir un agente capaz de inhibir la
desamidación.
Como se utiliza en este caso, las cantidades
especificas son entendidas como de aproximadamente el 10%, por ej.,
aproximadamente 50 mM incluyen 50 \pm 5 mM; por ej., el 4%
incluye el 4% \pm 0,4%, etc.
Los porcentajes son (peso/peso) ambos cuando se
refieren a sólidos disueltos en solución y líquidos mezclados en
soluciones. Por ejemplo, para Tween, es el peso del 100% de materia
prima/peso de la solución.
El término "fuerza iónica" es la fuerza
iónica de la solución (\mu) Esto es definido por la ecuación:
\mu = ½
\sum
([i](Zi^{2})),
donde \mu es la fuerza iónica,
[i] es la concentración molar de un ión, y Z_{i} es la carga (+ o
-) de este ión (James Fritz and George Schenk: Quantitative
Analytical Chemistry,
1979).
En diferentes formas de realización de la
invención, la fuerza iónica de la composición es al menos 50, tal
como al menos 75, 100, 150, 200, 250, 400, 500, 650, 800, 1000,
1200, 1600, 2000, 2400, 2800, o al menos 3200.
El término "isotónico" significa
"isotónico con suero", es decir, aproximadamente 300 \pm 50
milliosmol/kg. La tonicidad se entiende como una medida de
osmolalidad de la solución antes de la administración. El término
"hipertónico" designa niveles de osmolalidad sobre el nivel
fisiológico del suero, tales como niveles por encima de 300 \pm 50
milliosmol/kg.
El término "cantidad farmacéuticamente
eficaz" o "cantidad eficaz" es la dosis eficaz por ser
determinada por un profesional cualificado, que pueda valorar las
dosificaciones para conseguir la respuesta deseada. Los factores
para considerar la dosis incluirán fuerza, biodisponibilidad,
perfiles farmacocinéticos/farmacodinámicos deseados, condición de
tratamiento, factores relacionados con el paciente (por ej. peso,
salud, edad, etc.), presencia de medicaciones coadministradas (por
ej., anticoagulantes), tiempo de administración, u otros factores
conocidos por un profesional médico.
El término "tratamiento" es definido como
la gestión y cuidado de un sujeto, por ej. un mamífero, en
particular un humano, con el propósito de combatir la enfermedad,
condición, o trastorno e incluye la administración de un polipéptido
del factor VII para prevenir la aparición de los síntomas o
complicaciones, o aliviar los síntomas o complicaciones, o eliminar
la enfermedad, condición, o trastorno. Las composiciones
farmacéuticas según la presente invención que contienen un
polipéptido del factor VII pueden ser administradas parenteralmente
a sujetos en necesidad de tal tratamiento. La administración
parenteral puede ser realizada por inyección subcutánea,
intramuscular o intravenosa mediante una jeringa, opcionalmente una
jeringa tipo pluma. De forma alternativa, la administración
parenteral pueden ser realizada mediante una bomba de infusión.
La concentración del factor VIIa es expresada
convenientemente como mg/mL o como UI/mL, con 1 mg representando
habitualmente 43000-56000 UI o más.
Las preparaciones de la presente invención
pueden ser usadas para tratar cualquier síndrome sensible al Factor
VII, tales como por ej., alteraciones hemorrágicas, incluyendo, sin
limitación, aquellos provocados por deficiencias del factor de
coagulación (p. ej., hemofilia A y B o deficiencia de factores de
coagulación XI o VII); por trombocitopenia o enfermedad de von
Willebrand o por inhibidores del factor de coagulación o sangrado
excesivo por cualquier causa. Las preparaciones pueden también ser
administradas a pacientes en asociación con cirugía u otro
traumatismo o a pacientes que reciban terapia anticoagulante.
Los términos "factor humano VII" o
"FVII" indican factor humano VII producido por métodos que
incluyen la extracción de la fuente natural y purificación, y por
sistemas de cultivo celular recombinante. Su secuencia y
características son expuestas, por ejemplo, en el documento US nº.
4,784,950. Los términos cubren asimismo equivalentes del factor VII
biológicamente activos, que difieren por ej., en uno o más
aminoácido(s) en la secuencia global. Además, los términos
usados en esta solicitud están destinados a incluir sustitución,
eliminación e inserción de variantes de aminoácido del factor VII o
modificaciones postraduccionales. Como se utiliza en este caso,
"polipéptido del Factor VII" comprende sin limitación el
Factor VII así como polipéptidos relacionados con el Factor VII.
Los polipéptidos relacionados con el Factor VII incluyen, sin
limitación, polipéptidos del Factor VII que han sido o bien
químicamente modificados respecto al Factor humano VII y/o
contengan una o más alteraciones de secuencia de aminoácidos
respecto al Factor humano VII (es decir, variantes del Factor VII),
y/o contengan secuencias de aminoácidos truncadas respecto al
Factor humano VII (es decir, fragmentos del Factor VII). Dicho
polipéptido relacionado con el Factor VII puede mostrar propiedades
diferentes respecto al Factor humano VII, incluyendo estabilidad,
unión de fosfolípidos, actividad específica alterada, y
similares.
Se entiende que el término "Factor VII"
comprende polipéptidos del Factor VII en su forma no dividida
(zimógena), al igual que aquellos que han sido procesados
proteolíticamente para producir sus respectivas formas bioactivas,
que pueden ser designadas Factor VIIa. Normalmente el factor VII es
dividido entre los residuos 152 y 153 para producir el Factor VIIa.
El término "Factor VII" está también destinado a comprender,
sin limitación, polipéptidos que tengan la secuencia de aminoácidos
1-406 del Factor humano VII de tipo salvaje (como
se describe en U.S. nº. 4,784,950), al igual que el Factor VII de
tipo salvaje derivado de otras especies, tal como por ej., el Factor
VII bovino, porcino, canino, murino, y de salmón. Comprende además
variaciones naturales alélicas del factor VII que pueden existir y
ocurrir de un individuo a otro. También, el grado y ubicación de la
glicosilación u otras modificaciones de
post-traducción pueden variar dependiendo de las
células huésped elegidas y la naturaleza del medio celular del
huésped.
Como se utiliza en este caso, "polipéptidos
relacionados con el Factor VII" comprenden sin limitación,
polipéptidos que muestran sustancialmente la misma o actividad
biológica mejorada respecto al Factor VII humano tipo salvaje. Estos
polipéptidos incluyen, sin limitación, Factor VII o Factor VIIa que
ha sido químicamente modificado y variantes del Factor VII donde
hayan sido introducidas alteraciones específicas de secuencia de
aminoácidos que modifiquen o disgreguen la bioactividad del
polipéptido.
Comprende además polipéptidos con una secuencia
de aminoácidos ligeramente modificada, por ejemplo, polipéptidos
que tienen un extremo N-terminal modificado
incluyendo deleciones o adiciones de aminoácidos en el
N-terminal y/o polipéptidos que hayan sido
químicamente modificados respecto al factor humano VIIa.
Los polipéptidos relacionados con el Factor VII,
incluyendo las variantes del factor VII, que muestran
sustancialmente la misma o mejor bioactividad que el Factor VII de
tipo salvaje, incluyen, sin limitación, polipéptidos con una
secuencia de aminoácidos que difieren de la secuencia del Factor
VII de tipo salvaje por inserción, eliminación o sustitución de uno
o más aminoácidos.
Los polipéptidos relacionados con el Factor VII,
incluyendo variantes, que tengan sustancialmente la misma o
actividad biológica mejorada respecto al Factor VIIa de tipo
salvaje comprenden aquellos que muestran al menos aproximadamente el
25%, preferiblemente al menos aproximadamente el 50%, más
preferiblemente al menos aproximadamente el 75%, más
preferiblemente al menos aproximadamente el 100%, más
preferiblemente al menos aproximadamente el 110%, más
preferiblemente al menos aproximadamente el 120%, y de la forma más
preferible al menos aproximadamente el 130% de la actividad
específica del Factor VIIa de tipo salvaje que haya sido producido
en el mismo tipo de célula, evaluado en uno o más de los ensayos de
coagulación, ensayo de proteolisis, o ensayo de unión TF como se
describe en la presente descripción.
Los polipéptidos relacionados con el Factor VII
incluyen variantes particulares, donde la proporción entre la
actividad de dicho polipéptido del Factor VII y la actividad del
Factor VIIa humano nativo (FVIIa tipo salvaje) es al menos
aproximadamente 1,25 evaluado en el "ensayo de hidrólisis in
vitro" (véase "Ensayos", abajo); en otras formas de
realización, la proporción es de al menos aproximadamente 2,0; en
formas de realización adicionales, la proporción es de al menos
aproximadamente 4,0. En algunas formas de realización de la
invención, los polipéptidos del factor VII son equivalentes al
Factor VII, en particular variantes donde la proporción entre la
actividad de dicho polipéptido del Factor VII y la actividad de
factor humano nativo VIIa (FVIIa tipo salvaje) es de al menos
aproximadamente 1,25 evaluado en el "ensayo de proteolisis in
vitro" (véase "Ensayos", abajo); en otras formas de
realización, la proporción es de al menos aproximadamente 2,0; en
formas de realización adicionales, la proporción es de al menos
aproximadamente 4,0; en formas de realización adicionales, la
proporción es de al menos aproximadamente 8,0.
En algunas formas de realización el polipéptido
del Factor VII es el Factor humano VII, como se describe, por ej.,
en U.S. nº. 4,784,950 (Factor VII tipo salvaje). En algunas formas
de realización, el polipéptido del Factor VII es el Factor VIIa
humano. En una serie de formas de realización, los polipéptidos del
Factor VII incluyen polipéptidos que muestran al menos
aproximadamente el 90%, preferiblemente al menos aproximadamente el
100%, preferiblemente al menos aproximadamente el 120%, más
preferiblemente al menos aproximadamente el 140%, y de la forma más
preferible al menos aproximadamente el 160%, de la actividad
biológica específica del Factor VIIa humano.
En algunas formas de realización, los
polipéptidos del Factor VII tienen una secuencia de aminoácidos que
difiere de la secuencia del Factor VII tipo salvaje por inserción,
eliminación, o sustitución de uno o más aminoácidos.
Los polipéptidos del Factor VII incluyen
polipéptidos que muestran al menos aproximadamente el 70%,
preferiblemente al menos aproximadamente el 80%, y más
preferiblemente al menos aproximadamente el 90%, y de la forma más
preferible al menos aproximadamente el 95% de identidad con la
secuencia del Factor VII de tipo salvaje como se describe en U.S.
nº. 4,784,950. La homología/identidad de la secuencia de
aminoácidos es convenientemente determinada a partir de secuencias
alineadas, usando un programa de ordenador adecuado para el
alineamiento de secuencias, tal como por ej., el programa ClustalW,
versión 1.8, 1999 (Thompson et al., 1994, Nucleic Acid
Research, 22: 4673-4680).
Ejemplos no limitativos de variantes del Factor
VII que tienen sustancialmente la misma o actividad biológica
mejorada como el Factor VII de tipo salvaje incluyen
S52A-FVII, S60A-FVII (lino et
al., Arch. Biochem. Biophys. 352: 182-192,
1998); L305V-FVII,
L305V/M306D/D309S-FVII, L305I-FVII,
L305T-FVII, F374P-FVII,
V158T/M298Q-
FVII, V158D/E296V/M298Q-FVII, K337A- FVII, M298Q-FVII, V158D/M298Q-FVII, L305V/K337A-FVII, V158
D/E296V/M298Q/L305V-FVII, V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, V158D/E296V/M298Q/L305V/K337A-FVII, K157A-FVII, E296V-FVII, E296V/M298Q FVII, V158D/E296V-FVII, V158D/M298K-FVII, y S336G-FVII; variantes de FVIIa que muestran actividad aumentada TF-independiente como se describe en WO 01/83725 y WO 02/22776; variantes de FVIIa que muestran una mayor estabilidad proteolítica como se describe en U.S. nº. 5,580,560; el Factor VII que ha sido proteolíticamente dividido entre los residuos 290 y 291 o entre los residuos 315 y 316 (Mollerup et al., Biotechnol. Bioeng. 48:501-505, 1995); y formas oxidadas del Factor VIIa (Korn-felt et al., Arch. Biochem. Biophys. 363:43-54: 1999).
FVII, V158D/E296V/M298Q-FVII, K337A- FVII, M298Q-FVII, V158D/M298Q-FVII, L305V/K337A-FVII, V158
D/E296V/M298Q/L305V-FVII, V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, V158D/E296V/M298Q/L305V/K337A-FVII, K157A-FVII, E296V-FVII, E296V/M298Q FVII, V158D/E296V-FVII, V158D/M298K-FVII, y S336G-FVII; variantes de FVIIa que muestran actividad aumentada TF-independiente como se describe en WO 01/83725 y WO 02/22776; variantes de FVIIa que muestran una mayor estabilidad proteolítica como se describe en U.S. nº. 5,580,560; el Factor VII que ha sido proteolíticamente dividido entre los residuos 290 y 291 o entre los residuos 315 y 316 (Mollerup et al., Biotechnol. Bioeng. 48:501-505, 1995); y formas oxidadas del Factor VIIa (Korn-felt et al., Arch. Biochem. Biophys. 363:43-54: 1999).
La actividad biológica del Factor VII en la
coagulación de sangre deriva de su capacidad para (i) unirse con el
factor tisular (TF) y (ii) catalizar el seccionamiento proteolítico
del Factor IX o Factor X para producir el Factor activado IX o X
(Factor IXa o Xa, respectivamente).
Para los fines de la invención, la actividad
biológica de los polipéptidos del Factor VII ("actividad
biológica del factor VII") puede ser cuantificada midiendo la
capacidad de una preparación para promover la coagulación de la
sangre usando el plasma deficitario en factor VI y tromboplastina,
como se describe, por ej., en U.S. nº. 5,997,864 o WO 92/15686. En
este ensayo la actividad biológica es expresada como la reducción en
el tiempo de coagulación respecto a una muestra de control y es
convertida en "unidades del Factor VII" por comparación con un
estándar de suero humano agrupado que contenga 1 unidad/ml de
actividad del Factor VII. De forma alternativa, la actividad
biológica del Factor VII puede ser cuantificada por
- -
- Medición de la capacidad de un polipéptido relacionado con el Factor VIIa o el Factor VII para producir el Factor X activado (Factor Xa) en un sistema que comprenda TF introducido en una membrana lipídica y el Factor X. (Persson et al., J. Biol. Chem. 272:19919-19924: 1997);
- -
- Medición de la hidrólisis del Factor X en un sistema acuoso ("ensayo de proteolisis in vitro", véase abajo);
- -
- Medición de la unión física del Factor VIIa o un polipéptido relacionado con el Factor VII a TF usando un instrumento basado en resonancia de plasmón de superficie (Persson, FEBS Letts. 413:359-363, 1997); y
- -
- Medición de la hidrólisis de un sustrato sintético por el Factor VIIa y/o un polipéptido relacionado con el Factor VII ("ensayo de proteolisis in vitro", véase abajo); y
- -
- Medición de la generación de trombina en un sistema in vitro TF-independiente.
Los polipéptidos del Factor VII útiles conforme
a la presente invención pueden ser seleccionados por ensayos
adecuados que pueden ser realizados como pruebas simples
preliminares in vitro. Así, la presente descripción presenta
una prueba simple (titulada "ensayo de hidrolisis in
vitro") para la actividad de polipéptidos del Factor VII.
El factor VIIa nativo (tipo salvaje) y el
polipéptido del Factor VII (ambos designados de aquí en adelante
"factor VIIa") pueden ser evaluados para actividades
específicas. También pueden ser evaluados en paralelo para comparar
directamente sus actividades específicas. El ensayo se realiza en
una placa de microtitulación (MaxiSorp, Nunc, Dinamarca). El
sustrato cromogénico
D-Ile-Pro-Arg-p-nitroanilida
(S-2288, Chromogenix, Suecia), concentración final
1 mM, es añadido al Factor VIIa (concentración final 100 nm) en 50
mM de HEPES, pH 7.4, conteniendo 0,1 m de NaCl, 5 mM de CaCl_{2} y
1 mg/ml de albúmina de suero bovino. La absorbencia a 405 nm es
medida continuamente en un lector de placas SpectraMax^{TM} 340
(Molecular Devices, USA). La absorbencia desarrollada durante una
incubación de 20 minutos, después de sustracción de la absorbencia
en un pocillo para el blanco que no contiene enzima, se utiliza para
calcular la proporción entre las actividades de polipéptido del
Factor VII y el Factor VIIa de tipo salvaje:
Proporción =
(A405 nm polipéptido del Factor VII)/(A405 nm factor VIIa tipo
salvaje)
Basados en esto se pueden identificar
polipéptidos del Factor VII con una actividad inferior, comparable,
o superior al factor nativo VIIa, tales como, por ejemplo,
polipéptidos del Factor VII donde la proporción entre la actividad
del polipéptido del Factor VII y la actividad del factor nativo VII
(FVII tipo salvaje) es aproximadamente, en contra de lo expuesto
arriba, 1,0.
La actividad de los polipéptidos del Factor VII
puede ser medida también usando un sustrato fisiológico tal como el
factor X ("ensayo de proteólisis in vitro"), de manera
adecuada a una concentración de 100-1000 nm, donde
el Factor Xa generado es medido después de la adición de un
sustrato cromogénico adecuado (por ejemplo, S-2765).
Además, el ensayo de actividad puede ser ejecutado a temperatura
fisiológica.
El Factor VII nativo (tipo salvaje) y el
polipéptido del Factor VII (ambos designados de aquí en adelante
como "Factor VII") son evaluados en paralelo para comparar
directamente sus actividades específicas. El ensayo se realiza en
una placa de microtitulación (MaxiSorp, Nunc, Dinamarca). El Factor
VII (10 nm) y el Factor X (0,8 microM) en 100 microL 50 mM de
Hepes, pH 7.4, conteniendo 0,1 m de NaCl, 5 mM de CaCl_{2} y 1
mg/ml de albúmina de suero bovino, son incubados durante 15 min. El
seccionamiento del Factor X es después detenido por la adición de 50
microL 50 mM de HEPES, pH 7.4, conteniendo 0,1 M de NaCl, 20 mM de
EDTA y 1 mg/ml de albúmina de suero bovino. La cantidad del Factor
Xa generada es medida por adición del sustrato cromogénico
Z-D-Arg-Gly-Arg-p-nitroanilida
(S-2765, Chromogenix, Suecia), concentración final
0,5 mM. La absorbencia a 405 nm es medida continuamente en un
lector de placas SpectraMax^{TM} 340 (Molecular Devices, EEUU). La
absorbencia desarrollada durante 10 minutos, después de sustracción
de la absorbencia en un pocilllo para el blanco que no contiene
FVIIa, se utiliza para calcular la proporción entre las actividades
proteolíticas del polipéptido del Factor VII y el Factor VII de tipo
salvaje:
Proporción =
(A405 nm polipéptido del Factor VII)/(A405 nm de Factor VIIa tipo
salvaje).
Basados en esto puede identificarse el
polipéptido del Factor VII con una actividad inferior, comparable,
o superior al factor VIIa nativo, tal como, por ejemplo,
polipéptidos del Factor VII donde la proporción entre la actividad
del polipéptido del Factor VII y la actividad del factor nativo VII
(tipo salvaje FVII) es aproximadamente, en contra de lo señalado
arriba, 1,0.
La capacidad del factor VIIa o de los
polipéptidos del Factor VII para generar trombina puede también ser
medida en un ensayo (ensayo 4) que comprende todos los factores
relevantes de coagulación e inhibidores a concentraciones
fisiológicas (menos el factor VIII al imitar las condiciones de
hemofilia A) y plaquetas activadas (como se describe en la p. 543
en Monroe et al. (1997) Brit. J. Haematol. 99,
542-547, que se incorpora aquí como
referencia).
La actividad de los polipéptidos del Factor VII
puede también ser medida usando un ensayo de coagulación de un solo
paso (ensayo 4) como se describe esencialmente en WO 92/15686 o US
5,997,864. Brevemente, la muestra que debe evaluarse es diluida en
50 mM Tris (pH 7.5), 0,1% BSA y 100 \mul son incubados con 100
\mul de plasma deficitario en Factor VII y 200 \mul de
tromboplastina C conteniendo 10 mM Ca^{2+}. Los tiempos de
coagulación son medidos y comparados con una curva estándar que usa
un estándar de referencia o un volumen de plasma humano normal
citrado en dilución en serie.
El Factor humano purificado VII adecuado para el
uso en la presente invención es preferiblemente hecho por
tecnología de ADN recombinante, por ej. como describen Hagen et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 2412-2416,
1986, o como se describe en la patente europea nº. 200.421
(ZymoGenetics, Inc.). El Factor VII puede ser producido también por
los métodos descritos por Broze and Majerus, J. Biol. Chem. 255 (4):
1242-1247, 1980 y Hedner and Kisiel, J. Clin.
Invest. 71: 1836-1841, 1983. Estos métodos producen
el Factor VII sin cantidades detectables de otros factores de
coagulación sanguínea. Una preparación del Factor VII incluso más
purificada puede ser obtenida mediante la inclusión de una
filtración de gel adicional como fase de purificación final. El
Factor VII es después convertido en el factor VIIa activado por
medios conocidos, por ej. por varias proteínas diferentes
plasmáticas, tales como el factor XIIa, IX a o Xa. De forma
alternativa, como describen Bjoern et al. (Research
Disclosure 269 September 1986 págs. 564-565), el
factor VII puede ser activado pasándolo a través de una columna de
cromatografía de intercambio iónico, tal como Mono Q® (Pharmacia
fine Chemicals) o similares, o por autoactivación en la
solución.
Los polipéptidos relacionados con el Factor VII
pueden ser producidos por modificación del Factor VII de tipo
salvaje o por tecnología recombinante. Los polipéptidos
relacionados con el Factor VII con secuencia de aminoácidos alterada
en comparación con el Factor VII de tipo salvaje pueden ser
producidos modificando la secuencia de ácido nucleico que codifica
el factor VII de tipo salvaje o bien alterando los codones de
aminoácidos o por eliminación de algunos codones de aminoácidos en
el ácido nucleico que codifica el factor natural VII por medios
conocidos, por ej. por mutagénesis
sitio-específica.
Será evidente para los expertos en la técnica
que las sustituciones pueden ser hechas fuera de las regiones
criticas a la función de la molécula del Factor VII y además
suponen un polipéptido activo. Los residuos de aminoácidos
esenciales para la actividad del polipéptido del Factor VII y en
consecuencia preferiblemente no sujetos a sustitución, pueden ser
identificados según procedimientos conocidos en la técnica, tales
como la mutagénesis dirigida o mutagénesis de escaneado de alanina
(véase, p. ej., Cunningham and Wells 1989, Science 244:
1081-1085). En esta última técnica las mutaciones
son introducidas en cada residuo cargado positivamente en la
molécula, y las moléculas mutantes resultantes son evaluadas en
cuanto a la actividad coagulante, respectivamente de reticulación,
para identificar residuos aminoácidos que son críticos para la
actividad de la molécula. También se pueden determinar sitios de
interacción de enzima-sustrato por análisis de la
estructura tridimensional determinado por técnicas de este tipo como
análisis de resonancia magnética nuclear, cristalografía o marcado
por fotoafinidad (véase por ej., de Vos et al., 1992,
Science 255: 306-312; Smith et al., Journal
of Molecular Biology 224: 899-904; Wlodaver et
al., 1992, FEBS Letters 309: 59-64).
La introducción de una mutación en la secuencia
de ácido nucleico para intercambiar un nucleótido por otro
nucleótido puede ser realizada por mutagénesis
sitio-dirigida usando cualquiera de los métodos
conocidos en la técnica. Particularmente útil es el procedimiento
que utiliza un vector de ADN bicatenario muy enrollado, con un
inserto de interés y dos cebadores sintéticos que contienen la
mutación deseada. Los cebadores oligonucleótidos, cada uno
complementario a cadenas opuestas del vector, se extienden durante
la variación de la temperatura mediante polimerasa Pfu ADN. Al
incorporar los cebadores se genera un plásmido mutado que contiene
mellas ajustadas. Después de la variación de la temperatura el
producto es tratado con Dpnl, que es específico para ADN metilado y
semi-metilado para digerir el molde de ADN genitor y
para seleccionar el ADN sintetizado que contiene la mutación.
Pueden ser usados también otros procedimientos conocidos en la
técnica para crear, identificar y aislar las variantes, tales como,
por ejemplo, técnicas de transposición de genes o exposición
fágica.
La separación de polipéptidos de su célula de
origen puede ser conseguida por cualquier método conocido en la
técnica, incluyendo, sin limitación, la eliminación del medio de
cultivo celular que contiene el producto deseado de un cultivo
celular adherente; centrifugado o filtración para eliminar células
no adherentes; y similares.
Opcionalmente, pueden ser purificados
adicionalmente los polipéptidos del Factor VII. La purificación
puede ser conseguida usando cualquier método conocido en la
técnica, incluyendo sin limitación, cromatografía de afinidad, tal
como por ej., en una columna de anticuerpos del
anti-Factor VII (véase, p. ej., Wakabayashi et
al., J. Biol. Chem. 261:11097, 1986; y Thim et al.,
Biochem. 27:7785, 1988); cromatografía de interacción hidrofóbica;
cromatografía de intercambio iónico; cromatografía por exclusión de
tamaño; procedimientos electroforéticos (p. ej., isoelectroenfoque
preparatorio (IEF), solubilidad diferencial (p. ej., precipitación
de sulfato amónico), o extracción y similares. Véase, generalmente,
Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag, New
York, 1982; y Protein Purification, J.C. Janson y Lars Ryden,
editores, VCH Publishers, New York, 1989. Después de la
purificación la preparación contiene preferiblemente menos de
aproximadamente el 10% en peso, más preferiblemente menos de
aproximadamente el 5% y de la forma más preferible menos de
aproximadamente el 1% de polipéptidos de no-Factor
VII derivados de la célula huésped.
Los polipéptidos del Factor VII pueden ser
activados por seccionamiento proteolítico, usando el Factor XIIa u
otras proteasas que tienen especificidad tipo tripsina, tales como
p. ej., Factor IXa, calicreína, Factor Xa, y trombina. Véase, por
ej., Osterud et al., Biochem. 11: 2853 (1972); Thomas,
patente U.S. nº. 4,456,591; y Hedner et al., J. Clin.
Invest. 71:1836 (1983). De forma alternativa, los polipéptidos del
Factor VII pueden ser activados pasándolos a través de una columna
de cromatografía de intercambio iónico, tal como la Mono Q®
(Pharmacia) o similar, o por autoactivación en solución. El
polipéptido del Factor VII activado resultante puede después ser
formulado y administrado como se describe en la presente
solicitud.
\vskip1.000000\baselineskip
La Figura 1 muestra el contenido de los
agregados de FVII y fragmentos de FVII después de 3 meses de
almacenamiento a 2-8ºC.
Los siguientes ejemplos ilustran la práctica de
la invención. Estos ejemplos son para fines ilustrativos sólo y no
están destinados de ninguna manera a limitar el ámbito de la
invención reivindicada.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
El contenido de los agregados es determinado por
la exclusión de tamaño no desnaturalizante por HPLC. El contenido
de formas oxidadas es determinado por RP-HPLC. El
contenido de formas de degradación enzimática es determinado por
RP-HPLC.
La cromatografía por exclusión de tamaño no
desnauralizante fue llevada a cabo sobre una columna para Waters
Protein Pak 300 SW, 7,5x300 mM usando 0,2 M de sulfato amónico, 5%
de 2-propanol, pH 7.0, como fase móvil. Nivel de
flujo: 0,5 ml/min. Detección: 215 nm. Carga: 25 \mug FVIIa.
Se realizó una HPLC en fase inversa sobre una
columna propia de sílice enlazada con butilo de 4,5x250 mm con un
tamaño de partícula de 5 \mum y tamaño de poro 300\ring{A}.
Temperatura de columna: 70ºC. Tampón A: 0,1% v/v ácido
trifluoracético. Tampón B: 0,09% v/v ácido trifluoracético, 80% v/v
acetonitrilo. La columna fue eluida con un gradiente lineal desde X
hasta (X+13) % B en 30 minutos. X es ajustado de modo que FVIIa
eluya con un tiempo de retención de aproximadamente 26 minutos.
Nivel de flujo: 1,0 ml/min. Detección: 214 nm. Carga: 25 \mug
FVIIa.
\newpage
Ejemplo
2
En general, las muestras de composición acuosa
de FVIIa para el análisis en estos ejemplos experimentales fueron
preparadas a partir de una solución de volumen purificada por
intercambio de tampón sobre una columna de filtración de gel. Los
aditivos de la composición estaban o bien contenidos en el tampón
de elución en sus proporciones finales o fueron añadidos al eluato.
La solución resultante fue filtrada estéril usando un filtro de
membrana esterilizado (0,2 micras de tamaño de poro o equivalente) y
llenada en viales de cristal estériles, tapados y sellados con
tapones de caucho butílico y tapas de aluminio abatibles.
Ejemplo
3
Los viales de la composición acuosa del rFVIIa
conteniendo 1,4 mg de rFVIIa/ml, 50 mM de cloruro sódico, 10 mM de
cloruro cálcico y una mezcla de 10 mM de glicilglicina, acetato e
histidina ajustados a pH 3, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0,
7.5, 8.0, 8.5, y 9.0 fueron incubados a bien una temperatura de
2-8ºC, o a temperaturas de almacenamiento elevadas
de 30ºC, y después retirados en varios puntos de tiempo y
examinados en cuanto a cambios en el pH y la estabilidad química fue
determinada por RP-HPLC y
GP-HPLC.
Después del almacenamiento a
2-8ºC durante hasta tres meses las composiciones
acuosas mostraron cambios insignificantes en el pH. La HPLC de
exclusión por tamaño no desnaturalizante realizada en muestras
almacenadas durante hasta tres meses a 2-8ºC no
mostró agregación significativa del medicamento a valores de pH
\geq 5.5 (Figura 1). La RP-HPLC realizada en estas
muestras no mostró aumento significativo en la fragmentación u
oxidación de la proteína en el rango de pH
4.5-5.5.
La Figura 1 muestra datos después de 3 meses de
almacenamiento a 2-8 grados C. El contenido inicial
de agregados es aproximadamente el 0,5% y el contenido inicial de
fragmentos es de aproximadamente el 9%.
Ejemplo
4
Los viales de la composición acuosa del rFVIIa
conteniendo 1,0 mg de rFVIIa/mL 50 mM de cloruro sódico, 10 mM de
cloruro cálcico y una de las siguientes sustancias tamponadoras en
una concentración de 10 mM de glicilglicina, ácido málico, ácido
acético, histidina, ácido glutámico y ácido cítrico fueron incubados
a temperaturas de 2-8 grados C, o a temperaturas de
almacenamiento elevadas a 30 grados C durante hasta 3 meses. El pH
fue ajustado en el tiempo cero a 5.5, puesto que este dio la
cantidad mínima de productos de degradación (Figura 1). La medición
del pH en la composición que contiene glicilglicina mostró un
aumento de hasta 6.2 durante el periodo de almacenamiento. Las
otras composiciones mostraron en el mismo periodo valores estables
de 5.5 +/- 0.1.
Ejemplo
5
Doce composiciones diferentes fueron preparadas.
Las composiciones eran:
Las concentraciones de los
detergentes/solubilizadores evaluados están indicadas en la tabla
abajo.
Las composiciones fueron preparadas a partir de
una solución de volumen líquida de rFVIIa. Se prepararon soluciones
concentradas de los detergentes/solubilizadores en tampones
conteniendo NaCl, CaCl_{2}, 2 H_{2}O, y glicilglicina en las
concentraciones declaradas arriba. El volumen del rFVIIa y las
soluciones de detergente fueron mezclados, y el pH en las
soluciones fue ajustado a 5.5. Las composiciones fueron filtradas
(0,2 \muM) y llenadas en viales (1 ml de solución por vial).
La apariencia de las composiciones fue
determinada por inspección visual y la absorbencia de la
composición fue determinada a 400 nm. Posteriormente, los viales
fueron agitados durante 19 horas (800/min) a la temperatura
ambiente. Después de completar la agitación, la apariencia y la
absorbencia fueron determinadas en 400 nm. Los resultados están
relacionados en la tabla de abajo.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados muestran que la referencia (sin
adición de ningún detergente/solubilizador) se vuelve visualmente
turbio cuando se agita, observándose un aumento significativo en la
absorbencia a 400 nm. La adición de Tween® 20 (= polisorbato 20),
Tween® 80 (= polisorbato 80), Poloxámero 188, Pluronic® F127 (=
poloxámero 407), Brij® 35 (= polioxil 23 lauril éter), y LPCM (=
\alpha-lisofasfatidilcolina miristoil) casi evitó
completamente el aumento de turbidez y absorbencia, mientras que se
observó un ligero aumento de turbidez (en comparación con la
referencia) para Myrj® 59 (= polioxil 100 estearato) y Myrj® 52 (=
polioxil 40 estearato). El glicerol, polietilenoglicol 400 o
polietilenoglicol 4000 no pudieron evitar el aumento de turbidez en
las concentraciones usadas en este experimento.
\newpage
Ejemplo
6
Tres composiciones diferentes fueron preparadas.
Las composiciones fueron:
Las composiciones fueron preparadas a partir de
una solución de volumen líquida de rFVIIa. La metionina fue
disuelta en tampones conteniendo NaCl, CaCl_{2}, 2 H_{2}O, y
glicilglicina en las concentraciones indicadas arriba. El volumen
del rFVIIa y las soluciones de metionina fueron mezcladas, y el pH
en las soluciones fue ajustado a 6.5. Las composiciones fueron
filtradas (0,2 \muM) y llenadas en viales (1 ml solución por
vial). Los viales fueron almacenados a 5ºC, 25ºC y 40ºC. Las
muestras fueron retiradas y analizadas en cuanto al contenido de
formas oxidadas (por RP-HPLC) en el momento
indicado en la tabla de abajo. La tabla muestra el contenido de
formas oxidadas (en %).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados muestran que la adición de
metionina retarda el índice de oxidación en la composición.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
7
Cuatro composiciones diferentes fueron
preparadas. Las composiciones eran:
Las composiciones fueron preparadas a partir de
una solución de volumen líquida de rFVIIa. El cloruro cálcico fue
disuelto en tampones conteniendo NaCl y glicilglicina para dar como
resultado las concentraciones indicadas arriba después de mezclar
con el volumen del rFVIIa. Después de mezclar el pH en las
soluciones fue ajustado a 7.0. Las composiciones fueron filtradas
(0,2 \muM) y llenadas en viales (1 ml de solución por vial). Los
viales fueron almacenados a 5ºC. La actividad del Factor VII (UI/ml)
fue determinada por ensayo de coágulo.
\vskip1.000000\baselineskip
Esta lista de referencias citada por el
solicitante ha sido recopilada exclusivamente para la información
del lector. No forma parte del documento de patente europea. La
misma ha sido confeccionada con la mayor diligencia; la OEP sin
embargo no asume responsabilidad alguna por eventuales errores u
omisiones.
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Claims (35)
1. Composición líquida, acuosa que comprende
- (i)
- Un polipéptido del Factor VII
- (ii)
- Un agente adecuado para mantener el pH en el rango de desde aproximadamente 4.0 hasta aproximadamente 8.0;
- (iii)
- Un agente seleccionado de la lista de: una sal cálcica, una sal magnésica, o una mezcla de las mismas, donde la concentración de (iii) es al menos 15 mM; y
- (vii)
- Un antioxidante.
2. Composición según la reivindicación 1, que
comprende además (iv) un agente modificador de fuerza iónica.
3. Composición según la reivindicación 2 donde
el agente modificador de fuerza iónica (iv) es seleccionado de la
lista de: una sal neutra, por ej., cloruro sódico; un aminoácido; o
un péptido pequeño o una mezcla de al menos dos de dichos agentes
modificadores.
4. Composición según la reivindicación 3 donde
el agente modificador de fuerza iónica (iv) es cloruro sódico.
5. Composición según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, donde el agente (iii) está presente en una
concentración de al menos aproximadamente 25 mM, tal como al menos
aproximadamente 50 mM, 100 mM, 200 mM, 400 mM, o al menos
aproximadamente 800 mM.
6. Composición según cualquiera de las
reivindicaciones 2 a 5, donde el agente (iv) está presente en una
concentración de al menos aproximadamente 5 mM, tal como al menos
aproximadamente 10 mM, 20 mM, 50 mM, 100 mM, 200 mM, 400 mM, 800
mM, 1000 mM, 1200 mM, 1500 mM, 1800 mM, 2000 mM, o al menos
aproximadamente 2200 mM.
7. Composición según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, donde la sal cálcica es seleccionada de la
lista de: cloruro cálcico, acetato cálcico, gluconato cálcico, y
levulinato cálcico.
8. Composición según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, donde la sal magnésica es seleccionada de
la lista de: cloruro magnésico, acetato magnésico, sulfato
magnésico, gluconato magnésico, y levulinato magnésico.
9. Composición según cualquiera de las
reivindicaciones 6 a 8, donde el agente (iii) es seleccionado de la
lista de: cloruro cálcico, acetato cálcico, cloruro magnésico,
acetato magnésico, sulfato magnésico, o una mezcla de los mismos; y
donde el agente modificador de fuerza iónica (iv) es cloruro
sódico.
10. Composición según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9, que comprende además (v) un agente
modificador de tonicidad.
11. Composición según la reivindicación 10,
donde el agente modificador de tonicidad (v) es seleccionado de la
lista de: una sal neutra; un mono-, di- o polisacárido; un alcohol
de azúcar; un aminoácido; o un péptido pequeño o una mezcla de al
menos dos de dichos agentes modificadores.
12. Composición según las reivindicaciones 10 u
11, donde el agente modificador de tonicidad (v) está presente en
una concentración de desde 1 mM hasta 500 mM.
13. Composición según la reivindicación 12,
donde la concentración es 10-250 mM.
14. Composición según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 13, que comprende además (vi) un surfactante
no iónico.
15. Composición según la reivindicación 14,
donde el surfactante no iónico es un polisorbato o un poloxámero o
un éter de polioxietileno alquilo tal como poloxámero 188,
poloxámero 407, polisorbato 20, polisorbato 80, o polioxi 23 lauril
éter.
16. Composición según la reivindicación 1, donde
el antioxidante (vii) es seleccionado de la lista de: L- o
D-metionina, un análogo de metionina, un péptido con
metionina, un homólogo de metionina, ácido ascórbico, cisteína,
homocisteina, glutationa, cistina, y cistationina.
17. Composición según la reivindicación 16 donde
el antioxidante es metionina, preferiblemente
L-metionina.
\newpage
18. Composición según cualquiera de las
reivindicaciones 1 y 16 a 17, donde el antioxidante está presente
en una concentración de desde aproximadamente 0,1 hasta
aproximadamente 5,0 mg/ml, tal como desde aproximadamente 0,1 hasta
aproximadamente 4 mg/ml, desde aproximadamente 0,1 hasta
aproximadamente 3 mg/ml, desde aproximadamente 0,1 hasta
aproximadamente 2 mg/ml, o desde aproximadamente 0,5 hasta
aproximadamente 2 mg/ml.
19. Composición según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 18, donde el pH es mantenido en el rango de
desde aproximadamente 4.0 hasta aproximadamente 7.0, tal como desde
aproximadamente 4.5 hasta aproximadamente 7.0, desde
aproximadamente 5.0 hasta aproximadamente 7.0, desde aproximadamente
5.5 hasta aproximadamente 7.0, o desde aproximadamente 6.0 hasta
aproximadamente 7.0.
20. Composición según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 19, donde el agente adecuado para mantener el
pH en el rango de desde aproximadamente 4.0 hasta aproximadamente
7.0 es seleccionado de la lista de ácidos y sales de: citrato,
acetato, histidina, malato, fosfato, ácido tartárico, ácido
succínico, MES, HEPES, Imidazol, TRIS, lactato, glicilglicina,
PIPES, glicina, o una mezcla de al menos dos de dichos agentes.
21. Composición según la reivindicación 20,
donde la concentración del agente es desde aproximadamente 1 mM
hasta aproximadamente 50 mM.
22. Composición según la reivindicación 2, donde
la concentración del tampón es de aproximadamente 10 mM.
23. Composición según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 22, que comprende además (viii) un
conservante, tal como fenol, alcohol bencílico,
orto-cresol, meta-cresol,
para-cresol, metil paraben, propil paraben, cloruro
de benzalconio, o cloruro de benzatonio.
24. Composición según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 23, que es isotónica.
25. Composición según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 24, que es formulada para administración
farmacéutica.
26. Composición según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 25, que es estable durante al menos 6 meses a
2-8ºC.
27. Composición según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 26, donde el polipéptido del Factor VII es el
factor humano VIIa, preferiblemente el factor humano VIIa hecho de
forma recombinante.
28. Composición según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 26, donde el polipéptido del factor VII es una
variante de secuencia del factor VII.
29. Composición según la reivindicación 28,
donde la proporción entre la actividad del polipéptido del factor
VII y la actividad del Factor humano nativo VII (FVIIa tipo
salvaje) es al menos aproximadamente 1,25, preferiblemente al menos
aproximadamente 2,0, o 4,0, de la forma más preferida al menos
aproximadamente 8,0, cuando es evaluada en el "ensayo de
proteólisis in vitro" como se describe en la presente
descripción.
30. Composición según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 29, donde el polipéptido del factor VII está
presente en una concentración de desde aproximadamente 0,1 mg/ml
hasta aproximadamente 10 mg/ml, tal como desde aproximadamente 0,5
hasta aproximadamente 5,0 mg/ml, desde aproximadamente 0,6 hasta
aproximadamente 4,0 mg/ml, o desde aproximadamente 1,0 mg/ml hasta
aproximadamente 4,0 mg/ml.
31. Método para preparar una composición líquida
acuosa de un polipéptido del factor VII que comprende la fase de
suministrar polipéptido del factor VII a una solución que comprende
(ii) un agente adecuado para mantener el pH en el rango de desde
aproximadamente 4.0 hasta aproximadamente 8.0. (iii) un agente
seleccionado de la lista de: una sal cálcica, una sal magnésica, o
una mezcla de las mismas; donde la concentración de (iii) es de al
menos 15 mM; y (vii) un antioxidante.
32. Uso de una composición según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 30 para la preparación de un medicamento
para tratar alteraciones hemorrágicas.
33. Uso según la reivindicación 3, donde dicha
alteración hemorrágica es seleccionada del grupo que consiste en
hemofilia A, hemofilia B, deficiencia del Factor XI, deficiencia
del Factor VII, trombocitopenia, enfermedad de von Willebrand,
presencia de inhibidores para factores de coagulación, cirugía,
hemorragia intracerebral, traumatismo y terapia anticoagulante.
34. Composición como se describe en cualquiera
de las reivindicaciones 1- 30 para el uso en el tratamiento de
alteraciones hemorrágicas.
35. Composición para el uso según la
reivindicación 34, donde dicha alteración hemorrágica es
seleccionada del grupo que consiste en hemofilia A, hemofilia B,
deficiencia del Factor XI, deficiencia del Factor VII,
trombocitopenia, enfermedad de von Willebrand, presencia de
inhibidores de factores de coagulación, cirugía, hemorragia
intracerebral, traumatismo y terapia anticoagulante.
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