KR20040065278A - 변경된 인자 ⅶ 폴리펩티드의 액체 조성물 - Google Patents

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KR20040065278A
KR20040065278A KR10-2004-7009306A KR20047009306A KR20040065278A KR 20040065278 A KR20040065278 A KR 20040065278A KR 20047009306 A KR20047009306 A KR 20047009306A KR 20040065278 A KR20040065278 A KR 20040065278A
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Abstract

본 발명은 (ⅰ) 변경된 인자 Ⅶ 폴리펩티드; (ⅱ) 약 4 내지 약 8의 범위의 pH를 유지하기에 적절한 작용제; (ⅲ) 항산화제; (ⅳ) 칼슘 염, 마그네슘 염 또는 그것의 혼합물의 목록에서 선택된 작용제를 포함하는 액체 수성 조성물을 제공한다.

Description

변경된 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 액체 조성물{LIQUID COMPOSITION OF MODIFIED FACTOR VII POLYPEPTIDES}
인자 Ⅶ(FⅦ), 혈장 당단백질을 포함한 혈액 응고 과정에 관련된 많은 요소들이 확인되었다. 지혈은 혈관 벽이 손상 된 후에 순환하는 혈액에 노출된 조직 인자(TF)와 전체 Ⅶ 단백질 양의 약 1%에 대응하는 양으로 혈액에 존재하는 FⅦa 사이의 복합체의 형성으로 시작한다. FⅦa 는 주로 단일 사슬 지모겐으로 혈장에 존재하고, 단일 사슬 지모겐은 FXa에 의해 2 사슬, 활성화된 형태, FⅦa로 절단된다. 재조합체 활성화된 인자 Ⅶa (rFⅦa)는 전구지혈제로 발달해 왔다.
변경된 인자 Ⅶ 분자는 응혈 인자 Ⅶ 의 유도체이고 활성 형태, 인자 Ⅶa의 촉매 활성이 감소하도록 분자(예를 들어, 촉매 부위)는 변경된 반면 조직 인자로의 결합 능력은 유지되었다. 그러한 변경된 인자 Ⅶ 분자는 WO 92/15686, WO 94/27631, WO 96/12800 및 WO 97/47651에 기술되었다. 따라서, 천연 인자 Ⅶa 분자와 유사하게, 변경된 인자 Ⅶa 는 조직 인자에 결합하지만, 천연 인자 Ⅶa와 역으로, 변경된 인자 Ⅶ 는 응혈의 외래 경로에서 후속하는 단계를 활성화하지 않을 것이다. 그 때문에, 변경된 인자 VII 는 단지 피브린 응고 형성의 억제제로 기능한다. 따라서, 트롬빈의 생성과 피브린의 후속하는 침전을 막아서, 변경된 인자 Ⅶa 분자는 혈관 손상의 치료에서 시사되어왔다(WO 97/47651).
단백질로서, 변경된 인자 VII 분자는 이량체, 올리고머 및 중량체의 형태로 용해성 또는 비용해성 응집체의 형성과 같은 변성과 응집을 포함한 물리적 분해와 예를 들어, 가수분해, 탈아미노화 및 산화를 포함한 화학적 분해가 되기 쉽다. 전체적인 결과는 변경된 인자 VII 분자의 활성 상실, 독성과 면역성 분해 산물의 형성, 분해된 변경된 인자 VII 분자의 주입시 혈전증을 도입하는 심각한 위험, 주사에 사용되는 바늘이 막힘 및 비동질성이다. 따라서, 변경된 인자 Ⅶ를 포함하는 약제의 안전성과 효능은 변경된 인자 VII의 안정성과 직접 관련되어 있다. 따라서, 변경된 인자 VII 분자를 포함하는 조성물은 안정화될 필요가 있다. 특히 프리저가 필요없이 변경된 인자 Ⅶ 를 포함하는 약제를 저장하고 다루기 위한 필요가 있고 조성물은 사용전에 적어도 6개월같이 연장된 기간동안 저장될 수 있다.
저장과 송달에 적절한 변경된 인자 Ⅶa의 종결된 투여 형태를 가지는 것이 바람직하다. 이상적으로, 약물 생성물은 액체로서 저장되고 투여된다. 대안적으로, 약물 생성물은 동결건조 즉, 프리즈-드라이되고 그다음 환자에 사용하기 바로 전에 적절한 희석제를 첨가하여 재구성한다. 이상적으로, 약물 생성물은 장기간 즉, 6달 이상 저장에서 유지되도록 충분한 안정성을 가진다.
종결된 약물 생성물을 액체로 유지할 것인지 혹은 동결건조할 것인지의 결정은 대개 그러한 형태로 있는 단백질 약물의 안정성을 근거로 한다. 단백질 안정성은 이온 강도, pH, 온도, 동결/해동의 반복된 싸이클 및 전단 응력에 노출과 같은 인자에 의해 영향을 받을 수 있다. 활성 단백질은 변성과 응집( 용해성과 비용해성 응집 형태)을 포함한 물리적 불안정성과 소수를 지명할 수 있는 예를 들어 , 가수분해, 탈아미노화 및 산화를 포함한 화학적 불안정성의 결과로서 손실된다. 단백질 약물의 안정성의 일반적인 검토를 위해 예를 들어, Manning, et al., Pharmaceutical Research 6: 903-918 (1989) 참조.
단백질 불안정성의 가능한 발생이 널리 인정받는 반면, 특정 단백질의 특정 불안정성 문제를 예측하는 것은 불가능하다. 이러한 불안정성으로 낮은 활성, 증가한 독성 및/또는 증가한 면역원성을 갖는 단백질 부산물 또는 파생물이 형성된다. 실지로, 단백질 침전으로 혈전증, 투여 형태와 양이 비동질하고 막힌 주사기에 이른다. 게다가, 예를 들어, N-말단에서 어떤 글루탐산 잔기의 감마카르복실화와 탄순화물 곁가지의 첨가와 같은 번역후 변경은 저장시 변경에 민감한 잠재적 부위를 제공한다. 따라서, 단백질 조성물의 안정성과 효능은 안정성과 직접 관련이 있다. 분자적 움직임에 대해 매우 증가된 가능성과 따라서 분자 상호작용의 증가된 가능성 때문에 액체 형태에서 안정성을 유지하는 것은 일반적으로 동결건조된 형태와 다르다. 농축된 형태로 안정성을 유지하는 것은 증가한 단백질 농도에서 응집 형태에 대한 경향때문에 또한 다르다.
액체 조성물을 개발할 때, 많은 인자가 고려된다. 짧은 기간 즉, 6개월 이하동안 액체 안정성은 일반적으로 변성과 응집과 같은 전체 구조적 변화를 회피하는 것에 의존한다. 이러한 과정은 많은 단백질에 대한 문헌에 기술되어 있고 안정제의 많은 예가 존재한다. 하나의 단백질을 안정시키는데 효과적인 작용제는 실제로 또다른 것을 불안정화시키는 데 작용하는 것으로 알려져 있다. 단백질이 전체 구조적 변화에 대해 안정되면, 장기간 안정성(예를 들어, 6개월 이상)을 가진 액체조성물을 개발하는 것은 그 단백질에 특이적인 분해 유형으로부터 단백질을 안정화시키는 것에 더 의존한다. 분해의 더 특이적인 유형은 예를 들어, 이황 결합 혼합, 특정 잔기의 산화, 탈아미노화, 고리화를 포함한다. 각 분해 종류를 지적하는 것은 항상 가능하지 않지만, 특이 부형제가 해당 단백질만을 안정화시키는 능력을 조정하기 위해 미약한 변화를 조정하기 위한 검정이 개발되었다.
안정성을 고려하는 것에 추가로, 일반적으로 다양한 세계 의료 조정 기관에 의해 승인된 부형제를 선택한다. 조성물의 pH는 주사/주입시 생리적으로 적절한 범위에 있는 것이 바람직하며 그렇지 않으면 환자의 고통과 불안이 초래한다.
단백질 조성물의 일반적인 검토를 위해 예를 들어, Cleland et al.을 참조: The development of stable protein compositions: A closer look at protein aggregation, deamidation and oxidation, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 1993,10(4): 307-377; and Wang et al., Parenteral compositions of proteins and peptides: Stability and stabilizers, Journal of Parenteral Science and Technology 1988 (Supplement), 42(2S).
단백질의 안정화에 대해 해당하는 다른 공개는 다음과 같다.
U. S. 20010031721 A1 (American Home Productss)은 고도로 농축된 ,동결건조된 그리고 액체인 인자 IX 조성물과 관련된다.
U. S. 5,770, 700 (Genetics Institute)은 액체인자 IX 조성물과 관련된다.
WO 97/19687 (American Red Cross)은 혈장 단백질의 액체조성물, 특히 인자 Ⅷ와 인자 IX와 관련된다.
U. S. 4,297, 344 은 글리신, 알라닌, 하이드록시프롤린, 글루타민 및 아미노부티릭산과 같은 선택된 아미노산과 단당류, 올리고당 또는 당 알코올과 같은 탄수화물을 첨가하여 열에 대해 응혈 인자 Ⅱ와 VIII, 항 트롬빈 III 및 플라스미노겐의 안정화를 개시한다.
변경된 인자 Ⅶa에 대한 수성 조성물의 발달은 복원 오차를 제거하는 잇점을 가지므로 투여 정확성을 증가시키고 생성물의 사용을 임상적으로 단순화시켜 환자의 순응을 증가시킨다. 이상적으로, 변경된 인자 Ⅶa의 조성물은 넓은 범위의 단백질 농도에 대해 6 개월 이상동안 안정해야 한다. 이는 투여 방법이 융통적으로 되게 한다. 일반적으로, 더 고도로 농축된 형태는 적은 부피의 투여를 가능하게 하고 이는 환자의 관점에서 매우 바람직하다. 액체 조성물은 투여와 사용의 용이함 측면에서 동결 건조된 생성물에 대해 잇점을 가진다.
오늘날 변경된 인자 Ⅶ는 -80 ℃에서 저장될 필요가 있는 액제 제제로 제공될 수 있다.
따라서, 변경된 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 안정성을 향상하고 2 내지 8 ℃ 에서 6개월 이상 동안 연장된 저장에 적합한 액체 조성울을 제공하기 위한 방법에 대한 필요가 당업계에 있다. 따라서, 본 발명의 목적은 분해 생성물의 수용가능한 조정을 제공하는 수성 변경된 인자 Ⅶ 폴리펩티드 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 개요
본 발명자는 약 4 내지 약 8의 pH 범위로 유지하기에 적절한 작용제와 함께 수성 용액에서 제제되었을 때 변경된 인자 VII 또는 그것의 유사체("변경된 인자 Ⅶ 폴리펩티드"), 항산화제 및 칼슘염은 물리적으로 또는 화학적으로 안정하다는 것을 발견하였다.
한 양태에서, 본 발명은 (i) 변경된 인자 VII 폴리펩티드, (ii) 약 4.0 내지 약 8.0 범위의 pH를 유지하기에 적절한 작용제 및; (iii) 항산화제; (ⅳ) 칼슘 염, 마그네슘 염 또는 그것의 혼합물의 목록에서 선택된 작용제를 포함하는 액체수성 조성물을 제공한다.
다른 구체예에서, pH 는 약 4.5 내지 약 7.0, 약 5.0 내지 약 7.0, 약 5.5 내지 약 7.0, 또는 약 6.0 내지 약 7.0 와 같은 약 4.0 내지 약 7.0 의 범위에서 유지된다.
한 구체예에서, 항 산화제는 D- 또는 L-메티오닌; 메티오닌 유사체; 메티오닌-함유 펩티드; 메티오닌-상동체; 아스코르브산; 시스테인; 호모시스테인; 글루타치온; 시스틴 및 시스타치온; 바람직하게 항산화제는 L-메티오닌이다.
다른 구체예에서, 항산화제는 약 1.0 내지 약 4 mg/ml; 약 0.1 내지 약 3 mg/ml, 약 0.1 내지 약 2 mg/ml 또는 약 0.5 내지 약 2 mg/ml과 같은 약 0.1 내지 약 5.0 mg/ml의 농도로 존재한다.
추가 구체예에서, 조성물은 추가로 (v) 장도(tonicity) 변경제를 포함한다.한 구체예에서, 장도 변경제 (v)는 중성염; 단당류, 이당류 또는 다당류; 당 알코올; 아미노산; 또는 작은 펩티드 또는 상기 변경제의 적어도 두개의 혼합물의 목록에서 선택된다. 한, 바람직한 구체예에서, 장도 변경제는 만니톨 또는 중성염, 바람직하게 염화 나트륨이다. 한 구체예에서, 장도 변경제 (v)는 약 10 -250 mM 과 같은 약 1 내지 약 500 mM의 농도로 존재한다.
추가 구체예에서, 조성물은 추가로 (vi) 비이온 표면활성제를 포함한다.
한 구체예에서, 비이온 표면활성제(vi)는 중량으로 약 0.005 내지 약 2.0% 의 양으로 존재한다. 한 구체예에서, 비이온 표면활성제는 폴리소르베이트 또는 폴록사머이거나; 폴록사머 188, 폴록사머 407, 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80 또는 폴리옥시 23 라우릴 에테르와 같은 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르이다.
약 4.0 내지 약 8.0 의 범위에서 pH 를 유지하기에 적절한 작용제는: 시트레이트, 아세테이트, 히스티딘, 말레이트, 포스페이트, 타르타르산 ,숙신산, MES, HEPES, 이미다졸, TRIS, 락테이트, 글리실-글리신, PIPES, 글리신의 산과 염 또는 상기 완충제 중 적어도 2가지의 혼합물의 목록에서 선택된 완충제이다. 한 구체예에서, 작용제(ⅱ)의 농도는 10 mM과 같은 약 1mM 내지 약 50mM 이다.
한 구체예에서, 칼슘 및/또는 마그네슘 염(작용제 (iv))는 약 5 mM 내지 약 100 mM, 약 5 mM 내지 약 50 mM, 약 10 mM 내지 약 50 mM 과 같은 약 5 mM 내지 약 150 mM의 농도로 존재한다.
바람직한 구체예에서, 칼슘 염은 염화 칼슘, 아세트산 칼슘, 글루콘산 칼슘 및 래불레이트 칼슘의 목록에서 선택된다. 다른 구체예에서, 마그네슘 염은 염화마그네슘, 아세트산 마그네슘, 황산 마그네슘, 글루콘산 마그네슘, 래불레이트 마그네슘염의 목록에서 선택된다.
추가 구체예에서, 조성물은 페놀, 벤질알코올 오르쏘-크레졸, 메타-크레졸, 파라-크레졸, 메틸 파라벤, 프로필 파라벤, 염화 벤즈알코늄 및 염화 벤즈에토늄과 같은 (vii)방부제를 더 포함한다.
한 구체예에서, 조성물은 등장성이다. 한 구체예에서, 조성물은 약학적 투여를 위해 제제된다. 한 구체예에서, 조성물은 2-8℃ 에서 적어도 6개월동안 안정하고 /또는 안정화된다.
한 구체예에서, 변경된 인자 Ⅶ 폴리펩티드는 본 명세서에 기술된 바와 같은 하나 또는 그 이상의 응고 검정, 단백질 용해 검정, 또는 TF 결합 검정에서 시험하였을 때 야생형 인자 Ⅶa의 특이적 활성의 약 25% 이하, 바람직하게 약 10% 이하, 더 바람직하게 약 5% 이하, 가장 바람직하게 약 1% 이하인 야생형 인자 Ⅶa에 관한 생물학적 활성을 가진다.
일련의 구체예에서, 변경된 인자 Ⅶ 폴리펩티드는 활성 부위 잔기 Ser344 가 변경되고 Gly, Met, Thr 또는 더 바람직하게 Ala로 치환된 인간과 소인자 Ⅶ; 잔기 Lys341가 치환된 인간 인자 Ⅶ; 잔기 Asp242 가 치환된 인간 인자 Ⅶ; 잔기 His193 가 치환된 인간 인자 VII; FVII-(K341A); FVII-(S344A); FVII-(D242A) ;FVII-(H193A); 펩티드클로로메틸케톤 또는 펩티딜클로로 메탄; 아자펩티드; 다양한 구아니디노벤조에이트 유도체와 3-알콕시-4-클로로이소코우마린과 같은 아실화제; 페닐메틸설포닐플루오라이드(PMSF)와 같은 설포닐 플루오라이드; 디이소프로필플루오로포스페이트(DFP);토실프로필클로로메틸 케톤(TPCK); 토실이실클로로메틸 케톤(TLCK); 니트로페닐설포네이트; 이소코우마린과 코우마린과 같은 헤테로고리 프로테아제 억제제; L-Phe-Phe-Arg 클로로메틸 케톤, D-Phe-Phe-Arg 클로로메틸 케톤, L-Phe-Pro-Arg 클로로메틸 케톤, D-Phe-Pro-Arg 클로로메틸 케톤, L-Glu-Gly-Arg 클로로메틸 케톤, D-Glu-Gly-Arg 클로로메틸 케톤, Dansyl-L-Phe-Phe-Arg 클로로메틸 케톤, Dansyl-D-Phe-Phe-Arg 클로로메틸 케톤, Dansyl-L-Phe-Pro-Arg 클로로메틸 케톤, Dansyl-D-Phe-Pro-Arg 클로로메틸 케톤, Dansyl-L-Glu-Gly-Arg 클로로메틸 케톤 및 Dansyl-D-Glu-Gly-Arg 클로로메틸 케톤의 목록에서 선택된 시약과의 반응에 의해 활성 부위에서 변경된 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 목록에서 선택된다.
바람직한 구체예에서, 변경된 인자 Ⅶ 폴리펩티드는 FⅦ-(S344A); FⅦ-(H193A); L-Phe-Phe-Arg 클로로메틸 케톤, D-Phe-Phe-Arg 클로로메틸 케톤, L-Phe-Pro-Arg 클로로메틸 케톤, D-Phe-Pro-Arg 클로로메틸 케톤, L-Glu-Gly-Arg 클로로메틸 케톤, D-Glu-Gly-Arg 클로로메틸 케톤, Dansyl-L-Phe-Phe-Arg 클로로메틸 케톤, Dansyl-D-Phe-Phe-Arg 클로로메틸 케톤, Dansyl-L-Phe-Pro-Arg 클로로메틸 케톤, Dansyl-D-Phe-Pro-Arg 클로로메틸 케톤, Dansyl-L-Glu-Gly-Arg 클로로메틸 케톤 및 Dansyl-D-Glu-Gly-Arg 클로로메틸 케톤, 클로로메틸 케톤, Dansyl-D-Phe-Pro-Arg 클로로메틸 케톤, Dansyl-L-Glu-Gly-Arg 클로로메틸 케톤 및 Dansyl-D-Glu-Gly-Arg 클로로메틸 케톤의 목록에서 선택된 시약과 반응에 의해 활성 부위에서 변경된 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 목록에서 선택된다.
일련의 구체예에서, 변경된 인자 Ⅶ 폴리펩티드는 약 0.5 내지 약 10 mg/ml,약 0.5 내지 약 5.0mg/ml, 또는 약 1.0mg/ml 내지 5.0mg/ml와 같은 약 0.1 mg/ml 내지 약 15 mg/ml의 농도로 존재한다.
다른 양태에서, 본 발명은 (ⅱ) 약 4 내지 약 8의 범위의 pH를 유지하기에 적절한 작용제; (ⅲ) 항산화제; (ⅳ)칼슘 염, 마그네슘 염 또는 그것의 혼합물의 목록에서 선택된 작용제를 포함하는 용액에서 변경된 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 제공하는 것을 포함하는, 변경된 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 액체 수성 조성물을 제조하기 위한 방법을 제공한다.
다른 양태에서, 본 발명은 응혈을 억제하기 위한 약제를 제조하기 위한 조성물의 사용과 관련된다. 다른 양태에서, 본 발명은 조직 인자 중재된 반응의 억제를 위한 약제를 제조하기 위한 조성물의 사용과 관련된다.
다른 양태에서, 본 발명은 시험체에서 응혈을 억제하기 위한 방법과 관련되고, 이 방법은 (i) 변경된 인자 VII 폴리펩티드, (ii) 약 4.0 내지 약 8.0 범위의 pH 로 유지하기에 적절한 작용제; (iii) 항산화제; (ⅳ)칼슘 염, 마그네슘 염 또는 그것의 혼합물의 목록에서 선택된 작용제를 포함하는 수성 액체 조성물의 효과적인 양을 그것이 필요한 시험체에 투여하는 것을 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명은 시험체에서 조직 인자 중재된 반응을 억제하기 위한 방법과 관련되고, 이 방법은 (i) 변경된 인자 VII 폴리펩티드, (ii) 약 4.0 내지 약 8.0 범위의 pH 로 유지하기에 적절한 작용제; (iii) 항산화제; (ⅳ)칼슘 염, 마그네슘 염 또는 그것의 혼합물의 목록에서 선택된 작용제를 포함하는 수성 액체 조성물의 효과적인 양을 그것이 필요한 시험체에 투여하는 것을 포함한다.
다른 구체예에서, 원하지 않는 응혈은 혈관성형술, 깊은 정맥 혈전증, 폐 색전증, 뇌중풍, 산재성 혈관내 응고(DIC), 예를 들어, 그람 음성 내독소혈증과 관련된 폐 및/또는 신장에서 조직 내 피브린 침전 및 심장근육 경색증으로 구성된 군에서 선택된 상태와 관련되어 있다.
다른 구체예에서, 조직 인자 중재된 반응은 전신 염증 반응 증후군(SIRS), 급성 호흡 질병 증후군(ARDS), 다장기부전(MOF), HUS, 및 TTP로 구성된 군에서 선택된 상태와 관련되어 있다.
본 발명은 변경된 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 함유하는 액체 수성 조성물과 그러한 조성물을 만들고 사용하기 위한 방법과 관련된다. 더 구체적으로, 본 발명은 화학적 및/또는 물리적 분해에 대해 안정화된 액체 조성물과 관련된다.
본 발명에 따른 조성물은 유용하고 안정하며 바람직하게 변경된 인자 VII 폴리펩티드를 사용하기에 준비된 조성물이다. 조성물은 2 내지 8 ℃ 범위의 온도에서 저장될 때 적어도 6달 그리고 바람직하게 36 달까지 안정하다. 조성물은 화학적으로 및/또는 물리적으로 안정하며 특히 2 내지 8 ℃에서 적어도 6달 동안 저장될 때 화학적으로 안정하다.
"안정한"은 2 내지 8 ℃에서 6 달 동안 저장한 후, 조성물이 WO 92/15686에 기술된 바와 같이 특히 경쟁 응혈 검정(실시예II) 또는 본 명세서에 기술된 바와 같이 검정 5 내지 8의 하나 또는 그 이상(하기 "검정" 부분 참조)으로 측정한 바와 같이 초기 생물학적 활성의 적어도 50% 를 유지하는 것을 의미한다. 바람직하게, 안정한 조성물은 2 내지 8 ℃에서 6 달 동안 저장한 후 초기 생물학적 활성의 적어도 80% 를 유지한다.
용어 "물리적으로 안정한"은 시각적으로 맑게 남아있는 조성물을 지정한다.조성물의 물리적 안정성은 다양한 시간 동안 다른 온도에서 조성물을 저장한 후 시각적 검사와 혼탁도를 수단으로 평가된다. 조성물의 시각적 검사는 어두운 배경에서 정확하게 초점이 맞춰진 빛에서 수행된다. 조성물은 시각적 혼탁도를 보일 때 물리적으로 불안정한 것으로 분류된다.
용어 변경된 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 "물리적 안정성"은 변경된 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 2량체, 올리고머 및 폴리머 형태와 분자의 구조적 변형과 변성의 형태로 비용해성 및/또는 용해성 응집의 형성과 관련된다.
용어 "화학적으로 안정한"은 WO 92/15686에 기술된 바와 같이 실질적으로 경쟁 응혈 검정 또는 본 명세서에 기술된 바와 같이 검정 5 내지 8의 하나 또는 그 이상(하기 "검정" 부분 참조)으로 측정한 바와 같이 2 내지 8 ℃에서 6 달 동안 저장한 후 초기 생물학적 활성의 적어도 50%를 유지하는 조성물을 지정한다
용어 "화학적 안정성"은 가속된 조건에서 용해된 또는 고체 상태에서 저장시에 변경된 인자 Ⅶ 폴리펩티드에서 화학적 변화의 형성과 관련된다. 예는 가수분해, 탈아미노화 및 산화이다. 특히, 황 함유 아미노산은 대응 설폭사이드의 형성과 함께 산화되기 쉽다.
조성물은 변경된 인자 Ⅶ 폴리펩티드, 항산화제, 칼슘 및/또는 마그네슘이온, 완충제및, 선택적으로, 장도 변경제를 포함한, 변경된 인자 VII 폴리펩티드를 더 안정화하는 다른 부형제를 포함한다. 변경된 인자 Ⅶ 폴리펩티드 농도는 약 0.1 내지 약 15 mg/mL 의 범위이다.
여기에서 사용된 바와 같이, 용어 "장도 변경제"는 용액의 삼투압에 기여하는 작용제를 포함한다. 장도 변경제는, 제한되지 않고, 아미노산; 작은 펩티드(예를 들어, 2 내지 5 아미노산 잔기를 가지는); 중성염; 단당류 또는 이당류; 다당류; 당 알코올 또는 상기 변경제의 적어도 2가지의 혼합물을 포함한다. 장도 변경제의 예는 제한되지 않고, 염화 나트륨, 염화 칼륨, 시트레이트 나트륨, 수크로스, 글루코스, 글리실글리신 및 만니톨을 포함한다. 정상적으로, 변경제는 존재하는 다른 성분에 따라 약 1 내지 약 500 mM; 약 1 내지 약 300 mM; 약 10 내지 약 200 mM; 또는 약 20 내지 약 150 mM의 농도로 존재한다. 예를 들어, 염화 나트륨 또는 염화 칼륨과 같은 중성염이 사용된다. "중성 염"은 수성 용액에서 용해되었을 때 산이나 염기가 아닌 염을 의미한다.
용어 "약 4.0 내지 약 8.0 범위에서 pH를 유지하기에 적절한 작용제"는 약 4.0 내지 약 7.0, 약 4.5 내지 약 7.0, 약 5.0 내지 약 7.0, 약 5.0 내지 약 6.5, 약 5.5 내지 약 7.0, 약 5.5 내지 약 6.5, 약 6.0 내지 약 7.0, 약 5.0 내지 약 6.0, 약 6.4 내지 약 6.6 또는 약 6.5, 약 5.2 내지 약 5.7 또는 약 5.5와 같이 약 4.0 내지 약 8.0 의 수용가능한 범위에서 용액 pH를 유지하는 작용제를 포함한다. 용어는 "완충제"와 상호교환적으로 사용된다. 이것은 제한되지 않고, 시트레이트 (나트륨 또는 칼륨), 아세테이트(암모늄, 나트륨 또는 칼슘), 히스티딘(L-히스티딘 ), 말레이트, 포스페이트(나트륨 또는 칼륨), 타르타르산, 숙신산, MES, HEPES, 이미다졸, TRIS, 락테이트, 글루탐산, 글리실글리신, PIPES, 글리신의 산과 염 또는 상기 완충제 중 적어도 2가지의 혼합물을 포함한다. 버퍼 농도 범위는 용액의 바람직한 pH를 유지하도록 선택된다. 완충제는 적어도 2개의 완충제의 혼합물이며,혼합물은 구체적 범위에서 pH 값을 제공할 수 있다. 대안적 구체예에서, 버퍼 농도는 약 1 mM 내지 100 mM; 1 mM 내지 약 50 mM; 약 1 mM 내지 약 25 mM; 약 2 mM 내지 약 20 mM; 또는 약 10 mM의 범위에 있다.
선택적으로, 조성물은 또한 표면활성제 또는 계면활성제를 함유한다. "표면활성제" 또는 "계면활성제"는 일반적으로 단백질을 대기/용액 경계면 유도된 스트레스와 용액/표면 유도된 스트레스(예를 들어, 단백질 응집을 형성)으로부터 보호하는 작용제를 포함한다. 계면활성제는 바람직하게 제한되지 않고, 폴리소르베이트 20 또는80과 같은 폴리소르베이트(예를 들어 Tween®); 폴록사머 188 또는407과 같은 폴리옥시 에틸렌 알킬 에테르 또는 폴록사머(예를 들어, pluronic®polyols) 및 다른 에틸렌/폴리프로필렌 블락 폴리머 또는 PEG8000과 같은 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함하는 비이온 계면활성제이다. 존재하는 표면활성제의 양은 약 0.005 내지 약 2.0% 범위이다.
선택적으로, 조성물은 항산화제를 포함한다. 항산화제는 제한되지 않고, 아스코르브산, 시스테인, 호모시스테인, 시스테인, 시스타치온, 메티오닌, 글루타치온 및 시스테인 또는 메티오닌을 함유하는 다른 펩티드, 특히 2 내지 5 아미노산 잔기가 있는 펩티드(적어도 하나의 잔기는 메티오닌 또는 시스테인 잔기; 메티오닌, 특히 L-메티오닌이 바람직한)을 포함한다. 항산화제는 0.1 내지 4, 0.1 내지 3, 0.1 내지 2 또는 0.5 내지 2mg/ml와 같은 0.1 내지 5 mg/ml의 농도에서 포함된다.
방부제는 또한 조성물에 포함되어 미생물 성장을 방해하고 FVII 폴리펩티드의 "다중 사용" 패키징을 허용한다. 방부제는 페놀, 벤질알코올 오르쏘-크레졸, 메타-크레졸, 파라-크레졸, 메틸 파라벤, 프로필 파라벤, 염화 벤즈알코늄 및 염화 벤즈에토늄을 포함한다. 방부제는 보통 pH 범위와 방부제의 유형에 따라 0.1 내지 20 mg/ml의 농도에서 포함된다. 선택적으로, 조성물은 또한 탈아미노화를 억제할 수 있는 작용제를 포함한다.
여기에서 사용된 바와 같이, 구체화된 양은 ± 약 10%인 것으로 이해된다. 예를 들어, 약 50 mM은 50 mM ±5 mM를 포함한다; 예를 들어, 4% 는 4% ± 0.4%, 등이다.
용액에 용해된 고체와 용액으로 혼합된 액체를 말할 때 퍼센트는 (중량/중량)이다. 예를 들어, Tween에서, 이는 용액의 100% 스탁/중량의 중량이다.
용어 "등장성"은 즉, 약 300±50 milliosmol/kg에서 "혈청과 함께 등장성"을 의미한다. 장도은 투여 전에 용액의 삼투압을 측정하는 것을 의미한다.
용어 "약학적으로 효과적인 양" 또는 "효과적인 양"은 원하는 반응을 달성하기 위해 투여량을 적정하는 적임의 숙련인이 결정한 효과적인 투여량이다. 투여량을 고려할 때 필요한 인자는 효능, 생체이용율, 원하는 약동학 /약역학 프로필, 치료 조건, 환자-관련된 인자(예를 들어 체중, 건강, 나이, 등), 공동 투여 약물(예를 들어, 항응고제)의 존재, 투여 시간 또는 의료 수련가에게 알려진 다른 인자를 포함한다.
용어 "치료"는 질병, 상태 또는 질환을 치료할 목적으로 시험체, 예를 들어 포유동물, 특히 인간의 관리와 간호로 정의되며 증상 또는 합병증의 시작을 방지하기 위해 변경된 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 투여, 또는 증상 또는 합병증의 완화 또는 질병, 조건 또는 질환을 제거를 포함한다. 변경된 인자 VII 폴리펩티드를 함유하는 본 발명에 따른 약학적 조성물은 그러한 치료가 필요한 시험체에 비경구적으로 투여된다. 비경구 투여는 주사기, 선택적으로 펜과 같은 주사기를 수단으로 피하, 근육내 또는 정맥내 주사로 수행된다. 대안적으로, 비경구 투여는 주입 펌프를 수단으로 수행될 수 있다.
사용 방법:
야생형 인자 Ⅶ 에 대한 실질적으로 감소된 생물활성을 가지는 변경된 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 포함하는 본 발명의 제조물은 예를 들어 혈관성형술 또는, 혈전증 또는 예를 들어 restenosis에서 발생하는 것과 같이 혈관의 막힘의 위험을 증가시키는 다른 수술적 과정을 받은 환자에서처럼 항응고제로서 사용된다. 항응고제가 처방되는 다른 의료적 지시는 제한없이 깊은 정맥 혈전증, 폐 색전증, 뇌중풍, 산재성 혈관내 응고(DIC), 예를 들어, 그람 음성 내독소혈증과 관련된 폐 및/또는 신장에서 조직 내 피브린 침전 및 심장근육 경색증; 급성 호흡 질병 증후군(ARDS), 전신 염증 반응 증후군(SIRS), 용혈 요독 증후군(HUS), MOF 및 TTP로 구성된 군에서 선택된 상태와 관련되어 있다.
본 발명에 따라 제제된 인자 VII 폴리펩티드:
용어 "인간 인자 VII" 또는 "FVII"는 천연 자원 추출과 정제 및 재조합체 세포 배양 시스템을 포함한 방법에 의해 생산된 인간 인자 Ⅶ를 지정한다. 이것의 서열과 특징은 예를 들어, US 특허 No. 4,784, 950에 설명되어 있다. 용어 "인자Ⅶ"는 절단되지 않은(지모겐) 형태의 Ⅶ폴리펩티드와 단백질 분해적으로 공정되어 인자 Ⅶa로 지정된 각 생체활성적 형태를 생성하는 것들을 포함한다. 전형적으로, 인자 Ⅶ는 잔기 152와 153 사이에서 절단되어 인자 Ⅶa를 생성한다. 용어 "인자 Ⅶ"는 제한없이 야생형 인간 인자 Ⅶ의 아미노산 서열 1-406 (미국 특허 No. 4,784, 950에 개시된)을 가진 폴리펩티드와 소, 돼지, 고양이, 쥐과 동물, 연어 인자 Ⅶ과 같은 다른 종에서 유래한 야생형 인자 Ⅶ, 혈액 또는 혈장에서 유래하였거나 재조합체 수단으로 생산된 상기 인자 Ⅶ를 포함한다. 이는 개인마다 존재하고 발생하는 인자 Ⅶ의 자연적 대립 변이체를 더 포함한다. 또한, 글리코실레이션 또는 다른 번역 후 변경의 정도와 위치는 선택된 숙주 세포와 숙주 세포 환경의 성질에 따라 달라진다.
여기서 사용된 바와 같이, "변경된 인자 Ⅶ 폴리펩티드"는 제한없이 인자 Ⅶa 생물 활성이 야생형 인간 인자 Ⅶa의 활성에 관하여 변경되거나 감소된 폴리펩티드를 포함한다. 이러한 폴리펩티드는 제한없이, 화학적으로 변경된 인자 Ⅶ 또는 인자 Ⅶa 와 폴리펩티드의 생체활성을 변경 또는 파괴하는 하나 또는 그 이상의 특이적 아미노산 서열 변경이 도입된 인자 Ⅶ 변이체를 포함한다. 용어는 인자 Ⅶ의 아미노산 서열 변이체의 치환, 삭제 및 삽입 또는 후번역 변경을 포함한다. 야생형 인자 Ⅶ보다 실질적으로 변경된 또는 감소된 생물활성을 나타내는 변경된 인자 Ⅶ는 제한없이 인간 인자 Ⅶ에 괸해 화학적으로 변경되고/또는 인간 인자 Ⅶ에 관해 하나 또는 그 이상의 아미노산 서열 변경(즉, 인자 Ⅶ 변이체) 및/또는 인간 인자 Ⅶ에 관해 절단된 아미노산 서열을 함유하는(즉, 인자 Ⅶ 단편) 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 포함한다.
변경된 인자 Ⅶ는 N-말단 아미노산 삭제 또는 첨가를 포함하는 변경된 N-말단을 가지는 폴리펩티드를 포함한다.
야생형 인자 Ⅶa 에 관한 실질적으로감소된 생물학적 활성을 가지는, 변이체를 포함한 변경된 인자 Ⅶ 폴리펩티드는 검정 1 내지 4 (하기 "검정" 참조)에 기술된 바와 같은 하나 또는 그 이상의 응고 검정, 단백질 용해 검정, 또는 TF 결합 검정에서 시험하였을 때 같은 세포 유형에서 생산된 야생형 인자 Ⅶa의 특이적 활성의 약 25% 이하, 바람직하게 약 10% 이하, 더 바람직하게 약 5% 이하, 가장 바람직하게 약 1% 이하인 야생형 인자 Ⅶa에 관한 생물학적 활성을 가진다.
여기서 사용된 바와 같이, 용어 "변경된 인자 Ⅶ 폴리펩티드"는 적어도 하나의 변경을 가지는 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 의미하며 이 변경은 혈장 인자 Ⅹ 또는 인자 Ⅸ를 활성화하기 위해 변경된 인자 Ⅶ의 능력을 실질적으로 억제한다. 이는 제한 없이 실질적으로 감소된 촉매 활성과 이것의 단편을 가지는 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 포함한다. 활성화된 인자 Ⅶ 폴리펩티드는 높은 친화력과 특이성으로 조직 인자에 결합하지만 응혈을 개시하지 않는다. 용어"촉매적으로 비활성 인자 Ⅶ 폴리펩티드"," 비활성 인자 Ⅶ 폴리펩티드" 또는 "FⅦai"는 " 변경된 인자 Ⅶ 폴리펩티드" 또는 "변경된 인자 Ⅶ"와 상호교환적으로 사용된다.
발명의 한 구체예에서, 변경된 인자 VII 폴리펩티드는 본 명세서에 기술된 바와 같은 하나 또는 그 이상의 TF 결합 검정에서 시험하였을 때 야생형 인자 Ⅶa의 특이적 TF-결합 친화성의 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 100%, 적어도 약 110%, 적어도 약 120%, 또는 적어도 약 130%를 나타내는 것을 포함한다. 바람직한 구체예에서, TF 길항제는 야생형 인자 Ⅶa 의 결합 친화도의 적어도 약 75%를 나타낸다. 여기에서 사용된 바와 같이 용어 "TF 결합 활성"은 FⅦa 폴리펩티드 또는 TF 길항제가 재조합체 인간 1251-FⅦa 가 세포 표면 인간 TF에 결합하는 것을 억제하는 능력을 의미한다. TF 결합 활성은 검정 3 ( 본 명세서의)에 기술된 바와 같이 측정된다.
다른 구체예에서, 변경된 인자 VII 폴리펩티드는 본 명세서의 검정 1 내지 4 에 기술된 바와 같은 하나 또는 그 이상의 응고 검정 또는 단백질용해 검정에서 시험하였을 때 야생형 인자 Ⅶa의 특이적 활성의 약 25% 이하, 더 바람직하게 약10% 이하, 또는 5%, 또는 3%, 또는 2%, 및 가장 바람직하게 약 1 % 이하를 보이는 것들을 포함한다.
야생형 인자 VII 에 관한 실질적으로 감소된 또는 변경된 생물학적 활성을 가지는 인자 Ⅶ 변이체의 비제한적 실시예는 R152E-FⅦa (Wildgoose et al., Biochem 29:3413-3420, 1990), S344A-FⅦa (Kazama et al., J. Biol. Chem. 270: 66-72, 1995), FFR-FⅦa (Holst et al., Eur. J. Vasc. Endovasc. Surg. 15: 515-520,1998), 및 Gla 도메인이 없는 인자 Ⅶa (Nicolaisen et al., FEBS Letts. 317 : 245-249, 1993)를 포함한다. 비제한적 실시예는 또한 다른 아미노산 잔기로 치환된 위치 341 에 라이신 잔기를 가지는 인간 FⅦa ; 다른 아미노산 잔기로 치환된 위치 344 에 세린 잔기를 가지는 인간 FⅦa; 다른 아미노산 잔기로 치환된 위치 242 에 아스파르트산 잔기를 가지는 인간 FⅦa; 다른 아미노산 잔기로 치환된 위치 193 에 히스티딘 잔기를 가지는 인간 FⅦa; FVII-(K341A); FVII-(S344A) ;FVII- (D242A) ; 및FVII-(H193A)를 포함한다. 화학적으로 변경된 인자 VII 폴리펩티드 및 서열 변이체의 비제한적 실시예는 예를 들어 U. S. Patent No. 5,997, 864 에 기술되어 있다.
인자 Ⅶa 의 촉매적 활성은 촉매적 센터 또는 트리아드의 화학적 파생에 의해 억제된다. 파생은 인자 Ⅶ 와 유기인계 화합물, 플루오르화 설포닐, 펩티드 할로메틸 케톤 또는 아자펩티드 또는 아실화에 의해, 예를 들어, 펩티드클로로메틸케톤 또는 펩티딜 클로로 메탄과 같은 변경할 수 없는 억제제; 아자펩티드; 다양한 구아니디노 벤조에이트 유도체와 3-알콕시-4-클로로이소코우마린와 같은 아실화제; 페닐메틸설포닐플루오라이드(PMSF)와 같은 플루오르화 설포닐; 디이소프로필 플루오로인산(DFP); 토실프로필클로로메틸 케톤 (TPCK); 토실이실클로로메틸 케톤(TLCK); 니트로페닐설포네이트; 이소코우마린과 같은 헤테로고리 프로테아제 억제제 및 코우마린과 반응시켜 수행한다.
바람직한 펩티드 할로메틸 케톤은 Phe-Phe-Arg클로로메틸 케톤, Phe- Phe-Arg 클로로메틸케톤, D-Phe-Phe-Arg 클로로메틸 케톤, D-Phe-Phe-Arg 클로로메틸케톤 Phe-Pro-Arg 클로로메틸케톤, D-Phe-Pro-Arg 클로로메틸케톤, Phe- Pro-Arg클로로메틸케톤, D-Phe-Pro-Arg클로로메틸케톤, L-Glu-Gly-Arg클로로메틸케톤과 D-Glu-Gly-Arg 클로로메틸케톤, Dansyl-Phe-Phe-Arg 클로로메틸 케톤, Dansyl-Phe-Phe-Arg클로로메틸케톤, Dansyl-D-Phe-Phe-Arg 클로로메틸 케톤, Dansyl-D-Phe-Phe-Arg클로로메틸케톤, Dansyl-Phe-Pro-Arg 클로로메틸 케톤, Dansyl-D- Phe-Pro-Arg클로로메틸케톤, Dansyl-Phe-Pro-Arg 클로로메틸케톤, Dansyl-D-Phe-Pro- Arg 클로로메틸케톤,Dansyl-L-Glu-Gly-Arg 클로로메틸케톤과 Dansyl-D-Glu-Gly-Arg 클로로메틸케톤을 포함한다.
바람직한 구체예에서, 아미노산 치환은 인자 Ⅶa 촉매 부위에 기여하는 아미노산을 함유하는 영역으로 여기에서 정의된 인자 Ⅶ 촉매 트리아드의 아미노산 서열에서 이루어진다. 촉매 트리아드에서 치환, 삽입 또는 삭제는 일반적으로 촉매 부위를 형성하는 아미노산에 있거나 인접한다. 인간과 소 인자 Ⅶ 단백질에서, 촉매 "트리아드"를 형성하는 아미노산은 Ser344, Asp242, His193(인간 야생형 인자 Ⅶ 에서 위치를 나타내는 하부 숫자기입)이다. 다른 포유동물 종으로부터 인자 Ⅶ 에서 촉매 부위는 단백질 분리와 단백질 서열 분석을 포함한 현재 유용한 기술을 사용하여 결정된다. 다른 세린 프로테아제, 특히 촉매 부위가 이전에 결정된 키모트립신(여기에 참고문헌으로 통합된 Sigler et al., J. Mol. Biol., 35:143-164(1968))의 서열을 가진 서열을 정렬하고 상기 정렬로부터 유사 활성 부위 잔기를 결정하여 촉매 부위를 결정한다.
인자 Ⅹ 및/또는 Ⅸ의 인자 Ⅶa 에 의한 활성화를 방해 또는 억제하기 위해 아미노산 치환, 삽입 또는 삭제가 이루어진다. 그렇게 변경된 인자 Ⅶ는 응고 연속단계에서 조직 인자에 결합하기 위해 확실한 인자 Ⅶ 및/또는 인자 Ⅶa와 경쟁할 수 있는 능력을 보유해야 한다. 그러한 경쟁은 예를 들어, 인간 방광 암종세포주J82(Sakai et al.J. Biol. Chem. 264: 9980-9988 (1989))와 같은 세포-표면 조직 인자가 있는 세포 주를 사용하여 예를 들어 여기에 기술된 바와 같이 응혈 검정 또는 경쟁 결합 검정을 수단으로 쉽게 결정한다.
인간과 소 인자 Ⅶ 에서 Ser344, Asp242, His193 과 같은, 인자 Ⅶ 에서 촉매 부위를 형성하는 아미노산은 치환되거나 삭제된다. 단일 아미노산마을 바꾸어서 분자의 항원성을 증가하고 조직 인자에 결합하는 능력을 억제하는 가능성을 최소화하는 것이 바람직하지만 2개 또는 그 이상의 아미노산 변화(치환, 첨가 혹은 삭제)가 이루어지고 치환, 첨가와 삭제의 조합도 또한 이루어진다. 인간과 소 인자 Ⅶ 의 바람직한 구체예에서, Ser344는 바람직하게 Ala로 치환되지만 Gly, Met, Thr 또는 다른 아미노산이 치환될 수 있다. Asp를 Glu 로 His를 Lys 또는 Arg로 치환하는 것이 바람직하다. 일반적으로, 치환은 3차 단백질 구조를 가능한 적게 파괴하도록 선택된다. 인간 , 소 또는 다른 종의 적절한 인자 Ⅶ 서열의 촉매 부위에서 상기 기술된 바와 같이 잔기 변경을 도입하고 형성된 단백질을 여기에 기술된 바와 같이 촉매 활성 억제의 원하는 수준과 형성된 항응고 활성에 대해 시험한다.
인간 및 소 인자 Ⅶ의 바람직한 구체예에서, 활성 부위 잔기 Ser344 는 변경되고, Gly, Met, Thr,또는 더 바람직하게 Ala로 치환된다. 그러한 치환은 독립적으로 이루어지거나 His193 와 Asp242를 포함하는 촉매 트리아드에서 다른 부위에서 치환과 조합하여 이루어진다.
인자 Ⅶ 폴리펩티드의 생물학적 활성:
응혈에서 인자 Ⅶa의 생물학적 활성은 (i) 조직 인자(TF)에 결합하고 (ii) 활성화된 인자 IX 또는X (각각 인자 IXa 또는Xa)을 생산하기 위해 인자 IX 또는 인자 X의 단백질 분해적 절단을 촉매작용을 하는 능력에서 유래한다.
본 발명의 목적을 위해서, 인자 Ⅶ 폴리펩티드 ("인자 Ⅶ 생물 활성")의 생물 활성은 미국 특허 No. 5,997, 864 또는 WO 92/15686에 기술된 바와 같이 인자 Ⅶ 결핍된 혈장과 트롬보플라스틴을 이용하여 응혈을 촉진하기 위한 제제의 능력을 측정하여 정량화한다. 이 검정에서, 생물 활성은 대조군 샘플에 관하여 응혈 시간의 감소로 표현되고 1 단위/ml 인자 Ⅶ 활성을 포함하는 혼주된 인간 혈청 표준과 비교하여 "인자 Ⅶ 단위"로 전환한다. 대안적으로, 인자 Ⅶa 생물 활성은
- 지질막에 끼워진 TF와 인자 X를 포함하는 시스템에서 활성화된 인자 X (인자 Xa)을 생산하는 인자 Ⅶa 또는 인자 Ⅶa관련 폴리펩티드의 능력을 측정 (Persson et al., J. Biol. Chem. 272: 19919-19924,1997) ;
- 수용액 시스템에서 인자 X 가수분해를 측정 ("시험관 내 단백질 용해 검정", 하기 참조);
- 표면 플라스몬 공명에 근거한 도구를 이용하여 Ⅶa 또는 인자 Ⅶa관련 폴리펩티드가 TF에 물리적으로 결합하는 것을 측정(Persson, FEBS Lettes.413: 359-363,1997)하고;
- 인자 Ⅶa 및/또는 인자 Ⅶa관련 폴리펩티드에 의한 합성 기질의 가수분해를 측정("시험관 내 가수분해 검정", 하기 참조) ;
- TF-독립적 시험관 내 시스템에서 트롬빈 생성을 측정하여 정량화한다.
인자 Ⅶ 폴리펩티드의 생물학적 활성을 결정하기에 적절한 검정:
본 발명에 따라 유용한 인자 Ⅶ 폴리펩티드는 단순한 예비 시험관 내 시험으로서 수행될 수 있는 적절한 검정에 의해 선택된다. 따라서, 본 명세서는 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 활성에 대한 단순 시험("시험관 내 가수분해 검정"이라 불리는)을 개시한다.
시험관 내 가수분해 검정(검정 1)
본래 (야생형) 인자 Ⅶa와 인자 Ⅶa 변이체를("인자 Ⅶa"로 언급됨) 특이적 활성에 대해 검정한다. 특이적 활성과 직접적으로 비교하기 위해 동시에 검정할 수 있다. 검정은 미세적정 플레이트(MaxiSorp, Nunc,Denmark)에서 수행한다. 발색성 기질 D-lle-Pro-Arg-p-니트로아닐리드(S-2288, Chromogenix, Sweden), 최종 농도 1 mM은 pH 7.4에서 0.1 M NaCl, 5 mM CaCl2와 1 mg/ml 소 혈청 알부민을 포함하는 50 mM Hepes에 있는 인자 Ⅶa (최종 농도 100 nM)에 첨가한다. 405 nm에서 흡수도는 Spectra Max 340 plate reader (Molecular Devices, USA)와 연속적으로 측정한다. 효소를 함유하지 않는 블랭크 웰에서 흡수도를 뺀 후에 20분 배양하는 동안 나타난 흡수도는 변이체과 야생형 인자 Ⅶa의 활성 간의 비율을 계산하는 데 사용한다 :
비율= (A405 nm인자 Ⅶa 변이체)/ (A405 nm인자 Ⅶa 야생형).
이에 근거하여, 본래 인자 Ⅶa와 비교할 만한 또는 더 높은 활성이 있는 인자 Ⅶa 변이체, 예를 들어, 변이체의 활성과 본래 인자 Ⅶ의 활성 (야생형 FⅦ) 비율이 약 1.0. 이상인 변이체를 확인할 수 있다.
인자 Ⅶ 폴리펩티드의 활성은 적절한 발색성 기질(예를 들어 S-2765)을 첨가한 후 생성된 인자 Xa를 측정하는 적절하게 100-1000 nM의 농도에서 인자 X와 같은 생리적 기질을 사용하여("시험관 내 가수분해 검정")측정한다. 추가로, 활성 검정은 생리적 온도에서 수행된다.
시험관 내 단백질용해 검정(검정 2)
본래 (야생형) 인자 Ⅶa와 인자 Ⅶa 변이체 ("인자 Ⅶa"로 언급된)은 특이적활성을 직접적으로 비교하기 위해서 동시에 검정한다. 검정은 미세적정 플레이트 (MaxiSorp, Nunc, Denmark)에서 수행한다. 0.1 M NaCl, 5 mM CaCl2와 1 ㎎/ml 소 혈청 알부민을 함유하는 100 ㎖ 50 mM Hepes에서 인자 Ⅶa(10 nM)와 인자 X(0.8 microM)를 pH 7.4에서 15분 동안 배양한다. 인자 X 절단은 0.1 M NaCl, 20 mM EDTA와 1 mg/ml 소 혈청 알부민을 포함하는 50 microL 50 mM Hepes, pH 7.4를 첨가하면 중단된다. 생성된 인자 Xa의 양은 발색성 기질 Z-D-Arg-Gly-Arg-p-니트로 아닐리드 (S-2765, Chromogenix, Sweden), 최종 농도 0.5 mM을 첨가하여 측정한다. 405 nm 에서 흡광도는 SpectraMaxTM340 plate reader (Molecular Devices, USA)로 연속적으로 측정한다. FⅦa을 포함하지 않는 블랭크 웰에서 흡광도를 뺀 후에 10 분 동안 나타난 흡광도는 변이체의 단백질 분해 활성과 야생형 인자 Ⅶa의 비율을 계산하는데 사용한다 :
비율= (A405 nm 인자 Ⅶa 변이체)/ (A405 nm 인자 Ⅶa 야생형).
이에 근거하여, 변이체의 활성과 본래 인자 Ⅶ(야생형 FⅦ)의 활성사이의 비율이 약 1.0 이상인 변이체와 같은 본래 인자 Ⅶa 와 비교할 만하거나 더 높은 활성이 있는 인자 Ⅶa 변이체를 확인할 수 있다.
인자 Ⅶ 또는 인자 Ⅶ 관련 폴리펩티드의 트롬빈을 생성하는 능력은 생리적 농도에서 적절한 응고 인자와 저해제(혈우병 A 조건을 모방할 때 마이너스 인자 Ⅷ)와 활성화된 혈소판을 포함하는 검정(검정3)에서 측정할 수 있다(여기에 참고문헌으로 통합된 p. 543 in Monroe et al. (1997) Brit. J. Haematol. 99,542-547 에서 기술된 바와 같이).
인자 Ⅶ 폴리펩티드의 활성은 또한 본질적으로 WO 92/15686 또는 US 5,997, 864 에 기술된 바와 같이 한 단계 응혈 검정(검정 4)를 사용하여 측정한다. 요약하면, 시험될 샘플은 50 mM Tris (pH 7.5)에서 희석되고 0.1 % BSA 100 ㎕는 인자 Ⅶ 결핍된 혈장 100 ㎕와 10 mM Ca2+를 함유하는 트롬보플라스틴 C 200 ㎕와 함께 배양된다. 응혈 시간은 측정되고 참고 표준 또는 연속 희석에서 시트레이트화된 보통 인간혈장의 혼주를 사용하여 표준 곡선과 비교한다.
경쟁 검정:
FⅦa/sTF 아미드분해 활성의 억제(검정 5):
변경된 인자 Ⅶ에 의한 FⅦa-TF 촉매된 아미드분해 활성의 억제는 용해성 인간 TF (10 nM), 재조합체 인간 FⅦa (10 nM) 및 변경된 인자 Ⅶ의 증가 농도를 사용하여 시험한다. 변경된 인자 VII의 다양한 농도를 기질 S2288 (1.2 mM,Chromogenix)를 첨가하기 전에 실온에서 60분동안 BSA 버퍼(50 mM Hepes, pH 7.4, 100 mM NaCl, 5 mM CaCl2및 1mg/ml BSA)에서 10 nM sTF 와 10 nM FⅦa 와 함께 미리배양한다. 색 형성은 405 nm에서 30분동안 지속적으로 측정된다. 아미드분해 활성은 mOD/min로 제시된다. 변경된 인자 Ⅶ 에 의한 FⅦa/TF 아미드분해 활성의 억제에 대한 IC50 값을 계산한다.
FXa 생성의 억제 (검정 6).
FX (50 nM)를 첨가하기 전에 BSA 버퍼(검정 4 참조) 에 있는 지질화된 TF (10 nM), FⅦa (100 nM) 및 변경된 인자 Ⅶ (0-50 nM)를 실온에서 60분동안 배양한다. 1/2 부피 중단 버퍼(50 mM Hepes, pH 7.4, 100 mM NaCl, 20 mM EDTA)를 첨가하여 반응은 10분 후에 중단된다. 생성된 FXa의 양은 기질 S2765 (0.6 mM, Chromogenix)을 첨가하고 405 nm 에서 지속적으로 10 분동안 흡광도를 측정하여 결정한다. FX의 FⅦa/지질화된 TF-중재된 활성화의 변경된 인자 VII-억제에 대한 IC50 값을 계산한다.
TF-의존적 응혈 검정 (검정 7):
검정은 ACL300 Research clotting apparatus(ILS Laboratories)에서 수행한다. 50 mM 이미다졸, pH 7.4, 100 mM NaCl, 0.1 % BSA 에서 변경된 인자 VII의 희석물은 2 내지 5 의 비율로 25 mM CaCl2와 혼합하고 응혈 장치에서 샘플 컵에 첨가한다. 변경된 인자 VII 없이 표본에서 약 30초의 응혈 시간을 나타내는, 이미다졸 버퍼로 희석된 인간, 래트, 토끼, 비비원숭이 또는 돼지로부터 트롬보플라스틴은시약 저장고 2에 놓이고 인간 ,래트, 토끼, 비비원숭이 또는 돼지 혈장은 작용제 저장고 3에 놓인다. 70 ㎕ 의 변경된 인자 Ⅶ 를 분석하는 동안, CaCl2혼합물을 25 ㎕ 트롬보플라스틴 작용제에 전달하고 60 ㎕ 혈장을 첨가하고 응혈 시간을 측정하기 전에 900 초동안 미리 배양한다. 최대 응혈 시간은 400 초로 설정되었다. 트롬보플라스틴의 희석은 첨가된 변경 FVII 없이 응혈 시간을 대조구에 관한 TF 활성으로 전환하기 위한 표본 곡선으로 사용된다.
변경된 인자 VII 에 의한 FX 의 FⅦa/세포표면 TF 촉매된 활성화의 억제(검정 8):
인간 TF, 예를 들어 인간 폐 섬유아세포 WI-38 (ATTC No. CCL-75), 인간 방광 암종 세포주 J82(ATTC No. HTB-1), 인간 각질세포 세포주 CCD 1102 KerTr (ATCC no.CRL-2310), 인간 아교모세포종 세포주 U87, 또는 인간 유방암 세포주 MDA-MB231을 발현하는 세포의 단일층은 FX의 FⅦa/TF 촉매된 활성화에서 TF 출처로 사용된다. 24-, 48- 또는 96-웰 플레이트에 있는 합류 세포 단일층을 버퍼 A (10 mM Hepes, pH 7.45, 150 mM NaCl, 4 mM KCl, 및 11 mM 글루코스)에서 한 번 씻고 버퍼B (1mg/ml BSA 와 5 mM Ca2+가 보충된 버퍼A)에서 한 번 씻는다. FⅦa (1 nM), FX (135 nM) 및 버퍼 B 에 있는 변경된 인자 Ⅶ의 다양한 농도는 세포에 동시에 첨가된다. 대안적으로, 세포는 rFⅦa 와 FX 를 첨가하기 전에 변경된 인자 Ⅶ 와 15분간 미리 배양된다. FXa 형성은 37 ℃에서 15 분동안 허용된다. 50 ㎕ 일정량을 각 웰로부터 제거하고 및 50 ㎕ 중단 버퍼(10 mM EDTA 및 1 mg/ml BSA로보충된 버퍼A)에 첨가한다. 생성된 FXa 의 양은 50 ㎕ 의 상기 혼합물을 마이크로적정 플레이트 웰에 전달하고 25 ㎕ Chromozym X (최종 농도 0.6 mM)을 웰에 첨가하여 결정한다. 405 nm 에서 흡광도는 지속적으로 측정되고 색 형성의 초기 비율은 FXa 표준 곡선을 사용하여 FXa 농도로 전환된다.
인자 Ⅶ 폴리펩티드의 제조와 정제:
본 발명에 따라 제제되기에 적절한 변경된 인자 VII 분자와 그것의 제조는 WO 92/15686, WO 94/27631, WO 96/12800 및 WO 97/47651에 기술되어 있다.
일반적으로, 인간 정제된 인자 Ⅶa 는 바람직하게 예를 들어 Hagen et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 83: 2412-2416, 1986에 기술된 바와 같이 또는 European Patent No. 200.421 (ZymoGenetics,Inc.)에 기술된 바와 같이 DNA 재조합 기술로 만들어진다.
인자 Ⅶ는 또한 Broze and Majerus, J. Biol. Chem. 255 (4):1242-1247, 1980 and Hedner and Kisiel, J. Clin. invest. 71:1836-1841, 1983에 기술된 방법으로 생산된다. 이러한 방법으로 다른 응혈 인자의 검출가능한 양이 없이 인자 VII를 생성한다. 더 정제된 인자 VII 제조물은 최종 정제 단계로서 추가 젤 여과를 포함한 방법으로 획득된다. 인자 Ⅶ 는 예를 들어, 인자 XⅡa, IXa 또는 Xa 와 같은 여러 다른 혈장 단백질에 의해 알려진 방법으로 활성화된 인자 Ⅶa로 전환된다. 대안적으로, Bjoern et al. (Research Disclosure, 269 September 1986, pp. 564-565)에 의해 기술된 바와 같이, 인자 Ⅶ 는 MonoQ® (Pharmacia fine Chemicals) 또는 그 유사물과 같은 이온 교환 크로마토그래피를 통과시켜 또는 용액에서 자가활성화에 의해 활성화된다.
분리된 또는 재조합체적으로 만들어진 인자 VII 폴리펩티드는 예를 들어, WO 92/15686, WO 94/27631, WO 96/12800 및 WO 97/47651 또는 Sorensen et al. J. Biol. Chem. 272: 11863-11868,1997(FFR-rFⅦa: FⅦa blocked in the active site with D-Phe-L-Phe-L-Arg-chloromethyl ketone)기술된 바와 같이 화학적으로 변경된다.
인자 Ⅶ 변이체는 야생형 인자 Ⅶ 의 변경 또는 재조합체 기술로 생산된다. 야생형 인자 VII와 비교하여 변경된 아미노산 서열을 가진 인자 Ⅶ 등가물은, 예를 들어 부위 특이적 변이 유발(예를 들어, Cunningham and wells, 1989, Science 244: 1081-1085 참조)과 같은 알려진 수단으로 아미노산 코돈을 변경하거나 천연 인자 VII를 암호화하는 핵산에서 아미노산 코돈의 일부를 제거함으로써 야생형 인자 VII 를 암호화하는 핵산 서열을 변경하여 생산된다.
세포에서 폴리펩티드를 분리하는 것은 부착 세포 배양물로부터 원하는 생성물을 포함하는 세포 배양 매체의 제거; 부착되지 않은 세포를 제거하기 위한 원심분리 또는 여과;기타 등을 포함하는 당업계에 공지된 방법으로 수행한다.
선택적으로, 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 더 정제될 수 있다. 정제는 제한없이, 항-인자 Ⅶ 항체 칼럼과 같은 친화 크로마토그래피(참조, 예를 들어, Wakabayashi et al., J. Biol. Chem. 261: 11097,1986; and Thim et al.,Biochem.27: 7785,1988); 소수성 상호작용 크로마토그래피; 이온 교환 크로마토그래피; 크기 배제 크로마토그래피; 전기영동 과정(예를 들어, 예비 등전점 분리법(IEF), 차별적용해성(예를 들어, 암모늄 설페이트 침전), 또는 추출 등을 포함한 당업계에 공지된 방법으로 수행한다. 일반적으로, Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag, New York, 1982; and Protein Purification, J. C. Janson and Lars Ryden, editors, VCH Publishers, New York, 1989. 참조. 후속하는 정제, 제제는 바람직하게 숙주 세포에서 유도된 비인자 Ⅶ 또는 인자 Ⅶ 관련 폴리펩티드 중량의 약 10% 미만, 더 바람직하게 약 5% 미만, 가장 바람직하게 약 1 % 미만을 포함한다.
인자 Ⅶ 폴리펩티드는 인자 IXa, kallikrein, 인자 Xa와 트롬빈과 같은 트립신 유사 특이성이 있는 ⅩⅡa 또는 다른 프로테아제를 사용하여 단백질 분해 절단으로 두 개의 사슬 형태로 전환된다. Osterud et al., Biochem. 11: 2853 (1972); Thomas, US 특허 No. 4,456, 591; and Hedner et al., J. Clin. Invest. 71: 1836 (1983)참조. 대안적으로, 인자 Ⅶ 폴리펩티드는 Mono Q® (PharmaCla) 또는 유사물과 같은 이온 교환 크로마토그래피 칼럼을 통과시켜서 활성화한다. 형성된 활성화된 인자 Ⅶ 또는 인자 Ⅶ관련 폴리펩티드는 하기 기술된 바와 같이 제제하고 투여한다.
실시예 1
검정 방법
응집의 양은 비-변성 크기 배제 HPLC로 결정한다. 산화된 형태의 양은 RP-HPLC로 결정한다. 효소적 분해 형태의 양은 RP-HPLC로 결정한다.
비변성 크기 배제 크로마토그래피는 이동상으로서 0.2 M 암모늄 설페이트, 5% 2-프로판올 pH 7.0 을 사용하여 Waters Protein Pak 300 SW 컬럼, 7.5 x 300 mm 에서 작동한다. 흐름 속도: 0.5 ㎖/min. 검출: 215 nm. 로드:25 ㎍ FⅦa.
역상 HPLC 는 입자 크기가 5 ㎛ 이고 구멍 크기가 300 Å인 독점적 4.5 × 250 mm 부틸 결합된 실리카 컬럼에서 수행한다. 컬럼 온도: 70 ℃. A-버퍼: 0.1 %v/v 트리플루오로아세트산. B-버퍼: 0.09% v/v 트리플루오로아세트산, 80%v/v 아세토니트릴. 컬럼은 30 분 내에 X 내지 (X+13) % B의 선형 구배로 용출되었다. FⅦa 가 약 26 분의 보유 시간으로 용출되도록 X 는 조절되었다. 흐름 속도: 1.0 ㎖/min. 검출: 214 nm. 로드:25 ㎍ FⅦa.
실시예 2
항산화제로서 메티오닌을 함유하는 수성 Phe-Phe-Arg 클로로메틸케톤-비활성화된 인자 Ⅶ (FFR-rFⅦa) 제제의 화학적 안정성
2개의 다른 제제를 제조하였다. 제제의 조성은:
FFR-rFⅦa 2 mg/ml
NaCl 2.8- 2.9 mg/ml
CaCl2, 2H20 1.4-1.5 mg/ml
Glycylglycine 1.3 mg/ml
Methionine 0 또는 1mg/ml
pH 7.0
제제는 FFR-rFⅦa, NaCl, CaCl2및 glycylglyClne 을 함유하는 FFR-rFⅦa의 액체 벌크 용액으로부터 제조하였다. 메티오닌을 물에 용해하였다. FFR-rFⅦa 벌크와 메티오닌 용액은 혼합되고 용액의 pH 는 7.0으로 조정되었다. 제제를 여과하고(0.2 ㎛) 작은 병(작은 병 당 2.2 ml 용액)에 채웠다. 작은 병은 35 ℃ 에서 저장되었다. 샘플을 회수하고 하기 표에서 설명된 시간에서 산화된 형태의 양에 대해 분석하였다(RP-HPLC). 표는 산화된 형태의 양을 제시한다(%)
메티오닌(mg/ml) 0 시간 35 ℃2주 35 ℃4주
0 (기준) 2.7 3.7 3.9
1 2.7 3.0 2.9
이 결과에 의하면 메티오닌의 첨가는 제제의 산화 속도를 느리게 한다.

Claims (31)

  1. (ⅰ)변경된 인자 Ⅶ 폴리펩티드
    (ⅱ) 약 4 내지 약 8의 범위의 pH를 유지하기에 적절한 작용제
    (ⅲ) 항산화제 및;
    (ⅳ) 칼슘 염, 마그네슘 염 또는 그것의 혼합물의 목록에서 선택된 작용제를 포함하는 것을 특징으로 하는 액체 수성 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서, pH 는 약 4.5 내지 약 7.0, 약 5.0 내지 약 7.0, 약 5.5 내지 약 7.0, 또는 약 6.0 내지 약 7.0 와 같은 약 4.0 내지 약 7.0 의 범위에서 유지되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 항 산화제는 D- 또는 L-메티오닌; 메티오닌 유사체; 메티오닌-함유 펩티드; 메티오닌-상동체; 아스코르브산; 시스테인; 호모시스테인; 글루타치온; 시스틴 및 시스타치온의 목록에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 제 3 항에 있어서, 항 산화제는 L-메티오닌인 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 항산화제는 약 1.0 내지 약4 mg/ml; 약 0.1 내지 약 3 mg/ml, 약 0.1 내지 약 2 mg/ml 또는 약 0.5 내지 약 2 mg/ml과 같은 약 0.1 내지 약 5.0 mg/ml의 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 추가로 (v) 장도 변경제를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  7. 제 6 항에 있어서, 장도 변경제 (v)는 중성염; 단당류, 이당류 또는 다당류; 당 알코올; 아미노산; 또는 작은 펩티드 또는 상기 변경제의 적어도 두개의 혼합물의 목록에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  8. 제 7 항에 있어서, 장도 변경제는 만니톨 및/또는 중성 염, 바람직하게 염화 나트륨인 것을 특징으로 하는 조성물.
  9. 제 6 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 장도 변경제(v)는 약 1 내지 약 500 mM의 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  10. 제 9 항에 있어서, (v) 농도는 10-250 mM 인 것을 특징으로 하는 조성물.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, (vi) 비이온 표면활성제를더 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  12. 제 11 항에 있어서, 비이온 표면활성제는 폴록사머 188 또는 폴록사머 407 또는 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80 또는 폴리옥시 23 라우릴 에테르와 같은 폴리소르베이트 또는 폴록사머 또는 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르인 것을 특징으로 하는 조성물.
  13. 제 12 항에 있어서, 약 4.0 내지 약 8.0 의 범위에서 pH 를 유지하기에 적절한 작용제는 시트레이트, 아세테이트, 히스티딘, 말레이트, 포스페이트, 타르타르산, 숙신산, MES, HEPES, 이미다졸, TRIS, 락테이트, 글리실글리신, PIPES, 글리신의 산과 염 또는 상기 완충제 중 적어도 2가지의 혼합물의 목록에서 선택된 완충제인 것을 특징으로 하는 조성물.
  14. 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 작용제의 농도는 약 1 mM 내지 약 50 mM인 것을 특징으로 하는 조성물.
  15. 제 14 항에 있어서, 작용제 (ⅱ)의 농도는 약 10 mM 인 것을 특징으로 하는 조성물.
  16. 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서, 칼슘 및/또는 마그네슘 염(작용제 (iv))는 약 5 mM 내지 약 100 mM과 같은 약 5 mM 내지 약 150 mM, 약 10 mM 내지 약 50 mM 과 같은 약 5 mM 내지 약 50 mM의 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  17. 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서, 칼슘 염은 염화 칼슘, 아세트산 칼슘, 글루콘산 칼슘 및 래불레이트 칼슘의 목록에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  18. 제 17 항에 있어서, 마그네슘 염은 염화 마그네슘, 아세트산 마그네슘, 황산 마그네슘, 글루콘산 마그네슘, 래불레이트 마그네슘염의 목록에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  19. 제 1 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서, 페놀, 벤질 알코올, 오르쏘-크레졸, 메타-크레졸, 파라-크레졸, 메틸 파라벤, 프로필 파라벤, 염화 벤즈알코니움 및 염화 벤자에토니움과 같은 (viii) 방부제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  20. 제 1 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서, 등장성인 것을 특징으로 하는 조성물.
  21. 제 1 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서, 약학적 투여를 위해 제제된 것을 특징으로 하는 조성물.
  22. 제 1 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 있어서, 2-8℃ 에서 적어도 6개월동안 안정한 것을 특징으로 하는 조성물.
  23. 제 1 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 있어서, 변경된 인자 Ⅶ 폴리펩티드는 본 명세서에 기술된 바와 같은 하나 또는 그 이상의 응고 검정, 단백질 용해 검정, 또는 TF 결합 검정에서 시험하였을 때 야생형 인자 Ⅶa의 특이적 활성의 약 25% 이하, 바람직하게 약 10% 이하, 더 바람직하게 약 5% 이하, 가장 바람직하게 약 1% 이하인 야생형 인자 Ⅶa에 관한 생물학적 활성을 가지는 것을 특징으로 하는 조성물.
  24. 제 1 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 있어서, 변경된 인자 Ⅶ 폴리펩티드는 활성 부위 잔기 Ser344 가 변경되고 Gly, Met, Thr, 또는 더 바람직하게 Ala로 치환된 인간과 소 인자 Ⅶ; 잔기 Lys341 가 치환된 인간 인자 Ⅶ; 잔기 Asp242 가 치환된 인간 인자 Ⅶ; 잔기 His193 가 치환된 인간 인자 VII; FVII-(K341A); FVII-(S344A); FVII-(D242A) ;FVII-(H193A); 펩티드클로로메틸케톤 또는 펩티딜클로로 메탄; 아자펩티드; 다양한 구아니디노벤조에이트 유도체와 3-알콕시-4-클로로이소코우마린과 같은 아실화제; 페닐메틸설포닐플루오라이드(PMSF)와 같은 설포닐 플루오라이드; 디이소프로필플루오로포스페이트(DFP); 토실프로필클로로메틸 케톤(TPCK); 토실이실클로로메틸 케톤(TLCK); 니트로페닐설포네이트; 이소코우마린과 코우마린과 같은 헤테로고리 프로테아제 억제제; L-Phe-Phe-Arg 클로로메틸 케톤, D-Phe-Phe-Arg 클로로메틸 케톤, L-Phe-Pro-Arg 클로로메틸 케톤, D-Phe-Pro-Arg 클로로메틸 케톤, L-Glu-Gly-Arg 클로로메틸 케톤, D-Glu-Gly-Arg 클로로메틸 케톤, Dansyl-L-Phe-Phe-Arg 클로로메틸 케톤, Dansyl-D-Phe-Phe-Arg 클로로메틸 케톤, Dansyl-L-Phe-Pro-Arg 클로로메틸 케톤, Dansyl-D-Phe-Pro-Arg 클로로메틸 케톤, Dansyl-L-Glu-Gly-Arg 클로로메틸 케톤 및 Dansyl-D-Glu-Gly-Arg 클로로메틸 케톤의 목록에서 선택된 시약과의 반응에 의해 활성 부위에서 변경된 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 목록에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  25. 제 24 항에 있어서, 변경된 인자 Ⅶ 폴리펩티드는 활성 부위 잔기 Ser344 가 변경되고 Gly, Met, Thr, 또는 더 바람직하게 Ala로 치환된 인간과 소 인자 Ⅶ; 잔기 Lys341 가 치환된 인간 인자 Ⅶ; 잔기 Asp242 가 치환된 인간 인자 Ⅶ; 잔기 His193 가 치환된 인간 인자 VII; FVII-(K341A); FVII-(S344A); FVII-(D242A) ;FVII-(H193A); 펩티드클로로메틸케톤 또는 펩티딜클로로 메탄; 아자펩티드; 다양한 구아니디노벤조에이트 유도체와 3-알콕시-4-클로로이소코우마린과 같은 아실화제; 페닐메틸설포닐플루오라이드(PMSF)와 같은 설포닐 플루오라이드; 디이소프로필플루오로포스페이트(DFP);토실프로필클로로메틸 케톤(TPCK); 토실이실클로로메틸 케톤(TLCK); 니트로페닐설포네이트; 이소코우마린과 코우마린과 같은 헤테로고리프로테아제 억제제; L-Phe-Phe-Arg 클로로메틸 케톤, D-Phe-Phe-Arg 클로로메틸 케톤, L-Phe-Pro-Arg 클로로메틸 케톤, D-Phe-Pro-Arg 클로로메틸 케톤, L-Glu-Gly-Arg 클로로메틸 케톤, D-Glu-Gly-Arg 클로로메틸 케톤, Dansyl-L-Phe-Phe-Arg 클로로메틸 케톤, Dansyl-D-Phe-Phe-Arg 클로로메틸 케톤, Dansyl-L-Phe-Pro-Arg 클로로메틸 케톤, Dansyl-D-Phe-Pro-Arg 클로로메틸 케톤, Dansyl-L-Glu-Gly-Arg 클로로메틸 케톤 및 Dansyl-D-Glu-Gly-Arg 클로로메틸 케톤의 목록에서 선택된 시약과 의 반응에 의해 활성 부위에서 변경된 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 목록에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  26. 제 1 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 있어서, 변경된 인자 Ⅶ 폴리펩티드는 약 0.5 내지 약 10 mg/ml, 약 0.5 내지 약 5.0mg/ml, 또는 약 1.0mg/ml 내지 5.0mg/ml와 같은 약 0.1 mg/ml 내지 약 15 mg/ml의 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  27. 변경된 인자 VII 폴리펩티드의 액체 수성 조성물을 제조하기 위한 방법으로, (ii) 약 4.0 내지 약 8.0 의 범위에서 pH를 유지하기에 적절한 작용제; (iii) 항산화제; (ⅳ) 칼슘 염, 마그네슘 염 또는 그것의 혼합물의 목록에서 선택된 작용제를 포함하는 용액에서 변경된 인자 VII 폴리펩티드를 제공하는 것를 포함하는 방법.
  28. 응혈을 억제하기 위한 약제를 제조하기 위한 제 1 항 내지 제 26 항 중 어느한 항에 따르는 조성물의 사용.
  29. 조직 인자 중재된 반응의 억제를 위한 약제를 제조하기 위한 제 1 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 따르는 조성물의 사용.
  30. 시험체에서 응혈을 억제하기 위한 방법으로, (i) 변경된 인자 VII 폴리펩티드, (ii) 약 4.0 내지 약 8.0 범위의 pH 로 유지하기에 적절한 작용제; (iii) 항산화제; (ⅳ)칼슘 염, 마그네슘 염 또는 그것의 혼합물의 목록에서 선택된 작용제를 포함하는 수성 액체 조성물의 효과적인 양을 그것이 필요한 시험체에 투여하는 것을 포함하는 방법.
  31. 시험체에서 조직 인자 중재된 반응을 억제하기 위한 방법으로, (i) 변경된 인자 VII 폴리펩티드, (ii) 약 4.0 내지 약 8.0 범위의 pH 로 유지하기에 적절한 작용제; (iii) 항산화제; (ⅳ)칼슘 염, 마그네슘 염 또는 그것의 혼합물의 목록에서 선택된 작용제를 포함하는 수성 액체 조성물의 효과적인 양을 그것이 필요한 시험체에 투여하는 것을 포함하는 방법.
KR10-2004-7009306A 2001-12-21 2002-12-20 변경된 인자 ⅶ 폴리펩티드의 액체 조성물 KR20040065278A (ko)

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