NO317801B1

NO317801B1 - DNA-molekyl, kimaert DNA-molekyl eller vektor som koder for BMP12 eller BMP12-relaterte proteiner, og vertceller, fremgangsmater, proteiner, sammensetninger og anvendelse derav.

Info

Publication number: NO317801B1
Application number: NO19962304A
Authority: NO
Inventors: John M Wozney; Anthony J Celeste; Neil M Wolfman; Vicki A Rosen; Gerald H Thomsen; Douglas A Melton
Original assignee: Genetics Inst; Harvard College
Priority date: 1993-12-07
Filing date: 1996-06-04
Publication date: 2004-12-13
Also published as: PT733109E; ATE319823T1; OA10582A; US6984623B2; KR100353182B1; US5658882A; AU689184B2; EP0733109B1; JP2005312457A; WO1995016035A2; US20070004005A1; CA2176942C; NO962304L; WO1995016035A3; US20040146923A1; DE69434651T2; ES2255059T3; DE69434651D1; JPH09506261A; CA2176942A1

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en ny familie rensede proteiner, og sammensetninger som inneholder slike proteiner. Sammensetningene er nyttige for induksjon av tendon/- ligamentlignende vevsdannelse, leging av sår og ligament og annen vevsreparering.

Disse proteinene kan også bli anvendt i sammensetninger for å øke aktiviteten til benmorfogeniske proteiner.

Søken for å oppnå molekylet eller molekylene som er ansvarlig for dannelse av ben, brusk, sene og andre vev tilstede i ben og andre vevsekstrakter har ført til oppdagelsen av et nytt sett molekyler betegnet benmorfogeniske proteiner (BMP). Strukturer av flere proteiner, betegnet BMP-1 til og med BMP-11 er tidligere blitt bestemt. De unike induserende aktivitetene til disse proteinene, sammen med deres tilstedeværelse i ben, tyder på at de er viktige regulatorer av benrepareringsprosesser, og kan være involvert i den normale opprettholdelsen av benvev. Det er nødvendig å identifisere ytterligere proteiner som spiller en rolle for dannelsen av andre vitale vev. Foreliggende oppfinnelse vedrører identifikasjon av en familie proteiner med sene/ligamentlignende vevsinduserende aktivitet, og som er nyttige i sammensetninger for induksjon av sene/ligamentlignende vevsdannelse og reparering.

I en utførelsesform omfatter foreliggende oppfinnelse DNA-molekyler kodende for et sene/ligamentlignende induserende protein som oppfinnerne har betegnet VL-1. Dette nye proteinet er nå betegnet BMP-12. Foreliggende oppfinnelse omfatter også DNA-molekyler kodende for BMP-12 relaterte proteiner.

BMP-12 relaterte proteiner er en undergruppe av BMP/TGF-B/Vg-1 familie av proteiner, inkludert BMP-12 og Vl^l, som er definert som sene/ligamentlignende vevsinduserende proteiner som blir kodet av DNA-sekvenser som er klonet og identifisert, for eksempel ved anvendelse av PCR, ved anvendelse av BMP-12 spesifikke primere, så som primerene nr. 6 og nr. 7 beskrevet nedenfor, med reduserte stringensbetingelser.

Det er foretrukket at DNA-sekvensene kodende for BMP-12 relaterte proteiner er minst omtrent 80% homologe på aminosyrenivå fra aminosyrer med aminosyrene nr. 3 til nr. 103 ifølge SEQ ID NO: 1.

DNA-molekylene har fortrinnsvis en DNA-sekvens kodende for BMP-12 proteinet, sekvensen som er gitt i SEQ ID NO: 1, eller et BMP-12 relatert protein som beskrevet heri. Både BMP-12 proteinet og BMP-12 relaterte proteiner er karakterisert ved deres evne til

å indusere dannelsen av sene/ligamentlignende vev i analysen beskrevet i eksemplene.

DNA-molekylene ifølge oppfinnelsen omfatter fortrinnsvis en DNA-sekvens, som beskrevet i SEQ ID NO: 1; fortrinnsvis nukleotidene nr.496 til nr. 882, nr.571 tilnr.882 eller nr.577 til nr.882 av SEQ ID NO:l; eller DNA-sekvenser som hybridiserer til ovennevnte under stringente hybridiseringsbetingelser og som koder for et protein som tilveiebringer evnen til å danne sene/ligamentlignende vev. DNA-molekylene ifølge oppfinnelsen kan også omfatte en DNA-sekvens som beskrevet i SEQ ID NO: 25; fortrinnsvis nukleotidene nr. 604 eller nr.658 til nr.964 til SEQ ID NO:25.

DNA-molekylene ifølge oppfinnelsen omfatter også DNA-molekyler omfattende en DNA-sekvens kodende for et BMP-12 relatert protein med aminosyresekvensen vist i SEQ ID NO: 2 eller SEQ ID NO:26, samt naturlig forekommende alleliske sekvenser og ekvivalente degenerative kodonsekvenser ifølge SEQ ID NO: 2 eller SEQ ID NO: 26. DNA-sekvensen ifølge foreliggende oppfinnelse koder fortrinnsvis for aminosyrene nr. 25 til nr. 104, nr 1 til nr 104 eller nr 3 til nr 103 til SEQ ID NO: 2; eller aminosyrene nr. 1 til nr 120 eller nr 19 til nr 120 til SEQ ID NO: 26. DNA-sekvensen kan omfatte, i en 5' til 3'-retning, nukleotider kodende for et propeptid, og nukleotider kodende for aminosyrene nr. 25 til nr. 104, nr 1 til nr 104 eller nr 3 til nr 103 til SEQ ID NO: 2; eller aminosyrene nr 1 til nr 120 eller nr 19 til nr 120 til SEQ ID NO: 26. Egenskapene som er nyttige i ovennevnte utførelsesform blir fortrinnsvis valgt fra gruppen bestående av nativt BMP-12 propeptid og et proteinpropeptid fra et annet medlem av TGF-B superfamilien eller BMP familien. Oppfinnelsen omfatter videre DNA-sekvenser som hybridiserer til ovennevnte DNA-sekvenser under stringente hybridiseringsbetingelser og koder for et BMP-12 relatert protein som utviser evne til å indusere dannelse av sene/ligamentlignende vev.

I en annen utførelsesform omfatter foreliggende oppfinnelse vertsceller og vektorer som omfatter et DNA-molekyl kodende for BMP-12 protein, eller et BMP-12 relatert protein. Vertscellene og vektorene kan videre omfatte den kodende sekvensen i operativ assosiasjon med en ekspresjonskontrollsekvens derav.

I en annen utførelsesform omfatter foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for produsering av et renset BMP-12 relatert protein, i det metoden omfatter trinnene av å

dyrke en vertscelle transformert med ovennevnte DNA-molekyl eller vektor omfattende en nukleotidsekvens kodende for et BMP-12 relatert protein; og (b) isolering og rensing av nevnte BMP-12 relaterte protein fra dyrkningsmediet. I en foretrukket utførelsesform omfatter fremgangsmåten (a) dyrking av en celle transformert med et DNA-molekyl som omfatter nukleotidsekvensen fra nukleotid nr 496, nr 571 eller nr 577 til nr 879 eller nr 882 som vist i SEQ ID NO: 1; eller nukleotidsekvensen fra nr 604 eller nr 658 til nr 963 til SEQ ID NO: 25; og (b) isolering og rensing fra nevnte kulturmedium av et protein som omfatter aminosyresekvensen fra aminosyre nr -25, nr 1 eller nr 3 til aminosyre nr 103 eller nr 104 som vist i SEQ ID NO: 2; eller fra aminosyre nr 1 eller nr 19 til aminosyre nr 120 som vist i SEQ ID NO: 26. Foreliggende oppfinnelse omfatter også et renset protein produsert ifølge ovennevnte fremgangsmåter.

Foreliggende oppfinnelse omfatter videre renset BMP-12 relatert protein k jennetegnet ved evnen til å indusere dannelse av sene/ligamentlignende vev. BMP-12 relaterte polypeptider omfatter fortrinnsvis en aminosyresekvens som vist i SEQ ID NO: 2. Polypeptidet omfatter fortrinnsvis aminosyrene nr -25, nr 1 eller nr 3 til nr 103 eller 104 som angitt i SEQ ID NO: 2; eller aminosyrene nr 1 eller nr 19 til nr 120 som angitt i SEQ ID NO: 26.1 en foretrukket utførelsesform kan det rensede polypeptidet være i form av en dimer som omfatter to subenheter som hver har aminosyresekvensen ifølge SEQ ID NO: 2.

I en annen utførelsesform omfatter foreliggende oppfinnelse sammensetninger omfattende en effektiv mengde av ovennevnte BMP-12 relaterte proteiner. I sammensetningene kan proteinet blandes sammen med en farmasøytisk akseptabel bærer.

Oppfinnelsen kan anvendes ved fremgangsmåter for sene/ligamentlignende vevsleging og vevsreparering, for behandling av tendinitt, eller andre sene- eller ligamentdefekter, og for indusering av sene/ligamentlignende vevsdannelse hos en pasient som trenger dette, omfattende administrering til nevnte pasient en effektiv mengde av ovennevnte sammensetning.

Andre utførelsesformer innbefatter kimære DNA-molekyler som omfatter en DNA-sekvens kodende for et propeptid fra et medlem av TGF-B superfamilien av proteiner koblet i riktig leseramme til en DNA-sekvens kodende for et BMP-12 relatert polypeptid. Et egnet propeptid er propeptidet fra BMP-2. Oppfinnelsen omfatter også heterodi-meriske proteinmolekyler som omfatter en monomer som har aminosyresekvensen vist i SEQ ID NO: 2, og en monomer med aminosyresekvensen til et annet protein fra TGF-B superfamilien.

Foreliggende oppfinnelse kan også anvendes ved fremgangsmåter for å indusere sene/- ligamentlignende vevsdannelse i en pasient som trenger dette omfattende administrering til nevnte pasient en effektiv mengde av en sammensetning som omfatter et protein som utviser evne til å indusere dannelse av sene/ligamentlignende vev, i det nevnte protein har en aminosyresekvens vist i SEQ ID NO: 2 eller SEQ ID NO: 4 eller SEQ ID NO: 26. Aminosyresekvensene er fortrinnsvis en av følgende: (a) aminosyrene nr -25, nr 1 eller nr 3 til nr 103 eller nr 104 til SEQ ID NO: 2; (b) aminosyrene nr 1 eller nr 19 til nr 119 eller nr 120 til SEQ ID NO: 4; (c) aminosyrene nr 1 eller nr 19 tilnr 119 eller nr 120 til SEQ ID NO: 26; (d) mutanter og/eller varianter av (a), (b) eller (c) som utviser evne til å danne sene og/eller ligament. I andre utførelsesformer ifølge ovennevnte fremgangsmåte blir proteinet kodet av en DNA-sekvens ifølge SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:3 eller SEQ ID NO: 25, mer foretrukket en av følgende: (a) nukleotidene nr 496, nr 571 eller nr 577 til nr 879 eller nr 882 av SEQ ID NO: 1; (b) nukleotidene nr 845 eller nr 899 til nr 1201 eller nr 1204 av SEQ ID NO: 3; (c) nukleotider nr 605 eller nr 659 til nr 961 eller nr 964 av SEQ ID NO:25; og (d) sekvenser som hybridiserer til (a) eller (b) under stringente hybridiseringsbetingelser og som koder for et protein som utviser evne til å danne sene/ligamentlignende vev.

Beskrivelse av sekvensene

SEQ ID NO: 1 er nukleotidsekvensen som koder for humant BMP-12.

SEQ ID NO: 2 er aminosyresekvensen som omfatter modent humant BMP-12 polypeptid.

SEQ ID NO: 3 er nukleotidsekvensen som koder for proteinet MP52.

SEQ ID NO: 4 er aminosyresekvensen som omfatter modent MP52 polypeptid.

SEQ ID NO: 5 er nukleotidsekvensen til en spesifikk amplifisert del av human BMP-12 kodende sekvens.

SEQ ID NO: 6 er aminosyresekvensen som blir kodet av nukleotidsekvensen til SEQ ID NO: 5.

SEQ ID NO: 7 er nukleotidsekvensen til en spesifikk amplifisert del av human VL-1 kodende sekvens.

SEQ ID NO: 8 er aminosyresekvensen som blir kodet av nukleotidsekvensen til SEQ ID NO:7.

SEQ ID NO: 9 er nukleotidsekvensen til plasmid pALVl-781, anvendt for ekspresjon av BMP-12 iE.coli.

SEQ ID NO: 10 er nukleotidsekvensen av et fragment av den murine klonen mVl. SEQ ID NO: 11 er aminosyresekvensen til et fragment av murint protein kodet av mVl. SEQ ID NO: 12 er nukleotidsekvensen til et fragment av murin klon mV2.

SEQ JD NO: 13 er arninosyresekvensen til et fragment av murin protein kodet av mV2. SEQ ID NO: 14 er nukleotidsekvensen til et fragment av murin klon mV9.

SEQ ID NO: 15 er aminosyresekvensen til et fragment av murint protein kodet av mV9. SEQ ID NO: 16 er aminosyresekvensen til en BMP/TGF-B/Vg-l protein konsensus sekvens. Første Xaa representerer enten Gin eller Asn; andre Xaa representerer enten Val eller Ile.

SEQ ID NO: 17 er nukleotidsekvensen til oligonukleotid nr. 1.

SEQ ID NO: 18 er aminosyresekvensen til en BMP<y>TGF-tS/Vg-lprotein konsensus sekvens. Xaa representerer enten Val eller Leu.

SEQ ID NO: 19 er nukleotidsekvensen til oligonukleotid nr 2.

SEQ ID NO: 20 er nukleotidsekvensen til oligonukleotid nr 3.

SEQ ID NO: 21 er nukleotidsekvensen til oligonukleotid nr 4.

SEQ ID NO: 22 er nukleotidsekvensen til oligonukleotid nr 5.

SEQ ID NO: 23 er nukleotidsekvensen til oligonukleotid nr 6.

SEQ ID NO: 24 er nukleotidsekvensen til oligonukleotid nr 7.

SEQ ID NO: 25 er nukleotidsekvensen til human VL-1 (BMP-13) kodende sekvens. SEQ ID NO: 26 er aminosyresekvensen som blir kodet av nukleotidsekvensen til SEQ ID NO: 25.

SEQ ID NO: 27 er nukleotidsekvensen kodende for en fusjon av BMP-2 propeptid og moden kodende sekvens til BMP-12.

SEQ ID NO: 28 er aminosyresekvensen som blir kodet av nukleotidsekvensen til SEQ ID NO: 27.

SEQ ID NO: 29 er nukleotidsekvensen kodende for murint mVl protein . X01 er Val, Ala, Glu eller Gly; X02 er Ser, Pro Thr eller Ala; X03 er Ser eller Arg; X04 er Leu, Pro, Gin eller Arg; X05 er Cys eller Trp; X06 er Val, Ala, Asp eller Gly; C07 er Val, Ala, Glu eller Gly; X08 er Gin, Lys eller Glu.

SEQ ID NO: 30 er aminosyresekvensen som blir kodet av nukleotidsekvensen til SEQ ID NO: 29. X01 til og med X08 er de samme som i SEQ ID NO: 29.

SEQ ID NO: 31 er nukleotidsekvensen som blir kodet av murin mV2 protein. X01 er Pro eller Thr; X02 er Val.

SEQ ID NO: 32 er aminosyresekvensen som blir kodet av nukleotidsekvensen til SEQ ID NO: 31. X01 og X02 er de samme som i SEQ ID NO: 31.

SEQ JD NO: 33 er nukleotidsekvensen som blir kodet av humant BMP-12 protein. SEQ ID NO: 34 er aminosyresekvensen som blir kodet av nukleotidsekvensen til SEQ ID NO: 33.

SEQ ID NO:35: er nukleotidsekvensen til oligonukleotid nr. 8.

Kort beskrivelse av figurene

Figur 1 er en sammenligning av humane BMP-12 og humane MP52 sekvenser.

DNA-sekvensene ifølge foreliggende oppfinnelse er nyttige for fremstilling av proteiner som induserer dannelse av sene/ligamentlignende vev, som ytterligere beskrevet nedenfor. DNA-sekvensene ifølge foreliggende oppfinnelse er videre nyttige for isolering og kloning av ytterligere DNA-sekvenser kodende for BMP-12 relaterte proteiner med lignende aktivitet. Disse BMP-12 relaterte proteinene kan være homologe fra andre arter, eller kan være relaterte proteiner innenfor samme arter.

Et ytterligere aspekt av foreliggende oppfinnelse er DNA-sekvenser kodende for ekspresjon av et sene/ligamentlignende vevsinduserende protein. Slike sekvenser innbefatter sekvensen til nukleotidene i en 5' til 3' retning illustrert i SEQ ID NO: 1 eller SEQ ID NO: 25, DNA-sekvenser som unntatt degenerasjonen til den genetiske koden, er iden-tiske med DNA-sekvensen SEQ ID NO: 1 eller 25, og som koder for proteiner ifølge SEQ ID NO: 2 eller 26. Videre innbefatter foreliggende oppfinnelse DNA-sekvenser som hybridiserer under stringente betingelser med DNA-sekvensen til SEQ ID NO: 1 eller 25 og som koder for et protein som har evne til å indusere dannelse av sene eller ligament. Foretrukne DNA-sekvenser innbefatter de som hybridiserer under stringente betingelser som beskrevet i Maniatis et al, Molecular Cloning (A Laboratory Manual). Cold Spring Harbor Laboratory (1982) sidene 387 til 389. Alleliske eller andre variasjoner av sekvensene til SEQ ID NO: 1 eller 25, enten slike nukleotidforandringer resulterer i forandringer i peptidsekvensen eller ikke, men hvor peptidsekvensen fortsatt har sene/ligamentlignende vevsinduserende aktivitet, er også innbefattet i foreliggende oppfinnelse.

BMP-12 DNA-sekvensen (SEQ ID NO: 1) og aminosyresekvensen (SEQ ID NO: 2) er angitt i sekvenslisten. Et annet protein som er nyttig for sammensetningene og fremgangsmåtene ifølge foreliggende oppfinnelse er VL-1. VL-1 er et BMP-12 relatert protein som ble klonet ved anvendelse av sekvensene fra BMP-12. Oppfinnerne har nå betegnet VL-1 som BMP-13. En del DNA-sekvens til VL-1 (SEQ ID NO: 7) og kodede aminosyresekvens (SEQ ID NO: 8); samt en DNA-sekvens som koder for moden VL-1 (SEQ ID NO:25) og kodet aminosyresekvens (SEQ ID NO: 26) er angitt i sekvenslisten. Til tross for at ytterligere beskrivelser er utført med hensyn til BMP-12 sekvensen til SEQ ID NO: 1 og 2, er det å bemerke at oppfinnelsen innbefatter lignende modifikasjoner og forbedringer som kan bli dannet på andre BMP-12 relaterte sekvenser, så som VL-1 sekvensen vist i SEQ ID NO: 25 og 26.

Sekvensen til BMP-12 vist i SEQ ID NO: 1 innbefatter hele den modne sekvensen og omtrent 190 aminosyrer av propeptidet. Den kodende sekvensen til modent humant BMP-12 protein ser ut til å begynne ved nukleotid nr 496 eller nr 571 og fortsette til og med nukleotid nr 882 til SEQ ID NO: 1. Det første cysteinet i syv cystein strukturen som er karakteristisk for TGF-B proteinene begynner ved nukleotid nr 577. Det siste cysteinet ender ved nr 879. Det er følgelig ventet at DNA-sekvenser kodende for aktive BMP-12 arter vil omfatte nukleotidene nr 577 til nr 879 til SEQ ID NO: 1.

Det er ventet at BMP-12, som uttrykt fra pattedyrceller så som CHO celler, eksisterer som en heterogen populasjon av aktive BMP-12 protein arter med varierende N-terminale ender. Det er ventet at alle aktive arter vil inneholde aminosyresekvensen begynnende med cysteinresidiet ved aminosyre nr 3 til SEQ ID NO: 2 og fortsette til og med minst cysteinresidie ved aminosyre 103 eller helt til stoppkodonet etter aminosyre 104. Andre aktive arter inneholder ytterligere aminosyresekvens i den N-terminale retningen. Som ytterligere beskrevet heri er det ventet at den N-terminale enden til aktive arter produsert fra pattedyrceller begynner etter forekomst av et konsensus spaltningssete, kodende for en peptidsekvens Arg-X-X-Arg. Det er følgelig ventet at DNA-sekvensene kodende for aktive BMP-12 proteiner vil ha en nukleotidsekvens som omfatter nukleotidsekvensen begynnende ved hvilke som helst av nukleotidene nr 196,199, 208, 217, 361,388,493,496 eller 571 til nukleotid nr. 879 eller 882 til SEQ ID NO: 1.

Den N-terminale enden til en aktiv art av human BMP-12 er blitt eksperimentelt bestemt ved ekspresjon i E. coli å være som følger: [M]SRXSRKPLHVDF hvor X angir et aminosyreresidie uten klart signal, som er i samsvar med et cysteinresidie ved denne beliggenheten. Det ser følgelig ut som om den N-terminale enden til denne arten av BMP-12 er ved aminosyre nr. 1 til SEQ ID NO: 1, og en DNA-sekvens kodende for nevnte arter av BMP-12 vil begynne ved nukleotid nr 571 til SEQ ID NO: 1. Den tilsy-nelatende molekylvekten til denne arten av human BMP-12 dimer ble bestemt ved SDS-PAGE å være omtrent 20-22 kd på en Novex 16% tricin gel. Humant BMP-12 protein eksisterer som en klar, farveløs oppløsning i 0,1% trifluoreddiksyre.

Som tidligere beskrevet er BMP-12 relaterte proteiner en undergruppe av BMPfTGF-B/Vg-1 familien av proteiner, inkludert BMP-12 og VL-1, som kan bli definert som sene/ligamentlignende vevsinduserende proteiner kodet av DNA-sekvenser som kan bli klonet og identifisert, for eksempel ved anvendelse av PCR, ved anvendelse av BMP-12 spesifikke primere, som primerne nr 6 og nr 7 beskrevet nedenfor, med reduserte stringensbetingelser. Det er foretrukket at DNA-sekvensene ifølge foreliggende oppfinnelse har minst omtrent 80% homologi på arninosyrenivå i forhold til aminosyrene med DNA kodende aminosyre nr 3 til nr 103 til SEQ ID NO: 1.1 henhold til foreliggende oppfinnelse angir betegnelsen BMP-12 relaterte proteiner ikke humant MP52 protein. Ved anvendelse av sekvensinformasjonen til SEQ ID NO: 1 og SEQ ID NO:3, og sammen-ligningen angitt i figur 1, hører det inn under dette fagområdet og konstruere primere til BMP-12 sekvensen som vil muliggjøre kloning av gener kodende for BMP-12 relaterte proteiner.

Et eksempel på BMP-12-relaterte proteiner ifølge foreliggende oppfinnelse er VL-1, fortrinnsvis referert til som BMP-13. Sekvensen til hele modne BMP-13 sekvensen og idet minst en del av propeptidet til BMP-13 er gitt i SEQ ID NO: 25. Som BMP-12 er det ventet at BMP-13, som uttrykt av pattedyrceller så som CHO-celler, eksisterer som en heterogen populasjon av aktive arter av BMP-13 proteinet med varierende N-terminale ender. Det er ventet at alle aktive arter vil inneholde aminosyresekvensen begynnende med cysteinresidiet ved aminosyre nr. 19 til SEQ ID NO:26 og fortsette forbi det minste cysteinresidiet ved aminosyre 119 eller helt til stoppkodonet etter aminosyre 120. Andre aktive arter inneholder ytterligere aminosyresekvens i den N-terminale retningen. Som ytterligere beskrevet heri vil den N-terminale enden til de aktive artene produsert av pattedyrceller begynne etter forekomsten av et konsensusspaltningssete kodende for en peptidsekvens Arg-X-X-Arg. Det er følgelig ventet at DNA-sekvensene kodende for aktive BMP-13 proteiner vil ha en nukleotidsekvens som omfatter nukleotidsekvensen begynnende ved hvilke som helst av nukleotidene nr 410,458,602,605 eller 659 tilnukleotid nr 961 eller 964 av SEQ ID NO: 25.

For å produsere renset sene/ligamentlignende vevsinduserende proteiner nyttige i foreliggende oppfinnelse ble en fremgangsmåte anvendt som omfatter dyrking av en vertscelle transformert med en DNA-sekvens som omfatter en egnet kodende sekvens, spesielt DNA kodende sekvens fra nukleotid nr 496, nr 571 eller nr 577 til nr 879 eller n 882 til SEQ ID NO: 1; og isolering og rensing fra kulturmediet av et protein som inneholder aminosyresekvensen eller en vesentlig homolog sekvens som representert ved aminosyrene nr -25, nr 1 eller nr 3 eller nr 104 til SEQ ID NO: 2.1 en annen utførelses-form omfatter den anvendte fremgangsmåten dyrking av en vertscelle transformert med en DNA-sekvens som omfatter en egnet kodende sekvens, spesielt DNA-kodende sekvens fra nukleotid nr 605 eller nr 659 til nr 961 eller nr 964 til SEQ ID NO: 25; og isolering og rensing fra kulturmediet av et protein som inneholder aminosyresekvensen eller en vesentlig homolog sekvens som representert ved aminosyrene nr 1 eller nr 19 til nr 119 eller nr 120 til SEQ ID NO: 26.

Humant MP52 DNA er beskrevet i W093/16099 og beskrivelsen er inkorporert heri som referanse. Dette dokumentet beskriver ikke evnen som proteinet har til å danne sene/ligamentlignende vev, eller anvendelse derav i sammensetninger for induksjon av sene/ligamentlignende vev. Humant MP52 ble opprinnelig isolert ved anvendelse av RNA fra humant embryovev. Human MP52 nukleotidsekvens (SEQ ID NO:3) og kodede aminosyresekvenser (SEQ ID NO:4) er angitt i sekvenslisten heri. MP52 proteinet ser ut til å begynne ved nukleotid nr. 845 til SEQ ID NO: 3 og fortsetter til nukleotid nr. 1204 til SEQ ID NO: 3. Det første cysteinet av 7 cysteinstrukturen karakteristisk for TGF-6-proteinene begynner ved nukleotid nr. 899. Det siste cysteinet slutter ved nr. 1201. Andre aktive former av MP52 proteinet kan ha ytterligere nukleotider ved den N-terminale retningen fra nukleotid nr. 845 til SEQ ID NO:3.

Rensede humane MP52 proteiner ifølge foreliggende oppfinnelse kan bli produsert ved dyrking av en vertscelle transformert med en DNA-sekvens omfattende DNA-kodende sekvens til SEQ ID NO: 3 fra nukleotid nr 845 til nr 1204, og isolering og rensing fra kulturmediet et protein som inneholder aminosyresekvensen eller en vesentlig homolog sekvens som representert ved aminosyrene nr 1 til nr 120 til SEQ ID NO:4. Det er også ventet at aminosyresekvensen fra aminosyrene nr 17 eller nr 19 til nr 119 eller nr 120 til SEQ ID NO:4 vil beholde aktivitet. DNA-sekvensen fra nukleotidene nr 845, nr 893 eller nr 899 til nr 1201 eller nr 1204 er ventet å kode for aktive proteiner.

For ekspresjon av proteinet i pattedyrvertsceller blir vertscellen transformert med en kodende sekvens kodende for et propeptid egnet for sekresjon av proteinene fra vertscellen som er koblet i riktig leseramme til den kodende sekvensen for modent protein. Se for eksempel US-PS 5.168.050 og beskrivelsen er inkorporert heri som referanse, hvor et DNA kodende for en forløperdel av et pattedyrprotein forskjellig fra BMP-2 er koblet til DNA kodende for et modent BMP-2 protein. Foreliggende oppfinnelse innbefatter følgelig kimære DNA-molekyler som omfatter en DNA-sekvens kodende for et propeptid fra et medlem av TGF-B superfamilien til proteinene og som er koblet i riktig leseramme til en DNA-sekvens kodende for et sene/ligamentlignende vevsinduserende polypeptid. Betegnelsen "kimært" blir anvendt for å signifisere at propeptidet kommer fra et annet polypeptid enn det kodede modne polypeptidet. Vertscellen kan selvfølgelig bli transformert med en DNA-sekvens kodende for sekvensen som koder for det native propeptidet koblet i riktig leseramme til en kodende sekvens kodende for det modne proteinet vist i SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:4 eller SEQ ID NO: 26. Hele sekvensen til det native propeptidet kan bli bestemt ved hjelp av fremgangsmåter kjent innenfor fagområdet ved anvendelse av sekvenser beskrevet i SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:3 eller SEQ ID NO:25 for å konstruere en egnet probe for identifisering og isolering av hele klonen.

Foreliggende oppfinnelse omfatter også nye DNA-sekvenser, fri for assosiasjon med DNA-sekvenser kodende for andre proteinholdige materialer, og kodende for ekspresjon av sene/ligamentlignende vevsinduserende proteiner. Disse DNA-sekvensene innbefatter de som er vist i SEQ ID NO: 1 i en 5' til 3' retning og sekvenser som hybridiserer der-til under stringente hybridiseringsbetingelser (for eksempel 0, IX SSC, 0,1 % SDS ved 65°C, se T. Maniatis et al, Molecular Cloning (A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory (1982), sidene 387 til 389] og som koder for et protein med sene/- ligamentlignende vevsinduserende aktivitet.

DNA-sekvenser som koder for proteiner som blir kodet for av sekvensene ifølge SEQ ID NO: 1 eller SEQ ID NO:25, eller proteiner som omfatter aminosyresekvensen til SEQ ID NO: 2 eller SEQ ID NO: 26, men som har forskjellig kodonsekvens på grunn av degenerasjonen til den genetiske koden eller alleliske variasjoner (naturlig forekommende baseforandringer i arts populasjonen som kan eller som ikke behøver å resultere i en aminosyreforandring) også koder for sene/ligamentlignende vevsinduserende proteiner beskrevet heri. Variasjoner i DNA-sekvensene til SEQ ID NO: 1 eller SEQ ID NO:25 som blir forårsaket av punktmutasjoner eller ved induserte modifikasjoner (inkludert innskudd, delesjon og substitusjon) for å forsterke aktiviteten, halveringstiden eller produksjonen av polypeptidene som kodes for er også innbefattet i foreliggende oppfinnelse.

Et annet aspekt av foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en ny fremgangsmåte for fremstilling av sene/ligamentlignende vevsinduserende proteiner. Fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse innbefatter dyrking av en egnet cellelinje, som er blitt transformert med en DNA-sekvens kodende for et protein ifølge oppfinnelsen under kontroll av kjente regulatoriske sekvenser. Transformerte vertsceller blir dyrket og proteinene isolert og renset fra kulturmediet. De rensede proteinene er vesentlig fri for andre proteiner som de blir produsert med samt andre kontaminanter.

Egnede celler eller cellelinjer kan være pattedyrceller, så som kinesisk hamsterovarie-celler (CHO). Som beskrevet ovenfor krever ekspresjon av protein i pattedyrcellene et hensiktsmessig propeptid for å forsikre sekresjon av proteinet. Seleksjon av egnede pattedyrvertsceller og fremgangsmåte for transformasjon, dyrking, amplifikasjon, scree-ning, produkt produksjon og rensing er kjent innenfor fagområdet. Se for eksempel Gething and Sambrook, Nature, 293:620-625 (1981), eller alternativt Kaufman et al, Mol. Cell.Biol., 5(7): 1750-1759 (1985) eller Howley et al. US-PS 4.419.446. En annen egnet pattedyrcellelinje, som er beskrevet i eksemplene, er ape COS-1 cellelinjen. Patte-dyrcellen CV-1 kan også være egnet.

Bakterielle celler kan også være egnede verter. For eksempel er de forskjellige stam-mene av E. coli (for eksempel HB101, MC1061) velkjente som vertsceller innenfor området bioteknologi. Forskjellige stammer av B.subtilis, Peseudomonas eller andre bacil-ler og lignende kan også bli anvendt i denne fremgangsmåten. For ekspresjon av proteinet i bakterielle celler er DNA kodende for et propeptid ikke nødvendig.

Bakteriell ekspresjon av pattedyrproteiner, inkludert medlemmer av TGF-B familien er kjent for å produsere proteinene i en ikke-glykosylert form, og i form av uoppløselige pelleter, kjent som inklusjonslegemer. Teknikker er blitt beskrevet innenfor fagområdet for oppløsning av disse inklusjonslegemene, denaturering av proteinet ved anvendelse av et chaotropisk middel og refolding av proteinet tilstrekkelig for å muliggjøre produksjon derav i en oppløselig form. Se for eksempel EP 0433225, og beskrivelsen er inkorporert heri som referanse.

Alternativt er fremgangsmåter blitt beskrevet som omgår inklusjonslegemedannelse, så som ekspresjon av genfusjonsproteiner, hvori det ønskede proteinet blir uttrykt som et fusjonsprotein med en fusjonspartner. Fusjonsproteinet blir senere utsatt for spaltning for å produsere det ønskede proteinet. Et eksempel på et slikt genfusjonsekspresjonssys-tem for E. coli er basert på anvendelse av E. coli tioredoksin genet som en fusjonspartner, LaVallie et al., Bio/Technology, 11:187-193 (1993), og beskrivelsen er herved inkorporert som referanse.

Mange stammer av gjærceller som er kjent for fagfolk innenfor dette området kan også bli anvendt som vertscelle for ekspresjon av polypeptidene ifølge foreliggende oppfinnelse. Alternativt kan insektceller anvendes som vertsceller i fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse. Se for eksempel Miller et al, Genetic Engineering, 8:277-298 (Plenum Press 1986) og referansene sitert deri.

Et annet aspekt av foreliggende oppfinnelse tilveiebringer vektorer for anvendelse i fremgangsmåten for ekspresjon av disse sene/ligamentlignende vevsinduserende proteinene. Vektorene inneholder hele nye DNA-sekvenser som er beskrevet ovenfor og som koder for de nye faktorene ifølge oppfinnelsen. I tillegg inneholder vektorene hensiktsmessige ekspresjonskontrollsekvenser som muliggjør ekspresjon av proteinsekvensene. Alternativt er vektorer som inkorporerer modifiserte sekvenser som beskrevet ovenfor også utførelsesformer ifølge foreliggende oppfinnelse. I tillegg kan sekvensene ifølge SEQ ID NO: 1 eller SEQ ID NO: 3 eller SEQ ID NO: 25 manipuleres for å uttrykke et modent protein ved deletering av propeptidsekvensene og erstatning av disse med sekvenser som koder for fullstendig propeptid til BMP proteinene eller medlemmer av TGF-B superfamilien. Foreliggende oppfinnelse innbefatter følgelig kimære DNA-molekyler som koder for et propeptid fra et medlem av TGF-B superfamilien koblet i riktig leseramme til en DNA-sekvens kodende for et protein med aminosyresekvensen ifølge SEQ ID NO: 2 eller SEQ ID NO: 4 eller SEQ ID NO: 26. Vektorene kan bli anvendt i fremgangsmåten for transformering av cellelinjer og inneholder selekterte regulatoriske sekvenser i operativ assosiasjon med DNA kodende sekvenser ifølge oppfinnelsen som har evne til å lede replikasjon og ekspresjon derav i selekterte vertsceller. Regulatoriske sekvenser for slike vektorer er velkjente for fagfolk innenfor dette området og kan bli valgt avhengig av vertscellene. En slik seleksjon er rutinemessig og utgjør ikke en del av foreliggende oppfinnelse.

Et protein ifølge foreliggende oppfinnelse som induserer sene/ligamentlignende vev eller annen vevsdannelse i tilfeller hvor et slikt vev ikke normalt blir dannet kan anvendes for leging av sene eller ligament skader, deformiteter og andre sene eller ligament defekter i mennesker og andre dyr. En slik preparering som anvender et sene/ligamentlignende vevsinduserende protein kan ha profylaktisk anvendelse for å forhindre skade på sene eller ligamentvev, samt anvendelse ved forbedret fiksering av sene eller ligament til ben eller andre vev, og for reparering av defekter på sene eller ligament vev. De novo sene/ligamentlignende vevsdannelse indusert av en sammensetning ifølge foreliggende oppfinnelse bidrar til reparering av kongenital, traume indusert, eller andre sene eller ligament defekter med annen opprinnelse, og er også nyttig innen kosmetisk plastisk kirurgi for kobling eller reparering av sener eller ligamenter. Sammensetningene ifølge oppfinnelsen kan også være nyttige for behandling av tendinitt, carpal tunnelsyndrom og andre sene- eller ligamentdefekter. Sammensetningene ifølge foreliggende oppfinnelse kan også anvendes i andre indikasjoner hvor det er ønskelig å lege eller regenerere sene og/eller ligamentvev. Slike indikasjoner innbefatter, uten begrensning, regenerering eller reparering av skader på cementale fibre, så som ved tendonitt, og regenerering eller reparering av sene-til-ben kobling. Sammensetningene ifølge foreliggende oppfinnelse kan tilveiebringe et miljø for å tiltrekke sene- eller ligamentdannende celler, stimulere veksten av sene- eller ligamentdannende celler eller indusere differensiering av forlø-perne til sene- eller ligamentdannende celler.

BMP-12 relaterte proteiner kan bli isolert fra dyrkningsmediet og renset ved isolering av disse fra andre proteinholdige materialer som de blir produsert fra og fra andre kontaminanter som er tilstede. Proteinene ifølge foreliggende oppfinnelse har evnen til å indusere dannelse av sene/ligamentlignende vev. Disse proteinene kan videre bli karakterisert ved evnen til å demonstrere sene/ligamentlignende vevsdannelsesaktivitet i rotte ektopisk implantatanalyse beskrevet nedenfor. Disse proteinene kan ha evnen til å indusere dannelse av andre vevstyper, så som ligamenter.

Sene/ligamentlignende vevsinduserende proteiner gitt heri innbefatter også faktorer som blir kodet av sekvensene som er lik de til SEQ ID NO: 1 eller SEQ ID NO: 25, men hvor modifikasjoner er naturlig gitt (for eksempel alleliske variasjoner i nukleotidsekvensen som kan resultere i aminosyreforandringer i polypeptidet) eller med hensikt otn-konstruert. For eksempel kan syntetiske polypeptider fullt eller delvis duplikere kontinu-erlige sekvenser til aminosyreresidiene ifølge SEQ ID NO: 2. Disse sekvensene i kraft av deres felles primære, sekundære eller tertiære strukturelle og konformasjonsmessige karaktertrekk med sene/ligamentlignende vevsvekstfaktor polypeptider ifølge SEQ ID NO: 2, kan ha sene/ligamentlignende eller andre vevsvekstfaktor biologiske egenskaper felles deri. De kan følgelig anvendes som biologiske aktive substituenter for naturlig forekommende sene/ligamentlignende vevsinduserende polypeptider i terapeutiske sammensetninger og prosesser.

Andre spesifikke mutasjoner i sekvensene til sene/ligamentlignende vevsinduserende proteiner beskrevet heri innbefatter modifikasjoner av glykosyleirngsseter. Disse modi-fikasjonene kan innbefatte O-koblede eller N-koblede glykosyleirngsseter. Blant annet resulterer fravær av glykosylering eller bare delglykosylering av aminosyresubstitusjon eller delesjon ved asparaginkoblede glykosyleringsgjenkjenningsseter. Asparaginkoblede glykosylerings gjenkjenningsseter omfatter tripeptidsekvenser som blir spesifikt oppdaget av hensiktsmessige cellulære glykosyleringsenzymer. Disse tripeptidsekven-sene kan være asparagin-X-threonin, asparagin-X-serin eller asparagin-X-cystein, hvor X vanligvis er en hvilke som helst aminosyre unntatt prolin. Forskjellige aminosyre sub-stitusjoner eller delesjoner ved en eller begge av første eller tredje aminosyreposisjonene til glykosyleringsgjenkjenningssete (og/eller aminosyredelesjon ved den andre posisjo-nen) resulterer i ikke-glykosylering ved modifisert tripeptidsekvens. I tillegg vil bakteriell ekspresjon av proteinet også resultere i produksjonen av et ikke-glykosylert protein, selv hvis glykosyleirngssetene blir latt stå umodifiserte.

Sammensetningene ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter et renset BMP-12 relatert protein som kan bli produsert ved dyrking av en celle transformert med DNA-sekvensen ifølge SEQ ID NO: l eller SEQ ID NO: 25 og isolering og rensing av proteinet som har aminosyresekvensen til SEQ ID NO: 2 eller SEQ ID NO: 26 fra kulturmediet. Det rensede, uttrykte proteinet er vesentlig fri fra andre proteinholdige materialer som det blir produsert sammen med samt uten andre kontaminanter. Det isolerte rensede proteinet antas å utvise sene/ligamentlignende vevsdannelsesaktivitet, og annen vevs vekstaktivi-tet, så som ligament regenerering. Proteinene ifølge oppfinnelsen kan bli ytterligere karakterisert med evnen til å demonstrere sene/ligamentlignende vevsdannende aktivitet i rotteanalysen beskrevet nedenfor.

Sammensetninger for indusering av sene/ligamentlignende vevsdannelse ifølge oppfinnelsen kan omfatte en effektiv mengde av et sene/ligamentlignende vevsinduserende protein, hvor nevnte protein omfatter aminosyresekvensen ifølge SEQ ID NO: 2, fortrinnsvis aminosyrene nr -25, nr 1 eller nr 3 til nr 103 eller nr 104 til SEQ ID NO:2; eller aminosyrene nr 1 eller nr 19 til nr 120 til SEQ ID NO: 26; samt mutanter og/eller varianter ifølge SEQ ID NO: 2 eller SEQ ID NO: 26, som utviser evnen til å danne sene og/eller ligamentlignende vev.

Sammensetningene ifølge foreliggende oppfinnelse kan videre omfatte ytterligere proteiner, så som ytterligere medlemmer av TGF-B superfamilien av proteiner, så som aktivi-ner. Et annet aspekt ifølge oppfinnelsen tilveiebringer farmasøytiske sammensetninger inneholdende en terapeutisk effektiv mengde av et sene/ligamentinduserende protein, så som BMP-12 eller VL-1, i en farmasøytisk akseptabel bærer. Disse sammensetningene kan bli anvendt til å indusere dannelse av sene/ligamentlignende vev eller annet vev. Det antas at slike sammensetninger også kan bli anvendt for sene og ligament reparering, leging av sår og annen vevsreparering, så som hudreparering. Det blir videre betraktet at proteinene ifølge oppfinnelsen kan øke neuronaloverlevelsen og derfor være nyttig for transplantering og behandling av tilstander som utviser en reduksjon i neuro-nal overlevelse. Sammensetningene ifølge oppfinnelsen kan videre innbefatte minst et annet terapeutisk nyttig middel, så som BMP proteinene BMP-1, BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6 og BMP-7, blant annet beskrevet i US-PS 5.108.922; 5.013.649; 5.116.748; 5.106.748; 5.187.076; og 5.141.905; BMP-8, beskrevet i PCT publikasjon WO91/18098; BMP-9, beskrevet i PCT publikasjon WO93/00432; og BMP-10 eller BMP-11, beskrevet i inngitte patentsøknader med serienr. 08/061.695 og 08/061/464, inngitt mai 12,1993. Beskrivelsen av ovennevnte dokumenter er herved inkorporert som referanse.

Sammensetningene ifølge oppfinnelsen kan omfatte, i tillegg til et sene/ligamentinduser-ende protein så som BMP-12 eller VL-1 (BMP-13), andre terapeutiske nyttige midler som innbefatter MP52, epidermal vekstfaktor (EGF) fibroblast vekstfaktor (FGF), blod-plateavledet vekstfaktor (PDGF), transformerende vekstfaktorer (TGF-a og TGF-B) og fibroblast vekstfaktor-4 (FGF-4), parathyroidhormon (PTH), leukemi inhibitorisk faktor (LIF/HILDA/DIA), insulinlignende vekstfaktorer (IGF-I og IGF-IT). Deler av disse mid-lene kan også anvendes i sammensetningene ifølge oppfinnelsen. For eksempel gir en sammensetning som omfatter både BMP-2 og BMP-12 implantert sammen opphav til både ben og sene/ligamentlignende vev. En slik sammensetning kan være nyttig for behandling av defekter i embryonisk ledd hvor sene/ligamenter og ben dannes samtidig, ved siden av liggende anatomiske beliggenheter, og kan være nyttig for regenerering av vev ved stedet hvor senen blir festet til benet. Det er betraktet at sammensetningen ifølge oppfinnelsen kan være nyttig for leging av sår, så som leging av hud og beslektet vevsreparering. Sårtyper innbefatter, men er ikke begrenset til brannsår, innsnitt og andre sår (se for eksempel PCT publikasjon WO84/01106 for en beskrivelse av leging av sår og beslektet vevsreparering).

Det antas at proteinene ifølge oppfinnelsen kan virke sammen med eller kanskje syner-gistisk med andre beslektede proteiner og vekstfaktorer. Ytterligere terapeutiske metoder og sammensetninger omfatter følgelig en terapeutisk mengde av minst et protein ifølge oppfinnelsen med en terapeutisk mengde av minst et av BMP-proteinene beskrevet ovenfor. Slike sammensetninger kan omfatte separate molekyler av BMP-proteiner eller heteromolekyler som omfatter forskjellige BMP deler. En fremgangsmåte og sammensetning ifølge oppfinnelsen kan for eksempel omfatte en disulfidkoblet dimer omfattende en BMP-12 relatert protein subenhet og i en enhet fra en av "BMP" proteinene beskrevet ovenfor. Foreliggende oppfinnelse omfatter følgelig sammensetninger som omfatter et renset BMP-12 relatert polypeptid som er en heterodimer hvor en subenhet omfatter aminosyresekvensen fra aminosyre nr. 1 til aminosyre nr. 104 til SEQ ID NO: 2, og en subenhet som omfatter en aminosyresekvens for et benmorfogent protein valgt fra gruppen omfattende BMP-1, BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-8, BMP-9, BMP-10 og BMP-11. En ytterligere utførelsesform kan omfatte en heterodimer av disulfidbundet sene/ligamentlignende vevsinduserende deler så som BMP-12, VL-1 (BMP-13) eller MP52. For eksempel kan heterodimeren omfatte en subenhet som omfatter en aminosyresekvens fra nr.l til nr. 104 ifølge SEQ ID NO: 2 og den andre subenheten kan omfatte en aminosyresekvens fra nr. 1 til nr. 120 til SEQ ID NO: 4 eller nr. 1 til nr. 120 til SEQ ID NO: 26. Sammensetningene ifølge foreliggende oppfinnelse kan videre bli kombinert med andre midler som er nyttige for behandling av defekter, sår eller vev.

Preparering og formulering av slike fysiologiske akseptable proteinsammensetninger, men hensyn til pH, isotonisitet, stabilitet og lignende, hører inn under dette fagområdet. Terapeutiske sammensetninger er også verdifulle for veterinær anvendelser på grunn av mangel på artsspesifisitet i TGF-B proteinene. Husdyr og fullblodshester i tillegg til mennesker er ønskelige pasienter for slik behandling med sammensetningene ifølge foreliggende oppfinnelse.

Terapeutiske fremgangsmåter innbefatter administrering av sammensetningen topisk, systemisk eller lokalt som et implantat eller en innretning. Når administrert er den terapeutiske sammensetningen ifølge oppfinnelsen selvfølgelig i en pyrogenfri, fysiologisk akseptabel form. Sammensetningen kan fortrinnsvis bli innkapslet eller injisert i en viskøs form for levering til sted med vevsskade. Topisk administrering kan være egnet for leging av sår og reparering av vev. Terapeutiske nyttige midler forskjellige fra proteiner som også eventuelt kan bli innbefattet i sammensetningen som beskrevet ovenfor kan alternativt eller i tillegg, bli administrert samtidig eller sekvensielt med sammensetningen i fremgangsmåtene ifølge oppfinnelsen.

Sammensetningene kan også innbefatte en hensiktsmessig matrise og/eller sekvestreringsmiddel som en bærer. Matrisen kan blant annet understøtte sammensetningen eller utgjøre en overflate for sene ligamentlignende vevsdannelse og/eller annen vevsdannelse. Matrisen kan tilveiebringe sakte frigjøring av proteinet og/eller det hensiktsmessige miljøet for presentasjon derav. Sekvestreringsmiddelet kan være en forbindelse som hjelper administreringen ved injisering eller andre metoder, eller kan redusere migrering av proteinet fra applikasjonssetet.

Valg av et bærermateriale er basert på biokompatibilitet, biodegraderbarhet, mekaniske egenskaper, kosmetisk utseende og interfase egenskaper. Den bestemte applikasjonen av sammensetningene vil definere den hensiktsmessige formuleringen. Potensielle matriser for sammensetningene kan være biodegraderbare og kjemisk definerte. Ytterligere matriser består av rene proteiner eller ekstracellulære matrisekomponenter. Andre potensielle matriser er ikke biodegraderbare og kjemisk definerte. Foretrukne matriser innbefatter kollagenbaserte materialer, så som Helistat svamp (Integra LifeSciences, Plainsboro, N.J.), eller collagen i en injiserbar form, samt sekvestreringsmidler, som også kan være biodegraderbare, og som kan innbefatte alkylcelluloseholdige materialer.

En annen foretrukket klasse av protein er porøse partikkelformige polymermatriser, inkludert polymerer av poly(melkesyre), poly(glykolsyre) og kopolymerer av melkesyre og glykolsyre. Disse matrisene kan også innbefatte et sekvestreirngsmiddel. Egnede polymermatriser er for eksempel beskrevet i WO 93/00050, og beskrivelsen er inkorporert heri som referanse.

En foretrukket familie av sekvestreringsmidler er celluloseholdige materialer så som al-kylcellulose (inkludert hydroksyalkylcellulose), inkludert metylcellulose,etylcellulose, hydroksyetylcellulose, hydroksypropylcellulose, hydroksypropylmetylcellulose og karboksymetylcellulose, og den mest foretrukne er kationiske salter av (CMC). Andre foretrukne sekvestreringsmidler innbefatter hyaluronsyre, natriumalginat, poly(etylen-glykol), polyoksyetylenoksyd, karboksyvinylpolymer og poly(vinylalk<p>hol). Mengden av sekvestreringsmiddel som er nyttig heri er 0,5-20 vektprosent, fortrinnsvis 1-10 vektprosent basert på total formuleirngsvekt, som representerer mengden som er nødvendig for å forhindre desorpsjon av proteinet fra polymermatrisen og tilveiebringe hensiktsmessig håndtering av sammensetningen, men ikke så mye at forløpercellene blir forhindret fra infiltrering av matrisen og derved gir proteinet muligheten av å assistere aktiviteten til forløpercellene.

Ytterligere valgfrie komponenter som er nyttige ved anvendelse av applikasjonen innbefatter for eksempel kryogene beskyttelsesmidler så som mannitol, sukkrose, lak-tose, glukose eller glycin (for å beskytte proteinet fra degradering i løpet av lyofilise-ring), antimikrobielle konserveringsmidler så som metyl eller propylparabener og ben-zylalkohol; antioksyderingsmidler så som EDTA, sitrat og BHT (butylert hydroksyto-luen); og overflateaktive midler så som poly(sorbater) og poly(oksetylener); osv.

Som beskrevet ovenfor kan sammensetningen ifølge oppfinnelsen bli anvendt i fremgangsmåter for behandling av et antall sendefekter, så som regenerering av sene/ligamentlignende vev i områder med sene eller ligamentskade, for å assistere i reparering av revning av senevev, ligamenter og forskjellige andre typer av vevsdefekter eller sår. Disse fremgangsmåtene omfatter administrering til en pasient som trenger et slik sene/- ligamentlignende vev eller annen vevsreparering av en sammensetning som omfatter en effektiv mengde av et sene/ligamentlignende vevsinduserende protein, som beskrevet i SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 og/eller SEQ ID NO: 26. Disse fremgangsmåtene kan også innbefatte administrering av et sene/ligamentlignende vevsinduserende protein sammen med minst et av BMP proteinene beskrevet ovenfor.

I en annen utførelsesform kan fremgangsmåtene innbefatte administrering av et heterodimerisk protein hvor en av monomerene er et sene/ligamentlignende vevsinduserende polypeptid så som BMP-12, VL-1 (BMP-13) eller MP52, og den amdre monomeren er et medlem av TGF-B superfamilien av vekstfaktorer. I tillegg kan disse fremgangsmåtene også omfatte administrering av et sene/ligamentlignende vevsinduserende protein med andre vekstfaktorer inkludert EGF, FGF, TGF-ot, TGF-B og IGF.

Et ytterligere aspekt av oppfinnelsen er en sammensetning for reparering av sene/ligamentlignende vev, for reparering av sene eller ligament samt behandling av tendinitt og andre tilstander relatert til sene eller ligament defekter. Slike sammensetninger omfatter en terapeutisk effektiv mengde av en eller flere sene/ligamentlignende vevsinduserende proteiner, så som BMP-12, et BMP-12 relatert protein, eller MP52, blandet sammen

med en farmasøytisk akseptabel bærer eller matrise.

Doseringsregimet vil bestemmes av behandlende lege ved å betrakte forskjellige faktorer som modifiserer virkningen til sammensetningen, for eksempel mengden av sene eller ligamentvev som det er ønskelig at skal bli dannet. Sted for sene eller ligamentskade, tilstanden til skadet sene eller ligament, størrelsen på såret, type skadet vev, pasi-entens alder kjønn og diett, alvorligheten av eventuell infeksjon, administreringstid og andre kliniske faktorer. Doseringen kan variere med matrisetype som blir anvendt ved rekonstitusjon og type av ytterligere proteiner i sammensetningen. Tilsetning av andre kjente faktorer, så som IGF-1 (insulin lignende vekstfaktor I), til den endelige sammensetningen kan også påvirke doseringen.

Progresjonen kan bli registrert ved periodisk vurdering av sene/ligamentlignende vevsdannelse, eller sene eller ligamentvekst og/eller reparering. Progresjonen kan bli registrert ifølge fremgangsmåter kjent innenfor fagområdet for eksempel røntgenstråler, ar-troskopi, histomorfometriske bestemmelser og tetracyklin merking.

Foreliggende oppfinnelse omfatter et DNA-molekyl kjennetegnet ved at det har en sekvens som koder for et benmorfogenisk protein med evne til å indusere dannelse av sene/ligamentlignende vev, idet DNA-molekylet omfatter:

(a) nukleotid nr 196, nr 199, nr 208, nr 217, nr 361, nr 388, nr 493, nr 496, nr 571 eller nr 577 til nr 879 eller nr 882 av SEQ ID NO: 1; (b) nukleotider kodende for aminosyrene nr. 25, nr 1 eller nr 3 til nr 103 eller nr 104 av SEQ ID NO: 2; (c) nukleotid nr 410, nr 458, nr 602, nr 605 eller nr 659 til nr 961 eller nr 964 av SEQ ID NO: 25; (d) nukleotider kodende for aminosyrene nr 1 eller nr 19 til nr 119 eller nr 120 av SEQ ID NO: 26; (e) naturlig forekommende aleliske sekvenser eller ekvivalente degenererte kodonsekvenser av hvilke som helst ifølge (a) til (d); eller (f) sekvenser som hybridiserer til hvilke som helst av (a) til (e) under standard hybridiseringsbetingelser, eller et komplement av disse.

Foreliggende oppfinnelse omfatter videre et kimært DNA-molekyl kjennetegnet ved at det omfatter en DNA-sekvens som koder for et propeptid fra et medlem av TGF-B superfamilien av proteiner koblet i riktig leseramme til en DNA-sekvens ifølge krav 1.

Foreliggende oppfinnelsen omfatter også en vektor kjennetegnet ved at den omfatter DNA-molekylet ifølge det ovenstående i operativ assosiasjon med en ekspresjonskontrollsekvens derav.

Videre omfatter foreliggende oppfinnelse en vertscelle kjenntegnet ved at den er transformert med DNA-molekyler ifølge det ovenstående.

Videre omfatter foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for fremstilling av et BMP-12 eller BMP-12-relatert protein som har evnen til å indusere dannelse av sene/ligamentlignende vev kjennetegnet ved at den omfatter:

(a) dyrking av vertscellen ifølge det ovenstående og

(b) isolering og, eventuelt, rensing av nevnte BMP-12 eller BMP-12 relaterte protein fra

kulturmediet.

Videre omfatter foreliggende oppfinnelse et BMP-12 eller BMP-12-relatert protein med evnen til å indusere dannelse av sene/ligamentlignende vev kjennetegnet ved at det kodes av DNA-molekylet ifølge det ovenstående eller produseres ifølge fremgangsmåten beskrevet over.

Foreliggende oppfinnelse omfatter videre et polypeptid kjennetegnet ved at det er i form av en dimer omfattende to subenheter, hver med aminosyresekvensen kodet av DNA-molekylet ifølge ovenstående.

Oppfinnelsen omfatter også et heterodimerisk proteinmolekyl som er kjennetegnet ved at det omfatter en monomer med aminosyresekvensen til polypeptidet som beskrevet ovenfor, og en monomer som har aminosyresekvensen til et protein fra TGF-B superfamilien.

Videre omfatter foreliggende oppfinnelse en farmasøytisk sammensetning kjennetegnet ved at den omfatter polypeptidet eller proteinet som beskrevet ovenfor, eventuelt blandet sammen med en farmasøytisk akseptabel bærer.

Videre omfatter oppfinnelsen anvendelse av polypeptidet eller proteinet ifølge det ovenstående for fremstilling av en sammensetning for indusering av sene/ligamentlignende vevsdannelse hos en pasient som trenger dette.

Foreliggende oppfinnelse vedrører til slutt anvendelse av polypeptidet eller proteinet som beskrevet ovenfor for fremstilling av en sammensetning for behandling av tendinitt, eller annen sene- eller ligamentdefekt, hos en pasient som trenger dette.

Følgende eksempler illustrerer utførelse av foreliggende oppfinnelse for isolering og karakterisering av humant sene/ligamentlignende vevsinduserende protein og anvendelse av disse for å isolere andre sene/ligamentlignende vevsinduserende proteiner, oppnåelse av humane proteiner, uttrykking av proteinene ved hjelp av rekombinante teknikker og demonstrering av evnen som sammensetningene ifølge foreliggende oppfinnelse har til å danne sene/ligamentlignende vev i en in vivo modell. Til tross for at eksemplene demonstrerer oppfinnelsen med hensyn på BMP-12 kan det med mindre modifikasjoner innenfor dette fagområdet oppnås samme resultater med MP52 og VL-1.

Eksempel 1

Isolering av DNA

DNA-sekvenser kodende for BMP-12 og BMP-12 relaterte proteiner kan bli isolert ved hjelp av forskjellige teknikker kjent innenfor fagområdet. Som beskrevet nedenfor kan oligonukleotidprimerene bli konstruert på grunnlag av aminosyresekvensene tilstede i andre BMP-proteiner, Vg-1 relaterte proteiner og andre proteiner fra TGF-B superfamilien. Regioner inneholdende aminosyresekvenser som er sterkt konserverte med BMP familien av proteiner og innenfor andre medlemmer av TGF-B 1 superfamilien av proteiner kan bli identifisert og konsensus aminosyresekvensene til disse sterkt konserverte regionene kan bli konstruert basert på likheten til tilsvarende regioner til individuelle BMP/TGF-B/Vg-1 proteiner. Et eksempel på en slik konsensusaminosyre-sekvens er angitt nedenfor.

Konsensus aminosyresekvens (1):

Trp-Gln/Asn-Asp-Trp-De-Val/Ile-Ala (SEQ ID NO: 16)

hvor X/Y indikerer at hvilke som helst aminosyreresidie kan fremkomme ved den posi-sjonen.

Følgende oligonukleotid er konstruert på grunnlag av ovennevnte identifiserte konsen-susaminosyresekvens (1):

Denne oligonukleotidsekvensen blir syntetisert på en automatisert DNA synthesizer. Standardnukleotidsymboler i ovennevnte identifiserte oligonukleotidprimere er som følger: A, adenosin; C, cytosin; G, guanin; T, tymidin, N, adenosin eller cytosin eller guanin eller tymin; R, adenosin eller cytosin; Y, cytosin eller tymin; H, adenosin eller cytosin eller tymin, V, adenosin eller cytosin eller guanin; D, adenosin eller guanin eller tymin.

De første 7 nukleotidene til oligonukleotid nr. 1 (understreket) inneholder gjenkjenningssekvensen for restriksjonsendonuklease BamHI for å lette manipuleringen av en spesifikt amplifisert DNA-sekvens kodende for BMP-12 proteinet og blir følgelig ikke avledet fra konsensusaminosyresekvensen (1) presentert ovenfor.

En annen konsensus aminosyresekvens er avledet fra en annen sterkt konservert region av BMP/<T>GF-B/Vg-1 proteinene som beskrevet nedenfor:

His-Ala-Ile-Val/Leu-Gln-Thr (SEQ ID NO: 18)

Følgende oligonukleotid blir konstruert på grunnlag av ovenfor identifiserte konsensus aminosyresekvens (2):

Denne oligonukleotidsekvensen blir syntetisert på en automatisert DNA synthesizer. De samme nukleotidsymbolene blir anvendt som beskrevet ovenfor.

De første 7 nukleotidene til oligonukleotid nr. 1 (understreket) inneholder gjenkjenningssekvensen til restriksjonsendonuklease Xbal for å lette manipuleringen av en spesifikt amplifisert DNA-sekvens kodende for BMP-12 proteinet og er følgelig ikke avledet fra konsensus aminosyresekvensen (2) presentert ovenfor.

Det blir betraktet at BMP-12 proteinet ifølge oppfinnelsen og andre BMP/TGF-6/Vg-l relaterte proteiner kan inneholde aminosyresekvenser som ligner konsensus aminosyresekvensene beskrevet ovenfor og beliggenheten av de sekvensene innenfor et BMP-12 protein eller andre nye relaterte proteiner vil tilsvare de relative beliggenhetene i proteinene som de er blitt avledet fra. Det er videre betraktet at denne posisjonelle informa-sjonen oppnådd fra strukturen til andre BMP/TGF-B/Vg-1 proteiner og oligonukleotid-sekvensene nr. 1 og nr. 2 som er blitt avledet fra konsensus aminosyresekvensene (1) og (2) kan bli anvendt for spesifikk amplifisering av DNA-sekvensene som koder for de tilsvarende aminosyrene til BMP-12 proteinet eller andre BMP/TGF-B/Vg-1 relaterte proteiner.

Basert på kunnskapen av genstrukturene til BMP/TGF-B/Vg-1 proteinene er det videre betraktet at humant genomisk DNA kan bli anvendt som et templat for å utføre spesifikke amplifikasjonsreaksjoner som vil resultere i identifikasjon av BMP-12 BMP/TGF-B/Vg-1 (BMP-12 relatert protein) kodende sekvenser. Slike spesifikke amplifikasjonsreaksjoner til et humant genomisk DNA templat kan bli initiert ved anvendelse av oligonukleotidprimerene nr 1 og nr 2 beskrevet tidligere. Oligonukleotidene nr 1 og nr 2 identifisert ovenfor blir anvendt som primere for å muliggjøre spesifikk amplifikasjon av en spesifikk nukleotidsekvens fra humant genomisk DNA. Amplifikasjonsreaksjonen blir utført som følger: humant genomisk DNA (kilde:perifere blodlymfocyter), oppnådd fra Ken Jacobs, Genetics Institute, blir spaltet ved gjentatt gjennomkjøring gjennom en 25 gauge nål, denaturert 100°C i 5 minutter og deretter avkjølt på is før det ble tilsatt til en reaksjonsblanding inneholdende 200 (im av hver av deoksynukleotidtrifosfatene (dATP, dGTP, dCTP og dTTP), 10 mM tris-HCl pH 8,3, 50 mM KC1, 1,5 mM MgCl2,0,00 l%v gelatin, 1.25 enheter taq DNA polymerase, 100 pM oligonukleotid nr 1 og 100 pM oli-ognukleotid nr 2. Denne reaksjonsblandingen blir inkubert ved 94°C i 2 minutter og deretter utsatt for termisk cyklisering på følgende måter: 1 minutt ved 94°C, 1 minutt ved 40°C, 1 minutt ved 72°C i tre sykluser; og deretter I minutt ved 94°C, 1 minutt ved 55°C, 1 minutt ved 72°C i 37 sykluser, etterfulgt av 10 minutter inkubasjon ved 72°C. DNA som blir spesifikt amplifisert ifølge denne reaksjonen blir etanolpresipitert, spaltet med restriksjonsendonukleasene BamHI og Xbal og deretter utsatt for agarosegelelek-troforese. En region av gelen som tilsvarer den antatte størrelsen til BMP-12 eller annet BMP/TGF-B/Vg-1 kodende DNA-fragment, blir spaltet ut og spesifikt amplifiserte DNA-fragmenter innbefattet deri blir elektroeluert og subklonet inn i plasmidvektor pGEM-3 mellom Xbal og BamHI setene til polylinkeren. DNA-sekvens analysene av en av de resulterende BMP-12 relaterte subklonene indikerer spesifikt amplifisert DNA-sekvens produkt innbefattet deri som koder for en del av BMP-12 proteinet ifølge oppfinnelsen.

DNA-sekvensen (SEQ ID NO: 5) og oppnådd aminosyresekvens (SEQ ID NO:6) til dette spesifikt amplifiserte DNA-fragmentet til BMP-12 er vist i sekvenslisten.

Nukleotidene nr.l-nr.26 til SEQ ID NO: 5 omfatter en del av oligonukleotid nr. 1 og nukleotidene nr 103 - nr 128 omfatter en del av omvendte komplement til oligonukleotid nr. 2 anvendt for å utføre den spesifikke amplifikajsonsreaksjonen. På grunn av funksjonen til oligonukleotidene nr 1 og nr 2 for initiering av amplifikasjonsreaksjonen behøver ikke å korrespondere nøyaktig med den virkelige sekvensen kodende for et BMP-12 protein og blir følgelig ikke translatert i den tilsvarende aminosyrederivasjonen

(SEQ ID NO: 6).

DNA-sekvensanalyser av en annen subklon indikerer at spesifikt amplifisert DNA produkt innbefattet deri koder for en del av et annet BMP/TGF-B/Vg-1 (BMP-12 relatert) protein ifølge oppfinnelsen betegnet VL-1.

DNA-sekvensen (SEQ ID NO:7) og avledet aminosyresekvens (SEQ ID NO: 8) ifølge dette spesifikt amplifiserte DNA-fragmentet er vist i sekvenslisten.

Nukleotidene nr 1 - nr 26 til SEQ ID NO: 7 omfatter en del av oligonukleotid nr 1 og nukleotidene nr 103 - nr 128 omfatter en del av omvendte kompliment til oligonukleotid nr 2 anvendt for å utføre den spesifikke amplifikasjonsreaksjonen. På grunn av funksjonen til oligonukleotidene nr 1 og nr 2 når det gjelder initiering av amplifikasjonsreaksjonen behøver det ikke å tilsvare nøyaktig til den sanne sekvensen kodende for et VL-1 protein ifølge oppfinnelsen og blir ikke translatert til den tilsvarende aminosyrederivasjonen (SEQ JD NO:8).

Følgende oligonukleotidprobe blir konstruert på grunnlag av den spesifikt amplifiserte BMP-12 humane DNA-sekvensen som angitt ovenfor (SEQ ID NO: 5) og syntetisert på en automatisert DNA synthesizer:

Denne oligonukleotidproben blir radioaktivt merket med <32>p og anvendt for å screene et humant genomisk bibliotek konstruert i vektor XFTX (Stratagene katalog nr. 944291). 500.000 rekombinanter av humant genomisk bibliotek blir sådd ut i en tetthet på omtrent 10.000 rekombinanter pr skål på 50 skaler. Duplikate nitrocellulose replikaer av rekombinante bakteriofag plakk og hybridisert til oligonukleotidprobe nr 3 i standard-hybridiseringsbuffer (SHB = 5X SSC, 0,1% SDS, 5X Denhardfs, 100 ug/ml laksesperm DNA) ved 65°C over natt. Dagen deretter blir radioaktivt merket oligonukleotid inneholdende hybridiseringsoppløsning fjernet og filtrene blir vasket med 0,2X SSC, 0,1% SDS ved 65°C. En enkelt positivt hybridiseringsrekombinant blir identifisert og plakkrenset. Denne plakkrensede rekombinante bakteriofagklonen som hybridiserer til BMP-12 oligonukleotidprobe nr 3 blir betegnet AHuG-48. En bakteriofag platestokk blir dannet og bakteriofag DNA blir isolert fra A.HuG-48 human genomisk klon. Bakteriofagen XHuG-48 er blitt deponert til American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD "ATCC" under aksesjonsnr. 75625 desember 7,1993. Denne deponeringen fyller kravene ifølge Budapest Treaty of the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purpose of Patent Procedure and Regulations. Oligonukleotidhybridiserende region til denne rekombinanten XHuG-48 er lokalisert til et 3,2 kb BamHI fragment. Dette fragmentet blir subklonet inn i plasmidvektor (pGEM-3) og DNA-sekvensanalyser blir utført. Denne plasmidsubklonen blir betegnet PCR1-lnr2 og er blitt deponert til American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD "ATCC" under aksesjon nr 69517, desember 7,1993. Denne deponeringen oppfyller kravene ifølge Budapest Treaty of the International Recognition og the Deposit of Microorganisms for the Purpose of Patent Procedure and Regulations. Del DNA-sekvensen (SEQ ID NO: 1) og avledet aminosyresekvens (SEQ ID NO: 2) til 3,2 kb DNA innskuddet til plasmid subklon PCRl-lnr2, avledet fra klon XHuG-48, er vist i sekvenslistene.

Det er å bemerke at nukleotidene nr 639 - nr 714 til SEQ ID NO: 1 tilsvarer nukleotidene nr 27 - nr 102 ifølge spesifikt amplifisert BMP-12 kodende DNA-fragment angitt i SEQ ID NO: 5 og bekrefter følgelig at den humane genomiske bakteriofagklonen X HuG-48 og avledede subklon PCRl-lnr2 koder for minst en del av BMP-12 proteinet ifølge oppfinnelsen. Nukleotidsekvensen til en del av 3,2 kb BamHI innskuddet til plasmid PCRl-lnr2 inneholder en åpen leseramme med minst 882 basepar, som definert ved nukleotidene nr 1- nr 882 til SEQ ID NO: L Denne åpne leserammen koder for minst 294 aminosyrer av humant BMP-12 protein ifølge oppfinnelsen. Kodet 294 aminosyre humant BMP-12 protein innbefatter et fullstendig modent humant BMP-12 protein (aminosyrene nr 1 - nr 104 til SEQ ID NO: 2) samt den C-terminale delen av propeptidregionen til det primære translasjonsproduktet (aminosyre nr -190 til nr -1 til

SEQ ID NO: 2).

Ytterligere DNA-sekvens til 3,2 kb BamHI innskuddet til plasmid PCR1- lnr2 angitt i SEQ ID NO: 33 demonstrerer tilstedeværelse av en 1164 bp åpen leseramme, som definert ved nukleotidene nr 138 til og med nr 1301 ifølge SEQ ED NO: 33 (det er å bemerke at hele sekvensen beskrevet i SEQ ID NO: 11 er innbefattet i SEQ ID NO: 33). Fordi denne sekvensen er avledet fra en genomisk klon er det vanskelig å bestemme grensen mellom 5' omfanget av den kodende sekvensen og 3' grensen til mellomliggende sekvens (intron/ikke-kodende sekvens).

Basert på kunnskapen om andre BMP proteiner og andre proteiner innenfor TGF-B familien antas det at forløperpolypeptidet kan bli spaltet ved flerbasisk sekvens Arg-Arg-Gly-Arg i samsvar med en foreslått konsensus proteolytisk prosesserende sekvens Arg-X-X-Arg. Spaltning av BMP-12 forløperpolypeptidet er antatt å danne et 104 aminosyre modent peptid begynnende med aminosyren Ser i posisjon nr 1 ifølge SEQ ID NO: 2. Prosessering av BMP-12 til den modne formen antas å innbefatte dimerisering og fjerning av den N-terminale regionen på en måte som er analog med prosessering av beslektet protein TGF-B [Gentry et al., Molec & Cell.Biol., 8:4162 (1988); Derynck et al., Nature, 316:701 (1985)].

Det antas derfor at modne aktive former av BMP-12 omfatter en homodimer med to polypeptidsubenheter hvor hver subenhet omfatter aminosyrene nr 1 til nr 104 ifølge SEQ ID NO: 2 med en antatt molekylvekt på omtrent 12.000 daltan. Ytterligere aktive former antas å omfatte minst aminosyrene nr 3 til nr 103 ifølge SEQ ID NO: 2 og følge-lig innbefatter første og siste konserverte cysteinresidie. Som andre medlemmer av TGF-B/BMP familien av proteinene utviser den karboksy-terminale delen av BMP-12 proteinet høyere sekvenskonservering enn den mer amino-terminale delen. Prosent ami-nosyreidentitet til humant BMP-12 protein i det cystein-rike C-terminale domenet (aminosyrene nr 3 - nr 104) med tilsvarende region av humane BMP-proteiner og andre proteiner innenfor TGF-B familien er som følger: BMP-2, 55%; BMP-3,43%, BMP^l, 53%; BMP-5,49%; BMP-6,49%; BMP-7, 50%; BMP-8,57%; BMP-9,48%; BMP-10, 57%; aktivin WC (BMP-11), 38%; Vgl, 46%; GDF-1,47%; TGF-B1; 36%; TGF-62, 36%; TGF-B3,39%; inhibin B(B), 36%; inhibin B(A), 41%.

Human BMP-12 DNA-sekvens (SEQ TD NO: 1), eller en del derav, kan anvendes som en probe for å identifisere en human cellelinje eller et vev som syntetiserer BMP-12 mRMA. Kort forklart blir RNA ekstrahert fra valgte celle eller vevskilde og enten elek-troforert på en formaldehydagarosegel og overført til nitrocellulose, eller omsatt med formaldehyd og applisert direkte på nitrocellulose. Nitrocellulose blir deretter hybridisert til en probe avledet fra den kodende sekvensen til human BMP-12.

Human BMP-12 sekvens blir alternativt anvendt for å konstruere oligonukleotidprimere som vil spesifikt amplifisere en del av BMP-12 kodende sekvens beliggende i regionen mellom primerene anvendt for å utføre den spesifikke amplifikasjonsreaksjonen. Det antas at disse humane BMP-12 avledede primerene vil muliggjøre spesifikk amplifisering av tilsvarende BMP-12 kodende sekvenser fra mRNA, cDNA eller genomiske DNA-templater. Når en positiv kilde er blitt identifisert ifølge en av de ovennevnte metodene blir mRNA selektert ved oligo (dT) cellulosekromatografi og cDNA blir syntetisert og klonet i XgtlO eller X bakteriofag vektorer kjent for fagfolk innenfor dette området, for eksempel, XZAP ifølge kjente teknikker (Toole et al., supra). Det er også mulig å utføre oligonukleotidprimerrettet amplifikasjonsreaksjon, beskrevet ovenfor, direkte på forhånd etablerte humane cDNA eller genomiske bibliotek som er blitt klonet inn i en X bakteriofag vektor. I slike tilfeller vil et bibliotek som tilveiebringer et spesifikt amplifisert DNA produkt kodende for en del av humant BMP-12 protein bli screenet direkte ved anvendelse av fragmentet av amplifisert BMP-12 kodende DNA som en probe.

Oligonukleotidprimerene konstruert på grunnlag av DNA-sekvensen til human BMP-12 genomisk klon XHuG-48 antas å muliggjøre spesifikk amplifikasjon av humane BMP-12 kodende DNA-sekvenser fra på forhånd etablerte humane cDNA bibliotek som er kommersielt tilgjengelige (Stratagene, La Jolla, CA eller Clonentech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA). Følgende oligonukleotidprimer blir konstruert på grunnlag av nukleotidene nr 571 til nr 590 til DNA-sekvensen angitt i SEQ ID NO: 1 og syntetisert på en automatisert DNA synthesizer:

De første ni nukleotidene til primer nr 4 (understreket) omfatter gjenkjenningssekvensen for restriksjonsendonuklease BamHI som kan bli anvendt for å lette manipuleringen av en spesifikt amplifisert DNA-sekvens kodende for humant BMP-12 protein ifølge oppfinnelsen og er følgelig ikke avledet fra DNA-sekvensen presentert i SEQ ED NO: 1.

Følgende oligonukleotidprimer blir konstruert på grunnlag av nukleotidene nr 866 - nr 885 til DNA-sekvensen angitt i SEQ ED NO: 1 og syntetisert på en automatisert DNA synthesizer.

De første ni nukleotidene til primer nr 5 (understreket) omfatter gjenkjenningssekvensen for restriksjonsendonuklease Xbal som kan bli anvendt for å lette manipuleringen av en spesifikt amplifisert DNA-sekvens kodende for humant BMP-12 protein ifølge oppfinnelsen og er følgelig ikke avledet fra DNA-sekvensen presentert i SEQ ED NO: 1.

Standardnukleotidsymboler i ovenfor identifiserte primere er som følger: A, adenin; C, cytosin; G, guanin; T, thymin.

Primerne nr 4 og nr 5 identifisert ovenfor blir anvendt som primere for å muliggjøre amplifikasjon av en spesifikk BMP-12 kodende nukleotidsekvens fra på forhånd etablerte cDNA-bibliotek som kan innbefatte følgende: human føtal hjerne cDNAAZAPII (Stratagene katalog nr. 936206), human leverA.UNI-ZAP XR (Stratagene katalog nr. 937200), human lunge/XUNI-ZAP XR (Stratagene katalog nr. 937206) og human føtal milt/UNI-ZAP XR (Stratagene katalog nr. 937205).

Omtrent 1x10<*> pfu (plakkdannende enheter) av Xbakteriofag-bibliotek som inneholder humane cDNA innskudd som de som er angitt ovenfor blir denaturert ved 95°C i 5 minutter før tilsetning til en reaksjonsblanding inneholdende 200 [im av hver av deoksynukleotidtrifosfatene (dATP, dGTP, dCTP og dTTP) 10 mM tris-HCl pH 8,3,50 mM KC1,1,5 mM mgCl2,0,001% gelatin, 1,25 enheter Taq DNA polymerase, 100 pM oligonukleotidprimer nr 4 og 100 pM oligonukleotidprimer nr 5. Reaksjonsblandingen blir deretter utsatt for termisk cyklisering på følgende måte: 1 minutt ved 94°C, 1 minutt ved 50°C, 1 minutt ved 72°C i 39 sykluser etterfulgt av 10 minutter ved 72°C. ;DNA som blir spesifikt amplifisert ifølge denne reaksjonen ventes å danne et BMP-12 kodende produkt på omtrent 333 basepar, hvor indre 315 bp tilsvarer nukleotidene nr 571 til nr 885 til SEQ ED NO: 1 og også innbefatter 9 bp ved hver ende av BMP-12 spesifikt fragment som tilsvarer restriksjonssetene definert ved nukleotidene nr 1 - nr 9 til primerene nr 4 og nr 5. Resulterende 333 bp DNA produkt blir spaltet med restriksjonsendonukleasene BamHI og Xbal, fenolekstrahert, kloroformekstrahert og etanolpresipitert. ;I forhold til etanolpresipitering blir bufferskift og fjerning av små fragmenter av DNA resulterende fra BamHI/Xbal restriksjonsspaltningen oppnådd ved fortynning av spaltet DNA produkt i 10 mM tris-HCl pH 8,0,1 mM EDTA etterfulgt av sentrifugering gjennom en Centricon<TM> 30 mikrokonsentrator (W.R.Grace & Co., Beverly, MA; Product nr 4209). Resulterende BamHI/Xbal spaltet amplifisert DNA produkt blir subklonet inn i en plasmidvektor (dvs. pBluescript, pGEM-3 etc) mellom BamHI og Xbal setene til polylinkerregionen. DNA-sekvensanalyse av resulterende subkloner vil være nødvendig for å bekrefte integriteten til BMP-12 kodende innskudd. Når en positiv cDNA kilde er blitt identifisert på denne måten ble tilsvarende cDNA bibliotek hvorfra en 333 bp BMP-12 spesifikk sekvens ble amplifisert screenet direkte med 333 bp innskuddet eller andre BMP-12 spesifikke prober for å identifisere og isolere cDNA kloner kodende for full-lengde BMP-12 proteinet ifølge oppfinnelsen. ;Ytterligere fremgangsmåter kjent for fagfolk innenfor dette området kan bli anvendt for å isolere andre full-lengde cDNA kodende humane BMP-12 relaterte proteiner, eller ful-lengde cDNA kloner kodende for BMP-12 relaterte proteiner ifølge oppfinnelsen fra arter som er forskjellige fra mennesker, spesielt andre pattedyrarter. ;Følgende eksempler demonstrerer anvendelse av human BMP-12 sekvens for å isolere homologer fra BMP-12 relaterte proteiner i et murint genomisk DNA bibliotek. ;DNA-sekvensen som koder for humant BMP-12 protein ifølge oppfinnelsen antas å være betydelig homolog med BMP-12 og BMP-12-relaterte sekvenser fra arter som er forskjellige fra mennesker slik at det kan bli anvendt for spesifikk amplifisering av DNA-sekvenser fra andre arter som koder for tilsvarende BMP-12 relaterte proteiner. Følgende oligonukleotider blir konstruert på grunnlag av human BMP-12 sekvens (SEQ ID NO: 1) og blir syntetisert på en automatisert DNA synthesizer: ;De første 8 nukleotidene til oligonukleotidprimerene nr 6 og nr 7 (understreket) omfatter gjenkjenningssekvensen til restriksjonsendonukleasene BamHI og EcoRI. Disse sekvensene blir anvendt for å lette manipulering av en spesifikk amplifisert DNA-sekvens kodende for et BMP-12 eller BMP-12-relatert protein fra en art som er forskjellig fra mennesker og er følgelig ikke avledet fra DNA-sekvensen presentert i SEQ ID NO: 1. Oligonukleotidprimer nr 6 blir konstruert på grunnlag av nukleotidene nr 607 - nr 626 til SEQ ID NO: 1. Oligonukleotidprimer nr 7 blir konstruert på grunnlag av omvendt komplement til nukleotidene nr 846 - nr 865 av DNA-sekvensen angitt i SEQ ID NO: 1. ;Oligonukleotidprimerene nr 6 og nr 7 identifisert ovenfor blir anvendt som primere for å muliggjøre amplifikasjon av spesifikke BMP-12 relaterte sekvenser fra genomisk DNA avledet fra arter forskjellige fra mennesker. Amplifikasjonsreaksjonen blir utført som følger: murin genomisk DNA (kilde: stamme Balb c) blir spaltet ved gjentatt føring gjennom en 25 gauge nål, denaturert ved 100°C i 5 minutter og deretter avkjølt på is før tilsetning til en reaksjonsblanding inneholdende 200 \ im av hver av deoksynukleotidtrifosfatene (dATP, DGTP, dCTP og dTTP) 10 mM tris-HClpH 8,3,50 mM KC1,1,5 mM MgCl2, 0,001% gelatin, 1,25 enheter Taq DNA polymerase, 100 pM oligonukleotidprimer nr 6 og 100 pM oligonukleotidprimer nr 7. Reaksjonsblandingen blir deretter utsatt for termisk cyklisering på følgende måte: 1 min. ved 95°C, 1 min. ved 55°C, 1 min. ved 72°C i 40 sykluser etterfulgt av 10 min. ved 72°C. ;DNA som blir spesifikt amplifisert ifølge denne reaksjonen blir etanolpresipitert, spaltet med restriksjonsendonukleasene BamHI og EcoRI og utsatt for agarose gelelektroforese. En region av gelen, tilsvarende antatt størrelse av murin BMP-12 eller BMP-1-relatert kodende DNA-fragment, blir spaltet ut og spesifikt amplifiserte DNA-fragmenter innbefattet deri blir ekstrahert (ved elektroeluering eller ved hjelp av andre kjente metoder) og subklonet inn i en plasmidvektor, så som pGEM-3 eller pBluescript mellom BamHI og EcoRI setene til polylinkeren. DNA-sekvensanalyser av en av de resulterende subklonene betegnet mVl, indikerer at den spesifikt amplifiserte DNA-sekvensen innbefattet deri koder for en del av et protein som ser ut til å være murin homolog med enten BMP-12 eller VL-1 sekvensen ifølge oppfinnelsen. DNA-sekvensen (SEQ ID NO: 10) og avledet aminosyresekvens (SEQ ED NO: 11) til dette spesifikke amplifiserte murine DNA-fragmentet er vist i sekvenslisten. ;Nukleotidene nr 1 - nr 26 til SEQ ED NO: 10 omfatter en del av oligonukleotid nr 6 og nukleotidene nr 246 - nr 272 omfatter en del av omvendt komplement ("reverse compliment") av oligonukleotid nr. 7 anvendt for å utføre den spesifikke amplifikasjonsreaksjonen. Nukleotid nr. 27 til SEQ ED NO: 10 ser ut til å være det siste nukleotidet fra en kodontriplett, og nukleotidene nr 244 - nr 245 til SEQ ED NO: 10 ser ut til å være de første 2 nukleotidene til en kodontriplett. Nukleotidene nr 28 til nr 243 til SEQ ED NO: 10 tilsvarer følgelig en delkodende sekvens av mVl. På grunn av funksjonen til oligonukleotidene nr 6 og nr 7 for initiering av amplifikasjonsreaksjonen behøver disse ikke korrespondere nøyaktig med den aktuelle sekvensen som koder for murin homolog til human BMP-12 eller VL-1 protein ifølge oppfinnelsen og blir følgelig ikke translatert i tilsvarende aminosyrederivasjon (SEQ ID NO: 11). ;Oligonukleotidprober konstruert på grunnlag av spesifikk amplifisert murin BMP-12 eller VL-1 DNA-sekvens er angitt i SEQ EO NO: 10 kan bli anvendt av fagfolk innenfor dette området for å identifisere full-lengde murin BMP-12 eller VL-1 kodende klon (enten cDNA eller genomisk). ;DNA-sekvensanalyser av andre resulterende subkloner betegnet mV2 indikerer at spesifikk amplifisert DNA-sekvens innbefattet deri koder for en del av en murin BMP-12 relatert sekvens ifølge oppfinnelsen. DNA-sekvensen (SEQ ED NO: 12) og avledede aminosyresekvens (SEQ ED NO: 13) ifølge det spesifikt amplifiserte murine DNA-fragmentet er vist i sekvenslistene. ;Nukleotidene nr 1 - nr 26 til SEQ ED NO: 12 omfatter en del av oligonukleotid nr 6 og nukleotidene nr 246 - nr 272 omfatter en del av omvendte komplement til oligonukleotid nr 7 anvendt for å utføre den spesifikke amplifikasjonsreaksjonen. Nukleotid nr 27 til SEQ ID NO: 12 ser ut til å være det siste nukleotidet av en kodontriplett, og nukleotidene nr 244 - nr 245 til SEQ ED NO: 12 der ut til å være de første to nukleotidene til en kodontriplett. Nukleotidene nr 28 - nr 243 ifølge SEQ ED NO: 12 tilsvarer følgelig en delkodende sekvens av mV2. På grunn av funksjonen til oligonukleotidene nr 6 og nr 7 når det gjelder initiering av amplifikasjonsreaksjonen så behøver disse ikke nøyaktig tilsvare den virkelige sekvensen som koder for muring BMP-12 relatert protein ifølge oppfinnelsen og blir følgelig ikke translatert i tilsvarende aminosyresekvensderivasjon (SEQ ED NO: 13). ;Oligonukleotidprobene konstruert på grunnlag av spesifikk amplifisert murin BMP-12 relatert DNA-sekvens angitt i SEQ ED NO: 12 kan bli anvendt av fagfolk innenfor dette området for å identifisere full-lengde murin BMP-12 relatert kodende kloner (enten cDNA eller genomisk). ;DNA-sekvensanalyse av en annen av resulterende subkloner betegnet mV9 indikerer at den spesifikke amplifiserte DNA-sekvensen innbefattet deri koder for en del av en murin BMP-12 relatert sekvens ifølge oppfinnelsen. Denne sekvensen ser ut til å være den murine homologen til human MP52 DNA-sekvens beskrevet i SEQ ID NO: 3. DNA-sekvensen (SEQ LD NO: 14) og avledet aminosyresekvens (SEQ ED NO: 15) ifølge dette spesifikke amplifiserte amplifiserte murine DNA-fragmentet er vist i sekvenslisten. ;Nukleotidene nr 1 - nr 26 til SEQ ED NO: 14 omfatter en del av oligonukleotid nr 6 og nukleotidene nr 246 - nr 245 til SEQ ED NO: 14 omfatter en del av revers komplement til oligonukleotid nr 7 anvendt for å utføre den spesifikke amplifikasjonsreaksjonen. Nukleotid nr 27 til SEQ ED NO: 14 ser ut til å være det siste nukleotidet til en kodontriplett, og nukleotidene nr 244 - nr 245 til SEQ ED NO: 14 ser ut til å være de første to nukleotidene til en kodontriplett. Nukleotidene nr 28 til nr 243 til SEQ ED NO: 14 tilsvarer en delvis kodende sekvens til mV9. På grunn av funksjonen til oligonukleotidene nr 6 og nr 7 når det gjelder initiering av amplifikasjonsreaksjonen er det ikke sikkert at de tilsvarer nøyaktig den virkelige sekvensen kodende for murin BMP-12 relatert protein ifølge oppfinnelsen og blir følgelig ikke translatert i den tilsvarende aminosyresekvens-derivasjonen (SEQ ID NO: 15). ;Oligonukleotidprober konstruert på grunnlag av spesifikt amplifisert murin BMP-12 relatert DNA-sekvens angitt i SEQ ED NO: 14 kan bli anvendt av fagfolk innenfor dette området for å identifisere full-lengde murin BMP-12 relaterte kodende kloner (enten cDNA eller genomisk). ;Alternativt blir oligonukleotidprimerene nr 6 og nr 7 identifisert ovenfor anvendt som primere for å muliggjøre spesifikk amplifikasjon av en 275 basepar DNA probe hvor indre 259 bp tilsvarer nukleotidene nr 607 til nr 865 av SEQ ED NO: 1, fra BMP-12 kodende plasmid subklon PCRl-1 nr 2. Denne 275 bp DNA proben ble radioaktivt merket med <32>P og anvendt for å screene et murint genomisk bibliotek konstruert i vektor X, FEX U (Stratagene katalog nr. 946306). 1 million rekombinanter av murin genomisk bibliotek ble sådd ut i en tetthet på omtrent 20.000 rekombinanter pr skål på 50 skåler. Duplikate nitrocellulosereplikaer av rekombinante bakteriofagplakk ble hybridisert, under reduserte stringensbetingelser, til spesifikk amplifisert 33 bp probe i standard hybridisermgsbuffer (SHB = 5X SSC, 0,1% SDS, 5X Denhardfs, 100 ug/ml laksesperm DNA) ved 60°C over natten. Neste dag ble radioaktivt merket oligonukleotid inneholdende hybridiseringsoppløsning fjernet og filtrene vasket under reduserte stringensbetingelser med 2X SSC, 0,1% SDS ved 60°C. Fleire positivt hybridiseringsrekombinanter blir identifisert og plakkrenset. Fragmenter av positivt hybridiserende murine genomiske rekombinant kloner blir subklonet inn i standardplasmidvektorer (dvs. pGEM-3) og utsatt for DNA-sekvensanalyser. ;DNA-sekvensanalyser av en av disse subklonene betegnet MVR3 indikerer at det koder for en del av musegenet som tilsvarer PCR produktet mVl (murin homolog av human BMP-12 sekvens angitt i SEQ ID NO: 1) beskrevet ovenfor. Del DNA-sekvensen av denne subklonen og tilsvarende aminosyretranslasjon er angitt i SEQ ID NO: 29 og SEQ ED NO: 30. ;DNA-sekvensanalyser av en annen av disse subklonene betegnet MVR32 indikerer at det koder for en del av musegenet som tilsvarer PCR produktet mV2 (murin homolog av human VL-1 sekvensen angitt i SEQ ED NO: 7) beskrevet ovenfor. Del DNA-sekvensen av denne subklonen og tilsvarende aminosyretranslasjon er angitt i SEQ ED NO: 31 og SEQ ED NO: 32. ;DNA-sekvensanalyser av en annen av disse subklonene betegnet MVR23 indikerer at den koder for en del av musegenet som tilsvarer PCR produktet mV9 (murin homolog av MP-52 sekvensen angitt i SEQ ED NO: 3) beskrevet ovenfor. ;På lignende måte som beskrevet ovenfor for identifisering og isolering av humane genomiske kloner kodende for BMP-12 proteinet ifølge oppfinnelsen kan oligonukleotidprober tilsvarende VL-1 kodende sekvens angitt i SEQ ED NO: 7 bli konstruert og anvendt for å identifisere humane genomiske eller cDNA-sekvenser kodende for VL-1 (BMP-13) protein. Disse oligonukleotidene kan bli konstruert til regioner spesfikke for VL-1 kodende sekvenser og vil derfor sannsynligvis være avledet fra regioner av lavest grad av nukleotidsekvensidentitet mellom spesifikke amplifiserte VL-1 kodende sekvens (SEQ ID NO: 7) og spesifikk amplifisert BMP-12 kodende sekvens (SEQ ED NO: 5). ;Alternativt blir oligonukleotidprimerene nr 4 og nr 5 identifisert ovenfor anvendt som primere for å muliggjøre spesifikk amplifikasjon av en 333 basepar DNA probe hvor indre 315 bp tilsvarer nukleotidene nr 571 til nr 885 til SEQ ED NO: 1, fra BMP-12 kodende plasmidsubklon PCRl-1 nr 2. Denne 333 bp DNA proben ble radioaktivt merket med <32>p og anvendt for å screene et humant genomisk bibliotek konstruert i vektoren " K DASH II (Stratagene katalog nr. 945203). 1 million rekombinanter av humant genomisk bibliotek blir sådd ut i en tetthet på omtrent 20.000 rekombinanter pr skål på 50 skåler. Duplikate nitrocellulose replikaer av rekombinant bakteriofage plakk blir hybridisert, under reduserte stringensbetingelser, til spesifikk amplifisert 333 bp probe i standard-hybridiseirngsbuffer (SHB = 5X SSC, 0,1% SDS, 5X Denhardfs, 100 ug/ml laksesperm DNA) ved 60°C over natt. Neste dag blir radioaktivt merket oligonukleotid inneholdende hybridiseringsoppløsning fjernet og filtrene vasket under reduserte stringensbetingelser med 2X SSC, 0,1% SDS ved 60°C. Flere (omtrent 15) postivt hybridiserende rekombinante blir identifisert og plakkrenset. ;For å skjelne positivt hybridiserende rekombinanter kodende for VL-1 proteinet ifølge oppfinnelsen fra BMP-12 og andre BMP-12 relaterte kodende rekombinanter som antas å hybridisere positivt til 333 bp DNA proben dannet fra BMP-12 kodende plasmid PCRl-1 nr 2 anvendt i denne screeningsprosedyren, etter oligonukleotidproben, basert på VL-1 sekvensen angitt i SEQ ID NO: 7, er konstruert og syntetisert på en automatisert DNA synthesizer: ;Et oligonukleotid som tilsvarer oligonukleotidene nr 60 til nr 76 til SEQ ID NO:7 som inneholder 5 nukleotidforskjeller i forhold til tilsvarende region av BMP-12 kodende sekvens angitt i SEQ ED NO: 1 (nukleotidene nr 672 tilnt 689). En av rekombinante bak-teriofagkloner som hybridiserer til VL-1 oligonukleotidprobe nr 8 er betegnet XJLDc31. Denne rekombinante bakteriofagklonen blir plakkrenset, en bakteriofagskål stokk blir dannet og bakteriofag DNA blir isolert fra AJLDc31 human genomisk klon. Bakteriofagen ÅJLDc31 er blitt deponert til American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD "ATCC" under aksesjonsnr. 75922 oktober 20, 1994. Denne deponeringen oppfyller kravene ifølge Budapest Treaty of the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purpose of Patent Procedure and Regulations. Oligonukleotidhybridiseringsregionen til denne rekombinanten XJLDc31 er lokalisert til et 2,5 kb EcoRi fragment. Dette fragmentet blir subklonet inn i en plasmidvektor (pGEM-3) og DNA-sekvensanalyser blir utført. Denne plasmid subklonen er betegnet pGEMJLDc31/2,5 og er blitt deponert til American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD "ATCC" under aksesjon nr. 69710 oktober 20,1994. Denne deponeringen oppfyller kravene ifølge Budapest Treaty of the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purpose of Patent Procedure and Regulations. ;Del DNA-sekvensen (SEQ ED NO:25) og avledet aminosyresekvens (SEQ ED NO: 26) av en del av 2,5 kb DNA innskuddet til plasmidsubklon pGEMJLDc31/2,5 avledet fra klon XJLDc31, er vist i sekvenslisten. ;DNA-sekvensen til en del av 2,5 kb EcoRI innskuddet til plasmid pGEMJLDc31/2,5 er angitt i SEQ ID NO: 25 og inneholder en 912 bp åpen leseramme, som definert ved nukleotidene nr. 52 til og med nr. 963 ifølge SEQ ED NO: 25.1 det denne sekvensen er avledet fra en genomisk klon er det vanskelig å bestemme grensen mellom 5' omfanget av den kodende sekvensen og 3' grensen til mellomliggende sekvens (intron/ikke-kodende sekvens). Hele den åpne leserammen (nukleotidene nr 52 til og med nr 963 ifølge SEQ ED NO: 25) koder for en del av VL-1 proteinet ifølge oppfinnelsen opp til 304 aminosyrer. ;Basert på kunnskapen om andre BMP proteiner og andre proteiner innenfor TGF-B familien antas det at forløper polypeptidet kan bli spaltet ved flerbasesekvensen Arg-Arg-Arg i samsvar med en foreslått konsensus proteolytisk prosesseringssekvens til Arg-X-X-Arg. Spaltning av VL-1 forløperpolypeptidet er ventet å danne et 120 aminosyre modent peptid begynnende med aminosyren Thr i posisjon nr 1 ifølge SEQ ED NO: 26. Prosessering av VL-1 til den modne formen antas å involvere dimerisering og fjerning av den N-terminale regionen på en måte som er analog med prosessering av beslektet protein TGF-B [Gentry et al., Molec & Cell. Biol., 8:4162 (1988); Derynck et al. Nature, 316:701 (1985)]. ;Det antas derfor at modne aktive former av VL-1 omfatter en homodimer med 2 polypeptidsubenheter og hver subenhet omfatter aminosyrene nr 1 til nr 120 ifølge SEQ ED NO: 26 med en antatt molekylvekt på omtrent 12.000 dalton. Ytterligere aktive arter antas å omfatte minst aminosyrene nr 19 til nr 119 eller nr 120 ifølge SEQ ID NO: 26, og inkluderer følgelig første og siste konserverte cysteinresidie. ;Ved anvendelse av en slik fremgangsmåte ble en klon kodende for moden human VL-1 (BMP-13) oppnådd. Nukleotidsekvensen og tilsvarende aminosyresekvens som blir kodet av denne klonen er ført i sekvenslisten ved SEQ ED NO: 25 og 26. ;EKSEMPEL 2 ;Ekspresjon av BMP- 12 ;For å produsere humane BMP-12 proteiner blir DNA kodende derav overført til en hensiktsmessig ekspresjonsvektor og ført inn i pattedyrceller eller andre foretrukne eukary-ote eller prokaryote verter ved hjelp av konvensjonelle genetiske konstruksjonsteknikk-ker. ;For å produsere humant BMP-12 protein i bakterielle celler blir følgende prosedyre anvendt. ;Ekspresjon av BMP- 12 i E. coli ;Et ekspresjonsplasmid pALVl-781, for produksjon av BMP-12 i E. coli ble konstruert og inneholder følgende hovedtrekk: nukleotidene 1-2060 inneholder DNA-sekvenser med opphav fra plasmid pUC-18 [Norrander et al., Gene 26:101-106 (1983)] inkludert sekvenser inneholdende genet for J3-laktamase som utøver resistens overfor antibiotika ampicillin i E. coli vertsstammer, og et colEl-avledet replikasjonsorigo. Nukleotidene 2061-2221 inneholdende DNA-sekvenser for hoved "leftward" promoter (pL) til bakteriofag X [Sanger et al., J. Mol. Biol. 162:729-773 (1982)], inkludert 3 operatorsekven-ser OlI, OjJ2 og OjJ3. Operatorene er bindingsseter for Xcl repressorproteinet og intra-cellulære nivåer kontrollerer mengden av transkripsjonsinitiering fra pL. Nukleotidene ;2222-2723 inneholder en sterk ribosom bindende sekvens inkludert på en sekvens avledet fra nukleotidene 35566 til 35472 og 38137 til 38361 fra bakteriofag lambda beskrevet i Sanger et al., J. Mol. Biol. 162:729-773 (1982). Nukleotidene 2724-3041 inneholder en DNA-sekvens kodende for modent BMP-12 protein hvor alle 3' utranslaterte sekvenser er fjernet. BMP-12 DNA-sekvenser introdusert i pALV 1-781 ekspresjonsvekto-ren ble modifisert i 5' enden for å øke A+T innholdet uten å endre den kodende kapasite-ten. Disse forandringene ble utført for å øke translasjonseffektiviteten initiert på BMP-12 mRNA i E.coli. Nukleotidene 3042-3058 tilveiebringer en "linker" DNA-sekvens inneholdende restriksjonsendonuklease seter. Nukleotidene 3059-3127 tilveiebringer en transkripsjonstermineringssekvens basert på den til E. coli Asp A genet [Takagi et al., Nucl. Acids Res. 13:2063-2074 (1985)]. Nukleotidene 3128-3532 er DNA-sekvenser avledet fra pUC-18. ;Plasmid pALV 1-781 ble transformert inn i E. coli vertsstamme Gl724 (F, lacM, lacp<LS>, ampC::XcI<+>) ifølge prosedyren til Dagert og Ehrlich, Gene 6:23 (1979). G1724 (ATCC aksesjonsnr. 55151) inneholderen kopi av vill-type Xcl repressorgenet stabilt integrert inn i kromosomet ved ampC lokuset, hvor det er blitt plassert under transkripsjonen kontroll av Salmonella typhimurium trp promoter/operatorsekvenser. IG1724 blir XCl proteinet bare dannet i løpet av vekst i tryptofan-fritt medium, så som minimalmedium eller et minimalmedium supplementert med casaminosyrer så som EMC, beskrevet ovenfor. Tilførsel av tryptofan til en kultur av G1724 vil undertrykke trp promoteren og stenge syntesen av XcL og gradvis forårsake induksjon av transkripsjon fra pL promote-rene dersom de er tilstede i cellen. ;Transformantene ble selektert på 1,5% w/v agar skåler inneholdende MC medium som består av M9 medium [Miller, "Experiments in Molecular Genetics", Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1972)] inneholdende 1 mM MgSC>4 og supplementert med 0,5% w/v glukose, 0,2% w/v casaminosyrer og 100 ug/ml ampicillin. GI274 transformert med pALV 1-781 ble dyrket ved 37°C til en A550 0,5 i EMC medium inneholdende 100 (J-g/ml ampicillin. Tryptofan ble deretter tilsatt til en sluttkonsentrasjon på 100 [ig/ml og kulturen inkubert i ytterligere 4 timer. I løpet av denne tiden akkumulerer BMP-12 protein innenfor "inklusjonslegeme" fraksjonen. ;Preparering av proteinmonomer ;18 g frosne celler ble veid og resuspendert i 60 ml 100 mM tris, 10 mM EDTA, 1 mM fenylmetylsulfonylfluorid [PMSF], pH 8,3. Cellene ble lysert ved å bli sendt tre ganger gjennom en Microfluidizer™ [modell nr MCF 100 T]. Inklusjonslegeme pelleten ble oppnådd ved sentrifugering ved 15.000 g ved 4°C i 20 minutter. Supernatanten ble dekantert og pelleten vasket med 100 ml 100 mM tris, 1,0 M NaCl, 10 mM EDTA, 1 mM PMSF, pH 8,3. Suspensjonen ble på ny sentrifugert ved 15.000 g ved 4°C i 10 minutter og supernatanten dekantert. Pelleten ble deretter vasket med 100 ml 100 mM tris, 10 mM EDTA, 1% triton X-100,1 mM PMSF, pH 8,3. Suspensjonen ble på ny sentrifugert ved 15.000 g ved 4°C i 10 minutter og supernatanten dekantert. Pelleten ble resuspendert med 50 ml 20 mM tris, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, pH 8,3, inneholdende 1% DTT i en glassvevshomogenisator. Monomerisk BMP-12 ble deretter oppløst ved surgjøring til pH 2,5 med iseddiksyre. Oppløselig fraksjon ble isolert ved sentrifugering ved 15.000 g i 20 minutter ved 4°C. ;Supernatanten fra denne sentrifugeringen ble samlet og kromatografert over en Sephacryl S-IOO^<M> størrelseseksklusjonskolonne (83 cm x 2,6 cm; = 440 ml sjikt) i 20 ml deler. Sephacryl S-IOO^<M> kolonnen ble kjørt med en mobil fase bestående av 1% eddiksyre ved en strømningsrate på 1,4 ml/min. Fraksjoner som tilsvarer BMP-12 monomer ble detektert ved absorbanse ved 280 nm ved anvendelse av en databeregnet ekstinksjonskoeffisient på 18200M_<1>cm~<l> og molekylvekt (11667 dalton). Dette størrel-seseksklusjonskolonne materialet ble anvendt som utgangsmateriale for refoldingsreak-sjoner. ;Som et alternativ til ovennevnte blir 1,0 g celler lagret ved -80°C og målt. Oppløsningen (3,4 ml 100 mM tris, 10 mM EDTA, pH 8,5) blir tilsatt. Oppløsningen blir vortexbe-handlet helt til cellene er suspenderte. 40 ul 100 mM PMSF i isopropanol blir tilsatt. Cellene blir lysert ved 1000 psi i en French presscelle. Inklusjonslegemene blir sentrifugert ved 4°C i 20 minutter i Eppendorf mikrofuge for å danne pelleter. Supernatantene blir dekantert. Til en pelleten (av 4 totalt) blir 1,0 ml avgasset 8.0 M guanidinhydroklo-rid, 0,5 M tris, 5 mM EDTA, pH 8,5, inneholdende 250 mM DTT tilsatt. Pelleten blir løst opp og argon blir blåst over væsken i 30 sekunder. Deretter blir oppløsningen inkubert ved 37°C i 1 time. Uoppløselig materiale blir pelletert i 2-3 minutter i en Eppendorf mikrofuge ved 23°C. 0,5-1,0 ml supernatant blir injisert inn i en Supelco 2 cm guard cartridge (LC-304) og eluert med en acetonitrilgradient i 0,1% TFA fra 1-70% over 35 minutter. BMP-12 eluerer mellom 29 og 31 minutter. Fraksjonene blir slått sammen og proteinkonsentrasjonen bestemt ved adsorbanse ved 280 nanometer mot 0,1% TFA ved anvendelse av teoretisk ekstinksjonskoeffisient basert på aminosyreinnholdet. ;Som en annen alternativ metode i forhold til den ovennevnte blir frosne cellepelleter oppnådd fra E. coli transformanter som beskrevet ovenfor og tint i 30 ml TE8.3(100:10) buffer (100 mM tris-HCl pH 8,3,10 mM Na2EDTA, 1 mM PMSF). Cellene blir lysert ved å sende dem tre ganger gjennom en Microfluidizer™ [modell nr MCF 100 T]. Opprinnelig inklusjonslegeme materialpelleten blir løst opp i 8 M guanidin-HCl, TE8.5 (100:10) buffer (100 mM tris-HCI pH 8,5,10 mM Na2EDTA som inneholdt 100 mM DTT) og inkubert ved 37°C i 1 time. Dette materialet blir sentrifugert ved 12000 x g i 15 minutter ved romtemperatur. ;Refolding av BMP- 12 protein ved anvendelse av CHAPS- svstem ;Et tilstrekkelig volum av BMP-12-blandingen blir lyofilisert for å oppnå 10 [ig protein. 5 ul av glassdestillert vann blir tilsatt for å gjenoppløse resten og deretter blir 100 [il av refoldet blanding (50 mM tris, 1,0 M NaCl, 2% 3-(2-chlolamidopropyl)dimetylammo-nio-l-propansulfat (CHAPS), 5 mM EDTA, 2 mM glutation (redusert) 1 mM glutation (oksidert); ved pH på omtrent 8,5). Oppløsningen blir forsiktig blandet og lagret ved 23°C i 1-4 dager. Dimerdannelsen blir vurdert ved å kjøre en alikvot på en Novex 16% tricin gel ved 125 volt i 2,5 timer, etterfulgt av Coomassie blå farving og avfarving. ;BMP-12 dimeren ble renset ved anvendelse av en C4 analytisk RP-HPLC (revers fase-høy ytelse væskekromatografi) kolonne (Vydac 214TP54) som ble ekvilibrert til 1% B-buffer (fortynnet inn i A buffer) og ble kjørt i løpet av 35 minutter, hvor proteinet eluerer ved anvendelse av følgende gradient (A buffer = 0,1% trifluor eddiksyre, B buffer = 95% acetonitril, 0,1% trifluor eddiksyre [TFA], med en strømningsrate på 1 ml/min: ;1 -5 minutter 20% B buffer ;5-10 minutter 20-30% B buffer ;10-30 minutter 30-50% B buffer ;30-35 minutter 50-100% B buffer. ;Proteinet ble registrert ved absorbanse ved 280 nm. Topp BMP-12 fraksjoner (eluerende mellom 29 og 31 minutter) ble slått sammen. Renheten ble vurdert ved SDS-PAGE. Konsentrasjonen ble bestemt ved absorbanse ved 280 nm og anvendelse av computerbe-regnet ekstinksjonskoeffisient og molekylvekt som angitt ovenfor. ;Ekspresjon av BMP- 12 i pattedyrceller: ;Et annet betraktet foretrukket ekspresjonssystem for biologisk aktiv rekombinant human BMP-12 er stabilt transformerte pattedyrceller. ;Fagfolk innenfor dette området kan konstruere pattedyr ekspresjonsvektorer ved anvendelse av sekvensen til SEQ ID NO: 1, eller andre DNA-sekvenser kodende for BMP-12 proteiner eller andre modifiserte sekvenser og kjente vektorer, så som pCD [Okayama et al., Mol. Cell. Biol., 1:161-170 (1982)], pJL3, pJL4 [Gough et al., EMBO J., 4:645-653 (1985)] og pMT2 CXM. ;Pattedyr ekspresjonsvektor pMT2 CXM er et derivat av p91023(b) (Wong et al., Science 228:810-815, 1985) forskjellig fra sistnevnte ved at det inneholder ampicillin resistensgenet i stedenfor tetracyklinresistensgenet og videre inneholder et Xhol sete for innskudd av cDNA kloner. De funksjonelle elementene til pMT2 CXM er blitt beskrevet (Kaufman, R.J., 1985, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 82:689-693) og innbefatter adenovirus VA gener, SV40 replikasjonsorigo inkludert 72 bp enhancer, adenovirus major late promoter inkludert et 5' spleisesete og det meste av adenovirus tripartit ledersekvensen tilstede på adenovirus late mRNA, et 3' spleise akseptor sete, et DHFR innskudd, SV40 early polyadenyleringssete (SV40) og pBR322 sekvenser nøvendig for propagering i E. coli. ;Plasmid pMT2 CXM blir oppnådd ved EcoRI spaltning av pMT2-VWF som er blitt deponert til American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD (USA) under aksesjonsnr. ATCC 67122. EcoRI spaltningen spalter ut cDNA innskuddet til stede i pMT2-VWF, og tilveiebringe pMT2 i lineær form som kan bli ligert og anvendt for å transformere E. coli HB 101 eller DH-5 til ampicillin resistens. Plasmid pMT2 DNA kan bli dannet ved hjelp av konvensjonelle metoder. pMT2 CXM blir deretter konstruert ved anvendelse av "loopout/i mutagenese" [Moringa, et al„ Biotechnology 84: 636 ;(1984). Dette fjernen basen 1075 til 1145 i forhold til Hindm setet nær ved SV40 replikasjonsorigo og enhancer sekvenser til pMT2.1 tillegg blir det innskutt en sekvens inneholdende gjenkjenningssete for restriksjonsendonuklease Xhol. Et derivat pMT2CXM betegnet pMT23, inneholder gjenkjenningsseter for restriksjonsendonukleasene PstL EcoRL Sali og Xhol. Plasmid pMT2 CXM og pMT23 DNA kan bli dannet ved hjelp av vanlige metoder. ;pEMC261 avledet fra pMT21 kan også være egnet for utførelse av oppfinnelse. pMT21 blir avledet fra pMT2 som er avledet fra pMT2-VWF. Som beskrevet ovenfor spalter EcoRI spaltningen cDNA innskudd tilstede i pMT-VWF, og tilveiebringer pMT2 i lineær form som kan bli ligert og anvendt for å transformere E. coli HB 101 og DH-5 til ampicillinresistens. Plasmid pMT2 DNA kan bli dannet ved hjelp av konvensjonelle metoder. ;pMT21 blir avledet fra pMT2 ved hjelp av følgende to modifikasjoner. For det første blir 76 bp av 5' utranslatert region til DHFR cDNA inkludert et område med 19 G resi-dier fra G/C halen for cDNA kloning deletert. I denne prosessen blir et Xhol sete skutt inn for å oppnå følgende sekvens rett oppstrøms fra DHFR. Deretter blir et unikt Clal sete introdusert ved spaltning med EcoRV og XbaL behandling med Klenow fragment DNA polymerase I og ligering til en Clal linker (CATCGATG). Dette deleterer et 250 bp segment fra adenovirus assosiert RNA (VAI) region, men interfererer ikke med VAI RNA genekspresjonen eller funksjonen. pMT21 blir spaltet med EcoRI og Xhol og anvendt for å oppnå vektor pEMC2B 1. ;En del av EMCV lederen blir oppnådd fra pMT2-ECATl [S.K. Jung, et al, J.Virol 63: 1651-1660 (1989)] ved spaltning med EcoRI og Pstl og resulterer i et 2752 bp fragment. Dette fragmentet blir spaltet med Taql og tilveiebringer et EcoRI-Taql fragment på 508 bp som blir renset ved elektroforese på lavtsmeltende agarosegel. En 68 bp adapter og dets komplementære tråd blir syntetisert med en 5' Taql utragende ende og en 3' Xhol utragende ende som har en sekvens som samsvarer med EMC virus ledersekvensen fra nukleotid 763 til 827. Den forandrer også ATG ved posisjon 10 innenfor EMC virusle-deren til en ATT og blir etterfulgt av et Xhol sete. En treveis ligering av pMT21 Eco RI-Xhol fragmentet, EMC virus EcoRI-Taql fragmentet og 68 bp oligonukleotidadapter Taql-Xhol adapter resulterer i vektoren pEMC261. ;Denne vektoren inneholder SV40 replikasjonsorigo og enhancer, adenovirus major late promoter, en cDNA-kopi av det meste av adenovirus tripartit ledersekvensen, en liten hybrid intervenerende sekvens, et SV40 polyadenyleirngssignal og adenovirus VA I genet, DHFR og 6-laktamase markører og EMC sekvens, i hensiktsmessige forhold for å lede ekspresjon i høyt nivå av ønsket cDNA i pattedyrcellene. ;Konstruksjon av vektorene kan innbefatte modifikasjon av BMP-12 DNA-sekvenser. Blant annet kan BMP-12 cDNA modifiseres ved fjerning av ikke-kodende nukleotider på 5'og 3' endene til den kodende regionen. Deleterte ikke-kodende nukleotider kan erstattes av andre sekvenser kjent for å være fordelaktige for ekspresjon. Disse vektorene blir transdormert inn i hensiktsmessige vertsceller for ekspresjon av BMP-12 proteiner. I tillegg kan sekvensen til SEQ JD NO: 1 eller andre sekvenser kodende for BMP-12 proteinene bli manipulert for å uttrykke BMP-12 proteinet ved isolering av den modne kodende sekvensen til nukleotidene 571 til 882 ifølge SEQ ED NO: 1 og tilsetning ved 5'-enden sekvenser som koder for fullstendige propeptider til andre BMP proteiner. ;For eksempel kan fagfolk innenfor dette området danne et fusjonsprotein hvor propeptidet til BMP-2 er koblet på en operabel måte til modent BMP-12 peptid ved å danne en DNA-vektor hvor DNA-sekvensen kodende for BMP-2 propeptidet er koblet i riktig leseramme til DNA-sekvensen kodende for. modent BMP-12 peptid. DNA-sekvensen til et slikt fusjonsprotein er vist i SEQ ED NO: 27. ;Fagfolk innenfor dette området kan manipulere sekvensene ifølge SEQ ED NO: 1 ved å ;eliminere eller erstatte pattedyr regulatoriske sekvenser som flankerer den kodende sekvensen med bakterielle sekvenser for å danne bakterielle vektorer for intracellulær eller ekstracellulær ekspresjon av bakterielle celler, som beskrevet ovenfor. Som et annet eksempel kan kodende sekvenser bli ytterligere manipulert (for eksempel ligert til andre kjente linkere eller modifisert ved deletering av ikke-kodende sekvenser derfra eller endring av nukleotider deri ved hjelp av andre kjente teknikker). Modifisert BMP-12 kodende sekvens kan deretter bli innskutt i en kjent bakteriell vektor ved anvendelse av prosedyrene som beskrevet i T. Taniguchi et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 77:5230-5233 (1980). Denne eksempelvise bakterielle vektoren kan deretter bli transformert inn i bakterielle vertsceller og et BMP-12 protein dermed uttrykt. For en strategi for produsering av ekstracellulær ekspresjon av BMP-12 proteiner i bakterielle celler se for eksempel europeisk patentsøknad 177.343. ;Lignende manipuleringer kan bli utført for konstruksjon av en innskuddsvektor (se for eksempel prosedyrer beskrevet i publisert europeisk patentsøknad 155.476) for ekspresjon i insektsceller. En gjærvektor kan også bli konstruert ved anvendelse av regulatoriske sekvenser fra gjær for intracellulær eller ekstracellulær ekspresjon av faktorene ifølge foreliggende oppfinnelse fra gjærceller (se for eksempel prosedyrer beskrevet i publisert PCT søknad WO86700639 og europeiske patentsøknad EPA 123.289). ;En fremgangsmåte for produsering av høye nivåer av et BMP-12 protein ifølge oppfinnelsen i pattedyrceller kan bli anvendt for konstruksjon av celler inneholdende mange kopier av heterologt BMP-12 gen. Heterologt gen blir koblet til en amplifiserbar mar-kør, for eksempel dihydrofolat reduktase (DHFR) gen hvor celler inneholdende økte genkopier kan bli selektert for propagering av økende konsentrasjoner av metotreksat (MTX) ifølge prosedyren til Kaufman og Sharp, J.Moi. Biol., 159:601-629 (1982). Denne metoden kan anvendes med mange forskjellige celletyper. ;Et plasmid inneholdende en DNA-sekvens for en BMP-12 ifølge oppfinnelsen i operativ assosiasjon med andre plasmidsekvenser som etablerer ekspresjonen derav og DHFR ekspresjonsplasmid pAdA26SV(A)3 [Kaufman og Sharp, Mol. Cell. Biol., 2:1304 ;(1982) ] kan sammen innføres i DHFR-manglende CHO celler, DUKX-BH, ved hjelp av forskjellige fremgangsmåter som innbefatter kalsiumfosfat kopresipitasjon og transfek-sjon, elektroporasjon eller protoplastfusjon. DHFR ekspresjonstransformanter blir valgt for vekst i alfa medium med dialysen føtalt kalveserum, og deretter selektert for amplifikasjon ved vekst i økende konsentrasjoner MTX (for eksempel sekvensielle trinn i 0,02, 0,2, 1,0 og 5 nm MTX) som beskrevet i Kaufman et al., Mol. Cell.Biol., 5:1750 ;(1983) . Transformanter blir klonet og biologisk aktiv BMP-12 ekspresjon blir registrert i Rosen-modifisert Sampath-Reddi rotteanalyse beskrevet nedenfor i eksempel 5. BMP-12 ekspresjonen øker med økende nivåer av MTX resistens. BMP-12 polypeptider er karakterisert ved hjelp av standardteknikker kjent innenfor fagområdet så som pulsmer-king med [35S] metionin eller cystein og polyakrylamid gelelektroforese. Lignende prosedyrer kan bli fulgt for å produsere andre beslektede BMP-12 proteiner. ;Eksempel 3 ;Preparering av BMP- 2 propeptid/ BMP- 12 moden pe<p>tidfusion ;For å konstruere en vektor som koder for BMP-2 propeptid/BMP-12 moden peptidfu-sjon ble følgende kloningsprosedyre anvendt for å fusjonere de to sekvensene sammen. ;Først blir et DNA restriksjonsenzymfragment omfattende propeptidet til humant BMP-2 protein, omfattende nukleotidene 1 til og med 843 ifølge SEQ ED NO: 27 spaltet fra pBMP2AEMC. pBMP2AEMC er et plasmid avledet fra lambda U20S-39 (ATCC nr. ;40345) som omfatter hele den kodende sekvensen for humant BMP-2 protein med ikke-translaterte 5' og 3'sekvenser til BMP-2 deletert fra vektoren. 5' restriksjonsenzymet anvendt var BglK og det spalter pBMP2AEMC i vektoren ved nukleotid 979. 3' restriksjonsenzymet var Mae II og det spalter pBMP2AEMC i BMP-2 propeptidet ved nukleotid 1925 ved karboksyterminusen. Det resulterende 954 baseparproduktet ble deretter gelisolert og genrenset. Deretter blir et DNA restriksjonsenzymfragment omfattende 5' delen av human BMP-12 moden peptid DNA-sekvens spaltet fra pPCRl-1 nr 2 V1-1 (ATCC nr 69517). 5' restriksjonsenzymet anvendt var Eae I og spalter pPCRl-1 nr 2 VI-1 like 3' for den N-terminale enden til human BMP-12 moden peptidsekvens. Resulterende 259 baseparprodukt ble gelisolert og genrenset. Deretter ble to DNA oligoer konstruert og syntetisert slik at når sammensmeltet blir det dannet et lite DNA-fragment som omfatter fusjonssekvensen til ekstrem 3' ende av humant BMP-2 propeptid og 5' ende til BMP-12 modent peptid. DNA-fragmentet har en 5' Mae D komplementær klebrig ende som blir sammensmeltet til 3' restriksjonsenzymfragmentet som omfatter humant BMP-2 propeptid. Sammensmeltet oligo DNA-fragment har en 3' Eae I komplementær klebrig ende som blir sammensmeltet til 5' av restriksjonsenzymfragmentet som omfatter det modne peptidet til human BMP-12. Kodende oligotråd blir betegnet B2/12 og har en lengde på 13 basepar. Deretter ble et DNA-fragment kodende for 123 basepar-ene ved 3' enden av BMP-12 modent peptidfragment oppnådd som følger. Først blir et DNA-fragment som omfatter propeptidet til humant BMP-2 protein, omfattende nukleotidene nr 1 til og med 846 PCR amplifisert fra pBMP2AEMC. 5' primerene (oligo 655a) sammensmelter like 5' for polylinkeren. 3' primeren (BMPpro3) blir sammensmeltet til BMP-2 propeptid 3' enden og innfører et Bgl II restriksjonsenzymsete ved stille sekvensmutasjoner. Resulterende PCR produkt ble spaltet med Sal I som blir spaltet i polylinkeren, og Bgl EL 850 basepar restriksjonsenzym fragment (som ender i aminosyresekvens REKR) ble gelisolert og gen renset. BMP-12 modent peptid ble PCR amplifisert ved anvendelse av 5' primer (oligo 5-1) kodende for Bgl U restriksjonsenzymsetet ved stille sekvensmutasjoner, og sammensmeltning til 5' enden av et mulig modent spalt-ningsprodukt, begynnende med aminosyresekvens SRCS. 3* primeren (V 1-1 3) blir sammensmeltet til BMP-12 modent peptid 3' ende og innfører et Xbal restrisjonsenzymsete etter stoppkodonet. Det resulterende PCR produktet ble spaltet med Bgl II og Xbal. 321 basepar restriksjonsenzym fragmentet ble gelisolert og genet ble renset.

To restriksjonsfragmenter ble 3-veis ligert inn i en på forhånd Sali og Xbal spaltet vektor. Den resulterende konstruksjonen ble sekvensert for å undersøke PCR induserte feil og en stille C til T mutasjon ble observert ved basepar 185 i propeptidet. Dette plasmi-

det ble betegnet pREKRSRC. Deretter ble pREKRSRC spaltet med Bgin og NgoMI, og

vektorfragmentet som omfatter siste 123 basepar av BMP-12 moden sekvens ble derved isolert. De tre restriksjonsfragmentene og sammensmeltet oligolinker ble 4-veis ligert for å tilveiebringe pREKR-TAL med BMP-2 propeptid med modent spaltningssete ved 3' enden koblet til (TAL) 5' enden av BMP-12 modent peptid. Den kodende sekvensen til den resulterende ligerte vektoren er vist i SEQ LD NO: 27.

Eksempel 4

Biologisk aktivitet til uttrykt BMP- 12

For å måle den biologiske aktiviteten til uttrykte BMP-12 proteiner oppnådd i eksempel 2 ovenfor ble proteinene isolert fra cellekulturen og renset ved isolering av BMP-12 proteinene fra andre proteinholdige materialer som de blir produsert sammen med samt fra andre kontaminanter. Renset protein kan bli analysert i henhold til rotteanalysen beskrevet nedenfor i eksempel 5.

Rensingen blir utført ved anvendelse av standardteknikker kjent for fagfolk innenfor dette området.

Proteinanalyser blir utført ved anvendelse av standardteknikker så som SDS-PAGE ak-rylamid [Laemmli, Nature 227:680 (1970)] farvet med Coomassie blå eller sølv [Oakley, et al. Anal. Biochem. 105:361 (1980)] og ved immunoblotting [Towbin, et al. Proe. Nati. Acad. Sei. USA 76:4350 (1979)].

Eksempel 5

Rosen- modifisert Svmpath- Reddi analyse

En modifisert versjon av rotte ektopisk implanteringsanalyse beskrevet i Sampath og Reddi, Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 80:6591-6595 (1983) blir anvendt for å vurdere aktiviteten til BMP-12 proteinene. Denne modifiserte analysen er heri betegnet Rosen-modifisert Sympath-Reddi analyse. Analysen er blitt anvendt for å vurdere ben og brusk-induserende aktivitet til BMP. Etanolpresipiteringstrinnet til Sympath-Reddi prosedyren er erstattet med dialysering (dersom sammensetningen er en oppløsning) eller diafiltrering (dersom sammensetningen er en suspensjon) av fraksjonen som skal bli analysert mot vann. Oppløsningen eller suspensjonen blir deretter ekvilibrert til 0,1% TFA. Den resulterende oppløsningen blir tilsatt til 20 mg rottematrise. En uekte rottematirseprøve ikke behandlet med protein virker som en kontroll. Dette materialet blir frosset og lyofilisert og resulterende pulver innesluttet i nr 5 gelatinkapsler. Kapslene blir implantert subku-tant i abdominal thoraks område til 21-49 dager gamle hann Long Evans rotter. Implantatene blir fjernet etter 10 dager. Et snitt av hvert implantat blir fiksert og bearbeidet for histologisk analyse. 1 |im glykolmetakrylat deler blir farvet med Von Kossa og sur fuschin for å registrere mengden av indusert sene/ligamentlignende vevsdannelse tilstede i hvert implantat.

BMP-12 ble implantert i rotter i doser på 1, 5,25 og 50 ug pr implantat i 10 dager. BMP-2 i en dose på 5 u.g ble innbefattet som en positiv kontroll. For alle testede doser av BMP-12 ble ingen ben eller bruskdannelse observert i implantatene etter 10 dager. Implantatene ble fylt med vevslignende embryonisk sene som lett kan gjenkjennes ved tilstedeværelse av tette knuter av fibroblaster orientert i samme plan og pakket tett sammen (sene/ligamentlignende vev er for eksempel beskrevet i Ham og Cormack, Histology (JB Lippincott Co. (1979), s. 367-369, og beskrivelsen er inkorporert heri som referanse). Disse funnene ble reprodusert i et annet sett av analyser hvor sene/ligamentlignende vev var tilstede i alle BMP-12 inneholdende implantater. I kontrast til dette viste BMP-2 implantater, som ventet, brusk og bendannelse, men ikke sene/ligamentlignende vev.

BMP-12 proteinene og relaterte proteiner ifølge oppfinnelsen kan bli vurdert for aktivitet i denne analysen.

Eksempel 6

Anvendelse av fremgangsmåter i henhold til ovennevnte eksempler, med mindre modifikasjoner innenfor fagområdet, ble humant MP-52 protein og murin homolog av en BMP-13 protein uttrykt og analysert for sene/ligamentlignende vevsinduserende aktivitet. Alle proteinene viste sammenlignbare resultater som ligner de som er beskrevet ovenfor for human BMP-12.

Claims

1. DNA-molekyl, karakterisert ved at det har en sekvens som koder for et benmorfogenisk protein med evne til å indusere dannelse av sene/ligamentlignende vev, idet DNA-molekylet omfatter: (a) nukleotid nr 196, nr 199, nr 208, nr 217, nr 361, nr 388, nr 493, nr 496, nr 571 eller nr 577 til nr 879 eller nr 882 av SEQ ID NO: 1; (b) nukleotider kodende for aminosyrene nr. 25, nr 1 eller nr 3 til nr 103 eller nr 104 av SEQ ID NO: 2; (c) nukleotid nr 410, nr 458, nr 602, nr 605 eller nr 659 til nr 961 eller nr 964 av SEQ ID NO: 25; (d) nukleotider kodende for aminosyrene nr 1 eller nr 19 til nr 119 eller nr 120 av SEQ LD NO: 26; (e) naturlig forekommende aleliske sekvenser eller ekvivalente degenererte kodonsekvenser av hvilke som helst ifølge (a) til (d); eller (f) sekvenser som hybridiserer til hvilke som helst av (a) til (e) under standard hybridiseringsbetingelser, eller et komplement av disse.

2. Kimært DNA-molekyl, karakterisert ved at det omfatter en DNA-sekvens som koder for et propeptid fra et medlem av TGF-13 superfamilien av proteiner koblet i riktig leseramme til en DNA-sekvens ifølge krav 1.

3. Kimært DNA-molekyl ifølge krav 2, karakterisert ved at propeptidet er fra BMP-2.

4. Vektor, karakterisert ved at den omfatter DNA-molekylet ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 3 i operativ assosiasjon med en ekspresjonskontrollsekvens derav.

5. Vertscelle, karakterisert ved at den er transformert med DNA-molekyler ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 3 eller vektoren ifølge krav 5.

6. Fremgangsmåte for fremstilling av et BMP-12 eller BMP-12-relatert protein som har evnen til å indusere dannelse av sene/ligamentlignende vev, karakterisert ved at den omfatter: (a) dyrking av vertscellen ifølge krav 5 og (b) isolering og, eventuelt, rensing av nevnte BMP-12 eller BMP-12 relaterte protein fra kulturmediet.

7. BMP-12 eller BMP-12-relatert protein med evnen til å indusere dannelse av sene/ligamentlignende vev, karakterisert ved at det kodes av DNA-molekylet ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 4 eller produseres ifølge fremgangsmåten i krav 6.

8. Polypeptid, karakterisert ved at det er i form av en dimer omfattende to subenheter, hver med aminosyresekvensen kodet av DNA-molekylet ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 3.

9. Heterodimerisk proteinmolekyl, karakterisert ved at det omfatter en monomer med aminosyresekvensen til polypeptidet ifølge krav 7, og en monomer som har aminosyresekvensen til et protein fra TGF-13 superfamilien.

10. Farmasøytisk sammensetning, karakterisert ved at den omfatter polypeptidet eller proteinet ifølge et hvilket som helst av kravene 7 til 9, eventuelt blandet sammen med en farmasøytisk akseptabel bærer.

11. Anvendelse av polypeptidet eller proteinet ifølge et hvilket som helst av kravene 7 til 9 for fremstilling av en sammensetning for indusering av sene/ligamentlignende vevsdannelse hos en pasient som trenger dette.

12. Anvendelse av polypeptidet eller proteinet ifølge et hvilket som helst av kravene 7 til 9 for fremstilling av en sammensetning for behandling av tendinitt, eller annen sene- eller ligamentdefekt, hos en pasient som trenger dette.