JP3939729B2 - Ｂｍｐ−１２、ｂｍｐ−１３およびそれらの腱誘導組成物 - Google Patents

Description

本発明は、精製蛋白の新規ファミリー、およびかかる蛋白を含有する組成物に関し、該組成物は腱／靭帯様組織の形成、傷の治癒および靭帯ならびに他の組織の修復に有用である。骨形態形成蛋白の活性を増大させるための組成物中にこれらの蛋白を用いてもよい。

骨、軟骨、腱、および骨ならびに他の組織抽出物に存在する他の組織の形成のに関与する分子の検索は、骨形態形成蛋白（ＢＭＰｓ）と呼ばれる新規なセットの分子の発見につながった。ＢＭＰ−１ないしＢＭＰ−１１と命名されたいくつかの蛋白の構造はすでに調べられている（例えば、特許文献１参照）。これらの蛋白のユニークな誘導活性ならびにそれらの骨における存在は、それらが骨修復プロセスにおける重要なレギュレーターであり、骨組織の通常の維持に必要とされうるということを示唆する。他の生組織の形成において役割を果たすさらなる蛋白を同定する必要がある。
米国特許第５１４１９０５号

本発明の解決課題は、腱／靭帯様組織誘導活性を有し、腱／靭帯様組織の形成および修復を誘導するための組成物において有用である蛋白のファミリーを新たに同定することである。

本発明者らは、上記課題を解決せんと鋭意研究を重ね、腱／靭帯様組織誘導活性を有し、腱／靭帯様組織の形成および修復を誘導するための組成物において有用である蛋白のファミリーのＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を新たに同定し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、下記のものを提供する：
（１）ＤＮＡ配列が、配列番号：１のヌクレオチド４９６、５７１もしくは５７７から８８２までの配列の対立遺伝子変種配列から選択されるものである、腱／靱帯様組織の形成を誘導する能力を有するＢＭＰ−１２蛋白をコードする単離ＤＮＡ；
（２） ＤＮＡ配列が、配列番号：２５のヌクレオチド６０５もしくは６５９から９６４までの配列の対立遺伝子変種配列から選択されるものである、腱／靱帯様組織の形成を誘導する能力を有するＢＭＰ−１３蛋白をコードする単離ＤＮＡ；
（３）（１）または（２）のＤＮＡ配列で形質転換された宿主細胞；
（４）発現制御配列に作動可能に連結された、（１）または（２）のＤＮＡを含むベクター；
（５）（４）のベクターで形質転換された宿主細胞；
（６）以下の群：
（ａ）配列番号：２に示すアミノ酸−２５からアミノ酸１０４まで；
（ｂ）配列番号：２に示すアミノ酸１からアミノ酸１０４まで；および
（ｃ）配列番号：２に示すアミノ酸３からアミノ酸１０４まで
から選択されるアミノ酸配列の対立遺伝子変種配列から選択されるアミノ酸配列を含む精製ポリペプチド；
（７）以下の群：
（ａ）配列番号：２６示すアミノ酸１からアミノ酸１２０まで；および
（ｂ）配列番号：２６示すアミノ酸１９からアミノ酸１２０まで
から選択されるアミノ酸配列の対立遺伝子変種配列から選択されるアミノ酸配列を含む精製ポリペプチド；
（８）腱／靱帯様組織の形成を誘導する能力を有することにより特徴づけられる（６）のポリペプチド；
（９）腱／靱帯様組織の形成を誘導する能力を有することにより特徴づけられる（７）のポリペプチド；
（１０）医薬上許容される担体と混合された有効量の（８）または（９）のポリペプチドを含む、腱または靱帯に関連した疾病を治療または予防するための医薬組成物；
（１１）医薬上許容される担体と混合された有効量の（８）または（９）のポリペプチドを含む、腱／靱帯様組織の治癒および組織修復のための医薬組成物；
（１２）医薬上許容される担体と混合された有効量の（８）または（９）のポリペプチドを含む、結合組織と骨との間の接着を再生させるための医薬組成物；
（１３）医薬上許容される担体と混合された有効量の（８）または（９）のポリペプチドを含む、腱／靱帯様組織の修復のための医薬組成物；
（１４）腱／靱帯様組織の疾患を治療するための治療組成物を調製するための、有効量の（８）または（９）のポリペプチドの使用方法；
（１５）結合組織と骨との間の接着の再生を必要とする疾患を治療するための治療組成物を製造するための、有効量の（８）または（９）のポリペプチドの使用方法；
（１６）結合組織と骨との間の接着の再生を必要とする疾患を治療するための治療組成物を製造するための、有効量のＭＰ−５２の使用方法；
（１７）歯周靱帯の再生を必要とする疾患を治療するための治療組成物を製造するための、有効量の（８）または（９）のポリペプチドの使用方法；
（１８）歯周靱帯の再生を必要とする疾患を治療するための治療組成物を製造するための、有効量のＭＰ−５２の使用方法；
（１９）結合組織と骨との間の接着の再生を必要とする疾患を治療するための治療組成物であってさらにＢＭＰ−２を含有するものを製造するための、有効量の（８）または（９）のポリペプチドの使用方法；
（２０）結合組織と骨との間の接着の再生を必要とする疾患を治療するための治療組成物であってさらにＢＭＰ−２を含有するものを製造するための、有効量のＭＰ−５２の使用方法。

本発明の解決課題は、腱／靭帯様組織誘導活性を有し、腱／靭帯様組織の形成および修復を誘導するための組成物において有用である蛋白のファミリーが新たに提供され、効果的に腱／靭帯様組織の形成および修復を誘導することができる。

発明を解決するための手段

１の具体例において、本発明は、発明者らがＶＬ−１と命名した腱／靭帯様組織誘導蛋白をコードするＤＮＡ分子からなる。この新規蛋白は、現在ＢＭＰ−１２と呼ばれている。さらに本発明は、ＢＭＰ−１２関連蛋白をコードするＤＮＡ分子を包含する。

ＢＭＰ−１２関連蛋白は、ＢＭＰ−１２およびＶＬ−１を含むＢＭＰ／ＴＧＦ−β／Ｖｇ−１ファミリーの蛋白の部分集合であり、例えば、厳密性を減じた条件下で、下記プラーイマー＃６および＃７のごときＢＭＰ−１２特異的プライマーを用いるＰＣＲを用いてクローン化され同定されるＤＮＡ配列によりコードされる腱／靭帯様組織誘導蛋白として定義される。ＢＭＰ−１２関連蛋白をコードするＤＮＡ配列が、アミノ酸レベルにおいて、配列番号：１のアミノ酸＃３から＃１０３までと少なくとも８０％の相同性を有することが好ましい。

好ましくは、ＤＮＡ分子は、配列番号：１に示すＢＭＰ−１２、またはさらに本明細書において説明するＢＭＰ−１２関連蛋白をコードするＤＮＡ配列を有する。ＢＭＰ−１２蛋白およびＢＭＰ−１２関連蛋白はともに、実施例において説明するアッセイにおいて腱／靭帯様組織の形成を誘導する能力により特徴づけられる。

本発明ＤＮＡ分子は、好ましくは、配列番号：１に記載されたＤＮＡ配列、より好ましくは、配列番号：１のヌクレオチド＃４９６から＃８８２まで、＃５７１から＃８８２までもしくは＃５７７から＃８８２まで；あるいは厳密条件下で上記のものにハイブリダイゼーションし、腱／靭帯様組織を形成する能力を示す蛋白をコードしているＤＮＡ配列からなる。本発明ＤＮＡ分子は、配列番号：２５に記載したＤＮＡ配列；より好ましくは配列番号：２５のヌクレオチド＃６０４もしくは＃６５８から＃９６４までからなっていてもよい。

さらに本発明ＤＮＡ分子は、配列番号：２または配列番号：２６に示すアミノ酸配列を有するＢＭＰ−１２関連蛋白をコードするＤＮＡ配列、ならびに天然に存在する対立遺伝子および配列番号：２もしくは配列番号：２６の等価な縮重コドン配列からなるＤＮＡ分子を包含する。好ましくは、本発明ＤＮＡ配列は、配列番号：２のアミノ酸＃２５から＃１０４まで、＃１から＃１０４までもしくは＃３から＃１０３まで；あるいは配列番号：２６のアミノ酸＃１から＃１２０までもしくは＃１９から＃１２０までをコードする。ＤＮＡ配列は、５'から３'方向において、プロペプチドをコードするヌクレオチド、および配列番号：２のアミノ酸＃２５から＃１０４まで、＃１から＃１０４までもしくは＃３から＃１０３まで；あるいは配列番号：２６のアミノ酸＃１から＃１２０までもしくは＃１９から＃１２０までをコードするヌクレオチドからなっていてもよい。好ましくは、上記具体例において有用なプロペプチドは、ネイティブ（native）なＢＭＰ−１２プロペプチドおよびＴＧＦ−βスーパーファミリーまたはＢＭＰファミリーの異なるメンバー由来の蛋白プロペプチドからなる群より選択される。さらに本発明は、厳密条件下で上記ＤＮＡ配列にハイブリダイゼーションし、腱／靭帯様組織を形成する能力を示す蛋白をコードしているＤＮＡ配列からなる。

他の具体例において、本発明は、ＢＭＰ−１２蛋白またはＢＭＰ−１２関連蛋白をコードしているＤＮＡ分子を含んでいる宿主細胞およびベクターからなる。宿主細胞およびベクターは、さらに発現調節配列に作動可能に結合したコーディング配列からなっていてもよい。

もう１つの具体例において、本発明は、精製ＢＭＰ−１２関連蛋白の製造方法であって、（ａ）ＢＭＰ−１２関連蛋白をコードするヌクレオチド配列からなる上記ＤＮＡ分子またはベクターで形質転換した宿主細胞を培養し；次いで、（ｂ）培地より該ＢＭＰ−１２関連蛋白を回収し精製する工程からなる方法よりなる。好ましい具体例において、該方法は、（ａ）配列番号：１に示すヌクレオチド配列＃４９６、＃５７１もしくは＃５７７から＃８７９もしくは＃８８２まで；あるいは配列番号：２５のヌクレオチド配列＃６０４もしくは＃６５８から＃９６３までからなるＤＮＡ分子で形質転換した細胞を培養し；次いで、
（ｂ）配列番号：２に示すアミノ酸＃−２５、＃１もしくは＃３からアミノ酸＃１０３もしくは１０４まで；あるいは配列番号：２６に示すアミノ酸＃１もしくは＃１９からアミノ酸＃１２０までのアミノ酸配列からなる蛋白を該培地から回収し精製することからなる。また、本発明は上記方法により製造される精製蛋白を包含する。

さらに本発明は、腱／靭帯様組織の形成を誘導する能力によって特徴づけられる精製ＢＭＰ−１２関連蛋白からなる。好ましくは、ＢＭＰ−１２関連蛋白は配列番号：２に示すアミノ酸配列からなる。好ましくは、ポリペプチドは配列番号：２に示すアミノ酸−２５、＃１もしくは＃３から＃１０３もしくは＃１０４まで；あるいは配列番号：２６に示すアミノ酸＃１もしくは＃１９から＃１２０までからなる。好ましい具体例において、精製ポリペプチドは、それぞれが配列番号：２のアミノ酸配列とともに形成される、２つのサブユニットからなるダイマーの形態であってもよい。

もう１つの具体例において、本発明は、有効量の上記ＢＭＰ−１２関連蛋白からなる組成物よりなる。該組成物において蛋白は医薬上許容される担体と混合されていてもよい。

また、本発明は、腱炎、または他の腱もしくは靭帯の欠損の治療のための、および腱／靭帯様組織の形成を必要とする患者における腱／靭帯様組織の形成のための、腱／靭帯様組織の治癒および組織の修復方法であって、該患者に有効量の上記組成物を投与することからなる方法を包含する。

他の具体例は、ＢＭＰ−１２をコードするＤＮＡ配列に正しい読み取り枠で結合したＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバー由来のプロペプチドをコードしているＤＮＡ配列からなるキメラＤＮＡ分子を包含する。１の適当なプロペプチドはＢＭＰ−２由来のプロペプチドである。また、本発明は、配列番号：２に示すアミノ酸配列有する１のモノマー、およびＴＧＦ−βサブファミリーの別の蛋白のアミノ酸配列を有する１のモノマーからなるヘテロダイマー蛋白分子を包含する。

最後に、本発明は、腱／靭帯様組織の形成を必要とする患者における腱／靭帯様組織の形成の誘導方法であって、腱／靭帯様組織の形成を誘導する能力を示す蛋白であって配列番号：２または配列番号：４または配列番号：２６に示すアミノ酸配列を有する蛋白からなる有効量の組成物を該患者に投与することからなる方法よりなる。より好ましくは、アミノ酸配列は、（ａ）配列番号：２のアミノ酸＃２５、＃１もしくは＃３から＃１０３もしくは＃１０４；（ｂ）配列番号：４のアミノ酸＃１もしくは＃１９から＃１２０まで；（ｃ）配列番号：２６のアミノ酸＃１もしくは＃１９から＃１１９もしくは＃１２０まで；（ｄ）腱／靭帯形成能を示す（ａ）、（ｂ）または（ｃ）の変異体および／または変種のうちの１つである。上記方法の他の具体例において、蛋白は、配列番号：１、配列番号：３または配列番号：２５のＤＮＡ配列によりコードされ、より好ましくは、（ａ）配列番号：１のヌクレオチド＃４９６、＃５７１もしくは＃５７７から＃８７９もしくは＃８８２まで；（ｂ）配列番号：３のヌクレオチド＃８４５もしくは＃８９９から＃１２０１もしくは＃１２０４まで；（ｃ）配列番号：２５のヌクレオチド＃６０５もしくは＃６５９から＃９６１もしくは＃９６４まで；および（ｄ）厳密条件下で（ａ）または（ｂ）とハイブリダイゼーションし、腱／靭帯様組織の形成能を示す蛋白をコードしている配列のうちの１つによりコードされる。

配列の説明
配列番号：１はヒト・ＢＭＰ−１２をコードするヌクレオチド配列である。
配列番号：２は成熟ヒト・ＢＭＰ−１２ポリペプチドからなるアミノ酸配列である。
配列番号：３は蛋白ＭＰ５２をコードするヌクレオチド配列である。
配列番号：４は成熟ＭＰ５２ポリペプチドからなるアミノ酸配列である。
配列番号：５はヒト・ＢＭＰ−１２をコードする配列の特異的に増幅された部分のヌクレオチド配列である。
配列番号：６は配列番号：５のヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列である。
配列番号：７はヒト・ＶＬ−１をコードする配列の特異的に増幅された部分のヌクレオチド配列である。
配列番号：８は配列番号：７のヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列である。
配列番号：９はイー・コリにおけるＢＭＰ−１２の発現に使用されるプラスミドｐＡＬＶ１−７８１のヌクレオチド配列である。
配列番号：１０はネズミ・クローンｍＶ１のフラグメントのヌクレオチド配列である。
配列番号：１１はｍＶ１によりコードされるネズミ・蛋白のフラグメントのアミノ酸配列である。
配列番号：１２はネズミ・クローンｍＶ２のフラグメントのヌクレオチド配列である。
配列番号：１３はｍＶ２によりコードされるネズミ・蛋白のフラグメントのアミノ酸配列である。
配列番号：１４はネズミ・クローンｍＶ９のフラグメントのヌクレオチド配列である。
配列番号：１５はｍＶ９によりコードされるネズミ・蛋白のフラグメントのアミノ酸配列である。
配列番号：１６はＢＭＰ／ＴＧＦ−β／Ｖｇ−１蛋白のコンセンサス配列のアミノ酸配列である。最初のＸａａはＧｌｎまたはＡｓｎのいずれかを示し；２番目のＸａａはＶａｌまたはＩｌｅのいずれかを表す。
配列番号：１７はオリゴヌクレオチド＃１のヌクレオチド配列である。
配列番号：１８はＢＭＰ／ＴＧＦ−β／Ｖｇ−１蛋白のコンセンサス配列のアミノ酸配列である。ＸａａはＶａｌまたはＬｅｕのいずれかを示す。
配列番号：１９はオリゴヌクレオチド＃２のヌクレオチド配列である。
配列番号：２０はオリゴヌクレオチド＃３のヌクレオチド配列である。
配列番号：２１はオリゴヌクレオチド＃４のヌクレオチド配列である。
配列番号：２２はオリゴヌクレオチド＃５のヌクレオチド配列である。
配列番号：２３はオリゴヌクレオチド＃６のヌクレオチド配列である。
配列番号：２４はオリゴヌクレオチド＃７のヌクレオチド配列である。
配列番号：２５はヒト・ＶＬ−１（ＢＭＰ−１３）をコードする配列のヌクレオチド配列である。
配列番号：２６は配列番号：２５のヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列である。
配列番号：２７はＢＭＰ−１プロペプチドとＢＭＰ−１２の成熟コーディング配列との融合物をコードするヌクレオチド配列ある。
配列番号：２８は配列番号：２７のヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列である。
配列番号：２９はネズミ・ｍＶ１蛋白をコードするヌクレオチド配列である。Ｘ０１はＶａｌ、Ａｌａ、ＧｌｕまたはＧｌｙ；Ｘ０２はＳｅｒ、Ｐｒｏ、ＴｈｒまたはＡｌａ；Ｘ０３はＳｅｒまたはＡｒｇ；Ｘ０４はＬｅｕ、Ｐｒｏ、ＧｌｎまたはＡｒｇ；Ｘ０５はＣｙｓまたはＴｒｐ；Ｘ０６はＶａｌ、Ａｌａ、ＡｓｐまたはＧｌｙ；Ｘ０７はＶａｌ、Ａｌａ、ＧｌｕまたはＧｌｙ；Ｘ０８はＧｌｎ、ＬｙｓまたはＧｌｕである。
配列番号：３０は配列番号：２９のヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列である。
配列番号：３１はネズミ・ｍＶ２蛋白をコードするヌクレオチド配列である。Ｘ０１はＰｒｏまたはＴｈｒ；Ｘ０２はＶａｌである。
配列番号：３２は配列番号：３１のヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列である。Ｘ０１およびＸ０２は配列番号：３１と同じである。
配列番号：３３はヒト・ＢＭＰ−１２蛋白をコードするヌクレオチド配列である。
配列番号：３４は配列番号：３３のヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列である。
配列番号：３５はオリゴヌクレオチド＃８のヌクレオチド配列である。

発明の詳細な記述
本発明ＤＮＡ配列は、さらに後に説明するように、腱／靭帯様組織の形成を誘導する蛋白の製造にとり有用である。さらに本発明ＤＮＡ配列は、同様の活性を有するＢＭＰ−１２関連蛋白をコードするさらなるＤＮＡ配列の単位およびクローニングにとり有用である。これらのＢＭＰ−１２関連蛋白は他の種由来の同族体であってもよく、あるいは同一種内の関連蛋白であってもよい。

さらに、本発明のさらなる態様は、腱／靭帯様組織誘導蛋白の発現をコードするＤＮＡ配列である。かかる配列は、配列番号：１または配列番号：２５に示す５'から３'の方向のヌクレオチド配列、遺伝コードの縮重を除いては配列番号：１または配列番号：２５と同じであって配列番号：２または配列番号：２６の蛋白をコードしているＤＮＡ配列を包含する。さらに、厳密条件下で配列番号：１または配列番号：２５とハイブリダイゼーションし、腱または靭帯の形成を誘導する能力を有する蛋白をコードしているＤＮＡ配列は本発明に包含される。好ましいＤＮＡ配列は、マニアティス（Maniatis）ら,モレキュラー・クローニング（ア・ラボラトリー・マニュアル）(Molecular Cloning(A Laboratory Manual)),コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Cold Spring Harbor Laboratory）（１９８２年）,３８７〜３８９頁に記載の厳密条件下でハイブリダイゼーションするものを包含する。結局、配列番号：１または２５の配列の対立遺伝子または他の変種は、かかるヌクレオチド変化がペプチド配列の変化を引き起こしても、引き起こさなくても、そのペプチド配列がやはり腱／靭帯様組織誘導活性を有する場合には本発明に包含される。

ヒト・ＢＭＰ−１２のＤＮＡ配列（配列番号：１）およびアミノ酸配列（配列番号：２）を配列表に示す。本発明組成物および方法にとり有用な別の蛋白はＶＬ−１である。ＶＬ−１は、ＢＭＰ−１２由来の配列を用いてクローン化されたＢＭＰ−１２関連蛋白である。本発明者らはここにＶＬ−１をＢＭＰ−１３と命名した。ＶＬ−１の部分ＤＮＡ配列（配列番号：７）およびコードされるアミノ酸配列（配列番号：８）；ならびに成熟ＶＬ−１をコードするＤＮＡ配列（配列番号：２５）およびコードされるアミノ酸配列（配列番号：２６）を配列表に示す。配列番号：１および２のＢＭＰ−１２配列に関してさらなる説明をするが、本発明は、配列番号：２５および２６に示すＶＬ−１配列のごとき他のＢＭＰ−１２関連配列について行われてもよい同様の改変および改良を包含することが認識されよう。

配列番号：１に示すＢＭＰ−１２配列は、全成熟配列およびプロペプチドの約１９０個のアミノ酸を含む。成熟ヒト・ＢＭＰ−１２蛋白のコーディング配列は配列番号：１のヌクレオチド＃４９６または＃５７１から開始してヌクレオチド＃８８２まで続くと思われる。ＴＧＦ−β蛋白に特徴的な７個のシステインの構造のうち最初のシステインは＃５７７において始まる。最後のシステインは＃８７９において終了する。よって、活性ＢＭＰ−１２種をコードするＤＮＡ配列は配列番号：１のヌクレオチド＃５７７から＃８７９までからなるであろうと考えられる。

ＣＨＯ細胞のごとき哺乳動物細胞により発現されるようなＢＭＰ−１２は、異なるＮ末端を有するＢＭＰ−１２蛋白の活性種の異種集団として存在すると考えられる。すべての活性種は、配列番号：２のアミノ酸＃３におけるシステイン残基から始まりアミノ酸１０３における最後のシステイン残基もしくはアミノ酸１０４以降のストップコドンまで続くアミノ酸配列を含む。他の活性種は、Ｎ末端方向におけるさらなるアミノ酸を含む。さらに本明細書に記載したように、哺乳動物細胞により産生される活性種のＮ末端は、ペプチド配列Ａｒｇ−Ｘ−Ｘ−Ａｒｇをコードしているコンセンサス開裂部位の後ろから始まると考えられる。よって、活性ＢＭＰ−１２蛋白をコードするＤＮＡ配列は、配列番号：１のヌクレオチド＃１９６、１９９、２０８、２１７、３６１、３８８、４９３、４９６もしくは５７１からヌクレオチド＃８７９もしくは＃８８２までのいずれかにおいて開始するヌクレオチド配列からなるヌクレオチド配列を有しているであろうと考えられる。

ヒト・ＢＭＰ−１２の１の活性種のＮ末端を、イー・コリ（E.coli）における発現により実験的に決定したところ、以下のようであった：[Ｍ]ＳＲＸＳＲＫＰＬＨＶＤＦ（ここにＸは明確でないシグナルのアミノ酸残基を示し、その位置のシステイン残基と矛盾しない）。よって、このＢＭＰ−１２種のＮ末端は配列番号：１のアミノ酸＃１におけるものであり、該ＢＭＰ−１２種をコードする

ＤＮＡ配列は配列番号：１のヌクレオチド＃５７１において開始するであろうと思われる。このヒト・ＢＭＰ−１２種のダイマーの見かけの分子量をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定したところ、ノベックス（Novex）１６％トリシンゲル上で約２０〜２２ｋｄであった。ヒト・ＢＭＰ−１２蛋白は、０.１％トリフルオロ酢酸中で無色透明溶液として存在する。

先に説明したように、ＢＭＰ−１２関連蛋白は蛋白のＢＭＰ／ＴＧＦ−β／Ｖｇ−１ファミリーの部分集合であり、例えば、厳密性を減じた条件下で下記プライマー＃６および＃７のごときＢＭＰ−１２特異的プライマーを用いるＰＣＲを用いてクローン化され同定されうるＤＮＡ配列によりコードされる腱／靭帯様組織誘導蛋白として定義されうる。本発明ＤＮＡ配列が、アミノ酸レベルにおいて、配列番号：１のアミノ酸＃３から＃１０３までをコードするＤＮＡに関して少なくとも８０％の相同性を有することが好ましい。本発明の目的からすると、用語ＢＭＰ−１２関連蛋白はヒト・ＭＰ５２蛋白を包含しない。配列番号：１および配列番号：３の配列の情報および図１に示す比較を用いると、ＢＭＰ−１２関連蛋白をコードする遺伝子のクローニングを可能にするＢＭＰ−１２配列に対するプライマーを設計することは当業者の範囲内である。

本発明ＢＭＰ−１２関連蛋白の一例は、現在ＢＭＰ−１３と呼ばれるＶＬ−１である。全成熟ＢＭＰ−１３の配列およびＢＭＰ−１３のプロペプチドの少なくとも一部の配列を配列番号：２５に示す。ＢＭＰ−１２と同様、ＣＨＯ細胞のごとき哺乳動物細胞により発現されるようなＢＭＰ−１３は、異なるＮ末端を有するＢＭＰ−１３蛋白の活性種の異種集団として存在すると考えられる。すべての活性種は、配列番号：２６のアミノ酸＃１９におけるシステイン残基から始まりアミノ酸１１９における最後のシステイン残基もしくはアミノ酸１２０以降のストップコドンまで続くアミノ酸配列を含む。他の活性種は、Ｎ末端方向におけるさらなるアミノ酸を含む。さらに本明細書に記載したように、哺乳動物細胞により産生される活性種のＮ末端は、ペプチド配列Ａｒｇ−Ｘ−Ｘ−Ａｒｇをコードしているコンセンサス開裂部位の後ろから始まると考えられる。よって、活性ＢＭＰ−１３蛋白をコードするＤＮＡ配列は、配列番号：２５のヌクレオチド＃４１０、４５８、６０２、６０５もしくは６５９からヌクレオチド＃９６１もしくは＃９６４までのいずれかにおいて開始するヌクレオチド配列からなるヌクレオチド配列を有しているであろうと考えられる。

本発明において有用な精製腱／靭帯様組織誘導蛋白を製造するためには、適当なコーディング配列、特に配列番号：１のヌクレオチド＃４９６、＃５７１もしくは＃５７７から＃８７９もしくは＃８８２までの配列をコードするＤＮＡからなるＤＮＡ配列で形質転換された宿主細胞を培養し；次いで、配列番号：２のアミノ酸＃−２５、＃１もしくは＃３から＃１０３もしくは＃１０４までにより表される配列のアミノ酸配列または実質的にこれと相同的な配列を含む蛋白を培地から回収し精製することからなる方法を用いる。もう１つの具体例において、該方法は、適当なコーディング配列、特に配列番号：２５のヌクレオチド＃６０５もしくは＃６５９から＃９６１もしくは＃９６４までの配列をコードするＤＮＡからなるＤＮＡ配列で形質転換された宿主細胞を培養し；次いで、配列番号：２６のアミノ酸＃１もしくは＃１９から＃１１９もしくは＃１２０までにより表される配列のアミノ酸配列または実質的にこれと相同的な配列を含む蛋白を培地から回収し精製することからなる。

ヒト・ＭＰ５２のＤＮＡはＷＯ９３／１６０９９に記載されており、その開示を参照により本明細書に取り入れる。しかしながら、この文書は該蛋白の腱／靭帯様組織形成能、または腱／靭帯様組織誘導のための組成物におけるその使用を開示していない。もともと、ヒト・ＭＰ５２はヒト・胚組織由来のＲＮＡを用いて単離された。ヒト・ＭＰ５２ヌクレオチド配列（配列番号：３）およびコードされるアミノ酸配列（配列番号：４）を配列表に示す。ＭＰ５２蛋白は配列番号：３のヌクレオチド＃８４５から始まり配列番号：３のヌクレオチド＃１２０４をまで続くと思われる。ＴＧＦ−β蛋白に特徴的な７個のシステインの構造のうち最初のシステインは＃８９９において始まる。最後のシステインは＃１２０１において終了する。ＭＰ５２蛋白の他の活性種は配列番号：３のヌクレオチド＃８４５からＮ末端方向においてさらなるヌクレオチドを有していてもよい。

本発明精製ヒト・ＭＰ５２蛋白は、配列番号：３のヌクレオチド＃８４５から＃１２０４までの配列をコードするＤＮＡからなるＤＮＡ配列で形質転換された宿主細胞を培養し；次いで、配列番号：４のアミノ酸＃１から＃１２０までにより表される配列のアミノ酸配列または実質的にこれと相同的な配列を含む蛋白を培地から回収し精製することにより製造されうる。さらに配列番号：４のアミノ酸＃１７もしくは＃１９から＃１１９もしくは＃１２０までのアミノ酸配列は活性を保持しているであろうと考えられる。よって、ヌクレオチド＃８４５、＃８９３もしくは＃８９９から＃１２０１もしくは＃１２０４までのＤＮＡ配列は活性蛋白をコードすると考えられる。

哺乳動物宿主細胞における蛋白発現のためには、成熟蛋白に関するコーディング配列に正しい読み取り枠において結合している、宿主細胞による蛋白分泌に適するプロペプチドをコードするコーディング配列で宿主細胞を形質転換する。例えば、ＢＭＰ−２以外の哺乳動物蛋白の前駆体部分をコードするＤＮＡが成熟ＢＭＰ−２蛋白をコードするＤＮＡに融合されている米国特許第５,１６８,０５０号参照（その開示を参照により本明細書に取り入れる）。よって、本発明は、腱／靭帯様組織誘導ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に正しい読み取り枠において結合している、蛋白のＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバー由来のプロペプチドをコードするＤＮＡ配列からなるキメラＤＮＡ分子を包含する。

用語「キメラ」は、プロペプチドが、コードされる成熟ポリペプチド以外の異なるポリペプチドに由来することを意味するために用いられる。もちろん、配列番号：２、配列番号：４または配列番号：２６に示す成熟蛋白をコードしているコーディング配列に正しい読み取り枠において結合しているネイティブなプロペプチドをコードする配列をコードしているＤＮＡ配列を用いて宿主細胞を形質転換してもよい。ネイティブなプロペプチドの全配列を、当該分野において知られた方法により、配列番号：１、配列番号：３または配列番号：２５に開示された配列を用いて決定して、クローン全体を同定し単離するのに適したプローブを設計してもよい。

また本発明は、他の蛋白性物質をコードしているＤＮＡ配列が結合しておらず、蛋白を含む腱／靭帯様組織の発現をコードしている新規ＤＮＡ配列を包含する。これらのＤＮＡ配列は、配列番号：１に示す５'から３'方向の配列、および厳密条件下［例えば、６５℃において、０.１Ｘ ＳＳＣ、０.１％ ＳＤＳ；ティー・マニアティスら,モレキュラー・クローニング（ア・ラボラトリーマニュアル）,コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（１９８２年）,３８７〜３８９頁参照］においてそれにハイブリダイゼーションし、腱／靭帯様組織誘導活性を有する蛋白をコードしている配列を包含する。

同様に、配列番号：１または配列番号：２５の配列によりコードされる蛋白、あるいは配列番号：２または配列番号：２６のアミノ酸配列からなる蛋白をコードするが、遺伝コードの縮重または対立遺伝子変異（アミノ酸変化を引き起こしても、引き起こさなくてもよい種の集団における天然に存在する塩基変化）のためにコドン配列が異なっているＤＮＡ配列も、本明細書記載の腱／靭帯様組織誘導蛋白をコードする。コードされるポリペプチドの活性、半減期または生産を増大させるために点突然変異または誘導された修飾（挿入、欠失、および置換を含む）により生じた配列番号：１または配列番号：２５のＤＮＡ配列のバリエーションも、本発明に包含される。

本発明のもう１つの態様は、腱／靭帯様組織誘導蛋白の新規製造方法を提供する。本発明方法は、調節配列の調節下にある本発明蛋白をコードしているＤＮＡ配列で形質転換された適当な細胞系を培養しすることからなる。形質転換された宿主細胞を培養し、培地から蛋白を回収し精製する。精製蛋白は、同時生成される他の蛋白ならびに他の汚染物質を実質的に含まない。

適当な細胞または細胞系は、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）のごとき哺乳動物細胞であってもよい。上記のごとく、哺乳動物細胞における蛋白発現は蛋白の分泌を保証する適当なプロペプチドを必要とする。適当な哺乳動物宿主細胞および形質転換、培養、増幅、スクリーニング、生成物の生産および精製のための方法は当該分野において知られている。例えば、ゲシング（Gething）およびサムブルック（Sambrook）,ネイチャー（Nature）,第２９３巻：６２０〜６２５頁（１９８１年）、あるいは、例えば、カウフマン（Kaufman）ら,モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Moll.Cell.Biol.）,第５巻（７）：１７５０〜１７５９頁（１９８５年）またはホウリー（Howley）ら,米国特許第４,４１９,４４６号参照。付記した実施例において説明されるもう１つの適当な哺乳動物細胞系はサル・ＣＯＳ−１細胞系である。哺乳動物細胞ＣＶ−１も適当である。

細菌細胞も適当な宿主でありうる。例えば、種々のイー・コリ（E.coli）株（例えば、ＨＢ１０１、ＭＣ１０６１）はバイオテクノロジーの分野において宿主細胞としてよく知られている。ビー・スブチリス（B.subtilis）、シュードモナス（Pseudomonas）、他の枯草菌等を本発明方法に用いてもよい。細菌細胞において蛋白を発現させるには、プロペプチドをコードするＤＮＡは必要ない。

ＴＧＦ−βファミリーを含む哺乳動物細胞の細菌での発現は、グリコシレーションされていない形態、および封入体として知られる不溶性ペレット形態の蛋白を生じることが知られている。これらの封入体を可溶化し、カオトロピック（chaotropic）試薬を用いて蛋白を変性させ、次いで、その可溶性形態を製造するために十分に正しく再生させるための方法は、当該分野において記載されている。例えば、ＥＰ０４３３２２５（参照によりその開示を本明細書に取り入れる）参照。

別法として、所望蛋白が融合パートーを伴った融合蛋白として発現される、遺伝子融合蛋白の発現のごとき封入体形成を回避する方法が工夫されてきた。融合蛋白は、後で開裂されて所望蛋白を生じる。イー・コリに関するかかる遺伝子融合発現系の一例は、融合パートナーとしてのイー・コリ・チオレドキシン遺伝子の使用に基づいている。ラバリエ（LaVallie）ら,バイオ／テクノロジー（Bio/Technology）第１１巻：１８７〜１９３頁（１９９３年）（その開示を参照により本明細書に取り入れる）。

当業者に知られた酵母細胞の多くの株も、本発明ポリペプチド発現のための宿主細胞として使用されうる。さらに、所望ならば、本発明方法における宿主細胞として昆虫細胞を用いてもよい。例えば、ミラー（Miller）ら,ジェネティック・エンジニアリング（Genetic Engineering）第８巻：２７７〜２９８頁（プレナム・プレス（Plenum Press,１９８６年）およびそこに引用された文献参照。

本発明のもう１つの態様は、これらの腱／靭帯様組織誘導蛋白の発現方法に用いるベクターを提供する。好ましくは、ベクターは、本発明新規因子をコードする上記新規ＤＮＡの全配列を含んでいる。別法として、上記修飾配列を含んでいるベクターも本発明の具体例である。さらに、配列番号：１または配列番号：３または配列番号：２５の配列を操作して、プロペプチド配列を欠失させ、それらをＢＭＰ蛋白もしくはＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバーをコードする配列と置換することにより成熟蛋白を発現させることができよう。よって、本発明は、配列番号：２または配列番号：４または配列番号：２６のアミノ酸配列を有する蛋白をコードするＤＮＡ配列に正しい読み取り枠において結合しているＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバー由来のプロペプチドをコードしているキメラＤＮＡ分子を包含する。該ベクターを細胞系の形質転換法に用いてもよく、該ベクターは、選択宿主中で複製および発現を指令しうる本発明ＤＮＡコーディング配列に作動可能に結合した選択調節配列を含んでいる。かかるベクター用の調節配列は当業者に知られており、宿主細胞に応じて選択することができる。かかる選択は日常的なものであり、本発明の一部を形成しない。

組織が不正常に形成されている環境において腱／靭帯様組織または他の組織の形成を誘導する本発明蛋白は、ヒトおよび他の動物における腱または靭帯の裂傷、形成不全および他の腱または靭帯の損傷の治療に応用される。腱／靭帯様組織誘導蛋白を用いるかかる標品は、腱または靭帯に対するダメージの防止における予防的用途、ならびに骨または他の組織への腱または靭帯の改善された固定および腱または靭帯組織に対する損傷の修復における用途を有しうる。本発明組成物により誘導されるデノボ（De novo）腱／靭帯様組織形成は、先天的な、外傷により誘発される、あるいは別の原因による腱または靭帯の損傷の修復に貢献し、さらに、腱または靭帯を付着または修復させるための整形外科手術にも有用である。また、本発明組成物は、腱炎、手根骨トンネル症候群および他の腱または靭帯の損傷の治療においても有用でありうる。また、本発明組成物を、腱および／または靭帯組織を治療または再生することが必要な他の徴候に使用することもできる。かかる徴候は、腱炎において発生するような歯根膜に対する損傷の再生および修復、および骨に対する腱の付着の再生および修復を包含するが、これらに限定されない。本発明組成物は、腱または靭帯形成細胞を引き寄せ、腱または靭帯形成細胞の増殖を刺激し、あるいは腱または靭帯形成細胞前駆細胞の分化を誘導するための環境を提供しうる。

ＢＭＰ−１２関連蛋白を培地から回収し、同時生成される他の蛋白性物質および存在する他の汚染物質から単離することによりそれらを精製することができる。本発明蛋白は腱／靭帯様組織の形成能がある。後に説明するラット・異所性移植物アッセイにおける腱／靭帯様組織形成を示す能力によりこれらの蛋白をさらに特徴づけてもよい。これらの蛋白は、さらに、靭帯のごとき他のタイプの組織の形成を誘導する能力を有するかもしれないと考えられる。

さらに本発明により提供される腱／靭帯様組織誘導蛋白は、配列番号：１または配列番号：２５の配列と類似の配列によりコードされる因子であるが、その中において修飾が本来的になされている（例えば、ポリペプチドのアミノ酸変換を生じても生じなくてもよいヌクレオチド配列における対立遺伝子変異）かまたは計画的になされている因子を包含する。例えば、合成ポリペプチが配列番号：２のアミノ酸残基の連続した配列の全体または一部を複製したものであってもよい。これらの配列は、１次、２次または３次構造およびコンホーメーション的特徴を配列番号：２の腱／靭帯様組織成長因子ポリペプチドと共有することによって、それらに共通した腱／靭帯様組織または他の組織成長因子の生物学的特性を有しうる。よって、天然に存在する腱／靭帯様組織誘導ポリペプチドの生物学的に活性のある代替物としてそれらを治療組成物および治療プロセスにおいて使用してもよい。

本明細書記載の腱／靭帯様組織誘導蛋白の配列の他の特異的な変異は、グリコシレーション部位の修飾を包含する。これらの修飾はＯ−結合またはＮ−結合グリコシレーション部位を包含しうる。例えば、グリコシレーションの不存在または部分的にのみされたグリコシレーションは、アスパラギン結合グリコシレーション認識部位におけるアミノ酸置換または欠失から起こる。アスパラギン結合グリコシレーション認識部位は、適当な細胞のグリコシレーション酵素により特異的に認識されるトリペプチド配列からなる。これらのトリペプチド配列は、アスパラギン−Ｘ−スレオニン、アスパラギン−Ｘ−セリンまたはアスパラギン−Ｘ−システイン（ここに、通常には、Ｘはプロリン以外のいずれかのアミノ酸）であってよい。グリコシレーション認識部位の第１または第３のアミノ酸位置における種々のアミノ酸置換または欠失（および／または第２の位置におけるアミノ酸欠失）は修飾されたトリペプチド配列における非グリコシレーションを引き起こす。さらに、蛋白の細菌による発現も、グリコシレーレョンされていない蛋白の生産を引き起こすであろう。

本発明組成物は、配列番号：１または配列番号：２５のＤＮＡ配列で形質転換された細胞を培養し、次いで、配列番号：２または配列番号：２６のアミノ酸配列を有する蛋白を培地から回収し精製することにより製造される精製ＢＭＰ−１２関連蛋白からなる。精製された発現蛋白は、同時生成される蛋白性物質、ならびに他の汚染物質を実質的に含まない。回収された精製蛋白は腱／靭帯様組織形成活性、および靭帯再生のごとき他の組織の成長活性を示すと考えられる。後に説明するラットにおけるアッセにおける腱／靭帯様組織形成活性を示す能力により本発明蛋白をさらに特徴づけてもよい。

腱／靭帯様組織形成を誘導するための本発明組成物は有効量の腱／靭帯様組織誘導蛋白からなっていてもよく、該蛋白は、配列番号：２、好ましくは、配列番号：２のアミノ酸−＃２５、＃１もしくは＃３から＃１０３もしくは＃１０４；あるいは配列番号：２６のアミノ酸＃１もしくは＃１９から＃１２０まで；ならびに腱および／または靭帯様組織の形成能を示す配列番号：２または配列番号：２６の変異体および／または変種からなる。

さらに、発明組成物は、アクチビンのごとき、蛋白のＴＧＦ−βスーパーファミリーのさらなるメンバーのごときさらなる蛋白からなっていてもよい。本発明のもう１つの態様は、医薬上許容される賦形剤または担体中の、ＢＭＰ−１２またはＶＬ−１のごとき治療上有効量の腱／靭帯誘導蛋白を含有する医薬組成物を提供する。これらの組成物を用いて腱／靭帯様組織または他の組織の形成を誘導してもよい。腱および靭帯の修復、傷の治療および皮膚の修復のごとき他の組織の修復のためにかかる組成物を用いてもよいと考えられる。本発明蛋白は神経の生存を増加させ、それゆえ、移植および神経の生存の減少を示す症状の治療に有用でありうるとさらに考えられる。さらに本発明組成物は、米国特許第５,１０８,９２２号、第５,０１３,６４９号、第５,１１６,７３８号、第５,１０６,７４８号、第５,１８７,０７６号、および第５,１４１,９０５号に開示されたＢＭＰ−１、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６およびＢＭＰ−７；ＰＣＴ出願ＷＯ９１／１８０９８に開示のＢＭＰ−８；ＰＣＴ出願ＷＯ９３／００４３２に開示のＢＭＰ−９；および１９９３年５月１２に出願の同時係属特許出願第０８／０６１,６９５号と第０８／０６１,４６４号に開示のＢＭＰ−１０またはＢＭＰ−１１のごとき少なくとも１種の他の治療上有用な薬剤を含有していてもよい。上記文書の開示を参照により本明細書に取り入れる。

本発明組成物は、ＢＭＰ−１２またはＶＬ−１（ＢＭＰ−１３）のごとき腱／靭帯誘導蛋白のほかに、ＭＰ５２、表皮増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、形質転換増殖因子（ＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−β）、および線維芽細胞増殖因子−４（ＦＧＦ−４）、甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、白血球阻害因子（ＬＩＦ／ＨＩＬＤＡ／ＤＩＡ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ−IおよびＩＧＦ−II）を包含する他の治療上有用な薬剤からなっていてもよい。これらの薬剤の一部を本発明組成物に使用してもよい。例えば、一緒に移植されたＢＭＰ−２およびＢＭＰ−１２の両方からなる組成物は、骨および腱／靭帯様組織を生じさせる。隣接した解剖学的位置において腱、靭帯、および骨が同時に形成される胚関節の損傷の治療にかかる組成物を用いてもよく、さらに該組成物は、骨への腱付着部位における組織の再生に有用でありうる。皮膚の治療および関連組織の修復のごとき傷の治療に本発明組成物を用いてもよいと考えられる。傷のタイプは、熱傷、切り傷および潰瘍を包含するが、これらに限定されない（傷の治療および関連組織の修復に関しては、例えばＰＣＴ出願ＷＯ８４／０１１０６号参照）。

本発明蛋白は他の関連蛋白および増殖因子と協奏して、あるいはおそらく相乗的に作用しうると考えられる。それゆえ、本発明のさらなる治療方法および組成物は、治療量の少なくとも１種の上記ＢＭＰ蛋白を伴った治療量の少なくとも１種の本発明蛋白からなる。かかる組成物は、個々のＢＭＰ蛋白分子あるいは異なるＢＭＰ部分からなるヘテロダイマーからなっていてもよい。例えば、本発明方法および組成物は、ＢＭＰ−１２関連蛋白のサブユニットと上記「ＢＭＰ」蛋白のうちの１つ由来のサブユニットからなるジスルフィド結合したダイマーからなっていてもよい。よって、本発明は、１のサブユニットが配列番号：２のアミノ酸＃１からアミノ酸＃１０４までのアミノ酸配列からなり、もう１つのサブユニットがＢＭＰ−１、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１０およびＢＭＰ−１１からなる群より選択される骨形態形成蛋白に関するアミノ酸配列からなるヘテロダイマーである精製ＢＭＰ−１２関連ポリペプチドよりなる組成物を包含する。さらなる具体例は、ジスルフィド結合したＢＭＰ−１２、ＶＬ−１（ＢＭＰ−１３）またはＭＰ５２のごとき腱／靭帯様組織誘導部分からなるヘテロダイマーよりなっていてもよい。例えば、ヘテロダイマーは、配列番号：２の＃１から＃１０４までのアミノ酸配列からなる１のサブユニットおよび配列番号：４の＃１から＃１２０までもしくは配列番号：２６の＃１から＃１２０までのアミノ酸配列からなるもう１つのサブユニットからなっていてもよい。さらに、本発明組成物は、問題となる組織の損傷、傷害の治療に有益な他の薬剤を配合されていてもよい。

ｐＨ、等張性、安定性等を考慮した、かかる生理学的に許容される蛋白組成物の調製および処方は当業者の範囲内である。また、目下のところ、治療組成物は、ＴＧＦ−β蛋白における種特異性の欠如のため、獣医用途にも価値がある。特に、ヒトのほかに家畜およびサラブレッドの馬は本発明組成物でのかかる治療のための望ましい対象である。

治療方法は、組成物を局所的に、全身的に、あるいはインプラントまたはデバイスのように局部的に投与することを包含する。投与する場合、本発明に使用する治療組成物は、もちろん、パイロジェン不含の、生理学的に許容される形態である。さらに、望ましくは、組成物をカプセル封入するかまたは組織ダメージ部位への送達用の粘性のある形態で注射してもよい。別法として、あるいはさらに、所望により上記組成物に含有されていてもよい蛋白以外の治療上有用な薬剤を、本発明方法において組成物と同時にあるいは順次投与してもよい。

組成物は適当なマトリックスおよび／または隔離剤（sequestering agent）を担体として含んでいてもよい。例えば、マトリックスが組成物を支持し、あるいは腱／靭帯様組織形成および／または他の組織の形成のための表面を提供するものであってもよい。マトリックスが、蛋白および／またはその提供に適した環境をゆっくりと提供するものであってもよい。キレート剤は、注射または他の手段による投与を容易にすることにおいて助けとなる物質であってもよく、あるいは適用部位から蛋白がゆっくりと移動するようにするものであってもよい。

担体材料の選択は、生体適合性、生分解性、機械的特性、美容上の外観および界面の性質による。組成物の特別な適用は適切な処方を決定するであろう。組成物に適しうるマトリックスは生分解性で化学的に定義されたものであってもよい。さらなるマトリックスは純粋蛋白または細胞外マトリックス成分からなる。他の使用可能なマトリックスは非生分解性で化学的に定義されているものである。好ましいマトリックスは、ヘリスタット（Helistat^Ｒ）スポンジ（ニュージャージー州プレインズボロのインテグラ・ライフサイエンシズ（Integra LifeSciences）社製）のごときコラーゲンに基づく材料、または注射可能な形態のコラーゲン、ならびに隔離剤を包含するが、それらはやはり生分解性であってもよく、アルキルセルロース性材料を包含してもよい。

もう１つの好ましいクラスの担体は多孔性粒子ポリマーマトリックスであり、ポリ（乳酸）のポリマー、ポリ（グリコール酸）のポリマーおよび乳酸とグリコール酸のコポリマーを包含する。さらにこれらのマトリックスが隔離剤を含有していもよい。適当なポリマーマトリックスは、例えば、ＷＯ９３／０００５０（参照により本明細書に取り入れる）に記載されている。

隔離剤の好ましいファミリーはアルキルセルロース（ヒドロキシアルキルセルロースを包含する）のごときセルロース性材料であり、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、およびカルボキシメチルセルロースを包含し、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）のカチオン塩が最も好ましい。他の好ましい隔離剤は、ヒアルロン酸、アルギン酸ナトリウム、ポリ（エチレングリコール）、ポリオキシエチレンオキシド、カルボキシビニルポリマーおよびポリ（ビニルアルコール）を包含する。本発明に有用な隔離剤の量は、処方重量全体に対して０.５〜２０重量％、好ましくは１〜１０重量％であり、ポリマーマトリックスからの蛋白の脱落を防止し、組成物に適当な扱いやすさを与えるのに必要な量を提供するが、前駆細胞のマトリックスへの浸潤を妨げるような多量であってはならず、それゆえ、前駆細胞の活性を援助する機会を蛋白に付与する量である。

本願の実施において有用なさらなる任意成分は、例えば、マンニトール、シュクロース、ラクトース、グルコースもしくはグリシンのごとき低温性保護剤（凍結乾燥の間の分解から蛋白を保護する）、メチルパラベンならびにプロピルパラベンおよびベンジルアルコールのごとき抗菌保存料、ＥＤＴＡ、クエン酸およびＢＨＴ（ブチル化されたヒドロキシトルエン）のごとき抗酸化剤、およびポリ（ソルベート）ならびにポリ（オキシエチレン）のごとき界面活性剤等を包含する。

上記のごとく、本発明組成物を、腱または靭帯がダメージを受けている部分における腱／靭帯様組織の再生のごとき多くの腱損傷に用いて、腱組織の裂傷および種々のタイプの組織損傷もしくは傷害の修復を行ってもよい。本発明によれば、これらの方法は、かかる腱／靭帯様組織または他の組織の修復を必要とする患者に、配列番号：２、配列番号：４および／または配列番号：２６に記載されたような有効量の腱／靭帯様組織誘導蛋白からなる組成物を投与することからなる。また、これらの方法は少なくとも１種の上記ＢＭＰ蛋白と混合された腱／靭帯様組織誘導蛋白の投与からなっていてもよい。

もう１つの具体例において、該方法は、１のモノマーがＢＭＰ−１２、ＶＬ−１（ＢＭＰ−１３）またはＭＰ５２のごとき腱／靭帯様組織誘導ポリペプチドであり、第２のモノマーが増殖因子のＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバーであるヘテロダイマー蛋白の投与からなっていてもよい。さらに、これらの方法は、ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−βおよびＩＧＦを包含する他の増殖因子とともに腱／靭帯様組織誘導蛋白を投与することを包含してもよい。

よって、本発明のさらなる態様は、腱／靭帯様組織の修復、腱もしくは靭帯の修復、ならびに腱炎および腱もしくは靭帯の損傷に関連した他の症状の治療のための治療方法および組成物である。かかる組成物は、医薬上許容される賦形剤、担体またはマトリックスと混合されたＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１２関連蛋白またはＭＰ５２のごとき治療上有効量の１種またはそれ以上の腱／靭帯様組織誘導蛋白からなる。

組成物の作用を変化させる種々の要因、例えば、形成が望まれる腱または靭帯組織の量、腱または靭帯のダメージ部位、ダメージを受けた腱または靭帯の状態、傷害のサイズ、ダメージを受けた組織のタイプ、患者の年齢、性別ならびに食事、感染の程度、投与時期および他の臨床的要因を担当医が考慮することにより投与規則が決定されるであろう。再構成に使用するマトリックスのタイプおよび組成物中のさらなる蛋白のタイプに応じて用量を変更してもよい。ＩＧＦ−Ｉ（インスリン様増殖因子Ｉ）のごとき知られた増殖因子の最終組成物への添加も用量に影響しうる。

腱／靭帯様組織の形成、腱または靭帯の成長および／または修復を定期的に評価することにより進行状況をモニターすることができる。当該分野において知られた方法、例えば、Ｘ線、関節鏡検査、組織形態計測的調査およびテトラサイクリン標識により進行状況をモニターすることができる。

以下の実施例は、ヒト・腱／靭帯様組織誘導蛋白の回収ならびに特徴づけおよび他の腱／靭帯様組織誘導蛋白の回収のためのそれらの使用、ヒト・蛋白の取得、組み換え法による蛋白発現、およびインビボモデルにおいて腱／靭帯様組織を形成する本発明組成物の能力を示すことにおける本発明の実施を説明する。実施例はＢＭＰ−１２に関して本発明を示すが、当業者の範囲内の少しの変更により、ＭＰ５２およびＶＬ−１についても同じ結果が得られると確信する。

ＤＮＡの単離
ＢＭＰ−１２およびＢＭＰ−１２関連蛋白をコードするＤＮＡ配列を、当業者に知られた種々の方法により単離することができる。下記のごとく、他のＢＭＰ蛋白、Ｖｇ−１関連蛋白および他のＴＧＦ−βスーパーファミリーの蛋白に存在するアミノ酸配列に基づいてオリゴヌクレオチドプライマーを設計することができる。ＢＭＰファミリーの蛋白内およびＴＧＦ−βスーパーファミリーの蛋白の他のメンバー内において非常に保存的であるアミノ酸配列を含む領域を同定することができ、個々のＢＭＰ／ＴＧＦ−β／Ｖｇ−１蛋白お対応領域の類似性に基づいてこれらの非常に保存的な領域のコンセンサスアミノ酸配列を構築することができる。かかるコンセンサスアミノ酸配列の例を以下に示す。
コンセンサスアミノ酸配列（Ｉ）：
Ｔｒｐ−Ｇｌｎ／Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ／Ｉｌｅ−Ａｌａ（配列番号：１６）
［式中、Ｘ／Ｙはその位置にいずれかのアミノ酸が存在してもよいことを示す］ 上で同定したコンセンサスアミノ酸配列（１）に基づいて以下のオリゴヌクレオチドを設計する。：

このオリゴヌクレオチド配列を自動ＤＮＡ合成装置により合成する。上で同定したオリゴヌクレオチドプライマーの標準的なヌクレオチドのシンボルは以下のとおり：Ａ,アデノシン；Ｃ,シトシン；Ｇ,グアニン；Ｔ,チミン；Ｎ,アデノシンまたはシトシンまたはグアニンまたはチミン；Ｒ,アデノシンまたはシトシン；Ｙ,シトシンまたはチミン；Ｈ,アデノシンまたはシトシンまたはチミン；Ｖ,アデノシンまたはシトシンまたはグアニン；Ｄ,アデノシンまたはグアニンまたはチミン。

オリゴヌクレオチド＃１の最初の７個のヌクレオチド（下線）は、ＢＭＰ−１２蛋白をコードするＤＮＡ配列を特異的に増幅する操作を容易にするために制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩに対する認識部位を含んでおり、かくして上記コンセンサスアミノ酸配列（１）由来ではない。

第２のコンセンサスアミノ酸配列は、下記ＢＭＰ／ＴＧＦ−βＶｇ−１蛋白のもう１つの非常に保存的な領域に由来する：
Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ／Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ（配列番号：１８） 上で同定されたコンセンサスアミノ酸配列（２）に基づいて以下のオリゴヌクレオチドを設計する：

このオリゴヌクレオチド配列を自動ＤＮＡ合成装置により合成する。オリゴヌクレオチド＃１の最初の７個のヌクレオチド（下線）は、ＢＭＰ−１２蛋白をコードするＤＮＡ配列を特異的に増幅する操作を容易にするために制限エンドヌクレアーゼＸｂａＩに対する認識部位を含んでおり、かくして上記コンセンサスアミノ酸配列（２）由来ではない。

本発明ＢＭＰ−１２蛋白および他のＢＭＰ／ＴＧＦ−β／Ｖｇ−１関連蛋白は上記コンセンサスアミノ酸配列に類似のアミノ酸配列を含んでいてもよく、ＢＭＰ−１２または他の新規関連蛋白中のそれらの配列の位置はそれらが由来した蛋白における相対位置に対応しているであろうと考えられる。さらに、他のＢＭＰ／ＴＧＦ−β／Ｖｇ−１蛋白の構造から得られるこの位置的情報およびコンセンサスアミノ酸配列（１）ならびに（２）にそれぞれ由来するオリゴヌクレオチド配列＃１ならびに＃２を用いて、ＢＭＰ−１２蛋白または他のＢＭＰ／ＴＧＦ−βＶｇ−１関連蛋白の対応アミノ酸をコードするＤＮＡ配列を特異的に増幅することがでると考えられる。

ＢＭＰ／ＴＧＦ−β／Ｖｇ−１蛋白の遺伝子構造の知識に基づくと、ヒト・ゲノムＤＮＡを鋳型として用いてＢＭＰ−１２／ＴＧＦ−β／Ｖｇ−１（ＢＭＰ−１２関連蛋白）をコードする配列の同定となる特異的増幅反応を行うことができると考えられる。ヒト・ゲノムＤＮＡ鋳型のかかる特異的増幅反応を、先に説明したオリゴヌクレオチドプライマー＃１および＃２を用いて開始することができよう。上で同定したオリゴヌクレオチド＃１および＃２をプライマーとして用いてヒト・ゲノムＤＮＡ由来の特異的ヌクレオチド配列の特異的増幅を可能にする。増幅反応を以下のように行う：
ジェネティックス・インスティチュート（Genetics Institute）のケン・ジャコブス（Ken Jacobs）により提供されたヒト・ゲノムＤＮＡ（起源：末梢血リンパ球）を、２５ゲージの注射針中を繰り返し通すことにより剪断力を与え、１００℃で５分間変性させ、次いで、氷上で冷却してから２００μＭの各デオキシヌクレオチドトリホスフェート（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰ）、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８.３、５０ｍＭ ＫＣｌ、１.５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０.００１％ゼラチン、１.２５ユニットのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、１００ｐＭのオリゴヌクレオチド＃１および１００ｐＭのオリゴヌクレオチド＃２を含有する反応混合物に添加する。この反応混合物を９４℃で２分加熱し、次いで、以下の方法のサーマルサイクリングに供する：
９４℃１分、４０℃１分、７２℃１分を３サイクル；次いで、９４℃１分、５５℃１分、７２℃１分を３７サイクル行う。次いで、７２℃で１０分インキュベーションする。

この反応により特異的に増幅されるＤＮＡをエタノール沈殿し、制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩおよびＸｂａＩで消化し、次いで、アガロースゲル電気泳動に供する。ＢＭＰ−１２または他のＢＭＰ／ＴＧＦ−β／Ｖｇ−１をコードするＤＮＡフラグメントの予想サイズに対応するゲルの領域を切り取り、そこに存在する特異的に増幅されたＤＮＡフラグメントを電気溶出し、プラスミドベクターｐＧＥＭ−３のポリリンカーのＸｂａＩとＢａｍＨＩ部位の間にサブクローンする。得られるＢＭＰ−１２関連サブクローンの１つに関するＤＮＡ配列分析は、それに含まれている特異的に増幅されたＤＮＡ配列生成物が本発明ＢＭＰ−１２蛋白の一部をコードしていることを示す。

この特異的に増幅されたＢＭＰ−１２のＤＮＡフラグメントのＤＮＡ配列（配列番号：５）および誘導されるアミノ酸配列（配列番号：６）を配列表に示す。 配列番号：５のヌクレオチド＃１〜＃２６はオリゴヌクレオチド＃１の一部からなり、ヌクレオチド＃１０３〜＃１２８は特異的増幅反応を行うために用いられるオリゴヌクレオチド＃２のリバース・コンプリメント（reverse compliment）の一部からなる。増幅反応の開始におけるオリゴヌクレオチド＃１および＃２の機能のため、それらはＢＭＰ−１２蛋白をコードする実際の配列に正確に対応していなくてもよく、それゆえ、対応するアミノ酸誘導体（配列番号：６）には翻訳されない。

もう１つのサブクローンのＤＮＡ配列分析は、それに含まれている特異的に増幅されたＤＮＡ生成物が、ＶＬ−１と命名された、本発明のもう１つのＢＭＰ／ＴＧＦ−β／Ｖｇ−１（ＢＭＰ−１２関連）をコードしていることを示す。

この特異的に増幅されたＤＮＡフラグメントのＤＮＡ配列（配列番号：７）および誘導されるアミノ酸配列（配列番号：８）を配列表に示す。

配列番号：７のヌクレオチド＃１〜＃２６はオリゴヌクレオチド＃１の一部からなり、＃１０３〜＃１２８は特異的増幅反応を行うために用いられるオリゴヌクレオチド＃２のリバース・コンプリメントの一部からなる。増幅反応の開始におけるオリゴヌクレオチド＃１および＃２の機能のため、それらはＶＬ−１蛋白をコードする実際の配列に正確に対応していなくてもよく、それゆえ、対応するアミノ酸誘導体（配列番号：８）には翻訳されない。

上に示す特異的に増幅されたＢＭＰ−１２ヒト・ＤＮＡ配列（配列番号：５）に基づいて以下のオリゴヌクレオチドプローブを設計し、自動ＤＮＡ合成装置により合成する：

このオリゴヌクレオチドプローブを^３２Ｐで放射性標識し、ベクターλＦＩＸ（ストラタジーン（Stratagene）社カタログ＃９４４２０１）中に構築されたヒト・ゲノムライブラリーをスクリーニングする。ヒト・ゲノムライブラリーの５０００００個の組み換え体を、プレート１枚あたり約１００００個の組み換え体の密度で５０枚のプレートに撒く。組み換えバクテリオファージプラークを２系のニトロセルロースにレプリカし、標準的ハイブリダイゼーションバッファー（ＳＨＢ＝５ＸＳＳＣ、０.１％ＳＤＳ、５Ｘデンハーツ、１００μｇ／ｍｌサケ・***ＤＮＡ）中でオリゴヌクレオチドプローブ＃３と６５℃で一晩ハイブリダイゼーションさせる。翌日、放射性標識されたオリゴヌクレオチドを含有するハイブリダイゼーション溶液を除去し、フィルターを０.２ＸＳＳＣ、０.１％ ＳＤＳで、６５℃において洗浄する。単一のハイブリダイゼーション陽性組み換え体を同定し、プラーク精製する。ＢＭＰ−１２オリゴヌクレオチドプローブ＃３にハイブリダイゼーションする、このプラーク精製された組み換えバクテリオファージクローンをλＨｕＧ−４８と命名する。バクテリオファージプレートストックを作成し、バクテリオファージＤＮＡをλＨｕＧ−４８ヒト・ゲノムクローンから単離する。バクテリオファージλＨｕＧ−４８を、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、１２３０１パークローン・ドライブ、ロックビル、ＭＤ（American Type Culture Collection,12301 Parklawn Drive,Rockville,MD）「ＡＴＣＣ」に、１９９３年１２月７日に受託番号＃７５６２５の下、寄託されている。この寄託は特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に適合する。この組み換え体λＨｕＧ−４８のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域は３.２ｋｂのＢａｍＨＩフラグメントに局在化している。このフラグメントをプラスミドベクター（ｐＧＥＭ３）中にサブクローンし、ＤＮＡ配列分析を行う。このプラスミドサブクローンをＰＣＲ１−１＃２と命名し、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、１２３０１パークローン・ドライブ、ロックビル、ＭＤ（American Type Culture Collection,12301 Parklawn Drive,Rockville,MD）「ＡＴＣＣ」に、１９９３年１２月７日に受託番号＃６９５１７の下、寄託されている。この寄託は特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に適合する。クローンλＨｕＧ−４８由来の、プラスミドサブクローンＰＣＲ１−１＃２の３.２ｋｂのＤＮＡインサートの部分ＤＮＡ配列（配列番号：１）および誘導されるアミノ酸配列（配列番号：２）を配列表に示す。

配列番号：１のヌクレオチド＃６３９〜＃７１４は、配列番号：５に示す特異的に増幅されたＢＭＰ−１２をコードするＤＮＡフラグメントのヌクレオチド＃２７〜＃１０２に対応し、かくして、ヒト・ゲノムバクテリオファージクローンλＨｕＧ−４８および誘導されたサブクローンＰＣＲ１−１＃２は少なくとも本発明ＢＭＰ−１２蛋白の一部をコードしている。プラスミドＰＣＲ１−１＃２の３.２ｋｂのＢａｍＨＩインサートの一部分のヌクレオチド配列は、配列番号：１のヌクレオチド＃１〜＃８８２により定義される少なくとも８８２塩基対の読み取り枠を含んでいる。この読み取り枠は本発明ＢＭＰ−１２蛋白の少なくとも２９４個のアミノ酸をコードしている。コードされた２９４個のアミノ酸のヒト・ＢＭＰ−１２蛋白は成熟ヒト・ＢＭＰ−１２蛋白の全体（配列番号：２のアミノ酸＃１〜＃１０４）、ならびに１次翻訳産物のプロペプチド領域のＣ末端部分（配列番号：２のアミノ酸＃−１９０から＃−１まで）を含んでいる。

配列番号：３３に示すプラスミドＰＣＲ１−１＃２の３.２ｋｂのＢａｍＨＩインサートのさらなるＤＮＡ配列は、配列番号：３３のヌクレオチド＃１３８から１３０１により定義される１１６４塩基対の読み取り枠の存在を示す［注、配列番号：１の開示されたすべての配列は配列番号：３３に含まれる］。この配列はゲノムクローンに由来するため、コーディング配列の５'伸長部と介在配列（イントロン／非イントロン配列）の３'限界との間の境界を確定することは困難である。

他のＢＭＰ蛋白およびＴＧＦ−βファミリーに属する他の蛋白に関する知識に基づくと、提案されているコンセンサス蛋白分解プロセッシング配列Ａｒｇ−Ｘ−Ｘ−Ａｒｇと一致して、前駆体ポリペプチドが多塩基性配列Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇにおいて開裂されるであろうと予想される。ＢＭＰ−１２前駆体ポリペプチドの開裂は、配列番号：２の位置＃１におけるアミノ酸セリンから始まる１０４個のアミノ酸の成熟ペプチドを生じると考えられる。成熟形態へのＢＭＰ−１２のプロセッシングは、関連蛋白ＴＧＦ−βのプロセッシング［ジェントリー（Gentry）ら,モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Molec. & Cell. Biol.）第８巻：４１６２頁（１９８８年）；デリンク（Derynck）ら,ネイチャー（Nature）第３１６巻：７０１頁（１９８５年）］と類似の様式でのダイマー化およびＮ末端領域の除去を包含すると考えられる。

それゆえ、ＢＭＰ−１２の成熟活性種は２つのポリペプチドサブユニットのホモダイマーからなり、各サブユニットは配列番号：２のアミノ酸＃１から＃１０４までからなり、サブユニットの予想分子量約１２０００ダルトンである。さらなる活性種は、少なくとも配列番号：２のアミノ酸＃３から＃１０３までからなり、それゆえ、最初と最後の保存されたシステイン残基を含んでいると考えられる。蛋白のＴＧＦ−β／ＢＭＰファミリーの他のメンバーと同様に、ＢＭＰ−１２蛋白のカルボキシ末端部分はアミノ末端部分よりも高い配列保存性を示す。システインに富むＣ末端ドメイン（アミノ酸＃３〜＃１０４）におけるヒト・ＢＭＰ−１２蛋白の、ヒト・ＢＭＰ蛋白およびＴＧＦ−βファミリーの他の蛋白の対応ヒト・ＢＭＰ領域に対するアミノ酸同一性のパーセンテージは以下のようである：ＢＭＰ−２,５５％；ＢＭＰ−３,４３％；ＢＭＰ−４,５３％；ＢＭＰ−５,４９％；ＢＭＰ−６,４９％；ＢＭＰ−７,５０％；ＢＭＰ−８,５７％；ＢＭＰ−９,４８％；ＢＭＰ−１０,５７％；アクチビンＷＣ（ＢＭＰ−１１）,３８％；Ｖｇ１,４６％；ＧＤＦ−１,４７％；ＴＧＦ−β１,３６％；ＴＧＦ−β２,３６％；ＴＧＦ−β３,３９％；インヒビンβ（Ｂ）,３６％；インヒビンβ（Ａ）,４１％。

ヒト・ＢＭＰ−１２ ＤＮＡ配列（配列番号：１）、またはその一部をプローブとして用いて、ＢＭＰ−１２ ｍＲＮＡを合成するヒト・細胞系または組織を同定することができる。簡単に説明すると、ＲＮＡを選択細胞または組織源から抽出し、ホルムアルデヒドアガロースゲルによる電気泳動を行いニトロセルロースに移すか、あるいはホルムアクデヒドと反応させてニトロセルロース上に直接スポットする。次いで、ニトロセルロースを、ヒト・ＢＭＰ−１２コーディング配列由来のプローブとハイブリダイゼーションさせる。

別法として、ヒト・ＢＭＰ−１２配列を用いて、特異的増幅反応を行うために使用されるプライマー間の領域に存在するＢＭＰ−１２コーディング配列の一部を特異的に増幅するオリゴヌクレオチドプライマーを設計する。これらのヒト・ＢＭＰ−１２由来のプライマーは、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ鋳型由来の対応ＢＭＰ−１２コーディング配列を特異的に増幅することを可能にするであろうと考えられる。上記方法の１つにより使用可能な源が同定されたならば、オリゴ（ｄＴ）セルロースクロマトグラフィーによりｍＲＮＡを選択し、ｃＤＮＡを合成し、次いで、当業者に知られたλｇｔ１０または他のλバクテリオファージベクター、例えばλＺＡＰ中に確立された方法（トール（Toole）ら,上記）によってクローンする。上記のオリゴヌクレオチドプライマーにより行われる増幅反応を、λバクテリオファージベクター中にクローンされた前以て確立されている、ヒト・ｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーに対して直接行うことも可能である。かかる場合には、増幅されたＢＭＰ−１２をコードするＤＮＡのフラグメントをプローブとして用いて、ヒト・ＢＭＰ−１２蛋白の一部をコードする特異的に増幅されたＤＮＡ生成物を生じるライブラリーを直接スクリーニングすることができよう。

ヒト・ＢＭＰ−１２ゲノムクローンλＨｕＧ−４８のＤＮＡ配列に基づいて設計されたオリゴヌクレオチドプライマーを予想して、市販（すなわち、カリフォルニア州ラジョラのストラタジーン（Stratagene）社製またはカリフォルニア州パロ・アルトのクローンテック・ラボラトリーズ,インコーポレイテッド（Clontech Laboratories,Inc.）製）されている、前以て確立されたヒト・ｃＤＮＡライブラリー由来のヒト・ＢＭＰ−１２をコードするＤＮＡ配列の特異的増幅を行う。配列番号：１に示すＤＮＡ配列のヌクレオチド＃５７１から＃５９０までに基づいて以下のオリゴヌクレオチドプライマーを設計し、自動ＤＮＡ合成装置により合成する：

プライマー＃４の最初の９個のヌクレオチド（下線）は、ＢＭＰ−１２蛋白をコードするＤＮＡ配列を特異的に増幅する操作を容易にするために制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩに対する認識部位を含んでおり、かくして配列番号：１に示すＤＮＡ配列由来ではない。

配列番号：１に示すＤＮＡ配列のヌクレオチド＃８６６から＃８８５までに基づいて以下のオリゴヌクレオチドプライマーを設計し、自動ＤＮＡ合成装置により合成する：

プライマー＃５の最初の９個のヌクレオチド（下線）は、ＢＭＰ−１２蛋白をコードするＤＮＡ配列を特異的に増幅する操作を容易にするために制限エンドヌクレアーゼＸｂａＩに対する認識部位を含んでおり、かくして配列番号：１に示すＤＮＡ配列由来ではない。

上で同定された標準的なヌクレオチドシンボルは以下のごとし：Ａ,アデノシン；Ｃ,シトシン；Ｇ,グアニン；Ｔ,チミン
上で同定したプライマー＃４および＃５をプライマーとして用いて、以下のもの：
ヒト・胎児脳ｃＤＮＡ／λＺＡＰII(ストラタジーンのカタログ＃９３６２０６)、ヒト・肝臓／λＵＮＩ−ＺＡＰ ＸＲ（ストラタジーンのカタログ＃９３７２００）、ヒト・肺／λＵＮＩ−ＺＡＰ ＸＲ（ストラタジーンのカタログ＃９３７２０６）、およびヒト胎児脾臓／ＵＮＩ−ＺＡＰ ＸＲ（ストラタジーンのカタログ＃９３７２０５）を包含してもよい前以て確立されたｃＤＮＡライブラリー由来の特異的なＢＭＰ−１２をコードするヌクレオチド配列の増幅を行う。

上で詳述したヒト・ｃＤＮＡインサートバクテリオファージライブラリー約１ｘ１０^８ｐｆｕ（プラーク形成単位）を９５℃で５分間変性させた後、２００μＭの各デオキシヌクレオチドトリホスフェート（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ）、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８.３、５０ｍＭ ＫＣｌ、１.５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０.００１％ゼラチン、１.２５ユニットのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、１００ｐＭのオリゴヌクレオチドプライマー＃４および１００ｐＭのオリゴヌクレオチドプライマー＃５を含有する反応混合物に添加する。次いで、反応混合物を以下の方法のサーマルサイクリングに供する：９４℃１分、５０℃１分、７２℃１分を３９サイクル、次いで、７２℃で１０分インキュベーションする。

この反応により特異的に増幅されるＤＮＡは、約３３３塩基対のＢＭＰ−１２をコードする生成物を生じると考えられよう。その内部の３１５塩基対は配列番号：１のヌクレオチド＃５７１から＃８８５に対応し、さらにプライマー＃４および＃５のヌクレオチド＃１〜＃９により定義される制限部位に対応するＢＭＰ−１２特異的フラグメントの各末端の９塩基対を含んでいる。得られる３３３塩基対のＤＮＡ生成物を制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩおよびＸｂａＩで消化し、フェノール抽出し、クロロホルム抽出し、次いで、エタノール沈殿する。

別法として、エタノール沈殿、バッファー交換、次いで、消化されたＤＮＡ生成物を１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８.０、１ｍＭ ＥＤＴＡ中に希釈し、その後セントリコン（Centricon）^ＴＭ３０マイクロコンセントレーター（マサチューセッツ州ビバリーのダブリュ・アール・グレイス・アンド・カンパニー（W.R.Grace & Co.）製；製品番号＃４２０９）により遠心分離することにより、ＢａｍＨＩ／ＸｂａＩ制限消化により生じるＤＮＡの小フラグメントの除去を行う。得られるＢａｍＨＩ／ＸｂａＩ消化された増幅ＤＮＡ生成物を、プラスミドベクター（すなわち、pBluescript、ｐＧＥＭ−３等）のポリリンカー領域のＢａｍＨＩ部位とＸｂａＩ部位との間にサブクローンする。得られるサブクローンのＤＮＡ配列分析は、ＢＭＰ−１２をコードするインサートの完全性を確認するために必要であろう。この方法において使用可能なｃＤＮＡ源が同定されたならば、３３３塩基対のＢＭＰ−１２特異的配列が増幅された対応ｃＤＮＡライブラリーを、３３３塩基対のインサートまたは他のＢＭＰ−１２特異的プローブを用いて直接スクリーニングして本発明のＢＭＰ−１２蛋白の全長をコードするｃＤＮＡクローンを同定し単離することができよう。

当業者に知られたさらなる方法を用いてヒト・ＢＭＰ−１２関連蛋白をコードする他のｃＤＮＡの全長、あるいはヒト以外、特に他の哺乳動物種由来の本発明ＢＭＰ−１２関連蛋白をコードするｃＤＮＡクローンの全長を単離してもよい。 以下の実施例は、ネズミ・ゲノムＤＮＡライブラリー中のＢＭＰ−１２関連蛋白由来の相同体を単離するためのヒト・ＢＭＰ−１２配列の使用を示す。

本発明ヒト・ＢＭＰ−１２蛋白をコードするＤＮＡ配列は、ヒト以外の種由来のＢＭＰ−１２およびＢＭＰ−１２関連蛋白の配列に対して有意に相同的であると予想され、ヒトＢＭＰ−１２配列を用いて、対応するＢＭＰ−１２関連蛋白をコードするそれらの他の種由来のＤＮＡ配列を特異的に増幅することができよう。特別には、ヒト・ＢＭＰ−１２配列（配列番号：１）に基づいて以下のオリゴヌクレオチドを設計し、自動ＤＮＡ合成装置により合成する：

プライマー＃６および＃７の最初の８個のヌクレオチド（下線）は、それぞれ制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩからなる。ヒト以外の種由来のＢＭＰ−１２またはＢＭＰ−１２関連蛋白をコードする特異的に増幅されたＤＮＡ配列の操作を容易にするためにこれらの配列を用いることができ、よって、配列番号：１に示すＤＮＡ配列由来でない。配列番号：１のヌクレオチド＃６０７〜＃６２６に基づいてオリゴヌクレオチドプライマー＃６を設計する。配列番号：１に示すＤＮＡ配列のヌクレオチド＃８４６〜＃８６５のリバース・コンプリメント列に基づいて、オリゴヌクレオチドプライマー＃７を設計する。 上で同定したオリゴヌクレオチドプライマー＃６および＃７をプライマーとして用いて、ヒト以外の種由来のゲノムＤＮＡからの特異的ＢＭＰ−１２関連配列の増幅を行う。増幅反応を以下のように行う：
ネズミ・ゲノムＤＮＡ（源：Balb c株）を、２５ゲージの注射針中を繰り返し通すことにより剪断力を与え、１００℃で５分間変性させ、次いで、氷上で冷却してから２００μＭの各デオキシヌクレオチドトリホスフェート（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰ）、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８.３、５０ｍＭ ＫＣｌ、１.５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０.００１％ゼラチン、１.２５ユニットのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、１００ｐＭのオリゴヌクレオチド＃６および１００ｐＭのオリゴヌクレオチド＃７を含有する反応混合物に添加する。反応混合物を以下の方法のサーマルサイクリングに供する：９５℃１分、５５℃１分、７２℃１分を４０サイクル、次いで、７２℃で１０分インキュベーションする。

この反応により特異的に増幅されるＤＮＡをエタノール沈殿し、制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、次いで、アガロースゲル電気泳動に供する。ＢＭＰ−１２またはＢＭＰ−１２関連蛋白をコードするＤＮＡフラグメントの予想サイズに対応するゲルの領域を切り取り、そこに存在する特異的に増幅されたＤＮＡフラグメントを溶出し（当業者に知られた電気溶出または他の方法により）、ｐＧＥＭ−３またはpBluescriptのごときプラスミドベクターのポリリンカーのＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩ部位の間にサブクローンする。得られるサブクローンの１つ（ｍＶ１と命名）に関するＤＮＡ配列分析は、それに含まれている特異的に増幅されたＤＮＡ配列が、本発明ＢＭＰ−１２またはＶＬ−１配列のいずれかに対するネズミ・相同体であると思われる蛋白の一部をコードしていることを示す。この特異的に増幅されたネズミ・ＤＮＡフラグメントのＤＮＡ配列（配列番号：１０）および誘導されるアミノ酸配列（配列番号：１１）を配列表に示す。

配列番号：１０のヌクレオチド＃１〜＃２６はオリゴヌクレオチド＃６からなり、ヌクレオチド＃２４６〜＃２７２は、特異的増幅反応を行うために用いられるオリゴヌクレオチド＃７のリバース・コンプリメントの一部からなる。配列番号：１０のヌクレオチド＃２７はコドントリプレットの最後のヌクレオチドであると思われ、配列番号：１０のヌクレオチド＃２４４〜＃２４５はコドントリプレットの最初の２個のヌクレオチドであるように思われる。それゆえ、配列番号：１０のヌクレオチド＃２８から＃２４３まではｍＶ１の部分コーディング配列に対応する。増幅反応を開始させることにおけるオリゴヌクレオチド＃６よおび＃７の機能のため、それらは、本発明ヒト・ＢＭＰ−１２またはＶＬ−１蛋白に対するネズミ・相同配列をコードする実際の配列に正確に対応していなくてもよく、それゆえ、それらは対応するアミノ酸配列誘導体（配列番号：１１）に正確に翻訳されない。

当業者は、配列番号：１０に示す特異的に増幅されたネズミ・ＢＭＰ−１２またはＶＬ−１ ＤＮＡ配列に基づいて設計されたオリゴヌクレオチドプローブを用いて全長のネズミＢＭＰ−１２またはＶＬ−１をコードするクローン（ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡのいずれか）を同定することができよう。

ｍＶ２と命名されたもう１つの得られたクローンのＤＮＡ配列分析は、特異的に増幅されたＤＮＡ配列はその中に本発明ネズミ・ＢＭＰ−１２関連配列の一部を含んでいたことを示す。この特異的に増幅されたネズミ・ＤＮＡフラグメントのＤＮＡ配列（配列番号：１２）および誘導されるアミノ酸配列（配列番号：１３）を配列表に示す。

配列番号：１２のヌクレオチド＃１〜＃２６は、オリゴヌクレオチド＃６の一部からなり、ヌクレオチド＃２４６〜＃２７２は特異的増幅反応を行うために用いられたオリゴヌクレオチド＃７のリバース・コンプリメントの一部からなる。配列番号：１２のヌクレオチド＃２７はコドントリプレットの最後のヌクレオチドであると思われ、配列番号：１２のヌクレオチド＃２４４〜＃２４５はコドントリプレットの最初の２つのヌクレオチドであると思われる。それゆえ、配列番号：１２のヌクレオチド＃２８から＃２４３まではｍＶ２の部分コーディング配列に対応する。増幅反応開始におけるオリゴヌクレオチド＃６および＃７の機能のために、それらは本発明ネズミ・ＢＭＰ−１２関連蛋白をコードする実際の配列に正確に対応していなくてもよく、それゆえ、対応するアミノ酸配列誘導体（配列番号：１３）に翻訳されない。

ネズミ・ＢＭＰ−１２関連蛋白の全長をコードしているクローン（ｃＤＮＡまたはゲノムのいずれか）を同定するために、配列番号：１２に示す特異的に増幅されたネズミ・ＢＭＰ−１２関連ＤＮＡ配列に基づいて設計されたオリゴヌクレオチドプローブが当業者により用いられうる。

ｍＶ９と命名されたもう１つの得られたクローンのＤＮＡ配列分析は、特異的に増幅されたＤＮＡ配列はその中に本発明ネズミ・ＢＭＰ−１２関連配列の一部を含んでいたことを示す。この配列は、配列番号：３に記載されたヒト・ＭＰ５２ ＤＮＡ配列に対するネズミ・相同体であると思われる。この特異的に増幅されたネズミ・ＤＮＡフラグメントのＤＮＡ配列（配列番号：１４）および誘導されるアミノ酸配列（配列番号：１５）を配列表に示す。

配列番号：１４のヌクレオチド＃１〜＃２６はオリゴヌクレオチド＃６の一部からなり、ヌクレオチド＃２４６〜＃２７２は特異的増幅反応を行うために用いられたオリゴヌクレオチド＃７のリバース・コンプリメントの一部からなる。配列番号：１４のヌクレオチド＃２７はコドントリプレットの最後のヌクレオチドであると思われ、配列番号：１４のヌクレオチド＃２４４〜＃２４５はコドントリプレットの最初の２つのヌクレオチドであるように思われる。それゆえ、配列番号：１４のヌクレオチド＃２８から＃２４３まではｍＶ９の部分コーディング配列に対応する。増幅反応開始におけるオリゴヌクレオチド＃６および＃７の機能のために、それらは本発明ネズミ・ＢＭＰ−１２関連蛋白をコードする実際の配列に正確に対応していなくてもよく、それゆえ、対応するアミノ酸配列誘導体（配列番号：１５）に翻訳されない。

ネズミ・ＢＭＰ−１２関連蛋白の全長をコードしているクローン（ｃＤＮＡまたはゲノムのいずれか）を同定するために、配列番号：１４に示す特異的に増幅されたネズミ・ＢＭＰ−１２関連ＤＮＡ配列に基づいて設計されたオリゴヌクレオチドプローブが当業者により用いられうる。

別法として、上で同定したオリゴヌクレオチドプライマー＃６および＃７をプライマーとして用いて、ＢＭＰ−１２をコードしているプラスミドサブクローンＰＣＲ１−１＃２由来の２７５塩基対のＤＮＡプローブの特異的増幅を行う。該ＤＮＡプローブの内部の２５９塩基対は配列番号：１のオリゴヌクレオチド＃６０７から８６５までに対応している。この２７５塩基対のＤＮＡプローブを^３２Ｐで放射性標識し、ベクターλＦＩＸII（ストラタジーン（Stratagene）社カタログ＃９４６３０６）中に構築されたネズミ・ゲノムライブラリーをスクリーニングするのに用いた。該ネズミ・ゲノム遺伝子ライブラリーの１００万個の組み換え体を、プレート１枚あたり約２００００個の組み換え体の密度で５０枚のプレートに撒く。組み換えバクテリオファージプラークに関する２系のニトロセルロースレプリカを、厳密性を減じた条件下において、標準的なハイブリダイゼーションバッファー（ＳＨＢ＝５ＸＳＳＣ、０.１％、５Ｘデンハーツ、１００μｇ／ｍｌサケ・***ＤＮＡ）中、一晩６０℃において特異的に増幅された３３３塩基対のプローブとハイブリダイゼーションさせる。翌日、放射性標識されたオリゴヌクレオチドを含有するハイブリダイゼーション溶液を除去し、厳密性を減じた条件下において、２ＸＳＳＣ、０.１％ＳＤＳにてフィルターを洗浄する。複数のハイブリダイゼーション陽性組み換え体を同定し、プラーク精製する。ハイブリダイゼーション陽性ネズミ・ゲノム組み換えクローンのフラグメントを標準的なプラスミドベクター（すなわちｐＧＥＭ３）中にサブクローンし、ＤＮＡ配列分析に供する。

ＭＶＲ３と命名されたこれらのサブクローンのうちの１つのＤＮＡ配列分析は、それが上記ＰＣＲ生成物ｍＶ１に対応するマウス・遺伝子の一部をコードしていることを示す。このサブクローンの部分ＤＮＡ配列および対応アミノ酸翻訳物を、それぞれ、配列番号：２９および配列番号：３０に示す。

ＭＶＲ３２と命名されたこれらのサブクローンのうちのもう１つのサブクローンのＤＮＡ配列分析は、それが、上記ＰＣＲ生成物ｍＶ２（配列番号：７に示すヒト・ＶＬ１配列のネズミ・相同体）に対応するマウス・遺伝子の一部をコードすることを示す。このサブクローンの部分ＤＮＡ配列および対応アミノ酸翻訳物を、それぞれ、配列番号：３１および配列番号：３２に示す。

ＭＶＲ２３と命名されたこれらのサブクローンのうちのもう１つのサブクローンのＤＮＡ配列分析は、それが、上記ＰＣＲ生成物ｍＶ９（配列番号：３に示すＭＰ５２配列のネズミ・相同体）に対応するマウス・遺伝子の一部をコードすることを示す。

本発明ＢＭＰ−１２蛋白をコードするヒト・ゲノムクローンを同定し単離することに関して上で説明したのと同様の方法で、配列番号：７に示すＶＬ−１をコードする配列に対応するオリゴヌクレオチドプローブを設計することができ、ＶＬ−１（ＢＭＰ−１３）蛋白をコードするヒト・ゲノムまたはｃＤＮＡ配列を同定するために用いることができる。これらのオリゴヌクレオチドはＶＬ−１をコードする配列に特異的な領域に対して設計されるであろうし、それゆえ、特異的に増幅されたＶＬ−１をコードする配列（配列番号：７）と特異的に増幅されたＢＭＰ−１２をコードする配列（配列番号：５）との間の最低の程度のヌクレオチド配列同一性の領域由来である可能性があるだろう。

別法として、上で同定したオリゴヌクレオチド＃４および＃５をプライマーとして用いて、ＢＭＰ−１２をコードするプラスミドクローンＰＣＲ１−１＃２由来の３３３塩基対のＤＮＡプローブの特異的増幅を行う。該ＤＮＡプローブの内部の３１５塩基対は配列番号：１のヌクレオチド＃５７１から＃８８５までに対応している。この３３３塩基対のＤＮＡプローブを^３２Ｐで放射性標識し、ベクターλＤＡＳＨII（ストラタジーン（Stratagene）社カタログ＃９４５２０３）中に構築されたネズミ・ゲノムライブラリーをスクリーニングするのに用いた。該ネズミ・ゲノム遺伝子ライブラリーの１００万個の組み換え体を、プレート１枚あたり約２００００個の組み換え体の密度で５０枚のプレートに撒く。組み換えバクテリオファージプラークに関する２系のニトロセルロースレプリカを、厳密性を減じた条件下において、標準的なハイブリダイゼーションバッファー（ＳＨＢ＝５ＸＳＳＣ、０.１％、５Ｘデンハーツ、１００μｇ／ｍｌサケ・***ＤＮＡ）中、一晩６０℃において特異的に増幅された３３３塩基対のプローブとハイブリダイゼーションさせる。翌日、放射性標識されたオリゴヌクレオチドを含有するハイブリダイゼーション溶液を除去し、厳密性を減じた条件下において、２ＸＳＳＣ、０.１％ＳＤＳにてフィルターを洗浄する。複数（約１５個）のハイブリダイゼーション陽性組み換え体を同定し、プラーク精製する。

このスクリーニング工程に用いる、ＢＭＰ−１２をコードするプラスミドＰＣＲ１−１＃２から得られた３３３塩基対のＤＮＡプローブに陽性ハイブリダイゼーションすると予測されるＢＭＰ−１２および他のＢＭＰ−１２寒天蛋白をコードする組み換え体と、本発明ＶＬ−１をコードするハイブリダイゼーション陽性組み換え体とを区別するために、配列番号：７に示すＶＬ−１に基づく下記オリゴヌクレオチドプローブを設計し、自動ＤＮＡ合成装置により合成する：

配列番号：１に示すＢＭＰ−１２をコードする配列の対応領域（ヌクレオチド＃６７２から＃６８９まで）に対して５個のヌクレオチド相違を有する、配列番号：７のヌクレオチド＃６０から＃７６までに対応するオリゴヌクレオチド。ＶＬ−１オリゴヌクレオチドプローブ＃８にハイブリダイゼーションする組み換えバクテリオファージクローンの１つをλＪＬＤｃ３１と命名する。この組み換えバクテリオファージクローンをプラーク精製し、バクテリオファージプレートストックを作成し、λＪＬＤｃ３１ヒト・ゲノムクローンからバクテリオファージＤＮＡを単離する。バクテリオファージλＪＬＤｃ３１を、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、１２３０１パークローン・ドライブ、ロックビル、ＭＤ（「ＡＴＣＣ」）に、受託番号７５９２２の下、１９９４年１０月２０日に寄託した。この寄託は特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に適合する。この組み換え体λＪＬＤｃ３１のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域は２.５ｋｂのＥｃｏＲＩフラグメントに局在化している。このフラグメントをプラスミドベクター（ｐＧＥＭ３）中にサブクローンし、ＤＮＡ配列分析を行う。このプラスミドサブクローンをｐＧＥＭＪＬＤｃ３１／２.５と命名し、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、１２３０１パークローン・ドライブ、ロックビル、ＭＤ（「ＡＴＣＣ」）に、受託番号６９７１０の下、１９９４年１０月２０日に寄託した。この寄託は特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に適合する。

クローンλＪＬＤｃ３１由来のプラスミドサブクローンｐＧＥＭＪＬＤｃ３１／２.５の２.５ｋｂのＤＮＡインサートの部分ＤＮＡ配列（配列番号：２５）および誘導されるアミノ酸配列（配列番号：２６）を配列表に示す。

プラスミドｐＧＥＭＪＬＤｃ３１／２.５の２.５ｋｂのＥｃｏＲＩインサートの一部のＤＮＡ配列を配列番号：２５に示す。配列番号：２５のヌクレオチド＃５２から＃９６３により定義される９１２塩基対の読み取り枠を含んでいる。この配列がゲノムクローンに由来するため、コーディング配列の５'伸長部と介在配列（イントロン／非コーディング配列）の３'端との間の境界を決定することは困難である。全読み取り枠（配列番号：２５のヌクレオチド＃５２から＃９６３まで）は、３０４個のアミノ酸までの本発明ＶＬ−１蛋白の一部をコードしている。

ＢＭＰ蛋白およびＴＧＦ−βファミリーに属する他の蛋白に関する知識に基づくと、前駆体ポリペプチドは、提案されているコンセンサス蛋白分解配列Ａｒｇ−Ｘ−Ｘ−Ａｒｇと一致した多塩基性配列Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇにおいて開裂されるであろうと予測される。ＶＬ−１前駆体ポリペプチドの開裂は、配列番号：２６の位置＃１におけるアミノ酸Ｔｈｒから始まる１２０個のアミノ酸の成熟ペプチドを生じると考えられる。成熟形態へのＶＬ−１のプロセッシングは、関連蛋白ＴＧＦ−βのプロセッシング［ジェントリー（Gentry）ら,モレキュラー・アンド・セル・バイオロジー（Molec & Cell.Biol.）,第８巻：４１６２頁（１９８８年）；デリンク（Derynck）ら,ネイチャー（Nature）,第３１６巻：７０１頁（１９８５年）］に類似した様式でのダイマー化およびＮ末端領域の除去を包含すると考えられる。

それゆえ、ＶＬ−１の成熟活性種は、各サブユニットが配列番号：２６のアミノ酸＃１から＃１２０まで（予想分子量約１２０００ダルトン）からなる２個のポリペプチドサブユニットのホモダイマーからなると考えられる。さらなる活性種は、少なくとも配列番号：２６のアミノ酸＃１９から＃１１９もしくは＃１２０までからなり、それゆえ、最初と最後の保存されたシステイン残基を含むと考えられる。

かかる方法を用いて、成熟ヒト・ＶＬ−１（ＢＭＰ−１３）をコードするクローンを得た。このクローンによりコードされるヌクレオチド配列および対応アミノ酸配列を、それぞれ、配列番号：２５および２６において配列表に示す。

ＢＭＰ−１２の発現
ＢＭＰ−１２蛋白を製造するために、慣用的な遺伝子工学的方法により、それをコードするＤＮＡを適当な発現ベクター中に移行させ、哺乳動物細胞または他の好ましい真核もしくは原核宿主の細胞中に導入する。

細菌細胞においてＢＭＰ−１２蛋白を製造するために、以下の方法を用いる。

イー・コリにおけるＢＭＰ−１２の発現
イー・コリにおいてＢＭＰ−１２を製造するために、以下の主要な特徴を有する発現プラスミドｐＡＬＶ１−７８１を構築した。ヌクレオチド１〜２０６０は、宿主イー・コリ株における抗生物質アンピシリン耐性を付与するβ−ラクタマーゼに関する遺伝子およびＣｏｌＥ１由来の複製開始点を含むプラスミドｐＵＣ１８［ノランダー（Norrandar）ら,ジーン（Gene）第２６巻：１０１〜１０６頁（１９８３年）］由来のＤＮＡ配列を含む。ヌクレオチド２０６１〜２２２１は、３つのオペレーター配列Ｏ_Ｌ１、Ｏ_Ｌ２、Ｏ_Ｌ３を含むバクテリオファージλ［サンガー（Sanger）ら,ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（J.Mol.Biol.）第１６２巻：７２９〜７７３頁（１９８２年）］の大左方プロモーター（ｐＬ）に関するＤＮＡ配列を含む。該オペレーターはλｃＩリプレッサー蛋白の結合部位であり、該蛋白の細胞内レベルはｐＬからの転写開始量を調節する。ヌクレオチド２２２２〜２７２３は、サンガー（Sanger）ら,ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（J.Mol.Biol.）第１６２巻：７２９〜７７３頁（１９８２年）に記載されたバクテリオファージλ由来のヌクレオチド３５５６６から３５４７２までおよび３８１３７から３８３６１までに由来する配列上に含まれる強力なリボゾーム結合配列を含む。ヌクレオチド２７２４〜３０４１は、すべての３'非翻訳配列が除去されている成熟ＢＭＰ−１２蛋白をコードするＤＮＡ配列を含む。ｐＡＬＶ１−７８１発現ベクター中に導入されたＢＭＰ−１２ ＤＮＡ配列を５'末端において修飾してコーディング能力を変化させずにＡ＋Ｔ含量を増加させた。これらの変更を行ってイー・コリ中のＢＭＰ−１２ ｍＲＮＡ上への翻訳効率を上昇させた。ヌクレオチド３０４２〜３０５８は、制限エンドヌクレアーゼ部位を有する「リンカー」ＤＮＡ配列を提供する。ヌクレオチド３０５９〜３１２７は、イー・コリのａｓｐＡ遺伝子の転写終結配列［タカギ（Takagi）ら,ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Nucl.Acids Res.）第１３巻：２０６３〜２０７４頁（１９８５年）］に基づく転写終結配列を提供する。ヌクレオチド３１２８〜３５３２はｐＵＣ１８由来のＤＮＡ配列である。

ダガート（Dagert）およびエールリッヒ（Ehrlich）,ジーン（Gene）第６巻：２３頁（１９７９年）の手順によりプラスミドｐＡＬＶ１−７８１をイー・コリ宿主株ＧＩ７２４（F,lacI^ｑ,lacp^Ｌ８,ampC::λcI^＋）中に形質転換した。ＧＩ７２４（ＡＴＣＣ受託番号５５１５１）はａｍｐＣ遺伝子座における染色体中に安定に組み込まれたλｃＩリプレッサー遺伝子のコピーを含んでおり、該遺伝子はサルモネラ・チフィムリウム（Salmonella typhimurium）のｔｒｐプロモーター／オペレーター配列の転写調節下に置かれている。最少培地または上記ＩＭＣのごときカサミノ酸を補足した最少培地のようなトリプトファン不含培地中での増殖の間にのみ、ＧＩ７２４中においてλｃＩ蛋白が生産される。ＧＩ７２４培養へのトリプトファン添加はｔｒｐプロモーターを抑制し、λｃＩ合成のスイッチをオフにし、ｐＬプロモーターが細胞中に存在する場合にはｐＬプロモーターからの転写誘導を徐々に引き起こすであろう。

１ｍＭ ＭｇＳＯ_４を含有し、０.５％ｗ／ｖグルコース、０.２％ｗ／ｖカザミノ酸および１００μｇ／ｍｌアンピシリンを補足したＭ９培地［ミラー（Miller）,「イクスペリメンツ・イン・モレキュラー・ジェネティクス（Experiments in Molecular Genetics）」コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー、ニューヨーク（Cold Spring Harbor Laboratory,New York）（１９７２年）］からなるＩＭＣ培地を含有する１.５％ｗ／ｖ寒天プレート上で形質転換体を選択した。ｐＡＬＶ１−７８１で形質転換したＧＩ７２４を、１００μｇアンピシリン含有ＩＭＣ培地中で、Ａ_５５０が０.５になるまで３７℃で増殖させた。次いで、最終濃度１００μｇ／ｍｌとなるようにトリプトファンを添加し、さらに培養物を４時間インキュベーションした。この間に、ＢＭＰ−１２蛋白は「封入体」フラクション中に蓄積する。

蛋白モノマーの調製
１８ｇの凍結細胞を計量し、６０ｍｌの１００ｍＭ Ｔｒｉｓ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ フッ化フェニルメチルスルホニル［ＰＭＳＦ］,ｐＨ８.３中に再懸濁した。マイクロフルイダイザー（Microfluidizer）^ＴＭ［＃ＭＣＦ１００Ｔ型］に３回通すことにより細胞を溶解させた。４℃で２０分間１５０００ｇでの遠心分離により封入体ペレットを得た。上清を傾斜法で捨て、１００ｍｌの１００ｍＭ Ｔｒｉｓ、１.０Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＰＭＳＦ,ｐＨ８.３で洗浄した。懸濁物を、４℃で１０分間１５０００ｇで再度遠心分離し、上清を傾斜法で捨てた。次いで、ペレットを、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１ｍＭ ＰＭＳＦ,ｐＨ８.３で洗浄した。懸濁物を４℃で１０分間１５０００ｇで再度遠心分離し、上清を傾斜法で捨てた。ガラス製組織ホモジナイザー中で、１％ ＤＴＴを含有する５０ｍｌの２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１ｍＭ ＥＤＴＡ,１ｍＭ ＰＭＳＦ,ｐＨ８.３にペレットを再懸濁した。次いで、氷酢酸で酸性にしてｐＨを２.５にすることによりモノマーＢＭＰ−１２を可溶化した。４℃で２０分間１５０００ｇで遠心分離することにより可溶性フラクションを単離した。

この遠心分離により得られた上清を集め、２０ｍｌずつＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ−１００^ＴＭサイズ排除カラム（８３ｃｍ ｘ ２.６ｃｍ；ベッド約４４０ｍｌ）上でクロマトグラフィーを行った。１％酢酸を移動相として流速１.４ｍｌ／分でＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ−１００^ＴＭカラムを操作した。コンピューター計算した吸光係数１８２００Ｍ^−１ｃｍ^−１および分子量（１１６６７ダルトン）を用い、２８０ｎｍにおける吸光度によりＢＭＰ−１２モノマーに対応するフラクションを検出した。このサイズ排除カラムによりプールされた材料を再生反応の出発材料として用いた。

上記方法の別法として、−８０℃に保存された１.０ｇの細胞を計り取る。溶液（３.４ｍｌの１００ｍＭ Ｔｒｉｓ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ,ｐＨ８.５）を添加する。十分に懸濁するまで溶液をボルテックス撹拌する。４０μｌのイソプロパノール中１００ｍＭ ＰＭＳＦを添加する。フレンチプレスで細胞を１０００ｐｓｉにおいて溶解させる。封入体をエッペンドルフーブ中、４℃で２０分遠心分離してペレットを形成する。上清を傾斜法で捨てる。１個のペレット（全部で４個）に２５０ｍＭ ＤＴＴを含有する脱気した１.０ｍｌの８.０Ｍグアニジン塩酸、０.５Ｍ Ｔｒｉｓ、５ｍＭ ＥＤＴＡ,ｐＨ８.５を添加する。ペレットを溶解し、液にアルゴンを３０秒間吹き付ける。次に、溶液を３７℃で１時間インキュベーションする。エッペンドルフ微量遠心を２３℃で２〜３分行って不溶性物質をペレット化する。０.５〜１.０ｍｌの上清をスペルコ（Supelco）の２ｃｍガードカートリッジ（ＬＣ−３０４）に注入し、０.１％ＴＦＡ中アセトニトリルを３５分で１−７０％とするグラジエントで溶離する。ＢＭＰ−１２は２９ないし３１分の間に溶離する。フラクションをプールし、アミノ酸組成に基づく理論吸光係数を用いて、０.１％ＴＦＡに対する２８０ナノメーターの吸光度により蛋白濃度を決定する。

上記方法の第２の別法として、上記のごとくイー・コリから得た凍結細胞ペレットを３０ｍｌのＴＥ８.３（１００：１０）バッファー（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８.３、１０ｍＭ Ｎａ_２ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＰＭＳＦ）中で融解する。マイクロフルイダイザー（Microfluidizer）^ＴＭ［＃ＭＣＦ１００Ｔ型］に３回通すことにより細胞を溶解させる。最初に得られた封入体ペレットを、１００ｍＭ ＤＴＴを含有する８Ｍ グアニジン−ＨＣｌ、ＴＥ８.５（１００：１０）バッファー（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８.５）、１０ｍＭ Ｎａ_２ＥＤＴＡ）中に溶解し、３７℃で１時間インキュベーションする。この材料を室温で１５分間１２０００ｇで遠心分離する。

ＣＨＡＰＳ系を用いるＢＭＰ−１２蛋白の再生
十分な体積のＢＭＰ−１２プールを凍結乾燥して１０μｇの蛋白を得る。ガラス製装置で蒸留した５μｌの水を添加して残渣を再溶解し、次いで、１００μｌの再生用混合物（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１.０Ｍ ＮａＣｌ、２％ ３−（３−クロラミドプロピル）ジメチルアンモニオ−１−プロパン−サルフェート（ＣＨＡＰＳ）、５ｍＭ ＥＤＴＡ、２ｍＭ グルタチオン（還元型）、１ｍＭ グルタチオン（酸化型）；ｐＨ約８.５）を添加する。部分試料をノベックス（Novex）の１６％トリシンゲル上を１２５ボルトで２.５時間泳動させ、次いで、クーマシーブルー（Coomasie Blue）染色ならびに脱色することによりダイマー形成を評価する。

１％ Ｂバッファー（Ａバッファー中に希釈）に対して平衡化されたＣ４分析用ＲＰ−ＨＰＬＣ（逆相高品質液体クロマトグラフィー）カラム（ビダック（Vydac）２１４ＴＰ５４）を用い、流速１ｍｌ／分として以下のグラジエント（Ａバッファー＝０.１％トリフルオロ酢酸、Ｂバッファー＝９５％アセトニトリル、０.１％トリフルオロ酢酸）を３５分かけて行う間に蛋白を溶離させてＢＭＰ−１２ダイマーを精製した：

１−５分 ２０％Ｂバッファー
５−１０分 ２０−３０％Ｂバッファー
１０−３０分 ３０−５０％Ｂバッファー
３０−３５分 ５０−１００％Ｂバッファー

蛋白を２８０ｎｍにおける吸光度によりモニターした。ピークＢＭＰ−１２フラクション（２９ないし３１分の間に溶離）をプールした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより純度を評価した。上で示したコンピューターにより計算した吸光係数および分子量を用いて、２８０ｎｍにおける吸光度により蛋白濃度を決定した。

哺乳動物細胞におけるＢＭＰ−１２の発現
生物学的に活性のある組み換えヒト・ＢＭＰ−１２のためのもう１つの考えられる好ましい発現系は安定に形質転換された哺乳動物細胞である。

配列番号：１の配列またはＢＭＰ−１２をコードする他のＤＮＡ配列もしくは他の修飾配列およびｐＣＤ［オカヤマ（Okayama）ら,モレキュラー・セル・バイオロジー（Mol.Cell Biol.）,第２巻１６１〜１７０頁（１９８２年）］、ｐＪＬ３、ｐＪＬ４［ゴフ（Gough）ら,ＥＭＢＯ Ｊ.,第４巻：６４５〜６５３頁（１９８５年）］ならびにｐＭＴ２ ＣＸＭのごとき既知ベクターを用いることにより当業者は哺乳動物発現ベクターを構築することができる。

哺乳動物発現ベクターｐＭＴ２ ＣＸＭはｐ９１０２３（ｂ）（ウォング（Wong）ら,サイエンス第２２８巻：８１０〜８１５頁,１９８５年）の誘導体であるが、それがテトラサイクリン耐性遺伝子のかわりにアンピシリン耐性遺伝子を含み、さらにｃＤＮＡクローン挿入のためのＸｈｏＩ部位を含んでいるという点でｐ９１０２３（ｂ）とは異なる。ｐＭＴ２ ＣＸＭの機能的エレメントは記載されており（カウフマン,アール・ジェイ（Kaufman,R.J.）,１９８５年,プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユーエスエイ（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）第８２巻：６８９〜６９３頁）、アデノウイルスＶＡ遺伝子、７２塩基対のエンハンサーを含むＳＶ４０複製開始点、５'スプライス部位ならびにアデノウイルス後期ｍＲＮＡ上に存在するアデノウイルス三分節リーダー配列の大部分を含むアデノウイルス大後期プロモーター、３'スプライスアクセプター部位、ＤＨＦＲインサート、ＳＶ４０初期ポリアデニレーション部位（ＳＶ４０）、およびイー・コリ中での増殖に必要なｐＢＲ３２２配列を含む。

ｐＭＴ２−ＶＷＦのＥｃｏＲＩ消化によりプラスミドｐＭＴ２ ＣＸＭを得て、これを米国メリーランド州ロックビルのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに、受託番号ＡＴＣＣ６７１２２の下で寄託した。ＥｃｏＲＩ消化によりｐＭＴ２−ＶＷＦ中に存在するｃＤＮＡインサートを切除し、直鎖状のｐＭＴ２を得て、これを結合してイー・コリＨＢ１０１またはＤＨ−５をアンピシリン耐性に形質転換することができる。プラスミドｐＭＴ２ ＤＮＡを慣用的方法により調製することができる。次いで、ループアウト／イン突然変異［モリナガ（Morinaga）ら,バイオテクノロジー（Biotechnology）第８４巻：６３６頁（１９８４年）］を用いてｐＭＴ２ ＣＸＭを構築する。これにより、ＳＶ４０複製開始点およびｐＭＴ２のエンハンサー配列に近いＨｉｎｄIII部位に対する塩基１０７５から１１４５までを除去する。さらに、それは、制限エンドヌクレアーゼＸｈｏＩに関する認識部位を含む配列を挿入する。ｐＭＴ２３と命名したｐＭＴ２ＣＸＭの誘導体は制限エンドヌクレアーゼＰｓｔＩ、ＥｃｏＲＩ、ＳａｌＩおよびＸｈｏＩに関する認識部位を含んでいる。プラスミドｐＭＴ２ ＣＸＭおよびｐＭＴ２３ ＤＮＡを慣用的方法により調製してもよい。

ｐＭＴ２１由来のｐＥＭＣ２β１も本発明の実施に適する。ｐＭＴ２１は、ｐＭＴ２−ＶＷＦ由来のｐＭＴ２に由来する。上記のごとく、ＥｃｏＲＩ消化によりｐＭＴ−ＶＷＦ中に存在するｃＤＮＡインサートを切除し、直鎖状のｐＭＴ２を得て、これを結合してイー・コリＨＢ１０１またはＤＨ−５をアンピシリン耐性に形質転換することができる。プラスミドｐＭＴ２ ＤＮＡを慣用的方法により調製することができる。

ｐＭＴ２１は以下の２つの修飾によりｐＭＴ２に由来する。まず、ｃＤＮＡクローニングのためのＧ／Ｃテイリングからの１９個のＧ残基の伸長を含むＤＨＦＲ ｃＤＮＡの７６塩基対の５'非翻訳領域を欠失させる。この工程において、ＸｈｏＩ部位を挿入してＤＨＦＲのすぐ上流に続く配列を得る。次に、ＥｃｏＲＶおよびＸｂａＩでの消化、ＤＮＡポリメラーゼのクレノウフラクションでの処理、次いで、ＣｌａＩリンカーへの結合により唯一のＣｌａＩ部位を導入する。これにより、２５０塩基対のセグメントがアデノウイルス関連ＲＮＡ（ＶＡＩ）領域から欠失されるが、ＶＡＩ ＲＮＡ遺伝子の発現または機能は妨害されない。ｐＭＴ２１をＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで消化し、ベクターｐＥＭＣ２Ｂ１を誘導するために用いる。

ＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩでの消化によりｐＭＴ２−ＥＣＡＴ１［エス・ケイ・ジュング（S.K.Jung）ら,ジャーナル・オブ・ウイロロジー（J.Virol.）第６３巻：１６５１〜１６６０頁（１９８９年）］からＥＭＣＶリーダーの一部を得て、２７５２塩基対のフラグメントを生じさせる。このフラグメントをＴａｑＩで消化して、５０８塩基対のＥｃｏＲＩ−ＴａｑＩフラグメントを得て、これを低融点アガロースゲル上の電気泳動により精製する。６８塩基対のアダプターおよびその相補鎖を、５'ＴａｑＩ突出末端およびヌクレオチド７６３から８２７までのＥＭＣウイルスリーダー配列にマッチする配列を有する３'ＸｈｏＩ突出末端とともに合成する。さらに、ＥＭＣウイルスリーダー中の位置１０におけるＡＴＧをＡＴＴに変更し、ＸｈｏＩ部位に続ける。ｐＭＴ２１ ＥｃｏＲＩ−
ＸｈｏＩフラグメント、ＥＭＣウイルスＥｃｏＲＩ−ＴａｑＩフラグメント、および６８塩基対のオリゴヌクレオチドアダプターであるＴａｑＩ−ＸｈｏＩアダプターのスリー・ウェイ（three way）結合によりベクターｐＥＭＣ２β１を得る。

このベクターは、哺乳動物細胞における所望ｃＤＮＡの高レベル発現を指令する関係となっているＳＶ４０複製開始点ならびにエンハンサー、アデノウイルス大後期プロモーター、アデノウイルス三分節リーダー配列の大部分のｃＤＮＡコピー、小型のハイブリッド介在配列、ＳＶ４０ポリアデニレーションシグナルならびにアデノウイルスＶＡ Ｉ遺伝子、ＤＨＦＲならびにβ−ラクタマーゼマーカーおよびＥＭＣ配列を含んでいる。

ベクター構造はＢＭＰ−１２ ＤＮＡ配列の修飾を含んでいてもよい。例えば、コーディング領域の５'および ３'末端の非コーディングヌクレオチドを除去することによりＢＭＰ−１２ ｃＤＮＡを修飾することができる。欠失された非コーディングヌクレオチドを、発現に有益であることが知られている他の配列に置換してもよく、置換しなくてもよい。これらのベクターをＢＭＰ−１２蛋白発現に適する宿主細胞中に形質転換する。さらに、配列番号：１のヌクレオチド５７１から８８２までの成熟コーディング配列を単離し、他のＢＭＰ蛋白の完全なプロペプチドをコードする配列５'末端配列を付加することにより、配列番号：１の配列またはＢＭＰ−１２蛋白をコードする他の配列を操作してＢＭＰ−１２蛋白を発現させることができる。

例えば、当業者は、ＢＭＰ−２プロペプチドをコードするＤＮＡ配列が正しい読み取り枠において成熟ＢＭＰ−１２ペプチドをコードする配列に結合しているＤＮＡベクターを調製することにより、ＢＭＰ−２のプロペプチドが作動可能なように成熟ＢＭＰ−１２ペプチドに結合している融合蛋白を製造することができる。かかる融合蛋白のＤＮＡ配列を配列番号：２７に示す。

当業者は、コーディング配列に隣接する哺乳動物の調節配列を除去することにより、配列番号：１の配列を操作して上記のごとく細菌細胞による細胞内または細胞外発現用の細菌ベクターを作り出すことができる。もう１つの例として、さらにコーディング配列を操作することもできる（例えば、他の既知リンカーに結合する、非コーディング配列を欠失させることにより修飾する、あるいは他の既知方法によりヌクレオチドを変更する）。次いで、ティー・タニグチ（T.Taniguchi）ら,プロナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユーエスエイ（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）第７７巻：５２３０〜５２３３頁の記載のごとき手順を用いて、修飾されたＢＭＰ−１２コーディング配列を既知細菌ベクター中に挿入することができる。次いで、この代表的な細菌ベクターを細菌宿主細胞中に形質転換し、それによりＢＭＰ−１２を発現することができる。細菌細胞でのＢＭＰ−１２蛋白の細胞外発現生産については、例えば、欧州特許出願公開ＥＰＡ１７７,３４３参照。

昆虫細胞における発現のための昆虫ベクターの構築を行うために同様の操作をすることができる。酵母細胞による本発明因子の細胞内もしくは細胞外発現のために、酵母の調節配列を用いて酵母ベクターを構築することもできる［例えば、公開されたＰＣＴ出願ＷＯ８６／００６３９および欧州特許出願ＥＰＡ１２３,２８９参照］。

哺乳動物細胞における高レベルの本発明ＢＭＰ−１２蛋白の製造方法は、多コピーの異種ＢＭＰ−１２遺伝子を含む細胞の構築を包含してもよい。異種遺伝子を増幅可能なマーカー、例えばジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子に結合する。ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子のために、増加した遺伝子コピーを含む細胞をメトトレキセート（ＭＴＸ）濃度を増加させていった場合の増殖について選択できる（カウフマン（Kaufman）およびシャープ（Sharp）,ジャーナル・オブ・モレキュラー・マイオロジー（J.Mol.Biol.）,第１５９巻：６０１〜６２９頁（１９８２年）の手順に従う）。このアプローチを多くの異なる細胞タイプに関して用いることができる。

例えば、リン酸カルシウム共沈およびトランスフェクション、エレクトロポーレーションまたはプロトプラスト融合を包含する種々の方法により、その発現を可能にする他のプラスミド配列に作動可能に結合した本発明ＢＭＰ−１２に関するＤＮＡ配列を含むプラスミドおよびＤＨＦＲ発現プラスミドｐＡｄＡ２６ＳＶ（Ａ）３［カウフマンおよびシャープ,モレキュラー・セル・バイオロジー第２巻：１３０４頁（１９８２年）］をＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞ＤＵＫＸ−ＢII中に同時導入することができる。透析したウシ・胎児血清を含むアルファ培地での増殖に関してＤＨＦＲ発現形質転換体を選択し、次いで、カウフマンら,モレキュラー・セル・バイオロジー第５巻：１７５０頁（１９８３年）に記載されたようにＭＸＴ濃度を増加させていった場合（例えば、連続的ステップでＭＸＴを０.０２、０.２、１.０次いで、５μＭとする）の増殖について選択する。形質転換体をクローンし、下記実施例５において説明するローゼン−改変サムパス−レデイラットアッセイ（the Rosen-modified Sampath-Reddi rat assay）により生物学的に活性のあるＢＭＰ−１２の発現をモニターする。ＢＭＰ−１２発現はＭＸＴ耐性レデイの増加に伴って増加するはずである。［３５Ｓ］メチオニンもしくはシステインでのパルスラベリングおよびポリアクリルアミドゲル電気泳動のごとき当該分野において知られた標準的方法を用いてＢＭＰ−１２ポリペプチドを特徴づける。同様の手順に従って他の関連ＢＭＰ−１２蛋白を製造することができる。

ＢＭＰ−２プロペプチド／ＢＭＰ−１２成熟ペプチド融合物の調製
ＢＭＰ−２プロペプチド／ＢＭＰ−１２成熟ペプチド融合物をコードするベクターを構築するために、以下のクローニング手順を用いて２つの配列を融合させた。

まず、ヒトＢＭＰ−２蛋白のプロペプチドからなるＤＮＡ制限酵素フラグメント、すなわち、配列番号：２７のヌクレオチド１から８４３からなるフラグメントをｐＢＭＰ２ΔＥＭＣから切断する。ｐＢＭＰ２ΔＥＭＣは、ヒト・ＢＭＰ−２蛋白に関する全コーディング配列からなるラムダＵ２０Ｓ−３９（ＡＴＣＣ＃４０３４５）由来のプラスミドであり、ＢＭＰ−２の非翻訳３'および５'配列をベクターから欠失してある。使用５'制限酵素はＢｇｌIIであり、それはベクター中のｐＢＭＰ２ΔＥＭＣをヌクレオチド９７９において切断する。使用３'制限酵素はＭａｅIIであり、それはＢＭＰ−２プロペプチド中のｐＢＭＰ２ΔＥＭＣをカルボキシ末端のわずかに手前のヌクレオチド１９２５において切断する。次いで、得られた９５４塩基対の生成物をゲルにより単離し、遺伝子を精製した。次に、ヒト・ＢＭＰ−１２成熟ペプチドＤＮＡ配列の５'部分からなるＤＮＡ制限酵素フラグメントをｐＰＣＲ１−１＃２ Ｖ１−１（ＡＴＣＣ＃６９５１７）から切断する。使用５'制限酵素はＥａｅＩであり、それはヒト・ＢＭＰ−１２成熟ペプチド配列のＮ末端の丁度３'のところでｐＰＣＲ１−１＃２ Ｖ１−１を切断する。得られた２５９塩基対の生成物をゲルにより精製し、遺伝子を精製した。次いで、アニーリングした場合にヒト・ＢＭＰ−２プロペプチドの最先の３'末端とＢＭＰ−１２成熟ペプチドの５'末端との融合配列からなる小型のＤＮＡフラグメントを生じるように２つのＤＮＡオリゴを設計し合成した。該ＤＮＡフラグメントは、ヒト・ＢＭＰ−２プロペプチドからなる３'制限酵素フラグメントにアニールする５'ＭａｅII相補性粘着末端を有する。アニールしたオリゴＤＮＡフラグメントは、ヒト・ＢＭＰＯ−１２成熟ペプチドからなる制限酵素フラグメントの５'にアニールする３'ＥａｅＩ相補性粘着末端を有する。コーディング鎖オリゴをＢ２／１２と命名し、それは１３塩基対の長さである。次に、ＢＭＰ−１２成熟ペプチドフラグメントの３'末端における１２３塩基対をコードするＤＮＡフラグメントを以下のようにして得た。まず、ヒト・ＢＭＰ−２蛋白のプロペプチドからなるＤＮＡフラグメント、すなわちヌクレオチド１から８４６を、ｐＢＭＰ２ΔＥＭＣからＰＣＲ増幅する。５'プライマー（オリゴ６５５ａ）はポリリンカーの丁度５'のところにアニールし、沈黙の変異によりＢｇｌII制限酵素部位を導入する。得られたＰＣＲ生成物を、ポリリンカー中で開裂するＳａｌＩ、およびＢｇｌIIで切断した。８５０塩基対の制限酵素フラグメント（アミノ酸配列ＲＥＫＥで終わる）をゲルにより精製し、遺伝子を精製した。沈黙の変異によりＢｇｌII制限酵素部位をコードしていてアミノ酸配列ＳＲＣＳから始まる成熟開裂生成物の５'末端にアニーリングする５'プライマー（オリゴ５−１）を用いてＢＭＰ−１２成熟ペプチドをＰＣＲ増幅した。３'プライマー（Ｖ１−１３）はＢＭＰ−１２成熟ペプチド３'末端にアニーリングし、ストップコドンの後ろにＸｂａＩ制限酵素部位を導入する。得られたＰＣＲ生成物をＢｇｌIIおよびＸｂａＩで切断した。３２１塩基対の制限酵素フラグメントをゲルにより精製し、遺伝子を精製した。

前以てＳａｌＩおよびＸｂａＩで切断したベクター中に２つの制限フラグメントをスリー・ウェイ結合させた。得られた構築物を配列決定してＰＣＲにより誘発されたエラーをチェックしたところ、沈黙のＣからＴへの変異がプロペプチドの塩基対１８５において観察された。このプラスミドをｐＲＥＫＲＳＲＣと命名した。次いで、ｐＲＥＫＲＳＲＣをＢｇｌIIおよびＮｇｏＭＩで切断し、それによりＢＭＰ−１２成熟配列の１２３塩基対を包含するベクターフラグメントを単離した。その３つの制限フラグメントおよびアニーリングしたオリゴリンカーをフォー・ウェイ（four way）結合して、ＢＭＰ−１２成熟ペプチドの（ＴＡＬ）５'末端に融合した３'末端における成熟開裂部位を伴ったＢＭＰ−２プロペプチドを有するｐＲＥＫＲ−ＴＡＬを得た。得られた結合ベクターのコーディング配列を配列番号：２７に示す。

発現されたＢＭＰ−１２の生物学的活性
上記実施例２で得られた発現ＢＭＰ−１２蛋白の生物学的活性を測定するために、細胞培養物から蛋白を回収し、同時生成される他の蛋白性物質ならびに他の汚染物質からＢＭＰ−１２蛋白を単離する。精製蛋白を下記実施例５のアッセイに従ってアッセイしてもよい。

当業者に知られた標準的方法を用いて精製を行う。

クーマシーブルーまたは銀［オウクリー（Oakley）ら,アナリティカル・バイオケミストリー（Anal.Biochem.）第１０５巻：３６１頁（１９８０年）］で染色するＳＤＳ−ＰＡＧＥアクリルアミド［レムリ（Laemmli）,ネイチャー（Nature）第２２７巻：６８０頁（１９７０年）］のごとき標準的方法を用い、さらにイムノブロット［トウビン（Towbin）ら,プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユーエスエイ（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）第７６巻：４３５０頁（１９７９年）］により、蛋白分析を行う。

ローゼン改変サムパス−レデイアッセイ
サムパス（Sampath）およびレディ（Reddi）,プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユーエスエイ（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）第８０巻：６５９１〜６５９５頁（１９８３年）記載のラット異所性インプラントアッセイの改変バージョンを用いてＢＭＰ−１２蛋白の活性を評価する。この改変アッセイを本明細書においてローゼン−改変サムパス−レディアッセイと呼ぶ。サムパス−レディ法のエタノール沈殿工程を、アッセイすべきフラクションを水に対して透析（組成物が溶液の場合）または限界濾過（組成物が懸濁液の場合）することに置き換える。次いで、溶液または懸濁液を０.１％ＴＦＡに対して平衡化する。得られた溶液を２０ｍｇのラット・マトリックスに添加する。蛋白で処理されない模擬ラット・マトリックス試料は対照として役立つ。この材料を凍結乾燥し、得られた粉末を＃５ゼラチンカプセルに封入する。２１〜４９日齢のロング・エバンズ・ラット（Long Evans Rats）の腹胸部位の皮下にカプセルを移植する。１０日後にインプラントを除去する。各インプラントの切片を固定し、組織学的分析用に処理する。１μｍのグリコールメタクリレート切片をフォン・コッサ（Von Kossa）および酸フクシンで染色して各インプラントに存在する誘導された腱／靭帯様組織量のスコアをつける。

インプラント１個あたり１、５、２５および５０μｇの用量でＢＭＰ−１２を１０日間移植した。５μｇの用量のＢＭＰ−２は陽性対照として役立った。試験したすべてのＢＭＰ−１２用量に関して、１０日後にインプラントにおいて骨または軟骨の形成は観察されなかった。そのかわり、同じ平面に並んでおり互いに固く充填されている線維芽細胞の高密度の束の存在により容易に認識される、胚性の腱に類似した組織でインプラントが満たされていた［腱／靭帯様組織は、例えば、ハム（Ham）およびコーマック（Cormack）,ヒストロジー（Histology）（ＪＢ・リッピンコット・カンパニー（JB Lippencott Co.）（１９７９年）,３６７〜３６９頁に記載されており、引用によりその開示を本明細書に記載されているものとみなす］。腱／靭帯様組織がすべてのＢＭＰ−１２含有インプラントに存在していた次のセットのアッセイにおいてこれらの知見が再び得られた。対照的に、期待されたように、ＢＭＰ−２インプラントは骨および軟骨の形成を示したが、腱／靭帯様組織を含んでいなかった。

本発明ＢＭＰ−１２蛋白および関連蛋白をこのアッセイにおける活性に関して評価してもよい。

上記実施例による方法を用い、当業者が行える範囲内のわずかな変更を行って、ヒトＭＰ５２蛋白およびＢＭＰ−１３のネズミ・相同体を発現し、腱／靭帯様組織誘導活性に関してアッセイした。すべての蛋白は、ＢＭＰ−１２に関して上に記載した結果と同等の結果を示した。

上記記載は、本発明の目下好ましい具体例を詳述するものである。これらの記載を考慮して本発明の実施における多くの改変および変更が当業者により行われると考えられる。それらの改変および変更は添付した請求の範囲に包含されると確信する。本明細書において議論したすべての文献の開示を引用により本明細書に記載されているものとみなす。

本発明は、腱／靭帯様組織誘導活性を有し、腱／靭帯様組織の形成および修復を誘導するための組成物において有用である蛋白の新たなファミリーを提供するものであり、特に、腱／靭帯様組織の形成および修復を誘導するための医薬品の分野において利用可能である。
（配列表）

図１はヒト・ＢＭＰ−１２とヒト・ＭＰ５２配列の比較である。

Claims (15)

1. ６５℃において０．１ＸＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳである厳密ハイブリダイゼーション条件下において配列番号：１のヌクレオチド４９６、５７１もしくは５７７から８８２までの配列に相補的なヌクレオチド配列にハイブリダイゼーションする単離ＤＮＡ分子であって、腱／靱帯様組織の形成を誘導する能力を有する蛋白をコードする単離ＤＮＡ分子。
2. ６５℃において０．１ＸＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳである厳密ハイブリダイゼーション条件下において配列番号：２５のヌクレオチド６０５もしくは６５９から９６４までの配列に相補的なヌクレオチド配列にハイブリダイゼーションする単離ＤＮＡ分子であって、腱／靱帯様組織の形成を誘導する能力を有する蛋白をコードする単離ＤＮＡ分子。
3. 請求項１または２のＤＮＡ配列で形質転換された宿主細胞。
4. 発現制御配列に作動可能に連結された、請求項１または２のＤＮＡを含むベクター。
5. 請求項４のベクターで形質転換された宿主細胞。
6. 請求項１のＤＮＡ分子によりコードされるアミノ酸配列を含む精製ポリペプチド。
7. 請求項２のＤＮＡ分子によりコードされるアミノ酸配列を含む精製ポリペプチド。
8. 医薬上許容される担体と混合された有効量の請求項６または７のポリペプチドを含む、腱または靱帯に関連した疾病を治療または予防するための医薬組成物。
9. 医薬上許容される担体と混合された有効量の請求項６または７のポリペプチドを含む、腱／靱帯様組織の治癒および組織修復のための医薬組成物。
10. 医薬上許容される担体と混合された有効量の請求項６または７のポリペプチドを含む、結合組織と骨との間の接着を再生させるための医薬組成物。
11. 医薬上許容される担体と混合された有効量の請求項６または７のポリペプチドを含む、腱／靱帯様組織の修復のための医薬組成物。
12. 腱／靱帯様組織の疾患を治療するための治療組成物を調製するための、有効量の請求項６または７のポリペプチドの使用方法。
13. 結合組織と骨との間の接着の再生を必要とする疾患を治療するための治療組成物を製造するための、有効量の請求項６または７のポリペプチドの使用方法。
14. 歯周靱帯の再生を必要とする疾患を治療するための治療組成物を製造するための、有効量の請求項６または７のポリペプチドの使用方法。
15. 結合組織と骨との間の接着の再生を必要とする疾患を治療するための治療組成物であってさらにＢＭＰ−２を含有するものを製造するための、有効量の請求項６または７のポリペプチドの使用方法。

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