JP3485917B2 - Bmp−9蛋白 - Google Patents
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/51—Bone morphogenetic factor; Osteogenins; Osteogenic factor; Bone-inducing factor
-
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-
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、BMP−9と命名された精製蛋白の新規な族
およびその製法に関する。これらの蛋白を、骨および/
または軟骨の形成を誘導するために用いることができ、
さらに傷の治療ならびに組織の修復に用いることができ
る。
およびその製法に関する。これらの蛋白を、骨および/
または軟骨の形成を誘導するために用いることができ、
さらに傷の治療ならびに組織の修復に用いることができ
る。
ネズミ・BMP−9のDNA配列(配列番号:1)およびアミ
ノ酸配列(配列番号:2)を図1に示す。ヒト・BMP−9
の配列を図3(配列番号:8および9)に示す。BMP−9
蛋白は、軟骨および/骨の形成を誘導しうると考えられ
ている。BMP−9蛋白を、以下に記載したラットの骨形
成試験における軟骨および/または骨の形成活性を示す
能力によってさらに特徴づけてもよい。
ノ酸配列(配列番号:2)を図1に示す。ヒト・BMP−9
の配列を図3(配列番号:8および9)に示す。BMP−9
蛋白は、軟骨および/骨の形成を誘導しうると考えられ
ている。BMP−9蛋白を、以下に記載したラットの骨形
成試験における軟骨および/または骨の形成活性を示す
能力によってさらに特徴づけてもよい。
ネズミ・BMP−9を、図1の319〜428番目からなるア
ミノ酸(配列番号:2、アミノ酸1〜110番目)により特
徴づける。ネズミ・BMP−9を、図1に示した610〜1893
番目のヌクレオチドからなるDNA配列で形質転換された
細胞を培養することにより生成させ、培養基から、同時
に生成される蛋白性物質を実質的に含有しない図1(配
列番号:2)に示す319〜428番目のアミノ酸からなるアミ
ノ酸配列により特徴づけられる蛋白を回収し、精製す
る。
ミノ酸(配列番号:2、アミノ酸1〜110番目)により特
徴づける。ネズミ・BMP−9を、図1に示した610〜1893
番目のヌクレオチドからなるDNA配列で形質転換された
細胞を培養することにより生成させ、培養基から、同時
に生成される蛋白性物質を実質的に含有しない図1(配
列番号:2)に示す319〜428番目のアミノ酸からなるアミ
ノ酸配列により特徴づけられる蛋白を回収し、精製す
る。
ヒト・BMP−9は、ネズミ・BMP−9と相同的であると
期待され、図3(配列番号:9)の1番目のアミノ酸(Se
r、Ala、Gly)から110番目のアミノ酸(Arg)に至るア
ミノ酸からなる配列により特徴づけられる。本発明は、
ヒト・BMP−9をコードしているDNA配列を得る方法を包
含する。この方法は、ネズミ・BMP−9のヌクレオチド
配列またはその一部を用いることを必要とし、標準的方
法を用いて、ヒト・遺伝子またはその断片について、ラ
イブラリーを検索するためのプローブを設計するもので
ある。ヒト・BMP−9を、該BMP−9のDNA配列で形質転
換された細胞を培養することにより生成させ、培養基か
ら回収して該BMP−9を精製してもよい。発現した蛋白
を単離、回収し、培養基中から精製する。精製された発
現蛋白は、他の汚染源からの蛋白性物質のみならず同時
に生成される他の蛋白性物質を実質的に含まない。該回
収された精製蛋白は、軟骨および/または骨の形成能を
示すと考えられる。さらに、本発明の蛋白を、以下に記
載のラットの骨の形成試験における軟骨および/骨の形
成能によって特徴づけてもよい。
期待され、図3(配列番号:9)の1番目のアミノ酸(Se
r、Ala、Gly)から110番目のアミノ酸(Arg)に至るア
ミノ酸からなる配列により特徴づけられる。本発明は、
ヒト・BMP−9をコードしているDNA配列を得る方法を包
含する。この方法は、ネズミ・BMP−9のヌクレオチド
配列またはその一部を用いることを必要とし、標準的方
法を用いて、ヒト・遺伝子またはその断片について、ラ
イブラリーを検索するためのプローブを設計するもので
ある。ヒト・BMP−9を、該BMP−9のDNA配列で形質転
換された細胞を培養することにより生成させ、培養基か
ら回収して該BMP−9を精製してもよい。発現した蛋白
を単離、回収し、培養基中から精製する。精製された発
現蛋白は、他の汚染源からの蛋白性物質のみならず同時
に生成される他の蛋白性物質を実質的に含まない。該回
収された精製蛋白は、軟骨および/または骨の形成能を
示すと考えられる。さらに、本発明の蛋白を、以下に記
載のラットの骨の形成試験における軟骨および/骨の形
成能によって特徴づけてもよい。
ヒト・BMP−9を、配列番号:8に示した124〜453番目
のヌクレオチドからなるDNA配列により形質転換した細
胞を培養すること、および同時に生成される他の蛋白性
物質を実質的に含んでいない配列番号:9の1〜110番目
のアミノ酸からなる配列により特徴づけられる蛋白を、
培養基から回収し精製することにより得てもよい。
のヌクレオチドからなるDNA配列により形質転換した細
胞を培養すること、および同時に生成される他の蛋白性
物質を実質的に含んでいない配列番号:9の1〜110番目
のアミノ酸からなる配列により特徴づけられる蛋白を、
培養基から回収し精製することにより得てもよい。
本発明のもう1つの態様は、治療に有効な量のBMP−
9蛋白を医薬上許容される担体または賦形剤中に含む医
薬組成物を提供する。本発明のBMP−9組成物を、軟骨
の形成に用いてもよい。さらに、これらの組成物を、骨
の形成に用いてもよい。BMP−9組成物を、傷の治療お
よび組織の修復に用いてもよい。本発明組成物は、さら
に、BMP−1、BMP−2、BMP−3、BMP−4、BMP−5、B
MP−6およびBMP−7(例えばPCT公開WO88/00205号、WO
89/10409号、WO90/11366号に開示)ならびにBMP−8蛋
白(1991年1月15日付け米国特許出願第07/641,204号、
1990年5月16日付け第07/525,357号および1991年11月20
日付け第07/800,364号に開示)のごとき治療上有用な薬
剤を少なくとも1種含有していてもよい。
9蛋白を医薬上許容される担体または賦形剤中に含む医
薬組成物を提供する。本発明のBMP−9組成物を、軟骨
の形成に用いてもよい。さらに、これらの組成物を、骨
の形成に用いてもよい。BMP−9組成物を、傷の治療お
よび組織の修復に用いてもよい。本発明組成物は、さら
に、BMP−1、BMP−2、BMP−3、BMP−4、BMP−5、B
MP−6およびBMP−7(例えばPCT公開WO88/00205号、WO
89/10409号、WO90/11366号に開示)ならびにBMP−8蛋
白(1991年1月15日付け米国特許出願第07/641,204号、
1990年5月16日付け第07/525,357号および1991年11月20
日付け第07/800,364号に開示)のごとき治療上有用な薬
剤を少なくとも1種含有していてもよい。
本発明組成物は、BMP−9蛋白の他に、上皮成長因子
(EGF)、繊維芽細胞成長因子(FGF)、形質転換成長因
子(TGF−αおよびTGF−β)およびインシュリン様成長
因子(IGF)のごとき成長因子を含む他の治療上有用な
薬剤からなっていてもよい。該組成物はまた、例えば、
該組成物を支持し、骨および/または軟骨成長のための
表面を提供するための適当なマトリックスを含有してい
てもよい。該マトリックスは、骨形成誘導性蛋白を徐々
に遊離させ、そして/またはその機能発現のための適当
な環境を提供しうるものである。
(EGF)、繊維芽細胞成長因子(FGF)、形質転換成長因
子(TGF−αおよびTGF−β)およびインシュリン様成長
因子(IGF)のごとき成長因子を含む他の治療上有用な
薬剤からなっていてもよい。該組成物はまた、例えば、
該組成物を支持し、骨および/または軟骨成長のための
表面を提供するための適当なマトリックスを含有してい
てもよい。該マトリックスは、骨形成誘導性蛋白を徐々
に遊離させ、そして/またはその機能発現のための適当
な環境を提供しうるものである。
BMP−9組成物を、多くの骨および/または軟骨の欠
損、歯周疾患および種々の傷の治療方法に使用してもよ
い。本発明によれば、これらの方法は、骨および/また
は軟骨の形成、傷の治療あるいは組織の修復を必要とす
る患者に、BMP−9蛋白の有効量を投与することを必要
とする。これらの方法はまた、上記共同出願に開示され
た少なくとも1種の新規BMP蛋白とともに本発明蛋白を
投与することを必要とする。さらに、これらの方法はま
た、EGF、FGF、TGF−α、TGF−βおよびIGFを含む他の
成長因子とともにBMP−9蛋白を投与することを包含す
る。
損、歯周疾患および種々の傷の治療方法に使用してもよ
い。本発明によれば、これらの方法は、骨および/また
は軟骨の形成、傷の治療あるいは組織の修復を必要とす
る患者に、BMP−9蛋白の有効量を投与することを必要
とする。これらの方法はまた、上記共同出願に開示され
た少なくとも1種の新規BMP蛋白とともに本発明蛋白を
投与することを必要とする。さらに、これらの方法はま
た、EGF、FGF、TGF−α、TGF−βおよびIGFを含む他の
成長因子とともにBMP−9蛋白を投与することを包含す
る。
本発明のさらにもう1つの態様は、BMP−9蛋白の発
現についてコードしているDNA配列である。かかる配列
は、図1(配列番号:1)および図3(配列番号:8)に示
した5'から3'方向へのヌクレオチド配列あるいは図1ま
たは図3のDNA配列と緊縮条件下でハイブリダイズするD
NA配列を含んでおり、軟骨および/または骨の形成を誘
導する能力のある蛋白をコードしている。結局、図1ま
たは図3の配列の相同遺伝子あるいは他の変化は、かか
る核酸の変化が該ペプチド配列の変化を引き起こすか否
かにかかわらず、本発明に包含される。
現についてコードしているDNA配列である。かかる配列
は、図1(配列番号:1)および図3(配列番号:8)に示
した5'から3'方向へのヌクレオチド配列あるいは図1ま
たは図3のDNA配列と緊縮条件下でハイブリダイズするD
NA配列を含んでおり、軟骨および/または骨の形成を誘
導する能力のある蛋白をコードしている。結局、図1ま
たは図3の配列の相同遺伝子あるいは他の変化は、かか
る核酸の変化が該ペプチド配列の変化を引き起こすか否
かにかかわらず、本発明に包含される。
本発明のさらなる態様は、発現調節配列に作動可能に
連結した上記DNA配列からなるベクターを包含する。こ
れらのベクターを、本発明のBMP−9蛋白生成のための
新規方法に用いてもよい。該新規方法においては、BMP
−9蛋白の発現調節配列に作動可能に連結したBMP−9
蛋白配列をコードしているDNA配列で形質転換された細
胞系を適当な培地で培養し、BMP−9蛋白を回収し、精
製する。この方法は多くの既知の原核細胞および真核細
胞双方を、該ペプチド発現用宿主細胞として用いること
ができる。
連結した上記DNA配列からなるベクターを包含する。こ
れらのベクターを、本発明のBMP−9蛋白生成のための
新規方法に用いてもよい。該新規方法においては、BMP
−9蛋白の発現調節配列に作動可能に連結したBMP−9
蛋白配列をコードしているDNA配列で形質転換された細
胞系を適当な培地で培養し、BMP−9蛋白を回収し、精
製する。この方法は多くの既知の原核細胞および真核細
胞双方を、該ペプチド発現用宿主細胞として用いること
ができる。
本発明の他の態様および利点は、以下の詳細な説明お
よびその好ましい具体例を考慮すれば明白である。
よびその好ましい具体例を考慮すれば明白である。
図面の簡単な説明
図1は、以下にさらに記載されるML14aクローン由来の
ネズミ・BMP−9のDNA配列および推定アミノ酸配列を示
す。
ネズミ・BMP−9のDNA配列および推定アミノ酸配列を示
す。
図2は、ラムダU20S−3 ATCC 40342由来のヒト・BMP
−4のDNA配列および推定アミノ酸配列を示す。
−4のDNA配列および推定アミノ酸配列を示す。
図3は、λFIX/H6111 ATCC 75252由来のヒト・BMP−
9のDNA配列および推定アミノ酸配列を示す。
9のDNA配列および推定アミノ酸配列を示す。
発明の詳細な説明
ネズミ・BMP−9のヌクレオチド配列(配列番号:1)
およびコードされるアミノ酸配列(配列番号:2)を図1
に示す。本発明の精製ネズミ・BMP−9蛋白を、図1
(配列番号:1)の610〜1893番目のヌクレオチドからな
るDNA暗号配列で形質転換された宿主細胞を培養するこ
とにより生成させ、培養基から、当該アミノ酸配列また
は図1(配列番号:2)の319〜428番目のアミノ酸により
表される配列と実質的に相同的な配列を有する蛋白を回
収し精製する。培養基から回収したBMP−9蛋白を、同
時に生成する他の蛋白性物質および存在する他の汚染物
質から単離することにより精製する。
およびコードされるアミノ酸配列(配列番号:2)を図1
に示す。本発明の精製ネズミ・BMP−9蛋白を、図1
(配列番号:1)の610〜1893番目のヌクレオチドからな
るDNA暗号配列で形質転換された宿主細胞を培養するこ
とにより生成させ、培養基から、当該アミノ酸配列また
は図1(配列番号:2)の319〜428番目のアミノ酸により
表される配列と実質的に相同的な配列を有する蛋白を回
収し精製する。培養基から回収したBMP−9蛋白を、同
時に生成する他の蛋白性物質および存在する他の汚染物
質から単離することにより精製する。
ヒト・BMP−9ヌクレオチドおよびアミノ酸配列を配
列番号:8および9に示す。成熟したヒト・BMP−9は、
1(Ser、Ala、Gly)〜110番目(Arg)のアミノ酸から
なると考えられる。
列番号:8および9に示す。成熟したヒト・BMP−9は、
1(Ser、Ala、Gly)〜110番目(Arg)のアミノ酸から
なると考えられる。
ヒト・BMP−9を、配列番号:8に示した124〜453番目
のヌクレオチドからなるDNA配列で形質転換された細胞
を培養すること、および同時に生成される他の蛋白性物
質を実質的に含まない配列番号:9の1〜110番目のアミ
ノ酸配列により特徴づけられる蛋白を培地から回収し精
製することにより得てもよい。
のヌクレオチドからなるDNA配列で形質転換された細胞
を培養すること、および同時に生成される他の蛋白性物
質を実質的に含まない配列番号:9の1〜110番目のアミ
ノ酸配列により特徴づけられる蛋白を培地から回収し精
製することにより得てもよい。
BMP−9蛋白を、軟骨形成誘導能により特徴づけても
よい。BMP−9を、さらに、骨形成誘導能により特徴づ
けてもよい。さらに、BMP−9を、下記のラットの骨形
成試験における骨および/または軟骨形成活性を示す能
力により特徴づけてもよい。
よい。BMP−9を、さらに、骨形成誘導能により特徴づ
けてもよい。さらに、BMP−9を、下記のラットの骨形
成試験における骨および/または軟骨形成活性を示す能
力により特徴づけてもよい。
また、本発明により提供されるBMP−9蛋白は、図1
および図3(配列番号:1および8)の配列と同様の配列
によりコードされている因子を含むが、その修飾は、そ
の中へ自然に導入されるか(例えば、ポリペプチド中の
アミノ酸の変化を生じるヌクレオチド配列中の相同的変
異)または計画的に遺伝子操作により導入される。例え
ば、合成ポリペプチドが、図1または図3(配列番号:2
または9)の全部または一部において重複した連続的な
アミノ酸配列を有していてもよい。これらの配列は、1
次、2次または3次構造およびコンフォーメーション上
の特徴を図1および図3の骨成長因子のポリペプチドと
共有することにより、それらに共通した骨成長因子の生
物学的特性を持ちうる。よって、それらを、天然に存在
するBMP−9および他のBMP−9ポリペプチドの生物学的
活性のある代用物として、治療方法に用いてもよい。
および図3(配列番号:1および8)の配列と同様の配列
によりコードされている因子を含むが、その修飾は、そ
の中へ自然に導入されるか(例えば、ポリペプチド中の
アミノ酸の変化を生じるヌクレオチド配列中の相同的変
異)または計画的に遺伝子操作により導入される。例え
ば、合成ポリペプチドが、図1または図3(配列番号:2
または9)の全部または一部において重複した連続的な
アミノ酸配列を有していてもよい。これらの配列は、1
次、2次または3次構造およびコンフォーメーション上
の特徴を図1および図3の骨成長因子のポリペプチドと
共有することにより、それらに共通した骨成長因子の生
物学的特性を持ちうる。よって、それらを、天然に存在
するBMP−9および他のBMP−9ポリペプチドの生物学的
活性のある代用物として、治療方法に用いてもよい。
本明細書記載のBMP−9蛋白配列の他の特異滴突然変
異は、糖鎖付加部位の修飾を包含する。これらの修飾は
O−結合型またはN−結合型糖鎖付加部位を含んでいて
もよい。例えば、糖鎖付加がないこと、あるいはごく部
分的な糖鎖付加は、アスパラギン結合糖鎖付加認識部位
におけるアミノ酸の置換または欠失による。アスパラギ
ン結合糖鎖付加認識部位は、細胞の適当な糖鎖付加酵素
により特異的に認識されるトリペプチド配列からなる。
これらのトリペプチド配列は、アスパラギン−X−スレ
オニンまたはアスパラギン−X−セリンのいずれかであ
り、ここにXは通常いかなるアミノ酸であってもよい。
糖鎖付加認識部位の1番目または3番目のアミノ酸のう
ちの1個または両方における種々のアミノ酸置換あるい
は欠失(および/または2番目のアミノ酸の欠失)は、
当該修飾トリペプチド配列において糖鎖付加を生じな
い。
異は、糖鎖付加部位の修飾を包含する。これらの修飾は
O−結合型またはN−結合型糖鎖付加部位を含んでいて
もよい。例えば、糖鎖付加がないこと、あるいはごく部
分的な糖鎖付加は、アスパラギン結合糖鎖付加認識部位
におけるアミノ酸の置換または欠失による。アスパラギ
ン結合糖鎖付加認識部位は、細胞の適当な糖鎖付加酵素
により特異的に認識されるトリペプチド配列からなる。
これらのトリペプチド配列は、アスパラギン−X−スレ
オニンまたはアスパラギン−X−セリンのいずれかであ
り、ここにXは通常いかなるアミノ酸であってもよい。
糖鎖付加認識部位の1番目または3番目のアミノ酸のう
ちの1個または両方における種々のアミノ酸置換あるい
は欠失(および/または2番目のアミノ酸の欠失)は、
当該修飾トリペプチド配列において糖鎖付加を生じな
い。
本発明はまた、他の蛋白性物質をコードしているDAN
配列に連結していない新規DNA配列を包含し、該配列
は、BMP−9蛋白の発現をコードしている。これらのDNA
配列は、図1または図3(配列番号:1および8)に5'か
ら3'方向に示されたものを含み、緊縮条件下でそれらと
ハイブリダイズし(ティー・マニアティス(T.Maniati
s)ら,モレキュラー・クローニング(ア・ラボラトリ
ー・マニュアル)(Molecular Cloning(A Laboratory
Manual),コールド・スプリング・ハーバー・ラボラト
リー(Cold Spring Harbor Laboratory)(1982年),38
7〜389頁参照)、かつ軟骨および/または骨誘導活性を
有する蛋白をコードしている。
配列に連結していない新規DNA配列を包含し、該配列
は、BMP−9蛋白の発現をコードしている。これらのDNA
配列は、図1または図3(配列番号:1および8)に5'か
ら3'方向に示されたものを含み、緊縮条件下でそれらと
ハイブリダイズし(ティー・マニアティス(T.Maniati
s)ら,モレキュラー・クローニング(ア・ラボラトリ
ー・マニュアル)(Molecular Cloning(A Laboratory
Manual),コールド・スプリング・ハーバー・ラボラト
リー(Cold Spring Harbor Laboratory)(1982年),38
7〜389頁参照)、かつ軟骨および/または骨誘導活性を
有する蛋白をコードしている。
同様に、図1または図3の配列によりコードされたBM
P−9蛋白についてコードしているが、遺伝暗号の縮重
あるいは相同的変異(特定の遺伝子におけるアミノ酸変
化を生じない自然に生じる塩基変化)によりコドンに相
違を生じたDNA配列もまた、本明細書記載の新規因子を
コードしている。点突然変異または誘導的修飾(挿入、
欠失および置換を含む)を生じさせて、その活性、半減
期あるいはコードされたポリペプチド生産を増加させた
図1または図3(配列番号:1および8)のDNA配列の変
化もまた本発明の範囲内である。
P−9蛋白についてコードしているが、遺伝暗号の縮重
あるいは相同的変異(特定の遺伝子におけるアミノ酸変
化を生じない自然に生じる塩基変化)によりコドンに相
違を生じたDNA配列もまた、本明細書記載の新規因子を
コードしている。点突然変異または誘導的修飾(挿入、
欠失および置換を含む)を生じさせて、その活性、半減
期あるいはコードされたポリペプチド生産を増加させた
図1または図3(配列番号:1および8)のDNA配列の変
化もまた本発明の範囲内である。
本発明の別の態様は、BMP−9蛋白の新規製法を提供
する。本発明方法は、既知の調節配列の制御下、本発明
のBMP−9蛋白をコードしているDNA配列により形質転換
された適当な細胞系を培養することを包含する。形質転
換された細胞を培養し、BMP−9蛋白を培養基から回収
し精製する。該精製蛋白は、他の汚染物質のみならず同
時に生成される他の蛋白を実質的に含有しない。
する。本発明方法は、既知の調節配列の制御下、本発明
のBMP−9蛋白をコードしているDNA配列により形質転換
された適当な細胞系を培養することを包含する。形質転
換された細胞を培養し、BMP−9蛋白を培養基から回収
し精製する。該精製蛋白は、他の汚染物質のみならず同
時に生成される他の蛋白を実質的に含有しない。
適当な細胞または細胞系は、チャイニーズ・ハムスタ
ーの卵巣細胞(CHO)のごとき哺乳動物細胞であってよ
い。適当な哺乳動物宿主細胞の選択および形質転換、培
養、増幅、検索、生成物の生産ならびに精製のための方
法は、当該分野において知られている。ゲシング(Geth
ing)およびサムブルック(Sambrook),ネイチャー(N
ature),第293巻,620〜625頁(1981年)あるいはその
代わりにカウフマン(Kaufman)ら,モレキュラー・ア
ンド・セルラー・バイオロジー(Mol.Cell.Biol.),第
5巻,第7号,1750〜1759頁(1958年)またはハウリー
(Howley)らの米国特許第4,419,446号参照。以下の実
施例記載のもう1つの適当な哺乳動物細胞系は、サル・
COS−1細胞系である。哺乳動物細胞CV−1もまた適当
である。
ーの卵巣細胞(CHO)のごとき哺乳動物細胞であってよ
い。適当な哺乳動物宿主細胞の選択および形質転換、培
養、増幅、検索、生成物の生産ならびに精製のための方
法は、当該分野において知られている。ゲシング(Geth
ing)およびサムブルック(Sambrook),ネイチャー(N
ature),第293巻,620〜625頁(1981年)あるいはその
代わりにカウフマン(Kaufman)ら,モレキュラー・ア
ンド・セルラー・バイオロジー(Mol.Cell.Biol.),第
5巻,第7号,1750〜1759頁(1958年)またはハウリー
(Howley)らの米国特許第4,419,446号参照。以下の実
施例記載のもう1つの適当な哺乳動物細胞系は、サル・
COS−1細胞系である。哺乳動物細胞CV−1もまた適当
である。
細菌細胞もまた適当な宿主である。例えば、種々のイ
ー・コリ(E.coli)株(例えば、HB101株、MC1061株)
は、バイオテクノロジーの分野ではよく知られた宿主細
胞である。種々のバシルス・ズブチリス(B.subtili
s)、シュードモナス(Pseudomonas)、他のバシルス属
およびそれに類する菌株もまた本方法に使用できる。
ー・コリ(E.coli)株(例えば、HB101株、MC1061株)
は、バイオテクノロジーの分野ではよく知られた宿主細
胞である。種々のバシルス・ズブチリス(B.subtili
s)、シュードモナス(Pseudomonas)、他のバシルス属
およびそれに類する菌株もまた本方法に使用できる。
当業者に知られた多くの酵母細胞菌株もまた、本発明
ポリペプチド発現用宿主細胞として入手可能である。さ
らに、所望であれば、昆虫細胞も本発明方法の宿主細胞
として用いることができる。ミラー(Miller)ら,ジェ
ネティック・エンジニアリング(Genetic Engineerin
g),第8巻,227〜298頁(プレナム・プレス(Prenum P
ress)(1986年))およびその中で引用された文献参
照。
ポリペプチド発現用宿主細胞として入手可能である。さ
らに、所望であれば、昆虫細胞も本発明方法の宿主細胞
として用いることができる。ミラー(Miller)ら,ジェ
ネティック・エンジニアリング(Genetic Engineerin
g),第8巻,227〜298頁(プレナム・プレス(Prenum P
ress)(1986年))およびその中で引用された文献参
照。
本発明のもう1つの態様は、これらの新規BMP−9ポ
リペプチドの発現方法に用いるベクターを提供する。好
ましくは、該ベクターが、本発明の新規因子をコードし
ている上記新規DNA配列全体を含むものとする。さら
に、該ベクターもまた、BMP−9蛋白配列を発現させる
適当な発現調節配列を含むものとする。別法として、上
述のごとき修飾配列を含むベクターもまた、本発明の具
体例である。該ベクターを細胞系の形質転換に用いても
よく、該ベクターが、選択された宿主細胞における複数
および発現をつかさどることができる本発明のDNA暗号
配列に作動可能に連結した選択された調節配列を含んで
いてもよい。かかるベクターの調節配列は当業者に知ら
れており、宿主細胞に応じて選択することができる。か
かる選択は通常のものであって、本発明の一部を形成す
るものではない。
リペプチドの発現方法に用いるベクターを提供する。好
ましくは、該ベクターが、本発明の新規因子をコードし
ている上記新規DNA配列全体を含むものとする。さら
に、該ベクターもまた、BMP−9蛋白配列を発現させる
適当な発現調節配列を含むものとする。別法として、上
述のごとき修飾配列を含むベクターもまた、本発明の具
体例である。該ベクターを細胞系の形質転換に用いても
よく、該ベクターが、選択された宿主細胞における複数
および発現をつかさどることができる本発明のDNA暗号
配列に作動可能に連結した選択された調節配列を含んで
いてもよい。かかるベクターの調節配列は当業者に知ら
れており、宿主細胞に応じて選択することができる。か
かる選択は通常のものであって、本発明の一部を形成す
るものではない。
骨が正常に形成されない環境において、軟骨および/
または骨の形成を誘導する本発明蛋白を、ヒトや他の動
物における骨折および軟骨欠損の治療に適用する。BMP
−9を用いたかかる組成物を、解放骨折のみならず閉鎖
骨折ならびに人工関節の固定化の改善において、予防的
に利用してもよい。骨形成性物質により誘導されるデ・
ノボ(de novo)骨形成は、先天的に、外傷によりある
いは腫瘍切除により誘発される頭蓋と顔の中隔欠損の修
復に貢献し、また整形・形成外科においても有用であ
る。BMP−9蛋白を、歯周病の治療および他の歯の治療
方法に用いてもよい。かかる物質は、骨形成細胞を引き
寄せ、骨形成細胞の成長を刺激し、あるいは骨形成細胞
の前駆細胞の分化を誘導するための環境を提供しうる。
本発明のBMP−9ポリペプチドは骨粗鬆症の治療にも有
用である。種々の骨形成性、軟骨誘導性および骨誘導性
因子が記載されている。それを検討するには欧州特許出
願第148,155号および第169,016号を参照。
または骨の形成を誘導する本発明蛋白を、ヒトや他の動
物における骨折および軟骨欠損の治療に適用する。BMP
−9を用いたかかる組成物を、解放骨折のみならず閉鎖
骨折ならびに人工関節の固定化の改善において、予防的
に利用してもよい。骨形成性物質により誘導されるデ・
ノボ(de novo)骨形成は、先天的に、外傷によりある
いは腫瘍切除により誘発される頭蓋と顔の中隔欠損の修
復に貢献し、また整形・形成外科においても有用であ
る。BMP−9蛋白を、歯周病の治療および他の歯の治療
方法に用いてもよい。かかる物質は、骨形成細胞を引き
寄せ、骨形成細胞の成長を刺激し、あるいは骨形成細胞
の前駆細胞の分化を誘導するための環境を提供しうる。
本発明のBMP−9ポリペプチドは骨粗鬆症の治療にも有
用である。種々の骨形成性、軟骨誘導性および骨誘導性
因子が記載されている。それを検討するには欧州特許出
願第148,155号および第169,016号を参照。
本発明蛋白を、傷の治療および関連組織の修復に用い
てもよい。傷の形態は熱傷、切開および潰瘍を含むが、
これらに限定されない(例えば、傷の治療および関連組
織の修復の議論のためにはPCT公開WO84/01106号参
照)。
てもよい。傷の形態は熱傷、切開および潰瘍を含むが、
これらに限定されない(例えば、傷の治療および関連組
織の修復の議論のためにはPCT公開WO84/01106号参
照)。
さらに、本発明蛋白は、神経の生存を増加させ、それ
ゆえ、移植および神経の生存の減少を示す症状の治療に
有用であると考えられている。
ゆえ、移植および神経の生存の減少を示す症状の治療に
有用であると考えられている。
本発明のさらなる態様は、骨折および軟骨および/ま
たは骨の欠損あるいは歯周病に関連する他の症状の治療
のための方法ならびに組成物である。本発明はさらに、
傷の治療および組織の修復のための治療方法および組成
物を包含する。かかる組成物は、医薬上許容される担
体、賦形剤またはマトリックスとの混合物としての少な
くとも1種の本発明BMP−9蛋白の治療的有効量からな
る。
たは骨の欠損あるいは歯周病に関連する他の症状の治療
のための方法ならびに組成物である。本発明はさらに、
傷の治療および組織の修復のための治療方法および組成
物を包含する。かかる組成物は、医薬上許容される担
体、賦形剤またはマトリックスとの混合物としての少な
くとも1種の本発明BMP−9蛋白の治療的有効量からな
る。
本発明蛋白が、他の関連蛋白および成長因子と関連し
てあるいはおそらく共同的に作用しうると期待される。
それゆえ、本発明のさらなる治療方法および組成物は、
上記共同出願に開示された他のBMP蛋白の治療的有効量
を伴った少なくとも1種の本発明BMP−9蛋白の治療的
有効量からなる。かかる混合物が、BMP蛋白の個々の分
子あるいは異なるBMP分子の一部分からなる異形分子か
らなっていてもよい。例えば、本発明方法および組成物
が、BMP−9蛋白サブユニットおよび上記「BMP」蛋白の
1つに由来するサブユニットからなるジスルフィド結合
した二量体からなっていてもよい。さらなる具体例は、
BMP−9の一部分のヘテロ二量体を包含する。さらに、
対象となる骨/および/または軟骨欠損、傷あるいは組
織の治療に有益である他の薬剤とBMP−9蛋白とを組み
合わせてもよい。これらの薬剤は、上皮成長因子(EG
F)、血小板由来の成長因子(PDGF)、形質転換成長因
子(TGF−αおよびTGF−β)およびインシュリン様成長
因子(IGF)のごとき種々の成長因子を包含する。
てあるいはおそらく共同的に作用しうると期待される。
それゆえ、本発明のさらなる治療方法および組成物は、
上記共同出願に開示された他のBMP蛋白の治療的有効量
を伴った少なくとも1種の本発明BMP−9蛋白の治療的
有効量からなる。かかる混合物が、BMP蛋白の個々の分
子あるいは異なるBMP分子の一部分からなる異形分子か
らなっていてもよい。例えば、本発明方法および組成物
が、BMP−9蛋白サブユニットおよび上記「BMP」蛋白の
1つに由来するサブユニットからなるジスルフィド結合
した二量体からなっていてもよい。さらなる具体例は、
BMP−9の一部分のヘテロ二量体を包含する。さらに、
対象となる骨/および/または軟骨欠損、傷あるいは組
織の治療に有益である他の薬剤とBMP−9蛋白とを組み
合わせてもよい。これらの薬剤は、上皮成長因子(EG
F)、血小板由来の成長因子(PDGF)、形質転換成長因
子(TGF−αおよびTGF−β)およびインシュリン様成長
因子(IGF)のごとき種々の成長因子を包含する。
pH、等張性、安定性等に関するかかる生理学的に許容
される蛋白組成物の調製および処方は、当該分野の技術
的範囲内である。該治療用組成物は、BMP蛋白の種特異
性が乏しいために、目下、獣医学的な応用にも重要とな
っている。ヒトの他には、特に、家畜およびサラブレッ
ドの馬が、本発明BMP−9蛋白でのかかる治療の望まし
い対象である。
される蛋白組成物の調製および処方は、当該分野の技術
的範囲内である。該治療用組成物は、BMP蛋白の種特異
性が乏しいために、目下、獣医学的な応用にも重要とな
っている。ヒトの他には、特に、家畜およびサラブレッ
ドの馬が、本発明BMP−9蛋白でのかかる治療の望まし
い対象である。
該治療方法は、移植片または器具による該組成物の局
所的、全身的あるいは局部的投与を包含する。投与の際
には、本発明で使用する該治療用組成物は、勿論、発熱
原がなく生理学的に許容される形態である。さらに、該
組成物を、望ましくは、カプセルに入れるか、または粘
性のある形態として注入して骨、軟骨あるいは組織損傷
部位に到達させる。局所的投与は傷の治療および組織修
復に適するであろう。BMP−9以外の治療上有用な薬剤
を、所望により上記組成物に含有させてもよく、本発明
方法において、別法としてあるいは付加的に該BMP組成
物とともに同時または連続的に投与してもよい。
所的、全身的あるいは局部的投与を包含する。投与の際
には、本発明で使用する該治療用組成物は、勿論、発熱
原がなく生理学的に許容される形態である。さらに、該
組成物を、望ましくは、カプセルに入れるか、または粘
性のある形態として注入して骨、軟骨あるいは組織損傷
部位に到達させる。局所的投与は傷の治療および組織修
復に適するであろう。BMP−9以外の治療上有用な薬剤
を、所望により上記組成物に含有させてもよく、本発明
方法において、別法としてあるいは付加的に該BMP組成
物とともに同時または連続的に投与してもよい。
好ましくは、骨および/または軟骨形成のためには、
該組成物が、骨および/または軟骨損傷部位にBMP−9
あるいは他のBMP蛋白を送達し、骨および軟骨の成長に
適した構造を提供し、最適に体内に再吸収されるマトリ
ックスを含有するものとする。該マトリックスは、BMP
−9を徐々に放出し、そして/あるいはその機能発現に
適した環境を提供しうるものである。かかるマトリック
スを、他の体内移植用外用薬に直ちに用いる材料の形態
としてもよい。
該組成物が、骨および/または軟骨損傷部位にBMP−9
あるいは他のBMP蛋白を送達し、骨および軟骨の成長に
適した構造を提供し、最適に体内に再吸収されるマトリ
ックスを含有するものとする。該マトリックスは、BMP
−9を徐々に放出し、そして/あるいはその機能発現に
適した環境を提供しうるものである。かかるマトリック
スを、他の体内移植用外用薬に直ちに用いる材料の形態
としてもよい。
マトリックス材料の選択を、生体適合性、生分解性、
機械的特性、美容的外観および界面特性に基づいて行
う。BMP−9組成物の特殊な応用は,適当な処方を決定
するであろう。当該組成物に都合のよいマトリックス
は、生分解性であり化学的に性質の分かっている硫酸カ
ルシウム、りん酸三カルシウム、ヒドロキシアパタイ
ト、ポリ乳酸およびポリ無水物である。他の都合のよい
材料は、骨または皮膚コラーゲンのごとき生分解性であ
り生物学的に性質のよく分かっているものである。さら
に、マトリックスは純粋な蛋白または細胞外マトリック
ス成分からなる。他の都合のよいマトリックスは、焼結
ヒドロキシアパタイト、バイオグラス、アルミン酸塩あ
るいは他のセラミックスのごとき非生分解性であり化学
的に性質の分かっているものである。マトリックスが、
ポリ乳酸およびヒドロキシアパタイト、またはコラーゲ
ンおよびりん酸三カルシウムのごとき上述したいずれか
の形態の材料の混合物からなっていてもよい。カルシウ
ム−アルミン酸塩−りん酸中のごとき組成物中において
バイオセラミックスを変更し、孔のサイズ、粒子のサイ
ズ、粒子の形態および生分解性を変化させてもよい。
機械的特性、美容的外観および界面特性に基づいて行
う。BMP−9組成物の特殊な応用は,適当な処方を決定
するであろう。当該組成物に都合のよいマトリックス
は、生分解性であり化学的に性質の分かっている硫酸カ
ルシウム、りん酸三カルシウム、ヒドロキシアパタイ
ト、ポリ乳酸およびポリ無水物である。他の都合のよい
材料は、骨または皮膚コラーゲンのごとき生分解性であ
り生物学的に性質のよく分かっているものである。さら
に、マトリックスは純粋な蛋白または細胞外マトリック
ス成分からなる。他の都合のよいマトリックスは、焼結
ヒドロキシアパタイト、バイオグラス、アルミン酸塩あ
るいは他のセラミックスのごとき非生分解性であり化学
的に性質の分かっているものである。マトリックスが、
ポリ乳酸およびヒドロキシアパタイト、またはコラーゲ
ンおよびりん酸三カルシウムのごとき上述したいずれか
の形態の材料の混合物からなっていてもよい。カルシウ
ム−アルミン酸塩−りん酸中のごとき組成物中において
バイオセラミックスを変更し、孔のサイズ、粒子のサイ
ズ、粒子の形態および生分解性を変化させてもよい。
担当医師は、BMP−9蛋白の作用を調節する種々の因
子、例えば、形成されることが望まれる骨の重量、骨の
損傷部位、損傷した骨の状態、傷の大きさ、損傷組織の
形態、患者の年令、性別、食事、何等かの感染症の重篤
性、投薬期間および他の医療上の因子を考慮したうえで
投薬規則を決定する。再構成に使用するマトリックスの
形態および組成物中のBMP蛋白の形態により薬用量を変
更してもよい。最終組成物へのIGF−I(インシュリン
様成長因子I)のごとき他の知られた成長因子の添加も
また、薬用量に影響しうる。骨の成長および/または修
復を、例えば、X線、組織形態的分析およびテトラサイ
クリン標識のごとき定期的な分析により、経過をモニタ
ーする。
子、例えば、形成されることが望まれる骨の重量、骨の
損傷部位、損傷した骨の状態、傷の大きさ、損傷組織の
形態、患者の年令、性別、食事、何等かの感染症の重篤
性、投薬期間および他の医療上の因子を考慮したうえで
投薬規則を決定する。再構成に使用するマトリックスの
形態および組成物中のBMP蛋白の形態により薬用量を変
更してもよい。最終組成物へのIGF−I(インシュリン
様成長因子I)のごとき他の知られた成長因子の添加も
また、薬用量に影響しうる。骨の成長および/または修
復を、例えば、X線、組織形態的分析およびテトラサイ
クリン標識のごとき定期的な分析により、経過をモニタ
ーする。
以下の実施例は、ネズミ・BMP−9蛋白の回収ならび
に特徴付け、およびネズミ・BMP−9蛋白を用いてヒト
および他のBMP−9蛋白を回収すること、そして該蛋白
を組換え手法により発現させることにおける本発明の実
施を説明する。
に特徴付け、およびネズミ・BMP−9蛋白を用いてヒト
および他のBMP−9蛋白を回収すること、そして該蛋白
を組換え手法により発現させることにおける本発明の実
施を説明する。
実施例I
ネズミ・BMP−9
ラムダZAPベクター(ストラタジーン社製/カタログ
番号935302)中に構築された750,000個のマウス・肝臓c
DNAライブラリーをプレーティングし、複製ニトロセル
ロースレプリカを作成する。図2(配列番号:3)(ヒト
・BMP−4配列)の1330〜1627番目のヌクレオチドに相
当するヒト・BMP−4 DNAを、ランダムプライミング法
(ファインベルグ(Feinberg)ら,アナリティカル・バ
イオケミストリー(Anal.Biochem.),第132巻,6〜13頁
(1983年)により32Pで標識し、60℃のSHB中で双方の組
のフィルターに2〜3日ハイブリダイズさせる。双方の
組のフィルターを、緊縮条件下(4XSSC,0.1%SDS,60
℃)で洗浄する。多くの移し取られた種々の強度のハイ
ブリダイズしている組み換え体(約92個)が観察され
る。50個の最も強くハイブリダイズしている組み換えバ
クテリオファージをプラーク精製し、その挿入物を、製
造者(ストラタジーン社)により記載されたインビボ切
形法に従いブルースクリプト(Bluescript)SK(+/
−)プラスミドに移行させる。数種の組み換え体のDNA
配列分析は、それらが他のBMP蛋白および他のTGF−β族
の蛋白と相同性のある蛋白をコードしていることを示
す。ML14aと命名した1個の組み換え体のDNA配列および
推定アミノ酸配列を図1(配列番号:1)に示す。
番号935302)中に構築された750,000個のマウス・肝臓c
DNAライブラリーをプレーティングし、複製ニトロセル
ロースレプリカを作成する。図2(配列番号:3)(ヒト
・BMP−4配列)の1330〜1627番目のヌクレオチドに相
当するヒト・BMP−4 DNAを、ランダムプライミング法
(ファインベルグ(Feinberg)ら,アナリティカル・バ
イオケミストリー(Anal.Biochem.),第132巻,6〜13頁
(1983年)により32Pで標識し、60℃のSHB中で双方の組
のフィルターに2〜3日ハイブリダイズさせる。双方の
組のフィルターを、緊縮条件下(4XSSC,0.1%SDS,60
℃)で洗浄する。多くの移し取られた種々の強度のハイ
ブリダイズしている組み換え体(約92個)が観察され
る。50個の最も強くハイブリダイズしている組み換えバ
クテリオファージをプラーク精製し、その挿入物を、製
造者(ストラタジーン社)により記載されたインビボ切
形法に従いブルースクリプト(Bluescript)SK(+/
−)プラスミドに移行させる。数種の組み換え体のDNA
配列分析は、それらが他のBMP蛋白および他のTGF−β族
の蛋白と相同性のある蛋白をコードしていることを示
す。ML14aと命名した1個の組み換え体のDNA配列および
推定アミノ酸配列を図1(配列番号:1)に示す。
クローンML14aのヌクレオチド配列は、428個のアミノ
酸からなるBMP−9蛋白をコードしている1284bpのオー
プン・リーディング・フレームを有する。3つのリーデ
ィング・フレームすべてにおける終止コドンを伴う609b
pの5'非翻訳配列が当該暗号配列の前に存在するため
に、コードされている428個のアミノ酸からなるBMP−9
蛋白は、1次翻訳産物であると考えられる。該428個の
アミノ酸配列は、48,000ダルトンの分子量のBMP−9蛋
白を予測させる。
酸からなるBMP−9蛋白をコードしている1284bpのオー
プン・リーディング・フレームを有する。3つのリーデ
ィング・フレームすべてにおける終止コドンを伴う609b
pの5'非翻訳配列が当該暗号配列の前に存在するため
に、コードされている428個のアミノ酸からなるBMP−9
蛋白は、1次翻訳産物であると考えられる。該428個の
アミノ酸配列は、48,000ダルトンの分子量のBMP−9蛋
白を予測させる。
他のBMP蛋白およびTGF−β族の他の蛋白に関する知見
に基づいて、前駆体ポリペプチドが、提案されて意見が
一致している蛋白分解プロセッシング配列Arg−X−X
−Argと一致した多重塩基性配列Arg−Arg−Lys−Argに
おいて開裂されるものと予測される。この位置でのBMP
−9前駆体ポリペプチドの開裂が、319番目のSerの位置
から始まる110個のアミノ酸からなる成熟ペプチドを生
じるのであろう。BMP−9の成熟形態へのプロセッシン
グは、関連蛋白TGF−βのプロッセシング(エル・イー
・ジェントリー(L.E.Gentry)ら,モレキュラー・アン
ド・セルラー・バイオロジー(Moll.Cell.Biol.),第
8巻,4162頁(1988年);アール・デリンク(R.Derync
k)ら,ネイチャー(Nature),第316巻,701頁(1985
年))と類似の機構による二量体化およびN−末端領域
の除去を含むものと考えられる。
に基づいて、前駆体ポリペプチドが、提案されて意見が
一致している蛋白分解プロセッシング配列Arg−X−X
−Argと一致した多重塩基性配列Arg−Arg−Lys−Argに
おいて開裂されるものと予測される。この位置でのBMP
−9前駆体ポリペプチドの開裂が、319番目のSerの位置
から始まる110個のアミノ酸からなる成熟ペプチドを生
じるのであろう。BMP−9の成熟形態へのプロセッシン
グは、関連蛋白TGF−βのプロッセシング(エル・イー
・ジェントリー(L.E.Gentry)ら,モレキュラー・アン
ド・セルラー・バイオロジー(Moll.Cell.Biol.),第
8巻,4162頁(1988年);アール・デリンク(R.Derync
k)ら,ネイチャー(Nature),第316巻,701頁(1985
年))と類似の機構による二量体化およびN−末端領域
の除去を含むものと考えられる。
それゆえ、ネズミ・BMP−9の成熟活性種は、そのサ
ブユニットのそれぞれが319〜428番目のアミノ酸からな
り、推定分子量約12,000ダルトンの2個のポリペプチド
サブユニットのホモ二量体からなると考えられる。さら
なる活性種は、1個目の保存されたシイステイン残基を
含む326〜428番目のアミノ酸からなると考えられる。BM
PおよびTGF−β族の蛋白の他の構成種と同様、BMP−9
蛋白のカルボキシ末端領域は、多くのアミノ末端部分よ
りも高い配列保存性を示す。対応する他のヒト・BMP蛋
白および他のTGF−β族に属する蛋白に対する、システ
インに富むC末端領域(326〜428番目のアミノ酸)にお
けるネズミ・BMP−9蛋白のアミノ酸の同一性のパーセ
ント値は以下のごとくである。BMP−2 53%、BMP−3
43%、BMP−4 53%、BMP−5 55%、BMP−6 55
%、BMP−7 53%、Vgl 50%、GDF−1 43%、TGF−
β1 32%、TGF−β2 34%、TGF−β3 34%、イン
ヒビンβ(B)34%、インヒビンβ(A)42% 実施例II ヒト・BMP−9 ネズミおよびヒトの骨誘導因子遺伝子は、有意に相同
性のあるものと推定される。それゆえ、ネズミの暗号配
列またはその一部をプローブとして用いて、類似のヒト
・軟骨および/または骨蛋白を合成するヒト・細胞系ま
たは組織を検索する。ヒト・ゲノムライブラリー(トー
ル(Toole)ら、上記)を、かかるプローブで検索して
もよく、推定上の可能性のある検体を単離し、DNA配列
を得てもよい。この組み換え体がヒト・BMP−9の一部
をコードしているという証拠は、ネズミ/ヒト蛋白およ
び遺伝子構造の相同性に基づく。
ブユニットのそれぞれが319〜428番目のアミノ酸からな
り、推定分子量約12,000ダルトンの2個のポリペプチド
サブユニットのホモ二量体からなると考えられる。さら
なる活性種は、1個目の保存されたシイステイン残基を
含む326〜428番目のアミノ酸からなると考えられる。BM
PおよびTGF−β族の蛋白の他の構成種と同様、BMP−9
蛋白のカルボキシ末端領域は、多くのアミノ末端部分よ
りも高い配列保存性を示す。対応する他のヒト・BMP蛋
白および他のTGF−β族に属する蛋白に対する、システ
インに富むC末端領域(326〜428番目のアミノ酸)にお
けるネズミ・BMP−9蛋白のアミノ酸の同一性のパーセ
ント値は以下のごとくである。BMP−2 53%、BMP−3
43%、BMP−4 53%、BMP−5 55%、BMP−6 55
%、BMP−7 53%、Vgl 50%、GDF−1 43%、TGF−
β1 32%、TGF−β2 34%、TGF−β3 34%、イン
ヒビンβ(B)34%、インヒビンβ(A)42% 実施例II ヒト・BMP−9 ネズミおよびヒトの骨誘導因子遺伝子は、有意に相同
性のあるものと推定される。それゆえ、ネズミの暗号配
列またはその一部をプローブとして用いて、類似のヒト
・軟骨および/または骨蛋白を合成するヒト・細胞系ま
たは組織を検索する。ヒト・ゲノムライブラリー(トー
ル(Toole)ら、上記)を、かかるプローブで検索して
もよく、推定上の可能性のある検体を単離し、DNA配列
を得てもよい。この組み換え体がヒト・BMP−9の一部
をコードしているという証拠は、ネズミ/ヒト蛋白およ
び遺伝子構造の相同性に基づく。
ヒト・軟骨および/または骨誘導因子分子の一部をコ
ードしているDNAを有する組換えバクテリオファージを
得たならば、該ヒト・暗号配列をプローブとして用い
て、BMP−9を合成するヒト・細胞系または組織を確認
できる。別法として、ネズミの暗号配列をプローブとし
て用いて、かかるヒト・細胞系または組織を確認でき
る。簡単に記載すると、RNAを選択して細胞または組織
から抽出し、ホルムアルデヒドアガロースゲル上で電気
泳動してニトロセルロース上に移行させるかまたはホル
ムアルデヒドと反応させてニトロセルロース上に直接ス
ポットする。ついで、ニトロセルロースを、ネズミまた
はヒト・BMP−9暗号配列由来のプローブとハイブリダ
イズさせる。オリゴ(dT)セルロースクロマトグラフィ
ーによりmRNAを選択し、cDNAを合成し、確立されている
手法(トール(Toole)ら、上記)により、ラムダgt10
またはラムダZAP中にクローン化する。
ードしているDNAを有する組換えバクテリオファージを
得たならば、該ヒト・暗号配列をプローブとして用い
て、BMP−9を合成するヒト・細胞系または組織を確認
できる。別法として、ネズミの暗号配列をプローブとし
て用いて、かかるヒト・細胞系または組織を確認でき
る。簡単に記載すると、RNAを選択して細胞または組織
から抽出し、ホルムアルデヒドアガロースゲル上で電気
泳動してニトロセルロース上に移行させるかまたはホル
ムアルデヒドと反応させてニトロセルロース上に直接ス
ポットする。ついで、ニトロセルロースを、ネズミまた
はヒト・BMP−9暗号配列由来のプローブとハイブリダ
イズさせる。オリゴ(dT)セルロースクロマトグラフィ
ーによりmRNAを選択し、cDNAを合成し、確立されている
手法(トール(Toole)ら、上記)により、ラムダgt10
またはラムダZAP中にクローン化する。
当業者に知られたさらなる方法を用いて本発明のヒト
あるいは他の種のBMP−9蛋白を単離してもよい。
あるいは他の種のBMP−9蛋白を単離してもよい。
A.ヒト・BMP−9 DNAの単離
λFIXベクター(ストラタジーン社、カタログ番号944
201)中に構築された100万個のヒト・ゲノムライブラリ
ーの組み換え体をプレーティングし、複製ニトロセルロ
ースレプリカを作成する。図1(配列番号:1)に示した
1665〜1704番目および1837〜1876番目のヌクレオチド配
列に基づく2種のオリゴヌクレオチドプローブを、自動
DNA合成装置で合成する。これら2種のオリゴヌクレオ
チド配列は以下のごとし。
201)中に構築された100万個のヒト・ゲノムライブラリ
ーの組み換え体をプレーティングし、複製ニトロセルロ
ースレプリカを作成する。図1(配列番号:1)に示した
1665〜1704番目および1837〜1876番目のヌクレオチド配
列に基づく2種のオリゴヌクレオチドプローブを、自動
DNA合成装置で合成する。これら2種のオリゴヌクレオ
チド配列は以下のごとし。
これら2種のオリゴヌクレオチドプローブをγ32P−A
TPで放射性標識し、それぞれを、SHB中、65℃で、1組
の移し取られたニトロセルロースレプリカにハイブリダ
イズさせ、ついで、65℃で1XSSC、0.1%SDSにて洗浄す
る。両方のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズするこ
れらの組み換え体を記録する。3種の可能性のあるハイ
ブリダイズしている組み換え体すべてをプラーク精製
し、バクテリオファージのプレート・ストックを調製
し、それぞれからバクテリオファージDNAを単離する。
これらの組み換え体のうち1種のオリゴヌクレオチドに
ハイブリダイズする領域(HG111と命名)を、1.2kbのPs
t I/Xba I断片に挿入する。この断片をプラスミドベク
ター(pGEM−3)中にサブクローニングし、DNA配列分
析を行う。HG111を、米国メリーランド州、ロックビル
(Rockville)、パークローン・ドライブ(Parklawn Dr
ive)12301番地のATCCに、1992年6月16日に、ブタペス
ト条約の要請に基づき寄託し、受託番号ATCC 75252を
与えられた。このサブクローンをpGEM−111と命名す
る。クローンpGEM−111のDNA配列の一部を図3(配列番
号:8/ヒト・BMP−9配列)に示す。この配列はヒト・BM
P−9の成熟領域全部とそのプロペプチドの一部をコー
ドしている。この配列が予備的なデータからなることに
注意すべきである。詳細には、該プロペプチド領域をさ
らなる分析および特徴付けに供する。例えば、1〜3番
目のヌクレオチド(TGA)は、該配列の予備的な性質で
あるため正しくないかもしれない翻訳終止をコードす
る。pGEM−111(pGEM中にサブクローン化されたHG111の
1.2kbのPst I/Xba I断片)およびHG111の両方に存在す
るさらなる配列が、ヒト・プロペプチド領域のさらなる
アミノ酸をコードしていると予想される。他のBMPおよ
びTGF−βに属する他の蛋白の関する知見に基づいて、
該前駆体ポリペプチドが、提案されている蛋白分解プロ
セッシング配列Arg−X−X−Arg(配列番号:9の−4〜
−1番目のアミノ酸)と一致した多重塩基性配列Arg−A
rg−Lys−Argにおいて開裂されるものと予測される。こ
の位置でのヒト・BMP−9前駆体の開裂は、配列番号:9
の1番目のSer(配列番号:9の124〜126番目のヌクレオ
チドによりコードされる)から始まる110個のアミノ酸
の成熟ペプチドを生じるであろう。ヒト・BMP−9の成
熟形態へのプロセッシングは、関連蛋白TGF−βのプロ
ッセシング(エル・イー・ジェントリー(L.E.Gentry)
ら,モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー
(Mol.Cell.Biol.),第8巻,4162頁(1988年);アー
ル・デリンク(R.Derynck)ら,ネイチャー(Natur
e),第316巻,701頁(1985年))と類似の機構による二
量体化およびN−末端領域の除去を含むと考えられる。
TPで放射性標識し、それぞれを、SHB中、65℃で、1組
の移し取られたニトロセルロースレプリカにハイブリダ
イズさせ、ついで、65℃で1XSSC、0.1%SDSにて洗浄す
る。両方のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズするこ
れらの組み換え体を記録する。3種の可能性のあるハイ
ブリダイズしている組み換え体すべてをプラーク精製
し、バクテリオファージのプレート・ストックを調製
し、それぞれからバクテリオファージDNAを単離する。
これらの組み換え体のうち1種のオリゴヌクレオチドに
ハイブリダイズする領域(HG111と命名)を、1.2kbのPs
t I/Xba I断片に挿入する。この断片をプラスミドベク
ター(pGEM−3)中にサブクローニングし、DNA配列分
析を行う。HG111を、米国メリーランド州、ロックビル
(Rockville)、パークローン・ドライブ(Parklawn Dr
ive)12301番地のATCCに、1992年6月16日に、ブタペス
ト条約の要請に基づき寄託し、受託番号ATCC 75252を
与えられた。このサブクローンをpGEM−111と命名す
る。クローンpGEM−111のDNA配列の一部を図3(配列番
号:8/ヒト・BMP−9配列)に示す。この配列はヒト・BM
P−9の成熟領域全部とそのプロペプチドの一部をコー
ドしている。この配列が予備的なデータからなることに
注意すべきである。詳細には、該プロペプチド領域をさ
らなる分析および特徴付けに供する。例えば、1〜3番
目のヌクレオチド(TGA)は、該配列の予備的な性質で
あるため正しくないかもしれない翻訳終止をコードす
る。pGEM−111(pGEM中にサブクローン化されたHG111の
1.2kbのPst I/Xba I断片)およびHG111の両方に存在す
るさらなる配列が、ヒト・プロペプチド領域のさらなる
アミノ酸をコードしていると予想される。他のBMPおよ
びTGF−βに属する他の蛋白の関する知見に基づいて、
該前駆体ポリペプチドが、提案されている蛋白分解プロ
セッシング配列Arg−X−X−Arg(配列番号:9の−4〜
−1番目のアミノ酸)と一致した多重塩基性配列Arg−A
rg−Lys−Argにおいて開裂されるものと予測される。こ
の位置でのヒト・BMP−9前駆体の開裂は、配列番号:9
の1番目のSer(配列番号:9の124〜126番目のヌクレオ
チドによりコードされる)から始まる110個のアミノ酸
の成熟ペプチドを生じるであろう。ヒト・BMP−9の成
熟形態へのプロセッシングは、関連蛋白TGF−βのプロ
ッセシング(エル・イー・ジェントリー(L.E.Gentry)
ら,モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー
(Mol.Cell.Biol.),第8巻,4162頁(1988年);アー
ル・デリンク(R.Derynck)ら,ネイチャー(Natur
e),第316巻,701頁(1985年))と類似の機構による二
量体化およびN−末端領域の除去を含むと考えられる。
それゆえ、ヒト・BMP−9の成熟活性種は、それぞれ
が配列番号:9の1〜110番目のアミノ酸からなり、推定
分子量約12,000ダルトンの2個のポリペプチドサブユニ
ットのホモ二量体からなると考えられる。さらなる活性
種は、1個目の保存されたシステイン残基が含まれてい
る8〜110番目のアミノ酸からなると考えられる。BMPお
よびTGF−β族の蛋白の他の構成種と同様、ヒト・BMP−
9蛋白のカルボキシ末端領域は、多くのアミノ末端部分
よりも高い配列保存性を示す。対応する他のヒト・BMP
蛋白および他のTGF−β族に属する蛋白に対する、シス
テインに富むC末端領域(8〜110番目のアミノ酸)に
おけるヒト・BMP−9蛋白のアミノ酸の同一性のパーセ
ント値は以下のごとくである。BMP−2 52%、BMP−3
40%、BMP−4 52%、BMP−5 55%、BMP−6 55
%、BMP−7 53%、ネズミ・BMP−9 97%、Vgl 50
%、GDF−1 44%、TGF−β1 32%、TGF−β2 32
%、TGF−β3 32%、インヒビンβ(B)35%、イン
ヒビンβ(A)41%。
が配列番号:9の1〜110番目のアミノ酸からなり、推定
分子量約12,000ダルトンの2個のポリペプチドサブユニ
ットのホモ二量体からなると考えられる。さらなる活性
種は、1個目の保存されたシステイン残基が含まれてい
る8〜110番目のアミノ酸からなると考えられる。BMPお
よびTGF−β族の蛋白の他の構成種と同様、ヒト・BMP−
9蛋白のカルボキシ末端領域は、多くのアミノ末端部分
よりも高い配列保存性を示す。対応する他のヒト・BMP
蛋白および他のTGF−β族に属する蛋白に対する、シス
テインに富むC末端領域(8〜110番目のアミノ酸)に
おけるヒト・BMP−9蛋白のアミノ酸の同一性のパーセ
ント値は以下のごとくである。BMP−2 52%、BMP−3
40%、BMP−4 52%、BMP−5 55%、BMP−6 55
%、BMP−7 53%、ネズミ・BMP−9 97%、Vgl 50
%、GDF−1 44%、TGF−β1 32%、TGF−β2 32
%、TGF−β3 32%、インヒビンβ(B)35%、イン
ヒビンβ(A)41%。
実施例III
ローゼン(Rosen)改変サムパス(Sampath)−レディ
(Reddi)試験 サムパス(Sampath)およびレディ(Reddi),プロシ
ーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・
サイエンシズ・ユーエスエイ(Proc.Natl.Acad.Sci.US
A),第80巻,6591〜6595頁(1983年)記載のラットの骨
形成分析の改変版を用いて、BMP蛋白の骨および/また
は軟骨活性を評価する。この改変法を、本明細書ではロ
ーゼン改変サムパス−レディ試験と称す。サムパス−レ
ディ法のエタノール沈澱ステップを、分析すべきフラク
ションを水に対して透析(成分が溶液ならば)または限
外濾過(成分が懸濁液ならば)することに置き換える。
ついで、該溶液または懸濁液を0.1%TFAに再溶解し、得
られた溶液を20mgのラット・マトリックスに添加する。
該蛋白で処理していない処理をしたと見なしたラットの
マトリックス試料が対照として役立つ。この物質を凍結
し、凍結乾燥し、得られた粉末を#5ゼラチンカプセル
に封入する。該カプセルを、生後21〜49日目のオスのロ
ング・エバンズ(Long Evans)・ラットの胸腹部の皮下
に移植する。7〜14日目に移植物を除去する。それぞれ
の移植物の半分をアルカリホスファターゼ分析(エイ・
エイチ・レディ(A.H.Reddi)ら,プロシーディングス
・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ
・ユーエスエイ(Proc.Natl.Acad.Sci.USA),第69巻,1
601頁(1972年))に用いる。
(Reddi)試験 サムパス(Sampath)およびレディ(Reddi),プロシ
ーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・
サイエンシズ・ユーエスエイ(Proc.Natl.Acad.Sci.US
A),第80巻,6591〜6595頁(1983年)記載のラットの骨
形成分析の改変版を用いて、BMP蛋白の骨および/また
は軟骨活性を評価する。この改変法を、本明細書ではロ
ーゼン改変サムパス−レディ試験と称す。サムパス−レ
ディ法のエタノール沈澱ステップを、分析すべきフラク
ションを水に対して透析(成分が溶液ならば)または限
外濾過(成分が懸濁液ならば)することに置き換える。
ついで、該溶液または懸濁液を0.1%TFAに再溶解し、得
られた溶液を20mgのラット・マトリックスに添加する。
該蛋白で処理していない処理をしたと見なしたラットの
マトリックス試料が対照として役立つ。この物質を凍結
し、凍結乾燥し、得られた粉末を#5ゼラチンカプセル
に封入する。該カプセルを、生後21〜49日目のオスのロ
ング・エバンズ(Long Evans)・ラットの胸腹部の皮下
に移植する。7〜14日目に移植物を除去する。それぞれ
の移植物の半分をアルカリホスファターゼ分析(エイ・
エイチ・レディ(A.H.Reddi)ら,プロシーディングス
・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ
・ユーエスエイ(Proc.Natl.Acad.Sci.USA),第69巻,1
601頁(1972年))に用いる。
移植物のもう半分を固定し、形態学的分析用に処理す
る。1μmのメタクリル酸グリコール切片をフォン・コ
ッサ(Von Kossa)および酸性フクシンで染色し、各移
植物中に存在する誘導された骨および軟骨形成量を記録
する。+1ないし+5なる記号は、新たな骨および/ま
たは軟骨細胞およびマトリックスにより占有された移植
物の各形態学的切片の面積を表す。評点+5は、移植物
の50%以上が、該移植物中の蛋白の直接的な結果として
生産された新たな骨および/または軟骨であることを示
す。+4、+3、+2および+1は、それぞれ40%、30
%、20%および10%以上の移植物が、新たな軟骨および
/または骨を含んでいることを示す。改変評点法におい
ては、各植物からの3つの隣接していない切片を評価
し、平均する。「+/−」は、軟骨または骨がはっきり
と確認されないことを示す。「+1」は、各切片の10%
以上が新たな軟骨または骨であることを示し、「+2」
は25%以上、「+3」は50%以上、「+4」は75%ま
で、「+5」は80%以上であることを表す。「−」は、
移植物が回収されないことを示す。
る。1μmのメタクリル酸グリコール切片をフォン・コ
ッサ(Von Kossa)および酸性フクシンで染色し、各移
植物中に存在する誘導された骨および軟骨形成量を記録
する。+1ないし+5なる記号は、新たな骨および/ま
たは軟骨細胞およびマトリックスにより占有された移植
物の各形態学的切片の面積を表す。評点+5は、移植物
の50%以上が、該移植物中の蛋白の直接的な結果として
生産された新たな骨および/または軟骨であることを示
す。+4、+3、+2および+1は、それぞれ40%、30
%、20%および10%以上の移植物が、新たな軟骨および
/または骨を含んでいることを示す。改変評点法におい
ては、各植物からの3つの隣接していない切片を評価
し、平均する。「+/−」は、軟骨または骨がはっきり
と確認されないことを示す。「+1」は、各切片の10%
以上が新たな軟骨または骨であることを示し、「+2」
は25%以上、「+3」は50%以上、「+4」は75%ま
で、「+5」は80%以上であることを表す。「−」は、
移植物が回収されないことを示す。
マトリックス試料に対するBMP−9含有試料の投薬応
答特性は、形成された骨および/または軟骨量が、試料
中のBMP−9量に応じて増加するということを示すと考
えられる。対照試料は、何ら骨および/または軟骨を生
じないと考えられる。
答特性は、形成された骨および/または軟骨量が、試料
中のBMP−9量に応じて増加するということを示すと考
えられる。対照試料は、何ら骨および/または軟骨を生
じないと考えられる。
上記「BMP」蛋白のごとき他の軟骨および/または骨
誘導蛋白によるのと同様に、形成された骨および/また
は軟骨は、マトリックスによって占有される空間により
物理的に制限されると考えられる。試料を、オートラジ
オグラフィーにより追跡するSDSゲル電気泳動および等
電点フォーカシングによっても分析する。活性は蛋白バ
ンドおよびpIに対応している。特定のフラクション中の
蛋白の純度を測定するために、吸光係数1 OD/mg−cmを
蛋白測定基準として用い、蛋白をSDS PAGE上で泳動
し、ついで、銀染色あるいは放射ヨウ素化してオートラ
ジオグラフィーを行う。
誘導蛋白によるのと同様に、形成された骨および/また
は軟骨は、マトリックスによって占有される空間により
物理的に制限されると考えられる。試料を、オートラジ
オグラフィーにより追跡するSDSゲル電気泳動および等
電点フォーカシングによっても分析する。活性は蛋白バ
ンドおよびpIに対応している。特定のフラクション中の
蛋白の純度を測定するために、吸光係数1 OD/mg−cmを
蛋白測定基準として用い、蛋白をSDS PAGE上で泳動
し、ついで、銀染色あるいは放射ヨウ素化してオートラ
ジオグラフィーを行う。
実施例IV
BMP−9の発現
ネズミ、ヒトまたは他の哺乳動物のBMP−9蛋白を生
産するために、該蛋白をコードしているDNAを適当な発
現ベクターに導入し、慣用的な遺伝子工学の手法によ
り、哺乳動物細胞または他の好ましい真核あるいは原核
宿主に導入する。生物学的に活性のある組換えヒト・BM
P−9のための好ましい発現系は、安定に形質転換され
た哺乳動物細胞であると考えられている。
産するために、該蛋白をコードしているDNAを適当な発
現ベクターに導入し、慣用的な遺伝子工学の手法によ
り、哺乳動物細胞または他の好ましい真核あるいは原核
宿主に導入する。生物学的に活性のある組換えヒト・BM
P−9のための好ましい発現系は、安定に形質転換され
た哺乳動物細胞であると考えられている。
当業者は、図1(配列番号:1)もしくは図3(配列番
号:8)またはBMP−9あるいは他の修飾配列をコードし
ている他のDNA配列およびpCD(オカヤマ(Okayama)
ら,モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー
(Mol.Cell.Biol.),第2巻,161〜170頁(1982
年))、pJL3、pJL4(ゴウ(Gough)ら,エムボー・ジ
ャーナル(EMBO.J.),第4巻,645〜653頁(1985年))
ならびにpMT2 CXMのごとき既知ベクターを用いること
により、哺乳動物発現ベクターを構築できる。
号:8)またはBMP−9あるいは他の修飾配列をコードし
ている他のDNA配列およびpCD(オカヤマ(Okayama)
ら,モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー
(Mol.Cell.Biol.),第2巻,161〜170頁(1982
年))、pJL3、pJL4(ゴウ(Gough)ら,エムボー・ジ
ャーナル(EMBO.J.),第4巻,645〜653頁(1985年))
ならびにpMT2 CXMのごとき既知ベクターを用いること
により、哺乳動物発現ベクターを構築できる。
哺乳動物発現ベクターpMT2 CXMは、p91023(b)
(ウォン(Wong)ら,サイエンス(Science),第228
巻,810〜815頁(1985年))の誘導体であり、p92023
(b)とは異なり、テトラサイクリン耐性遺伝子のかわ
りにアンピシリン耐性遺伝子を有し、さらにcDNAクロー
ン挿入用にXho I部位を有する。pMT2 CXMの機能的構成
要素が記載されており(カウフマン,アール・ジェイ
(Kaufman,R.J.),プロシーディングス・オブ・ナショ
ナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユーエスエー
(Proc.Natl.Acad.Sci.USA),第82巻,689〜693頁(198
5年))、アデノウイルスVA遺伝子、72bpのエンハンサ
ーを含むSV40複製開始点、5'スプライシング部位を含む
アデノウイルス大後期プロモーターならびにアデノウイ
ルス後期mRNA上に存在するアデノウイルス三分節リーダ
ー配列の大部分、3'−スプライス受容部位、DHFR挿入断
片、SV40初期ポリアデニレーション部位およびイー・コ
リ中で増殖するのに必要なpBR322配列を含んでいる。
(ウォン(Wong)ら,サイエンス(Science),第228
巻,810〜815頁(1985年))の誘導体であり、p92023
(b)とは異なり、テトラサイクリン耐性遺伝子のかわ
りにアンピシリン耐性遺伝子を有し、さらにcDNAクロー
ン挿入用にXho I部位を有する。pMT2 CXMの機能的構成
要素が記載されており(カウフマン,アール・ジェイ
(Kaufman,R.J.),プロシーディングス・オブ・ナショ
ナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユーエスエー
(Proc.Natl.Acad.Sci.USA),第82巻,689〜693頁(198
5年))、アデノウイルスVA遺伝子、72bpのエンハンサ
ーを含むSV40複製開始点、5'スプライシング部位を含む
アデノウイルス大後期プロモーターならびにアデノウイ
ルス後期mRNA上に存在するアデノウイルス三分節リーダ
ー配列の大部分、3'−スプライス受容部位、DHFR挿入断
片、SV40初期ポリアデニレーション部位およびイー・コ
リ中で増殖するのに必要なpBR322配列を含んでいる。
プラスミドpMT2 CXMを、米国メリーランド州ロック
ビルのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション
(American Type Culture Collection)に受託番号ATCC
67122の下で寄託されたpMT2−VWFをEcoR I消化するこ
とにより得る。EcoR I消化によりpNT−VWFに存在するcD
NA挿入断片が切除され、直鎖状のpMT2が得られ、これを
ライゲーションしてイー・コリHB101またはDH−5を形
質転換するのに用い、アンピシリン耐性とすることがで
きる。プラスミドpMT2DNAを慣用的方法により調製でき
る。ついで、pMT2 CXMを、ループアウト/イン変異種
生成法(モリナガ(Morinaga)ら,バイオテクノロジー
(Biotechnology),第84巻,636頁(1984年))により
構築する。この方法で、SV40複製開始点およびpMT2エン
ハンサー配列近傍のHind III部位に関連した1075〜1145
番目の塩基を除去する。さらに以下の配列 を1145番目のヌクレオチド部位に挿入する。この配列は
制限エンドクヌレアーゼXho Iの認識部位を有する。pMT
23と命名したpMT2CXM誘導体は、制限エンドヌクレアー
ゼPst I、EcoR I、Sal IおよびXho Iの認識部位を有す
る。プラスミドpMT2 CXMおよびpMT23DNAを、慣用的方
法で調製してもよい。
ビルのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション
(American Type Culture Collection)に受託番号ATCC
67122の下で寄託されたpMT2−VWFをEcoR I消化するこ
とにより得る。EcoR I消化によりpNT−VWFに存在するcD
NA挿入断片が切除され、直鎖状のpMT2が得られ、これを
ライゲーションしてイー・コリHB101またはDH−5を形
質転換するのに用い、アンピシリン耐性とすることがで
きる。プラスミドpMT2DNAを慣用的方法により調製でき
る。ついで、pMT2 CXMを、ループアウト/イン変異種
生成法(モリナガ(Morinaga)ら,バイオテクノロジー
(Biotechnology),第84巻,636頁(1984年))により
構築する。この方法で、SV40複製開始点およびpMT2エン
ハンサー配列近傍のHind III部位に関連した1075〜1145
番目の塩基を除去する。さらに以下の配列 を1145番目のヌクレオチド部位に挿入する。この配列は
制限エンドクヌレアーゼXho Iの認識部位を有する。pMT
23と命名したpMT2CXM誘導体は、制限エンドヌクレアー
ゼPst I、EcoR I、Sal IおよびXho Iの認識部位を有す
る。プラスミドpMT2 CXMおよびpMT23DNAを、慣用的方
法で調製してもよい。
pMT21から誘導されたpEMC2b1もまた本発明の実施に適
当である。pMT21を、pMT−VWF由来のpMT2から誘導す
る。上記のごとく、EcoR I消化によりpMT−VWF中に存在
するcDNA挿入断片を切除し、直鎖状のpMT2を得、これを
ライゲーションしてイー・コリHB101またはDH−5を形
質転換するのに用い、アンピシリン耐性とすることがで
きる。プラスミドpMT2DNAを慣用的方法により調製でき
る。
当である。pMT21を、pMT−VWF由来のpMT2から誘導す
る。上記のごとく、EcoR I消化によりpMT−VWF中に存在
するcDNA挿入断片を切除し、直鎖状のpMT2を得、これを
ライゲーションしてイー・コリHB101またはDH−5を形
質転換するのに用い、アンピシリン耐性とすることがで
きる。プラスミドpMT2DNAを慣用的方法により調製でき
る。
pMT21を、以下の2つの修飾によりpMT2から誘導す
る。最初に、cDNAクローニングのためにG/C尾部由来の
一連の19個のG残基を含むDHFRcDNAの76bpの5'非翻訳領
域を欠失させる。この方法において、Xho I部位を挿入
してDHFRのすぐ上流の下記配列 を得る。次に、EcoR VおよびXba Iによる消化、DNAポリ
メラーゼIのクレノウフラグメントによる処理およびCl
a Iリンカー(CATCGATG)に対するライゲーションによ
り単一Cla I部位を導入する。この方法により、アデノ
ウイルス関連RNA(VAI)領域から250bpが除去される
が、この方法は、VAI RNA遺伝子の発現または機能を妨
害しない。pMT21をEcoR IおよびXho Iで消化し、pEMC2B
1を誘導するのに用いる。
る。最初に、cDNAクローニングのためにG/C尾部由来の
一連の19個のG残基を含むDHFRcDNAの76bpの5'非翻訳領
域を欠失させる。この方法において、Xho I部位を挿入
してDHFRのすぐ上流の下記配列 を得る。次に、EcoR VおよびXba Iによる消化、DNAポリ
メラーゼIのクレノウフラグメントによる処理およびCl
a Iリンカー(CATCGATG)に対するライゲーションによ
り単一Cla I部位を導入する。この方法により、アデノ
ウイルス関連RNA(VAI)領域から250bpが除去される
が、この方法は、VAI RNA遺伝子の発現または機能を妨
害しない。pMT21をEcoR IおよびXho Iで消化し、pEMC2B
1を誘導するのに用いる。
EcoR IおよびPst I消化により、pMT2−ECAT1(エス・
ケイ・ジュング(Jung)ら,ジャーナル・オブ・ウイロ
ロジー(J.Virol),63巻,1651〜1660頁(1989年))か
らEMCVリーダーの一部を得、2752bpの断片を生じさせ
る。この断片をTaq Iで消化し、508bpのEcoR I−Taq I
断片を得、これを低融点アガロースゲル電気泳動で精製
する。68bpのアダプターおよび5'側に突出したTaq I部
位および3'側に突出したXho I部位を有するその相補的
ストランド(下記配列) を合成する。この配列は、763〜827番目のヌクレオチド
のEMCウイルスリーダー配列に合致する。それは、EMCウ
イルスリーダー中の10番目の位置のATGをATTに変更し、
ついで、Xho I部位を導入したものである。pMT21EcoR I
−Xho I断片、EMCウイルスEcoR I−Taq I断片および68b
pのオリゴヌクレオチドアダプターTaq I−Xho Iアダプ
ターについての3種のライゲーションによりベクターpE
MC2β1を得る。
ケイ・ジュング(Jung)ら,ジャーナル・オブ・ウイロ
ロジー(J.Virol),63巻,1651〜1660頁(1989年))か
らEMCVリーダーの一部を得、2752bpの断片を生じさせ
る。この断片をTaq Iで消化し、508bpのEcoR I−Taq I
断片を得、これを低融点アガロースゲル電気泳動で精製
する。68bpのアダプターおよび5'側に突出したTaq I部
位および3'側に突出したXho I部位を有するその相補的
ストランド(下記配列) を合成する。この配列は、763〜827番目のヌクレオチド
のEMCウイルスリーダー配列に合致する。それは、EMCウ
イルスリーダー中の10番目の位置のATGをATTに変更し、
ついで、Xho I部位を導入したものである。pMT21EcoR I
−Xho I断片、EMCウイルスEcoR I−Taq I断片および68b
pのオリゴヌクレオチドアダプターTaq I−Xho Iアダプ
ターについての3種のライゲーションによりベクターpE
MC2β1を得る。
このベクターは、哺乳動物細胞における所望のcDNAの
直接的高レベル発現に適切に関連しているSV40複製開始
点ならびにエンハンサー、アデノウイルス大後期プロモ
ーター、アデノウイルス三分節リーダ配列の大部分のcD
NAコピー、小さなハイブリッド介在配列、SV40ポリアデ
ニレーションシグナルならびにアデノウイルスVA I遺
伝子、DHFRならびにβ−ラクタマーゼマーカーおよびEM
C配列を含んでいる。
直接的高レベル発現に適切に関連しているSV40複製開始
点ならびにエンハンサー、アデノウイルス大後期プロモ
ーター、アデノウイルス三分節リーダ配列の大部分のcD
NAコピー、小さなハイブリッド介在配列、SV40ポリアデ
ニレーションシグナルならびにアデノウイルスVA I遺
伝子、DHFRならびにβ−ラクタマーゼマーカーおよびEM
C配列を含んでいる。
ベクターの構築がBMP−9DNA配列の修飾を包含しても
よい。例えば、暗号領域の5'および3'末端の非暗号ヌク
レオチドを除去ることによりBMP−9 cDNAを修飾でき
る。該欠失非暗号ヌクレオチドを、発現に有利であるこ
とが知られている他の配列により置換してもよく、しな
くてもよい。これらのベクターを、BMP−9蛋白発現の
ための適当な宿主細胞中に形質転換する。
よい。例えば、暗号領域の5'および3'末端の非暗号ヌク
レオチドを除去ることによりBMP−9 cDNAを修飾でき
る。該欠失非暗号ヌクレオチドを、発現に有利であるこ
とが知られている他の配列により置換してもよく、しな
くてもよい。これらのベクターを、BMP−9蛋白発現の
ための適当な宿主細胞中に形質転換する。
当業者は、細菌の配列を伴う暗号配列の横にある哺乳
動物の調節配列を除去あるいは置換することにより、図
1または図3(配列番号:1および8)の配列を処理し、
細菌細胞による細胞内または細胞外発現用細菌ベクター
を調製できる。例えば、該暗号配列をさらに処理するこ
とができる(例えば、他の既知のリンカーにライゲーシ
ョンする、または他の知られた手法で、それより非暗号
配列を除去しあるいはその中のヌクレオチドを変更する
ことにより修飾する)。ついで、ティー・タニグチ(T.
Taniguchi)ら,プロシーディングス・オブ・ナショナ
ル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユーエスエイ
(Proc.Natl.Acad.Sci.USA),第77巻,5230〜5233頁(1
980年)記載のごとき方法を用いて、既知の細菌ベクタ
ー中に該修飾したBMP−9暗号配列を挿入できる。つい
で、この代表的な細菌のベクターを細菌宿主細胞中に形
質転換し、それによりBMP−9蛋白を発現させることが
できる。無菌細胞中のBMP−9蛋白を細胞外に発現させ
る方法に関しては、例えば、欧州特許出願EPA177,343号
参照。
動物の調節配列を除去あるいは置換することにより、図
1または図3(配列番号:1および8)の配列を処理し、
細菌細胞による細胞内または細胞外発現用細菌ベクター
を調製できる。例えば、該暗号配列をさらに処理するこ
とができる(例えば、他の既知のリンカーにライゲーシ
ョンする、または他の知られた手法で、それより非暗号
配列を除去しあるいはその中のヌクレオチドを変更する
ことにより修飾する)。ついで、ティー・タニグチ(T.
Taniguchi)ら,プロシーディングス・オブ・ナショナ
ル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユーエスエイ
(Proc.Natl.Acad.Sci.USA),第77巻,5230〜5233頁(1
980年)記載のごとき方法を用いて、既知の細菌ベクタ
ー中に該修飾したBMP−9暗号配列を挿入できる。つい
で、この代表的な細菌のベクターを細菌宿主細胞中に形
質転換し、それによりBMP−9蛋白を発現させることが
できる。無菌細胞中のBMP−9蛋白を細胞外に発現させ
る方法に関しては、例えば、欧州特許出願EPA177,343号
参照。
昆虫細胞における発現のための昆虫ベクターの構築の
ために、同様の処理を行うことができる(例えば、公開
された欧州特許出願155,476号記載の方法参照)。酵母
細胞による本発明因子の細胞内または細胞外発現のため
に、酵母の調節配列を用いて酵母ベクターを構築するこ
ともできる(例えば、公開されたPCT出願WO86/00639号
および欧州特許出願EPA123,289号記載の方法参照)。
ために、同様の処理を行うことができる(例えば、公開
された欧州特許出願155,476号記載の方法参照)。酵母
細胞による本発明因子の細胞内または細胞外発現のため
に、酵母の調節配列を用いて酵母ベクターを構築するこ
ともできる(例えば、公開されたPCT出願WO86/00639号
および欧州特許出願EPA123,289号記載の方法参照)。
哺乳動物における本発明BMP−9蛋白の高レベルの生
産方法は、異種のBMP−9遺伝子の多重コピーを有する
細胞の構築を包含していてもよい。該異種遺伝子は、例
えばジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)遺伝子のような
増幅可能なマーカーに連結しており、そのマーカーに関
しては、カウフマン(Kaufman)およびシャープ(Shar
p),ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー
(J.Mol.Biol.),第159巻,601〜629頁(1982年)の方
法に従い、増加しつつある遺伝子のコピーを有する細胞
を、メトトレキサン(MTX)濃度を増加させながら行う
増殖に関して選択することができる。このアプローチ
を、多くの異なる細胞形態に用いることができる。
産方法は、異種のBMP−9遺伝子の多重コピーを有する
細胞の構築を包含していてもよい。該異種遺伝子は、例
えばジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)遺伝子のような
増幅可能なマーカーに連結しており、そのマーカーに関
しては、カウフマン(Kaufman)およびシャープ(Shar
p),ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー
(J.Mol.Biol.),第159巻,601〜629頁(1982年)の方
法に従い、増加しつつある遺伝子のコピーを有する細胞
を、メトトレキサン(MTX)濃度を増加させながら行う
増殖に関して選択することができる。このアプローチ
を、多くの異なる細胞形態に用いることができる。
例えば、その発現を可能ならしめている他のプラスミ
ド配列と作動可能に連結した本発明のBMP−9に関するD
NA配列を有するプラスミドおよびDHFR発現プラスミドpA
dA26SV(A)3(カウフマン(Kaufman)およびシャー
プ(Sharp),モレキュラー・アンド・セルラー・バイ
オロジー(Mol.Cell.Biol.),第2巻,1304頁(1982
年))を、りん酸カルシウム共沈およびトランスフェク
ション、エレクトロポーレーションまたはプロトプラス
ト融合をはじめとする種々の方法により、DHFR−欠損CH
O細胞、DUKX−BII中に同時形質導入できる。DHFR発現
形質転換体を、透析ウシ胎児血清を含有するアルファ培
地中での増殖に関して選択し、ついで、カウフマン(Ka
ufman)ら,モレキュラー・アンド・セルラー・バイオ
ロジー(Mol.Cell.Biol.),第5巻,1750頁(1983年)
記載のごとく、MTX(例えば、0.02,0.2,1.0および5μ
Mと連続的段階で)濃度を増加させていく場合の増殖に
よる増幅に関して選択する。形質転換体をクローン化
し、生物学的に活性のあるBMP−9発現を、上記実施例I
II記載のローゼン改変サムパス−レディのラット・骨形
成試験によりモニターする。BMP−9発現はMXT耐性レベ
ルの上昇にともない増加するはずである。[35S]メチ
オニンまたはシステインによるパルスラベリングおよび
ポリアクリルアミドゲル電気泳動のごとき当業者に知ら
れた標準的手法を用いてBMP−9ポリペプチドを特徴づ
ける。同様の方法に従い、他の関連BMP−9蛋白生産を
行うことができる。
ド配列と作動可能に連結した本発明のBMP−9に関するD
NA配列を有するプラスミドおよびDHFR発現プラスミドpA
dA26SV(A)3(カウフマン(Kaufman)およびシャー
プ(Sharp),モレキュラー・アンド・セルラー・バイ
オロジー(Mol.Cell.Biol.),第2巻,1304頁(1982
年))を、りん酸カルシウム共沈およびトランスフェク
ション、エレクトロポーレーションまたはプロトプラス
ト融合をはじめとする種々の方法により、DHFR−欠損CH
O細胞、DUKX−BII中に同時形質導入できる。DHFR発現
形質転換体を、透析ウシ胎児血清を含有するアルファ培
地中での増殖に関して選択し、ついで、カウフマン(Ka
ufman)ら,モレキュラー・アンド・セルラー・バイオ
ロジー(Mol.Cell.Biol.),第5巻,1750頁(1983年)
記載のごとく、MTX(例えば、0.02,0.2,1.0および5μ
Mと連続的段階で)濃度を増加させていく場合の増殖に
よる増幅に関して選択する。形質転換体をクローン化
し、生物学的に活性のあるBMP−9発現を、上記実施例I
II記載のローゼン改変サムパス−レディのラット・骨形
成試験によりモニターする。BMP−9発現はMXT耐性レベ
ルの上昇にともない増加するはずである。[35S]メチ
オニンまたはシステインによるパルスラベリングおよび
ポリアクリルアミドゲル電気泳動のごとき当業者に知ら
れた標準的手法を用いてBMP−9ポリペプチドを特徴づ
ける。同様の方法に従い、他の関連BMP−9蛋白生産を
行うことができる。
A. BMP−9ベクターの構築
本発明のヒト・BMP−9蛋白を生産するために、ヒト
・BMP−9蛋白の成熟領域をコードしているDNA配列を、
ネズミ・BMP−9蛋白のプロペプチド領域をコードして
いるDNA配列に連結してもよい。このネズミ/ヒト・ハ
イブリッドDNA配列を適当な発現ベクター中に挿入し、
慣用的遺伝子工学的手法により、動物細胞または他の好
ましい真核または原核宿主中に導入する。このネズミ/
ヒト・BMP−9を含む発現プラスミドの構築を以下に記
載する。
・BMP−9蛋白の成熟領域をコードしているDNA配列を、
ネズミ・BMP−9蛋白のプロペプチド領域をコードして
いるDNA配列に連結してもよい。このネズミ/ヒト・ハ
イブリッドDNA配列を適当な発現ベクター中に挿入し、
慣用的遺伝子工学的手法により、動物細胞または他の好
ましい真核または原核宿主中に導入する。このネズミ/
ヒト・BMP−9を含む発現プラスミドの構築を以下に記
載する。
105〜470番目のヌクレオチド配列からなるヒト・BMP
−9配列誘導体(配列番号:8)を特異的に増幅する。以
下に示したオリゴヌクレオチド をプライマーとして用いて上記クローンpGEM−111由来
のヒト・BMP−9(配列番号:8)の105〜470番目のヌク
レオチドを増幅する。この方法は、105番目のヌクレオ
チドのすぐ前のヌクレオチド配列ATCGGGCCCCTの挿入お
よび470番目のヌクレオチドのすぐ後のヌクレオチド配
列GAATTCGCTの挿入を生じさせる。これらの配列の付加
は、特異的に増幅されるDNA断片の個々の末端にApa Iお
よびEcoR I制限エンドヌクレアーゼ部位を生じさせる。
得られた374bpのApa I/EcoR I断片を、Apa IおよびEcoR
Iで消化したプラスミドベクターpGEM−7Zf(+)(プ
ロゲマ(Progema)社製,カタログ番号p2251)中にサブ
クローニングする。得られたクローンをphBMP9mex−1
と命名する。
−9配列誘導体(配列番号:8)を特異的に増幅する。以
下に示したオリゴヌクレオチド をプライマーとして用いて上記クローンpGEM−111由来
のヒト・BMP−9(配列番号:8)の105〜470番目のヌク
レオチドを増幅する。この方法は、105番目のヌクレオ
チドのすぐ前のヌクレオチド配列ATCGGGCCCCTの挿入お
よび470番目のヌクレオチドのすぐ後のヌクレオチド配
列GAATTCGCTの挿入を生じさせる。これらの配列の付加
は、特異的に増幅されるDNA断片の個々の末端にApa Iお
よびEcoR I制限エンドヌクレアーゼ部位を生じさせる。
得られた374bpのApa I/EcoR I断片を、Apa IおよびEcoR
Iで消化したプラスミドベクターpGEM−7Zf(+)(プ
ロゲマ(Progema)社製,カタログ番号p2251)中にサブ
クローニングする。得られたクローンをphBMP9mex−1
と命名する。
ネズミ・BMP−9配列(配列番号:1)に基づいて以下
に示したオリゴヌクレオチド配列 を設計し、修飾して上述ネズミ/ヒト・発現プラスミド
の構築を容易にする。これらのオリゴヌクレオチドは、
互いに付加すると該2つの個々の配列のアニーリングを
容易にする相補的配列を含んでおり、下記のような合成
二本鎖DNAリンカー(LINK−1と命名) を形成する。このDNAリンカー(LINK−1)は、哺乳動
物細胞発現系における異種配列の最大発現のみならずネ
ズミ/ヒト・発現プラスミドの構築に必要なそれ以降の
操作を容易にするのに必要な制限エンドヌクレアーゼの
認識配列を有している。より詳細には(ヌクレオチド#
5/LINK−1の番号づけした配列を参照)、1〜11番目の
ヌクレオチドは制限エンドヌクレアーゼBamH IおよびSa
l I認識部位からなっており、11〜15番目のヌクレオチ
ドは哺乳動物細胞発現系において異種配列を最大発現さ
せるものであり、16〜31番目のヌクレオチドは、ネズミ
・BMP−9配列(配列番号:1)の610〜625番目のヌクレ
オチドに対応しており、32〜33番目のヌクレオチドが2
つの隣接制限エンドヌクレアーゼ部位(EcoO109およびX
ba I)の有効な制限的消化を容易ならしめるために挿入
されている。34〜60番目のヌクレオチドは、合成ヌクレ
オチド#5の58番目のヌクレオチドが配列番号1の1539
番目にあるAよりもむしろGであることを除いては、ネ
ズミ・BMP−9配列(配列番号:1)の1515〜1541番目の
ヌクレオチドに対応している。このヌクレオチド変換
は、コードすることが予期されるアミノ酸配列を変更す
ることなく、Apa I制限エンドヌクレアーゼ認識配列を
生ぜしめ、さらなるネズミ/ヒト・ハイブリッド発現プ
ラスミドの操作を容易ならしめる。LINK−1(オリゴヌ
クレオチド#5および#6をアニーリングした二本鎖産
物)を、制限エンドヌクレアーゼApa IおよびBamH Iで
消化したプラスミドベクターpGEM−7Zf(+)中にサブ
クローニングする。これにより、通常はpGEM−7Zf
(+)プラスミドポリリンカーのApa IおよびBamH I部
位の間に存在している配列が、上記LINK−1配列に置き
換わったプラスミドを得る。得られたプラスミドクロー
ンをpBMP−9linkと命名する。
に示したオリゴヌクレオチド配列 を設計し、修飾して上述ネズミ/ヒト・発現プラスミド
の構築を容易にする。これらのオリゴヌクレオチドは、
互いに付加すると該2つの個々の配列のアニーリングを
容易にする相補的配列を含んでおり、下記のような合成
二本鎖DNAリンカー(LINK−1と命名) を形成する。このDNAリンカー(LINK−1)は、哺乳動
物細胞発現系における異種配列の最大発現のみならずネ
ズミ/ヒト・発現プラスミドの構築に必要なそれ以降の
操作を容易にするのに必要な制限エンドヌクレアーゼの
認識配列を有している。より詳細には(ヌクレオチド#
5/LINK−1の番号づけした配列を参照)、1〜11番目の
ヌクレオチドは制限エンドヌクレアーゼBamH IおよびSa
l I認識部位からなっており、11〜15番目のヌクレオチ
ドは哺乳動物細胞発現系において異種配列を最大発現さ
せるものであり、16〜31番目のヌクレオチドは、ネズミ
・BMP−9配列(配列番号:1)の610〜625番目のヌクレ
オチドに対応しており、32〜33番目のヌクレオチドが2
つの隣接制限エンドヌクレアーゼ部位(EcoO109およびX
ba I)の有効な制限的消化を容易ならしめるために挿入
されている。34〜60番目のヌクレオチドは、合成ヌクレ
オチド#5の58番目のヌクレオチドが配列番号1の1539
番目にあるAよりもむしろGであることを除いては、ネ
ズミ・BMP−9配列(配列番号:1)の1515〜1541番目の
ヌクレオチドに対応している。このヌクレオチド変換
は、コードすることが予期されるアミノ酸配列を変更す
ることなく、Apa I制限エンドヌクレアーゼ認識配列を
生ぜしめ、さらなるネズミ/ヒト・ハイブリッド発現プ
ラスミドの操作を容易ならしめる。LINK−1(オリゴヌ
クレオチド#5および#6をアニーリングした二本鎖産
物)を、制限エンドヌクレアーゼApa IおよびBamH Iで
消化したプラスミドベクターpGEM−7Zf(+)中にサブ
クローニングする。これにより、通常はpGEM−7Zf
(+)プラスミドポリリンカーのApa IおよびBamH I部
位の間に存在している配列が、上記LINK−1配列に置き
換わったプラスミドを得る。得られたプラスミドクロー
ンをpBMP−9linkと命名する。
pBMP−9linkを、制限エンドヌクレアーゼBamH Iおよ
びXba Iで消化し、LINK−1の1〜34番目のヌクレオチ
ド(オリゴヌクレオチド#5の番号づけを参照)を除去
する。クローンML14aは、配列番号:1に示した配列から
なる挿入断片からなり、制限エンドヌクレアーゼBamH I
およびXba Iで消化すると、配列番号:1(ネズミ・BMP−
9)の1〜1515番目の配列が除去される。ネズミ・BMP
−9のこのBamH I/Xba I断片をML14aプラスミドクロー
ンの残りの部分から単離し、上記のごとく合成リンカー
配列を除去することにより生じたBamH I/Xba I部位中に
サブクローニングする。得られたクローンをp302と命名
する。
びXba Iで消化し、LINK−1の1〜34番目のヌクレオチ
ド(オリゴヌクレオチド#5の番号づけを参照)を除去
する。クローンML14aは、配列番号:1に示した配列から
なる挿入断片からなり、制限エンドヌクレアーゼBamH I
およびXba Iで消化すると、配列番号:1(ネズミ・BMP−
9)の1〜1515番目の配列が除去される。ネズミ・BMP
−9のこのBamH I/Xba I断片をML14aプラスミドクロー
ンの残りの部分から単離し、上記のごとく合成リンカー
配列を除去することにより生じたBamH I/Xba I部位中に
サブクローニングする。得られたクローンをp302と命名
する。
p302クローンを制限エンドヌクレアーゼEcoO109Iで消
化し、ネズミ・BMP−9配列(配列番号:1)の621〜1515
番目のヌクレオチドおよびLINK−1の35〜59番目のヌク
レオチド(オリゴヌクレオチド#5の番号づけ参照)に
対応するヌクレオチド配列を切形する。上記のごとくA
からGへの変換により作られたApa I制限部位がEcoO109
I認識配列のサブセットであることに注意すべきであ
る。それゆえ、EcoO109Iによるp302の消化は、もともと
存在するネズミのEcoO109I部位(配列番号:1の619〜625
番目に位置)のみならずApa I部位をも開裂させ、上記
配列からなる920bpのEcoO109I/EcoO109I(Apa I)断片
を切形する。この920bpのEcoO109I/EcoO109I(Apa I)
断片を、p302プラスミドグローンの残りの部分から単離
し、同様にEcoO109Iで消化したpBMP−9link中にサブク
ローニングする。LINK−1の2つの隣接するEcoO109Iお
よびXba I制限部位の消化をより完全なものにするため
に、ヌクレオチドGG(オリゴヌクレオチド#5の32〜33
番目)をはじめに作っておき、今度はこれをpBMP−9lin
kの一部とし、Dcmメチレーション認識部位を生じさせる
ことに注意すべきである。制限ヌクレアーゼEcoO109Iは
Dcmメチレーションに感受性があり、それゆえ、制限ヌ
クレアーゼEcoO109Iによるこの配列(オリゴヌクレオチ
ド#5/LINK−1の25〜31番目のヌクレオチド)の開裂が
この部位において防止される。よって、プラスミドクロ
ーンpBMP−9linkを、EcoO109I部位ではなくApa I部位に
おいて、上記のごとく制限エンドヌクレアーゼEcoO109I
で消化することにより開裂させ、LINK−1のEcoO109Iと
Xba I部位との間の配列(オリゴヌクレオチド#5の番
号づけにより定義された32〜55番目)の予期された除去
を防止する。これにより、pBMP−9linkのEcoO109I(Apa
I)部位において、920bpのEcoO109I/Apa I断片の挿入
が起こる。得られたクローンをp318と命名する。
化し、ネズミ・BMP−9配列(配列番号:1)の621〜1515
番目のヌクレオチドおよびLINK−1の35〜59番目のヌク
レオチド(オリゴヌクレオチド#5の番号づけ参照)に
対応するヌクレオチド配列を切形する。上記のごとくA
からGへの変換により作られたApa I制限部位がEcoO109
I認識配列のサブセットであることに注意すべきであ
る。それゆえ、EcoO109Iによるp302の消化は、もともと
存在するネズミのEcoO109I部位(配列番号:1の619〜625
番目に位置)のみならずApa I部位をも開裂させ、上記
配列からなる920bpのEcoO109I/EcoO109I(Apa I)断片
を切形する。この920bpのEcoO109I/EcoO109I(Apa I)
断片を、p302プラスミドグローンの残りの部分から単離
し、同様にEcoO109Iで消化したpBMP−9link中にサブク
ローニングする。LINK−1の2つの隣接するEcoO109Iお
よびXba I制限部位の消化をより完全なものにするため
に、ヌクレオチドGG(オリゴヌクレオチド#5の32〜33
番目)をはじめに作っておき、今度はこれをpBMP−9lin
kの一部とし、Dcmメチレーション認識部位を生じさせる
ことに注意すべきである。制限ヌクレアーゼEcoO109Iは
Dcmメチレーションに感受性があり、それゆえ、制限ヌ
クレアーゼEcoO109Iによるこの配列(オリゴヌクレオチ
ド#5/LINK−1の25〜31番目のヌクレオチド)の開裂が
この部位において防止される。よって、プラスミドクロ
ーンpBMP−9linkを、EcoO109I部位ではなくApa I部位に
おいて、上記のごとく制限エンドヌクレアーゼEcoO109I
で消化することにより開裂させ、LINK−1のEcoO109Iと
Xba I部位との間の配列(オリゴヌクレオチド#5の番
号づけにより定義された32〜55番目)の予期された除去
を防止する。これにより、pBMP−9linkのEcoO109I(Apa
I)部位において、920bpのEcoO109I/Apa I断片の挿入
が起こる。得られたクローンをp318と命名する。
クローンp318を制限エンドヌクレアーゼSal IおよびA
pa Iで消化し、LINK−1の6〜56番目のヌクレオチド
(位置についてはオリゴヌクレオチド#5参照)、ネズ
ミ・BMP−9(配列番号:1)の621〜1515番目のヌクレオ
チドおよびLINK−1(位置についてはオリゴヌクレオチ
ド#5参照)の35〜60番目のヌクレオチドからなる配列
を切形する。得られた上記972bpのSal I/Apa I断片を、
p318プラスミドクローンの残りの部分から単離し、引き
続いての操作に用いる。
pa Iで消化し、LINK−1の6〜56番目のヌクレオチド
(位置についてはオリゴヌクレオチド#5参照)、ネズ
ミ・BMP−9(配列番号:1)の621〜1515番目のヌクレオ
チドおよびLINK−1(位置についてはオリゴヌクレオチ
ド#5参照)の35〜60番目のヌクレオチドからなる配列
を切形する。得られた上記972bpのSal I/Apa I断片を、
p318プラスミドクローンの残りの部分から単離し、引き
続いての操作に用いる。
ヒト・BMP−9蛋白の全成熟領域およびそのプロペプ
チドをコードしているDNA配列を含むクローンphBMP−9m
ex−1(上記)を、制限エンドヌクレアーゼApa Iおよ
びEcoR Iで消化する。これにより、ヒト・BMP−9配列
(配列番号:8)の105〜470番目のヌクレオチドからなる
374bpの断片と、制限エンドヌクレアーゼApa Iならびに
EcoR I認識配列を有するオリゴヌクレオチドプライマー
#3および#4のヌクレオチドとが切形される。この37
4bpのApa I/EcoR I断片を、p318由来の972bpのSal I/Ap
a I断片(上記のごとく単離)に結合し、Sal IおよびEc
oR Iで消化された哺乳動物細胞発現プラスミドpED6(pE
MC2β1誘導体)に連結する。得られたクローンをp324
と命名する。
チドをコードしているDNA配列を含むクローンphBMP−9m
ex−1(上記)を、制限エンドヌクレアーゼApa Iおよ
びEcoR Iで消化する。これにより、ヒト・BMP−9配列
(配列番号:8)の105〜470番目のヌクレオチドからなる
374bpの断片と、制限エンドヌクレアーゼApa Iならびに
EcoR I認識配列を有するオリゴヌクレオチドプライマー
#3および#4のヌクレオチドとが切形される。この37
4bpのApa I/EcoR I断片を、p318由来の972bpのSal I/Ap
a I断片(上記のごとく単離)に結合し、Sal IおよびEc
oR Iで消化された哺乳動物細胞発現プラスミドpED6(pE
MC2β1誘導体)に連結する。得られたクローンをp324
と命名する。
クローンML14a(ネズミ・BMP−9)をEcoO109Iおよび
Xba Iで消化して、配列番号:1の621〜1515番目のヌクレ
オチドからなる断片を得る。
Xba Iで消化して、配列番号:1の621〜1515番目のヌクレ
オチドからなる断片を得る。
以下のオリゴヌクレオチドを自動DNA合成装置にて合
成して結合し、その相補的配列を互いに塩基ペアーとし
(アニーリングし)、LINK−2と命名される合成二本鎖
DNAリンカー LINK−2: を得る。この合成二本鎖DNAリンカー(LINK−2)を、
下記のようにしてSal I(一方の末端)またはEcoO109I
(もう一方の末端)のどちらにも対応する一重鎖末端 を生じるようなやり方でアニーリングする。
成して結合し、その相補的配列を互いに塩基ペアーとし
(アニーリングし)、LINK−2と命名される合成二本鎖
DNAリンカー LINK−2: を得る。この合成二本鎖DNAリンカー(LINK−2)を、
下記のようにしてSal I(一方の末端)またはEcoO109I
(もう一方の末端)のどちらにも対応する一重鎖末端 を生じるようなやり方でアニーリングする。
このLINK−2合成DNAリンカーを、上記ネズミ・BMP−
9(配列番号:1)の621〜1515番目のヌクレオチドから
なる上記895bpのEcoO109I/Xba I断片にライゲーション
する。これにより、915bpのSal I/Xba I断片を得る。
9(配列番号:1)の621〜1515番目のヌクレオチドから
なる上記895bpのEcoO109I/Xba I断片にライゲーション
する。これにより、915bpのSal I/Xba I断片を得る。
クローンp324をSal I/Xba Iで消化して、LINK−1の
6〜56番目のヌクレオチドからなる配列(位置について
はオリゴヌクレオチド#5参照)およびネズミ・BMP−
9(配列番号:1)の612〜1515番目のヌクレオチドから
なる配列を除去する。LINK−1の35〜60番目のヌクレオ
チドからなる配列(位置についてはオリゴヌクレオチド
#5参照)およびphBMP−9mex−1由来の374bpのApa I/
EcoR I断片(ヒト・BMP−9配列)からなる配列はpED6
骨格に結合したままである。LINK−2配列およびネズミ
・BMP−9(配列番号:1)の621〜1515番目のヌクレオチ
ドからなる該915bpのSal I/Xba I断片を、上記したSal
IからXba Iまでの配列を除去したp324クローン中にライ
ゲーションする。
6〜56番目のヌクレオチドからなる配列(位置について
はオリゴヌクレオチド#5参照)およびネズミ・BMP−
9(配列番号:1)の612〜1515番目のヌクレオチドから
なる配列を除去する。LINK−1の35〜60番目のヌクレオ
チドからなる配列(位置についてはオリゴヌクレオチド
#5参照)およびphBMP−9mex−1由来の374bpのApa I/
EcoR I断片(ヒト・BMP−9配列)からなる配列はpED6
骨格に結合したままである。LINK−2配列およびネズミ
・BMP−9(配列番号:1)の621〜1515番目のヌクレオチ
ドからなる該915bpのSal I/Xba I断片を、上記したSal
IからXba Iまでの配列を除去したp324クローン中にライ
ゲーションする。
得られたプラスミドをBMP9fusionと命名する。該プラ
スミドは、LINK−2、ネズミ・BMP−9(配列番号:1)
の612〜1551番目のヌクレオチド、LINK−1の35〜59番
目のヌクレオチドよりなる配列(位置についてはオリゴ
ヌクレオチド#5参照)、および哺乳動物細胞発現ベク
ターpED6のSal IならびにEcoR I部位の間に挿入された
クローンpBMP9mex−1(上記)由来の374bpのApa I/Eco
R I断片からなる。
スミドは、LINK−2、ネズミ・BMP−9(配列番号:1)
の612〜1551番目のヌクレオチド、LINK−1の35〜59番
目のヌクレオチドよりなる配列(位置についてはオリゴ
ヌクレオチド#5参照)、および哺乳動物細胞発現ベク
ターpED6のSal IならびにEcoR I部位の間に挿入された
クローンpBMP9mex−1(上記)由来の374bpのApa I/Eco
R I断片からなる。
BMP9fusionを、当業者に知られた標準的手法を用いて
CHO細胞中に形質転換し、ヒト・BMP−9蛋白を発現でき
る安定な細胞系を造成する。該細胞系を適当な培養条件
下で培養し、BMP−9蛋白を培養基から単離、精製す
る。
CHO細胞中に形質転換し、ヒト・BMP−9蛋白を発現でき
る安定な細胞系を造成する。該細胞系を適当な培養条件
下で培養し、BMP−9蛋白を培養基から単離、精製す
る。
実施例V
発現BMP−9の生物学的活性
上記実施例IVで得られた発現BMP−9蛋白の生物学的
活性を測定するために、該蛋白を細胞培養基から回収
し、他の汚染物質と同様に同時生成される他の蛋白性物
質からBMP−9蛋白を単離することにより精製する。該
精製蛋白を、実施例III記載のラット・骨形成試験によ
り分析してもよい。
活性を測定するために、該蛋白を細胞培養基から回収
し、他の汚染物質と同様に同時生成される他の蛋白性物
質からBMP−9蛋白を単離することにより精製する。該
精製蛋白を、実施例III記載のラット・骨形成試験によ
り分析してもよい。
当業者に知られた標準的な手法を用いて精製を行う。
精製が、他のBMP蛋白に関するのと同様に、ヘパリンセ
ファロースの使用を包含していてもよいと考えられる。
精製が、他のBMP蛋白に関するのと同様に、ヘパリンセ
ファロースの使用を包含していてもよいと考えられる。
銀染色(アール・アール・オークリー(R.R.Oakley)
ら,アナリティカル・バイオケミストリー(Anal.Bioch
em.),第105巻,361頁(1980年))と組み合わせたSDS
−PAGEアクリルアミド(ユー・ケイ・ラエムリ(U.K.La
emmli),ネイチャー(Nature),第227巻,680頁(1970
年))のごとき標準的手法およびイムノブロット(エイ
チ・トウビン(H.Towbin)ら,プロシーディングス・オ
ブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユ
ーエスエイ(Proc.Natl.Acad.Sci.USA),第76巻,4350
頁(1979年))を用いて、蛋白の分析を行う。
ら,アナリティカル・バイオケミストリー(Anal.Bioch
em.),第105巻,361頁(1980年))と組み合わせたSDS
−PAGEアクリルアミド(ユー・ケイ・ラエムリ(U.K.La
emmli),ネイチャー(Nature),第227巻,680頁(1970
年))のごとき標準的手法およびイムノブロット(エイ
チ・トウビン(H.Towbin)ら,プロシーディングス・オ
ブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユ
ーエスエイ(Proc.Natl.Acad.Sci.USA),第76巻,4350
頁(1979年))を用いて、蛋白の分析を行う。
以上の記載は、本発明の好ましい具体例を詳説するも
のである。その実施において、当業者は、これらの記載
を考慮して、多くの改変および変法を思い付くであろ
う。これらの改変および変法は、本明細書に付記した請
求の範囲中に包含されると確信する。
のである。その実施において、当業者は、これらの記載
を考慮して、多くの改変および変法を思い付くであろ
う。これらの改変および変法は、本明細書に付記した請
求の範囲中に包含されると確信する。
配列表
(1)一般的情報:
(i)出願人:ウォズニー,ジョン・エム(Wozney,J
ohn M.)セレステ,アンソニー(Celeste,Anthony) (ii)発明の名称:BMP−9組成物 (iii)配列の数:9 (iv)連絡先: (A)名称:ジェネティックス・インスティテュー
ト・インコーポレイテッド(Genetics Institute,In
c.) (B)通り名:リーガル・アフェアーズ(Legal Af
fairs)−ケンブリッジパーク・ドライブ(CambridgePa
rk Drive)87番 (C)都市名:ケンブリッジ(Cambridge) (D)州名:マサチューセッツ州 (E)国名:アメリカ合衆国 (F)郵便番号:02140 (v)コンピューター・リーダブル・フォーム(Comp
uter Readable Form): (A)媒体形態:フロッピーディスク (B)コンピューター:IBM PC コンパチブル (C)オペレーティングシステム:PC−DOS/MS−DOS (D)ソフトウェア:パテントイン・リリース(Pa
tentIn Release)#1.0,バージョン#1.25 (vi)現在の出願データ: (A)出願番号:US (B)受理日: (C)分類: (viii)代理人等の情報: (A)氏名:カピノス,エレン・ジェイ(Capinos,
Ellen J) (B)登録番号:32,245 (C)代理人等における処理番号:GI 5186A (ix)テレコミュニケーションの情報: (A)電話番号:(617)876−1170 (B)ファックス番号:(617)876−5851 (2)配列番号:1に関する情報 (i)配列の特徴: (A)配列の長さ:2447塩基対 (B)配列の型:核酸 (C)鎖の数:二本鎖 (D)トポロジー:直鎖状 (ii)配列の種類:mRNAに対するcDNA (iii)ハイポセティカル配列:なし (iv)アンチセンス:なし (vi)起源: (A)生物名:ハツカネズミ(Mus musculus) (B)株名:C57B46xCBA (F)組織の種類:肝臓 (vii)直接の起源: (A)ライブラリー:マウス・肝臓cDNA (B)クローン:ML14A (viii)ゲノム内での位置: (C)単位:塩基対 (ix)配列の特徴 (A)特徴を表す記号:mat peptide (B)存在位置:1564..1893 (ix)配列の特徴 (A)特徴を表す記号:CDS (B)存在位置:610..1896 (ix)配列の特徴 (A)特徴を表す記号:mRNA (B)存在位置:1..2447 (xi)配列の記載:配列番号:1 (2)配列番号:2に関する情報 (i)配列の特徴: (A)配列の長さ:428アミノ酸 (B)配列の型:アミノ酸 (D)トポロジー:直鎖状 (ii)配列の種類:蛋白 (xi)配列の記載:配列番号:2 (2)配列番号:3に関する情報 (i)配列の特徴: (A)配列の長さ:1954塩基対 (B)配列の型:核酸 (C)鎖の数:二本鎖 (D)トポロジー:直鎖状 (ii)配列の種類:mRNAに対するcDNA (iii)ハイポセティカル配列:なし (iv)アンチセンス:なし (vi)起源: (A)生物名:ヒト(Homo sapiens) (G)細胞型:骨肉腫細胞系 (H)細胞系:U−20S (vii)直接の起源: (A)ライブラリー:ラムダ gt10中のU−20S c
DNA (B)クローン:ラムダ U−20S−3 (viii)ゲノム内での位置: (C)単位:塩基対 (ix)配列の特徴 (A)特徴を表す記号:CDS (B)存在位置:403..1629 (ix)配列の特徴 (A)特徴を表す記号:mat peptide (B)存在位置:1279..1626 (ix)配列の特徴 (A)特徴を表す記号:mRNA (B)存在位置:9..1934 (xi)配列の記載:配列番号:3 (2)配列番号:4に関する情報 (i)配列の特徴: (A)配列の長さ:408アミノ酸 (B)配列の型:アミノ酸 (D)トポロジー:直鎖状 (ii)配列の種類:蛋白 (xi)配列の記載:配列番号:4 (2)配列番号:5に関する情報 (i)配列の特徴: (A)配列の長さ:15塩基対 (B)配列の型:核酸 (C)鎖の数:二本鎖 (D)トポロジー:直鎖状 (ii)配列の種類:mRNAに対するcDNA (xi)配列の記載:配列番号:5 (2)配列番号:6に関する情報 (i)配列の特徴: (A)配列の長さ:34塩基対 (B)配列の型:核酸 (C)鎖の数:二本鎖 (D)トポロジー:直鎖状 (ii)配列の種類:mRNAに対するcDNA (xi)配列の記載:配列番号:6 (2)配列番号:7に関する情報 (i)配列の特徴: (A)配列の長さ:68塩基対 (B)配列の型:核酸 (C)鎖の数:二本鎖 (D)トポロジー:直鎖状 (ii)配列の種類:mRNAに対するcDNA (xi)配列の記載:配列番号:7 (2)配列番号:8に関する情報 (i)配列の特徴: (A)配列の長さ:470塩基対 (B)配列の型:核酸 (C)鎖の数:二本鎖 (D)トポロジー:直鎖状 (ii)配列の種類:DNA(ゲノム) (iii)ハイポセティカル配列:なし (v)フラグメント型:C末端フラグメント (vi)起源: (A)生物名:ヒト(Homo sapiens) (H)細胞系:W138(ゲノムDNA) (vii)直接の起源: (A)ライブラリー:ヒト・ゲノム (B)クローン:ラムダ 111−1 (viii)ゲノム内での位置: (C)単位:塩基対 (ix)配列の特徴 (A)特徴を表す記号:exon (B)存在位置:1..470 (ix)配列の特徴 (A)特徴を表す記号:CDS (B)存在位置:1..456 (ix)配列の特徴 (A)特徴を表す記号:mat peptide (B)存在位置:124..453 (ix)配列の特徴 (A)特徴を表す記号:mRNA (B)存在位置:1..470 (xi)配列の記載:配列番号:8 (2)配列番号:9に関する情報 (i)配列の特徴: (A)配列の長さ:151アミノ酸 (B)配列の型:アミノ酸 (D)トポロジー:直鎖状 (ii)配列の種類:蛋白 (xi)配列の記載:配列番号:9
ohn M.)セレステ,アンソニー(Celeste,Anthony) (ii)発明の名称:BMP−9組成物 (iii)配列の数:9 (iv)連絡先: (A)名称:ジェネティックス・インスティテュー
ト・インコーポレイテッド(Genetics Institute,In
c.) (B)通り名:リーガル・アフェアーズ(Legal Af
fairs)−ケンブリッジパーク・ドライブ(CambridgePa
rk Drive)87番 (C)都市名:ケンブリッジ(Cambridge) (D)州名:マサチューセッツ州 (E)国名:アメリカ合衆国 (F)郵便番号:02140 (v)コンピューター・リーダブル・フォーム(Comp
uter Readable Form): (A)媒体形態:フロッピーディスク (B)コンピューター:IBM PC コンパチブル (C)オペレーティングシステム:PC−DOS/MS−DOS (D)ソフトウェア:パテントイン・リリース(Pa
tentIn Release)#1.0,バージョン#1.25 (vi)現在の出願データ: (A)出願番号:US (B)受理日: (C)分類: (viii)代理人等の情報: (A)氏名:カピノス,エレン・ジェイ(Capinos,
Ellen J) (B)登録番号:32,245 (C)代理人等における処理番号:GI 5186A (ix)テレコミュニケーションの情報: (A)電話番号:(617)876−1170 (B)ファックス番号:(617)876−5851 (2)配列番号:1に関する情報 (i)配列の特徴: (A)配列の長さ:2447塩基対 (B)配列の型:核酸 (C)鎖の数:二本鎖 (D)トポロジー:直鎖状 (ii)配列の種類:mRNAに対するcDNA (iii)ハイポセティカル配列:なし (iv)アンチセンス:なし (vi)起源: (A)生物名:ハツカネズミ(Mus musculus) (B)株名:C57B46xCBA (F)組織の種類:肝臓 (vii)直接の起源: (A)ライブラリー:マウス・肝臓cDNA (B)クローン:ML14A (viii)ゲノム内での位置: (C)単位:塩基対 (ix)配列の特徴 (A)特徴を表す記号:mat peptide (B)存在位置:1564..1893 (ix)配列の特徴 (A)特徴を表す記号:CDS (B)存在位置:610..1896 (ix)配列の特徴 (A)特徴を表す記号:mRNA (B)存在位置:1..2447 (xi)配列の記載:配列番号:1 (2)配列番号:2に関する情報 (i)配列の特徴: (A)配列の長さ:428アミノ酸 (B)配列の型:アミノ酸 (D)トポロジー:直鎖状 (ii)配列の種類:蛋白 (xi)配列の記載:配列番号:2 (2)配列番号:3に関する情報 (i)配列の特徴: (A)配列の長さ:1954塩基対 (B)配列の型:核酸 (C)鎖の数:二本鎖 (D)トポロジー:直鎖状 (ii)配列の種類:mRNAに対するcDNA (iii)ハイポセティカル配列:なし (iv)アンチセンス:なし (vi)起源: (A)生物名:ヒト(Homo sapiens) (G)細胞型:骨肉腫細胞系 (H)細胞系:U−20S (vii)直接の起源: (A)ライブラリー:ラムダ gt10中のU−20S c
DNA (B)クローン:ラムダ U−20S−3 (viii)ゲノム内での位置: (C)単位:塩基対 (ix)配列の特徴 (A)特徴を表す記号:CDS (B)存在位置:403..1629 (ix)配列の特徴 (A)特徴を表す記号:mat peptide (B)存在位置:1279..1626 (ix)配列の特徴 (A)特徴を表す記号:mRNA (B)存在位置:9..1934 (xi)配列の記載:配列番号:3 (2)配列番号:4に関する情報 (i)配列の特徴: (A)配列の長さ:408アミノ酸 (B)配列の型:アミノ酸 (D)トポロジー:直鎖状 (ii)配列の種類:蛋白 (xi)配列の記載:配列番号:4 (2)配列番号:5に関する情報 (i)配列の特徴: (A)配列の長さ:15塩基対 (B)配列の型:核酸 (C)鎖の数:二本鎖 (D)トポロジー:直鎖状 (ii)配列の種類:mRNAに対するcDNA (xi)配列の記載:配列番号:5 (2)配列番号:6に関する情報 (i)配列の特徴: (A)配列の長さ:34塩基対 (B)配列の型:核酸 (C)鎖の数:二本鎖 (D)トポロジー:直鎖状 (ii)配列の種類:mRNAに対するcDNA (xi)配列の記載:配列番号:6 (2)配列番号:7に関する情報 (i)配列の特徴: (A)配列の長さ:68塩基対 (B)配列の型:核酸 (C)鎖の数:二本鎖 (D)トポロジー:直鎖状 (ii)配列の種類:mRNAに対するcDNA (xi)配列の記載:配列番号:7 (2)配列番号:8に関する情報 (i)配列の特徴: (A)配列の長さ:470塩基対 (B)配列の型:核酸 (C)鎖の数:二本鎖 (D)トポロジー:直鎖状 (ii)配列の種類:DNA(ゲノム) (iii)ハイポセティカル配列:なし (v)フラグメント型:C末端フラグメント (vi)起源: (A)生物名:ヒト(Homo sapiens) (H)細胞系:W138(ゲノムDNA) (vii)直接の起源: (A)ライブラリー:ヒト・ゲノム (B)クローン:ラムダ 111−1 (viii)ゲノム内での位置: (C)単位:塩基対 (ix)配列の特徴 (A)特徴を表す記号:exon (B)存在位置:1..470 (ix)配列の特徴 (A)特徴を表す記号:CDS (B)存在位置:1..456 (ix)配列の特徴 (A)特徴を表す記号:mat peptide (B)存在位置:124..453 (ix)配列の特徴 (A)特徴を表す記号:mRNA (B)存在位置:1..470 (xi)配列の記載:配列番号:8 (2)配列番号:9に関する情報 (i)配列の特徴: (A)配列の長さ:151アミノ酸 (B)配列の型:アミノ酸 (D)トポロジー:直鎖状 (ii)配列の種類:蛋白 (xi)配列の記載:配列番号:9
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フロントページの続き
(72)発明者 セレステ,アンソニー・ジェイ
アメリカ合衆国マサチューセッツ州
01749、ハドソン、パーカード・ストリ
ート86番
(58)調査した分野(Int.Cl.7,DB名)
C12N 15/09
C07K 14/51
C12P 21/02
SwissProt/PIR/GeneS
eq
GenBank/EMBL/DDBJ/G
eneSeq
BIOSIS/WPI(DIALOG)
Claims (12)
- 【請求項1】図3(配列番号:9)に示す8〜110番目の
アミノ酸配列からなるBMP−9ポリペプチド。 - 【請求項2】図3(配列番号:9)に示す1〜110番目の
アミノ酸配列からなるBMP−9ポリペプチド。 - 【請求項3】各サブユニットが少なくとも図3(配列番
号:9)の8〜110番目のアミノ酸配列からなる二量体で
ある請求項1記載のBMP−9ポリペプチド。 - 【請求項4】各サブユニットが少なくとも図3(配列番
号:9)の1〜110番目のアミノ酸配列からなる二量体で
ある請求項1記載のBMP−9ポリペプチド。 - 【請求項5】(a)図3(配列番号:8)に示す124〜453
番目のヌクレオチド配列からなるcDNAで形質転換された
細胞を培養すること;および (b)図3(配列番号:9)に示す1〜110番目のアミノ
酸配列からなる蛋白を該培養基から回収、精製すること
からなる段階により製造される精製BMP−9蛋白。 - 【請求項6】(a)図3(配列番号:8)に示す124〜453
番目のヌクレオチド配列からなるcDNAで形質転換された
細胞を培養すること;および (b)図3(配列番号:9)に示す8〜110番目のアミノ
酸配列からなる蛋白を該培養基から回収し精製すること
からなる段階により製造される精製BMP−9蛋白。 - 【請求項7】軟骨および/または骨の形成を誘導する能
力により特徴づけられる、配列番号:9の1〜110番目の
アミノ酸からなるBMP−9蛋白。 - 【請求項8】配列番号:9の1〜110番目のアミノ酸から
なるBMP−9蛋白をコードしている、配列番号:8の124〜
453番目のヌクレオチドからなるDNA。 - 【請求項9】(a)124〜453番目のヌクレオチド(配列
番号:8);および (b)上記配列(a)と緊縮ハイブリダイゼーション条
件下でハイブリダイズし、軟骨および/または骨を形成
させる能力を発揮するDNA からなる請求項8記載のDNA。 - 【請求項10】(a)145〜453番目のヌクレオチド(配
列番号:8);および (b)上記配列(a)と緊縮ハイブリダイゼーション条
件下でハイブリダイズし、軟骨および/または骨を形成
させる能力を発揮するDNA からなる請求項8記載のDNA。 - 【請求項11】配列番号:9の1〜110番目のアミノ酸を
含むBMP−9蛋白をコードしている、配列番号:8の124〜
453番目のヌクレオチドからなるDNAで形質転換された宿
主細胞。 - 【請求項12】(a)BMP−9蛋白をコードしているヌ
クレオチド配列からなるcDNAで形質転換された細胞を培
養すること;および (b)該BMP−9蛋白を該培養基から回収し精製するこ
と の段階からなる、配列番号:9の1〜110番目のアミノ酸
からなる精製BMP−9蛋白の製法。
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