JP3485917B2 - Ｂｍｐ−９蛋白 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、BMP−９と命名された精製蛋白の新規な族
およびその製法に関する。これらの蛋白を、骨および／
または軟骨の形成を誘導するために用いることができ、
さらに傷の治療ならびに組織の修復に用いることができ
る。

ネズミ・BMP−９のDNA配列（配列番号:1）およびアミ
ノ酸配列（配列番号:2）を図１に示す。ヒト・BMP−９
の配列を図３（配列番号:8および９）に示す。BMP−９
蛋白は、軟骨および／骨の形成を誘導しうると考えられ
ている。BMP−９蛋白を、以下に記載したラットの骨形
成試験における軟骨および／または骨の形成活性を示す
能力によってさらに特徴づけてもよい。

ネズミ・BMP−９を、図１の319〜428番目からなるア
ミノ酸（配列番号:2、アミノ酸１〜110番目）により特
徴づける。ネズミ・BMP−９を、図１に示した610〜1893
番目のヌクレオチドからなるDNA配列で形質転換された
細胞を培養することにより生成させ、培養基から、同時
に生成される蛋白性物質を実質的に含有しない図１（配
列番号:2）に示す319〜428番目のアミノ酸からなるアミ
ノ酸配列により特徴づけられる蛋白を回収し、精製す
る。

ヒト・BMP−９は、ネズミ・BMP−９と相同的であると
期待され、図３（配列番号:9）の１番目のアミノ酸（Se
r、Ala、Gly）から110番目のアミノ酸（Arg）に至るア
ミノ酸からなる配列により特徴づけられる。本発明は、
ヒト・BMP−９をコードしているDNA配列を得る方法を包
含する。この方法は、ネズミ・BMP−９のヌクレオチド
配列またはその一部を用いることを必要とし、標準的方
法を用いて、ヒト・遺伝子またはその断片について、ラ
イブラリーを検索するためのプローブを設計するもので
ある。ヒト・BMP−９を、該BMP−９のDNA配列で形質転
換された細胞を培養することにより生成させ、培養基か
ら回収して該BMP−９を精製してもよい。発現した蛋白
を単離、回収し、培養基中から精製する。精製された発
現蛋白は、他の汚染源からの蛋白性物質のみならず同時
に生成される他の蛋白性物質を実質的に含まない。該回
収された精製蛋白は、軟骨および／または骨の形成能を
示すと考えられる。さらに、本発明の蛋白を、以下に記
載のラットの骨の形成試験における軟骨および／骨の形
成能によって特徴づけてもよい。

ヒト・BMP−９を、配列番号:8に示した124〜453番目
のヌクレオチドからなるDNA配列により形質転換した細
胞を培養すること、および同時に生成される他の蛋白性
物質を実質的に含んでいない配列番号:9の１〜110番目
のアミノ酸からなる配列により特徴づけられる蛋白を、
培養基から回収し精製することにより得てもよい。

本発明のもう１つの態様は、治療に有効な量のBMP−
９蛋白を医薬上許容される担体または賦形剤中に含む医
薬組成物を提供する。本発明のBMP−９組成物を、軟骨
の形成に用いてもよい。さらに、これらの組成物を、骨
の形成に用いてもよい。BMP−９組成物を、傷の治療お
よび組織の修復に用いてもよい。本発明組成物は、さら
に、BMP−１、BMP−２、BMP−３、BMP−４、BMP−５、B
MP−６およびBMP−７（例えばPCT公開WO88/00205号、WO
89/10409号、WO90/11366号に開示）ならびにBMP−８蛋
白（1991年１月15日付け米国特許出願第07/641,204号、
1990年５月16日付け第07/525,357号および1991年11月20
日付け第07/800,364号に開示）のごとき治療上有用な薬
剤を少なくとも１種含有していてもよい。

本発明組成物は、BMP−９蛋白の他に、上皮成長因子
（EGF）、繊維芽細胞成長因子（FGF）、形質転換成長因
子（TGF−αおよびTGF−β）およびインシュリン様成長
因子（IGF）のごとき成長因子を含む他の治療上有用な
薬剤からなっていてもよい。該組成物はまた、例えば、
該組成物を支持し、骨および／または軟骨成長のための
表面を提供するための適当なマトリックスを含有してい
てもよい。該マトリックスは、骨形成誘導性蛋白を徐々
に遊離させ、そして／またはその機能発現のための適当
な環境を提供しうるものである。

BMP−９組成物を、多くの骨および／または軟骨の欠
損、歯周疾患および種々の傷の治療方法に使用してもよ
い。本発明によれば、これらの方法は、骨および／また
は軟骨の形成、傷の治療あるいは組織の修復を必要とす
る患者に、BMP−９蛋白の有効量を投与することを必要
とする。これらの方法はまた、上記共同出願に開示され
た少なくとも１種の新規BMP蛋白とともに本発明蛋白を
投与することを必要とする。さらに、これらの方法はま
た、EGF、FGF、TGF−α、TGF−βおよびIGFを含む他の
成長因子とともにBMP−９蛋白を投与することを包含す
る。

本発明のさらにもう１つの態様は、BMP−９蛋白の発
現についてコードしているDNA配列である。かかる配列
は、図１（配列番号:1）および図３（配列番号:8）に示
した5'から3'方向へのヌクレオチド配列あるいは図１ま
たは図３のDNA配列と緊縮条件下でハイブリダイズするD
NA配列を含んでおり、軟骨および／または骨の形成を誘
導する能力のある蛋白をコードしている。結局、図１ま
たは図３の配列の相同遺伝子あるいは他の変化は、かか
る核酸の変化が該ペプチド配列の変化を引き起こすか否
かにかかわらず、本発明に包含される。

本発明のさらなる態様は、発現調節配列に作動可能に
連結した上記DNA配列からなるベクターを包含する。こ
れらのベクターを、本発明のBMP−９蛋白生成のための
新規方法に用いてもよい。該新規方法においては、BMP
−９蛋白の発現調節配列に作動可能に連結したBMP−９
蛋白配列をコードしているDNA配列で形質転換された細
胞系を適当な培地で培養し、BMP−９蛋白を回収し、精
製する。この方法は多くの既知の原核細胞および真核細
胞双方を、該ペプチド発現用宿主細胞として用いること
ができる。

本発明の他の態様および利点は、以下の詳細な説明お
よびその好ましい具体例を考慮すれば明白である。

図面の簡単な説明 図１は、以下にさらに記載されるML14aクローン由来の
ネズミ・BMP−９のDNA配列および推定アミノ酸配列を示
す。

図２は、ラムダU20S−３ ATCC 40342由来のヒト・BMP
−４のDNA配列および推定アミノ酸配列を示す。

図３は、λFIX/H6111 ATCC 75252由来のヒト・BMP−
９のDNA配列および推定アミノ酸配列を示す。

発明の詳細な説明 ネズミ・BMP−９のヌクレオチド配列（配列番号:1）
およびコードされるアミノ酸配列（配列番号:2）を図１
に示す。本発明の精製ネズミ・BMP−９蛋白を、図１
（配列番号:1）の610〜1893番目のヌクレオチドからな
るDNA暗号配列で形質転換された宿主細胞を培養するこ
とにより生成させ、培養基から、当該アミノ酸配列また
は図１（配列番号:2）の319〜428番目のアミノ酸により
表される配列と実質的に相同的な配列を有する蛋白を回
収し精製する。培養基から回収したBMP−９蛋白を、同
時に生成する他の蛋白性物質および存在する他の汚染物
質から単離することにより精製する。

ヒト・BMP−９ヌクレオチドおよびアミノ酸配列を配
列番号:8および９に示す。成熟したヒト・BMP−９は、
１（Ser、Ala、Gly）〜110番目（Arg）のアミノ酸から
なると考えられる。

ヒト・BMP−９を、配列番号:8に示した124〜453番目
のヌクレオチドからなるDNA配列で形質転換された細胞
を培養すること、および同時に生成される他の蛋白性物
質を実質的に含まない配列番号:9の１〜110番目のアミ
ノ酸配列により特徴づけられる蛋白を培地から回収し精
製することにより得てもよい。

BMP−９蛋白を、軟骨形成誘導能により特徴づけても
よい。BMP−９を、さらに、骨形成誘導能により特徴づ
けてもよい。さらに、BMP−９を、下記のラットの骨形
成試験における骨および／または軟骨形成活性を示す能
力により特徴づけてもよい。

また、本発明により提供されるBMP−９蛋白は、図１
および図３（配列番号:1および８）の配列と同様の配列
によりコードされている因子を含むが、その修飾は、そ
の中へ自然に導入されるか（例えば、ポリペプチド中の
アミノ酸の変化を生じるヌクレオチド配列中の相同的変
異）または計画的に遺伝子操作により導入される。例え
ば、合成ポリペプチドが、図１または図３（配列番号:2
または９）の全部または一部において重複した連続的な
アミノ酸配列を有していてもよい。これらの配列は、１
次、２次または３次構造およびコンフォーメーション上
の特徴を図１および図３の骨成長因子のポリペプチドと
共有することにより、それらに共通した骨成長因子の生
物学的特性を持ちうる。よって、それらを、天然に存在
するBMP−９および他のBMP−９ポリペプチドの生物学的
活性のある代用物として、治療方法に用いてもよい。

本明細書記載のBMP−９蛋白配列の他の特異滴突然変
異は、糖鎖付加部位の修飾を包含する。これらの修飾は
Ｏ−結合型またはＮ−結合型糖鎖付加部位を含んでいて
もよい。例えば、糖鎖付加がないこと、あるいはごく部
分的な糖鎖付加は、アスパラギン結合糖鎖付加認識部位
におけるアミノ酸の置換または欠失による。アスパラギ
ン結合糖鎖付加認識部位は、細胞の適当な糖鎖付加酵素
により特異的に認識されるトリペプチド配列からなる。
これらのトリペプチド配列は、アスパラギン−Ｘ−スレ
オニンまたはアスパラギン−Ｘ−セリンのいずれかであ
り、ここにＸは通常いかなるアミノ酸であってもよい。
糖鎖付加認識部位の１番目または３番目のアミノ酸のう
ちの１個または両方における種々のアミノ酸置換あるい
は欠失（および／または２番目のアミノ酸の欠失）は、
当該修飾トリペプチド配列において糖鎖付加を生じな
い。

本発明はまた、他の蛋白性物質をコードしているDAN
配列に連結していない新規DNA配列を包含し、該配列
は、BMP−９蛋白の発現をコードしている。これらのDNA
配列は、図１または図３（配列番号:1および８）に5'か
ら3'方向に示されたものを含み、緊縮条件下でそれらと
ハイブリダイズし（ティー・マニアティス（T.Maniati
s）ら，モレキュラー・クローニング（ア・ラボラトリ
ー・マニュアル）（Molecular Cloning（A Laboratory
Manual），コールド・スプリング・ハーバー・ラボラト
リー（Cold Spring Harbor Laboratory）（1982年）,38
7〜389頁参照）、かつ軟骨および／または骨誘導活性を
有する蛋白をコードしている。

同様に、図１または図３の配列によりコードされたBM
P−９蛋白についてコードしているが、遺伝暗号の縮重
あるいは相同的変異（特定の遺伝子におけるアミノ酸変
化を生じない自然に生じる塩基変化）によりコドンに相
違を生じたDNA配列もまた、本明細書記載の新規因子を
コードしている。点突然変異または誘導的修飾（挿入、
欠失および置換を含む）を生じさせて、その活性、半減
期あるいはコードされたポリペプチド生産を増加させた
図１または図３（配列番号:1および８）のDNA配列の変
化もまた本発明の範囲内である。

本発明の別の態様は、BMP−９蛋白の新規製法を提供
する。本発明方法は、既知の調節配列の制御下、本発明
のBMP−９蛋白をコードしているDNA配列により形質転換
された適当な細胞系を培養することを包含する。形質転
換された細胞を培養し、BMP−９蛋白を培養基から回収
し精製する。該精製蛋白は、他の汚染物質のみならず同
時に生成される他の蛋白を実質的に含有しない。

適当な細胞または細胞系は、チャイニーズ・ハムスタ
ーの卵巣細胞（CHO）のごとき哺乳動物細胞であってよ
い。適当な哺乳動物宿主細胞の選択および形質転換、培
養、増幅、検索、生成物の生産ならびに精製のための方
法は、当該分野において知られている。ゲシング（Geth
ing）およびサムブルック（Sambrook），ネイチャー（N
ature），第293巻,620〜625頁（1981年）あるいはその
代わりにカウフマン（Kaufman）ら，モレキュラー・ア
ンド・セルラー・バイオロジー（Mol.Cell.Biol.），第
５巻，第７号,1750〜1759頁（1958年）またはハウリー
（Howley）らの米国特許第4,419,446号参照。以下の実
施例記載のもう１つの適当な哺乳動物細胞系は、サル・
COS−１細胞系である。哺乳動物細胞CV−１もまた適当
である。

細菌細胞もまた適当な宿主である。例えば、種々のイ
ー・コリ（E.coli）株（例えば、HB101株、MC1061株）
は、バイオテクノロジーの分野ではよく知られた宿主細
胞である。種々のバシルス・ズブチリス（B.subtili
s）、シュードモナス（Pseudomonas）、他のバシルス属
およびそれに類する菌株もまた本方法に使用できる。

当業者に知られた多くの酵母細胞菌株もまた、本発明
ポリペプチド発現用宿主細胞として入手可能である。さ
らに、所望であれば、昆虫細胞も本発明方法の宿主細胞
として用いることができる。ミラー（Miller）ら，ジェ
ネティック・エンジニアリング（Genetic Engineerin
g），第８巻,227〜298頁（プレナム・プレス（Prenum P
ress）（1986年））およびその中で引用された文献参
照。

本発明のもう１つの態様は、これらの新規BMP−９ポ
リペプチドの発現方法に用いるベクターを提供する。好
ましくは、該ベクターが、本発明の新規因子をコードし
ている上記新規DNA配列全体を含むものとする。さら
に、該ベクターもまた、BMP−９蛋白配列を発現させる
適当な発現調節配列を含むものとする。別法として、上
述のごとき修飾配列を含むベクターもまた、本発明の具
体例である。該ベクターを細胞系の形質転換に用いても
よく、該ベクターが、選択された宿主細胞における複数
および発現をつかさどることができる本発明のDNA暗号
配列に作動可能に連結した選択された調節配列を含んで
いてもよい。かかるベクターの調節配列は当業者に知ら
れており、宿主細胞に応じて選択することができる。か
かる選択は通常のものであって、本発明の一部を形成す
るものではない。

骨が正常に形成されない環境において、軟骨および／
または骨の形成を誘導する本発明蛋白を、ヒトや他の動
物における骨折および軟骨欠損の治療に適用する。BMP
−９を用いたかかる組成物を、解放骨折のみならず閉鎖
骨折ならびに人工関節の固定化の改善において、予防的
に利用してもよい。骨形成性物質により誘導されるデ・
ノボ（de novo）骨形成は、先天的に、外傷によりある
いは腫瘍切除により誘発される頭蓋と顔の中隔欠損の修
復に貢献し、また整形・形成外科においても有用であ
る。BMP−９蛋白を、歯周病の治療および他の歯の治療
方法に用いてもよい。かかる物質は、骨形成細胞を引き
寄せ、骨形成細胞の成長を刺激し、あるいは骨形成細胞
の前駆細胞の分化を誘導するための環境を提供しうる。
本発明のBMP−９ポリペプチドは骨粗鬆症の治療にも有
用である。種々の骨形成性、軟骨誘導性および骨誘導性
因子が記載されている。それを検討するには欧州特許出
願第148,155号および第169,016号を参照。

本発明蛋白を、傷の治療および関連組織の修復に用い
てもよい。傷の形態は熱傷、切開および潰瘍を含むが、
これらに限定されない（例えば、傷の治療および関連組
織の修復の議論のためにはPCT公開WO84/01106号参
照）。

さらに、本発明蛋白は、神経の生存を増加させ、それ
ゆえ、移植および神経の生存の減少を示す症状の治療に
有用であると考えられている。

本発明のさらなる態様は、骨折および軟骨および／ま
たは骨の欠損あるいは歯周病に関連する他の症状の治療
のための方法ならびに組成物である。本発明はさらに、
傷の治療および組織の修復のための治療方法および組成
物を包含する。かかる組成物は、医薬上許容される担
体、賦形剤またはマトリックスとの混合物としての少な
くとも１種の本発明BMP−９蛋白の治療的有効量からな
る。

本発明蛋白が、他の関連蛋白および成長因子と関連し
てあるいはおそらく共同的に作用しうると期待される。
それゆえ、本発明のさらなる治療方法および組成物は、
上記共同出願に開示された他のBMP蛋白の治療的有効量
を伴った少なくとも１種の本発明BMP−９蛋白の治療的
有効量からなる。かかる混合物が、BMP蛋白の個々の分
子あるいは異なるBMP分子の一部分からなる異形分子か
らなっていてもよい。例えば、本発明方法および組成物
が、BMP−９蛋白サブユニットおよび上記「BMP」蛋白の
１つに由来するサブユニットからなるジスルフィド結合
した二量体からなっていてもよい。さらなる具体例は、
BMP−９の一部分のヘテロ二量体を包含する。さらに、
対象となる骨／および／または軟骨欠損、傷あるいは組
織の治療に有益である他の薬剤とBMP−９蛋白とを組み
合わせてもよい。これらの薬剤は、上皮成長因子（EG
F）、血小板由来の成長因子（PDGF）、形質転換成長因
子（TGF−αおよびTGF−β）およびインシュリン様成長
因子（IGF）のごとき種々の成長因子を包含する。

pH、等張性、安定性等に関するかかる生理学的に許容
される蛋白組成物の調製および処方は、当該分野の技術
的範囲内である。該治療用組成物は、BMP蛋白の種特異
性が乏しいために、目下、獣医学的な応用にも重要とな
っている。ヒトの他には、特に、家畜およびサラブレッ
ドの馬が、本発明BMP−９蛋白でのかかる治療の望まし
い対象である。

該治療方法は、移植片または器具による該組成物の局
所的、全身的あるいは局部的投与を包含する。投与の際
には、本発明で使用する該治療用組成物は、勿論、発熱
原がなく生理学的に許容される形態である。さらに、該
組成物を、望ましくは、カプセルに入れるか、または粘
性のある形態として注入して骨、軟骨あるいは組織損傷
部位に到達させる。局所的投与は傷の治療および組織修
復に適するであろう。BMP−９以外の治療上有用な薬剤
を、所望により上記組成物に含有させてもよく、本発明
方法において、別法としてあるいは付加的に該BMP組成
物とともに同時または連続的に投与してもよい。

好ましくは、骨および／または軟骨形成のためには、
該組成物が、骨および／または軟骨損傷部位にBMP−９
あるいは他のBMP蛋白を送達し、骨および軟骨の成長に
適した構造を提供し、最適に体内に再吸収されるマトリ
ックスを含有するものとする。該マトリックスは、BMP
−９を徐々に放出し、そして／あるいはその機能発現に
適した環境を提供しうるものである。かかるマトリック
スを、他の体内移植用外用薬に直ちに用いる材料の形態
としてもよい。

マトリックス材料の選択を、生体適合性、生分解性、
機械的特性、美容的外観および界面特性に基づいて行
う。BMP−９組成物の特殊な応用は，適当な処方を決定
するであろう。当該組成物に都合のよいマトリックス
は、生分解性であり化学的に性質の分かっている硫酸カ
ルシウム、りん酸三カルシウム、ヒドロキシアパタイ
ト、ポリ乳酸およびポリ無水物である。他の都合のよい
材料は、骨または皮膚コラーゲンのごとき生分解性であ
り生物学的に性質のよく分かっているものである。さら
に、マトリックスは純粋な蛋白または細胞外マトリック
ス成分からなる。他の都合のよいマトリックスは、焼結
ヒドロキシアパタイト、バイオグラス、アルミン酸塩あ
るいは他のセラミックスのごとき非生分解性であり化学
的に性質の分かっているものである。マトリックスが、
ポリ乳酸およびヒドロキシアパタイト、またはコラーゲ
ンおよびりん酸三カルシウムのごとき上述したいずれか
の形態の材料の混合物からなっていてもよい。カルシウ
ム−アルミン酸塩−りん酸中のごとき組成物中において
バイオセラミックスを変更し、孔のサイズ、粒子のサイ
ズ、粒子の形態および生分解性を変化させてもよい。

担当医師は、BMP−９蛋白の作用を調節する種々の因
子、例えば、形成されることが望まれる骨の重量、骨の
損傷部位、損傷した骨の状態、傷の大きさ、損傷組織の
形態、患者の年令、性別、食事、何等かの感染症の重篤
性、投薬期間および他の医療上の因子を考慮したうえで
投薬規則を決定する。再構成に使用するマトリックスの
形態および組成物中のBMP蛋白の形態により薬用量を変
更してもよい。最終組成物へのIGF−Ｉ（インシュリン
様成長因子Ｉ）のごとき他の知られた成長因子の添加も
また、薬用量に影響しうる。骨の成長および／または修
復を、例えば、Ｘ線、組織形態的分析およびテトラサイ
クリン標識のごとき定期的な分析により、経過をモニタ
ーする。

以下の実施例は、ネズミ・BMP−９蛋白の回収ならび
に特徴付け、およびネズミ・BMP−９蛋白を用いてヒト
および他のBMP−９蛋白を回収すること、そして該蛋白
を組換え手法により発現させることにおける本発明の実
施を説明する。

実施例Ｉ ネズミ・BMP−９ ラムダZAPベクター（ストラタジーン社製／カタログ
番号935302）中に構築された750,000個のマウス・肝臓c
DNAライブラリーをプレーティングし、複製ニトロセル
ロースレプリカを作成する。図２（配列番号:3）（ヒト
・BMP−４配列）の1330〜1627番目のヌクレオチドに相
当するヒト・BMP−４ DNAを、ランダムプライミング法
（ファインベルグ（Feinberg）ら，アナリティカル・バ
イオケミストリー（Anal.Biochem.），第132巻,6〜13頁
（1983年）により³²Pで標識し、60℃のSHB中で双方の組
のフィルターに２〜３日ハイブリダイズさせる。双方の
組のフィルターを、緊縮条件下（4XSSC,0.1％SDS,60
℃）で洗浄する。多くの移し取られた種々の強度のハイ
ブリダイズしている組み換え体（約92個）が観察され
る。50個の最も強くハイブリダイズしている組み換えバ
クテリオファージをプラーク精製し、その挿入物を、製
造者（ストラタジーン社）により記載されたインビボ切
形法に従いブルースクリプト（Bluescript）SK（＋／
−）プラスミドに移行させる。数種の組み換え体のDNA
配列分析は、それらが他のBMP蛋白および他のTGF−β族
の蛋白と相同性のある蛋白をコードしていることを示
す。ML14aと命名した１個の組み換え体のDNA配列および
推定アミノ酸配列を図１（配列番号:1）に示す。

クローンML14aのヌクレオチド配列は、428個のアミノ
酸からなるBMP−９蛋白をコードしている1284bpのオー
プン・リーディング・フレームを有する。３つのリーデ
ィング・フレームすべてにおける終止コドンを伴う609b
pの5'非翻訳配列が当該暗号配列の前に存在するため
に、コードされている428個のアミノ酸からなるBMP−９
蛋白は、１次翻訳産物であると考えられる。該428個の
アミノ酸配列は、48,000ダルトンの分子量のBMP−９蛋
白を予測させる。

他のBMP蛋白およびTGF−β族の他の蛋白に関する知見
に基づいて、前駆体ポリペプチドが、提案されて意見が
一致している蛋白分解プロセッシング配列Arg−Ｘ−Ｘ
−Argと一致した多重塩基性配列Arg−Arg−Lys−Argに
おいて開裂されるものと予測される。この位置でのBMP
−９前駆体ポリペプチドの開裂が、319番目のSerの位置
から始まる110個のアミノ酸からなる成熟ペプチドを生
じるのであろう。BMP−９の成熟形態へのプロセッシン
グは、関連蛋白TGF−βのプロッセシング（エル・イー
・ジェントリー（L.E.Gentry）ら，モレキュラー・アン
ド・セルラー・バイオロジー（Moll.Cell.Biol.），第
８巻,4162頁（1988年）；アール・デリンク（R.Derync
k）ら，ネイチャー（Nature），第316巻,701頁（1985
年））と類似の機構による二量体化およびＮ−末端領域
の除去を含むものと考えられる。

それゆえ、ネズミ・BMP−９の成熟活性種は、そのサ
ブユニットのそれぞれが319〜428番目のアミノ酸からな
り、推定分子量約12,000ダルトンの２個のポリペプチド
サブユニットのホモ二量体からなると考えられる。さら
なる活性種は、１個目の保存されたシイステイン残基を
含む326〜428番目のアミノ酸からなると考えられる。BM
PおよびTGF−β族の蛋白の他の構成種と同様、BMP−９
蛋白のカルボキシ末端領域は、多くのアミノ末端部分よ
りも高い配列保存性を示す。対応する他のヒト・BMP蛋
白および他のTGF−β族に属する蛋白に対する、システ
インに富むＣ末端領域（326〜428番目のアミノ酸）にお
けるネズミ・BMP−９蛋白のアミノ酸の同一性のパーセ
ント値は以下のごとくである。BMP−２ 53％、BMP−３
43％、BMP−４ 53％、BMP−５ 55％、BMP−６ 55
％、BMP−７ 53％、Vgl 50％、GDF−１ 43％、TGF−
β１ 32％、TGF−β２ 34％、TGF−β３ 34％、イン
ヒビンβ（Ｂ）34％、インヒビンβ（Ａ）42％ 実施例II ヒト・BMP−９ ネズミおよびヒトの骨誘導因子遺伝子は、有意に相同
性のあるものと推定される。それゆえ、ネズミの暗号配
列またはその一部をプローブとして用いて、類似のヒト
・軟骨および／または骨蛋白を合成するヒト・細胞系ま
たは組織を検索する。ヒト・ゲノムライブラリー（トー
ル（Toole）ら、上記）を、かかるプローブで検索して
もよく、推定上の可能性のある検体を単離し、DNA配列
を得てもよい。この組み換え体がヒト・BMP−９の一部
をコードしているという証拠は、ネズミ／ヒト蛋白およ
び遺伝子構造の相同性に基づく。

ヒト・軟骨および／または骨誘導因子分子の一部をコ
ードしているDNAを有する組換えバクテリオファージを
得たならば、該ヒト・暗号配列をプローブとして用い
て、BMP−９を合成するヒト・細胞系または組織を確認
できる。別法として、ネズミの暗号配列をプローブとし
て用いて、かかるヒト・細胞系または組織を確認でき
る。簡単に記載すると、RNAを選択して細胞または組織
から抽出し、ホルムアルデヒドアガロースゲル上で電気
泳動してニトロセルロース上に移行させるかまたはホル
ムアルデヒドと反応させてニトロセルロース上に直接ス
ポットする。ついで、ニトロセルロースを、ネズミまた
はヒト・BMP−９暗号配列由来のプローブとハイブリダ
イズさせる。オリゴ（dT）セルロースクロマトグラフィ
ーによりmRNAを選択し、cDNAを合成し、確立されている
手法（トール（Toole）ら、上記）により、ラムダgt10
またはラムダZAP中にクローン化する。

当業者に知られたさらなる方法を用いて本発明のヒト
あるいは他の種のBMP−９蛋白を単離してもよい。

A.ヒト・BMP−９ DNAの単離 λFIXベクター（ストラタジーン社、カタログ番号944
201）中に構築された100万個のヒト・ゲノムライブラリ
ーの組み換え体をプレーティングし、複製ニトロセルロ
ースレプリカを作成する。図１（配列番号:1）に示した
1665〜1704番目および1837〜1876番目のヌクレオチド配
列に基づく２種のオリゴヌクレオチドプローブを、自動
DNA合成装置で合成する。これら２種のオリゴヌクレオ
チド配列は以下のごとし。

これら２種のオリゴヌクレオチドプローブをγ³²P−A
TPで放射性標識し、それぞれを、SHB中、65℃で、１組
の移し取られたニトロセルロースレプリカにハイブリダ
イズさせ、ついで、65℃で1XSSC、0.1％SDSにて洗浄す
る。両方のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズするこ
れらの組み換え体を記録する。３種の可能性のあるハイ
ブリダイズしている組み換え体すべてをプラーク精製
し、バクテリオファージのプレート・ストックを調製
し、それぞれからバクテリオファージDNAを単離する。
これらの組み換え体のうち１種のオリゴヌクレオチドに
ハイブリダイズする領域（HG111と命名）を、1.2kbのPs
t I/Xba I断片に挿入する。この断片をプラスミドベク
ター（pGEM−３）中にサブクローニングし、DNA配列分
析を行う。HG111を、米国メリーランド州、ロックビル
（Rockville）、パークローン・ドライブ（Parklawn Dr
ive）12301番地のATCCに、1992年６月16日に、ブタペス
ト条約の要請に基づき寄託し、受託番号ATCC 75252を
与えられた。このサブクローンをpGEM−111と命名す
る。クローンpGEM−111のDNA配列の一部を図３（配列番
号:8/ヒト・BMP−９配列）に示す。この配列はヒト・BM
P−９の成熟領域全部とそのプロペプチドの一部をコー
ドしている。この配列が予備的なデータからなることに
注意すべきである。詳細には、該プロペプチド領域をさ
らなる分析および特徴付けに供する。例えば、１〜３番
目のヌクレオチド（TGA）は、該配列の予備的な性質で
あるため正しくないかもしれない翻訳終止をコードす
る。pGEM−111（pGEM中にサブクローン化されたHG111の
1.2kbのPst I/Xba I断片）およびHG111の両方に存在す
るさらなる配列が、ヒト・プロペプチド領域のさらなる
アミノ酸をコードしていると予想される。他のBMPおよ
びTGF−βに属する他の蛋白の関する知見に基づいて、
該前駆体ポリペプチドが、提案されている蛋白分解プロ
セッシング配列Arg−Ｘ−Ｘ−Arg（配列番号:9の−４〜
−１番目のアミノ酸）と一致した多重塩基性配列Arg−A
rg−Lys−Argにおいて開裂されるものと予測される。こ
の位置でのヒト・BMP−９前駆体の開裂は、配列番号:9
の１番目のSer（配列番号:9の124〜126番目のヌクレオ
チドによりコードされる）から始まる110個のアミノ酸
の成熟ペプチドを生じるであろう。ヒト・BMP−９の成
熟形態へのプロセッシングは、関連蛋白TGF−βのプロ
ッセシング（エル・イー・ジェントリー（L.E.Gentry）
ら，モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー
（Mol.Cell.Biol.），第８巻,4162頁（1988年）；アー
ル・デリンク（R.Derynck）ら，ネイチャー（Natur
e），第316巻,701頁（1985年））と類似の機構による二
量体化およびＮ−末端領域の除去を含むと考えられる。

それゆえ、ヒト・BMP−９の成熟活性種は、それぞれ
が配列番号:9の１〜110番目のアミノ酸からなり、推定
分子量約12,000ダルトンの２個のポリペプチドサブユニ
ットのホモ二量体からなると考えられる。さらなる活性
種は、１個目の保存されたシステイン残基が含まれてい
る８〜110番目のアミノ酸からなると考えられる。BMPお
よびTGF−β族の蛋白の他の構成種と同様、ヒト・BMP−
９蛋白のカルボキシ末端領域は、多くのアミノ末端部分
よりも高い配列保存性を示す。対応する他のヒト・BMP
蛋白および他のTGF−β族に属する蛋白に対する、シス
テインに富むＣ末端領域（８〜110番目のアミノ酸）に
おけるヒト・BMP−９蛋白のアミノ酸の同一性のパーセ
ント値は以下のごとくである。BMP−２ 52％、BMP−３
40％、BMP−４ 52％、BMP−５ 55％、BMP−６ 55
％、BMP−７ 53％、ネズミ・BMP−９ 97％、Vgl 50
％、GDF−１ 44％、TGF−β１ 32％、TGF−β２ 32
％、TGF−β３ 32％、インヒビンβ（Ｂ）35％、イン
ヒビンβ（Ａ）41％。

実施例III ローゼン（Rosen）改変サムパス（Sampath）−レディ
（Reddi）試験 サムパス（Sampath）およびレディ（Reddi），プロシ
ーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・
サイエンシズ・ユーエスエイ（Proc.Natl.Acad.Sci.US
A），第80巻,6591〜6595頁（1983年）記載のラットの骨
形成分析の改変版を用いて、BMP蛋白の骨および／また
は軟骨活性を評価する。この改変法を、本明細書ではロ
ーゼン改変サムパス−レディ試験と称す。サムパス−レ
ディ法のエタノール沈澱ステップを、分析すべきフラク
ションを水に対して透析（成分が溶液ならば）または限
外濾過（成分が懸濁液ならば）することに置き換える。
ついで、該溶液または懸濁液を0.1％TFAに再溶解し、得
られた溶液を20mgのラット・マトリックスに添加する。
該蛋白で処理していない処理をしたと見なしたラットの
マトリックス試料が対照として役立つ。この物質を凍結
し、凍結乾燥し、得られた粉末を＃５ゼラチンカプセル
に封入する。該カプセルを、生後21〜49日目のオスのロ
ング・エバンズ（Long Evans）・ラットの胸腹部の皮下
に移植する。７〜14日目に移植物を除去する。それぞれ
の移植物の半分をアルカリホスファターゼ分析（エイ・
エイチ・レディ（A.H.Reddi）ら，プロシーディングス
・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ
・ユーエスエイ（Proc.Natl.Acad.Sci.USA），第69巻,1
601頁（1972年））に用いる。

移植物のもう半分を固定し、形態学的分析用に処理す
る。１μｍのメタクリル酸グリコール切片をフォン・コ
ッサ（Von Kossa）および酸性フクシンで染色し、各移
植物中に存在する誘導された骨および軟骨形成量を記録
する。＋１ないし＋５なる記号は、新たな骨および／ま
たは軟骨細胞およびマトリックスにより占有された移植
物の各形態学的切片の面積を表す。評点＋５は、移植物
の50％以上が、該移植物中の蛋白の直接的な結果として
生産された新たな骨および／または軟骨であることを示
す。＋４、＋３、＋２および＋１は、それぞれ40％、30
％、20％および10％以上の移植物が、新たな軟骨および
／または骨を含んでいることを示す。改変評点法におい
ては、各植物からの３つの隣接していない切片を評価
し、平均する。「＋／−」は、軟骨または骨がはっきり
と確認されないことを示す。「＋１」は、各切片の10％
以上が新たな軟骨または骨であることを示し、「＋２」
は25％以上、「＋３」は50％以上、「＋４」は75％ま
で、「＋５」は80％以上であることを表す。「−」は、
移植物が回収されないことを示す。

マトリックス試料に対するBMP−９含有試料の投薬応
答特性は、形成された骨および／または軟骨量が、試料
中のBMP−９量に応じて増加するということを示すと考
えられる。対照試料は、何ら骨および／または軟骨を生
じないと考えられる。

上記「BMP」蛋白のごとき他の軟骨および／または骨
誘導蛋白によるのと同様に、形成された骨および／また
は軟骨は、マトリックスによって占有される空間により
物理的に制限されると考えられる。試料を、オートラジ
オグラフィーにより追跡するSDSゲル電気泳動および等
電点フォーカシングによっても分析する。活性は蛋白バ
ンドおよびpIに対応している。特定のフラクション中の
蛋白の純度を測定するために、吸光係数1 OD/mg−cmを
蛋白測定基準として用い、蛋白をSDS PAGE上で泳動
し、ついで、銀染色あるいは放射ヨウ素化してオートラ
ジオグラフィーを行う。

実施例IV BMP−９の発現 ネズミ、ヒトまたは他の哺乳動物のBMP−９蛋白を生
産するために、該蛋白をコードしているDNAを適当な発
現ベクターに導入し、慣用的な遺伝子工学の手法によ
り、哺乳動物細胞または他の好ましい真核あるいは原核
宿主に導入する。生物学的に活性のある組換えヒト・BM
P−９のための好ましい発現系は、安定に形質転換され
た哺乳動物細胞であると考えられている。

当業者は、図１（配列番号:1）もしくは図３（配列番
号:8）またはBMP−９あるいは他の修飾配列をコードし
ている他のDNA配列およびpCD（オカヤマ（Okayama）
ら，モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー
（Mol.Cell.Biol.），第２巻,161〜170頁（1982
年））、pJL3、pJL4（ゴウ（Gough）ら，エムボー・ジ
ャーナル（EMBO.J.），第４巻,645〜653頁（1985年））
ならびにpMT2 CXMのごとき既知ベクターを用いること
により、哺乳動物発現ベクターを構築できる。

哺乳動物発現ベクターpMT2 CXMは、p91023（ｂ）
（ウォン（Wong）ら，サイエンス（Science），第228
巻,810〜815頁（1985年））の誘導体であり、p92023
（ｂ）とは異なり、テトラサイクリン耐性遺伝子のかわ
りにアンピシリン耐性遺伝子を有し、さらにcDNAクロー
ン挿入用にXho I部位を有する。pMT2 CXMの機能的構成
要素が記載されており（カウフマン，アール・ジェイ
（Kaufman,R.J.），プロシーディングス・オブ・ナショ
ナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユーエスエー
（Proc.Natl.Acad.Sci.USA），第82巻,689〜693頁（198
5年））、アデノウイルスVA遺伝子、72bpのエンハンサ
ーを含むSV40複製開始点、5'スプライシング部位を含む
アデノウイルス大後期プロモーターならびにアデノウイ
ルス後期mRNA上に存在するアデノウイルス三分節リーダ
ー配列の大部分、3'−スプライス受容部位、DHFR挿入断
片、SV40初期ポリアデニレーション部位およびイー・コ
リ中で増殖するのに必要なpBR322配列を含んでいる。

プラスミドpMT2 CXMを、米国メリーランド州ロック
ビルのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション
（American Type Culture Collection）に受託番号ATCC
67122の下で寄託されたpMT2−VWFをEcoR I消化するこ
とにより得る。EcoR I消化によりpNT−VWFに存在するcD
NA挿入断片が切除され、直鎖状のpMT2が得られ、これを
ライゲーションしてイー・コリHB101またはDH−５を形
質転換するのに用い、アンピシリン耐性とすることがで
きる。プラスミドpMT2DNAを慣用的方法により調製でき
る。ついで、pMT2 CXMを、ループアウト／イン変異種
生成法（モリナガ（Morinaga）ら，バイオテクノロジー
（Biotechnology），第84巻,636頁（1984年））により
構築する。この方法で、SV40複製開始点およびpMT2エン
ハンサー配列近傍のHind III部位に関連した1075〜1145
番目の塩基を除去する。さらに以下の配列 を1145番目のヌクレオチド部位に挿入する。この配列は
制限エンドクヌレアーゼXho Iの認識部位を有する。pMT
23と命名したpMT2CXM誘導体は、制限エンドヌクレアー
ゼPst I、EcoR I、Sal IおよびXho Iの認識部位を有す
る。プラスミドpMT2 CXMおよびpMT23DNAを、慣用的方
法で調製してもよい。

pMT21から誘導されたpEMC2b1もまた本発明の実施に適
当である。pMT21を、pMT−VWF由来のpMT2から誘導す
る。上記のごとく、EcoR I消化によりpMT−VWF中に存在
するcDNA挿入断片を切除し、直鎖状のpMT2を得、これを
ライゲーションしてイー・コリHB101またはDH−５を形
質転換するのに用い、アンピシリン耐性とすることがで
きる。プラスミドpMT2DNAを慣用的方法により調製でき
る。

pMT21を、以下の２つの修飾によりpMT2から誘導す
る。最初に、cDNAクローニングのためにG/C尾部由来の
一連の19個のＧ残基を含むDHFRcDNAの76bpの5'非翻訳領
域を欠失させる。この方法において、Xho I部位を挿入
してDHFRのすぐ上流の下記配列 を得る。次に、EcoR VおよびXba Iによる消化、DNAポリ
メラーゼＩのクレノウフラグメントによる処理およびCl
a Iリンカー（CATCGATG）に対するライゲーションによ
り単一Cla I部位を導入する。この方法により、アデノ
ウイルス関連RNA（VAI）領域から250bpが除去される
が、この方法は、VAI RNA遺伝子の発現または機能を妨
害しない。pMT21をEcoR IおよびXho Iで消化し、pEMC2B
1を誘導するのに用いる。

EcoR IおよびPst I消化により、pMT2−ECAT1（エス・
ケイ・ジュング（Jung）ら，ジャーナル・オブ・ウイロ
ロジー（J.Virol）,63巻,1651〜1660頁（1989年））か
らEMCVリーダーの一部を得、2752bpの断片を生じさせ
る。この断片をTaq Iで消化し、508bpのEcoR I−Taq I
断片を得、これを低融点アガロースゲル電気泳動で精製
する。68bpのアダプターおよび5'側に突出したTaq I部
位および3'側に突出したXho I部位を有するその相補的
ストランド（下記配列） を合成する。この配列は、763〜827番目のヌクレオチド
のEMCウイルスリーダー配列に合致する。それは、EMCウ
イルスリーダー中の10番目の位置のATGをATTに変更し、
ついで、Xho I部位を導入したものである。pMT21EcoR I
−Xho I断片、EMCウイルスEcoR I−Taq I断片および68b
pのオリゴヌクレオチドアダプターTaq I−Xho Iアダプ
ターについての３種のライゲーションによりベクターpE
MC2β１を得る。

このベクターは、哺乳動物細胞における所望のcDNAの
直接的高レベル発現に適切に関連しているSV40複製開始
点ならびにエンハンサー、アデノウイルス大後期プロモ
ーター、アデノウイルス三分節リーダ配列の大部分のcD
NAコピー、小さなハイブリッド介在配列、SV40ポリアデ
ニレーションシグナルならびにアデノウイルスVA Ｉ遺
伝子、DHFRならびにβ−ラクタマーゼマーカーおよびEM
C配列を含んでいる。

ベクターの構築がBMP−9DNA配列の修飾を包含しても
よい。例えば、暗号領域の5'および3'末端の非暗号ヌク
レオチドを除去ることによりBMP−９ cDNAを修飾でき
る。該欠失非暗号ヌクレオチドを、発現に有利であるこ
とが知られている他の配列により置換してもよく、しな
くてもよい。これらのベクターを、BMP−９蛋白発現の
ための適当な宿主細胞中に形質転換する。

当業者は、細菌の配列を伴う暗号配列の横にある哺乳
動物の調節配列を除去あるいは置換することにより、図
１または図３（配列番号:1および８）の配列を処理し、
細菌細胞による細胞内または細胞外発現用細菌ベクター
を調製できる。例えば、該暗号配列をさらに処理するこ
とができる（例えば、他の既知のリンカーにライゲーシ
ョンする、または他の知られた手法で、それより非暗号
配列を除去しあるいはその中のヌクレオチドを変更する
ことにより修飾する）。ついで、ティー・タニグチ（T.
Taniguchi）ら，プロシーディングス・オブ・ナショナ
ル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユーエスエイ
（Proc.Natl.Acad.Sci.USA），第77巻,5230〜5233頁（1
980年）記載のごとき方法を用いて、既知の細菌ベクタ
ー中に該修飾したBMP−９暗号配列を挿入できる。つい
で、この代表的な細菌のベクターを細菌宿主細胞中に形
質転換し、それによりBMP−９蛋白を発現させることが
できる。無菌細胞中のBMP−９蛋白を細胞外に発現させ
る方法に関しては、例えば、欧州特許出願EPA177,343号
参照。

昆虫細胞における発現のための昆虫ベクターの構築の
ために、同様の処理を行うことができる（例えば、公開
された欧州特許出願155,476号記載の方法参照）。酵母
細胞による本発明因子の細胞内または細胞外発現のため
に、酵母の調節配列を用いて酵母ベクターを構築するこ
ともできる（例えば、公開されたPCT出願WO86/00639号
および欧州特許出願EPA123,289号記載の方法参照）。

哺乳動物における本発明BMP−９蛋白の高レベルの生
産方法は、異種のBMP−９遺伝子の多重コピーを有する
細胞の構築を包含していてもよい。該異種遺伝子は、例
えばジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR）遺伝子のような
増幅可能なマーカーに連結しており、そのマーカーに関
しては、カウフマン（Kaufman）およびシャープ（Shar
p），ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー
（J.Mol.Biol.），第159巻,601〜629頁（1982年）の方
法に従い、増加しつつある遺伝子のコピーを有する細胞
を、メトトレキサン（MTX）濃度を増加させながら行う
増殖に関して選択することができる。このアプローチ
を、多くの異なる細胞形態に用いることができる。

例えば、その発現を可能ならしめている他のプラスミ
ド配列と作動可能に連結した本発明のBMP−９に関するD
NA配列を有するプラスミドおよびDHFR発現プラスミドpA
dA26SV（Ａ）３（カウフマン（Kaufman）およびシャー
プ（Sharp），モレキュラー・アンド・セルラー・バイ
オロジー（Mol.Cell.Biol.），第２巻,1304頁（1982
年））を、りん酸カルシウム共沈およびトランスフェク
ション、エレクトロポーレーションまたはプロトプラス
ト融合をはじめとする種々の方法により、DHFR−欠損CH
O細胞、DUKX−ＢII中に同時形質導入できる。DHFR発現
形質転換体を、透析ウシ胎児血清を含有するアルファ培
地中での増殖に関して選択し、ついで、カウフマン（Ka
ufman）ら，モレキュラー・アンド・セルラー・バイオ
ロジー（Mol.Cell.Biol.），第５巻,1750頁（1983年）
記載のごとく、MTX（例えば、0.02,0.2,1.0および５μ
Ｍと連続的段階で）濃度を増加させていく場合の増殖に
よる増幅に関して選択する。形質転換体をクローン化
し、生物学的に活性のあるBMP−９発現を、上記実施例I
II記載のローゼン改変サムパス−レディのラット・骨形
成試験によりモニターする。BMP−９発現はMXT耐性レベ
ルの上昇にともない増加するはずである。［³⁵S］メチ
オニンまたはシステインによるパルスラベリングおよび
ポリアクリルアミドゲル電気泳動のごとき当業者に知ら
れた標準的手法を用いてBMP−９ポリペプチドを特徴づ
ける。同様の方法に従い、他の関連BMP−９蛋白生産を
行うことができる。

A. BMP−９ベクターの構築 本発明のヒト・BMP−９蛋白を生産するために、ヒト
・BMP−９蛋白の成熟領域をコードしているDNA配列を、
ネズミ・BMP−９蛋白のプロペプチド領域をコードして
いるDNA配列に連結してもよい。このネズミ／ヒト・ハ
イブリッドDNA配列を適当な発現ベクター中に挿入し、
慣用的遺伝子工学的手法により、動物細胞または他の好
ましい真核または原核宿主中に導入する。このネズミ／
ヒト・BMP−９を含む発現プラスミドの構築を以下に記
載する。

105〜470番目のヌクレオチド配列からなるヒト・BMP
−９配列誘導体（配列番号:8）を特異的に増幅する。以
下に示したオリゴヌクレオチド をプライマーとして用いて上記クローンpGEM−111由来
のヒト・BMP−９（配列番号:8）の105〜470番目のヌク
レオチドを増幅する。この方法は、105番目のヌクレオ
チドのすぐ前のヌクレオチド配列ATCGGGCCCCTの挿入お
よび470番目のヌクレオチドのすぐ後のヌクレオチド配
列GAATTCGCTの挿入を生じさせる。これらの配列の付加
は、特異的に増幅されるDNA断片の個々の末端にApa Iお
よびEcoR I制限エンドヌクレアーゼ部位を生じさせる。
得られた374bpのApa I/EcoR I断片を、Apa IおよびEcoR
Iで消化したプラスミドベクターpGEM−7Zf（＋）（プ
ロゲマ（Progema）社製，カタログ番号p2251）中にサブ
クローニングする。得られたクローンをphBMP9mex−１
と命名する。

ネズミ・BMP−９配列（配列番号:1）に基づいて以下
に示したオリゴヌクレオチド配列 を設計し、修飾して上述ネズミ／ヒト・発現プラスミド
の構築を容易にする。これらのオリゴヌクレオチドは、
互いに付加すると該２つの個々の配列のアニーリングを
容易にする相補的配列を含んでおり、下記のような合成
二本鎖DNAリンカー（LINK−１と命名） を形成する。このDNAリンカー（LINK−１）は、哺乳動
物細胞発現系における異種配列の最大発現のみならずネ
ズミ／ヒト・発現プラスミドの構築に必要なそれ以降の
操作を容易にするのに必要な制限エンドヌクレアーゼの
認識配列を有している。より詳細には（ヌクレオチド＃
5/LINK−１の番号づけした配列を参照）、１〜11番目の
ヌクレオチドは制限エンドヌクレアーゼBamH IおよびSa
l I認識部位からなっており、11〜15番目のヌクレオチ
ドは哺乳動物細胞発現系において異種配列を最大発現さ
せるものであり、16〜31番目のヌクレオチドは、ネズミ
・BMP−９配列（配列番号:1）の610〜625番目のヌクレ
オチドに対応しており、32〜33番目のヌクレオチドが２
つの隣接制限エンドヌクレアーゼ部位（EcoO109およびX
ba I）の有効な制限的消化を容易ならしめるために挿入
されている。34〜60番目のヌクレオチドは、合成ヌクレ
オチド＃５の58番目のヌクレオチドが配列番号１の1539
番目にあるＡよりもむしろＧであることを除いては、ネ
ズミ・BMP−９配列（配列番号:1）の1515〜1541番目の
ヌクレオチドに対応している。このヌクレオチド変換
は、コードすることが予期されるアミノ酸配列を変更す
ることなく、Apa I制限エンドヌクレアーゼ認識配列を
生ぜしめ、さらなるネズミ／ヒト・ハイブリッド発現プ
ラスミドの操作を容易ならしめる。LINK−１（オリゴヌ
クレオチド＃５および＃６をアニーリングした二本鎖産
物）を、制限エンドヌクレアーゼApa IおよびBamH Iで
消化したプラスミドベクターpGEM−7Zf（＋）中にサブ
クローニングする。これにより、通常はpGEM−7Zf
（＋）プラスミドポリリンカーのApa IおよびBamH I部
位の間に存在している配列が、上記LINK−１配列に置き
換わったプラスミドを得る。得られたプラスミドクロー
ンをpBMP−9linkと命名する。

pBMP−9linkを、制限エンドヌクレアーゼBamH Iおよ
びXba Iで消化し、LINK−１の１〜34番目のヌクレオチ
ド（オリゴヌクレオチド＃５の番号づけを参照）を除去
する。クローンML14aは、配列番号:1に示した配列から
なる挿入断片からなり、制限エンドヌクレアーゼBamH I
およびXba Iで消化すると、配列番号:1（ネズミ・BMP−
９）の１〜1515番目の配列が除去される。ネズミ・BMP
−９のこのBamH I/Xba I断片をML14aプラスミドクロー
ンの残りの部分から単離し、上記のごとく合成リンカー
配列を除去することにより生じたBamH I/Xba I部位中に
サブクローニングする。得られたクローンをp302と命名
する。

p302クローンを制限エンドヌクレアーゼEcoO109Iで消
化し、ネズミ・BMP−９配列（配列番号:1）の621〜1515
番目のヌクレオチドおよびLINK−１の35〜59番目のヌク
レオチド（オリゴヌクレオチド＃５の番号づけ参照）に
対応するヌクレオチド配列を切形する。上記のごとくＡ
からＧへの変換により作られたApa I制限部位がEcoO109
I認識配列のサブセットであることに注意すべきであ
る。それゆえ、EcoO109Iによるp302の消化は、もともと
存在するネズミのEcoO109I部位（配列番号:1の619〜625
番目に位置）のみならずApa I部位をも開裂させ、上記
配列からなる920bpのEcoO109I/EcoO109I（Apa I）断片
を切形する。この920bpのEcoO109I/EcoO109I（Apa I）
断片を、p302プラスミドグローンの残りの部分から単離
し、同様にEcoO109Iで消化したpBMP−9link中にサブク
ローニングする。LINK−１の２つの隣接するEcoO109Iお
よびXba I制限部位の消化をより完全なものにするため
に、ヌクレオチドGG（オリゴヌクレオチド＃５の32〜33
番目）をはじめに作っておき、今度はこれをpBMP−9lin
kの一部とし、Dcmメチレーション認識部位を生じさせる
ことに注意すべきである。制限ヌクレアーゼEcoO109Iは
Dcmメチレーションに感受性があり、それゆえ、制限ヌ
クレアーゼEcoO109Iによるこの配列（オリゴヌクレオチ
ド＃5/LINK−１の25〜31番目のヌクレオチド）の開裂が
この部位において防止される。よって、プラスミドクロ
ーンpBMP−9linkを、EcoO109I部位ではなくApa I部位に
おいて、上記のごとく制限エンドヌクレアーゼEcoO109I
で消化することにより開裂させ、LINK−１のEcoO109Iと
Xba I部位との間の配列（オリゴヌクレオチド＃５の番
号づけにより定義された32〜55番目）の予期された除去
を防止する。これにより、pBMP−9linkのEcoO109I（Apa
I）部位において、920bpのEcoO109I/Apa I断片の挿入
が起こる。得られたクローンをp318と命名する。

クローンp318を制限エンドヌクレアーゼSal IおよびA
pa Iで消化し、LINK−１の６〜56番目のヌクレオチド
（位置についてはオリゴヌクレオチド＃５参照）、ネズ
ミ・BMP−９（配列番号:1）の621〜1515番目のヌクレオ
チドおよびLINK−１（位置についてはオリゴヌクレオチ
ド＃５参照）の35〜60番目のヌクレオチドからなる配列
を切形する。得られた上記972bpのSal I/Apa I断片を、
p318プラスミドクローンの残りの部分から単離し、引き
続いての操作に用いる。

ヒト・BMP−９蛋白の全成熟領域およびそのプロペプ
チドをコードしているDNA配列を含むクローンphBMP−9m
ex−１（上記）を、制限エンドヌクレアーゼApa Iおよ
びEcoR Iで消化する。これにより、ヒト・BMP−９配列
（配列番号:8）の105〜470番目のヌクレオチドからなる
374bpの断片と、制限エンドヌクレアーゼApa Iならびに
EcoR I認識配列を有するオリゴヌクレオチドプライマー
＃３および＃４のヌクレオチドとが切形される。この37
4bpのApa I/EcoR I断片を、p318由来の972bpのSal I/Ap
a I断片（上記のごとく単離）に結合し、Sal IおよびEc
oR Iで消化された哺乳動物細胞発現プラスミドpED6（pE
MC2β１誘導体）に連結する。得られたクローンをp324
と命名する。

クローンML14a（ネズミ・BMP−９）をEcoO109Iおよび
Xba Iで消化して、配列番号:1の621〜1515番目のヌクレ
オチドからなる断片を得る。

以下のオリゴヌクレオチドを自動DNA合成装置にて合
成して結合し、その相補的配列を互いに塩基ペアーとし
（アニーリングし）、LINK−２と命名される合成二本鎖
DNAリンカー LINK−2: を得る。この合成二本鎖DNAリンカー（LINK−２）を、
下記のようにしてSal I（一方の末端）またはEcoO109I
（もう一方の末端）のどちらにも対応する一重鎖末端 を生じるようなやり方でアニーリングする。

このLINK−２合成DNAリンカーを、上記ネズミ・BMP−
９（配列番号:1）の621〜1515番目のヌクレオチドから
なる上記895bpのEcoO109I/Xba I断片にライゲーション
する。これにより、915bpのSal I/Xba I断片を得る。

クローンp324をSal I/Xba Iで消化して、LINK−１の
６〜56番目のヌクレオチドからなる配列（位置について
はオリゴヌクレオチド＃５参照）およびネズミ・BMP−
９（配列番号:1）の612〜1515番目のヌクレオチドから
なる配列を除去する。LINK−１の35〜60番目のヌクレオ
チドからなる配列（位置についてはオリゴヌクレオチド
＃５参照）およびphBMP−9mex−１由来の374bpのApa I/
EcoR I断片（ヒト・BMP−９配列）からなる配列はpED6
骨格に結合したままである。LINK−２配列およびネズミ
・BMP−９（配列番号:1）の621〜1515番目のヌクレオチ
ドからなる該915bpのSal I/Xba I断片を、上記したSal
IからXba Iまでの配列を除去したp324クローン中にライ
ゲーションする。

得られたプラスミドをBMP9fusionと命名する。該プラ
スミドは、LINK−２、ネズミ・BMP−９（配列番号:1）
の612〜1551番目のヌクレオチド、LINK−１の35〜59番
目のヌクレオチドよりなる配列（位置についてはオリゴ
ヌクレオチド＃５参照）、および哺乳動物細胞発現ベク
ターpED6のSal IならびにEcoR I部位の間に挿入された
クローンpBMP9mex−１（上記）由来の374bpのApa I/Eco
R I断片からなる。

BMP9fusionを、当業者に知られた標準的手法を用いて
CHO細胞中に形質転換し、ヒト・BMP−９蛋白を発現でき
る安定な細胞系を造成する。該細胞系を適当な培養条件
下で培養し、BMP−９蛋白を培養基から単離、精製す
る。

実施例Ｖ 発現BMP−９の生物学的活性 上記実施例IVで得られた発現BMP−９蛋白の生物学的
活性を測定するために、該蛋白を細胞培養基から回収
し、他の汚染物質と同様に同時生成される他の蛋白性物
質からBMP−９蛋白を単離することにより精製する。該
精製蛋白を、実施例III記載のラット・骨形成試験によ
り分析してもよい。

当業者に知られた標準的な手法を用いて精製を行う。
精製が、他のBMP蛋白に関するのと同様に、ヘパリンセ
ファロースの使用を包含していてもよいと考えられる。

銀染色（アール・アール・オークリー（R.R.Oakley）
ら，アナリティカル・バイオケミストリー（Anal.Bioch
em.），第105巻,361頁（1980年））と組み合わせたSDS
−PAGEアクリルアミド（ユー・ケイ・ラエムリ（U.K.La
emmli），ネイチャー（Nature），第227巻,680頁（1970
年））のごとき標準的手法およびイムノブロット（エイ
チ・トウビン（H.Towbin）ら，プロシーディングス・オ
ブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユ
ーエスエイ（Proc.Natl.Acad.Sci.USA），第76巻,4350
頁（1979年））を用いて、蛋白の分析を行う。

以上の記載は、本発明の好ましい具体例を詳説するも
のである。その実施において、当業者は、これらの記載
を考慮して、多くの改変および変法を思い付くであろ
う。これらの改変および変法は、本明細書に付記した請
求の範囲中に包含されると確信する。

配列表 （１）一般的情報： （ｉ）出願人：ウォズニー，ジョン・エム（Wozney,J
ohn M.）セレステ，アンソニー（Celeste,Anthony） （ii）発明の名称:BMP−９組成物 （iii）配列の数:9 （iv）連絡先： （Ａ）名称：ジェネティックス・インスティテュー
ト・インコーポレイテッド（Genetics Institute,In
c.） （Ｂ）通り名：リーガル・アフェアーズ（Legal Af
fairs）−ケンブリッジパーク・ドライブ（CambridgePa
rk Drive）87番 （Ｃ）都市名：ケンブリッジ（Cambridge） （Ｄ）州名：マサチューセッツ州 （Ｅ）国名：アメリカ合衆国 （Ｆ）郵便番号:02140 （ｖ）コンピューター・リーダブル・フォーム（Comp
uter Readable Form）： （Ａ）媒体形態：フロッピーディスク （Ｂ）コンピューター:IBM PC コンパチブル （Ｃ）オペレーティングシステム:PC−DOS/MS−DOS （Ｄ）ソフトウェア：パテントイン・リリース（Pa
tentIn Release）＃1.0,バージョン＃1.25 （vi）現在の出願データ： （Ａ）出願番号:US （Ｂ）受理日： （Ｃ）分類： （viii）代理人等の情報： （Ａ）氏名：カピノス，エレン・ジェイ（Capinos,
Ellen J） （Ｂ）登録番号:32,245 （Ｃ）代理人等における処理番号:GI 5186A （ix）テレコミュニケーションの情報： （Ａ）電話番号：（617）876−1170 （Ｂ）ファックス番号：（617）876−5851 （２）配列番号:1に関する情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:2447塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:mRNAに対するcDNA （iii）ハイポセティカル配列：なし （iv）アンチセンス：なし （vi）起源： （Ａ）生物名：ハツカネズミ（Mus musculus） （Ｂ）株名:C57B46xCBA （Ｆ）組織の種類：肝臓 （vii）直接の起源： （Ａ）ライブラリー：マウス・肝臓cDNA （Ｂ）クローン:ML14A （viii）ゲノム内での位置： （Ｃ）単位：塩基対 （ix）配列の特徴 （Ａ）特徴を表す記号:mat peptide （Ｂ）存在位置:1564..1893 （ix）配列の特徴 （Ａ）特徴を表す記号:CDS （Ｂ）存在位置:610..1896 （ix）配列の特徴 （Ａ）特徴を表す記号:mRNA （Ｂ）存在位置:1..2447 （xi）配列の記載：配列番号:1 （２）配列番号:2に関する情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:428アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：蛋白 （xi）配列の記載：配列番号:2 （２）配列番号:3に関する情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:1954塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:mRNAに対するcDNA （iii）ハイポセティカル配列：なし （iv）アンチセンス：なし （vi）起源： （Ａ）生物名：ヒト（Homo sapiens） （Ｇ）細胞型：骨肉腫細胞系 （Ｈ）細胞系:U−20S （vii）直接の起源： （Ａ）ライブラリー：ラムダ gt10中のＵ−20S c
DNA （Ｂ）クローン：ラムダ Ｕ−20S−３ （viii）ゲノム内での位置： （Ｃ）単位：塩基対 （ix）配列の特徴 （Ａ）特徴を表す記号:CDS （Ｂ）存在位置:403..1629 （ix）配列の特徴 （Ａ）特徴を表す記号:mat peptide （Ｂ）存在位置:1279..1626 （ix）配列の特徴 （Ａ）特徴を表す記号:mRNA （Ｂ）存在位置:9..1934 （xi）配列の記載：配列番号:3 （２）配列番号:4に関する情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:408アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：蛋白 （xi）配列の記載：配列番号:4 （２）配列番号:5に関する情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:15塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:mRNAに対するcDNA （xi）配列の記載：配列番号:5 （２）配列番号:6に関する情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:34塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:mRNAに対するcDNA （xi）配列の記載：配列番号:6 （２）配列番号:7に関する情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:68塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:mRNAに対するcDNA （xi）配列の記載：配列番号:7 （２）配列番号:8に関する情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:470塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA（ゲノム） （iii）ハイポセティカル配列：なし （ｖ）フラグメント型:C末端フラグメント （vi）起源： （Ａ）生物名：ヒト（Homo sapiens） （Ｈ）細胞系:W138（ゲノムDNA） （vii）直接の起源： （Ａ）ライブラリー：ヒト・ゲノム （Ｂ）クローン：ラムダ 111−１ （viii）ゲノム内での位置： （Ｃ）単位：塩基対 （ix）配列の特徴 （Ａ）特徴を表す記号:exon （Ｂ）存在位置:1..470 （ix）配列の特徴 （Ａ）特徴を表す記号:CDS （Ｂ）存在位置:1..456 （ix）配列の特徴 （Ａ）特徴を表す記号:mat peptide （Ｂ）存在位置:124..453 （ix）配列の特徴 （Ａ）特徴を表す記号:mRNA （Ｂ）存在位置:1..470 （xi）配列の記載：配列番号:8 （２）配列番号:9に関する情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:151アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：蛋白 （xi）配列の記載：配列番号:9

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 セレステ，アンソニー・ジェイ アメリカ合衆国マサチューセッツ州 01749、ハドソン、パーカード・ストリ ート86番 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/09 C07K 14/51 C12P 21/02 ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳ ｅｑ ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ ｅｎｅＳｅｑ ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (12)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】図３（配列番号:9）に示す８〜110番目の
   アミノ酸配列からなるBMP−９ポリペプチド。
2. 【請求項２】図３（配列番号:9）に示す１〜110番目の
   アミノ酸配列からなるBMP−９ポリペプチド。
3. 【請求項３】各サブユニットが少なくとも図３（配列番
   号:9）の８〜110番目のアミノ酸配列からなる二量体で
   ある請求項１記載のBMP−９ポリペプチド。
4. 【請求項４】各サブユニットが少なくとも図３（配列番
   号:9）の１〜110番目のアミノ酸配列からなる二量体で
   ある請求項１記載のBMP−９ポリペプチド。
5. 【請求項５】（ａ）図３（配列番号:8）に示す124〜453
   番目のヌクレオチド配列からなるcDNAで形質転換された
   細胞を培養すること；および （ｂ）図３（配列番号:9）に示す１〜110番目のアミノ
   酸配列からなる蛋白を該培養基から回収、精製すること
   からなる段階により製造される精製BMP−９蛋白。
6. 【請求項６】（ａ）図３（配列番号:8）に示す124〜453
   番目のヌクレオチド配列からなるcDNAで形質転換された
   細胞を培養すること；および （ｂ）図３（配列番号:9）に示す８〜110番目のアミノ
   酸配列からなる蛋白を該培養基から回収し精製すること
   からなる段階により製造される精製BMP−９蛋白。
7. 【請求項７】軟骨および／または骨の形成を誘導する能
   力により特徴づけられる、配列番号:9の１〜110番目の
   アミノ酸からなるBMP−９蛋白。
8. 【請求項８】配列番号:9の１〜110番目のアミノ酸から
   なるBMP−９蛋白をコードしている、配列番号:8の124〜
   453番目のヌクレオチドからなるDNA。
9. 【請求項９】（ａ）124〜453番目のヌクレオチド（配列
   番号:8）；および （ｂ）上記配列（ａ）と緊縮ハイブリダイゼーション条
   件下でハイブリダイズし、軟骨および／または骨を形成
   させる能力を発揮するDNA からなる請求項８記載のDNA。
10. 【請求項１０】（ａ）145〜453番目のヌクレオチド（配
    列番号:8）；および （ｂ）上記配列（ａ）と緊縮ハイブリダイゼーション条
    件下でハイブリダイズし、軟骨および／または骨を形成
    させる能力を発揮するDNA からなる請求項８記載のDNA。
11. 【請求項１１】配列番号:9の１〜110番目のアミノ酸を
    含むBMP−９蛋白をコードしている、配列番号:8の124〜
    453番目のヌクレオチドからなるDNAで形質転換された宿
    主細胞。
12. 【請求項１２】（ａ）BMP−９蛋白をコードしているヌ
    クレオチド配列からなるcDNAで形質転換された細胞を培
    養すること；および （ｂ）該BMP−９蛋白を該培養基から回収し精製するこ
    と の段階からなる、配列番号:9の１〜110番目のアミノ酸
    からなる精製BMP−９蛋白の製法。