NO317129B1 - Interlaukin 1<beta> protease og interlaukin 1<beta> proteaseinhibitorer - Google Patents

Interlaukin 1<beta> protease og interlaukin 1<beta> proteaseinhibitorer Download PDF

Info

Publication number
NO317129B1
NO317129B1 NO19934335A NO934335A NO317129B1 NO 317129 B1 NO317129 B1 NO 317129B1 NO 19934335 A NO19934335 A NO 19934335A NO 934335 A NO934335 A NO 934335A NO 317129 B1 NO317129 B1 NO 317129B1
Authority
NO
Norway
Prior art keywords
asp
pro
amino acid
sequence
ch2f
Prior art date
Application number
NO19934335A
Other languages
English (en)
Other versions
NO934335D0 (no
NO934335L (no
Inventor
Roy A Black
Paul R Sleath
Shirley R Kronheim
Original Assignee
Vertex Pharma
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Vertex Pharma filed Critical Vertex Pharma
Publication of NO934335D0 publication Critical patent/NO934335D0/no
Publication of NO934335L publication Critical patent/NO934335L/no
Publication of NO317129B1 publication Critical patent/NO317129B1/no

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/81—Protease inhibitors
    • C07K14/8107—Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
    • C07K14/8142—Aspartate protease (E.C. 3.4.23) inhibitors, e.g. HIV protease inhibitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/02—Nutrients, e.g. vitamins, minerals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C271/00—Derivatives of carbamic acids, i.e. compounds containing any of the groups, the nitrogen atom not being part of nitro or nitroso groups
    • C07C271/06—Esters of carbamic acids
    • C07C271/08—Esters of carbamic acids having oxygen atoms of carbamate groups bound to acyclic carbon atoms
    • C07C271/10—Esters of carbamic acids having oxygen atoms of carbamate groups bound to acyclic carbon atoms with the nitrogen atoms of the carbamate groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms
    • C07C271/22—Esters of carbamic acids having oxygen atoms of carbamate groups bound to acyclic carbon atoms with the nitrogen atoms of the carbamate groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms to carbon atoms of hydrocarbon radicals substituted by carboxyl groups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/545—IL-1
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/02—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing at least one abnormal peptide link
    • C07K5/0202—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing at least one abnormal peptide link containing the structure -NH-X-X-C(=0)-, X being an optionally substituted carbon atom or a heteroatom, e.g. beta-amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06191—Dipeptides containing heteroatoms different from O, S, or N
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6472—Cysteine endopeptidases (3.4.22)
    • C12N9/6475—Interleukin 1-beta convertase-like enzymes (3.4.22.10; 3.4.22.36; 3.4.22.63)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/868—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof involving autoimmunity, allergy, immediate hypersensitivity, delayed hypersensitivity, immunosuppression, or immunotolerance

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører et interleukin lfi proteaseenzym (IL-IB pro) med biologisk aktivitet for å spalte inaktive forløper interleukin lfi (IL IB) polypeptider til aktive modne IL-lfi polypeptider. Mer spesifikt angår foreliggende oppfinnelse et isolert IL-lfi pro polypeptid og derivater derav som kan spalte en bestemt aminosyresekvens, inkludert aminosyresekvensen ved N-terminusen til humant IL-lfi. Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer videre en gruppe av forbindelser som kan inhibere IL-IB proaktiviteten og dermed virke som IL-1 antagonister.
EP 533 350 angår et c-DNA som koder for forløper interleukin-ip (pre-IL-1 B) konverterende enzym (ICE). Dette dokumentet angår også de tilsvarende polypeptider (20-22 og 10 kDa-proteiner) og spesifikke antistoffer mot disse.
Ifølge EP 533 350 er (ICE) i stand til å spalte peptidbindingen mellom Asp 116 og Ala 117 og peptidbindingen mellom Asp 27 og Gly 28 i IL-1 p.
Journal of Cellular Biochemistry, Suppl. 15F (april 1991), side 125, sammendrag nr. P506 (3) og Journal of Cellular Biochemistry, Suppl. 15G (april 1991), side 128, sammendrag nr. CH 201 (4) angår den molekylære kloning av IL-1 p-prosesseringsenzymet. Selv om den tilsvarende sekvens ikke er beskrevet, presenteres enzymet som en protease som spalter den inaktive forløperen av IL-1 P mellom Asp 116 og Ala 117. Protokollen som anvendes for å oppnå full lengde cDNA og det rensede rekombinante protein er oppsummert.
FEBS, vol. 247 nr. 2, sidene 386-390, april 1989 beskriver spaltingsseter for IL-lp-proteasen. Av viktighet er at dokumentet verken beskriver eller antyder forbindelser som omfatter en elektronegativ avspaltbar gruppe ved en C-terminal asparginsyrerest.
US 4 644 055 angår en generell fremgangsmåte for å fremstille spesifikke inhibitorer av virus-spesifiserte proteaser. Disse inhibitorene omfatter en halometylketondel bundet til en peptidsekvens som befinner seg oppstrøms nær et spaltingssete som gjenkjennes av en virus-spesifisert protease.
US 4 636 492 angår de utvalgte ketoner som anvendes for behandling av virusinfeksjon hos pattedyr, og gir en oversikt over ulike peptidderivater som er kjent som proteaseinhibitorer.
Foreliggende oppfinnelse er rettet mot et isolert polypeptid med proteolytisk aktivitet for et spesifikt proteasespaltningssete, idet proteaseaktiviteten er spesifikk for et substratpeptid som har en aminosyresekvens omfattende:
Ri - Asp - R2 - R3
hvor Ri og R3 uavhengig er en hvilken som helst D eller L isomeraminosyre, R2 er Ala eller Gly og hvor det spesifikke proteasespaltningssetet er mellom Asp og R2. Substratpeptidet har fortrinnsvis minst en lengde på 8 aminosyrer. Det isolerte polypeptidet blir betegnet interleukin 18 protease (IL-lfl pro) på grunn av at det spalter forløper IL-IB polypeptidet for å tilveiebringe modent IL-lfl polypeptid ved dets spaltningssete mellom Asp 116 og Ala 117 residiene.
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også substituerte peptid IL-lfl inhibitorforbindelser omfattende en aminosyresekvens på fra 1 til omtrent 5 aminosyrer, med en N-terminal beskyttende gruppe og et C-terminalt Asp residie koblet til en elektronegativ avspaltbar gruppe. Aminosyresekvensen tilsvarer fortrinnsvis minst en del av aminosyresekvensen Ala-Tyr-Val-His-Asp.
Inhibitorforbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse har formelen:
Z-Q2-Asp-Q!
hvor Z er en N-terminal beskyttelsesgruppe, Q2 er 0 til 1 aminosyrer og Qi omfatter en elektronegativ avspaltbar gruppe. Z er fortrinnsvis Ci-Cg alkylketon, benzyl, acetyl, alkoksykarbonyl, benzyloksykarbonyl eller C\- C$ alkylkarbonyl. Mer foretrukket er Z t-butoksykarbonyl (t-Boc), acetylkarbonyl eller benzyloksykarbonyl (Cbz).
Ql er fortrinnsvis C1-C3 alkyl, et aldehyddiazometylketon eller halometylketon. Mer foretrukket er Qj et aldehyd eller fluormetylketon.
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer videre reversible og irreversible IL-IB proinhibitorer. Irreversible inhibitorer er inhibitorforbindelser omfattende en aminosyresekvens på fra 1 til 2 aminosyrer med en N-terminal beskyttende gruppe og et C-terminalt Asp residie koblet til et diazometylketon eller et halometylketon.
Reversible IL-1B inhibitorer er forbindelser omfattende en aminosyresekvens på fra 1 til 2 aminosyrer som har en N-terminal beskyttelsesgruppe og et C-terminalt Asp residie koblet til en aldehyddel.
Forbindelsene med formel Z - Q2 - Asp - Qi er i stand til å inhibere de fysiologiske virkninger av interleukin IB i et pattedyr som har behov for slik behandling, omfattende administrering til pattedyret av en effektiv mengde av inhibitorforbindelsen ifølge oppfinnelsen.
Foreliggende oppfinnelse omfatter videre et farmasøytisk preparat omfattende en fysiologisk akseptabel bærer og en inhibitorforbindelse ifølge oppfinnelsen.
Forbindelsene ifølge oppfinnelsen er i stand til å behandle inflammasjon assosiert med autoimmun sykdom hos pattedyr som har behov for slik behandling. Forbindelsen ifølge oppfinnelsen kan anvendes ved en fremgangsmåte for å behandle artritt, fremgangsmåte for å behandle en autoimmun sykdom hos et mottakelig individ, fremgangsmåte for å forbedre sårheling og en fremgangsmåte for å redusere skadelige bivirkninger av strålebehandling. Alle fremgangsmåtene omfatter administrering av en terapeutisk effektiv mengde av en isolert IL-1 B-protease eller et biologisk derivat av dette i en egnet farmasøytisk bærer.
I tegningene som er en del av beskrivelsen viser:
Figur 1 DNA (Seq. LD. nr 1) og tilsvarende aminosyresekvens (Seq. LD. nr 2) for et polypeptid med en IL-10 probiologisk aktivitet og som tilsvarer humant modent IL-lfi pro eller et biologisk aktivt fragment derav. Figur 2 viser aminosyresekvensen til prelL-lfi (Seq. LD. nr 3), som publisert av March et al, Nature (London), 315(6021):641-647 (1985). Aminosyreresidiene er nummerert (under sekvensen) begynnende med initiatormethioninet. Figur 3 viser en Western Blot analyse av produkter dannet av IL-lfi pro i nærvær og fravær av IL-16 proinhibitor Boc-Asp-CH2F. Produktene ble utsatt for SDS-PAGE, overført til nitrocellulose og probet med et antistoff dannet mot COOH terminusen til modent IL-16. Kolonne 3, prelL-lfi inkubert med 25 u.m inhibitor, kolonne 4, prelL-lfi inkubert med 10 um inihibor, kolonne 5, prelL-lfi inkubert med 5 um inhibitor, kolonne 6, prelL-lfi inkubert med 1 um inhibitor.
I. Interleukin lfi protease
Ved anvendelse av polymerasekjedereaksjon (PCR)-prosedyrer og andre teknikker er det heri isolert, renset, karakterisert og uttrykt et pattedyr IL-1B propolypeptid og aktive fragmenter derav.
Tilgjengeligheten av store mengder av et rekombinant IL-IB proenzym har videre muliggjort oppnåelse av inhibitorforbindelser som kan inhibiere IL-IB proaktiviteten og derved virke som IL-1 antagonister. Videre har anvendelse av IL-lB-prp vist at den har IL- 1-agonistaktivitet. Substratpeptidene er nærmere presisert pattedyr IL-IB propolypeptider, derivater, analoger og alleliske varianter derav som har protolytisk aktivitet for et substratpeptid med en aminosyresekvens omfattende:
Ri - Asp - R2 - R3
hvor Ri og R3 uavhengig er en hvilken som helst D eller L isomeraminosyre, R2 er Ala eller Gly, og hvor det spesifikke proteasespaltningssetet er mellom Asp og R2. Substratpeptidet har fortrinnsvis minst en lengde på 8 aminosyrer. R2 er fortrinnsvis Gly. IL-IB pro fra pattedyr er fortrinnsvis et humant IL-IB pro og har substratspesifisitet for et substratpeptid med en aminosyresekvens beskrevet heri. Det humane IL-IB propolypeptidet eller derivatet derav er fortrinnsvis et polypeptid med biologisk aktivitet som spalter humant forløper IL-IB polypeptid for å tilveiebringe det humane modne IL-IB polypeptidet.
IL-IB pro er videre kjennetegnet ved cDNA (Seq. LD. nr 1) og aminosyresekvensen (Seq. LD. nr 2) i figur 1. Fullengde (forløper) IL-1B pro omfatter 404 aminosyrer. Renset IL-IB pro begynner med Asn-Pro-Ala-Met-Pro sekvensen begynnende med aminosyre 120. Basert på en molekylvektanalyse er den omtrentlige C-terminusen til moden IL-IB pro på omtrent 297 aminosyrer. Bestemmelse av molekylvekten indikerer derimot at C-terminusen til det modne enzymet er fra omtrent aminosyre 278 til omtrent aminosyre 315. Ifølge foreliggende oppfinnelse viser det isolerte IL-B pro polypeptid* eller derivat, analog, eller allelvariant av dette biologisk aktivitet overfor proteolytisk spalting av et humant forløper IL-lp polypeptid ved et spaltingssete mellom Asp 116 og Ala 117 residiene. Betegnelsen "IL-lp pro" skal i foreliggende oppfinnelse omfatte aminosyresekvensen vist i figur 1, pluss alle allele varianter, derivater, analoger og fragmenter av denne sekvensen som utviser IL-IB probiologisk aktivitet.
IL-IB probiologisk aktivitet blir for eksempel bestemt ved å analysere IL-1 aktivitet med et forløper IL-IB polypeptid. Forløper IL-IB er inaktivt, mens modent IL-IB er et aktivt IL-1 polypeptid. En fremgangsmåte for å måle IL-1B proaktiviteten er beskrevet i Black et al II. Denne fremgangsmåten omfatter omtrent 5 mikroliter av forløper IL-IB (pre IL-IB) (10-50 ug/ml fremstilt som beskrevet i Black et al I) inkubert med 10 ^1IL-1B propolypeptid eller annen forbindelse antatt å ha IL-IB probiologisk aktivitet. Inkuberingen fortsetter i omtrent 1 time ved omtrent 37°C og blir avsluttet ved tilsetning av 15 ul 2 X SDS prøvebuffer etterfulgt av koking i 5 minutter. Den kokte prøven blir elektroforert på en SDS-polyakrylamidgel og plassert på et Western blott ved anvendelsen av et IL-1B C-termnialt-spesifikt monoklonalt antistoff såsom 16F5 beskrevet i Black et al I. .
Figur 1 viser også en nukleotidsekvens kodende for en 404 aminosyresekvens som har IL-IB probiologisk aktivitet.
En isolert DNA sekvens kodende for IL-IB pro eller et derivat, en analog eller en allel variant derav som utviser biologisk aktivitet for proteolytisk spaltning av et humant forløper IL-16 polypeptid ved et spaltningssete mellom Asp 116 og Ala 117 residiene er nyttig ved utøvelsen av foreliggende oppfinnelse. Den isolerte DNA sekvensen blir valgt fra gruppen bestående av nukleotidsekvensen i figur 1 begynnende ved nukleotid 1 og som strekker seg til nukleotid 1232, begynnende ved nukleotid 374 og som strekker seg til nukleotid 1232, begynnende ved nukleotid 374 og som strekker til et nukleotid fra omtrent 851 til omtrent 962, DNA sekvenser som detekterbart hydriserer til figur 1 sekvensen fra nukleotid 1 til nukleotid 1232 og som koder for et polypeptid som utviser biologisk aktivitet overfor proteolytisk spaltning av et humant forløper IL-1B polypeptid ved dets spaltningssete mellom Asp 116 og Ala 117 residiene, og DNA sekvenser som på grunn av degenerasjonen av den genetiske koden, koder for et pattedyr IL-IB propolypeptid som blir kodet av hvilket som helst av de foregående DNA innskuddene og sekvensene.
DNA sekvensene som detekterbart hybridiserer til figur 1 nukleotidsekvensen fra nukleotid 1 til nukleotid 856 hybridiserer under betingelser med høy eller svært høy stringens. Høye eller svært høye stringensbetingelser omfatter for eksempel hybridisering over natt ved omtrent 68°C i en 6 X SSC oppløsning etterfulgt av vasking ved omtrent 68°C i en 0,6 X SSC oppløsning.
Antisensoligonukleotider kan bli syntetisert (ved konvensjonelle fosfodiesterteknikker så som til Synthecell, Rockville, MD) som er komplementære med unike regioner av minst 18 baser ved initieringskodonet (TACCGGCTCTTCCAGGAC, Seq. LD. nr 4) eller (TACCTATTTGGGCTCGA, Seq. LD. nr 5) komplementær med basene 18-36 og 168 til 196, i figur 1 ved N-terminusen til moden IL-1B pro
(TTGGTCGATACGGGTGT, Seq. LD. nr 6) som er komplementær med basene 374 til 392 i figur 1, ved den approksimative C-terminusen etter proteasespaltning (CACCACACCAAATTTCTA, Seq. LD. nr 7) komplementær med basene 890 til 908 i
figur 1, eller ved en region rett ved 5' til termineringskodonet
(ATGGAGAAGGGTCCTGATA, Seq. LD. nr 8) som er komplentær med basene 1205 til 1229 i figur 1.
fi ■
Den primære aminosyrestrukturen til IL-IB pro eller det aktive fragmentet derav kan bli modifisert ved dannelse av kovalente eller sammensatte konjugater med andre kjemiske deler, så som glykocylgrupper, lipider, fosfater, acetylgrupper og lignende, eller ved dannelsen av aminosyresekvensmutanter eller derivater. Kovalente derivater til IL-1B pro blir dannet ved kobling av spesielt funksjonelle grupper til IL-IB proaminosyresidekjeder eller ved N-terminusen eller C-terminusen til IL-IB propolypeptidet.
Andre derivater av IL-IB pro innenfor rammen av denne oppfinnelsen omfatter kovalente eller sammensatte konjugater av IL-IB pro eller fragmentene derav med andre proteiner eller polypeptider, så som ved syntese i rekombinant kultur som N-terminale eller C-terminale fusjoner. Det konjugerte polypeptidet kan for eksempel være en signal- (eller leder) polypeptidsekvens ved den N-terminale regionen av IL-IB propolypeptidet som ko-translasjonelt eller post-translasjonelt leder overføring av IL-IB propolypeptidet fra syntesesetet til et sete på innsiden eller utsiden av cellemembranen eller veggen (for eksempel a-faktorleder fra gjær). IL-1B propolypeptidfusjoner kan omfatte polypeptider tilsatt for å lette rensingen og identifiseringen av IL-IB pro (for eksempel poly-His). Aminosyresekvensen til EL-1 fl pro kan videre bli koblet til peptidet Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (Hopp et al BioTechnology 6:1204 (1988)), som er en meget antigent sekvens og tilveiebringer en epitope som er reversibelt bundet av et spesifikt monoklonalt antistoff for å muliggjøre hurtig analyse og lette rensingen av det uttrykte rekombinante polypeptidet. Denne spesifikke ledersekvensen blir spaltet av bovin mukosal enterokinase ved residiene som følger rett etter Asp-Lys parringen. Fusjonspolypeptidene som har denne ledersekvensen ved dets N-terminal kan være motstandsdyktig overfor degradering i E.coli vertcellene.
Foreliggende oppfinnelse frembringer IL-1B propolypeptider med eller uten assosiert nativ-mønstret glykosylering. IL-1B, pro uttrykt i gjær eller
pattedyrekspresjonssystemer (for eksempel COS-7 celler) kan være lik eller betraktelig forskjellig i molekylvekt og glykosyleirngsmønstre enn den native humane EL-IB propolypeptidet. Dette avhenger av valget av ekspresjonssystem. Ekspresjon av IL-1B propolypeptider i bakterielle ekspresjonssystemer så som E.coli tilveiebringer ikke-glykosylerte molekyler.
Funksjonelle mutantanaloger av human IL-lfi pro kan for eksempel bli syntetisert med inaktiverte N-glykosyleringsseter ved oligonukleotidsyntese og ligering eller ved setespesifikke mutageneseteknikker. IL-lfi proderivatene kan bli uttrykj i homogen, redusert karbohydratform ved anvendelse av ekspresjonssystemer fra gjær. N-glykosyleringsetene i eukaryote polypeptider er kjennetegnet ved en aminosyretriplett Asn-O-Il hvor <X> er en hvilken som helst aminosyre unntatt pro og XI er Ser eller Thr. I denne sekvensen er karbohydratresidiene kovalent koblet ved Asn sidekjeden. IL-lfl proanaloger eller derivater kan også bli oppnådd ved mutasjoner av IL-lfl pro DNA sekvensen. Et IL-lfi promutant derivat, som referert til heri, er et polypeptid som er vesentlig homologt med IL-lfl pro, men som har en aminosyresekvens som er forskjellig fra nativ IL-16 pro på grunn av en delesjon, et innskudd eller en substitusjon.
EL-16 pro blir uttrykt fra et pattedyrgen som sannsynligvis blir kodet av en eller flere multi-eksongener. Alternative mRNA konstruksjoner som kan komme fra forskjellige mRNA spleisehendelser etter transkripsjon, og som har felles regioner med identitet eller likhet med cDNA er nyttige ved utøvelsen av foreliggende oppfinnelse.
Bioekvivalente analoger av IL-lfi propolypeptider (definert som polypeptider med IL-lfl probiologisk aktivitet) kan for eksempel bli konstruert ved å danne forskjellige substitusjoner eller aminosyreresidier eller sekvenser, eller ved delesjon av terminale eller indre residier eller sekvenser som ikke er nødvendig for biologisk aktivitet. For eksempel kan Cys residiene bli deletert eller erstattet med andre aminosyrer for å forhindre dannelsen av ukorrekte intramolekylære disulfidbroer ved renaturering. Andre tilnærmingsmetoder for mutagenese omfatter modifisering av dibasiske aminosyreresidier for å forsterke ekspresjonen i gjærsystemer hvor KEX2 proteaseaktiviteten er til stede.
Generelt blir substitusjonene gjort konservativt ved substituering av aminosyre med fysiologiske karaktertrekk som ligner de til det erstattede residiet. Ytterligere substitusjoner kan være utenfor "kjerne" sekvensen nødvendig for IL-16 probiologisk aktivitet. Subenhetene til IL-16 pro kan bli konstruert ved delesjon av terminale eller indre residier eller sekvenser. Det resulterende polypeptidet bør ha IL-lfi probiologisk aktivitet som definert heri.
Betegnelsen "EL-lfi pro", "human IL-lfi protease" omfatter, men er ikke begrenset til, analoger eller subenheter av IL-lfi pro som er vesentlig lik human IL-lfi pro og/eller som utviser den substrat-spesifikke proteolytiske biologiske aktiviteten som er assosiert med IL-16 pro som beskrevet heri.
Betegnelsen "vesentlig lik" betyr, når den skal beskrive aminosyresekvenser, at en bestemt sekvens kan variere fra en beskrevet referansesekvens med en eller flere substitusjoner, delesjoner eller addisjoner. Nettoeffekten er derimot den samme proteasebiologiske aktiviteten som er karakteristisk for det humane EL-lfi propolypeptidet som referanse. For eksempel kan et derivat ha en forkortet sekvens omfattende en "kjerneregion" eller en sekvens av aminosyrer som er nødvendige for den spesifikke proteasebiologiske aktiviteten som er karakteristisk for EL-lfi pro. Vesentlig like EL-16 proderivater vil være mer enn omtrent 30 % like med den tilsvarende sekvensen til human IL-lfl pro og ha LL-lfi probiologisk aktivitet. Polypeptider som har aminosyresekvenser med lavere grad av likhet, men med sammenlignbar biologisk aktivitet (inkludert substratspesifisitet) blir betraktet å være ekvivalenter. Derivatpolypeptidene vil fortrinnsvis ha høyere enn 80 % aminosyresekvenshomologi med det humane IL-lfi propolypeptidet.
Prosent likhet kan for eksempel bli bestemt ved sammenligning av sekvensinformasjon ved anvendelse av et GAP dataprogram, versjon 6.0, som er tilgjengelig fra University of Wisconsin Genetics Computer Group. GAP programmet anvender oppstill-ingsmetoden til Needleman og Wunsch (J. Mol. Biol, 48:443 (1970)), revidert av Smith og Waterman (Adv. Appl. Math, 2:482 (1981)). GAP programmet definerer likhet som antallet oppstilte symboler som er like, delt med det totale antallet symboler i den korteste av de to sekvensene. De foretrukne standardparametrene for GAP programmet omfatter: (1) en veid sammenligningsmatrise for aminosyrene (se Schwartz og Dayhoff, red. Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, sidene 353-58 (1979)); (2) en straff på 3,0 for hvert "gap" og en ytterligere 0,10 straff for hvert symbol i hvert "gap", og (3) ingen straff for ende "gap".
"Biologisk aktiv" som anvendt heri referer til EL-16 probiologisk aktivitet nødvendig for å spalte en bestemt aminosyresekvens ved peptidbindingen mellom et Asp residie og et Ala eller Gly residie.
"Rekombinant" som anvendt heri betyr at et polypeptid er avledet fra rekombinante (for eksempel mikrobielle eller pattedyr) ekspresjonssystemer. "Mikrobiell" referer til bakterielle eller sopp (for eksempel gjær) ekspresjonssystemer. Som et produkt
definerer "rekombinant mikrobiell" et polypeptid produsert i et mikrobielt ekspresjonssytem som er vesentlig fri for native endogene forbindelser. Polypeptider uttrykt i de fleste bakterielle ekspresjonssystemene (for eksempel E.coli) vil være fri for glykan. Polypeptider uttrykt i gjær kan ha en glykosyleringsmønster som er forskjellig fra det som blir uttrykt i pattedyrcellene. IL-16 proprotease har en meget begrenset substratspesifisitet. Det humane forløper IL-16 polypeptidet har en aminosyresekvens His-Asp-Ala-Pro for residiene 115-118. Human IL-16 pro spalter denne sekvensen mellom residiene 116 og 117 (Asp-Ala) for å danne det humane modne IL-16 polypeptidet. Forandring av Asp-116 til Ala i et humant forløper IL-16 polypeptid ved sete-rettet mutagenese forhindrer spaltning av det mutante IL-16 polypeptidderivåtet.
Isolert humant IL-16 pro var i stand til å spalte ved dets spesifikke substratsete selv når den tertiære strukturen til substratet forløper IL-16 polypeptidet ble endret ved denaturering av substratpolypeptidet i kokende vann. Forløper human IL-16 ble denaturert ved koking av en oppløsning av forløperen IL-18 i 15 minutter. Denaturering hadde liten virkning på evnen det humane IL-16 pro har til å kunne spalte human forløper IL-16 til moden IL-16. Den tertiære strukturen til substratpolypeptidet bidrar ikke betraktelig til reaksjon med enzymet IL-16 pro.
Den biologiske aktiviteten til IL-16 pro ble bestemt ved en proteaseanalyse. På grunn av at IL-16 pro enzymet er følsomt overfor salt ble prøver med en saltkonsentrasjon høyere enn 50 mM innledningsvis avsaltet. Prøvene kan for eksempel bli avsaltet ved applisering av 100 ul av prøven på en forspunnet 1 ml Biogel P-6DG (Bio-Rad) kolonne som var ekvilibrert i 10 mM Tris-HCl, 5 mM ditioteritol, pH 8,1 og sentrifugert i 5 minutter ved en 1876 X g. Analysen ble utført ved inkubering av en blanding av 5 ul (30 ng) av renset human IL-16 forløper og 10 ul av prøven som skal bli testet for IL-16 proteasebiologisk aktivitet i 60 minutter ved 37°C. En kontrollprøve ble likeledes inkubert for å undersøke endogen IL-1. Kontrollprøveblandingen inneholdt 5 ul 10 mM Tris-HCl, pH 8,1 og 5 mM ditiotreitol istedenfor DL-16 forløperen. Inkubasjonene av kontrollprøven ble avsluttet ved tilsetning av SDS (natriumdodecylsulfat) i en prøvebuffer etterfulgt av koking i 5 minutter.
Alle inkuberte analyseblandinger ble elektroforert på 0,75 mm-tykk SDS, 14 % polyakrylamid slabgeler ved anvendelse av et diskontinuerlig system, som det som er beskrevet i Laemmli, Nature, 277:680 (1970). Western blott ble utført etter elektroforese ved overføring av proteinene på nitrocellulose (Sartorius) og probing ved anvendelse av en 20 ug/ml oppløsning av renset IL-16 COOH-terminalt-spesifikt monoklonalt antistoff (dvs 16F5). Blottet ble utviklet ved anvendelse av pepperrotperoksydasefarveutviklingsreagenset (Bio Rad). 100 ng renset moden IL-18 ble anvendt som en kontroll 17,500 daltonmarkør på Western blottet.
Humant IL-16 proenzym ble oppnådd og renset fra THP-1 cellene oppnådd fra American Type Culture Collection (ATCC). Omtrent 120 liter av celler ble dyrket og deretter stimulert i 16 timer med liposakkarid, hydroksyurea og silika som beskrevet i Matsushima, Biochemistry, 25:3424 (1986). Cellene ble høstet ved sentrifugering, og vasket i Hanks balanserte saltoppløsning og deretter på ny sentrifugert. Cellene ble resuspendert i 10 mM Tris-HCl, 5 mM ditiotreitol, pH 8,1 ved en tetthet på 10^/ml. De suspenderte cellene ble fryst og opptinet tre ganger og lysatene lagret ved -80°C frem til ytterligere anvendelser. Før rensingen ble lysatene tint og deretter sentrifugert i 20 minutter ved 47.800 X g ved 4°C. Supematanten ble tatt ut for ytterligere rensing. Frysetine prosedyren ble gjentatt fire ganger og friga over 50 % av 11-18 proaktiviteten til supematanten. Ytterligere fryse-tininger økte ikke utbytte av det oppløselige materialet.
Det humane IL-1B propolypeptidet ble renset i en seks-trinns metode beskrevet nedenfor. Alle kromatografitrinnene ble utført ved 4°C ved anvendelse av et Pharmacia FPLC system. DEAE-Sephacel, hydroksyapatitt og blå agarosegeler ble forbehandlet med 0,1 % Triton-X-100 og 10 % bovint kalveserum for å forhindre uspesifikk absorbsjon av proteinene til gelene. Den blå agarosekolonnen ble vasket med 8 M urea for å fjerne eventuelt ukovalent absorbert fargestoff.
1. Omtrent 500-600 ml lysatsupernatant ble fortynnet 1:2 i 10 mM Tris-HCl og 5 mM ditiotreitol, pH 8,1 ("buffer A") for å redusere ionestyrken til lysatet til
<20 mM. pH ble justert til 8,1. Den fortynnede lysatsupernatanten ble applisert på en DEAE-Sephacel kolonne (20 x 4,4 cm, Pharmacia Fine Chemicals), ekvilibrert med buffer A. Strømningshastigheten var 120 ml/time. Kolonnen ble vasket med to kolonnevolumer av buffer A og deretter eluert med en lineær gradient (3 kolonnevolumer) varierende fra 0 til 300 mM NaCl i buffer A. 15 ml fraksjoner ble oppsamlet, analysert for IL-16 proaktivitet og lagret for ytterligere rensing. IL-16 proaktiviteten ble eluert med mellom 0,07 og 0,13 M NaCl. Dette trinnet fjernet 79 % av kontaminerende proteiner. Hovedvekten av de kontaminerende proteinene ble eulert mellom 0,15 og 0,25 M NaCl. Dette trinnet var videre nyttig for delvis fjerning av
endogen moden IL-IB som eluerte mellom 0,06 og 0,11 M NaCl og endogen forløper IL-IB som eluerte mellom 0,12 og 0,18 M NaCl. 2. De sammenslåtte aktive fraksjonene fra DEAE kolonnen ble fortynnet i 50 mM kaliumfosfatbuffer, 5 mM ditiotreitol, pH 7,0 ("buffer B"). En 14 x 3 cm kolonne hydroksyapatitt (HA Ultrogel, D3F Biotechnics) ble ekvilibrert med buffer B. De fortynnede fraksjonene ble applisert på den ekvilibrerte hydroksyapatittkolonnen ved en strømningsrate på 60 ml/time. Kolonnen ble vasket med to kolonnevolumer buffer B og deretter eluert med en lineær gradient (4 kolonnevolumer) varierende fra 50-200 mM kaliumfosfat. Fraksjonene ble samlet som 10 ml volumer, analysert for IL-1B proaktivitet og lagret for ytterligere rensing. IL-IB pro eluerte mellom 0,085 og 0,113 M kaliumfosfat. 40 % kontaminerende polypeptider eluerte før proteasen og 40 % eluerte senere enn proteasen. Endogen moden IL-IB eluerte mellom 0,05 og 0,08 M kaliumfosfat. 3. En 20 x 1,6 cm blå agarosekolonne (Gibco-BRL) ble ekvilibrert med buffer A. Fraksjonene fra hydroksyapatittkolonnen med aktivitet ble fortynnet 1:3 i buffer A for å redusere ionestyrken til 30 mM. Dette var nødvendig for å muliggjøre at IL-IB pro blir bundet til kolonnen. Fortynnede fraksjoner ble applisert på blå agarosekolonnen i en hastighet på 30 ml/time. Kolonnen ble vasket med tre kolonnevolumer av buffer A. Proteinene ble eluert med fem kolonnevolumer av en lineær gradient varierende fra 0,1 til 1 M NaCl i buffer A. 10 ml fraksjoner ble samlet, analysert for IL-1B proaktivitet og lagret for ytterligere rensing. IL-1B pro ble eluert med 0,5 til 0,68 M NaCl. 80 % kontaminerende proteiner ble fjernet i dette trinnet, idet 20 % eluerte tidligere og gjenværende 60 % forble bundet til kolonnen. 4. En 95 c 2,5 cm Sephadex G-75 kolonne (Pharmacia Fine Chemicals) ble ekvilibrert i buffer A og opprinnelig kalibrert med ferritin (Mv 400.000) ovalbumin (Mv 43.000), soyabønnetrypsininhibitor (Mv 20.000) og DNP-asparginsyre (Mv 300). Blå agarosekolonnefraksjoner inneholdende proteaseaktivitet ble slått sammen og konsentrert på en Centriprep-10 konsentrater (Amicon) til et volum på omtrent 2 ml og deretter applisert på Sephadex F-75 kolonnen. Proteinene ble elueret med buffer A ved en strømningshastighet på 20 ml/time. 4 ml fraksjoner ble slått sammen og fraksjoner innholdene proteaseaktivitet ble slått sammen for ytterligere rensing. IL-IB proaktiviteten ble eluert med mellom 196 og 220 ml. Denne posisjonen er identisk med elueringsposisjonen til soyabønnetrypsinihibitoren og antyder at human IL-IB pro har en molekylvekt på omtrent 20.000 dalton. Dette trinnet fjernet over 90 % av de kontaminerende proteinene fra preparatet. Ved hjelp av Sephadex-trinnet ble mer enn 99,8 % av utgangsproteinkontaminanter separert fra IL-IB pro. PAGE (plyakrylamidgel elektroforese) analyse av fraksjonene viste fortsatt flere proteinbånd som ikke korrelerte med IL-IB probiologisk aktivitet. ri. 5. Fraksjoner fra Sephadex kolonnen som inneholdt proteaseaktivitet ble slått sammen og blandingen ble konsentrert på forbehandlet Centriprep 10 konsentratorer til et volum på 500 ul. På grunn av at proteinkonsentrasjonen til Sephadexblandingen var lav (<30 ug/ml), reduserte forbehandling av Centriprep med bovinseriumalbumin tapet av IL-IB proaktiviteten under konsentreringen. Omfattende vasking av forbehandlet centriprep før anvendelsen forhindret kontaminering av prøvene med albumin. Forbehandlingen ble oppnådd ved sentrifugering av 15 ml 1 % bovinsyrealbumin (BSA) i centriprep i 30 minutter, dekantering av den gjenværende oppløsningen og vasking med 10 mM Tris-HCl. En mono P5/20 FPLC kromatofokuserende kolonne (Pharmacia Fine Chemicals) ble ekvilibrert med 25 mM Tris-acetat og 5 mM ditiotreitol, pH 8,3 buffer. Den konsentrerte oppløsningen ble blandet (1:1 v/v) med 500 (il 25 mM Tris-acetat og 5 mM ditiotreitol, pH 8,3 og applisert på Mono P5/20 FPLC kolonnen. Proteinene ble eluert med Polybuffer 96:Polybuffer 74 (3:7) pH 5,0 (Pharmacia) ved en strømningshastighet på 15 ml/time. 1 ml fraksjoner ble samlet og analysert for pH og biologisk proteaseaktivitet. Dette kromatofokuserende trinnet økte renheten av IL-IB pro ytterligere 100 ganger og muliggjorde visualisering av et enkelt proteinbånd som korrelerte med EL-IB probiologisk aktivitet. IL-IB pro ble eluert fra kromatofokuseirngskolonnen mellom pH 6,95 og 6,70. Fraksjonene ble konsentrert på BSA-forbehandlede Centricon 10 konsentratorer (Amicon) fra 1 ul til 50 ul. 6. Fraksjonene ble utsatt for elektroforese på en polyakrylamingel (PAGE) etterfulgt av elektroblotting på polyvinyldifluoirdmembranpapir (PVDF, Millipore Immobilin-P) ved 300 mA i 30 minutter. PVDF membranen ble farget med Coomassie blå. Det var fem hovedbånd med molekylvekter på omtrent 45.000,43.000,36.000, 22.000 og 18.000 dalton. 22.000 daltonbåndet korrelerte med IL-1B proaktiviteten og ble sekvensert.
Den N-terminale sekvensen til 22.000 daltonbåndet ga en aminosyresekvens beskrevet heri. Et modent humant IL-IB pro cDNA eller et aktivt fragment derav ble klonet ved anvendelse av denne N-terminale aminosyresekvensen og en tretrinns polymerasekjedereaksjons (PCR) prosedyre. I første trinnet av PCR prosedyren ble fullstendig degenererte PCR primere konstruert og dannet fra den N-terminale aminosyresekvensen. De degenererte primerene ble anvendt for å amplifisere IL-16 pro-spesifikke sekvenser fra et cDNA bibliotek dannet fra THP-1 celle mRNA. Et tilfeldig primet førstetråd THP-1 cDNA bibliotek ble konstruert ifølge forhandlerens instruksjoner (Amersham). En blandet oligonukleotidprimet amplifisering ble utført ifølge fremgangsmåten beskrevet i Lee et al. "cDNA Cloning Using Degenerate Primers" i PCR Protocols (Innis. Gelfand, Snisky and White red.) Academic Press, Inc. New York, sidene 46-53,1990. Primer nr 1 ble konstruert for å kryss-hybridisere til IL-16 pro DNA (nukleotidene 1-17) og for å inneholde et Eco RI restriksjonssete. Primer nr 1 hadde sekvensen:
Primer nr 2 ble konstruert for å kryss-hybridisere til IL-16 pro DNA (komplementær til nukleotidene 31-47 og inneholder et Xba I restriksjonssete. Primer nr 2 har sekvensen:
PCR amplifikasjon ble utført med thermus aquatius polymerase (Perkin-Elmer Cetus) i 100 ul buffer i 30 cykluser som beskrevet i Lyy et al nedenfor. Et 63 bp amplifisert fragment ble oppnådd fra PCR amplifisering. Dette amplifiserte fragmentet ble subklonet inn i en pGem-4 vektor (Promega). DNA sekvensanalyse av 10 isolater indikerte at dette fragmentet koder for de første 16 aminosyrene av N-terminus til EL-16 pro bestemt ved rensing og N-terminal sekvensanalyse.
Det andre stadiet av PCR prosedyren dannet primer nr 3 bestående av nukleotidene 1-17 (figur 1) og en Not I restriksjonssete og primer nr 4 inneholdende 20 T residier og et Not I restriksjonssete. Primerene nr 3 og nr 4 ble tilsatt til THP-1 cDNA bibliotek beskrevet ovenfor og PCR amplifisert i 6 cykluser ved 94°C i 1 minutt, 50°C i 1 minutt og 72°C i 1 minutt. Southern analyse av den PCR amplifiserte klonen ved anvendelse av en 17 base oligonukleotidprobe (komplementær med nukleotidene 16-32 i figur 1) fant et bånd på omtrent 1000 bp som også ble funnet å inneholde EL-16 pro biologisk aktivitet. 1000 bp DNA ble gelrenset, utsatt for en lignende andre runde av PCR og subklonet inn i pGem-5 for sekvensiering. Nukleotidsekvensen til denne klonen er vist i figur 1.
I det tredje stadiet av PCR kloningen ble full-lengde IL-16 prokloner isolert fra et cDNA bibliotek fremstilt fra perifere blodneutrofiler. Det ble funnet at neutrofiler uttrykte IL-IB pro mRNA. Det ble isolert to kloner (p48 og p214) med IL-IB prospesifikt innskudd på henholdsvis 1367 og 1360 basepart. DNA sekvensen vist i figur 1 er en blanding av alle IL-IB prokloner. Aminosyrene som ble kodet av alle IL-IB proklonene som funnet var identiske. n
IL-IB pro cDNA er omtrent 1373 basepar i lengde, som inkluderer et område av A nukleotider som tilsvarer poly (A) halen til mRNA. For disse A residiene var det to polyadenyleringssignaler, AATAA, ved basepar 1316 og 1335. Sekvensen har en åpen leseramme på 404 aminosyrer begynnende med et initiator Met kodon ved nukleotid 18 og som avsluttes med et termineringskodon ved nukleotid 1230. Initiering av translasjonen kan også begynne med et i-ramme Met kodon ved nukleotid 66. Begge initiator Met kodon har konsensus Kozak translasjonsinitieringssekvenser. Polypeptider initiert med Met residiet i posisjon 51 har også biologisk aktivitet. IL-1B pro er et cytoplasmisk enzym. Idet den rensede enzym N-terminale aminosyren er Asn (120), så gjennomgår proteasen N-terminal prosessering som resulterer i fjerning av 119 aminosyrer eller 69 aminosyrer dersom det alternative intitatorkodonet blir anvendt. Delesjonsanalyse har indikert at minst 107 aminosyrer blir fjernet fra C-terminusen. Det ser ut som om den fullstendige C-terminusen er nødvendig for riktig folding av proteasen før omtrent 107 C-terminale aminosyrer kan bli fjernet for å sikre biologisk aktivitet for proteasen. DNA sekvensen vist i figur 1 ble uttrykt i en pattedyrcelle (for eksempel COS-7 celler). For pattedyrcelleekspresjon ble syntetiske oligonukleotidprimere dannet for å amplifisere det fullstendige kodende domenet til IL-IB pro. 5' primeren
inneholdt et Asp 718 restriksjonssete og et initiator Met residie kolbet til N-terminusen av enzymet (nukleotidene 1-20).
3' primer
inneholder et Ngl II restriksjonssete og er komplementær med nukleotidene 883-902 ifølge figur 1. Det PCR dannende fragmentet ble ligert inn i pDC303 pattedyrvektoren som beskrevet i Mosley et al, Cell, 59:335-348 (1989).
Human IL-16 pro blir fortrinnsvis produsert ved rekombinante DNA teknikker. Et rekombinant DNA ekspresjonssystem innfører et klon kodende for det humane IL-16 propolypeptidet eller et derivat derav med biologisk aktivitet i en ekspresjonsvektor. Ekspresjonsvektoren blir ført inn i en vertscelle. Vertscellens proteinsyntesemaskineri syntetiserer det rekombinante humane IL-16 propolypeptidet.
Egnede vertsceller for ekspresjon av pattedyr IL-16 propolypeptidet eller derivatet omfatter prokaryoter, gjær eller høyere eukaryote celler under kontroll av hensiktsmessige promotere. Prokaryoter omfatter gram negativ eller gram positiv organismer for eksempel E.coli eller bacilli. Egnede prokaryote vertceller for transformering omfatter for eksempel E.coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurim, og forskjellige andre arter innenfor slekten Pseudomonas, Streptomyces og Staphylococcus. Høyere eukaryote celler omfatter etablerte cellelinjer med pattedyropprinnelse som beskrevet nedfor. Celle-frie translasjonssystemer kan også bli anvendt for å produsere pattedyr IL-16 propolypeptider eller derivater derav ved anvendelse av RNA avledet fra DNA konstruksjonene beskrevet heri. Hensiktsmessig klonings- og ekspresjonsvektorer for anvendelse med bakterielle, sopp, gjær og pattedyrcellulære verter er for eksempel beskrevet i Pouwels et al, Cloning Vectors: A Loboratory Manual, Elsevier, New York (1985).
Når et EL-16 propolypeptid eller derivat derav blir uttrykt i en gjærvertscelle kan nukleotidsekvensen (for eksempel det strukturelle genet) som ved ekspresjon koder for et IL-16 propolypeptid eller derivat derav kan innbefatte en ledersekvens. Ledersekvensen muliggjør forbedret ekstracellulær sekresjon av det translerte polypeptidet ved en gjærvertscelle.
I en prokaryot vertscelle, så som E.coli, kan IL-16 propolypeptidet eller derivatet derav innbefatte et N-terminalt metioninresidie for å lette ekspresjonen av det rekombinante polypeptidet i en prokaryot vertscelle. N-terminal Met kan bli spaltet fra det uttrykte rekombinante EL-16 propolypeptidet eller derivatet derav. Prokaryote vertsceller kan bli anvendt for ekspresjon og disulfidprosessering.
Rekombinante ekspresjonsvektorer inneholdende rekombinant IL-16 pro strukturelt gennukleotidsekvens eller derivat derav blir transfektert eller transformert inn i en egnet homogen kultur av en egnet mikroorganismevert eller pattedyrcellelinje. Eksempler på egnede vertsceller omfatter bakterier så som E.coli, gjær så som S.cerevisiae eller en pattedyrcellelinje så som kinesisk hamster ovare (CHO) celler.
Transformerte vertsceller er celler som er blitt transformert eller transfektert med IL-16 pro eller et derivat derav av strukturelle genenukleotidsekvenser. Uttrykte IL-16 propolypeptider vil være beliggende innenfor vertscellen og/eller utskilt,i kultursupernatanten, avhengig av egenskapene til vertscellen og genkonstruksjonen innskutt i vertscellen. Ekspresjonsvektorer transfektert inn i prokaryote vertsceller omfatter generelt en eller flere fenotypiske selekterbare markører. En fenotypisk selekterbar markør utgjør for eksempel et gen kodende for proteiner som utviser antibiotisk resistens eller som har et autotrofisk krav og et replikasjonsorigo som blir gjenkjent av verten for å forsikre amplifikasjon innenfor verten.
Andre nyttige ekspresjonsvektorer for prokaryote vertsceller omfatter en selekterbar markør med bakteriell opprinnelse avledet fra kommersielt tilgjengelige plasmider. Denne selekterbare markøren kan omfatte genetiske elementer av kloningsvektoren pBR322 (ARRC 37017). pBR322 inneholder gener for ampicillin- og tetracyklinresistens og tilveiebringer derfor enkle midler for å identifisere de transformerte cellene. pBR322 skjelettdelene blir kombinert med en hensiktsmessig promoter og en IL-16 postrukturell gensekvens. Andre kommersielle vektorer omfatter for eksempel pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sverige) og pGEMl (Promega Biotec, Madison, WI, USA).
Promotersekvenser blir vanligvis anvendt for rekombinante prokaryote vertscelle ekspresjonsvektorer. Vanlige promotersekvenser omfatter 6-lactamase (penicillinase), laktose promotersystem (Chang et al, Nature, 275:615, 1978; og Goeddel et al, Nature 281:544,1979), tryptofan (trp) promotersystem (Goeddel et al, Nucl. Acids Res., 8:4057,1980; og EPA 36,776) og tac promoter (Maniatis, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratyr, s. 412,1982). Et spesielt nyttig prokaryotisk vertscelleekspresjonssystem anvender en fag Pl promoter og en cI875ts termolabil repressorsekvens. Plasmidvektorer tilgjengelige fra American Type Culture Collection som inkorporerer derivater av Pl promoteren omfatter plasmid pHUB2 (iboende i E.coli stammeJNB9 (ATCC 37092)) og pPLc28 (iboende i E.coli stamme RR1 (ATCC 53082)).
Humane IL-16 propolypeptider og derivatpolypeptider kan bli uttrykt i vertsceller fra gjær, fortrinnsvis fra Saccharomyces slekten (for eksempel S.cerevisiae). Andre gjærgener så som Pichia eller Kluyveromyces kan også bli anvendt. Gjærvektorer inneholder ofte en replikasjonsorigosekvens fra et 2 ugjærplasmid, en autonomt replikerende sekvens (ARS), en promoterregion, sekvenser for polyadenylering og sekvenser for transkripsjonsterminering. Gjærvektorer omfatter fortrinnsvis en replikasjonsorigosekvens og selekterbar markør. Egnede promotersekvenser for gjærvektorer omfatter promotere for metallotionein, 3-fosfoglyceratkinase (Hitzeman et al, J. Biol. Chem., 255:2073, (1980)) eller andre glykolyttiske enzymer (Hess eta 1, J.Adv. Enzyme Reg. 7:149, (1068); og Holland et al, Biochem. 17:49900, (1978)), så som enolase, glyveraldehyd-3-fosfatdehydrogenase, heksokinase, pyruvatdekarboksylase, fosfofruktokinase, glukose-6-fosfatisomerase, 3-fosfoglyseratmutase, puruvatkinase, triosefosfatisomerase, fosfoglukoseisomerase og glukokinase. Andre egnede vektorer og promotere for anvendelse i gjær ekspresjon er ytterligere beskrevet i Hitzeman, EP-A-73.657.
Gjærvektorer kan for eksempel bli oppstilt ved anvendelse av DNA sekvenser fra pBR322 for seleksjon og replikasjon i E.coli (Amp<r> gen og replikasjonsorigo). Andre gjær DNA sekvenser som kan bli innbefattet i en gjærekspresjonskonstruksjon omfatter en glukose-reversibel ADH2 promoter og en a-faktor sekresjonsleder. ADH2 promoteren er blitt beskrevet av Russell et al, (J. Biol. Chem., 258:2674, (1982)) og Beier et al, (Nature, 300:724, (1982)). Gjær a-faktor ledersekvensen leder sekresjonen av heterologe polypeptider. a-faktor ledersekvensen blir ofte skutt inn mellom promotersekvensen og den strukturelle gensekvensen (se for eksempel Kurjan et al, Cell, 30:933, (1982); og Bitter et al, Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 81:5330, (1984)). En ledersekvens kan bli modifisert nær 3' enden for å inneholde en eller flere restriksjonsseter. Dette vil lette fusjonen av ledersekvensen til det strukturelle genet.
Protokoller for gjærtransformasjon er kjent for fagfolk innenfor fagområdet. En slik protokoll er beskrevet av Hinnen et al, Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 75: 1929, (1978). Protokollen til Hinnen et al selekterer for Trp<+> transformanter i et selektivt medium hvor det selektive mediet består av 0,67 % gjæmitrogenbase, 0,5 % casaminosyrer, 2 % glukose, 10 ug/ml adenin og 20 ug/ml uracil.
Vertsceller fra gjær transformert med vektorer inneholdende ADH2 promotersekvensen kan bli dyrket for indusering av ekspresjonen i et næringsrikt medium. Eksempel på et næringsrikt medium er et som bestar av 1 % gjærekstrakt, 2 % pepton og 1 % glukose supplementert med 80 ug/ml adenin og 80 |ag/ml muacil. Derepresjon av ADH2 promoteren oppstår når glukose blir oppbrukt fra mediet.
Cellekultursystemer fra pattedyr eller insekter kan også bli anvendt for å uttrykke rekombinant IL-16 propolypeptid eller derivater derav. Eksempler på egnede pattedyrvertscellelinjer omfatter COS-7 linjene fra apenyreceller (Gluzman, Cell, 23:175, (1981)), L celler, C127 celler, 3T3 celler, kinesisk hamsterovarie (CHO) celler, HeLa celler og BHK cellelinjer. Egnede pattedyrekspresjonsvektorer omfatter ikke-transkriberte elementer så som et replikasjonsorigo, en promotersekvens, en enhancer koblet til det strukturelle genet, andre 5' eller 3' flankerende ikke-transkriberte sekvenser så som ribosombindingsseter, et polyadenyleringssete, spleisedonor og akseptorseter og transkripsjonene termineringssekvenser.
Transkripsjonene og translasjonelle kontroUsekvenser i
pattedyrcellevertsekspresjonsvektorer kan bli gitt av fra virale kilder. For eksempel kan vanlig anvendte pattedyrcellepromotersekvenser og enhancersekvenser bli oppnådd fra Polyoma, Adenovirus 2, Simian Virus 40 (SV40) og human cytomgalovirus. DNA sekvenser avledet fra SV40 viralt genom, for eksempel SV40 origo, tidlige og sene promoter, enhancer, spleise- og polyadenyleringsseter kan bli anvendt for å gi de andre genetiske elementene som er nødvendig for ekspresjon av en strukturell gensekvens i en pattedyrvertscelle. Virale tidlige og sene promotere er spesielt nyttige på grunn av at begge lett kan oppnås fra et viralt genom som et fragment som også kan inneholde et viralt replikasjonsorigo (Fiers et al, Nature, 273:113, (1978)). Mindre eller større SV40 fragmenter kan også bli anvendt forutsatt at den omtrent 250 bp sekvensen som utgår fra Hind III setet mot Bgll setet beliggende i det virale SV40 replikasjonsorigosetet blir innbefattet.
Videre kan genomisk IL-16 propromoter, kontroll og/eller signalsekvenser fra pattedyr bli anvendt forutsatt at slike kontroUsekvenser er kompatible med den valgte vertscellen. Eksempelvise vektorer kan bli konstruert som beskrevet av Okayama og Berg (Mol. Cell. Biol, 3:280, (1983)).
Rensede humane IL-16 propolypeptider eller derivater derav blir fremstilt ved dyrking av transformerte vertsceller under dyrkningsbetingelser som er nødvendige for å uttrykke DL-16 propolypeptider eller derivater derav. Uttrykte polypeptider blir renset fra kulturmediet eller celleekstrakter. For eksempel kan supematanter fra dyrkede transformerte vertsceller skille ut rekombinant EL-16 propolypeptid i dyrkningsmediet. IL-16 propolypeptidet eller derivatet derav blir konsentrert ved anvendelse av et kommersielt tilgjengelig proteinkonsentreringsfilter, for eksempel, en Amicon eller Millipore Pellicon ultrafiltreirngsenhet. Etter konsentreirngstrinnet kan konsentratet bli applisert på en rensingsmatriks. For eksempel utgjør en egnet rensingsmatriks en IL-16 proinhibitor eller et antistoffmolekyl som er spesifikt for et IL-113 propolypeptid eller derivat derav og som er bundet til en egnet bærer. Alternativt kan en anionbytteharpiks bli anvendt, for eksempel en matriks eller et substrat med utstikkende dietylaminoetyl (DEAE) grupper. Matrisene kan være akrylamid, agarose, dekstran, cellulose eller andre typer som vanligvis blir anvendt ved proteinrensing. Alternativt kan et kationbyttetrinn bli anvendt. Egnede kationbyttere omfatter forskjellige uoppløselige matriser
omfattende sulfopropyl eller karboksymetylgrupper. Sulfopropylgrupper er foretrukket.
En eller flere revers-fase høy-ytelse væskekromatografi (RP-HPLC) trinn som anvender hydrofobt RP-HPLC medium, for eksempel silikagel med utragende metyl eller andre alifatiske grupper kan bli anvendt for å ytterligere rense en IL-IB propolypep-tidsammensetning. Noen eller alle av de foregående rensingstrinnene kan i forskjellige kombinasjoner også bli anvendt for å tilveiebringe et homogent rekombinant protein. Alternativt kan noen eller alle trinn anvendt i rensingsprosedyren beskrevet heri også bli anvendt.
Rekombinant polypeptid produsert i bakterielle kulturer blir vanligvis isolert ved innledende ødeleggelse av vertscellene, ekstrahering fra cellepelleter av et uoppløselig polypeptid eller fra supematanten til et oppløselig polypeptid, etterfulgt av en eller flere konsentrerings-, utsaltnings-, ionebytte- eller størrelseseksklusjonslaomatografitrinn. Revers-fase høy-ytelse væskekromatografi (RP-HPLC) kan bli anvendt for de endelige rensingstrinnene. Mikrobielle celler kan bli ødelagt ved en hvilken som helst hensiktsmessig metode, inkludert fryse-tine cykluser, sonikering, mekanisk ødeleggelse eller anvendelse av cellelyseirngsmidler.
Transformerte gjærvertsceller uttrykker generelt IL-16 propolypeptidet som et utskilt polypeptid. Dette forenkler rensingen. Utskilt rekombinant polypeptid fra en gjærverts-cellefermentering kan bli renset ved metoder som er analoge til de som er beskrevet av Urdal et al (J. Chromatog., 296:171, (1984)). Urdal et al beskriver to sekvsensielle, revers-fase HPLC trinn for rensing av rekombinant human IL-2 på en preparativ HPLC kolonne.
II. Interleukin 16 proteaseinhibitorer
Isolering og karakterisering av proteasen ansvarlig for prosessering av forløperen IL-16 til dets biologiske aktive form hjelper til med å konstruere inhibitorer for IL-16 prosessering på grunn av at tilgjengeligheten av store mengder IL-16 pro utgjør en nyttig screeningsbærer for å finne forbindelser med IL-113 antagonistaktivitet. Slike IL-1 antagonister eller IL-IB proinhibitorer er nyttige for behandling av betennelse og transplantasj onsfrastøtning.
*» ■ Inhibitorene ifølge foreliggende oppfinnelse er substituerte forbindelser omfattende en aminosyresekvens på fra 1 til 2 aminosyreresidier med en N-terminal blokkerende gruppe og et C-terminal Asp residie koblet til en elektronegativ avspaltbar gruppe.
Aminosyresekvensen til prelL-lfi er presentert i Seq. LD. nr 3 og i figur 2 ifølge March C.J. et al, Nature (London), 315(6021):641-647 (1985). Moden IL-1B er representert ved de C-terminale 153 aminosyreresidiene til preIL-lB. N-terminalen til IL-1B er Ala residiet i posisjon 117 til Seq. LD. nr 3.
Aminosyreresidiene kan bli uttrykt fra det fullstendige navnet (for eksempel alanin) eller ved trebokstavbetegnelsen (for eksempel Ala). Det vil heri bli anvendt trebokstavbetegnelsen.
De naturlig forekommende aminosyrene er L isomerene og blir indikert uten noen isomerisk (for eksempel L eller D) betegnelse. D isomerene er indikert slik.
Som anvendt heri betyr frasen "tilsvarer" at en bestemt sekvens til en inhibitorforbindelse kan være forskjellig fra den beskrevne sekvensen ved en eller flere konservative substitusjoner dersom slike substitusjoner ikke i avgjørende grad endrer den inhibitoriske aktiviteten til forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse.
Eksempler på substitusjoner som ikke endrer den inhibitoriske aktiviteten er erstatning av Ala i posisjon 112 ifølge Seq. LD. nr 3 med Ser eller Gly, erstatning av Tyr ved posisjon 113 ifølge Seq. LD. nr 3 med Phe, erstatning av Val i posisjon 114 ifølge Seq LD. nr 3 med Leu, De eller Met og erstatning av His i posisjon 115 med Sel LD. nr 3 med Phe, Pro, en positivt ladet aminosyre så som Lys, Arg, His eller Tyr eller anvendelse av D isomerer.
Det C-terminale aminosyreresidiet til inhibitorforbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse er asparaginsyre (Asp). Asp har en sidekjede med formel CH2-COOH. Asp sidekjede karboksylgruppen blir fortrinnsvis beskyttet for å lette syntesen av forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse.
Asp sidekjedebeskyttende grupper omfatter for eksempel en benzyl, substituert benzyl, formylmetyl eller t-butyldel. Benzylsubstituentene øker syre-labiliteten til den Asp sidekjedebeskyttende del. Eksempelvis substituerte benzyler er 2,4,6-trimetylbenzyl og 4-metoksybenzyl.
I en foretrukket utførelsesform er den Asp sidekjedebeskyttende delen koblet til Asp sidekjeden via en esterbinding, idet bindingen er utsatt for spaltning fra naturlig forekommende intracellulære esteraseenzymer. På denne måten får den beskyttede Asp med høy lipidoppløselighet adgang til en celle og blir spaltet av en esterase for å tilveiebringe en ladet, vannoppløselig avspaltet Asp som forblir i cytoplasmaet hvor IL-16 pro hovedsakelig er beliggende.
Som anvendt heri refererer frasen "N-terminal blokkeringsgruppe" til kjemiske grupper koblet til aminogruppen til det N-terminale aminosyreresidiet til sekvensene ifølge foreliggende oppfinnelse. Slike blokkeringsgrupper er velkjente og fremkommer for fagfolk innenfor dette området. The Peptides, ed. av Gross og Meienhofer, Academic Press, New York, sidene 3-81 (1981). N-terminale blokkeringsgrupper er blitt anvendt med andre typer av proteaseinhibitorer. Se for eksempel US patenter nr 4.652.552 og 4.636.492.
Betegnelsen "elektronegativ avspaltbar gruppe" refererer heri til kjemiske grupper mottakelige for nukleofilt angrep av et aminosyreresidie i det enzymaktive setet som modifiserer IL-16 pro slik at EL-113 pro ikke kan reagere med og spalte preEL-16.
Forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse inhibierer den katalytiske aktiviteten til IL-16 pro på en reversibel eller en irreversibel måte. Som anvendt heri betyr "irreversible" dannelsen av en kovalent binding mellom enzymet og inhibitoren.
Reversibiliteten til IL-lfi pro aktiviteten er en funksjon av den elektronegative avspaltbare gruppen. Når den elektronegative avspaltbare gruppen er et diazoalkylketon er inhibisjon av EL-16 pro irreversibel og forbindelsen er en irreversibel inhibitor. Når den elektronegative avspaltbare gruppen er et aldehyd er inhibisjon av IL-16 pro reversibel og forbindelsen er en reversibel inhibitor.
Forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse har formelen:
hvor Z er en N-terminal blokkeringsgruppe,
Q2 er 0 til 1 aminosyrer og Qj er en elektronegativ avspaltbar gruppe.
I en foretrukket utførelsesform er Z C^-Cg alkyl, benzyl, acetyl, Cj-Cg alkoksykarbonyl, benzyloksykarbonyl eller C\- C$ alkylkarbonyl. Som^anvendt heri referer "alkyl" til lineære eller forgrenede kjeder med 1 til 6 karbonatomer som eventuelt kan bli substituert som definert heri. Representative alkylgrupper omfatter metyl, etyl, propyl, isopropyl, butyl, pentyl, heksyl og lignende. I en mer foretrukket utførelsesform er Z t-butoksykarbonyl (t-Boc), acetyl eller benzyloksykarbonyl (Cbz).
Q2 er fortrinnsvis en aminosyre. Det er foretrukket at Q2 er His, Phe, Pro eller Tyr. Det er mest foretrukket at Q2 er His eller Phe.
Ql er fortrinnsvis et aldehyd, et diazoalkylketon eller et haloalkylketon. Som anvendt heri med referanse til elektronegative avspaltbare grupper refererer "alkyl" til lineære eller forgrenede radikaler med 1 til 3 karbonatomer som eventuelt kan bli substituert som definert heri. Representative alkylgrupper omfatter metyl, etyl, propyl og lignende. Det er mest foretrukket at Qi er et aldehyd eller et fluormetyl (CH2F) keton.
Forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse blir dannet ved teknikker som generelt tilsvarer fremgangsmåtene som er kjente og som lett fremkommer for fagfolk innenfor dette området. Se for eksempel Kettner CA. et al, Arch. Biochem. Biophvs, 162:56
(1974); US patent nr 4.582.821; US patent nr 4.644.055; Kettner, CA. et al Arch., Biochem. Biophvs. 165:739 (1974); Dakin, H.D. og West R., J. Biol. Chem., 78:91
(1928); Rasnich, D., Anal. Biochem., 149:461 (1985).
Forbindelser med en fluormetylelektronegativ avspaltbar gruppe blir fortrinnsvis syntetisert ved hjelp av Rasnick prosedyren.
Forbindelser med en ikke-fluor, haloalkylketonelektronegativ avspaltbar gruppe blir syntetisert i henhold til prosedyren til Kettner. En N-blokkert aminosyre eller peptid blir omsatt med N-metylmorfolin og en alkyl, ikke-fluorhaloformat for ådanne et peptid-syreanhydrid. Anhydridet blir deretter omsatt med et diazoalkan i et inert, aprotisk oppløsningsmiddel for å danne et peptid-diazometanketon. Diazometanketonet blir deretter omsatt med en vannfri oppløsning av HC1, HBr eller HI for å danne det ønskede N-blokkerte, C-terminale haloalkylketonpeptidet eller aminosyren.
Forbindelser med en fluoralkylketon elektronegativ avspaltbar gruppe blir syntetisert i henhold til en Rasnick prosedyre. Et N-blokkert peptid blir omsatt med fluoreddiksyreanhydrid og et trialkylamin i et organisk oppløsningsmiddel for ådanne et peptid-anhydrid. Anhydridet blir deretter omsatt med en katalysator så som 4-dimetylaminopyridin og reaksjonsblandingen blir opprettholdt ved omtrent 25°C i omtrent 2 timer for åmuliggjøre utvikling av CO2. Reaksjonsblandingen blir deretter ekstrahert med et organisk oppløsningsmiddel og den organiske fasen blir vasket og tørket. Det organiske opp løsningsmidlet blir fjernet for å danne en olje som deretter blir applisert på en silikagelkolonne. Det N-blokkerte, fluoralkylketonpeptidet blir deretter eluert fra gelen og renset.
Forbindelsene med en fluoralkylketon elektronegativ avspaltbar gruppe kan bli utvidet i N-terminusretningen ved fjerning av den N-terminale blokkeringsgruppen og kobling av den avspaltbare forbindelsen med andre beskyttede aminosyrer. Bodanszky, The Practice of Peptid Synthesis, Springer-Verlag, Berlin (1984). Alternativt blir de avspaltbare forbindelsene acetylert for å tilveiebringe forbindelser med en N-terminal acetylbeskyttende gruppe. Stewart et al, Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemical CO.,Rockford,IL(1984).
III. Farmasøytiske sammensetnin<g>er
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer terapeutiske sammensetninger omfattende en effektiv mengde EL-16 propolypeptider og derivater derav i et egnet oppløsningsmiddel og en bærer. For terapeutisk anvendelse blir renset IL-16 pro eller et biologisk aktivt derivat derav administrert til en pasient, fortrinnsvis et menneske, for behandling på en måte som er hensiktsmessig for indikasjonen. For eksempel kan dermed IL-16 pro sammensetninger administrert for å undertrykke autoimmuniteten bli gitt ved bolus injeksjon, kontinuerlig infusjon, vedvarende frigivelse fra implantater eller annen egnet teknikk. Vanligvis vil et IL-16 pro terapeutisk middel bli administrert i form av en farmasøytisk sammensetning omfattende renset polypeptid sammen med fysiologisk akseptable bærere, eksipienser eller fortynningsmidler. Slike bærere vil være ikke-toksiske for pasienter ved doseringene og konsentrasjonene som blir anvendt og kan inneholde hvilke som helst av de konvensjonelle eksipiensene som blir anvendt for å danne farmasøytisk akseptable sammensetninger.
Inhibitorforbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse er nyttig for inhibering av de fysiologiske virkningene til interleukin 16 ved å forhindre dannelsen av biologisk aktiv IL-16. Inhibisjon av IL-16 pro resulterer i en reduksjon i aktive IL-16 nivåer og en
samtidig økning i preIL-16 og forbindelsen er biologisk uaktiv.
Inhibitorforbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse er også nyttige for behandling av d<y>sfunksjonelle tilstander så som autoimmun sykdoms-assosiert betennelse som ofte er formidlet med øket EL-1 aktivitet.
Pattedyr som trenger behandling for en betennelsesforstyrrelse eller forhindring av en autoimmun tilstand blir administrert effektive mengder av inhibitorforbindelsene ifølge oppfinnelsen enten alene eller i form av en farmasøytisk sammensetning.
De farmasøytiske sammensetningene ifølge foreliggende oppfinnelse innbefatter en eller flere av forbindelsene ifølge denne oppfinnelsen formulert til sammensetninger sammen med en eller flere ikke-toksiske fysiologiske akseptable bærere, adjuvans eller bærere som kollektivt blir referert til som bærere, for parenteral injeksjon, for oral administrasjon eller i fast eller flytende form, for rektal eller topisk administrering og lignende.
Den totale daglige dosen av inhibitorforbindelsene ifølge denne oppfinnelsen administrert til en vert i enkel eller oppdelte doser kan være i mengder på fra for eksempel 0,1 mg til omtrent 160,0 mg pr kg kroppsvekt. Doseringsenhetsammenset-ninger kan inneholde slike mengder av slike submultipler derav som blir anvendt for åutgjøre den daglige dosen. Det er å bemerke at det spesifikke doseringsnivået for en hvilken som helst bestemt vil avhenge av forskjellige faktorer, inkludert kroppsvekten, generell helsetilstand, kjønn, diett, tid og administrasjonsmåle, absorbsjonshastigheter og utskillelse, kombinasjon med andre medikamenter og alvorligheten av den bestemte sykdommen som blir behandlet.
Følgende eksempler skal illustrere oppfinnelsen.
EKSEMPLER
EKSEMPEL 1: Substratspesifisitet til IL-113 pro
Dette eksemplet illustrerer området for subtratspesifisiteten til renset humant IL-16 pro enzym for spaltning av en gruppe av aminosyresekvenser. Forskjellige peptidsubstrater ble dannet med forandringer i individuelle aminosyrer i regionen som tilsvarer spaltningssetet i human forløper IL-16 (His 115 til Pro 118). Reaktiviteten til peptidsubstratene ble uttrykt relativt til peptidet som tilsvarer Ala 112 til Ser 121 av forløper IL-16 sekvensen.
Substratpeptidene ble syntetisert ved fast fase metoden (Merrifield, J. Amer. Chem. Soc., 86:304-05 (1964)) ved anvendelse av enten en Applied Biosystems 430A peptid syntesizer eller ved den manuelle "T-bag" metoden til Houghten (Proe. Nat. Acad. Sei. USA, 82:5131-35 (1985). 4-metylbenzhydrylaminharpiks ble anvendt. Substratpeptidene ble acetylert før spaltning fra harpiksen av flytende HF (0°C, 1 time) i nærvær av anisol som oppfanger (HF:anisol 9:1). Etter avdampning av HF ble substratpeptidharpiksblandingene vasket med dietyleter og ekstrahert med 15 % (vekt/v) eddiksyre, lyofilisert og renset på revers fase høyytelse væskekromatografi (RP-HPLC) på en Vydac Cl8, 2,2 cm x 25 cm kolonne. Trifluoreddiksyre (0,1 %) i vann var oppløsningsmiddel A og 0,1 % trifluoreddiksyre i acetonitril var oppløsningsmiddel B for de mobile fasene.
De rensede substratpeptidene ble kjennetegnet ved aminosyreanalyse ved anvendelse av et Beckman 6300 system, RP-HPLC og massespektrometri. Massespektrene ble oppnådd ved enten fast atombombaredement på et VG Trio-2 system med xenon som ioniserende gass og glyserol/tioglyserol (1:1) som prøvematrise eller ved <252>cf plasma desoipsjonsmassespektrometri på et Bio-Ion 20 massespektrometer (se Tsarbopuoulos, Peptide Res. 2:258-66 (1989). I hvert tilfelle tilsvarer massen av det observerte peptidsubstratet med den teoretiske verdien.
Peptidoppløsninger av standardkonsentrasjonen ble dannet ved oppløsning av omtrent 2-3 mg peptidsubstrat i vann, applisering av oppløsningen på en Waters Sep-Pak C18 beholder og vasking tre ganger med 5 ml vann. Peptidsubstratene ble eluert med acetonitril og deretter avdampet til tørrhet. Hvert substrat ble standardisert til l mm ved aminosyreanalyse før anvendelsen.
Renset humant IL-1J3 proenzym (10 ul), peptidsubstrat i vann (10 ul) og 10 mM trisbuffer, pH 8,0 inneholdende 25 % v/v glyserol (10 ul) ble blandet og blandingene ble inkubert ved 37°C i 4 timer. Reaksjonen ble stoppet ved tilsetning av 1 M glycin/HCl buffer pH 2,0 (10 ul). Prøvene ble deretter analysert ved anvendelse av RP-HPLC med en Vydac Cl8 kolonne (0,46 cm x 25 cm) og eluering med en lineær gradient fra 100 % oppløsningsmiddel A til 70 % oppløsningsmiddel A/30 % oppløsningsmiddel B over 30 minutter ved en strømningshastighet på 1 ml/min. Elueringsmiddelet ble registrert ved 280 nm absorberende produkt. En sammenligning av toppområdet til produktpeptidet med det til det totale toppområde av substratet og produktet ga grad av peptidspaltning på grunn av at området under de kombinerte substrat og produkttoppene var konstante og uavhengige av mengden av spaltning av IL-16 proenzymet. Identitetene til peptidprodukttoppene ble bekreftet <y>ed aminosyreanalyse og ved massespektrometri.
Tabell 1 viser de relative reaktivitetene til en serie av åtte peptidsubstrater som var utsatt for spaltning av renset IL-16 proenzym.
Spaltningssetet kan bli beskrevet med tilsvarende humane forløpere IL-16 aminosyreresidier som følger:
P2 Pl P1P2'
His-Asp-Ala-Pro
Forandring av L-asparginsyreresidie i peptid 1 til enten asparagin (peptid 2), glutaminsyre (peptid 3) eller D-aspartat (peptid 4) har en betydelig virkning på evnen som EL-16 pro har til å spalte substratet. Disse data etablerer kravet for et L-aspartatresidie i Pl posisjonen til dette enzymet for å muliggjøre å spalte et substrat. Peptidene 5 og 6 representerer forandringer i Pl' posisjonen til det humane forløper IL-16 spaltningssetet. Erstatning av alanin med glycin (peptid 5) resulterer i et substrat som er 3,4 ganger mer reaktivt enn peptid 1. Forandring av det samme residiet til en valin (peptid 6) forhindrer effektivt den protolytiske spaltningen. Det faktum at med et glycinresidie i Pl<1> peptidet lettere blir spaltet tyder på at alaninresidiet i det humane forløper IL-16 polypeptidet ikke er kritisk for substratbinding, mens resultatet med et valinresidie i Pl' posisjonen indikerer lav sterisk toleranse ved Pl' posisjon. Det virker derfor usannsynlig at IL-16 proenzymet eller derivatene derav vil spalte noe annet sted enn mellom Asp-Gly og Asp-Ala residiene.
Peptidene 7 og 8 representerer forandring til henholdsvis P2 og P2' setene. Forandring av prolin i peptid 1 til en alanin ga et substrat som fortsatt ble spaltet av human IL-16 pro, men som bare var halvparten så effektiv som peptidet med den humane IL-16 native sekvensen. Et lignende resultat ble oppnådd når hisitidin i peptid 1 ble erstattet med en fenylalanin. Disse data tyder på at det humane IL-16 proenzymet tolererer konservative erstatninger av begge residiene og at P2 og P2' posisjonene ikke er så vitale for aktivitet som aminosyrene ved Pl og Pl' posisjonene.
EKSEMPEL 2: Virkning av substratlengden
Dette eksemplet illustrerer virkning av substratpeptidlengden på evnen som det humane IL-16 proenzymet har til å spalte peptidsubstratene. Eksperimenter ble utført som beskrevet i eksempel 1. Fem substratpeptider ble dannet og disse tilsvarer aminosyresekvensen til EL-16 pro spaltningssetet til human forløper IL-16. Resultatene er vist i tabell 2 nedenfor.
Det åtte aminosyrepepidet (Ac-Tyr-Val-His-Asp-Ala-Pro-Val-Arg-NH2) blir spaltet mest effektivt, mens fire og seks aminosyrepeptidene ikke blir spaltet. IL-lfi pro har derfor et minimalt antall aminosyreresidier nødvendig for substratpeptidspaltning.
EKSEMPEL 3: Syntese av IL- lfi proteaseinhibitorer
A. Syntese av Boc- Asp- CH2F
En suspensjon av Boc-Asp-OH (8,11 mmol) og fluoreddiksyreanhydrid (16,2 mmol) i benzen (30 ml) ble behandlet med trietylamin (16,2 mmol) ved romtemperatur. Katalysatoren 4-dimetylaminopyridin (0,41 mmol) ble tilsatt til oppløsningen og reaksjonen ble omrørt i omtrent 2 timer ved romtemperatur. Omtrent 100 ml benzen ble tilsatt til reaksjonsblandingen. Den organiske oppløsningen ble vasket med 1 N HC1 (2 x 50 ml), mettet NaHC03 (2 x 50 ml) og mettet NaCl (2 x 50 ml), etterfulgt av tørking over vannfri MgSCty. Oppløsningsmidlet ble deretter fjernet ved avdampning under redusert trykk. Den resulterende oljen ble applisert på en 2,5 x 80 cm kolonne av silikagel (60-200 mesh). Tittelforbindelsen ble eluert med 2 % metanol j, kloroform.
B. Syntese av Boc- His- Asp- CH^ F, Boc- Tyr- Asp- CH2F og Boc- Phe- Asp-CH2E
Boc-Asp-CH2F fremstilt i henhold til metoden i eksempel 3A ovenfor kan bli løst opp i trifluoreddiksyre (TFA) og blandingen omrørt i omtrent 5 minutter ved omtrent 23°C. Kald eter kan deretter bli tilsatt til blandingen. Eter blir avdampet og toluen tilsatt til ko-avdampet gjenværende TF A. Det avspaltede peptidet (H-Asp-CH2F) blir oppnådd som et TFA salt. Det avspaltede peptidet kan deretter bli koblet til en beskyttet aminosyre (dvs Boc-HisOH, Boc-ProOH, Boc-TyrOH, Boc-PheOH) ved anvendlelse av en standard symmetrisk anhydridprosedyre som anvender dicykloheksylkarbodimid som et koblingsreagens. Bodanszky, ovenfor.
C. Syntese av Ac- His- Aso- CH2F. Ac- Pro- Asp- CH2 F. Ac- Tvr- Asp- CH2F op Ac- Phe- Asp- CHg F
Boe beskyttelsesgruppene kan bli fjernet fra forbindelsene dannet i henhold til fremgangsmåten i eksempel 3B ved anvendelse av trifluoreddiksyre som beskrevet ovenfor. Hver avspaltet forbindelse kan deretter bli acetylert med eddiksyreanhydrid og diisopropylamin (DIAE) ifølge standardteknikker. Stuart et al, ovenfor.
D. Syntese av Cbz- His- Asp- CH2F. Cbz- Pro- Asp- CH2F. Cbz- Tvr- Asp- CH2F
oe Cbz- Phe- Asp- CH2F
Boe beskyttelsesgruppen kan bli fjernet fra Boc-Asp-CH2F fremstilt ifølge fremgangsmåten i eksempel 3 A ved anvendelse av TFA som beskrevet ovenfor. Benzyloksykarbonyl-beskyttede aminosyrer (dvs Cbz-His-OH, Cbz-Phe-OH, Cbz-TyrOH, Cbz-Pro-OH) tilgjengelig fra kommersielle kilder (Bachem, Philadelphia, PA) kan deretter bli koblet til avspaltet Asp ved anvendelse av en symmetrisk anhydridkoblingsprosedyre. Bodanszky, ovenfor.
EKSEMPEL 4: Inhibisjon av IL- IB proaktivitet
Boc-Asp-CH2F ble testet for evnen til å inhibiere IL-1B pro katalysert degradering av prelL-lfi ved anvendelse av en in vi tro analysemetode. Black et al, J. Biol. Chem., 263(19): 9437 (1988). Resultatene av denne studien er vist i figur 3. Boc-Asp-CH2F ble dannet i henhold til metoden i eksempel IA. ri.
A. Produksjon av preIL- lB
Forløper preEL-IB polypeptidet ble oppnådd fra E.coli ved anvendelse av standard rekombinante DNA teknikker, Black, ovenfor. Rekombinant prelL-lfi ble uttrykt i E.coli under kontroll av fagen, Pl promoteren og CI857<*8> termolabil repressor. Ved anvendelse av standard rekombinante DNA teknikker ble pLNIL-lBF konstruert ved ligering av følgende DNA segmenter: (1) 6160 basepar av Nco I/Hind ID-spaltet pLNIL-lfl (12) inneholdende vektoren (som gir ampicillinresistens), kodonene 134-269 og 3' ikke-kodende regioner til HuIL-lB; (2) komplementære syntetiske oligonukleotider kodende for residiene 1-6 til IL-IB og Nco I og Sst I komplementære ender; og (3) et 380-basepar Sst I/Hind III restriksjonsfragment fra plasmid IL-13-6(1) kodende for residiene 7-133. Ligeringsblandingen ble transformert inn i den tetracyklin-resistente verten RRI:pRK248cI<ts> og riktig oppstilte plasmider ble identifisert ved restriksjonsanalyse av DNA isolert fra transformanter resisitente overfor både ampicillin og tetracyklin. Transformanter inneholdende pLNIL-lBF ble testet for produksjon av prelL-lfi ved SDS-PAGE analyse av kulturer dyrket i superinduksjonsmedium til A500 av 0,5 og derepressert i 1-20 timer ved forhøyning av temperaturen fra 30° til 42°C. Et protein på omtrent 31.000 dalton var tydelig i prøvene fra pLNIL-lBF inneholdende kulturer, men ikke i kontrollkulturer som mangler IL-IB kodende region. Immuno-dot blott analyse med et anti-IL-lB monoklonalt antistoff (MAb) og renset rekombinant moden IL-lfi som en standard indikerer at kulturene inneholdt omtrent 2,5-5,0 ug/ml preIL-lB.
B. Ekstrahering av preIL- lB fra E. coli
Cellepelleter fra 2,5 liter overført E.coli kultur ble resuspendert i 20 ml 30 mM tris-HCl buffer (pH 9,5) inneholdende 5 mM etylendiamintetraeddiksyre (EDTA), 500 ug/ml lysozym, og 1 mM fenylmetansulfonyl (PMSF). Cellesuspensjonene ble homogenisert ved anvendelse av en Polytron homogenisator (Brinkmann Instruments), hurtig fryst i et tønis/metanolbad og deretter tint. Deretter ble 200 ml 30 mM tris-HCl buffer (pH 8,0) inneholdende 150 mM NaCl og 1 mM PMSF tilsatt til suspensjonene som ble homogenisert helt til et jevnt homogenat ble oppnådd. Suspensjonene ble inkubert i 30 minutter ved 4°C, sentrifugert ved 4°C i 6 minutter ved 3800 X g. Supernatantfraksjonene ble forsiktig dekantert og filtrert for å fjerne partikkelformige materialer. Pelletene ble på ny ekstrahert i 200 ml 30 mM tris-HCl buffer (pH 8,0) inneholdende 150 mM NaCl, 8 M urea og 1 mM PMSF. På grunn av at både tris og ureaekstraktene inneholdt vesentlige mengder preIL-16 ble begge renset som beskrevet nedenfor.
C. Rensing av preIL- lB
Alle kromatografiske prosedyrene ble utført ved 4°C. Alle fraksjonene ble analysert for proteinkonstentrasjon og ledningsevnen ble målt der hvor det var hensiktsmessig. Etter hvert kromatografitrinn ble fraksjonene analysert ved natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelektroforese SDS-PAGE (med en 10-20 % gradient av polyakrylamid), etterfulgt av sølvfarging og ved Western blott ved anvendelse av en MAb dannet mot renset moden IL-IB.
Ekstraktene ble fortynnet 1:4 i H2O, pH justert til 8,1 og materialet ble applisert i 100 ml/time på en 25 x 2,5 cm Q-Sepharose kolonne. For tris-ekstraktet ble kolonnen ekvilibrert i 10 mM tris-HCl (pH 8,1). For ureaekstraktet ble kolonnen ekvilibrert i 10 mM tris-HCl (pH 8,1), 2 M urea. Kolonnene ble vasket med 8 kolonnevolum 10 mM tris-HCl (pH 8,1) og de bundne proteinene ble eluert med en lineær gradient (3 kolonnevolum) varierende fra 0 til 1,5 M NaCl i 10 mM tris-HCl (pH 8,1). Fraksjoner på 7,5 ml ble samlet og lagret ved 4°C frem til det neste rensingstrinnet.
Q-Sepharose fraksjoner inneholdende preIL-lB (bestemt ved Western blott analyse) ble slått sammen og fortynnet 1:10 i 10 mM tris-HCl (pH 8,1). Kolonnen ble vasket med 4 kolonnevolum av utgangsbufferen.
Tris-HCl oppløsningen ble applisert på en 20 x 5 cm kolonne av fenyl-Sepharose CL-1B som var blitt ekvilibrert i 10 mM tris-HCl buffer (pH 8,0) inneholdende 0,2 M (NH4)2SC>4. Kolonnen ble vasket med 3 kolonnevolumer av utgangsbufferen og deretter ble materialet eluert innledningsvis med 4 kolonnevolum av en reduserende lineær gradient av (NH^SC^, dannet med 0,2 og 0 M oppløsninger i 10 mM tris-HCl buffer (pH 8,1). Til slutt ble materialet eluert med 2 kolonnevolum 10 mM tris-HCl (pH 8,1). Fraksjoner inneholdende delvis renset preIL-lB ble slått sammen, dialysert mot PBS og lagret ved -70°C frem til anvendelsen.
D. Proteolytisk behandling av preIL- 16
5 ul preIL-lB (omtrent 50 ug/ml i PBS) ble blandet med 10 (il renset IL-1B pro (15-75 fig/ml i BPS) og inkubert ved 37°C i 30 minutter. Inkubasjonen ble avsluttet ved å plassere prøvene på tørris eller ved tilsetning av SDS prøvebuffer. PMSF ble deretter tilsatt til en konsentrasjon på 1 mM og prøvene ble dialysert mot vann. Etter dialyse ble prøvene konsentrert til tørrhet i en Speed-Vac konsentrater og løst opp i SDS prøvebuffer.
E. Western blott analyse av protolvtiske produkter
SDS-PAGE ble utført med 12 % polyakrylamidgeler. Gelene ble plassert i overføringsbuffer (0,192 M glycin. 0,025 M tris-HCl (pH 8,3), 20 % v/v metanol), og protein ble deretter elektroforert på nitrocellulose (Sartorius) i en Hoeffer overføringsapparatur (1 time ved maksimal strømstyrke). Nitrocellulose ble deretter plassert i 20 mM natriumfosfat, pH 7,4 (PBS) inneholdende 3 % bovinserumalbumin i minst 15 minutter ved romtemperatur. Det ble anvendt et MAb som var spesifikt for moden IL-IB for å probe blottet. MAb ble tilsatt til en konsentrasjon på 9 ug/ml og inkubasjon ble fortsatt i 30 minutter. Blottet ble deretter skylt tre ganger med PBS og ble utviklet med en oppløsning oppnådd ved blanding av 6 mg pepperrotperoksydase utviklingsreagens (Bio-Rad) oppløst i 2 ml metanol og hydrogenperoksid (60 ul fortynnet inn i 10 ml tris-buffret saltvann).
Dataene viser at Boc-Asp-CH2F fullstendig inhiberer dannelsen av moden IL-IB fra preIL-lB med en konsentrasjon på 5 uM og inhiberer delvis dannelsen av moden IL-1 B i en konsentrasjon på 1 uM.
EKSEMPEL 5: Biologisk aktivitet til IL- IB pro når transfektert inn i COS- 7 celler
Det ble skutt inn et cDNA tilsvarende aminosyrene 120 til 404 inn i en pattedyrcelleekspresjonsvektor (pDC303). Dette plasmidet ble kotransfektert inn i COS-7 celler (apenyre) med et andre pattedyrekspresjonsplasmid inneholdende et cDNA kodende for forløper EL-1B. Etter to dager ble cellene radioaktivt merket med ^ 5$ 0g IL-lfi spesifikke proteiner ble immunopresipitert fra cellelysatene. Immunopresipitatene ble analysert ved SDS-PAGE og autoradiografi. Transfekterte COS-7 celler kan prosessere forløper IL-lfi til moden IL-lfi bare dersom cellene ble ko-transfektert med et plasmid kodende for IL-lfi pro. Celler ko-transfektert med et kontrollplasmid eller celler som ble blanktransfektert viste ingen prosessering av forløper IL-16. IL-16 pro som mangler de N-terminale 119 aminosyrene muliggjør at cellene prosesserer forløper IL-16 til den modne formen av dette proteinet.
f, ■

Claims (10)

  1. Forbindelse karakterisert ved at den har formelen (I): (I) Z-Q2-Asp-Ql, der: Z er en N-terminal beskyttelsesgruppe Q2 er O til 1 aminosyrer; og QI er en elektronegativ avspaltbar gruppe.
  2. 2. Forbindelse ifølge krav 1,karakterisert ved atZer Ci-Ce-alkyl, benzyl, acetyl, C|-C6-alkoksykarbonyl, benzyloksykarbonyl eller Ci-Ce-alkylkarbonyl.
  3. 3. Forbindelse ifølge krav 2, karakterisert ved atZer t-butoksykarbonyl, acetyl eller benzyloksykarbonyl.
  4. 4. Forbindelse ifølge krav 1,karakterisert ved at Qi er et aldehyd, et diazometylketon eller et halometylketon.
  5. 5. Forbindelse ifølge krav 4, karakterisert ved at Qi er et fluormetylketon.
  6. 6. Forbindelse ifølge krav 4, karakterisert ved at Qi er et aldehyd.
  7. 7. Forbindelse ifølge krav 1, karakterisert ved at Qj er en aminosyre.
  8. 8. Forbindelse ifølge krav 7, karakterisert ved atQ2er His, Phe, Pro eller Tyr.
  9. 9. Forbindelse ifølge krav 1,karakterisert ved at den er utvalgt fra gruppen Boc-Asp-CH2F, Boc-His-Asp-CH2F, Boc-Phe-Asp-CH2F, Boc-Pro-Asp-CH2F, Boc-Tyr-Asp-CH2F, Ac-His-Asp-CH2F, Ac-Pro-Asp-CH2F, Ac-Tyr-Asp-CH2F, Cbz-His-Asp-CH2F, Cbz.Phe-Asp-CH2F, Cbz-Pro-Asp-CH2F, eller CbzTyr-Asp-CH2F der Boe er t-butoksykarbonyl, Ac er acetyl og Cbz er benzyloksykarbonyl.
  10. 10. Farmasøytisk preparat, karakterisert ved at det omfatter en forbindelse ifølge ethvert av kravene 1-9 og en fysiologisk akseptabel bærer.
NO19934335A 1991-08-30 1993-11-30 Interlaukin 1<beta> protease og interlaukin 1<beta> proteaseinhibitorer NO317129B1 (no)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US75064491A 1991-08-30 1991-08-30
PCT/US1991/006595 WO1993005071A1 (en) 1991-08-30 1991-09-12 INTERLEUKIN 1β PROTEASE AND INTERLEUKIN 1β PROTEASE INHIBITORS

Publications (3)

Publication Number Publication Date
NO934335D0 NO934335D0 (no) 1993-11-30
NO934335L NO934335L (no) 1993-11-30
NO317129B1 true NO317129B1 (no) 2004-08-23

Family

ID=25018683

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO19934335A NO317129B1 (no) 1991-08-30 1993-11-30 Interlaukin 1<beta> protease og interlaukin 1<beta> proteaseinhibitorer

Country Status (22)

Country Link
US (2) US5756465A (no)
EP (2) EP0600880B1 (no)
JP (3) JP2759895B2 (no)
KR (1) KR100226296B1 (no)
AT (1) ATE257517T1 (no)
AU (1) AU657701B2 (no)
CA (1) CA2111100C (no)
DE (1) DE69133354T2 (no)
DK (1) DK0600880T3 (no)
ES (1) ES2213138T3 (no)
FI (1) FI935020A (no)
HK (1) HK1014013A1 (no)
HU (1) HU220098B (no)
IE (1) IE913268A1 (no)
IL (2) IL99598A (no)
MX (1) MX9101346A (no)
MY (1) MY131144A (no)
NO (1) NO317129B1 (no)
NZ (3) NZ335312A (no)
PT (1) PT99118B (no)
RU (2) RU2206611C2 (no)
WO (1) WO1993005071A1 (no)

Families Citing this family (52)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5874424A (en) * 1995-12-20 1999-02-23 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Inhibitors of interleukin-1β converting enzyme
US6008217A (en) * 1995-12-20 1999-12-28 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Inhibitors of interleukin-1β converting enzyme
US6204261B1 (en) 1995-12-20 2001-03-20 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Inhibitors of interleukin-1β Converting enzyme inhibitors
US6995141B1 (en) 1990-04-04 2006-02-07 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Interleukin 1β protease and interleukin 1β protease inhibitors
HU220098B (hu) * 1991-08-30 2001-10-28 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Interleukin-1 béta proteáz enzim, és interleukin-1 béta proteáz inhibitorok
IL105741A0 (en) * 1992-05-22 1993-09-22 Genta Inc Pharmaceutical compositions for treating cellular hyperproliferation using interleukin-1 inhibitory compounds
US5462939A (en) * 1993-05-07 1995-10-31 Sterling Winthrop Inc. Peptidic ketones as interleukin-1β-converting enzyme inhibitors
JPH0789951A (ja) * 1993-06-03 1995-04-04 Sterling Winthrop Inc インターロイキン−１β転換酵素阻害剤
US5843905A (en) * 1993-06-04 1998-12-01 Vertex Pharmaceuticals, Incorporated Peptidic phosphinyloxymethyl ketones as interleukin-1β-converting enzyme inhibitors
DE69413167T2 (de) * 1993-06-04 1999-05-06 Vertex Pharma Peptid-Phosphinyloxymethyl-Ketonen als Inhibitoren von Interleukin-1 beta-konvertierenden Enzymen
EP0711174A4 (en) * 1993-06-24 1997-11-12 Gen Hospital Corp REGULATORY GENES OF PROGRAMMED CELL DEATH AND PROTEINS
US6087160A (en) * 1993-06-24 2000-07-11 The General Hospital Corporation Programmed cell death genes and proteins
US5716929A (en) * 1994-06-17 1998-02-10 Vertex Pharmaceuticals, Inc. Inhibitors of interleukin-1β converting enzyme
US5756466A (en) 1994-06-17 1998-05-26 Vertex Pharmaceuticals, Inc. Inhibitors of interleukin-1β converting enzyme
US5847135A (en) * 1994-06-17 1998-12-08 Vertex Pharmaceuticals, Incorporated Inhibitors of interleukin-1β converting enzyme
US6420522B1 (en) 1995-06-05 2002-07-16 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Inhibitors of interleukin-1β converting enzyme
US5955072A (en) * 1994-07-13 1999-09-21 Sankyo Company, Limited Expression systems utilizing autolyzing fusion proteins and a reducing polypeptide
CA2202549C (en) * 1994-10-14 2003-08-05 Tara Seshadri Transgenic nonhuman animal having functionally disrupted interleukin-1.beta. converting enzyme gene
CA2215211A1 (en) * 1995-03-31 1996-10-03 Takeda Chemical Industries, Ltd. Cysteine protease inhibitor
US5869315A (en) * 1995-12-18 1999-02-09 Basf Aktiengesellschaft Modified interleukin-1β converting enzyme with increased stability
US5843904A (en) * 1995-12-20 1998-12-01 Vertex Pharmaceuticals, Inc. Inhibitors of interleukin-1βconverting enzyme
US6288037B1 (en) 1996-01-29 2001-09-11 Basf Aktiengesellschaft Substrates and inhibitors for cysteine protease ICH-1
US6416753B1 (en) 1996-03-15 2002-07-09 The General Hospital Corporation Method for modulating apoptosis
US6610683B2 (en) 1996-09-12 2003-08-26 Idun Pharmaceuticals, Inc. Treatment of infectious disease using interleukin-1β-converting enzyme (ICE)/CED-3 family inhibitors
US6531467B2 (en) 1996-09-12 2003-03-11 Idun Pharmaceuticals, Inc. Inhibition of inflammation using interleukin-1β-converting enzyme (ICE)/CED-3 family inhibitors
US6200969B1 (en) 1996-09-12 2001-03-13 Idun Pharmaceuticals, Inc. Inhibition of apoptosis using interleukin-1β-converting enzyme (ICE)/CED-3 family inhibitors
US6184244B1 (en) 1996-12-16 2001-02-06 Idun Pharmaceuticals, Inc. C-terminal modified (N-substituted)-2-indolyl dipeptides as inhibitors of the ICE/ced-3 family of cysteine proteases
US6054487A (en) * 1997-03-18 2000-04-25 Basf Aktiengesellschaft Methods and compositions for modulating responsiveness to corticosteroids
US6184210B1 (en) 1997-10-10 2001-02-06 Cytovia, Inc. Dipeptide apoptosis inhibitors and the use thereof
KR100580333B1 (ko) * 1997-10-10 2006-05-16 시토비아 인크. 디펩티드 고사 억제제 및 그의 용도
WO1999046248A1 (en) 1998-03-09 1999-09-16 Vertex Pharmaceuticals Incorporated 1,2-diazepane derivatives as interleukin-1beta converting enzyme inhibitors
CA2323439A1 (en) * 1998-03-16 1999-09-23 Cytovia, Inc. Dipeptide caspase inhibitors and the use thereof
PT1064298E (pt) 1998-03-19 2009-01-02 Vertex Pharma Inibidores de caspasas
CN1346344A (zh) * 1999-03-16 2002-04-24 西托维亚公司 取代的2－氨基苯甲酰胺天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶抑制剂及其应用
DE19915465A1 (de) * 1999-04-06 2000-10-19 Apotech Res & Dev Ltd Verwendung eines Caspase-Inhibitors zur Proliferationshemmung von Zellen und Verwendung eines oder mehrerer Caspase-Inhibitors/en zur Behandlung von Erkrankungen beruhend auf Lymphozyten-Hyperproliferation oder zur Suppression einer Immunantwort durch Lymphozyten
JP2002541237A (ja) * 1999-04-09 2002-12-03 サイトビア インコーポレイテッド カスパーゼインヒビターおよびその使用
AU770380B2 (en) * 1999-06-14 2004-02-19 Wisconsin Alumni Research Foundation Oligomers and polymers of cyclic imino carboxylic acids
US6495522B1 (en) 1999-08-27 2002-12-17 Cytovia, Inc. Substituted alpha-hydroxy acid caspase inhibitors and the use thereof
US6566338B1 (en) 1999-10-12 2003-05-20 Cytovia, Inc. Caspase inhibitors for the treatment and prevention of chemotherapy and radiation therapy induced cell death
AU2001249619B2 (en) 2000-03-29 2006-08-17 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Carbamate caspase inhibitors and uses thereof
EP1923386A3 (en) 2000-03-29 2008-05-28 Vertex Pharmceuticals Incorporated Carbamate caspase inhibitors and uses thereof
WO2001087328A2 (en) * 2000-05-12 2001-11-22 Immunex Corporation Interleukin-1 inhibitors in the treatment of diseases
PE20011350A1 (es) 2000-05-19 2002-01-15 Vertex Pharma PROFARMACO DE UN INHIBIDOR DE ENZIMA CONVERTIDORA DE INTERLEUCINA-1ß (ICE)
EA006860B1 (ru) * 2002-01-29 2006-04-28 Уайт Композиции и способы модулирования гемиканалов коннексина
US7009053B2 (en) 2002-04-30 2006-03-07 Yungjin Pharmaceuticals Co., Ltd. Quinoline derivatives as caspase-3 inhibitor, preparation for producing the same and pharmaceutical composition comprising the same
AU2004275821A1 (en) * 2003-09-25 2005-04-07 Dmi Biosciences Inc. Methods and products which utilize N-acyl-L-aspartic acid
CA2566362C (en) 2004-05-15 2013-09-10 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Treating seizures using ice inhibitors
GB0411056D0 (en) 2004-05-18 2004-06-23 Novartis Ag Organic compounds
CN1980658A (zh) 2004-05-27 2007-06-13 沃泰克斯药物股份有限公司 治疗自身炎性疾病的ice抑制剂
US7618801B2 (en) * 2007-10-30 2009-11-17 Danison US Inc. Streptomyces protease
WO2012061786A1 (en) 2010-11-05 2012-05-10 Brandeis University Ice cleaved alpha-synuclein a biomarker
US9956260B1 (en) 2011-07-22 2018-05-01 The J. David Gladstone Institutes Treatment of HIV-1 infection and AIDS

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB2124233B (en) * 1982-07-19 1985-09-18 Nat Res Dev Synthetic peptides and their preparation
US4636492A (en) * 1984-08-29 1987-01-13 E. I. Du Pont De Nemours And Company Inhibition of viral protease activity by peptide halomethyl ketones
US5104853A (en) * 1984-12-11 1992-04-14 California Biotechnology Inc. Alveolar surfactant proteins having cys to ser mutations
US4644055A (en) * 1984-12-17 1987-02-17 E. I. Du Pont De Nemours And Company Method for preparing specific inhibitors of virus-specified proteases
JPS63145300A (ja) * 1984-12-17 1988-06-17 イ−・アイ・デユポン・デ・ニモアス・アンド・カンパニ− ウイルスにより特定されているプロテア−ゼの特異的阻害剤を製造する方法
US5225354A (en) * 1986-08-22 1993-07-06 Molecular Diagnostics, Inc. Monoclonal antibodies specific for human glycoalbumin
WO1991000912A1 (en) * 1989-07-07 1991-01-24 Massachusetts Institute Of Technology Production and use of hybrid protease inhibitors
AU7775991A (en) * 1990-04-04 1991-10-30 Immunex Corporation Interleukin 1beta protease
US5298421A (en) * 1990-04-26 1994-03-29 Calgene, Inc. Plant medium-chain-preferring acyl-ACP thioesterases and related methods
EP0533350B1 (en) * 1991-08-16 1999-05-26 Merck & Co. Inc. DNA encoding precursor interleukin 1B converting enzyme
HU220098B (hu) * 1991-08-30 2001-10-28 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Interleukin-1 béta proteáz enzim, és interleukin-1 béta proteáz inhibitorok

Also Published As

Publication number Publication date
WO1993005071A1 (en) 1993-03-18
US6136787A (en) 2000-10-24
IL99598A0 (en) 1992-08-18
EP0600880A4 (en) 1994-12-21
CA2111100C (en) 2004-11-02
IL99598A (en) 2005-06-19
HUT66057A (en) 1994-09-28
KR100226296B1 (ko) 1999-10-15
HU9303244D0 (en) 1994-03-28
JP2001192397A (ja) 2001-07-17
RU94028712A (ru) 1997-03-10
ES2213138T3 (es) 2004-08-16
HU220098B (hu) 2001-10-28
EP1378573A1 (en) 2004-01-07
IL166791A0 (en) 2006-01-15
ATE257517T1 (de) 2004-01-15
RU2002128757A (ru) 2004-07-27
PT99118A (pt) 1993-02-26
AU657701B2 (en) 1995-03-23
NO934335D0 (no) 1993-11-30
EP0600880A1 (en) 1994-06-15
JPH1028588A (ja) 1998-02-03
FI935020A (fi) 1993-12-03
NO934335L (no) 1993-11-30
CA2111100A1 (en) 1993-03-18
DE69133354D1 (de) 2004-02-12
HK1014013A1 (en) 1999-09-17
AU8537391A (en) 1993-04-05
FI935020A0 (fi) 1993-11-12
EP0600880B1 (en) 2004-01-07
RU2206611C2 (ru) 2003-06-20
JP3445572B2 (ja) 2003-09-08
DE69133354T2 (de) 2004-11-11
NZ248377A (en) 2000-01-28
US5756465A (en) 1998-05-26
DK0600880T3 (da) 2004-04-13
NZ335312A (en) 2005-08-26
NZ239895A (en) 1996-01-26
IE913268A1 (en) 1993-03-10
JPH08505280A (ja) 1996-06-11
PT99118B (pt) 1999-02-26
MX9101346A (es) 1993-02-01
JP2759895B2 (ja) 1998-05-28
MY131144A (en) 2007-07-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
NO317129B1 (no) Interlaukin 1&lt;beta&gt; protease og interlaukin 1&lt;beta&gt; proteaseinhibitorer
US5416013A (en) Interleukin 1β protease and interleukin 1β protease inhibitors
WO1991015577A1 (en) INTERLEUKIN 1&#39;beta&#39; PROTEASE
Mikayama et al. Molecular cloning and functional expression of a cDNA encoding glycosylation-inhibiting factor.
KR101299417B1 (ko) 카복시-말단 아미드화 펩티드를 제조하는 방법
Kikumoto et al. Purification and characterization of recombinant human interleukin-1β produced in Escherichia coli
JPH05255392A (ja) Ａ−ｃ−ｂプロインスリン、その製造法および使用法、およびインスリン生産の中間体
NO301775B1 (no) DNA-sekvens som koder for nye former av kolonistimulerende faktor-1, vektor, ekspresjonssystem og rekombinant vertscelle
WO2021057826A1 (zh) 一种重组白介素-15类似物
NO316122B1 (no) DNA-sekvens som koder for interleukin-1-inhibitorer, rekombinant vektor sominneholder og kan kode DNA-sekvensen, vertcelle som inneholder ogkan uttrykkevektorer, og fremgangsmåte til fremstilling av interleukin-1-inhibitorer, og rekombinant vertcelle s
JPH0787789B2 (ja) リポコルチンをコードするｄｎａ分子および形質転換宿主
Hong et al. Production of C-terminal amidated recombinant salmon calcitonin in Streptomyces lividans
AU2001280442A1 (en) Method for preparing a physiologically active IL-18 polypeptide
EP1292697A2 (en) Method for preparing a physiologically active il-18 polypeptide
US9290582B2 (en) B cell activating factor antagonist and preparation method and use thereof
US20060188474A1 (en) Interleukin 1beta protease and interleukin 1beta protease inhibitors
JPH04190796A (ja) マウスｇｐ１３０蛋白質
AU8076491A (en) A novel vector to produce biologically important peptides
HU211309A9 (hu) Új polipeptid és előállítása
JPH0394682A (ja) ペプチドの製造法
EP0535119A1 (en) A novel vector to produce biologically important peptides