NO301775B1 - DNA-sekvens som koder for nye former av kolonistimulerende faktor-1, vektor, ekspresjonssystem og rekombinant vertscelle - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører DNA-sekvens som koder for human kolonistimulerende faktor-1 (CSF-1), vektor, ekspresjonssystem og rekombinant vertscelle.

Evnen som visse faktorer som blir produsert i veldig lav konsentrasjon i forskjellige vev har til å stimulere vekst og utvikling av benmargsforløperceller til granulocytter og/eller makrofager har vært kjent i nesten 15 år. Tilstedeværelse av slike faktorer i sera, urinprøver, og vevsekstrak-ter fra et antall arter kan demonstreres ved bruk av en in vitro analyse som måler stimulering av kolonidannelse ved benmargsceller sådd i semisolid kulturmedium. Det finnes ikke noen kjent pålitelig in vivo analyse. Siden disse faktorene induserer dannelsen av slike kolonier, er faktorene samlet blitt betegnet kolonistimulerende faktorer (CSF).

Nylig er det blitt vist at det eksisterer minst fire subklasser av humane CSF-proteiner som kan bli definert i henhold til celletypene som blir funnet i de resulterende koloniene. En subklasse, CSF-1 resulterer i kolonier inneholdende hovedsakelig makrofager. Andre subklasser produserer kolonier som inneholder både nøytrofile granulocytter og makrofager; som hovedsakelig inneholder nøytrofile granulocytter; og som inneholder nøytrifile og eosinofile granulocytter og makrofager .

Det finnes murine faktorer som er analoge til de første tre av ovenfor humane CSFer. En murin faktor betegnet IL-3 induserer kolonier fra murine benmargsceller som inneholder alle disse celletypene pluss megakaryocytter, erytrocytter, og mastceller, i forskjellige kombinasjoner. Humant IL-3 er også kjent. Disse CSFene er blitt gjennomgått av Dexter, T.M., Nature (1984) 309:746, og Vadas, M.A. et al, J. Immunol

(1983) 130:793, Metcalf, D. Science (1985) 229:16-22; Clark, S.C. et al, Science (1987) 236:1229-1237. Ved rekombinant produksjon kan proteiner som er medlemmer av den første av disse subklassene, CSF-1 bli dannet. Denne subklassen er blitt viderekarakterisertog beskrevet ved spesifikk radioimmunoanalyse og radioreseptoranalyser-f.eks. antistoffer produsert mot renset CSF-1 har evnen til å undertrykke spesifikk CSF-1 aktivitet, uten å påvirke de biologiske aktivitetene til andre subklasser, og makrofag-cellelinje J774 inneholder reseptorer som binder CSF-1 spesifikt. En beskrivelse av disse analysene ble publisert av Das, S.K., et al, Blood (1981) 58:630.

Rensingsmetode for forskjellige CSF-proteiner er blitt publisert.

Stanley, E.R., et al, J Biol Chem (1977) 252:4305 har beskreve rensing av et CSF-protein fra murine L929-celler til en spesifikk aktivitet på omtrent 1 x 10<8>enheter/mg, som også stimulerte hovedsakelig makrofagproduksjon. Waheed, A., et al, Blood (1982) 60:238, beskrev rensing av muse L-celle CSF-1 til klar homogenitet ved anvendelse av en kanin antistoff-kolonne og rapporterte de første 25 aminosyrene av den murine sekvensen (Ben-Avram, C.M., et al, Proe Nati Acad Sei (USA) (1985) 882:4486.

Stanley, E.R., et al, J Biol Chem (1977) 252:4305-4312 beskriver en rensingsprosedyre for CSF-1 fra menneskeurin og Das, S.K., et al, Blood (1981) 58:630; J Biol Chem (1982) 257:13679 tilveiebragte et humant urin CSF-1 ved en spesifikk aktivitet på 5 x IO<7>enheter/mg som bare produserte makrofagkolonier, og beskrev sammenhengen mellom glykosylering av CSF-1 proteinene fremstilt fra dyrkede muse L-celler og fra human urin og deres aktiviteter. Wang, F.F. , et al, J Cell Biochem (1983) 21:263, isolerte humant urin CSF-1 til spesifikk aktivitet på 10<8>U/mg. Waheed, A., et al, beskriver rensing av humant urin CSF-1 til en spesifikk aktivitet på 0,7-2,3 x IO<7>U/mg på en kanin antistoff kolonne (Exp Hemat

(1984) 12:434).

Wu, M., et al, J Biol Chem (1979) 254:6226 rapporterte preparering av et CSF-protein fra dyrkede humane bukspytt-kjertelkreft (MIAPaCa) cellene som resulterte i veksten av murine granulocytiske og makrofage kolonier. Det resulterende proteinet hadde en spesifikk aktivitet på omtrent 7 x IO<7>enhet/mg.

Delvis rensede preparater fra forskjellige CSFer er også blitt rapportert fra menneske og muse lunge-celle kondisjon-ert media (Fojo, S.S., et al, Biochemistry (1978) 17:3109; Burgess, A.W. , et al, J Biol Chem (1977) 252:1998): fra humane T-lymfoblast-celler (Lusis, A.J., et al, Blood (1981) 57:13; US Patent 4,438,032); fra human morkakekondisjonert medium til klar homogenitet og spesifikk aktivitet på 7 x IO<7>U/mg (Wu, M., et al, Biochemistry (1980) 19:3846).

En signifikant vanskelighet i å anvende CSF-proteiner generelt og CSF-1 spesielt, til noen nyttige funksjoner har vært at de ikke har vært tilgjengelige i distinkte og karakteriserbar form i tilstrekkelige mengder for å gjøre anvendelsen av disse i terapeutiske anvendelser praktisk eller mulig. Foreliggende oppfinnelse bøter på disse manglene ved å tilveiebringe utgangsmateriale for å oppnå renset humant og murint CSF-1 i nyttige mengder ved bruk av rekombinante teknikker.

Et CSF-protein fra en annen subklasse, murin og human GM-CSF er blitt renset og cDNAene er blitt klonet. Dette proteinet har vist seg å være forskjellig fra andre CSFer , f.eks. CSF-1, ved Gough, et al, Nature (1984) 309:763-767. Dette GM-CSF-proteinet er videre beskrevet i W087/02060, publisert 9. april, 1987, som anvendelig for behandling av kreftpasienter for å regenerere hvite blodlegemer etter tradisjonell kreftbehandling, og å redusere sannsynligheten for viral, bakteriell, sopp, og parasitt-infeksjon, så som i acquired immune deficiency syndrome (AIDS). Murin IL-3 er blitt klonet av Fung, M.C., et al, Nature (1984) 307:233. Human og ape IL- 3 er blitt klonet av Yang, Y.-C, et al, Cell (1986) 47:3-10, og av Dorssers, L. , et al, Gene (1987), in press. Se også Yokota, T., et al, PNAS (1984) 81:1070-1074; Wong, G.G., et al, Science (1985) 228:810-815; Lee, F., et al, PNAS (1985) 82:4360-4364; og Cantrell, M.A., et al, PNAS (1985) 82:6250-6254 ).

Kloning av et cDNA som koder for en form av humant CSF-1, spesifikt klonen betegnet heri nedenfor som pcCSF-17, er også publisert (Kawasaki, E.S., et al, Science (1985) (230:292-296): PCT søknad publikasjon Nr. W086/04607, publisert 14. august, 1986. Tilveiebringing av en klon som koder for en "lang form" av humant CSF-1 er publisert av Wong, G.G., et al, Science (1987) 235:1504-1509 og av Ladner, M.D., et al, EMBO J (1987) 6:2693-2698.

Foreliggende oppfinnelse vedrører DNA-sekvens, kjennetegnet ved at den koder for et humant M-CSF-1 NV3 eller NV2 mutein som har minst aminosyresekvensen til NV3 eller NV2/SCSF/CV150 fig. 1 eller NV3 eller NV2/LCSF/CV150 fig. 2 eller en modifikasjon av en av disse hvor 1-5 aminosyrer er substituert eller deletert, og hvori dimerer av nevnte mutein stimulerer dannelsen av hovedsakelig makrofag kolonier i in vitro CSF-1 analysen.

Det er også beskrevet vektor kjennetegnet ved at den inneholder og kan uttrykke en DNA-sekvens ifølge kravene og et replikon som er operativ i en encellet organisme. Det er videre beskrevet ekspresjonssystem kjennetegnet ved at det omfatter en DNA-sekvens eller en vektor ifølge kravene som er operabelt koblet til egnede kontrollsekvenser.

Foreliggende oppfinnelse vedrører også rekombinant vertscelle som er kjennetegnet ved at den er transformert med og kan uttrykke et ekspresjonssystem som angitt ovenfor.

Noen av de spesifikke utformingene av proteinene beskrevet heri inneholder omtrent 522 aminosyrer, eller er fragmenter og/eller muteiner avledet fra de native sekvensene med denne lengden; andre er enkelt eller dobbelt utskiftningsmuteiner av det pcCSF-17 kodete protein. De humane proteinene relatert til den lange formen er beskrevet relativt til aminosyresekvensen vist i figur 2, betegnet LCSF, og de som er relatert til den korte formen til det som er vist i figur 1, betegnet SCSF. Figur 1 viser DNAet og avledet aminosyresekvens for en cDNA-klon som koder for en "kort form" av humant CSF-1 (SCSF), betegnet pcCSF-17. Figur 2 viser cDNAet og avledet aminosyresekvens for et cDNA som koder for en "lang form" av huCSF-1 (LSCF). Figur 3 er et diagram av den genome klonen som viser opprinn-elsen av de korte og lange formene av humant CSF-1. Figur 4 viser cDNAet og den avledete aminosyresekvensen for en murin 4 kb klon som koder for en muCSF-1. Figur 5 viser cDNAet og avledet aminosyresekvens for en murin cDNA 2 kb klon som koder for en lignende muCSF-1. Figur 6 viser RP-HPLC av rekombinant CSF-1 produsert i E. coli fra ekspresjon av et gen som koder for SCSF/CV158. Figur 7 viser RP-HPLC av rekombinant CSF-1 produsert i E. coli fra et gen som koder for aspsg SCSF/CV150. Figur 8 viser RP-HPLC analyse av den korresponderende N-terminal utslettede formen, asp5g SCSF/NV2CV15 0. Figur 9 viser RP-HPLC analyse av ekspresjonsproduktet fra et gen som koder for asp5g SCSF/NV3CV150.

Måter å utføre oppfinnelsen på

A. Definisjoner

"Et protein som har kolonistimulerende faktor-1 (CSF-1) aktivitet" refererer seg til et protein som utviser det spektrum av aktivitet som er kjennetegnet for CSF-1, dvs. når den blir anvendt i en standard in vitro kolonistimulerende analyse til Metcalf, D., J Cell Physiol (1970) 76:89, resulterer det i dannelsen av hovedsakelig makrofagkolonier. Nativt CSF-1 er en glykosylert dimer; i noen tilfeller er dimeriseringen antatt å være nødvendig for aktivitet. Både dimer- og monomerformene er innbefattet innenfor definisjonen av CSF-1 i oppfinnelsen. Den monomere formen kan bli omdannet til dimer ved å tilveiebringe in vitro egnede betingelser, og monomeren er i seg selv nyttig som et antigen for å produsere anti-CSF-1 antistoffer.

Det ser ut til å være noe spesies (art) spesifisitet: Humant CSF-1 kan virke både på humane og på murine benmargceller; murint CSF-1 viser ikke aktivitet med humane celler. "Humant" CSF-1 bør dermed være positiv i den spesifikke murine radioreseptoranalysen til Das, S.K., et al, Blood (1981) 58:630, selv om det nødvendigvis ikke er en fullstendig korrelasjon. Den biologiske aktiviteten til proteinet vil generelt også bli inhibert ved nøytraliserende antiserum til humant urin CSF-1 (Das, S.K., et al, ovenfor). I noen spesielle omstendigheter (så som, for eksempel, hvor et spesielt antistoffpreparat gjenkjenner en CSF-1 epitope som ikke er essensiell for biologisk funksjon, og hvor denne epitopen ikke er tilstede i det bestemte CSF-1 muteinet som blir testet) oppfylles dette kriteriet ikke.

Visse andre egenskaper til CSF-1 er i det siste blitt oppdaget, innbefattende evnen som dette proteinet har til å stimulere utskilling av E prostaglandiner, interleukin-1 og interferon fra modne makrofager (Moore, R., et al, Science

(1984) 223:178). Mekanismen for disse siste aktivitetene er enda ikke forstått, for en definisjon heri, er kriteriet for oppfyllelse av definisjonen evnen til å stimulere dannelsen av monocytt/makrofag kolonier ved bruk av benmargsceller fra den hensiktsmessige arten som utgangsmaterialer, i de fleste tilfellene (se ovenfor) inhibering av denne aktiviteten ved nøytralisering av antiserum mot renset humant urin CSF-1, og, hvor det er hensiktsmessig for arts-type, en positiv respons i radioreseptoranalysen. (Det er kjent at den proliferative effekten til CSF-1 er begrenset til celler fra den mononukle-ære fagocyttiske cellelinjen (Stanley, E.R., The Lymphokines

(1981), Stewart, W.E. , II, et al, ed. Humana Press, Clifton, NJ), s. 102-132) og at reseptorer for CSF-1 er begrenset til disse cellelinjene (Byrne, P.V., et al, Cell Biol (1981) 91:848)) og til morkake tropoblast-relaterte celler.

Som det er tilfelle for alle proteinene, er den nøyaktige kjemiske strukturen avhengig av et antall faktorer. Da ioniserbare amino- og karboksylgrupper er tilstede i mole-kylet, kan et spesielt protein bli tilveiebragt som et surt eller basisk salt, eller i nøytral form. Alle slike preparater som opprettholder deres aktivitet når de blir plassert i egnede omgivende betingelser er innbefattet i definisjonen. Den primære aminosyresekvensen, kan, hvis dette kan bli gjort uten å ødelegge aktiviteten, blir modifisert ved oksydering eller redusering, eller supplert ved derivaterisering ved bruk av sukkerbestanddeler (glykosylering) eller med andre tilleggsmolekyler såsom lipider, fosfat, acetylgruppe og lignende, mere vanlig ved konjugasjon med sakkarider.

Proteiner som blir kodet av genene beskrevet heri kan også bli bearbeidet prosessert. Det er antatt at CSF-1 kan oppstå i naturen i en eller flere C-terminalt utslettede (deleterte) former. Den primære aminosyrestrukturen (enten om den er spaltet i C-terminale enden eller ikke) kan også aggregere for å danne komplekser, vanligvis dimerer. Native humane urin CSF-1 blir isolert som en sterkt glykosylert dimer på 45-90 kd, avhengig av målingsmetoden og identiteten til markøren. Native humane CSF-1 proteiner fra andre kilder, såsom monocytter, HL-60 og PanC-cellelinjer har lignende karakter-trekk. MIAPaCa-avledet CSF-1 ser ut til å være en omfattende blanding av glykosylerte dimere proteiner med monomer molekyl vekter på 70, 48, 40, 30 og 26 kd, bestemt ved immunoblotter av SDS-PAGE. Visse aspekter av slik supplering blir tilveiebragt gjennom posttranslasjons-prosesseringssystemer til verten som produserer disse; andre slike modifikasjoner kan bli innført in vitro. I alle tilfeller, kan slike modifikasjoner bli innbefattet i definisjonen forutsatt at aktiviteten til proteinet, som definert ovenfor, ikke blir ødelagt. Det er selvfølgelig ventet, at slike modifikasjoner kan innvirke kvanitativt eller kvalitativt , på aktiviteten, enten ved forsterking eller redusering av aktiviteten til proteinet i de forskjellige analyser. Utøvere har vist at den ikke-glykosylerte monomeren kan ha aktivitet i noen analyser.

Molekylvekten til deglykosylert monomer er blitt studert, men klare konklusjoner kunne ikke bli trukket i lys av vanskelig-heten ved å forsikre mangel på proteolyse i løpet av fermen-teringen, rensingen, og i deglykosyleringsreaksjonen. Molekylvekten til denne deglykosylerte dimeren ble beskrevet til å være bare 14-17 kd av Das, S.K. , et al, J. Biol Chem

(1982) 257:13679-13684. Rekombinant produsert CSF-1 rapportert av Wong, G.G., et al (1987) (ovenfor) ser ut til å ha en molekylvekt på omtrent 21 kd. På den andre siden, er molekylvekten beregnet på basis av aminosyresekvensen avledet fra "korte" 224 aminosyreformen til CSF (SCSF) i størrelsesorden av 36 kd, mens molekylvekten til "lange" formen (LCSF) er beregnet til å være omtrent 55 kd. Når deleterte konstruksjoner av disse genene blir uttrykt i E. coli (hvor glykosylering ikke oppstår), tilveiebringer disse selvfølgelig proteiner med betraktelig lavere molekylvekt, dvs. 17-18 kd for SCSF/CV150, og omtrent 30 kd for LCSF/CV221. Når LCSF eller SCSF blir uttrykt i pattedyr eller insektceller, blir høyere molekylvekt tilveiebragt, men det er vanskelig å bestemme i hvilken grad disse er forårsaket av glykosylering, og i hvilken grad de er forårsaket av den primære aminosyresekven sen i seg selv. Som beskrevet ovenfor, ser det ut som om det nativt produserte proteinet til og med kan inneholde C-terminal avkortninger.

Det er selvfølgelig velkjent at bakterielt produserte modne proteiner som med en gang går forut for et ATG-startkodon kan eller behøver ikke å ha innbefattet N-terminalt metionin i den formen det blir produsert og utvunnet. Dermed, er begge formene innbefattet. En liten modifikasjon av N-terminale sekvensen kan medvirke til prosessering av N-terminal metionin, og det er blitt vist nedenfor at delesjon av residiene 1 og 2 (begge er glutaminsyre) eller residiene 1-3 (glu-glu-val) medvirker på denne måten. Disse formene er dermed også klart innbefattet i definisjonen.

I tillegg til å tilveiebringe ekspresjonsprodukter som blir mere effektivt prosessert ved N-terminus, er proteinene produsert i E. coli fra genene som koder for disse NV2 og NV3 muteinene relativt homogene når de blir undersøkt ved RP-HPLC, sammenlignet med ekspresjonsproduktene fra genene som koder for former som har beholdt de to N-terminale glutamin-syreresidiene. Denne heterogeniteten kan være et fenomen som er assosiert med bakteriell ekspresjon av disse proteinene siden det ikke forekommer når genene blir uttrykt i pattedyrceller, såsom CV-l celler.

Effekten av N-terminale modifikasjoner på N-terminal metionin-prosessering: Når konstruksjoner som koder for det modne proteinet blir uttrykt intracellulært i E. coli, ser det ut som om essenensielt ikke noe av proteinet som er blitt produsert er blitt prosessert for å fjerne N-terminal metionin, dvs. det sekvenserbare materialet som blir ervervet etter proteinrensing begynner med met. Hvis de korresponderende konstruksjonene som koder for NV2-deletert CSF-1 muteiner blir uttrykt under lignende betingelser, er 23$ av proteinet i N-terminal met-fri form. I NV3-konstruksjonene, øker prosentdelen av protein som blir prosessert ved N-terminus for å fjerne metionin med omtrent 95%.

Med hensyn på heterogenitet, når revers-fase HPLC analyse blir utført på det reduserte CSF-1 protein som er produsert fra forskjellige rekombinante konstruksjoner i E. coli, viser konstruksjoner som koder for endelig N-terminus heterogenitet på to nivåer. Først er det to topper på omtrentelig den samme molekylvekt og den samme tilsynelatende aminosyrekomposisjo-nen som innehar omtrent 70:30 arealforhold. Det er en tilleggstopp resulterende fra en indre restart som oppstår i kloner som koder for tyrosin i residiet 59, som vist i figur 6. Denne komplikasjonen blir fjernet ved å omkonstruere genet oppstrøms for posisjon 65, som beskrevet nedenfor. Konstruksjoner som koder for NV2 og NV3 formene og som koder for en asp i residie 59, fortrinnsvis via et GAT-kodon, viser ikke det indre restart-fragmentet og inneholder bare protein som har retensjonstiden til 70% toppen av de endelige modne proteinkomposisjonene.

I tillegg de N-terminale og C-terminale utslettingene og aggregeringene, kan individuelle aminosyreresidier i kjeden bli modifisert ved oksydering, redusering, eller andre avledete former, av disse proteinene kan også bli spaltet og/eller aggregert for å tilveiebringe fragmenter som bibeholder aktivitet. Slike omdanninger som ikke ødelegger aktiviteten fjerner ikke proteinsekvensen fra definisjonen, og er spesifikt innbefattet. CSF-1 avledet fra andre arter kan passe inn under definisjonen til et protein som har "human" CSF-1 aktivitet i kraft av dets fremvisning av det nødvendige aktivitetsmønster som beskrevet ovenfor med hensyn på humant substrat.

Figur 1 viser aminosyresekvensen til en spesiell form av humant CSF-1 som er kodet av den rekombinante cDNA-klonen pcCSF-17. Dette proteinet inneholder 224 aminosyrer i den endelige sekvensen og en ledersekvens på 32 aminosyrer. Som demonstrert heri, er proteinet produsert som ekspresjonspro-dukt av denne klonen aktivt i analyser som er spesifikke for CSF-1, dvs. benmargsprolifereringsanalysen (hvori aktiviteten blir ødelagt ved tilsetting av anti-CSF-1 antistoffer), kolonistimuleringsanalyser, og en radioreseptoranalyse.

Det endelige proteinet med aminosyresekvens vist i figur 1, avledet fra cDNA-klonen illustrert heri, er betegnet kort CSF-1 (SCSF). Figur 1 viser tilstedeværelse av en antatt signalsekvens med 32 residier, som antageligvis blir spaltet ved utskilling fra pattedyrcellene; SCSF er representert ved aminosyrene 1-224 vist i den figuren. Spesielt innbefattet i oppfinnelsen er muteiner som er monomerer og dimerer av visse relaterte former av SCSF som er designert heri ved at de er forskjellige fra SCSF.

Aminosyresekvensen til SCSF kommer til å bli anvendt som en referanse og andre nært relaterte sekvenser som har CSF-1 aktivitet vil bli designert ved å referere til sekvensen vist i figur 1. Siden N-terminal metionin er eller er ikke tilstede, er begge formene innbefattet i alle tilfellene hvori CSF-1 proteinet blir produsert i bakterien. Substitusjonen av en spesiell aminosyre vil bli merket med referanse til aminosyreresidiet som er erstattet. serggSCSF er f.eks. referert til proteinet som har sekvensen vist i figur 1 med unntagelse av at aminosyre i posisjon 90 er serin istedenfor cystein. Utslettelser fra termini er merket NV etterfulgt av aminosyrenummeret utslettet fra N-terminale sekvensen, eller med CV og posisjonen til den siste aminosyren som er igjen når residiene er utslettet fra den C-terminale sekvensen. "SCSF/NV4" eller "NV4 formen av SCSF" refererer til CSF-1 i figur 1 hvori de 4 første aminosyrene fra det native N-terminus er blitt utslettet; "SCSF/CV130" eller "CV130 formen av SCSF" refererer til CSF-1 hvori de siste 94 aminosyrene etter aminosyre 130 er blitt utslettet. Under er for eksempel asp5gSCSF (som inneholder et asparginsyreresidie som er kodet av genet i posisjon 59 istedenforvtyrosinresidiet som blir kodet av cDNA) illustrert ogSCSF/CV158 som innbefatter bare aminosyrene 1-158 til SCSF.

CSF-1 proteinene, som inneholder aminosyresekvensene relatert til de som er avledet fra utvunnet lang form cDNA, dvs., som innbefatter et 298 aminosyre "ekstra" segment som er satt inn i residiet 150 til det pcCSF-17 kodete protein er betraktet som lange former av proteinet, og aminosyresekvensen vist som 1-522 i figur 2 er vilkårlig betegnet LCSF. Denne kan ha eller behøver ikke å ha metionin forut når det blir produsert i E. coli. Merkingen med hensyn på muteinene til LCSF er analog til det som er beskrevet med hensyn på SCSF ovenfor.

Den 522 aminosyresekvensen som er kodet i, for eksempel, pcDBhuCSF-4 og dets korresponderende kloner er de til LCSF og kan også bli betegnet huCSF-1. Når det gjelder murine sekvenser, koder begge ervervede kloner "lange former" inneholdende 520 aminosyrer. Disse to, nært homologe, sekvenser er kollektivt betegnet muLCSF-1. Forkortelsene anvendt heri innbefatter også "huCSF-1" for alle humane former av proteinet og "muCSF-1" for de murine formene.

"Diskret peptid" eller "mutein" refererer til en bestemt primær aminosyresekvens som ikke er del av en større sekvens. Disse betegnelsene refererer dermed til peptidmolekyler som ikke har videre utvidelser av N- og C- aminosyresekvensen. Proteinpreparatene som har CSF-1 aktivitet som er krevd heri, kan derimot være monomerer, dimerer eller andre aggregater av disse diskrete peptidene eller muteinene.

"Operabelt bundet" refererer til sammenstilling slik at den normale funksjonen til komponentene kan bli utført. En kodende sekvens som er "operabelt bundet" til kontrollsekvensene, refererer til en konfigurasjon hvori den kodende sekvensen kan bli uttrykt under kontroll av disse sekvensene.

"Kontrol1sekvenser" refererer til DNA-sekvenser som er nødvendige for ekspresjon av en operabelt bundet kodende sekvens i en bestemt vertsorganisme. Kontrollsekvensene som er egnet for prokarioter, f.eks., innbefatter en promoter, eventuelt en operatorsekvens, er ribosom bindende sete, og muligens, andre til nå dårlig forståtte sekvenser. Eukaryote celler er kjent for å anvende promotere, polyadenylerings-signaler, og forsterkere.

"Ekspresjonssystem" refererer til DNA-sekvenser inneholdende en ønsket kodende sekvens og kontrollsekvenser som er operabelt bundet, slik at verter som er transformert med disse sekvensene har evnen til å produsere de kodete proteinene. For å tilveiebringe transformering, kan ekspresjonssys-temet være innbefattet på en vektor; men, det relevante DNA kan også være integrert inn i vertskromosomet.

Slik det blir anvendt heri, blir "celle", "cellelinje" og "cellekultur" anvendt om hverandre, og alle slike betegnelser innbefatter avkom. "Transformanter" eller "transformerte celler" innbefatter de primære cellene og kulturene avledet derfra uten hensyn på antall overføringer. Det er også klart at alle avkom ikke behøver å være helt identiske når det gjelder DNA-innhold, forårsaket av tilsiktede eller utilsik-tede mutasjoner. Mutante avkom som har den samme funksjonaliteten som det blir screenet i den opprinnelige transformerte cellen, er innbefattet. Når bestemte betegnelser er ment, vil disse komme klart frem fra sammenhengen.

"Effektiv mengde" betegner en mengde som er effektiv for å utføre den spesifiserte funksjonen, såsom å drepe svulster eller redusere svulst-belastningen eller forhindre eller lege infeksiøse sykdommer.

B. Produksjon av CSF- 1 for farmasøytisk anvendelse:

Glenervervelse av genet

Selv om eksistensen av et aktivitetsmønster betegnet CSF-1 er i noen tid vært kjent, er proteinet som er ansvarlig for dette aldri blitt tilveiebragt i både tilstrekkelig renhet og i tilstrekkelige mengder for å tillate sekvensbestemmelse, heller ikke i tilstrekkelig renhet og mengde for å tilveiebringe en nyttig terapeutisk funksjon. På grunn av at hverken fullstendig rene, praktiske mengder av proteinet eller dets kodende DNA har vært tilgjengelig, har det ikke vært mulig å optimalisere modifikasjonene til strukturen ved å tilveiebringe muteiner, heller ikke har det vært mulig å anvende dette proteinet i en terapeutisk sammenheng.

Anvendelse av rekombinante teknikker retter på disse defekt-ene. Som beskrevet i PCT W086/04607 (ovenfor), ble prober basert på isolerte humane urin CSF-1, N-terminale sekvenser anvendt for å probe det humane genome biblioteket for å tilveiebringe genet med full lengde. Den humane genomt klonede sekvensen kan direkte bli uttrykt ved bruk av dets egne kontrollsekvenser, eller i konstruksjoner som er hensiktsmessige for pattedyrsystemer som har evnen til å prosessere intron. De genome sekvensene ble også anvendt som prober for et humant cDNA-bibliotek tilveiebragt fra en cellelinje som produserer CSF-1 for å tilveiebringe det pcCSF-17 kodende protein med CSF-1 aktivitet. Dette cDNAet, når det blir riktig preparert, kan bli uttrykt direkte i COS eller CV-1 celler og kan bli konstruert i vektorer som er egnet for ekspresjon i et stort antall verter. Som beskrevet i beskrivelsen ovenfor, utviser visse modifikasjoner på den primære strukturen CSF-1 aktivitet.

Det humane cDNA som koder for den 224 aminosyref ormen av proteinet ble anvendt som en probe for å tilveiebringe sekvensene som koder for murint CSF-1 fra en cDNA-bank preparert i XgtlO fra L-929 mENA som var blitt anriket for CSF-1 produksjonsevne. To kloner ble tilveiebragt som kodet for et lignende 520 aminosyreprotein. Klonene divergerte dramatisk i den 3' ikke-translaterte regionen. I den lengre 4 kb murine klonen, er den 3' ikke-translaterte regionen mer enn 2 kb og er lite lik den korresponderende humane sekvensen; den andre, kortere 2 kb klonen inneholder omtrent 500 bp i den ikke-translaterte regionen og viser betraktelig homologi med det korresponderende humane DNA.

Disse lange formene av CSF-1 tilveiebragt fra det murine biblioteket ble deretter anvendt som en basis for å preparere prober for dermed å gjenerverve de korresponderende lange humane sekvensene, hvor dets primære struktur er kodet i genomet. Basert på sammenligning av de murine cDNAene med den humane genome sekvensen, viste en region av genet som noen ganger beter seg som en intron-region, og koder for en aminosyresekvens med betraktelig homologi til det "ekstra" 298 aminosyresegmentet inneholdende i den murine sekvensen. Dette tillot konstruksjon av en oligonukleotidprobe basert på det "ekstra" DNA som var blitt oppdaget, i det murine systemet, translatert til protein. Siden den humane genome sekvensen var tilgjengelig, ble proben konstruert på en slik måte at den inneholdt nøyaktig den humane sekvensen.

pcCSF-17 er blitt konstruert som en Okayama-Berg vektor fra MIAPaCa mRNA anriket for CSF-l-kodende materialer, men, cDNA-biblioteket fra hvilket den lang-form-kodende cDNA var tilveiebragt ble preparert fra totalt mRNA ekstrahert fra MIAPaCa-celler og klonet inn i XgtlO. XgtlO-biblioteket ble først screenet ved bruk av pcCSF-17-sekvenser som probe, og valgte probe-positive kandidater ble screenet ved bruk av en oligonukleotidprobe basert på den "ekstra" translaterte sekvensen til det murine cDNA, men modifisert for å korre-spondere til den relaterte regionen i det humane genomet. Flere kloner som koder for en korresponderende "lang form" av et humant protein ble tilveiebragt.

Den "lange" formen oppstår sannsynligvis fra en forskjell i mRNA-spleising som vist i figur 3. Den "ekstra" kodende sekvensen i mRNA oppstår fra DNA beliggende i oppstrøms ende for exon 6; og den er spleiset ut i den korte formen. Forskjellig mRNA-kodete LCSFer divergerer også ved 3' enden (men ikke i proteinsekvens).

cDNA som koder for den "lange formen" av proteinet fra både de murine og humane systemene kan bli uttrykt på en måte som ligner den som er diskutert for den korte formen ovenfor. Egnede verter innbefatter pattedyrceller, for å tilveiebringe mer effektiv prosessering av det primære proteinproduktet, og, i kraft av ligering i ekspresjonsvektorer, bakterier, gjær, insektceller eller andre verter.

Tilgjengeligheten av DNA som koder for hver av disse sekvensene tilveiebringer muligheten av å modifisere kodonsekvensen for å danne muteinformer som også har CSF-1 aktivitet.

Disse redskapene kan dermed tilveiebringe hele den kodende sekvensen for humant eller murint CSF-1 fra hvilke ekspresjonsvektorer som kan anvendes i en mengde vertssystemer kan bli konstruert og den kodende sekvensen bli uttrykt. Den mengden av verter som er tilgjengelige og ekspresjonsvektorer som er egnet for slike verter tillater at man kan velge mellom posttranslasjons-prosesseringssystemer, og omgivelses-faktorer som tilveiebringer konformasjonsregulering av proteinet som derved blir produsert.

Det er helt klart fra det som er beskrevet ovenfor at deler av den CSF-l-kodende sekvensen er nyttig som prober for å erverve andre CSF-l-kodende sekvenser i forskjellige arter. Dermed kan porsjoner av cDNAet eller det genome DNAet som koder for minst seks aminosyrer bli replikert i E. coli og de denaturerte formene kan bli anvendt som prober for å erverve flere DNAer som koder for CSF-1. På grunn av at det ikke nødvendigvis oppstår en helt nøyaktig matching mellom nukleotidsekvensen i den humane formen og den korresponderende delen til andre former, er oligomerer som inneholder omtrent 18 nukleotider (som koder for den 6 aminosyredelen) sannsynligvis nødvendig for å tilveiebringe hybridisering ved betingelser med tilstrekkelig stringens for å eliminere falsk positive. Sekvenser som koder for 6 aminosyrer ville tilføre tilstrekkelig informasjon for slike prober.

C. Egnede verter, kontrollsystemer og metoder.

Produksjonen av en rekombinant form av CSF-1 innbefatter vanligvis følgende: Først blir et DNA som koder for det endelige (anvendt her for å innbefatte alle muteinene) protein, preproteinet, eller en fusjon av CSF-1 proteinet til en tilleggssekvens som ikke ødelegger dets aktivitet eller til tilleggssekvens som er spaltbar under kontrollerte betingelser (såsom behandling med peptidase) for å tilveiebringe et aktivt protein, tilveiebragt. Hvis sekvensen ikke er avbrutt av introns er den egnet for ekspresjon i en hvilken som helst vert. Hvis det finnes introns, kan man oppnå ekspresjon i pattedyr eller andre eukaryote systemer som kan prosessere disse. Denne sekvensen bør være i utspaltbar og erholdelig form. Det utspaltede eller den utvunnete kodete sekvensen blir deretter fortrinnsvis plassert i operabel binding med egnede kontrollsekvenser i en replikerbar ekspresjonsvektor. Vektoren blir anvendt for å transformere en egnet vert og den transformerte verten blir dyrket under egnede betingelser for å tilveiebringe produksjon av rekombinant CSF-1. Eventuelt blir CSF-1 isolert fra mediet eller fra cellene; utvinning og rensing av proteinet er noen ganger ikke nødvendig, i de tilfeller hvor noen urenheter kan bli tolerert. For eksempel, ved in vitro styrking av celler hvorfra en lymfokinfaktor vil bli isolert for administrering til et individ, er fullstendig renhet noen ganger ikke påkrevet. Direkte anvendelse i terapi ved administrering til et individ ville, selvfølgelig, kreve rensing av det produserte CSF-1.

Ever av de foregående trinnene kan bli "utført på mange forskjellige måter. For eksempel, kan de ønskede kodende sekvensene bli tilveiebragt ved å preparere egnede cDNA fra cellulær meddeler (messenger) og manipulering av cDNAet for å tilveiebringe hele sekvensen. Alternativt, så kan de genome fragmentene bli tilveiebragt og anvendt direkte i hensiktsmessige verter. Konstruksjoner for ekspresjonsvektorer som er operable i en mengde verter blir utført ved bruk av hensiktsmessig replikons og kontrollsekvenser, som beskrevet nedenfor. Egnede restriksjonsseter kan, hvis ikke de normalt er tilgjengelige, bli tilført endende i den kodende sekvensen for å tilveiebringe et utspaltbart gen for å sette inn i disse vektorene.

Kontrollsekvensene, ekspresjonsvektorene, og transformerings-metodene er avhengig av vertscelletype som ble anvendt for å uttrykke genet. Generelt er prokaryote, gjær, insekt eller pattedyrceller anvendbare som verter. Siden nativt CSF-1 blir utskilt som en glykosylert dimer, er vertssystemer som har evnen til riktig posttranslasjonsprosessering foretrukket. Siden prokaryote verter ikke har evnen til å tilveiebringe glykosylering eller kontrollert dimerisering, er disse vertene bare hensiktsmessige hvis den ikke-glykosylerte formen kan bli renset og prosessert til en aktiv form. Dette gjelder CSF-1. CSF-1 kan effektivt bli produsert som en monomer i E. coli og foldet på nytt ved bruk av forskjellige teknikker til et aktivt, ikke-glykosylert dimer form.

Eukaryote celler kan derimot også bli anvendt. Spesielt, insekt eller pattedyrceller er foretrukket. Hvis utskilling er ønskelig, er det mere sannsynlig at den native signalsekvensen vil bli gjenkjent av insekt- eller pattedyrcelleverter som gjør slik utskilling mulig, og derfor, letter rensingen. CSF-1 blir stabilt produsert i CHO-celler, og kan også bli produsert i stabilt transformerte CV-l-celler og virus-infiserte insektceller.

Når det gjelder humant CSF-1, akkumulerer nå bevis som tyder på at det kan oppstå betraktelig utsletting ved C-terminus av proteinet under både rekombinant og native betingelser, og at in vitro aktiviteten til proteinet blir beholdt. Det ser ut som om de native proteinene som blir isolert kan være i en slags C-terminal avkortet form eller blandinger derav, og kan utvise variabel C-terminal prosessering. Aktiviteten til disse "avkortede" formene er bestemt ved deres tilsiktede produksjon. Muteinet produsert fra DNA som koder for SCSF/CV150, er fullstendig aktivt i analyser for CSF-1, og likeledes det som blir produsert fra cDNA som koder for LCSF/CV190V Produkter fra rekombinant ekspresjon fra både lange og korte former av genene ser ut til å ha lavere subenhetmolekylvekter enn det som er ventet fra sekvens med full lengde. Det er antatt at "naturlig" prosessering kan oppstå ved forskjellige proteolyttiske seter, innbefattende, for eksempel i den lange formen, ved arg-residiet ved 223, lys-residiet ved 238, arg-residiet ved 249, eller arg ved 411. Siden det er konstatert at visse C-terminal forkortede former er aktive, kan anvendte konstruksjoner også innbefatte de korresponderende forkortede formene av den kodende sekvensen.

Cl. Kontrollsekvenser og korresponderende verter Prokaryoter er som oftest representert ved forskjellige E. coli-stammer. Andre mikrobielle stammer kan derimot også bli anvendt, såsom basiller, for eksempel Bacillus subtilis, forskjellige Pseudomonas-arter eller andre bakterielle stammer. I slike prokaryote systemer, blir plasmidvektorer som inneholder réplikeringsseter og kontrollsekvenser avledet fra en art som er kompatibel med verten anvendt. For eksempel, E. coli blir vanligvis transformert ved bruk av pBR322-derivater, et plasmid avledet fra en E. coli-art av Bolivar, et al, Gene (1977) 2:95. pBR322 inneholder genene for ampicillin og tetracyklin resistens, og tilveiebringer dermed flere markører som enten kan bli beholdt eller ødelagt ved konstruering av den ønskede vektoren. Prokaryote kontroll sekvenser som vanligvis blir anvendt er definert heri til å innbefatte promotere for transkripsjonsinitiering, eventuelt med en operator, sammen med ribosom-bindingssete-sekvenser, innbefattende så vanlige promotere som beta-laktamase (penicillinase) og laktose (lac) promoter-systemer (Chang, et al, Nature (1977) 198:1056 og tryptofan (trp) promoter-systemet (Goeddel, et al, Nucleic Acids Res (1980) 8:4057 og lambda-avledet PL~promoter og N-gen ribosom-bindingssete (Shimatake, et al, Nature (1981) 292:128), som er blitt gjort nyttig som en transportabel kontrollkassett. En hvilket som helst tilgjengelig promoterssystem som er kompatibel med prokaryoter kan bli anvendt.

Det var opprinnelig noe motstand mot bruk av bakterielle systemer når det gjelder CSF-1 i lys av dets store post-translasjonsprosesseringsgrad, som innbefatter glykosylering og dimerisering. I tillegg, er det et stort antall cysteinresidier, spesielt, i den N-terminale delen av proteinet. Det er, til og med, totalt ti cysteinresidier i LCSF-subenheten, den siste er i posisjon 225; og det er syv i SCSF. Begge disse inneholder cysteinresidier i posisjonene 7, 31, 49, 90, 102, 139, 146; den lange formen har i tillegg cysteiner i 157, 159 og 225. Det er antatt at prosessering for å danne dimer innbefatter dannelse av multiple intrakjeder og minst en interkjede-binding. Teknikker er tilgjengelige, for omfolding av bakterielt produserte proteiner av denne typen, og spesifikke protokoller som er nyttige til fremstilling av rensede biologisk aktive CSF-1 fra bakterier er blitt utviklet. I tillegg til bakterier, kan eukaryote mikrober, såsom gjær, bli anvendt som verter. Laboratoriestammer av Saccharomyces cerevisiae, Bakers gjær, er de som blir anvendt mest selv om et stort antall andre stammer er vanlig tilgjengelige. Mens vektorer som anvender to mikron replikasjonsorigo er illustrert, Broach, J.R., Meth Enz (1983) 101:307, er andre plasmidvektorer som er egnet for gjæreks-presjon kjent (se, for eksempel, Stinchcomb, et al, Nature

(1979) 282:39, Tschempe, et al, Gene (1980) 10:157 og Clarke,

L, et al, Meth Enz (1983) 101:300). Kontrollsekvenser for gjærvektorer innbefatter promotere for syntese av glykolytiske enzymer (Hess, et al, J Adv. Enzyme Reg (1968) 7:149; Holland et al, Biochemistry (1978) 17:4900). Andre promotere som er kjent innenfor fagområdet innbefatter promoteren for 3-fosfoglyserat-kinase (Hitzeman, et al, J Biol Chem (1980) 255:2073), og de for andre glykolytiske enzymer, såsom glyceraldehyd-3-fosfat dehydrogenase, heksokinase, pyruvat-dekarboksylase, fosfofruktokinase, glukose-6-fosfatisomerase, 3-fosfoglyceratmutase, pyruvatkinase, triosefosfatisomerase, fosfoglukoseisomerase, og glukokinase. Andre promotere som i tillegg har fordelene innbefattet i transkripsjon kontrollert ved vekstbetingelsene er promoterregionene for alkohol dehydrogenase 2, isocytokrom C, syrefosfatase, nedbrytende enzymer assosiert med nitrogenmetabolisme, og enzymer som er ansvarlig for maltose og galaktose-anvendelse (Holland, ibid). Det er også antatt at terminatorsekvenser er ønskelig ved 3'-enden av de kodende sekvenser. Slike terminatorer finnes i den 3'-ikke-translaterte regionen etter de kodende sekvensene i gjær-avledete gener. Mange av vektorene som er illustrert inneholder kontrollsekvenser avledet fra enolase-genet inneholdende plasmid peno46 (Holland, M.J., et al. J Biol Chem (1981) 256:1385) eller LEUZ-genet tilveiebragt fra YEpl3 (Broach, J., et al, Gene (1978) 8:121), en hvilken som helst vektor inneholdende en gjærkompatibel promoter, replikasjonsorigo og andre kontrollsekvenser er egnet.

Det er selvfølgelig mulig å uttrykke gener som koder for polypeptider i eukaryote vertscellekulturer avledet fra multicellulære organismer. Se, for eksempel, Tissue Culture, Academic Press, Cruz og Patterson, editors (1973). Nyttige vertscellelinjer innbefatter murin myeloma N51, VERO og HeLa celler, og kinesisk hamster ovarie (CH0) celler. Ekspresjonsvektorer for slike celler innbefatter vanligvis promotere og kontrollsekvenser som er kompatible med pattedyrceller såsom, for eksempel, de vanlig anvendte tidlig og sen promoterene fra Simian Virus 40 (SV 40) (Fiers, et al, Nature (1978) 273:113), eller andre virale promotere såsom de som er avledet fra polyoma, Ådenovirus Z, bovin papilomavirus, eller avian sarcoma vimser, eller immunoglobulinpromotere og varmesjokkpromotere. Generelle aspekter til pattedyrcelle-vertssystem-transformeringer er blitt beskrevet av Axel; US Patentnummer 4,399,216 utgitt 16. august 1983. Det ser nå ut som om at "forsterker" regioner er viktige for å optimalisere ekspresjon; disse er vanligvis sekvenser beliggende oppstrøms for promoterregionen. Replikasjonsorigo kan bli tilveiebragt, hvis nødvendig, fra virale kilder. Integrering inn i kromo-somet er derimot en vanlig mekanisme for DNA-replikasjon i eukaryoter. Planteceller er også nå tilgjengelige som verter, og kontrollsekvenser som er kompatible med planteceller såsom nopalinsyntase-promoter og polyadenyleringssignalsekvenser (Depicker, A., et al, J Mol Appl Gen (1982) 1:561) er tilgjengelige.

Nylig er ekspresjonssystemer som anvender insektceller og som benytter kontrollsystemene tilveiebragt av baculovirusvektor-ene i tillegg blitt beskrevet (Miller, D.W., et al., eds., Plenum Publishing, Vol. 8, s. 277-297). Disse systemene er også vellykkede for produsering av CSF-1.

C.2. Transformeringer

Avhengig av hvilken vertscelle som blir anvendt, blir transformering utført ved bruk av standardteknikker som er hensiktsmessige for slike celler. Kalsiumbehandling ved bruk av kalsiumklorid, som beskrevet av Cohen, S.N., Proe Nati Acad Sei (USA) (1972) 69:2110 blir anvendt for prokaryoter eller andre celler som inneholder vesentlig celleveggbarri-erer. Infeksjon med Agrobacterium tumefaciens (Shaw, C.H., et al, Gene (1983) 23:315) blir anvendt for visse planteceller. For pattedyrceller uten slike cellevegger, er kalsiumfosfat presipiteringsmetoden til Graham og van der Eb, Virology

(1978) 52:546 foretrukket. Transformeringer inn i gjær blir utført i henhold til metoden til Van Solingen, P., et al, J Bact (1977) 130:946 og Hsiao, C.L., et al, Proe Nati Acad Sei (USA) (1979) 76:3829.

C. 3. Probing av mRNA ved Northern Blot; cDNA- probe eller

genome biblioteker

RNA blir fraksjonert for Norhtern blot ved agarose slab-gelelektroforese under fullstendig denaturerende betingelser ved bruk av formaldehyd (Maniatis, T. , et al, Molecular Cloning (1982) Cold Spring Earbor Press, s. 202-203) eller 10 mM metyl kvikksølv (CE3EgOH) (Bailey, J.M., et al, Anal Biochem (1976) 70:75-85; og Sehgal, P.B. et al, Nature (1980) 288:95-97) som denatureringsmiddel. For metyl kvikksølvgeler, blir 1,5% geler preparert ved å smelte agarose i løpebufferen (100 mM borsyre, 6 mM natriumborat, 10 mM natriumsulfat, 1 mM EDTA, pE 8,2), avkjøling til 6CC og tilsetting av 1/100 volum 1 M CHsHgOE. RNAet blir løst opp i 0,5 x løpebuffer og denaturert ved inkubering i 10 mM metyl kvikksølv i 10 min ved romtemperatur. Glycerol (20%) og bromfenol blå (0,05%) blir tilsatt for påføring av prøvene. Prøvene blir elektro-forert ved 500-600 volt-t med resirkulering av buffer. Etter elektroforesen blir gelen vasket i 40 min i 10 mM 2-merkaptoetanol for å detoksifisere metyl kvikksølv, og Northern blot blir preparert ved overføring av RNA fra gelen til et membranfilter.

cDNA eller genome bibliotek blir screenet ved bruk av koloni eller plaque hybridiseringsprosedyren. Bakterielle kolonier, eller plaquene for fag blir løftet på duplikate nitrocellu-losefilterpapir (S & S type BA-85). Plaquene eller koloniene blir lysert og DNA blir fiksert til filteret ved sekvensiell behandling i 5 min med 500 mM NaOH, 1,5 M NaCl. Filterene blir vasket to ganger i 5 min hver gang med 5 x standard saltvanns-citrat (SSC) og lufttørket og bakt ved 80°C i 2 t.

Gelene for Northern blot eller de duplikate filterene for cDNA eller genomisk screening blir prehybridisert ved 25-42"C i 6-8 t med 10 ml per filter DNA hybridiseringsbuf f er uten probe (0-50% formamid, 5-6 x SSC, pH 7,0, 5x Denhardts oppløsning (polyvinylpyrrolidin, pluss Ficoll og bovint serumalbumin; 1 x = 0,02% av hver), 20-50 mM natriumfosfatbuffer ved pH 7,0, 0,2% SDS, 20 ug/ml poly U (ved probing av cDNA), og 50 jjg/ml denaturert laksesperm DNA). Prøvene ble deretter hybridisert ved inkubering ved den hensiktsmessige temperaturen i omtrent 24-36 timer ved bruk av hybridiseringsbuffer inneholdende kinasebehandlet probe (for oligomerer). Lengre cDNA eller genome fragmentprober ble merket ved nick-translasjon eller ved primer-forlenging.

Betingelsene for både prehybridisering og hybridisering avhenger av stringentheten som er ønskelig, og varierer, for eksempel, med probelengden. Vanlige betingelser for relativt lange (f.eks. mere enn 30-50 nukleotider) prober benytter en temperatur på 42°-55°C og hybridiseringsbuffer inneholdende omtrent 20%-50% formamid. Når det gjelder lavere stringenthet som er nødvendig for oligomere prober på omtrent 15 nukleotider, blir lavere temperaturer på omtrent 25°-42°C, og lavere formamidkonsentrasjoner (0%-20%) anvendt. For lengre prober, kan filtrene bli vasket, f.eks. fire ganger i 30 minutter, hver gang ved 40°-55°C med 2 x SSC, 0,2% SDS og 50 mM natriumfosfatbuffer ved pH 7, deretter bli vasket to ganger med 0,2 x SSC og 0,2% SDS, lufttørket, og autoradiografert ved — 70° C i 2 til 3 dager. Vaskebetingelsene er noe mindre grove når det gjelder kortere prober.

C. 4. Vektorkonstruks. 1 on

Konstruksjon av egnede vektorer inneholdende de ønskede koding og kontrollsekvensene anvender standard ligerings- og restriksjonsteknikker som er velkjente innenfor fagområdet. Isolerte plasmider, DNA-sekvenser, eller syntetiserte oligonukleotider blir spaltet, skreddersydd, og religert i den ønskede formen.

Setespesifikk DNA-spalting blir utført ved behandling med egnet restriksjonsenzym (eller enzymer) ved betingelser som er generelt kjente for fagmannen, og hvor særegenhetene er spesifisert av fabrikanten av disse kommersielt tilgjengelige restriksjonsenzymene. Se, f.eks., New England Biolabs, produktkatalog. Generelt blir omtrent 1 jjg plasmid eller DNA-sekvens spaltet av en enzymenhet i omtrent 20 jjI bufferopp-løsning; i eksemplene heri, blir vanligvis et overskudd av restriksjonsenzym anvendt for å forsikre fullstendig spalting av DNA-substratet. Inkubasjonstider på omtrent en time til to timer ved omtrent 37° C virker, selv om variasjoner kan bli tolerert. Etter hver inkubasjon fjernes protein ved ekstrahering med fenol/kloroform, og som kan bli etterfulgt av eterekstraksjon, og nukleinsyren kan bli fjernet fra de vannholdige fraksjonene ved etanolfelling. Hvis ønskelig, kan man foreta en størrelsesseparasjon av de spaltede fragmentene ved å utføre polyakrylamidgel eller agarosegelelektroforese ved bruk av standårdteknikker. En generell beskrivelse av størrelsesseparasjoner finnes i Methods in Enzymology (1980) 65:499-560.

Restriksjonsspaltede fragmenter kan påføres butte ender ved behandling med det store fragmentet til E. coli DNA-polymerase I (Klenow) i nærvær av de fire deoksynukleotidtrifosfåt-ene (dNTPs) ved bruk av inkubasjonstider på omtrent 15 til 25 min ved 20 til 25" C i 50 mM Tris pH 7,6, 50 mM NaCl , 6 mM MgCl2, 6 mM dTT og 5-10 uM dNTPs. Klenowfragmentet fyller i ved de 5'-klebrige endene, men fordøyer overhengende 3' enkelttråder, selv om de fire dNTPene er tilstede. Hvis ønskelig, igjenparing kan bli utført ved å tilføre bare en av, eller spesielt utvalgte, dNTPer innenfor begrensningene som er diktert ved beskaffenheten av de klebrige endene. Etter behandling med Klenow blir blandingen ekstrahert med fenol/kloroform og utsatt for etanolfelling. Behandling under hensiktsmessige betingelser med Sl nuklease resulterer i hydrolyse av tilstedeværende enkelt-trådet del.

Syntetiske oligonukleotider kan bli fremstilt ved triester-metoden til Matteucci, et al (J Am Chem Soc (1981) 103:3185- 3191) eller ved anvendelse av automatiserte syntesemetoder. Kinasebehandling av enkelttråder før sammensmelting eller for merking blir oppnådd ved bruk av et overskudd, f.eks. omtrent 10 enheter polynukleotidkinase til 1 nM substrat i nærvær av 50 mM Tris, pH 7,6, 10 mM MgCl2, 5 mM di t iotreitol, 1-2 mM ATP. Hvis kinasebehandling er for merking av probe, vil ATP inneholde 32-yP med høy spesifikk aktivitet.

Ligeringer blir utført i volumer på 15-30 pl under følgende standard betingelser og temperaturer: 20 mM Tris-Cl pH 7,5, 10 mM MgCl2, 10 mM dTT, 33 pg/ml BSA, 10 mM-50 mM NaCl, og enten 40 uM ATP, 0,01-0,02 (Weiss) enheter T4 DNA-ligase ved 0°C (for "klebrig ende" ligering) eller 1 mM ATP, 0,3-0,6 (Weiss) enheter T4 DNA-ligase ved 14° C (for "butt ende" ligering). Intermolekylære "klebrig ende" ligeringer blir vanligvis utført ved totale DNA-konsentrasjoner på 33-100 ug/ml (5-100 nM total sluttkonsentrasjon). Intermolekylær butt ende ligeringer (som vanligvis anvender et 10-30 ganger molart overskudd av linkere) blir utført ved 1 pM total sluttkonsentrasjon.

Ved vektorkonstruksjon som anvender "vektorframgenter", blir vektorfragmentet vanligvis behandlet med bakteriell alkalisk fosfatase (BAP) for å fjerne 5'-fosfatet og forhindre religering av vektoren. BAP-spaltingene blir utført ved pH 8 i omtrentelig 150 mM Tris, i nærvær av Na<+>og Mg<+2>ved bruk av omtrent 1 BAP-enhet per pg vektor ved 60° i omtrent en time. For å erverve nukleinsyrefragmentene, ekstraheres preparatet med fenol/kloroform og blir deretter felt med etanol. Alternativt, kan religering bli forhindret i vektorer som er blitt dobbeltspaltet ved i tillegg restriksjonsenzym-spalting av de uønskede fragmentene.

C.5. Modifikasjon av DNA- sekvenser

For delene av vektorene som er avledet fra cDNA eller genomt DNA som krever sekvensmodifikasjoner, blir setespesifikk primer-rettet mutagenese anvendt. Denne teknikken er velkjent for fagmannen, og blir utført ved bruk av en primer-syntetisk oligonukleotid som er komplementær til en enkelttrådet fag-DNA som skal bli mutert med unntagelse av begrenset feil-paring, som representerer den ønskede mutasjonen. Det syntetiske oligonukleotidet blir anvendt som en primer for å lede syntese av en tråd som er komplementær til fagen, og det resulterende dobbelt-trådete DNA blir transformert inn i en fag-understøttende vertsbakterie. Kulturer av de transformerte bakteriene blir sådd i toppagar, som tillater dannelse av plaque fra enkelt-celler som inneholder fagen.

Teoretisk, vil 50% av de nye plaquene inneholde fagen med, som en enkelttråd, den muterte formen; og 50% vil ha den opprinnelige sekvensen. Plaquene blir hybridisert med kinasebehandlet syntetisk primer ved en temperatur som tillater hybridisering av en nøyaktig paring, men hvor uriktig paring med den opprinnelige tråden er tilstrekkelig for å forhindre hybridisering. Plaque som hybridiserer med proben, blir deretter plukket, dyrket, og DNAet blir ervervet. Detaljer av setespesifikk mutasjonsfremgangsmåte er beskrevet nedenfor i spesifikke eksempler.

C.6. Verifisering av konstruksjon

I konstruksjonene som er utført nedenfor, blir riktig ligering av plasmidkonstruksjonen bekreftet ved å først transformere E. coli stamme MM294, eller annen egnet vert, med ligeringsblandingen. Vellykkede transformanter blir selektert ved ampicillin, tetracyklin eller annen antibiotika-resistens eller ved anvendelse av andre markører avhengig av plasmid-konstruksjonsmåten, som er kjent for fagmannen. Plasmider fra transformantene blir deretter preparert i henhold til metoden til Clewell, D.B., et al, Proe Nati Acad Sei (USA) (1969) 62:1159, eventuelt etterfulgt kloramfenikol-amplifisering (Clewell, D.B. , J Bacteriol

(1972) 110:667). Det isolerte DNAet blir analysrt ved

restriksjon og/eller sekvensert ved dideoksymetoden til Sanger, F., et al, Proe Nati Acad Sei (USA) (1977) 74:5463

som videre er beskrevet av Messing, et al, Nucleic Acids Res

(1981) 9:309, eller ved metoden til Maxam, et al, Methods in Enzymology (1980) 65:499.

C. 7. Eksempler på verter

Vertsstammer anvendt ved kloning og ekspresjon heri er som følger: For kloning og sekvensering, og for ekspresjon av konstruksjonen under kontroll av for det meste bakterielle promote-rer, ble E. coli stamme MM294 tilveiebragt fra E. coli Genetic Stock Center GSCS #6135, anvendt som vert. For ekspresjon under kontroll av P^Nj^s-<p>romoter, °le E. coli stamme K12 MC1000 lambda lysogen, N7N53<c>l857 SusPgg, ATCC 39531 anvendt.

For M13 fagrekombinanter ble E. coli-stammene som er mottage-lig for faginfeksjon, såsom E. coli K12 stamme DG98 anvendt. DG98-stammen er blitt deponert med ATCC 13. juli 1984 og har aksesjonsnummer 39768.

Pattedyrekspresjon er blitt tilveiebragt heri i COS-7, C0SA2, CV-1 og CHO-cellene.

D. Foretrukne fremstillinger

De rekombinante CSF-l-proteinene ifølge foreliggende oppfinnelse kan innbefatte to sett "basiske" proteiner, LCSF og dets muteiner og visse spesifikke muteiner av SCSF. Disse proteinene har lignende, men ikke identiske, primære aminosyresek-venser, og forskjellige lengder, som alle utviser, eller er spesifikt spaltbare til et mutein som utviser, aktivitets-mønsteret som er karakteristisk for CSF-l--dvs., de har evnen til å stimulere benmargsceller til å differensiere til monocytter, hovedsakelig, og, er innenfor begrensningene beskrevet i definisjonsdelen ovenfor, immunoreaktive med antistoffer som er laget mot nativt CSF-1 og med reseptorene som er assosiert med CSF-1 aktivitet. Visse fremstillinger av muteiner referert til SCSF "ble ikke spesifikt beskrevet i PCT-søknad publikasjon nr. W086/04607 som er basert på prioriteten til flere patentsøknader hertil. De humane og murine lange formene av CSF-1; spesifikt LCSF og dets relaterte muteiner er heller ikke beskrevet i nevnte EPO-søknad. Visse N- og C-terminalt fjernede former av LCSF er også spesielt foretrukket.

Noen spesifikke fremstillinger av SCSF-muteinene er beskrevet i EPO-søknaden. Som beskrevet i EPO-søknaden er posisjon 59 tilgjengelig mellom asp og tyr—dvs., i tillegg til SCSF som opprinnelig ble oppnådd, innbefattet er muteiner hvori SCSF-sekvensen er forandret ved substitusjon av asp for tyr i posisjon 59 (dvs., aspsg SCSF). Omvendt, så har LCSF asp i posisjon 59 og kan bli erstattet med tyr (tyrsg LCSF).

Beskrevet heri er den klassen av muteiner av SCSF og LCSF som mangler de N-terminale 2 eller 3 residiene, og som dermed har en N-terminal sekvens valgt fra gruppen bestående av val-ser-glu-tyr-cys-ser og ser-glu-tyr-cys-ser. Disse NV2, NV3 muteinene kan representere de korresponderende NV2, NV3 muteinene til SCSF og LCSF modne formene—dvs., SCSF/NV2, SCSF/NV3, LCSF/NV2, og LCSF/NV3. I tillegg derimot, er de C-terminalforkortede formene av disse NV2 og NV3 mutasjonene, likeledes posisjonelt substituerte muteinene, innbefattet som videre beskrevet nedenfor.

Forskjellige C-terminalt fjernede muteiner er også av spesiell interesse. EPO-søknaden nevnt ovenfor beskrev forkortede former av bare SCSF—og bare CV158 og lengre. Det er ikke kjent i hvilken grad de native proteinene blir prosessert fra C-terminus in vivo. Det er nå bekreftet at i hvert fall, den C-terminale regionen tilbake til aminosyre 150 i SCSF kan bli fjernet og proteinet vil opprettholde in vitro CSF-1 aktivitet i benmargsprolifereringsanalysen. Det er videre antatt at den 23 aminosyre hydrofobe sekvensen som strekker seg fra posisjon 166-188 i den korte formen og 464- 486 i den lange formen kan ha en membran forankringsfunksjon og kan bli separert fra proteinet når den blir transportert gjennom membranen og utskilt. Denne delen kan også være ansvarlig for membranbinding i seg selv, og tillater at CSF-1, når den er bundet til cellemembranene, til å reagere med andre celler ved det stedet hvor den er bundet. Disse sekvensene kan uavhengig være unnværlige totalt eller delvis. Det ser ut som om former av CSF-1 som er markert kortere enn enten SCSF eller LCSF som er kodet blir funnet ved isolering av det native proteinet, og i de utskilte proteinene tilveiebragt fra rekombinant produksjon. Resultater opp til nå indikerer at ekspresjon av konstruksjonene som koder for SCSF i CV-1 cellene kan resultere i SCSF/CV158 i supernatanten.

Dermed er CSF-l-proteinene som består av aminosyresekvensen inneholdende bare de første 150 aminosyrene av SCSF eller LCSF og deres utskiftbare posisjon 59 tyr eller asp muteinene som beskrevet ovenfor (som derfor er identiske med unntagelse av den siste aminosyren) eller NV2 eller NV3 variasjoner derav, eventuelt utvidet med et vilkårlig antall aminosyrer i sekvensen også innbefattet i oppfinnelsen. Blant denne gruppen, er C-terminale fjerninger korresponderende til SCSF/CV150, SCSF/CV158, LCSF/CV150, LCSF/CV190, LCSF/CV191, CSF/CV221, LCSF/CV223, LCSF/CV236, LCSF/CV238, LCSF/CV249, LCSF/CV258, og LCSF/CV411 og deres korresponderende NV2 og NV3 former spesielt foretrukket.

Konstruksjoner som koder for ovenfor nevnte C-terminale fjerninger hvori modifikasjonene av en eller mere aminosyrer fortrinnsvis 1-5 og helst 1-2 aminosyrer i sekvensen fra "hoved" sekvensen er blitt utført og er å foretrekke.

De forskjellige CSF-1 formene kan også inneholde mutasjoner som ikke ødelegger funksjonaliteten i regionene som ikke er sterkt konserverte blant artene. Disse er 1-5 aminosyre-fjerningene og/eller substitusjonene i posisjonene 15-20, 51-52 og/eller 75-84. En annen slik region er den i 191-193 i SCSF og 489-491 i LCSF. EPO-publIkasjonen beskrevet ovenfor beskriver bare mutanter av SCSF og det C-terminale muteinet derav som er fjernet og danner CV158; dermed er disse muteinene nye da de relaterer til både LCSF i lang form og dets muteiner eller til den forkortede SCSF/CV150-158. Det er oppdaget at glu52-f ormene av både SCSF og LCSF og deres muteiner er aktive.

Det er også blitt vist heri at forandring av en eller flere glykosyleringsseter kan resultere i aktive proteiner. LCSF har fire glykosyleringsseter—ved 122-124, 140-142, 349-351, og ved 383-385; SCSF har bare de to første. Et hvilket som helst mutein som inneholder en inaktiverende mutasjon ved en eller flere av disse setene er også innbefattet.

Cystein i posisjon 90 har vist seg å være unnværlig for immunoreaktiviteten. Muteiner som er alagøeller sergg er innbefattet når den tilsiktede hensikten bare beror på antigenisiteten. Cysteinene i posisjonene 157 og 159 til LCSF er også uunnværlige for aktiviteten og ser^57, ser^g og se<r>157ser159^cSF muteinene (innbefattende de N- og C-terminalt delegerte formene) viser forbedret homogenitet på HPLC. Det er også antatt at de antatte membran forankringsre-gionene til både LCSF og SCSF er unnværlige for noen typer av CSF-1 aktivitet.

Andre foretrukne former ifølge oppfinnelsen innbefatter muteiner som korresponderer til aminosyresekvensene til murine proteiner vist i figurene 5 og 6 og muteiner derav som korresponderer til de som er beskrevet for humant LCSF.

Foretrukne fremstillinger av CSF- 1 kodende DNA

I tillegg til å modifisere aminosyresekvensene, kan DNA-sekvensen som koder for proteinet bli modifisert for å hjelpe med ekspresjon i bestemte systemer. I E. coli, for eksempel, medfører forandringene av kodonene for de første seks aminosyrene i den native sekvensen til de som er ønskelige i bakterier resulterer i høyere produksjonsnivåer både når det gjelder LCSF og SCSF og for deres forkortede former. Vektorer (betegnet O/E nedenfor for "over ekspresjon") inneholder DNA som er av den N-terminale kodende sekvensen GAAGAAGTTT CTGAATAT eller dets NV eller NV3 forkortingene. Denne blir tilført som et syntetisk Hindlll/BstXI fragment, og er forskjellig fra det native GAGGAGGTGTCGGAGTAC ved de understrekede posisjonene som er vist. Et aspekt av oppfinnelsen innbefatter tilveiebringelse av CSF-l-kodende DNA, når den skal bli uttrykt intracellulært i bakterier, i en form hvori et hensiktsmessig antall kodoner ved N-terminus blir valgt i henhold til reglene for bakterie-foretrukne kodoner.

Også med hensyn på bakterielle ekspresjon, kan DNA-sekvensene oppstrøms for ATG i posisjon 65 bli modifisert for å forhindre anvendelse av dette ATG som et indre startsete. Dette er et mere alvorlig problem for tyr$ q enn for aspsg-konstruksjonene. En primer av sekvensen 5'-3'

MM MHM

GGTACAAGATATCATGGAAGATACAATGCGCTTC

blir anvendt i setespesifikk mutagenese for å lage de forandringene som er merket med stjerne i det native genet. Ingen forandring i aminosyrene som er kodet oppstår.

E. Anvendelse og administrasjon

CSF-l-proteinene ifølge oppfinnelsen har evnen til både å stimulere monocytt-forløper/makrofag-celleproduksjon fra forløper-margcellene, som dermed forsterker effektiviteten til det immune systemet, og til å stimulere slike funskjoner til disse differensierte cellene som utskilling av lymfokiner i de modne makrofagene. Det er også nyttige anti-infiserende midler, spesielt som antivirale og antimikrobielle midler.

I en anvendelse, er disse proteinene nyttige som tilsetningsstoffer til kjemoterapi. Det er anerkjent av kjemoterapeutisk behandling resulterer i undertrykking av det immune systemet. Selv om den medfører en vellykket ødeleggelse av svulst- cellene mot hvilket de er rettet, resulterer kjemoterapeutisk behandling ofte til at individet dør på grunn av denne sideeffekten av de kjemotoksiske midlene på cellene i immunsystemet. Administrering av CSF-1 til slike pasienter, på grunn av evnen som CSF-1 har til å lede og forsterke veksten og differensieringen av benmargs-avledete forløpere til makrofager, resulterer i en restimulering av det immune systemet for å forhindre denne sideeffekten, og dermed forhindre tilbøyeligheten som pasienten har for å bukke under for sekundære infeksjoner. Andre pasienter som vil bli hjulpet av en slik behanding innbefatter de som blir behandlet for leukemi ved benmargstransplantasjoner; de er ofte en immunoundertrykt tilstand for å forhindre avstøping. For disse pasientene, kan immunoundertrykkingen også bli rever-sert ved administrering av CSF-1. Generelt, så vil et hvilket som helst individ som lider av immunoundertrykking enten det er forårsaket av kjemoterapi, benmargstransplantasjon, eller andre, tilfeldige former av immunoundertrykking, såsom sykdom (f.eks., AIDS, acquired immune deficiency syndrome) vil være hjulpet av tilgjengeligheten av CSF-1 for farmakologisk anvendelse. I tillegg kan individer bli tilført forhøyede mengder av nylig differensierte makrofager for å supplemen-tere de som er i det opprinnelige system, hvor makrofagene blir produsert ved in vitro kultur av benmarg til andre egnede preparater behandlet med CSF-1. Disse preparatene innbefatter pasientens egne blodmonocytter, som kan bli dyrket på denne måten og returnert for lokal eller systemisk terapi.

Evnen som CSF-1 har til å stimulere produksjonen av lymfokiner ved makrofager og til å forsterke deres evne til å drepe målceller gjør også CSF-1 anvendbar til behandling av neoplasmer og infeksjoner.

CSF-1 stimulerer produksjon av interferoner ved murin-avledet makrofag (Fleit, H.B., et al, J Cell Physio (1981) 108:347, og humant, delvis renset, CSF-1 fra MIAPaCa-cellene stimu lerer poly IC-indusert produksjon av interferon og TNF fra humane monocytter. I tillegg, stimulerer CSF-1 produksjonen av myeloid CSF ved humane blod-monocytter.

Behandling av pasienter som lider av AIDS med CSF-1, alene eller sammen med erytropoietin og/eller et antiviralt middel og/eller IL-2 er rapportert i W087/03204, publisert 4. juni, 1987. US Patent 4,482,485, publisert 13. november, 1984, hevder at CSF-1 kan bli anvendt i en støtterolle ved behandling av kreft. I tillegg rapporterer EP 118,915, publisert 19. september, 1984, at anvendelse av CSF-1 for forhindring og behandling av granulocytopeni og makrofagocytopeni i pasienter som mottar kreftterapi, for forhindring av infeksjoner, og for behandling av pasienter med implantert benmarg. Ralph et al, Cell Immuno (1987) 105:270-279, rapporterer den forhøyede svulstdrepende effekten av en kombinasjon av CSF-1 og lymfokin på murine sarcoma TU5-mål.

(Murint CSF-1 er inkonsekvent rapportert til å stimulere murin makrofag til å være cytostatisk til P815-svulstcellene (Wing, E.J., et al, J Clin Invest (1982) 69:270) eller til ikke å drepe andre leukemimål (Ralph, P. et al, Cell Immunol

(1983) 76:10). Nogawa, R.T., et al, Cell Immunol (1980) 53:116, rapporterer at CSF-1 kan stimulere makrofag til å fordøye og drepe gjær).

I tillegg til å få bukt med immunoundertrykking i seg selv, kan CSF-1 bli anvendt for å ødelegge de invaderende organismene eller maligne cellene indirekte ved stimulering av makrofagutskilling og aktivitet.

CSF-1 kan bli anvendt sammen med et annet lymfokin eller cytokin såsom, f.eks. a-IFN, e-IFN, -ylFN, IL-1,, IL-2, IL-3, IL-4, eller TNF for å behandle svulster.

CSF-1 ifølge oppfinnelsen kan bli formulert på konvensjonelle måter som er vanlige innenfor administrering av protein-substanser. Administrering ved injeksjon er foretrukket; formuleringene innbefatter oppløsninger eller suspensjoner, emulsjoner, eller fast komposisjon for rekonstitusjon til injiserbare stoffer. Egnede tilsetningsstoffer innbefatter, for eksempel, Ringers oppløsning, Hanks oppløsning, vann, saltvann, glycerol, dekstroseoppløsninger, og lignende. I tillegg kan CSF-1 ifølge oppfinnelsen bli preinkubert med preparater av celler for å stimulere hensiktsmessig respons og enten så kan hele preparatet eller supernatanten derfra bli introdusert inn i individet. Som vist heri nedenfor er stoffene som blir produsert ii respons til CSF-1 stimulering ved forskjellige typer blodceller effektive mot ønskede mål, og egenskapene som disse blodcellene selv har til å angripe innvaderende viruser eller neoplasmer kan bli forsterket. Individets egne celler kan bli fjernet og anvendt på denne måten, eller for eksempel, kan monocytter eller lymfocytter fra et annet kompatibelt individ bli anvendt i inkuberingen.

Det er foretrukket at de "humane" formene av CSF-1 blir anvendt i farmasøytiske komposisjoner; de murine formene av dette proteinet er spesielt nyttige i hensiktsmessige modellsystemer i mus for å bestemme det komplekse mønsteret ved CSF-l-aktivitetene.

F. Kloning og ekspresjon av humant CSF- 1

Det følgende illustrerer metodene som blir anvendt ved tilveiebringelse av den kodende sekvensen for humant CSF-1, for å utsette denne sekvensen i ekspresjonsvektorene, og for tilveiebringing av ekspresjon av det ønskede protein. Tilveiebringing av DNAet trenger ikke å bli gjentatt; de beskrevne sekvensene kan bli tilveiebragt delvis eller totalt fra syntese.

F.1. Rensing av nativt humant CSF- 1 og probekonstruksjon Humant urin CSF-1 ble delvis renset ved standard fremgangsmåte som beskrevet av Das, S.K., et al, Blood (1981) 58:630, etterfulgt av et affinitetsrensingstrinn ved bruk av et rotte-monoklonalt antistoff til urint CSF-1, betegnet YYG106, bundet til en Sepharose 4 B kolonne (Stanley, E.R., Methods Enzymol (1985) 116:564). Det endelige trinnet ved rensing var revers fase HPLC i et 0,1% TFA/30% acetonitril - 0,1% TFA/60% acetonitril buffersystem. Detaljene og resultatene av rensingen og konstruksjon av probene er beskrevet i PCT-søknad W086/04607 (ovenfor).

F.2. Preparering av den humane genome sekvensen

En human genom sekvens som koder for CSF-1 ble tilveiebragt fra Maniatis humane genome bibliotek i Xfag Charon 4 ved bruk av probene som var konstruert på en slik måte at de koder for den N-terminale sekvensen til humant protein, som beskrevet i PCT-søknad W086/04607 (ovenfor). En Charon 4X fag inneholdende CSF-l-sekvensen slik det ble vurdert ved hybridisering til proben som beskrevet nedenfor, og betegnet phCSF-1, ble deponert til American Type Culture Collection (ATCC) 2. april, 1985 og har aksesjonsnummer 40177. Ved senere studie av denne fagen, ble det oppdaget at rearrangeringer og/eller fjerninger var oppstått og de riktige sekvensene ble ikke opprettholdt. Derfor ble en alternativ koloni som ble tilveiebragt fra det genome biblioteket på lignende måte, og propagert for å bestemme stabiliteten ved replikasjon, betegnet phCSF-la og deponert med ATCC 21. mai, 1985, og ble gitt aksesjonsnummer 40185. phCSF-la inneholdt et 18 kb innskudd og hadde evnen til å danne restriksjonsenzymspalt-inger som også hybridiserte til proben, og den ble anvendt for sekvensbestemming og probekonstruksjon.

Hele 18 kd genet som var inne i phCSF-la ble sekvensert. Genet inneholder 9 eksons som er separert av 8 introns når det blir sammenlignet med pcCSF-17 sekvensen i figur 1. Regionene til det modne protein cDNA korresponderer nøyaktig til de genome eksonkodonene unntatt kodon 59; den "lange formen" av det humane CSF-l-proteinet viser en utvidet kodende region ved 5'-enden av ekson 6, som nærmere beskrevet nedenfor.

Figur 3 representerer et skjema for den genome strukturen for humant CSF-1. Det første ekson inneholder ikke-translatert 5'-sekvens og de første 13 aminosyreresidiene til signalsekvensen. De gjenværende 19 aminosyrene til signalsekvensen og de første 22 aminosyrene til det modne CSF-proteinet blir kodet i det andre eksonet. Stoppkodonet oppstår i ekson 8, som også innbefatter 9 bp av den 3'-ikke-translaterte sekvensen. Genet inneholder omtrent 18 kb og inneholder minst 9 eksons, sannsynligvis 10, som varierer i størrelse fra 63 bp til et antatt maksimum på 2-3 kb. Det er antatt at den 3'-ikke-translaterte sekvensen kan bli fullført enten med ekson 9 eller ekson 10. Selv om to adskilte eksons er vist, er det ikke klarlagt om det er et 9. intron og 10. ekson eller om et alternativt spleisesete er innenfor, ekson 9. Som det vil bli beskrevet videre nedenfor, resulterer den korte formen av CSF-1 fra anvendelse av spleisesete mot 3'-enden til ekson 6; den lange formen resulterer fra spleisesetet som vist i figur 3 ved begynnelsen av det eksonet.

Størrelsene av eksonene og intronene illustrert i figur 3 er som følger:

At den genome klonen blir transkribert inn i et antall RNA-transkripter avhengig av spleisesetene er verifisert ved Northern-analyse. MIAPaCa-cellene ble indusert under serum- frie "betingelser med 50 ng/ml PMA og 10 \ M retinsyre i 3 dager ved tre påfølgende induksjoner og mRNA ble isolert etter den tredje induksjonen i henhold til den generelle prosedyren beskrevet nedenfor. mRNA-isolatet ble elektro-forert på en 1% agarosegel inneholdende 2,5 M formaldehyd, og blottet på nitrocellulose og probet med den hensiktsmessige olignukleotiden. Et antall bånd, korresponderende til mRNAer på 16S, 18S, 26S, 28S, og en samling ved 22-25S blir tilveiebragt .

ML06, en 20-mer som korresponderer til kodingssekvensen i ekson 8 til genomet, hybridiserer til transkriptene til alle disse; som bekrefter at alle koder for CSF-1. Sekvensene til ekson 8 er, selvfølgelig, felles for både lange og korte former. (En probe i tillegg, GM15, som er en 21-mer som matcher en av de murine 3'-ikke-translaterte sekvensene som ikke viser homologi til de humane klonene, hybridiserer ikke til noen av MIAPaCA-transkriptene).

GM11, en 40-mer som er beliggende ved 5'-enden av det lange ekson 6, og som dermed korresponderer med det "ekstra" innskuddet inneholdende 894 bp i den lange form-sekvensen, hybridiserer til transkriptene ved 28S og gruppen ved 22-25S, men ikke til de gjenværende tre. Disse er dermed sannsynligvis transkripter som korresponderer til den lange formen. En 20-mer, JV30, som matcher 5'-enden av ekson 9 til genomet, hybridiserer til 22-25S gruppen og til 16S og 18S mRNAene, men ikke til 26S eller 28S. 26S og 28S ser ut til å resultere fra prosesseringen som viser seg å innbefatte antatt ekson 10 i figur 3. En probe i tillegg, en 4,2 kb probe som er laget fra et humant CSF-1 genomt fragment som begynner 1500 bp inn i ekson 9, hybridiserer bare til 26S og 28S transkriptene.

Det genome fragmentet som koder for CSF-1 kan bli anvendt for ekspresjon i eukaryote celler som har evnen til å prosessere introns. For å uttrykke det genome fragmentet, blir innskuddet ligert inn i en egnet vertsvektor såsom et bovint papilloma-virus eller annen pattedyrvirusvektor rett ned-strøms fra en egnet promoter såsom det murine eller humane metallotionin-promoteren.

F.3. Tilveiebringing av cDNA som koder for humant CSF- 1

pcCSF- 17 ( SCSF)

Humant avledet bukspyttkjertel-karsinoma cellelinjen MIAPaCa-2 ble anvendt som en mRNA-kilde for å godkjenne prober og for dannelsen av et cDNA-bibliotek inneholdende en intronløs form av den humane CSF-1 kodende sekvensen. MIAPaCA-cellelinjen produserer CSF-1 I et nivå som er omtrent 10-ganger under det som murine L-929-cellene produserer. pcCSF-17 ble tilveiebragt fra dette biblioteket, som beskrevet i PCT-søknad W086/04607.

Forklart i korte trekk, ble et 300.000 klon-bibliotek tilveiebragt fra en anriket MIAPaCa mRNA ved Okayama og Berg-metoden probet under betingelser med høy stringens, ved bruk av ekson II proben avledet fra det genome DNA. Ti kolonier som hybridiserte til proben ble plukket og kolonirenset. Disse klonene ble analysert for nærvær av CSF-1 kodende sekvenser ved transient ekspresjon i C0S-7-celler. Kloningsvektoren, som inneholder et SV40-promoter ble anvendt per se ved transformering av C0S-7-cellene.

Plasmid DNA ble renset fra 10 positive kloner ved bruk av en CsCl-gradient, og C0S-7-cellene ble transfektert ved bruk av en modifikasjon (Wang, A.M., et al, Science (1985) 228:149) av kalsiumfosfat-kopresipiteringsteknikken. Etter inkubasjon i tre dager, ble CSF-l-produksjon analysert ved å utsette kultursupernatantene for radioreseptoranalyse som ble utført vesentlig som beskrevet av Das, S.K., et al, Blood (1981) 58:630, og for en kolonistimulerings (benmargsproliferings)-analyse utført i vesentlig grad som beskrevet av Prystowsky, M.B., et al, Am J Pathol (1984) 114: 149. Ni av de ti klonene som ble plukket viste ikke transient CSF-l-produksjon i COS-7-cellene. En klon, som viste ekspresjon, ble dyrket, plasmid DNA ble isolert, og innskuddet ble sekvensert. DNA-sekvensen, sammen med den utledete aminosyresekvensen, er vist i figur 1. Hele lengden av cDNA er 1,64 kb og koder for et modent CSF-l-protein på 224 aminosyrer (SCSF), som vist i figur 1. Klonen ble betegnet CSF-17 med Cetus deponeringsnummer CMCC 2347 og ble deponert til the American Type Culture Collection, 14. juni, 1985, med aksesjonsnummer 53149. Plasmidet som bærer CSF-l-kodende DNA ble betegnet pcCSF-17.

Kloner som koder for LCSF

pcCSF-17, preparert som beskrevet ovenfor, ble anvendt som en probe for å tilveiebringe flere CSF-l-kodende kloner fra et humant cDNA-bibliotek. Totalt mRNA ble preparert fra MIAPaCa-cellene nøyaktig som beskrevet i PCT-søknad W086/04607 (ovenfor) og anvendt for å tilveiebringe et cDNA-bibliotek i XgtlO fag-vektorene ved ligering av de omvendte transkriptene til EcoRI-linkere og innsetting av EcoRI-spaltingsproduktet til cDNA som slik ble tilveiebragt inn i EcoRI-setet til XgtlO, som beskrevet av Huynh, T.V., et al, i DNA Cloning Techniques: A Practical Approach, IRL Press, Oxford, 1984, D. Glover, ed.

Over en million fag ble screenet ved bruk av en enkelt-trådet sterkt merket probe avledet fra CSF-17 ved bruk av standard fremgangsmåter, som kort blir summert som følger.

Et EcoRI-fragment av pcCSF-17 DNA, som innbefatter hele kodingssekvensen for CSF-1 (det er EcoRI-sete rett etter stoppkodonet til den kodende sekvensen i pcCSF-17) ble satt inn i M13, og en merket annen tråd ble syntetisert som følger: Omtrent 1 pmol av M13 inneholdende enkelt-trådet EcoRI-spaltet pcCSF-17 ble sammensmeltet med 10 pmol sekven-seringsprimer i 20 mM Tris, pH 7,9, 20 mM MgCl2, 100 mM NaCl, og 20 mM p<->merkaptoetanol ved 67° C i 5 min og deretter overført til 42°C i 45 min. Det sammensmeltede preparatet ble tilført 100 umol av hver av dATP, dCTP og dTTP, og 2,5 pmol P<32->merket (a)dGTP, sammen med 5 U Klenow-fragment. Reaksjo- nen ble inkubert ved 37° C i 20 min. og DNAet ble erveret på en P-6 dG (Bio-Rad) spin-kolonne, og kokt i 10 min. for å separere trådene.

Probene som ble preparert på denne måten, ble anvendt for å screene plaquene (som var blitt overført til nitrocellulose) ved hybridisering under stringente betingelser (50% formamid, 5x SSC, 5x Denhards) ved 42°C i 18 t.

Omtrent 150-fagplaque var positive. Fem av disse 150 probe-positive plaquene var også probepositive ved bruk av oligonukleotid JD11, et 14-mer som er komplementær til basene i området til ekson 2 og 3 spleisegrensen, når hybridisert ved 45°C overnatt i 5x SSC, 5x Denhardts.

De 5 JD11 positive klonene ble deretter utsatt for hybridisering til oligonukleotid GM11, som har de sekvenskomplemen-tære nukleotidene 506-545 i figur 2. Som beskrevet ovenfor matcher denne sekvensen nøyaktig til den delen av den humane genome sekvensen som korresponderer til den "ekstra" delen av det murine cDNA, beskrevet nedenfor, som koder for den "ekstra" 298 aminosyresegmenet i de "lange formene" av det murine CSF-1 proteinet. Hybridisering var i 20% formamid, 5 x SSC, 5x Denhardts ved 45° C i 18 t. Tre kloner var positive, innbefattende de relevante klonene 4 og 25.

Den fullstendige DNA-sekvensen for de aktuelle kodende regionene til cDNA-innskuddene i klonene 4 og 25, sammen med den utledete aminosyresekvensen vist i figur 2. Sekvensen ble tilveiebragt ved integrering av den kjente sekvensen til den genome klonen, phCSF-la, beskrevet ovenfor, ved bruk av "ekstra" innskuddet til de murine sekvensene på 298 aminosyre beskrevet nedenfor som en rettleder for å utrede den fullstendige sekvensen som er vist. Sekvensen som er vist viser spleising av "ekstra" segmentet, som er tilstrekkelig for å kode for 298 "ekstra" aminosyrer som er innbefattet i genet ved 5'-siden av ekson 6, inn i sekvensen til pcCSF-17 mellom det første nukleotidet til kodonet for Gly-residiet ved aminosyreposisjon 150 inn i leseramraen med den gjenværende CSF-17 sekvensen. Innskuddet forandrer kodonet ved 150 til et kodon for asparaginsyre, det påfølgende kodonet ved enden av innskuddet blir rekonstituert til en Gly, og den gjenværende sekvensen av residiene som fortsetter med His-Glu-Arg osv. ned til det C-terminale Val-residiet forblir som i pcCSF-17. LCSF er ellers identisk i sekvens til SCSF opp til residie 150, med unntagelse av at det har Asp istedenfor Tyr i posisjon 59.

To av klonene, 4 og 25, ble klonet inn i M13mpl8 eller M13mpl9 for sekvensering for å bekrefte resultatene vist i figur 2 ved bruk av EcoRI-restriksjonssetene. Disse to klonene viste seg å være identiske ved restriksjonsenzymana-lyse. Den fullstendige sekvensen til klon 4 ble bestemt og er som vist i figur 2; delvis sekvensering av klon 25 gir samsvarende resultater. De ble deretter subklonet inn i den modifiserte Okayama-Berg vektor pcDB, som ble fremstilt fra publisert Okayama-Berg vektorene pcDVl og pLl (Okayama, H. , et al, Mol Cel Biol (1983) 3:280-289) som følger: pcDVl ble spaltet med Hindlll og Kpnl og det store fragmentet, som tilveiebragte Amp<R>, pBE322 replikasjonsorigo, og et polyadenyleringssete, ble isolert. pLl ble spaltet med Hindlll og Pstl og det lille fragmentet, som tilveiebringer SV40-promoter og replikasjonsorigo, ble isolert. Disse fragmentene ble ligert på nytt i en treveis ligering med det syntetiske, Kpnl/Pstl-spaltede oligonukleotidfragment

for å tilveiebringe pcDB, et plasmid som korresponderer til pcD-x vist i referansen, hvori "x" blir erstattet med en polylinker. pcDB inneholder dermed SV40 tidlig-promoteren og en rett nedstrøms linker etterfulgt av et polyadenylerings-

sete. Sekvenser ligert inn i polylinkerregionen bør bli uttrykt under kontroll av SV40 tidlig promoter.

Før testing av ekspresjon, fordi klonene 4 og 25 så ut til å mangle noen 5'-endesekvenser sammenlignet med CSF-17, ble oppstrømsdelene fra pcCSF-17 erstattet med de fra klonene 4 og 25.

Fremgangsmåten for denne substitusjonen var som følger: pcCSF-asp59-BamBcl (se nedenfor) ble spaltet med Smal, som kutter ved den ekstreme 5'-enden til den ikketranslaterte sekvensen (se figur 1) og det lineariserte plasmidet ble ligert til EcoRI-linkere og påny forseglet. Det religerte plasmidet ble deretter spaltet med EcoRI, som fjerner hele den kodende regionen fra Smal-setet ved den ekstreme 5'-enden til EcoRI-setet rett nedstrøms for stoppkodonet. Denne ble ligert inn i polylinkeren til pcDB ved EcoRI-setet. De kodende sekvensene nedstrøms for BstXI-setet, som er beliggende ved omtrent kodonet for aminosyre 8 til CSF-17 modne proteinsekvensen (se figur 1) ble fjernet ved spaltning med BstXI og Kpnl. (Kpnl kutter inn i linkeren like nedstrøms for EcoRI-setet etter stoppkodonet). Denne fjernede nedstrøms-sekvensen ble erstattet med det analoge Bstl/Kpnl-fragmentet fra pM13-4 og pM13-25. De resulterende klonene, pcDBhuCSF-4 og pcDBhuCSF-25 inneholdt dermed de kodende sekvensene nedstrøms for kodonet for omtrent aminosyre 8 fra klonene 4 og 25, respektivt, og oppstrømssekvensene fra pCSF-17. De ligerte sekvensene er i leseramme og under kontroll av SV40 tidlig-promoter.

Mutein- kodende sekvenser/ eukarvote ekspresjonsvektorer Modifikasjoner ble utført på pcCSF-17-innskuddene for å tilveiebringe korresponderende plasmider som koder for muteiner til SCSF-protein. For sete-spesifikk mutagenese, ble pcCSF-17 og M13mpl8 spaltet med det samme restriksjonsenzymet som kutter ut den hensiktsmessige regionen av CSF-1 kodende sekvensen, og den utkuttede sekvensen ble ligert inn i M13- vektoren. Syntese av den andre tråden og tilveiebringing av det ønskede muterte DNA anvendte følgende oligonukleotid-primere: for pro52SCSF, 5' -TACCTTAAACCGGCATTTCTC-3', som danner et nytt Hpall-sete ved kodonene 52-53;

for gln52SCSF, 5 ' -TACCTTAAACAGGCCTTTCTC-3' , som danner et nytt Stul-sete ved kodonene 52-53;

for asp59SCSF, 5'-GGTACAAGATATCATGGAG-3', som danner et nytt EcoRV sete ved kodonene 59-60.

Etter utvidelse av den andre tråden ved bruk av Klenow, ble fagen transformert inn i E. coli DG98 og de resulterende plaquene ble screenet med kinasemerket probe. Etter plaque-rensing, ble de ønskede muterte innskuddene satt tilbake for å erstatte de ikke-muterte innskuddene i pcCSF-1, som ga pCSF-pro52, pCSF-gln52 og pCSF-asp59, respektivt.

Plasmidene inneholdende tre delesjonsmutanter som koder for C-terminal deletert SCSF/CV158 ble også fremstilt: pCSF-Bam, pCSF-BamBcl, og pCSF-BamTGA. pCSF-Bam, pcCSF-17 ble spaltet med BamHI, og oppstrømsfragmentet BamHI/BamHI-fra den kodende regionen ble isolert og religert til vektorfragmentet. Ligeringsblandingen ble transformert inn i E. coli MM294 og plasmidene med den riktige orientering ble isolert. Det resulterende pCSF-Bam koder for 158 aminosyrer av CSF-1-proteinet som er fusert til seks residier som kommer fra vektoren ved C-terminus: arg-his-asp-lys-ile-his.

For pCSF-BamBcl, som inneholder hele CSF-l-kodende sekvensen, med unntagelse av at serin i posisjon 159 er mutert til et stoppkodon, ble den kodende sekvensen kuttet ut fra pcCSF-17 og ligert inn i M13 for sete-spesifikk mutagenese ved bruk av primeren: 5'-GAGGGATCCTGATCACCGCAGCTCC-3'. Dette resulterer i et nytt Bcll-sete ved kodonene 159-160. Det muterte DNA ble kuttet ut med BstXI/EcoRI og ligert inn i BstXI/EcoRI spaltet pcCSF-17, og ligeringsblandingen ble transformert inn i E. coli DG105, en dam- vert, og plasmid DNA ble isolert. pCSF-BamTGA, hvori kodonene nedstrøms for stopp ved 159 er deletert, hie pCSF-BamBcl spaltet med Xhol og Bell, og innskuddet ligert inn i XhoI/BamHI spaltet pcCSF-17.

I tillegg ble pCSF-Glyl50, som inneholder et TGA-stoppkodon istedenfor histidin i posisjon 151 fremstilt fra pcCSF-17 innskuddet ved sete-spesifikk mutagenese ved bruk av den hensiktsmessige primeren, som beskrevet ovenfor. Den hensiktsmessige primer er 5 *-AGCCAAGGCTGATCAAGGCAGTCC-3'. Dermed ble nedstrømsdelen av den kodende sekvensen kuttet ut fra pcCSF-17 med BstXI/EcoRI inn i M13-vektorene for mutagenese, og deretter satt inn igjen etter plaque-rensing som et BstXI/EcoRI-innskudd.

"Dobbel"-muteiner ble fremstilt på en lignende måte. Dermed, ble for eksempel pCSF-asp59-glyl50, som koder for asp5gSCSF/CV150 spaltet med BstXI/EcoRI for å plassere C-terminalfragmentet inn i M13 for sete-spesifikk mutagenese med den samme primeren som ovenfor for dannelse av pCSF-glyl50. Det muterte fragmentet ble deretter satt tilbake i vektoren for å tilveiebringe pCSF-l-asp59-glyl50.

På lignende måte ble fremgangsmåten for fremstilling av pCSF-BamBcl gjentatt (med unntagelse av at pcSF-asp59 ble anvendt istedenfor pcCSF som et utgangsplasmid) for å tilveiebringe pCSF-asp59-BamBclI.

Ved bruk av analoge teknikker ved de som er beskrevet ovenfor for fremstilling av pCSF-gln52 og pCSF-asp59, blir de korresponderende plasmidene inneholdende de lange formene av de korresponderende muteinene, pLCSF-gln52 og pLCSF-tyr59, fremstilt. Fremgangsmåten er som beskrevet ovenfor med unntagelse av at hver gang pcCSF-17 blir anvendt i den fremgangsmåten, blir pcDBhuCSF-4 eller dets ekvivalente plasmid substituert, og de hensiktsmessige forandringer i primer for tyrsg-muteinet blir utført.

Sete-spesifikk mutagenese blir også anvendt for å tilveiebringe de ønskede mutasjonene ved glykosyleringssetene til begge proteinene og for erstatning av cystein i posisjon 90; den kan også bli anvendt for å tilveiebringe forskjellige C-terminale delesjoner i LCSF-kodende DNA.

F.4. Transient ekspresjon av CSF- 1

Ekspresjon av pcCSF- 17

Ekspresjon av plasmid DNA fra CSF-17 (pcCSF-17) i COS-7 cellene ble bekreftet og kvantitert ved bruk av benmargs-prolifereringsanalyse, kolonistimuleringsanalyse og radioreseptoranalyse. Som kjent ligger spesifisiteten til benmargsprolifereringsanalysen for CSF-1 bare i evnen som CSF-1 antiserum har til å forminske aktiviteten; og spesifisiteten for kolonistimuleringsanalysen, ligger i beskaffenheten av koloniene som er tilveiebragt. Begge analysene viste at CSF-1 produksjonen var på flere tusen enheter per ml.

Benmargsproliferering

For benmargsstimuleringsanalysen, som måler biologisk aktivitet til proteinet, ble benmargsceller fra Balb/C-mus behandlet med en serie fortynninger av 72-timer supernatanter og proliferering av cellene ble målt ved opptak av merket tymidin, essensielt som beskrevet av Moore, R.N, et al, J Immunol (1983) 131:2374; Prystowsky, M.B., et al, Am J Pathol

(1984) 114:149. Mediet fra induserte MIAPaCa-cellene ble anvendt som kontroll. Spesifisitet for CSF-1 ble bekreftet ved evnen som kanin antisera som er laget mot humant urin CSF-1 har til å undertrykke tymidin-opptak. Resultatene for C0S-7-celle supernatantene transfektert med pcCSF-17 (CSF-17 supernatant) ved en 1:16 fortynning som vist i tabell 1.

(Antihumant CSF-l-serum ble fremstilt som beskrevet ved Das et al, ovenfor ).

MIAPaCa-supernatanten (ved 1:16 fortynningen anvendt ovenfor) inneholdt 125 U/ml CSF-aktivitet som korresponderer til 2000 U/ml i den fortynnede supernatant, hvor 1 enhet kolonistimulerende aktivitet er definert som mengden av CSF som er nødvendig for å produsere en koloni fra IO<5>benmargscelle/ml i analysen til Stanley, E.R. , et al, J Lab Clin Med (1972) 79:657).

Disse resultatene viser at benmargsstimulerende aktivitet er assosiert med CSF-1, siden tymidinopptaket er inhibert av anti-CSF-l-serum. Regresjon av resultatene i denne benmargs-prolifereringsanalysen som ble oppnådd ved 4 fortynninger varierende fra 1:8 til 1:64 tilveiebragte en estimert aktivitet for CSF-1 i CSF-17-supernatantene på 2358 U/ml, som ble redusert til 424 U/ml i nærvær av antiserum, men som viste en tilsynelatende økning til 3693 U/ml i nærvær av ikke-immunt serum. Dette var sammenlignbart med nivåene vist i radioreseptoranalysen nedenfor.

Kolonistimulering

Direkte analyse av CSF-17-supernatantene for kolonistimulering (Stanley, E.R. , et al, J Lab Clin Med (ovenfor) viste 4287 U/ml, som var i vesentlig grad upåvirket av tilstedeværelse av ikke-immunt serum, men som reduserte til 0 U/ml i nærvær av kanin antihumant CSF-1. Dette kan sammenlignes med 2562 U/ml i MIAPaCa-supernatantene. Åttifem prosent av pcCSF-17 transformert COS-7 supernatant induserte kolonier hadde mononukleær morfologi; MIAPaCa-supernatant-induserte kolonier viste en 94% makrofag-6% granulocyttforhold.

Radipreseptoranalyse

Radioreseptoranalysen måler konkurransen mellom<125>I-merket CSF-1 og testforbindelsen for spesifikke reseptorer på J774.2 muse makrofag-celler. MIAPaCa-supernatanten, analysert for kolonistimulerende aktivitet som ovenfor, hie anvendt som en standard (2000 U/ml).

CSF-l-konsentrasjonen til pcCSF-17 transformert COS-7 supernatant ble funnet å være 2470 U/ml basert på 1:10 fortynningen og 3239 U/ml basert på en 1:5 fortynning.

Dermed ble sammenlignbare verdier for CSF-1 konsentrasjon i mediet til C0S-7-cellene transformert med pcCSF-17 funnet i alle analysene.

Ekspresjon av SCSF

På en lignende måte som den som er beskrevet ovenfor for pcCSF-17, ble mutein-kodende plasmidene transfektert inn i C0S-A2-cellene og forbigående ekspresjon av CSF-l-aktivits-analyse ved benmargsprolifereringsanalysen og ved radio-immunoanalysen ved bruk av anti-CSF antistoffer utført. Ekspresjonsproduktet til pCSF-pro52 var ikke-aktivt, som ventet, indikerer at substitusjon med prolin ikke er varende. Alle andre muteiner viste aktivitet i begge analysene som vist ved resultatene nedenfor:

Ekspresjon av pcDBhuCSF- 4 og pcDBhuCSF- 25

Okayama/Berg-type vektorene inneholdende den lange formen av humant CSF-l-kodende DNA (pcDBhuCSF-4 og pcDBhuCSF-25) ble transfektert inn i C0S-A2-cellene på en måte som er nøyaktig analog til den som ble beskrevet for transfeksjon av COS-7 celler med pCSF-17 ovenfor. Supernatantene til de transfek-terte cellene ble analysert for CSF-1 ved bruk av radioimmunoanalyse med antiserum som ble laget mot CSF-1 og preparert som beskrevet av Das et al (ovenfor), og også i benmargsprolifereringsanalysen beskrevet ovenfor. Resultatene, i enheter CSF-1 per ml, er vist i tabell 4.

Som indikert, inneholdt supernatantene til cellene transfektert med hvilken som helst av vektorene protein med CSF-1 aktivitet.

På en lignende måte "blir muteine former av disse spesifikke LCSF langform-proteiner tilveiebragt.

F. 5 Eukaryot ekspresjon av CSF- 1 i stabilt transformerte

celler

COS-7 eller C0S-A2 systemene tilveiebringer rekombinant CSF-1 ved å tillate replikasjon av og ekspresjon fra Okayama-Berg-type vektorsekvenser. Det er et transient ekspresjonssystem.

Humane eller murine CSF-1 sekvenser kan også bli stabilt uttrykt i prokaryote eller eukaryote systemer. Generelt tilbyr prokaryote verter en lett produksjon, men eukaryote tillater anvendelse av native signalsekvenser for å tilveiebringe utskilling og utføre av en hvilken som helst ønskelig posttranslasjonsprosessering. Dette kan være viktig når det gjelder CSF-1 siden det native proteinet er en dimer. Bakterier produserer CSF-1 som en monomer, som deretter kan bli utsatt for dimeriseringsbetingelser etter ekstrahering, hvis nødvendig.

Okayama-Berg plasmid pcCSF-17, eller de analoge vektorene inneholdende DNA-kodende muteiner, f.eks. pCSF-asp5g-gly^50og pCSF-asp5g-BamBcl, eller de analoge vektorene pcDBhuCSF-4, pcDBhuCSF-25, pcDBmuCSF-L og pcDBmuCSF-S eller andre vektorer som koder for muteinet til LCSF, som inneholder cDNA som koder for CSF-1 under kontroll av SV40-promoteren kan også bli anvendt for å tilveiebringe stabil ekspresjon i ape CV-1 cellene, morcellelinjen som C0S-7-linjen ble avledet fra. Vert ape-CV-l-cellene ble dyrket til konfluens og deretter kotransformert ved bruk av 10 jjg av ekspresjonsvektoren, og forskjellige mengder (1, 2, 5, og 10 >jg) av pRSV-NE02 (Gorman, C, et al, Science (1983) 221:551-553) per 500.000 celler. Transformantene ble latt vokse i DMEM med 10% FBS- medium inneholdende 100 jjg/ml G418-antihiotika, som pRSV-NE02-plasmidet er motstandsdyktig for. CV-l-cellelinjen viser en G418-transformeringsfrekvens på omtrent IO-<5,12>kolonier per 10^ celler per pg DNA. CV-l-cellene blir kotransformert som beskrevet ovenfor og selektert i G418-inneholdende medium. Resitente kloner ble testet for stabiliteten av G418-resistent fenotype ved vekst i G418-fritt medium og deretter returnert til G418-inneholdende medium. Evnen som disse kulturene har til å overleve når de blir returnert til antibiotika-inneholdende medium foreslår at pRSV-NE02 DNAet er permanent integrert i celle-genomet. Siden cellene som er stabilt transformert med et markørplasmid omtrent har en 50% sannsynlighet for å ha DNAet fra et kotransfekterende plasmid integrert, vil omtrent halvparten av disse cellene også inneholde ekspresjons-systemet for CSF-l-proteinet i deres kromosomale DNA.

Flere kloner fra G418-resistente samlingen av CV-l-cellene som har vist seg å være stabilt transformert som ovenfor, blir plukket og latt vokse i duplikate flasker til nesten konfluens. En flaske av hver duplikat blir infisert med SV40-virus ved en infeksjonsmultiplisitet på 5, og mediet blir høstet 6 dager etter infeksjon for analyse for CSF-1 ved bruk av en radioimmunoanalyse. Immunoanalysen er basert på konkurransen for<125>I-merket MIAPaCa CSF-1 for "kanin 52" polyklonalt antiserum som er laget mot renset humant urin CSF-1.

En av de selekterte CV-l-klonene fra transfeksjon med pcCSF-17 viste en produksjon på 2335 U/ml CSF-1, i henhold til denne analysen, mens cellene ikke infisert med SV40 viste mindre enn 20 U/ml. Kontroller som benytter C0S-7-cellene transformert med 10 pg pcCSF-17 viste 2400 U/ml CSF-1 produksjon uten SV40-infeksjon.

CSF-l-produserende CV-1 cellelinjen inneholder ekspresjons-systemet til CSF-1 som er stabilt integrert inn i dets genom, og som dermed kan bli anvendt for produksjon av CSF-1 ved infeksjon med SV40. Infeksjonen er antatt å "redde" ekspre-sjonssystemet fra genomet, og tilveiebringe SV40 T-antigen som er nødvendig for replikasjon av reddet DNA. Uten SV40-infeksjon blir det integrerte genet som koder for CSF-1 ikke uttrykt effektivt.

Optimalisering av ekspresjonen av CSF-l-kodende sekvensen ved CV-1 (CSF-17) cellelinjen viste 6500-8000 U/ml når den blir målt ved radioimmunoanalyse seks dager etter SV40-infeksjon ved bruk av en infeksjonsmultiplisitet på minst en 1, og et 10% FBS-medium. Studier av ekspresjonsnivåer ved en multi-plisitet på 10 viste sammenlignbar produksjon, men produksjonen ble redusert ved fjerning av FBS fra mediumet andre dag etter infeksjon.

I alternativet kan hensiktsmessige kontrollsystemer og vertsvektorer som tillater ekspresjon i andre eukaryote verter bli anvendt for å tilveiebringe CSF-l-kodende innskuddene. For eksempel, kan CHO-cellene og egnede vektorer bli anvendt. I tillegg blir baculovirus-vektorer inneholdende disse sekvensen anvendt til å infisere insektcellene for produksjon av protein som beskrevet ved Miller, D.W., et al, i Genetic Engineering (1986), s. 277-297 (ovenfor).

F.6 Prokaryot ekspresjon

For prokaryot ekspresjon blir cDNA-klonen, eller den genome sekvensen med introner kuttet ut ved, for eksempel, sete-spesifikk mutagenese, forandret for å plassere et ATG-startkodon rett oppstrøms for glutaminsyre ved N-terminus, og et Hindlll-sete rett oppstrøms for ATG for å tilveiebringe et hensiktsmessig sete for innskudd inn i standard vertsekspre-sjonsvektorene nedenfor. Dette kan bli utført direkte ved bruk av innskudds sete-spesifikk mutagenese med en syntetisk oligomer som inneholder en ny sekvens som er komplementær til det ønskede AAGCTTATG, flankert av nukleotidsekvensene som er komplementære til den native leder og N-terminale kodende sekvenser.

DNA-fragmentet inneholdende hele den kodende sekvensen ble kuttet ut fra pcCSF-17, eller fra pcDBhuCSF-4, ved spalting med EcoRI, isolert ved agarosegel-elektroforese, og ervervet ved elektroeluering. For å utføre mutagenesen, ble verts-bakteriofag M13mpl8 DNAet også behandlet med EcoRI og ligert med det rensede fragmentet under standard betingelser og transfektert inn i frosne kompentente E. coli K12 stamme DG98. Cellene ble plassert i media inneholdende 5 x IO-<4>M isopropyltiogalaktosid (IPTG) tilveiebragt fra Sigma Chem.

(St. Louis, MO) og 40 jjg/ml X-gal. Ikke-komplementerende hvite plaques ble plukket inn i friskt medium. Mini-kulturer ble screenet for rekombinant enkelttrådet fag-DNA med ventet størrelse, og strukturen til den ønskede rekombinante fagen ble bekreftet ved bruk av restriksjonsanalyse.

En 34-mer som er komplementær til N-terminal og lederkodende delene av CSF-l-sekvensen, men som inneholder komplementet til den ønskede AAGCTTATG-sekvensen ble syntetisert og renset. I alterantivet, når den negative plusstråden M13 ble anvendt, ble den positive pluss 34-mer anvendt. En del av dette 34-mer preparatet som senere skal bli anvendt som probe ble radiomerket i henhold til en modifikasjon av teknikken til Maxam og Gilbert (Maxam, A., et al, Methods in Enzymology

(1980) 68:521, Academic Press) som beskrevet ovenfor.

For å utføre mutagenesen ble den ovenfor preparerte rekombinante bakteriofagen preparert i E. coli K12 stamme DG98 og enkelttrådet fag-DNA renset. Et pmol av enkelttrådet fag-DNA og 10 pmol av ovenfor syntetiske nukleotidprimer (ikke kinasebehandlet) ble sammensmeltet ved oppvarming i en min. ved 67°C, og deretter 30 min. ved 37°C i 15jj1 20 mM Tris-Cl, pH 8, 20 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 20 mM 2-merkaptoetanol. Sammensmeltet DNA ble inkubert med DNA-polymerase I (Klenow) og 500 pmol dNTPer i 30 min., 0°C og deretter bragt til 37°C. Aliquoter (0,05 eller 0,25 pmol) ble fjernet etter 5 min., 20 min., og 45 min., transformert inn i E. coli K12-stammen DG98 og sådd ut.

Etter vekst, ble platene avkjølt ved 4°C og plaquene ble løftet med Pall-membranet tilveiebragt fra Biodyne eller S&S-filtrene (1-2 min. i det første filteret, mer enn 10 min. når det gjelder det andre filteret. Filtrene blir denaturert i 2,5 M NaCl, 0,5 M NaOH (5 min.). Denatureringsmediumet blir nøytralisert med 3 M natriumacetat til pH 5,5, eller med 1 M Trls-Cl, pH 7,5 inneholdende 1 M NaCl, filtrene ble bakt ved 80°C under vakuum in 1 t, og deretter prehybridisert ved høy stringens. Filtrene ble deretter probet med kinasebehandlet syntetisk 34-mer preparert ovenfor ved høy stringens, vasket, og autoradiografert over natt ved —70°C.

RF-formen av hver ønsket mutert fag ble behandlet med EcoRI, gjort butt med Klenow, og deretter spaltet med Hindlll for å kutte ut genet som et HindiII/butt fragment.

Plasmid pFC54.t (ATCC 39789), som inneholder pL-promoter og Bacillis thuringiensis positive retroregulatoriske sekvens (som beskrevet i EPO søknad publikasjonsnr. 717,331, publisert 29. mars, 1985), ble anvendt som en vertvektor. pFC54.t ble spaltet med Hindlll/BamHI (butt), og de ønskede kodende sekvensene ble ligert inn i vektoren ved bruk av Hindlll/EcoRI (butt) utkuttede fragment fra mutert M13 avledet fra pcCSF-17 eller pcDBhuCSF-4. Etter transformering inn i E. coli MC1000 lambda lysogen, og induksjon, CSF-l-produksjon, formodentlig av SCSF og LCSF, respektivt, ble tilveiebragt og verifisert som beskrevet ovenfor.

Dermed ble for eksempel Hindlll/EcoRI butt fragmentet fra M13 substratet mutert fra pcCSF-17 ligert inn i pFC54.t som beskrevet ovenfor for å tilveiebringe pPLCSF-17. pPLCSF-17 ble deretter spaltet med BamHI og religert for å tilveie bringe pPLCSF-17/CV158, som inneholder den kodende sekvensen for modent SCSF med et foranliggende ATG-startkodon, og avkortet for å kode for et protein som har de første 158 aminosyrene til SCSF-sekvensen, etterfulgt av en i-leseramme prolin og stoppkodon fra den retroregulatoriske sekvensen til pFC54.t. pPLCSF-17/CV158 ble videre modifisert ved sete-spesifikk mutagenese. Hindlll/BamHI kodende sekvensen ble kuttet ut og ligert inn i M13. En hensiktsmessig primer ble anvendt for å plassere et stoppkodon rett etter kodonet som koder for aminosyre 158, og etterfølge det med TGA. Dette danner et BamHI/BclI-sete for videre manipulering. Det muterte fragmentet ble deretter kuttet ut fra M13 og religert inn i Eindlll/BamHI-spaltet pPLCSF-17/CV158 for å tilveiebringe pPLCSF-17/CV158TGA.

Andre konstruksjoner som har kodoner for substituert aminosyrer innbefatter modifikasjoner som erstatter lys i posisjon 52 med gin eller pro og/eller tyr i 59 med asp i SCSF. Disse konstruksjonene ble laget analogt ved sete-rettet mutagenese av Ml3-innskudd inneholdende Hindlll/EcoRI (butt) fragment fra det opprinnelige pPlCSF-17. HindiII/EcoRI-fragmentene fra disse muterte fagene ble deretter anvendt istedenfor det opprinnelige Hindlll/EcoRI-innskuddet i konstruksjon av korresponderende vektorer. Generelt kan ønskede mutasjoner ved valgte steder bli utført i henhold til variasjoner av denne standardteknikken.

Det er mulig å forbedre nivået av CSF-1 produksjon fra en hvilken som helst av de foregående konstruksjonene ved å forandre det tredje nukleotidet i hver av de første seks kodonene til N-terminus. pFC54.t inneholdende CSF-l-kodende fragment fra et hvilket som helst mutein blir spaltet med Hindlll/BstXI, og det utkuttede fragment (som inneholder ATG og en kort del av den påfølgende kodende sekvensen) blir erstattet med et syntetisk Hindlll/BstXI-segment hvori de første seks kodonene har sekvensen: GAAGAAGTTTCT GAATAT. Den resulterende analoge ekspresjonsvektoren representerer ingen forandring i den kodete aminosyresekvensen; grad av ekspresjon ble derimot forbedret når denne modifiserte vektoren ble anvendt. De korresponderende vektorene har prefiks O/E (over-ekspresjon). Dermed blir for eksempel O/E pPlCSF-17, O/E pPLCSF-17/CV158, og O/E pPLCSF-17/CV158TGA dannet.

Den korresponderende vektoren, O/E pPLCSF-17asp5g, CV158TGA ble syntetisert som beskrevet ovenfor med unntagelse av at M13 inneholdende det opprinnelige EcoRI-innskuddet ble dobbeltmutert for å plassere et Hindlll-sete og ATG-startkodon rett foran aminosyre 1 i det modne protein, og å ersattet tyrosinkodonet i residie 59 med et kodon som representerer asparaginsyre. De korresponderende vektorene O/E pPLCSF-17asp5g/CV158, og O/E pPLCSF-17a<sp>59/CV158TGA blir dermed dannet på korresponderende måte. I alle foregående tilfellene, kan hver av de intermediate vektorene bli spaltet med Hindlll og BstXI og det syntetiske DNA-fragmentet som inneholder foretrukne kodoner kan bli substituert for den native sekvensen som koder for de første seks aminosyrene.

I tillegg, blir alle forutgående vektorene modifisert for å kode for proteiner med N-terminale delesjoner ved substitusjon av det hensiktsmessige syntetiske fragmentet for det utkuttede HindiII/BstXI DNA. På denne måten, ble de korresponderende vektorene som koder for CSF/NV2 og NV3, som mangler glu-glu og glu-glu-val konstruert.

Analoge vektorer ble også konstruert som inneholder et termineringskodon rett etter glycinresidiet i posisjon 150 i SCSF-proteinet. Disse vektorene ble tilveiebragt ved mutagenese av Hindlll/EcoRI-fragmentet fra pPLCSF-17 eller pPLCSF-17asp59eller deres korresponderende muteiner inn i Hindlll/Smal-spaltet M13. De resulterende vektorene, for eksempel, pPLCSF-17/CV150 og pPLCSF-17asp5g/CV150 koder derfor for de første 150 aminosyreresidiene til det modne SCSF-proteinet.

De forutgående vektorene ble deretter transformert inn i E. coli X lysogenvert, såsom DG116 og indusert ved høy temperatur (omtrent 42°C) produserer CSF-1 og muteiner derav i monomerisk eller aggregert deglykosylert form. Produksjonen av dette proteinet kan bli detektert ved anvendelse av standard radioimmunoanalyse eller andre CSF-l-spesifikke analyser. Aktiviteten av proteinet kan målbart bli forbedret ved anvendelse av refoldings-prosedyren.

Konstruksjoner er også blitt laget ved anvendelse av fosfatase A promoter og utskillbar ledersekvens istedenfor Pl~promoter. Kontrollsekvensene, innbefattende 3'-retroregulatoriske sekvensene korresponderende til de som er i pFC54.t blir tilveiebragt ved å sette inn den ønskede kodende sekvensen inn i Narl/BamHI spaltet pSYC1089, en vertvektor som inneholder disse kontrollene.

For å anvende denne vektoren, blir de relevante CSF-kodende sekvensene religert inn i M13 for å forandre Eindlll-setet rett foran ATG til et Clal-sete. Den muterte sekvensen blir deretter kuttet ut som et Clal/BclI-fragment og ligert inn i den spaltede pSYC1089-vektoren som beskrevet. Produktene av denne konstruksjonen, korresponderende til de korte formene som ble produsert under kontroll av PL-promoteren i pl~vektorseriene blir utskilt inn i periplasmaområdet når den blir uttrykt i E. coli og er relativt oppløselig sammenlignet med produkter av gener uttrykt under PL-kontroll. Vektorer som kan bli konstruert ved bruk av phoA-systemet som her er beskrevet innbefatter pPhoA-LCSF/CV158 og pPhoA/NV3CV150. Disse vektorene blir transformert for ekspresjon inn i en ikke-X lysogen vert, såsom E. coli MM294.

Vektorer ble også konstruert ved bruk av DNA avledet fra klonen med lang form. O/E pPLCSF-17asp5g/CV150, beskrevet ovenfor, ble anvendt som vertsvektor for konstruksjoner av den lange formen og for forskjellige C-terminal avkortinger i den kodende sekvensen til den lange formen. På grunn av at sekvensene oppstrøms for BstXI-setet er felles for både de korte og lange formene, kan vektorene inneholdende den korte formen og dets muteiner bli omdannet til vektorer med lang form ved ombytting av BstXI til BamHI fragmentet i denne vektoren, som kutter ut nedstrømsdelene av sekvensen innbefattende TGA-stoppkodonet med BstXI til BamHI-fragmentet til M13 inneholdende lang-form kodende sekvensen fra klon 4, eller dets C-terminale avkortinger.

Dermed ble M13-klonen inneholdende klon 4 innskuddet mutert med hensiktsmessige oligomerer for å sette stoppkodoner etter residiene ved posisjonene etter 150, 190, 191, 221, 223, 236, 238, 249, 258 og 411. For eksempel, ble den omvendte tråden M13 inneholdende klon 4 innskuddet behandlet med en primer med oligonukleotidet GGCTTGACCTGATCAGACTCTGAGG for å plassere et stoppkodon etter treoninresidiet ved posisjon 191 og tilveiebringe et unikt Bcll-sete rett etter. Den mutageni-serte RF-formen av fagen ble spaltet med BstXI og BamHI og ligert inn i BstXI/BamHI-spaltet O/E pPLCSF-17asp59/CV150 for å tilveiebringe O/E pPLCSFasp5g/CV150.

Den muterte lange formen kan bli anvendt til å erstatte de korresponderende kortform-fragmentene fra vektorene som koder for CSF-l-proteinene med N-terminale delesjonene, og likeledes fra de korresponderende konstruksjonene i phoA-kontrollerte vektorene. For eksempel, ble pPhoA-LCSF/NV3CV221 og pPhoA-LCSF/CV221 konstruert og transformert inn i E. coli MM294. Mer enn en mutasjon av den lange formen kan selvfølge-lig bli tilveiebragt; aminosyresubstitusjoner, såsom glysg eller ty<r>5g, kan også bli utført.

Andre konstruksjoner er blitt utført for muteiner som koder for SCSF, LCSF og deres muteiner hvori glykosyleringssetet ved posisjonene 122-124 og 140-142, som er felles for proteinene er blitt erstattet med aminosyrene som ikke er utsatt for glykosylering. CSF-proteinene som er produsert fra bakteriell ekspresjon av disse konstruksjonene er aktive i biologiske analyser; dette underbygger proposisjonen om at glykosylering ikke er nødvendig for aktivitet. Erstatning av et hvilket som helst cysteinresidie mellom posisjonene 1-150 med serin eller alanin resulterer i ikkeaktive proteiner, med unntagelse av at muteinene som har en substitusjon i posisjon 90 har immunoreaktivitet. Alle syv cysteinene er nødvendige, eller i hvert fall ønskelige, for riktig refolding.

Konstruksjon av NV2 og NV3 muteinene ifølge oppfinnelsen fra hvilke som helst av de ovenfor nevnte vektorene er veldig enkelt, og innbefatter bare deletering av Hindlll/BstXI-fragment og erstatning av denne med et syntetisk fragment som ikke innbefatter kodonene for de første to eller tre aminosyrene. Hver av de foregående vektorene kan bli modifisert for å tilveiebringe en vektor som koder for muteinene ifølge oppfinnelsen ved denne enkle substitusjonsprosedyren.

Innbefattet i de rekombinante organismene som blir preparert, er E. coli DG116 X lysogen transformert med følgende plasmider, som er konstruksjoner for ekspresjon av de indikerte kort form-avleste CSF-l-muteinformene:

Følgende analoge rekombinante organismer som koder for variasjoner av den lange formen blir konstruert:

For ekspresjon av konstruksjonene, blir riktig transformert E. coli (X lysogen, f.eks. DG116 for PL-konstruksjonene, ikke-lysogen, f.eks. MM294 for PhoA) latt vokse til ønsket celletetthet og deretter blir produksjon av det kodete proteinet indusert. Hvis det blir uttrykt under kontroll av PL-promoteren, induserer en økning i temperatur til 37" C eller 42°C ekspresjon. Tilsetting av 0,5-2% casamino-syrer til mediumet er også til hjelp for å øke ekspresjon. Kon struksjoner beskrevet ovenfor resulterer i dannelsen av CSF-1 som et ikke-oppløselig intracellulært protein som kan bli utvunnet fra lyserte celler, renset og refoldet. Lignende prosedyrer kan bli anvendt til å rense og refolde CSF-1 utskilt i periplasmaområdet til E. coli transformert med phoA-kontrollerte gener.

Generelt begynner refoldingen med den oppløste monomeren i chaotrofe omgivelser, som blir opprettholdt under reduserende betingelser. Slik opprettholdelse kan innbefatte anvendelse av et egnet reduseringsmiddel, såsom p<->merkaptoetanol eller ditiotreitol (DTT), men CSF-1 kan allerede ha blitt redusert, og utelatelse av oksyderingsmiddel kan være tilstrekkelig. Det oppløste proteinet blir vanligvis opprettholdt i, for eksempel, 8 M urea eller 7 M guanidinhydroklorid, ved en pH på omtrent 7-8,5, i nærvær av omtrent 25-100 mM tiolforbind-else. Med utgangspunkt i denne oppløste formen, kan monomeren enten bli refoldet med en gang eller renset fra gjenværende proteiner ved anvendelse av en egnet rensingsprosedyre såsom kromatografi på en adsorberende gel eller gel-gjennomtreng-ningskromatografi før refolding. Gel-gjennomtrengnings-kromatografi er foretrukket, da den tillater en enkel størrelsesseparasjon av den ønskede monomer1engden, som vanligvis er kjent på forhånd, fra urenheter med forskjellig molekylvekt. Det er påkrevd at rensingen blir utført under reduserende betingelser for å forhindre dannelsen av di-sulfid-bundete aggregater. Dermed, uansett hvilken kromato-grafisk fremgangsmåte som blir anvendt, blir et egnet reduseringsmiddel innbefattet i oppløsningene som blir applisert på de kromatografiske kolonnene eller batchene og I elueringsoppløsningene. I noen tilfeller, kan en lav pH bli erstattet med reduseringsmiddel, da en lav pH vil forhindre disulfidbinding-dannelsen i noen kromatografiske systemer, selv i fravær av reduserende middel.

Den delvis rensede monomeren blir deretter utsatt for refoldingsbetingelser for dannelsen av dimeren. Protein konsentrasjonen i løpet av dette steget er veldig viktig. Generelt blir det høyere utbyttet hvis proteinkonsentrasjonen er mindre enn 2 mg/ml av CSF-1 protein; et konsentrasjons-område på 0,03-0,3 mg/ml er foretrukket. Refoldingsbeting-elsene kan innbefatte gradvis fjerning av de chaotropiske omgivelsene i løpet av en hensiktsmessig tidsperiode, vanligvis flere timer. En enkel metode er fortynning av prøven til den ønskede konsentrasjonen til det chaotropiske middelet, men dette er i enkelte tilfeller ikke foretrukket, siden proteinet også blir fortynnet. Mere foretrukket er fremgangsmåtene som tilveiebringer en konstant proteinkonsen-trasjon, såsom dialyse eller hult fiber diafiltrering. Ved slutten av denne prosessen, når de chaotropiske omgivelsene er fjernet, oppnåes et ikke-denaturerende nivå. For eksempel, hvis guanidinhydroklorid blir anvendt som chaotropisk middel, blir en endelig konsentrasjon på mindre enn omtrent 2 M, og fortrinnsvis 0,5-1 M oppnådd.

Refolding i løpet av fjerning av chaotropiske omgivelser blir utført på en måte som tillater oksydering av sulfhydryl-gruppene til disulfider for å oppnå den resulterende biologisk aktive dimere konfigurasjonen som, når det gjelder CSF-1 blir stabilisert ved dannelsen av disulfider, en eller flere som kan binde de to kjedene. Intrakjede disulfider blir også dannet. Egnede redoksbetingelser som oppmuntrer denne dannelsen av dimer innbefatter SH/disulfid-reagentkombinasjo-nene, såsom oksydert og redusert glutation. Forholdet mellom redusert og oksydert glutation eller andre sulfhydryl/di-sulfid-kombinasjoner er vanligvis fra omtrent 2 mM/0,1 mM til 0,5 mM/1,0 mM. Alternative metoder for tilveiebringing av denne oksydasjon er også akseptable. Enkel fjerning av reduseringsmiddelet uten forsiktighetsforanstaltning for å ekskludere luft- og metallioner kan være tilstrekkelig for å tilveiebringe dannelsen av noen riktige disulfidbindinger, men dette er mindre foretrukket. I alle tilfeller bør pH i oppløsningen i løpet av refoldingsprosessen bli opprettholdt ved omtrent ph 7,5-9,0. I refoldingsprosessen kan selvfølge- lig de reduserende betingelser som ble anvendt i løpet av den opprinnelige rensingen ikke bli benyttet.

I løpet av refoldingsprosessen, kan aggregater av monomeren, som er uoppløselige, bli dannet. Dette blir minimalisert ved temperaturkontroll, hvori lave temperturer på omtrent 0-4°C er foretrukket i forhold til høyere temperaturer på 25-37°C. Etter at refoldingen er fullført, blir dimeren renset fra andre proteiner ved bruk av standard prosedyrer.

Når konstruksjoner som koder for de N-terminal fjernede muteinene blir uttrykt i E. coli, som nevnt ovenfor, blir metioninet i N-terminus prosessert mere effektivt enn det som er tilfellet for de korresponderende modne sekvensene. Spesifikt resulterer ekspresjon av pPlCSF-17/CV150 i protein hvori mest, hvis ikke alle av de sekvenserbare molekylene inneholdende N-terminalmetioninet: korresponderende ekspresjon av pPLCSF-17/NV2CV150 resulter i protein hvori bare 78% av molekylene opprettholder N-términal metionin. Ekspresjon av pPlCSF-17/NV3CV150 gir protein hvori bare omtrent 5% av produktet inneholder metionin ved N-terminus.

Figurene 6-9 viser effekten av N-terminale delesjoner på resulterende protein heterogenitet. Figur 6 og 7 viser RP-HPLOanalyser av renset CSF-1 uttrykt i E. coli ved bruk av pPLCSF-17/CV158 (tyr59) og pPLCSF-17/CV150 (asp5g), respektivt. Som vist i begge figurene, er det hovedtopper ved omtrent 18 kd ved reduserende betingelser hvorved disse analysene ble kjørt. Den ledende toppen, merket 18 K-A i figur 6 (og den korresponderende toppen i figur 7) innbefatter omtrent 70% av hele 18 kd proteinet, og har i vesentlig grad den samme aminosyresammensetningen og SDS-PAGE subenhet molekylvekt som den følgende toppen (merket 18 K-B). I tillegg resulterer 158 kodonkonstruksjonen i en hoveduren-het i form av et 15 kd protein, som sannsynligvis er produktet av en indre ny begynnelse. Denne toppen ser ut til å mangle i produktet til 150 kodon (asp5g) konstruksjon, vist i figur 7.

Resultatene i figur 7 bør nøye bli sammenlignet med de figurene 8 og 9, som representerer RP-HPLC analyse fra ekspresjon av pPLCSF-17/NV2CV150 og pPLCSF-17/NV3CV150, respektivt. I begge tilfellene, er den betraktelige heterogeniteten som blir sett på RP-HPLC borte, og en enkelt topp korresponderende til den ledende 70% toppen i figur 7 er tilveiebragt.

G. Murint CSF- 1

En intronløs DNA-sekvens som koder for murint CSF-1 ble fremstilt ved bruk av en murin fibroblastcellelinje som produserer store mengder CSF-1. L-929 linjen, som kan bli tilveiebragt fra ATCC, ble anvendt som en kilde for mRNA for å produsere et cDNA-bibliotek. To kloner som koder for "lang form" av CSF-1 ble ervervet ved bruk av humant "kort form" cDNA som probe. Murint CSF-1 antas å være omtrentelig 80% homolog til det humane stoffet på grunn av homologien til N-terminale sekvenser, evnen som både humant og murint CSF-1 preparater har til å stimulere makrofagkolonier fra benmargceller, og begrenset kryss-reaktivitet med hensyn på radio-reseptor og radioimmunoanalyser (Das, S.K., et al, Blood

(1981) 58:630).

Murint CSF-1 protein er spesielt nyttig i modellsystemer for å bestemme aktivitetsprofilen til CSF-1.

G.1. Preparering av murint CSF- 1 cDNA

Anvendelse av CSF- 17 probe

Total meddeler-RNA ble ekstrahert og renset fra murine L-929-celler. Murine L-929-celler ble dyrket i 8 dager i DME-medium og deretter høstet ved sentrifugering. Total cytoplasma-meddeler-RNA ble isolert fra cellene ved bruk av den samme protokollen som beskrevet ovenfor for MIAPaCa mRNA.

Hele mRNA-preparatet ble kjørt på sukrosegradienter, som beskrevet i PCT-søknad W086/04607 (ovenfor), i sammenheng med preparering av mRNA fra MIAPaCa-cellene, med unntagelse av at en 5-20% sukrosegradient ble anvendt istedenfor 5-20% gradienten som ble anvendt der.

Aliquoter fra hver fraksjon i gradienten ble injisert inn i Xenopus laevis oocytter og produktene ble analysert ved radioimmunoanalyse mot anti-CSF-l-antistoffer fremstilt i henhold til Das et al, (ovenfor). Det var to mRNA-topper ved fraksjonene 17-20 og ved 23-26 som viste translatert produkt immunoreaktivitet med CSF-1.

Fraksjoner 19-20 og 24-25 ble slått sammen og anvendt for å konstruere et cDNA-bibliotek i XgtlO, som beskrevet av Huynh et al (ovenfor). Før innsetting, ble rå-cDNA-preparatet ligert til EcoRI-linkere, spaltet med EcoRI og dobbelt-trådet cDNA ble elektrof orert på en 5% akrylamidgel. Bare DNA inneholdende mer enn 800 bp ble eluert, deretter ligert med XgtlO armer, og pakket ved bruk av vektorkloningssystemene (Strategene) Gigapak.

Omtrent 1 million fagplaque ble probet med et<32>P-merket enkelttrådet CSF-17 DNA preparert som beskrevet i sammenheng med isolering av lang form humant CSF-1 ovenfor.

Et antall fagplaques som hybridiserte til proben ble renset, og to kloner, et med et 2 kb innskudd og det andre med et 4 kb innskudd, ble valgt for videre studier. Restriksjonskart-legging viste at disse klonene hadde en større region felles, og begge klonene ble subklonet inn i M13mpl8 og M13mpl9 for dideoksysekvensering; klonene ble sekvensert på begge trådene. Nukleotidsekvensene for begge klonene og den avledete aminosyresekvensen som er kodet av disse er vist i figurene 4 og 5.

Som vist i figur 4, begynner den lengre, 4 kb klonene ved nukleotid 24 relativt til det humane CSF-17 vist i figur 1 og har 159 bp ikketranslatert 5'-sekvens, etterfulgt av 96 bp DNA som koder for lederen. Den kodende sekvensen for det modne proteinet begynner ved nukleotid 256 i denne klonen og fortsetter i 1560 nukleotider til, og som dermed koder for et 520 aminosyreprotein. Det er betraktelig sekvenshomologi med den humane "lang form" CSF-l-kodende sekvensen. Etter stoppkodonet ved nukleotid 1816, divergerer nukleotidsekvensen sterkt fra den humane 3'-ikke-translaterte sekvensen i pcCSF-17 og i "lang form" klonene.

Den kortere 2 kb klonen har omtrent 500 bp av 3' ikke-translatert sekvens, som er betraktelige mere homolog med 3' ikke-translaterte sekvensen funnet i CSF-17. DNA-sekvensen for den kortere, 2 kb klonen er vist i figur 5. Denne er 90 bp kortere ved 5' enden, men inneholder den samme kodende sekvensen som 4 kb klonen med unntagelse for 2 nukleotid-forandringer, som begge resulterer i forandringer i aminosyresekvens. De relevante posisjonene er 1034 i den lengre (944 i den kortere) klonen, og 1192 i den lengre (1102 i den kortere) klonen. G i posisjon 944 i den kortere klonen resulterer i en Gly i posisjon 259 i det modne protein; den korresponderende A i den lengre klonen resulterer i Asp i denne posisjonen. Den andre forandringen, fra T i den lengre til C i den kortere klonen, resulterer i en forandring fra serin i posisjon 312 til prolin i den kortere klonen.

Dermed, som vist i figurene 4 og 5, er det murine CSF-proteinet omtrent homologt med den lange formen av det humane proteinet, og inneholder tilsynelatende et 296-aminosyreseg-ment korresponderende til den "ekstra" peptidsekvensen "satt inn i" peptidet som blir kodet av CSF-17 DNA.

De lengre og kortere klonene som koder for murint CSF-1, beskrevet ovenfor, og i figurene 5 og 6, ble kuttet ut fra XgtlO ved EcoRI-spalting og klonet inn i den modifiserte Okayama/Berg kloningsvektoren pcDB, som dermed plasserer dem under kontroll av SV40 tidlig promoter, og for å tilveiebringe pcDBmuCSF-L og pcDBmuCSF-S, respektivt.

Muteinformene

På en måte som er nøyaktig lik det som er beskrevet ovenfor i sammenheng med den humane sekvensen, er muterte former av den murine sekvensen nå tilgjengelig i kraft av det isolerte DNA. Spesielt, kan ty^g og<g>lns<g>og tyr5ggln52formene bli tilveiebragt ved modifisering av DNA-innskuddene til pcDBmuCSF-L og pcDBmuCSF-S på en måte som er nøyaktig lik det som er beskrevet for pcCSF-17 ovenfor. De modifiserte vektorene koder deretter for muteinformene til proteinet betegnet as<p>sg-<m>uLCSF, gln52~niuLCSF, og tyr5ggln52-muLCSF, respektivt.

G.2 Eks<p>resjon av murint CSF- 1 DNA

Ekspresjonsvektorene pcDBmuCSF-L og pcDBmuCSF-S ble transfektert inn i C0S-A2 cellene ved bruk av DEAE dekstran med tilsetting av klorquin, som beskrevet ovenfor.

Supernatantene ble samlet etter 72 t og testet for CSF-1 aktivitet ved anvendelse av benmargs-prolifereringsanalysen beskrevet ovenfor. Begge supernatantene inneholdt CSF-1 aktivitet, i henhold til denne analysen, som vist av resultatene i tabell 5.

På lignende måte ble de muteine formene av murinsekvensen tilveiebragt.

H. Formulering av CSF- 1

Rekombinantproduserte humane CSF-1 kort og lang form kan bli formulert for administrering ved bruk av standard farmasøy-tiske prosedyrer. Vanligvis vil CSF-1 bli preparert inn i injiserbar form, og kan enten bli anvendt som det eneste aktive ingrediens, eller i kombinasjon med andre proteiner eller andre forbindelser som har komplementær eller lignende aktivitet. Slike andre forbindelser kan innbefatte alternative anti-svulstmidler, såsom adriamycin eller lymfokiner, såsom IL-1, -2, og -2, alfa-, beta-, og7-interferoner og svulstnekrosefaktor. Effekten av CSF-1 aktivt ingrediens kan bli forsterket eller forbedret ved nærvær av slike tilset-ningskomponenter. Som beskrevet ovenfor kan CSF-1 reagere på hensiktsmessig måte med hensiktsmessige blodceller, og komposisjonene ifølge oppfinnelsen innbefatter dermed Inkubasjonsblandinger av slike celler med CSF-1, eventuelt i nærvær av flere lymfokiner. Enten så kan supernatantfraksjon-ene av slike inkubasjonsblandinger, eller hele blandingen inneholdende cellene bli anvendt.

Deponeringer

2. april, 1985, har søkerne deponert til the American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA (ATCC) fag phCSF-1 i E. coli dG98, aksesjonsnummer 40177. 21. mai 1985, phCSF-la, betegnet CMCC 2312 i Cetus collection, betegnet phCSF-la/X Charon 4A for deponering, ble deponert med ATCC og har aksesjonsnummer 40185. 14. juni 1985, ble pcCSF-17 i E. coli MM294, betegnet CMCC 2347, deponert til ATCC og har aksesjonsnummer 53149.

I tillegg, ble pcDBCSF4, betegnet heri pcdBhuCSF-4 (CMCC 2894 ), deponert til ATCC 24. oktober 1986 og har ATCC aksesjonsnummer 67250. 7. april, 1987, ble pPLCSF- 17asp5o/CV150 i DG116 (CMCC 2946) deponert til ATCC og har aksesjonsnummer 67.383. Murin sekvensplasmidene pcDBmuCSF53 og pcDBmuCSFlO, betegnet heri pcDBmuCSF-S og pcDBmuCSF-L respektivt, ble deponert til ATCC også på denne datoen, og har CMCC numrene 2892 og 2893, og ATCC-numrene 67,248 og 67,249.

Tilleggsdeponeringer ble gjort 14. april, 1987 som følger:

Disse deponeringene ble gjort i kraft av Budapest-loven om International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purposes of Patent Procedure and the Regulations thereunder (Budapest Treaty). Dette forsikrer opprettholdelse av en levedyktig kultur i 30 år fra deponer ingsdatoen. Deponeringene vil bli gjort tilgjengelig ved ATCC under vilkårene for Budapest Treaty, og utsatt for en enighet mellom søkerne og ATCC som forsikrer permanent og ubegrenset tilgjengelighet ved utstedelse av foreliggende US patent. Assignataren heri er inneforstått med at hvis kulturen ved deponering dør eller mistes eller ødelegges når den blir dyrket under egnede betingelser, vil den bli erstattet ved henvendelse med en levedyktig form av den samme kulturen. Tilgjengeligheten av deponeringene skal ikke bli konstruert som en lisens for å utøve oppfinnelsen i strid méd rettig-hetene som er forsikret under autoriteten til hvilken som helst regjering i henhold til dets patentlover.

Disse deponeringene er utført for hensiktsmessigheten til det relevante publikum og innbefatter ikke en adgang at en skrevet beskrivelse vil ikke være tilstrekkelig for å tillate utøvelse av oppfinnelsen eller en hensikt for å begrense oppfinnelsen til disse spesifikke konstruksjonene. Ovenfor er en fullstendig skrevet beskrivelse beskrevet som gjør det mulig for fagmannen til å duplikere konstruksjonene deponert og til å konstruere alternative former av DNA, eller organismer som inneholder disse, som tillater utførelse av oppfinnelsen ifølge kravene.

Claims (9)

1. DNA-sekvens,karakterisert vedat den koder for et humant M-CSF-1 NV3 eller NV2 mutein som har minst aminosyresekvensen til NV3 eller NV2/SCSF/CV150 fig. 1 eller NV3 eller NV2/LCSF/CV150 fig. 2 eller en modifikasjon av en av disse hvor 1-5 aminosyrer er substituert eller deletert, og hvori dimerer av nevnte mutein stimulerer dannelsen av hovedsakelig makrofag kolonier i in vitro CSF-1 analysen.

2. DNA-sekvens ifølge krav 1,karakterisertved at nevnte DNA sekvens koder for et CSF-1 polypeptid som videre omfatter aminosyresekvensen vist ved aminosyrene 150-447 ifølge figur 2.

3. DNA-sekvens ifølge krav 1,karakterisertved at nevnte DNA-sekvens koder for et CSF-1 polypeptid som er et NV3 mutein av hvilke som helst av følgende: SCSF, gln52SCSF, pr<o>52SCSF, SCSF/CV158-pro, gln52SCSF/CV158-pro, pro52SCSF/CV158-pro, SCSF/CV158, pro52SCSF/CV158, SCSF/CV150, LCSF/CV150, gln52LCSF/CV150, tyr5gLCSF/CV190, LCSF/CV191, LCSF/CV221, LCSF/CV223, KCSF/CV236, LCSF/CV238, LCSF/CV249, LCSF/CV250, og LCSF/CV411.

4. DNA-sekvens ifølge krav 1,karakterisertved at nevnte DNA-sekvens koder for et CSF-1 polypeptid valgt fra: (a) NV3 muteiner av LCSF, SCSF, LSCF/CV150, tyr5gLCSF/- CV150, SCSF/CV150 og gln52muteiner derav, (b) NV3 muteiner av hver av de mulige C-terminale delesjonspolypeptidene fra LCSF/CV149 til LCSF/CV521 og tyrsg, gln52og ty<r>5g<g>ln52muteiner derav, (c) NV3 muteiner av LCSF/CV190, LCSF/CT191, LCSF/CV221, LCSF/CV223, LCSF/CV236, LCSF/CV238, LCSF/CV249, LCSF/CV258 og LCSF/CV411 og tyr59, gln52, tyr59gln52, ser157, ser159, se<r>157se<r>159muteiner derav, og (d) NV3 muteiner av SCSF/CV158 og gln52muteiner derav.

5 . DNA-sekvens ifølge krav 1,karakterisertved at nevnte DNA-sekvens koder for et polypeptid omfattende LCSF/NV3CV221 eller LCSFser157ser159NV3CV221 eller SCSF/NV3CV158.

6. Vektor,karakterisert vedat den inneholder og kan uttrykke en DNA-sekvens ifølge et hvilket som helst av kravene 1-5 og et replikon som er operativ i en encellet organisme.

7. Vektor ifølge krav 6,karakterisert vedat den inneholder og kan uttrykke 0/EpPLLCSF/NV3CV221 som er oppnåelig fra ATCC 67390.

8. Ekspresjonssystem,karakterisert vedat det omfatter en DNA-sekvens ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 5 eller en vektor ifølge krav 6 eller krav 7 operabelt koblet til egnede kontrollsekvenser.

9. Rekombinant vertscelle,karakterisert vedat de er transformert med og kan uttrykke et ekspresjons-