CN1980658A

CN1980658A - 治疗自身炎性疾病的ice抑制剂

Info

Publication number: CN1980658A
Application number: CNA2005800228873A
Authority: CN
Inventors: J·C·R·兰德尔
Original assignee: Vertex Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Vertex Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2004-05-27
Filing date: 2005-05-27
Publication date: 2007-06-13
Also published as: JP2008500374A; US20050267101A1; CA2567080A1; EP2295054A1; US20090192094A1; US7531570B2; AU2005249503B2; WO2005117846A3; EP1778221A2; AU2005249503A1; WO2005117846A2

Abstract

本发明涉及治疗自身炎性疾病的方法和组合物。本发明也涉及评价ICE抑制剂治疗自身炎性疾病的能力的测定法。

Description

治疗自身炎性疾病的ICE抑制剂

相关申请的交叉参考

本申请根据35 U.S.C.119(e)要求2004年5月27日提交的美国临时专利申请No.60/574,993的利益，其公开内容引用在此作为参考。

背景技术

自身炎性疾病是一组相关的病症，包括Muckle-Wells综合征(MWS)、家族性寒性自身炎性综合征(FCAS)(也被称为家族性冷性荨麻疹或FCU)、家族性地中海热(FMF)、慢性婴儿神经性皮肤与关节综合征(CINCAS)、a.k.a.始于新生期的多***炎性疾病(NOMID)、TNFR1-有关的周期综合征(TRAPS)、超lgD周期热综合征(HIDS)和Blau氏综合征(Gumucio等人，Clin.Exp.Rheumatol.20：S-45-S-53，2002)。

这些病症具有不同的遗传和表型特征，但是都具有一些临床表现特性，包括发热、荨麻疹、关节痛、浆膜炎、***性淀粉样变性作为共同的并发症、强烈的急性期响应和病患组织中突出的中性白细胞增多。

这些病症是由编码各种参与细胞信号传导的蛋白质的基因的突变所导致的，主要是参与白介素-1β转化酶(ICE，a.k.a.天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-1)活化调节的那些。ICE是转化无活性前体白介素-1β原(pro-IL-1β)为活性细胞因子白介素-1β(IL-1β)以及pro-IL-18为成熟活性IL-18的蛋白酶。在这些调控性基因和蛋白质中，例如有基因CAIS1，它编码蛋白质cryopyrin。这种基因的突变和cryopyrin的变化改变ICE活化、随后pro-IL-1β原加工为IL-1β，导致MWS和FCAS(Hoffman等人，Nat.Genet.29：301-305，2001)。

IL-1β在MWS(根据推断，以及FCAS、FMF、CINCAS、NOMID、TRAPS、HIDS和其他自身炎性疾病与病症)病因中的关键作用得到MWS患者对重组人白介素-1受体拮抗剂(rhuIL-1Ra，anakinra)治疗的应答的证明，戏剧性地、迅速而持续地减少临床炎性症状、减少血清淀粉样蛋白A(急性期炎性反应物)和淀粉样蛋白的尿***。这种治疗尽管有效，不过其应用有限，因为它需要每日注射治疗剂。

响应于阿那白滞素(anakinra)的深刻临床改善可能表明IL-1是作为疾病状态基础的关键炎性细胞因子，而且的确这类疾病状态在事实上是其遗传基础尚未被确定的自身炎性综合征。实例包括全身起始性青少年自发性关节炎(soJIA)，也被称为斯提尔氏病，和巨噬细胞活化综合征。本发明也涵盖这些适应症。

本发明描述ICE/天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-1(caspase)抑制剂的用途，无论是ICE/天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-1选择性的还是对一些其他天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(2-14)有广泛活性。这种治疗通过抑制ICE和抑制IL-1β产生，将减少MWS、FCAS、FMF、CINCAS、NOMID、TRAPS、HIDS和其他自身炎性疾病、病症或综合征的症状和其他疾病条件。

尽管阿那白滞素已经显示在治疗Muckle-Wells综合征、家族性寒性自身炎性综合征、超IgD综合征和全身起始性青少年自发性关节炎上是有效的，不过阿那白滞素是一种蛋白质，因此不具备理想的药学性质。因此，需要治疗某些疾病的小分子、口服活性ICE抑制剂。这类化合物将极为有用于治疗ICE在其中起作用的上述疾病状态。

发明内容

本发明涉及治疗某些与自身炎性疾病(有时称之为自身炎性发热综合征)有关的疾病、cryopyrin-有关的周期综合征和相关综合征的化合物，例如Muckle-Wells综合征(MWS)、家族性寒性自身炎性综合征(FCAS)(也被称为家族性冷性荨麻疹或FCU)、家族性地中海热(FMF)、慢性婴儿神经性皮肤与关节综合征(CINCAS)、a.k.a.始于新生期的多***炎性疾病(NOMID)、TNFR1-有关的周期综合征(TRAPS)、超IgD周期热综合征(HIDS)和Blau氏综合征。本发明也涉及治疗某些表现响应于阿那白滞素的深刻临床改善的疾病的化合物。本发明也涉及治疗上述疾病的方法。

本发明也涉及鉴定可用于治疗这些疾病的成分的方法。

附图说明

图1A-1C描绘化合物7对FCAS患者全血产生IL-1β和IL-18的体外抑制作用，与健康志愿者比较。参见实施例18。

图2描绘化合物7对MWS患者全血产生IL-1β的体外抑制作用，与健康志愿者比较。参见实施例19。

图3A-3C描绘MWS患者对900mg化合物7治疗14天的临床响应，每天给药三次。图3A中，血清白介素-18在第14天平均减少55％。图3B中，血清急性期反应物蛋白质血清淀粉样蛋白A(SAA)和C-反应性蛋白(CRP)分别平均减少75％和65％。图3C中，自我报告的患者总体症状在治疗期间平均减少60％。参见实施例21。

发明详细说明

本发明提供本文公开的化合物及其药学上可接受的衍生物，它们特别有效地改善、治疗和/或预防某些与自身炎性综合征和相关综合征有关的疾病，包括但不限于Muckle-Wells综合征(MWS)、家族性寒性自身炎性综合征(FCAS)(也被称为家族性冷性荨麻疹或FCU)、家族性地中海热(FMF)、慢性婴儿神经性皮肤与关节综合征(CINCAS)、a.k.a.始于新生期的多***炎性疾病(NOMID)、TNFR1-有关的周期综合征(TRAPS)、超IgD周期热综合征(HIDS)和Blau氏综合征，以及全身起始性青少年自发性关节炎(也被称为斯提尔氏病)和巨噬细胞活化综合征。与这些疾病有关的症状包括但不限于发热、荨麻疹、关节炎、浆膜炎、***性淀粉样变性、强烈的急性期响应和病患组织中突出的中性白细胞增多。

根据本发明的化合物可以用于治疗哺乳动物的这些疾病状态。任何抑制ICE的化合物都可以用在本发明的方法和组合物中。这类化合物包括选择性抑制ICE的那些化合物和抑制天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶或ICE/CED-3家族中的一种或多种酶的那些。

本发明的化合物抑制ICE和/或降低IL-1、特别是IL-1β和IL-18水平。这些化合物能够测定例如它们抑制ICE、IL-1β和/或IL-18产生、调节IL-1和/或IL-18水平和/或影响IL-1β和/或IL-18活性的能力。测试每种这些活性的测定法是本领域已知的(参见本文实施例、WO 95/35308、WO 97/22619、WO 99/47545或WO 01/90063)。因此，这些化合物能够靶向和抑制本文所述ICE和/或IL-1介导疾病中的事件。

可以用于本发明的化合物包括但不限于下列文献的化合物：WO04/058718，WO 04/002961，WO 03/088917，WO 03/068242，WO03/042169，WO 98/16505，WO 93/09135，WO 03/106460，WO 03/103677，WO 03/104231，WO 02/085899，WO 00/55114，WO 00/55127，WO00/61542，WO 01/05772，WO 01/10383，WO 01/16093，WO 01/42216，WO 01/72707，WO 01/90070，WO 01/94351，WO 02/094263，WO 02/42278，美国专利6,184,210，美国专利6,184,244，美国专利6,187,771，美国专利6,197,750，美国专利6,242,422，April 2001 AmericanChemical Society(ACS)meeting in San Diego，California，USA，WO 02/22611，US 2002/0058630，WO 02/12638，WO 95/35308，美国专利5,716,929，WO 97/22619，美国专利6,204,261，WO 99/47545，WO 01/90063，美国专利公报2004/0014753，美国专利公报2004/0009966，美国专利公报2003/0236296，美国专利公报2003/0096737，美国专利公报2003/0092703，美国专利公报2002/0169177，美国专利6,693,096，美国专利6,610,683，美国专利6,531,467，美国专利6,528,506，美国专利6,200,969，WO2003/072528，WO 2003/032918，WO 01/00658，WO 98/10778，美国专利6,716,818，美国专利6,620,782，美国专利6,566,338，美国专利6,495,522，美国专利6,355,618,6，153,591，WO 2005/003100，WO2004/002401，WO 00/61542，WO 00/55114，WO 99/47154，美国专利6,083,981，美国专利5,932,549，美国专利5,919,790，美国专利5,744,451，WO 2002/089749，WO 99/36426，WO 98/16505，WO98/16504，WO 98/16502，美国专利6,316,415，美国专利5,932,549，美国专利5,919,790，美国专利5,744,451，EP 1082127，EP 1049703，EP 0932600，EP 0932598，WO 99/56765，WO 93/05071，EP 0600880和EP 1378573(如本文所述，它们都引用在此作为参考)。在一种实施方式中，用在本发明中的化合物包括下列那些：WO 00/55114，W000/55127，WO 00/61542，W0 00/61542，WO 01/05772，WO 01/10383，WO 01/16093，WO 01/42216，WO 01/72707，WO 01/90070，WO 01/94351，美国公报2003/0092703，WO 02/094263，美国公报2002/0169177，美国专利6,184,210，美国专利6,184,244，美国专利6,187,771，美国专利6,197,750，美国专利6,242,422，April 2001 AmericanChemical Society(ACS)meeting in San Diego，California USA，WO 02/22611，美国公报2002/0058630，美国公报2003/0096737，WO95/35308，WO 97/22619，WO 99/47545和WO 01/90063。在另一种实施方式中，用在本发明中的化合物包括下列那些：WO 04/058718，WO04/002961，WO 95/35308，WO 97/22619，WO 99/47545和WO 01/90063。或者，用在本发明中的化合物包括下列那些：WO 95/35308，WO97/22619，WO 99/47545和WO 01/90063。优选的化合物是在本文权利要求书中引用的那些。这些化合物可以借助技术人员已知的方法和在本文引用文献中公开的方法获得。

本发明的药物组合物和方法因此将可用于体外或体内控制IL-1β、IL-18和其它生物标志物的水平和/或活性。本发明的组合物和方法因而将可用于体内控制IL-1β、IL-18和其它生物标志物的水平，治疗某些病症或者减少其进展、严重性或后果，包括本文所述疾病、病症或后果。

按照另一种实施方式，本发明提供组合物，包含如上所述本发明化合物或其药学上可接受的衍生物(例如盐)和药学上可接受的载体。

按照另一种实施方式，本发明的组合物可以进一步包含另一种治疗剂。这类成分包括但不限于溶栓剂，例如组织纤溶酶原激活物和链激酶；抗炎剂；基质金属蛋白酶抑制剂；脂氧合酶抑制剂；细胞因子拮抗剂(包括但不限于对抗TNF、IL-1、IL-6、IL-1 2、IL-18或它们受体的抗体或结合蛋白)；趋化因子拮抗剂；免疫抑制剂；抗癌剂；抗病毒剂；细胞因子(包括但不限于白介素-1受体拮抗剂或阿那白滞素)；生长因子；免疫调控剂(例如溴隐亭、抗人α干扰素抗体、IL-2、GM-CSF、甲硫氨酸脑啡肽、干扰素α、二硫代氨基甲酸二乙酯、肿瘤坏死因子、纳曲酮和rEPO)；***素；或抗血管过度增殖化合物。

术语“药学上可接受的载体”表示无毒性载体，它可以与本发明化合物一起对患者给药，并且不会破坏其药理活性。

可以用在这些组合物中的药学上可接受的载体包括但不限于离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白质(例如人血清白蛋白)、缓冲物质(例如磷酸盐)、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物、水、盐或电解质(例如硫酸鱼精蛋白)、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、胶体二氧化硅、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素类物质、聚乙二醇、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸酯、蜡类、聚乙烯-聚丙烯-嵌段聚合物、聚乙二醇和羊毛脂。

在仅包含本发明化合物作为活性组分的药物组合物中，给予这些组合物的方法可以另外包含对受治疗者给予附加成分的步骤。这类成分包括但不限于溶栓剂，例如组织纤溶酶原激活物和链激酶；抗炎剂；基质金属蛋白酶抑制剂；脂氧合酶抑制剂；细胞因子拮抗剂，包括但不限于对抗TNF、IL-1、IL-6、IL-12、IL-18或它们受体的抗体或结合蛋白；趋化因子拮抗剂；免疫抑制剂；抗癌剂；抗病毒剂；细胞因子，包括但不限于白介素-1受体拮抗剂或阿那白滞素；生长因子；免疫调控剂，例如溴隐亭、抗人α干扰素抗体、IL-2、GM-CSF、甲硫氨酸脑啡肽、干扰素α、二硫代氨基甲酸二乙酯、肿瘤坏死因子、纳曲酮和rEPO；***素；或抗血管过度增殖化合物。当使用第二成分时，该第二成分可以以单独的剂型或者作为单一剂型的一部分与本发明化合物或组合物一起给药。

化合物在上述组合物中的含量应当足以导致疾病的严重性或者ICE抑制、IL-1β、IL-18或其他生物标志的水平或者IL-1β、IL-18或其他生物标志的活性有可检测的降低。

如果在这些组合物中采用本发明化合物的药学上可接受的盐，这些盐优选地是从无机或有机酸和碱衍生的。这样的酸式盐包括如下：乙酸盐、己二酸盐、藻酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、硫酸氢盐、丁酸盐、柠檬酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、富马酸盐、葡庚酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、2-羟基乙磺酸盐、乳酸盐、马来酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、草酸盐、扑酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、甲苯磺酸盐和十一烷酸盐。碱盐包括铵盐、碱金属盐(例如钠和钾盐)、碱土金属盐(例如钙和镁盐)、有机碱的盐(例如二环己胺盐、N-甲基-D-葡糖胺盐)和氨基酸(例如精氨酸、赖氨酸)的盐等。

而且，碱性含氮基团可以用下列试剂季铵化，例如低级烷基卤化物，例如甲基、乙基、丙基和丁基的氯化物、溴化物和碘化物；硫酸二烷基酯，例如硫酸的二甲基、二乙基、二丁基和二戊基酯；长链卤化物，例如癸基、月桂基、肉豆蔻基和硬脂基的氯化物、溴化物和碘化物；芳烷基卤化物，例如苄基和苯乙基的溴化物和其他。由此得到水-或油-可溶性或可分散性产物。

用在本发明组合物和方法中的化合物也可以通过附加适当的官能团加以修饰，以增强选择性生物性质。这类修饰是本领域已知的，包括增加进入给定生物***(例如血液、淋巴***、中枢神经***)的生物渗透性、增加口服可利用性、增加溶解度以便注射给药、改变代谢和/或改变***速率。

按照优选的实施方式，可以将本发明的组合物配制成对受治疗者给药，例如哺乳动物，优选人类。这类药物组合物用于改善、治疗或预防受治疗者的自身炎性疾病，包含抑制ICE的化合物和药学上可接受的载体。

本发明的这类药物组合物可以被口服、肠胃外、通过吸入喷雾、局部、直肠、鼻、口腔、***或经由植入药库给药。本文所用的术语“肠胃外”包括皮下、静脉内、肌内、关节内、滑膜内、胸骨内、鞘内、肝内、伤口内与颅内注射或输注技术。优选地，组合物是口服或静脉内给药的。

本发明组合物的无菌可注射形式可以是水性或油性混悬剂。这些混悬剂可以按照本领域已知的技术、利用适合的分散或润湿剂和悬浮剂加以配制。无菌的可注射制剂还可以是在无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液剂或混悬剂，例如在1，3-丁二醇中的溶液。可以采用的可接受的载体和溶剂有水、林格氏溶液和等渗的氯化钠溶液。另外，无菌的不挥发油也经常被用作溶剂或悬浮介质。为此，可以采用任何温和的不挥发油，包括合成的单-或二-甘油酯。脂肪酸、例如油酸及其甘油酯衍生物可用于制备注射剂，它们是天然的药学上可接受的油，例如橄榄油或蓖麻油，尤其是它们的聚氧乙基化形式。这些油溶液剂或混悬剂还可以含有长链醇稀释剂或分散剂，例如羧甲基纤维素或相似的分散剂，它们普遍用于配制药学上可接受的剂型，包括乳剂和混悬剂。出于制剂的目的，还可以使用其他常用的表面活性剂，例如吐温类、司盘类，和其他乳化剂或生物利用度增强剂，它们普遍用在药学上可接受的固体、液体或其他剂型的制造中。

如果使用固体载体，制剂可以被压片，放置在硬明胶胶囊中，为粉末或颗粒的形式，或者为片剂或锭剂的形式。固体载体的量例如将从约25mg至800mg，优选25mg至400mg。当使用液体载体时，制剂例如可以是糖浆、乳液、软明胶胶囊、无菌可注射液体的形式，例如安瓿或非水性液体悬液。若组合物为胶囊的形式，任何常规的包封法都是适合的，例如在硬明胶胶囊外壳中使用上述载体。

糖浆制剂可以由化合物在液体载体中的悬液或溶液组成，所述液体载体例如乙醇、甘油或水，含有矫味剂或着色剂。气雾剂制剂可以由化合物在液体载体中的溶液或悬液组成，所述液体载体例如水、乙醇或甘油；在干粉气雾剂中，制剂可以包括例如湿润剂。

本发明的制剂包含活性成分以及一种或多种可接受的载体和可选的任何其他治疗成分。在与制剂其他成分相容并且对其接受者无害的意义上，载体必须是“可接受的”。

本发明的药物组合物可以按任意口服可接受的剂型口服给药，包括但不限于胶囊剂、片剂、水性混悬剂或溶液剂。在口服用片剂的情况下，常用的载体包括乳糖和玉米淀粉。通常还加入润滑剂，例如硬脂酸镁。就按胶囊剂型口服给药而言，有用的稀释剂包括乳糖和干燥的玉米淀粉。当口服用需要水性混悬剂时，活性成分是与乳化和悬浮剂联用的。如果需要的话，还可以加入某些甜味剂、矫味剂或着色剂。

或者，本发明药物组合物可以按栓剂形式直肠给药。它们可以如下制备，将药物与适合的无刺激性赋形剂混合，所述赋形剂在室温下是固体，但是在直肠温度下是液体，因此将在直肠内融化，释放药物。这类材料包括可可脂、蜂蜡和聚乙二醇。

本发明药物组合物还可以被局部给药，尤其当治疗靶包括容易为局部用药接近的区域或器官时，包括眼、皮肤或下部肠道的疾病。适合的局部制剂容易根据每种这些区域或器官加以制备。

下部肠道的局部用药可以按直肠栓剂(见上)或适合的灌肠剂进行。还可以使用局部透皮贴剂。

就局部用药而言，可以将药物组合物配制成适合的软膏剂，其中含有悬浮或溶解在一种或多种载体中的活性组分。用于本发明化合物局部给药的载体包括但不限于矿物油、液体凡士林、白凡士林、丙二醇、聚氧乙烯、聚氧丙烯化合物、乳化蜡和水。或者，可以将药物组合物配制成适合的洗剂或霜剂，其中含有悬浮或溶解在一种或多种药学上可接受的载体中的活性组分。适合的载体包括但不限于矿物油、脱水山梨醇单硬脂酸酯、聚山梨醇酯60、鲸蜡酯蜡、鲸蜡硬脂醇、2-辛基十二烷醇、苄醇和水。

就眼用而言，可以将药物组合物配制成在等渗的经过pH调节的无菌盐水中的微粉化混悬剂，或者优选为在等渗的经过pH调节的无菌盐水中的溶液，其中含有或没有防腐剂，例如苯扎氯铵。或者，就眼用而言，可以将药物组合物配制成软膏剂，例如凡士林。

本发明药物组合物还可以借助鼻气雾剂或吸入给药。这类组合物是按照药物制剂领域熟知的技术制备的，可以制成在盐水中的溶液剂，其中采用苯甲醇或其他适合的防腐剂、增强生物利用度的吸收增强剂、碳氟化合物和/或其他常规的增溶或分散剂。

本领域技术人员将认识到，药学上可接受的载体或稀释剂的形式和特征取决于与之组合的活性成分的量、给药的途径和其他熟知的变量。

上述化合物和组合物也可用于涉及某些疾病的治疗应用。

这类某些疾病包括自身炎性综合征，例如cryopyrin-有关的周期综合征(包括Muckle-Wells综合征、家族性寒性自身炎性综合征(FCAS)(也被称为家族性冷性荨麻疹或FCU)、慢性婴儿神经性皮肤与关节综合征(a.k.a.始于新生期的多***炎性疾病))、家族性地中海热、TNFR1-有关的周期综合征(TRAPS)、超IgD周期热综合征(HIDS)和Blau氏综合征。其他遗传基础尚未被确定的自身炎性综合征可以包括全身起始性青少年自发性关节炎(soJIA)，也被称为斯提尔氏病，和巨噬细胞活化综合征。

本发明的化合物能够抑制IL-1、特别是IL-1β和/或IL-18的释放，因而能够用于抑制或阻滞本文所述某些疾病的若干病理生理学后果。

本发明也涉及治疗某些疾病的治疗方法，该方法(1)抑制IL-1、特别是IL-1β和IL-18从细胞中释放，和/或(2)预防IL-1、特别是IL-1β和IL-18在哺乳动物(包括人类)中的过高组织水平的不希望的、有毒的或致命的后果。这种方法包含对哺乳动物给予有效的ICE抑制量的一种或多种ICE/CED-3抑制剂。这种方法也能够用于某些适用于此的疾病的预防性处置或预防，包括Muckle-Wells综合征(MWS)、家族性寒性自身炎性综合征(FCAS)(也被称为家族性冷性荨麻疹或FCU)、家族性地中海热(FMF)、慢性婴儿神经性皮肤与关节综合征(CINCAS)、a.k.a.始于新生期的多***炎性疾病(NOMID)、TNFR1-有关的周期综合征(TRAPS)、超IgD周期热综合征(HIDS)、Blau氏综合征、全身起始性青少年自发性关节炎、斯提尔氏病和巨噬细胞活化综合征。本发明提供治疗这些病症的方法，该方法对有需要的哺乳动物(包括人类)给予有效量的这类化合物。

这些化合物通过抑制ICE和阻滞IL-1、特别是IL-1β和IL-18的释放或者降低IL-1、特别是IL-1β和IL-18水平和活性，以及在每种这些环境中过量IL-1、特别是IL-1β和IL-18水平的病理生理学作用，直接促进某些疾病的停止或消散，促进正常功能的恢复。总之，这些作用涉及它们在治疗某些疾病中的新用途。

ICE抑制作用可以借助本领域已知的方法加以测量，本文有更充分的描述。

术语“抑制I L-1、特别是IL-1β和IL-18的释放”表示：a)降低哺乳动物、例如人类的体内IL-1β和/或IL-18水平；b)减量调节体外或体内IL-1、特别是IL-1β和IL-18水平；或者c)通过直接抑制体内或体外IL-1β和IL-18合成或转译后事件，以及间接抑制IL-1α，减量调节IL-1、特别是IL-1β和IL-18活性。

这些化合物可以用于抑制IL-1、特别是IL-1β和IL-18被单核细胞、巨噬细胞、神经元细胞、内皮细胞、表皮细胞、***(例如：成纤维细胞、骨骼肌细胞、平滑肌细胞、心肌细胞)和很多其他细胞类型所释放。

术语“病症”或“状态”表示在受治疗者中产生有害生物学后果的任何疾病、病症或效应。

患者血液或细胞或者细胞培养物中(也就是细胞或细胞培养基内)IL-1、特别是IL-1β和IL-18蛋白的水平可以如下测定，例如测定与IL-1β或IL-18或者其他已知作为活性IL-1β和IL-18存在的结果而产生的蛋白质、包括但不限于IL-1α的免疫特异性结合。这类方法是本领域已知的。例如，可以使用的免疫测定法包括但不限于竞争性与非竞争性测定***、蛋白质印迹、放射性免疫测定法、ELISA(酶联免疫吸附测定法)、“三明治”免疫测定法、免疫沉淀测定法、沉淀素反应、凝胶扩散沉淀素反应、免疫扩散测定法、凝集作用测定法、补体-固定测定法、免疫放射测定法、荧光免疫测定法、A蛋白免疫测定法和带有标记抗体的FACS分析。这类测定法是本领域熟知的(例如参见Ausubel et al，eds.，1994，Current Protocols in MolecularBiology，Vol.1，John Wiley&Sons，Inc.，New York，其全文引用在此作为参考)。

也可以利用竞争性结合测定法测定IL-1、特别是IL-1β和IL-18的水平。竞争性结合测定法的一个实例是放射性免疫测定法，包含在递增量未标记IL-1β或IL-18的存在下温育来自表达IL-1、特别是IL-1β和IL-18的细胞的带标记蛋白(例如³H或¹²⁵I)与IL-1β或IL-18抗体，再检测与带标记IL-1β或IL-18结合的IL-1β或IL-18抗体。借助Scatchard图分析可以从该数据测定有关抗体对特完抗原的亲和性和结合率。利用放射性免疫测定法也可以测定第二抗体的竞争性。在这种情况下，在递增量未标记第二抗体的存在下将抗原与有关抗体温育，所述抗体与带标记化合物(例如³H或¹²⁵I)缀合。

也可以借助活性测定IL-1β或IL-18水平，例如，借助能够检测细胞因子、象IL-1β或IL-18或者生长因子的生物活性水平的细胞系可以测定IL-1水平。按照一种实施方式，通过温育用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷遗传加工的细胞系，检测生物样品中生物活性IL-1β的水平。将细胞系与供试样品温育，通过测定蓝色的强度监测细胞系中的细胞死亡，蓝色是所测试样品中生物活性细胞因子或生长因子的指征。例如另见Burns(1994)20(1)：40-44关于患者血清的IL-1活性测定法。

可用于单一疗法的活性成分化合物的剂量水平为约0.01与约100mg/kg体重每天之间，优选约0.5与约75mg/kg体重每天之间，最优选约1与约50mmg/kg体重每天之间。

在另一种实施方式中，可用于单一疗法的活性成分化合物的剂量水平为约2与约200mg/kg体重每天之间，优选约6与约100mg/kg体重每天之间，最优选约25与约100mg/kg体重每天之间。

按照本发明的一种实施方式，本发明的活性成分化合物对受治疗者给药的剂量为约20mg至约10,000mg每次给药之间。在另一种实施方式中，本发明的活性成分化合物对受治疗者给药的剂量为约300mg至约2,400mg每次给药之间。在另一种实施方式中，本发明的活性成分化合物对受治疗者给药的剂量为约600mg至约1,800mg每次给药之间。在优选的实施方式中，本发明的化合物对受治疗者给药的剂量为约900mg每次给药。

通常，本发明的药物组合物将以每天约1至5次给药，或者，作为连续输注给药。这类给药可以用作慢性或急性疗法。活性成分可以与载体材料组合形成单一剂型的量将因所治疗的宿主和特定的给药模式而异。典型的制剂将含有约5％至约95％活性化合物(w/w)。优选地，这类制剂含有约20％至约80％活性化合物。

当本发明组合物包含本发明化合物与一种或多种附加治疗剂的组合时，该化合物和该附加成分都应当以在单一疗法方案中正常给予剂量的约10％至约80％存在。

一旦患者的状态有所改进，可以给予本发明的化合物、组合物或组合的维持剂量，如果必要的话。随后，给药的剂量或频率或此二者可以作为症状的函数减少至保持已改善的条件的水平，当症状已经减轻至所需水平时，治疗可以停止。不过，一旦疾病症状有任何复发，患者可能需要在长期基础上的间歇性治疗。

也应当理解，就任意特定患者而言的具体剂量和治疗制度将依赖于多种因素，包括所采用的具体化合物的活性、年龄、体重、一般健康状况、性别、饮食、给药时间、***速率、药物组合、特定疾病的严重性与过程、患者对所治疗疾病的素因和主治医师的判断。活性成分的量也将依赖于特定的化合物和组合物中的其他治疗剂，如果有的话。

因此，在受治疗者中治疗或预防本发明疾病的方法包含对该受治疗者给予本文所述任何化合物、药物组合物或组合的步骤。

在优选的实施方式中，本发明提供治疗患有上述疾病之一的哺乳动物的方法，包含对所述哺乳动物给予上述药学上可接受的组合物的步骤。在这种实施方式中，如果患者也被给予另一种治疗剂，它可以与本发明化合物一起在单一剂型中被递送，或者作为分开的剂型被递送。当作为分开的剂型给药时，该另一种治疗剂可以在包含本发明化合物的药学上可接受的组合物的给药之前、同时或之后给药。

鉴定化合物或组合物治疗根据本发明的疾病的方法包括筛选大量化合物或组合物改善某些疾病后果和改进患有本发明某些疾病的患者条件的能力。按照本发明的一种实施方式，高通量筛选可以如下实现，在微量滴定平板的大量小孔中放入细胞培养物，向每孔加入不同的化合物或组合物，对比每一细胞培养物中的ICE抑制作用和/或IL-1水平和/或活性与对照孔细胞培养基中的水平或活性。对照可用于根据本发明的对比步骤，包括没有用化合物或组合物处理的细胞或受试材料和已经用已知对ICE抑制作用或活性没有影响的化合物或组合物处理的细胞或受试材料。按照本发明的一种实施方式，高通量筛选是自动化的，以便包括向平板加入细胞直到化合物或组合物加入后的数据收集和分析步骤都是由机器进行的。可用于本发明对比步骤的仪器、例如能够检测带标记对象(例如放射性标记、荧光或有色对象)或者本身是可检测的对象的仪器是商业上可获得的和/或本领域已知的。因此，能够快速和高效地筛选可用于治疗本文公开的某些疾病的根据本发明的化合物和组合物。

在本发明的另一种实施方式中，鉴定改善、治疗或预防受治疗者自身炎性疾病的化合物或组合物的方法包含对所述受治疗者给予抑制ICE的化合物或者包含该化合物的药物组合物，再比较用该化合物治疗前后该受治疗者的ICE抑制作用。在替代的实施方式中，本发明提供鉴定改善、治疗或预防受治疗者自身炎性疾病的化合物或组合物的方法，包含对所述受治疗者给予抑制ICE的化合物或者包含该化合物的药物组合物，再比较用所述化合物治疗前后所述受治疗者的自身炎性疾病生物标志。

术语“生物标志(biomarker)”是生理或疾病过程的物理、功能或生化指标，例如特定代谢产物的存在。按照本发明，炎症的某些生物标志可以用于评价患有本文所列自身炎性疾病的患者对于抑制ICE的化合物的响应。这些炎性生物标志包括但不限于白介素-1、白介素-6(全自身炎性疾病)、白介素-8(全自身炎性疾病)、白介素-18、血清淀粉样蛋白A、C-反应性蛋白、红细胞沉降率(ESR)、结合珠蛋白、TNFα、免疫球蛋白(特别是IgD)、铁蛋白、白细胞数、血小板数和血红蛋白。

因此，本发明也提供减少自身炎性疾病受治疗者中IL-1β、IL-18或其他生物标志的方法，包含对所述受治疗者给予抑制ICE的化合物或者包含所述化合物的药物组合物的步骤。在一种实施方式中，化合物或组合物在受治疗者中的血浆浓度大约等于或大于按照本发明所教导的IC₅₀值(例如参见实施例18和19)。在另一种实施方式中，化合物或组合物在受治疗者中的血浆浓度为约0.2μM至约50μM之间，或者约0.8μM至约6μM。在另一种实施方式中，受治疗者中IL-1β、IL-18或其他生物标志的减少是如下测量的，比较(a)用所述化合物或组合物治疗前后所述受治疗者中的IL-1β、IL-18或其他生物标志浓度，与(b)用所述化合物或组合物治疗期间所述受治疗者中的IL-1β、IL-18或其他生物标志浓度。按照本发明，受治疗者中IL-1β、IL-18或其他生物标志的减少百分比选自下组：(a)减少至少约50％至约100％；(b)减少至少约50％至约90％；和(c)减少至少约60％至约90％。

本文公开的所有申请、专利和参考文献都引用在此作为参考。为了更加充分地理解本发明，陈述下列制备和测试实施例。这些实施例仅供阐述的目的，不被解释为以任何方式限制本发明的范围。

实施例

实施例1

[3S/R，(2S)-5-氟-4-氧代-3-{[1-(吩噻嗪-10-羰基)哌啶-2-羰基]氨基}-戊酸

方法A：(S)-(1-吩噻嗪-10-羰基)哌啶-2-羧酸甲基酯

向搅拌着的哌可酸甲酯盐酸盐(1g，5.57mmol)的THF(10ml)溶液加入吩噻嗪碳酰氯(1.457g，5.57mmol)，继之以二异丙基乙胺(2.02ml，11.68mmol)。将所得溶液搅拌16h(小时)，然后在乙酸乙酯与NH₄Cl饱和水溶液之间分配。将有机层用盐水洗涤，干燥(MgSO₄)，过滤，蒸发。残余物经过快速色谱纯化(15％乙酸乙酯的己烷溶液)，得到小标题化合物，为无色的油，放置后结晶(1.823g，89％)：¹HNMR(400MHz，CDCl₃)δ1.13-1.48(3H，m)，2.57-2.69(2H，m)，2.16(1H，m)，3.00(1H，m)，3.74(4H，s+m)，5.00(1H，m)，7.11(2H，t)，7.22-7.34(4H，m)，7.76(2H，d)；¹³C NMR(100MHz，CDCl₃)δ21.3(CH₂)，24.8(CH₂)，27.3(CH₂)，44.9(CH₂)，52.5(CH₃)，55.9(CH)，122.8(CH)，125.5(CH)，127.8(CH)，128.0(CH)，129.2(C)，141.7(C)，158.4(C)，172.2(C).

方法B：(S)-(1-吩噻嗪-10-羰基)哌啶-2-羧酸

向搅拌着的(S)-(1-吩噻嗪-10-羰基)哌啶-2-羧酸甲基酯(0.912g)的THF(15ml)与水(8ml)溶液加入2M NaOH(3.71ml)，将反应混合物搅拌16小时。将反应混合物倒入碳酸氢钠溶液(50ml)中，用乙酸乙酯(40ml)萃取。调节水相为酸性，用乙酸乙酯萃取(2×75ml)。合并有机萃取液，干燥(MgSO₄)，浓缩，得到小标题化合物，为白色固体(0.709g，81％)： ¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ0.9 9-1.72(5H，m)，2.23(1H，m)，2.97(1H，m)，3.58(1H，m)，4.93(1H，m)，7.16(2H，t)，7.28(2H，t)，7.37(2H，d)，7.78(2H，d)；¹³C NMR(100MHz，CDCl₃)δ21.0(CH₂)，24.2(CH₂)，26.7(CH₂)，45.7(CH₂)，56.0(CH)，123.8(CH)，126.0(CH)，127.9(CH)，128.1(CH)，130.3(C)，141.2(C)，160.1(C)，175.9(C).

方法C：[3S/R，4S/R(2S)]-5-氟-4-羟基-3-{[1-(吩噻嗪-10-羰基)哌啶-2-羰基]氨基}-戊酸叔丁基酯

将搅拌着的(S)-(1-吩噻嗪-10-羰基)哌啶-2-羧酸(233mg，0.658mmol)、3-氨基-5-氟-4-羟基-戊酸叔丁基酯(150mg，0.724mmol)、HOBt(98mg，0.724mmol)、DMAP(88mg，0.724mmol)与无水THF(10ml)的混合物冷却至0℃，然后加入EDC(139mg，0.724mmol)。使混合物在16h内升温至室温，然后在减压下浓缩。残余物经过快速色谱纯化(50％乙酸乙酯的己烷溶液)，得到小标题化合物，为淡粉红色泡沫(294mg，82％)：

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ1.96(1H，m)，1.18-1.60(13H，m)，2.10-2.25(1H，m)，2.48-2.70(2H，m)，2.78-2.94(1H，m)，3.51-4.72(7H，m)，7.03-7.36(7H，m)，7.71-7.76(2H，m)；¹⁹F(376MHz，CDCl₃)δ-228.9(t)，-229.3(t)，-230.1(t)，-230.2(t).

方法D：[3S/R，(2S)]-5-氟-4-氧代-3-{[1-(吩噻嗪-10-羰基)哌啶-2-羰基]氨基}-戊酸叔丁基酯

在0℃下，将搅拌着的[3S/R，4S/R(2S)]-5-氟-4-羟基-3-{[1-(吩噻嗪-10-羰基)哌啶-2-羰基]氨基}-戊酸叔丁基酯(294mg，0.541mmol)的无水DCM(10mL)溶液用1，1，1-三乙酰氧基-1，1-二氢-1，2-benziodoxol-3(1H)-酮(344mg，0.812mmol)处理。使所得混合物历经2h升温至室温，用乙酸乙酯稀释，然后倒入饱和碳酸氢钠水溶液与饱和硫代硫酸钠水溶液的1∶1混合物中。除去有机层，水层用乙酸乙酯反萃取。合并有机萃取液，干燥(Na₂SO₄)，浓缩。残余物经过快速色谱纯化(30％乙酸乙酯的己烷溶液)，得到小标题化合物，为淡粉红色泡沫(220mg，75％)：

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ0.84-0.96(1H，m)，1.20-1.40(10H，m+2s)，1.51-1.56(3H，m)，2.20-2.27(1H，m)，2.70-2.98(3H，m)，3.49-3.63(1H，m)，4.74-5.24(4H，m)，7.14-7.18(2H，m)，7.28-7.38(4H，m)，7.48-7.79(3H，m)；¹³C(100MHz，CDCl₃)δ20.8/21.0(CH₂)，23.7/23.9(CH₂)，25.8/25.9(CH₂)，28.2/28.3(CH₃)，36.8/36.9(CH₂)，46.0/46.1(CH₂)，52.9(CH)，56.8(CH)，82.6(C)，84.4/84.5(2d，J 184.0/183.3，CH₂F)，123.7/123.8(CH)，126.1(CH)，128.0/128.1(CH)，128.2/128.3(CH)，130.4/130.5(C)，141.4(C)，160.0(C)，170.0(C)，171.7(C)，202.9(C)；¹⁹F(376MHz，CDCl₃)δ-231.9(t)，-232.2(t).

方法E：[3S/R，(2S)]-5-氟-4-氧代-3-{[1-(吩噻嗪-10-羰基)哌啶-2-羰基]氨基}-戊酸

将三氟乙酸(5mL)加入到搅拌着的冰冷却的[3S/R，(2S)]-5-氟-4-氧代-3-{[1-(吩噻嗪-10-羰基)哌啶-2-羰基]氨基}-戊酸叔丁基酯(130mg，0.24mmol)的无水DCM(5mL)溶液中。将混合物在0℃下搅拌0.5h，然后在室温下搅拌0.5h。在减压下浓缩混合物，然后将残余物溶于无水DCM。这种过程重复若干次，目的是除去过量三氟乙酸。将胶状物从HPLC级水中冻干两次，得到标题化合物，为白色粉末(77mg，66％)：IR(固体)1670，1716，1782cm^-1；¹H NMR(400MHz，d₆-DMSO)δ0.96-0.99(1H，m)，1.23-1.26(2H，m)，1.42-1.44(1H，m)，1.60(1H，m)，1.91-1.98(1H，m)，2.51-2.89(2H，m)，3.11-3.22(1H，m)，3.57-3.60(1H，m)，4.30-4.72 and5.05-5.29(4H，2m)，7.11-7.17(2H，m)，7.24-7.30(2H，m)，7.34-7.38(2H，m)，7.57-7.63(2H，m)，8.07-8.61(1H，m)；¹³C NMR(100MHz，DMSO)δ(DMSO+TFA)18.8/18.9(CH₂)，22.2/22.3(CH₂)，25.8/26.1(CH₂)，31.5/33.2(CH₂)，43.2(CH₂)，50.6/51.1(CH)，54.4/54.5(CH)，82.8/82.9(2d，J 178.6/178.1，CH₂F)，119.9/120.0(CH)，120.4/120.5(CH)，124.0/124.1m(CH)，125.9/126.0(C)，126.4/126.5(CH)，139.6/139.7(C)，156.0/156.4(CO)，170.3(CO)，170.7/170.8(CO)，202.2/202.3(2d，J 14.6/15.1，CO).；¹⁹F(376MHz，DMSO)δ化学漂移(多态性，相对强度)-226.7(t，3)，-22 6.9(t，3)，-230.4(t，1)，-231.2(t，1)，-232.7(t，10)，-233.0(t，10).

实施例2

[3S/R，(2S)]-3-{[-1-(2-氯吩噻嗪-10-羰基)哌啶-2-羰基]氨基}-4-氟-4-氧代-戊酸

利用与上文方法A-E所述那些相似的工艺，从2-氯吩噻嗪碳酰氯制备之(73mg，69％)： IR(固体，cm^-1)1738，1660，1555，1363，1224；¹H NMR(400MHz，d₆-DMSO+TFA)δ0.98-1.61(4H，m)，1.94-2.03(1H，m)，2.53-2.89(2H，m)，3.12-3.24(1H，m)，3.51-3.61(1H，m)，4.31-4.73 and 5.10-5.24(4H，2m)，7.15-7.49(6H，m)，7.77-7.81(1H，m)，8.13-8.64(1H，m)；¹³C NMR(100MHz，DMSO+TFA)δ18.7/18.8(CH₂)，22.3/22.6(CH₂)，25.9/26.2(CH₂)，31.5/33.2(CH₂)，43.0/43.2(CH₂)，50.6/51.1(CH)，54.4/54.5(CH)，82.8/82.9(2d，J 178.7/178.3，CH₂F)，119.3/119.8(CH)，120.2/120.3(CH)，123.6/123.7(CH)，124.4/124.5(CH)，124.6/124.8(C)，126.6(CH)，126.9(CH)，127.5(CH)，131.0(C)，139.2/139.2(C)，140.7/140.7(C)，155.5/155.9(C)，170.1/170.2(C)，170.7/170.8(C)，201.2/201.3(2d，J 14.3/13.9，CO)；¹⁹FNMR(376MHz，DMSO+TFA)δ-226.7(t)，-226.9(t)，-230.3(t)，-232.7(t)，-233.0(t).

实施例3

[3S/R，(2S)]-3-{[1-(3-氯吩噻嗪-10-羰基)哌啶-2-羰基]氨基}-4-氟-4-氧代-戊酸

利用与上文方法A-E所述那些相似的工艺，从3-氯吩噻嗪碳酰氯制备之(108mg，65％)：

IR(固体，cm^-1)1737，1655，1455，1373，1224；¹H NMR(400MHz，d₆-DMSO+TFA)δ0.99-1.61(5H，m)，1.91-2.04(1H，m)，2.54-2.90(2H，m)，3.12-3.24(1H，m)，3.48-3.60(1H，m)，4.26-5.28(4H，m)，7.15-7.68(7H，m)，8.10-8.62(1H，m)；¹³C NMR(100MHz，DMSO+TFA)δ18.8(CH₂)，22.2/22.3(CH₂)，25.8(CH₂)，33.1/33.2(CH₂)，43.2(CH₂)，50.6/51.0(CH)，54.3/54.4(CH)，82.7/82.8(2d，CH₂F)，120.2/120.3(CH)，121.3/121.4(CH)，124.2/124.3(CH)，124.8/125.0(C)，125.7(CH)，126.3(CH)，126.6(CH)，126.8(CH)，127.7/127.9(C)，127.9/128.0(C)，138.5(C)，139.3(C)，156.0(CO)，170.1(CO)，170.6/170.7(CO)，201.1/201.2(2d，CO)；¹⁹F NMR(376MHz，DMSO+TFA)δ-226.6(t)，-226.9(t)，-232.6(t)，-232.9(t).

实施例4

[3S/R，(2S)]-3-{[1-(3，4-二氯吩噻嗪-10-羰基)哌啶-2-羰基]氨基}-4-氟-4-氧代-戊酸

利用与上文方法A-E所述那些相似的工艺，从3，4-二氯吩噻嗪碳酰氯制备之(91mg，66％)：

IR(固体，cm^-1)1737，1439，1363，1219；¹H NMR(400MHz，d₆-DMSO+TFA)δ1.03-1.62(5H，m)，1.97-2.06(1H，m)，2.54-2.86(2H，m)，3.14-3.28(1H，m)，3.59-3.66(1H，m)，4.30-5.26(4H，m)，7.15-7.68(6H，m)，8.14-8.96(1H，m)；¹³C NMR(100MHz，DMSO+TFA)δ20.2(CH₂)，23.8(CH₂)，27.3(CH₂)，34.6/34.7(CH₂)，44.5(CH₂)，52.1/52.5(CH)，55.7/55.9(CH)，84.2/84.3(2d，CH₂F)，120.2/120.3(CH)，120.8/120.9(CH)，124.2/124.4(C)，125.9(CH)，127.7/127.8(C)，128.2(CH)，128.4/128.5(C)，128.8(CH)，128.9(CH)，140.0(C)，140.1(C)，140.6(C)，156.8/156.8(CO)，171.5(CO)，172.1/172.1(CO)，202.6/202.7(2d，CO)；¹⁹F NMR(376MHz，DMSO+TFA)δ-226.6(t)，-226.8(t)，-232.6(t)，-232.9(t).

实施例5

[3S/R，(2S)]-3-{[1-(2，6-二氯吩噻嗪-10-羰基)哌啶-2-羰基]氨基)-4-氟-4-氧代-戊酸

利用与上文方法A-E所述那些相似的工艺，从2.7g二氯吩噻嗪碳酰氯制备之(91mg，70％)：

IR(固体，cm^-1)1737，1660，15551363，1224；¹H NMR(400MHz，d₆-DMSO+TFA)δ1.02-1.62(5H，m)，1.91-2.02(1H，m)，2.53-2.90(2H，m)，3.13-3.25(1H，m)，3.51-3.62(1H，m)，4.31-5.29(4H，m)，7.22-7.75(6H，m)，8.18-8.65(1H，m)；¹³C NMR(100MHz，DMSO+TFA)δ20.2(CH₂)，23.8(CH₂)，27.3(CH₂)，34.6(CH₂)，44.7(CH₂)，52.5(CH)，55.8(CH)，84.3(d，J178.2，CH₂F)，120.7/121.2(CH)，122.7/122.8(CH)，124.7/125.1(C)，125.3/125.4(CH)，127.4(CH)，128.1(CH)，128.7/128.9(C)，129.1(CH)，129.8(C)，132.7(C)，139.5/139.6(C)，141.8/141.9(C)，157.0(CO)，171.5(CO)，172.1(CO)，202.6(d，J 14.3，CO)；¹⁹FNMR(376MHz，DMSO+TFA)δ-226.6(t)，-226.9(t)，-232.6(t)，-232.9(t).

实施例6

[3S/R，(2S)]-3-{1-(咔唑-9-羰基)哌啶-2-羰基]氨基}-4-氟-4-氧代-戊酸

利用与上文方法A-E所述那些相似的工艺，从9-咔唑碳酰氯制备之(180mmg，75％)： IR(固体，cm^-1)1737，1655，1419，1373，1224；¹H NMR(400MHz，d₆-DMSO+TFA)δ1.36-1.65(6H，m)，1.94-1.99(1H，m)，2.12-2.21(1H，m)，2.59-2.89(2H，m)，4.32-5.27(4H，m)，7.30-7.36(2H，m)，7.48-7.54(2H，m)，7.63-7.76(2H，m)，8.17-8.72(3H，m)；¹³C NMR(100MHz，DMSO+TFA)δ19.0(CH₂)，23.7/23.8(CH₂)，26.5/26.8(CH₂)，33.3/33.5(CH₂)，44.1(br，CH₂)，50.9/51.4(CH)，54.5(br，CH)，82.9/83.1(2d，J 178.7/178.7，CH₂F)，111.0/111.1(CH)，111.9(CH)，119.5/119.7(CH)，120.6/120.7(CH)，122.5/122.7(C)，125.8/125.9(CH)，137.1/137.4(C)，153.2/153.3(C)，170.3/170.4(C)，170.8/170.9(C)，201.4/201.5(2d，J 14.6/14.6，CO)；¹⁹F NMR(376MHz，DMSO+TFA)δ d(J，％I)-226.6(t，3)，-22 6.8(t，3)，-230.0(t，1)，-232.7(t，10)，-232.7(t，10).

实施例7

[3S/R，(2S)]-5-氟-4-氧代-3-{[1-(6H-菲啶-5-羰基)-哌啶-2-羰基]氨基}-戊酸

利用与上文方法A-E所述那些相似的工艺，从9，10-二氢菲啶碳酰氯制备之(115mg，61％)：IR(固体，cm^-1)1731，1419，1363，H NMR(1219；¹H NMR(400MHz，d₆-DMSO+TFA)δ1.27-1.69(5H，m)，1.90-2.06(1H，m)，2.55-2.87(2H，m)，3.13-3.21(2H，m)，4.31-5.26(6H，m)，7.12-7.48(6H，m)，7.84-7.86(2H，m)，8.08-8.58(1H，m)；¹³C NMR(100MHz，DMSO+TFA)δ20.5(CH₂)，24.2(CH₂)，27.73(CH₂)，34.6/34.8(CH₂)，44.9(CH₂)，48.5/48.7(CH)，52.1/52.5(CH)，55.4/55.7(CH)，84.2(d，CH₂F)，120.2(CH)，123.3(CH)，123.6(CH)，124.7(CH)，126.1(C)，126.3(CH)，128.0(CH)，128.3(CH)，128.7(CH)，131.6(C)，134.6(C)，140.2(C)，172.1/172.2(CO)，172.4/172.4(CO)，203.0(d，CO)；¹⁹F NMR(376MHz，DMSO+TFA)δ-226.8(t)，-226.9(t)，-232.7(t)，-232.9(t).

实施例8

[3S/R，(2S)]-5-氟-3-{2-[(1H-咪唑-2-羰基)-氨基]-丙酰氨基}-4-氧代-戊酸，三氟乙酸盐(化合物1)

方法A：(2S)-2-[(1H-咪唑-2-羰基)-氨基]-丙酸叔丁基酯

向1H-咪唑-2-羧酸(0.17g)的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)(3mL)溶液加入丙氨酸叔丁酯盐酸盐(0.22g)、二异丙基乙胺(0.27mL)和HOBT(0.41g)，然后冷却至0℃，然后将反应混合物用EDC HCl(0.32g)处理。除去冷却浴，将反应混合物在环境温度下搅拌18hr(小时)，然后用乙酸乙酯稀释，用水和盐水洗涤，干燥(MgSO₄)，在减压下浓缩。残余物经过硅胶色谱纯化(30％乙酸乙酯的己烷溶液)，得到小标题化合物，为无色的油(0.263g，73％)：

¹H NMR 400MHz CDCl₃1.50(9H，s)，1.51(3H，d，J 7.2)，3.70(1H，m)，7.28(2H，s)，7.78(1H，d，J 7.6)，11.49(1H，br s).

方法B：[3S/R，4S/R，(2S)]-5-氟-4-羟基-3-{2-[(1H-咪唑-2-羰基)-氨基]-丙酰氨基}-戊酸叔丁基酯

将(2S)-2-[(1H-咪唑-2-羰基)-氨基]-丙酸叔丁基酯(0.257g)的二氯甲烷(2ml)溶液冷却至0℃，然后滴加三氟乙酸，将反应混合物升温至室温，搅拌2hr，然后在减压下蒸发。使残余物与二氯甲烷(两次)和甲苯(两次)共蒸发，留下所需的(2S)-2-[(1H-咪唑-2-羰基)-氨基]-丙酸，无需进一步纯化即可使用(0.40g)。

将(2S)-2-[(1H-咪唑-2-羰基)-氨基]-丙酸与3-氨基-5-氟-4-羟基-戊酸叔丁基酯(0.254g)的THF(7mL)溶液冷却至0℃，然后加入DMAP(0.151g)、二异丙基乙胺(0.56mL)、HOBT(0.16g)和EDC HCl(0.23g)。将反应混合物在环境温度下搅拌18hr，然后在减压下浓缩。残余物经过硅胶色谱纯化(5％甲醇的二氯甲烷溶液)，得到小标题化合物，为无色固体(0.386g，97％)： ¹H NMR 400MHzCDCl₃/CD₃OD 1.40(12H，m)，3.92(1H，m)，4.20-4.55(4H，m)，7.11(2H，d，J 15)；¹⁹F NMR CDCl₃ -229.74(m)， -229.84(m)，-230.54(m)，-230.87(m).

方法C：[3S/R，(2S)]-5-氟-3-{2-[(1H-咪唑-2-羰基)氨基]-丙酰氨基}-4-氧代-戊酸叔丁基酯

将[3S/R，(2S)]-5-氟-4-羟基-3-(2-[(1H-咪唑-2-羰基)-氨基]-丙酰氨基}-戊酸叔丁基酯(0.381g)的二氯甲烷溶液冷却至0℃，然后加入1，1，1-三乙酰氧基-1，1-二氢-1，2-benziodoxol-3(1H)-酮(0.476g)。将混合物在室温下搅拌2h，然后加入另一部分1，1，1-三乙酰氧基-1，1-二氢-1，2-benziodoxo1-3(1H)-酮(0.05g)，然后将反应混合物搅拌90min(分钟)，然后在减压下浓缩。将残余物溶于乙酸乙酯，用NaHSO₄水溶液与Na₂S₂O₃水溶液的1∶1混合物洗涤。收集有机层，干燥(MgSO₄)，浓缩。残余物经过快速色谱纯化(5％甲醇的二氯甲烷溶液)，得到小标题化合物，为无色泡沫(319mg，84％)：

¹H NMR 400MHz CDCl₃ 1.37+1.43(9H，2xs)，1.54(3H，m)，2.85(1H，m)，3.03(1H，m)，4.85-5.30(4H，m)，7.18(2H，d，J 16)，7.90(1H，m)，7.98(1H，m)，11.37+11.45(1H，2xs)；¹⁹F NMR 376MHz CDCl₃ -231.85(t，J 48)，-232.12(t，J 48).

方法D：

化合物1

将[3S/R，(2S)]-5-氟-3-{2-[(1H-咪唑-2-羰基)-氨基]-丙酰氨基}-4-氧代-戊酸叔丁基酯(0.31g)的二氯甲烷(2ml)溶液冷却至0℃，然后滴加三氟乙酸，将反应混合物升温至室温，搅拌2hr，然后在减压下蒸发。使残余物与二氯甲烷共蒸发(两次)，在醚中研制，得到标题化合物，为无色固体(0.35g)：

IR 1785.7，1730.1，1653.7，1538.1，1458.2，1384.2，1268.7，1188.4，1150.9，1053.3，992.13，931.8，867.9，847.0，768.5cm^-1；¹H NMR 400MHz DMSO-d₆ 1.37(3H，d)，2.40-2.85(2H，m，asp CH₂)，4.34-4.75(2.5H，m，2xCH+0.5CH₂F)，5.13-5.41(1.5H，m，CH₂F)，7.50(2H，s，咪唑 CHs)，8.58-8，79(2H，m，NHs)，¹³C NMR 100MHz DMSO-d₆ 18.13，18.85(alaCH₃)；33.13，34.75(asp CH₂)，48.68，52.41(CHs)，83.46，85.21(CH₂F)，123.67(CH 咪唑)，

139.57，158.86，172.35(m)(C＝Os)，202.70(5峰酮)；¹⁹F NMR 376MHz DMSO-d₆解偶联-75.19(3F，s，CF₃COOH)，-(226.89，226.96，230.80，231.59，232.95，233.06(1F，6xs，COCH₂F打开的环和闭合的环).

实施例9

[3S/R，(2S)]-3-{2-[(1 H-苯并咪唑-2-羰基)-氨基]-丙酰氨基}-5-氟-4-氧代-戊酸，三氟乙酸盐(化合物2)

利用与上文方法A-D所述那些相似的工艺，从1H-苯并咪唑-2-羧酸制备之(142mg，90％最后一步收率)：(作为TFA盐所分离的化合物)灰白色固体；

IR(固体，cm^-1)3277.9，1654.6，1526.6，1188.6，1142.5，1050.4，927.5，748.2，712.4 ；¹H NMR(DMSO-d₆)1.42(3H，d)，2.51-2.95(2H，m)，4.21-4.75(2H，m)，4.76-5.60(3H，brm)，7.41(2H，m)，7.65(2H，m)，8.21-9.05(2H，m)；¹³C NMR(DMSO-d₆)18.0，18.7，18.8(AlaCH₃)，37.2，34.6，34.7(Asp CH₂)，47.6，48.8，48.85，49.1(Asp CH)，52.0，52.5(Ala CH)，83.5，85.2，85.3，103.8，106.0(CH₂F)，116.6，123.9(芳基CH)，145.3，145.4，(Aryl C)，158.4，158.7，158.8，172.1，172.2，172.4，172.5，172.6，172.7，173.2(NC＝O)，202.6，202.7，202.8，202.9(C＝O)；实测值M⁺364.1177.C₁₆H₁₇FN₄O₅

计算值M⁺364.1183(1.8ppm).

实施例10

[3S/R，(2S)]-5-氟-3-{2-[(1H-咪唑-2-羰基)-氨基]-丁酰氨基}-4-氧代-戊酸，三氟乙酸盐(化合物3)

利用与上文方法A-D所述那些相似的工艺，从1H-苯并咪唑-2-羧酸制备之(147mg，64％最后一步收率)：

IR(cm^-1)3280.0，1659.5，157.9，1192.5，1141.6，784.7，721.1；¹H NMR 400MHz DMSO-d₆ 0.95(3H，m)，1.78(2H，m)，2.58-2.98(2H，m)，4.30-4.78(2.5H，m)，5.10-5.42(1.5H，m)，7.41(2H，s)，8.44+8.75(2H，2xm)；¹³CNMR 100MHz DMSO-d₆ 10.19，10.29，15.52(CH₃)，25.42，25.49，26.03，33.06，33.13，34.65，34.80(CH₂)，47.45，47.53，52.0，53.96，54.13(CH)65.27(CH₂)，84.36(d，J177，CH₂F)，103.81，104.00(C)，123.89(CH)，139.74(C＝O)，156.90，158.39，158.74，171.51，171.80，171.83，172.02，173.11(C＝O)，202.51，202.66，202.76，202.90(CH₂FC＝O)；¹⁹F NMR 376MHz DMSO-d₆-226.82(t，J 45)，-226.84(t，J 45)，-230.67(t，J 45)，-231.43(t，J 45)，-232.79(t，J 45)，-232.82(t，J 45).

实施例11

[3S/R，(2S)]-5-氟-3-{2-[(1H-咪唑-2-羰基)-氨基]-3-甲基-丁酰氨基}-4-氧代-戊酸(化合物4)

利用与上文方法A-D所述那些相似的工艺，从1H-苯并咪唑-2-羧酸制备之(80g，85％最后一步收率)：白色粉末，IR(固体，cm^-1)

IR(固体，cm^-1)1736，1649，1557，1511，1455，1434，1393；1H NMR(DMSO+TFA)0.92-0.95(6H，m)，2.06-2.15(1H，m)，2.56-2.90(2H，m)，4.33-5.36(4H，m)，7.79(2H，s)，8.58-8.90(2H，m)；¹⁹FNMR(DMSO+TFA)-226.8(t)，-230.6(t)，-231.0(t)，-232.5(t)，-232.6(t)；¹³C NMR(DMSO+TFA)18.1/18.4(CH₃)，19.2/19.3(CH₃)，34.5/34.8(CH₂)，51.9/52.2(CH)，58.5/58.8(CH)，84.3/84.4(2d，J 178.7/178.7，CH₂F)，122.0(CH)，137.5(C)，153.7(C)，170.6(C)，171.9/172.0(C)，202.5/202.8(2d，J 14.6/14.6，CO).

实施例12

[3S/R，(2S)]-3-{2-[(1H-苯并咪唑-2-羰基)-氨基]-3-甲基丁酰氨基}-5-氟-4-氧代-戊酸(化合物5)

利用与上文方法A-D所述那些相似的工艺，从1H-苯并咪唑-2-羧酸制备之(90mg，87％最后一步收率)：白色粉末，

IR(固体，cm^-1)1737，1665，1527，1373，1194，1137；1H NMR(DMSO-d₆)0.90-0.95(6H，m)，2.15-2.18(1H，m)，2.59-2.92(2H，m)，4.33-4.76 and5.12-5.38(4H，2m)，7.31-7.35(2H，m)，7.66-7.68(2H，m)，8.3 6-8.82(2H，m)；¹⁹FNMR(DMSO+TFA)-226.7(t)，-226.9(t)，-232.4(t)，-23 2.6(t)；¹³C NMR(DMSO-d₆)18.3/18.4/18.5/18.7(CH₃)，19.4/19.5(CH₃)，31.0/31.1/31.6(CH)，34.7/34.8(CH₂)，51.8/52.1(CH)，57.9/58.3/58.6(CH)，84.3/84.4(2d，J 178.7/178.7，CH₂F)，124.0(CH)，145.2/145.2(C)，158.4/158.5/1 58.7/158.8(C)，170.9/171.1/171.2(C)，172.0/172.0(C)，173.1(C)，173.9(C)，202.06/202.6(2d，J 13.8，CO).

实施例13

[3S/R(2S)]-3-[2-(咔唑-9-基-2-氧代-乙基)-戊酰氨基]-5-氟-4-氧代-戊酸

方法A：(4S)-苄基-3-戊酰基-唑烷-2-酮

在-78℃下，将4(S)-(-)-苄基-2-唑烷酮(10g，56.43mmol)的无水THF(200ml)溶液用2.5M正丁基锂的己烷溶液(23.70ml，59.26mmol)处理，同时搅拌。将反应混合物在-78℃下搅拌30min，然后加入戊酰氯(7.57ml，62.10mmol)。然后使反应混合物历经15h升温至环境温度，然后用NH₄Cl溶液稀释，用乙酸乙酯稀释，用盐水洗涤。将有机相干燥(Na₂SO₄)，浓缩得到胶状物。经过快速色谱纯化(10％EtOAc的40/60己烷溶液)，得到小标题化合物(14.61g，99％)，为无色的油： ¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ0.94-1.20(3H，m)，1.35-1.50(2H，m)，1.62-1.80(2H，m)，2.74-2.84(1H，m)，2.86-3.08(2H，m)，3.27-3.39(1H，m)，4.11-4.26(2H，m)，4.62-4.76(1H，m)，7.18-7.40(5H，m).

方法B：[4S(3R)]-3-(4-苄基-2-氧代-唑烷-3羰基)-己酶叔丁基酯

在-78℃下，将(4S)-苄基-3-戊酰基-唑烷-2-酮(14.20g，54.34mmol)的THF(100ml)溶液用1M双(三甲基甲硅烷基)氨基钠的THF溶液(59.80ml，59.77mmol)处理10min，同时搅拌。将反应混合物在-78℃下搅拌30min，然后加入溴乙酸叔丁酯(10.43ml，70.64mmol)。然后将反应混合物在-78℃下搅拌另外3.5h，然后用NH₄Cl溶液稀释，用乙酸乙酯稀释，先后用NaHCO₃溶液和盐水洗涤。将有机相干燥(Na₂SO₄)，浓缩得到胶状物。放置后生成白色固体，从40/60DCM/己烷中重结晶，得到小标题化合物(14.62g，72％)，为白色固体：¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ0.81-1.20(3H，m)，1.21-1.76(13H，m)，2.41-2.55(1H，m)，2.66-2.92(2H，m)，3.27-3.40(1H，m)，4.05-4.26(2H，m)，4.61-4.72(1H，m)，7.12-7.40(5H，m).

方法C：(2R)-2-丙基-琥珀酸1-苄基酯4-叔丁基酯

在-20℃下，将苄醇(4.62ml，44.64mmol)的THF(80ml)溶液用2.5M正丁基锂的己烷溶液(13.36ml，33.48mmol)处理，同时搅拌。使反应混合物历经40min升温至-5℃，然后加入[4S(3R)]-3-(4-苄基-2-氧代-唑烷-3-羰基)-己酸叔丁基酯(8.38g，22.32mmol)的THF(20ml)溶液。使反应混合物历经15h升温至环境温度，然后用NH₄Cl溶液和乙酸乙酯稀释，用盐水洗涤。将有机相干燥(Na₂SO₄)，浓缩得到胶状物。经过快速色谱纯化(11％EtOAc的40/60己烷溶液)，得到小标题化合物(4.56g，67％)，为无色的油：

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ0.83-1.00(3H，m)，1.21-1.71(13H，m)，2.34-2.45(1H，m)，2.75-2.95(1H，m)，5.09-5.25(2H，m)，7.30-7.43(5H，m).

方法D：(2R)-2-丙基-琥珀酸1-苄基酯

在0℃下，将搅拌着的(2R)-2-丙基-琥珀酸1-苄基酯4-叔丁基酯(4.56g，14.88mmol)的无水DCM(20ml)溶液用三氟乙酸(10ml)的无水DCM(10ml)溶液处理。使反应混合物历经3h升温至环境温度，然后在减压下浓缩。将残余物溶于无水DCM，然后再次浓缩。这种过程重复若干次，目的是除去过量三氟乙酸，留下小标题化合物(3.70g，99％)，为胶状物： ¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ0.82-0.99(3H，m)，1.21-1.76(4H，m)，2.45-2.60(1H，m)，2.76-3.00(2H，m)，5.10-5.21(2H，m)，7.28-7.43(5H，m)，7.83-8.18(1H，m).

方法E：(2R)-2-(2-咔唑-9-基-2-氧代-乙基)-戊酸苄基酯

在-78℃下，将搅拌着的咔唑(2.49g，14.88mmol)的无水THF(30ml)溶液用1.0M双(三甲基甲硅烷基)氨基锂的THF溶液(14.88ml，14.88mmol)处理。使反应混合物历经2h升温至环境温度，然后重新冷却至-78℃。

将在0℃下搅拌着的(2R)-2-丙基-琥珀酸1-苄基酯(3.70g，14.78mmol)的无水DCM(20ml)溶液用草酰氯(1.43ml，16.37mmol)和DMF(14滴)处理。将反应混合物在0℃下搅拌1h，然后在真空中浓缩。将残余物溶于无水THF(10mL)，在-78℃下加入到预先制备的咔唑的锂阴离子中。使反应混合物历经40h升温至环境温度，然后用NH₄Cl溶液和乙酸乙酯稀释，先后用2N HCl、NaHCO₃溶液和盐水洗涤。将有机相干燥(Na₂SO₄)，浓缩，得到胶状物，经过快速色谱纯化(10％EtOAc的40/60己烷溶液)，得到小标题化合物(4.50g，76％)，为半固体/油，也含有咔唑： ¹HNMR(400MHz，CDCl₃)δ0.82-1.05(3H，m)，1.11-1.99(4H，m)，3.18-3.38(2H，m)，3.56-3.71(1H，m)，5.10-5.30(2H，m)，7.11-7.60(9H，m)，7.92-8.29(4H，m).

方法F：(2R)-2-(2-咔唑-9-基-2-氧代-乙基)-戊酸

将搅拌着的(2R)-2-(2-咔唑-9-基-2-氧代-乙基)-戊酸苄基酯(4.50g，11.26mmol)的EtOAc(60ml)溶液用10％披钯碳(～400mg)处理，然后将反应混合物置于氢气氛下。1h后加入另外的10％披钯碳(～300mg)，将反应混合物置于氢下另外3H，同时搅拌，然后通过C盐垫过滤反应混合物，浓缩，得到小标题化合物(2.94g，84％)，为白色固体，也含有咔唑： ¹HNMR(400MHz，CDCl₃)δ0.92-1.04(3H，m)，1.32-2.00(4H，m)，3.19-3.34(2H，m)，3.58-3.70(1H，m)，7.30-7.53(4H，m)，8.00-8.30(4H，m).

方法G：[3S/R，4S/R，(2R)]-3-[2-(2-咔唑-9-基-2-氧代-乙基)-戊酰氨基]-5-氟-4-羟基-戊酸叔丁基酯

将搅拌着的(2R)-2-(2-咔唑-9-基-2-氧代-乙基)-戊酸(2.94g，9.50mmol)、3-氨基-5-氟-4-羟基-戊酸叔丁基酯(2.07g，9.99mmol)、HOBT(1.41g，10.43mmol)、DMAP(1.34g，10.97mmol)与无水THF(40ml)的混合物冷却至0℃，然后加入EDC(2.00g，10.43mmol)。使混合物在16h内升温至室温，然后在减压下浓缩。残余物经过快速色谱纯化(33％EtOAc的40/60己烷溶液)，得到小标题化合物(2.51g，53％)，为泡沫： ¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ0.90-1.03(3H，m)，1.20-1.90(13H，m)，2.50-3.00(3H，m)，3.12-3.26(1H，m)，3.59-3.80(2H，m)，4.00-4.68(3H，m)，6.53-6.89(1H，m)，7.30-7.52(4H，m)，7.95-8.05(2H，m)，8.15-8.26(2H，m)；¹⁹F NMR(376MHz，CDCl₃)-229.10，-229.34，-230.95，-231.09.

方法H：[3S/R，(2R)]-3-[2-(2-咔唑-9-基-2-氧代-乙基)-戊酰氨基]-5-氟-4-氧代-戊酸叔丁基酯

在0℃下，将搅拌着的[3S/R，4S/R，(2R)]-3-[2-(2-咔唑-9-基-2-氧代-乙基)-戊酰氨基]-5-氟-4-羟基-戊酸叔丁基酯(2.51g，5.03mmol)的无水DCM(60ml)溶液用1，1，1-三乙酰氧基-1，1-二氢-1，2-benziodoxol-3(1H)-酮(2.35g，5.53mmol)处理。将所得混合物在0℃下保持3h，用DCM稀释，然后先后用饱和硫代硫酸钠水溶液、NaHCO₃溶液和盐水洗涤。将有机相干燥(Na₂SO₄)，浓缩。残余物经过快速色谱纯化(25％乙酸乙酯的40/60己烷溶液)，得到小标题化合物，为灰白色固体(1.437g，57％)：IR(固体，cm^-1)1722，1689，1636，1531，1441，1365，1279，1155；¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ0.85-1.50(3H，m)，1.35-1.54(11H，m)，1.55-1.69(1H，m)，1.78-1.95(1H，m)，2.67-3.28(4H，m)，3.60-3.79(1H，m)，4.80-5.59(3H，m)，6.89-7.04(1H，m)，7.33-7.54(4H，m)，7.98-8.04(2H，m)，8.15-8.28(2H，m)；¹³C(100MHz，CDCl₃)δ14.12，14.40，14.47，14.60，20.78，20.84，21.47，28.32，28.42，28.48，29.77，33.63，34.58，34.91，40.05，43.05，43.26，43.29，52.60，53.00，53.64，66.90，66.99，82.62，82.69，85.53，116.88，116.94，120.28，120.31，124.2，127.76，127.86，128.69，128.77，128.99，138.80，171.21，171.29，172.21，172.25，175.53，176.03，203.04，203.20，203.30，203.46；¹⁹F(376MHz，CDCl₃)δ-232.12，-233.24.

方法I：[3S/R，(2R)]-3-[2-(2-咔唑-9-基-2-氧代-乙基)-戊酰氨基]-5-氟-4-氧代-戊酸

将[3S/R，(2R)]-3-[2-(2-咔唑-9-基-2-氧代-乙基)-戊酰氨基]-5-氟-4-氧代-戊酸叔丁基酯(1.43g，2.88mmol)的无水DCM(20ml)溶液用TFA(10ml)的无水DCM(10ml)溶液处理，同时搅拌。将混合物在0℃下搅拌2h，然后在室温下搅拌2h。在减压下浓缩混合物，然后将残余物溶于无水DCM。这种过程重复若干次，目的是除去过量三氟乙酸。使灰白色固体从Et₂O/40/60己烷中重结晶，得到标题化合物，为白色粉末(71mg)： IR(固体，cm^-1)1746，1689，1641，1541，1436，1374，1284，1207，1160cm-1；¹H NMR(400MHz，d₆-DMSO)δ0.80-1.00(3H，m)，1.20-1.76(4H，m)，2.30-2.90(2H，m)，2.95-3.24(1H，m)，3.26-3.59(2H，m)，4.25-4.79(1.5H，m)，5.02-5.43(1.5H，m)，7.36-7.58(4H，m)，8.10-8.30(4H，m)，8.54-8.91(1H，m)；¹³C NMR(100MHz，DMSO)δ14.31，20.03，20.13，21.92，22.51，34.36，34.77，41.20，41.62，44.06，51.77，52.84，83.45，85.22，116.70，120.54，123.91，124.01，127.85，126.01，138.20，172.15，172.36，172.96，173.00，175.32，175.48，202.60，203.10；¹⁹F(376MHz，DMSO)δ-226.68，-226.73，-231.21，-232.95，-233.38，-233.52.

实施例14

[3S/R(2S)]-3-[2-(2-咔唑-9-基-2-氧代-乙基)-3-甲基-丁酰氨基]-5-氟-4-氧代-戊酸

利用与上文方法A-I所述那些相似的工艺制备之。分离产物，为白色固体(71％最后一步收率)： IR(固体，cm^-1)1739，1682，1646，1545，1447，1381，1290，1209，1170cm^-1；¹H NMR(400MHz，DMSO+TFA)δ0.79-1.08(6H，m)，1.89-2.15(1H，m)，2.31-3.60(5H，m)，4.21-4.78(1.25H，m)，4.98-5.45(1.75H，m)，7.38-7.60(4H，m)，8.14-8.35(4H，m)，8.56-8.90(1H，m)；¹³C NMR(100MHz，DMSO)δ20.46，20.84，21.04，21.21，30.77，30.85，33.37，34.83，35.24，38.16，38.89，47.67，48.23，52.19，53.43，83.96，84.01，85.72，85.77，117.16，121.02，124.43，126.42，126.52，128.42，138.75，172.64，172.90，173.85，173.90，174.74，174.93，175.16，202.91，203.04，203.51，203.65；¹⁹F(376MHz，DMSO)δ-226.63，-226.68，-231.24，-233.16，-233.38，-233.55.

生物学方法

实施例15

借助本领域已知的方法可以测量ICE抑制作用。

借助两项研究可以证明ICE抑制剂有效治疗MWS、FCU、FMF、CINCAS、NOMID、TRAPS、HIDS、全身起始性青少年自发性关节炎、斯提尔氏病和巨噬细胞活化综合征以及其他自身炎性疾病、病症或综合征：

实施例16

从MWS、FCU、FMF、CINCAS、NOMID、TRAPS、HIDS、全身起始性青少年自发性关节炎、斯提尔氏病和巨噬细胞活化综合征或者其他自身炎性疾病或病症患者收集血样，体外培养全血或者加工为外周血单核细胞(PBMC)制备物。在正常未受刺激的条件下或者在刺激物(例如脂多糖、金黄色葡萄球菌、尼日利亚菌素或佛波醇肉豆蔻酸酯)的存在下，评价IL-1β的产生。向培养物加入浓度1-100,000nM的ICE抑制剂，以证明它们抑制MWS、FCU、FMF、CINCAS、NOMID、TRAPS、HIDS、全身起始性青少年自发性关节炎、斯提尔氏病和巨噬细胞活化综合征或者其他自身炎性疾病、病症或综合征患者细胞产生IL-1β和/或IL-18的能力。

实施例17

MWS、FCU、FMF、CINCAS、NOMID、TRAPS、HIDS、全身起始性青少年自发性关节炎、斯提尔氏病和巨噬细胞活化综合征或者其他自身炎性疾病或病症患者参加接受ICE抑制剂治疗的临床试验。借助适当的途径(口服、静脉内、皮下等)以10-10,000mg的剂量给予药物，给药频率为1-4次/天或者根据需要，以控制该疾病、病症或综合征的症状和其他表现。治疗持续时间可以从每一天或多天定期使用直到在患者生命期间每天使用。借助它们减少临床指征和症状的能力来证明功效，例如发热、荨麻疹、关节痛、浆膜炎、全身淀粉样变性、强烈的急性期响应和病患组织的突出的中性白细胞增多。

实施例18

化合物7对LPS-刺激的FCAS患者PBMC释放IL-1β和IL-18的抑制作用，与健康对照相比

CAIS1基因在FCAS中突变，由该基因编码的蛋白质cryopyrin调控ICE/天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-1活化和其加工pro-IL-1β为活性IL-1β以及加工pro-IL-18为活性IL-18。可以预期突变的cryopyrin蛋白将以不同方式干扰ICE/天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-1，可能以改变ICE抑制剂化合物与ICE/天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-1相互作用的方式改变ICE/天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-1构型，从而减少该化合物抑制ICE活化和IL-1β与IL-18加工的能力。因此，进行本例实验以证实化合物7能够抑制FCAS患者细胞中的ICE。

研究了来自3个家族的FCAS患者以及健康对照。FCAS患者表达3种不同的CIAS1基因突变。五名有亲属关系的患者(母亲、两名女儿、孙女和男性远亲)在cryopyrin中具备共同的L353P祖传突变，这在以前已有描述(Johnstone RF，Dolen WK，Hoffman HM.A largekindred with familial cold autoinflammatory syndrome.AnnAllergy Asthma Immunol.2003；90(2)：233-7)。其他患者具备尚未报道过的新颖突变。两名患者(母亲和女儿)在CIAS1基因的核苷酸1976上具有T到A的转变，引起cryopyrin中的M659K取代。一名患者在CIAS1基因的核苷酸1573上具有G到A的转变，生成尚未报道过的E525K氨基酸取代，以及V198M变化，这在以前若干具有不同表型的患者中已有描述，但是在正常对照中也是如此。所有突变都位于外显子3中，它编码NBS(NACHT)结构域或NBS有关的结构域，并且都在其他已报道过的突变的3种氨基酸内，与提示突变热点的研究是一致的(Neven B，Callebaut I，Prieur AM，Feldmann J，Bodemer C，Lepore L，Derfalvi B，Benjaponpitak S，Vesely R，Sauvain MJ，Oertle S，Allen R，Morgan G，Borkhardt A，Hill C，Gardner-MedwinJ，Fischer A，de Saint Basile G.Molecular basis of the spectralexpression of CIAS1 mutations associated with phagocyticcell-mediated autoinflammatory disorders CINCA/NOMID，MWS，andFCU.Blood.2004；103(7)：2809-15)。

从FCAS患者和健康志愿者对照收集全血样品，体外培养。在正常未受刺激的条件下和在浓度为10-10,000ng/mL的脂多糖的存在下评价IL-1β的产生。向培养物加入浓度为30-30,000nM的化合物7，以观察其抑制FCAS患者或健康志愿者细胞产生IL-1β和IL-18的能力。图1阐述这些实验的结果。

具体而言，在图1A中，在递增浓度化合物7(0.03-30μM)的存在下，将来自FCAS患者和正常对照的PBMC与10ng/mL LPS温育24小时。借助ELISA测量细胞培养基中的IL-1β，使每名受试者的结果正常化为在没有化合物7存在下的IL-1β释放水平。结果以平均±SEM报道，就3名FCAS患者和5名对照患者而言。化合物7抑制LPS-刺激的IL-1β的效力非常相似于来自正常受试者的PBMC(IC₅₀值～1μM)。

图1B阐述在有或没有10μM化合物7的存在下、在暴露于LPS达24小时后来自FCAS患者或对照受试者的PBMC中IL-1β的释放。结果以平均±SEM报道，就7名FCAS患者和5名对照患者而言。LPS刺激FCAS患者PBMC比正常受试者释放更大量的IL-1β，FCAS PBMC响应于更低浓度的LPS。尽管如此，10μM化合物7抑制LPS-刺激的IL-1β，相似于来自正常受试者的PBMC。

图1C阐述在有或没有10μM化合物7的存在下、在暴露于LPS达24小时后来自FCAS患者或对照受试者的PBMC中IL-18的释放。结果以平均±SEM报道，就3名FCAS患者和3名对照患者而言。LPS刺激FCAS患者PBMC比正常受试者释放更大量的IL-18，FCAS PBMC响应于更低浓度的LPS。尽管如此，10μM化合物7抑制LPS-刺激的IL-18到相似于来自正常受试者的PBMC的程度。

这些数据证明，FCAS患者表现出明显的IL-1β和IL-18分泌对LPS刺激的响应性过高，但是没有证据表明这些细胞因子的基础分泌增加或者基础性或受刺激的βro-IL-1β水平改变。化合物7阻滞IL-1β和IL-18分泌(图1)，在来自FCAS和对照受试者的LPS-刺激细胞中的效力相等。此外，本文所列FCAS患者数据提示，FCAS患者中的CAIS1基因突变及其所编码的cryopyrin蛋白不改变ICE/天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-1对ICE抑制剂(如化合物7)的敏感性。

实施例19

化合物7对LPS-刺激的来自4名MWS患者的PBMC释放IL-1β的抑制作用，该PBMC在递增浓度化合物7(0.03-10μM)的存在下与10ng/mL LPS温育24小时

如实施例18所述，可以预见突变的cryopyrin蛋白将以不同方式干扰ICE/天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-1，并且可能以改变ICE抑制剂化合物与ICE/天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-1相互作用的方式改变ICE/天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-1构型，从而减少该化合物抑制ICE活化和IL-1β与IL-18加工的能力。因此，进行本例实验，以证实化合物7能够抑制MWS患者细胞中的ICE。

研究四名MWS患者，其中三名具备262位精氨酸对色氨酸的替换(R262W)，一名具备350位苏氨酸对甲硫氨酸的替换(T350M)。

从MWS患者收集全血样品，体外培养。在正常未受刺激的条件下和在浓度为10-10,000ng/mL的脂多糖的存在下评价IL-1β的产生。向培养物加入浓度为30-10,000nM的化合物7，以观察其抑制MWS患者或健康志愿者细胞产生IL-1β的能力。图2阐述这些实验的结果。

具体而言，在图2中，借助ELISA测量细胞培养基中的IL-1β，使每名受试者的结果正常化为在没有化合物7存在下的IL-1β释放水平。结果以平均±SEM报道，就4名MWS患者的每一名而言。化合物7抑制LPS-刺激的MWS患者PBMC释放IL-1β的效力相似于来自正常受试者的PBMC(正如在实施例18中所观察到的)。这表明三名MWS患者中的cryopyrin突变不以其改变化合物7的活性代谢产物(化合物8)与ICE/天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-1相互作用的效力的方式改变ICE/天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-1活化。

实施例20

片剂制备

表1提供用在下文实施例21中的化合物7片剂的组成。配制药物产品，得到每片300mg化合物7。

表1：化合物7 300mg片的组成

组分	量(mmg/片)	功能
组分	量(mmg/片)	功能	化合物7	300	活性成分
微晶纤维素(NF)	277.50	填充剂	化合物7	300	活性成分
微晶纤维素(NF)	277.50	填充剂	预胶化淀粉(NF)	131.25	崩解剂
淀粉羟乙酸钠(NF)	15.00	崩解剂	预胶化淀粉(NF)	131.25	崩解剂
淀粉羟乙酸钠(NF)	15.00	崩解剂	胶体二氧化硅(NF)	11.25	助流剂
滑石(USP)	7.50	助流剂	胶体二氧化硅(NF)	11.25	助流剂
滑石(USP)	7.50	助流剂	硬脂酸镁(NF)	7.50	润滑剂
总计	750		硬脂酸镁(NF)	7.50	润滑剂

实施例21

4名MWS患者对每天口服给予900mg化合物7达14天的临床响应

四名MWS患者参加开放标记的临床试验，接受化合物7治疗。三名患者具备262位精氨酸对色氨酸的替换(R262W)，一名患者具备350位苏氨酸对甲硫氨酸的突变(T350M)。

每天3次口服给予剂量900mg的化合物7达14天。在治疗阶段血清白介素-18、淀粉样蛋白A和C-反应性蛋白水平的明显减少证明化合物7在MWS患者中的抗炎活性(参见图3)。由患者报告的临床症状减少证明化合物7的临床功效，在图3中被阐述为症状总和，包括皮疹、发热/发冷、关节痛/肌痛、眼不适、疲劳(参见图3)。在14天的治疗阶段化合物7也被四名患者所良好耐受。

具体而言，在图3A中，在用化合物7治疗之前(第-9天和第0天(第一点))、期间(第0天(第二点)、第7天和第14天(第三点))和之后(第14天(第二点)和第21天)测量血清白介素-18(IL-18)。平均而言，血清IL-18水平在第14天减少55％。数据以来自4名患者的平均±SEM报道。血清IL-18的基线水平为170-370pg/mL，相对于健康对照受试者观测值而言仅有略微升高。

在图3B中，在用化合物7治疗之前、期间和之后测量血清淀粉样蛋白A(SAA)和C-反应性蛋白(CRP)，SAA和CRP的量分别平均减少75％和65％。SAA的基线水平为150-650mg/L，CRP的基线水平为20-90mg/L，相对于健康对照受试者而言都有明显升高。

图3C阐述自我报告的患者总体症状得分在治疗期间平均减少60％。患者每天评价单个症状(皮疹、发热/发冷、关节痛/肌痛、眼不适、疲劳)为不存在(0)、微小(1)、轻微(2)、中等(3)或严重(4)，计算总分，为单个症状得分之和(0-20)。患者在治疗之初经历轻微-中等的症状(10-15分)，在用化合物7治疗期间减少至微小水平(约5分)。

因而，在本例中我们证明，ICE/天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-1抑制剂化合物7在自身炎性疾病、特别是Muckle-Wells综合征的治疗中是有效的和有益的，因为化合物7的给药降低炎症的标志，包括血清白介素-18、血清淀粉样蛋白A和血清C-反应性蛋白，并且减少由患者所经历的MWS症状。

尽管我们已经描述了本发明的大量实施方式，不过显然可以改变我们的基本实施例，以提供其他采用本发明化合物和方法的实施方式。因此将领会到，本发明的范围受到权利要求书、而非具体实施方式的限定，后者仅供举例说明。

Claims

1、改善、治疗或预防受治疗者自身炎性疾病的方法，包含对所述受治疗者给予抑制ICE的化合物或者包含所述化合物的药物组合物。

2、改善、治疗或预防受治疗者cryopyrin-有关的周期综合征。Muckle-Wells综合征(MWS)、家族性寒性自身炎性综合征(FCAS)(也被称为家族性冷性荨麻疹或FCU)、家族性地中海热(FMF)、慢性婴儿神经性皮肤与关节综合征(CINCAS)、a.k.a.始于新生期的多***炎性疾病(NOMID)、TNFR1-有关的周期综合征(TRAPS)、超IgD周期热综合征(HIDS)、Blau氏综合征、全身起始性青少年自发性关节炎(斯提尔氏病)或巨噬细胞活化综合征的方法，包含对所述受治疗者给予抑制ICE的化合物或者包含所述化合物的药物组合物。

3、根据权利要求1或权利要求2的方法，其中所述化合物是根据任意WO00/55114，WO00/55127，WO00/61542，WO00/61542，WO01/05772，WO01/10383，WO01/16093，WO01/42216，WO01/72707，WO01/90070，WO01/94351，美国公报2003/0092703，WO02/094263，美国公报2002/0169177，美国专利6,184,210，美国专利6,184,244，美国专利6,187,771，美国专利6,197,750，美国专利6,242,422，April2001 American Chemical Society (ACS) meeting in San Diego，California，USA，WO02/22611，美国公报2002/0058630，美国公报2003/0096737，WO95/35308，WO97/22619，WO99/47545和WO01/90063的。

4、根据权利要求3的方法，其中所述化合物是根据任意WO95/35308，WO97/22619，WO99/47545和WO01/90063的。

5、根据权利要求1的化合物，其中所述化合物是：

及其每种立体异构体，包括：

(化合物6)。

6、根据权利要求1的化合物，其中所述化合物是：

及其每种立体异构体，包括：

7、根据权利要求1的化合物，其中所述化合物是：

及其每种立体异构体，包括：

(化合物7)

8、根据权利要求1的化合物，其中所述化合物是：

及其每种立体异构体，包括：

(化合物8)

9、鉴定改善、治疗或预防受治疗者自身炎性疾病的化合物的方法，包括给予抑制ICE的化合物或者包含所述化合物的药物组合物，并且比较该受治疗者用所述化合物治疗前后的ICE抑制作用。

10、鉴定改善、治疗或预防受治疗者自身炎性疾病的化合物的方法，包括给予抑制ICE的化合物或者包含所述化合物的药物组合物，并且比较所述受治疗者用所述化合物治疗前后的所述自身炎性疾病的生物标志。

11、根据权利要求10的方法，其中所述生物标志选自：白介素-1β、白介素-6、白介素-8、白介素-18、血清淀粉样蛋白A、C-反应性蛋白、红细胞沉降率(ESR)、结合珠蛋白、TNFα、免疫球蛋白、铁蛋白、白细胞数、血小板数和血红蛋白。

12、改善、治疗或预防受治疗者自身炎性疾病的药物组合物，包含抑制ICE的化合物和药学上可接受的载体。

13、根据权利要求12的药物组合物或者根据权利要求9-11任意一项的方法，其中所述化合物是如权利要求3-8任意一项所引用的。

14、根据权利要求1的方法，其中对受治疗者给予化合物的剂量选自：

(a)每次给药约300mg至约2,400mg之间；

(b)每次给药约600mg至约1,800mg之间；和

(c)每次给药约900mg。

15、根据权利要求1的方法，其中对受治疗者给予化合物的剂量选自：

(a)每天约2mg/kg体重至约200mg/kg体重之间；

(b)每天约6mg/kg体重至约100mg/kg体重之间；和

(c)每天约25mg/kg体重至约75mg/kg体重之间。

16、减少患有自身炎性疾病的受治疗者中IL-1β、IL-18或其他生物标志的方法，包括对所述受治疗者给予抑制ICE的化合物或者包含所述化合物的药物组合物的步骤。