NO179587B

NO179587B - Analogifremgangsmåte for fremstilling av en terapeutisk aktiv insulinanalog og mellomprodukt

Info

Publication number: NO179587B
Application number: NO900615A
Authority: NO
Inventors: Ronald Eugene Chance; Richard Dennis Dimarchi; Bruce Hill Frank; James Edwin Shields
Original assignee: Lilly Co Eli
Priority date: 1989-02-09
Filing date: 1990-02-08
Publication date: 1996-07-29
Also published as: DE19675034I2; EP0383472A2; FI900600A0; IL93282A0; LU88830I2; RU2109749C1; NO900615D0; DK0383472T3; DE69033889T2; NO1996013I1; CN1148984A; EP0678522B1; HU212679B; ES2083424T3; EP0383472B1; EP0678522A1; DE69033889D1; ES2170122T3; BG60769B2; NO900615L

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en analogifremgangsmåte for fremstilling av en terapeutisk aktiv insulinanalog samt mellomprodukt som er nyttig i denne fremgangsmåten. Nevnte insulinanaloger er mindre utsatt for dimerisering eller selv-assosiering til former med høyere molekylvekt og utviser dermed en sammenlignbar mere hurtig begynnende aktivitet mens den biologiske aktiviteten til nativt humant insulin blir opprettholdt.

Foreliggende oppfinnelse vedrører følgelig en analogifremgangsmåte for fremstilling av en terapeutisk aktiv insulinanalog med formel

eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav, hvor Bl er fenylalanin, asparaginsyre eller er fraværende; B2 er val in

eller kan være fraværende når Bl er fraværende; B3 er asparagin eller asparaginsyre; B10 er histidin eller asparaginsyre; B28 er en hvilken som helst aminosyre, B29 er L-prolin; D-lysin, eller L-Lysin; Z er -0H; kjennetegnet ved A) kombinering av ekvimolare mengder S-sulfonert A-kjedepeptid med formel (I) og S-sulfonert B-kjede-peptid med formel (I) i en egnet buffer, tilsetning av et reduksjonsmiddel til blandingen slik at tiolsulfonerte cyteinresidier blir redusert til sulfhydrylcysteinresidier, oksydering av cystein-residiene til cysteinresidier, og isolering av den disulfid brodannede forbindelsen indikert i formel (I); eller B) kombinering av omtrent ekvimolare mengder av en forbindelse med formel (I) som mangler karboksylokta-peptidsekvensen begynnende ved B23 og et oktapeptid som har sekvensen Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-B28-B29-Thr, tilsetning av en egnet mengde av et proteolytisk enzym under betingelser som betydelig favoriserer revers proteolyse, og isolering av en forbindelse indikert i formel (I).

Hyperglycemi kan behandles ved administrering til en pasient en effektiv mengde av en insulinanalog med formel I. Farma-søytiske sammensetninger inneholdende en effektiv mengde av en insulinanalog med formel I i kombinasjon med en eller flere farmasøytisk akseptable hjelpestoffer kan videre bli fremstilt.

Formel I er en forkortet representasjon av aminosyresekvensen til insulinanalogene fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse. Aminosyreforkortelsene har følgende konvensjonelle betydninger:

B28 kan være en hvilken som helst naturlig eller ikke-naturlig oppstående aminosyre. Nevnte aminosyre er fortrinnsvis asparaginsyre, valin, leucin, isoleucin, norleucin, prolin, arginin, histidin, citrullin, ornitin, lysin, fenylalanin, alanin eller glycin. Av ovennevnte aminosyrer er en spesielt foretrukket undergruppe derav asparaginsyre, valin, leucin, isoleucin, norleucin, prolin, arginin, histidin, ornitin eller lysin. Lysin er den mest foretrukne aminosyren ved B28. B29 er fortrinnsvis L-prolin. En spesielt foretrukket insulinanalog ifølge foreliggende oppfinnelse er en hvori B28 er lysin og B29 er prolin, d.v.s. en ombytting av den native humane insulinaminosyre-sekvensen ved posi-sjonene 28 og 29 i B-kjeden.

Det er kjent for fagmannen at glutamin-residiene til insulinanalogene også kan være følsomme overfor deamidering og rearrangering og substitusjon med glutaminsyre kan forekomme.

Som nevnt ovenfor omfatter oppfinnelsen fremstilling av farmasøytisk akseptable salter av insulinanaloger. Foretrukne salter er salter av zink, natrium, kalium, magnesium eller kalsium.

Insulinanaloger fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse kan bli fremstilt ved de forskjellige peptidsyntese-teknikkene som omfatter klassiske (oppløsnings-) metoder, fast-fase metoder, semisyntetiske metoder og de nyere tilgjengelige rekombinante DNA-metodene.

I fast-fase teknikken blir aminosyre-sekvensen konstruert sekvensielt fra en opprinnelig, uoppløselig, harpiks-båret C-terminal aminosyre. Teknikker for fast-fase metoden er beskrevet av J. Stewart et al., "Solid-Phase Peptide Synthesis", Freeman and Co., San Francisco, 1969.

I fast-fase metoden blir aminosyren korresponderende med det C-terminale aminosyre-residiet til det ønskede peptidet koblet til en uoppløselig harpiksbærer, og peptidkjeden blir deretter dannet begynnende ved den harpiks-bårede C-terminale aminosyren. Individuelle aminosyrer blir sekvensielt innført helt til den ønskede aminosyre-sekvensen er tilveiebragt. Alternativt kan små peptidfragmenter bli fremstilt og ført inn i peptidkjeden i den ønskede rekkefølgen. Peptidkjeden forblir knyttet til harpikset ved syntesen, og når kjeden er fullført blir peptidet spaltet fra harpikset.

Peptidkjeden er koblet til polystyren-harpikset ved hjelp av en esterbinding dannet mellom karboksylgruppen til den C-terminale delen og en spesifikk metylengruppe tilstede på harpiks-matrisen som et sete for slik kobling.

Aminosyrene blir koblet ved anvendelse av velkjente teknikker for dannelse av peptidbindinger. En metode omfatter omdanning av aminosyren til et derivat som vil gjøre karboksylgruppen mer mottakelig for reaksjon med den frie N-terminale aminogruppen til peptidfragmentet. For eksempel kan aminosyren blir omdannet til et blandet anhydrid ved reaksjon av en beskyttet aminosyre med etylklorformat, fenylklorformat, sec-butylklorformat eller isobutylklorformat. Alternativt kan aminosyren bli omdannet til en aktiv ester så som en 2,4,5-triklorfenylester , en pentaklorfenylester , en p_-nitrofenyl-ester, en N-hydroksysuccinimidester eller en ester dannet fra 1-hydroksybenzotriazol.

En annen koblingsmetode omfatter anvendelse av et egnet koblingsmiddel, så som N,N'-dicykloheksylkarbodimid (DCC) eller N,N'-diisopropylkarbodiimid (DIC). Andre hensiktsmessige koblingsmidler er kjente for fagmannen. Se Schroder og Lubke, "The Peptides", Academic Press, 1965, kapittel III, som er inkorporert heri som referanse.

Det er å bemerke at a-aminogruppen til hver aminosyre som blir anvendt ved peptidsyntesen må bli beskyttet i løpet av koblingsreaksjonen for å forhindre sidereaksjoner omfattende den reaktive a-aminofunksjonen. Det er også å bemerke at visse aminosyrer inneholder reaktive side-kjede funksjonelle grupper (f.eks. sulfhydryl, e-amino, P-og y-karboksyl, imidazol, guanido og hydroksyl), og slike funksjonelle grupper må også bli beskyttet både i løpet av det opp-rinnelige og påfølgende koblingstrinn. Egnede beskyttende grupper er kjent innenfor fagområdet. Se for eksempel "Protective Groups In Organic Chemistry", M. McOmie, redaktør, Plenum Press, N.Y., 1973 og U.S. patent 4.617.149 som er inkorporert heri som referanse.

Ved valg av en spesiell beskyttende gruppe må visse betingelser vurderes. En a-amino beskyttende gruppe (1) må gjøre a-aminofunksjonen inert under betingelsene anvendt i koblingsreaksjonen, (2) må lett kunne fjernes etter koblingsreaksjonen under betingelser som ikke fjerner sidekjede beskyttende grupper og som ikke forandrer strukturen til peptidfragmentet og (3) må unngå muligheten av racemisering ved aktivering rett før koblingen. En sidekjede beskyttende gruppe (1) må gjøre sidekjedefunksjonelle gruppen inert under betingelsene anvendt i koblingsreaksjonen, (2) må være stabil under betingelsene anvendt for fjerning av a-amino beskyttende gruppen og (3) må lett kunne fjernes etter at den ønskede aminosyresekvensen er fullført under reaksjons-betingelser som ikke forandrer strukturen til peptidkjeden.

Det er innlysende for fagmannen at beskyttelsesgruppene som anvendes i peptidsyntesen har forskjellig reaktivitet i forhold til midlene anvendt for fjerning derav. For eksempel er visse beskyttelsesgrupper, så som trifenylmetyl og 2-(p_-bifenylyl)isopropyloksykarbonyl veldig labile og kan bli spaltet under svakt sure betingelser. Andre beskyttende grupper, så som t-butyloksykarbonyl, t-amyloksykarbonyl, adamantyloksykarbonyl og p-metoksybenzyloksykarbonyl er mindre labile og krever moderat sterke syrer, så som trifluoreddiksyre, saltsyre eller bortrifluorid i eddiksyre for fjerning av disse. Andre beskyttende grupper, så som benzyl-oksykarbonyl, halobenzyloksykarbonyl, p_-nitrobenzyloksy-karbonyl, cykloalkyloksykarbonyl og isopropyloksykarbonyl er endra mindre labile og krever sterkere syrer, så som hydrogenfluorid, hydrogenbromid eller bortrifluoracetat i trifluoreddiksyre, for fjerning av disse.

Etter at den ønskede peptidsekvensen er fullført må det beskyttede peptidet bli spaltet fra harpiksbæreren, og alle beskyttende grupper må bli fjernet. Spaltningsreaksjonen og fjerning av de beskyttende gruppene kan bli oppnådd samtidig eller trinnvis. Når harpiksbaereren er en klormetylert polystyren-harpiks er bindingen som kobler peptidet til harpiksen en esterbinding dannet mellom den frie karboksylgruppen til den C-terminale delen og en av de mange klor-metylgruppene tilstede på harpiksmatrisen. Det er å bemerke at forankringsbindingen kan bli spaltet av reagenser som kan bryte en esterbinding og penetrere harpiksmatrisen. En spesielt hensiktsmessig metode er ved behandling med flytende vannfritt hydrogenfluorid. Dette reagenset spalter peptidet fra harpikset og fjerner alle beskyttende grupper. Anvendelse av dette reagenset vil derfor direkte tilveiebringe helt avbeskyttet peptid. Når det er ønskelig å spalte peptidet uten fjerning av de beskyttende gruppene kan den beskyttede peptid-harpiksen undergå metanolyse for å tilveiebringe det beskyttede peptidet hvori den C-terminale karboksylgruppen er metylert. Metylester kan deretter bli hydrolysert under svake, alkaliske betingelser for å tilveiebringe fri C-terminal karboksyl. De beskyttende gruppene på peptidkjeden kan deretter bli fjernet ved behandling med en sterk syre, så som flytende hydrogenfluorid. En spesielt nyttig teknikk for metanolyse er den til G. Moore et al., "Peptides", Proe. 5. Amer. Pept. Symp., M. Goodman og J. Meienhofer, red., John Wiley, N.Y., 1977, s. 518-521, hvori den beskyttede peptid-harpiksen blir behandlet med metanol og kaliumcyanid i nærvær av kroneter.

En annen metode for spaltning av det beskyttede peptidet fra harpikset er ved ammonolyse eller ved behandling med hydrazin. Om ønskelig kan det resulterende C-terminale amidet eller hydrazidet bli hydrolysert til fri C-terminal karboksyl, og de beskyttende gruppene kan bli fjernet.

Den beskyttende gruppen på den N-terminale a-aminogruppen kan fortrinnsvis bli fjernet enten før eller samtidig med spaltningen av det beskyttede peptidet fra harpiksbaereren.

A og B kjedene til insulinanalogene fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse kan også bli fremstilt ved rekombinant DNA-metodologi. Ved fremstillingen blir en nukleotid-sekvens kodende for det ønskede peptidet til A eller B kjeden fremstilt ved anvendelse av rutinemessige teknikker for en slik syntese. Disse metodene omfatter generelt fremstilling av oligonukleotider som koder både for fragmenter av den ønskede kodende sekvensen og for den komplementære sekvensen derav. 01igonukleotidene er konstruert slik at de tilveiebringer overlapping av et fragment av den kodende sekvensen med to fragmenter av den komplementære sekvensen og omvendt. Oligonukleotider blir parret og spleiset. Dette danner den ønskede gensekvensen.

Sekvensen blir spleiset inn i en kloningsvektor i et sted som muliggjør at peptidproduktet som den koder for blir uttrykt. En egnet kloningsvektor inneholder minst en del av ekspre-sjonskontrollsekvensen til genet.

A og B kjedene til insulinanalogene ifølge foreliggende oppfinnelse kan også bli preparert via et proinsulin-lignende forløpermolekyl ved anvendelse av rekombinante DNA-teknikker. Se Frank et al., "Peptides: Synthesis-Structure-Function", Proe. Seventh Am. Pept. Symp. , red. D. Rich og E. Gross

(1981) som er inkorporert heri som referanse.

Trinnet som kombinerer de individuelle A og B kjedene kan oppnås ved hjelp av metoden til Chance et al., "Peptides: Synthesis, Structure and Function: Proe. of Seventh American Peptide Symposium" (1981) som er inkorporert heri som referanse.

Følgende eksempler er tilveiebragt for å illustrere foreliggende oppfinnelse.

Eksempel 1

Lvs( B28). Pro( B29) human Insulin

A. Preparering av rekombinant-avledet A-kjede

Human insulin A-kjede ble preparert via rekombinant DNA-teknologi fra kjemisk syntese av genet som koder for A-kjeden og ekspresjon derav i E. coli. Forklart i korte trekk, ble genet for A-kjeden syntetisert fra forskjellige trinukleo-tider inn i syntetiske fragmenter, deka-to pentadekanukleo-tider i lengde, ved en blokk-fosfotriestermetode. Genet har enkelt-trådede kohesive ender for Eco RI og Barn EI restrik-sjonsendonukleaser. Spleising av dette inn i en hensiktsmessig ekspresjonsvektor inneholdende p<->galaktosidasegenet (p<->gal) tilveiebringer et chimerisk plasmid med A-kjeden bundet til P-gal genet via et metioninkodon. Tryptofan-syntetasegenet (trp LE') blir fortrinnsvis anvendt som en promoter istedenfor P-gal genet for å oppnå høyere ekspre-sjonsnivåer. Det chimeriske plasmidet ble transformert inn i E. coli og resulterte i ekspresjon av et forløper-protein, d.v.s. p-gal-met-A-kjede (eller trp LE'-met-A-kjede når trp LE' promotersystemet blir anvendt). Behandling av forløper-proteinet med cyanogenbromid spaltet metionin-bindingen og tilveiebragte etter rensning human insulin A-kjede. Oksidativ sulfitolyse tilveiebragte den S-sulfonerte A-kjeden som ble anvendt for kombinering med B-kjeden (S-sulfonat) som beskrevet.

Den detaljerte beskrivelsen angående kjemisk syntese av genene for den humane insulin A-kjeden er beskrevet i Crea et al., "Proe. Nati. Acad. Sei." USA, 75, 5765-5769, 1978 og referanser sitert deri som er inkorporert heri som referanse. For fullstendige detaljer på ekspresjonen i E. coli av det kjemisk syntetiserte genet for human insulin A-kjeden se Goeddel et al., "Proe. Nati. Acad. Sei." USA, 76, 101-110, 1979 og referanser sitert deri er inkorporert heri som referanse.

B. Preparering av B-kjede analog [Lys(B28), Pro(B29)]

En Applied Biosystems 430A peptidsyntese-maskin (inkludert programvare 1.4) ble anvendt for å fremstille rå peptidylharpiks. 0,5 millimol (mMol) av fastfase harpiks (t-BOC-Thr(Bzl)0CH2 Pam harpiks) ble anvendt (.76 mMol/g x .658 g). Alle aminosyrene som ble anvendt ble BOC-beskyttet og, med unntagelse av glutaminsyre og histidin, ble direkte anvendt som mottatt (d.v.s. i beholdere fra Applied Biosystems, Inc., idet hver beholder inneholdt omtrent 2 mmol beskyttet aminosyre). Glutaminsyre og histidin ble tilveiebragt fra Peptides International Corporation og overført til beholdere .slik at hver beholder inneholdt omtrent 2 mmol av den ønskede beskyttede aminosyren. Etter tørking av råpeptidyl-harpiksen (under vakuum ved romtemperatur over natt) ble vekten bestemt og sammenlignet med utgangsvekten for å forsikre tilstrek-kelig vektøkning. En liten del av prøven ble utsatt for aminosyreanalyse for å forsikre at de ønskede aminosyrene ble tilsatt i riktige mengder.

Peptidet ble spaltet fra peptidyl-harpiksen og side-kjeden ble avbeskyttet ved omrøring i omtrent 1 time ved 0°C i en oppløsning bestående av 10 deler (v/w) HF (inneholdende 5$ v/v etylmerkaptan og 5% v/v m-kresol) til 1 del peptidylharpiks. Etter at det meste av HF ble fjernet ved vakuum ble peptidet presipitert i etyleter. Etter flere skyllinger med etyleter etterfulgt av vakuumfiltrering ble peptidet løst opp i omtrent 200 ml 7M deionisert urea inneholdende 0,IM TRIS, 0,1M Na2S03 og 0.01M Na2S406. Oppløsningen ble justert til pH 8,5 med 5N NaOH og omrørt over natt ved 4°C.

Den resulterende S-sulfonerte peptid-oppløsningen ble applisert på en Sephadex G-25 (Fine) 5 x 215 cm kolonne ved romtemperatur. Prøven ble eluert ved 20 ml/min ved romtemperatur ved anvendelse av 50 mM ammoniumbikarbonat. Eluatet ble registrert ved 276 nm. 20 ml fraksjoner ble samlet og en blanding av de ønskede fraksjonene dannet og ytterligere renset ved høytrykks-væskekromatografi (HPLC) som følger.

Blandingen av de ønskede fraksjonene ble pumpet på en 2,5 x 30 cm DuPont C8, 9-12p HPLC-kolonne og eluert ved anvendelse av en lineær gradient med økende acetonitril i 100 mM ammoniumbikarbonat ved romtemperatur (2,6 ml/min). Eluatet ble registrert ved 280 nm. 25 ml fraksjoner ble samlet. Analytiske HPLC-analyser ble utført på valgte fraksjoner for å bestemme hvilke fraksjoner som skulle bevares. De ønskede fraksjonene ble slått sammen og lyofilisert, og anvendt i følgende kombinasjon med A-kjeden fremstilt som beskrevet ovenfor.

C. Preparering av Lys(B28), Pro(B29) human insulin

Kombinasjon av A og B kjeden ble utført ved prosedyren til Chance et al., ovenfor. 700 mg rekombinant DNA-avledet A-kjede S-sulfonat og 140 mg syntetisk Lys(B28), Pro(B29) B-kjede S-sulfonat (begge tilveiebragt som beskrevet ovenfor) ble hver løst opp i 70 ml og 14 ml, respektivt, 0,1M glycinbuffer ved romtemperatur, hver justert til pH 10,5 med 5N NaOH og deretter avkjølt til 5°C. 6 ml ditiotreitol (DTT) oppløsning ved 10,5 mg/ml ble preparert i 0, IM glycinbuffer ved romtemperatur, justert til pH 10,5 med 5N NaOH og deretter avkjølt til 5°C.

A- og B-kjede-oppløsningene ble slått sammen og deretter ble 5,21 ml av DTT-oppløsningen hurtig tilsatt (SH/SSO3 = 0,90). Reaksjonsoppløsningen ble omrørt ved 5°C i en åpen 200 ml glass-sentrifugebeholder i 2,5 timer ved 5°C. 45 ml iseddiksyre ble tilsatt og oppløsningen ble latt stå ved 5°C over natt.

Den resulterende presipiterte blandingen ble sentrifugert i 20 minutter ved 2.000 rpm ved 5"C. Supernatanten ble kombinert med en IM eddiksyre-vask av pelleten og applisert på en 5 x 200 cm Sephadex G-50 (superfine) kolonne i molar eddiksyre ved 5°C og eluert ved tyngdekraften. Tyve-minutt fraksjoner ble samlet i tre dager. Fraksjonene ble undersøkt ved 276 nm og noen ved analytisk HPLC. Fraksjonene inneholdende Lys(B28), Pro(B29) sekvensen av insulinanalogen ble slått sammen og lyofilisert til en prøve på 125 mg. Denne prøven ble ytterligere renset ved revers-fase HPLC (ved anvendelse av en 2,12 x 25 cm DuPont C8 kolonne eluert ved romtemperatur, ved 2,6 ml/min, ved anvendelse av en lineær gradient med økende acetonitril i 0, IM NaHgPC^, pH 2,2). Eluatet ble registrert ved 276 nm. Valgte fraksjoner ble analysert ved analytisk HPLC. De ønskede fraksjonene ble slått sammen og ytterligere renset ved anvendelse av pH 7 HPLC som følger.

Blandingen fra lav pH HPLC prepareringen ble fortynnet omtrent 2 ganger i et isbad med 0,1M (NH^gHPC^. pH ble justert til 7 med kald 2N NaOH i isbad. Prøven ble applisert og eluert fra samme HPLC-kolonne ved anvendelse av de samme betingelsene som lav pH prepareringskjøringen med unntagelse av at elueringsbufferen var 0,1M, pH 7 (NH4 ^HPO^acetonitril.

Blandingen fra pH 7 HPLC preparative kjøringen ble avkjølt i et isbad og fortynnet to ganger med 0,1% vandig trifluoreddiksyre (TFA). IN HC1 ble tilsatt (avkjølt, prøve i isbad) for å senke pH til 3. Prøven ble applisert på en Vydac C4 eller, alternativt en DuPont C8 HPLC-kolonne (2,12 x 25 cm) og eluert med en lineær gradient av økende acetonitril i 0,1% vandig TFA. Eluatet ble registrert ved 214 nm eller 276 nm. De ønskede fraksjonene ble slått sammen og lyofilisert, og dette tilveiebragte en prøve på 41 mg av den ønskede analogen med større renhet enn 97 prosent ifølge revers-fase HPLC.

Eksempel 2

Lvs( B28). Pro( B29) human insulin

En annen metode for preparering av Lys(B28), Pro(B29) human insulin anvender enzymatisk semisyntese (revers proteolyse) for å kombinere des-oktapeptid insulin (& 1- 21 ~ Bi-22) med et syntetisk oktapeptid. Des-oktapeptid insulin ble tilveiebragt fra en tryptisk spaltning av naturlig grise- eller human insulin som beskrevet av Bromer og Chance, "Preparation and Characterization of Des-octapeptide-Insulin", Biochim. Biophys. Acta, 133:219-223 (1967) som er inkorporert heri ved referanse. Det syntetiske oktapeptidet Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Lys-Pro-Thr ble fremstilt ved automatisk fast-fase syntese som beskrevet ovenfor.

Des-oktapeptid insulin (435 mg) og 465 mg syntetisk Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Lys-Pro-Thr ble kombinert i 15 ml av en oppløs-ning inneholdende 1 del dimetylsulfoksid, 2 deler 1,4-butandiol og 1 del 0,25M tris acetatbuffer pE 7,3. Peptidene ble fullstendig løst opp ved oppvarming av oppløsningen på en varmeplate. Oppløsningen ble deretter inkubert ved 37°C og 90 mg grisetrypsin ble tilsatt. Oppløsningen ble omrørt leilighetsvis i 90 minutter ved 37°C. Reaksjonen ble stoppet ved kombinering av oppløsningen med 135 ml 0,05N EC1.

Tittel-insulinanalogen ble renset ved applisering av den surgjorte oppløsningen inneholdende analogen på en 2,5 x 25 cm C-8 Zorbax EPLC kolonne og eluering av denne med en lineær gradient av økende acetonitril i 0,1M natrium monobasisk fosfat pE 2,2 buffer. Eluatet ble registrert ved 276 nm. De ønskede fraksjonene ble slått sammen, fortynnet to ganger med vann og applisert på en 1 x 25 cm C-8 Ultrasphere EPLC-kolonne. Analogen ble eluert med en lineær gradient av økende acetonitril i 0,5% vandig TFA. Eluatet ble registrert ved 276 nm. De ønskede fraksjonene ble igjen slått sammen og lyofilisert for å tilveiebringe 125 mg av den rensede analogen. Strukturen ble verifisert ved aminosyre-analyse (tabell I) og massespektroskopi (MS).

MS: 5809,2 (teoretisk: 5808,7).

"Fast Atom Bombardement" - massespektroskopi-analyser tilveiebragt heri ble bestemt ved anvendelse av et VG-ZAB-25E

dobbeltfokuserende massespektrometer ved en resolusjon på omtrent 1.500. Human insulinanalogene ble løst opp i en blanding av glycerol og tioglycerol inneholdende oxalsyre. Cesiumiodid ble anvendt for å kalibrere instrumentet som ble scannet magnetisk fra m/z 5.300 til m/z 6.500. De resulterende data er presentert som gjennomsnittlig masse + 1.

Eksempel 3

Aba( B28). Pro( B29) human insulin

Grise des-oktapeptid-insulin (384 mg) og syntetisk oktapeptid Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Aba-Pro-Thr (362 mg) ble slått sammen i 13 ml av en oppløsning inneholdende en del dimetylsulfoksid, to deler 1,4-butandiol og en del 0.25M tris pH 7,3 buffer ved 37°C. Grisetrypsin (75 mg) ble tilsatt. Oppløsningen ble grundig blandet og omrørt i 120 min. ved 37°C.

Reaksjonen ble deretter stoppet ved tilsetning av blandingen til 137 ml 0.05N HC1. Hele oppløsningen ble pumpet på en 21 x 250 mm C-8 Zorbax-kolonne, og produktene ble eluert i en grunn acetonitrilgradient i 0,1 M natrium-monobasisk fosfat, pH 2 buffer.

Hensiktsmessige fraksjoner, bestemt ved analytisk HPLC, ble slått sammen, fortynnet to ganger med vann og pumpet på en 25 x 300 mm C-18 Vydac-kolonne. Det avsaltede proteinet ble eluert fra kolonnen med en acetonitrilgradient i 0,5% trifluoreddiksyre. Fraksjonene inneholdende den rensede insulinanalogen ble slått sammen og lyofilisert til 59 mg. Strukturen ble verifisert ved aminosyreanalyse (tabell I) og massespektroskopi (MS).

MS: 5765,7 (teoretisk: 5765,6).

Eksempel 4

Ala( B28). Pro( B29) human insulin

Grise des-oktapeptidinsulin (290 mg) og syntetisk oktapeptid Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Ala-Pro-Thr (310 mg) ble kombinert i 10 ml av en oppløsning inneholdende en del dimetylsulfoksid, to deler 1,4-butandiol og en del 0.25M tris pH 7,3 buffer ved 37°C. Grisetrypsin (60 mg) ble tilsatt. Oppløsningen ble blandet godt og omrørt av og til i 60 min. ved 37°C.

Reaksjonen ble på denne tiden stoppet ved tilsetning av blandingen til 90 ml 0,05N HC1. Hele oppløsningen ble pumpet på en 21 x 250 mm C-8 Zorbax-kolonne, og produktene ble eluert i en grunn acetonitrilgradient i 0,1 M natrium monobasisk fosfatbuffer pH 2.

De hensiktsmessige fraksjonene, bestemt ved analytisk HPLC, ble slått sammen, fortynnet to ganger med vann, og pumpet på en 10 x 250 mm C-8 TJltrasphere-kolonne. Avsaltet protein ble eluert fra kolonnen med en acetonitrilgradient i 0,5% trifluoreddiksyre. Fraksjonene inneholdende den rensede insulinanalogen ble slått sammen og lyofilisert til 43 mg. Strukturen ble verifisert ved aminosyreanalyse (tabell I) og massespektroskopi (MS).

MS: 5752,3 (teoretisk: 5751,6).

Eksempel 5

Arg( B28). Pro( B29) human insulin

Grise des-oktapeptidinsulin (290 mg) og syntetisk oktapeptid Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Arg-Pro-Thr (310 mg) ble kombinert i 10 ml av en oppløsning inneholdende en del dimetylsulfoksid, to deler 1,4-butandiol og en del 0,25M tris pH 7,3 buffer ved 37°C. Grisetrypsin (60 mg) ble tilsatt. Oppløsningen ble godt blandet og av og til omrørt i 60 min. ved 37°C.

Reaksjonen ble deretter stoppet ved tilsetning av blandingen til 90 ml 0,05N HC1. Hele oppløsningen ble pumpet på en 21 x 250 mm C-8 Zorbax-kolonne, og produktene ble eluert i en grunn acetonitrilgradient i 0,1 M natrium monobasisk fosfatbuffer pH 2.

Hensiktsmessige fraksjoner, bestemt ved analytisk HPLC, ble slått sammen, fortynnet to ganger med vann, og pumpet på en 10 x 250 mm C-8 Ultrasphere-kolonne. Det avsaltede proteinet ble eluert fra kolonnen med en acetonitrilgradient i 0,5% trifluoreddiksyre. Fraksjonene inneholdende den rensede insulinanalogen ble slått sammen og lyofilisert for å tilveiebringe 103 mg. Strukturen ble verifisert ved aminosyreanalyse (tabell I) og massespektroskopi (MS).

MS: 5836,1 (teoretisk: 5836,7).

Eksempel 6

Asn( B28). Pro( B29) human insulin

Grise des-oktapeptidinsulin (409 mg) og syntetisk oktapeptid Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Asn-Pro-Thr (398 mg) ble slått sammen i 14 ml av en oppløsning inneholdende en del dimetylsulfoksid, to deler 1,4-butandiol og en del 0,25M tris pH 7,3 buffer ved 37°C. Grisetrypsin (81 mg) ble tilsatt. Oppløsningen ble blandet grundig og omrørt av og til i 120 min. ved 37°C. Reaksjonen ble nå stoppet ved tilsetning av blandingen til 136 ml 0,05N HC1. Hele oppløsningen ble pumpet på en 21 x 250 mm C-8 Zorbax-kolonne, og produktene ble eluert i en grunn acetonitrilgradient i 0,1 M natrium monobasisk fosfatbuffer pH 2.

Hensiktsmessige fraksjoner, bestemt ved analytisk HPLC, ble slått sammen, fortynnet to ganger med vann og pumpet på en 25 x 300 mm C-18 Vydac-kolonne. Avsaltet protein ble eluert fra kolonnen med en acetonitrilgradient i 0,5% trifluoreddiksyre. Fraksjonene inneholdende den rensede insulinanalogen ble slått sammen og lyofilisert til 56 mg. Strukturen ble verifisert ved aminosyreanalyse (tabell I) og massespektroskopi (MS).

MS: 5794,7 (teoretisk: 5794,6).

Eksempel 7

Asp( B28) Pro( B29) human insulin

Grise des-oktapeptidinsulin (400 mg) og syntetisk oktapeptid Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Asp-Pro-Thr (388 mg) ble slått sammen i 13 ml av en oppløsning inneholdende en del dimetylsulfoksid, to deler 1,4-butandiol og en del 0,25M tris pH 7,3 buffer ved 37° C. Grisetrypsin (78 mg) ble tilsatt. Oppløsningen ble grundig blandet og av og til omrørt i 120 min. ved 37°C.

Reaksjonen ble deretter stoppet ved tilsetning av blandingen til 137 ml 0.05N HC1. Hele oppløsningen ble pumpet på en 21 x 250 mm C-8 Zorbax-kolonne, og produktene ble eluert i en grunn acetonitrilgradient i 0,1 M natrium monobasisk fosfatbuffer pH 2.

Hensiktsmessige fraksjoner, bestemt ved analytisk HPLC, ble slått sammen, fortynnet fire ganger med vann og pumpet på en 25 x 300 mm C-18 Vydac-kolonne. Avsaltet protein ble eluert fra kolonnen med en acetonitrilgradient i 0,1% trifluoreddiksyre. Fraksjonene inneholdende den rensede insulinanalogen ble slått sammen og lyofilisert til 85 mg. Strukturen ble verifisert ved aminosyreanalyse (tabell I) og massespektroskopi (MS).

MS: 5795,7 (teoretisk: 5795,6).

Eksempel 8

Asp( BlO). Lys( B28). Pro( B29) human insulin

A. Preparering av Asp(BlO), Lys(B28), Pro(B29) human insulin

B-kjede.

En Applied Biosystems 430A peptidsyntese-maskin (inkludert "software revision" 1,4) ble anvendt for å preparere en rå peptidylharpiks. 0,5 millimol (mMol) av fastfase harpiksen (t-BOC-Thr(Bzl)0CH2 Pam harpiks) ble anvendt (.72 mMol/g x

.705 g). Alle anvendte aminosyrene ble BOC-beskyttet og, med unntagelse av glutaminsyre, asparaginsyre og histidin, ble alle direkte anvendt som mottatt (d.v.s. i beholdere fra Applied Biosystems, Inc.; idet hver beholder inneholdt omtrent 2 mmol beskyttet aminosyre). Glutaminsyre, asparaginsyre og histidin ble tilveiebragt kommersielt og overført til beholdere slik at hver beholder omtrent inneholdt 2 mmol av den ønskede beskyttede aminosyren. Rå peptidylharpiksen ble

tørket under vakuum ved romtemperatur over natt og dens vekt sammenlignet med utgangsvekten for å forsikre akseptabel vektøkning. En liten del av prøven ble utsatt for aminosyre-analyse for å forsikre at de ønskede aminosyrene ble tilsatt i riktige proporsjoner.

Peptidet ble spaltet fra peptidylharpiksen og sidekjeden ble avbeskyttet ved omrøring i omtrent 1 time ved 0°C i en oppløsning bestående av 10 deler (v/w) HF (inneholdende 5% v/v p_-tiocresol og 5% v/v m-cresol) til 1 del peptidylharpiks. Etter fjerning av det meste av HF ved vakuum ble peptidet presipitert i etyleter. Etter flere skyllinger med etyleter etterfulgt av vakuumfiltrering, ble peptidet løst opp i omtrent 120 ml 8M guanidin HC1 pH 11, inneholdende 0,1M TRIS, 35 mg/ml NagSC^ og 25 mg/ml Na2S4<0>^. Oppløsningen ble justert til pH 8,8 med 5N NaOH og omfattende omrørt i 3 timer ved romtemperatur.

Den resulterende S-sulfonerte peptidoppløsningen ble applisert på en 5 x 215 cm Sephadex G-25 (medium) kolonne ved romtemperatur. Prøven ble eluert ved 21 ml/min. ved romtemperatur ved anvendelse av 50 mM ammoniumbikarbonat. Eluatet ble registrert ved 276 nm. Fraksjoner på hver 25 ml ble slått sammen, og en blanding av de ønskede fraksjonene ble ytterligere renset ved høy ytelse væskekromatografi (HPLC) som følger.

Blandingen av de ønskede fraksjonene ble pumpet på en 2,5 x 30 cm DuPont C8, 9-12jj HPLC-kolonne og eluert ved anvendelse av en lineær gradient av økende acetonitril i 100 mM ammoniumbikarbonat ved romtemperatur (2,6 ml/min.). Eluatet ble registrert ved 280 nm. Fraksjoner (25 ml hver) ble samlet. Analytiske HPLC-analyser ble utført på utvalgte fraksjoner for å bestemme hvilke som skulle beholdes. De ønskede fraksjonene ble slått sammen og lyofilisert og anvendt i følgende kombinasjon med A-kjeden.

B. Kombinasjon av Asp(BlO), Lys(B28), Pro(B29) human insulin

B-kjede med human insulin A-kjede.

Kombinasjonen av A og B kjedene ble tilveiebragt ved prosedyren til Chance et al., ovenfor. To g rekombinant DNA-avledet A-kjede S-sulfonat og 400 mg syntetisk Asp(BlO), Lys(B28), Pro(B29) B-kjede S-sulfonat ble hver løst opp i 200 ml og 40 ml, respektivt, 0,1M glycinbuffer ved romtemperatur, hver justert til pH 10,5 med 5N NaOH og deretter avkjølt til 5°C. En ditiotreitol (DTT) oppløsning ved 15,5 mg/ml ble preparert i 0,1M glycinbuffer ved romtemperatur, justert til pH 10,5 med 5N NaOH og deretter avkjølt til 5°C.

A- og B-kjede oppløsningene ble kombinert og deretter ble 15,9 ml av DTT-oppløsningen hurtig tilsatt (SH/SS03" = 1,0). Reaksjonsoppløsningen ble omrørt ved 4°C i en åpen 200 ml glass-sentrifugeflaske i 19,6 timer ved 4°C. Iseddiksyre (129 ml) ble tilsatt, og oppløsningen ble latt stå ved 4°C i en time.

Den resulterende utfelte blandingen ble sentrifugert i 30 minutter ved 2.000 rpm ved 4°C. Supernatanten ble kombinert med 292 ml milli-Q vann og 73 ml acetonitril og ytterligere renset ved revers-fase HPLC (ved anvendelse av en 2,5 x 30 cm Vydac C18 kolonne eluert ved romtemperatur ved 2,6 ml/min., ved anvendelse av en lineær gradient av økende acetonitril i 0.1M NaH2P04, pH 2,1). Eluatet ble registrert ved 280 nm. Valgte fraksjoner ble analysert ved analytisk HPLC og de ønskede fraksjonene ble slått sammen og fortynnet to ganger med 0,1% vandig trifluoreddiksyre (TFA), og deretter applisert på en Ultrasphere oktyl HPLC-kolonne (1,0 x 25 cm) og eluert med en lineær gradient av økende acetonitril i 0,1% vandig TFA. Eluatet ble registrert ved 280 nm. Valgte fraksjoner ble analysert ved analytisk HPLC og de ønskede fraksjonene ble slått sammen og på ny renset ved anvendelse av samme kolonne og betingelser som ovenfor med en noe annerledes gradient av acetonitril. Hensiktsmessige fraksjoner ble slått sammen og lyofilisert med et utbytte på 65 mg av insul inanalogen med mere enn 93% renhet ifølge revers-fase HPLC. Strukturen ble verifisert ved aminosyre-analyse (tabell I) og massespektroskopi (MS).

MS: 5786,1 (teoretisk: 5786,7).

Eksempel 9

Cva( B28). Pro( B29) human insulin

Permaursyre-oksidasjon ble utført for å omdanne cysteinet i oktapeptidet til cysteinsyreformen. Det syntetiske oktapeptidet Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Cys-Pro-Thr (363 mg) ble løst opp i 36 ml nylaget permaursyre i en isavkjølt flaske, og omrørt forsiktig i en time. Det oksiderte materialet ble fortynnet ti ganger med vann og lyofilisert. Lyofilisatet ble anvendt i semisyntesen.

Grise des-oktapeptidinsulin (222 mg) og syntetisk oktapeptid Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Cya-Pro-Thr (225 mg) ble kombinert i 18 ml av en oppløsning inneholdende en del dimetylsulfoksid, to deler 1,4-butandiol og en del 0.25M tris pH 7,3 buffer ved 37°C. Grisetrypsin (45 mg) ble tilsatt. Oppløsningen ble blandet godt og omrørt av og til i 120 min. ved 37°C.

Reaksjonen ble nå stoppet ved tilsetning av blandingen til 242 ml 0.05N HC1. Hele oppløsningen ble pumpet på en 21 x 250 mm C-8 Zorbax-kolonne, og produktene ble eluert i en grunn acetonitrilgradient i 0,1 M natrium monobasisk fosfatbuffer pH 2.

Hensiktsmessige fraksjoner, bestemt ved analytisk HPLC, ble slått sammen, fortynnet to ganger med vann, og pumpet på en 25 x 300 mm C-18 Vydac-kolonne. Avsaltet protein ble eluert fra kolonnen med en acetonitrilgradient i 0,5% trifluoreddiksyre. Fraksjonene inneholdende den rensede insulinanalogen ble slått sammen og lyofilisert til 16 mg. Strukturen ble verifisert ved aminosyreanalyse (tabell I) og massespektroskopi (MS).

MS: 5831,5 (teoretisk: 5831,7).

Eksempel 10

Gln( B28). Pro( B29) human insulin

Grise des-oktapeptidinsulin (290 mg) og syntetisk oktapeptid Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Gln-Pro-Thr (310 mg) ble kombinert i 10 ml av en oppløsning inneholdende en del dimetylsulfoksid, to deler 1,4-butandiol og en del 0.25M tris pE 7,3 buffer ved 37°C. Svinetrypsin (60 mg) ble tilsatt. Oppløsningen ble blandet godt og av og til omrørt i 60 min. ved 37°C.

Reaksjonen ble deretter stoppet ved tilsetning av blandingen til 90 ml 0.05N EC1. Eele oppløsningen ble pumpet på en 21 x 250 mm C-8 Zorbax-kolonne, og produktene ble eluert i en grunn acetonitrilgradient i 0,1 M natrium monobasisk fosfatbuffer pE 2.

Eensiktsmessige fraksjoner, bestemt ved analytisk EPLC, ble slått sammen, fortynnet to ganger med vann og pumpet på en 10 x 250 mm C-8 Ultrasphere kolonne. Avsaltet protein ble eluert fra kolonnen med en acetonitrilgradient i 0,5% trifluoreddiksyre. Fraksjoner inneholdende den rensede insulinanalogen ble slått sammen og lyofilisert til 87 mg. Strukturen ble verifisert ved aminosyreanalyse (tabell I) og massespektroskopi (MS).

MS: 5809,4 (teoretisk: 5808,6).

Eksempel 11

Glu( B28). Pro( B29) human insulin

Grise des-oktapeptidinsulin (402 mg) og syntetisk oktapeptid Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Glu-Pro-Thr (398 mg) ble kombinert i 14 ml av en oppløsning inneholdende en del dimetylsulfoksid, to deler 1,4-butandiol og en del 0,25M tris pE 7,3 buffer ved 37° C. Grisetrypsin (80 mg) ble tilsatt. Oppløsningen ble blandet godt og omrørt iblant i 120 min. ved 37°C. Reaksjonen ble deretter stoppet ved tilsetning av blandingen til 136 ml 0,05N HC1. Hele oppløsningen ble pumpet på en 21 x 250 mm C-8 Zorbax-kolonne, og produktene ble eluert i en grunn acetonitrilgradient i 0,1 M natrium monobasisk fosfatbuffer pE 2.

Eensiktsmessige fraksjoner, bestemt ved analytisk EPLC, ble slått sammen, fortynnet fire ganger med vann, og pumpet på en 25 x 300 mm C-18 Vydac-kolonne. Avsaltet protein ble eluert fra kolonnen med en acetonitrilgradient i 0,5% trifluoreddiksyre. Fraksjoner inneholdende den rensede insulinanalogen ble slått sammen og lyofilisert til 59 mg. Strukturen ble verifisert ved aminosyreanalyse (tabell I) og massespektroskopi (MS).

MS: 5809,6 (teoretisk: 5809,6).

Eksempel 12

Glv( B28). Pro( B29) human insulin

Grise des-oktapeptidinsulin (412 mg) og syntetisk oktapeptid Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Gly-Pro-Thr (376 mg) ble kombinert i 13 ml av en oppløsning inneholdende en del dimetylsulfoksid, to deler 1,4-butandiol og en del 0,25M tris pH 7,3 buffer ved 37°C. Grisetrypsin (79 mg) ble tilsatt. Oppløsningen ble omfattende blandet og omrørt av og til i 180 min. ved 37°C.

Reaksjonen ble deretter stoppet ved tilsetning av blandingen til 147 ml 0,05N EC1. Eele oppløsningen ble pumpet på en 21 x 250 mm C-8 Zorbax-kolonne, og produktene ble eluert i en grunn acetonitrilgradient i 0,1 M natrium monobasisk fosfatbuffer pE 2.

Eensiktsmessige fraksjoner, bestemt ved analytisk EPLC, ble slått sammen, fortynnet fire ganger med vann, og pumpet på en 25 x 300 mm C-18 Vydac-kolonne. Avsaltet protein ble eluert fra kolonnen med en acetonitrilgradient i 0,1% trifluoreddiksyre. Fraksjoner inneholdende den rensede insulinanalogen ble slått sammen og lyofilisert til 11 mg. Strukturen ble verifisert ved aminosyreanalyse (tabell I) og massespektroskopi (MS).

MS: 5737,2 (teoretisk: 5737,6).

Eksempel 13

His( B28), Pro( 29) human insulin

Grise des-oktapeptidinsulin (400 mg) og syntetisk oktapeptid Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-His-Pro-Thr (398 mg) ble kombinert i 13 ml av en oppløsning inneholdende en del dimetylsulfoksid, to deler 1,4-butandiol og en del 0,25M tris pE 7,3 buffer ved 37°C. Grisetrypsin (79 mg) ble tilsatt. Oppløsningen ble blandet godt og omrørt av og til i 120 min. ved 37°C.

Reaksjonen ble deretter stoppet ved tilsetning av blandingen til 237 ml 0,05N EC1. Eele oppløsningen ble pumpet på en 21 x 250 mm C-8 Zorbax-kolonne, og produktene ble eluert i en grunn acetonitrilgradient i 0,1 M natrium monobasisk fosfatbuffer pE 2.

Eensiktsmessige fraksjoner, bestemt ved analytisk EPLC, ble slått sammen, fortynnet fire ganger med vann, og pumpet på en 25 x 300 mm C-18 Vydac-kolonne. Avsaltet protein ble eluert fra kolonnen med en acetonitrilgradient i 0,1% trifluoreddiksyre. Fraksjoner inneholdende den rensede insulinanalogen ble slått sammen og lyofilisert til 79 mg. Strukturen ble verifisert ved aminosyreanalyse (tabell I) og massespektroskopi (MS).

MS: 5816,9 (teoretisk: 5817,7).

Eksempel 14

Ile( B28). Pro( B29) human insulin

Grise des-oktapeptidinsulin (409 mg) og syntetisk oktapeptid Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Ile-Pro-Thr (398 mg) ble kombinert i 13 ml av en oppløsning inneholdende en del dimetylsulfoksid, to deler 1,4-butandiol og en del 0,25M tris pE 7,3 buffer ved 37°C. Grisetrypsin (81 mg) ble tilsatt. Oppløsningen ble blandet godt og omrørt av og til i 120 min. ved 37°C. Reaksjonen ble deretter stoppet ved tilsetning av blandingen til 136 ml 0,05N HC1. Hele oppløsningen ble pumpet på en 21 x 250 mm C-8 Zorbax-kolonne, og produktene ble eluert i en grunn acetonitrilgradient i 0,1 M natrium monobasisk fosfatbuffer pH 2.

Hensiktsmessige fraksjoner, bestemt ved analytisk HPLC, ble slått sammen, fortynnet to ganger med vann, og pumpet på en 25 x 300 mm C-18 Vydac-kolonne. Avsaltet protein ble eluert fra kolonnen med en acetonitrilgradient i 0,5% trifluoreddiksyre. Fraksjoner inneholdende den rensede insulinanalogen ble slått sammen og lyofilisert til 57 mg. Strukturen ble verifisert ved aminosyreanalyse (tabell I) og massespektroskopi (MS).

MS: 5793,7 (teoretisk: 5793,7).

Eksempel 15

Leu( B28). Pro( B29) human insulin

Grise des-oktapeptidinsulin (418 mg) og syntetisk oktapeptid Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Leu-Pro-Thr (410 mg) ble kombinert i 14 ml av en oppløsning inneholdende en del dimetylsulfoksid, to deler 1,4-butandiol og en del 0,25M tris pH 7,3 buffer ved 37°C. Grisetrypsin (83 mg) ble tilsatt. Oppløsningen ble blandet godt og omrørt av og til i 120 min. ved 37°C.

Reaksjonen ble deretter stoppet ved tilsetning av blandingen til 136 ml 0,05N HC1. Hele oppløsningen ble pumpet på en 21 x 250 mm C-8 Zorbax-kolonne, og produktene ble eluert i en grunn acetonitrilgradient i 0,1 M natrium monobasisk fosfatbuffer pH 2.

Hensiktsmessige fraksjoner, bestemt ved analytisk HPLC, ble slått sammen, fortynnet to ganger med vann, og pumpet på en 25 x 300 mm C-18 Vydac-kolonne. Avsaltet protein ble eluert fra kolonnen med en acetonitrilgradient i 0,5% trifluoreddiksyre. Fraksjoner inneholdende den rensede insulinanalogen ble slått sammen og lyofilisert til 74 mg. Strukturen ble verifisert ved aminosyreanalyse (tabell I) , og massespektroskopi (MS).

MS: 5793,8 (teoretisk: 5793,7).

Eksempel 16

Nle( B28). Pro( B29) human insulin

Grise des-oktapeptidinsulin (290 mg) og syntetisk oktapeptid Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Nle-Pro-Thr (310 mg) ble kombinert i 10 ml av en oppløsning inneholdende en del dimetylsulfoksid, to deler 1,4-butandiol og en del 0,25M tris pH 7,3 buffer ved 37°C. Grisetrypsin (60 mg) ble tilsatt. Oppløsningen ble blandet godt og omrørt av og til i 60 min. ved 37°C.

Reaksjonen ble deretter stoppet ved tilsetning av blandingen til 90 ml 0.05N HC1. Hele oppløsningen ble pumpet på en 21 x 250 mm C-8 Zorbax-kolonne, og produktene ble eluert i en grunn acetonitrilgradient i 0,1 M natrium monobasisk fosfatbuffer pH 2.

Hensiktsmessige fraksjoner, bestemt ved analytisk HPLC, ble slått sammen, fortynnet to ganger med vann, og pumpet på en 10 x 250 mm C-8 Ultrasphere-kolonne. Avsaltet protein ble eluert fra kolonnen med en acetonitrilgradient i 0,5% trifluoreddiksyre. Fraksjoner inneholdende den rensede insulinanalogen ble slått sammen og lyofilisert til 54 mg. Strukturen ble verifisert ved aminosyreanalyse (tabell I) og massespektroskopi (MS).

MS: 5794,6 (teoretisk: 5793,7).

Eksempel 17

D- Lvs( B29) human insulin

Grise des-oktapeptidinsulin (392 mg) og syntetisk oktapeptid Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-D-Lys-Thr (387 mg) ble kombinert i 13,5 ml av en oppløsning inneholdende en del dimetylsulfoksid, to deler 1,4-butandiol og en del 0,25M tris pH 7,3 buffer ved 37°C. Grisetrypsin (78 mg) ble tilsatt. Oppløs-ningen ble blandet godt og omrørt av og til i 120 min. ved 37°C.

Reaksjonen ble deretter stoppet ved tilsetning av blandingen til 136,5 ml 0.05N HC1. Hele oppløsningen ble pumpet på en 21 x 250 mm C-8 Zorbax-kolonne, og produktene ble eluert i en grunn acetonitrilgradient i 0,1 M natrium monobasisk fosfatbuffer pH 2.

Hensiktsmessige fraksjoner, bestemt ved analytisk HPLC, ble slått sammen, fortynnet fire ganger med vann, og pumpet på en 25 x 300 mm C-18 Vydac-kolonne. Avsaltet protein ble eluert fra kolonnen med en acetonitrilgradient i 0,5% trifluoreddiksyre. Fraksjoner inneholdende den rensede insulinanalogen ble slått sammen og lyofilisert til 94 mg. Strukturen ble verifisert ved aminosyreanalyse (tabell I) og massespektroskopi (MS).

MS: 5809,0 (teoretisk: 5808,7).

Eksempel 18

Met( B28). Pro( B29) human insulin

Grise des-oktapeptidinsulin (350 mg) og syntetisk oktapeptid Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Met-Pro-Thr (366 mg) ble kombinert i 12 ml av en oppløsning inneholdende en del dimetylsulfoksid, to deler 1,4-butandiol og en del 0,25M tris pH 7,3 buffer ved 37°C. Grisetrypsin (71 mg) ble tilsatt. Oppløsningen ble blandet omhyggelig og omrørt av og til i 120 min. ved 37°C.

Reaksjonen ble deretter stoppet ved tilsetning av blandingen til 118 ml 0.05N HC1. Hele oppløsningen ble pumpet på en 21 x 250 mm C-8 Zorbax-kolonne, og produktene ble eluert i en grunn acetonitrilgradient i 0,1 M natrium monobasisk fosfatbuffer pH 2.

Hensiktsmessige fraksjoner, bestemt ved analytisk HPLC, ble slått sammen, fortynnet fire ganger med vann, og pumpet på en 25 x 300 mm C-18 Vydac-kolonne. Avsaltet protein ble eluert fra kolonnen med en acetonitrilgradient i 0,1% trifluoreddiksyre. Fraksjoner inneholdende den rensede insulinanalogen ble slått sammen og lyofilisert til 72 mg. Strukturen ble verifisert ved aminosyreanalyse (tabell I) og massespektroskopi (MS).

MS: 5811,8 (teoretisk: 5811,7).

Eksempel 19

0rn( B28). Pro( B29) human insulin

Grise des-oktapeptidinsulin (290 mg) og syntetisk oktapeptid Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Orn-Pro-Thr (310 mg) ble kombinert i 10 ml av en oppløsning inneholdende en del dimetylsulfoksid, to deler 1,4-butandiol og en del 0,25M tris pH 7,3 buffer ved 37°C. Grisetrypsin (60 mg) ble tilsatt. Oppløsningen ble blandet omhyggelig og omrørt av og til i 90 min. ved 37°C.

Hensiktsmessige fraksjoner, bestemt ved analytisk HPLC, ble slått sammen, fortynnet to ganger med vann, og pumpet på en 10 x 250 mm C-8 Ultrasphere-kolonne. Avsaltet protein ble eluert fra kolonnen med en acetonitrilgradient i 0,5% trifluoreddiksyre. Fraksjoner inneholdende den rensede insulinanalogen ble slått sammen og lyofilisert til 89 mg. Strukturen ble verifisert ved aminosyreanalyse (tabell I) og massespektroskopi (MS).

MS: 5795,2 (teoretisk: 5794,7).

Eksempel 20

Phe( B28). Pro( B29) human insulin

Grise des-oktapeptidinsulin (290 mg) og syntetisk oktapeptid Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Phe-Pro-Thr (310 mg) ble kombinert i 10 ml av en oppløsning inneholdende en del dimetylsulfoksid, to deler 1,4-butandiol og en del 0,25M tris pH 7,3 buffer ved 37°C. Grisetrypsin (60 mg) ble tilsatt. Oppløsningen ble blandet godt og omrørt av og til i 80 min. ved 37°C.

Hensiktsmessige fraksjoner, bestemt ved analytisk HPLC, ble slått sammen, fortynnet fire ganger med vann, og pumpet på en 25 x 300 mm C-18 Vydac-kolonne. Avsaltet protein ble eluert fra kolonnen med en acetonitrilgradient i 0,1% trifluoreddiksyre. Fraksjoner inneholdende den rensede insulinanalogen ble slått sammen og lyofilisert til 17 mg. Strukturen ble verifisert ved aminosyreanalyse (tabell I) og massespektroskopi (MS).

MS: 5827,9 (teoretisk: 5827,7).

Eksempel 21

Pro( B29) human insulin

Grise des-oktapeptidinsulin (339 mg) og syntetisk oktapeptid Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Pro-Thr (363 mg) ble kombinert i 9 ml av en oppløsning inneholdende en del dimetylsulfoksid, to deler 1,4-butandiol og en del 0,25M tris pH 7,3 buffer ved 37°C. Grisetrypsin (70 mg) ble tilsatt. Oppløsningen ble blandet godt og omrørt av og til i 80 min. ved 37°C.

Reaksjonen ble deretter stoppet ved tilsetning av blandingen til 108 ml 0.05N HC1. Hele oppløsningen ble pumpet på en 10 x 250 mm C-8 Zorbax-kolonne, og produktene ble eluert i en grunn acetonitrilgradient i 0,1 M natrium monobasisk fosfatbuffer pH 2.

Hensiktsmessige fraksjoner, bestemt ved analytisk HPLC, ble slått sammen, fortynnet to ganger med vann, og pumpet på en 10 x 250 mm C-8 Ultrasphere-kolonne. Avsaltet protein ble eluert fra kolonnen med en acetonitrilgradient i 0,5% trifluoreddiksyre. Fraksjoner inneholdende den rensede insulinanalogen ble slått sammen og lyofilisert til 97 mg. Strukturen ble verifisert ved aminosyreanalyse (tabell I) og massespektroskopi (MS).

MS: 5778,6 (teoretisk: 5777,6).

Eksempel 22

Ser( B28), Pro( B29) human insulin

Grise des-oktapeptidinsulin (412 mg) og syntetisk oktapeptid Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Ser-Pro-Thr (390 mg) ble kombinert i 13 ml av en oppløsning inneholdende en del dimetylsulfoksid, to deler 1,4-butandiol og en del 0,25M tris pE 7,3 buffer ved 37° C. Grisetrypsin (80 mg) ble tilsatt. Oppløsningen ble blandet omhyggelig og omrørt av og til i 120 min. ved 37°C.

Reaksjonen ble deretter stoppet ved tilsetning av blandingen til 137 ml 0,05N HC1. Hele oppløsningen ble pumpet på en 21 x 250 mm C-8 Zorbax-kolonne, og produktene ble eluert i en grunn acetonitrilgradient i 0,1 M natrium monobasisk fosfatbuffer pH 2.

Hensiktsmessige fraksjoner, bestemt ved analytisk HPLC, ble slått sammen, fortynnet to ganger med vann, og pumpet på en 25 x 300 mm C-18 Vydac-kolonne. Avsaltet protein ble eluert fra kolonnen med en acetonitrilgradient i 0,5% trifluoreddiksyre. Fraksjoner inneholdende den rensede insulinanalogen ble slått sammen og lyofilisert til 37 mg. Strukturen ble verifisert ved aminosyreanalyse (tabell I) og massespektroskopi (MS).

MS: 5768,1 (teoretisk: 5767,6).

Eksempel 23

Thr( B28). Pro( B29) human insulin

Grise des-oktapeptidinsulin (437 mg) og syntetisk oktapeptid Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Thr-Pro-Thr (420 mg) ble kombinert i 14,5 ml av en oppløsning inneholdende en del dimetylsulfoksid, to deler 1,4-butandiol og en del 0.25M tris pH 7,3 buffer ved 37°C. Grisetrypsin (86 mg) ble tilsatt. Oppløs-ningen ble blandet omhyggelig og omrørt av og til i 120 min. ved 37°C.

Reaksjonen ble deretter stoppet ved tilsetning av blandingen til 135,5 ml 0.05N HC1. Hele oppløsningen ble pumpet på en 21 x 250 mm C-8 Zorbax-kolonne, og produktene ble eluert i en grunn acetonitrilgradient i 0,1 M natrium monobasisk fosfatbuffer pH 2.

Hensiktsmessige fraksjoner, bestemt ved analytisk HPLC, ble slått sammen, fortynnet to ganger med vann, og pumpet på en 25 x 300 mm C-18 Vydac-kolonne. Avsaltet protein ble eluert fra kolonnen med en acetonitrilgradient i 0,5% trifluoreddiksyre. Fraksjoner inneholdende den rensede insulinanalogen ble slått sammen og lyofilisert til 78 mg. Strukturen ble verifisert ved aminosyreanalyse (tabell I) og massespektroskopi (MS).

MS: 5781,9 (teoretisk: 5781,6).

Eksempel 24

Trp( B28). Pro( B29) human insulin

Grise des-oktapeptidinsulin (310 mg) og syntetisk oktapeptid Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Trp-Pro-Thr (325 mg) ble kombinert i 10,5 ml av en oppløsning inneholdende en del dimetylsulfoksid, to deler 1,4-butandiol og en del 0.25M tris pH 7,3 buffer ved 37°C. Grisetrypsin (64 mg) ble tilsatt. Oppløs-ningen ble blandet omhyggelig og omrørt av og til i 120 min. ved 37°C.

Reaksjonen ble deretter stoppet ved tilsetning av blandingen til 140 ml 0.05N HC1. Hele oppløsningen ble pumpet på en 21 x 250 mm C-8 Zorbax-kolonne, og produktene ble eluert i en grunn acetonitrilgradient i 0,1 M natrium monobasisk fosfatbuffer pH 2.

Hensiktsmessige fraksjoner, bestemt ved analytisk HPLC, ble slått sammen, fortynnet to ganger med vann, og pumpet på en 25 x 300 mm C-18 Vydac-kolonne. Avsaltet protein ble eluert fra kolonnen med en acetonitrilgradient i 0,5% trifluoreddiksyre. Fraksjoner inneholdende den rensede insulinanalogen ble slått sammen og lyofilisert til 47 mg. Strukturen ble verifisert ved aminosyreanalyse (tabell I) og massespektroskopi (MS).

MS: 5866,2 (teoretisk: 5866,7).

Eksempel 25

Tyr( B28). Pro( B29) human insulin

Grise des-oktapeptidinsulin (391 mg) og syntetisk oktapeptid Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Tyr-Pro-Thr (400 mg) ble kombinert i 13 ml av en oppløsning inneholdende en del dimetylsulfoksid, to deler 1,4-butandiol og en del 0.25M tris pH 7,3 buffer ved 37°C. Grisetrypsin (79 mg) ble tilsatt. Oppløsningen ble blandet omhyggelig og omrørt av og til i 120 min. ved 37°C.

Hensiktsmessige fraksjoner, bestemt ved analytisk HPLC, ble slått sammen, fortynnet to ganger med vann, og pumpet på en 25 x 300 mm C-18 Vydac-kolonne. Avsaltet protein ble eluert fra kolonnen med en acetonitrilgradient i 0,5% trifluoreddiksyre. Fraksjoner inneholdende den rensede insulinanalogen ble slått sammen og lyofilisert til 30 mg. Strukturen ble verifisert ved aminosyreanalyse (tabell I) og massespektroskopi (MS).

MS: 5843,7 (teoretisk: 5843,7).

Eksempel 26

Val( B28). Pro( B29) human insulin

Grise des-oktapeptidinsulin (40 mg) og syntetisk oktapeptid Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Val-Pro-Thr (383 mg) ble kombinert i 12 ml av en oppløsning inneholdende en del dimetylsulfoksid, to deler 1,4-butandiol og en del 0,25M tris pH 7,3 buffer ved 37°C. Grisetrypsin (78 mg) ble tilsatt. Oppløsningen ble blandet omhyggelig og omrørt av og til i 120 min. ved 37°C.

Reaksjonen ble deretter stoppet ved tilsetning av blandingen til 238 ml 0.05N HC1. Hele oppløsningen ble pumpet på en 21 x 250 mm C-8 Zorbax-kolonne, og produktene ble eluert i en grunn acetonitrilgradient i 0,1 M natrium monobasisk fosfatbuffer pH 2.

Hensiktsmessige fraksjoner, bestemt ved analytisk HPLC, ble slått sammen, fortynnet fire ganger med vann, og pumpet på en 25 x 300 mm C-18 Vydac-kolonne. Avsaltet protein ble eluert fra kolonnen med en acetonitrilgradient i 0,1% trifluoreddiksyre. Fraksjoner inneholdende den rensede insulinanalogen ble slått sammen og lyofilisert til 74 mg. Strukturen ble verifisert ved aminosyreanalyse (tabell I) og massespektroskopi (MS).

MS: 5780,0 (teoretisk: 5779,6).

Eksempel 27

Nva( B28). Pro( B29) human insulin

Grise des-oktapeptidinsulin (292 mg) og syntetisk oktapeptid Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Nva-Pro-Thr (279 mg) ble kombinert i 10 ml av en oppløsning inneholdende en del dimetylsulfoksid, to deler 1,4-butandiol og en del 0,25M tris pH 7,3 buffer ved 37°C. Grisetrypsin (57 mg) ble tilsatt. Oppløsningen ble blandet omhyggelig og omrørt av og til i 120 min. ved 37°C.

Reaksjonen ble deretter stoppet ved tilsetning av blandingen til 240 ml 0.05N HC1. Hele oppløsningen ble pumpet på en 21 x 250 mm C-8 Zorbax-kolonne, og produktene ble eluert i en grunn acetonitrilgradient i 0,1 M natrium monobasisk fosfatbuffer pH 2.

Hensiktsmessige fraksjoner, bestemt ved analytisk HPLC, ble slått sammen, fortynnet to ganger med vann, og pumpet på en 25 x 300 mm C-18 Vydac-kolonne. Avsaltet protein ble eluert fra kolonnen med en acetonitrilgradient i 0,5% trifluoreddiksyre. Fraksjoner inneholdende den rensede insulinanalogen ble slått sammen og lyofilisert til 51 mg. Strukturen ble verifisert ved aminosyreanalyse (tabell I) og massespektroskopi (MS).

MS: 5780,0 (teoretisk: 5779,6).

Eksempel 28

Ved anvendelse av prosedyrene beskrevet heri blir følgende ytterligere insulinanaloger preparert:

De fysiologiske effektene av insulinanalogene fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse blir vist i følgende in vivo analyse-system.

Normale hann Sprague Dawley rotter fra Charles River Labora-tories (Portage, MI) ble anvendt som testdyr. De ble tilveiebragt i et vektområde på 160-180 g og ble i en uke oppholdt i dyrerom ved 24°C med en kontrollert lyssyklus (lysene på 7:00-19:00, lysene av 19:00-7:00). Dyrene ble matet med Purana rat-chow 5001 ad libitum. Rotter som ble anvendt i hver analyse ble fastet 1 16 timer før de ble anvendt. De veide omtrent 200 g når de først ble anvendt. Når de oppnådde en fastet vekt på omtrent 275 g (over en periode på tre uker) ble dyrene ikke anvendt noe mer. En gruppe på ti hann-rotter ble anvendt hver dag for hver undersøkte forbindelse (d.v.s. biosyntetisk humaninsulin, griseinsulin og humaninsulin-analog). Hver gruppe ble bare anvendt en gang i løpet av uken. De ti rottene ble delt inn i to grupper med fem rotter i hver gruppe. En gruppe var kontroll og ble subkutant bare gitt bærer. Den andre gruppen på fem rotter ble gitt forbindelsen som ble undersøkt. Proteinene ble løst opp i 0.05N HC1 (pH 1,6) for å tilveiebringe en stamoppløsning på 100 jjg pr. ml. Fra denne ble et antall fortynning tilveiebragt i normalt saltvann som ble injisert subkutant i rottene. En 100 pl blodprøve ble tatt fra halevenen til hver rotte ved tiden null og 30 minutter, 1 time, 2 timer, 3 timer og 4 timer etter administrasjon. Glukose ble bestemt kolorimetrisk ved en glukoseoksidase-metode (Sigma Chemical Co.). Prosentforandring av blodglukose fra tiden null ble beregnet for hver rotte og de endelige resultatene ble uttrykt som gjennomsnittlig prosentforandring ± SEM i den eksperimentelle gruppen korrigert for gjennomsnittlig forandring i kontroll-gruppen for den dagen.

En dose-respons kurve ble trukket fra tester med 4 til 7 forskjellige konsentrasjoner av den undersøkte forbindelsen ved anvendelse av maksimalresponsen ved en gitt tid (vanligvis en eller to timer etter administrasjon av proteinet). Fra denne kurven ble en ED50-verdi bestemt som den subkutane dosen (jjg/kg) av proteinet som tilveiebragte den halve maksimale hypoglycemi-responsen. Resultatene er vist i følgende tabell III. Som tidligere angitt har insulinanalogene fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse en redusert tendens til å dimerisere eller på annen måte selv-assosiere til former med høyere molekylvekt. Ved administrasjon av en eller flere av de nevnte analogene blir et hurtig forløp av aktiviteten oppnådd. Insulinanalogene fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse er effektive for behandling av hyperglycemi ved administrering til en pasient som trenger dette, en effektiv mengde av en insulinanalog med formel I. Som anvendt heri angir betegnelsen "effektiv mengde" den mengden av en eller flere insulinanaloger fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse som er nødvendig for å redusere eller opprettholde blodsukkernivåene enten terapeutisk eller profylaktisk. Denne mengden kan vanligvis variere fra omtrent 10 enheter opp til omtrent 60 enheter eller mer pr. dag (eller omtrent 0,3 til omtrent 2 mg, med antagelse om omtrent 29 enheter pr. mg). Det er å bemerke at mengden av insulinanalogen(e) som blir administrert vil bli bestemt av legen i lys av relevante omstendigheter, inkludert tilstanden som blir behandlet (d.v.s. årsaken til hyperglycemi), den bestemte analogen som blir administrert, valgte parenterale administrasjonsvei, alder, vekt og respons til den individuelle pasienten og alvorligheten av pasientens symptomer. Ovennevnte doserings-område er derfor ikke ment å begrense rammen av oppfinnelsen.

Insulinanalogene fremstilt ifølge oppfinnelsen kan bli administrert til en pasient som trenger disse (d.v.s. en pasient som lider av hyperglycemi) ved hjelp av farmasøytiske sammensetninger inneholdende en effektiv mengde av minst en insulinanalog med formel I i kombinasjon med en eller flere farmasøytisk akseptable hjelpestoffer eller bærere. De farmasøytiske sammensetningene kan vanligvis bli formulert slik at de omtrent inneholder 100 enheter pr. ml eller lignende konsentrasjoner inneholdende en effektiv mengde av insulinanalogen(e). Disse sammensetningene har vanligvis, men ikke nødvendigvis, parenteral natur og kan bli preparert ved en av forskjellige teknikker under anvendelse av konvensjonelle hjelpestoffer eller bærere for parenterale produkter velkjent innenfor fagområdet. Se for eksempel, "Remington's Pharmaceutical Sciences", 17. utgave, Mack Publishing Company, Easton, PA, "USA (1985) som er inkorporert heri som referanse. For eksempel kan doseringsformer for parenteral administrasjon bli preparert ved suspendering eller opp-løsning av den ønskede mengden av minst en insulinanalog med formel I i en ikke-toksisk flytende bærer egnet for injeksjon, så som et vandig medium og sterilisering av suspensjonen eller oppløsningen. Alternativt kan en målt mengde av forbindelsen bli plassert i en beholder, og beholderen samt innholdet derav kan bli sterilisert og forseglet. En tilleggsbeholder eller bærer kan bli tilveiebragt for blanding før administrasjon. Farmasøytiske sammensetninger tilpasset parenteral administrasjon anvender fortynningsmidler, hjelpemidler og bærere så som vann og organiske oppløsningsmidler som er blandbare med vann så som glycerin, sesamolje, jordnøttolje, vandig propylenglycol, N ,N'-dimetylformamid og lignende. Eksempler på slike farmasøytiske sammensetninger omfatter sterile, isotoniske, vandige saltoppløsninger av insulinanalogene med formel I som kan bli bufferet med en farmasøytisk akseptabel buffer og som er pyrogenfri. I tillegg kan den parenterale farmasøytiske formuleringen inneholde konserveringsmidler, så som meta-cresol eller andre midler for å justere pH til sluttproduktet så som natriumhydroksid eller saltsyre.

Insulinanalogene fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse kan også bli formulert til farmasøytiske sammensetninger egnede for intranasal administrasjon. Slike sammensetninger er i detalj beskrevet i Europeisk Patentsøknad nr. 0200383 A3 som er inkorporert heri som referanse. Slike sammensetninger er formulert med en eller flere farmasøytisk akseptable fortynningsmidler, en farmasøytisk akseptabel mengde av et alkalimetallsalt, ammoniumsalt eller fri syre av et vesentlig zink-fritt insulin og eventuelt en absorpsjonsfremmende mengde av minst ett absorpsjonsfremmende middel valgt fra gruppen bestående av (1) oljesyre eller en ester eller et salt derav, (2) en sorbitanfettsyre-ester i flytende form, (3) et polyoksyetylen-derlvat i flytende form av en sorbitan-fettsyreester og (4) en hydroksypolyoksyetylen-polyoksy-propylen-polyoksyetylen-copolymer i flytende form.

For å demonstrere effektiviteten ved intranasal administrasjon av insulinanalogen Lys(B28), Pro(B29) humaninsulin i forhold til human natriuminsulin ble følgende studie utført. Hannharehunder med vekt på 10 til 12 kg ble opprettholdt i god fysisk tilstand før og i løpet av studien. Hundene ble fastet i 16 timer men hadde adgang til vann for å være forsikret overfor uventede variasjoner i insulinnivåene. I løpet av hele studien ble hundene bedøvet med natriumpento-barbitol og deres kroppstemperatur ble opprettholdt med varmekluter for å minimalisere glukosevariasjon. Insulintest-prøver (d.v.s. Lys(B28), Pro(B29) human insulin og human natriuminsulin) ble løst opp i destillert vann og pH til oppløsningen ble justert til 7,5 med natriumhydroksid. Sluttkonsentrasj onen av insulin var 70 enheter pr. ml. En insulindose på 0,8 enheter pr. kg av Lys(B28), Pro(B29) humaninsulin ble administrert til alle åtte hundene og likeledes ble en dose på 0,8 enheter pr. kg human natriuminsulin administrert til alle fire hundene. Alle dosene ble administrert i nasalhulrommet ved administrering av en spray pr. nesebor med en tilmålt doseforstøver og en modifisert neseapplikator. Blodprøver ble tatt fra jugularvenen 30, 15 og 0 minutter før administrasjon og 10, 20, 30, 45, 60, 90, 120, 180 og 240 minutter etter administrasjon for måling av reduksjon av blodglukose. Resultatene av denne studien er vist i tabell IV.

Ved anvendelse av protokollen beskrevet ovenfor ble en sammenligning av blodglukose-reduksjonsprofilen til Lys(B28), Pro(B29) humaninsulin via intranasal administrasjon sammenlignet med både intravenøs og subkutan administrasjon av analogen som følger. For intravenøs administrasjon ble insulinoppløsningen inneholdende Lys(B28), Pro(B29) human-insulinanalogen administrert ved bolus-injeksjon (0,1 enheter pr. kg) inn i saf enus venen til hver av de fire hundene. Blodprøver ble tatt 30, 15 og 0 minutter før administrasjonen og 5 , 10, 15, 20, 30, 45, 60, 90, 120, 180 og 240 minutter etter administrasjonen. For subkutan administrasjon ble insulinoppløsningen inneholdende Lys(B28), Pro(B29) human-insulinanalogen administrert under epidermis (0,2 enheter pr. kg) av den ytre siden av hver av de seks hundene. Blodprøver ble tatt ifølge samme protokoll som beskrevet etter nasal administrasjon som beskrevet ovenfor. Resultatene av denne sammenlignende studie er vist i tabell V.

Claims

1. Analogifremgangsmåte for fremstilling av en terapeutisk aktiv insulinanalog med formel eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav, hvor Bl er fenylalanin, asparaginsyre eller er fraværende; B2 er valin eller kan være fraværende når Bl er fraværende; B3 er asparagin eller asparaginsyre; B10 er histidin eller asparaginsyre; B28 er en hvilken som helst aminosyre, B29 er L-prolin; D-lysin, eller L-Lysin; Z er -0H; karakterisert vedA) kombinering av ekvimolare mengder S-sulfonert A- kjedepeptid med formel (I) og S-sulfonert B-kjede-peptid med formel (I) i en egnet buffer, tilsetning av et reduksjonsmiddel til blandingen slik at tiolsulfonerte cyteinresidier blir redusert til sulfhydrylcysteinresidier, oksydering av cystein-residiene til cysteinresidier, og isolering av den disulfid brodannede forbindelsen indikert i formel (I); eller B) kombinering av omtrent ekvimolare mengder av en forbindelse med formel (I) som mangler karboksylokta-peptidsekvensen begynnende ved B23 og et oktapeptid som har sekvensen Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-B28-B29-Thr, tilsetning av en egnet mengde av et proteolytisk enzym under betingelser som betydelig favoriserer revers proteolyse, og isolering av en forbindelse indikert i formel (I).

2. Analogifremgangsmåte ifølge krav 1, der Bl er fenylalanin; B2 er valin; B3 er asparagin; B10 er histidin, B28 lysin, B29 er L-prolin; Z er -0H, karakterisert ved at tilsvarende utgangsmaterialer anvendes.

3. Mellomprodukt nyttig i fremgangsmåten ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at det omfatter B-kjeden ifølge formel (I) hvor Bl er en fenylalanin, asparaginsyre eller fraværende; B2 er valin eller kan være fraværende når Bl er fraværende; B3 er asparagin eller asparaginsyre; B10 er histidin eller asparaginsyre; B28 er en hvilken som helst aminosyre, B29 er L-prolin; D-lysin eller L-lysin; Z er -0H.

4. Mellomprodukt nyttig i en fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at det omfatter B-kjeden ifølge formel (I) hvor Bl er fenylalanin; B2 er valin; B3 er asparagin; B10 er histidin; B28 lysin; B29 er L-prolin; Z er -0H.