RU2205836C2 - Усовершенствованный способ получения предшественника инсулина с правильно соединенными цистиновыми мостиками - Google Patents
Усовершенствованный способ получения предшественника инсулина с правильно соединенными цистиновыми мостиками Download PDFInfo
- Publication number
- RU2205836C2 RU2205836C2 RU98116259/04A RU98116259A RU2205836C2 RU 2205836 C2 RU2205836 C2 RU 2205836C2 RU 98116259/04 A RU98116259/04 A RU 98116259/04A RU 98116259 A RU98116259 A RU 98116259A RU 2205836 C2 RU2205836 C2 RU 2205836C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- amino acid
- cysteine
- insulin
- precursor
- residue
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/12—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by hydrolysis, i.e. solvolysis in general
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/62—Insulins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
- A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
- A61P5/48—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones
- A61P5/50—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones for increasing or potentiating the activity of insulin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/02—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length in solution
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Diabetes (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Hematology (AREA)
- Emergency Medicine (AREA)
- Obesity (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Изобретение относится к способу получения предшественника инсулинов или инсулиновых производных с правильно соединенными цистиновыми мостиками в присутствии цистеина или цистеингидрохлорида и хаотропного вспомогательного вещества, отличающемуся тем, что следующие стадии проводят друг за другом: (а) смешивание водной суспензии предшественника инсулинов или инсулиновых производных с количеством цистеина или цистеингидрохлорида, которое дает до 15 SH-остатков цистеина или цистеингидрохлорида на один цистеиновый остаток предшественника, (б) внесение цистеин- или цистеингидрохлоридсодержащей суспензии предшественника в 4-9-молярный раствор хаотропного вспомогательного вещества при значении рН 8 - 11,5 и температуре 15 - 55oС, выдерживание полученной смеси в течение 10-60 мин при этой температуре и (в) внесение смеси при значении рН 8 - 11,5 и температуре 5 - 30oС в количество воды, которое дает разбавление концентрации цистеина или цистеингидрохлорида в смеси на 1-5 мМ и хаотропного вспомогательного вещества на 0,2-1,0 М. Способ обеспечивает высокий выход правильно уложенных предшественников инсулина или инсулиновых производных и низкое время реакции для процесса укладки. 12 з.п. ф-лы.
Description
Настоящее изобретение относится к усовершенствованному способу получения предшественника инсулина с правильно соединенными цистиновыми мостиками в присутствии цистеина или цистеингидрохлорида и хаотропного вспомогательного вещества.
Человеческий инсулин представляет собой белок с двумя аминокислотными цепями, содержащими в общей сложности 51 аминокислотный остаток. В обеих аминокислотных цепях встречается шесть цистеиновых остатков, причем каждые два цистеиновых остатка соединены друг с другом дисульфидным мостиком (= дисульфидной мостиковой связью). В биологически активном человеческом инсулине цепи А и В соединены друг с другом двумя цистиновыми мостиками, и другой цистиновый мостик существует в цепи А. Таким образом, внутри молекулы человеческого инсулина имеется, с точки зрения статистики, 15 возможностей для образования дисульфидных мостиков. В биологически активном человеческом инсулине реализована лишь одна из 15 возможностей. Соединены друг с другом следующие цистеиновые остатки:
А6-А11,
А7-В7,
А20-В19.
А6-А11,
А7-В7,
А20-В19.
Буквы А и В обозначают соответствующую аминокислотную цепь инсулина, число обозначает положение аминокислотного остатка, занимаемое им в соответствующей аминокислотной цепи, считая в направлении от аминного к карбоксильному концу. Дисульфидные мостики могут быть образованы также между двумя молекулами человеческого инсулина, так что легко может образоваться необозримо большое количество различных дисульфидных мостиков.
Известный способ получения человеческого инсулина основан на применении человеческого проинсулина. Человеческий проинсулин является белком с линейной аминокислотной цепью, состоящей из 86 аминокислотных остатков, причем цепи А и В человеческого инсулина соединены друг с другом через С-пептид с 35 аминокислотными остатками. Образование встречающихся в человеческом инсулине дисульфидных мостиков происходит через промежуточный продукт, причем цистеиновые остатки человеческого инсулина содержат серозащитную группу, например, 3-сульфонатную группу (-S-SО3) (см. Европейский патент ЕР 0037255). Далее, известен способ получения проинсулина с правильно соединенными цистиновыми мостиками (Biochemistry, 60, (1968), стр.622-629), который исходит из проинсулина, полученного из поджелудочной железы свиньи, в котором цистеиновые остатки присутствуют в виде тиольных остатков (-SH). Под понятием "правильно соединенные цистиновые мостики" подразумевают дисульфидные мостики, которые существуют в биологически активном инсулине из млекопитающих.
Генно-инженерные способы позволяют получать предшественники инсулина и инсулиновые производные, в частности, человеческий проинсулин или проинсулин, имеющий аминокислотную последовательность и/или длину аминокислотной цепи, отличные от таковых человеческого инсулина, в микроорганизмах. Проинсулины, произведенные клетками Escherichia coli, модифицированными с помощью генной инженерии, не имеют правильно соединенных цистиновых мостиков. Способ получения человеческого инсулина с помощью Е. coli (EP 0055945) основывается на стадиях ферментации микроорганизмов - растворение клетки - выделение слитого белка - галогенциановое расщепление слитого белка - выделение продукта расщепления с проинсулиновой последовательностью - защита цистеиновых остатков проинсулина с помощью S-сульфонатных групп - хроматографическая очистка S-сульфоната - образование правильно соединенных цистиновых мостиков - обессоливание проинсулина - хроматографическая очистка проинсулина с правильно соединенными цистиновыми мостиками - концентрирование раствора проинсулина - хроматографическая очистка концентрированного раствора проинсулина - ферментативное расщепление проинсулина для получения человеческого инсулина - хроматографическая очистка полученного человеческого инсулина.
Недостатками этого способа являются большое число стадий и потери на стадиях очистки, которые приводят к невысокому выходу инсулина. Из-за многостадийности способа приходится мириться со значительными потерями. Начиная со стадии выделения слитого белка и далее на стадиях галогенцианового расщепления, сульфитолиза и очистки проинсулина потери проинсулина составляют до 40% (EP 0055945). Такие же высокие потери могут происходить в ходе последующих стадий очистки вплоть до получения конечного продукта.
Повышение выхода продукта при генно-инженерном получении человеческого инсулина или инсулиновых производных может быть достигнуто в том случае, если количество необходимых стадий процесса будет существенно уменьшено.
Из Европейского патента ЕР 0600372 А1 (соответственно из патента США US 5473049) и Европейского патента ЕР 0668292 А2 известен усовершенствованный соответствующим образом способ получения инсулинов или инсулиновых производных, в котором инсулиновый предшественник или предшественник инсулинового производного, имеющий неправильно соединенные цистиновые мостики, подвергают взаимодействию в присутствии меркаптана, например цистеина, и по меньшей мере одного хаотропного вспомогательного вещества, например мочевины или гуанидингидрохлорида, с получением инсулинового предшественника, соответственно предшественника инсулинового производного, с правильно соединенными цистиновыми мостиками. В известном способе эти белки вначале растворяют в водных растворах хаотропного вспомогательного вещества или смесей различных хаотропных вспомогательных веществ в очень низкой концентрации. Затем смесь белков смешивают с водным раствором меркаптана.
Неожиданно было установлено, что выход правильно уложенных предшественников инсулина или инсулиновых производных может быть повышен, и время реакции для процесса укладки может быть сокращено тем, что предшественник растворяют с помощью хаотропного вспомогательного вещества не на первой стадии, но, что прежде всего в водную суспензию предшественника вводят меркаптан, а именно цистеин или цистеингидрохлорид, и лишь на следующей стадии растворяют предшественник, внося его в водный раствор хаотропного вспомогательного вещества, и, наконец, осуществляют правильную укладку предшественника путем разбавления смеси до предпочтительной концентрации цистеина, соответственно цистеингидрохлорида, внося смесь в соответствующее количество воды.
В соответствии с этим настоящее изобретение относится к способу получения предшественника инсулинов или инсулиновых производных с правильно соединенными цистиновыми мостиками в присутствии цистеина или цистеингидрохлорида и хаотропного вспомогательного вещества, отличающемуся тем, что следующие стадии проводят друг за другом:
(а) смешивание водной суспензии предшественника инсулинов или инсулиновых производных с количеством цистеина или цистеингидрохлорида, которое дает до 15 SH-остатков цистеина или цистеингидрохлорида на один цистеиновый остаток предшественника,
(б) внесение цистеин- или цистеингидрохлоридсодержащей суспензии предшественника в 4-9-молярный раствор хаотропного вспомогательного вещества при рН от 8 до 11,5 и температуре от 15 до 55oС, выдерживание полученной смеси в течение 10-60 мин при этой температуре и
(в) внесение смеси при рН от 8 до 11,5 и температуре от 5 до 30oС в количество воды, которое обеспечивает разбавление концентрации цистеина или цистеингидрохлорида в смеси на 1-5 мМ и хаотропного вспомогательного вещества на 0,2-1,0 М.
(а) смешивание водной суспензии предшественника инсулинов или инсулиновых производных с количеством цистеина или цистеингидрохлорида, которое дает до 15 SH-остатков цистеина или цистеингидрохлорида на один цистеиновый остаток предшественника,
(б) внесение цистеин- или цистеингидрохлоридсодержащей суспензии предшественника в 4-9-молярный раствор хаотропного вспомогательного вещества при рН от 8 до 11,5 и температуре от 15 до 55oС, выдерживание полученной смеси в течение 10-60 мин при этой температуре и
(в) внесение смеси при рН от 8 до 11,5 и температуре от 5 до 30oС в количество воды, которое обеспечивает разбавление концентрации цистеина или цистеингидрохлорида в смеси на 1-5 мМ и хаотропного вспомогательного вещества на 0,2-1,0 М.
Предпочтительно способ отличается тем, что на стадии (а) количество цистеина или цистеингидрохлорида соответствует количеству, которое дает 1-6 SH-остатков цистеина или цистеингидрохлорида на один цистеиновый остаток предшественника,
на стадии (б) цистеин- или цистеингидрохлоридсодержащую суспензию предшественника вносят в 4-9-молярный раствор хаотропного вспомогательного вещества при рН от 8 до 11 и температуре от 30 до 45oС, полученную смесь выдерживают при этой температуре в течение 20-40 мин и
на стадии (в) смесь вносят при рН от 8 до 11 и температуре от 15 до 20oС в количество воды, которое дает разбавление концентрации цистеина или цистеингидрохлорида в смеси до 1-5 мМ и концентрацию хаотропного вспомогательного вещества 0,2-1,0 М.
на стадии (б) цистеин- или цистеингидрохлоридсодержащую суспензию предшественника вносят в 4-9-молярный раствор хаотропного вспомогательного вещества при рН от 8 до 11 и температуре от 30 до 45oС, полученную смесь выдерживают при этой температуре в течение 20-40 мин и
на стадии (в) смесь вносят при рН от 8 до 11 и температуре от 15 до 20oС в количество воды, которое дает разбавление концентрации цистеина или цистеингидрохлорида в смеси до 1-5 мМ и концентрацию хаотропного вспомогательного вещества 0,2-1,0 М.
Хаотропные вспомогательные вещества представляют собой соединения, которые в водном растворе разрушают водородные мостиковые связи, например, сульфат аммония, гуанидин-гидрохлорид, этиленкарбонат, тиоцианат, диметилсульфоксид и мочевина.
В способе согласно изобретению в качестве хаотропного вспомогательного вещества предпочтительно применяется гуанидин, гуанидингидрохлорид или, особенно предпочтительно, мочевина.
В способе согласно изобретению концентрация хаотропного вспомогательного вещества составляет на стадии (б) предпочтительно от 7,0 до 9 М, температура на стадии (б) равна предпочтительно 40oС и рН на стадии (б) предпочтительно находится в пределах 10-11.
В способе согласно изобретению рН на стадии (в) предпочтительно находится в пределах 10-11. Количество воды, в которое вносят смесь, на стадии (в) способа согласно настоящему изобретению предпочтительно выбирают так, чтобы оно давало разбавление концентрации цистеина или цистеингидрохлорида в смеси до приблизительно 2,5-3 мМ и концентрацию хаотропного вспомогательного вещества 0,5 М.
Особенно предпочтительно способ согласно изобретению отличается тем, что концентрация хаотропного вспомогательного вещества составляет на стадии (б) 8 М, температура на стадии (б) равна 40oС и рН на стадии (б) равен 10,6, рН на стадии (в) равен 10,6 и количество воды на стадии (в) обеспечивает разбавление концентрации цистеина и цистеингидрохлорида в смеси до 2-3 мМ и концентрацию хаотропного вспомогательного вещества 0,5 М.
Результатом способа согласно настоящему изобретению является предшественник инсулинов или инсулиновых производных, в частности, проинсулин, цистиновые мостики которого соединены правильно.
Инсулиновые производные представляют собой производные встречающихся в природе инсулинов, а именно человеческого инсулина (см. Последовательность SEQ ID NO 1=A цепь человеческих инсулинов; см. Последовательность SEQ ID NO 2= B цепь человеческих инсулинов, протокол последовательностей) или животных инсулинов, которые отличаются от соответствующих, в остальном таких же встречающихся в природе инсулинов, замещением по меньшей мере одного встречающегося в природе аминокислотного остатка и/или присоединением по меньшей мере одного аминокислотного остатка и/или органического остатка.
Из полученного по способу согласно настоящему изобретению предшественника инсулинов, соответственно инсулиновых производных с правильно соединенными цистиновыми мостиками в конечном итоге согласно способу, описанному в ЕР 0600372 А1 (соответственно US 5473049), путем ферментативного расщепления с помощью трипсина или аналогичного трипсину фермента и, при необходимости, дополнительно с помощью карбоксипептидазы В с последующей очисткой на адсорбирующей смоле, могут быть получены инсулин или инсулиновое производное с правильно соединенными цистиновыми мостиками.
Инсулин или инсулиновое производное, получаемые из предшественника, могут быть описаны предпочтительно формулой I:
где обозначают:
Y - генетически кодируемый аминокислотный остаток,
Z а) аминокислотный остаток из группы His, Arg или Lys,
б) пептид с 2 или 3 аминокислотными остатками, содержащий аминокислотный остаток Arg или Lys на карбоксильном конце пептида,
в) пептид с 2-35 генетически кодируемыми аминокислотами, содержащий 1-5 гистадиновых остатков, или
г) ОН,
R1 - фенилаланиновый остаток (Phe) или ковалентную связь,
R3 - генетически кодируемый аминокислотный остаток,
причем не указанные в целях упрощения формулы I остатки А2-А20 соответствуют аминокислотной последовательности цепи А человеческого инсулина, животного инсулина или инсулинового производного и не указанные в целях упрощения формулы I остатки В2-В29 соответствуют аминокислотной последовательности цепи В человеческого инсулина, животного инсулина или инсулинового производного.
где обозначают:
Y - генетически кодируемый аминокислотный остаток,
Z а) аминокислотный остаток из группы His, Arg или Lys,
б) пептид с 2 или 3 аминокислотными остатками, содержащий аминокислотный остаток Arg или Lys на карбоксильном конце пептида,
в) пептид с 2-35 генетически кодируемыми аминокислотами, содержащий 1-5 гистадиновых остатков, или
г) ОН,
R1 - фенилаланиновый остаток (Phe) или ковалентную связь,
R3 - генетически кодируемый аминокислотный остаток,
причем не указанные в целях упрощения формулы I остатки А2-А20 соответствуют аминокислотной последовательности цепи А человеческого инсулина, животного инсулина или инсулинового производного и не указанные в целях упрощения формулы I остатки В2-В29 соответствуют аминокислотной последовательности цепи В человеческого инсулина, животного инсулина или инсулинового производного.
Аминокислотная последовательность пептидов и белков обозначается, начиная от N-терминального конца аминокислотной цепи. Сделанные в формуле I указания в скобках, например, А6, А20, B1, B7 или В19, соответствуют положению аминокислотных остатков в цепях А или В.
Понятие "генетически кодируемый аминокислотный остаток" включает в себя аминокислоты Gly, Ala, Ser, Thr, Val, Leu, Ile, Asp, Asn, Glu, Gln, Cys, Met, Arg, Lys, His, Tyr, Phe, Trp, Pro и селеноцистеин.
Под понятиями "остатки А2-А20" и "остатки В2-В29" животного инсулина подразумеваются, например, аминокислотные последовательности инсулина из крупного рогатого скота, свиней или кур. Понятие "остатки А2-А20" и "В2-В29" инсулиновых производных охватывают соответствующие аминокислотные последовательности человеческого инсулина, которые образуются путем обмена аминокислот с другими генетически кодируемыми аминокислотами.
Цепь А человеческого инсулина имеет, например, следующую последовательность (SEQ ID NO: 1):
Cly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu
Glu Asn Tyr Cys Asn.
Cly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu
Glu Asn Tyr Cys Asn.
Цепь В человеческого инсулина имеет, например, следующую последовательность (SEQ ID NO: 2):
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
Leu Val Cys Gly Glu Arg Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr.
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
Leu Val Cys Gly Glu Arg Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr.
При этом в формуле I R3 обозначает аспарагин (Asn), R1 - фенилаланин (Phe), Y - треонин (Thr) и Z - ОН.
В соответствии с вышеизложенным способ согласно настоящему изобретению особенно пригоден для получения предшественника инсулинов или инсулиновых производных общей формулы II, цистиновые мостики которого (в формуле I не показаны) уложены правильно,
R2-R1-(B2-B29)-Y-X-Gly-(A2-A20)-R3 (II),
где обозначают:
R2 а) атом водорода,
б) аминокислотный остаток из группы лизин (Lys) или аргинин (Аrg) или
в) пептид с 2-45 аминокислотными остатками, содержащий аминокислотный остаток лизин (Lys) или аргинин (Аrg) на карбоксильном конце пептида,
R1 - фенилаланиновый остаток (Phe) или ковалентную связь,
(В2-В29) - аминокислотные остатки в положениях В2-В29 цепи В человеческого инсулина, животного инсулина или необязательно модифицированного в одном или нескольких из этих положений инсулинового производного,
Y - генетически кодируемый аминокислотный остаток,
Х а) аминокислотный остаток из группы лизин (Lys) или аргинин (Arg),
б) пептид с 2-35 аминокислотными остатками, содержащий аминокислотный остаток лизин (Lys) или аргинин (Arg) на N-терминальном и на карбоксильном конце пептида,
в) пептид с 2-35 генетически кодируемыми аминокислотами, содержащий 1-5 гистидиновых остатков,
(А2-А20) - аминокислотные остатки в положениях А2-А20 цепи A человеческого инсулина, животного инсулина или необязательно модифицированного в одном или нескольких из этих положений инсулинового производного и
R3 - генетически кодируемый аминокислотный остаток.
R2-R1-(B2-B29)-Y-X-Gly-(A2-A20)-R3 (II),
где обозначают:
R2 а) атом водорода,
б) аминокислотный остаток из группы лизин (Lys) или аргинин (Аrg) или
в) пептид с 2-45 аминокислотными остатками, содержащий аминокислотный остаток лизин (Lys) или аргинин (Аrg) на карбоксильном конце пептида,
R1 - фенилаланиновый остаток (Phe) или ковалентную связь,
(В2-В29) - аминокислотные остатки в положениях В2-В29 цепи В человеческого инсулина, животного инсулина или необязательно модифицированного в одном или нескольких из этих положений инсулинового производного,
Y - генетически кодируемый аминокислотный остаток,
Х а) аминокислотный остаток из группы лизин (Lys) или аргинин (Arg),
б) пептид с 2-35 аминокислотными остатками, содержащий аминокислотный остаток лизин (Lys) или аргинин (Arg) на N-терминальном и на карбоксильном конце пептида,
в) пептид с 2-35 генетически кодируемыми аминокислотами, содержащий 1-5 гистидиновых остатков,
(А2-А20) - аминокислотные остатки в положениях А2-А20 цепи A человеческого инсулина, животного инсулина или необязательно модифицированного в одном или нескольких из этих положений инсулинового производного и
R3 - генетически кодируемый аминокислотный остаток.
1. Предпочтительно в формуле II обозначают:
R2 а) атом водорода или
б) пептид с 2-25 аминокислотными остатками, содержащий аминокислотный остаток аргинин (Arg) на карбоксильном конце пептида,
R1 - фенилаланиновый остаток (Phe),
(В2-В29) - аминокислотные остатки в положениях В2-В29 цепи В человеческого инсулина,
Y - аминокислотный остаток из группы аланин (Ala), треонин (Thr) или серии (Ser),
Х - аминокислотный остаток аргинин (Arg) или пептид с аминокислотной последовательностью цепи С человеческого инсулина,
(А2-А20) - аминокислотные остатки в положениях А2-А20 цепи А человеческого инсулина и
R3 - аминокислотный остаток из группы аспарагин (Asn), серин (Sеr) или глицин (Gly).
R2 а) атом водорода или
б) пептид с 2-25 аминокислотными остатками, содержащий аминокислотный остаток аргинин (Arg) на карбоксильном конце пептида,
R1 - фенилаланиновый остаток (Phe),
(В2-В29) - аминокислотные остатки в положениях В2-В29 цепи В человеческого инсулина,
Y - аминокислотный остаток из группы аланин (Ala), треонин (Thr) или серии (Ser),
Х - аминокислотный остаток аргинин (Arg) или пептид с аминокислотной последовательностью цепи С человеческого инсулина,
(А2-А20) - аминокислотные остатки в положениях А2-А20 цепи А человеческого инсулина и
R3 - аминокислотный остаток из группы аспарагин (Asn), серин (Sеr) или глицин (Gly).
Цепь С человеческого инсулина имеет следующую последовательность (SEQ ID NO: 3):
Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly
Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu
Gln Lys Arg.
Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly
Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu
Gln Lys Arg.
2. Предпочтительно в формуле II обозначают:
R2 а) атом водорода или
б) пептид с 2-15 аминокислотными остатками, на карбоксильном конце которого находится аргининовый остаток (Arg);
R1 - фенилаланиновый остаток (Phe),
(В2-В29) - аминокислотные остатки в положениях В2-В29 цепи В человеческого инсулина,
Y - треониновый остаток (Thr),
Х - аминокислотный остаток аргинин (Arg) или пептид с 2-35 аминокислотными остатками, причем в начале и в конце пептида стоят два основных аминокислотных остатка, в частности, аргинин (Arg) и/или лизин (Lys),
(А2-А20) - аминокислотные остатки в положениях А2-А20 цепи В человеческого инсулина и
R3 - аминокислотный остаток аспарагин (Asn) или глицин (Gly).
R2 а) атом водорода или
б) пептид с 2-15 аминокислотными остатками, на карбоксильном конце которого находится аргининовый остаток (Arg);
R1 - фенилаланиновый остаток (Phe),
(В2-В29) - аминокислотные остатки в положениях В2-В29 цепи В человеческого инсулина,
Y - треониновый остаток (Thr),
Х - аминокислотный остаток аргинин (Arg) или пептид с 2-35 аминокислотными остатками, причем в начале и в конце пептида стоят два основных аминокислотных остатка, в частности, аргинин (Arg) и/или лизин (Lys),
(А2-А20) - аминокислотные остатки в положениях А2-А20 цепи В человеческого инсулина и
R3 - аминокислотный остаток аспарагин (Asn) или глицин (Gly).
Остаток Z инсулина или инсулинового производного формулы I является, как правило, частью аминокислотной последовательности Х предшественника формулы II и образуется в результате деятельности протеаз, таких как трипсин, трипсиноподобный фермент или карбоксипептидаза В.
Остаток R3 является аминокислотным остатком, который находится в положении А21 цепи А инсулина. Остаток Y является аминокислотным остатком, который находится в положении В30 цепи В инсулина.
Трипсин или трипсиноподобные ферменты являются протеазами, которые расщепляют аминокислотные цепи аргининового или лизинового остатков.
Карбоксипептидаза В является экзопротеазой, которая отщепляет основные аминокислотные остатки, такие как Аrg или Lys, находящиеся на карбокситерминальном конце аминокислотных цепей (Kemmler et al., J. Biol. Chem. 246, стр.6786-6791).
Из названного в параграфе 1 предшественника может быть, например, получен инсулин, соответственно инсулиновое производное формулы I с правильно соединенными цистиновыми мостиками, причем Y, R1, R2, R3, A2-A20 и В2-В29 имеют указанное в параграфе 1 значение и Z обозначает аргининовый остаток (Аrg), пептидный остаток Аrg-Аrg или -ОН.
Из названного в параграфе 2 предшественника может быть, например, получен инсулин, соответственно инсулиновое производное формулы I с правильно соединенными цистиновыми мостиками, причем Y, R1, R2, R3, A2-A20 и В2-В29 имеют указанное в параграфе 2 значение и Z обозначает аргининовый остаток (Аrg), пептидный остаток Аrg-Аrg или Lys-Lys или -ОН.
Предшественник формулы II может быть образован с помощью множества генно-инженерных конструкций в микроорганизмах (ЕР 0489780, ЕР 0347781, ЕР 0453969). Генно-инженерные конструкции подвергают экспрессии в микроорганизмах, таких как Escherechia coli или Streptomyceten во время ферментации. Образовавшиеся белки откладывают внутри микроорганизмов (ЕР 0489780) или выделяют в ферментационный раствор.
Для способа согласно изобретению могут применяться предшественники инсулина или инсулиновых производных формулы II, которые непосредственно после растворения клетки еще загрязнены большим количеством примесей белков, попавших в них из ферментационного раствора или из микроорганизмов. Однако предшественники формулы II могут быть применены также, например, и в предварительно очищенной форме после осаждения или хроматографической очистки.
Пример 1 (Сравнительный пример, уровень техники)
Путем ферментации генетически модифицированных клеток Escherechia coli (EP 0489780) получают слитой белок со следующей аминокислотной последовательностью.
Путем ферментации генетически модифицированных клеток Escherechia coli (EP 0489780) получают слитой белок со следующей аминокислотной последовательностью.
Последовательность 1 проинсулина (SEQ ID NO: 4):
Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg Phe Val Asn Gln His Leu
Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg
Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gln
Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln
Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln
Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
Последовательность I проинсулина соответствует формуле II, при этом обозначают:
Х - С-пептид человеческого инсулина (SEQ ID NO: 3):
Y - Тhr(В3О),
R1 - Phe (B1),
R2 - пептид с 10 аминокислотными остатками;
R3 - Asn (A21) и
A2-A20 - аминокислотную последовательность цепи А человеческого инсулина (аминокислотные остатки 2-20) и
В2-В29 - аминокислотную последовательность цепи В человеческого инсулина (аминокислотные остатки 2-29).
Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg Phe Val Asn Gln His Leu
Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg
Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gln
Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln
Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln
Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
Последовательность I проинсулина соответствует формуле II, при этом обозначают:
Х - С-пептид человеческого инсулина (SEQ ID NO: 3):
Y - Тhr(В3О),
R1 - Phe (B1),
R2 - пептид с 10 аминокислотными остатками;
R3 - Asn (A21) и
A2-A20 - аминокислотную последовательность цепи А человеческого инсулина (аминокислотные остатки 2-20) и
В2-В29 - аминокислотную последовательность цепи В человеческого инсулина (аминокислотные остатки 2-29).
В клетках Е. coli накапливается экспрессированный слитой белок с проинсулиновой последовательностью 1 и образует тельца-включения. По окончании ферментации клетки отделяют путем центрифугирования и растворяют путем обычной гомогенизации под высоким давлением. Высвободившиеся тельца-включения слитого белка выделяют с помощью центрифугирования.
20 кг выделенных телец-включений слитого белка (в пересчете на сухую массу после сушки вымораживанием; долю инсулинсодержащего слитого белка определяют с помощью жидкостной хроматографии высокого давления (ЖХВД); эта доля составляет 50%) с проинсулиновой последовательностью 1 растворяют в 550 л 8-молярного раствора мочевины при рН 10,6. После отделения небольших количеств взвешенных веществ с помощью центрифугирования прозрачный раствор (необязательно) замешивают в 9000 л водного раствора цистеина (5 кг гидрата цистеингидрохлорида) при рН 10,6 и температуре 4oС. По окончании реакции укладывания приблизительно через 24 ч определяют с помощью анализа ЖХВД содержание проинсулиновой последовательности 1 с правильно соединенными цистиновыми мостиками в реакционной смеси, которое находят равным 3,0 кг, что соответствует степени конверсии 30%.
рН 9500 л раствора устанавливают с помощью 1 н. НС1 на значение 5,0 и раствор сепарируют. Затем рН доводят до 9, добавляя 1 н. раствор едкого натра. В раствор вводят 3 г трипсина. Образуется 1,25 кг инсулина с 2 карбокситермальными аргининовыми остатками согласно анализу, произведенному с помощью ЖХВД. После расщепления карбоксипептидазой В образуется человеческий инсулин, который подвергается дальнейшей очистке хроматографическими методами.
Человеческий инсулин соответствует формуле I, при этом обозначают:
Y - Thr (B30),
Z - ОН,
R1 - Phe (B1),
R3 - Asn (A21) и
А2-А20 - аминокислотную последовательность цепи А человеческого инсулина (аминокислотные остатки 2-20) и
В2-В29 - аминокислотную последовательность цепи В человеческого инсулина (аминокислотные остатки 2-29).
Y - Thr (B30),
Z - ОН,
R1 - Phe (B1),
R3 - Asn (A21) и
А2-А20 - аминокислотную последовательность цепи А человеческого инсулина (аминокислотные остатки 2-20) и
В2-В29 - аминокислотную последовательность цепи В человеческого инсулина (аминокислотные остатки 2-29).
Человеческий инсулин 2 состоит из SEQ ID NO: 1 и 2, связанных друг с другом правильно соединенными цистиновыми мостиками.
Раствор концентрируют, как описано в ЕР 0668292, с помощью адсорбирующей смолы и очищают. Элюат, содержащий инсулин 2, после разбавления водой и регулирования рН может быть подвергнут дальнейшей очистке непосредственно на хроматографической колонке.
Анализ с помощью ЖХВД
0,5 г белка растворяют в 40 мл раствора, состоящего из 6 М гуанидингидрохлорида, 50 мМ Tris, pH 8,5, 5 мМ этилендиаминтетраацетата (ЭДТА), 1% 2-меркаптоэтанола, 10 мМ дитиотреитола при 95oС в течение 2 мин и затем центрифугируют при 14000 g в течение 20 мин. 0,02 мл прозрачной надосадочной жидкости помещают в хроматографическую колонку высокого давления.
0,5 г белка растворяют в 40 мл раствора, состоящего из 6 М гуанидингидрохлорида, 50 мМ Tris, pH 8,5, 5 мМ этилендиаминтетраацетата (ЭДТА), 1% 2-меркаптоэтанола, 10 мМ дитиотреитола при 95oС в течение 2 мин и затем центрифугируют при 14000 g в течение 20 мин. 0,02 мл прозрачной надосадочной жидкости помещают в хроматографическую колонку высокого давления.
Колонка: ®Nucleogel RP 300-5/46 (Macherey & Nagel, Аахен, Германия).
Градиент: буфер А: 0,1%-ная трифторуксусная кислота (ТФУ); буфер Б: 0,09%-ная ТФУ в ацетонитриле.
Температура: 55oС.
Общее время процесса: 40 мин.
Градиент характеризуется следующими количествами буфера В после соответствующих времен процесса:
10 мин 25%, 12 мин 60%, 13 мин 90%, 15 мин 100%.
10 мин 25%, 12 мин 60%, 13 мин 90%, 15 мин 100%.
Поток: 1 мл/мин.
Детектирование: 215 нм.
Время удержания инсулина: около 19 мин.
Пример 2 (Способ согласно настоящему изобретению)
Путем ферментации генетически модифицированных клеток Escherichia coli (EP 0489780) получают слитой протеин с показанной в примере 1 аминокислотной последовательностью (проинсулиновая последовательность 1 SEQ ID NO: 4). В клетках Е. coli накапливается экспрессированный белок с проинсулиновой последовательностью 1 и образует тельца-включения. По окончании ферментации клетки отделяют путем центрифугирования и растворяют путем обычной гомогенизации под высоким давлением. Высвободившиеся тельца-включения слитого белка выделяют с помощью центрифугирования.
Путем ферментации генетически модифицированных клеток Escherichia coli (EP 0489780) получают слитой протеин с показанной в примере 1 аминокислотной последовательностью (проинсулиновая последовательность 1 SEQ ID NO: 4). В клетках Е. coli накапливается экспрессированный белок с проинсулиновой последовательностью 1 и образует тельца-включения. По окончании ферментации клетки отделяют путем центрифугирования и растворяют путем обычной гомогенизации под высоким давлением. Высвободившиеся тельца-включения слитого белка выделяют с помощью центрифугирования.
К водной суспензии слитого белка, содержащей 40 кг слитого белка (определение производилось путем сушки вымораживанием аликвота), добавляют 5 кг гидрата цистеингидрохлорида.
Суспензию (долю инсулинсодержащего слитого белка определяют с помощью ЖХВД; эта доля составляет 50%) с проинсулиновой последовательностью 1 растворяют в 550 л 8-молярного раствора мочевины при рН 10,2 и 40oС. Прозрачный раствор замешивают в 9000 л воды при рН 10,6 и температуре 15oС. По окончании реакции укладывания приблизительно через 24 ч определяют с помощью анализа ЖХВД содержание проинсулиновой последовательности 1 с правильно соединенными цистиновыми мостиками в реакционной смеси, которое находят равным 10,0 кг, что соответствует степени конверсии 50%.
рН 9500 л раствора устанавливают с помощью 1 н. НС1 на значение 5,0 и раствор сепарируют. Затем рН доводят до 9, добавляя 1 н. раствор едкого натра. В раствор вводят 10 г трипсина. Образуется 4 кг инсулина с 2 карбокситермальными аргининовыми остатками. После расщепления карбоксипептидазой В образуется человеческий инсулин (SEQ ID NO: 1 и 2 с правильно соединенными цистиновыми мостиками).
Раствор концентрируют с помощью адсорбирующей смолы и очищают.
Элюат, содержащий человеческий инсулин, после разбавления водой и регулирования рН может быть подвергнут дальнейшей очистке непосредственно на хроматографической колонке.
Пример 3 (Сравнительный пример, уровень техники)
Путем ферментации генетически модифицированных клеток Escherechia coli (EP 0489780) получают слитой белок со следующей аминокислотной последовательностью.
Путем ферментации генетически модифицированных клеток Escherechia coli (EP 0489780) получают слитой белок со следующей аминокислотной последовательностью.
Последовательность 2 проинсулина (SEQ ID NO: 5):
Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg Phe Val Asn Gln His Leu
Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg
Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gln
Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln
Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln
Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Gly
Последовательность 2 проинсулина соответствует формуле II, при этом обозначают:
Х - С-пептид человеческого инсулина (SEQ ID NO: 3):
Y - Thr(B30),
R1 - Phe (B1),
R2 - пептид с 10 аминокислотными остатками,
R3 - Gly (A21) и
А2-А20 - аминокислотную последовательность цепи А человеческого инсулина (аминокислотные остатки 2-20) и
В2-В29 - аминокислотную последовательность цепи В человеческого инсулина (аминокислотные остатки 2-29).
Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg Phe Val Asn Gln His Leu
Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg
Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gln
Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln
Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln
Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Gly
Последовательность 2 проинсулина соответствует формуле II, при этом обозначают:
Х - С-пептид человеческого инсулина (SEQ ID NO: 3):
Y - Thr(B30),
R1 - Phe (B1),
R2 - пептид с 10 аминокислотными остатками,
R3 - Gly (A21) и
А2-А20 - аминокислотную последовательность цепи А человеческого инсулина (аминокислотные остатки 2-20) и
В2-В29 - аминокислотную последовательность цепи В человеческого инсулина (аминокислотные остатки 2-29).
В клетках Е. coli накапливается экспрессированный слитой белок с проинсулиновой последовательностью 2 и образует тельца-включения. По окончании ферментации клетки отделяют путем центрифугирования и растворяют путем обычной гомогенизации под высоким давлением. Высвободившиеся тельца-включения слитого белка выделяют с помощью центрифугирования.
20 кг выделенных телец-включений слитого белка (в пересчете на сухую массу после сушки вымораживанием; долю инсулинсодержащего слитого белка определяют с помощью ЖХВД. Эта доля составляет 50%) с проинсулиновой последовательностью 2 растворяют в 550 л 8-молярного раствора мочевины при рН 10,6 и 20oС. Прозрачный раствор замешивают в 9000 л водного раствора цистеина (5 кг гидрата цистеингидрохлорида) при рН 10,6 и температуре 4oC. По окончании реакции укладывания приблизительно через 24 ч определяют с помощью анализа ЖХВД содержание проинсулиновой последовательности 2 с правильно соединенными цистиновыми мостиками в реакционной смеси, которое находят равным 3,0 кг, что соответствует степени конверсии 30%.
рН 9500 л раствора устанавливают с помощью 1 н. НС1 на значение 5,0 и раствор сепарируют. Затем рН доводят до 9, добавляя 1 н. раствор едкого натра. В раствор вводят 3 г трипсина. Образуется 0,98 кг инсулинового производного с 2 карбокситермальными аргининовыми остатками согласно анализу, произведенному с помощью ЖХВД. Это инсулиновое производное соответствует формуле I, причем обозначают:
Y - Thr (B30),
Z - Аrg-Аrg,
R1 - Phe(B1),
R3 - Gly (A21) и
А2-А20 - аминокислотную последовательность цепи А человеческого инсулина (аминокислотные остатки 2-20) и
В2-В29 - аминокислотную последовательность цепи В человеческого инсулина (аминокислотные остатки 2-29),
и состоит из SEQ ID NO: 6 и 7, связанных друг с другом правильно соединенными цистиновыми мостиками.
Y - Thr (B30),
Z - Аrg-Аrg,
R1 - Phe(B1),
R3 - Gly (A21) и
А2-А20 - аминокислотную последовательность цепи А человеческого инсулина (аминокислотные остатки 2-20) и
В2-В29 - аминокислотную последовательность цепи В человеческого инсулина (аминокислотные остатки 2-29),
и состоит из SEQ ID NO: 6 и 7, связанных друг с другом правильно соединенными цистиновыми мостиками.
Раствор концентрируют с помощью адсорбирующей смолы и очищают.
Элюат, содержащий инсулиновое производное, после разбавления водой и регулирования рН может быть подвергнут дальнейшей очистке непосредственно на хроматографической колонке.
Пример 4 (Способ согласно настоящему изобретению)
Путем ферментации генетически модифицированных клеток Escherichia coli (EP 0489780) получают слитой протеин с аминокислотной последовательностью согласно примеру 1 (SEQ ID NO: 5).
Путем ферментации генетически модифицированных клеток Escherichia coli (EP 0489780) получают слитой протеин с аминокислотной последовательностью согласно примеру 1 (SEQ ID NO: 5).
В клетках Е. coli накапливается экспрессированный слитой белок с проинсулиновой последовательностью 2 и образует тельца-включения. По окончании ферментации клетки отделяют путем центрифугирования и растворяют путем обычной гомогенизации под высоким давлением. Высвободившиеся тельца-включения слитого белка выделяют с помощью центрифугирования.
К водной суспензии слитого белка, содержащей 40 кг слитого белка (определение производилось путем сушки вымораживанием аликвоты), добавляют 5 кг гидрата цистеингидрохлорида.
Суспензию (долю инсулинсодержащего слитого белка определяют с помощью ЖХВД; эта доля составляет 50%) с проинсулиновой последовательностью 2 растворяют в 550 л 8-молярного раствора мочевины при рН 10,2 и 40oС. Прозрачный раствор замешивают в 9000 л воды при рН 10,6 и температуре 15oС. По окончании реакции укладывания приблизительно через 5 ч определяют с помощью анализа ЖХВД содержание проинсулиновой последовательности 1 с правильно соединенными цистиновыми мостиками в реакционной смеси, которое находят равным 10,0 кг, что соответствует степени конверсии 50%.
рН 9500 л раствора устанавливают с помощью 1 н. НС1 на значение 5,0 и раствор сепарируют. Затем рН доводят до 9, добавляя 1 н. раствор едкого натра. В раствор вводят 10 г трипсина. Образуется 2,8 кг инсулинового производного (анализ с помощью ЖХВД), состоящего из последовательностей SEQ ID NO: 6 и 7, связанных между собой правильно соединенными цистиновыми мостиками.
Раствор концентрируют с помощью поглощающей смолы и очищают.
Элюат, содержащий инсулиновое производное, после разбавления водой и регулирования рН может быть подвергнут дальнейшей очистке непосредственно на хроматографической колонке.
Claims (13)
1. Способ получения предшественника инсулинов или производных инсулина с правильно соединенными цистиновыми мостиками в присутствии цистеина или цистеингидрохлорида и хаотропного вспомогательного вещества, отличающийся тем, что проводят следующие друг за другом стадии: (а) смешивание водной суспензии предшественника инсулинов или производных инсулина с количеством цистеина или цистеингидрохлорида, которое дает 1-15 SH-остатков цистеина или цистеингидрохлорида на один цистеиновый остаток предшественника, (б) внесение цистеин- или цистеингидрохлоридсодержащей суспензии предшественника в 4-9-молярный раствор хаотропного вспомогательного вещества при рН = 8 - 11,5 и температуре 15 - 55oС, выдерживание полученной смеси в течение 10-60 мин при этой температуре, (в) внесение смеси при рН = 8 - 11,5 и температуре 5 - 30oС в количество воды, которое обеспечивает разбавление концентрации цистеина или цистеингидрохлорида в смеси на 1-5 мМ и хаотропного вспомогательного вещества на 0,2 -1,0 М.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что на стадии (а) количество цистеина или цистеингидрохлорида соответствует количеству, которое дает 1- 6 SH-остатков цистеина или цистеингидрохлорида на один цистеиновый остаток предшественника, на стадии (б) цистеин- или цистеингидрохлоридсодержащую суспензию предшественника вносят в 4-9-молярный раствор хаотропного вспомогательного вещества при рН = 8 - 11 и температуре 30 - 45oС, полученную смесь выдерживают при этой температуре в течение 20-40 мин, на стадии (в) внесение смеси осуществляют при рН = 8 - 11 и температуре 15 - 20oС в количество воды, которое обеспечивает разбавление концентрации цистеина или цистеингидрохлорида в смеси на 1-5 мМ и концентрацию хаотропного вспомогательного вещества 0,2 - 1,0 М.
3. Способ по пп.1 и 2, отличающийся тем, что хаотропным вспомогательным веществом является гуанидин или гуанидингидрохлорид.
4. Способ по пп.1 и 2, отличающийся тем, что хаотропным вспомогательным веществом является мочевина.
5. Способ по одному из нескольких пп.1-4, отличающийся тем, что концентрация хаотропного вспомогательного вещества на стадии (б) составляет 7,0 - 9 М.
6. Способ по одному из нескольких пп.1-5, отличающийся тем, что температура на стадии (б) составляет 40oС.
7. Способ по одному из нескольких пп.1-6, отличающийся тем, что рН на стадии (б) составляет 10-11.
8. Способ по одному из нескольких пп.1-7, отличающийся тем, что рН на стадии (в) составляет 10-11.
9. Способ по одному из нескольких пп.1-8, отличающийся тем, что на стадии (в) количество воды обеспечивает разбавление концентрации цистеина или цистеингидрохлорида в смеси на 2,5-3 мМ и концентрации хаотропного вспомогательного вещества на 0,5 М.
10. Способ по одному из нескольких пп.2-9, отличающийся тем, что концентрация хаотропного вспомогательного вещества на стадии (б) составляет 8 М, температура на стадии (б) 40oС, рН на стадии (б) 10,6, рН на стадии (в) 10,6 и количество воды на стадии (в) обеспечивает разбавление концентрации цистеина или цистеингидрохлорида в смеси на 2,5-3 мМ и концентрацию хаотропного вспомогательного вещества 0,5 М.
11. Способ по одному из нескольких пп. 1-10, отличающийся тем, что предшественник инсулинов или производных инсулина имеет последовательность согласно общей формуле II
R2-R1-(B2-B29)-Y-X-Gly-(A2-A20)-R3, (ll)
где R2 - пептид с 2-45 аминокислотными остатками, содержащий аминокислотный остаток лизин (Lys) или аргинин (Аrg) на карбоксильном конце пептида;
R1 - фенилаланиновый остаток (Phe);
(В2-В29) аминокислотные остатки в положениях В2-В29 В-цепи человеческого инсулина, животного инсулина или, в случае необходимости, модифицированного в одном или нескольких из этих положений производного инсулина;
Y - генетически кодируемый аминокислотный остаток;
Х - пептид с 2-35 аминокислотными остатками, содержащий аминокислотный остаток лизин (Lys) или аргинин (Аrg) на N-терминальном и на карбоксильном конце пептида;
(А2-А20) - аминокислотные остатки в положениях А2-А20 А-цепи человеческого инсулина, животного инсулина или, в случае необходимости, модифицированного в одном или нескольких из этих положений производного инсулина;
R3 - генетически кодируемый аминокислотный остаток.
R2-R1-(B2-B29)-Y-X-Gly-(A2-A20)-R3, (ll)
где R2 - пептид с 2-45 аминокислотными остатками, содержащий аминокислотный остаток лизин (Lys) или аргинин (Аrg) на карбоксильном конце пептида;
R1 - фенилаланиновый остаток (Phe);
(В2-В29) аминокислотные остатки в положениях В2-В29 В-цепи человеческого инсулина, животного инсулина или, в случае необходимости, модифицированного в одном или нескольких из этих положений производного инсулина;
Y - генетически кодируемый аминокислотный остаток;
Х - пептид с 2-35 аминокислотными остатками, содержащий аминокислотный остаток лизин (Lys) или аргинин (Аrg) на N-терминальном и на карбоксильном конце пептида;
(А2-А20) - аминокислотные остатки в положениях А2-А20 А-цепи человеческого инсулина, животного инсулина или, в случае необходимости, модифицированного в одном или нескольких из этих положений производного инсулина;
R3 - генетически кодируемый аминокислотный остаток.
12. Способ по п.11, отличающийся тем, что в формуле II обозначают:
R2 - пептид с 2-25 аминокислотными остатками, содержащий аминокислотный остаток аргинин (Arg) на карбоксильном конце пептида,
R1 - фенилаланиновый остаток (Phe),
(В2-В29) - аминокислотные остатки в положениях В2-В29 В-цепи человеческого инсулина,
Y - аминокислотный остаток из группы аланин (Аla), треонин (Thr) или серин (Ser),
Х - аминокислотный остаток аргинин (Аrg) или пептид с аминокислотной последовательностью С-цепи человеческого инсулина,
(А2-А20) - аминокислотные остатки в положениях А2-А20 А-цепи человеческого инсулина,
R3 - аминокислотный остаток из группы аспарагин (Asn), серин (Ser) или глицин (Glу).
R2 - пептид с 2-25 аминокислотными остатками, содержащий аминокислотный остаток аргинин (Arg) на карбоксильном конце пептида,
R1 - фенилаланиновый остаток (Phe),
(В2-В29) - аминокислотные остатки в положениях В2-В29 В-цепи человеческого инсулина,
Y - аминокислотный остаток из группы аланин (Аla), треонин (Thr) или серин (Ser),
Х - аминокислотный остаток аргинин (Аrg) или пептид с аминокислотной последовательностью С-цепи человеческого инсулина,
(А2-А20) - аминокислотные остатки в положениях А2-А20 А-цепи человеческого инсулина,
R3 - аминокислотный остаток из группы аспарагин (Asn), серин (Ser) или глицин (Glу).
13. Способ по п.11, отличающийся тем, что в формуле II обозначают:
R2 - пептид с 2-15 аминокислотными остатками, на карбоксильном конце которого находится аргининовый остаток (Arg),
R1 - фенилаланиновый остаток (Phe),
(В2-В29) - аминокислотные остатки в положениях В2-В29 В-цепи человеческого инсулина,
Y - треониновый остаток (Thr),
Х - аминокислотный остаток аргинин (Аrg) или пептид с 2-35 аминокислотными остатками, причем в начале и в конце пептида стоят два основных аминокислотных остатка, в частности аргинин (Аrg) и/или лизин (Lys),
(А2-А20) - аминокислотные остатки в положениях А2-А20 А-цепи человеческого инсулина,
R3 - аминокислотный остаток аспарагин (Asn) или глицин (Glу).
R2 - пептид с 2-15 аминокислотными остатками, на карбоксильном конце которого находится аргининовый остаток (Arg),
R1 - фенилаланиновый остаток (Phe),
(В2-В29) - аминокислотные остатки в положениях В2-В29 В-цепи человеческого инсулина,
Y - треониновый остаток (Thr),
Х - аминокислотный остаток аргинин (Аrg) или пептид с 2-35 аминокислотными остатками, причем в начале и в конце пептида стоят два основных аминокислотных остатка, в частности аргинин (Аrg) и/или лизин (Lys),
(А2-А20) - аминокислотные остатки в положениях А2-А20 А-цепи человеческого инсулина,
R3 - аминокислотный остаток аспарагин (Asn) или глицин (Glу).
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE19735711A DE19735711C2 (de) | 1997-08-18 | 1997-08-18 | Verfahren zur Herstellung eines Vorläufers von Insulin oder Insulinderivaten mit korrekt verbundenen Cystinbrücken |
DE19735711.3 | 1997-08-18 |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2002126598/15A Division RU2302882C2 (ru) | 1997-08-18 | 2002-10-07 | Способ получения инсулина или производных инсулина с правильно соединенными цистиновыми мостиками |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU98116259A RU98116259A (ru) | 2000-06-10 |
RU2205836C2 true RU2205836C2 (ru) | 2003-06-10 |
Family
ID=7839275
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU98116259/04A RU2205836C2 (ru) | 1997-08-18 | 1998-08-17 | Усовершенствованный способ получения предшественника инсулина с правильно соединенными цистиновыми мостиками |
RU2002126598/15A RU2302882C2 (ru) | 1997-08-18 | 2002-10-07 | Способ получения инсулина или производных инсулина с правильно соединенными цистиновыми мостиками |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2002126598/15A RU2302882C2 (ru) | 1997-08-18 | 2002-10-07 | Способ получения инсулина или производных инсулина с правильно соединенными цистиновыми мостиками |
Country Status (21)
Country | Link |
---|---|
US (3) | US5986048A (ru) |
EP (2) | EP0980874B1 (ru) |
JP (1) | JP4291900B2 (ru) |
KR (2) | KR100537842B1 (ru) |
CN (3) | CN1483831B (ru) |
AR (1) | AR016821A1 (ru) |
AT (2) | ATE217636T1 (ru) |
AU (1) | AU744824B2 (ru) |
BR (2) | BRPI9816233B8 (ru) |
CA (1) | CA2245151C (ru) |
CZ (1) | CZ295679B6 (ru) |
DE (3) | DE19735711C2 (ru) |
DK (2) | DK0906918T3 (ru) |
ES (2) | ES2176870T3 (ru) |
HK (3) | HK1018464A1 (ru) |
HU (2) | HU228161B1 (ru) |
ID (1) | ID20717A (ru) |
PL (1) | PL191901B1 (ru) |
PT (2) | PT906918E (ru) |
RU (2) | RU2205836C2 (ru) |
TR (1) | TR199801587A2 (ru) |
Families Citing this family (33)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE19735711C2 (de) | 1997-08-18 | 2001-04-26 | Aventis Pharma Gmbh | Verfahren zur Herstellung eines Vorläufers von Insulin oder Insulinderivaten mit korrekt verbundenen Cystinbrücken |
DE19930676B4 (de) | 1999-07-02 | 2006-01-19 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Verfahren zur Stabilisierung von Insulin, Insulinderivaten und/oder deren Vorläufer in komplexen Mischungen bei deren Lagerung in wäßrigen Lösungsmitteln |
AU2151401A (en) | 1999-12-22 | 2001-07-03 | Novo Nordisk A/S | Method for extractive refolding of scrambled single-chain polypeptides |
US20030212248A1 (en) * | 2000-07-12 | 2003-11-13 | Furman Thomas Charles | Process to increase protein stability |
DE10235168A1 (de) * | 2002-08-01 | 2004-02-12 | Aventis Pharma Deutschland Gmbh | Verfahren zur Reinigung von Preproinsulin |
DE102004015965A1 (de) * | 2004-04-01 | 2005-10-20 | Aventis Pharma Gmbh | Verfahren zur Gewinnung von Insulinen durch verbesserte Luftbegasung der Faltung |
ATE497973T1 (de) | 2005-12-22 | 2011-02-15 | Genentech Inc | Rekombinante produktion heparinbindender proteine |
SG162834A1 (en) | 2006-07-14 | 2010-07-29 | Genentech Inc | Refolding of recombinant proteins |
CN101815944A (zh) * | 2007-07-03 | 2010-08-25 | 安姆根有限公司 | 利用包含体干重的蛋白测量 |
RU2451750C2 (ru) * | 2007-09-24 | 2012-05-27 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Герофарм" | Способ получения рекомбинантного с-пептида проинсулина человека |
RU2524423C2 (ru) | 2008-01-09 | 2014-07-27 | Санофи-Авентис Дойчланд Гмбх | Новые производные инсулина с чрезвычайно замедленным профилем время/действие |
US9296806B2 (en) * | 2008-04-30 | 2016-03-29 | Wockhardt Limited | Processes for refolding of insulin |
CA2740685C (en) | 2008-10-17 | 2018-09-11 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Combination of an insulin and a glp-1 agonist |
JP5973918B2 (ja) | 2009-11-13 | 2016-08-23 | サノフィ−アベンティス・ドイチュラント・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング | Glp−1アゴニスト及びメチオニンを含む薬学的組成物 |
AU2010317995B2 (en) | 2009-11-13 | 2014-04-17 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Pharmaceutical composition comprising a GLP-1 agonist, an insulin, and methionine |
JP6199186B2 (ja) | 2010-08-30 | 2017-09-20 | サノフィ−アベンティス・ドイチュラント・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング | 2型糖尿病の治療用の医薬の製造のためのave0010の使用 |
US9821032B2 (en) | 2011-05-13 | 2017-11-21 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Pharmaceutical combination for improving glycemic control as add-on therapy to basal insulin |
TWI559929B (en) | 2011-09-01 | 2016-12-01 | Sanofi Aventis Deutschland | Pharmaceutical composition for use in the treatment of a neurodegenerative disease |
US20180282405A1 (en) * | 2012-08-05 | 2018-10-04 | Absci, Llc | Cytoplasmic expression system |
WO2014099577A1 (en) | 2012-12-17 | 2014-06-26 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Process for purifying insulin and analogues thereof |
ES2868351T3 (es) * | 2013-02-26 | 2021-10-21 | Hanmi Pharm Ind Co Ltd | Conjugados de análogos de insulina y usos de los mismos |
CN103694339B (zh) * | 2013-12-04 | 2017-10-13 | 珠海联邦制药股份有限公司 | 一种甘精胰岛素前体的复性方法 |
EP3116531B1 (en) | 2014-03-14 | 2021-10-20 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Purifying insulin using cation exchange and reverse phase chromatography in the presence of an organic modifier and elevated temperature |
HRP20230470T1 (hr) | 2014-12-12 | 2023-07-21 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Formulacija fiksnog omjera inzulin glargin/liksisenatid |
TWI748945B (zh) | 2015-03-13 | 2021-12-11 | 德商賽諾菲阿凡提斯德意志有限公司 | 第2型糖尿病病患治療 |
TW201705975A (zh) | 2015-03-18 | 2017-02-16 | 賽諾菲阿凡提斯德意志有限公司 | 第2型糖尿病病患之治療 |
CN104911203A (zh) * | 2015-06-30 | 2015-09-16 | 成都易胜科生物科技有限公司 | 一种重组人胰岛素的工业制备方法 |
WO2017040363A1 (en) | 2015-09-02 | 2017-03-09 | Merck Sharp & Dohme Corp. | A process for obtaining insulin with correctly formed disulfide bonds |
US10689430B2 (en) | 2016-05-25 | 2020-06-23 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Insulin receptor partial agonists |
WO2018018613A1 (zh) | 2016-07-29 | 2018-02-01 | 广东东阳光药业有限公司 | 一种提高抗体纯度的细胞培养基和培养方法 |
CN113773400B (zh) * | 2020-06-09 | 2023-08-18 | 宁波鲲鹏生物科技有限公司 | 一种门冬胰岛素衍生物及其应用 |
CN113773391B (zh) * | 2020-06-09 | 2023-10-20 | 宁波鲲鹏生物科技有限公司 | 一种门冬胰岛素的制备方法 |
CN113773396A (zh) * | 2020-06-10 | 2021-12-10 | 宁波鲲鹏生物科技有限公司 | 一种地特胰岛素衍生物及其应用 |
Family Cites Families (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
NZ199391A (en) * | 1981-01-02 | 1985-12-13 | Genentech Inc | Chimeric polypeptides comprising a proinsulin sequence,and preparation by recombinant dna technique;production of human insulin |
DE3501641A1 (de) * | 1985-01-19 | 1986-07-24 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Verfahren zur gewinnung von insulin-vorlaeufern aus reaktionsgemischen, die bei der faltung von insulin-vorlaeufern aus den entsprechenden s-sulfonaten anfallen |
IL95495A (en) * | 1989-08-29 | 1996-10-16 | Hoechst Ag | Fusion proteins their preparation and use |
EP0600372B1 (de) * | 1992-12-02 | 1997-02-05 | Hoechst Aktiengesellschaft | Verfahren zur Gewinnung von Proinsulin mit korrekt verbundenen Cystinbrücken |
DE4405179A1 (de) * | 1994-02-18 | 1995-08-24 | Hoechst Ag | Verfahren zur Gewinnung von Insulin mit korrekt verbundenen Cystinbrücken |
BR9408638A (pt) * | 1994-12-29 | 2004-09-21 | Bio Technology General Corp | Geração de insulina humana |
DE19735711C2 (de) * | 1997-08-18 | 2001-04-26 | Aventis Pharma Gmbh | Verfahren zur Herstellung eines Vorläufers von Insulin oder Insulinderivaten mit korrekt verbundenen Cystinbrücken |
-
1997
- 1997-08-18 DE DE19735711A patent/DE19735711C2/de not_active Expired - Lifetime
-
1998
- 1998-08-11 DE DE59803985T patent/DE59803985D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-08-11 EP EP99115386A patent/EP0980874B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-08-11 PT PT98115048T patent/PT906918E/pt unknown
- 1998-08-11 PT PT99115386T patent/PT980874E/pt unknown
- 1998-08-11 AT AT98115048T patent/ATE217636T1/de active
- 1998-08-11 DK DK98115048T patent/DK0906918T3/da active
- 1998-08-11 DE DE59804121T patent/DE59804121D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-08-11 EP EP98115048A patent/EP0906918B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-08-11 AT AT99115386T patent/ATE217012T1/de active
- 1998-08-11 ES ES98115048T patent/ES2176870T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-08-11 DK DK99115386T patent/DK0980874T3/da active
- 1998-08-11 ES ES99115386T patent/ES2177178T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-08-14 ID IDP981136A patent/ID20717A/id unknown
- 1998-08-14 AR ARP980104052A patent/AR016821A1/es active IP Right Grant
- 1998-08-14 CA CA002245151A patent/CA2245151C/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-08-17 CN CN031523307A patent/CN1483831B/zh not_active Expired - Lifetime
- 1998-08-17 BR BRPI9816233A patent/BRPI9816233B8/pt not_active IP Right Cessation
- 1998-08-17 HU HU9801886A patent/HU228161B1/hu unknown
- 1998-08-17 AU AU80763/98A patent/AU744824B2/en not_active Expired
- 1998-08-17 BR BR9803755-2A patent/BR9803755A/pt not_active Application Discontinuation
- 1998-08-17 TR TR1998/01587A patent/TR199801587A2/xx unknown
- 1998-08-17 US US09/134,836 patent/US5986048A/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-08-17 CZ CZ19982598A patent/CZ295679B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1998-08-17 HU HU0600287A patent/HU228203B1/hu unknown
- 1998-08-17 RU RU98116259/04A patent/RU2205836C2/ru active
- 1998-08-17 JP JP23036898A patent/JP4291900B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1998-08-17 CN CN2006101000625A patent/CN101186940B/zh not_active Expired - Lifetime
- 1998-08-17 CN CN98117909A patent/CN1132845C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1998-08-18 PL PL328108A patent/PL191901B1/pl unknown
- 1998-08-18 KR KR1019980033384A patent/KR100537842B1/ko not_active IP Right Cessation
-
1999
- 1999-08-06 HK HK99103399A patent/HK1018464A1/xx not_active IP Right Cessation
- 1999-08-31 US US09/386,303 patent/US6380355B1/en not_active Expired - Lifetime
-
2001
- 2001-09-07 US US09/947,563 patent/US6727346B2/en not_active Expired - Lifetime
-
2002
- 2002-10-07 RU RU2002126598/15A patent/RU2302882C2/ru active
-
2004
- 2004-07-06 HK HK04104835.7A patent/HK1061870A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2005
- 2005-05-27 KR KR1020050044974A patent/KR100574580B1/ko not_active IP Right Cessation
-
2008
- 2008-07-18 HK HK08107963.0A patent/HK1119449A1/xx not_active IP Right Cessation
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2205836C2 (ru) | Усовершенствованный способ получения предшественника инсулина с правильно соединенными цистиновыми мостиками | |
EP0397420B1 (en) | Enzymatic removal of a protein amino-terminal sequence | |
US5473049A (en) | Process for obtaining proinsulin possessing correctly linked cystine bridges | |
US4649131A (en) | Growth hormone releasing factor analogs | |
EP0251615B1 (en) | Method of chain combination | |
US5698669A (en) | Tri-arginine insulins | |
NO318424B1 (no) | Fremgangsmate for isolering av insulin med korrekt koblede cysteinbroer | |
Inouye et al. | Semisynthesis and properties of some insulin analogs | |
FI98731C (fi) | Menetelmä superaktiivisten insuliinianalogien valmistamiseksi | |
CA1254000A (en) | Growth hormone releasing factor analogs | |
US7659363B2 (en) | Process for the preparation of insulin or an insulin derivative in the presence of oxygen | |
EP0037255B1 (en) | Process for producing an insulin precursor | |
US4732972A (en) | Polypeptides having growth hormone releasing activity | |
DANHO et al. | Human Proinsulin, IV. Synthesis of a Protected Peptide Fragment Corresponding to the Sequence 1-23 of the Prohormone | |
MXPA98006666A (en) | Improved procedure for the obtaining of insulin precursors with cistina bridges correctly uni |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PD4A | Correction of name of patent owner |