CN1034080C

CN1034080C - 胰岛素类似物的制备方法

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Publication number: CN1034080C
Application number: CN90101415A
Authority: CN
Inventors: 罗纳德·尤金·钱斯; 理查德·丹尼斯·迪马奇; 布鲁斯·希尔·弗兰克; 詹姆斯·埃德温·希尔滋
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 1989-02-09
Filing date: 1990-02-08
Publication date: 1997-02-19
Anticipated expiration: 2005-02-08
Also published as: PT93057A; IE900440L; FI95915C; BG60769B2; CN1148984A; LU88830I2; HU212679B; HK60296A; NZ232375A; CY1911A; IE73251B1; DK0383472T3; DE69025210T2; ATE133961T1; DK0678522T3; EP0383472A3; CA2009579C; DE69033889D1; KR0169727B1; NL960026I2

Abstract

在B链的29位置和其它任选位置经修饰的人胰岛素类似物，它具有改进的生物化学和药物动力学性质，可用于治疗高血糖。

Description

胰岛素类似物的制备方法

本发明涉及经过在天然人胰岛素B链的第29位氨基酸和其他可选择位点的修改而得到的胰岛素类似物。所说的胰岛素类似物不易于聚合或自我联合成大分子形式，从而具有相对较快的活化作用，并且保留了天然人胰岛素的生物活性。

本发明提供了具如下结构式的胰岛素类似物其中A21是丙氨酸、天门冬酰胺、天门冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、苏氨酸或丝氨酸；B1是苯丙氨酸、天门冬氨酸或者缺失；B2是缬氨酸或在B1不存在时缺失；B3是天门冬酰胺或天门冬氨酸；B9是丝氨酸或天门冬氨酸；B10是组氨酸或天门冬氨酸；B28是任一种氨基酸；B29是L-脯氨酸、D-脯氨酸、D-羟脯氨酸、L-羟脯氨酸、L-(N-甲基赖氨酸)、D-赖氨酸、L-(N-甲基精氨酸)或D-精氨酸；B30是丙氨酸、苏氨酸或者缺失；Z是-OH、-NH₂、-OCH₃或-OCH₂CH₃；X是Arg、Arg-Arg、Lys、Lys-Lys、Arg-Lys、Lys-Arg或者缺失；而Y可以是只有当X存在时才存在，如果存在，则可以是谷氨酸，或者是一个含有下列全部或部分顺序的氨基酸顺序：-Glu-Ala-Glu-AsP-leu-Gln-Val-Gly-Gln-Val-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Ser-Leu-Gln-Lys-Arg-，而且Y的顺序以上述顺序的N端谷氨酸为起点。

本文还公开和申请了一种治疗高血糖症的方去，该方法是在病人需要时给以有效量的结构I的胰岛素类似物。而且，本文还公开和申请了一些由有效量的结构I的胰岛素类似物和一种或多种医药上可接受的赋形剂组成的药物组合物。

本文所提供的附图没有按实际比例描绘。

图1是质粒pKC283的切割位点和功能图。

图2是质粒pKC283PX的切割位点和功能图。

图3是质粒pKC283-L的切割位点和功能图。

图4是质粒pKC283-LB的切割位点和功能图。

图5是质粒pKC283-PRS的切割位点和功能图。

图6是质粒pL32的切割位点和功能图。

图7是质粒pNM789的切割位点和功能图。

图8是质粒120的结构略图。

图9是质粒pL47的切割位点和功能图。

图10是质粒pPR12的切割位点和功能图。

图11是质粒pPR12ARl的切割位点和功能图。

图12是质粒pL110的切割位点和功能图。

图13是质粒pL110C的结构略图。

图14是质粒pCZR126S的切割位点和功能图。

图15是合成的人胰岛素原基因的核苷酸顺序。

图16是质粒pRB145的切割位点和功能图。

图17是质粒pRB164A的切割位点和功能图。

图18是质粒pRB172的切割位点和功能图。

图19是质粒pRB173的切割位点和功能图。

图20是质粒pRB175的切割位点和功能图。

结构式I代表本发明胰岛素类似物的氨基酸顺序略图。氨基酸缩写字母具有下列常规含义：

缩写氨基酸

Aba α-氨基丁酸

Ala 丙氨酸

Arg 精氨酸

Asn 天门冬酰胺

Asp 天门冬氨酸

Cya 磺基丙氨酸

Cys 半胱氨酸

Gln 谷氨酰胺

Glu 谷氨酸

Gly 甘氨酸

His 组氨酸

Ile 异亮氨酸

Leu 亮氨酸

Lys 赖氨酸

Met 蛋氨酸

Nle 亮氨酸

Nva 正缬氨酸

Orn 鸟氨酸

Phe 苯丙氨酸

Pro 脯氨酸

Ser 丝氨酸

Thr 苏氨酸

Trp 色氨酸

Tyr 酪氨酸

Val 缬氨酸

B28可以是任何天然或非天然产生的氨基酸。所说的氨基酸最好是天门冬氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、正亮氨酸、脯氨酸、精氨酸、组氨酸、瓜氨酸、鸟氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸或甘氨酸。在上述氨基酸中，其中优选的亚组为天门冬氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、正亮氨酸、脯氨酸、精氨酸、组氨酸、鸟氨酸或赖氨酸。赖氨酸是B28的最佳氨基酸选择。B29最好是L-脯氨酸、D-脯氨酸、D-羟脯氨酸或L-羟脯氨酸。本发明的最佳胰岛素类似物是一种B28是赖氨酸而B29是脯氨酸的胰岛素类似物，也就是说。将天然人胰岛素B链氨基酸顺序中的B28和B29位点进行颠倒。

如上所述，另一种方案是，当B28是L-脯氨酸时，位点B29优选L-(N-甲基赖氨酸)、D-赖氨酸、L-(N-甲基精氨酸)或D-精氨酸。这种方案的最佳胰岛素类似物中B28是L-脯氨酸而B29是L-(N-甲基赖氨酸)或D-赖氨酸。

下面还讨论了本发明胰岛素类似物的进一步修改，也就是说，在位点B28和B29以外的位点处对胰岛素类似物进行修改。尤其是希望用丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、苏氨酸或丝氨酸在A链的21位点处(也即羧端)随意地取代天冬酰胺残基，如果进行取代，最好用丙氨酸取代。同样，可在B链的位点3处用天冬氨酸取代天冬酰胺残基。这种可选择地取代可以有效地增加胰岛素类似物在pH极端状态下的稳定性，因为天冬酰胺在低pH和高pH下都特别易于脱酰胺和出现重排反应。熟练的技术人员也会认为，胰岛素类似物的谷氨酰胺基团同样易于脱酰胺和重排。因此，对谷氨酸进行取代也属本发明的范围。另外，对本发明胰岛素类似物的可选择修改还包括(可与其他任何修改相结合)用天冬氨酸在B10位取代组氨酸；用天冬氨酸在B1位取代苯丙氨酸；用丙氨酸在B30位取代苏氨酸；用天冬氨酸在B9位取代丝氨酸；单独使B1位的氨基酸缺失(des-B1)或同时使B2位的氨基酸缺失(des-B2)；和B30位的苏氨酸缺失(des-B30)。

对本发明的胰岛素类似物的修改还可在B30末端加上任何一种下列氨基酸或二肽：Arg、Arg-Arg、Lys、Lys-Lys、Arg-Lys或Lys-Arg。如果存在这些基团，在结构式I中用X表示。进行这种延伸时，最好是用Arg-Arg。

另外，如果进行上述B30处的伸展，还可以进一步对该类似物进行修改，方法是在得到的B30延伸后的末端加上谷氨酸或含有下列全部或部分顺序的氨基酸顺序：-Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-Gln-Val-Gly-Gln-Val-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Ser-Leu-Gln-Lys-Arg-，该顺序的N端以谷氨酸开始。如果加上这个氨基酸或顺序，在结构式I中以Y基团表示。如果该顺序只是上述顺序的一部分，它可以是以该顺序的N端为起点的任何部分，也就是说以谷氨酸为起点。

在上述中，X或X与Y的结合代表了存在于人胰岛素原中的全部或部分连接肽，人胰岛素原是天然人胰岛素形成中的生物学前体。

Y的优选顺序是：-Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-Gln-Val-Gly-Gln-Val-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Ser-Leu-Gln-Lys-Arg-；-Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-Gln-Val-Gly-Gln-Val-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Ser-Leu-Gln-Lys-；-Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-Gln-Val-Gly-Gln-Val-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Ser-Leu-Gln-；-Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-Gln-Val-Gly-Gln-Val-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala-Leu-Glu-；-Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-Gln-Val-Gly-Gln-Val-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala-；和-Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-Gln-Val-Gly-Gln-Val-Glu-。

另外，不论X是单独还是与Y同时存在或不存在，末端基团Z可以是下列基团的任何一种：-OH、-NH₂、-OCH₃或-OCH₂CH₃。最好是-OH。

如上所述，本发明还包括胰岛素类似物的医药上可接受的盐。这些盐最好是它的锌盐、钠盐、钾盐、镁盐或钙盐。

可以采用任何一种公认的肽合成技术制备本发明的胰岛素类似物，这些技术包括古典方法(溶液法)、固相法、半合成法和最近出现的DNA重组法。

在固相方法中，氨基酸顺序的构建是从一个起始的、不溶性的、树脂支持的C端氨基酸依次进行的。对固相法的描述见J.Stewart等，《固相肽合成》，Freeman and Co.，SanFrancisco，1969。

一般情况下，在固相方法中，将与所需肽的C端氨基酸残基相对应的氨基酸固定于一个不溶的树脂支持物上，然后即可从树脂支持的C端氨基酸开始形成肽链。依次加上单个氨基酸直至得到所要求的氨基酸顺序。也可以制备小的肽片段，然后按照所需顺序加到肽链上。在整个合成过程中肽链保持固定于树脂上，而当肽链合成完成时，即将肽链从树脂上分离下来。

可以通过在C端部分的羧基与树脂基质上作为连接点的特定亚甲基之间形成酯键，将肽链连接到聚苯乙烯树脂上。

可用现有技术中的已知方法将氨基酸连接在一起以形成肽键。一种方法是，将氨基酸转化成一种衍生物，使得羧基更易于和肽片段的自由N端氨基发生反应。例如，可通过使保护的氨基酸与氯甲酸乙酯、氯甲酸苯酯、氯甲酸仲丁酯或氯甲酸异丁酯发生反应，而把氨基酸转化成一种混合酐。也可以把氨基酸转化成一种活性酯，如一种2，4，5-三氯苯酯、一种五氯苯酯、一种对硝基苯酯、一种N-羟基琥珀酰亚胺酯或一种由1-羟基苯并***形成的酯。

另外一种连接方法包括使用一种合适的连接剂，如N，N′-二环己基碳二亚胺(DCC)或N，N′-二异丙基碳二亚胺(DIC)。其他合适的连接剂对于现有技术中的专业人员来说是显而易见的。见Schroder和Lubke，《肽》，Academic Press，1965，第3章，本文对此进行了参考。

应当指出，在连接反应中必须对肽合成中所用的每个氨基酸的α-氨基进行保护，以防止出现涉及活性α-氨基功能的副作用。还应当指出的是，某些氨基酸含有活性的侧链功能团(如硫氢基、ε-氨基、β-和γ-羧基、咪唑、胍基和羟基等)，而且在起始和依次连接步骤中必须对这些功能团进行保护。适宜的保护基团在现有技术中是已知的。例如，参见《有机化学中的保护基团》，M.Mcomie，editor，Plenum Press，NY，1973和US4,617,149。本文对此进行了参考。

在选择某一特定保护基团时，必须考虑到某些条件。一个α-氨基保护基团(1)必须使得α-氨基在发生连接反应的情况下不具备功能活性，(2)必须在完成连接反应之后，在不去掉侧链保护基团和不改变肽片段结构的情况下易于去除，(3)必须排除在连接之前活化时的消旋可能性。一个侧链保护基团(1)必须使得侧链功能团在连接反应中不具备活性，(2)必须在去除α-氨基保护基团的条件下处于稳定状态，(3)必须是在不改变肽链结构的反应条件下完成所需氨基酸顺序后易于去掉的。

已知可用于肽合成的这些保护基团对于去除它们时所用试剂的反应活性各不相同，这对于现有技术中的专业人员来说是显而易见的。例如，某些保护基团，象三苯甲基和2-(对-联苯基)异丙基氧羰基都非常不稳定，在轻度酸性条件下即可被切割下来。其他保护基团，象t-丁基氧羰基、t-戊基氧羰基、金刚烷基氧羰基和p-甲氧苄氧基羰基都较稳定，需要稍强的酸，象三氟乙酸、盐酸或三氟化硼乙酸才能将它们去除。还有一些保护基团，象苄氧基羰基、卤苄氧基羰基、对硝基苄氧基羰基、环烷氧基羰基和异丙基氧羰基甚至更稳定，要去除它们，需要更强的酸，象氟化氢、溴化氢或在三氟乙酸中的三氟乙酸硼。

当所需肽顺序合成完毕后，要将已保护的肽从树脂支持物上切割下来，并且去掉所有的保护基团。切割反应和保护基团的去除可以同时进行或逐步进行。如果树脂支持物是一种氯甲基化的聚苯乙烯树脂，将肽固定于该树脂上的键则是一种C端部分的自由羰基与树脂上存在的许多氯甲基中的一种之间形成的酯键。

应当指出，可以用已知能够切割酯键和能够透过树脂的试剂使固定键分离。一种尤其方便的方法是用液态的无水氟化氢进行处理。这种试剂不仅可以将肽从树脂上分离下来，而且还可以去掉所有的保护基团。因此，使用这种试剂可以直接得到完全脱保护的肽。如果需要分离下肽而不去掉保护基团，可以将保护的肽—树脂进行甲醇分析，而得到C端羧基甲基化的被保护肽。然后可将甲酯在轻度碱性条件下进行水解，得到自由C端羧基。之后可用一种强酸如液态氟化氢进行处理，去掉肽链上的保护基团。一种尤为有用的甲醇分析法见G.Moore等人，《肽》，Proc.5th Amer.Pept.Symp.，M.Goodman和J.Meienhofer编，John Wiley，NY，1977，pp.518-521，该方法是，在冠醚的存在下，用甲醇和***对已保护的肽—树脂进行处理。

另一种方法是通过氨解作用或通过用肼进行处理将已保护的肽从树脂上分离下来。如果需要，可以将得到的C端酰胺或肼水解成自由C端羧基，并且将保护基团按常规去掉。

还应当指出的是，最好在将保护的肽从树脂支持物上分离下的同时或之前，就把N端α-氨基上的保护基团去掉。

也可以通过DNA重组技术制备本发明的胰岛素类似物的A和B链。在制备过程中，使用现有的常规合成技术制备可编码A或B链所需肽的核苷酸顺序。这些方法一般包括，制备一些可用于编码那些所需编码顺序的片段及其互补顺序的寡核苷酸。所设计的寡核苷酸能够将一个编码顺序的片段和两个互补顺序的片段进行重迭，并且反过来也这样。将寡核苷酸配对，并且连接在一起，最后制得所需基因顺序。

将该顺序插到一个克隆载体的某个位置以使它所编码的肽产物得以表达。一个合适的克隆载体至少含有一部分某种基因的表达控制顺序。

还可以使用DNA重组方法，用一种胰岛素原样前体制备本发明胰岛素类似物的A和B链。见Frank等，《多肽：合成—结构—功能》，Proc.7th Am.Pept.Symp.，Eds.D.Rich和E.Gross编(1981)，本文对此进行了参考。

将不管怎样制备的单个A链和B链结合在一起，可以采用Chance等人的方法，见Chance等，《多肽：合成，结构和功能：第七届美国肽专题论文集》，1981，本文对此进行了参考。

下列实例作为对本发明的解释，但不限制本发明。实例1 Lys(B28)，Pro(B29)人胰岛素A.用重组法制备A链

通过DNA重组法制备人胰岛素A链，即化学合成编码A链的基因并使其在大肠杆菌中表达。简单地说，就是通过磷酸酯片段法，用各种三核苷酸合成10-15核苷酸长度的合成片段以制备A链基因。这个基因具有EcoRI和BamHI限制性核酸内切酶的单链粘性末端。将它插到一个含有β-半乳糖苷酶基因(β-gal)的适宜表达载体中，可得到一个使A链通过蛋氨酸密码连接到β-半乳糖苷酶基因上的嵌合质粒。最好用色氨酸合成酶基因(trpLE′)替代β-半乳糖苷酶基因作为启动子以达到更高水平的表达。将嵌合质粒转移到大肠杆菌内以表达前体蛋白，即β-gal-met-A链(或当使用色氨酸启动子***时是trp LE′-met-A链)。在纯化后用溴化氰对该前体蛋白进行处理以切断蛋氨酸键，得到人胰岛素A链。通过氧化型亚硫酸解(sulfitolysis)可以得到S-磺化的A链，用它和下面所说的B链(S-磺化)进行结合。

有关人胰岛素A链基因化学合成的全部详细情况见Crea等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA75：5765-5769，1978以及该文所引用的参考文献。本文参考了这些文献。有关人胰岛素A链的化学合成基因在大肠杆菌内表达的全部详细资料见Goeddel等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA76：101-110，1979以及该文中所引用的参考文献。本文对此进行了参考。B. 制备B链类似物〔Lys(B28)，Pro(B29)〕

使用Applied Biosystems公司的430A型肽合成仪(包括软件转换1.4)来制备粗制肽基树脂。使用0.5毫摩尔(mmol)的起始固相树脂(t-BOC-Thr(Bzl)OCH₂ Pam树脂)(0.76mmol/g×0.658g)。所使用的全部氨基酸用BOC进行保护，而且除谷氨酸和组氨酸外，所有氨基酸可以在买来后直接使用(也就是Applied Biosystems公司的储存管，每个储存管容有大约2mmol的保护氨基酸)。从国际肽公司(Peptides International Corporation)得到谷氨酸和组氨酸，并将它们转移到储存管中，使每个储存管容有大约2mmol的所需保护氨基酸。将粗制肽基树脂干燥(在真空室温下过夜)后，测定其重量，并与起始重量比较以确定合理的重量增值。取一小部分样本进行氨基酸分析，以确保所要的氨基酸是以正确数量加入的。

通过在含有10份(V/W)HF(含有5％V/V乙硫醇和5％V/V间甲酚)和1份肽基树脂的溶液中在0℃下搅拌大约1小时，将肽从肽基树脂上分离下来并去除对侧链的保护。利用真空将大部分HF去掉后在***中使肽沉淀。用***冲洗几次后进行真空过滤，将肽溶于大约200ml的含有0.1M Tris，0.1MKa₂SO₃和0.01M Na₂S₄O₆的7M去离子尿素中。用5NNaOH将溶液pH调至8.5，并在4℃下有力地搅拌过夜。

在室温下将得到的S-磺化肽溶液置于一个5×215cm的Sephadex G-25柱(细)上。用50mM碳酸氢铵在室温下以20ml/分的速度洗脱样品。在276nm监测流出液。收集20ml的组分，合并所需组分，如下面所述用高效液相层析(HPLC)进一步纯化。

将所需组分的合并液抽到2.5×30cm Dupont C8，9-12μm HPLC的柱上，并在室温下用在100mM碳酸氢铵中含有以线性梯度增加的乙腈的溶液洗脱(2.6ml/min)。在280nm波长下监测流出液。收集25ml的组分。用分析型HPLC对选择组分进行分析，确定哪些组分需要保留。合并所需组分并冻干，以便在与上述制备的A链结合时使用。C. 制备Lys(B28)，Pro(B29)人胰岛素

用上述Chance等人的方法将A和B链进行结合。在环境温度下，分别将700mg的DNA重组法制备的A链S-磺化物和140mg合成的Lys(B28)，Pro(B29)B链S-磺化物(二者都如上述得到)分别溶于70ml和14ml 0.1M甘氨酸缓冲液中。用5N NaOH将每个缓冲液调至PH10.5，然后冷却到5℃。在环境温度下，在0.1M甘氨酸缓冲液中以10.5mg/ml浓度制备6ml的二硫苏糖醇(DTT)溶液，并用5N NaOH调至pH10.5，然后冷却到5℃。

将A和B链溶液混合，然后快速加入5.21ml DTT溶液(SH/SSO₃ ^-＝0.90)。将反应液在敞开的200ml玻璃离心瓶中在5℃下搅拌2.5小时。再加入45ml冰乙酸并将该溶液在5℃放置过夜。

将得到的沉淀混合物在5℃下以2000rpm离心20分钟。将上清液和沉淀物的1M乙酸洗涤液混合，在5℃下置于在1M乙酸中的5×200cm Sephadex G-50(超细)柱上，靠重力洗脱。在三天内收集20分钟的组分。在276nm波长下监测组分，有些则用分析型HPLC分析。将含有胰岛素类似物Lys(B28)，Pro(B29)顺序的组分合并，冻干后得到125mg样品。通过反相HPLC将此样品进一步纯化(使用2.12×25cm DuPont C8柱，在室温下以2.6ml/分的速度，用0.1MNaH₂PO₄中含有以线性梯度增加的乙腈的pH2.2溶液洗脱)。在276nm波长下监测流出液。将选择的组分用分析型HPLC进行测定。合并所需组分，并用下述的pH7的HPLC进一步纯化。

将低pH HPLC制备中的合并液用0.1M(NH₄)₂HPO₄在冰浴中稀释大约2倍。用冷却的2N NaOH在冰浴中将pH调至7。使用低pH制备中所用的相同条件，将该样品置于同样的HPLC柱上洗脱，只是洗脱缓冲液改为0.1M pH7(NH₄)₂HPO₄/乙腈。

将在pH7 HPLC制备中的合并液在冰浴中冷却，并用0.1％三氟乙酸水溶液(TFA)将其稀释2倍。加入1N HCl(冷的，将样品置于冰浴中)使pH降至3。将该样品置于Vydac C4或DuPont C8 HPLC柱上(2.12×25cm)，并用乙腈浓度以线性梯度增加的0.1％TFA水溶液洗脱。在214nm波长下或276nm波长下监测流出液。合并所需组分并冻干，经过反相HPLC纯化，得到41mg所需类似物，纯度大于97％。实例2Lys(B28)，Pro(B29)人胰岛素

第二种制备Lys(B28)，Pro(B29)人胰岛素的方法是使用酶促半合成法(反向蛋白水解法)，用一种合成的八肽与缺八肽胰岛素(A_1-21-B_1-22)结合。该缺八肽胰岛素可通过将天然猪或人胰岛素用胰蛋白酶消化而获得。有关描述见Bromer和Chahce“缺八肽胰岛素的制备和特征”，Biochim.Biophys.Acta133：219-223(1967)，本文对此进行了参考。通过上述的自动固相合成方法可制备合成八肽，Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Lys-Pro-Thr 。

将缺八肽胰岛素(435mg)和465mg合成的Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Lys-Pro-Thr在15ml含有1份二甲亚砜，2份1，4-丁二醇(1，4-butanediol)和1份0.25M pH7.3的Tris乙酸盐缓冲液的溶液中结合。通过在电炉上加热溶液使多肽完全溶解。然后在37℃保温该溶液，加入90mg猪胰蛋白酶。在37℃下不时地搅拌该溶液90分钟。向溶液中加入135ml0.05NHCl以终止该反应。

将含有类似物的酸化溶液置于一个2.5×25cm C8Zorbax HPLC柱上，用乙腈浓度呈线性梯度增加的0.1M磷酸二氢钠pH2.2缓冲液洗脱，以纯化本实例的胰岛素类似物。在276nm波长下监测流出液。合并所需组分，用水稀释2倍，然后置于1×25cm C8 Ultrasphere HPLC柱上。用乙腈浓度呈线性增加的0.5％TFA水溶液洗脱胰岛素类似物。在276nm波长下监测流出物。再合并所需组分并冻干，得到125mg的纯胰岛素类似物。通过氨基酸分析(表I)和质谱分析(MS)来验证其结构。

MS：5809.2(理论值：5808.7)

用VG-ZAB-25E双聚焦质谱仪在大约1500的分辨率下进行快速原子轰击——质谱分析测定。将人胰岛素类似物溶于由甘油和含草酸的硫甘油组成的混合溶液中。用碘化铯进行从m/z5300到m/z6500的磁扫描以校准该仪器。所测得数据以平均值+1表示。实例3Aba(B28)，Pro(B29)人胰岛素

在含有1份二甲亚砜，2份1，4-丁二醇和1份0.25MTris pH7.3缓冲液的13ml溶液中，在37℃下将猪缺八肽胰岛素(384mg)和合成八肽Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Aba_Pro-Thr(362mg)结合。加入猪胰蛋白酶75mg。充分混合该溶液，并于37℃下不时地搅拌120分钟。

此时将该混合液加到137ml 0.05N HCl中终止该反应。将全部溶液抽到21×250mm C8 Zorbax柱子上，并用含有低(shallow)乙腈梯度的0.1M磷酸二氢钠pH2缓冲液洗脱该产物。

合并用分析型HPLC确定的适当的组分，用水稀释2倍，然后抽到25×300mm C-18 Vydac柱子上。用含有乙腈梯度的0.5％三氟乙酸溶液从该柱子中对脱盐蛋白进行洗脱。合并含有纯化胰岛素类似物的组分并冻干，得到59mg胰岛素类似物。通过氨基酸分析(表I)和质谱分析(MS)来验证其结构。

MS：5765.7(理论值：5765.6)

实例4Ala(B28)，Pro(B29)人胰岛素

在10ml含有1份二甲亚砜、2份1，4-丁二醇和1份0.25M Tris pH7.3缓冲液的溶液中，在37℃下使猪缺八肽胰岛素(290mg)和合成八肽Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Ala-Pro-Thr(310mg)结合。加入猪胰蛋白酶60mg。将该溶液充分混合，并在37℃下不时地搅拌60分钟。

此时将该反应液加到90ml 0.05N HCl中终止该反应。将全部溶液抽到21×250mm C-8 Zorbax柱子上，并用含有低乙腈梯度的0.1M磷酸二氢钠pH2缓冲液洗脱该产物。

合并用分析型HPLC确定的合适的组分，用水稀释2倍，然后抽到10×250mm C-8 Ultrasphere柱子上，用含有乙腈梯度的0.5％三氟乙酸溶液从柱子中洗脱去盐蛋白。合并含有纯胰岛素类似物的组分并冻干得到43mg。通过氨基酸分析(表I)和质谱分析(MS)验证其结构。

MS：5752.3(理论值：5751.6)实例5Arg(B28)，Pro(B29)人胰岛素

在10ml含有1份二甲亚砜，2份1，4-丁二醇和1份0.25M Tris pH7.3缓冲液的溶液中，于37℃下使猪缺八肽胰岛素(290mg)和合成八肽Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Arg-Pro-Thr(310mg)结合。加入猪胰蛋白酶(60mg)。将该溶液充分混合，并在37℃下不时地搅拌60分钟。

此时将该混合液加到90ml 0.05N HCl中终止该反应。将全部溶液抽到21×250mm C-8 Zorbax柱子上，并用含有低乙腈梯度的0.1M磷酸二氢钠pH2缓冲液洗脱该产物。

合并用分析型HPLC确定的合适的组分，用水稀释2倍，然后抽到10×250mm C-8 Ultrasphere柱子上。用含有乙腈梯度的0.5％三氟乙酸溶液从柱子中洗脱去盐蛋白。合并含有纯胰岛素类似物的组分并冻干得到103mg。通过氨基酸分析(表I)和质谱分析(MS)来验证其结构。

MS：5836.1(理论值：5836.7)实例6Asn(B28)，Pro(B29)人胰岛素

在14ml含有1份二甲亚砜、2份1，4-丁二醇和1份0.25M Tris pH7.3缓冲液的溶液中，在37℃下使猪缺八肽胰岛素(409mg)和合成八肽Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Asn-Pro-Thr(398mg)结合。加入猪胰蛋白酶81mg。将该溶液充分混合并在37℃下不时地搅拌120分钟。

此时把该混合溶液加到136ml 0.05N HCl中终止该反应。将全部溶液抽到21×250mm C-8 Zorbax柱子上，用含有低乙腈梯度的0.1M磷酸二氢钠pH2缓冲液洗脱该产物。

合并用分新型HPLC确定的合适的组分，用水稀释2倍，然后抽到25×300mm C-18 Vydac柱子上。用含有乙腈梯度的0.5％三氟乙酸溶液从柱子中洗脱去盐蛋白。合并含有纯化胰岛素类似物的组分并冻干得到56mg。通过氨基酸分析(表I)和质谱分析(MS)验证其结构。

MS：5794.7(理论值：5794.6)实例7Asp(B28)，Pro(B29)人胰岛素

在13ml含有1份二甲亚砜，2份1，4-丁二醇和1份0.25M Tris pH7.3缓冲液的溶液中，在37℃下使猪缺八肽胰岛素(400mg)和合成八肽Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Asp-Pro-Thr(388mg)结合。加入猪胰蛋白酶78mg。将该溶液充分混合并在37℃不时地搅拌120分钟。

此时把该混合溶液加到137ml 0.05N HCl中终止其反应。将全部溶液抽到21×250mm C-8 Zorbax柱子上，并用含有低乙腈梯度的0.1M磷酸二氢钠pH2缓冲液洗脱该产物。

合并用分析型HPLC确定的适当的组分，用水稀释4倍，然后抽到25×300mm C-18 Vydac柱子上。用含有乙腈梯度的0.1％三氟乙酸溶液从柱子中洗脱去盐蛋白。合并含有纯化胰岛素类似物的组分并冻干得到85mg。通过氨基酸分析(表I)和质谱分析(MS)验证其结构。

MS：5795.7(理论值5795.6)实例8Asp(B10)，Lys(B28)，Pro(B29)人胰岛素A.制备Asp(B10)，Lys(B28)，Pro(B29)人胰

岛素B链

使用Applied Biosystems公司的430A型肽合成仪(包括软件转换1.4)来制备粗制肽基树脂。使用0.5mmol的起始固相树脂(t-BOC-Thr(Bzl)OCH₂ Pam树脂)(0.72mmol/g×0.705g)。所用全部氨基酸用BOC保护，除谷氨酸、天冬氨酸和组氨酸外，所有氨基酸可以在买来后直接使用(也即Applied Biosystems公司的储存管；每个储存管含有大约2mmol的保护氨基酸)。从商业上得到谷氨酸、天冬氨酸和组氨酸，并转移到储存管中，使每个储存管含有大约2mmol的所需保护氨基酸。将粗制肽基树脂在真空室温下干燥过夜，并将其重量与起始重量加以比较以确定合理的重量增值。取一小部分样品进行氨基酸分析以保证所需氨基酸是以正确比例加上的。

通过将10份(V/W)HF(含有5％V/V对硫甲酚和5％V/V间甲酚)和1份肽基树脂一起在0℃下搅拌约1小时，把肽从肽基树脂上分离下来，并去除对侧链的保护。通过真空将大部分HF去除后使肽在***中沉淀。用***冲洗几次后经真空过滤，然后将肽溶于大约120ml含有0.1M Tris，35mg/ml Na₂SO₃和25mg/ml Na₂S₄O₆的8M盐酸胍pH11溶液中。用5N NaOH将该溶液调至pH8.8，并在室温下有力地搅拌3小时。

将得到的S-磺化肽溶液在室温下置于5×215cm的Sephadex G-25柱子上(中等)。用50mM碳酸氢铵在室温下以21ml/分的速度洗脱该样品。在276nm波长下监测流出液。收集每25ml一份的组分，将所需组分汇集在一起用下述高效液相色谱分析(HPLC)进一步纯化。

把收集的所需组分抽到2.5×30cm DuPont C8，9-12μ HPLC柱子上，并且用乙腈以线性梯度增加的100mM碳酸氢铵在室温下洗脱(2.6ml/分)。在280nm下监测流出液。收集25ml一份的组分。对所选择的组分进行分析型HPLC分析以确定哪部分需要保留。将所需组分合并在一起并冻干，以用于下一步与A链的结合。B.使Asp(B10)，Lys(B28)，Pro(B29)人胰岛

素B链和人胰岛素A链结合

用上述Chance等人的方法进行A和B链的结合。在环境温度下将2g的DNA重组法得到的A链S-磺化物和400mg合成的Asp(B10)，Lys(B28)，Pro(B29)B链S-磺化物分别溶于200ml和40ml的0.1M甘氨酸缓冲液中，用5N NaOH将每个溶液调至pH10.5，然后冷却至5℃。在环境温度下用0.1M甘氨酸缓冲液制备浓度为15.5mg/ml的DTT溶液，用5N NaOH调至pH10.5，然后冷却至5℃。

将A和B链溶液进行结合，然后快速加入15.9ml DTT溶液(SH/SSO₃ ^-＝1.0)。在4℃下于一个敞开的200ml玻璃离心瓶中将该溶液搅拌19.6小时。加入冰乙酸(129ml)，并将该溶液在4℃下放置1小时。

将得到的沉淀混合物在4℃下以2000rpm离心30分钟。取上清液与292ml的milli-Q水和73ml乙腈混合，并通过反相HPLC(用2.5×30cm Vydac C18柱子，在室温下用0.1M NaH₂PO₄中乙腈以线性梯度增加的pH2.1的溶液以2.6ml/分的速度洗脱)进一步纯化。在280nm下监测流出液。用分析型HPLC对所选择组分进行测定，合并所需组分，用(0.1％三氟乙酸(TFA)水溶液稀释2倍，然后置于Ultrasphere octyl HPLC柱(1.0×25cm)，用含乙腈线性梯度增加的0.1％TFA水溶液洗脱，在280nm下监测流出液。用分析型HPLC对所选择组分进行测定，合并所需组分，用上述同样的柱子和条件，只是乙腈的梯度略有不同，进行再纯化。合并合适的组分并冻干，得到65mg胰岛素类似物，通过反相HPLC得到的纯度大于93％。用氨基酸分析(表I)和质谱分析(MS)验证其结构。

MS：5786.1(理论值5786.7)实例9Cya(B28)，Pro(B29)人胰岛素

用过甲酸氧化将八肽中的半胱氨酸转化成磺基丙氨酸。在一个冰冷却的瓶子中，将合成八肽Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Cys-Pro-Thr、(363mg)溶于36ml新制备的过甲酸中，并轻轻搅拌1小时。用水将氧化物稀释10倍并冻干。该冻干物用于半合成过程。

在37℃下将缺八肽猪胰岛素(222mg)和合成八肽Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Cya-Pro-Thr(225mg)在18ml含有1份二甲亚砜，2份1，4-丁二醇和1份0.25M Tris pH7.3缓冲液的溶液中结合。加入猪胰蛋白酶45mg。充分混合该溶液，并在37℃下不时地搅拌120分钟。

将该反应液加到242ml 0.05NHCl中以终止该反应。把全部溶液置于一个21×250mm C-8 Zorbax柱子上，用0.1M磷酸二氢钠pH2缓冲液中含有低乙腈梯度的溶液洗脱该产物。

合并用分析型HPLC确定的适当的组分，用水稀释2倍，然后抽到25×300mm C-18 Vydac柱子上。用0.5％三氟乙酸中含有乙腈梯度的溶液从柱子中洗脱去盐蛋白。合并含有纯化胰岛素类似物的组分并冻干得到16mg。用氨基酸分析(表I)和质谱分析(MS)验证其结构。

MS：5831.5(理论值5831.7)实例10 Gln(B28)，Pro(B29)人胰岛素

在37℃下使猪缺八肽胰岛素(290mg)和合成八肽Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Gln-Pro-Thr(310mg)在10ml含有1份二甲亚砜，2份1，4-丁二醇和1份0.25M Tris pH7.3缓冲液的溶液中结合。加入猪胰蛋白酶(60mg)。充分混匀该溶液并在37℃下不时搅拌60分钟。

把反应液加到90ml 0.05N HCl中以终止该反应。将全部溶液抽到21×250mm C-8 Zorbax柱子上，并用0.1M磷酸二氢钠pH2缓冲液中含有低乙腈梯度的溶液洗脱该产物。

合并用分析型HPLC确定的合适的组分，用水稀释2倍，然后抽到10×250mm C-8 Ultrasphere柱子上。用0.5％三氟乙酸中含有乙腈梯度的溶液从柱子中洗脱去盐蛋白。合并含有纯化胰岛素类似物的组分并冻干得到87mg。用氨基酸分析(表I)和质谱分析(MS)验证其结构。

MS：5809.4(理论值5808.6)实例11 Glu(B28)，Pro(B29)人胰岛素

在37℃下使缺八肽猪胰岛素(402mg)和合成八肽Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Glu-Pro-Thr(398mg)在14ml含有1份二甲亚砜，2份1，4-丁二醇和1份0.25M Tris pH7.3缓冲液的溶液中结合。加入猪胰蛋白酶(80mg)。充分混匀该溶液并在37℃下不时搅拌120分钟。

将反应液加到136ml 0.05N HCl中以终止该反应。把全部溶液抽到21×250mm C-8 Zorbax柱子上，并用0.1M磷酸二氢钠中含有低乙腈梯度的pH2缓冲液洗脱该产物。

合并用分析型HPLC确定的合适的组分，用水稀释4倍，然后抽到25×300mm C-18 Vydac柱子上。用0.5％三氟乙酸中含有乙腈梯度的溶液从柱子中洗脱去盐蛋白。合并含有纯化胰岛素类似物的组分并冻干得到59mg。用氨基酸分析(表I)和质谱分析(MS)验证其结构。

MS：5809.6(理论值：5809.6)实例12 Gly(B28)，Pro(B29)人胰岛素

在37℃下将猪缺八肽胰岛素(412mg)和合成八肽Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Gly-Pro-Thr(376mg)在13ml含有1份二甲亚砜，2份1，4-丁二醇和1份0.25M Tris pH7.3缓冲液的溶液中结合。加入猪胰蛋白酶(79mg)。充分混匀该溶液，并在37℃下不时地搅拌180分钟。

将该反应液加到147ml 0.05N HCl中以终止该反应。把全部溶液抽到21×250mm C-8 Zorbax柱子上，并用0.1M磷酸二氢钠中含有低乙腈梯度的pH2缓冲液洗脱该产物。

合并用分析型HPLC确定的合适的组分，用水稀释4倍，然后抽到25×300mm C-18 Vydac柱子上。用0.1％三氟乙酸中含有乙腈梯度的溶液从柱子上洗脱去盐蛋白。合并含有纯化胰岛素类似物的组分并冻干得到11mg。用氨基酸分析(表I)和质谱分析(MS)验证其结构。

MS：5737.2(理论值5737.6)实例13 His(B28)，Pro(B29)人胰岛素

在37℃下将猪缺八肽胰岛素(400mg)和合成八肽Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-His-Pro-Thr(398mg)在13ml含有1份二甲亚砜，2份1，4-丁二醇和1份0.25M Tris pH7.3缓冲液的溶液中结合。加入猪胰蛋白酶(79mg)。充分混合该溶液并在37℃下不时地搅拌120分钟。

此时将该反应液加到237ml 0.05N HCl中以终止该反应。把全部溶液抽到21×250mm C-8 Zorbax柱子上，并用0.1M磷酸二氢钠中含有低乙腈梯度的pH2缓冲液洗脱该产物。

合并用分析型HPLC确定的合适的组分，用水稀释4倍，并抽到25×300mm C-18 Vydac柱子上。用0.1％三氟乙酸中含有乙腈梯度的溶液从柱子中洗脱去盐蛋白。合并含有纯化胰岛素类似物的组分并冻干得到79mg。用氨基酸(表I)和质谱分析(MS)验证其结构。

MS：5816.9(理论值5817.7)实例14 Ile(B28)，Pro(B29)人胰岛素

在37℃下将猪缺八肽胰岛素(409mg)和合成八肽Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Ile-Pro-Thr(398mg)在13ml含有1份二甲亚砜，2份1，4-丁二醇和1份0.25M Tris pH7.3缓冲液的溶液中结合。加入猪胰蛋白酶(81mg)。充分混合该溶液并在37℃下不时地搅拌120分钟。

此时把该反应液加到136ml 0.05N HCl中以终止该反应。将全部溶液抽到21×250mm C8 Zorbax柱子上。并用0.1M磷酸二氢钠中含有低乙腈梯度的pH2缓冲液洗脱该产物。

合并用分析型HPLC确定的合适的组分，用水稀释2倍，然后抽到25×300mm C-18 Vydac柱子上。用0.5％三氟乙酸中含有乙腈梯度的溶液从柱子中洗脱去盐蛋白。合并含有纯化胰岛素类似物的组分并冻干得到57mg。用氨基酸分析(表I)和质谱分析(MS)验证其结构。

MS：5793.7(理论值5793.7)实例15 Leu(B28)，Pro(B29)人胰岛素

在37℃下将猪缺八肽胰岛素(418mg)和合成八肽Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Leu-Pro-Thr(410mg)在14ml含有1份二甲亚砜，2份1，4-丁二醇和1份0.25M Tris pH7.3缓冲液的溶液中结合，加入猪胰蛋白酶(83mg)。充分混合该溶液并在37℃下不时地搅拌120分钟。

此时把该反应液加到136ml 0.05N HCl中以终止该反应。将全部溶液抽到21×250mm C-8 Zorbax柱子上，并用0.1M磷酸二氢钠中含有低乙腈梯度的pH2缓冲液洗脱该产物。

合并用分析型HPLC确定的合适的组分，并抽到25×300mm C-18 Vydac柱子上。用0.5％三氟乙酸中含有乙腈梯度的溶液从柱子中洗脱去盐蛋白。合并含有纯化胰岛素类似物的组分并冻干得到74mg，用氨基酸分析(表I)和质谱分析(MS)验证其结构。

MS：5793.8(理论值5793.7)实例16 Nle(B28)，Pro(B29)人胰岛素

在37℃下将猪缺八肽胰岛素(290mg)和合成八肽Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Nle-Pro-Thr(310mg)在10ml含有1份二甲亚砜，2份1，4-丁二醇和1份0.25M Tris pH7.3缓冲液的溶液中结合。加入猪胰蛋白酶(60mg)。充分混合该溶液，并在37℃下不时地搅拌60分钟。

此时将该反应液加到90ml 0.05N HCl中以终止反应。把整个溶液抽到21×250mm C-8 Zorbax柱子上，并用0.1M磷酸二氢钠中含有低乙腈梯度的pH2缓冲液洗脱该产物。

合并用分析型HPLC确定的合适的组分，用水稀释2倍，并抽到10×250mm C-8 Ultrasphere柱子上。用0.5％三氟乙酸中含有乙腈梯度的溶液从柱子中洗脱去盐蛋白。合并含有纯化胰岛素类似物的组分得到54mg。用氨基酸分析(表I)和质谱分析(MS)验证其结构。

MS：5794.6(理论值5793.7)实例17 D-Lys(B29)人胰岛素

在37℃下将猪缺八肽胰岛素(392mg)和合成八肽Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-D-Lys-Thr(387mg)在13.5ml含有1份二甲亚砜，2份1，4-丁二醇和1份0.25M Tris pH7.3缓冲液的溶液中结合。加入猪胰蛋白酶78mg。充分混合该溶液并在37℃不时地搅拌120分钟。

此时把反应液加到136.5ml 0.05N HCl中以终止该反应。将整个溶液抽到21×250mm C-8 Zorbax柱子上，并用0.1磷酸二氢钠中含有低乙腈梯度的pH2缓冲液洗脱该产物。

合并用分析型HPLC确定的合适的组分，用水稀释4倍，并抽到25×300mm C-18 Vydac柱子上。用0.5％三氟乙酸中含有乙腈梯度的溶液从柱子中洗脱去盐蛋白。合并含有纯化胰岛素类似物的组分并冻干得到94mg。用氨基酸分析(表I)和质谱分析(MS)验证其结构。

MS：5809.0(理论值5808.7)实例18 Met(B28)，Pro(B29)人胰岛素

在37℃下将猪缺八肽胰岛素(350mg)和合成八肽Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Met-Pro-Thr(366mg)在12ml含有1份二甲亚砜，2份1，4-丁二醇和1份0.25M Tris pH7.3缓冲液的溶液中结合。加入猪胰蛋白酶71mg。充分混合该溶液并在37℃下不时搅拌120分钟。

此时将反应液加到118ml 0.05N HCl中以终止该反应。将全部溶液抽到21×250mm C-8 Zorbax柱子上。并用0.1M磷酸二氢钠中含有低乙腈梯度的pH2缓冲液洗脱该产物。

合并用分析型HPLC确定的合适的组分，用水稀释4倍，并抽到25×300mm C-18 Vydac柱子上。用0.1％三氟乙酸中含有乙腈梯度的溶液从柱子中洗脱去盐蛋白。合并含有纯化胰岛素类似物的组分并冻干得到72mg。用氨基酸分析(表I)和质谱分析(MS)验证其结构。

MS：5811.8(理论值5811.7)实例19 Orn(B28)，Pro(B29)人胰岛素

在37℃将猪缺八肽胰岛素(290mg)和合成八肽Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Orn-Pro-Thr(310mg)在10ml含有1份二甲亚砜，2份1，4-丁二醇和1份0.25M Tris pH7.3缓冲液的溶液中结合。加入猪胰蛋白酶60mg。充分混合该溶液并在37℃下不时地搅拌90分钟。

此时把该反应液加到90ml 0.05N HCl中以终止该反应。将整个溶液抽到21×250mm C-8 Zorbax柱子上，并用0.1M磷酸二氢钠中含有低乙腈梯度的PH2缓冲液洗脱该产物。

合并用分析型HPLC确定的合适的组分，用水稀释2倍，并抽到10×250mm C-8 Ultrasphere柱子上。用0.5％三氟乙酸中含有乙腈梯度的溶液从柱子中洗脱去盐蛋白。合并含有纯化胰岛素类似物的组分并冻干得到89mg。用氨基酸分析(表I)和质谱分析(MS)验证其结构。

MS：5795.2(理论值5794.7)实例20 Phe(B28)，Pro(B29)人胰岛素

在37℃下将猪缺八肽胰岛素(290mg)和合成八肽Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Phe-Pro-Thr(310mg)在10ml含有1份二甲亚砜，2份1，4-丁二醇和1份0.25M Tris pH7.3缓冲液的溶液中结合。加入猪胰蛋白酶60mg。充分混合该溶液并在37℃下不时地搅拌80分钟。

此时把该反应液加到90ml 0.05N HCl中以终止该反应。将全部溶液抽到21×250mm C-8 Zorbax柱子上，并用0.1M磷酸二氢钠中含有低乙腈梯度的pH2缓冲液洗脱该产物。

合并用分析型HPLC确定的合适的组分，用水稀释4倍，并抽到25×300mm C-18 Vydac柱子上。用0.1％三氟乙酸中含有乙腈梯度的溶液从柱子中洗脱去盐蛋白。合并含有纯化胰岛素类似物的组分并冻干得到17mg。用氨基酸分析(表I)和质谱分析(MS)验证其结构。

MS：5827.9(理论值5827.7)实例21 Pro(B29)人胰岛素

在37℃下将猪缺八肽胰岛素(339mg)和合成八肽Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Pro-Thr(363mg)在9ml含有1份二甲亚砜，2份1，4-丁二醇和1份0.25M Tris pH7.3缓冲液的溶液中结合。加入猪胰蛋白酶(70mg)。充分混合该溶液并在37℃下不时地搅拌80分钟。

此时把该反应液加到108ml 0.05N HCl中以终止该反应。将全部溶液抽到10×250mm C-8 Zorbax柱子上，并用0.1M磷酸二氢钠中含有低乙腈梯度的pH2缓冲液洗脱该产物。

合并用分析型HPLC确定的合适的组分，用水稀释2倍，并抽到10×250mm C-8 Ultrasphere柱子上。用0.5％三氟乙酸中含有乙腈梯度的溶液从柱子中洗脱去盐蛋白。合并含有纯化胰岛素类似物的组分并冻干得到97mg。用氨基酸分析(表I)和质谱分析(MS)验证其结构。

MS：5778.6(理论值5777.6)实例22 Ser(B28)，Pro(B29)人胰岛素

在37℃下将猪缺八肽胰岛素(412mg)和合成八肽Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Ser-Pro-Thr(390mg)在13ml含有1份二甲亚砜，2份1，4-丁二醇和1份0.25M Tris pH7.3缓冲液的溶液中结合。加入猪胰蛋白酶80mg。充分混合该溶液并在37℃下不时地搅拌120分钟。

此时把该反应液加到137ml 0.05N HCl中以终止该反应。将全部溶液抽到21×250mm C-8 Zorbax柱子上，并用0.1M磷酸二氢钠中含有低乙腈梯度的pH2缓冲液洗脱该产物。

合并用分析型HPLC确定的合适的组分，用水稀释2倍，并抽到25×300mm C-18 Vydac柱子上。用0.5％三氟乙酸中含有乙腈梯度的溶液从柱子中洗脱去盐蛋白。合并含有纯化胰岛素类似物的组分并冻干得到37mg。用氨基酸分析(表I)和质谱分析(MS)验证其结构。

MS：5768.1(理论值5767.6)实例23 Thr(B28)，Pro(B29)人胰岛素

在37℃下将猪缺八肽胰岛素(437mg)和合成八肽Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Thr-Pro-Thr(420mg)在14.5ml含有1份二甲亚砜，2份1，4-丁二醇和1份0.25M TrispH7.3缓冲液的溶液中结合。加入猪胰蛋白酶86mg。充分混合该溶液并在37℃下不时地搅拌120分钟。

此时把该反应液加到135.5ml 0.05N HCl中以终止该反应。将全部溶液抽到21×250mm C-8 Zorbax柱子上并用0.1M磷酸二氢钠中含有低乙腈梯度的pH2缓冲液洗脱该产物。

合并用分析型HPLC确定的合适的组分，用水稀释2倍，并抽到25×300mm C-18 Vydac柱子上。用一种0.5％三氟乙酸中含有乙腈梯度的溶液从柱子中洗脱去盐蛋白。合并含有纯化胰岛素类似物的组分并冻干得到78mg。用氨基酸分析(表I)和质谱分析(MS)验证其结构。

MS：5781.9(理论值5781.6)实例24 Trp(B28)，Pro(B29)人胰岛素

在37℃下将猪缺八肽胰岛素(310mg)和合成八肽Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Trp-Pro-Thr(325mg)在10.5ml含有1份二甲亚砜，2份1，4-丁二醇和1份0.25M TrispH7.3缓冲液的溶液中结合，加入猪胰蛋白酶64mg。充分混合该溶液并在37℃下不时地搅拌120分钟。

此时把反应液加到140ml 0.05N HCl中以终止该反应。将全部溶液抽到21×250mm C-8 Zorbax柱子上，并用0.1M磷酸二氢钠中含有低乙腈梯度的pH2缓冲液洗脱该产物。

合并用分析型HPLC确定的合适的组分，用水稀释2倍，并抽到25×300mm C-18 Vydac柱子上。用0.5％三氟乙酸中含有乙腈梯度的溶液从柱子中洗脱去盐蛋白。合并含有纯化胰岛素类似物的组分并冻干得到47mg。用氨基酸分析(表I)和质谱分析(MS)验证其结构。

MS：5866.2(理论值5866.7)实例25 Tyr(B28)，Pro(B29)人胰岛素

在37℃下将猪缺八肽胰岛素(391mg)和合成八肽Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Tyr-Pro-Thr(400mg)在13ml含有1份二甲亚砜，2份1，4-丁二醇和1份0.25M Tris pH7.3缓冲液的溶液中结合。加入猪胰蛋白酶79mg。充分混合该溶液并在37℃下不时地搅拌120分钟。

此时将该反应液加到137ml 0.05N HCl中以终止该反应。将全部溶液抽到21×250mm C-8 Zorbax柱子上，并用0.1M磷酸二氢钠中含有低乙腈梯度的pH2缓冲液洗脱该产物。

合并用分析型HPLC确定的合适的组分，用水稀释2倍，并抽到25×300mm C-18 Vydac柱子上。用0.5％三氟乙酸中含有乙腈梯度的溶液从柱子中洗脱去盐蛋白。合并含有纯化胰岛素类似物的组分并冻干得到30mg。用氨基酸分析(表I)和质谱分析(MS)验证其结构。

MS：5843.7(理论值5843.7)实例26 Val(B28)，Pro(B29)人胰岛素

在37℃下将猪缺八肽胰岛素(400mg)和合成八肽Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Val-Pro-Thr(383mg)在12ml含有1份二甲亚砜，2份1，4-丁二醇和1份0.25M Tris pH7.3缓冲液的溶液中结合。加入猪胰蛋白酶78mg。充分混合该溶液并在37℃下不时地搅拌120分钟。

此时把该反应液加到238ml 0.05N HCl中以终止该反应。将全部溶液抽到21×250mm C-8 Zorbax柱子上，并用0.1M磷酸二氢钠中含有低乙腈梯度的pH2缓冲液洗脱该产物。

合并用分析型HPLC确定的合适的组分，用水稀释4倍，并抽到25×300mm C-18 Vydac柱子上。用0.1％三氟乙酸中含有乙腈梯度的溶液从柱子中洗脱去盐蛋白。合并含有纯化胰岛素类似物的组分并冻干得到74mg。用氨基酸分析(表I)和质谱分析(MS)验证其结构。

MS：5780.0(理论值5779.6)实例27 Nva(B28)，Pro(B29)人胰岛素

在37℃下将猪缺八肽猪岛素(292mg)和合成八肽Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Nva-Pro-Thr(279mg)在10ml含有1份二甲亚砜，2份1，4-丁二醇和1份0.25M Tris pH7.3缓冲液的溶液中结合。加入猪胰蛋白酶57mg。充分混合该溶液并在37℃不时地搅拌120分钟。

此时把该反应液加到240ml 0.05N HCl中以终止该反应。将全部溶液抽到21×250mm C-8 Zorbax柱子上，并用0.1M磷酸二氢钠中含有低乙腈梯度的pH2缓冲液洗脱该产物。

合并用分析型HPLC确定的合适的组分，用水稀释2倍，并抽到25×300mm C-18 Vydac柱子上。用0.5％三氟乙酸中含有乙腈梯度的溶液从柱子中洗脱去盐蛋白。合并含有纯化胰岛素类似物的组分并冻干得到51mg。用氨基酸分析(表I)和质谱分析(MS)验证其结构。

NS：5780.0(理论值(5779.6)实例28

用前面所述方法，制备下列其他胰岛素类似物：

(a)Asp(B1)，Lys(B28)，Pro(B29)人胰岛素

(b)脱(Phe-B1)，Lys(B28)，Pro(B29)人胰岛素

(c)脱(Phe-B1)，Asp(B10)，Lys(B28)，Pro(B29)人胰岛素

(d)脱(Phe-B1，Val-B2)，Lys(B28)，Pro(B29)人胰岛素

(e)脱(Phe-B1，Val-B2)，Asp(B10)，Lys(B28)，Pro(B29)人胰岛素

(f)Gly(A21)，Asp(B10)，Lys(B28)，Pro(B29)人胰岛素

(g)Ala(A21)，Asp(B10)，Lys(B28)，Pro(B29)人胰岛素

(h)脱(Thr-B30)，Lys(B28)，Pro(B29)人胰岛素

(i)Asp(B10)，Arg(B28)，Pro(B29)人胰岛素

(j)Ala(A21)，Arg(B28)，Pro(B29)人胰岛素

(k)Asp(B1)，Arg(B28)，Pro(B29)人胰岛素实例29 Lys(B28)，Pro(B29)人胰岛素

重组载体和宿主的构建A.质粒pCZR126S的构建

1.分离质粒pKC283

以保藏号NRRL-B15830从Peoria，Illinois61604，北部地区研究室得到大肠杆菌K12B E1201/pKC283的亲液胶体。将该亲液胶体倒入含有10ml LB基质(10g Bacto-胰蛋白胨，5g Bacto-酵母膏和10gNaCl/升；调至pH7.5)的试管中，并在32℃下保温2小时，此时在培养液中加入50μg/ml氨苄青霉素，然后在32℃下保温过夜。因为大肠杆菌K12BE1201/pKC283细胞中含有一个整合在细胞DNA中的温度敏感型cI阻遏物基因，将该细胞在32℃下进行培养。如果在此质粒分离过程中使用含有野生型λpL阻遏物基因或不含有λpL启动子的细胞，则如下面的实例所述，保温温度是37℃。

取一小部分过夜的培养液，将它置于含有50μg/ml氨苄青霉素的LB-琼脂(带有15g/l Bacto-琼脂的LB基质)平板上，以得到大肠杆菌K12BE1201/pKC283的单菌落分离物。将得到的单菌落接种到10ml含有50μg/ml氨苄青霉素的LB基质中，并在32℃有力震动下保温过夜。将10ml过夜培养物接种到500ml含有50μg/ml氨苄青霉素的LB基质中，并在32℃有力震动下保温直至该培养物达到稳定期。

下述方法是Maniatis等的修改方法(1982，Molecular Cloning，冷泉港实验室)。

在4℃下以4000g离心10分钟以收集细胞，并去除上清液。将细胞沉淀物在100ml冰冷的STE缓冲液(0.1M NaCl，10mM Tris-HCl，pH7.8，1mM EDTA)中洗涤。洗涤之后，将细胞沉淀物再悬浮于10ml含有5mg/ml溶菌酶的溶液1(50mM葡萄糖；25mM Tris-HCl pH8.0，和10mM EDTA)中，并于室温下放置10分钟。然后将20ml溶液2(0.2N NaOH和1％SDS)加到溶菌酶处理过的细胞溶液中，并通过倒置轻轻地混合该溶液。将该混合液在冰上保温10分钟。

将15ml冰冷的5M乙酸钾pH4.8加到溶解细胞的混合液中，并通过倒置混合该溶液。把该溶液置于冰上保温10分钟。将11.5ml冰乙酸加到28.5ml水和60ml 5M乙酸钾中，以制备5M乙酸钾溶液；所得到的溶液有3M的钾和5M乙酸。

将溶解细胞混合液用Beckman SW27(或其等同物)在4℃以20,000rpm离心20分钟。细胞DNA和碎片在试管的底部形成沉淀。回收到36ml上清液，加入0.6体积的异丙醇，混匀，将所得到的溶液置于室温下15分钟。通过在室温下以12,000g离心30分钟收集质粒DNA。去除上清液，用70％乙醇在室温下洗涤该DNA沉淀。倾析乙醇冲洗物，并将沉淀在真空干燥器中进行干燥。再将沉淀悬浮于8ml TE缓冲液(10mMTris-HCl，pH8.0，1mM EDTA)中。

将8g氯化铯(CsCl)加到DNA溶液中。在每10mlCsCl-DNA溶液中加入约0.8ml 10mg/ml的溴化乙锭水溶液。该溶液最终浓度是大约1.55g/ml，而溴化乙锭的浓度大约是600μg/ml。将该溶液转移到Beckman Type50的离心管中，用石蜡油装满，密封，在20℃以45,000rpm离心24小时。离心之后，在正常光线下可看到两个DNA带。去掉离心管的盖，用带21号皮下注射针头的注射器***离心管的侧壁取出下面的DNA带。

用水饱和的丁醇经过几次提取去除溴化乙锭。通过TE缓冲液透析去除氯化铯。用缓冲酚提取后，再用氯仿提取，然后用70％乙醇沉淀和洗涤，并干燥。得到大约1mg的质粒pKC283，然后以大约1μg/μl的浓度在4℃下储存于TE缓冲液中。附图1给出了质粒pKC283的切割位点和功能图。

2.构建质粒pKC283PX

将大约10μl实例1中制备的质粒pKC283DNA与20μl 10X基质盐限制缓冲液(500mM NaCl；100mMTris-HCl pH7.5；100mM MgCl₂；和10mMDTT)，20μl 1mg/ml BSA，5μl′限制酶PvuII(～50单位，由Bethesda Research Laboratories(BRL)定义，这里所用的全部限制酶都来自该公司)和145μl水混合。将所得到的反应液在37℃下保温2小时。通过常规的酚和氯仿提取终止这里所说的限制酶反应，接着使DNA沉淀，用乙醇冲洗，然后再将DNA悬浮于TE缓冲液中。如上所说的PvuII消化终止之后，使PvuII消化的质粒pKC283DNA沉淀，并将它再悬浮于5μl的TE缓冲液中。

在含有10μl 5×激酶缓冲液(300mM Tris-HCl，pH7.8；50mM MgCl₂和25mM DTT)，5μl 5mM ATP，24μl水，0.5μl的T4多核苷酸激酶(按P-L Biochemicals公司的规定大约为2.5单位)，5μl1mg/ml BSA，和5μl 10mM亚精胺的混合液中，通过在37℃下使该混合液与大约600微微(10^-12)摩尔(pM)的XhoI人工接头(5’-CCTCGAGG-3’)保温30分钟而使之激活。

将大约12.5μl激活的XhoI人工接头加到5μl PvuII消化的质粒pKC283DNA中，然后向DNA中加入2.5μl 10X连接酶缓冲液(300mM Tris-HCl，pH7.6；100mM MgCl₂；和50mM DTT)，2.5μl 1mg/ml BSA，7μl 5mM ATP，2.5μl(按P-LBiochemicals公司的定义大约为2.5单位)T4 DNA连接酶，2.5μl 10mM亚精胺，和3μl水。所产生的连接反应液在4℃下保温过夜。连接反应之后，调节反应混合液使之具有高盐缓冲液的成分(0.1M NaCl；0.05M Tris-HCl pH7.5；10.0mM MgCl₂；和1mM DTT)。将大约10μl(100单位)限制酶XhoI加到混合液中，然后使得到的反应液在37℃下保温2小时。

终止该反应，如上所述使XhoI消化的DNA沉淀，再悬浮和连接，只是不向连接混合液中加入XhoI人工接头。连接的DNA构成了所需要的质粒pKC283PX。附图2给出了质粒pKC283PX的切割位点和功能图。

3.构建大肠杆菌K12MO(λ⁺)/pKC283PX

以保藏号NRRL B-15993从北部地区研究室可得到冻干形式的大肠杆菌K12MO(λ⁺)。大肠杆菌K12MO(λ⁺)中含有野生型λPL cI阻遏物基因，因此在大肠杆菌K12MO(λ⁺)细胞中不会发生来自本发明杂交pL-lpp启动子的转录。重新构造亲液胶体，分离MO(λ⁺)的单个菌落，用基本上与实例29A1一致的方法制备10ml MO(λ⁺)细胞的过夜培养物，不同的只是保温温度是37℃，以及在生长培养基中没有使用氨苄青霉素。

用50μl的过夜培养液接种5ml也含有10mM MgSO₄和10mM MgCl₂的LB培养基。将培养物在37℃有力震动下保温过夜。第二天早晨，用含有10mM MgSO₄和10mMMgCl₂的LB基质将培养物稀释到200ml。将稀释的培养物在37℃并有力震动下进行保温，直至在550nm(^A550)下的吸收率大约是0.5为止，此时表明细胞密度为大约1×10⁸个细胞/ml。在冰水浴中将培养物冷却10分钟，然后在4℃下以4000g离心10分钟收集细胞。将细胞沉淀物再悬浮于100ml的冷却10mM MgSO₄中，并立即通过离心使之再沉淀。将该细胞沉淀物再悬浮于100ml的30mM CaCl₂中并在冰上保温20分钟。

通过离心再次收集细胞，并再悬浮于10ml的30mMCaCl₂中。将0.5ml等分的细胞加到实例29A2中制备的连接DNA中；而该DNA已制备成30mM CaCl₂的浓度。将细胞-DNA混合液在冰上保温1小时，在42℃下加热震荡90秒，然后在冰上冷却大约2分钟。将细胞-DNA混合液在125ml瓶子中稀释于10ml LB基质中，并在37℃下保温1小时。取100μl等分的培养液置于含有氨苄青霉素的LB琼脂平板上，在37℃下保温直至菌落出现。

将这些菌落单个进行培养，通过限制酶分析和凝胶电泳对单个菌落的质粒DNA进行检查。用实例29A1的方法在较小水平上进行质粒DNA分离，但省去氯化铯梯度步骤，直至识别出所需的大肠杆菌K12MO(λ⁺)/pKC283PX转化体。附图2给出了质粒pKC283PX的切割位点和功能图。

4.构建大肠杆菌K12MO(λ⁺)/pKC283-L

将10μg实例29A1的方法制备的质粒pKC283PXDNA溶于20μl 10X高盐缓冲液，20μl 1mg/mlBSA，5μl(～50单位)限制酶BglII，5μl(～50单位)限制酶XhoI和150μl水当中。将所产生的反应液在37℃保温2小时。终止该反应，使BglII-XhoI消化的DNA沉淀，再将DNA悬浮于5μl的TE缓冲液中。

合成一个带有BglII和XhoI限制酶切割特征的单链DNA末端的DNA人工接头，并使之激活。用与实例29A2基本一致的方法激活该人工接头。该DNA人工接头具有下面的结构：

5′-GATCTATTAACTCAATCTAGAC-3 ′

||||||||||||||||||

3 ′-ATAATTGAGTTAGATCTGAGCT-5′

用现有技术中已知的方法从单链脱氧低聚核苷酸合成上述人工接头。可以用市售可得的仪器合成单链脱氧寡核苷酸，如由AppliedBiosystems公司出售的380A型合成仪(850 LincolnCentre Drive，Foster City，CA 94404)，它利用了氨基磷酸化学的机理。其他一些DNA合成法在现有技术中也是已知的。对于用常规修改的磷酸酯方法合成单链DNA的描述见Itakura等，1977，Science 198：1056和Crea等，1978，Proc.Nat.Acad.Sci.USA75：5765。另外一种优选合成DNA的方法见Hsiung等，1983，Nucleic Acid Research 11：3227和Narang等，1980，Methods in Enzymology 68：90。

用基本上与实例29A2一致的方法将人工接头和BglII-XhoI消化的质粒pKC283PX进行连接。连接的DNA构成所需要的质粒pKC283-L。附图3给出了质粒pKC283-L的切割位点和功能图。用质粒pKC283-LDNA来转化大肠杆菌K12MO-(λ⁺)，并用与实例29A3基本一致的方法识别所得到的大肠杆菌K12MO(λ⁺)/pKC283-L转化体。

5.大肠杆菌K12MO(λ⁺)/pKC283-LB的构建

将基本上按实例29A1方法制备的约10μg质粒pKC283-L DNA溶于20μl 10X高盐缓冲液，20μl 1mg/ml BSA，5μl(～50单位)限制性内切酶XhoI和155μl H₂O中，得到的反应液在37℃保温2小时。然后加入3倍体积的95％乙醇和1/10体积的3M乙酸钠，从该反应混合物中沉淀XhoI消化的质粒pKC283-L DNA，在干冰-乙醇浴中保温5分钟，离心分离。用70％的乙醇洗涤得到的DNA沉淀，干燥后再悬浮在2μl 10X缺口转译缓冲液(0.5M Tris-HClpH7.2；0.1M MgSO₄；1mM DTT)，1μl脱氧核苷三磷酸各为2mM的溶液，15μl H₂O，1μl(～6个P-L Biochemicals公司定义的单位)Klenow(大肠杆菌DNA聚合酶I的大片段)以及1μl的1mg/mlBSA中。得到的反应液在25℃保温30分钟；再在70℃保温该溶液5分钟以停止反应。

使BamHI人工接头(5′-CGGGATCCCG-3′)激活，基本上按实例29A2的方法与XhoI消化并经Klenow处理的质粒pKC283-L DNA相连接。连接反应后，在37℃，在高盐缓冲液中，用约100单位BamHI消化DNA约2小时。BamHI消化后，制备基本上按实例29A2方法连接用的DNA。

基本上按实例29A2和29A3的方法，通过连接并转化至大肠杆菌K12MO(λ⁺)中，使～5.9Kb BamHI限制性片段环化。鉴定大肠杆菌K12MO(λ⁺)/pKC283-LB转化体，然后基本上按实例29A1的方法制备质粒pKC283-LBDNA。质粒pKC283-LB的限的性位点和功能图如附图4所示。

6.大肠杆菌K12MO(λ⁺)/pL32的构建

在高盐缓冲液中，用限制性内切酶SalI消化约10μg质粒pKC283PX，用Klenow处理，基本上按实例29A5的方法与EcoRI人工接头(5′-GAGGAATTCCTC-3′)连接，只是所用的起始质粒、限制性内切酶和人工接头不同。用限制性内切酶EcoRI消化以切下～2.1Kb的DNA，通过连接使～4.0Kb EcoRI限制性片段环化以产生质粒pKC283PRS。基本上按实例29A3的方法将连接的DNA用于转化大肠杆菌K12MO(λ⁺)。鉴别出大肠杆菌K12MO(λ⁺)/pKC283PRS转化体以后，基本上按实例29A1的方法制备质粒pKC283PRS DNA。质粒pKC283PRS的限制性位点和功能图如附图5所示。

在含限制性内切酶PstI和SphI各50单位的200μl高盐缓冲液中消化约10μg质粒pKC283PRS。在37℃保温反应液约2小时，然后在～130V、～75mA，在Tris-乙酸盐缓冲液中，使反应混合物在0.6％低胶凝温度琼脂糖(FMCCorporation，Marine Colloids Division，Rockland，Maine 04841)中电泳2-3小时。

在溴化乙锭稀溶液中使凝胶染色，用长波紫外光检测构成～0.85Kb PstI-SphI限制性片段的DNA带；并将其从凝胶中切下。由该切段的重量和密度测出该切段的体积，将等体积pH7.6的10mM Tris-HCl加到含有该切段的管中。然后在72℃保温使该切段熔化。可制得体积为100μl，约1μg质粒pKC283PRS的～0.85Kb PstI-SphI限制性片段。用类似的方法，用限制性内切酶PstI和SphI消化质粒pKC283-LB，通过琼脂糖凝胶电泳分离得到～3.0Kb限制性片段，并制备用于连接的产物。

基本上按实例29A2的方法将质粒pKC283PRS的～0.85Kb PstI-SphI限制性片段与质粒pKC283-LB的～3.0Kb PstI-SphI限制性片段相连接。连接的DNA构成所要的质粒pL32。质粒pL32的限制性位点和功能图如附图6所示。基本上按实例29A3的方法将质粒pL32转化至大肠杆菌K12MO(λ⁺)细胞中。基本上按实例29A1的方法，由大肠杆菌K12MO(λ⁺)/pL32转化体制备质粒p^L32DNA。质粒pL32DNA的分析结果证明，有多个EcoRI人工接头与Klenow处理的质粒pKC283PX的SalI端相连接。多个EcoRI人工接头的存在不会影响质粒pL32的效用或质粒pL32的衍生物，并可通过XhoI限制性位点的存在(每当2个EcoRI人工接头连在一起时就产生该位点)而进行检测。另一种方法是，按构建质粒pKC283-LB实例的第一段进行SalI-EcoRI切除和连接，也可构建质粒pL32。

7.大肠杆菌K12MO(λ⁺)/pL47的构建

从北方地区研究室得到经冷冻干燥的大肠杆菌K12RV308/pNM789(保藏号为NRRL B-18216)。pNM789的限制性位点和功能图如附图7所示。基本上按实例1的方法从培养物中提取质粒DNA，所不同的是保温温度为37℃。将10μg pNM789悬浮在200μl PvuII缓冲液(50mMTris-HCl pH7.5，60mM NaCl和6mM MgCl₂)中。加入1单位PvuII，在37℃使反应混合物保温5分钟。在65℃加热10分钟使该酶失活。再加入30μl 10X BamHI缓冲液(200mM Tris-HCl pH8.0，1M NaCl和70mMMgCl₂)，70μl H₂O和10单位的BamHI，在37℃使反反应液保温1小时。随后向该反应液加入5单位碱性磷酸酶并于65℃保温1小时。在1％琼脂糖凝胶中分离DNA片段，纯化大小为单切割片段的DNA片段(图8)。

基本上按实例29A4的方法合成具有平端和BamHI端的DNA人工接头。该人工接头(如图8中的118所示)具有下列结构：

5′-CTGTGCCTTCTAG-3′

|||||||||||||

3 ′-GACACGGAAGATCCTAG-5′

基本上按实例29A2的方法使该人工接头激活并与BamHI-PvuII消化的质粒pNM789连接。用该连接混合物转化大肠杆菌K12RV308细胞，基本上按实例29A3的方法使这些转化体进行质粒分离。选择到好几个含有合适大小PvuII片段(494bp)和XbaI-BamHI片段(628bp)的质粒。通过BamHI位点到单一SmaI位点的测序至少测定了这些质粒中二个的顺序，并选择一个具有所需顺序的克隆。这中间质粒被称为质粒120。该方法的框图以及质粒120的限制性位点和功能图如附图8所示。

为了分离编码EK-BGH的DNA，在含限制性内切酶XbaI和BamHI各50单位的200μl高盐缓冲液中消化约10μg质粒120。通过琼脂糖凝胶电泳分离消化产物，并分离和制备编码EK-BGH的～0.6Kb XbaI-BamHI限制性片段，用于基本上按实例29A6的方法连接。

也用限制性内切酶XbaI和BamHI消化质粒pL32，并分离和制备用于连接的～3.9Kb限制性片段。基本上按实例29A2的方法使质粒pL32的～3.9Kb XbaI-BamHI限制性片段与质粒120的～0.6Kb XbaI-BamHI限制性片段相连接以产生质粒pL47。质粒pL47的限制性位点和功能图如附图9所示。基本上按实例29A3的方法将质粒pL47转化至大肠杆菌K12MO(λ⁺)中，鉴定大肠杆菌K12MO(λ⁺)/pL47转化体。基本上按实例29A1的方法由该转化体制备质粒pL47DNA。

8.大肠杆菌K12RV308/pPR12AR1的构建

质粒pPR12含有温度敏感型pL阻遏物基因cI857，质粒pBR322具有抗四环素基因。在US4436815(1984.3.13批准)中已公开质粒pPR12。质粒pPR12的限制性位点和功能图如附图10所示。

在200μl高盐缓冲液中，在37℃，用约50单位的限制性内切酶EcoRI消化约10μg质粒pPR12 2小时，基本上按实例29A5的方法沉淀EcoRI消化的质粒pPR12DNA，并用Klenow处理。Klenow反应后，基本上按实例29A2的方法进行连接使EcoRI消化的和Klenow处理的质粒pPR12DNA再环化。连接的DNA构成所要的质粒pPR12ΔR1，它可用于基本上按实例29A3的方法(所不同的是选择物基于抗5μg/ml四环素而不是抗氨苄青霉素)转化大肠杆菌K12RV308。大肠杆菌K12RV308可从NRRL得到(保藏号为NRRLB-15624)。鉴定大肠杆菌K12RV308/pPR12ΔR1转化体以后，基本上按实例29A11的方法由该转化体制备质粒pPR12ΔR1 DNA 。

在200μl中盐缓冲液中，在37℃，用约50单位的限制性内切酶AvaI消化约10μg质粒pPR12ΔR12小时。基本上按实例29A5的方法沉淀AvaI消化的质粒pPR12ΔR1DNA，并用Klenow处理。Klenow反应以后，基本上按实例29A2的方法将AvaI消化的、经Klenow处理的质粒pPR12ΔR1 DNA与EcoRI人工接头(5′-GAGGAATTCCTC-3′)连接。人工接头连接后，沉淀该DNA，然后再悬浮在约含50单位限制性内切酶EcoRI的约200μl高盐缓冲液中。在37℃保温所得到的反应液约2小时。 EcoRI消化以后，使反应混合物加在琼脂糖凝胶上，基本上按实例29A6的方法纯化～5.1Kb EcoRI限制性片段。基本上按实例29A2的方法进行连接使～5.1Kb EcoRI限制性片段再环化。连接的DNA构成所要的质粒pPR12AR1。基本上按实例29A3的方法(除选择基于抗四环素而不是抗氨苄青霉素外)使质粒pPR12AR1 DNA转化至大肠杆菌K12RV308中。鉴定大肠杆菌K12RV308/pPR12AR1转化体后，基本上按实例29A1的方法制备质粒pPR12AR1 DNA。质粒pPR12AR1的限制性位点和功能图如附图11所示。

9.大肠杆菌K12RV308/pL110的构建

将约10μg质粒pPR12AR1 DNA悬浮在含限制性内切酶PstI和EcoRI各50单位的约200ml高盐缓冲液中，在37℃保温消化反应液约2小时。然后将反应混合物加在琼脂糖凝胶上基本上按实例29A6的方法分离和制备用于连接的质粒pPR12AR1的～2.9Kb PstI-EcoRI限制性片段。

在200μl高盐缓冲液中，在37℃，用限制性内切酶PstI和BamHI消化约10μg质粒pL47 2小时。将PstI-BamHI消化的DNA加在琼脂糖凝胶上，基本上按实例29A6的方法分离和制备用于连接的～2.7Kb PstI-BamHI限制性片段，该片段含有复制原点和抗氨苄青霉素基因。在分离反应中，在200μl高盐缓冲液中，在37℃，用限制性内切酶EcoRI和BamHI消化约10μg质粒pL47DNA2小时，基本上按实例29A6的方法分离和制备用于连接的～1.03Kb EcoRI-BamHI限制性片段，该片段含有新的转录和转泽活化顺序和EK-BGH编码DNA。所得到的～2μg～1.03KbEcoRI-BamHI限制性片段可用于构建质粒pL110。

将质粒pL47的～2.7Kb PstI-BamHI和～1.03Kb EcoRI-BamHI限制性片段与质粒pPR12AR1的～2.9Kb PstI-EcoRI限制性片段相连接以构成质粒pL110，基本上按实例29A2和A3的方法(除基于抗四环素而不是抗氨苄青霉素选择转化体外)用连接的DNA转化大肠杆菌K12RV308。

在EK-BGH编码区存在二个PstI限制性内切酶识别位点(附图的限制性位点和功能图中未标出)。质粒pL110的限制性位点和功能图如附图12所示。

10.大肠杆菌K12RV308/pL110C的构建

a.大肠杆菌K12RV308/pL110A的构建

在总体积为20μl含2μl 10X高盐缓冲液(1.0MNaCl；0.50M Tris-HCl pH7.5；0.10MMgCl₂；和10mM二硫苏糖醇)和3单位NdeI酶的溶液中，在37℃，用限制性内切酶NdeI消化约1μg质粒pL110 DNA1小时。用苯酚/氯仿提取反应混合物，用乙醇沉淀DNA。将NdeI消化的质粒pL110 DNA溶于50μl 1X Klenow缓冲液(40mM KPO₄ pH＝7.5；6.6mM MgCl₂；1.0mM 2-巯基乙醇；33μM dATP；33μMdCTP；33μM dGTP；33μM TTP)中。加入2μl(～10单位，New England Biolabs)大肠杆菌DNA聚合酶I的大片段即Klenow，与该DNA混合，并在16℃保温所得到的反应液1小时。通过苯酚提取终止该反应，DNA按常规纯化。然后在4℃使NdeI消化的，经Klenow处理的DNA用T4DNA连接酶连接16小时。将所得到的DNA用于常规的大肠杆菌K12菌株RV308(NRRL B-15624)转化。在含有100μg/ml氨苄青霉素的L琼脂平板上选择转化体，按Birnboim和Doly所述的快速碱性提取法从抗性菌落中分离质粒选择没有NdeI位点的质粒(图13中的pL110A)。

b.通过位点特异性诱变构建噬菌体pL110B

通过位点特异性诱变消除抗四环素基因中的BamHI位点所用的方法如附图13的右边所示。

b(i)噬菌体M13Tc3的构建

用质粒pL110作抗四环素基因的来源。将50μl TE缓冲液中的约50μg质粒pL110加到25μl 10X HindIII缓冲液和170μl H₂O中。将约5μl(～50单位)的限制性内切酶HindIII加到质粒pL110 DNA的溶液中，在37℃使反应液保温2小时。将约13μl 2M Tris-HCl，pH7.4和5μl(～50单位)的限制性内切酶EcoRI加到HindIII消化的质粒pL110 DNA中，在37℃使反应液再保温2小时。用TE饱和的苯酚提取该反应混合物以使反应停止；用氯仿提取以除去苯酚。然后经过沉淀和离心分离收集EcoRI-HindIII消化的质粒pL110 DNA，加在1％琼脂糖凝胶上，分离和纯化大的～4.3Kb EcoRI-HindIII限制性片段。

将约5μg噬菌体m13mp18(New EnglandBiolabs)溶于50μl TE缓冲液中，然后按上述方法用HindIII和EcoRI消化。按上述pL110的方法(除分离和纯化～7.25Kb限制性片段以外)纯化HindIII-EcoRI切割的噬菌体M13mp18 DNA。

将质粒pL110的～4.3Kb HindIII-EcoRI片段约100毫微克与约100毫微克噬菌体M13mp18的～7.25Kb HindIII-EcoRI片段，2μl 10X连接酶缓冲液，1μl(～100单位)的T4DNA连接酶和14μl H₂O相混合。在15℃保温连接反应液1.5小时；连接的DNA构成所要的噬菌体m13Tc3 DNA。噬菌体m13Tc3的限制性位点和功能图如附图13所示。

用1ml的大肠杆菌K12JM1.09(可用从NewEngland Biolabs买到的大肠杆菌K12JM101代替大肠杆菌K12JM109)的过夜培养物接种50ml L-肉汤，在37℃通气保温得到的培养液直到O.D.660为0.3～0.4。将这些细胞再悬浮在25ml 10mM NaCl中，在冰上保温10分钟，通过离心分离而收集。再将这些细胞悬浮在1.25ml的75mM CaCl₂中；取出200μl该细胞，加到10μl上述制备的连接的DNA中，在冰中保温约40分钟。然后在42℃保温该细胞-DNA混合物2分钟，取出不同的等分试样(即1，10和100μl)，加到3ml高级琼脂(top agar)(L-肉汤，含有0.5％在45℃熔融的琼脂)中，该琼脂还含有50μl 2％X-Gal，50μl 100mM IPTG和200μl对数生长期的大肠杆菌K12JM109。然后将该细胞—高级琼脂混合物涂在L-琼脂平板上，该平板含有40μg/ml X-Gal(5-澳-4-氯-3-吲哚基-β-D-硫代半乳糖苷)和0.1mM IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)，在37℃保温平板过夜。

第二天早晨，分别用几个澄清的(与蓝色相对比)的噬斑接种2ml L肉汤，在37℃通气保温培养液2小时。缺少蓝色表示已发生所要的DNA***。然后，使该培养液离心，将得到的200μl上清液加到在37℃通气生长的10ml大肠杆菌K12JM109培养液(OD₅₅₀＝0.5)中。在37℃使这些培养液再保温30分钟；然后，通过离心使该细胞沉淀，用于制备它们所含的复制型重组噬菌体。用实例1所述并按比例缩小方法从该细胞中分离双链复制型噬菌体DNA。通过噬菌体DNA的限制性内切酶分析鉴定含噬菌体m13Tc3DNA的转化体。

b(ii)单链噬菌体m13Tc3DNA的制备

离心1.5ml大肠杆菌K12JM109/m13Tc3的过夜培养液，用100μl含噬菌体m13Tc3的上清液接种25ml OD₆₆₀约为0.4-0.5的大肠杆菌JM109的培养液。在37℃通气保温该培养液6小时，离心该培养液，将得到的20ml上清液移入新的管中。将约2ml含20％聚乙二醇(PEG)6000和14.6％NaCl的溶液加到该上清液中，然后在冰中保温20分钟。

以7000rpm离心该上清液25分钟，将所得到的含单链噬菌体m13Tc3DNA的沉淀再悬浮在500μl TE缓冲液中。用TE饱和的苯酚提取该DNA溶液2次，再用氯仿提取2次。然后用NaOAc和乙醇沉淀该单链DNA，离心分离。用70％乙醇洗涤得到的沉淀，干燥，然后溶于60μl H₂O中。

b(iii)诱变

在自动操纵的DNA合成仪中合成诱变用的单链DNA片段。该片段具有顺序5′-CCCGTCCTGTGGATACTCTACGCCGA-3′，它类似于质粒pBR322抗四环素基因中BamHI位点(5′-GGATCC-3′)周围的区域，所不同的是在质粒pBR322中5′端的第二个残基(或3′端的第三个残基)是C。这种变化不会改变抗四环素蛋白质的氨基酸组成，但能消除BamHI位点。

用在20μl的1X激酶缓冲液(60mM Tris-HCl pH7.8；15mM 2-巯基乙醇；10mM MgCl₂；0.41μM ATP)中的10单位(BRL)T4多核苷酸激酶，在37℃℃分别处理约10微微摩尔的诱变引物和M13普通引物(Bethesda Research Laboratories(BRL)，P.O.Box 6009，Gaithersburg，MD20760)30分钟。将经激酶处理的DNA用于下述的诱变步骤中。

将300ng(1.2μl)单链噬菌体M13Tc3，1微微摩尔(2μl)普通引物，1微微摩尔(2μl)诱变引物，2μl10X退火缓冲液(100mM Tris-HCl，pH7.5；1mMEDTA；500mM NaCl)以及12.8μl H₂O混合在一起，以进行退火反应。使该反应在80℃保温2分钟，在50℃保温5分钟，然后冷至室温。

在退火的DNA混合物中加入5μl 10X伸展缓冲液(500mM Tris-HCl pH8；1mM EDTA；120mMMgCl₂)；5μl 2mM dATP；1μl dGTP、dTTP、和dCTP均为6mM的溶液；1μl(～2单位，PharmaciaP-L Biochemicals，800 Centennial Avenue，Piscataway，NJ08854)Klenow酶；1μl(100单位)T4DNA连接酶；和17μl H₂O以进行伸展反应。在室温下保温该伸展反应1小时，然后在37℃保温2.5小时，然后在4℃过夜。

先用TE饱和的苯酚提取2次以停止反应，再用CHCl₃提取2次。用乙醇和NaOAc沉淀该DNA。通过离心收集该DNA，再悬浮在50μl H₂O中，然后在DNA溶液中加入6μl 10X S1缓冲液。

将该DNA溶液平均分入3个管中。在2个管中加入约200单位(Miles Laboratories)S1核酸酶。一种S1反应液在室温下保温5分钟，其他反应液保温10分钟。用TE饱和的苯酚提取反应混合物2次以停止反应。该苯酚提取物再用氯仿提取2次；然后用NaOAc和乙醇从反应混合物中沉淀该DNA。用未经处理的DNA样品作对照。所有经S1处理的样品在其他步骤中都彼此分开，但都得到类似的结果。

将该DNA沉淀再悬浮在20μl H₂O中，按构建噬菌体m13Tc3时所用的方法(除无IPTG或X-Gal加到平板上外)，用10μl得到的溶液转化大肠杆菌K12JM109(也可用大肠杆菌K12JM101)。

按上述方法分离来自约48个噬班的双链复制型DNA，并筛选出有BamHI限制性位点的。按上述方法制备单链DNA，再选择没有BamHI位点的分离物。用双脱氧测序法(J.H.Smith，1980；Methods in Enzymology 65：560-580)测定单链DNA顺序。所要的分离物称为pL110CB(图13)。

C.质粒pL110C的构建

在含～50单位的NheI限制性内切酶的250μl 1X NheI缓冲液(50mM NaCl；6mM Tris-HCl pH7.5；6mM MgCl₂和6mM β-巯基乙醇)中，在37℃，消化约50μg复制型噬菌体pL110B DNA2小时。然后在NheI消化的噬菌体pL110B DNA中加入5μl 5M NaCl，接着加入5μl(～50单位)SalI限制性内切酶。在37℃继续消化2小时。然后按公知的一般方法从丙烯酰胺凝胶中分离具有抗四环素基因突变区的所要的～422bp NheI-SalI片段。

在相同的条件下，用NheI和SalI消化质粒pL110ADNA，所不同的是用质粒pL110A代替噬菌体pL110B。从琼脂糖中纯化质粒pL110A的～6.1Kb NheI-SalI限制性片段。

用普通方法将pL110A(～6.1Kb)和pL110B(～422bp)的NheI-SalI片段各100毫微克连接在一起以构建所要的质粒pL110C。质粒pL110C的限制性位点和功能图如附图13所示。所要的质粒pL110C使大肠杆菌具有10μg/ml四环素抗性，但在抗四环素基因中缺少BamHI位点。

11.质粒pCZR111的构建

质粒pL110C含有单一的ClaI限制位点，该位点可通过下列反应除去。基本上按实例29A2的方法〔除采用限制性内切酶ClaI和10X ClaI缓冲液(500mM NaCl，100mMTris-HCl pH7.9和100mM MgCl₂)外〕用ClaI消化约1μg质粒pL110C。然后，基本上按实例29A5的方法(所不同的是只加入dCTP，而不是加入所有4种dNTP)用Klenow处理ClaI消化的DNA。

然后沉淀该DNA，再悬浮在50μl Mung Bean核酸酶缓冲液(50mM NaOAc pH5.0，30mM NaCl和1mMZnSO₄)中。加入1单位的Mung Bean核酸酶(从NewEngland Biolabs可买到)，在30℃保温该反应30分钟。然后将试管放在冰中，加入NaCl至0.2M，该混合物用苯酚/氯仿提取，用乙醇沉淀，再悬浮在10mM Tris-HCl pH8.0中。然后基本上按实例29A3和29A4的方法使该DNA自身连接并转化至大肠杆菌细胞中。得到的质粒称为质粒pCZR111。

12.质粒pCZR126S的构建

按下述方法用XbaI消化约26μg的质粒pCZR111。10X XbaI缓冲液含有600mM Tris-HCl，100mMMgCl₂，1M NaCl和10mM 2-巯基乙醇，pH为7.5(在37℃)。将50μl的10X XbaI缓冲液，15μlXbaI(10U/μl)和185μl H₂O加到约含25μg质粒pL110的250μl水中。在37℃消化1小时。然后用苯酚提取XbaI消化的pL110，加入1/10体积的3M CH₃COO-Na，加入3体积的乙醇；该混合物在干冰—乙醇浴中保温5分钟，然后离心分离。将沉淀的DNA再悬浮在50μl H₂O中。

按下述方法用BamHI消化经XbaI消化的质粒pCZR111。在得到的50μl经XbaI消化的pL110中加入0.2μlBamHI(10U/μl)，10μl BamHI缓冲液(100mM Tris-HCl，50mM MgCl₂，1M NaCl和10mM2-巯基乙醇，pH为8.0，在37℃)以及90μl水。在37℃消化5分钟。用苯酚提取消化的pCZR111，加入1/10体积的CH₃COONa，接着加入3体积乙醇。将沉淀的DNA再悬浮在50μl的10mM Tris，1mM EDTA，pH为8.0的缓冲液中。

然后将XbaI和BamHI消化的pCZR111加在琼脂糖凝胶上，分离约5.8Kb的DNA带。将pCZR111的～5.8Kb片段与XbaI-NdeI人工接头和编码EK-牛生长激素的合成基因(在它的5′端含有NdeI位点，在它的3′端含有BamHI位点)连接，从而产生质粒pCZR126S。用普通的寡核苷酸测序法可得到XbaI-NdeI顺序，该顺序包括如下顺序：5 ′CTAGAGGGTATTAATAATGTATATTGATTTTAATAAGGAGGAATAATCA 3′

|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

TCCCATAATTATTACATATAACTAAAATTATTCCTCCTTATTAGTAT 5 ′

上述顺序是通过两条链的化学合成，然后混合以使其杂交而构建的。编码EKbGH的基因是由单链DNA的16个化学合成片段构建的，这些片段长为71-83核苷酸，它含有整个基因的两条互补链。用Applied Biosystems(ABS)公司的仪器进行合成，合成物包括如下顺序：5′ TATGTTCCCATTGGATGATGATGATAAGTTCCCAGCCATGTCCTT

|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

ACAAGGGTAACCTACTACTACTATTCAAGGGTCGGTACAGGAAGTCCGGCCTGTTTGCCAACGCTGTGCTCCGGGCTCAGCACCTGCATCAGCTGGCTGCTGA||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||CAGGCCGGACAAACGGTTGCGACACGAGGCCCGAGTCGTGGACGTAGTCGACCGACGACTCACCTTCAAAGAGTTTGAGCGCACCTACATCCCGGAGGGACAGAGATACTCCATCCAGAA||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||GTGGAAGTTTCTCAAACTCGCGTGGATGTAGGGCCTCCCTGTCTCTATGAGGTAGGTCTTCACCCAGGTTGCCTTCTGCTTCTCTGAAACCATCCCGGCCCCCACGGGCAAGAATGAGGC||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||GTGGGTCCAACGGAAGACGAAGAGACTTTGGTAGGGCCGGGGGTGCCCGTTCTTACTCCGCCAGCAGAAATCAGACTTGGAGCTGCTTCGCATCTCACTGCTCCTCATCCAGTCGTGGCT||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||GGTCGTCTTTAGTCTGAACCTCGACGAAGCGTAGAGTGACGAGGAGTAGGTCAGCACCGATGGGCCCCTGCAGTTCCTCAGCAGAGTCTTCACCAACAGCTTGGTGTTTGGCACCTCGGA||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||ACCCGGGGACGTCAAGGAGTCGTCTCAGAAGTGGTTGTCGAACCACAAACCGTGGAGCCTCCGTGTCTATGAGAAGCTGAAGGACCTGGAGGAAGGCATCCTGGCCCTGATGCGGGAGCT||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||GGCACAGATACTCTTCGACTTCCTGGACCTCCTTCCGTAGGACCGGGACTACGCCCTCGAGGAAGATGGCACCCCCCGGGCTGGGCAGATCCTCAAGCAGACCTATGACAAATTTGACAC||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||CCTTCTACCGTGGGGGGCCCGACCCGTCTAGGAGTTCGTCTGGATACTGTTTAAACTGTGAAACATGCGCAGTGACGACGCGCTGCTCAAGAACTACGGTCTGCTCTCCTGCTTCCGGAA||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||TTTGTACGCGTCACTGCTGCGCGACGAGTTCTTGATGCCAGACGAGAGGACGAAGGCCTTGGACCTGCATAAGACGGAGACGTACCTGAGGGTCATGAAGTGCCGCCGCTTCGGGGAGGC||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||CCTGGACGTATTCTGCCTCTGCATGGACTCCCAGTACTTCACGGCGGCGAAGCCCCTCCGCAGCTGTGCCTTCTAG 3′||||||||||||||||GTCGACACGGAAGATCCTAG 5′

通过连接下列组分可完成质粒pCZR126S的构建：总体积为2μl的～0.28μg 5.8Kb片段(用XbaI完全消化和用BamHI部分消化质粒pL110而得到)，总体积为2.5μl的0.18μg编码牛生长因子衍生物的合成基因(其5′端对应于XbaI位点，3′端对应于BamHI位点)，8.75微微摩尔的1μl化学合成的XbaI-NdeI人工接头。将质粒成分加到6μl5X连接缓冲液中，该缓冲液含有250mM Tris-HCl，50mM MgCl₂，5mM ATP，5mM DTT，25％V/V聚乙二醇8000，pH7.6，2μl连接酶，16.5μlH₂O。在16℃使该连接混合物保温过夜。然后基本上按实例29A3的方法用环化质粒pCZR126S转化大肠杆菌RV308细胞。质粒pCZR126S的限制性位点和功能图如附图14所示。B.人胰岛素原表达质粒pRB172的构建

1.质粒pRB145的构建

通常首先合成人胰岛素原基因并克隆入pUC18质粒中(从BRL买到)。用一般方法合成该基因，它具有如下顺序：

HindIII NdeI DraIII

| | |5′ AGCTTCAT ATGTATTTTGTTAACCAACACCTGTGCGGCTCCCACCTG GTGGAAGCTCT

AGTA TACATAAAACAATTGGTTGTGGACACGCCGAGGGTGGAC CACCTTCGAGA

GTACCTGGTGTGCGGTGAACGTGGCTTCTTCTACACCCCGAAGACCCGCCGTGAGGCA

CATGGACCACACGCCACTTGCACCGAAGAAGATGTGGGGCTTCTGGGCGGCACTCCGT

AvaII XmaI

| |

GAG GACCTGCAGGTGGGTCAGGTGGAGCTGGGCGGTGGC CCGGGTGCAGGCAGCCTGC

CTC CTGGACGTCCACCCAGTCCACCTCGACCCGCCACCG GGCCCACGTCCGTCGGACG

AGCGGCTGGCCCTGGAGGGTTCCCTGCAGAAGCGTGGCATTGTGGAACAATGCTGTAC

TCGGCGACCGGGACCTCCCAAGGGACGTCTTCGCACCGTAACACCTTGTTACGACATG

BamHI

|

CAGCATCTGCTCCCTGTACCAGCTGGAGAACTACTGCAACTAG GATCCG 3′

GTCGTAGACGAGGGACATGGTCGACCTCTTGATGACGTTGATC CTAGGCTTAA 5′

|

EcoRI选择具有正确顺序的一个克隆以用于产生氯化铯纯化的DNA。用一般方法分离该质粒(参见例如，Molecular Cloning，ALaboratory Manual，1982，ed.by Maniatis，T；Fritsch，E.F.and Sambrook，J.，ColdSpring Harbour Laboratory Publications，New York，该文的全部方法作为本文的参考文献)。将约6μl(20μg)质粒DNA加到20μl 10X NdeI缓冲液(150mM NaCl，10mM Tris-HCl pH7.8，6mM MgCl₂，6mM 2-巯基乙醇，100μg/ml BSA)，5μlNdeI限制性内切酶(～40单位)和169μl水中。混合后，使该反应在37℃保温2小时。加入0.3M NaOAc和3体积乙醇使DNA沉淀，混合并冷至-70℃，离心分离。用70％乙醇(1ml)洗涤DNA沉淀物，干燥并溶于20μl 10X BamHI缓冲液(150mM NaCl，6mM Tris-HCl pH7.9，6mM MgCl₂，100μg/ml BSA)，2μl BamHI限制性内切酶(40单位)和178μl水中。慢慢混合后，使该反应在37℃保温2小时。按上述方法再用3体积的乙醇沉淀该DNA，在1％低熔点琼脂糖凝胶(FMC，Sea Plaque琼脂糖)中电泳。从该凝胶中切下相当于约270bp的所要的DNA片段，然后通过熔融该琼脂糖而回收DNA，按厂商推荐的方法使DNA通过Elutip-d柱(Schleicher & Schuell，Keene，N.H.)。沉淀后干燥，将DNA贮藏在pH为8.0的30μl 10mM Tris-HCl中。

将约15μg质粒pCZR126S(来自实例29A12)悬浮在20μl 10X NdeI缓冲液，5μl NdeI限制性内切酶(40单位)和175μl水中，慢慢混合并在37℃保温2小时。保温后，按上述方法用3体积的乙醇沉淀DNA，干燥，然后再悬浮在20μl 10X BamHI缓冲液，2μl BamHI限制性内切酶(40单位)和178μl水中。慢慢混合后，使该反应在37℃保温2小时。再用3体积的乙醇沉淀DNA，在1％低熔点琼脂糖凝胶中电泳。从凝胶中切下对应于载体DNA的大片段，用上述的Elutip-d柱方法回收该DNA。沉淀后，干燥，将载体DNA贮藏在pH8.0的35l 10mM Tris-HCl中。

将约2.5μl载体DNA与上述12μl纯化的人胰岛素基因片段，4μl 10mM ATP，0.5μl 1M二硫苏糖醇，5μl10X连接酶缓冲液(500mM Tris-HCl pH7.6和100mM MgCl₂)，26μl水和0.5μl T4DNA连接酶(Pharmacia，3.5单位)相混合。该反应在4℃保温16小时。用50μl 10mM Tris-HCl pH7.6和3μl 1MCaCl₂稀释连接混合物，然后基本上按实例29A3的方法转化至大肠杆菌K12RV308中。将细胞涂在加有5μg/ml四环素的TY平板上，然后在32℃保温过夜。

用快速碱性提取法(如Molecular Cloning，ALaboratory Manual，1982，ed.by Maniatis，T.；Fritsch，E.F.，and Sambrook，J.ColdSpring Harbour Publications，New York，P368-369)，从抗四环素菌落中分离3ml培养液中的质粒。按微量筛选法用聚丙烯酰胺凝胶电泳分析XbaI/BamHI消化的片段，从而发现了正确的人胰岛素原基因片段的存在。选择具有正确大小(约315bp)插段的质粒以用于扩增和纯化。含有人胰岛素原基因的质粒是pRB145。质粒pRB145的限制性位点和功能图如附图16所示。

2.质粒pRB164A的构建

将约30μg质粒pRB145悬浮在20μl的10XNdeI缓冲液，5μl NdeI限制性内切酶(New EnglandBiolabs，40单位)和175μl水中，慢慢混合，在37℃保温1小时。然后将2μl的BamHI限制性内切酶(NewEngland Biolabs，40单位)加到该反应混合物中，在37℃再继续保温2小时。用3体积的乙醇和0.3M NaOAc沉淀该DNA，在1％低熔点琼脂糖凝胶中电泳。从该凝胶中切下编码人胰岛素原基因的较小(约270bp)的NdeI/BamHI限制性片段，按上述方法通过Elutip-d柱回收该DNA。沉淀后干燥，将该DNA贮藏在pH8.0的30μl 10mM Tris中。

然后在该DNA(30μl)中，加入20μl的10X AyaII缓冲液(50mM NaCl，6mM Tris-HCl，pH8.0，10mM MgCl₂，6mM 2-巯基乙醇，100μg/mlBSA)，5μl的AvaII限制性内切酶(New EnglandBiolabs，20单位)和175μl水。慢慢混合后，该反应在37℃保温2小时。用3体积乙醇和3M NaOAc(20μl)沉淀该DNA，然后在1.2％低熔点琼脂糖凝胶中电泳。从该凝胶中切下较大的AvaII/BamHI限制性片段(约156bp)，然后按上述方法通过Elutip-d柱回收DNA。沉淀后干燥，将DNA贮藏在pH8.0的30μl 10mM Tris中。

用合成方法制备相应于人胰岛素原基因的NdeI/AvaII限制性片段的DNA(～115bp)。第一步包括用DNA合成仪(Applied Biosystems，Model380B)合成4个单链脱氧寡核苷酸。这4个寡核苷酸的核苷顺序为

1.TATGCGTATGTTTGTTAACCAACACCTGTGCGGCTCCCACCTG

GTGGAAGCTCTGTACCT (60聚体)

2.GGTGTGCGGTGAACGTGGCTTCTTCTACACCAAGCCGACC

CGCCGTGAGGCAGAG (55聚体)

3.CACCAGGTACAGAGCTTCCACCAGGTGGGAGCC

GCACAGGTGTTGGTTAACAAACATACGCA(62聚体)

4.GTCCTCTGCCTCACGGCGGGTCGGCTTGGTGTAGAA

GAAGCCACGTTCACCGCA (54聚体)

通过聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化每个寡核苷酸后，按Brown，E.L.，Belagaje，R.，Ryan，M.J.和Khorana，H.G(1979)教导的方法(Methods in Enzymology，Ed.by Wu，R.，Academic Press，N.Y.68：109-151，整个公开列入本文参考文献中)，使寡核苷酸2和3磷酸化。然后使磷酸化的寡核苷酸2和3(各为～715微微摩尔)与寡核苷酸1和2(～860微微摩尔)相混合，在含50mMTris-HCl pH7.6，10mM MgCl₂，10mM DTT，50μM ATP和20单位T4DNA连接酶(Pharmacia)的的缓冲液(200μl)中在4℃退火并连接16小时。在15％聚丙烯酰胺凝胶中纯化连接产物。从凝胶切片中电泳回收DNA，接着在Sephadex G-50柱中脱盐。得到所要的连接产物是485微微摩尔。

按Brown，E.L.等人，1979，Methods inEnzymology 68：109-151所述方法(列入本文参考文献)，在含50mM Tris pH7.6，10mM MgCl₂，10mM DTT和ATP的缓冲液(50μl)中使约100微微摩尔DNA磷酸化。通过Sephadex G-50柱过滤后，将DNA贮藏在50μl 10mM Tris pH8.0中。

使约2.5μl载体DNA(NdeI-BamHI消化的pCZR126S)与18μl质粒pRB145的AvaII/BamHI限制性片段和10μl(10微微摩尔)NdeI/AvaII合成人工接头(在含有50mM Tris pH7.6；10mM MgCl₂；10mM DTT；800μl ATP和3.5单位T4DNA连接酶的50μl缓冲液中刚构建的)相混合。该反应液在4℃保温过夜，然后按实例29A3的方法转化至大肠杆菌K12RV308中。通过分析其质粒DNA鉴定所要的转化体大肠杆菌K12RV308/pRB164A。使合适的转化体在30℃，在含有5μg/ml四环素的TY介质中生长至OD₅₅₀约为0.2，即早对数期，然后移至42℃3-3.5小时以诱导合成人胰岛素原。使细胞离心沉淀，加入样品缓冲液(0.125M Tris-HCl pH6.8，2％SDS，30％甘油，1M 2-巯基乙醇，6M尿素)使其溶解。在97℃加热样品2分钟，然后加在丙烯酰胺凝胶上。用考马斯亮蓝染色很容易检测这些带。用扫描凝胶密度计测定细胞蛋白质的百分量。质粒pRB164A的限制性位点和功能图如附图17所示。

3.质粒pRB172的构建

将约25μg质粒pRB145悬浮在15μl 10X DraII缓冲液(200mM NaCl，50mM Tris-HCl pH7.5，10mM MgCl₂，1mM DTT，10μg/ml BSA)，6μl DraIII限制性内切酶(Boehringer Mannheim，27单位)和129μl水中，慢慢混合，在37℃保温6小时。保温后沉淀该DNA，干燥并再悬浮在10μl 10X XbaI缓冲液(150mM NaCl，6mM Tris-HCl pH7.9，6mMMgCl₂，7mM 2-巯基乙醇，100μg/ml BSA)，3μl XbaI限制性内切酶(Boehringer Mannheim，36单位)和77μl水中。慢慢混合该反应液，在37℃保温4小时。再用3体积乙醇和NaOAc沉淀该DNA，在1％低熔点琼脂糖凝胶中电泳。从该凝胶中切下对应于人胰岛素原基因的约85bp XbaI/DraIII限制性片段的低带，用Elutip-d柱方法回收DNA。沉淀后干燥，将DNA贮藏在pH为8.0的30μl的10mMTris中。

按上述方法，用限制性内切酶DraIII和XbaI切割约15μg质粒pRB164A。用Elutip-d柱方法从琼脂糖凝胶中分离对应于XbaI/DraIII载体片断的上层带。沉淀后干燥，将DNA贮藏在pH为8.0的30μl 10mM Tris中。

将约5μl XbaI/DraIII消化的pRB164A载体DNA与在缓冲液(50μl，含50mM Tris-HCl pH7.6，10mM MgCl₂，10mM DTT，800μM ATP和6单位T4DNA连接酶)中的质粒pRB145的5μl XbaI/DraIII限制性片段相混合。该反应在4℃保温过夜，用于转化CaCl₂处理的感受态大肠杆菌K12/RV308细胞。

在含5μg/ml四环素的TY琼脂平板上选择转化体。用快速碱性提取法从抗四环素菌落中分离质粒，通过用XbaI和BamHI限制性内切酶消化以进行分析。用顺序分析***(U.S.Biochemicals)测定来自阳性克隆的DNA顺序。选择所要的具有正确顺序的质粒用于扩增和纯化。这样可分离到大肠杆菌K12RV308/pRB172转化体。在15％聚丙烯酰胺基质中电泳分离后，通过测定总细胞蛋白质而分析质粒的人胰岛素原的表达和积聚情况。质粒pRB172的限制性位点和功能图如附图18所示。C.大肠杆菌RV308/pRB173和pRB174的构建

将约20μg质粒pRB172或pRB145悬浮在20μl10X XbaI缓冲液(150mM NaCl，6mMTris-HCl，pB7.9，6mM MgCl₂，7mM 2-巯基乙醇，100μg/ml BSA)中，加入2μl XbaI限制性内切酶(Boehringer Mannheim，24单位)，慢慢混合，并在37℃保温4小时。保温后，沉淀该DNA，干燥，再悬浮在10μl 10X BamHI缓冲液(100mM NaCl，10mMTris-HCl pH8.0，5mM MgCl₂，1mM 2-巯基乙醇，100μg/ml BSA)，5μl BamHI限制性内切酶(Boehringer Mannheim，40单位)和75μl水中，使该反应液慢慢混合，在37℃保温4小时。再用乙醇和NaOAc沉淀DNA，在1％低熔点琼脂糖凝胶中电泳，用Elutip-d柱方法从凝胶中分离对应于人胰岛素原基因的约320bp XbaI/BamHI限制性片段。沉淀后干燥，将DNA再悬浮在20μl10X XmaI缓冲液(25mM NaCl，10mM Tris-HClpH7.5，10mM MgCl₂，10mM 2-巯基乙醇，100μg/ml BSA)，10μl XmaI限制性内切酶(NewEngland Biolabs，10单位)和170μl水中。使该反应液慢慢混合，在37℃保温4小时。保温后，用乙醇和NaOAc沉淀DNA，在1％低熔点琼脂糖凝胶中电泳。从凝胶中切下对应于约200bp XbaI限制性片段的大DNA，按上述方法通过Elutip-d回收DNA。将DNA贮藏在30μl 10mMTris pH8.0中。

按下述合成法构建对应于人胰岛素原基因的XmaI/BamHI限制性片段的51bp DNA。在合适的AppliedBiosystems公司的DNA合成仪中(380B型)合成2个单链脱氧寡核苷酸：CCGGGTGCAGGCAGCCTGCAGCCGCTGGCCCTGGAGGGTTCCCTGCAGTAG(51聚体)和GATCCTACTGCAGGGAACCCTCCAGGGCCAGCGGCTGCAGGCTGCCTGCAC(51聚体)在有7M尿素的情况下，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯化。分离后，按Brown，E.L.，Belagaje，R.，Ryan，M.J.，和Khorana，H.G.(1979)Methods inEnzymology，ed.by Wu，R.，Academic Press，N.Y.68：109-151中的教导使2个寡核苷酸磷酸化，并退火以形成所要的人工接头。

将约10μg质粒pCZR126S(来自实例29A12)悬浮在20μl 10X XbaI缓冲液(150mM NaCl，6mMTris-HCl pH7.9，6mM MgCl₂，7mM 2-巯基乙醇，100μg/ml BSA)，2μl XbaI限制性内切酶(Boehringer Mannheim，24单位)和178μl水中。慢慢混合该反应液，在37℃保温2小时。保温后，加入4μl 5M NaCl和2μl BamHI限制性内切酶(New EnglandBiolabs，20单位)，在37℃继续保温2小时。然后用一般方去，用乙醇和NaOAc沉淀DNA，在1％低熔点琼脂糖凝胶中电泳。用Elutip-d柱分离对应于XbaI/BamHI载体DNA的上层带。沉淀后干燥，将该DNA贮藏在pH为8.0的30μl 10mM Tris中。

在含50μM Tris pH7.6，10mM MgCl₂，10mM DTT，800μM ATP和6单位T4DNA连接酶的50μl缓冲液中，将约5μl XbaI/BamHI消化的pCZR126S载体DNA与10μl来自pRB145或pRB172的XbaI/XmaI限制性片段和上述制得的4μl激活的XmaI/BamHI人工接头相混合。该反应液在4℃保温过夜，用于按实例29A3的方法转化大肠杆菌K12RV308菌株。在42℃保温前和保温后通过分析其质粒DNA和蛋白质产物而鉴定所要的转化体大肠杆菌K12RV308/pRB173(若由pRB172载体片段组成的话)和大肠杆菌K12RV308/pRB174(若由pRB145载体片段组成的话)。质粒pRB173的限制性位点和功能图如附图19所示。

将得自微量制备的约200ng质粒DNA也转化至大肠杆菌L201细胞中，在含有15μg/ml四环素的2XTY琼脂平板上选择转化体。分析该转化体表达的蛋白质，由它们产生人胰岛素原的能力确定所要的转化体。由此分离大肠杆菌L201/pRB173和大肠杆菌L201/pRB174。D.大肠杆菌K12RV308/pRB175、pRB176、

pRB177和pRB178的构建

将约12μg质粒pRB172悬浮在15μl 10X NdeI缓冲液(100mM NaCl，50mM Tris-HCl pH7.5，10mM MgCl₂，1mM DTT，100μg/ml BSA)，2.5μl NdeI限制性内切酶(20单位)和133μl水中。慢慢混合该反应液，在37℃保温过夜。保温后，用一般方法用乙醇和NaOAc沉淀该DNA，干燥，再悬浮在15μl 10X DraIII缓冲液(50mM Tris-HCl pH7.5，200mM NaCl，10mM MgCl₂，1mM DTT)，5μl DraIII限制性内切酶(20单位)和130μl水中。慢慢混合后，该反应液在37℃保温过夜。再按上述方法用乙醇和NaOAc沉淀该DNA，在1％低熔琼脂糖中电泳。从该凝胶中切下所要的大限制性片段，用Elutip-d柱方法回收DNA，将DNA贮藏在pH为8.0的30μl 10mM Tris HCl中。

用Applied Biosystems的DNA合成仪(380B型)化学合成下列DNA人工接头：(i) 5′TATGTACGACCAACACCTGTGCGGCTCCCATCTG 3′

3′ ACATGCTGGTTGTGGACACGCCGAGGGTA 5′用于pRB175(ii)5′TATGTACGACGTTAACCAACACCTGTGCGGCTCCCATCTG 3′

3′ ACATGCTGCAATTGGTTGTGGACACGCCGAGGGTA 5′用于pRB176(iii)5′TATGTATAACCAACACCTGTGCGGCTCCCATCTG 3′

3′ACATATTGGTTGTGGACACGCCGAGGGTA 5′用于pRB177(iv)5′TATGTACGTTAACCAACACCTGTGCGGCTCCCATCTG 3′

3′ACATGCAATTGGTTGTGGACACGCCGAGGGTA 5′用于pRB178

用聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化每个低聚核苷酸后，按上述方法使其磷酸化，并退火以便连接和构建人胰岛素原基因(该基因可模拟编码DNA片段)。用人工接头(i)-(iv)分别构建质粒pRB175、pRB176、pRB177和pRB178。

在含50μM Tris-HCl(pH7.6)，10mM MgCl₂，10mM DTT，800μM ATP和6单位T4 DNA连接酶的缓冲液(50μl)中，使约3μl NdeI/DraIII消化的pRB172载体DNA片段与激活的人工接头(i-iv)各4μl相混合。该反应液在4℃保温过夜，按实例29A3的方法用该混合物转化大肠杆菌K12RV308细胞。在42℃诱导该细胞前后，通过分析它们的质粒DNA和蛋白质的产生以鉴定所要的转化体大肠杆菌K12RV308/pRB175、大肠杆菌K12RV308/pRB176、大肠杆菌RV308/pRB177和大肠杆菌K12RV308/pRB178。质粒pRB175的限制性位点和功能图如附图20所示。

表I人胰岛素原类似物类似物质粒％蛋白质Met-Tyr-Human Proinsulin (HPI) pRB145 11.3Met-Arg-Met-[Lys(B28)，Pro(B29)HPI] pRB164A 10.5Met-Tyr-[Lys(B28)，Pro(B29)HPI] pRB172 7.3Met-Tyr[Lys(B28)，Pro(B29)B-chain]-Q^* pRB173 NDMet-Tyr-[B-chain]-Q^* pRB174 NDMet-Tyr-[Des(B1)，Des(B2)，Asp(B3)， pRB175 8.5Lys(B28)，Pro(B29)HPI]Met-Tyr-[Asp(B1)，Lys(B28)， pRB176 9.3Pro(B29)HPI]Met-Tyr-[Des(B1)，Des(B2)，Lys(B28)， pRB177 9.4Pro(B29)HPI]Met-Tyr-[Des(B1)，Lys(B28)， pRB178 8.5Pro(B29)HPI]^*Q ＝ -Arg-Arg-Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-Gln-Val-Gly-Gln-Val-Glu-

Leu-Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-

Ala-Leu-Glu-Gly-Ser-Leu-Gln-；E.按下列方法使大肠杆菌K12RV308/pRB172的贮备

培养物变成永久性贮备培养物

将分离的菌落点在下列表型平板上：L-琼脂＋5μg/mlTc(四环素)，L-琼脂＋Sm(链霉素硫酸盐)，M-9琼脂介质(含MgSO₄、硫胺素、HYCASE和葡萄糖的盐基介质)和不含葡萄糖而含乳糖的M-9琼脂介质。一块L-琼脂/Tc平板在42℃保温，其余的平板在30℃保温24小时。从30℃L-琼脂/Tc平板中选择表型正确的菌落，用于接种合50ml L-肉汤(含胰蛋白胨、酵母膏、NaCl和葡萄糖)加5μg/ml Tc介质的培养瓶。该培养瓶在30℃震荡保温7小时。将瓶中物质(1.2ml)放入生物冷冻瓶中，在液氨的蒸气相中冷冻。然后使该物质解冻，用1ml接种在含50ml L-肉汤加5μg/mlTc的瓶中。该瓶在30℃震荡保温4小时。再各用1ml上述物质接种2个含有500ml BG-7介质(含MgSO₄、硫胺素、葡萄糖、Tc和微量盐)的培养瓶。在30℃使这二个培养瓶震荡保温9小时。

将1升上述BG-7介质液体培养基接种在150升发酵罐内，该罐含有80升介质(该介质含有柠檬酸、硫酸亚铁铵、K₂HPO₄、NH₄Cl、NaH₂PO₄、CaCl₂、MgSO₄、葡萄糖和微量无机盐)。在30℃操作该发酵罐直到二氧化碳排放速率达到1.0mM/L/分为止。此时，将50升液体培养基转移到发酵罐中以提供细胞接种物。

在30℃操作含1500升介质(与150升发酵罐中所用介质相同)的2500升发酵罐，直到二氧化碳排放率达到1.0mM/L/分，然后将温度升至40℃，继续运行8小时。然后在61℃使液体培养基热失活7分钟，由该热失活的液体培养基可得到下列产率数据：细胞产量为13.1g/L(干重)；生产力为273μg脱甲酰化产物/ml液体培养基；比活(即每克产物/克细胞)为2.1％；甲酰化产物百分数为13％。

将发酵的液体培养基转入不锈钢储料罐中保持温度为2-8℃。然后使整个液体培养基离心或过滤以收集大肠杆菌细胞，得到干重约15-20％的固体。将收集的细胞固体再添于加工水中以使其成浆料。然后用高压均化法或其他合适的方法使细胞***，结果90-99％的细胞分解。用加工水稀释均化的浆料以达到5％干重。加入NaOH使稀释的分解细胞浆液的pH调至7-10。通过差分离心从细胞碎片中分离内含体(颗粒)。所得到的固体浓度为15-20％。

在半胱氨酸和尿素的情况下，在碱性pH中溶解内含体。为了从大量颗粒物中分辨混合的胰岛素原类似物的二硫化物，在SPSepharose中，使溶解的颗粒进行超流阳离子交换层析。

通过与组织蛋白酶C、二肽氨肽酶保温以除去胰岛素原类似物氨基端的甲硫氨酰基酪氨酸伸展。用pH8.8的连四硫酸钾和半胱氨酸通过亚硫酸分解终止组织蛋白酶的***反应通过Sephadex G-25进行溶剂交换后，在pH为10.6时，在有半胱氨酸情况下保温使得到的胰岛素原类似物的S-磺酸盐折叠。通过将pH调至2.4以终止折叠过程。在SP20SS树脂中用疏水作用层析从不合适的折叠物以及由组织蛋白酶C***步骤留下的污染物中分离出正确折叠的胰岛素原类似物。由于此分离过程是通过丙酮梯度进行的，因此在进一步加工前，必须通过蒸发从主流池中除去有机溶剂。

有机溶剂蒸发后，使正确折叠的胰岛素原类似物与胰蛋白酶和羧肽酶B保温。这些酶可切割胰岛素原类似物的C肽，产生Lys(B28)，Pro(B29)人胰岛素。然后在S-Sepharose中进行阳离子交换层析，再在10μm C-8树脂中进行高效反相层析以进一步纯化胰岛素类似物。通过Sephadex G-25进行溶剂交换从反相主流中除去乙腈，用螺旋绕制的超过滤***浓缩所得的物质。在Sephadex G-50树脂中对浓缩的物质进行大小排阻层析，并冷冻干燥。

下列表II提供了上述实例中化合物的氨基酸分析。

表II

人胰岛素类似物1，2中氨基酸分析实例号 2 3 4 5 6 7 8 9 10氨基酸残基Asp 3.00(3) 3.00(3) 3.00(3) 3.00(3) 4.00(4) 4.00(4) 4.00(4) 3.00(3) 3.00(3)Thr 2.82(3) 2.81(3) 2.64(3) 2.80(3) 2.80(3) 2.94(3) 2.81(3) 2.71(3) 2.73(3)Ser 2.76(3) 2.73(3) 2.70(3) 2.75(3) 2.71(3) 2.46(3) 2.71(3) 2.74(3) 2.72(3)Glu 7.16(7) 7.05(7) 6.93(7) 7.08(7) 7.01(7) 6.69(7) 7.18(7) 6.99(7) 7.94(8)Pro 1.02(1) 1.11(1) 0.92(1) 0.98(1) 1.01(1) 0.98(1) 1.02(1) 1.09(1) 0.98(1)Gly 3.93(4) 4.00(4) 3.85(4) 3.99(4) 4.02(4) 3.97(4) 4.01(4) 3.95(4) 3.90(4)Ala 1.01(1) 1.04(1) 1.93(2) 1.02(1) 1.05(1) 1.05(1) 1.03(1) 1.03(1) 1.02(1)Cys(1/2) 5.13(6) -(6)3 5.13(6) 5.17(6) 5.32(6) 4.91(6) 5.53(6) 5.23(6) 5.33(6)Val 3.45(4) 3.44(4) 3.49(4) 3.51(4) 3.41(4) 3.67(4) 3.54(4) 3.45(4) 3.48(4)Ile 1.47(2) 1.47(2) 1.49(2) 1.58(2) 1.44(2) 1.65(2) 1.68(2) 1.48(2) 1.47(2)Leu 6.04(6) 6.01(6) 5.86(6) 6.19(6) 6.06(6) 5.67(6) 5.99(6) 6.02(6) 5.98(6)Tyr 3.83(4) 3.74(4) 3.52(4) 4.19(4) 3.90(4) 3.55(4) 3.82(4) 3.73(4) 3.58(4)Phe 2.84(3) 2.85(3) 2.64(3) 2.85(3) 2.84(3) 3.02(3) 2.86(3) 2.72(3) 2.73(3)His 2.35(2) 2.10(2) 2.02(2) 2.14(2) 1.60(2) 2.09(2) 1.07(1) 2.02(2) 2.10(2)Lys 0.97(1) 0.97(1)Arg 0.99(1) 0.90(1) 0.88(1) 1.96(2) 0.91(1) 0.81(1) 0.91(1) 0.89(1) 0.98(1)Aba -(1)³Cya 0.90(1)NleOrnNvaMetTrp1摩尔单位以天冬氨酸计2括号中的数表示理论上的氨基酸含量3半胱氨酸加氨基丁酸总共为6.49

表II(续)

人胰岛素类似物1，2中氨基酸分析实例号 11 12 13 14 15 16 17 18 19氨基酸残基Asp 3.00(3) 3.00(3) 3.00(3) 3.00(3) 3.00(3) 3.00(3) 3.00(3) 3.00(3) 3.00(3)Thr 2.76(3) 3.59(3) 2.80(3) 2.80(3) 2.70(3) 2.83(3) 2.85(3) 3.03(3) 2.80(3)Ser 2.69(3) 2.64(3) 2.43(3) 2.78(3) 2.87(3) 2.78(3) 2.97(3) 2.68(3) 2.72(3)Glu 8.04(8) 6.84(7) 6.89(7) 7.09(7) 7.04(7) 7.08(7) 6.94(7) 6.99(7) 7.01(7)Pro 1.11(1) 1.48(1) 1.09(1) 1.12(1) 0.93(1) 1.16(1) 1.10(1) 1.14(1) 1.02(1)Gly 4.04(4) 5.70(5) 3.89(4) 4.03(4) 3.98(4) 4.00(4) 4.12(4) 4.08(4) 3.92(4)Ala 1.05(1) 1.14(1) 1.04(1) 1.05(1) 1.08(1) 1.04(1) 1.09(1) 1.07(1) 1.03(1)Cys(1/2) 5.26(6) 4.54(6) 4.57(6) 5.19(6) 5.00(6) 4.75(6) 5.20(6) 4.82(6) 5.30(6)Val 3.60(4) 3.52(4) 3.58(4) 3.43(4) 3.41(4) 3.51(4) 3.49(4) 3.63(4) 3.51(4)Ile 1.62(2) 1.82(2) 1.70(2) 2.36(3) 1.44(2) 1.51(2) 1.52(2) 1.75(2) 1.55(2)Leu 5.99(6) 5.79(6) 5.95(6) 5.98(6) 6.89(7) 6.10(6) 5.95(6) 5.98(6) 6.11(6)Tyr 3.73(4) 3.89(4) 3.75(4) 3.74(4) 3.64(4) 3.86(4) 3.74(4) 3.80(4) 3.84(4)Phe 2.88(3) 3.47(3) 3.01(3) 2.85(3) 2.71(3) 2.86(3) 2.87(3) 3.13(3) 2.89(3)His 2.08(2) 2.24(2) 3.39(3) 2.07(2) 2.30(2) 2.48(2) 2.20(2) 2.29(2) 2.10(2)Lys 0.99(1)Arg 0.91(1) 0.80(1) 0.95(1) 0.89(1) 0.86(1) 1.00(1) 0.87(1) 0.80(1) 1.03(1)AbaCyaNle 0.93(1)Orn 0.96(1)NvaMet 0.98(1)Trp

表II(续)

人胰岛素类似物1，2中氨基酸分析实例号 20 21 22 23 24 25 26 27氨基酸残基Asp 3.00(3) 3.00(3) 3.00(3) 3.00(3) 3.00(3) 3.00(3) 3.00(3) 3.00(3)Thr 2.51(3) 3.04(3) 2.76(3) 3.73(4) 2.70(3) 2.80(3) 3.16(3) 2.75(3)Ser 2.55(3) 2.69(3) 3.60(4) 2.74(3) 2.76(3) 2.78(3) 2.75(3) 2.63(3)Glu 7.25(7) 7.06(7) 6.99(7) 7.07(7) 7.01(7) 7.04(7) 6.98(7) 7.02(7)Pro 0.93(1) 2.20(2) 0.95(1) 1.00(1) 0.95(1) 1.11(1) 1.22(1) 1.16(1)Gly 3.92(4) 3.93(4) 3.91(4) 3.97(4) 3.94(4) 3.97(4) 4.26(4) 3.98(4)Ala 1.09(1) 1.02(1) 1.07(1) 1.03(1) 1.08(1) 1.04(1) 1.14(1) 1.03(1)Cys(1/2) 4.53(6) 5.57(6) 4.31(6) 5.01(6) 4.05(6) 5.17(6) 4.81(6) 5.16(6)Val 3.72(4) 3.61(4) 3.37(4) 3.42(4) 3.41(4) 3.43(4) 4.80(5) 3.59(4)Ile 1.72(2) 1.56(2) 1.42(2) 1.48(2) 1.44(2) 1.48(2) 1.67(2) 1.59(2)Leu 6.01(6) 6.09(6) 5.95(6) 6.02(6) 6.01(6) 5.98(6) 5.96(6) 5.99(6)Tyr 3.55(4) 3.93(4) 3.60(4) 3.72(4) 3.78(4) 4.67(5) 3.77(4) 3.75(4)Phe 3.59(4) 3.13(3) 2.76(3) 2.85(3) 2.74(3) 2.83(3) 3.28(3) 2.87(3)His 2.14(2) 2.10(2) 2.55(2) 2.32(2) 2.82(2) 2.08(2) 2.25(2) 2.02(2)LysArg 0.87(1) 1.02(1) 0.85(1) 0.92(1) 1.05(1) 0.86(1) 1.02(1) 0.87(1)AbaCyaNleOrnNva 0.98(1)MetTrp 0.89(1)

下列的体内检测***可显示本发明胰岛素类似物的生理作用。

用取自Charles River Laboratories(Portage，MI)的普通雄性Sprague Dawley大鼠作试验动物。这些动物重量为160-180g，在75°F控制光照(在上午7：00至下午7：00有光，下午7：00至上午7：00无光)的动物饲养室内饲养一周。给这些动物随意饲喂Purina大鼠饲料5001。在使用前使用于每一检测的鼠饥饿16小时。它们在最初使用时重约200g。饥饿动物的重量达到275g(在三周以内)后便不再使用。每天用10只一组的雄性大鼠作各种化合物试验(即生物合成人胰岛素、猪胰岛素和人胰岛素类似物)。每周中各组均只用一次。将10个鼠分成2组，每组5个鼠。用一组作对照，只在皮下注射载体，另一组的5个鼠注射待测化合物。将蛋白质溶于0.05N HCl(pH1.6)中以制备100μg/ml的贮备液。用普通盐水稀释该贮备液，皮下注入鼠中。施药后在0、30分钟、1小时、2小时、3小时和4小时从每个鼠的尾静脉中取出100μl血样。用葡萄糖氧化酶法(Sigma Chemical Co.)比色测定葡萄糖。计算每个鼠从0时起血液中葡萄糖％数的变化，试验组中的平均％变化值±SEM(经那天对照组中的平均变化值校正后)可表示最终结果。

在给定时间内(通常为注射蛋白质后1或2小时)，由4-7个不同浓度的测试化合物的最大反应特色画出剂量—反应特性曲线。由该曲线，测定ED₅₀的值，从而给出最大低血糖反应的1/2蛋白质皮下剂量(μg/Kg)。结果如下表III所示。

表III^a化合物最大作用 ED₅₀ ^b 生物活性^c

(％)人胰岛素(HI)^d 66 7.95 100猪胰岛素 60 7.70 103Lys(B28)，Pro(B29)EI 66 6.8 117Ala(B28)，Pro(B29)HI 71 15.0 53Asp(B28)，Pro(B29)HI 64 10.2 78Asp(B10)，Lys(B28)，Pro(B29)HI 53 10.7 74Gln(B28)，Pro(B29)HI 69 6.6 120Gly(B28)，Pro(B29)EI 58 10.5 76Met(B28)，Pro(B29)HI 51 14.6 54Nle(B28)，Pro(B29)HI 54 7.0 114Orn(B28)，Pro(B29)HI 60 12.7 63Pro(B29)HI 63 8.7 91Phe(B28)，Pro(B29)HI 57 9.7 82Val(B28)，Pro(B29)HI 53 8.7 91

a.所有的数值均表示注射所示化合物后1小时取出的血样的分析结果

b.表示皮下剂量μg/Kg

c.相对于人胰岛素

d.生物合成人胰岛素

如上所述，本发明的胰岛素类似物聚合成二聚物的倾向小，或换句话说不会自联成高分子量形式。因此施用一种或多种该类似物后，很快达到活性。根据病人需要施用有效量的结构式I的胰岛素类似物，则本发明的胰岛素类似物可有效地治疗高血糖。本文所用的“有效量”是指治疗或预防高血糖时降低或保持血糖含量所需的本发明一种或多种胰岛素类似物的量。该量一般为每天约10-60单位或更多(或如果每mg有29单位，则为约0.3-2mg)。但是，应该明白，实际施用的胰岛素类似物的量是由医生根据有关情况决定的，这些情况包括治疗条件(即高血糖的起因)、待施用的特定类似物、所选用的肠胃外施用途径、每个病人的年龄、体重及反应以及病人症状的严重程度等。因此，不能以任何方式，用上述剂量限定本发明的范围。

借助于含有效量的至少一种结构式I的胰岛素类似物的药物组合物与一种或多种医药上可接受的赋形剂或载体相混合，可根据病人需要(即患高血糖的病人)施用本发明的胰岛素类似物。在这些情况下，一般配制的药物组合物每ml含100单位或含有效量的胰岛素类似物的类似浓度。这些组合物一般(但不是必须的)不口服，可用现有技术中公知的肠胃外产物的普通赋形剂或载体，用不同的方法制得。参见例如列入本文参考文献的Remington′s PharmaceuticalSciences 17th edition，Mack PublishingCompany，Easton，PA，USA(1985)。例如将所需量的至少一种结构式I的胰岛素类似物悬浮或溶于适用于注射的无毒液体载体如一种含水介质中，并使该悬浮液或溶液消毒，可制备肠胃外施用的药剂。另一种方法是，将一定量的化合物放在药瓶中，使药瓶和它的内含物消毒并密封。为便于施用前混合，可再提供一个附加药瓶或载体。适用于肠胃外施用的药物组合物所使用的稀释剂、赋形剂和载体例如水和水可溶混的有机溶剂如丙三醇、芝麻油、花生油、含水丙二醇、N，N′-二甲基甲酰胺等。这些药物组合物的例子包括结构式I的胰岛素类似物的无菌、等渗的盐水溶液，它能用医药上可接受的缓冲剂缓冲，它是无热原的。另一种肠胃外药物配方含有防腐剂，例如间甲酚或调节最终pH的其他试剂如NaOH或HCl。

也可将本发明胰岛素类似物制成适于鼻内给药的药物组合物。该组合物在EP0200383A3(已列入本文参考文献)中已详细公开。简单地说，该组合物是用下列试剂配制的：一种或多种医药上可接受的稀释剂、医药上可接受量的碱金属盐、铵盐或实质上无锌胰岛素的游离酸，以及任选的增加吸收量的至少一种吸收增加剂，该吸收增加剂可选自下列化合物：(1)油酸或其酯或盐，(2)液态山梨聚糖脂肪酸酯，(3)山梨聚糖脂肪酸酯的液体聚氧乙烯衍生物，(4)液体羟基聚乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯共聚物。

为证明鼻内给药胰岛素类似物Lys(B28)，Pro(B29)人胰岛素(与人胰岛素钠相比)的效果，进行了下列试验。与试验过程中和试验前，在良好的自然条件下饲养重10-12Kg的雄性警犬。使狗饥饿16小时，但使其饮水以确保胰岛素浓度稳定变化。整个试验过程中，用戊巴比妥钠麻醉该狗，用加热垫片保持它们的体温以减少葡萄糖的变化。将胰岛素试验样品(即Lys(B28)，Pro(B29)人胰岛素和人胰岛素钠)溶于蒸馏水中，用NaOH调节溶液pH为7.5。最终的胰岛素浓度为每ml70单位。对8条狗施用的Lys(B28)，Pro(B29)人胰岛素的剂量均为每Kg0.8单位胰岛素，同样对4条狗施用的人胰岛素钠剂量均为每Kg0.8单位。用剂量测量喷雾器和改进的鼻腔施药器通过鼻腔一次喷雾将所有剂量施入鼻腔内。在施药前30、15和0分钟及施药后10、20、30、45、60、90、120、180和240分钟从颈静脉中取出血液样品，用于测定血液葡萄糖的减少。试验结果如表IV所示。

用上述方法，通过鼻内给药Lys(B28)，Pro(B29)人胰岛素后血液葡萄糖减少情况与静脉和皮下施用该类似物的结果比较如下：静脉施药时，含Lys(B28)，Pro(B29)人胰岛素类似物的胰岛素溶液都是用大丸剂注射(bolus injection)每Kg0.1单位)注入4条狗的隐静脉(Saphenous Vein)中，在注射前30、15和0分钟和注射后5、10、15、20、30、45、60、90、120、180和240分钟取出血液样品。皮下施药时，将含Lys(B28)，Pro(B29)人胰岛素类似物的胰岛素溶液从6条狗的肋外边表皮下方注入(每Kg0.2单位)。按上述从鼻腔施药的相同方法取出血样。比较试验的结果如表V所示。

表IV^a时间 Lys(B28)，Pro(B29) 人胰岛素钠(分) 人胰岛素(开始时的％) (开始时的％)-30 95.4±2.5 101.6±2.4-15 98.2±2.8 102.4±2.90 100 10010 95.4±2.1 100.8±1.920 83.5±3.3 96.0±2.130 72.2±4.5 91.6±2.845 61.6±6.9 89.1±2.360 60.0±6.0 93.6±4.590 71.6±4.6 92.2±1.6120 76.1±3.7 91.3±2.8180 91.2±1.8 93.8±1.8240 85.4±2.7 90.7±2.8a血葡萄糖含量：平均±S.E.M.

表V^a时间 I.V. S.C. 鼻腔(分) (开始时的％) (开始时的％) (开始时的％)-30 96.6±6.5 95.6±2.1 95.4±2.5-15 101.3±1.5 98.7±2.7 98.2±2.80 100 100 1005 99.9±2.5 - -10 84.8±4.0 99.2±4.8 95.4±2.115 68.1±2.7 - -20 54.5±3.3 91.9±2.4 83.5±3.330 43.3±2.8 81.6±3.0 72.2±4.545 - 55.8±3.5 61.6±6.960 55.3±3.1 35.3±3.1 60.6±6.090 77.2±6.4 39.5±3.4 71.6±4.6120 85.2±4.7 36.1±2.6 76.1±3.7180 97.1±6.4 64.5±7.0 91.2±1.8240 100.0±9.6 81.3±2.4 85.4±2.7a血液葡萄糖浓度：平均±S.E.M.

Claims

1.一种制备具有治疗活性的式(I)胰岛素类似物或其可药用盐的方法：

其中A21是天冬酰胺、丙氨酸或甘氨酸；B1是苯丙氨酸、天冬氨酸或没有；B2是缬氨酸，或B1没有时B2也没有；B3是天冬酰胺或天冬氨酸；B10是组氨酸或天冬氨酸；B28是任何氨基酸；B29是L-脯氨酸、D-赖氨酸或L-赖氨酸；Z是-OH；X是Arg-Arg或是没有；Y只有当有X时才有，若有Y的话，Y是Glu或一种氨基酸顺序，该顺序含有所有或部分如下顺序：

Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-Gln-Yal-Gly-Gln-Yal-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Ser-Leu-Gln-Lys-Arg，该顺序从氨基末端Glu开始；

所述方法包括如下三种制备方法：

(A)使式(I)的A链肽与式(I)的B链所限定的肽混合，形成如式(I)所示的适当二硫键；或

(B)使没有始于B23的肽顺序的式(I)化合物与具有顺序Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-B28-B29-Thr-X-Y-Z的肽偶联；或

(C)(i)用编码式(I)胰岛素原的DNA转化宿主细胞，式(I)中X、Y和Z都有；

(ii)培养重组宿主细胞，并分离由步骤(i)中的DNA编码的化合物；

(iii)将上述化合物酶切除去X、Y和Z，生成胰岛素类似物。

2.按权利要求1的方法，其中A21是天冬酰胺，B1是苯丙氨酸，B2是缬氨酸，B3是天冬酰胺，B10是组氨酸，B28是赖氨酸，B29是L-脯氨酸，Z是-OH，X没有，Y没有。