NO164152B - Preparat for oral administrering til droevtyggere for aa forbedre effektiviteten av forutnyttelse for disse. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår et preparat for

oral administrering til drøvtyggere for å forbedre effektiviteten av forutnyttelsen for disse.

Drøvtyggere som har en sammensatt mage slik som sauer (Ovis aries aries), kveg (Bos primigenius taurus),

geit {Capra hircus) og deres vilde slektninger (hjortedyr og muflon) spiller en viktig rolle i næringskjeden og i økonomien. Deres spesielle betydning er at de lever på fSrstoffer som ikke kan utnyttes av andre planteetere. Formagene gir anaerobt miljø for vomfloraen som er i stand til å fordøye cellulose og utnytter ikke-proteinnitrogen ved siden av de vanlige næringsmidler. Sammensetningen av vomfloraen avhenger i stor grad av foringsrasjonen og er tilpasset dietten. Denne tilpasning tar imidlertid flere dager og den sluttelige stabilisering kan kreve flere uker. Brå forandring av rasjonen påvirker ugunstig inntak, for-døyelighet og produksjon, og kan bevirke sykdom eller til og med død.

Det er vel kjent at i 1 ml vomsaft lever og vokser millioner av bakterier. Anaerob fermentering av bakterier er av stor betydning for den normale fordøyelse og forinn-tak. Energiproduserende næringsmidler fermenteres til eddiksyre, propionsyre og smørsyre, som anvendes av vertdyret som fettsyrer, og bakteriemassen som passerer til tarmene fordøyes og anvendes som proteinkilde. Når det gjelder melk og kjøttproduksjon vil tilførselen av eddiksyre og propionsyre og deres gjensidige forhold spille en vesentlig rolle. Derfor spiller vomfloraen en viktig rolle i opprettholdelse og produksjon av drøvtyggere innen land-bruket.

Etter fødselen utvikles vomfloraen spontant og antar voksen-sammensetningen etter tilvending til fast f6r. Det er imidlertid ikke sikkert at denne tilfeldige flora

vil representere det optimale fermenteringssystem. Det vil således være fordelaktig å råde over en fremgangsmåte for modulering av sammensetningen av og/eller antallet i vom-

floraen i henhold til økonomiske interesser.

Økning av produksjon av flyktig fettsyre i vommen og derved forbedring av forutnyttelsen og' følgelig kjøtt- eller melkeproduksjon er et lenge følt savn innen husdyrhold. Visse resultater er blitt oppnådd med monensin-£2-^5-ethyl-tetrahydro-5-{ tetrahydro-3-methyl-5-./tetrahydro-6-hydroxy-6-(hydroxymethyl) -3,5-dimethyl-2H-pyran-2-yl7-2-furyl}--2-f uryl7 -y-hydroxy-J&-methoxy-a, y , 2 , 8-tetramethyl-l, 6-dioxaspiroZ"4,57decan-7-smørsyreJ anvendt som et middel mot kulebakterier (se f.eks. US patentskrift 4 085 255) . Forsøks-anvendelse av andre beslektede polyethere slik som salino-mycin, lasalocid etc, fthalidderivater (US patentskrift 4 333 923) og glycopeptider slik som avoparcin, actaplanin og lignende (Ingle et al., Abstr. Am. Soc. Anim. Sei. 424

(1978)) er også blitt rapportert. Den observerte effekt

er imidlertid svært forskjellig på dyr fåret på forskjellige forstoffer og er samlet ikke vesentlig (Chalupa,

W., Chemical Control of Rumen Microbial Metabolism, Digestive Physiology and Metabolism in Ruminants, MTP Press, Lancaster, England, 1980 og Chalupa, W. et al., Manipulating Rumen Fermentation with Monensin and Amicloral, Abstr. Am. Soc. Anim. Sei., 410 (1978)). Det

er ikke kjent noen metode innen faget ved hvilken den mikrobielle kultur tilstedeværende i vommen på drøvgyggere kan direkte influeres under dannelse av signifikante resultater.

Under foreliggende forsøk er det funnet at genetiske rekombinantmetoder med hell kan anvendes for separering av mikroorganismer; Praktisk talt enhver bakteriestamme kan merkes med genetiske markører, f.eks. ved en antibiotisk resistensfaktor som muliggjør identifisering av bakterien blant andre bakterier.

Vombakterier er blitt isolert, stammene er blitt merket genetisk, og etter dyrkning ble disse innført på nytt i vommen.i Prøver av vominnholdet ble periodevis tatt og dyrket i selektive media, og det ble funnet at enkelte av stammene som hadde fermentative karakteristika som var fordelaktig for vertdyret og som var i stand til å vokse in vitro, kunne vokse i vommen og holde seg der i lang tid hvis det samme f6rstoff ble tilført som under isoleringen, og disse stimulerte fordøyelsen og derved f6rutnyttelsen

til vertdyret.

Foreliggende oppfinnelse angår således et preparat for oral administrering til drøvtyggere for å forbedre effektiviteten av forutnyttelse for disse, som er kjenne-tegnet ved at det inneholder en mikrobiell kultur valgt fra gruppen bestående av mikroorganismer deponert ved National Collection of Agricultural and Industrial Microorganisms under deponeringsbetegnelsene NCAIM B (P) 000287, 000288 og 000289, som er i stand til å justere vektforholdet mellom eddiksyre og propionsyre, dannet under fermentering av energiproduserende næringsstoffer i- vommen hos et dyr, til en optimal verdi på 1,5 til 4,0:1, og som er i stand til å vokse i vommen og holde seg der i minst 40 dager.

Hvis preparatet anvendes for å øke kjøttproduk-sjonen er den aktive bestanddel fortrinnsvis en mikrobiell kultur som er i stand til å justere forholdet mellom eddiksyre og propionsyre til 2,0 - 3,5 : 1, f.eks. 2:1.

For melkeproduksjon er det optimale forhold mellom eddiksyre og propionsyre ca. 3,0 : 1, for opprettholdelse eller drektighet ca. 4,0 : 1, og for kvigeavl ca. 2,0 - 3,0 : 1. Det er derfor tilrådelig å anvende preparater som er i

stand til å justere forholdet mellom eddiksyre og propionsyre til den optimale verdi for dette formål. I littera-turen fremgår det en viss usikkerhet med hensyn til det mest ønskelige forhold mellom eddiksyre og propionsyre,

idet det foretrukne forhold er en funksjon av drøvtyggeren, det anvendte forstoff og andre faktorer og dets valg er en oppgave for fagmannen (se f.eks. Kaufmann, W. and Rohr,

K., Der Einfluss des Futters auf die bakterielle Fermentation in Vormagen, Handbuch der TiernShrung, 263, 1969, Parey, Hamburg, Berlin.

De mikrobielle kulturer anvendt som aktiv bestanddel i det ovenfor angitte preparat, fremstilles ved en fremgangsmåte hvor

prøver taes fra vommen i dyr fåret med et gitt

f6rstoff eller en bestemt rasjon,, metabolismen av mikrober isolert fra prøven undersøkes in vitro og/eller in vivo, og mikrober med fordelaktige metabolske karakteristika dyrkes i media inneholdende det samme forstoff eller den samme rasjon som carbon- eller nitrogen-kilden,

en genetisk markør som muliggjør valg innføres

i de voksne mikrober, de genetisk merkede stammer dyrkes, kulturene innføres på nytt i vommen på dyrene foret med samme f6rstoff eller rasjon,

prøver taes fra vommen,

celleantallet av den genetisk merkede stamme telles,

stammer som holder seg i minst 60 dager og som justerer forholdet mellom eddiksyre og propionsyre til en optimal verdi, fortrinnsvis 1,5 - 4,0 : 1, separeres, og

om ønsket, formuleres disse stammer i en form som er akseptabel for anvendelse innen husdyrhold og ernæring.

I henhold til en foretrukket utførelsesform av fremgangsmåten taes prøver fra vommen

av en fistulert drøvtygger fåret på høy, cerealt mel eller melasse, og kulturene inneholdende vombakterier utspredes på et fast medium inneholdende N- og C-kilder, uorganiske salter, vomsaft og agar (Bryant and Burkey, J. Dairy Sei., 36, 205, 1953). Kulturene inkuberes under anaerobe betingelser hvoretter klonene isoleres og dyrkes i lignende medium som ovenfor angitt.

De utvokste kulturer inokuleres i væskemedia inneholdende nitrogenkilde, uorganiske salter, vomsaft,

og som carbonkilde, høy eller cellulose, eller i andre tilfeller cerealt mel eller melasse, og inkuberes inntil intensiv vekst begynner i mediene.

Celler dyrket på høy (cellulose), cerealt mel (stivelse) eller melasse (sucrose) som carbonkilder utspredes, dyrkes og isoleres på faste media inneholdende cellulose (for celler dyrket med høy), glucose (for celler cyrket med cerealt mel) eller sucrose (for celler dyrket med melasse) som carbonkilder.

De erholdte kulturer merkes genetisk. For merking kan en hvilken som helst arvelig genetisk markør anvendes

som muliggjør identifisering av den merkede mikrobe blant andre mikrober.

I henhold til en ytterligere foretrukket utførel-sesform av oppfinnelsen innføres antibiotikum-resistente gener i de valgte celler. Hvis bakterien som lever i vommen er følsomme for et bestemt antibioticum og resistente celler blandes med disse, kan vekst og død av de sistnevnte mikrober lett finne sted hvis prøvene utspredes på media inneholdende det samme antibioticum. I dette tilfelle vil bare resistente celler vokse.

Ved transformasjon (Bergmans et al., J.Bacteriol. 146, 564 (1981)) ble plOll-plasmid (Simon et al., Proc-8th North American Rhizobium Conference, Winnipeg, Canada, Univ. of Manitoba Press, 1983) som bærer kanamycin-og kloramfenicol-resistente gener innført i de valgte kulturer som vokser på cellulose, cerealt mel eller melasse. Plasmid-DNA ble isolert fra E. coli-celler (Birnboim and Doly, Nucl. Acid. Res. 7, 1513 (1979)). Stammen er deponert i National Collection of Agricultural and Industrial Microorganisms, Budapest, under betegnelsen NCAIM B (P) 000264.

Etter transformasjon med DNA-bærende antibiotikum-resistente gener, ble celler inneholdende og uttrykkende den nye genetiske informasjon utvalgt på faste media med den ovenfor angitte sammensetning, men supplert med kanamycin.

De resistente stammer ble lagret.

Med de isolerte og lagrede kulturer ble media inneholdende nitrogenkilde, uorganiske salter, saft og agar (for å oppnå en halvfast konsistens) inoculert og inkubert under anaerobe betingelser. De utviklede kulturer ble blandet med foret for sauer fastet én dag. Før og etter fåring av bakteriene til dyret ble vomprøver tatt daglig, prøvene ble spredt ut på det ovenfor beskrevne faste medium inneholdende kanamycin, og bakterieceller som var resistente og følsomme overfor antibiotikumet ble tellet. Vomproduksjon av flyktige fettsyrer bestemmes også kvalitativt og kvantitativt. Det er kjent at forutnyttelsen av drøvtyggere påvirkes av forholdet mellom flyktige fettsyrer (Eskeland et al., J. Anim. Sei. 33, 282 (1971); Church et al., Digestive Physiology and Nutrition of Ruminants, Vol. 2, s. 622 - 625, 1971). Som ovenfor angitt er det optimale forhold mellom eddiksyre og propionsyre betraktet å være 2,0 - 3,5 : 1, 3:1 og 4:1 for henholdsvis vekst, melkeproduksjon og opprettholdelse såvel som drektighet, (Kaufmann, W. and Rohr, K.: Der Einfluss des Futters auf die bakterielle Fermentation in Vormagen.

In: Handbuch der Tieremahrung, s. 263, Parey, Hamburg-Berlin, 1969) .

I henhold til en foretrukket utførelsesform av fremgangsmåten isoleres bakterier fra

vomprøver og kapasiteten av isolatene når det gjelder produksjon av flyktige fettsyrer undersøkes. Mikroorganismen dyrkes i anaerobe betingelser i de beskrevne fullstendige media inneholdende vomsaft, hvoretter eddiksyre-, propionsyre- og smørsyrekonsentrasjoner av kulturene bestemmes. Mikrobielle celler som produserer flyktige fettsyrer i de krevede forhold merkes genetisk og deres vomvekst under-søkes.

Stammer som er i stand til å vokse i vommen på dyr foret med det beskrevne ffirstoff i minst 60 dager og som kan fermentere carbohydrater til flyktige fettsyrer i optimale forhold utvelges, dyrkes, isoleres, opprettholdes og lagres, og om ønsket, deres kulturer i en form som er akseptabel for husdyrhold administreres oralt til drøv-tyggere for utvikling eller modulering av vomfloraen.

Tre stammer, Hh-GYOKI-l-123Sz, Hh-GYOKI-2-14Ab og Hh-GYOKI-3-81Me, som er i stand til å vokse i vommen på dyr foret med høy,1 cerealt mel eller melasse og som kan holde seg i vommen i lang tid og påvirke fordøyelsen fordelaktig, er deponert ved National Collection of Agricultural and Industrial Microorganisms under deponeringsbetegnelsene NCAIM B (P) under 00028 7, 00028 8 og 0002 89.

Mikroorganismen Hh-GYOKI-1-123 Sz som ble isolert fra vom, biosyntetiserer propionsyre. Bakterien er gram-positiv og stavformet. Den fermenterer glukose og stivelse til propionsyre og eddiksyre, samtidig som noe smørsyre og carbondioxyd dannes. Cellene som er stavformede i det tid-lige stadium på komplett dyrkningsmedium, vil senere for-andres til pleomorf form uten cilium, og ofte utvides i endene og få en irregulær form og størrelse. Den vokser lett under anaerobe og også under semianaerobe betingelser, og er fakultativ anaerob.

På det ovenfor nevnte grunnlag kan stammen Hh-GYOKI-1-123 Sz klassifiseres i slekten Propioniumbakter-ium i familien Propionibacteriaceae. (Mikroorganismen Hh-GYOKI-48a som skriver seg fra Hh-GYOKI-1-123 Sz kan like-ledes klassifiseres i slekten Propioniumbacterium).

Mikroorganismen Hh-GY0KI-2-14Ab isolert av opp-finnerene fra vom produserer propionsyre og eddiksyre, den er ubevegelig og har kuleform, den er gram-negativ og produserer ikke fargestoff. Den vokser lett også under anaerobe betingelser ved en temperatur på 37°C. Cellene med kuleform utfelles i store mengder ved siden av hverandre,

og gjennomsnittsstørrelsen er 0,3 - 0,4 ym. Den fermenterer syre og carbondioxyd fra carbohydrater og produserer hydrogensulfid på komplett dyrkningsmedium. Den flytende-gjør ikke gelatin og hemolyserer ikke. På grunnlag av de ovenfor nevnte trekk kan mikroorganismen Hh-GYOKI-2-14Ab klassifiseres i den lite kjente slekt Weillonella.

Mikroorganismen Hh-GYOKI-3-8lMe produserer eddiksyre og er fakultativ anaerob. Cellene beveger seg ikke, er stavformede og endene er flattrykte. De er gram-positive.

I tillegg til eddiksyre produserer de melkesyre fra glukose. På forskjellige dyrkningsmedier befinner stavene seg sjeldent enkeltvis, men er ofte i en kjede. Produksjon av pigmenter kan ikke observeres.

Basert på de ovenfor nevnte fakta kan mikroorganismen Hh-GYOKI-3-8lMe klassifiseres i familien Lactobacteria-ceae til slekten Bifidobacteria.

Artsbestemmelsene er blitt gjort i henhold til

den følgende litteratur: Bergey's Manual of Determinative

Bacteriology; Breed, Murray og Hitchens, The Williams and Wilkins Company, Baltimore, 1948, 8. utgave.

Det foretrekkes å dyrke mikroorganismene fra vommen ved mellom 32 og 37°C under anaerobe betingelser og under utnyttelse av oxygen, i media inneholdende carbon- og nitrogen-kilder, uorganiske salter, reduksjonsmidler og vomsaft, idet den sistnevnte tilveiebringer vekstfaktorer. Som carbonkilde kan glucose, cellulose, høy, cerealt mel eller melasse anvendes, mens uorganiske salter, gjærekstrakt, casein og lignende additiver er egnede N-kilder.

Et vesentlig "trekk er at unicellulære organismer som fordelaktig fermenterer det tilførte f6rstoff eller den tilførte rasjon, og som er i stand til å holde seg i vommen i lang tid, anvendes for modulering av vomfloraen.' For ut-velgelsen av slike stammer anvendes genetiske markører som ovenfor beskrevet, f.eks. gener som koder for antibiotisk resistens, enzymproteiner eller andre påvisbare proteiner. Auxotrope celler kan også anvendes.

Den genetiske markør innføres i cellen ved et vektor DNA-molekyl, f. eks. med et plasmid eller fag, men de valgbare karakteristika, f.eks. resistens overfor et antibioticum kan velges ved spontan utvelgelse.

De utvalgte stammer som har fordelaktige fermentative karakteristika og som holder seg i vommen i lang tid, anvendes enten for å øke utviklingen av vomflora i die-givende drøvtyggere eller for å modifisere fordelaktig sammensetningen av den etablerte vomflora. Det anbefales å administrere preparatet med foret eller med drikkevann.

Den valgte mikroorganisme for fremstilling av preparatet ifølge oppfinnelsen dyrkes i media inneholdende organiske carbonkilder, organiske eller uorganiske nitrogen-kilder og organiske og uorganiske salter, og isoleres deretter i en form egnet for oral administrering eller for transport. Om ønsket formuleres mikroorganismekulturen ved å blande denne med faste eller væskeformige bærere eller andre additiver. Preparatet kan blandes til foret

eller drikkevann, eller kan f6res alene.

Når det gjelder sauer, tilsettes for eksempel 1 til 20 gram, fortrinnsvis 5 gram, av et preparat ifølge oppfinnelsen til ca. 0,5 kg for. Som f6r kan for eksempel en blanding av maismel, blålucernhøy og biffkvegf6r anvendes, og de aktuelle proporsjoner bestemmes i lys av de aktuelle betingelser og den ønskede daglige vektøkning.

Kveg administreres generelt i 10 til 200 g, fortrinnsvis

50 g av et preparat ifølge oppfinnelsen pr. dag, f.eks. i blanding med ca. 5 kg konvensjonelt f6rstoff.

Etter dyrkning i væskemedia som ovenfor beskrevet, separeres mikroorganismene ved sentrifugering eller filtrering. Eastaer, frysetørrede preparater eller suspensjoner inneholdende sporer eller vegetative former kan fremstilles, og additiver som er akseptable for husdyrhold og ernæring kan tilsettes. Andre additiver, for eksempel proteiner, aminosyrer eller glycerol kan hjelpe til å holde mikroorganismene i live. Til preparatene ifølge oppfinnelsen anvendt for å forbedre forutnyttelsen i drøvtyggere kan andre substanser som konvensjonelt anvendes innen faget også tilsettes, f.eks. antibiotica som stimulerer veksten av vertdyret (monensin, nigericin, salynomycin etc) eller øker holdbarheten av de tilførte mikroorganismer.

Preparatene ifølge oppfinnelsen muliggjør således dannelse av en levende mikrobiell kultur i vommen eller den fordelaktige modifisering av en etablert flora.

Under dieperioden er vomfloraen i stand til effek-tivt å fermentere vanlig forstoff. Floraen utvikles spontant og tilfeldig, og det er på ingen måte sikkert at dets sammensetning er optimal for vertdyret.

Ved f6ring med de utvalgte mikrobielle stammer

vil det i stedet for den langsomme og spontane utvikling av vomfloraen kunne fås en hurtigutvikling, og vomfloraen vil være i stand til optimalt å utnytte f6ret.

Fordelen med foreliggende fremgangsmåte er at ved mikroorganismene fremstilt på den beskrevne måte (for eksempel med stammene 000287, 000288 og 000289) kan man akti-vere en hurtig tilpasning eller utvikling av vomfloraen under forforandring eller tilvenning, ved å øke vomveksten av mikroorganismer som er i stand til optimal nedbrytning av foret.

Fremgangsmåten kan blant annet anvendes i følgen-de tilfeller: - for melkekuer under forandringer i melkeperiode, ved slutten av drektighet og under sesongmessige og andre forandringer i1 fårrasjonen; - for biffkveg ved begynnelsen og slutten av beiteperioden,' ved forandringen av fetningen med grovfor til en intensiv fetning med ceralt mel, og under andre forandringer av vekst-fetningsdietten; - for sauer under sesongmessige forandringer av fåringen, ved begynnelsen og slutten av beiteperioden og under starten av en intensiv vekst og fetning.

Mulighetene er lignende i geitehushold. Mikrobielle kulturer fremstilt -ved den ovenfor beskrevne fremgangsmåte, kan også anvendes i flere spesielle tilfeller, f.eks. for ville drøvtyggere, i viltpleie og for dådyr.

Det skal bemerkes at selv om de mikrobielle kulturer anvendt i preparatene ifølge oppfinnelsen fortrinnsvis er av vom-opprinnelse, kan andre eddiksyre-og/eller propion-syreproduserende bakterier som ikke nødvendigvis stammer fra vommen, også anvendes. Slike bakterier innbefatter visse medlemmer av slekten Angerovibrio (lipolytica), Bacteroider, Selenomonas (ruminanticum) og Propionibacteria.

Oppfinnelsen illustreres ytterligere i de etter-følgende eksempler. "Fremstillingen av

mikrobielle stammer som er i stand til å utnytte i første rekke forrasjoner inneholdende hovedsakelig cellulose

(høy), stivelse (ceralt mel) eller sucrose (melasse) og som holder seg i vommen i lang tid, vil bli beskrevet i detalj. Anvendelse av preparatet er beskrevet for sauer, men opp-finnelsens ramme gjelder også preparater med mikroorganismer som er i stand til å vokse på annet fårstoff og gi utvikling eller modifisering av vomfloraen i andre drøv-

tyggere.

Eksempel 1

Modifisering av vomfloraen i dyr foret på høy

A) Isolering av mikroorganismer i stand til å vokse på høy

Sauer ble laparomisert og utstyrt med vomfistel og foret på høy i 1 måned. Vomprøver tatt gjennom fistelen, ble fortynnet og spredd ut på RGCA fast medium med følgende sammensetning:

Før sterilisering under C02~gass ble pH på RGCA-medium justert til 6,8. Sterilisering, preparering av mediet og dyrking ble utført som beskrevet av Bryant and Burkey (J. Dairy Sei., 36, 205 (1953)).

Vomsaften ble fortynnet med én steril blanding med følgende sammensetning:

Angivelsene av denne blanding er HB.

Kulturene ble inkubert i anaerobe betingelser

ved 35° C (se Atlas of Rumen Microbiology, Ogimoto and Imai, Japan Scientific Societies Press, Tokyo, 1981) i 120 timer, hvoretter individuelle, cloner ble inoculert og media inneholdende ekstrahert høy, med følgende sammensetning:

Før sterilisering ble pH i mediet justert til 6,5. Testrør inneholdende 5 ml" sterilt medium ble inoculert med den mikrobielle suspensjon erholdt fra individuelle cloner dyrket på RGCA fast medium og incubert under anaerobe betingelser ved 35° C. Veksten ble kontrollert ved mikroskopisk undersøkelse, og kulturene -ble spredd ut på RGCA fast medium hvori 2,0 % Bacto-cellulose ble anvendt

i stedet for glucosen og cellobiosen.

Kulturene ble incubert i anaerobe betingelser ved 35° C i 120 timer, hvoretter individuelle cloner av celler som utnytter cellulose ble inoculert på RGCA-media inneholdende cellulose.

På denne måte kan det erholdes vom-mikroorganismer som er i stand til å vokse på høy eller cellulose.

B. Genetisk merking av vom- bakterie som er i stand til å vokse på høy

Genetisk merking ble utført med E. coli plOll plasmid, i henhold til Simon et al. (Proe. 8th North American Rhizobium Conference, Winnipeg, Canada, Univ. of Manitoba Press, 1983).

Plasmid -DNA ble isolert fra en E. coli kultur

i henhold til Birnboim and Doly (Nucl. Acid Res. 7, 1513

(1979)) og ble oppløst i en vandig løsning inneholdende følgende komponenter:

Mikrober som er i stand til å vokse på høy og som var isolert i henhold til avsnitt A) i Eksempel 1, ble dyrket på RGCF-media og separert ved sentrifugering med CC>2. Cellene ble suspendert i en vandig løsning inneholdende i 1 liter følgende komponenter:

hvori suspensjonen skal inneholde 5 x 10 9 celler pr. ml. Suspensjonen ble fortynnet med det samme volum løsning inneholdende plasmid-DNA (0,1 yg/ml) og ble incubert i 60 minutter ved 4° C. Deretter ble incuberingen fortsatt ved 41° C i 2 minutter, hvoretter kulturen ble spredd ut på fast medium inneholdende 500 ug/ml kanamycin B, og cellulose som carbonkilde. Kulturen ble incubert ved 35° C i 120 timer under anaerobe betingelser og cloner som var i stand til å vokse i nærvær av 500 yg/ml kanamycin B ble undersøkt.

Plasmid plOll bærer gener som bestemmer resistensen overfor kanamycin og kloramfenicol, og inneholder enn videre replikasjonsopprinnelse som muliggjør starten av replikasjon i E. coli-celler. Hvis plasmidet transformeres i andre bakterier vil plasmid-DNA, på grunn av dets mangel på egnet oppfinnelse som muliggjiør replikasjon, enten eli-mineres eller inkorporeres i kromosomene (delvis eller

i

fullstendig) og genetisk rekombinasjon finner sted. Eventuelt uttrykkes genet inkorporert i kromosomet og utstyrer cellen med kanamycin-og kloramfenicolresistens.

I foreliggende forsøk ble det erholdt kanamycin B resistente cloner med transformasjonsfrekvens på 3 x 10<-5>

Flere resistente cloner ble isolert og følsom-heten overfor antibiotica av den opprinnelige stamme og den kanamycin B-resistente (Km )-stamme ble bestemt. Resultatene erholdt med flere stammer er vist i Tabell 1.

Man kan således oppnå mikroorganismer av vom-opprinnelse som er i stand til å utnytte høy eller cellulose og vokse i nærvær av store mengder kanamycin B.

Stammen Hh-GYOKI-1-123 (Km<R>) ble utspredt på RGCA-mediet inneholdende cellulose, hvoretter kanamycin B

i konsentrasjoner på 1000, 5000 og 10 000 yg/ml ble tilsatt. Kulturené ble incubert i anaerobe betingelser ved 35° C i

168 timer, og stammer som vokste i nærvær av 10 000 yg/ml antibioticum ble isolert. Med spontan utvelgelse ble det erholdt spontane mutanter som var meget resistente overfor kanamycin B. Én av disse stammer er blitt betegnet som Hh-GYOKI-l-123Sz og er deponert ved National Collection of Agricultural and Industrial Microorganisms, Budapest, under betegnelsen NCAIM B (P) 000287.

C) Reintroduksjon av merkede mikrober i vommen

Sterilt, fast medium angitt RGCFa ble inoculert med kulturen av stamme Hh-GYOKI-1-123 (Km<R>) lagret på RGCA skråagar ved +4° C. Sammensetningen av RGCFa-mediet var som følger:

De 7 løsninger ble fremstilt separat og blandet i den angitte rekkefølge.

Dyrkningen ble utført i 500 ml's Erlenmeyer-kolber inneholdende 150 ml medium, under anaerobe betingelser. Veksten ble sjekket etter 48 timer hvoretter kulturen ble blandet til fåringen av en høy-foret sau. 340 ml kultur inneholdende 4,7 x 10^ bakterier pr. ml ble administrert oralt til sauen. Før administrering og de etter-følgende dager ble 50 til 200 ml prøver tatt ut gjennom vomfistelen. Prøvene ble fortynnet med HB-løsning og ut-bredt på RGCA-medium som manglet kanamycin B eller andre antibiotica. Kulturene ble incubert under anaerobe betingelser ved. 35° C i 72 timer, og de bakterielle cloner ble tellet. Resultatene er vist i Tabell 2.

Det fremgår fra Tabell 2 at mikroorganismene administrert til dyret holder seg og vokser i vommen.

I henhold til den ovenfor beskrevne fremgangsmåte ble det også dyrket stammen Hh-GYOKI-l-123Sz resistent overfor 10 000 ug/ml kanamycin B, og den ble oralt administrert til samme sau på den 15nde dag.

q

140 ml kultur inneholdende 2 x 10 bakterier pr. ml ble administrert oralt.

Bakterier i vomprøver ble dyrket og tellet som tidligere angitt. Resultatene er vist i Tabell 3.

Dataene i Tabell 3 indikerer at den administrerte mikroorganisme er til stede i betydelige mengder i vommen, og fordi væskefasen av vominnholdet kontinuerlig tømmes, replikeres denne. Forskjeller i bakterietellinger mellom prøver kan forklares ved variasjoner i konsistensen av vominnholdet fra en tykk konsistens til en flytende konsistens.

Eksempel 2

Modifisering av vomflora i sauer foret på cerealt mel

A) Isolering av mikroorganismer i stand til å vokse på cerealt mel

Fremgangsmåten beskrevet i avsnitt A) i Eksempel 1 ble gjentatt med den forskjell at den opprinnelige prøve ble tatt fra vommen på en sau foret på cerealt mel, og de individuelle isolater ble inoculert i RGCF-væskemedium (se ovenfor) inneholdende 2 % cerealt mel pulverisert i en mor-ter, i stedet for ekstrahert høy, kulturene dyrket i RGCF-væskemedium ble utspredt på RGCA fast medium (se ovenfor)

og cloner utviklet fra cellene som var i stand til å utnytte cerealt mel, ble isolert på lignende medium.

På denne måte ble det erholdt mikroorganismer som er i stand til å vokse på cerealt mel som carbonkilde.

B) Genetisk merking av vombakterier som utnytter cerealt mel

Fremgangsmåten beskrevet under avsnitt B) i Eksempel 1 ble gjentatt med den forskjell at stammene erholdt i henhold til avsnitt A) i Eksempel 2 ble anvendt for transformasjon med plOll-plasmid-DNA i stedet for de som ble erholdt i henhold til avsnitt A) i Eksempel 1.

Resistens overfor kanamycin B for flere transfor-merte og Km -stammer er angitt i Tabell 4.

Ved å utføre den ovenfor angitte fremgangsmåte erholdes mikrober av vomopprinnelse som er i stand til å utnytte cerealt mel som carbonkilde og som er åtte ganger mer resistent overfor kanamycin B enn vomfloraen.

Stammen betegnet som Hh-GYOKI-2-14Ab er blitt deponert ved National Collection of Agricultural and Industrial Microorganisms, Budapest, under betegnelsen NCAIM B (P) 000288.

C). Reintroduksjon av mikroorganismer merket genetisk i vommen

Fremgangsmåten beskrevet under avsnitt C) i Eksempel 1 ble gjentatt med den forskjell at sterilt RGCFa-medium inneholdende 1,8 % stivelse i stedet for 1,8 % cellulose (Bacto) ble inoculert, blandet i forstoffet for sauer, og prøver ble tatt daglig gjennom fistelen før administrering og etter administrering. 310 ml's kultur inneholdende 7,1 x IO<5> bakterie/ml ble administrert oralt til sauen.

Dataene i Tabell 5 indikerer at den administrerte mikroorganisme holder seg og replikerer i vommen i lang tid.

Eksempel 3

Molifisering av vomfloraen i en sau foret på melasse

A) Isolering av mikroorganismer som er i starid til å vokse på melasse

Fremgangsmåten beskrevet i avsnitt A) i Eksempel 1 ble gjentatt med den forskjell at de opprinnelige prøver ble tatt fra en sau foret på melasse, de individuelle isolater ble inoculert på RGCF-medium inneholdende glucose i stedet for ekstrahert høy, kulturene dyrket i væskemedium ble utspredt på RGCA-medium og cloner oppdyrket fra celler som utnytter melasse, ble inoculert på samme RGCA-medium.

Det ble således erholdt mikroorganismer av vom-opprinnelse som utnytter melasse.

B) Genetisk merking av bakterier som utnytter melasse

Fremgangsmåten beskrevet i avsnitt B) i Eksempel

1 ble gjentatt med den forskjell at celler fremstilt i henhold til avsnitt A) i Eksempel 3 ble transformert ved plOll plasmid DNA i stedet for de erholdt i henhold til avsnitt A) i Eksempel 1.

Resistensen overfor kanamycin B for flere Km R-stammer er vist i Tabell 6.

På denne måte ble det erholdt isolater som er meget resistente overfor kanamycin B og som utnytter melasse.

Stammen betegnet som Hh-GYOKI-3-81Me er blitt deponert ved National Collection of Agricultural and Industrial Microorganisms, Budapest, under betegnelsen NCAIM B (P) 000289.

C) Reintroduksjon av genetisk merkede bakterier i vommen

Fremgangsmåten beskrevet i avsnitt C) i Eksempel 1 ble gjentatt med den forskjell at stammen Hh-GYOKI-3-81Me

ble inoculert på RGCFa-medium inneholdende 1,8 % glucose

i stedet for 1,8 % cellulose, og kulturen ble blandet med foret til en sau foret på melasse. 380 ml av en løsning inneholdende 1,6 x IO<7> bakterier pr. ml ble administrert oralt. En prøve ble tatt daglig før og etter administrering gjennom en vomfistel.

Dataene indikerer at den administrerte mikroorganisme holder seg i lang tid i vommen på en' sau foret på melasse.

Eksempel 4

Forandringer i forhold mellom flyktige fettsyrer på grunn av behandling med bakterielt preparat

To sauer ble foret på en fullstendig forrasjon i 14 dager, hvoretter vomprøven ble tatt gjennom en fistel

2 liter vomsaft ble filtrert gjennom flere lag av gas. Den partikkelformige rest ble suspendert i 1 liter fysiologisk buffer (se nedenfor), ble blandet og filtrert som tidligere. To filtrater ble blandet, fikk stå i 1 time, fast materiale som fløt opp til overflaten ble kastet, og væskefasen ble undersøkt.

Sammensetningen av den fysiologiske buffer var som følger:

pH på blandingen ble kontrollert, og ble om nød-vendig justert til pH 7,2 med en vandig HC1 eller NaOH-løsning (Cheng et al.: J. Dairy Sei. 38, 1225 (1955)).

Til den erholdte blanding ble tilsatt det samme volum av fysiologisk buffer, og i 1 liter av den fortynnede blanding ble 4 g av forrasjonen suspendert. 30 ml hver av suspensjonen ble helt over i Erlenmeyer-kolber med et volum på 100 ml. 200 doser ble sterilisert og 200 ble ikke sterilisert.

Sterile media og media inneholdende levende vombakterier ble inoculert med de bakteriestammer som skulle undersøkes med hensyn til produksjon av eddiksyre, propionsyre og smørsyre.

Bakteriestammer som viste seg å være i stand til å holde seg i vommen i lang tid etter en in vitro dyrkning ble undersøkt. I tillegg til bakteriestammer isolert fra vomsaften og en sau foret på fullstendig rasjon eller en hvilken som helst forrasjon i henhold til avsnitt A, B og C i Eksempel 1 ble også undersøkt.

Bakteriene som skulle undersøkes ble dyrket på RGC+CG-medium (se nedenfor) i anaerobe betingelser ved 37° C i 48 timer.

Sammenstning av RGC+CG-medium:

Kulturer ble inoculert i media fremstilt i E.rlenmeyer-kolber. 2 ml hver av kultur ble inoculert i 50 ml medium, i to parallelle kolber. Ikke-sterile kulturer ble også inoculert.

Kolbene ble incubert under anaerobe betingelser

i 40 timer. Veksten ble stoppet med 10 % maursyreløsning, og innholdet av flyktig fettsyre i kulturene ble undersøkt.

Kulturene ble filtrert gjennom gaslag og ble sentrifugert ved 4000 omr. pr. min. i 15 minutter, og ble deretter igjen filtrert og overført til separ.asjonskolonnen av en Carlo Erba GI-452 gas-væskekromatograf utstyrt med en flammeioniseringsdetektor, for bestemmelse av C2-C,- fettsyrer .

Temperaturen på kolonnen: 150° C.

Separasjonskolonne: 2 meter lang, indre diameter 4 mm glass, rør fylt med 10 % ethylenglycol-adipat og 2 % o-fosforsyre på en silanert silicagelbærer (0,2 til 0,3 mm partikkel-diameter).

Temperatur på injektoren: 19 0° C.

N2 strømningshastighet: 50 ml/min.

H2 strømningshastighet: 50 ml/min.

Strømningshastighet av luft: 200 ml/min.

Papirhastighet: 160 cm/time.

Varighet av kromatografi: 2 0 min.

Prøvevolum: 1 yl.

Trippelmålinger ble foretatt for hver prøve. Standardløsningen inneholdt eddiksyre, propionsyre, iso-smørsyre, smørsyre, isovalerinsyre og valerinsyre.

Flere enn 90 stammer av bakterier ble isolert

fra en sau foret på en fullstendig forrasjon. Stammene ble deretter merket genetisk og undersøkt (de positive stammer ble undersøkt flere ganger). Representative resultater er angitt i Tabell 8.

Forklaring av symbolene anvendt i Tabell 8:

S: inoculert etter sterilisering

NS: kultur inneholdende levende vomflora ble inoculert

a) spormengder

b) negativ kontroll: flyktig fettsyreinnhold i media fremstilt fra vomsaft, fysiologisk buffer og forstoff

anvendt for forsøket (gjennomsnitt av 12 målinger)

c) positiv kontroll: flyktig fettsyreinnhold av incubert kultur inneholdende opprinnelige vombakterier og ellers

fremstilt ved den samme prosess (gjennomsnitt av 12

målinger)

d) som c)> men 5 ppm monensin-Na ble tilsatt til mediet (gjennomsnitt av 6 bestemmelser) e) som c) men 10 ppm monensin-Na ble tilsatt til mediet (gjennomsnitt av 7 bestemmelser).

Dataene i Tabell 8 indikerer at forholdet mellom flyktige fettsyrer dannet ved den fermentative funksjon av vomfloraen kan moduleres innen et vidt område ved administrering av preparater ifølge oppfin-

nelsen. Eksempelvis kan produksjon av propionsyre signifikant stimuleres med en kultur fremstilt fra stamme Hh-GYOKI-48a, mens stamme Hh-GYOKI-109b stimulerer produksjon av eddiksyre. Stimulering av produksjon av individuelle fettstyrer ble observert både på media som manglet (S) eller som inneholdt (NS) levende vommikrober. I foreliggende forsøksystem nedsatte monensin-Na forholdet mellom eddiksyre og propionsyre med 0,1 eller 0,2 (d, e).

Mikroorganismer valgt ved den ovenfor angitte fremgangsmåte merkes genetisk, administreres til drøvtyggere og undersøkes med hensyn til vomvekst og oppholdstid ved å gjenta fremgangsmåten beskrevet i avsnitt B) i Eksempel 1. Stammer med et fordelaktig fermentativt mønster og som holder seg lenge i vommen administreres oralt for å modifisere produksjonen av flyktige fettsyrer.

Eksempel 5

Bakterielt preparat for oral administrering til drøvtyggere

Bakterier som skal administreres ble dyrket på RGCA+CG-media (Eksempel 4) under anaerobe betingelser ved den beskrevne prosess. Etter dyrkning ble cellene separert ved filtrering eller sentrifugering. Separerte celler ble suspendert i fysiologisk buffer (Eksempel 4) og frysetørket. Det lyofiliserte bakterielle preparat lagres, formuleres og administreres oralt til drøvtyggere.

Mikroorganismer kan også dyrkes på andre konvensjonelt anvendte media, f.eks. i media inneholdende glucose og stivelse som carbonkilde og uorganiske salter som N-kilde.

Preparatet kan lett administreres ved å blandes til forstoffet eller drikkevannet, alene eller sammen med andre biologisk aktive midler, f.eks. med antibiotica og vitaminer.

I tillegg til det frysetørkede preparat kan også andre produkter fremstilles. Mikroorganismene kan også administreres etter blanding av den filtrerte eller sentri-fugerte bakteriemasse med egnede bærer- eller fortynnings-substanser, for eksempel calsiumcarbonat, konsentrater, forblandinger eller andre fårstoffer.

Bakteriestammene velges fra de mikroorganismer, fremstilt ved den ovenfor beskrevne fremgangsmåte, og som fordelaktig modifiserer vomfloraen, og mengden av disse som skal administreres bestemmes avhengig av forrasjonen og anvendelse av dyret. Hvis en nedsettelse av forholdet mellom eddiksyre og propionsyre kreves, kan det eksempelvis anvendes en kultur fremstilt fra stammen Hh-GYOKI-48a, mens for å øke forholdet anbefales administrering av stammen Hh-GYOKI-3-81Me.

Bestemmelse av det krevede mikrobielle celleantall vil ikke by på noen problemer for fagmannen. Det anbefales å administrere cellene i en mengde for å gi 5 x 10 2 til 5 x IO<7> dyrkede mikroorganismer pr. ml vomsaft.

Eksempel 6

Administrering av stammene Hh- GYOKI- 48a og Hh- l- 123Sz til sauer

Hh-GYOKI-48a-stammen ble dyrket på RGCA+CG media (Eksempel 4) i to 5-liters fermentorer ved 37°C under anaerobe betingelser. Fermenteringen ble startet ved in-oculering med en 10 ml's kultur av lignende sammensetning. Etter 48 timers dyrkning ble cellene separert ved sentrifugering (5000 omr. pr. min) og våtsedimentet som veide 58 g ble forsiktig blandet med 4 kg maismel. Blandingen ble oppdelt i åtte like deler og ble administrert oralt til åtte sauer som på forhånd hadde fastet i 24 timer. Stammen Hh-GYOKI-l-123Sz kan anvendes på lignende måte med en bak-teriell høst på 53 g.

I et vekst-fetningsforsøk ble 23 sauer foret ad lib på dårlig høy og dyrene ble veiet hver uke i 5 uker. Forsøksgrupper bestående av åtte sauer ble foret med én av bakteriepreparatene hver i en enkel foring, og syv sauer tjente som kontroll. 600 til.900 g høy ble forbrukt pr. dag og dyr, pluss en mineral- og vitaminforblanding blandet med maismel (100 g). Resultatene er vist i Tabell 9.

Den midlere daglige vektøkning ble beregnet fra dataene angitt i Tabell 9 og er vist i Tabell 10.

Sauer behandlet med stamme Hh-GYOKI-l-123Sz og stamme Hh-GYOKI-4 8a og kontrollgruppen øket vekten ved foring av den dårlige forrasjon gjennomsnittlig 2620, 3875 og 360 g under den 35 dagers lange.forsøksperiode.

Begynnelseskroppsvekten avvek ikke signifikant mellom gruppene, men signifikante forskjeller ble funnet i de sluttelige kroppsvekter (Tabell 11) og i den daglige økning (Tabell 12).

Dataene indikerer at preparater ifølge

oppfinnelsen markert stimulerer vektøkning i sauer.

Eksempel 9

Holdbarhet av genetisk merkede bakterier i kvegvom

Fremgangsmåten beskrevet i avsnitt C) i Eksempel 1 ble gjentatt med den forskjell at stammen Hh-GYOKI-l-123Sz som var resistent overfor 10 000 yg/ml kanamycin, ble dyrket i 4 liter RGCFa-medium. Etter at den stasjonære fase ble oppnådd (38 timer) ble kulturen høstet ved sentrifugering (5000 omdr. pr. min) og cellene ble grundig blandet med 500 g maismel og foret til en ku. Ukentlige prøver ble tatt gjennom en fistel, og vom-holdbarheten av den administrerte stamme ble bestemt som beskrevet i avsnitt c) i Eksempel 1.

Resultatene indikerer at stamme Hh-GYOKI-l-123Sz vokser i kvegvommen og kan holde seg der i minst 40 dager.

Claims (3)

1. Preparat for oral administrering til drøvtyggere for å forbedre effektiviteten av ffirutnyttelse for disse, karakterisert ved at det inneholder en mikrobiell kultur valgt fra gruppen bestående av mikroorganismer deponert ved,National Collection of Agricultural and Industrial Microorganisms under deponeringsbetegnelsene NCAIM B (P) 000287, 000288 og 000289, som er i stand til å justere vektforholdet mellom eddiksyre og propionsyre, dannet under fermentering av energiproduserende næringsstoffer i vommen hos et dyr, til en optimal verdi på 1,5 til 4,0:1, og som er i stand til å vokse i vommen og holde seg der i minst 40 dager.

2. Preparat ifølge krav 1, karakterisert ved at det omfatter maksimalt 95 vekt% aktiv bestanddel.

3. Preparat ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at omfatter.en mikrobiell kultur som er i stand til å justere forholdet mellom eddiksyre og propionsyre i vommen til 2,0 - 3,5: 1.