CS593085A3 - Mixture of microbial cultures for improving efficiency of a fodder utilization for ruminants and process for preparing microbial cultures - Google Patents

Description

V

IV - 1 - ; Vynález se týká směsi mikrobiálních kultur pro zlepšeníúčinnosti využívání krmivá u přežvýkavců s obsahem nosičů,zředovadel, konzervačních činidel používaných v’živočišnávýrobě a nutričních látek běžně podávaných přežvýkavcům.

Vynález se dále týká způsobu přípravy mikrobiálníchkultur kmenů mikroorganismů používaných jako účinné složkyVe výše uvedené směsi* Přežvýkavci se složeným žaludkem, jako ovce /Ovis ariesaries/, skot /Bos primigenium taurus/, koza /Capra hircus/a jejich divocí příbuzní /jelen a muflon atd./, mají důle-žitou úlohu jako článek potravního řetězu a v ekonomice.Jejich speciální význam spočívá v tom, že žijí z potravy,která nemůže být využita ostatními býlo&žravci. Předžaludkyposkytují anaerobní.prostředí pro floru bachoru, která jeschopna trávit celulózu a využívat dusíku nebílkovinnéhopůvodu vedle běžných živin. Složení flory bachoru závisíširoce na poměru potravy a adaptaci na dietu. Taková adap-tace však trvá několik dní a konečná.stabilizace může v vyžadovat několik týdnů. Náhlá změna poměru ovlivňuje nao-pak nepříznivě příjem, stravitelnost a produkci a může vy-volat onemocnění nebo dokonce smrt.

Je dobře známo, že v 1 ml tekutiny z bachoru žijea roste miliony bakterií. Anaerobní fermantace pomocíbakterií je velice důležitá pro normální trávení a příjempotravy. Živiny produkující energii jsou fermentovány nakyselinu octovou, propionovou a máselnou, kterých zvířecí «i hostitel používá jako mastných kyselin; bakteriální hmota procházející střevy je trávena a používána jako v íi zdroj bílkovin* Se zřetelem na produkci mléka a masa č má přísun kyseliny octové a propionové a jejich vzá- f í.;. jemný podíl podstatný význam. Flora bachoru hraje ? tudíž důležitou úlohu při udržování a pžndukci pře- žvýkavců. í?

Po narození se flora bachoru spontánně rozvíjí i; a podržuje si svoje složení po odstavení na pevnou ? potravu.. Není však jisté, že tato náhodná flora před- stavuje optimální fermentační systém. Bylo by výhodné regulovat složení a/nebo množství flory bachoru podle £

ekonomických hledisek. L

Vzrůst produkce těkavých mastných kyselin v ba-choru a tudíž zlepšení využití potravy a spolu lze použít úspěšně k separaci mikroorganismů· Frak»ticky kterýkoliv bakteriální kmen lze značkovat ge-netickými značkovači, například pomocí faktoru anti- V ' · biotické resisten.ee, který umožňuje identifikaci bak- .terie mezi jinými bakteriemi·

Autoři tohoto vynálezu izolovali bakteriez bachoru, geneticky označili kmeny a po kultivaci jeznovu vpravili do bachoru. Potom odebírali periodickyvzorky obsahu bachoru, pěstovali je v selektivním mediua zjistili, že některé z kmenů, které měly výhodnéfermentační vlastnosti pro zvíře a které byly schopnérůst in vitro, by mohly růst v bachoru a udržet se zdepo dlouhou dobu, bylo-li krmeno stejnou potravou jakoběhem izolace, stimulovaly by zažívání a tudíž využitípotravy zvířetem. Předmětem vynálezu je směs mikrobiálních kulturpro zlepšení účinnosti využívání krmivá u přešvýkavcůs obsahem nosičů, zředovadel, konzervačních činidel použí-vaných v živočišné výrobě a nutričních látek běžně podá-vaných přežvýkavcům, která obsahuje jako účinnou složkuv množství do 99 hmot. alespoň jednu mikrobiální kul- v turu z kmenů mikroorganizmů, uložených v Madarské státnísbírce lékařsk-eých bakterií Státního ústavu hygieny podčísly 00 287, 00288 a 00289, schopných upravovat hmot-nostní poměr kyseliny octové ke kyselině propionové nahodnotu 1,5 až 4,0:1, a schopných růst v bachoru a zdr-

žovat se tam alespoň po dobu 60 dní, zbytek do 100 jShmot. tvoří známé krmné komponenty, například seno, pícea melasa.

Jestliže má být smésí použito ke zvýšení produkcemasa, je účinnou složkou s výhodou mikrobiální kulturaschopná upravovat poměr kyseliny octové ke kyselině pro-pionové na 2,0 až 3,5 ku 1, například .2 ku 1. Pro tvorbumléka je optimální poměr kyseliny octové ke kyselině pro-pionové asi 3,0 ku 1, pro udržovací chov nebo pro bře-zivost asi 4,0 ku 1 a pro chov jalovic asi 2,0 až 3,0 ku 1.Doporučuje se tudíž používat směsi schopné upravovat poměrkyseliny octové ke kyselině propionové na optimální hodno-tu pro tyto účely. V literatuře existuje určitá nejistotatýkající se požadovaných poměrů kyseliny octové ke kyseliněpropionové, přičemž výhodný poměr je funíceí přežvýkavce,použité potravy a dalších faktorů a jeho výběr je úkolemodborníků /viz například V.Kaufmann, K.Rohr, Vliv krmivána bakteriální fermentaci v předžaludcích, Handbuch derTiernahrung, 263, 1969» Parsey, Hamburk, Berlín/.

Směs má výhodně formu pasty mikroorganizmů, lyofilizátunebo suspenze. Předmětem vynálezu je dále způsob přípravy mikro-biálních kultur používaných jako účinné složky ve výšeuvedených směsích, který spočívá v tom, že se odebírajíz bachoru zvířat krmených potravou nebo krmivém obsahujícím celulózu, škrob nebo mono- a disacharidy vzorky, vyše-třuje se metabolismus mikroorganizmů izolovaných ze vzor-ku in vitro a invivo a mikroorganizmy upravující poměrkyseliny octové ke/kyselině propionové na hodnotu 1,5až 4,0 : 1 se kultivují v prostředí obsahujícím stejnoupotravu nebo krmivo jako zdroj uhlíku nebo dusíku, dorostoucích mikroorganizmů se zavádí antibiotická resistence v jako genetický značkovač, kterýÝ; umožňuje selekci, gene-ticky značené kmeny se kultivují, kultury se znovu zavá-dějí do bachoru zvířat krmených stejnou potravou nebokrmivém, z bachoru se odebírají vzorky, speočítá se poěetbuněk geneticky značeného kmene, oddělí se kmeny přetrá-vající alespoň 60 dní a tyto kmeny se upravují do formypřijatelné v praxi živočišné výroby a výživy.

Tyto kmeny se spřípadně upravují do formy přijatelnépro praxi živočišné výroby a výživy.

Podle výhodného provedení způsobu podle vynálezuse sondou odebírají vzorky z bachoru přežvýkavce krme-ného senem, obilnou moukou nebo melasou, a kultury ob-sahující bakterie bachoru sekrozptýlí na pevná médiaobsahující zdroje dusíku a uhlíku, anorganické soli,tekutinu z bachoru a agar /Bryant a Burkey, D. Dairy

ι:·ΐ 1

Sci., 36, 205, 1953/· Kultury se inkubují za anaerob-ních podmínek, potom se izolují klony a kultivují sev podobném médiu jako uvedeno vpředu.

Narostlé kultury se naočkují do tekutéhoprostředí obsahujícího zdroj dusíku, anorganické so-li, tekutinu z bachoru a jako zdroj uhlíku seno nebocelulózu, nebo v jiných případech obilnou mouku nebomelasu, a inkubují se tak dlouho, až začne intenziv-ní růst v médiu.

Buňky pěstované na seně /celulóze/, moucez obilovin /škrobu/ nebo melase /cukru/ jako zdrojiuhlíku se nanesou, kultivují a izolují na pevné me-dium obsahující celulózu /pro buňky pěstované na se-ně/, glukózu /pro buňky pěstované na seně/, glukózu/pro buňky pěstované na mouce z obilovin/ nebo sacha-rózu /pro buňky pěstované na melase/ jako zdroj uhlí-ku. Získané kultury se geneticky značkují. Proznačení lze použít kteréhokoliv dědičného genetické-ho značkovače, který umožní identifikaci značenéhomikroba mezi ostatními mikroby.

Podle dalšího výhodného provedení vynálezuse vnášejí do vybraných buněk geny rezistence na anti-biotika. Jestliže bakterie žijící v bachoru jsou citli- vé na určitá antibiotika a.přidájí-li se X nim resis»tentní buňky, lze růst i zánik posledně zmíněných mi-krobů snadno sledovat, jestliže se vzorky nanesou hamedia obsahující totéž antibiotikum. V tomto případěporostoui jenom rezistentní buňky. Při transformaci /Bergmans a spol., J. Bacte-riol. 146, 564, 1981/ zavádějí autoři tohoto vynálezuplOll plasmid /Simon a spol., Proč. 8th North AmericanEhizobium Conference, Winnipeg, Kanada, Univ. of Mani-toba Press, 1983/ nesoucí geny rezistence na kanamycina chloramfenikol do selektovaných kultur, které rostouna celulóze, mouce z obilovin nebo na melase. PlasmidDNA byl izolován z buněk E. coli /Birnboim a Doly, Nucl.Acid. Pes. 7, 1513» 1979/. Kmen je uložen v Maňarskéstátní sbírce lékařských bakterií státního ústavu hy-gieny, Budapešť, pod číslem 00264·

Po transformaci pomocí DNA nesoucí geny resis-tence na antibiotika se selektují buňky obsahující avyjadřující novou genetickou informaci na pevném médiuvýše uvedeného složeni, avšak doplněné o kanamycin.

Tyto rezistentní kmeny budou uloženy. Těmito izolovanými a uloženými kulturami se oč-kují media obsahující zdroj dusíku, anorganické soli,tekutinu bachoru /k docílení polopevné konsistence/ a

*·'..,ι.tMrAVjf/^jk^UvtAí. 'IZ^řSSÍjZv.V.U^JkU.hřA.V-.tífx'j'Jit. <ΰιι6'\' iS^ifáAMtów^rtiíítójltflzÍAý^ÍMA^^/i.^^ínJ^iSÍ^U.švZťíTj/.^iZftyiVPÍI/?^ - 10 - inkubují se za anaerobních podmínek. Vyvinuté kultu-šesmísí s potravou ovcí hladovějících po dobu jed-noho dne. Před a po krmení zvířat bakteriemi, jsouodebírány denně vzorky z bachoru; vzorky se vnáše-jí na výše popsaná pevná média obsahující kanamycina počítají se bakteriální buňky rezistentní a citli-vé na antibiotikum. Kvalitativně i kvantitativně serovněž stanoví produkce těkavých mastných kyselinv bachoru. Je známo, že Využívání potravy přežvýkav-ci je ovlivňováno poměrem mastných kyselin /Eskelanda spol., J. Anim. Sci., 33, 282, 1971; Church a spol.,Digestive; Physiology and Nutrition of ruminants, sva-zek 2, str. 622-625, 1971/. Jak bylo uvedeno výše, jeza optimální poměr kyseliny octové ke kyselině propio-nové považován poměr 2,0 až 3,5 ku 1, 3 ku 3La 4 ku 1pro růst„ produkci mléka a pro udržování, jakož i probřeživost /W. Kaufinann a K. Éohr.; Vliv potravy na bakte-riální fermentaci v předžaludcích, Hanbuch der Tier- ·· ... nahrung, str· 263, Prey, Hamburg - Berlín, 1969/.

Podle výhodného provedení způsobu podle vyná-lezu, se bakterie izolují ze vzorků z bachoru a hod-botí se schopnost izolátů produkovat těkavé mastnékyseliny. Mikroorganismus se pěstuje za anaerobníchpodmínek v popsaném úplném médiu, obsahujícím tekuti- - 11 - nu z bachoru, potom se stanoví v kulturách koncentra-ce kyseliny octové, propionové a máselné. Mikrobiál-ní buňky produkující těkavé mastné kyseliny v poža-dovaných poměrech se geneticky označí a sleduje se je-jich růst v bachoru.

Kmeny, které jsou schopné růst v bachoruzvířete krmeného popsanou potravou nejméně po dobu60 dní a které mohou fermentovat dietní uhlohydrátyv optimálním poměru na těkavé mastné kyseliny, se se-lektují, pěstují, izolují, udržují a ukládají, a je-lito žádoucí, jejich kultury ve formě přijatelné pro ži-vočišnou; výrobu se perorálně podávají přežvýkavcůmza účelem vývoje nebo regulace flory bachoru. Tři kmeny, a to Hh-GY0KI-l-123Sz, Hh-GYOKI-2-14Ab a Hh-GY0KI-3-81-Me, schopné růstu v bachoru pře-žvýkavců krmených seneírn, moukou z obilovin, nebo mela-sou, které by mohly setrvávat po dlouhou dobu; v bacho-ru a ovlivňovat příznivě trávení, byly uloženy v Ma-ďarské státní sbírce, lékařských bakterií Státního ústa-vu hygieny pod čísly 00287, 00288 a 00289·

Podle vynálezu je výhodné kultivovat mikro-organismy, izolované z bachoru při teplotě 32 °C až37 °C za anaerobních podmínek* za vyloučení kyslíku,v médiu obsahujícím zdroje uhlíku a dusíku, anorganické

l.$ - 12 - soli, redukční činidla a tekutinu z bachoru; poslé-ze jmenovaná tekutina je zdrojem růstových faktorů.

Jako zdroj uhlíku lze používat glukózu,celulózu, se-no, mouku z obilovin nebo melasu, zatímco anorganic-ké soli, kvasničný extrakt, kasein a podobné přísa-dy jsou vhodné jako zdroje dusíku.

Esenciálním znakem vynálezu je, že se použí-vá jednobuněčných organismů s výhodou: fermentujícíchzkrmenou potravu a dávku a schopných přetrvávat podlouhou dobu v bachoru, k modulaci flory v bachoru.

Pro selekci takových kmenů se používá genetickýchznačkovačů, jak bylo popsáno výše, například genů kó-dujících rezistenci na antibiotika, enzymové protei-ny nebo jiné zjistitelné proteiny. Lze používat rov-něž auxotrofních buněk.

Genetický značkovač se zavádí do buňky pomocívektorové molekuly DNA, například pomocí plasmidu ne-bo fágu, ale selektovatelné charakteristiky, napří-klad resitenci vůči antibiotikům lze volit i pomocísponténí selekce.

Selektované kmeny, které mají výhodné fer-mentační charakteristiky a přetrvávají po dlouhoudobu v bachoru, se používají buá ke zvýšení rozvojeflory v bachoru u sajících mlááat přežvýkavců nebo - 13 - k výhodnému modifikování skladby flory bachoru. Dopo-ručuje se podávat přípravek s potřevou nebo s pitnouvodou.

Mikroorganismy vybrané pro výrobu preparátupodle vynálezu se kultivují v mediu obsahujícím or-ganické zdroje uhlíku, organické nebo anorganickézdroje dusíku a anorganické soli, a potom se izolujíve formě vhodné pro perorální podávání nebo pro trans-port. Je-li to žádoucí,, kultura mikroorganismů se u-pravuje smícháním s pevnými nebo tekutými nosiči ne-bo jinými přísadami. Preparát lze míchat s krmivémnebo pitnou vodou nebo jej lze zkrmovat samotný. V případě ovcí se přidává například 1 až 20 g,s výhodou 5 g, kultury mikroorganismu podle vynálezuk asi 0,5 kg potravy. Jako krmivá lze například použítsměsi mouky z kukuřice, sena z vojtěšky a krmivá prohovězí dobytek; aktuální poměr se stanovuje se zřete-lem na aktuální podmínky a požadovaný denní přírůstekhmotnosti. Hovězímu dobytku se podává obvykle 10 až200 g, s výhodou?. 50 g kultury mikroorganismu podle vy-nálezui denně, např. ve směsi s asi 5 kg obvyklé potra-vy.

Způsob zlepšování účinnosti využívání potra- - 14 - vy u přežvýkavců patří rovněž do rozsahu tohoto vyná-lezu.

Po kultivaci v tekutém prostředí, jak bylouvedeno vpředu, se mikroorganismy separují odstředě-ním nebo filtrací. Lze vyrábět pasty, lyofilizovanépreparáty nebo suspenze obsahující spory$ mohou býtpřidávány přísady přijatelné pro živočišnou výrobu avýživu. Další přísady například proteiny, aminokyse-liny a glycerol mohou napomáhat k udržování života-schopnosti mikroorganismů. Ke směsím podle vynálezupoužívaným ke zlepšení využívání potravy u přežvý-kavců lze přidávat rovněž další látky používané ob-vykle v praxi, například antibiotika, která stimu-lují růst hostitelského zvířete /monensin, nigericin,salynomycin atd./ nebo zvýšit setrvání zkrmovanýchmikroorganismů.

Mikrobiální kultury podle vynálezu umožňujítvorbu živé mikrobiální kultury u přežvýkavců nebovýhodnou modifikaci ustavené flory. Během období sání mláSat je flora bachoruneschopná účinně fermentovat obvyklou potravu. Florase rozvíjí spontánně a nahodile a její skladba nenínikterek pro hostitelské zvíře optimální.

Zkrmováním selektovaných mikrobiálních kmenů - 15 - místo pomalého a spontánního rozvoje flory bachoru lze docílit rychlého rozvoje, a flora bachoru budeschopna optimálního využití potravy. Výhoda přítomného způsobu spočívá v tom„ žes mikroorganismy připravenými popsaným způsobem /na-příklad kmeny 00287, 00288 a 00289/ lze docílit rychléadaptace; nebo rozvoje flory bachoru během změny potra-vy nebo odstavení zvýěením růstu mikroorganismů v ba-choru schopných optimální degradace potravy.

Způsobu lze kromě jiného použít, v následu-jících případech: - u dojnice během, změny laktace, na koncibřeživosti a během sezónních a jiných změn dávek, - u hovězího dobytka na začátku a konci ob-dobí pastvy, při změně výkrmu přechodem na intenziv-ní výkrm moukou z obilovin a během jiných změn růsto-vě-výkrmové diety, - u ovcí během sezónních změn krmeni, na po-čátku a na konci období pastvy a během začátku inten-zivního růstu a výkrmu.

Podobné možnosti jsou i u choyu koz· Mikro-biálních kultur připravovaných: způsobem podle vyná-lezu lze použiti u několika speciálních případů, na- 1 ť

L 1.< - 16 - příklad u divoce žijících, přežvýkavců, v oboráchlovné zvěře a u polní zvěře.

Je třeba poznamenat, že ačkoliv mikrobiálníkultury použité ve směsích podle vynálezu pocházejís výhodou z bachoru, jsou vhodné i jiné bakterie pro-dukující kyselinu octovou a/nebo kyselinu propiono-vou, které nemusejí pocházet nezbytně z bachoru. Ta-kovými bakteriemi jsou některé členy rodu Angero-vibrio /lipolytica/, Bacteroides, Selenomonas /ru-minanticum/ a Propionibacteria.

Vynález bude dále vysvětlen: pomocí násle-dujících, avšak neomezujících příkladů. Podrobněbude popsána příprava mikrobiálních kmenů, kteréjsou schopny využívat základní dávky obsahující hlav-ně celulózu /seno/, škrob /mouka z obilnin/ a sacha-rózu /melasu/ a přetrvávají po dlouhou dobu v bacho-ru. Použití přípravku je popsáno pro ovce, rozsahochrany vynálezu se však týká i organismů, jež jsouschopné růst na jiných krmiyech a týká se i rozvojenebo modifikace flory bachoru: u jiných druhů přežvý-kavců . * - 17 - Přiklad 1

Modifikace flory v bachoru zvířat krmených senem a/ Izolace mikroorganismů schopných růst na seně

Ovce byly laparatomizovány a opatřeny bacho-rovou sondou /pištěli/ a krmeny senem po dobu 1 mě-síce . Sondou se odebírá vzorek z bachoru, ředí a na-náší se na RGCA pevné médium následujícího složení:

Roztok solí I:

destilovaná voda

Roztok solí II: 0,6 g ad 100,0 g.

NaCl 1,2 g 1,2 g KÍ^PO* 0,6 δ CaCl2 0,12 δ MgSO4.7H2O 0,25 δ destilovaná voda ad 100,0 ml /resazurin /0,1% roztok/ 0,1 ml agar /Bacto/ * 2,5 δ tekutina z bachoru 10,0 ml glukóza 0,05 δ cellobióza 0,05 δ monohydrát hydrochloriducysteinu 0,05 δ - 18 uhličitan sodný /8% roztok/ 5,0 g destilovaná voda ad 50,0 ml.

Poznámka:

x/ Difco Labs. Detroid, USA xx/ Vzorek obsahu bachoru se filtruje přes několik vrstev gázy, potom se filtrát uchovává pod kyslič-níkem uhličitým při teplotě -20 °C. Před sterilizací pod plynným kysličníkem uhli-čitým se hodnota pH média RCGA nastaví na 6,8. Steri-lizace, příprava média a kultivace se provádějí podleBryanta a Burkeye /J. Dairy Sci., 36, 205, 1953/·

Tekutina z bachoru se ředí sterilní směsí ná-sledujícího složení: roztok solí I /viz vpředu/ 7,5 ml roztok solí II /viz vpředu/ 7,5 ml monohydrát hydrochloridu cysteinu 0,05 g Na2C03 0,3 g resazurin /0,1% roztok/ 0,1 ml destilovaná voda ad 100,0 ml

Tato směs se označuje jako HB.

Kultury se inkubují za anaerobních podmínekpři teplotě 35 °C /viz Atlas of Rumen Microbiology,

Ogimoto a Tmai, Japan Scientific Soeieties Press, To-ky o, 1981/ po dobu 120 hddin, potom se individuálníklony očkují do média obsahujícího extrakt ze sena následujícího složení: roztok solí I /viz vpředu/ 15,0 % roztok solí II /viz vpředu/ 15,0 % resazurin /0,1% roztok/ 0,1 %

Tripton L42 /Oxoid/* 15,0 % kvasničný extrakt /Oxoid/ * 0,5 % kapalina z bachoru*3* 10,0 %

Na2C03 0,4 % monohydrát hydrochloridu cysteinu 0,05 %extrakt ze sena *** 10,0 %.

Označení média: RGCF tekuté médium «/ Oxoid Ltd., Londýn, V. Británie ««/ Viz vpředu rxk/ Pro přípravu extraktu ze sena se seno jemnénařeže, částice se suspendují ve vodě, vaříse a zfiltruje. Filtrát se přidává do médiapřed sterilizací. Před sterilizací se hodnoty pH upraví na 6,5· r z

Zkumavky obsahující 5 ml sterilního média se U naočkují mikrobiální suspenzí získanou z individuál-ních klonů vyrostlých na RGCA pevném médiu a inkubujíse za anaerobních podmínek při teplotě 35 °G. Růst 20 - se kontroluje mikroskopickým zkoušením a kulturase nanese na pevné médium RGCA, kde se 2,0 % celu-lózy Bacto nahradí glukózou a cellobiózou·

Kultury se inkubují za anaerobních podmí-o nek při teplotě 35 C po dobu 120 hodin, potom sevzniklé individuální klony buněk využívajících ce-lulózu očkují na RGCA médium obsahující celulózu.

Takto lze získat bachorové mikroorganismyschopné růst na seně nebo na celulóze. b/ Genetické značení bakterií bachoru schopnýchrůst na seně

Genetické značení se provádí plasmidem plOllEfcoli podle Simona a spol. /Proč. 8th North Ameri-can Rhizobium Conference, Winnipeg, Kanada, Univ. ofManitoba Press, 1983/·

Plasmid DNA se izoluje z kultury E.coli po-dle Birnboima a Dolyho /Nucl. Acid. Res. 7, 1513» 1979/a rozpouští se ve vodném roztoku obsahujícím následu-jící složky: 75 mM CaGlg 5 mM MgCl2 10 mM tris. HC1 pufrs, «/ tris-/hydroxymethyl/-aminoethan hydrochlorid. - 21 -

Mikroby schopné růst na seně a izolova-né podle A/ příkladu 1 se kultivují na RGCF mé-diu a separují se odstředěním pod kysličníkem uhli-čitým. Buňky se suspendují ve vodném roztoku ob-sahujícím následující složky v 1 litru: 75 mM CaCl25 mM MgClg 10 mM hydrochlorid-monohydrátu cysteinu 1 mM thiosíranu sodného o

Suspenze má obsahovat 5 x 10 buněk v ml. Suspen-ze se ředí stejným objemem roztoku obsahujícíhoplasmid DNA /0,1 yUg/ml/ a inkubujé se po dobu 60minut při teplotě 4 °C. Potom se v inkubaci pokra-čuje při 41 °C po dobu 2 minut, pak se kultura na-náší na pevné médium obsahující 500/Ug/ml kanamy-cinu B a celulózu. jako zdroj uhlíku. Kultura seihkubuje při 35 °G po dobu 120 hodin za anaerob-ních podmínek a zkoušejí se klony, které jsouschopny růstu v přítomnosti 500/Ug/ml kanamycinu B.

Plasmid plOll nese geny určující resisten-ci na kanamycin a chloramfenikol; déle obsahujezdroj replikace umožňující start replikace v buň-kách E.coli. Je-li přenesen do jiných bakteriív důsledku chybějícího vodného zdroje umožňují-' í<SlťZCOu>j7U/V.ú .λ^^ϊΙίΛΛ ú.^úV^ii-iuAArnV/í^fí/^Á?,^ Ý,>Uíy<.-'.3V<·'. ··',*>«.'-' - 22 čího replikaci, je plasmid DNA buá eliminován neboinkorporován do chromosomů /částečně nebo úplně/a probíhá genetická rekombinace. Výsledný gen inkor-porovaný do chromosomu je vytěsněn a udělí buňkámrezistenci na kanamycin a chloromycetin. V pokusech autorů tohoto vynálezu byly získány klony rezistentní na kanamycin B o trans-—5 formační frekvenci 3x10 ·

Bylo izolováno několik rezistentních klo-nů a byla zjištěna citlivost na antibiotika u po-

* R čátečních, na kanamycin B rezistentních /Km / kme-nů. Výsledky dosažené s několika kmeny jsou udá-ny v tabulce 1.

Tabulka 1

Citlivost na kanamycin B u bakterií z bachoru a ge-neticky značených kmenů a degradujících seno

Mikroby Nejmenší účinná koncentra- ce kanamycinu B, yUg/ml tekutina z bachoru 31 počáteční kmeny 4,0 až 7,5 geneticky značené Km kmeny

Hh-GY0KI-l-8 500 - 23 - pokračování tabulky 1 27 250 91 500 123 1000 142 500

Takto lze získat organismy původem z bachoru,které Jsou schopné využívat seno nebo celulózu a ros-tou v přítomnosti vysokých množství kanamycinu B.

Kmen Hh-GYOKI-1-123 /Km®/ se nanese na RGCAmédium obsahující celulózu, načež se přidá kanamycinB v koncentracích 1000, 5000 a 10.000 ýug/ml. Kultu-ry se inkutují za anaerobních podmínek při teplotě35 °C po dobu 168 hodin, a izolují se kmeny rostou-cí v přítomnosti 10.000 /Ug/ml antibiotika.

Takto se spontánní selekcí získají spontánnímutanty vysoce rezistentní na kanamycin B. Jedenz těchto kmenů byl označen jako Hh-GY0KI-l-123Sz auložen v Madarské státní sbírce; lékařských bakteriíStátního ustavu hygieny v Budapeěti pod číslem 00287. C/ Znovuzavádění značených mikrobů do bachoru

Sterilní pevné médium, označené jako RGCFa, seočkuje kulturou kmene Hh-GYOKI-1-123 /Km®/ na RGCAšikmých agarech při teplotě +4 °C. Složení RGCFa media - 24 - je následující: 1. KgHK^ 0,3 % 45 ml roztoku 2. /NH4/2SO4 0,6 % NaCl 0,6 % MgS04.2H20 0,06 % CaCl2.2H20 0,06 % kh2po4 0,3 % 45 ml roztoku směsi 3· Celulóza /Bacto/* 1,8 % fe i - Agar /Bacto/X 3,0 % 65 ml roztoku směsi 4. kvasniěný extrakt 0,1 % 20 ml roztoku 5. cystein.HCl.HgO 0,1 % 20 ml roztoku 6. thiosíran sodný 0,1 % Na2C03 0,2 % 10 ml roztoku směsi XX 7. kapalina z bachoru 20 ml

Vysvětlivky:

x/ Difco Labs. Detroit USA xx/ viz vpředu Těchto sedm roztoků se připravuje odděleněa míchá se v udaném pořadí.

Kultivace se provádí v 500 ml Erlenmeyerověbaňce obsahující 150 ml média za anaerobních podmí-nek. Růst se kontroluje po dobu 48 hodin, potom sesmíchá kultura s krmivém pro ovce krmené senem. g 340 ml kultury obsahující 4,7 x 10 bakterií v ml - 25 - bylo podáno perorálně ovcím. Před podáním a v ná-sledujících dnech byly bachorovou sondou odebírány50 až 200 ml vzorky. Vzorky se ředí roztokem HB ananášejí se na RGCA médium neobsahující kanamycin Bnebo jiná antibiotika. Kultury se irikubují za anaerob-ních podmínek při teplotě 35 °C po dobu 72 hodin,a počítají se bakteriální klony. Výsledky jsou udány v tabulce 2»

Tabulka 2

Změny flory bachoru u ovcí po podání kmene

Hh-GYOKI-1-123 /KmR/ *·

Vzorek Počet buněk/ml bez antibiotik v přítomnosti

1000yUg/mlkanamycinu B Před podáním 5x10° 0 Po podání 1. den 5,9xlO6 2,OxlO4 2, den 3,2xlO7 4,lxl04 3. den 2,4xlO6 3,lxlO4 6, den 3,9xlO7 l,8xl04 8. den 9,8xl06 l,O5xlO5 15. den 8,-lxlO5 3,lxlO4 - 26 - Z tabulky je vidět, že podané mikroorga-nismy přetrvávají a rostou v bachoru.

Podle výše uvedeného způsobu autoři vynále-zu také kultivovali kmen Hh-GXOKI-l-123Sz rezis-tentní na 10.000 ^ug/ml kanamycinu H a perorálnějej podávali patnáctého dne stejné ovci.

Orálně bylo podáváno 140 ml kultury obsahu-

O jící 2x10 bakterií na ml.

Bakterie ze vzorků z bachoru byly kultivová-ny a počítány jako dříve. Výsledky jsou uvedeny v ta-bulce 3.

Tabulka 3

Změny ve floj$e bachoru ovce. po přidání kmene ' T?

Hh-GX0KI-l-123Sz /Km/

Vzorek

Počet buněk/ml bez antibiotik v přítomnosti 8000 /U /ml

kanamycinu B Před podáním 1,4x10 Po podání 1. den 7,4x10 2. den 1,7x10 0 3,2xl04 l,3xlO4 t -27 - pokračování tabulky 3 5. den 4,OxlO6 9,lxlO3 7t den Ι,ΙχΙΟ7 2,0xl04 14. den 8,0xl06 3,lxlO4 21. den 7,lxlO5 6,2xlG4 28. den 8,2xl06 8,lxl04 35. den 8,7xlOa6 l,8xl04 Údaje z tabulky 3 ukazují, že podané mikro organismy jsou přítomny ve značném množství v ba- j; ΪΙ i ’ choru a protože fluidní fáze obsahu bachoru se kon- í ; tinuálně vyprázdňuje, dochází bez pochyby k repli- » ·' u -i kaci. ' h j í

Odlišnosti v počtu bakterií u jednotlivých j

vzorků!lze vysvětlit změnami v konsistenci obsahu j I bachoru od hustého do fluidního stavu. r á I j Příklad 2 ! ξ [ ·jí·

Modifikace flory bachonu ovcí krmených mou- f S

II kout z obilovin f m

’ ..... )N A/ Izolace mikroorganismů schopných růstu za mouce ή

H z obilovin g > b v

Způsob popsaný pod a/ v příkladě 1 se opakuje í s tím rozdílem, že počáteční vzorek se odebírá z ba- 1 choru ovcí krmených moukou z obilovin, individuální - 28 - izoléty se očkují do RGCF tekutého média /vizvpředu/ obsahujícího 2 % mouky z obilovin práško-vané ve hmoždíři místo extrahovaného sena, kulturyrostlé na RGGF tekutém médiu se nanesou na RGCApevném médiu /viz vpředu/ a klony vzniklé z buněk,schopných; využívat mouku z obilnin se izolují napodobném médiu·

Takto se získají mikroorganismy schopné růs-tu na mouce z obilovin jako zdroji uhlíku. b/ Genetické značení bakterií bachoru využí-vajících mouku z obilovin

Způsob popsaný pod B/ v příklad 1 se opakujes tím rozdílem, že kmeny získané podle bodu A/ v pří-kladě 2 se použijí k transformaci pomocí plOll plas-miduDNA, místo těch, které se získají podle bodu A/v příkladu 2.

Rezistence několika transformovaných kmenů

*D a Kin kmenů na kanamycin B je uvedena v tabulce 4· *» Γ' lí - 29 -

Tabulka 4

Citlivost bakterií bachoru a kmenů značených gene**ticky a využívajících mouku z obilovin na kanamycin B

Mikroorganismy »1 ií

Nejnižší koncentracekanamycinu inhibujícírůst, ^.ug/ml kapalina z bachoru 31 počáteční kmeny 1,8

H geneticky značené Km kmenyHh-GYOKI-2-4 250 -l4Ab 250 -37 250 -81 125

Provedením výše uvedeného způsobu se získá-vají mikroby pocházející z bachoru, které jsouschopné využívat mouku z obilovina jako zdroj uhlí-ku a jsou 18 x rezistentnější na kanamycim B nežflora bachoru.

Kmen označený jako Hh-GY0KI-2-14Ab byl ulo-žen v Maůarské státní sbírce: lékařských bakteriíStátního ústavu hygieny v Budapešti pod číslem00288. μ; h íi - 30 - 0/ Znovuzavádění geneticky značených mikroorganismůdo bachoru

Způsob popsaný pod bodem C/ v příkladě 1 seopakuje s tím rozdílem, že sterilní RGCFa médium,obsahující 1,8 % škrobu místo 1,8 % celulózy /Bacto/,se očkuje, smíchá s potravou pro ovce a denně se son-dou; odebírají vzorky před podáním a po podání.»310 mlkultury obsahující 7,1x10^ bakterií/ml bylo podává-no orálně ovci.

Tabulka 5

Změny flory bachoru u ovce po přidání kmene

Hh-GY0KI-2-l4Ab /KmR/

Vzorek Počet buněk/ml

Bez antibiotik V přítomnosti 250 /Ug/ml kanamycinu B Před podáním 4i3xlO6 1,4x1ο1 Po podání: l.den 4,1.106 l,8xlO3 2. den 3,2xlO6 2,lxlO3 3» den 8,OxlO3 Ι,ΙχΙΟ3 6. den 9,lxlO6 7,lxlO2 8. den 8,0xl06 8,lxl03 - 31 - pokračování tabulky 5 15*den 6,8xlO6 8,7xlO3 22. den 5,OxlO6 9,8xlO3 29. den 8,OxlO6 Ι,ΙχΙΟ4 36. den 9,lxlO6 7,OxlO3 43. den 7,OxlO6 7,9xlO3 60« den 6,lxlO6 7,OxlO3 Údaje z tabulky 5 ukazují, že podané mikro-organismy zůstávají a replikují se po dlouhou dobuv bachoru. Příklad 3

Modifikace flory bachoru ovc® krmené melasouA/ Izolace mikroorganismů schopných růstu na melase

Způsob popsaný pod bodem A/ v příkladě 1 seopakuje s tím rozdílem, že počátečníí vzorky jsouodebírány od ovce krmené melasou, individuální izo-láty se očkují do RGCF média obsahujícího glukózumísto extrahovaného sena, kultury vyrostlé v teku-tém médiu se nanesou do RGCA média, klony vyrostléz buněk využívajících melasu se očkují do stejnéhoRGCA média. - 32 -

Tak se získají mikroorganismy pocházejícíz bachoru využívající melasu. B/ Genetické značení bakterií využívajících melasu

Způsob popsaný pod bodem B/ v příkladě 1 seopakuji s tím rozdílem, že buňky připravené podlebodu A/ v příkladě 3 se transformují plOlí plasmi-dem DNA místo buněk získaných podle bodu A/ v pří-kladě 1.

R

Rezistence některých Km kmenů na kanamycin Bje uvedena v tabulce 6.

Tabulka 6

Rezistence bakterií bachoru a geneticky značenýchkmenů využívajících melasu na kanamycin B

Mikroorganismy

Nejnižší koncentracei kana-mycinu B inhibující růst kapalina z bachoru 31 počáteční kmeny 7,5

R geneticky značené Kin kmeny' Hh-GYOKI-3-2 250 -14 500 -34 250 - 33 pokračování tabulky 6 81Me 500 -132 500

Takto se získávají izoláty vysoce rezistent- ' šj' ní na kanamycin B a využívající melasu·

Kmen označený jako Hh-GY0KI-3-81Me je uloženv Maóarské státní sbírce lékařských bakterií Stát-ního ústavu hygieny v Budapešti pod číslem 00289. 0/ Znovuzavedení geneticky značených bakterií do h

bachoru. J •í

Způsob popsaný pod bodem C/ v příkladě 1se opakuje s tím rozdílem, že kmen Hh-GY0KI-3-81Me se .očkuje do RGCFA média obsahujícího 1,8 % glukózy namísto 1,8 % glukózy namísto 1,8 % celulózy, a kul-tura se smíchá s potravou pro ovce krmené melasou.380 ml kultury obsahující 1,6x10^ bakterií/ml bylopodáno perorálně. Denně se -odebírá jeden vzorek son-dou z bachoru před a po podání.

- 34 -

Tabulka 7

Změny ve floře bachoru ovce po podéní kmeneHh-GY0KI-3-81Me /KmS/

Vzorek

Počet buněk/ml

Bez antibiotik V přítomnosti 500

/Ug/ml kanamycinuB Před podáním 5,0x10° 0 Po podání 1, den Ι,ΙχΙΟ6 l,9xio5 2. den l,8xl07 2,5xlO5 3. den 6,2xlO6 6,lxlO5 6· den 8,lxl06 8,7xl05 8. den 6,2xlO6 9,1x10 15.x den l,3xlO3 l,3xlO5 22. den 3,OxlO6 3,lxlO5 29. den 1,1x106 7,OxlO5 36. den 8,0xl05 9,lxlO4 43. den. 6,lxlO6 8,lxlO5 60. den 6,8xl06 δ',ΛχΙΟ^ MM·» _ M — MMMM M «... M MMMM «. MMM MMMMmMMMMMMMM·» M-WIM — WTtm-WMM·

Poznámka:x/ omyl ve vzorku - 35 Údaje ukazují, že podané mikroorganismy setr-vávají dlouhou dobu v bachoru ovcí krmených melasou· Příklad 4

Změny v poměrech těkavých mastných kyselin působe-ním bakteriálního preparátu

Dvě ovce jsou krmeny úplnými dávkami po dobu14 dní a sondou jsou odebírány vzorky z bachoru· Dvalitry kapaliny z bachoru se filtrují několika vrstva-mi gázy. Příslušný zbytek se suspenduje do litru fý-siologického pufru /viz níže/ smíchá se a zfiltruje sejako dříve. Dva filtráty se smísí, ponechají se státpo dobu dvou hodin, pevná hmota vznášející se na po-vrchu >se odstraní a kapalná fáze se použije ke zkoušení·

Složení fysiologického pufru je následující:

Na2HPO4 0,316 &amp;Ά KH2P°4 0,152 g/1 NaHCO^ 2,260 g/1 KC1 0,375 g/1 NaCl 0,375 g/1 MgSO^ 0,112 g/1 CaCl2.H2O 0,050 g/1 PeSO4.7H2O 0,008 g/1

1 i 36

MnS04.H20

ZnS04.7H20

CuSO4.5H2O

CoC12.6H20 0,004 S/10,004 &amp;/10,002 g/10,001 g/1

Zjistí se hodnota pH směsi a je-li to žádou-cí, pomocí vodné kyseliny chlorovodíkové nebo roz-toku hydroxidu sodného se upraví hodnota pH na 7,2/Cheng a spol.í J.Dairy Sei. 38, 1225, 1955/· K získané směsi se přidá stejný objem fysiolo-gického pufru a do 1 litru zředěné směsi se suspen-dují 4 g dávky. 30 ml každé suspenze se nalije doErlenmeyerovy banky o objemu 100 ml. 200 dávek se ste-rilizuje a 200 jiných nikoliv.

Sterilní média a média obsahující živé bakte-rie z bachoru se zaoěkují bakteriálními kmeny, kte-ré mají být sledovány z hlediska produkce; kyselinyoctové, propionové a máselné.

Sledují se bakteriální kmeny schopné přetr-vávat dlouhou dobu v; bachoru po kultivaci in vitro.Kromě toho jsou také sledovány bakteriální kmenyizolované z tekutiny bachoru ovce: krmené úplnou ne-bo jakoukoli dávkou podle bodů A, B a C z příkladu 1.

Bakterie, které mají být sledovány, se kulti- - 37 - vují na RGC + CG médiu /viz níže/ za anaerobníchpodmínek při teplotě 37 °C po dobu 48 hodin.Složení RGC + CG média: roztok solí I /viz A příkladu 1/ 15 % roztok solí II /viz A příkladu 1/ 15 % roztok stopových prvkůx 0,3 % kvasničný extrakt /Oxoid/ 0,5 % zfiltrovaná tekutina z bachoru 10,0 % Na2CO3 0,4 % cy s te in>. HC1. HgO 0,05 % thiosíran sodný 0,008 % celulóza /Bacto/ 0,3 % glukóza 2,0 % x Složení roztoku stopových prvků: ZnClg 40 mg CuC12.2H20 10 mg tetraborát dvojsodný /dekahydrát/ 10 mg molybdenát amonný /tetrahydrát/ 10 mg FeClyóHgO 200 mg MnCl2.4H2O 10 mg deionizovaná voda ad 1000 ml

Kultury se naočkují do média připravenéhov Erlenmeyerových baňkách* Dva ml každé kultury - 38 - se naočkují do dvou paralelních baněk po 50 ml media·Nesterilní kultury se zaočkují rovněž·

Baňky se inkubují za anaerobních podmínekpo dobu 40 hodin. Růst se zastaví 10% kyselinou mravenčil·a sleduje se obsah těkavých, mastných kyselin, v kultu-rách.

Kultury se zfiltrují vrstvami gázy a odstředíse při 4000 ot./min. po dobu 15 minut, potom se zfil-trují znovu a vnesou na separační kolonu Carlo Erba GI-452 plynově-kapalinového chromatografu opatřeného pla-menových ionizačním detektorem pro stanovení Cg-C^mastných kyselin.

Teplota kolony: 150 °C

Separační kolona: 2 m délky, 4 mm šíře /vnitřní prů-měr/ skleněná trubice naplněná 10% ethyleglykol-adi-pátem a 2% kyselinou o-fosforečnou na silanovaném si-likagelovém nosiči /průměr částic 0,2 až 0,3 mm/.

Teplota injektoru: 190 °C

Proud dusíku: 50 ml/min

Proud vodíku: 50 ml/min

Proud vzduchu: 200. ml/min

Pohyb papíru: 160 cm/hod.

Trvání chromatografie: 20 min. »

Objem vzorku: lyúl. - 39 - U každého vzorku bylo prováděno trojí měření.

Standartní roztok obsahuje kyselinu octovou, propio-novou, isomásienou, máselnou, isovalerovou a valero-vou. Z ovce krmené úplnými dávkami bylo izolovánovíce než 90 kmenů bakterii. Potom byly kmeny označenygeneticky a sledovány /pozitivní kmeny byly sledoványněkolikrát/. Reprezentativní výsledky jsou uvedenyv tabulce 8.

Vysvětlení zkratek použitých v tabulce 8: S: očkováno po sterilizaci NSí kultura obsahující živou floru bachoru byla očko-vána a/ stopová množství b/Z negativní kontrola: obsah těkavých mastných kyse-lin v médiu připraveném z tekutiny z bachoru,fysiologického pufru a krmivá použitého pro,po-kus /průměr ze 12 měření/; c/ pozitivní kontrola: obsah těkavých mastných kyse-lin inkubované kultury, obsahující počáteční: báká-te rie z bachoru, a jinak připravené stejným způ-sobem /průměr ze 12 měření/

- 40 - d/ jako sub c/, k médiu však bylo přidáno 5 ppm monensinu sodného /průměr ze 6 měření/; e/ jako sub c/, k médiu však bylo přidáno 10 ppmmonensinu sodného /průměr ze 6 měření/. 41

co 0 44

P 3 40 £

X I 3 O ΛP OO 14O ft ; 0 00 CJP PP PΦ Φ -003 03 >

fcjř S 1 Φ (0 0 a »3 'č 3 bO &amp; P P 0 f> A ‘k 1 0 1 0 Φ > o X oi a O 14 bO &amp; P P 63 P Φ P 'k t 1 i—1 φ » s Φ 03 X bO s *rl rd 1 k 1 rj Φ (0 'S 03 G o P bO £ *ri H 63 P Φ 03 k 1 05 0 1 o P Φ 03 ft o £ X ho £ •H rd 14 O fl X 1 1 á Φ $5 o X co a P (0 &amp; •H rH o o 0 s 1 63

O P4

M

P Φ

P

S 40 H c- trs os c- i: χι- M* c- t- 0v o- so ' xř CM xf- ό 00 M3 ř- ·* ·*- ·* r» 0* «i 1 ·* 0» ' 0* 0* O o O rH m n CM H H r-4

OS

O 1 1 1 0 i 1 1 1 0 ο 0 0 CM Η Ρ γ4 0» •S 0 0 0 ο 0 0 ’ 0 ο 0 0 trs 2 IfS CM os Η Ρ C— m tTS η trs η ITS •Μ· η 0« Λ Λ 0S 0 0 1 0« ·% Μ ·* o o ο ο 1 ο ο Ο ο 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 ο- Ο 00 U0 C- 1 Ρ Μ- Ρ 00 Ρ οο SO IÍS η S0 00 1 Ι" OS Ο σν 0* •S ·* 0¾ 0* 0* ·* 01 •S Η CM ο Η ο Ο 1 ο Ο γΜ ο Η Ο 00 ιη Η Η 1 Η 00 as (Η C— Ο η Os CM οο trs Μ0 SO ΚΟ Λ 0« Λ μ *» 1 ** 0* 0* 0» Ρ CM ο γΗ CM CM rM 1 γΗ γΗ Η w co S5 1 63 ω η 1 3 ΐ CM Η χί- Η ρ Ο Ρ Ο Ρ Ο 00 1 1 1 1 1 1 Λ Η Λ CM Λ m S 1 « 1 S | 1 i1

ί! I • b i íí

• I !i >a

I! i!

0

P o f-t

P tí o 44

40 Čí Ό ΦI I I I

I - 42 -

OJ > \ S'g °

O

P o o

•H

(X

O

X

(X as asfl a •Η -rlΗ HΦ ΦW 0

φ as φ« fl H &amp;3 * 5 t)0 g >» t> 14 P ?k

I as φ as > oi « o &amp; s “ o 14 Φ r4 «Ο 3_ σ\ rH Ol CO M-. CM ca ί- ir\ o OJ c- irs ca co O co r4 r— ο ca IÍY Ol o •\ ♦* ·» r» «% Λ Λ Λ O O o o CM M- CM OJ CM rH Ol as i i r-4 φ as φ οι β 01 •h 'asH a φ as Hta a o •rl Nr4 -rl

WJ &amp;

CO &amp; r4 1 •p Ή f>

O χυ es (4 Λ4

O ft co lí\ m Μ- -Φ r-4 rd γΗ «« ·* Λ as o as O as o as o 1 1 1 Ol Μ- μ- to <o to Μ- Γ- Μ- t- rH r-1 co η γπ n ΓΊ n η η η O1 CO m ·* r« Λ ·* •s 0% •s <* «* ·* ·* o o O o o o o o o o O o to ·§ < 'φ 33 Φoi to<1a g"g 'žs kos»x s x i

0 § -P '«O φ asoi tí &amp; 3

I

I o •r4 asaseasasajasasajas

o co <o r-4 C—· o H co t— o Γ- r-4 <£> n to O M- c- l£\ c— vo v£> ΟΟ CA Λ rn *» •t »* »» - »* e» 0* ·* r4 OJ rH Ol O o O o o o o O KO r4 M- n Γ- Ol O co ca t- r-4 Ol Ol Ol M- o η o r-t p4 n t- n o ·» *« *» ·% ·* ·* . ·* 0* ·* r-f r4 H Ol Ol CM OJ r4 rH r4 OJ CO řZ3 ca a ta m ca tu ca <2; ca N XS O SX as as as as n Ol co o r4 to r4 Ol Μ- lf\ UA IO p4 r4 ι I 1 1 1 1 V4 H H H H H H •H M M M M M X O O O o O O a Φ P O ÍH O &amp; 8 S h CÍJ s i A 1 <-4 A A A S XI 3 3 3 3 3 3 ca - 43 - \ i 3 §· O h op, OJ co

P P •H *rl

r-l i—I

Φ © XO CO CO f> &amp; j? 2

I Φ i—(

I

Φ Λ<0 P

I Φ

CO

(H *HI

rHΦCO a g

2 M 1? 2 «Λ =<

tsO 3 00 N Φ J3

I o

•H cn trs

H r-1

lí\ CO o\ o CM m «t o o co co trs tJ- pokračování tabulky 8 3 w 8 o "S *!ž &amp; a s. a a X. &amp;3 S?\

I

Φ esco P

I o +> o\ «Μ- <n

CM

Ch

CM CM co

P

M

O

ÍM PΦ P ť • ·8

CO CO » ja σ\ o

H á s o

I

Hh-GYOKT-126 S 0,56 0,60 a 0,52 a a 0,93 NS 0,83 1,14 a 1,55 0,11 0,70 0,73 - 44 - Údaje z tabulky 8 dokazují, že poměrytěkavých mastných kyselin produkovaných fermen-taěním působením flory bachoru lze modulovat v širo-kém rozsahu podáváním mikrobiálních kultur připrave-ných. podle vynálezu. Například produkci kyselinypropionové lze významně stimulovat kulturou připra-venou z kmene Hh-GY0KI-48a, kdežto kmen Hh-GYOKI-lO9bstimuluje produkci kyseliny octové. Stimulování pro-dukce. jednotlivých mastných kyselin bylo pozorovánona médiu postrádajícím /S/ i obsahujícím /NS/ živémikroby bachoru. V našem pokusném systému monensinsodný snižoval poměr kyseliny octové ke kyselině pro-pionové o 0,1 nebo 0,2 /d,e/.

Mikroorganismy vybrané' výše uvedeným způ-sobem jsou značeny geneticky, podávány přežvýkavcůma zkoušeny na růst přežvýkavců a na přetrvávání opa-kováním postupu popsaného v bodě b/ v příkladě 1. Kiněny s výhodnou fermentaění strukturou, a dlouhým pře-trváním v bachoru budou podávány perorálně za úěelemiúpravy produkcec těkavých mastných kyselin. - 45 - P ř í k 1 ad 5

Bakteriální přípravek pro perorální podávání přežvý-kavcům

Bakterie, které mají být podávány, se kulti-vují na RGCA = CO médiu /příklad 4/ za anaerobníchpodmínek popsaným způsobem. Po kultivaci se buňkyoddělují filtrací nebo odstředěním.

Oddělené buňky se suspendují ve fysiologic-kém pufru /příklad 4/ a lyofilizují se. lyofilizo vánýbakteriální preparát se skladuje, vhodně upraví a po-dává perorálně pře žvýká vcům.

Mikroorganismy lze kultivovat v jiném běžněpoužívaném médiu, například v médiu obsahujícím glukó-zu a škrob atd. jako zdroje uhlíku a anorganické solijako zdroje dusíku. Přípravek lze podávat snadno smícháním s po-travou nebo s pitnou vodou, samotný nebo spolu s jiný-mi biologicky účinnými látkami, například s antibio-tiky a vitaminy.

Kromě lyofilizováného preparátu; lze připra-vovat i jiné produkty. Mikroorganismy mohou být taképodávány po smíchání filtrované nebo odstředěné bak-

!1 - 46 - teriální masy se vhodným nosičem nebo zřeňovadly, na-příklad s uhličitanem vápenatým, koncentráty, premixya jinými.

Bakteriální kmen/y/ jsou voleny z mikroor-ganismů připravených způsobem podle vynálezu a výhod-ně zlepšujícím floru bachoru, a jejich množství„ kte-ré má být zkrmováno se určuje v závislosti na dávce; apotřebě zvířete. Je-li potřebné snížení poměru kyse-liny octové ke kyselině propionové, může se použít, napříkladkultura připravená z kmene Hh-GYOKI-48a, avšak pro zvý-šení tohoto poměru se doporučuje podání kmene Hh-GYOKI- 3-81Me.

Stanovení požadovaného množství mikrobiálníchbuněk nemůže znamenat pro odborníka problém. Doporučujese podávat buňky v množství 5x10^ až 5x10? kultivova-ných mikroorganismů na 1 ml tekutiny z bachoru. Příklad6

Podávání kmenů Hh-GY0KI-48a a Hh-GY0KI-l-123Sz ovcím

Hh-GY0KI-48a kmen se kultivuje na RGCA-CG médiu/příklad 4/ v pětilitrových fermentorech /užitečný objem/při teplotě 37 °C za anaerobních podmínek. Permentacese zahajuje očkováním 10 mililitry kultury podobnéhosložení, PQ 48 hodinách kultivace se buňky oddělí odstře- • · ' .

- 47 - . II Ί t děním /5000 otáček za min./a vlhký sediment váží- ! |

- - ' ' : ‘ . ; ' ': ' IH cí 58 g se smíchá pečlivě se 4kg kukuřičné-mouky. í í jí

Směs se rozdělí na osm: stejných dílů a perorólně se ? ií ί

« Ί L podává osmi ovcím,, které před tím 24 hodin hladově- ly. Kmenu Hh-GYOKI-l-123Sz lze použít podobně, s bak-

. · IN teriálním výtěžkem 53 g· 1 ? ' Ϊ ? ií { V růstově výkrmném pokuse bylo 23 ovcí krmě-no ad libitum senem z hubené trávy a zvířata byla podobu 5 týdnů každý týden vážena. Pokusné skupiny, se-stávající z osmi ovcí, byly krmeny jedním z bakteriál-ních preparátů, každá pro jediné krmení a sedm ovcí 1 ( :: í sloužilo jako kontrola. Denně bylo konzumováno zvíře-tem 600 až 900 g sena plus minerální a vitaminový pre- mix smíchaný s kukuřičnou moukou /100 g/. Výsledky . - - ' . "· . - ' ' lÍ 5' jsou uvedeny v tabulce 9· ;i 51 jí P, il — 48 — IA O 1 ia O o : ia o O o »A ·* Λ •v: r*- .'·.·* «* ' •s co 00 M0 co o C— 00 xf- co 00 04 04 i 04 04 - (Ό 04 04 co 04 04 tA IA IA O IA O O ' tA IA O *» r* r» »* ·* ·* Λ co VO CO o co co co n co CO Ol 04 04 m 04 04 04 on 04 Ol

Hmotnostní přírůstek ovcí krmených ad libitum. senem z trávy fl tu CO Ό'>5+» 04 rd M σ +» XJ M <U O •P tí X0 -P XI O o § ft Λ (0 rd

O Λ4

N

CO IA O IA tA IA o O n o IA O ·* Λ V* r» Λ *» 04 ** co C— 0— o o to 00 rd co 00 04 04 04 n m 04 04 1 co 04 04 O IA O o o IA : ia a IA o O •s r» ·* ·» «% «s o 00 c— o CO vx, c- 04 t— tA m 04 Ol m Ol 04 04 <u m 04 04 fl

<U IA IA O IA o : ia O Vd fi Φ O IA IA ·* ·* Λ £> ·* <» CO c— c— o o IA c— O Ol \o IA 04 04 04 m 00 04 C\J co co 04 04 •3 ft O O IA O IA O O IA tA O 0¼ *» A ** *» ·* r* CO c— co o co IA tr- co tA IA 04 04 04 m 04 04 oj 04 04 04 xu o

Ό OJ0 rd>H MO Ή:P. >O rd 04 CO Μ· ΙΛ VĎ t~ CO <O Ord IX 25,5 24,5 25,5 27,5 27,0 .28,0

o IA o o m o o : ia o ·* <* n »»· . — ·» O O rH CM o rH O m m co m cn co m m o IA ΙΛ ia o o m o IA ·*. ·* «* n ·» ca ca o O CM ca O ca CM CM CM m m m CM CM m tí φ m όS>>+»

CM aJ o o IA o IA IA ΙΛ o O ·* «* ·* Λ Λ μ- H r- ca 00 rM 00 ca o o ι co CM CM CM n CM CM (*3 H 8 o ·* CA IA Λ o IA Λ CA IA o S ía o ÍA ·* CO IA co O c- O H CM m CM m φ rn CM CM CM m a §

I o O IA O 3 O o IA O IA Λ' Φ *k ·» - ·* oo o 00 CA O o IA C— co o CM n CM CM O cn CM CM CM co ra o. pokračování tabulky 9 >o Φ +» Ό, X)

O 'φ ►

P 0} +» o o Ό Ogj hω o ΉΛ X)

o IA IA IA IA : tA O O IA •s r» ·« r* · ·* ·* CA CA i CA 00 CA co o- CO CA CM CM CM CM CM CM CM CM CM

cm m m· iarH i—I r-1 i—I co c- co ca o

Η Η Η H CM 28,0 28,0 28,0 29,0 29,0 30,0

H

CM

I

I - 50 -

Pokračování tabulky 9 • in 33,5 0 Λ CM m co 0 • ·% ·« *^· CM H m m ti Φ 0 0 • Λ m d 0 σ\ m CM '>i -P CM m • Λ •X CM m r- m CM • tn 0 H ·% Λ. 0 CO n CM Ή ti +i >O m Φ 0 0 O P ti ·* OJ -P o\ C~- O 0 CM CM O i Λ .ti XD > O d 0 ď H *5 ω CM m 0 Ή CM CM P< >o o

H Φ

O (—1

I (0 +» ti Φ d Φ

S Φ •Γ3 Φ *.- · IT\ - 51 -

Průměrná hmotnost a denní přírůstek hmotnosti pokusných a kontrolních ovci

CM «

iH

KO n Λ co

CM ΙΛ + Ε-ΓΩ- ·»o

CY

O t-

O

O

CO

CM co

I <á o\

CM

CM

CO a a> Ό '>»

P

PM WO

<4O P> O

US a)

rH

O ř4

P fl

O Λ4

Cl 00

CM o r4 bj 03 m

CM

H f

rH t r4

Cl Λ σ\

CM c—

CO M σ\ Cl r—1 p co o H ·* 00 O co CM + 1 ši CM 'Φ U-i 0) O r4 o β O CM 0) ·* co a co CM +- Λ CM M tí Φ P

CO

CO !l· S'? if Ěí

O

O co

CM

O n •3

A c— c—

CM

ít : «Λ * Μ- tí <i> η ό >> +»

OJ

rH «5

CO Μ- Ι

B

H o

I s i i - 52 - O\

VO ·« a η c·— ·» o n t- n ·% o\

OJ

OJ

O Ολ

OJ M- σ\ 0t c-

OJ Ή

CJ Φ P X> M to O £3 o w f—1 Ό tí •a 00 O +» Λ «* > 2 o •3 0 04 ft Λ o

<M

H + o c- M- M- + ií\ n

H +

VO

H + pokračování tabulky 10

ff

Kiv/jgaajBaaaaiMÉBfl

- 53 -

Ovce krmené kmeny Hh-GYOKI-l-123Sz aHh-GYOKI-48a kontrolní skupina měly při chudých dáv-kách přírůstky v průměru 2620, 3875 a 360 g během35denní pokusné doby.

Počáteční tělesné hmotnosti mezi sku-pinami se významně nelišily, avšak u konečných těles-ných hmotností /tabulka 11/ a u denních přírůstků/tabulka 12/ byly nalezeny významné rozdíly.

Tabulka IX

Statistické hodnocení konečných tělesných hmotností kontrola Hh-GYOKI- 1-123SZ Hh-GYOKI- 48a průměr /kg/ 28,357 30,375 31,6875 korigovaný kvadrát standartní odchylky 1,476 3,910 2,281 p /%/ <5,0 <0,1

i - 54 -

Tabulka 12

Statistické hodnocení přírůstků tělesné hmotnosti./5 týdnů/ kc >ntrola Hh-GYOKI- 1-123SZ Hh-GYOKI- 48a počet zvířat celkový hmot. pří- 7 8 8 růstek skupin Ag/ 2,5 21,0. 31,0 maximální přírůstek Ag/ 2,5 4,5 5,0 minimální přírůstek Ag/ průměrný přírůstek -2,0 1,0 2,0 na ovci Ag/ korigovaný kvadrát 0,3571 2,6250 3,8750 standartní odchylky 2,143 1,768 0,839 standartní odchylka + 1,355 + 1,244 + 0,857 Údaje dokazují, že přípravky vyráběné po-dle vynálezu mohou významně stimulovat přírůstek hmot-ností ovcí, > Příklad 9

Setrvávání geneticky značených bakterií v hovězím ba-choru

Způsob popsaný pod bodem C v příkladě 1 :4*ΐΧΛ«Λ«Λ>-7Ζ<*’ Μνκηρ^ &amp;i

-55 se opakuje s tím: rozdílem, že kmen Hh-GY0KI-l-123Sz, rezistentní vůči 10.000 yUg/ml kanamycinu, se kulti- vuje ve 4 litrech média RGCTa. Po dosažení stacionár-ní fáze /třicátá osmá hodina/ se kultura izoluje od-středěním /5000 otáček za minutu/ a buňky se důklad-ně smíchají s 500 g kukuřičné mouky a použijí se kekrmeni krav. Týdně se odebírají sondou vzorky a po-dle bodu G z příkladu 1 se zjišťuje setrvávání podá- j. něho kmene v bachoru. Λ Výsledky ukazují, že kmen Hh-GY0KI-l-123Szroste v bachoru hovězího dobytka a může zde přetrvá-vat nejméně 40 dní. i* 4 ij Η v

Účinek mikroorganismů Hh-GY0KI-48a na zvýšení hmot-* nosti ve srovnání s negativními a positivnímikontrolami

Mikroorganismus Hh-GY0KI-48a sepěstují způsobem, popsaným v příkladu 6 s tím roz-dílem, že se do živné půdy nepřidává šíáva z bacho-ru. 41 g bakterií ve formě vlhké pasty, získané poodstředění se smísí s 1,2 kg kukuřičného šrotu apak se získaný materiál rozdělí na 12 stejných dílů. Dále se postupuje stejným způso-bem jako v příkladu 6, s tím rozdílem, že se rozdě-lí 36 ovcí do tří skupin, positivním kontrolám sepodává kromě přídatného krmivá a sena ještě 100 gkrmivá. Výsledky jsou uvedeny v následu-jící tabulce 13, v níž n znamená počet zvířat vuvedené skupině. - 57 -

Tabulka 13

Negativní kontrolní skupina, n 12 číslo hmotnost (kg) v týdnu přírůstek v kg : i i č zvířete a 1 2 4 za 4 týdny 1 32,8 31,0 33,2 34,1 1,3 lJ 2 34,8 33,0 35,4 37,0 2,2 s i 3 26,7 27,4 28,5 30,1 3,4 4 32,5 35,4 36,3 35,7 3,2 1 Ě 5 32,6 30,6 32,0 34,0 1,4 F 6 35,0 35,1 34,9 35,2 0,2 ϊ 1 Π 3$j6 N 7 34,7 36,4 37,7 3,0 4 8 35,8 36,8 37,5 38,1 2,3 il 9 32,0 32,7' 34,0 35,0 3,0 H 10 30,0 30,3 32,0 34,2 4,2 11 34,0 33,9 35,5 36,6 2,6 i *·, 12 35,8 35,0 36,1 38,0 2,2 i V 1 &amp;í Φ celkem 396,7 397,8 411,8 425,7 29,0 5 «£ , t* průměr 33,06 33,15 34,3 35,475 2,4 j i { - 58 -

Positivní skupina, n =12 číslo hmotnost (kg) v týdnu přírůstek v kg zvířete 0 1 2 2 4 4 za 4 týdny 13 35,2 37,6 38,0 39,0 3,8 14 31,6 32,7 33,4 35,3 3,7 15 33,3 34,6 36,3 37,0 3,7 16 33,2 34,0 35,6 36,0 2,8 17 34,5 36,8 39,0 39,6 5,1 18 27,3 29,5 31,4 32,4 5,1 19 34,5 36,0 37,4 37,7 3,2 20 31,7 31,6 34,0 35,0 3,3 21 31,o 36,8 38,0 38,7 7,7 22 35,5 37,0 38,9 39,8 4,3 23 34,4 35,5 37,7 38,8 4,$ 24 34,0 34,9 37,2 37,9 3,9 celkem 396,2 417,0 436,9 447,2 51,0 průměr 33,0 34,75 36,40 37,266 4,3 - 59 - pokusná skupina, n = 12 • »< i přírůstekza 4 týdny číslo zvířete hmotnost (kg) v týdnu 0 1 . 2 4 25 33,2 35,9 37,4 •38,1 4,9 26 33,6 35,7 37,0 37,9 4,3 27 34,7 36,4 37,4 38,0 3,3 28 33,5 35,0 36,8 37,3 3,8 29 28,8 32,0 33,2 34,2 5,4 30 27,6 31,9 33,4 35,0 7,4 31 32,0 32,5 35,5 36,1 4,1 32 30,5 35,6 35,9 38,0 7,5 33 33,4 33,7 34,5 35,3 1,9 34 31,3 36,0 37,3 38,9 7,6 35 34,7 33,5 34,1 36,8 2,1 36 31,6 34,8 36,1 37,2 5,4 celkem 384,9 413,0 428,6 442,8 57,7 průměr 32,075 34,42 35,7 36,98 4,8

MB ί«

- 60 Výsledky matematické analýzy ,-<;: J- J . í

Srovnání mezi negativní apositivníkontrolnískupina positivníkontrolní a pokusnou skupinou mezi negativníkontrolní apokusnou skupinou S = + 1,236 S = + 1,664 S = + 1,613 ú= 1.9 Δ= 0,5 Δ « 2,4 t = 3,766 t = 0,736 t = 3,645 p <0,01 p <0,5 p < 0,05 velmi významné slabě významné významné

Poznámky: S, 4 , t a p jsou statistické konstanty.S znamená standardní odchylku, 4 znamená rozdíl hodnot pro průměr,t znamená t-vzorek, p hodnota pro statistickou významnost. >-Π4ΤrtíuwHaiuw,-rr,.·»] t.’<VATA JVC'.: - 61 - Z výsledků svrchu uvedených po-kusů je zřejmé, že, hmotnost zvířat ve skupině, kte-.ré byly podávány mikroorganismy v průběhu 28 dní,přepočítáno na jedno zvíře převýšilo průměrnou hmot-nost kontrolních zvířat o 2,4 kg. Přírůstek zvířatv positivní kontrolní skupině byl průměrně 4,3 kg,tj. o 0,5 kg méně než průměrný přírůstek zvířat,ošetřených mikroorganismy. To může znamenat, že připodávání prostředku podle vynálezu ve svrchu uvede-ném množství jehňatům při udržení přírůstku je mož-no uspořit na jedno zvíře alespoň 100 g nákladnéhokrmivá denně. Pří k 1 a d 11

Způsob výroby.prostředku s obsahem mikroorganismuHh-G®0KI-48a A· Způsob výroby lyofilizováného prostředku.

Pasta bakterií OE-950, získanézpůsobem podle příkladu 6 po odstředění s hmotností100 g se lyofilizuje v lyofilizačním zařízení

- 62 - (Labor MIM, Maúarsko), pak se 54 g takto získanéhoproduktu opatrně promísí se 486 g pšeničných klíčků,a uloží se do zásobníku nebo pytle, nepropustnéhopro bakterie. Tímto způsobem se získá prostředek s obsahem 10 % účinné látky. * B. Způsob výroby prostředku, který obsahuje jakonosič pšeničné klíčky 100 g vlhké pasty mikroorganismůpo odstředění, tak, jak byla získána způsobem podlepříkladu 6, se promísí se 100 g nebo 900 g pšeničnýchklíčků a pak se uloží do zásobníku nebo pytle, nepro-pustného pro bakterie. Tímto způsobem se získá pro-středek s obsahem 5 nebo 10 % účinné látky. C. Způsob výroby prostředku, obsahujícího jako nosičbentonit 100 kg bentonitového prášku "Veegumneutrál" (Lehmann und Voss Co., Hamburg, NSR) se ste-rilizuje 2 hodiny při teplotě 160 °C, pak se při tep-lotě místnosti vloží do mísícího zařízení typuLodige íM 130 (výrobce: Gebruder Lodige Maschinenbau

I - 63 -

GmbH, Paderborn, NSR)· Mísící zařízení se uvede doichodu a přívodem pro kapalinu se přivede 10 kg sus-penze mikroorganismů, získané způsobem podle pří-kladu 6. získané disperze mikroorganismů a bentonituse suší při teplotě 30 °C až do dosažení obsahu vody6 až 8 % a pak se uloží do zásobníků nebo pytlů, ne-prostupných pro bakterie. Vždy 5 g takto získaného produktuse skladuje při teplotě 4 °C, přiteplotě místnostia při teplotě 37 °C, přičemž ve dnech 0, 20, 51 a 72se odeberou vzorky, prostředek se uvede do suspenzeve sterilní směsi HB se složením uvedeným v příkladu1 a po příslušném zředění se naočkuje na agar RGCA,jehož složení je rovněž popsáno v příkladu 1. Pak semikroorgahismy pěstují 46 hodin za anaerobních pod-mínek, načež se počítá množství vytvořených kolonií. Získané výsledky jsou uvedeny vnásledující tabulce 14.

- 64 -

+

Tabu 1 k a 14 ,

Stálost produktu s obsahem bentonitu jako nosiče

Teplota Počet bakterií/g produktu ve dni 0 20 51 72 4 °C - 4,3 x 107 teplota místnosti 2 x 108 6 x 107 37 °G 3 x 107 2,5 x 108 8 x 108 9 x 106 8 x 107 9 x 106 5 x 106 Z údajů, uvedených v tabulce jezřejmé, že se obsah bakterií v prostředku, který ob-sahuje bentonit v průběhu svrchu uvedeného měřeníjen velmi málo mění· D. Způsob výroby prostředku s obsahem atapulgitujako nosiče 100 kg koloidního atapulgitu"Pharmasorb HVM" (Chemie-Mineralien KG, Břemen, NSR)se sterilizuje 2 hodiny při teplotě 160 °0, po

- 65 - zchlazení na teplotu místnosti se atapulgit uložído mísícího zařízení typu Diosna P-25O-A (výrobce:Dierks Sohne Maschinenfabrik, Osnabruck, NSR). Mísící zařízení se uvede do chodua přívodem pro kapalínu se přijívede 10 kg suspenzemikroorganismů, připravené způsobem, popsanýta v pří-kladu 6.

Takto získané disperze atapulgitua mikroorganismů se suší při teplotě 30 °0 až do do-sažení obsahu vody 6 % a pak se ukládá do zásobníkůnebo pytlů, neprostupných pro mikroorganismy. Vždy 5 g produktu se skladuje přiteplotě 4 °C, při teplotě místnosti a při teplotě37 °C, načež se ve dnech O, 20, 51 a 72 odeberouvzorky. Prostředek se uvede do suspenze ve sterilnísměsi HB se složením, uvedeným v příkladu 1 a po od-povídajícím zředění se očkuje na agat RGGA, jehožsložení je rovněž popsáno v příkladu 1. Mikroorganismyse pěstují 46 hodin za anaerobních podmínek a pak sepočítá množství vytvořených kolonií. Získané výsledky jsou uvedeny vnásledující tabulce 15.

-λ; 27aÍ ;W··'.··. · · ." * ;Λ· - 66 - T a b u 1 k a 15

Stálost prostředku podle vynálezu, který obsahujejako nosič atapulgit /

Teplota Počet bakterií/g produktu ve dni 0 20 51 72 4 °<3 2 x 108 1,5 x 107 3 x 107 teplota

7 R místnosti 9 x 10' 3 x 10 9 x 107 5 x 108

37 °G 2 x 108 9 x 107 8 x 105 K, Z údajů, které jsou uvedeny vtabulce, je zřejmé, že se obsah bakterií v pro-středku podle vynálezu, který obsahuje jako nosičatapulgit za svrchu uvedených teplotních podmínekjen velmi málo mění.

Produkty, které byly způsobempodle tohoto příkladu vyrobeny v odstavcích A až D

- 67 - mohou být doplněny také jinými nosiči, napříkladvojtěškovou moukou, drcenými kukuřičnými palicemi,mletým uhličitanem vápenatým, hydrogenfosforečnanemdraselným nebo jinými látkami, které se obvykle po-užívají při výrobě přídatných krmiv a dalších krmiv.Prostředek, získaný tímto způsobem se před svým po-užitím přidává do přídatného krmivá, do krmivá nebodo pitné vody.

Claims (4)

1. vadel, konzervačních Činidel používaných v živočišné ťivý-robě a nutričních látek běžně podávaných přežvýkavcům,vyznačená tím, že obsahuje jako plčinnou složku v množstvído 99 hmot. alespoň jednu mikrobiální kulturu z kmenů v mikroorganizmů, uložených v Madarské státní sbírce lékařskýchbakterií Státního ústavu hygieny pod čísly 00287, 00288 a00289, schopných upravovat hmotnostní pomér kyseliny octovéke kyselině propionové na 'hodnotu 1,5 až 4,0 : 1, a schop- v ných růst v bachoru a zdržovat se tam alespoň po dobu 60dní, zbytek do 100 hmot. tvoří nňiué krmné komponenty,například seno, píce a melasa.
2. 2. Směs podle bodu 1, vyznačená tím, že obsahuje mikro-biální kulturu schopnou upravovat poměr kyseliny octové kekyselině propionové u přežvýkavců na 2,0 až 3,5 : 1.
3. 3. Směs podle bodu 1 nebo 2, vyznačená tím, že máformu pasty mikroorganizmů, lyofilizátu nebo suspenze.
4. 4. Způsob přípravy mikrobiálních kultur kmenů . mikro-organizmů používaných jako účinné složky ve směsi podlebodu 1 až 3, vyznačený tím, že se odebírají z bachoru sví-

   ' řK / 2. > _ zvířat krmených potravou nebo krmivém obsahujícím celu-lózu, škrob nebo mono- a disacharidy vzorky, vyšetřuje semetabolismu^ mikroorganizmů izolovaných ze vzorku in vitroa in vivo a mikroorganizmy upravující poměř kyseliny: octovéke kyselině propionové na hodnotu 1,5 až 4,0 : 1 se' kulti-vují v prostředí obsahujícím stejnou potravu nebo krmivojako zdroj uhlíku nebo dusíku, do rostoucích mikkoorganizmůse zavádí antibiotická resistence jako genetický značkovač, V 'i který umožňuje selekci, geneticky značené kmeny se kulti-vují, kultury se znovu; zavádějí do bachoru zvířat krmenýchstejnou potravou nebo krmivém, z bachoru se odebírají vzorky,spočítá se počet buněk geneticky značeného kmene, oddělí sekmeny přetrvávající alespoň 60 dní a tyto kmenty se upravujído formy přijatelné v ,praxi živočišné výroby a výživy.

   £ ; j t t E