NO153005B - Analogifremgangsmaate ved fremstilling av terapeutisk aktive, fluorerte diamino-heptynderivater - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en analogifremgangs-

måte ved fremstilling av nye farmasøytisk anvendbare fluorerte diaminoheptynderivater som in vivo er inhibitorer av et decarboxylaseenzym involvert i polyamindannelsen i organismer.

Decarboxyleringen av ornithin til putrescin, en reaksjon som katalyseres av enzymet ornithin-decarboxylase (ODC), er det første trinn i biosyntesen av polyaminene kjent som spermidin og spermin. Spermidin dannes ved overføringen av en aktivert aminopropyldel fra S-adenosyl-S-methyl-homocyste-amin til putrescin, mens spermin dannes ved overføring av en andre aminopropylgruppe til spermidin. S-adenosyl-S-methyl-homocysteamin dannes ved decarboxylering av S-adenosylmethionin (SAM), en reaksjon katalysert av enzymet S-adenosylmethionin-decarboxylase (SAM-DC).

De polyaminer som finnes i dyrevev og mikroorganismer,

er kjent for å spille en viktig rolle i cellevekst og celledeling. Starten av celleveksten og celledelingen er for-bundet med både en markert økning i ODC-aktivitet og en økning i nivåene av putrescin og polyaminene. Selv om den eksakte mekanisme for rollen polyaminene i cellevekst og celledeling ikke er kjent, synes det som om polyaminene kan lette makromolekylære prosesser slik som DNA, RNA eller proteinsyntese. Polyaminnivåer er kjent for å være høye i fostervev, i testes, ventral prostata og tymus; i tumorvev,

i psoriatiske hudlesjoner og i andre celler som gjennomgår hurtig vekst eller celledeling.

Da putrescin er forløperen for både spermidin og

spermin, ville blokade av omdannelsen av ornithin til putrescin, slik som ved inhibering av ODC, kunne forhindre ny biosyn-

tese av disse polyaminer, og således bevirke gunstige fysio-logiske effekter.

I britisk patentskrift 2003276A er det bl.a. beskrevet forbindelser av følgende formel A som er inhibitorer av ornithin-decarboxylase:

hvori p betegner 1 eller 2.

I britisk patentskrift 2001058A er det beskrevet forbindelser med etterfølgende formel B som er ornithin-decarboxylaseinhibitorer:

hvori Y betegner ethynyl (dvs. CH=C-).

Foreliggende oppfinnelse angår en analogifremgangsmåte for fremstilling av et terapeutisk aktivt fluorert diaminoheptynderivat av generell formel i:

hvori Y betegner CH=C-, og

p betegner 1 eller 2,

eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav.

Forbindelsene av formel I inhiberer ornithin-decarboxylaseenzym (ODC) in vitro og in vivo, og fremkaller en nedsettelse i putrescin- og spemidinkonsentrasjoner i celler hvori aktiv biosyntese av polyaminer finner sted. Forbindelsene av formel I er derfor anvendbare i pattedyr for regulering av uønsket cellevekst eller celledeling. Forbindelsene av formel I er anvendbare farmakologiske midler for behandling av de sykdommer eller tilstander som er kjent innen faget for å være karakterisert ved høy ODC-aktivitet. I særdeleshet er forbindelsene anvendbare systemer for regulering av veksten av tumorvev i pattedyr, for behandling av godartet prostata-hypertrofi og for regulering av veksten av patogene para- . sittiske protozoa i infiserte husdyr og mennesker. Forbindelsene av formel I kan også anvendes for å studere nærvær og fysiologisk funksjon av ODC-inhibering i biologiske systemer og deres forbindelse med patologiske prosesser.

Det skal forstås at forbindelsene av formel I kan være substituerte ved en aminogruppe med en hvilken som helst gruppe kjent innen faget til å være i stand til å splittes in vivo (enzymatisk eller kjemisk) for å danne en fri aminogruppe. Forbindelser som inneholder slike splittbare substi-tuenter og som derfor kan omdannes in vivo til en forbindelse av formel I, vil være ekvivalente med forbindelsene av formel I for oppfinnelsens formål. Slike derivater kan fremstilles på kjent måte fra forbindelsene av formel I. Et for tiden foretrukket derivat er N-glutamyl.

ODC-aktiviteten av forbindelsene kan bestemmes in vitro ved den metode som er beskrevet av B. Metcalf et al. J. Am. Chem. Soc, 100, 2551 (1978). ODC-aktiviteten av forbindelsene av formel I kan bestemmes in vivo ved metoden ifølge C. Danzin, Biochemical Pharmacology, ^8, 627 (1979) .

I den ovenfor generelle formel I betegner Y ethynyl (dvs. CH=C-).

I den ovenfor generelle formel I betegner p 1 eller 2. Det skal forstås at når p betegner 1, er forbindelsene mono-fluormethylderivater og når p betegner 2, er de difluormethyl-dérivater. For tiden foretrekkes det at p er lik 1.

Illustrative eksempler på farmasøytisk akseptable salter av forbindelsene fremstilt ifølge oppfinnelsen, innbefatter ikke-toksiske syreaddisjonssalter dannet med uorganiske syrer slik som saltsyre, hydrobromsyre, svovelsyre og fosforsyre, eller med organiske syrer slik som organiske carboxylsyrer, f.eks. salicylsyre, maleinsyre, malonsyre, vinsyre, sitron-syre og ascorbinsyrer, og organiske sulfonsyrer, f.eks. methan-sulfonsyre.

I en foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen tilveie-bringes forbindelser av følgende generelle formel IA:

hvori p er som definert i forbindelse med formel I; og farma-søytisk akseptable salter derav.

En særlig foretrukken forbindelse er:

l-fluor-2,5-diamino-6-heptyn.

Det er antatt at forbindelsene av generell formel I er "substrat-induserte irreversible inhibitorer" av ornithin-decarboxylase. Slike inhibitorer er også kjent innen faget som "enzym-aktiverte irreversible inhibitorer", "selvmords-enzyminhibitorer" , "<K>^^<-i>nhibitorer" eller "mekanisme- - baserte inhibitorer". For at en forbindelse skal være en substrat-indusert irreversibel enzyminhibitor, må forbindelsen være et substrat for målenzymet, og forbindelsen må inneholde en latent reaktiv gruppe som er ømfintlig overfor å bli umaskert som resultat av den normale katalytiske virkning av enzymet. Umaskeringen av den latente reaktive gruppe ved virkningen av enzymet skaper en reaktiv funksjon som alkylerer en nukleofil rest tilstede ved det aktive sete av enzymet. Således dannes det en kovalent binding mellom inhibitoren og enzymet ved det aktive sete, resulterende i irreversibel inaktivering av enzymet. Slike inhibitorer er ekstremt spesifikke da inhibitoren må være et substrat for målenzymet, og da biooverføringen av inhibitoren med målenzymet er nødvendig før enzymet inaktiveres. Selvom det er antatt at forbindelsene av generell formel I generelt utviser sin virkning ved hjelp av en substrat-indusert mekanisme, kan inhiberingen finne sted ved andre mekanismer slik som ved

konkurrerende inhibering.

Som anvendt her, menes med uttrykket "tumorvev" både godartet og ondartet tumor eller neoplasme, og innbefatter leukemias, lymphomas, melanomas og sarcomas. Uttrykket "regulering av veksten av tumorvev" som anvendt her, betyr en nedsettelse, avbrytelse, stansing eller stopping av veksten av en hurtig celledelende tumor i et varmblodig dyr. Det skal forstås at administrering av en forbindelse av formel I ikke bevirker en "legning" av tumoren i den betyd-ning av tumorvevet ødelegges eller totalt elimineres fra det dyr som behandles.

For regulering av veksten av tumorvev kan en forbindelse av formel K administreres til pasienten i forbindelse med andre terapeutiske metoder eller i kombinasjon med cytotoksiske legemidler kjent innen faget for å være nyttige ved cancerkjemoterapi. Eksempelvis kan en forbindelse av formel I administreres i forbindelse med kirurgisk fjerning av tumoren eller med bestrålingsterapi, hormonbehandling immun-terapi eller lokal varmeterapi. Ennvidere kan en forbindelse av formel I administreres til en pasient i kombinasjon med et kjemisk cytotoksisk middel kjent innen faget for å være anvendbart ved tumor-kjemoterapi. Når en slik kombinasjonsterapi anvendes for behandling av en tumor, kan det cancerkjemoterapeutiske middel administreres ved en dosering kjent innen faget for å være effektiv for behandling av tumoren. Imidlertid kan en forbindelse av formel I fremkalle en additiv eller synergistisk effekt med et kjemoterapeutisk middel overfor en bestemt tumor. Når således slik anti-tumorkombinasjonsterapi anvendes, kan dosen av det administrerte kjemoterapeutiske middel være mindre enn hva som administreres når midlet anvendes alene. I kombinasjon med en forbindelse av formel I kan derfor det kjemoterapeutiske middel administreres ved et lavere doseringsnivå eller ved mindre hyppige intervaller sammenlignet med det kjemoterapeutiske middel når dette anvendes alene.

I kombinasjon med en forbindelse av formel I kan et hvilket som helst cancerkjemoterapeutisk middel anvendes. Legemidler som vanligvis anvendes for cancerkjemoterapi, er beskrevet i The Medical Letter, vol. 22, nr. 24 (utg. 571), 28. nov. 1980, publisert av the Medical Letter, Inc.,

New Rochalle, N.Y., 10801. Illustrative eksempler på cytotoksiske kjemoterapeutiske midler er cyclofosfamid, metho-trexat, prednison, 6-mercaptopyrin, procarbozin, daunorubicin, vincristin, vindesin, vinblastin, klorambucil, cytosin-arabinosid, 6-thioguanin, thio-TEPA, 5-fluoruracil, 5-fluor-2-deoxyuridin, 5-azacytidin, nitrogensennep, l,3-bis-(2-klorethyl)-1-nitrosourea (BCNU), 1-(2-klorethyl)-3-cyclo-hexyl-l-nitrosourea (CCNU), busulfan, adriamycin, bleomycin, cycloleucin eller methylglyoxal-bis-(guanylhydrazon)(MGBG). Andre cancerkjemoterapeutiske midler vil være kjent for fagmannen .

Effekten av forbindelsene av formel I for regulering av vekstgraden av hurtig celledelende tumorvev kan fastslås ved standard dyretumormodeller etter oral eller parenteral administrering. F.eks. kan antitumoreffektene demonstreres i følgende modeller: (a) L1210 leukemia i mus, (b) EMT 6 tumor i balb/C mus, (c) 7,12-dimethylbenzanthracen-indusert (DMBA-indusert) brysttumor i rotter, eller (d) Morris 7288 C eller 5123 hepatoma i buffalorotter. I tillegg kan antitumoreffektene av forbindelsene i kombinasjon med kjemoterapeutiske midler demonstreres i dyremodeller.

Når ved behandling av en ondartet neoplastisk sykdom,

en forbindelse av formel I administreres i kombinasjon med et kjemoterapeutisk middel, kan den terapeutiske effekt av det kjemoterapeutiske middel potensieres ved at den remisjon som fremkalles av det kjemoterapeutiske middel, kan økes, og nyvekst av tumorvevet kan nedsettes eller forhindres. Anvendelse av en slik kombinasjonsterapi tillater derfor at mindre doser eller færre individuelle doser av det kjemoterapeutiske middel kan anvendes. Således vil de uønskede og/eller svekkende bivirkninger av det kjemoterapeutiske middel nedsettes samtidig som tumoreffekten økes. Uttrykket "kombinasjonsterapi" tar i betraktning administrering av en forbindelse av formel I umiddelbart før starten av kjemoterapien, samtidig med kjemoterapien, eller i tidsrommet umiddelbart etter opphør.

Når kjemoterapi resulterer i remisjon av tumoren og

alle tumorceller ikke er ødelagt, kan nyvekst av tumoren forhindres eller nedsettes i det uendelige ved kontinuerlig behandling med en forbindelse av formel I. Således kan en forbindelse av formel I administreres for å stoppe eller ned-sette veksten av tumoren i de perioder hvor kjemoterapi under anvendelse av et cytotoksisk middel temporært kan være avbrutt.

Et foretrukket cytotoksisk middel for kombinasjonsterapi med en forbindelse av formel I er methylglyoxal-bis-(guanyl-hydrazon), heretter som angitt som MGBG, som også er en inhibitor av S-adenosylmethionin-decarboxylase. Aktiviteten av MGBG som et kjemoterapeutisk middel ved behandling av neo-plastiske sykdommer, er vel dokumentert. Eksempelvis har W. A. Knight et al. Cancer Treat. Rep., 43, 1933, (1979) rapportert at en dose av MGBG administrert intravenøst én eller to ganger i uken til pasienter i fremskredne trinn av carcinoma i blæren, esofagus, lunge, pancreas, colon, nyre, bryst og prostata, "oat cell"-carcinoma, adenocarcinoma, lymphoma, hepatoma, melanoma, leukemia eller Edwing's sarcoma, ga målbar tilbakedannelse av tumoren i mange av pasientene som ble behandlet, og fullstendig forsvinning av sykdommen i to av de 65 behandlede pasienter.

Mengden av MGBG som må administreres, kan være den samme som den mengde som er kjent innen faget for å være effektiv for tumorterapi. Effektive og ikke-toksiske doser bestemmes av legen i hvert tilfelle under hensyntagen til tilstanden av den individuelle pasient. Eksempelvis kan en dose på 250-500 mg pr. m 2 kroppsoverflate infuseres én eller to ganger i uken i 100 ml vandig 5%-ig dextroseløsning i løpet av en 30 minutters periode. Kombinasjonsterapi med en forbindelse av formel I forbedrer responsen av tumorvevet overfor den cytotoksiske effekt av MGBG og muliggjør bruk av en mindre individuell dose av MGBG og et kortere behandlings-forløp enn hva som ville være nødvendig ved anvendelse av MBGB alene.

Egnede doser av forbindelsene av formel I for anvendelse i kombinasjonsterapi med MGBG eller andre cancerkjemoterapeutiske midler kan være en hvilken som helst mengde som er effektiv til å inhibere polyamin-biosyntesen tilstrekkelig til å regulere turn rvekstgraden eller for å oppnå en for-sterket respons på det cytotoksiske middel som administreres i forbindelse med dette.

Med uttrykket "regulering av veksten av patogene parasittiske protozoa" som anvendt her, menes en nedsettelse, avbrytelse, stansing eller stopping av replikasjon av protozoa i en infisert vert. Forbindelsene av formel I er særlig anvendbare overfor T.b. brucei (som fremkaller trypanoso-miasis i kveg), T.b. rhodesiense (som fremkaller human sove-syke), coccidia, f.eks. Eimeria tenella (som fremkaller intestinal coccidiosis i fugl (f.eks. kyllinger, kalkuner og ender)) og exoerythrocytisk form av plasmodia, f.eks. plasmodium falciparum (som fremkaller human malaria).

Den antiprotozoale aktivitet av forbindelsene av

formel I kan demonstreres in vivo eller in vitro i standard mikrobiologiske testprosedyrer. F.eks. kan aktiviteten av forbindelsene overfor T.b. brucei og T.b. rhodesiense bestemmes i infiserte mus ved administrering av testforbindelsen ad lib daglig (3 til 15 dager etter infeksjon) som en løsning i drikkevannet. Aktiviteten indikeres ved en økning i over-levelsestiden (sammenlignet med ubehandlede kontrolldyr) eller ved fravær av parasitter i blodet. Aktiviteten av forbindelsene overfor coccidia kan bestemmes i infiserte kyllinger, f.eks. de som er infisert med E. tenella ved administrering av testforbindelsen daglig ad lib (fra en dag før infeksjon til 5 dager etter infeksjon) som en løsning i drikkevannet. De cecale lesjoner vurderes ved en standard lesjons-graderingsprosedyre. (Se Reid. Am. J. Vet. Res., 30, 447 (1969) og Avian Coccidiosis, P. Long. Editor, British Poultry Science, Ltd., Edinburgh). Aktiviteten av forbindelsene overfor malaria (p. faleiparum) kan bestemmes ved en standard in vitro platekulturtest (se K. Rieckmann et al., Lancet, 1, 22 (1978)). Antimalariaaktivitet kan også bestemmes i spesielle stammer av mus infisert med den exo-erythrocytiske "form av p. berghei. I denne test administreres forbindelsen ad lib i drikkevann idet man starter to dager før infeksjon og fortsetter i 28 dager etter infeksjon. Aktiviteten måles ved en signifikant nedsettelse i dødsfall sammenlignet med kontroller, eller ved en signifikant økning i overlevelsestid.

Forbindelsene fremstilt ifølge oppfinnelsen kan administreres på forskjellig måte for å oppnå den ønskede effekt.. Forbindelsene kan administreres alene eller i form av farmasøytiske preparater enten oralt eller parenteralt, f.eks. subkutant, intravenøst eller intraperitonealt.

Mengden av administrert ny forbindelse vil variere og kan være en hvilken som helst effektiv mengde. Avhengig av pasienten, den tilstand som skal behandles og administreringsmåten, kan den effektive dose av den administrerte forbindelse variere fra 5 mg/kg til 500 mg/kg, kroppsvekt av pasienten pr. dag. Enhetsdoser av disse forbindelser kan f.eks. inneholde fra 10 mg til 500 mg av forbindelsene og kan f.eks. administreres fra 1 til 4 ganger daglig.

Uttrykket "enhetsdoseringsform" anvendes her for å

angi en enkel eller multippel doseringsform inneholdende en mengde av den aktive bestanddel i blanding med eller på annen måte i assosiasjon med fortynneren eller bæreren, hvilken mengde er slik at én eller flere på forhånd bestemte enheter normalt kreves for en enkelt terapeutisk administrering.

Når det gjelder multiple doseringsformer slik som væsker " eller graderte tabletter, vil en på forhånd bestemt enhet være en fraksjon slik som en 5 ml's (teskje) mengde av en væske eller halvparten eller en kvart av en gradert tablett av den multiple doseringsform.

Farmasøytiske formuleringer fremstilles på kjent måte innen den farmasøytiske industri og omfatter vanligvis minst én aktiv forbindelse i blanding med en farmasøytisk akseptabel bærer eller fortynningsmiddel.. For fremstilling av disse formuleringer vil vanligvis den aktive bestanddel bli blandet'med en bærer, eller bli fortynnet med et fortynningsmiddel, eller' innelukket eller innkapslet i en kapsel, pose, papir eller annen beholder. En bærer eller fortynningsmiddel kan være fåst, halvfast

eller væskeformig materiale som tjener som bærer, eksipient eller medium for den aktive bestanddel. Egnede bærere eller fortynningsmidler er vel kjent.

Formuleringene kan være tilpasset enteral eller parenteral bruk og kan administreres til pasienten i form av

tabletter, kapsler, stikkpiller, løsninger, suspensjoner eller lignende.

Fremgangsmåter for fremstilling av forbindelsene av formel I

vil nå bli beskrevet. Hvis en aminogruppe av en reaktant i noen av de beskrevne reaksjonstrinn ville være involvert i en uønsket reaksjon under de relevante reaksjonsbetingelser,

vil aminogruppen være beskyttet på kjent måte ved innføring av en egnet beskyttende gruppe. Den beskyttende gruppe vil velges under hensyntagen til arten av den relevante reaksjon og enkelheten ved fjerningen av denne for å frigjøre aminogruppen. Den beskyttende gruppe kan velges fra f.eks.

acyl, f.eks. lavere alkanoyl, f.eks. acetyl, propionyl, trifluoracetyl og lignende; aroyl, f.eks. benzoyl, toluoyl og lignende; lavere alkoxycarbonyl, f.eks. methoxycarbonyl, ethoxycarbonyl, t-butoxycarbonyl og lignende; carbobenzoxy, benzensulfonyl og tosyl. Begge aminohydrogenatomene kan være substituert med en enkel beskyttende gruppe slik som f.eks. fthalyl. De beskyttende grupper innføres på kjent måte,

f.eks. ved omsetning av aminet med en lavere alkanoyl eller aroylklorid, anhydrid, sulfonylklorid, t-butoxycarbonyloxy-imino-2-fenylacetonitril (BOC-ON) eller di-t-butyl-dicarbonat ((BOC)20).

Fjerning av den beskyttende gruppe etter at reaksjonen

er fullført, kan utføres på kjent måte for den relevante beskyttende gruppe. Vanligvis vil fjerningen være en hydrolytisk splitting under anvendelse av en sterk organisk eller uorgan-

isk syre slik som f.eks. trifluoreddiksyre, saltsyre eller lignende syrer; eller med hydrogenkloridgass under vannfrie betingelser. Anvendelse av betingelser som vil redusere den umettede binding eller av reaktanter, slik som hydrobromsyre,

som vil reagere med den umettede dobbeltbinding, må unngåes. De anvendte løsningsmidler vil bli valgt avhengig av beting-eisene ved fjerning av den beskyttende gruppe. F.eks. kan ethere slik som diethylether, anvendes for splitting under anvendelse av hydrogenkloridgass.

I det tilfelle hvor en acetylenisk gruppe skal be-

skyttes, er den foretrukne beskyttende gruppe trialkyl-

silyl, spesielt trimethylsilyl, som lett kan innføres ved om-

setning av den frie acetyleniske gruppe med et trialkylsilyl-klorid. Trialkylsilylgruppen kan lett fjernes ved basehydro-lyse for å frigjøre den acetyleniske gruppe.

Analogifremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er kjenne-tegnet ved at et amino- og acetylen-beskyttet derivat av propargylamin alkyleres med et amino-beskyttet derivat av et halogenid av generell formel III:

hvori X betegner brom, klor eller jod, og

p betegner 1 eller 2,

hvoretter de beskyttende grupper fjernes.

I formel III betegner X brom, klor eller fortrinnsvis jod, og p betegner 1 eller 2..__

Den foretrukne acetylen-beskyttende gruppe er trialkyl-silyl, spesielt trimethylsilyl, og den foretrukne amino-beskyttende gruppe er t-butoxycarbonyl.

Reaksjonen forløper via carbanionet av det beskyttede propargylamin. Hensiktsmessig kan angitte carbanion dannes ved anvendelse av et overskudd av sterk base slik som et alkyllithium eller lithium-di-alkylamid, spesielt lithium-di-isopropylamid, i et aprotisk organisk løsningsmiddel, f.eks. tetrahydrofuran, ved -70°C i nærvær av et lithium-kompleks-dannende middel, f.eks. tetramethylethylendiamin.

Halogenidreaktanten tilsettes til løsningen av carbanionet fremstilt som ovenfor beskrevet for å bevirke alkyler-ingen. Hensiktsmessig er reaksjonstemperaturen ca. -70°C.

De beskyttede halogenider av formel III kan fremstilles på kjent måte fra det tilsvarende beskyttede hydroxyamin av etterfølgende formel IV:

hvori p betegner 1 eller 2.

F.eks. kan hydroxyaminet behandles med methansulfonsyreanhydrid eller paratoluensulfonylklorid under dannelse av mesyloxy-eller tosyloxyderivatet, som deretter behandles med magnesiumjodid under dannelse av det ønskede jodid.

Hydroxyaminene av formel IV kan fremstilles på kjent måte ved reduksjon av den tilsvarende syre av.formel V eller en ester derav.

hvori p betegner.1 eller 2.

Fortrinnsvis reduseres syren med diboran eller methyl-esteren reduseres med-lithiumaluminiumhydrid etter beskyttelse av aminogruppen.

Syrene av formel V er kjente, og fremstilling av disse er beskrevet i britisk,patentskrift 2058052A.

Det skal forståes at rekkefølgen av enkelte av reak-sjonstrinnene ved fremgangsmåten kan forandres.

Forbindelsene av formel I eksisterer som stereoisomerer. Metoder for separering av stereoisomerene av en bestemt forbindelse vil være kjent for fagmannen. Eksempelvis kan de individuelle optiske isomerer separeres på kjent måte under anvendelse av optisk aktive syrer eller baser. I særdeleshet kan aminogruppen lengst borte fra den fluorerte methylgruppe beskyttes under anvendelse av et (C2~C,--alkoxycarbonyl) - fthalimid i et løsningsmiddel slik som f.eks. tetrahydrofuran, diethylether eller C^-C^-alkanol, f.eks. methanol eller ethanol. Det beskyttede aminderivat oppdeles deretter under anvendelse av en chiral syre. Den oppdelte fthalimidofor-bindelse avbeskyttes deretter, f.eks. under anvendelse av hydrazin eller methylamin for å fjerne fthalimidgruppen. De således oppdelte aminer kan anvendes for å fremstille de individuelle isomerer av andre forbindelser ifølge oppfinnelsen på de her beskrevne metoder.

Forbindelsene fremstilt ved de foregående prosesser kan isoleres enten som sådanne eller som syreaddisjonssalter derav.

Syreaddisjonssaltene er fortrinnsvis de farmasøytisk akseptable, ikke-toksiske addisjonssalter med egnede syrer slik som de tidligere angitte. Bortsett fra farmasøytisk akseptable syreaddisjonssalter innbefattes også andre salter innen oppfinnelsens ramme slik som f.eks. de med picrinsyre eller oxalsyre, idet disse kan tjene som mellomprodukter ved rensing av forbindelsene eller ved fremstilling av andre, farmasøytisk akseptable syreaddisjonssalter, eller de er anvendbare for identifisering eller karakterisering av basene.

Et resulterende syreaddisjonssalt kan omdannes til den frie forbindelse etter kjente metoder, f.eks. ved behandling av denne med et alkali- eller jordalkalimetallhydroxyd eller -alkoxyd; med et alkalimetall eller jordalkalimetallcarbonat eller hydrogencarbonat; med trialkylamin eller med en anionbytterharpiks.

Et resulterende syreaddisjonssalt kan også omdannes til et annet syreaddisjonssalt etter kjente metoder, eksempelvis kan et salt med en uorganisk syre behandles med et natrium-, barium- eller sølvsalt av en syre i et egnet fortynningsmiddel, hvori et resulterende uorganisk salt er uløselig, og således fjernes fra reaksjonsmediet. Et syreaddisjonssalt kan også omdannes til et annet syreaddisjonssalt ved behandling med en anionbytterharpiks.

Oppfinnelsen illustreres ytterligere i de etterfølgende eksempler. Alle NMR-målinger er gitt på delta-skalaen (dvs. tetramethylsilan = 0).

Eksempel I

1- fluor- 2, 5- diamino- 6- heptyn- dihydroklorid

A) Fremstilling av:

4- hydroxy- 2-( N- t- butoxycarbonylamino)- 1- fluorbutan

10 ml (10 mmol) av en 1 M løsning av bortrifluorid-etherat ble tilsatt til en suspensjon av 0,75 g 3-amino-4-fluorbutansyre under tilbakeløpskjøling i løpet av 15 minutter. En løsning av diboran i tetrahydrofuran (THF) (5/5 ml sol IM, 5,5 mmol) ble tilsatt og kokt under tilbakeløps-kjøling i løpet av ytterligere 2 timer. 6 N HCl-løsning ble tilsatt, og blandingen ble konsentrert under redusert trykk. En løsning av 1,1 g (5 mmol) di-t-butyldicarbonat og 1,4 ml

(10 mmol) triethylamin i 20 ml diklormethan ble tilsatt. Løsningen ble omrørt i 12 timer ved romtemperatur, fortynnet med 100 ml ether og vasket med 2 x 50 ml vann. Tittel-alkoholen ble renset ved kolonnekromatografi (ether: petroleum-ether, 40:60).

Utbytte: 0,8 g, 80%.

NMR 1,38 (9H, s), 1,71 (2H, m), 3,5 (2H, t, J=5Hz),

4,38 (2H, dd, J1=46Hz, J2=4Hz).

Analyse for C H NO F:

B) Fremstilling av:

4- jod- 2- ( N- t- butoxycarbonylamino)- 1- fluorbutan

En løsning av 0,19 g (1,1 mmol) methansulfonsyreanhydrid i 5 ml diklormethan ble tilsatt til en isavkjølt løsning av 0,21 g (1 mmol) 4-hydroxy-2-(N-t-butoxycarbonylamino)-1-fluorbutan fremstilt som beskrevet i trinn A, og 0,16 ml (1,1 mmol) triethylamin i 5 ml diklormethan. Løsningen ble omrørt i 10 minutter ved 0°C, fortynnet med 100 ml ether og vasket suksessivt med 50 ml av en 1 N løsning av eddiksyre, en mettet vandig løsning av natriumbicarbonat og saltvann. Det organiske lag ble tørket (MgSO^) og konsentrert under redusert trykk. Det urene mesylat (0,25 g) ble fortynnet med 10 ml tørr ether og ble avkjølt til 0°C, hvorpå 20 ml (2 mmol) av en 0,1 N løsning av magnesiumjodid i ether ble langsomt tilsatt i løpet av 10 minutter. Etter ytterligere 10 minutter ved romtemperatur ble 100 ml vann tilsatt, og produktet ble ekstrahert med 2 x 50 ml ether. Det organiske lag ble tørket (MgSO^) og konsentrert under reduset trykk. Titteljodidet (0,3 g) kunne anvendes uten ytterligere rensing.

NMR 1,4 (9H, s); 2,13 (2H, m) ; 3,13 (2H, t), 3,5 (1H, m);

4,33 (2H, dd, J^tHz, J2=3Hz); ca. 5 (1H, m) .

C) Fremstilling av; 1- fluor- 2, 5- di-( N- t- butoxycarbonylamino)- 7- trimethylsilyl-6- heptyh

En løsning av 2,3 g (0,01 mol) N-t-butoxycarbonylamino-3-trimethylsilyl-prop-2-ynylamin i 10 ml tørr THF ble tilsatt til 100 ml av en THF løsning av lithium-diisopropylamin (LDA)

(0,04 mol) og 6 ml (0,04 mol) N,N,N',N'-tetramethylethylendiamin ved -78°C. Løsningen ble omrørt i 1 time ved -78°C, hvorpå en løsning av (0,01 mol) 4-jod-2-(N-t-butoxycarbonyl-amino) -1-fluorbutan erholdt i trinn B i 10 ml THF ble tilsatt. Etter 1 time ved -78°C ble 2,5 ml eddiksyre tilsatt, etterfulgt av 200 ml vann og 300 ml ether. Det organiske lag ble vasket med 3 x 100 ml vann, tørket (MgSO^) og konsentrert under redusert trykk. Den urene tittelforbindelse kunne anvendes i neste trinn uten ytterligere rensing. D) Fremstilling av:

1- fluor- 2, 5- di-( N- t- butoxycarbonylamino)- 6- heptyn

120 ml av en 0,1 M løsning av natriumhydroxyd ble tilsatt til en løsning av det urene 1-fluor-2,5-di-(N-t-butoxy-carbonylamino) -7-trimethylsilyl-6-heptyn erholdt i trinn C i 20 ml methanol ved romtemperatur. Etter 2 timer ble methanolen fordampet og 100 ml ether ble tilsatt. Produktet ble vasket med 2 x 25 ml vann og tørket (magnesiumsulfat). Tittelforbindelsen ble renset ved middeltrykks-kolonnekromatografi (ether:petroleumether, 20:80) (2 g, .60%).

NMR 1,41 (18H, s); 1,73 (4H, m); 2,26 (1H, d); 3,56 (1H, m);

4,33 (2H, dd, J1=46Hz, J2=4Hz)

Analyse for C, 7H..-N^O.F:

E) Fremstilling av:

1- fluor- 2, 5- diamino- 6- heptyn- dihydroklorid

En mettet løsning av tørr hydrogenkloridgass i 10 ml tørr ether ble tilsatt til 1-fluor-2,5-di-(N-t-butoxycarbonyl-amino) -6-heptyn erholdt i trinn D (1 mmol) og fikk stå over natten ved romtemperatur. Dihydrokloridet som ble dannet som krystaller, ble filtrert fra, vasket med ether og tørket under dannelse av 0,21 g av tittelforbindelsen.

NMR 1,96. (4H, m) ; 3,1 (1H, d, J=2Hz) ; 4,15 (2H, m) ;

ca. 4,6 (2H, dd, J1=50Hz, J2=4Hz)

Analyse for C.H NjFCl^

Eksempel 2 1, 1- difluor- 2, 5- diamino- 6- heptyn- dihydroklorid A) Fremstilling av:

4- hydroxy- 2-( N- t- butoxycarbonylamino)- 1, 1- difluorbutan

10 ml (10 mmol) av en 1 M løsning av bortrifluorid-etherat ble tilsatt til en suspensjon av 0,8 g 3-amino-4,4-difluorbutansyre under tilbakeløpskjøling i løpet av 15 minutter. En løsning av diboran i tetrahydrofuran (5,5 ml sol 1 M, 5,5 mmol) ble tilsatt og kokt under tilbakeløpskjøling i løpet av ytterligere 2 timer. 6 N HCl-løsning ble tilsatt, og blandingen ble konsentrert under redusert trykk. En løs-ning av 1,1 g (5 mmol) di-t-butyldicarbonat og 1,4 ml (10 mmol) triethylamin i 20 ml diklormethan ble tilsatt. Løsningen ble omrørt i 12 timer ved romtemperatur, fortynnet med 100 ml ether og vasket med 2 x 50 ml vann. Tittel-alkoholen ble renset ved kolonnekromatografi (ether:petrol-eumether, 40:60). Utbytte 0,85 g, 75%. B) Fremstilling av:

4- tosyl- 2-( N- t- butoxycarbonylamino)- 1, 1- difluorbutan

En løsning av 1,25 g (5 mmol) 4-hydroxy-2-(N-t-butoxy-carbonylamino) -1,1-difluorbutan erholdt i trinn A, 0,9 g (5 mmol) tosylklorid og 2,5 ml pyridin i 25 ml diklormethan ble omrørt over natten ved romtemperatur. Løsningen ble fortynnet med 100 ml ether og vasket med 2 x 50 ml av en 1 N løs-ning av eddiksyre. Det vandige lag ble tørket (MgSO^) og konsentrert under redusert trykk. Titteltosylatet ble krystallisert i ether:pentan (1,5 g).

NMR 1,42 (9H, s); 1,91 (2H, rn) ; 2,41 (3H, s) ; 3,58 (1H, m) ;

4,08 (2H, t); 5,25 (1H, td, J1=26Hz, J2=2Hz); 7,41 (4H, m) Analyse for C^gH^-NSOgF»:

C) Fremstilling av:

4-jod-2-( N- t- butoxycarbonylamino)- 1, 1- difluorbutan

En løsning av 0,37 g (1,1 mmol) av tosylatet erholdt i trinn B i 5 ml ether ble tilsatt til en isaykjølt løsning av magnesiumjodid i ether (20 ml, 0,1 N, 2 mmol). Etter 10 minutter ved 0°C ble løsningen vasket med 100 ml vann, tørket

(MgS04) og konsentrert under redusert trykk. Titteljodidet (0,31 g) kunne anvendes for den etterfølgende alkylering uten ytterligere rensing.

NMR 1,43 (9H, s); 2,16 (2H, m); 3,2 (2H, t); 4,05 (1H, m);

5,76 (1H, td, J1=54Hz, J2=3Hz); 4,66 (1H, m).

D) Fremstilling av: 1, 1- difluor- 2, 5- di-( N- t- butoxycarbonylamino)- 7- trimethylsilyl- 6- heptyn

En løsning av 2,3 g (0,01 mol) N-t-butoxycarbonylamino-3-trimethylsilyl-prop-2-ynylamin i 10 ml tørr THF ble tilsatt til 100 ml av en THF-løsning av 0,04 mol LDA og 6 ml (0,04 mol) N,N,N<1>,N'-tetramethylethylendiamin ved -78°C. Løs-ningen ble omrørt i 1 time ved -78°C, hvorpå en løsning av (0,01 mol) 4-jod-2-(N-t-butoxycarbonylamino)-1,1-difluorbutan erholdt i trinn C i 10 ml THF, ble tilsatt. Etter 1 time ved -78°C ble 2,5 ml eddiksyre tilsatt etterfulgt av tilsetning av 200 ml vann og 300 ml ether. Det organiske lag ble vasket med 3 x 100 ml vann, tørket (MgS04) og konsentrert under redusert trykk. Det urene tittelprodukt kunne anvendes i neste trinn uten ytterligere rensing. E) Fremstilling av:

1, 1- difluor- 2, 5- di-( N- t- butoxycarbonylamino)- 6- heptyn

120 ml av en 0,1 M løsning av natriumhydroxyd ble tilsatt til en løsning av det urene 1,1-difluor-2,5-di-(N-t-butoxycarbonylamino) -7-trimethylsilyl-6-heptyn erholdt i trinn D i 20 ml methanol ved romtemperatur. Etter 2 timer ble methanolen fordampet, og 100 ml ether ble tilsatt. Produktet ble vasket med 2 x 25 ml vann og ble tørket (MgS04) .. Tittelforbindelsen ble renset ved middelstrykk-kolonnekromatografi (ether:petroleumether, 20:80) (1,9 g, 53%).

NMR 1,41 (18H, s); 1,75 (4H, m); 2,28 (1H, d, J=2Hz);

3,83 (1H, m); 5,66 (1H, td, Jt=55Hz, Jd=2Hz)

Analyse for <ci>7<H>2<HN>2°4<F>2<:>

F) Fremstilling av:

1, 1- difluor- 2, 5- diamino- 6- heptyn- dihydroklorid

En mettet løsning av tørr hydrogenkloridgass i 10 ml

tørr ether ble tilsatt til 1,1-difluor-2,5-di-(N-t-butoxy-carbonylamino) -6-heptyn erholdt i trinn E (1 mmol) og fikk stå ved romtemperatur over natten. Diklorhydratet som ble

dannet som krystaller, ble filtrert, vasket med ether og tørket under dannelse av tittelforbindelsen (0,2 3 g) . Analyse:

Den ODC-inhiberende aktivitet av forbindelsene av formel I kan demonstreres in vivo etter følgende prosedyre: Hanrotter av Sprague-Dawley-stammen (200-2 20 g kroppsvekt) ervervet fra Charles River, ble gitt mat og drikke ad lib under en konstant 12 timers lys - 12 timers mørke-syklus. Legemidler ble injisert intraperitonealt (oppløst i 0,9% saltvann) eller ble gitt ved sonde (oppløst i vann). Rotter gitt saltvann eller vann, tjente som kontroll.

5 til 6 timer etter legemiddeladministrering ble dyrene av-livet ved halshugging, og venetral prostata og tymus ble hurtig skåret ut og umiddelbart bearbeidet. Vevet ble homo-genisert med 3 volumer 30 mM natriumfosfatbuffer (pH 7,1) inneholdende 0,1 mM EDTA, 0,2 5 M sucrose, 0,1 mM pyridoxal-fosfat og 5 mM dithiothreitol. Ornithin-decarboxylase-aktiviteter ble bestemt på en 1000 g supernatant av prostata-homogenat og på hele tymushomogenatet, hovedsakelig som beskrevet av Ono et al. (Biochem. Biophys. Acta, 284, 285

(1972)).

Aktiviteten av forbindelsene av formel I som inhibitorer av ornithin-decarboxylase (ODC) kan demonstreres in vitro etter følgende prosedyre: Ornithin-decarboxylase (ODC) ble fremstilt fra leveren av rotter som var blitt injisert med thioacetamid (150 mg/kg kroppsvekt) 18 timer før avliving og ble renset ca. 10 ganger ved syrebehandling ved pH 4,6 som beskrevet av Ono et al.

(Biochem. Biophys. Acta 284, 285 (1972)). Lagerløsningen av ODC var sammensatt av 16 mg/ml protein, 30 mM natriumfosfat-, buffer (pH 7,1), 5 mM dithiothreitol og 0,1 mM pyridoxal-fosfat. Den spesifikke aktivitet av denne lagerløsning er 0,12 nmol C02/minutt pr. mg protein. For et typisk forsøk ble 320^/ul av denne lagerløsning blandet ved et tidspunkt 0 med 80/ul av en løsning av inhibitoren i vann og ble inkubert

ved 37°C. På forskjellige tidspunkter ble 5Cyul alikvoter overført til et 1 ml's forsøksmedium inneholdende natriumfosfat (30 mM, pH 7,1), dithiothreitol (5 mM), pyridoxal-fosfat (0,1 mM), L-ornithin (0,081^umol) og DL-[1- 14C]-ornithin (0,04 3^umol, 58 Ci/mol, Amersham) i et lukket kar hvori et filterpapir fuktet med 50/Ul hyaminhydroxyd (1 M) var anordnet. Reaksjonen fikk forløpe i 60 minutter ved 37 oC og ble deretter avsluttet ved tilsetning av 0,5 ml 40%-ig tri-kloreddiksyre. Etter ytterligere 30 minutter ble CO2 absor-bert på filterpapiret tellet i en standard scintillasjons-væske. K^. (tilsynelatende dissosias jonskonstant) og T50 (halveringstid, ved uendelig konsentrasjon av inhibitor) ble beregnet etter metoden ifølge Kitz og Wilson (J. Biol. Chem., 237, 3245 (1962)).

Når forbindelsene ifølge eksempel 1 og 2 ble testet ved den ovenfor angitte prosedyre, utviste disse de resultater som er vist i det etterfølgende. Halveringstid (t^-) ved lO^uM er også angitt.

Claims (2)

1. Analogifremgangsmåte for fremstilling av et terapeutisk aktivt fluorert diaminoheptynderivat av generell formel I: hvori Y betegner CH=C-, og p betegner 1 eller 2, eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav, karakterisert ved at et amino- og acetylen-beskyttet derivat av propargylamin alkyleres med et amino-beskyttet derivat av et halogenid av generell formel III: hvori X betegner brom, klor eller jod, og p betegner 1 eller 2, hvoretter de beskyttende grupper fjernes.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1 for fremstilling av 2,5-diamino-6-heptyn eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav, karakterisert ved at N-t-butoxy-carbonylamino- 3-trimethylsilyl-prop-2-ynylamin alkyleres med 4-jod-2-(N-t-butoxycarbonylamino)-1-fluorbutan hvoretter de beskyttende grupper fjernes, og den erholdte forbindelse, om ønskes, overføres til et farmasøytisk akseptabelt salt derav.