NO145247B - Fremgangsmaate for fremstilling av clavulansyre - Google Patents

Fremgangsmaate for fremstilling av clavulansyre Download PDF

Info

Publication number
NO145247B
NO145247B NO751407A NO751407A NO145247B NO 145247 B NO145247 B NO 145247B NO 751407 A NO751407 A NO 751407A NO 751407 A NO751407 A NO 751407A NO 145247 B NO145247 B NO 145247B
Authority
NO
Norway
Prior art keywords
clavulanic acid
lactamase
medium
acid
culture
Prior art date
Application number
NO751407A
Other languages
English (en)
Other versions
NO751407L (no
NO145247C (no
Inventor
Martin Cole
Thomas Trevor Howarth
Christopher Reading
Original Assignee
Beecham Group Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=27448389&utm_source=***_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=NO145247(B) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Priority claimed from GB17410/74A external-priority patent/GB1508977A/en
Application filed by Beecham Group Ltd filed Critical Beecham Group Ltd
Publication of NO751407L publication Critical patent/NO751407L/no
Publication of NO145247B publication Critical patent/NO145247B/no
Publication of NO145247C publication Critical patent/NO145247C/no

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/18—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing at least two hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system, e.g. rifamycin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/18—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing at least two hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system, e.g. rifamycin
    • C12P17/188—Heterocyclic compound containing in the condensed system at least one hetero ring having nitrogen atoms and oxygen atoms as the only ring heteroatoms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A61K31/42—Oxazoles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A61K31/425—Thiazoles
    • A61K31/429—Thiazoles condensed with heterocyclic ring systems
    • A61K31/43—Compounds containing 4-thia-1-azabicyclo [3.2.0] heptane ring systems, i.e. compounds containing a ring system of the formula, e.g. penicillins, penems
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D498/00—Heterocyclic compounds containing in the condensed system at least one hetero ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D498/02—Heterocyclic compounds containing in the condensed system at least one hetero ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms in which the condensed system contains two hetero rings
    • C07D498/04—Ortho-condensed systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D503/00—Heterocyclic compounds containing 4-oxa-1-azabicyclo [3.2.0] heptane ring systems, i.e. compounds containing a ring system of the formula:, e.g. oxapenicillins, clavulanic acid derivatives; Such ring systems being further condensed, e.g. 2,3-condensed with an oxygen-, nitrogen- or sulfur-containing hetero ring
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/465—Streptomyces
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Nitrogen And Oxygen Or Sulfur-Condensed Heterocyclic Ring Systems (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

Oppfinnelsen tilveiebringer en fremgangsmåte for fremstilling av clavulansyre og salter derav, og denne fremgangsmåte omfatter dyrkning av en stamme av Streptomyces clavuligerus og utvinning av clavulansyre eller et salt derav fra dyrkningsmedi-
et ved i og for seg kjente metoder.
Fortrinnsvis anvendes Streptomyces clavuligerus ATCC 27064 ved fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen.
Streptomyces clavuligerus er beskrevet i detalj av Higgens m.fl. i Int. J. Systematic Bacteriology, 2/ L, 326 (1971). Denne streptomycet var av interesse fordi den produserte visse (3-laktam-antibiotika, f.eks. penicillin N, 7-(5-amino-5-karboksy-valer-amido)-3-karbamoyloksymetyl-3-cefem-4-karboksylsyre og 7-(5-amino-5-karboksyvaler-amido)-3-karbamoyloksymetyl-7-met-oksy-3-cefem-4-karboksylsyre. Streptomyceten er deponert i Agricultural Research Service Collection som NRRL 3585 og i American Type Culture Collection som ATCC 27064. Streptomyces clavuligerus er også blitt referert til i US-patent 3 770 590
og også av Nagarajan m.fl. i J. Amer. Chem. Soc . , 9_3, 2308 (1971), Brannon m.fl. i Antimicrob. Agents Chemother., 1, 237 (1972) og Antimicrob. Agents Chemother., 1, 247 (1972) og Higgens m.fl.
i J.Antibiotics, 27, 298 (1974).
(3-laktamaser er enzymer som åpner |3-laktamringen i penicilliner og cefalosporiner slik at man får produkter som er blottet for antibakteriell aktivitet. Disse enzymer produseres av mange bakterier, spesielt arter eller stammer av Escherichia, Klebsiella, Proteus, Pseudomonas, Enterobacter og Staphylococcus, og er i mange tilfeller forklaringen på resistensen hos visse stammer av slike organismer overfor noen penicilliner og cefalosporiner. Betydningen av |3-laktamase-produksjonen kan forståes når man erkjenner at en stor andel av klinisk isolerte organismer produserer |3-laktamaser (se f.eks.- M.Wilson og I.A. Freeman i Bacteriological Proceedings, 80 (1969) hvor i en ar-tikkel med tittelen "penicillin-inaktivering ved hjelp av Gram-negative basiller" forfatterne viser at 84 % av de Gram-negati-
ve organismer som er isolert i et amerikansk hospital, produser-
te 3-laktamase). I mange tilfeller er noen penicilliner eller cefalosporiner ineffektive med hensyn til behandling av sykdommer som tilskrives ikke-3-laktamase-produserende organismer, på
grunn av den vanlige forekomst av ko-infeksjon av en 3-laktamase-produsent [se f.eks. R.May m.fl. i Brit.J.Dis.Chest., 661 185
(1972)]. Kombinasjonen av en 3-laktamase-inhiberende substans med et penicillin eller cefalosporin kan forventes å beskytte sistnevnte mot nedbrytning av bakteriell 3-laktamase og derved forbedre deres antibakterielle aktivitet overfor mange ineffektive organismer. Denne prosess med hensyn til å forbedre den antibakterielle aktivitet kalles synergisme når den antibakterielle aktivitet av kombinasjonen er godt i overskudd av den enk-le addisjon av aktivitetene til de to separate substanser. Den
3-laktamase-inhiberende komponent i blandingen kalles synergist, og slike substanser er verdifulle med hensyn til å øke den antibakterielle aktivitet hos penicilliner og cefalosporiner mot re-sistente organismer. Det er et av formålene ved foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe slike synergister.
Eksempler på anvendelse av visse 3-laktamase-resisten-te halvsyntetiske penicilliner og cefalosporiner som 3-laktamase-inhibitorer og synergister for penicilliner og cefalosporiner er. allerede beskrevet i litteraturen, se f.eks. Sutherland m.fl. i Nature, 201, 868 (1964); Sabath m.fl. i Nature, 204, 1066 (1964); 0'Callaghan m.fl. i Antimicrob. Agents and Chemotherapy, 1968, 67 (1969). Imidlertid har ingen av disse kjente midler noen dra-matisk effekt på spektret til det annet antibiotikum som er til stede i blandingen.
Visse aktinomycetkulturer er beskrevet som produsenter av 3-laktamase-inhiberende substanser som opptrer synergistisk med penicilliner eller cefalosporiner, f.eks. de kulturer som er åpenbart i britisk patentskrift 1 363 075, og de som er beskrevet av Hata m.fl. i J.Antibiotics, 25_, 473 (1972) og Umezawa m.fl. i J.Antibiotics, 2_6, 51 (1973). Ingen av disse 3-laktamase-inhibitorer av aktinomycetisk opprinnelse er hittil funnet nyttige i det kliniske arbeid. Spesielt bemerkelsesver-dige trekk som adskiller clavulansyre fra andre 3-laktamase-inhibitorer av aktinomycetisk opprinnelse, er dens ekstraherbar-het i organiske løsningsmidler fra dyrkningsfiltrat ved pH 2, dens -høye stabilitet i menneskeblod og dens brede spektrum av antibakteriell og 3-laktamase-inhiberende aktivitet, dens lave molekylvekt og dens høye R^-verdier i papirkromatografering
under anvendelse av et utvalg av løsningsmiddelsystemer.
Vi har oppdaget at den aerobe dyrkning av Streptomyces clavuligerus i konvensjonelle næringssubstrater ved ca. 25-30°C under grovt sett nøytrale betingelser produserer en 3-laktamase-inhiberende substans som også er i besittelse av antibakteriell aktivitet. Dette nye materiale er betegnet "clavulansyre".
Clavulansyre har følgende egenskaper:
(a) Den er en karboksylsyre.
(b) Den danner et natriumsalt som har et karakteristisk infra-rødt spektrum i alt vesentlig som vist i figur 1. (c) Den har evne til å inhibere vekst av stammer av
Staphylococcus aureus.
(d) Den har evne til å synergisere den antibakterielle effekt av ampicillin mot 3-laktamase-produserende stammer av Escherichia coli, Klebsiella aerogenes og Staphylococcus
aureus.
(e) Den har evne til å synergisere den antibakterielle effekt av cefaloridin mot de 3-laktamase-produserende stammer av
Proteus mirabilis og Staphylococcus aureus.
(f) Den danner en metylester med molekylvekt (bestemt ved massespektroskopi) 213,0635, hvilket tilsvarer formelen C9HllfV
Således kan clavulansyre betraktes som en énbasisk karboksylsyre av formel CgHgNO^ som i form av sitt natriumsalt har et karakteristisk infrarødt absorpsjonsspektrum i alt vesentlig som vist i figur 1.
Den forbindelse som produseres av Streptomyces clavuligerus med de ovennevnte egenskaper, har formel (II):
Således kan clavulansyre betegnes 3-(3-hydroksyetyli-den)-7-okso-4-oksa-l-azabicyklo[3,2,0]heptan-2-karboksylsyre.
Stereokjemien ved C^ og C2 i clavulansyren er den samme som den man finner hos naturlig forekommende penicilliner og cefalosporiner, slik at clavulansyre kan representeres ved strukturformel (I):
Således er et mer fullstendig kjemisk navn på clavulansyre Z-(2R,5R)-3-(3-hydroksyetyliden)-7-okso-4-oksa-l-azabicyklo-[3,2,0]heptan-2-karboksylsyre.
Den store nytte ved clavulansyre vil lett forståes når det innsees at visse stammer av Klebsiella aerogenes A, hvis vekst ikke inhiberes ved nærvær av 125 yg/ml ampicillin, amoxy-cillin, carbenicillin eller benzylpenicillin eller ved nærvær av 10 yg/ml clavulansyre, inhiberes ved nærvær av mindre enn 12,5 yg/ml av de tidligere omtalte penicilliner når 5 yg/ml clavulansyre også er til stede. Det er også funnet at stammer av Staphylococcus aureus Russell, hvis vekst ikke inhiberes ved nærvær av 100 yg/ml ampicillin eller av 5 yg/ml clavulansyre, inhiberes ved nærvær av mindre enn 10 yg/ml ampicillin i nærvær av 1 yg/ml clavulansyre. Ved tester på hunn-mus er det funnet at blod- og vevspeil av clavulansyre betydelig i overskudd av 5 yg/ml lett kan oppnås ved subkutan administrering av 100 mg/kg av natriumsaltet av clavulansyre og at brukbare konsentrasjoner av clavulansyre kan oppnås etter oral administrering av 100 mg/ kg av natriumsaltet av clavulansyre.
Følgelig tilveiebringer oppfinnelsen clavulansyre som tidligere beskrevet, samt dens salter.
Saltene av clavulansyre er som regel farmasøytisk akseptable salter som f.eks. natrium-, kalium-, kalsium-, magne-sium-, aluminium-, ammonium- og substituerte ammoniumsalter såsom trimetylammonium-, benzatin-, prokain- og lignende salter som konvensjonelt dannes med penicilliner eller cefalosporiner. Ikke-farmasøytisk akseptable salter av clavulansyre er nyttige mellomprodukter ved fremstilling av estere av clavulansyre, f. eks. litium- eller sølvsaltene av clavulansyre som kan omsettes med benzylbromid for dannelse av den nyttige benzylester av clavulansyre.
Salter av clavulansyre har tendens til å være mer sta-bile enn mor-syren og danner således foretrukne produkter av fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen. Spesielt egnede salter av clavulansyre omfatter natrium- og kaliumsaltene som har henholdsvis formel (III) og (IV) :
Krystallinske former av slike salter kan inneholde hydratvann.
Slik det her brukes betyr uttrykket "dyrkning" den tilsiktede aerobe vekst av en clavulansyre-produserende organisme i nærvær av assimilerbare kilder av karbon, nitrogen og mineralsalter. En slik aerob vekst kan finne sted i et fast eller halvfast næringsmedium, eller i et flytende medium hvor nærings-saltene er oppløst eller suspendert. Dyrkningen kan finne sted på en aerob overflate eller ved neddyppet kultur. Næringsmedi-et kan bestå av komplekse næringssalter eller kan være kjemisk definert. Søkeren har på sin side funnet medier som inneholder komplekse næringssalter, f.eks. gjærekstrakt, soyabønnemel og lignende, å være spesielt egnet.
De næringsmedier - også kalt substrater - som kan anvendes for dyrkning av Streptomyces clavuligerus, kan inneholde 0,1-10 % av en kompleks organisk nitrogenkilde, f.eks. gjærekstrakt, maisstøpvæske, vegetabilsk protein, frøprotein, hydrolysater av slike proteiner, melkeproteinhydrolysater, fis-ke- og kjøtt-ekstrakter og hydrolysater, f.eks. peptoner. Al-ternativt kan det anvendes slike kjemisk definerte nitrogenkil-der som urinstoff, amider, enkelte eller blandinger av vanlige aminosyrer, f.eks. valin, asparagin, glutaminsyre, prolin og fenylalanin. 0,1-5 % karbohydrat kan inkluderes i substratene, men glukose er uønsket i visse substrater, da det har en nedset-tende effekt på utbyttet av den ønskede clavulansyre. Stivelse eller stivelsehydrolysater, f.eks. dekstrin, sukrose, lakto-se eller andre sukkerarter eller glycerol eller glycerolestere kan også anvendes. Karbonkilden kan også stamme fra vegetabil-ske oljer eller animalske fett. Karboksylsyrer og deres salter kan inkluderes som karbonkilde for vekst og produksjon av
3-laktamase-inhibitorer. Et spesielt egnet, billig substrat er et som inneholder soyabønnemel ("Arkasoy") pluss tørket malt-destillator-løselig materiale ("Scotasol") pluss dekstrin.
Tilsetning av antiskummemidler,-f . eks. "Piuronic"
L81, kan være nødvendig for å regulere skumming av visse substrater i fermentatorer.
Slike mineralsalter somNaCl, KC1, MgCl„, ZnCl0, FeCl., , Na2S0^, FeS04, MgS04 og Na <+> - eller K +-salter av fosforsyre kan tilsettes til de ovenfor beskrevne substrater spesielt hvis de er kjemisk definert; CaCO^ kan tilsettes som kilde for Ca ioner eller for å gi pufringsvirkning. Salter av sporelementer, for eksempel nikkel, kobolt eller mangan, kan også inkluderes. Vitaminer kan tilsettes om så ønskes.
Dyrkning av Streptomyces clavuligerus finner normalt sted i temperaturområdet 15-40°C, vanligvis 20-35°C og fortrinnsvis 25-30°C og ved en pH-verdi på mellom 5 og 8,5, fortrinnsvis mellom 6 og 7,5.
Streptomyces clavuligerus kan dyrkes i de ovenfornevnte substrater i koniske kolber av glass, som luftes ved rysting på roterende rystemaskin eller i fermentatorer av rustfritt stål utstyrt med ledeplater og omrørt med skiveformede skovlhjul utstyrt med vinger og luftet med en spreder. Fermenteringen kan også utføres på kontinuerlig måte.
Utgangs-pH-verdien ved fermenteringen er typisk 7,0, og maksimalt utbytte av clavulansyre oppnås i løpet av 2-10 dager ved 20-35°C. I en fermentator av rustfritt stål med omrøring, hvor det anvendes det "Arkasoy"/"Scotasol"/dekstrin-medium som det er henvist til ovenfor, er den foretrukne temperatur 26°C,
og topp-ytelser med hensyn til clavulansyre oppnås i løpet av 5 dager.
Clavulansyre kan ekstraheres fra dyrkningsfiltrat ved hjelp av en rekke metoder. Løsningsmiddel-ekstraksjon fra koldt dyrkningsfiltrat justert til sure pH-verdier, og fremgangsmåter basert på den anioniske natur av metabolitten, såsom anionebytte-harpikser har vist seg å være spesielt nyttige. Cellene til Streptomyces clavuligerus fjernes normalt først fra fermenteringen ved filtrering eller s.entrifugering før slike ekstraksjons-prosesser påbegynnes.
Ved løsningsmiddel-ekstraksjonsprosessen kjøles dyrkningsfiltratet^ og pH-verdien senkes til området pH 2-3 ved tilsetning av syre mens man blander grundig wed et organisk løsningsmiddel som ikke er blandbart med vann, for eksempel n-butylacetat, metylisobutylketon, n-butanol eller etylacetat. Syren som anvendes for å senke pH-verdien i substratet, er normalt en mineralsyre, for eksempel saltsyre, svovelsyre og salpetersyre, fosforsyre eller en lignende syre. n-butanol er et spesielt egnet løsningsmiddel for anvendelse ved ekstraksjon av det surgjorte dyrkningsfiltrat. Etter separering av fasene ved hjelp av sentr i fuger ing tilbake-ekstraheres den /3-laktamase-inhiberende metabolitt fra løsningsmiddelfasen inn i vandig natriumbikarbonat eller kaliumhydrogenfosfatpuffer, CaCO^-suspensjon eller vann mens man opprettholder pH-verdien ved tilnærmet nøytralitet, for eksempel ved pH 7,0. Denne vandige ekstrakt kan etter separering av fasene konsentreres under redusert trykk og frysetørkes slik at man får et rått preparat av et salt av clavulansyre. Dette preparat er stabilt når det lagres som et tørt, fast stoff ved -20°C.
I anionebytteharpiks-prosessen perkoleres det klarnede dyrkningsfiltrat ved en tilnærmet nøytral eller svakt sur pH-verdi, for eksempel pH 6-7, ned en kolonne med svak eller sterk base-anionbytteharpiks, for eksempel henholdsvis "Amberlite"
IR4B eller "Zerolit" FFIF inntil harpiksen er mettet og det /3-laktamase-inhiberende materiale strømmer ut fra bunnen. Kolonnen vaskes så med vann og elueres med vandig natriumklorid. De /3-laktamase-inhiberende fraksjoner oppsamles, gjøres voluminøse, avsaltes og frysetørkes slik at man får et rått, fast salt av clavulansyre.
"Amberlite"IR4B er et eksempel på en svakt basisk anionebytteharpiks med polyamin-aktive grupper og tverrbundet"polystyren/ divinylbenzen-grunnmasse. "Zerolite" FFIP" er en sterkt basisk anionebytteharpiks med kvaternære ammonium-aktive grupper og en tverrbundet polyvinyl/divinylbenzen-grunnmasse. Harpikser i lik-het med "Zerolite" FFIP inkluderer "Isopor" FFIP og "DeAcidite" FFIP SRA.64. Disse harpikser markedsføres av BDH Chemicals Ltd., Poole, Dorset, Storbritannia.
En alternativ form av ekstraksjonsprosessen er å bringe dyrkningsfiltratet (vanligvis ved tilnærmet nøytral pH-verdi) som inneholder et salt av clavulansyre, i kontakt med en organisk
fase i hvilken et vann-uløselig amin er oppløst. Egnede organiske løsningsmidler inkluderer slike konvensjonelle polare løsnings-midler som ikke er blandbare med vann, som metylisobutylketon,
trikloretylen og lignende. Egnede aminer inkluderer sekundære eller tertiære aminer hvor én av substituentgruppene er en lang-kjedet alifatisk gruppe, for eksempel med 12-16 karbonatomer, og den annen er en tertiær-alkylgruppe slik at molekylet er lipofilt. Søkeren har funnet at "Amberlite" LA2 er et vellykket amin. Normalt anvendes aminet i form av sitt syreaddisjonssalt.
Etter denne ekstraksjonsprosess er clavulansyren til stede i den organiske fase som aminsalt. Den organiske fase separeres så fra dyrkningsfiltratet. Clavulansyren kan tilbake-ekstraheres inn i en vannfase ved hjelp av en saltløsning, fortrinnsvis en konsentrert løsning av natriumklorid, natriumnitrat eller lignende. Det rå salt av clavulansyre kan så oppnås ved frysetørking eller lignende.
Andre primære isolasjonsmetoder som kan anvendes, inkluderer konvensjonelle metoder, for eksempel adsorpsjon på karbon, utfelling, utsalting og molekylfiltrering, men disse metoder er vanligvis ikke så vellykket som de ovenfor beksrevne metoder, som foretrekkes.
Ytterligere rensning av det rå fast-stoff som oppnås ved fremgangsmåtene som er beskrevet ovenfor, kan oppnås ved hjelp av en rekke metoder, men ionebyttekolonnekromatografi er spesielt godt egnet, spesielt ved anvendelse av "Isopor", "DeAcidite" FFIP, SRA64 eller DEAE cellulose. "DeAcidite"-kolonnen kan gradient-elueres med vandig løsning av et salt, for eksempel natriumklorid (0-0,5m). Søylen av "DEAE"-cellulose i O.Olm fosfatpuffer ved pH 7 kan elueres med en saltløsning, normalt en NaCl-løsning (0-0,2m NaCl i 0,0lm fosfatpuffer pH 7). Aktive fraksjoner kan påvises ved hjelp av sin Ø-laktamase-inhiberende aktivitet og sin antibakterielle aktivitet overfor Klebsiella aerogenes i en agar-diffusjonsanalyse. Fraksjonene som inneholder hovedmengden av denne aktivitet, kombineres så og konsentreres til et lite volum under vakuum. Dette råpreparat av clavulansyresaltet avsaltes ved perkolering ned en kolonne av "Bio Gel P2". ("Bio Gel P2"
er et eksempel på en høyt lipofil harpiks på hvilken organiske materialer kan adsorberes , men som ikke holder tilbake uorganiske salter. "Bio Gel P2" er en polyakrylamid-gel som leveres av Bio Rad, 32nd and Griffen Avenue, Richmond, Ca 94804, U.S.A.). Det aktive avsaltede materiale konsentreres så, blandes med etanol og kromatograferes ytterligere på en cellulose-kolonne under anvendelse av butanol/etanol/vann 4/1/5 vol./vol. toppfase som løsningsmiddel.
Fraksjoner som inneholder materiale som inhiberer Escherichia coli /3-laktamase gjøres voluminøse, inndampes til tørrhet under vakuum, gjenoppløses i vann og frysetørkes slik at man får et salt av clavulansyre som et hvitt, fast stoff.
De fremgangsmåter som er funnet mest nyttige ved påvisning av clavulansyre i dyrkningsfiltrater, er papirkromatografi og et bioautografisk påvisningssystem. Clavulansyre kan påvises ved å gjøre bruk av dens /3-laktamase-inhiberende aktivitet. Tynnsjiktkromatografi kan anvendes for påvisning av clavulansyre i faste preparater. Disse påvisnings- og analyse-prosesser er beskrevet 'senere i denne beskrivelse.
Beskrivelse 1
Analyse som er egnet for påvisning av clavulansyre
Prinsippet ved analysen
Løsninger som inneholder clavulansyre (dyrkningsfiltrat, prøver fra isolasjonsprosessen og lignende) inkuberes i 15 minutter med et /3-laktamase-preparat i 0,05m fosfatpuffer ved pH 7 og 37°C. 1 løpet av dette tidsrom inntrer enzym-inhibering eller -inaktivering. Substrat (benzylpenicillin) tilføyes så og inkuberingen fortsetter i 30 minutter ved 37°C. Mengden av enzymned-brytning av substratet til penicilloinsyre bestemmes ved hydroksylaminanalysen for penicillin. Mengden av /3-laktamase som anvendes, er slik at man får 75 % hydrolyse av benzyl-penicillinet i løpet av 30 minutter ved 37°C.
Graden av hydrolyse er en gjenspeiling av den enzym-mengde som forblir u-inhibert. Resultatene uttrykkes som prosent inhibering av enzym-aktiviteten ved en gitt fortynning av den clavulansyre-holdige løsning (for eksempel dyrkningsfiltrat)
eller konsentrasjonen av clavulansyre (^ug/ml) som gir 50 % inhibering av enzymet under de ovenfor angitte betingelser (I^q)•
ff- laktamase- enzym
Den /3-laktamase som produseres av Escherichia coli JT4, anvendes som enzym. Denne kultur er en ampicillin-resistent stamme og skylder sin resistens produksjonen av en R-faktor-
styrt /3-laktamase. Andre lignende R-faktor-styrte /3-laktamaser kan anvendes om så ønskes.
Kulturen som holdes på skråkulturer av næringsagar, in-okuleres i 400 ml sterilt trypton-medium som inneholdes i en 2 liter konisk kolbe. Dette medium har følgende sammensetning: Trypton ("Oxoid") 32 g/l, gjærekstrakt ("Oxoid") 20 g/l, NaCl 5 g/l og CaCl26H20 2,2 g/l. Den endelige pH-verdi ble justert til 7,4 med fortynnet NaOH. Kolben rystes ved 25 C i 20 timer på en roterende rystemaskin ved 240 o.p.m.
Bakteriecellene oppsamles ved sentrifugering, vaskes
med 0,05m fosfatpuffer pH 7 (resuspendert og sentrifugert) og resuspenderes i vann slik at man får en cellekonsentrasjon som er 25 ganger den som er i dyrkningsmediet. Denne cellesuspensjon ble så oppbrutt i en MSE ultrasonisk desintegrator ved 4°C. Celle-avfallet ble fjernet ved sentrifugering, og alikvoter av den over-
stående væske lagret i dypfrossen tilstand. For anvendelse i analyseprosessen fortynnes den overstående væske i 0,005m fosfatpuffer til den gir ca. 75 % hydrolyse av en 1 mg/ml løsning av benzylpenicillin i løpet av 30 minutter ved 37°C.
Analysemetode
Egnede fortynninger av inhibitorpreparatet og Ø-laktamase-løsningen blandes og inkuberes ved 37°C i 15 minutter ' (test).
En kontrollprøve med puffer istedenfor inhibitorpreparat inkuberes også. Benzylpenicillinløsning (substrat) tilsettes så til testen og kontrollblandingene, og inkuberingen fortsettes i ytterligere 30 minutter ved 37°C. Det resterende benzylpenicillin i hver blanding anslås så under anvendelse av den hydroksylaminanalyse som er beskrevet av Batchelor m.fl. Proe. Roy. Soc, B 154, 498
(1961). 6 ml hydroksylamin-reagens tilsettes til alle tester, kontrollprøver og blindprøver og tillates å reagere i 10 minutter ved romtemperatur før tilsetning av 2 ml ferri-ammoniumsulfat-reagens. Absorpsjonen av de endelige løsninger måles i et "E.E.L." kolorimeter eller et spektrofotometer ved 490 nm mot reagens-blindprøven. Sammensetningen av reaksjonene, testene og blind-prøvene før hydroksylamin-analysen er som følger:
Beregning av resultatene
Den prosentvise inhibering av /3-laktamasen beregnes på følgende måte:
Absorpsjon av benzylpenicillin-blindprøve minus absorpsjon av kontrollprøven (u-inhibert reaksjon) = x Absorpsjon av test (inhibert reaksjon) minus absorpsjon av kontrollprøven (u-inhibert reaksjon) = y
For oppnåelse av I5Q-verdien fortynnes inhibitor-preparatet til
50 % inhibering av /3-laktamase-inaktiveringen av benzylpenicillin oppnåes i ovennevnte prosess.
Beskrivelse 2
Papirkromatografisk påvisning av clavulansyre
Dyrkningsfiltrat og en referanseløsning av clavulansyre (250 ^ug/ml delvis renset preparat) avsettes som flekker (20 ^ul/ opprinnelse) på 1 cm brede papirstrimler av "Whatman" nr. 1. Kromatogrammene kjøres ved hjelp av nedadgående kromatografi i
16 timer ved 5°C under anvendelse av n-butanol/isopropanol/vann, 7/7/6 vol./vol. som løsningsmiddel. Strimlene tørkes ved 40°C
og legges på agarplater som inneholder 6 yug/ml benzylpenicillin, og kimdannes med en /3-laktamase-produserende stamme av Klebsiella aerogenes (synérgisme-system). Platene inkuberes natten over ved 30°C, og clavulansyre avsløres som en sone med inhibert vekst. Rf-verdien til sonen var 0,46. 6 ^ug/ml benzylpenicillin alene
er under den konsentrasjon som er nødvendig for å drepe Klebsiella aerogenes, men i nærvær av en /3-laktamase-inhibitor blir denne konsentrasjon toksisk, dvs. at det er synergisme til stede.
Anvendelse av det ovenfor nevnte synergisme-system muliggjør påvisning av clavulansyre ved konsentrasjoner som er under dem ved hvilke den viser antibakteriell aktivitet.
Beskrivelse 3
Tynnsjiktkromatografisk påvisning av clavulansyre - natriumsalt
Løsninger av clavulansyre-natriumsaltpreparater avsettes som flekker (5 ^ul av lmg/ml) på glassplater som er bestrøket med et 0,25 mm sjikt av silikagel ("F254") fra E. Merck, Darmstadt, Vest-Tyskland. Kromatogrammene kjøres ved 22°C under anvendelse av toppfasen av blandingen n-butanol/etanol/vann 4/1/5 vol./vol. Kromatogramplatene tørkes ved 40°C, og clavulansyre-natriumsaltet lokaliseres ved hjelp av bioautografi på agarplater som inneholder 6 yug/ml benzylpenicillin, og kimdannes med Klebsiella aerogenes (synergisme-system - se avsnittet om papirkromatografi ovenfor). Agaroverflaten dekkes av et fint filterklede før man legger TLC-platen på den. Etter at man har latt det gå 15-30 minutter for fukting og diffusjon, løftes TLC-platen av ved hjelp av filter-duken, og agarplaten inkuberes natten over ved 30°C for avsløring av sonene med inhibert vekst. R^-verdien til clavulansyre-natriumsalt i det ovenfor nevnte løsningsmiddel er tilnærmet 0,37. To spray-reagenser, Ehrlich- og trifenyltetrazoliumklorid anvendes også for avsløring av clavulansyre-natriumsaltsonen. Det først-nevnte reagens består av 300 mg p-dimetylaminobenzaldehyd opp-løst i 9 ml etylalkohol, 54 ml n-butanol og 9 ml konsentrert HCl. Ved oppvarmning av den sprøytede TLC-plate ved 120°C i 1-2 minutter viser clavulansyre-natriumsaltet seg som en rosa flekk. Trifenyltetrazoliumklorid-reagenset består av en blanding av
1 volumdel av en 4 % løsning av denne forbindelse i metanol med
1 volumdel metanolisk natriumhydroksyd. Etter sprøyting oppvar-mes TLC-platene ved 80°C. Clavulansyre-natriumsalt viser seg som en rød flekk på hvit bakgrunn.
Beskrivelse 4
(a) Antibakterielt spektrum av clavulansyre
Den antibakterielle aktivitet av clavulansyre-natriumsalt mot et område av bakterier ble bestemt under anvendelse av mikrotiter-metoden. Seriefortynninger av clavulansyre-natriumsalt i "Oxoid"-sensitivitetstest-buljong inneholdt i et mikrotiter-plastkar, ble inokulert med en overnattings-buljongkultur av hver organisme, slik at den endelige fortynning av pode-
-4 stoffet var 0,5 x 10 .. Kulturene ble inkubert natten over og punktene for bakterievekst notert neste morgen ved observasjon av kulturens grumsethet. Resultatene, uttrykt som tilnærmede MIC-verdier (minste inhiberende konsentrasjon yg/ml) er angitt i tabell 1 som viser at forbindelsen har et bredt spektrum av antibakteriell aktivitet. (b) Eksempler på [ 3- laktamase- inhibering av clavulansyre-natriumsalt.
Clavulansyre inhiberer progressivt og irreversibelt 3-laktamasen av Escherichia coli. Metoden fra beskrivelse 1 viser at de andre 3-laktamaser som er vist i tabell 2, også inhiberes av clavulansyre.
Med penicillin G som subtrat er I5Q-verdien til clavulansyre-natriumsalt mot /3-laktamasen av Staph. aureus (Russell) tilnærmet 0,06 yug/ml. (c) Antibakteriell synergisme mellom ampicillin og clavulansyre- natriumsalt.
Den minste inhiberende konsentrasjon (M.I.C.-verdier) for ampicillin, clavulansyre-natriumsalt og ampicillin i nærvær av 1 yug/ml clavulansyre-natriumsalt ble bestemt for et område, av /3-laktamase-produserende bakterier. Organismene ble inokulert i "Oxoid"-sensitivitetstestbuljong som befant seg i små groper i en plastskål og inneholdt separate konsentrasjonsgradienter av ampicillin, clavulansyre-natriumsalt eller ampicillin pluss 1 yug/ml clavulansyre-natriumsalt (mikrotitermetoden). Den endelige fortynning av overnattingsbuljong-podestoffet var 0,5 x 10 ^. Skålen ble inkubert ved 37°C natten over, og neste morgen ble det gjort notater angående sluttpunktene for bakterievekst. M.I.C.-verdiene i ^ug/ml er gjengitt i tabell 3 som av-slører at synergisten ved den lave konsentrasjon av 1 /ug/ml markert forbedrer den antibakterielle aktivitet for ampicillin mot visse Gram-positive og -negative bakterier. Mekanismen for denne synergisme innebærer sannsynligvis inhibering av ampicillin-ødeleggende /3-laktamase-enzymer, men eksistensen av andre mekanismer kan ikke utelukkes.
Lignende resultater som dem som er vist i tabell 3 ble oppnådd ved utbytting av ampicillin med amoksycillin eller med ftalidylesteren av ampicillin.
(d) Antibakteriell synergisme mellom cefaloridin og clavulansyre- natriumsalt
De minste inhiberende konsentrasjoner av cefaloridin, clavulansyre-natriumsalt og cefaloridin i nærvær av 5 ug/ml clavulansyre-natriumsalt ble bestemt ved den metode som er beskrevet i (c) ovenfor. Resultatene i tabell 4 viser at synergisme kan oppnås mellom clavulansyre-natriumsalt og cefaloridin spesielt for den 3-laktamase-produserende stamme av Staphylococcus aureus (Russell).
(e) Antibakteriell synergisme mellom nlaviilansyrp-nal-rliinisalt og forskjellige penicilliner
De resultater som presenteres i tabell 5, ble oppnådd ved den metode som er beskrevet i (c) ovenfor.
Eksempel 1
Dyrkning av Streptomyces clavuligerus
Streptomyces clavuligerus ATCC 27064 ble dyrket ved 26°c på agar-skråkulturer inneholdende 1 % "Yeatex" (gjærekstrakt), 1 %
glukose og 2 % "Oxoid"-agar nr. 3, pH 6,8. En steril løkke ble anvendt for overføring av mycel og sporer fra skråkulturen til lOO ml av et flytende medium i en 500 ml erlenmeyer-kolbe. Det flytende medium hadde følgende sammensetning:
Mediet ble justert til pH 7,0 med natriumhydroksyd-løsning, og 100 ml ble dispensert inn i kolber som ble lukket med skumplugger før autoklavering ved 1,05 kg/cm 2 i 20 minutter. En inokulert kimkolbe ble rystet i 3 dager ved 26°C på en roterende rystemaskin med 50,8 mm kast og en hastighet på 240 o.p.m. Produksjonstrinnkolber som inneholder det flytende medium som er beskrevet ovenfor, ble inokulert med 5 % vegetativt podestoff og dyrket under de samme betingelser som kimkolben. Prøver av dyrkningsfiltrat ble analysert med hensyn på inhibitor-virkning mot /3-laktamasen av Escherichia coli JT4. Optimal aktivitet ble oppnådd etter 3 dager. Resultatene er vist i tabell 6. En sone av clavulansyre ved R f = 0,46 ble sett da dyrkningsfiltratet ble undersøkt ved hjelp av papirkromatografisk metode som tidligere beskrevet. Økningen i størrelse av sonen var parallell med økningen i /3-laktamase-inhibitor-analyse.
Streptomyces clavuligerus ATCC 27064 ble også dyrket i 2 liters rystede kolber som inneholdt 400 ml medium (produksjonstrinn) under anvendelse av det samme medium og de samme dyrkningsbetingelser som er beskrevet tidligere i dette eksempel. I disse større kar var veksten av organismen langsommere, og optimal /3-laktamase-inhiberende aktivitet ble oppnådd 7-9
dager etter inokuleringen med det vegetative kim. Resultatene er også vist i tabell 6»
EKSEMPEL 2
Dyrkning av Streptomyces clavuligerus
En kimkolbe fremstilt som i eksempel 1 ble anvendt for inokulering av 500 ml koniske kolber som inneholdt 100 ml alikvoter av følgende medium i avionisert vann: Løselig stivelse 2 ' vekt/vol.% Glycerol 0,3 vekt/vol.% "Scotasol" 0,1 vekt/vol.% "Arkasoy" 1 vekt/vol.% FeS04.7H20 0,01 vekt/vol.%
Mediet ble sterilisert ved autoklavering ved 1,05 kg/cm<2 >i 20 minutter og inokulert ved tilsetning av det 5 % vegetative kimtrinn. Kolbene ble rystet ved 26°C på en roterende rystemaskin som angitt i eksempel 1. Optimal titer av clavulansyren ble oppnådd mellom 3 og 5 dager. En fortynning på 1/2500 av dyrkningsfiltratet ga 60 % inhibering i /3-laktamase-inhiberingsanalysen. En sone av clavulansyre ble sett ved Rf = 0,46 ved anvendelse av den papirkromatografiske (bioautografiske) metode som tidligere er beskrevet. Denne sone øket i størrelse parallelt med økningen av aktivitet i /3-laktamase-inhibitor-analysen.
[Løselig stivelse levert av British Drug Houses Ltd.,
Poole, Storbritannia;
"Scotasol" er tørket destillators løselig materiale, levert av Thomas Borthwich Ltd., 60 Wellington Street, Glasgow, Storbritannia;
"Arkasoy" er soyabønnemel levert av British Arkady Co., Old Trafford, Manchester, Storbritannia].
EKSEMPEL 3
Dyrkning av Streptomyces clavuligerus
En kimflaske som produsert i eksempel 1 ble anvendt for inokulering av 500 ml koniske kolber som inneholdt 100 ml alikvoter av følgende medium fremstilt i avionisert vann og sterilisert som beskrevet tidligere. Podestoffnivået var 5 %.
De inokulerte kolber ble rystet ved 26°C. Optimal /3-laktamase-inhiberende aktivitet ble oppnådd mellom 3 og 5
dager. Aktiviteten var lik den som ble oppnådd i eksempel 2.
[Dekstrin markedsføres av C.P.C. (Storbritannia) Ltd., Trafford Park, Manchester, Storbritannia].
EKSEMPEL 4
Dyrkning av Streptomyces clavuligerus
Kimtrinnet som beskrevet i eksempel 1 ble anvendt for inokulering av 500 ml koniske kolber som inneholdt følgende medium, fremstilt i avionisert vann:
Disse kolber ble behandlet nøyaktig som i de foregående eksempler og dyrket under identiske betingelser. /3-laktamase-inhiberingsaktiviteten ble produsert mellom 3 og 5 dager. Dyrkningsfiltrat ved endelig fortynning på 1/2500 ga 35-45 % inhibering i /3-laktamase-inhiberingsanalysen.
EKSEMPEL 5
Dyrkning av Streptomyces clavuligerus
/3-laktamase-inhiberende aktivitet som skyldes clavulansyre, ble produsert under anvendelse av følgende medium med identisk kimtrinn og identiske dyrkningsbetingelser som i eksempel 1.
Mediet ble fremstilt i avionisert vann.
/3-laktamase-inhiberingsaktivitet nådde et maksimumsnivå mellom 3 og 5 dager og var av lignende størrelse som det som ble produsert i henhold til eksempel 4.
EKSEMPEL 6
Dyrkning av Streptomyces clavuligerus
Følgende medium produserte clavulansyre under anvendelse av de betingelser og det vegetative kim-podestoff som er beskrevet i eksempel 1.
Mediet ble fremstilt i avionisert vann.
Optimale titre ble oppnådd i løpet av 3 til 5 dager, og en 1/2500-fortynning av dyrkningsfiltratet ga 35-45 % inhibering i /3-laktamase-enzym-inhiberingsanalysen.
EKSEMPEL 7
Dyrkning av Streptomyces clavuligerus
Som i eksemplene 4, 5 og 6 produserte det følgende medium 35-45 % inhibering (1/2500-fortynning) i /3-laktamase-analysen ved den optimale titer som nåes 3-5 dager etter inokuleringen. Alle betingelser var som tidligere beskrevet.
EKSEMPEL 8
Dyrkning av Streptomyces clavuligerus
Følgende produksjonstrinn-medium produserte, ved anvendelse under standard dyrkningsbétingeIser som beskrevet i de foregående eksempler, 20-30 % inhibering ved 1/2500 fortynning i /3-laktamase-analysen mellom 3-5 dager etter inokulering. Under anvendelse av den papirkromatografiske metode som er beskrevet tidligere, ble en sone av clavulansyre sett ved = 0,46 da dyrkningsfiltratet ble undersøkt.
EKSEMPEL 9
Dyrkning av Streptomyces clavuligerus
Under standard dyrkningsbetingeIser produserte det følgende medium clavulansyre 3-5 dager etter inokulering med det vegetative kim fra eksempel 1. En 1/2500 fortynning a<y> kulturen ga 20-30 % inhibering i P-laktamase-inhiberingsanalysen.
EKSEMPEL 10
Dyrkning av Streptomyces clavuligerus
En "Yeatex"/glukose-agar-skråkultur av S. clavuligerus ATCC 27064 ble anvendt for inokulering av en "Yeatex"/glukose-agar-skråkultur i en Roux-flaske ved å lage en mycel/sporesuspensjon i sterilt vann. Roux-flaskekulturen ble inkubert ved 26°C i 10 dager. Til denne skråkultur ble 100 ml sterilt vann tilsatt og en mycelsuspensjon fremstilt. Denne ble anvendt for inokulering av 50 liter av damp-sterilisert kim-medium med følgende sammensetning, i springvann."
["Pluronic" fra Jacobs and Van den Berg UK Ltd., 231
The Vale, London, W3, inneholdende en polypropylen/ polyetylen-blokkpolymer, og soyaolje fra British Oil and Cake Mills Ltd., Stoneferry Road, Hull, Storbritannia]
Mediet befant seg i en 90 liter fermentator av rustfritt stål med ledeplater , agitert ved hjelp av en 12,7 cm skovlhjul med skiver og vinger ved 240 o.p.m. Steril luft ble tilført v?d 50 l/min. og tanken inkubert ved 26°C.
Etter 72 timer ble kimfermentatoren anvendt for inokulering av 150 liter av det samme medium under anvendelse av en 5 vol.% tilsetning av steril overføring. Dette produksjonstrinn-medium befant seg i en 300 1 fermentator av rustfritt stål, fullstendig utstyrt med ledeplater og agitert ved hjelp av et 21,6 cm skovlhjul med skiver og vinger ved 210 o.p.m. Steril luft ble tilført ved 150 l/min. Fermenteringen ble opprettholdt ved 26°C. "Antifoam" ble tilsatt etter behov i 10 ml porsjoner (10 % "Pluronic" L81 i soyaolje). Det ble tatt prøver for /?-laktamase-inhiberings-analyse med jevne mellomrom. Fermentatoren ble høstet mellom 4 og 5 dager ved det optimale nivå av /3-laktamase-inhiberings-aktivitet (tabell 7).
EKSEMPEL 11
Dyrkning av Streptomyces clavuligerus
Kimfermentatoren ble kjørt nøyaktig som beskrevet i eksempel 10 under anvendelse av det samme medium.
Etter 72 timer ble kimfermentatoren anvendt slik at
man fikk et 5 vol.% vegetativt podestoff inn i en 300 liter fermentator av rustfritt stål fullstendig utstyrt med ledeplater, inneholdende 150 liter dampsterilisert medium agitert ved hjelp av et 21,6 cm skovlhjul med skiver og vinger ved 210 o.p.m. Steril luft ble tilført ved 150 l/min. Fermenteringen ble opprettholdt ved 26°C. "Ahtifoam" ble tilsatt etter behov i 10 ml porsjoner (10 % "Pluronic" L81 i soyaolje).
Mediet som ble anvendt i produksjonstrinnet, var som beskrevet i eksempel 3 med tilsetning av 0,05 vol.% 10 % "Pluronic" L81/soyaolje-"Antifoam" før sterilisering.
Den /3-laktamase-inhiberende aktivitet for fermenterings-prøvene var lik verdiene fra eksempel 10 (se tabell 7). Papir-kromatograf isk undersøkelse avslørte en sone av clavulansyre ved Rf = 0,46 under anvendelse av den bioautografiske (synergisme-) metode som er tidligere beskrevet. Størrelsen av clavulansyre-sonen øket parallelt med økningen i /3-laktamase-inhibitoranalysen.
EKSEMPEL 12
Dyrkning av Streptomyces clavuligerus
100 ml sterilt vann ble tilsatt til en sporekultur av S. clavuligerus ATCC 27064 som var dyrket på Bennett's agar i en Roux-flaske i 10 dager ved 26°C. En mycel/sporesuspensjon ble produsert og anvendt for inokulering av 75 liter dampsterilisert medium av følgende sammensetning i springvann:
Mediets pH-verdi ble justert til 7,0.
Mediet befant seg i en lOO liter fermentator av rustfritt stål, utstyrt med ledeplater, agitert med et 19 cm skovlhjul med skiver og vinger ved 140 o.p.m. Steril luft ble til-ført ved 75 l/min. og tanken inkubert i 72 timer ved 26°C.
Innholdet av kimfermentatoren ble anvendt for inokulering av 1500 liter dampsterilisert medium av følgende sammensetning i springvann:
Mediets pH-verdi ble justert til 7,0.
Mediet befant seg i en 2000 liters fermentator av rustfritt stål, fullstendig utstyrt med ledeplater og agitert ved hjelp av to 48,2 cm skovlhjul med skiver og vinger ved 106 o.p.m.
Steril luft ble tilført ved 1200 l/min. "Antifoam" ble tilsatt i 25 ml porsjoner etter behov. (10 % "Pluronic" L81 i soyaolje). Fermenteringen ble regulert ved 26°C til det ble oppnådd et maksimalt utbytte av clavulansyre mellom 3 og 5 dager da 200-300 ^ug/ml clavulansyre ble produsert.
EKSEMPEL 13
Dyrkning av Streptomyces clavuligerus
Podestoff ble produsert i en kimkolbe som beskrevet tid-ligére, men under anvendelse av det medium som er beskrevet i eksempel 3 (med mediets pH-verdi justert til 7,0). Dette ble anvendt for inokulering av 500 ml koniske kolber som inneholdt 100 ml alikvoter av følgende medium fremstilt i avionisert vann og sterilisert. Podestoffnivået var 5 %.
Mediets pH-verdi ble justert til 7,0.
De inokulerte kolber ble rystet ved 26°C, og optimal /3-laktamase-inhiberende aktivitet ble oppnådd mellom 3 og 5 dager. Nivåer av 300-500 ^ug/ml av clavulansyre ble oppnådd.
"Prichem" P224 er et triglycerid levert av Prices Limited, Bromborough, Bebington, Wirral, Cheshire, Storbritannia. "Prichem" P 224 er basert på oljesyre (65 %) , palmitinsyre (11 %) og andre lignende syrer.
EKSEMPEL 14
Isolering av rått clavulansyre- natriumsalt
Høstet dyrkningsvæske, produsert som beskrevet i eksempel 10, ble klarnet ved kontinuerlig strømningssentrifugering og mycelet vraket. Fra 150 liter fermenteringsvæske ble det oppnådd 120 liter klarnet dyrkningsvæske. Dette filtrat ga 58 % inhibering i /3-laktamase-inhiberingsanalysen ved 1/2500. Filtratet ble avkjølt til 5°C, og 40 liter n-butanol ble tilsatt. Blandingen ble omrørt og 25 % ^SO^ tilsatt inntil pH-verdien var 2,0. Den surgjorte blanding ble omrørt i ytterligere 10 minutter før separering av fasene ved sentrifugering. Vannfasen ble vraket. Til n-butanol-ekstrakten ble 0,5 % "Norit" GSX karbon tilsatt og blandingen omrørt i 15 minutter. Karbonet ble vraket etter fjerning ved filtrering under anvendelse av kiselguhr som filter-medium. Til n-butanolen ble det tilsatt 1/4 volumdel avionisert vann, og blandingen ble omrørt under tilsetning av 20 % NaOH-løsning inntil pH-verdien hadde innstilt seg på likevekt ved 7,0. Fasene ble separert ved sentrifugering og n-butanolfasen vraket. Vannfasen ble konsentrert under redusert vakuum til 800 ml og så frysetørket. Dette ga 35 g av et rått, fast preparat av clavulansyre med en I^-verdi på 1,3 ^ug/ml i /3-laktamase-inhiberingsanalysen. Dette faste preparat ble lagret tørt ved -20°C mens man avventet ytterligere rensning.
EKSEMPEL 15
Isolering av rått clavulansyre- natriumsalt
En liter dyrkningsfiltrat som ga 53 % inhibering ved 1/2500 i /3-laktamase-inhiberingsanalysen, og som ble oppnådd som beskrevet i eksempel 12, ble perkolert ned en søyle med diameter 25,4 mm og lengde 152 mm av "Permutit Isopore"-harpiks FF 1P (SRA 62) i Cl-formen Ifra Permutit Co. Ltd., 632-652
London Road, Isleworth, Middlesex, Storbritannia]. Dyrkningsfiltratet ble fulgt av 300 ml destillert vann for vasking av kolonnen. Eluering av den aktive /3-laktamase-inhibitor ble ut-ført med 0,2m NaCl-løsning. 20 ml fraksjoner ble oppsamlet og analysert ved 1/2500 endelig fortynning i /3-laktamase-inhiberingsanalysen. Aktive fraksjoner ble kombinert og konsentrert under vakuum til 20 ml. Denne løsning ble avsaltet ved hjelp av gel-utelukkelses-kromatografi på en "Biorad Biogel" P2 kolonne med diameter 38,1 mm, med et gelsjikt på 40,6 cm, og eluert med 1 % n-butanol i vann.' ["Biogel" P2 leveres av Bio Rad Laboratories, 32nd and Griffin ave., Richmond , California, U.S.A.] De aktive fraksjoner, bestemt ved hjelp av /3-laktamase-inhiberingsanalysen , ble kombinert. Natriumklorid ble eluert etter clavulansyre og påvist ved hjelp av sølvnitrat-løsning. De kombinerte aktive fraksjoner ble konsentrert og frysetørket.
En liter dyrkningsfiltrat etter ovennevnte behandling
ga 0,45 g av et rått, fast preparat av clavulansyre med en I5q-verdi på 0,92 ^ug/ml.
Dette faste stoff ble lagret ved -20°C under avventing
av ytterligere rensning.
EKSEMPEL 16
Isolering av rått clavulansyre- natriumsalt
Dyrkningsfiltrat som inneholdt 300 ^ug/ml clavulansyre surgjøres under anvendelse av et "in-line"-blandesystem, ekstraheres med n-butanol, og clavulansyre tilbakeekstraheres inn i vann ved nøytral pH.
Avkjølt dyrkningsfiltrat (5-10°C) ble pumpet til en "in-line"-blander ved innløpet av hvilken nok 6 vol.% salpetersyre ble tilsatt til å opprettholde en utløps-pH-verdi på 2,0 jf 0,1. Det surgjorte filtrat ble ført med 4 l/min. gjennom en glykol-avkjølt plateformet varmeveksler (fra A.P.V. Ltd.) for opprett-holdelse av en temperatur mellom 2-5°. pH-verdien ble overvåket i en strømningscelle før passering inn i en tre-trinns-, motstrøms-
separator (fra Westfalia Separator Ltd., Model EG 1006).
Avkjølt vann-mettet n-butanol (av ca 5°C) ble pumpet
med 3 l/min. inn i motstrøms-separatoren.
Vannutløpet fra motstrøms-separatoren ble kjørt til kloakk. Oppfanget vann ble fjernet fra butanolutløpet i motstrøms-separatoren under anvendelse av en væske/væske-sentrifugalseparator. (Fra Alfa Laval Ltd., modell 3024X - G). Butanolen ble oppsamlet i et kar av rustfritt stål, utstyrt med kjølekappe i hvilket den ble lagret ved ca. 5°C.
Fra karet ble 40 1 alikvoter fjernet og blandet grundig med 2 liter avkjølt vann (5°C), mettet med n-butanol. pH-verdien til denne blanding ble justert til 6,8 + 0,1 under anvendelse av 20 % natriumhydroksydløsning.
Denne vandige ekstrakt/butanolblanding ble matet til en væske/væske-sentrifugalseparator (fra Sharples Centrifuge Ltd., modell M35PY - 5 PH) ved en pumpehastighet på 2 l/min.
Fra 1800 liter dyrkningsfiltrat ble 90 liter vannfase gjenvunnet som inneholdt 39 % av clavulansyren som var til stede i dyrkningsfiltratet. 15 liter av vannekstrakten ble justert fra 2 % til 8 % totalt tørrstoff ved tilsetning av 60 g natriumklorid pr. liter, og forstøvningstørket (Anhydro, København, type Lab S 1). Be-tingelsene som ble anvendt var: Matehastighet 2 l/h. Atomiserings-strøm 170 V. VarmeovninnstiIling: 6-7. Innløpstemperatur: 150°C. Utløpstemperatur: 80°C.
Det tørkede produkt, total vekt 1 kg, inneholdt 62 % av clavulansyren som var til stede i mateforrådet.
De gjenværende 75 liter vannekstrakt ble konsentrert
ved hjelp av ultrafiltrering (De Danske Sukkerfabrikker. Labora-tory Module, Membrane Type 900). Fremgangsmåten var å resirkulere det tilbakeholdte fra en tank av rustfritt stål, utstyrt med et kjølesystem, med utløpsventilen satt slik at det skulle bli et differensial-trykk tvers over de 40 membraner på 25 atmosfærer. Temperaturen ble holdt på 2-5°C og pH-verdien på 6,8 ± 0,1 ved tilsetning av 2n saltsyre, etter behov. Volumet ble redusert til 34 liter, som inneholdt 72 % av clavulansyren som var til stede i forrådet.
Det vandige konsentrat ble lagret ved ca. 5°C, justert til 8 % tørrstoff, og forstøvningstørket som angitt ovenfor. Det tørkede materiale inneholdt 75 % av clavulansyren som var til stede i forrådet, til forstøvningstørkeren.
Det totale forstøvningstørkede produkt, fra de 90 liter vannekstrakt som inneholdt 69,4 g clavulansyre som var 72 % av clavulansyren i materialet som skulle forstøvningstørkes , og 21 % av clavulansyren som var til stede i de 1800 liter dyrkningsfiltrat.
EKSEMPEL 17
Delvis rensning av rå clavulansyre
Rå clavulansyrepreparater oppnådd som beskrevet i eksempel 15 ble renset ved hjelp av ionebyttekromatografi. 18 g materiale, fremstilt som beskrevet i eksempel 15, med en 1,-Q-verdi på 1,3 yug/ml (endelig konsentrasjon) ble oppløst i 25 ml destillert vann og ført til et 38,1 mm x 40,6 cm sjikt av "Permutit" FF 1P (SRA 62) harpiks i kloridform. Kolonnen ble eluert med en natriumklorid-gradient dannet ved tyngdekraftmating av 0,5m natriumklorid inn i et blandereservoar som inneholdt 1 liter destillert vann, som igjen ble matet inn i krornatografikolonnen. 10 ml fraksjoner ble oppsamlet og /3-laktamase-inhiberingsaktiviteten analysert under anvendelse av en 1/2500 fortynning av fraksjonene. Aktiviteten ble eluert etter et hovedbånd av farve mellom fraksjonene 24 og 30. De aktive fraksjoner ble kombinert og konsentrert til
30 ml.
Denne løsning ble avsaltet under anvendelse av et 50,8 mm x 45,7 cm sjikt av "Biorad Biogel" P2 og eluering med 1 % n-butanol i vann. De 20 ml-fraksjoner ble analysert med hensyn på clavulan-syreinnhold under anvendelse av /3-laktamase-inhiberingsanalysen. Fraksjonene ble også avsatt som flekker på papirstrimler og for-støvet med enten Ehrlich-reagens eller trifenyltetrazolium-spray-reagensene som er beskrevet i beskrivelse 3. /3-laktamase-inhiberingsaktiviteten sammenholdt med de rosa, respektive røde flekker frembragt ved hjelp av disse reagenser. Aktive fraksjoner ble kombinert, bortsett fra dem som inneholdt natriumklorid, og konsentrert under vakuum til tørrhet. Dette ga 520 mg delvis renset clavulansyre-natriumsalt med en 1,-Q-verdi på 0,2 ^,ug/ml i standard /3-laktamase-inhibitoranalysen.
Tynnsjiktkromatografi (silikagel) av dette clavulansyre-preparat ga følgende R^-verdier: n-butanol/etanol/vann 4:1:5 vol./vol. toppfase R^ = 0,37; n-butanol/eddiksyre/vann 12:3:5 vol./vol. R^ = 0,44; isopropanol/vann 7:3 vol./vol. R^ = 0,78. Sonene ble påvist ved sprøyting med Ehrlich 's reagens. 6-aminopenicillansyre kjørt som markør og påvist med samme spray, hadde R^-verdier på henholdsvis 0,38, 0,39 og 0,77.
EKSEMPEL 18
Delvis rensning av clavulansyre- natriumsalt
Dyrkningsfiltrat produsert som beskrevet i eksempel 12 ble løsningsmidlet ekstrahert som i eksempel 14, slik at man fikk et fast preparat som ble renset ytterligere ved hjelp av ionebyttekromatografi under anvendelse av Whatman dietylamino-etylcellulose "DE 52". Dette faste stoff (10 g) ble oppløst i 20 ml destillert vann og tilført til en 38,1 mm x 50,8 cm kolonne av "DE 52" cellulose som på forhånd var bragt i likevekt med 0,01m natriumfosfatpuffer pH 7,5. Kolonnen ble eluert med en NaCl-gradient. 0,lm NaCl i 0,01m natriumfosfatpuffer pH 7,5 ble matet inn i et blandekammer som inneholdt 1 liter 0,0lm fosfatpuffer pH 7,5 som på sin side var forbundet til kolonnen. 10 ml fraksjoner ble oppsamlet, og disse ble analysert med hensyn på /3-laktamase-inhiberingsaktivitet ved en fortynning på 1/2500. Fraksjonene ble også undersøkt med hensyn på antibakteriell aktivitet ved hjelp av hull-i-plate-analysemetoden under anvendelse av næringsagarplater som var kimsatt med Klebsiella aerogenes. De fraksjoner som hadde høyeste j3-laktamase-inhiberingsaktivitet og ga inhiberingssoner i hull-i-plate-analysen, ble kombinert, konsentrert og deretter avsaltet på en "Biorad Biogel" P2 kolonne. Disse fraksjoner viste seg å inneholde clavulansyre, ved hjelp av papir- og tynnsjiktkromatografi.
EKSEMPEL 19
Isolering av fast clavulansyre- natriumsalt
Et delvis renset, fast preparat av clavulansyre (500 mg), fremstilt som angitt i eksempel 17, ble belagt på en Whatman mikrokrystallinsk "CC 31" cellulose-kolonne med 25,4 mm x 50,8 cm sjiktstørrelse. Det kromatografiske løsningsmiddel var n-butanol/ etanol/vann 4:1:5 vol./vol., toppfase. Kolonnen ble kjørt ved 4°C, og 4 ml fraksjoner ble oppsamlet. Fraksjonene ble testet med hensyn på nærvær av clavulansyre ved å anbringe flekker på filterpapir og sprøyte med Ehrlich 's-reagens (rosa flekk) eller trifenyltetrazolium-reagens (rød flekk). Disse flekktester ble bekreftet ved hjelp av /3-laktamase-inhiberingsanalyser ved 1/1250 fortynning. Aktive fraksjoner ble kombinert og tørket under vakuum på en roterende inndamper. Det faste stoff ble opp-løst i et lite volum av destillert vann og frysetørket. Et hvitt, fast preparat av natriumsaltet av clavulansyre ble oppnådd (40 mg) med en I^^-verdi på 0,08 ^ug/ml i /3-laktamase-inhiberingsanalysen.
EKSEMPEL 20
Isolering av fast clavulansyre- natriumsalt
Konsentrert tilbakeekstrakt (6 liter) (fra ultrafiltrering i eksempel 16) som inneholdt 10 g clavulansyre, bestemt ved /3-laktamase-inhiberingsanalysen fra beskrivelse 1. Denne ble perkolert ved 1 l/h på en 50,8 mm x 61 cm kolonne av "Permutit Zerolit" FF 1 P SRA 62 anionbytte-harpiks i kloridform. Kolonnen ble så vasket med 2 liter avionisert vann før eluering med en natriumkloridgradient. Gradienten ble dannet av et reservoar som inneholdt 4 liter av 1,4 m NaCl som matet et om-rørt reservoar som inneholdt 4 liter av 0,7 NaCl som på sin side var forbundet med et omrørt reservoar som inneholdt 4 liter avionisert vann som ble tilknyttet via en pumpe til kolonnen. Kolonnen ble eluert ved 2,5 ml/min. og 25 ml fraksjoner oppsamlet. Fraksjonene ble analysert ved hjelp av /3-laktamase-inhiberingsanalysen.
Aktive fraksjoner (nr. 140-230) ble kombinert og vakuum-inndampet til nær tørrhet. 500 ml etanol ble så tilsatt og det faste stoff filtrert fra etter kraftig rysting. Etanolekstrakten ble så vakuum-inndampet til tørrhet på en roterende inndamper og gjenoppløst i 40 ml avionisert vann. Dette ble belagt på en 101,6 mm x 61 cm kolonne av "Biorad Biogel" og eluert med en 1 % n-butanol-løsning. 25 ml fraksjoner ble oppsamlet og analysert med hensyn på /3-laktamase-inhiberingsaktivitet ved en slutt-fortynning på 1/2500. Tester med hensyn på natriumkloridinnhold på 1/25 fortynninger av fraksjonene ble gjort under anvendelse av sølvnitratløsning. De fraksjoner som inneholdt clavulansyre som var fri for natriumklorid, ble kombinert, konsentrert ved inn-dampning av løsningsmidlet under redusert trykk til 20 ml og deretter frysetørket. Dette ga 4,8 g av natriumsaltet av clavulansyre. (I^Q-verdi på ca. 0,06 ^ug/ml).
EKSEMPEL 21
Ekstraks- on av clavulansyre under anvendelse av flytende ione-bytte- harpiks
Dyrkningsfiltrat (200 ml, oppnådd på lignende måte som
i eksempel 3, men under anvendelse av et medium som inneholder 0,1 vol.% KH2P04 istedenfor 0,01 % FeS04.7H20) ble ekstrahert med "Amberlite" LA2<+>(Cl~-form, 15 vol.% i metylisobutylketon,
66 ml) i 30 minutter ved 5°C.
Fasene ble separert ved sentrifugering (1660 g, 20 min.). Løsningsmiddeltasen (60 ml) ble gjenvunnet med pipette og delt
i fire like deler. Hver del ble ekstrahert ved omrøring ved 5°C i 20 minutter med 1/4 volumdel (3,75 ml) vandig ekstraksjons-middel som angitt i nedenstående tabell. Den resulterende blanding ble sentrifugert (1660 g, 15 min.). 3,6 ml vannfase ble gjenvunnet fra hver ekstraksjon.
EKSEMPEL 22-
Ekstraksjon av clavulansyre under anvendelse av flytende ione-bytte- harpiks
Klarnet væske (47 liter, oppnådd som i eksempel 12) ble ekstrahert med "Amberlite" LA2 (acetat-form, 15 vol.% i metylisobutylketon, 12,5 liter) ved omrøring i 1 time ved 17°C. Etter tilsetning av 500 ml oktan-l-ol ble fasene separert i en kontinuerlig strøm-sentrifuge som ga 9,2 liter løsningsmiddelfase, som deretter ble omrørt ved 5°C i 1,5 timer med molart natriumnitrat (2,3 liter). Blandingen ble separert ved kontinuerlig strøm-sentrifugering, og dette ga 2,4 liter vannfase (inklusive vann som ble brukt for utbyttingsformål). Vannfasens pH-verdi (innledningsvis 8,0) ble justert til 7,0 med konsentrert saltsyre .

Claims (2)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av clavulansyre, som er forbindelsen av formel (I): eller et salt derav, karakterisert ved å dyrke en stamme av Streptomyces clavuligerus og utvinne clavulansyre eller et salt derav.
2. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karak-terisert ved å dyrke Streptomyces clavuligerus ATCC 27064.
NO751407A 1974-04-20 1975-04-18 Fremgangsmaate for fremstilling av clavulansyre NO145247C (no)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB17410/74A GB1508977A (en) 1974-04-20 1974-04-20 Beta-lactam antibiotic from streptomyces clavuligerus
GB2771574 1974-06-21
GB4365174 1974-10-09
GB5352574 1974-12-11

Publications (3)

Publication Number Publication Date
NO751407L NO751407L (no) 1975-10-21
NO145247B true NO145247B (no) 1981-11-02
NO145247C NO145247C (no) 1982-02-10

Family

ID=27448389

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO751407A NO145247C (no) 1974-04-20 1975-04-18 Fremgangsmaate for fremstilling av clavulansyre
NO791956A NO150838C (no) 1974-04-20 1979-06-12 Analogifremgangsmaate for fremstilling av nye klavulansyreforbindelser med antibakterielle og beta-laktamase-inhiberende egenskaper
NO801852A NO801852L (no) 1974-04-20 1980-06-20 Farmasoeytisk clavulansyrepreparat.

Family Applications After (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO791956A NO150838C (no) 1974-04-20 1979-06-12 Analogifremgangsmaate for fremstilling av nye klavulansyreforbindelser med antibakterielle og beta-laktamase-inhiberende egenskaper
NO801852A NO801852L (no) 1974-04-20 1980-06-20 Farmasoeytisk clavulansyrepreparat.

Country Status (26)

Country Link
US (5) US4427690A (no)
JP (7) JPS521996B2 (no)
AR (3) AR206627A1 (no)
CA (1) CA1059050A (no)
CH (2) CH629252A5 (no)
CY (1) CY1078A (no)
DD (2) DD121799A5 (no)
DE (4) DE2559411C2 (no)
DK (1) DK141254B (no)
FI (1) FI54144C (no)
FR (1) FR2267778B1 (no)
HK (1) HK54780A (no)
IE (1) IE41109B1 (no)
IL (1) IL47087A (no)
IN (1) IN140042B (no)
KE (1) KE3076A (no)
LU (1) LU72322A1 (no)
MY (1) MY8100195A (no)
NL (1) NL163824C (no)
NO (3) NO145247C (no)
NZ (1) NZ177159A (no)
OA (1) OA05203A (no)
PH (1) PH16474A (no)
RO (2) RO77320A (no)
SE (8) SE422063B (no)
YU (3) YU39941B (no)

Families Citing this family (94)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IE41109B1 (en) 1974-04-20 1979-10-24 Beecham Group Ltd Novel -lactam antibiotic from streptomyces clavuligerus
YU40452B (en) * 1975-02-07 1986-02-28 Beecham Group Plc Process for the elimination of contaminating impurities from clavulinic acid
JPS596796Y2 (ja) * 1975-04-04 1984-03-01 株式会社東芝 脱水兼用洗濯機
US6048977C1 (en) * 1975-04-17 2001-10-16 Smithkline Beecham Plc Clavulanic acid and salts thereof
US6218380B1 (en) * 1975-04-17 2001-04-17 Smithkline Beecham P.L.C. Pharmaceutical compositions
GB1563103A (en) * 1975-10-13 1980-03-19 Beecham Group Ltd Process for the preparation of clavulanic acid
US4230622A (en) * 1975-12-17 1980-10-28 Glaxo Laboratories Limited Halogen derivatives of clavulaic acid
GB1515241A (en) * 1976-01-27 1978-06-21 Beecham Group Ltd Beta-lactam antibiotics
IT1078465B (it) * 1976-06-08 1985-05-08 Glaxo Lab Ltd Composti fungicidi per agricoltura composizioni che li contengono e procedimento per produrli
GB1562802A (en) * 1976-06-26 1980-03-19 Beecham Group Ltd Pharmaceutical compositions containing containing clavulanic acid
GB1562902A (en) * 1976-06-30 1980-03-19 Beecham Group Ltd Pharmaceutical compositions containing clavulanic acid
GB1578739A (en) * 1976-07-23 1980-11-05 Beecham Group Ltd Amine salts of clavulanic acid methods for their preparation and compositions containing them
GB1594001A (en) * 1977-03-16 1981-07-30 Beecham Group Ltd Pellets suitable for use in the testing of microorganisms
GB1582884A (en) * 1977-05-19 1981-01-14 Beecham Group Ltd Clavulanic acid derivatives their preparation and use
DE2912511C2 (de) * 1977-06-07 1982-06-24 Pfizer Inc., 10017 New York, N.Y. Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend Penicillansäure
JO984B1 (en) * 1977-10-11 1979-12-01 بيتشام غروب ليمتد A dry pharmaceutical compound with a suitable dosage unit for oral administration
JPS54126735A (en) * 1978-03-24 1979-10-02 Toyama Chem Co Ltd Bactericidal composition for medical use
DE2964817D1 (en) * 1978-09-06 1983-03-24 Beecham Group Plc Pharmaceutical compositions containing two beta-lactam derivatives
JPS5545906U (no) * 1978-09-21 1980-03-26
US4202819A (en) * 1979-05-04 1980-05-13 Hoffman-La Roche Inc. 2-(3-Alanyl)clavam antibiotic
ZA804670B (en) * 1979-08-03 1981-07-29 Beecham Group Ltd Derivatives of clavulanic acid, a process for their preparation and their use
DE3063683D1 (en) * 1979-08-24 1983-07-14 Beecham Group Plc Amine salt of clavulanic acid, its preparation and use
EP0053893B1 (en) * 1980-12-09 1985-03-20 Beecham Group Plc Derivatives of clavulanic acid, their preparation and their use
US4562182A (en) * 1980-12-23 1985-12-31 Beecham Group P.L.C. Compounds containing beta-lactams
JPS58361A (ja) * 1981-06-22 1983-01-05 Kurosaki Refract Co Ltd 溶融金属鋳造用ノズル
US4533542A (en) * 1983-08-22 1985-08-06 Eli Lilly And Company Pharmaceutical compositions for storage in plastic containers and process therefor
US4684643A (en) * 1983-08-22 1987-08-04 Eli Lilly And Company Pharmaceutical compositions for storage in plastic containers and process therefor
IT1207982B (it) * 1983-10-07 1989-06-01 Lisapharma Spa Composizioni farmaceutiche adattivita' antibiotica.
JPS60151610U (ja) * 1984-03-22 1985-10-08 住友重機械工業株式会社 回転ホイ−ル式連続金属押出装置におけるアバツトメント
JPS6155889A (ja) * 1984-08-28 1986-03-20 松下電器産業株式会社 高周波加熱装置
US4757066A (en) * 1984-10-15 1988-07-12 Sankyo Company Limited Composition containing a penem or carbapenem antibiotic and the use of the same
DE3725375A1 (de) * 1987-07-31 1989-02-09 Bayer Ag Stabile oxapenem-3-carbonsaeuren
GB9009446D0 (en) * 1990-04-26 1990-06-20 Beecham Group Plc Veterinary composition
DE4027928A1 (de) * 1990-09-04 1992-03-05 Bayer Ag Neue 2-tert.substituierte methyl-oxapenem-3-carbonsaeuren und -ester, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung
DE4030706A1 (de) * 1990-09-28 1992-04-02 Bayer Ag Neue 3-substituierte cephalosporine, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung als arzneimittel
GB9201639D0 (en) * 1992-01-25 1992-03-11 Smithkline Beecham Plc Pharmaceutical formulations
AT400033B (de) * 1992-03-10 1995-09-25 Biochemie Gmbh Neues verfahren zur isolierung und reinigung von clavulansäure und zur herstellung von pharmakologisch verträglichen salzen derselben
AT399155B (de) * 1992-03-26 1995-03-27 Lek Tovarna Farmacevtskih Neue alkylendiammonium-diclavulanat-derivate, verfahren zu deren herstellung sowie deren verwendung
EP1034784A3 (en) * 1993-01-22 2001-06-27 Smithkline Beecham Plc Pharmaceutical formulations containing clavulanic acid and an antibacterial agent
US5821364A (en) * 1993-03-26 1998-10-13 Gist-Brocades N.V. Diamine salts of clavulanic acid
EP0719778A1 (en) * 1993-03-26 1996-07-03 Gist-Brocades N.V. Diamine salts of clavulanic acid
US5760218A (en) * 1993-03-26 1998-06-02 Gist-Brocades N.V. Diamine salts of clavulanic acid
US5741903A (en) * 1993-03-26 1998-04-21 Gist-Brocades N.V. Diamine salts for purification of clavulanic acid
GB9315393D0 (en) 1993-07-24 1993-09-08 Smithkline Beecham Plc Novel product
US20030219867A1 (en) * 1993-07-24 2003-11-27 Smithkline Beecham Plc Clavulanic acid dehydrogenase, preparation and use for the production of clavulanic acid
SI9400107A (en) * 1994-03-02 1995-10-31 Lek Tovarna Farmacevtskih New process of the isolation of clavulanic acid and its pharmaceutical salts from fermented broth of streptomyces sp.p 6621 ferm p 2804.
US20030109503A1 (en) * 1995-06-06 2003-06-12 Smithkline Beecham P.L.C. Pharmaceutical formulations comprising clavulanic acid alone or in combination with other beta-lactam antibiotics
GB9515809D0 (en) * 1995-08-02 1995-10-04 Smithkline Beecham Plc Process
SI9500265A1 (en) 1995-08-28 1997-02-28 Lek Tovarna Farmacevtskih Process for purification of the aqueous fermented broth filtrate of streptomyces sp. p 6621 ferm p 2804 by ultrafiltration
BR9610396A (pt) * 1995-09-07 1999-07-06 Smithkline Beecham Corp Formulação farmacêutica
AT403375B (de) * 1995-11-15 1998-01-26 Biochemie Gmbh Verfahren zur fällung von alkalisalzen der clavulansäure
US20030124187A1 (en) * 1997-02-14 2003-07-03 Smithkline Beecham Laboratoires Pharmaceutiques, Pharmaceutical formulations comprising amoxycillin and clavulanate
AU6400098A (en) * 1997-02-20 1998-09-09 Gist-Brocades B.V. Fermentative production of valuable compounds on an industrial scale using chemically defined media
AR015825A1 (es) * 1997-05-28 2001-05-30 Gist Brocades Bv Produccion fermentativa de acido clavulanico bajo condiciones controladas de fosfato
CA2336363A1 (en) * 1998-07-03 2000-01-13 Dsm N.V. Fermentation process to produce clavulanic acid at a low concentration of free amino acids
US7250176B1 (en) * 1999-04-13 2007-07-31 Beecham Pharmaceuticals (Pte) Limited Method of treating a bacterial infection
US6878386B1 (en) 1999-04-13 2005-04-12 Beecham Pharmaceuticals (Pte) Limited Method of treating a bacterial infection comprising amoxycillin and potassium clavulanate
US6294199B1 (en) * 1999-04-13 2001-09-25 Beecham Pharmaceuticals (Pte) Limited Method of treating a bacterial infection comprising administering amoxycillin
US6544555B2 (en) 2000-02-24 2003-04-08 Advancis Pharmaceutical Corp. Antibiotic product, use and formulation thereof
US6565882B2 (en) 2000-02-24 2003-05-20 Advancis Pharmaceutical Corp Antibiotic composition with inhibitor
US6756057B2 (en) 2000-10-12 2004-06-29 Beecham Pharmaceuticals (Pte) Limited Amoxicillin and potassium clavulanate dosage form
WO2002030392A2 (en) 2000-10-12 2002-04-18 Beecham Pharmaceuticals (Pte) Limited Formulation containing amoxicillin
US20020068078A1 (en) 2000-10-13 2002-06-06 Rudnic Edward M. Antifungal product, use and formulation thereof
US6541014B2 (en) 2000-10-13 2003-04-01 Advancis Pharmaceutical Corp. Antiviral product, use and formulation thereof
IL150907A (en) * 2002-07-25 2007-07-04 Stephan Cherkez Process for the preparation of stable amorphous calcium pseudomonate
EP1648418A4 (en) 2003-07-21 2011-11-16 Middlebrook Pharmaceuticals Inc ANTIBIOTIC PRODUCT, ITS USE AND FORMULATION
US8313776B2 (en) 2003-07-21 2012-11-20 Shionogi Inc. Antibiotic product, use and formulation thereof
AU2004258953B2 (en) 2003-07-21 2011-02-10 Shionogi, Inc. Antibiotic product, use and formulation thereof
EP1653925A1 (en) 2003-08-11 2006-05-10 Advancis Pharmaceutical Corporation Robust pellet
AU2004264356B2 (en) 2003-08-12 2011-01-27 Shionogi, Inc. Antibiotic product, use and formulation thereof
JP5686494B2 (ja) 2003-08-29 2015-03-18 シオノギ インコーポレイテッド 抗生物質製剤、その使用法及び作成方法
WO2005027877A1 (en) 2003-09-15 2005-03-31 Advancis Pharmaceutical Corporation Antibiotic product, use and formulation thereof
JP2008505124A (ja) 2004-07-02 2008-02-21 アドバンシス ファーマスーティカル コーポレイション パルス送達用錠剤
US20060194285A1 (en) * 2005-02-08 2006-08-31 Wei Lian Biological production of clavulanic acid and related compounds
DE102005009277B4 (de) * 2005-02-25 2008-07-31 Johnson Controls Interiors Gmbh & Co. Kg Halterung für eine Komponente
CN102988362B (zh) * 2005-12-07 2014-11-05 巴斯利尔药物股份公司 单环-内酰胺类抗生素与β-内酰胺酶抑制剂的有效的联合应用
US8357394B2 (en) 2005-12-08 2013-01-22 Shionogi Inc. Compositions and methods for improved efficacy of penicillin-type antibiotics
US8778924B2 (en) 2006-12-04 2014-07-15 Shionogi Inc. Modified release amoxicillin products
US20070218038A1 (en) 2006-03-17 2007-09-20 Pegasus Biologics, Inc. Stabilized, sterilized collagen scaffolds with active adjuncts attached
US8299052B2 (en) * 2006-05-05 2012-10-30 Shionogi Inc. Pharmaceutical compositions and methods for improved bacterial eradication
EP2575781A1 (en) 2010-06-03 2013-04-10 Mahmut Bilgic Production method for the effervescent formulation comprising cephalosporin and potassium clavulanate
WO2014089365A1 (en) 2012-12-07 2014-06-12 Venatorx Pharmaceuticals, Inc Beta-lactamase inhibitors
JP6346904B2 (ja) 2013-01-10 2018-06-20 ベナトルクス ファーマシューティカルズ，インク． ベータ−ラクタマーゼ阻害剤
US9944658B2 (en) 2013-03-14 2018-04-17 VenatoRx Pharmaceuticals, Inc. Beta-lactamase inhibitors
US20150361108A1 (en) * 2014-06-11 2015-12-17 VenatoRx Pharmaceuticals, Inc. Orally bioavailable beta-lactamase inhibitors
US9511142B2 (en) 2014-06-11 2016-12-06 VenatoRx Pharmaceuticals, Inc. Beta-lactamase inhibitors
PT3154989T (pt) 2014-06-11 2021-05-18 Venatorx Pharmaceuticals Inc Inibidores de beta-lactamase
EP3347008B1 (en) 2015-09-11 2022-03-09 Venatorx Pharmaceuticals, Inc. Beta-lactamase inhibitors
WO2017100537A1 (en) 2015-12-10 2017-06-15 VenatoRx Pharmaceuticals, Inc. Beta-lactamase inhibitors
JP2019527214A (ja) 2016-07-14 2019-09-26 アカオジェン インコーポレイテッド 細菌感染症の処置における使用のためのセフチブテンとクラブラン酸の組み合わせ
EP3494121B1 (en) 2016-08-04 2021-10-06 Venatorx Pharmaceuticals, Inc. Boron-containing compounds
US11267826B2 (en) 2017-05-26 2022-03-08 VenatoRx Pharmaceuticals, Inc. Penicillin-binding protein inhibitors
EP3630782A4 (en) 2017-05-26 2021-03-03 Venatorx Pharmaceuticals, Inc. PENICILLIN BINDING PROTEIN INHIBITORS
CN114846332A (zh) 2019-10-25 2022-08-02 仪器实验室公司 与酶生物传感器相容的杀生物剂组合物及其使用方法

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3801464A (en) 1972-02-09 1974-04-02 Lilly Co Eli Antibiotic a16886 and process for production thereof
IE41109B1 (en) 1974-04-20 1979-10-24 Beecham Group Ltd Novel -lactam antibiotic from streptomyces clavuligerus
US4140764A (en) * 1974-12-18 1979-02-20 Beecham Group Limited β-Lactamase inhibitors and process for their preparation
US4123540A (en) * 1974-12-18 1978-10-31 Beecham Group Limited Isoclavulanic acid as an antibacterial and a β-lactamase inhibitor
YU40452B (en) * 1975-02-07 1986-02-28 Beecham Group Plc Process for the elimination of contaminating impurities from clavulinic acid
US4144242A (en) * 1975-02-07 1979-03-13 Glaxo Laboratories Limited Process for the purification of clavulanic acid
JO984B1 (en) * 1977-10-11 1979-12-01 بيتشام غروب ليمتد A dry pharmaceutical compound with a suitable dosage unit for oral administration

Also Published As

Publication number Publication date
US4556559A (en) 1985-12-03
AR216430A1 (es) 1979-12-28
JPS5549831B2 (no) 1980-12-15
LU72322A1 (no) 1975-08-20
JPS533588A (en) 1978-01-13
US4526783A (en) 1985-07-02
FI54144B (fi) 1978-06-30
DE2560074C2 (de) 1985-03-28
DE2517316A1 (de) 1975-10-23
NO751407L (no) 1975-10-21
YU42744B (en) 1988-12-31
SE8605405L (sv) 1986-12-16
DD132297A5 (de) 1978-09-20
DK167275A (no) 1975-10-21
NO801852L (no) 1975-10-21
RO69984A (ro) 1980-12-30
RO77320A (ro) 1981-08-17
SE435286B (sv) 1984-09-17
NO791956L (no) 1975-10-21
OA05203A (fr) 1981-02-28
JPS521996B2 (no) 1977-01-19
JPS50142789A (no) 1975-11-17
CA1059050A (en) 1979-07-24
DD121799A5 (no) 1976-08-20
DE2559410A1 (de) 1976-09-23
US4525352A (en) 1985-06-25
JPS533590A (en) 1978-01-13
SE443562B (sv) 1986-03-03
CH629252A5 (de) 1982-04-15
US4427690A (en) 1984-01-24
AR206627A1 (es) 1976-08-06
DE2517316C2 (de) 1985-03-07
KE3076A (en) 1980-10-03
MY8100195A (en) 1981-12-31
SE7811201L (sv) 1978-10-27
JPS5549830B2 (no) 1980-12-15
YU274381A (en) 1983-06-30
HK54780A (en) 1980-10-03
SE446687B (sv) 1986-10-06
SE435287B (sv) 1984-09-17
NO150838C (no) 1985-01-09
CY1078A (en) 1980-12-27
JPS5549833B2 (no) 1980-12-15
DE2559411A1 (de) 1976-10-21
IN140042B (no) 1976-09-04
NL7504621A (nl) 1975-10-22
IL47087A0 (en) 1975-06-25
YU42745B (en) 1988-12-31
SE8306328L (sv) 1983-11-16
SE7811203L (sv) 1978-10-27
FR2267778A1 (no) 1975-11-14
IL47087A (en) 1979-07-25
SE7811202L (sv) 1978-10-27
JPS533589A (en) 1978-01-13
FR2267778B1 (no) 1978-11-17
DK141254C (no) 1980-08-11
YU90875A (en) 1982-05-31
PH16474A (en) 1983-10-25
JPS50142591A (no) 1975-11-17
DE2559411C2 (de) 1982-07-01
IE41109B1 (en) 1979-10-24
SE7811200L (sv) 1978-10-27
CH630631A5 (de) 1982-06-30
IE41109L (en) 1975-10-20
JPS532495A (en) 1978-01-11
AR219050A1 (es) 1980-07-31
YU274481A (en) 1983-06-30
SE8105829L (sv) 1981-10-02
JPS532494A (en) 1978-01-11
SE7504541L (no) 1975-12-19
SE422063B (sv) 1982-02-15
SE453600B (sv) 1988-02-15
DK141254B (da) 1980-02-11
YU39941B (en) 1985-06-30
SE8306328D0 (sv) 1983-11-16
JPS5246957B2 (no) 1977-11-29
FI751133A (no) 1975-10-21
SE8605405D0 (sv) 1986-12-16
NL163824C (nl) 1980-10-15
NO150838B (no) 1984-09-17
FI54144C (fi) 1978-10-10
NL163824B (nl) 1980-05-16
US4560552C1 (en) 2001-10-16
JPS5549832B2 (no) 1980-12-15
NZ177159A (en) 1978-03-06
NO145247C (no) 1982-02-10
US4560552A (en) 1985-12-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
NO145247B (no) Fremgangsmaate for fremstilling av clavulansyre
SU648117A3 (ru) Способ получени антибактериального вещества
US4110165A (en) Process for the production of clavulanic acid
US6218380B1 (en) Pharmaceutical compositions
US6031093A (en) Solid salts of clavulanic acid
US4072569A (en) Preparation of clavulanic using Streptomyces jumonjinensis
US4168202A (en) Process for producing antibiotics
IE46719B1 (en) Thienamycin derivatives
US4235882A (en) Antibiotic MM 4550A
US4162324A (en) Antibiotics 890A1 and 890A3
US4189473A (en) Antibiotic MM 13902
US4282322A (en) Process for enzymatic deacylation of antibiotics
SU1194285A3 (ru) Способ получени антибиотиков А51568-фактора А и А51568-фактора В
US4172129A (en) Antibiotics
US4235967A (en) Process for producing antibiotics by cultivation of Streptomyces flavogriseus
US4113856A (en) Antibiotic mm 13902
US3973005A (en) Antibiotic TA
NO136204B (no)
US4292309A (en) Antibiotics C-14482 B1, B2 and B3
US4335108A (en) Paulomycin A and B and preparation thereof
JPS6253157B2 (no)
US3061516A (en) Telomycin and its production
US4206202A (en) Antibiotics
CA1055395A (en) Antibiotics
US4205067A (en) Antibiotics