NO137012B

NO137012B - Analogifremgangsm}te for fremstilling av terapeutisk aktive pyrazolo (1,5a)-pyrimidiner

Info

Publication number: NO137012B
Application number: NO4476/72A
Authority: NO
Inventors: Roland Kenith Robins; Brien Darrell Eugene O; Thomas Novinson; Robert Henry Springer
Original assignee: Icn Pharmaceuticals
Priority date: 1971-12-09
Filing date: 1972-12-06
Publication date: 1977-09-05
Also published as: JPS4864097A; IL40895A; NO137012C; LU66597A1; IE37189B1; GB1412017A; RO62762A; NL7216539A; CH603652A5; IE37189L; HU168530B; DE2257547A1; BE792533A; BG22401A3; IL40895A0; SE398751B; DD104530A5

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrorer en analogifremgangsmåte for fremstilling av terapeutisk aktive pyrazolo-/1 ,5-a7pvriinidiner med den generelle formel

hvori R^ er alkyl med 1-8 karbonatomer eller fenyl, R2 er alkyl med 1-8 karbonatomer og R^ er fluor, klor, brom eller jod, og det særegne ved analogifremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen er at aminopyrazol med formel omsettes med et diketon med den generelle formel

hvori R1 og har den ovennevnte betydning, og.det resulterende 5,7-disubstituerte pyrazolo/J , 5-a7pyrimidin behandles med et halogenerende middel for å oppnå det onskede produkt.

Som angitt i Sutherland et al, in "Cyclic AMP", Am. Rev. Biochem. 37, 1^9 (1968) er cyklisk adenosin-monofosfat (C-AMP) funnet å være en intracellulær "sekundær budbringer" som iverksetter mange av virkningene for en rekke forskjellige hormoner. I samsvar med denne teori påvirker de faste budbringer-hormoner epinefrin og norepinefrin den adenyl-cyclase som inneholdes ved eller i celleveggene til intracellulært å danne cyklisk AMP fra adenosin-trifosfat ved mottagelse av det ekstracellulære hormonsignal. Det dannede cykliske AMP virker i sin tur som en sekundær budbringer og stimulerer intra cellulære,funksjoner som er spesielle for målcellene for hormonet. Cyklisk AMP er således påvist å "aktivere" proteinkinåse som i sin tur frembringer fysiologiske virkninger som f.eks. muskelkontraksjon, glycogeno-lyse, steriodegenisis og lipolyse.

Cyklisk AMP nedbrytes imidlertid in vivo av f osf odiesterase enzymer som katalyserer hydrolyse av cyklisk purin.-nucleotid til 5'-adenosin-monofosfat med en påfolgende tap av virkning. Det har fblgelig vært foreslått at suibstituterte cykliske AMP analoge som er mer motstandsdyktige overfor fosfodiesterase-nedbrytning enn det naturlig forekommende cykliske nucleotid skulle tilfores for å hjelpe til med å fremme de cellulære prosesser. Syntetisk produksjon .. av slike forbindelser er imidlertid ganske kostbar og det ville derfor være fordelaktig å forbedre de gunstige virkninger av naturlig produsert cyklisk AMP ved å tilfore forbindelser som er i stand til å inhibere

de' uonskede virkninger av f osf odiesterase-enzymer.

Sutherland et al foreslår i Circulation ^ 7. 1279 (1968), at den farmakologiske effekt av teofyllin som har strukturformelen er en folge av dets evne til å inhibere virkningen av f osf odiesterase-enzymer. Te'ofyllin har således vært anvendt i stedet for de adenylcyklasestimulerende hormoner, epinefrin og norepinefrin, som en hjertestimulant etter hjertestans og i refraktoriske astmatilfeller som bronkialdilator. Teofyllin inhiberer imidlertid ikke selektivt fosfodiesterase, men gir heller en generell stimulasjon til sentralnervesystemet.

Folgelig kan bruk av teofyllin gjore mottageren nervos og

irritabel og kan også medfore kardiovasculære virkninger, dvs. hurtige hjerteslag. I samme forbindelse er teofyllin ikke så kraftig som en fosfodiesterase-inhibitor som onskelig og må folgelig anvendes i storre mengder, og dette kan selvfølgelig forsterke de uonskede virkninger som er nevnt ovenfor.

F.L. Rose et al, i artikler i J. Chem. Soc. 56^-2 (1963), 3357

(1965) og 1593 (1969) nevner et antall triazoloZ2,3-c7pyrimi-

diner og triazolo/J+,3-Q7pyraziner (f.eks. forbindelsene I og II vist i det'folgende) som er strukturmessig beslektet med teofyllin og som er i stand til å beskytte dyr mot histamin-induserte bronchospasmer.

Basert på den mulighet at de farmakologiske virkninger av forbindelsene I og II kan være resultatet av den samme biokjemiske mekanisme som er foreslått for teofyllin ble det fremstilt forskjellige substituerte pyrazolo/"! , 5-a7pyrimidiner og disse ble funnet å besitte evnen til å inhibere enzymet 3'?5'-cyklisk AMP-fosfodiesterase. Videre vurdering av disse forbindelser har også vist at mange av disse fosfodiesterase-inhibitorer har betydningsfulle farmakologiske egenskaper, spesielt innen det kardiovasculære område. F.eks. er 3-bromo-5 ,7-dimetylpyrazolo^Tl ,5-a7pyrimidin og 3-bromo-5-metyl-7-n-propylpyrazolo/1,5~a7pyrimidin ikke bare vesentlig mer aktive enn teofyllin mot forskjellige fosfodiesterase-enzymer, men de har også evnen til å frembringe en positiv inotropisk virkning i en anestetisert hund uten særlig endring av hjerterytmen eller blodtrykket.

Det vil sees at de illustrerende utforelseseksempler og den. beskrivelse som folger at alkylsubstituentene generelt inneholder fra 1 til 8 karbonatomer, foretrukket fra 1 til 6 karbonatomer og kan være forgrenet eller lineære.

De i henhold til fremgangsmåten fremstillbare forbindelser og den generelle fremgangsmåte er illustrert i forbindelse med de skjematiske tegninger som folger. Det utgangsmaterial som anvendes er 5-aminopyrazol (1).

Den vanlige- fremgangsmåte for fremstilling av 5?7-dialkylpyrazolo/^,5-a7pyrimidiner skjer i samsvar med Y. Makisumi, Chem. Pharm. Bull. (Tokyo), IQ, 612 (1962) og er gjengitt i reaksjonsskjema I. 5-aminopyrazol (1) kondenseres med pentan-2, h-dion og gir 5,7-dimetylpyrazolo/T,5-&7pyrimidin (2). Det er ytterligere funnet at kondensering av 5-aminopyrazol (1) med heptan-3 ,5-dion og. nonan->+,6-dion gir utmerkede utbytter av 5,7-dietylpyrazolo/T,5-a7pyrimidin (3) henhv. 5,7-di-n-propyl-pyrazolo/T , 5-a7pyi'imidin (1+).

De 3-usubstituerte-5,7-uialkylpyrazolo/J ,5-a7pyrimiciner

(2, 3 og h) underkastes lett elektrofilt angrep i 3-stillingon som vist i reaksjonsskjema II. Behandlingen av 5,7-dialkylpyrazolo/1,5-a/pyrimidiner (2, 3 eller h) med N-bromsuccinimid resulterer i dannelse av 3-brom-5,7-dialkylpyrazolo/l,5-a7-pyrimidiner (5, 9 og 10). Det or ytterligere funnet at behandlingen av (2) med N-klor-succinimid eller med iod-mono-klorid resulterer i dannelsen av 3_klor (6) og 3-iodo (2)-derivatene av'5,7~dimetylpyrazolo/J ,5-a7pyrimidin. Reaksjonen mellom 5,7-dimetylpyrazolo/l,5-a7pyrimidin (2) med trifluoreddiksyre og bor-trifluorideterat er funnet å gi 5,7- dimetyl-3-fluoro-pyrazolo/1,5-a/pyrimidin (8). At det elektrofile angrep finner sted i 3-stillingen i disse 5,7-dialkylpyrazolo/1 ,5-a7pyrimidiner er blitt vist v.ed protonmagnetiske resonansspektra, da protonet (the up-field proton) ved 6,60 i (som er koblet til protonet ved 2;

J = 0,0066 i) som finnes i 5,7-dimetylpyrazolo/J ,5-a7pyrimidinet (2) ikke er tilstede i disse 3_sut>stituerte derivater. Kondenseringen av 5-aminopyrazol (1) med usymmetriske B-diketoner er vist i reaks jonsskjema III. Omsetningen mellom 5-aminopyrazol (1) med heksan-2,^-dion gir en blanding av siomerene 11 og 13. På grunn av likheten i de fysikalske egenskaper for disse to isomerer er separering vanskelig og av denne grunn ble den rå isornerblanding av 11 og 13 omdannet til hoyeresmeltende derivater 15, som kan isoleres ved kolonne-kromatografering og fraksjonert omkrystallisering. Tilsvarende gir kondensering av 5-aminopyrazol (1) med heptan-2,^-dion en blanding av isomerer 12 og 1^-, som når den behandles med N-bromsuccinimid gir 3-brom-5-metyl-7-n-pro<p>yl<p>yrazolo/J , 5-a/- pyrimidin (16) som renses ved kromatografering. Tilsvarende gir kondensering av 1-fenyl-1,3-butan-dion med 3-aminopyrazol (1) et isomert produkt som kan omkrystalliseres uten kromatografering og gir 7-Kietyl-5-f enylpyrazolo/J ,5-a/pyrimidin (17) • At denne isomer ble oppnådd i stedet for 5-metyl-7-fenylpyrazolo/J ,5-a7-pyrimidin ble påvist ved sammenligning av fysikalske data

(proton-magnetiske resonansspektra, ultraviolettspektra og smp.)

med den 5-me~tyl-isomer som tidligere er omtalt av H. Dorn et al, J. Prak. Chem.. 313. 969 0970-

Den strukturformel som er angitt for forbindelsene 15-17 er basert på de poroton-magnetiske resonansspektra for de godt adskilte C^ og C^ metyl-signaler. Det er påvist (H. Reimlinger, Chem. Ber.. 103, 1900 og 3252 (1970), IQjf, 2232 og 2237 (1971 ))

at i 5,7-dimetylpyrazolo/JT ,5-a7pyrimidin (2) er C^-metylsignalet, ved at denne ligger inntil brohode-nitrogenet, udekket i en storre utstrekning enn C^-metylsignalet (inntil N^-nitrogenet) og opptrer således i et lavere felt. Verdiene er 2,56 & for C^-metyl og 2,73 for C^-metyl i deuterokloroform. Da erstatningen med en lengre alkylkjede (etyl, propyl etc.) av en metylgruppe ved enten CV eller C^ ikke var forventet å endre den kjemiske forskyvning for deri resterende metylgruppe, kan 5-metyl-7-alkyl-is orne r en skjelnes fra 7-Kietyl-5-alkyl-isomer en ved hjelp av pmr (i deuterokloroform) og prosentinnholdet av hver isomer i den isomere blanding kan bedommes ut fra integrering av signalene. På tilsvarende måte opptrer C^-metylsignalet ved 2,6o£ og C^-metylsignalet ved 2,72 & (i deuterokloroform) for pmr-spektret for 3-brom-5 , 7-dimetylpyrazolo/Jl ,5~a7pyrimidin (5), hvilket tillater identifisering av de fraskilte produkter 15 og 16 fra bromeringen (og etterfølgende kromatografering) av de isomere blandinger 11 og 13 eller 12 og 1^f.

Oppfinnelsen skal ytterligere beskrives og illustreres i de folgende eksempler, hvori alle deler og ^-andeler er på vektbasis og alle temperaturer er.angitt i °C med mindre annet er angitt. Smeltepunkter ble foretatt på et smeltepunktapparat av Thomas-Hoover-typen, og er ukorrigert. Infrarode og nucleare magnetiske resonans-spektra ble bestemt på et Perkin-Elmer-257 infra-rodt spektrofotometer henhv. på et Hitachi Perkin-Elmer R-20A nucleært magnetisk resonans-spektrofotometer med hoy opplosning. Hydro-generinger ble gjennomfort på en Parr-hydrogenator ved romtemperatur og et utgangstrykk på 2,9^- kg/cm hydrogen. Alle prover ga en enkel flekk ved tynnskikt-kromatografering og ble analysert av Heterocyclic Chemical Corporation, Harrisonville, Missouri, USA. Hvor analyser er angitt bare ved tegnene for elementene eller funksjonene, var de analytiske resultater oppnådd for disse elementer eller funksjoner innenfor + 0, h% av de teoretiske verdier.

EKSEMPEL I

5 ,7-dietylpyrazolo/J ,5-a7pyrimidin (3)

Denne forbindelse ble fremstilt fra 6,5 g (0,05 mol) heptan-3., 5-di ori og utbyttet av kromatograf ert material (hvite nåler med smp. i+3 - V+°C fra petroleter) var 6,3 g ( 72%).

Analyse beregnet for C^H^N^ (MW 175): C, 68, 5>+; H, 7,^8;

W, 23, 98

Funnet: C, 68,52; H, 7,58; N, 2^,25

NMR (CDCl^) m, 1,<l>f£(både C^-etyl og C^-etyl-tripletter);

m, 3,1 $ (både C^-etyl og C^-etyl-kvartetter); s, 6 ,58& (Cg-H);

s, 6,6£ (C3~H^ °S s, 8,1(C2-H), idet de siste to protoner er parret med J0 = 1 ,9 eps.

EKSEMPEL II

5 ,7-di-n-propylpyrazolo/JI , 5-a7pyrimidin ( h-)

Denne forbindelse ble syntetisert fra nonan-^-,6-dion (15,6 g,

0,10 mol) og ga etter kromatografering 17,0 g ( 8h%) av en blekgul olje.

Analyse beregnet for C12<H>17N3(MW 203): C, 70,93; H,.., N,20,68

Funnet: C, 71,16; H, 8,25; N,20,85

Kp. 155-158°C (0j1 mm)

EKSEMPEL III

3-brom-5,7-dimetyl-pyrazolo/i ,5-a7pyrimidin (5)

Til en losning av 2,0 g (13,6 mmol) 5,7-dimetylpyrazolo-Zl,5-a/pyrimidin (Y. Makisumi, Chem. Pharm. Bull. (Tokyo) 10, 612 (1962)) i CHCl^ (25 ml) ble det tilsatt N-bromsuccinimid (NBS) (2,^2 g (13,6 mmol)). Denne blanding ble oppvarmet på et dampbad 10 min. og fikk deretter avkjole seg til romtemperatur. Den klare gule losning ble så tilsatt til en iskold opplosning av kaliumhydroksyd (50 ml 2N) under god omroring. CHCl^-laget ble torret over Na2S0^ og ble deretter kromatograf ert på basisk aluminiumoksyd. Inndamping av CHCl^-elueringsmidlet ga et hvitt faststoff som ble renset videre ved omkrystallisering fra petroleter (30-60°) og ga 1,7 g (56%) av analytisk rent produkt med smp. 115 - 116°C.

Analyse (CgHgN^Br) C, H, N.

NMR (CDCl^); fire singletter i et forhold på 3:3:1:1 ved 2,60$

(CH^), 2,72£> (CB^) , 6,62 l (H i 6-stillingen) og 8,10£ (H i 2- stillingen). Spektret for utgangsmaterialet fremviser topper ved 2,56i> (CH3 ved C?) , 2,73 S (CH3 ved. C^) , 6,58fc (Cg-H) , . 6,60 £ (C^-H), 8,11£ (C2-H) (protoner ved C2 og C^ var parret,

J = 2,1 eps.)

EKSEMPEL IV

3- klor-5 ,7-dimetyl-pyrazolo/J*1 ,5-a7pyrimidin (6)

På tilsvarende måte som ved fremstillingen i eksempel III ga behandlingen av 5 ,7_dimetyl-pyrazolo,£l , 5-a^pyrimidin (1,20 g (8,15 mmol)) med N-klorsuccinimid (NOS) (1,33 g (10,0 mmol)) 963 mg (65%) av analytisk rent produkt med smp. 89 - 90 C.

Analyse (CgHg^Cl) C, H, N.

EKSEMPEL V

5,7-dimetyl-3-iodo-pyrazolo/l,5-a7pyrimidin (7)

En losning av. ICI (5,0 g (27 mmol)) i CHCl^ (5o ml) ble tilsatt til en omrort losning av 5,7-dimetylpyrazolo/JI ,5-a/pyrimidin (2,96 g (20 mmol)) i CHCl^ (50 ml). I lopet av noen minutter ble blandingen varm og krystaller av hydrokloridsaltet av den onskede forbindelse begynte å skille seg ut. Blandingnn ble oppvarmet på dampbad i 2-3 min. for fullstendig omsetning og ble satt bort i kjoleskap over natten. Det gule hydrokloridsalt ble fraskilt ved filtrering, vasket med E^O og deretter lufttorret. Det gule faststoff, som veide h, k g, ble opplost i vann (100 ml) og denne opplosning ble gjort alkalisk ved tilsetning av NaOH-opplosning (2,5 N). Den alkaliske opplosning ble ekstrahert medCHCl^ (3 ganger 25 ml) og CHCl^-ekstraktene ble torret over Na2S0^_. CHCl^-ekstrakten ble kromatograf ert på basisk aluminiumoksyd og CHCl,-elueringsmidlet inndampet til torrhet. Resten ble omkrystallisert fra petroleter (30-60 ) og ga 2,02 g (37%) analytisk xent produkt med smp. (120-122°C).

Analyse (CgHgN^I) C, H, N.

EKSEMPEL VI

5,7-dimetyl-3-fluor-pyrazolo/1,5-a/pyrimidin (8)

En blanding av 5,7-dimetyl-pyrazolo/J ,5-a/pyrimidin (1,^7 g

(10 mmol)) trifluoreddiksyreanhydrid (2,0 ml) og bortrifluorid-eterat (2,0 ml) i CB^C^ (30 ml) ble oppvarmet under tilbakelop i 2h timer. Ved slutten av dette tidsrom ble den rode losning avkjolt og tilsatt til en iskald opplosning av NaOH (30 ml),

2N). Det organiske skikt ble fraskilt og det alkaliske lag ble ekstrahert med CH^C^ (3 ganger 20 ml). De kombinerte CB^C^-ekstrakter ble vasket med vann (2 ganger 20 ml) og torret over Na2S0^_. CH2CI2-ekstrakten ble inndampet og resten dekket med

n-pentan og bråkjolt. De gulhvite krystallinske plater ble fraskilt ved filtrering og omkrystallisert fra n-heptan og ga et analytisk rent produkt med smp. 129 - 130°C.

Analyse (CgHgN^F) C, H, N, F.

NMR (CDCl^) fire singlétter i et forhold på 3:3:1:1 ved

2,55 b (CH^), 2,60 b (CH3), 6,60^ (H i 6-stilling) og 8,60 i>

(H ved 2-stilling).

EKSEMPEL VII

3-brom-5 ,7-dietylpyrazolo/J , 5-a/pyr imi din (9)

Denne forbindelse ble fremstilt ved bromering av 1,75 g

(0,01 mol) av dialkylforbindelsen. Kromatografering på basisk aluminiumoksyd med kloroform ga 2,0 g ( 79%) hvite nåler med smp. 6!+ - 65°C

Analyse beregnet for C^R^N^r (MW 2$ k): C, ^7,2^; H, ^,72;

N, 16,53-

Funnet: C, ^7,10; H, h, 63; N, 16,71.

NMR (CDC13) t, 1 ,35fe og t, 1 ,!+3£ (fra Cy og C^etyl);

q, 2,98b og q, 3,105 (fra C^- og Cy-etyl); s, 6,63å (Cg-H) og s, 8,08b(C2-H) i forholdet 3:3:2:2:1:1 . Det ble ikke iakttatt noen kobling for singlétter ved 6,63 tø og 8,08 .

EKSEMPEL VIII

3~brom-5,7-di-n-propylpyrazolo/J ,5-a7pyrimidin (10)

Denne forbindelse ble fremstilt ved bromering av ^-,06 g

(0,02 mol) av 5,7-di-n-propyl-utgangsforbindelsen for å oppnå

-, C I C^ Ol\ V,,,-; 4-^ .Sl^^ ^ rv, r, & 0°r ottor. Ir

petroleter.

•Analyse beregnet for C^H^N^Br (MW 282): C, 51 ,06; H, 5,67;

N, l<*>f,89.

Funnet: C, 50,85; H, 5,92; N, 15,11-.

NMR (CDCl^) propylgrupper synes som overlappende multipletter

ved 1,2b , 1,8b og 3,Oi ; s, 6,6o£> (Cg-H); s, 8,8 å (C-H) .

I forholdet 6:^:^:1:1.

EKSEMPEL IX

5-metyl(n-propyl)-7-n-propyl(metyl)pyrazolo/l ,5-a7pyrimidin (12 og%)

Denne forbindelse ble fremstilt fra heptan-2,<1>+-dion (8,2 g

0,06<1>+ mol) og den dominerende isomer ble funnet å være 5-metyl-7-n-propyl. Utbytte: 15 g blandede isomerer (86%) farvelost halvfast stoff med smp. ho - Lf5°C pg kp. 165 - 169°C/

0,1 mm.

Massespektrum M+ = 175

Analyse beregnet for' C^H^N^MW 175): C, 68,5^; H, 7,W;

N, 23,98.

Funnet: C, 68,31; H, 7,56; N, 23,79'.

NMR (CDCl^) m, 1,2 b (C^, C^-propyl); m, 1,8 (C^, C^-propyl);

m, 3,OS(C5, C7-propyl); s, 2,58 b (C^-CH^ og s, 2,72&

(C7-CH3)'; s, 6,58S(C6-H) og koblet s, 6,63& (C3~H) med koblet s, 8,10fc (C2-H) H2?3 = 1,9 eps.

EKSEMPEL X

3-brom-7-etyl-5-metylpyrazolo//i ,5-a7pyrimidin (15)

Denne forbindelse ble fremstilt fra 2,6 g (0,063 mol) av isomerblandingen av dialkylforbindelsen og ga 2,5 g ( 6h%) av den rene 7-etyl-5metyl-isomer med smp. 78 - 79°C. -Analyse beregnet for C^H^N^Br (MW 2^0): C, ^5,00; H, M-,16;

N, 17,50.

Funnet: C, ¥f,79; H, ^,38; N, 17,<1>+0.

NMR (CDC13) t, 1,<l>f3> (etyl); s, 2,6 i (C^-CH^ ; q, 3,10$, (etyl); s, 6,63S (C6-H); s, 8,10i(C2-H).

Bestemmelsen av den isolerte isomer er basert pa nmr data for 3-brom-5,7-dimetyl-pyrazolo/"1 ,5-a/pyrimidin og som har metyl-topper ved 2, 60b og 2,72Å . Toppen ved 2,6oå skyldes C^-CH^ dvs. metylgruppen nærmest N^-nitrogenet som ikke er innbefattet i brohodet. Toppen ved 2,72fc skyldes 0,-,-CH^, dvs. metylgruppen nærmest brohodenitrogenet på grunn av dettes storre avskjermede effekt (engelsk: "deshielding effect") som er i samsvar med studier av andre forfattere (Y. Makisumi, et al, Chem. Pharm. Bull.. J2, 20h (196^)).

ff

EKSEMPEL XI

3-brom-5-metyl-7-n-propylpyrazolo(/"1 , 5-a/pyrimidin (16)

Denne forbindelse ble fremstilt fra 1,75 g (0,01 mol) av 5,7-dialkyl-forbindelsen (blandede isomerer) som ble renset ved kromatografering på basisk aluminiumoksyd med kloroform. Det ble oppnådd en farvelos olje og denne stivnet hurtig til hvite krystaller som ved omkrystallisering fra benzen-potroleter (1:25) ga hvite nåler med smp. 88 - 89°C i en mengde på 1,20 g ( h8%).

Analyse beregnet for C^ qE^ N^ Bv (MW 2^): C, , 2h-, H, ^,72;

N, 16,53-

Funnet: C, M-7,30; H, k,81 ; N, 16,60.

NMR (CDC13) t, 1,05}> (propyl); m, 1 ,8£ (propyl); s, 2,6^

(C5-CH3); t, 3,10i (propyl);- s, 6,59Å (Cg-H); s, 8,05i (C2-H).

EKSEMPEL XII

5-fenyl-7-metyl-pyrazolo/l,5-a7pyrimidin (17)

Denne forbindelse ble fremstilt fra 1-fenylbutan-1,3-dion

(8,1 g 0,05 mol) på vanlig måte og ga et råprodukt som var kromatografert på basisk aluminiumoksyd med eterkloroform (9:2) og ga hvite plater, 1,3 g (12,7%) ved smp. 70 - 71°C

etter omkrystallisering fra petroleter. Dette produkt ble påvist å være den rene 5~metyl-7-fenyl-isomer ved hjelp av nmr.

Analyse beregnet for C^H^N^ (MW 209,3): C, 7^,62; H, 5,30;

N, 20,08.

Funnet: C, 7^,77; H, 5,20; N, 20,21.

NMR (CDCXj): s, 2,82$> (C^-CH^); koblet s, 6,7U (C^-H);

s, 7,10i (C6-H) m, 7,80bog 8,15& (C^-fenyl ABX-monster) og koblet s, 8,03S (C2-H). J2 3 = 2>1 CPS-

EKSEMPEL XIII

Forbindelsene i henhold til oppfinnelsen ble provd på inhibering av fosfodiesterase ved den folgende fremgangsmåte.

3',5'-cyklisk-AMP-fosfodiesterase (PDE) ble isolert og renset fra tre forskjellige vev på folgende måte. Homogenater av kaninnyre, kaninlunge og kveghjerte ble fremstilt i sukrose-tris-magnesium-buffer og underkastet sentrifugering ved liten hastighet for å fjerne kjerner og cellerester. Væskefåsene ble så sentrifugert ved 105,000 x g i 30 min. og væskefasen etter de 105,000 x g ble så fraksjonert under anvendelse av ammonium-sulfat. De bunnfall som dannes ved 0-30%'metting samles ved sentrifugering ved 20,000 x g, opploses i trismagnesiumpuffer og

dialyseres over natten mot den samme puffer. En annen (NH^^SO^-f raks jon oppnås ved å heve konsentrasjonen i den forste væskefase til 50%. Disse to (NHIf)2S01+-fraksjoner så vel som væskefasen fra 30 til 50%-fraksjonen ble så provd på PDE-aktivitet under anvendelse av metoden til Appleman, Biochem. 10, 311 (1971). Den forste fraksjon oppnådd fra både nyre og lungevev inneholder en PDE med lav affinitet for 3',5'-c-AMP (hoy Km). Den annen fraksjon fremviser en to-faset kurve når Lineweaver-Burk-metoden for analysen anvendes. Dette viser enten nærvær av to separate enzymer, det ene med en hoy og det annet med en lav affinitet for C-AMP, eller et protein med to separate posisjoner. Appleman, supra, viser at ekstrakter av hjerne gir to separate enzymer (en hoy Km og en lav Km) som kan skilles ved separose-gelkromatografering.

De inhiberingstudier som er gjengitt i tabellene I og II ble gjennomfort med enzymet med lav affinitet (fraksjon I, hoy Km) oppnådd fra kaninnyre eller kaninlunge. De forsok som er

gjengitt i tabellene III-VI ble gjennomfort med enzymet med hoy affinitet (fraksjon II, lav Km) oppnådd fra kaninlunge eller nyre eller kveghjerte. I^Q-verdier ble beregnet i enkelte tilfeller ved en avsetning av lang I mot prosent I ved eksperimenter hvori inhibitor-konsentrasjonen varieres over et bredt område, ved en konstant 3',5'-cyklisk AMP-konsentrasjon på omtrent 5 x 10<-I>fM (tabellene I og II) eller 1 ,6 x 10~^M

(tabellene III og IV). Den relative inhiberende aktivitet for hver forbindelse sammenlignet med teofyllin er uttrykt som en a-verdi. Denne verdi oppnås ved å dividere I^Q-verdien oppnådd for den spesielle forbindelse som vurderes.

I de fleste tilfeller ble det beregnet a-verdier fra inhiberingsforsok gjennomfort med en eneste konsentrasjon for proveforbindelsen så lenge som den frembragte inhibering ved denne konsentrasjon var fra 20 til 80%. I dette tilfelle ble a-verdien beregnet som

konsentrasjon av teofyllin som gir (x%) inhibering konsentrasjon av provesubstans som gir den samme (x%) inhibering

Gyldigheten av denne metode or kontrollert, ve-.; sammenligning av de oc-verdior som oppnås ved (1) målinger v od on onest~ konsentrasjon av inhibitor og (2) målinger ved fire konsentrasjoner av inhibitor (Ic~ bestemmelser), a-vc-rdiene

jo .. sammenlignet på denne'måte er blitt funnet å samsvare innenfor 10% i forhold til hverandre.

Den basiske inkubasjonsblanding inneholdt f 61gend.e.-substanser (mengder i /imol) . ^H-cAMP (spesifikk aktivitet omtrent 2,180 cmp/pmol), 0,00016; Tris pH 7,5, ^0; HgCl2, 0,5; enzym (cAMPfosfodiesterase), 5-50 /ug protein; og 10~^ til 10~<6 >molarkonsentrasjoner av inhrbitor; inkubasjonstid 10 min. ved 30°C. Ved avsluttet inkubering ble blandingen oppvarmet til 90°C i 2 min. og 100 jig slanggift-fosfodiesterase fra Crotalus atrox ble tilsatt og rorene ble inkubert i 10 min.

ved 30°C. Blandingen ble så avkjolt i 1 ml "Dowex" 1-2X, 200-^fOO mesh suspensjon, fremstilt ved å blande 100 g av harpiksen i 200g"H20, ble tilsatt og blandingen sentrifugert. En prove av væskefasen ble anvendt for å bestemme enheter pr. min. under anvenJ-lse av et væskeskintillasjons-spektrometer. Verdier for zero-tid ble oppnådd ved å anvende inkubasjoner hvori cAMP fosfodiesterasen var utelatt fra den forste inkubasjon.

De resultater som er vist i de foregående tabeller viser at flere av de ved fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen fremstillbare forbindelser er mange ganger så effektive som inhibitorer for fosfodiesteraseenzym enn teofyllin. Av samme grunn viser resultatene at forbindelsene er i stand til selektiv inhibering.

Generelt kan forbindelsene som virker som fosfodiesterase-inhibitorer finne anvendelse ved behandling av forstyrrelser som lar seg påvirke ved tilforsel av epinefrin eller norepinefrin, da i begge tilfeller resultatet er opprettholdelse av storre nivåer av C-AMP- i det forste tilfelle ved å bremse C-AMP-nedbrytningen og i det annet tilfelle ved å stimulere dets fremstilling.

Flere av de omhandlede forbindelser er provd in vivo og viser

en rekke aktiviteter som indikerer selektiv transport til spesifikke vev. 5?7-dimetyl-3-brom-pyrazolo/l,5-a/pyrimidin fremviste anti-odem og inhiberende virkning mot ADP-indusert plateaggregasjon, og hadde i tillegg muskelrelakserende egenskaper ved 300 mg/kg 3 timer etter tilfdrselen. Denne forbindelse hadde også en positiv inopropisk virkning på hjertet.

Forelopige farmakologisk bedommelse har vist at 5?7-dimetyl-3-jodopyrazolo/1,5-a7pyrimidin og 3-bromo-5,7-dimetylpyrazolo-/I,5-a7pyrimidin har kraftige kardiovaskulære egenskaper. Ved fremstilling av isolert Langendorf-hjerte, medforer disse forbindelser koronar dilatering og/eller frembringer en positiv inotropisk effekt ved konsentrering på 2,5 mg/ml.

Når de tilfores oralt til rotter i en dose på 50 mg/kg kroppsvekt, senket 3~Dronlo-5,7-dimetylpyrazolo//*l ,5-j!?>yrimidin og 5 ,7-dimetyl-3- jodo-pyrazolo//1 ,5-a7pyrimidin betraktelig blodtrykket (10% eller mer). Ved en oral dose på 25 mg/kg senket 5 ,7<_>dimetyl-3- jodo<py>razolo/f ,5-a7pyrimidin blodtrykket med 10% i perioder på opptil 6 timer.

Ved bedbvede hunder bevirket 3-t>romo-5,7-climetyl-pyrazolo/1., 5-a/- pyrimidin (5 mg/kg i.v. infusjon) en kraftig oking i hjerte-

ytelsen ved både 30 og 60 min. etter begynt infusjon, (p 0,05).

Den okte effekt var henhv. 21 og 20%. Hjerteeffekten ble holdt

over basislinjeverdier i 2 timer etter at infusjonen var stanset. Lignende okning (p=0,005) ble iakttatt i slagvolum under det

samme tidsrom. Det ble ikke bemerket noen særlige endringer i arterietrykket, sentralt venetrykk, eller pulsen.

Claims

1. Analogifremgangsmåte for fremstilling av terapeutisk aktive pyrazolo/1,5-&7pyrimidiner med den generelle formel

hvori R 1 er alkyl med 1-8 karbonatomer eller fenyl, R2 er alkyl med 1-8 karbonatomer og. R^ er fluor, klor, brom eller jod,karakterisert ved at aminopyrazol med formel omsettes med et diketon med den generelle formel hvori IL og R2 har den ovennevnte betydning, og det resulterende 5 ,7-disubstituerte pyrazoloZ/1 ,5-aypyrimidin behandles med et halogenerende middel for å oppnå det onskede produkt.