JP2006517191A - 共刺激因子を用いた併用療法 - Google Patents

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Abstract

炎症又は免疫症状を治療する方法について述べる。ＩＬ−１阻害剤及びＢ細胞若しくはＴ細胞活性化の阻害剤を用いて炎症又は免疫症状を治療する方法について述べる。ＴＮＦ阻害剤及びＢ細胞若しくはＴ細胞活性化の阻害剤を用いて炎症又は免疫症状を治療する方法について述べる。

Description

優先権情報
本願は、２００２年１２月３０日出願の米国特許出願第６０／４３７，４０５号の優先権の利益を主張する。米国特許出願第６０／４３７，４０５号の全内容は、参照により、本明細書中に組み込まれる。
本発明は、炎症及び免疫反応の制御に関与するポリペプチドに関する。本発明はまた、サイトカインアンタゴニストによるＢ細胞及びＴ細胞刺激に関与する分子を用いた併用療法にも関する。
炎症性自己免疫疾患は、主として、生体システムの複雑な調節異常によって起こる。進行中の自己免疫疾患において、ある例では、ある一定の炎症性サイトカイン、例えばＴＮＦ及びＩＬ−１等が上昇する。さらに、ある例では、免疫Ｔ細胞及びＢ細胞も、サイトカイン、ケモカイン及び自己抗体を産生することにより関与し得る。
体の自己分子に対して免疫系が活性化されることにより、自己免疫が生じる。ある一定の炎症性自己免疫疾患は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）とＴ細胞との間、及びＴ細胞とＢ細胞との間で起こる相互作用の結果である。ある炎症性自己免疫疾患は、炎症性サイトカインカスケードに加えて、Ｂ細胞の活性化の結果でもある。免疫反応において、抗原性ペプチドは、Ｔ細胞上で発現されているＴ細胞受容体に対して、抗原提示細胞（ＡＰＣｓ）上で発現されている主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子により提示される。
このような認識が起こってもＴ細胞が十分に活性化されないことがあり得る。ある例においては、ＣＤ４がＭＨＣ分子と相互作用し、「第二の、又は共刺激」シグナル（ＡＰＣ及びＴ細胞のコグネイト相互作用の間）が、Ｔ細胞増殖、サイトカイン産生及び細胞内のシグナル伝達に必要とされ得る。ＣＤ２８とＢ７分子との相互作用は、Ｔ細胞を活性化するための第二のシグナルとして位置づけられている。この免疫共刺激経路には、活性化Ｔ細胞で発現される、負の調節因子、ＣＴＬＡ４が存在する。ＣＴＬＡ−４の可溶性受容体組み換えタンパク質で処理すると、免疫Ｔ及びＢ細胞が不活性化される。
近年、ＡＰＣ又はＴ細胞で発現される多くの他の共刺激分子（ＣＤ４０：ＣＤ４０Ｌ、Ｂ７：ＣＤ２８及びＣＴＬＡ−４、４−ＩＢＢ：４−１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ：ＯＸ４０、Ｂ７ＲＰ１：ＩＣＯＳ等）が、Ｔ細胞活性化に関与することが示されてきた。これらの共刺激分子のうちあるものは、Ｂ細胞活性化及び抗体産生にも関与している。
ある実施形態において、治療上有効量の、ＩＬ−１阻害剤と、Ｂ７阻害剤及びＣＤ２８阻害剤のうち少なくとも１つとを投与することを含む、ＩＬ−１介在疾患の治療法を提供する。
ある実施形態において、治療上有効な量の、ＴＮＦ−α阻害剤と、Ｂ７阻害剤及びＣＤ２８阻害剤のうち少なくとも１つとを投与することを含む、ＴＮＦ−α介在疾患の治療方法を提供する。
ある実施形態において、治療上有効な量の、ＩＬ−１阻害剤と、Ｂ７阻害剤及びＣＤ２８阻害剤のうち少なくとも１つとを投与することを含む、炎症又は自己免疫症状の治療方法を提供する。
ある実施形態において、治療上有効な量の、ＴＮＦ−α阻害剤と、Ｂ７阻害剤及びＣＤ２８阻害剤のうち少なくとも１つとを投与することを含む、炎症又は自己免疫症状の治療方法を提供する。
ある実施形態において、治療上有効な量の、（ｉ）ＡＧＰ３阻害剤、ＢＡＦＦＲ阻害剤及びＴＡＣＩ阻害剤のうち少なくとも１つと、（ｉｉ）Ｂ７阻害剤及びＣＤ２８阻害剤のうち少なくとも１つとを投与することを含む、炎症又は自己免疫症状の治療方法を提供する。
ある実施形態において、治療上有効な量の、ＩＬ−１阻害剤と、治療上有効な量のＴＮＦ−α阻害剤と、Ｂ７阻害剤及びＣＤ２８阻害剤のうち少なくとも１つとを投与することを含む、炎症又は自己免疫症状の治療方法を提供する。
本明細書中で使用される節の表題は、組織的な目的のためのみであり、記載される内容を限定するようには解釈されるべきものではない。本願において引用される全ての参考文献及び参考文献の一部は、あらゆる目的のために、明示的な参照により本明細書に組み込まれる。
本出願において、単数形を使用する場合、別段の定めをした場合を除き、それは複数形を含む。この出願において、「又は」の使用は、別段の定めをした場合を除き、「及び／又は」を意味する。さらに、「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語、ならびに他の形、例えば「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」及び「含まれた（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」等の使用は、限定的ではない。また、「要素」又は「成分」等の用語は、１つのユニットを含有する要素及び成分、及び、別段の定めをした場合を除き、複数のサブユニットを含有する要素及び成分、の両方を包含する。
組み換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成及び組織培養及び形質転換（例えばエレクトロポレーション、リポフェクション）のために、標準的技術を使用し得る。製造者によるマニュアルに従って、又は本分野で一般に完成されているようにして、又は本明細書中で記載するようにして、酵素反応及び精製技術を行い得る。先行技術及び手段は、通常、本分野において公知の従来法に従って、及び、本明細書をとおして引用し考察する様々な全般的及びより具体的な参考文献に記載されているようにして行い得る。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９））（あらゆる目的のために、参照により本明細書に組み込まれる。）を参照のこと。具体的な定義を行わない限り、本明細書中で記載する分析化学、合成有機化学及び医薬品化学、薬化学に関連して利用する専門用語、検査法及び技術は、本分野で公知であり一般的に用いられているものである。化学合成、化学分析、製剤、処方及び送達、ならびに患者の治療に対して、標準的技術を用い得る。
本開示により利用される場合、次の用語は、別段に定めない限り、次の意味を有すると理解されたい。
「単離されたポリヌクレオチド」という用語は、本明細書中で使用する場合、ゲノム、ｃＤＮＡ若しくは合成由来のポリヌクレオチド、又は、それらのある組み合わせを意味するが、それらは、その由来に基づいて、「単離されたポリヌクレオチド」が、（１）天然においてその「単離されたポリヌクレオチド」が見出されるポリヌクレオチド全て又はその一部が付随していない、（２）それが天然では連結していないポリヌクレオチドと連結している、又は（３）より大きな配列の一部として、天然では生じない。
「単離されたタンパク質」という用語は、本明細書中で使用する場合、ｃＤＮＡ、組み換えＲＮＡ又は合成由来のものによりコードされたタンパク質又はそれらのある組み合わせを意味するが、それは、（１）それが通常一緒に見出される少なくともいくつかのタンパク質がない、（２）例えば同種由来といった、同じソース由来の他のタンパク質が本質的にない、（３）異種由来の細胞により発現される、又は（４）天然に生じない。
「ポリペプチド」という用語は、天然のタンパク質又は、天然配列の１つ又は複数のアミノ酸の欠失、付加及び／又は置換を有する配列に対する総称として本明細書中で使用する。
本明細書中で使用する場合、対象物に対して適用される場合、「天然に生じる」とは、対象物が天然において見出され得ることを意味する。例えば、天然のソースから単離することができる、及び実験室等で人為的、意図的に改変していない、生物（ウイルスを含む）において存在するポリペプチド又はポリヌクレオチド配列は、天然に生じるものである。
「作動可能に連結された」という用語は、本明細書中で使用する場合、ある成分に対して意図された様式でその成分が機能できるような関係にある成分を意味する。例えば、コード配列に「作動可能に連結された」制御配列は、コード配列の発現が制御配列に対応する状態で行われる様式で連結されている。
「制御配列」という用語は、本明細書中で使用する場合、それらに連結されているコード配列の発現及びプロセシングに影響を与え得るポリヌクレオチド配列を意味する。このような制御配列の性質は、ホスト生物により異なり得る。ある実施形態によると、原核生物に対する制御配列には、プロモーター、リボソーム結合部位及び転写終結配列が含まれ得る。ある実施形態によると、真核生物に対する制御配列には、プロモーター及び転写終了配列が含まれ得る。ある実施形態において、「制御配列」には、リーダー配列及び／又は融合パートナー配列が含まれ得る。
「可溶性受容体分子」という用語は、受容体と会合する１つ又は複数のリガンドと依然として結合可能であるその受容体の断片を含有する分子を意味する。ある実施形態において、断片には、受容体の完全な細胞外ドメイン又はそのサブフラグメントが含まれ得る。ある実施形態において、その可溶性受容体分子は、他の基と連結され得る。
ある実施形態において、この断片は、スプライシング変異体において見られるように、その受容体由来の追加のアミノ酸と連結され得る。ある実施形態において、スプライシング変異体には、細胞内ドメイン又は膜貫通ドメイン由来のアミノ酸、又は他の天然タンパク質由来のアミノ酸さえも含まれ得る。
ある実施形態において、この断片は、別のタンパク質又はタンパク質断片配列と連結されて、融合タンパク質を形成し得る。ある実施形態において、この融合パートナータンパク質又は断片により、この分子の半減期を延長させ得る（例えば、Ｆｃドメイン、アルブミン又はロイシンジッパードメイン）。ある実施形態において、この融合パートナータンパク質又は断片により、異なる機能が与えられ（例えば、同様の又は別のリガンドと結合可能になる）、二機能性の分子を形成し得る。ある実施形態において、この機能融合パートナーは、同じ受容体の別の断片であり得、従ってリガンド結合二量体を形成し得る。
ある実施形態において、この断片をＮ末端メチオニンと連結させ得るが、これは、Ｅ．コリ細胞等の原核細胞で発現させるのに有用であり得る。
ある実施形態において、この断片を非タンパク性の基と連結させ得る。このような基には、これらに限定されないが、Ｎ−結合又はＯ−結合炭水化物鎖、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の水溶性ポリマー及びそれらの誘導体が含まれる（例として、米国特許第４，１７９，３３７号を参照のこと。）。この用語の意味の範囲内の他の化学的修飾には、これらに限定されないが、エチレングリコール／プロピレングリコール共重合体、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール及び関連分子が含まれる。ある実施形態において、このポリペプチドは、この分子内の任意の場所で、又はこの分子内の所定の場所で修飾され得、１、２、３個以上の結合した化学部分を含み得る。ある実施形態において、ポリペプチドは、アミノ末端、又はそのペプチド内の選択されたリジン若しくはアルギニン残基等、このポリペプチドの所定の位置でも修飾され得る。他の化学修飾には、これらに限定されないが、タンパク質を検出及び単離可能にする酵素的、蛍光性、同位体又はアフィニティ標識等の検出可能な標識が含まれる。
「タンパク質」という用語は、長さ又は由来に関係なく、組み換えにより産生された、又は天然に生じる、全長又は短縮型の、天然の配列又は突然変異配列を有する、翻訳後修飾がある、又はない、哺乳類細胞、細菌細胞又は他のどの発現系で発現されるかを問わない分子を含む、ポリペプチドを意味する。
「特異的結合パートナー」という用語は、関心のあるタンパク質に対するその分子の活性がアンタゴニスト的であるかアゴニスト的であるかにかかわらず、関心のあるタンパク質に選択的に結合するあらゆる分子を意味する。典型的には、特異的結合パートナーには、これらに限定されないが、抗体、可溶性受容体、ペプチド、改変ペプチド及び関連分子が含まれる。
「ビヒクル」という用語は、治療用タンパク質の分解を防ぎ、及び／又は半減期を延長させ、毒性を低下させ、免疫原性を低下させ、又は生物活性を向上させる分子を意味する。ある実施形態において、ビヒクルには、Ｆｃドメイン、加えて、直鎖状ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリリジン、デキストラン等）、分枝鎖ポリマー（例えば、Ｄｅｎｋｅｎｗａｌｔｅｒらに対する、１９８１年９月１５日発行の米国特許第４，２８９，８７２号；Ｔａｍに対する、１９９３年７月２０日発行の米国特許第５，２２９，４９０号；Ｆｒｅｃｈｅｔらによる、１９９３年１０月２８日公開の国際特許ＷＯ第９３／２１２５９号を参照）、脂質、コレステロール基（ステロイド等）、炭水化物又はオリゴ糖、及び、サルベージ受容体（ｓａｌｖａｇｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）に結合するあらゆる天然又は合成タンパク質、ポリペプチド又はペプチドが含まれる。
「天然のＦｃ」という用語は、単量体であれ多量体であれ、完全な抗体を消化することにより得られる非抗原結合断片の配列を含む、分子又は配列を意味する。ある実施形態において、天然のＦｃのオリジナルの免疫グロブリンのソースは、ヒト由来のものであり、これらに限定されないが、ＩｇＧ１及びＩｇＧ２を含む免疫グロブリンの何れかであり得る。典型的な天然のＦｃは、共有（つまり、ジスルフィド結合）及び非共有結合により２量体又は多量体型に連結され得る単量体ポリペプチドで構成されている。ある実施形態において、天然のＦｃ分子の単量体サブユニット間の分子間ジスルフィド結合数は、クラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ）又はサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＡ１、ＩｇＧＡ２）に依存して１〜４の範囲である。ある実施形態において、天然のＦｃは、ＩｇＧのパパイン消化により、ジスルフィド結合した２量体となる（例えば、Ｅｌｌｉｓｏｎら（１９８２）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１０：４０７１−９を参照のこと。）。「天然のＦｃ」という用語は、本明細書中で使用する場合、単量体、２量体及び多量体に対する総称である。
「Ｆｃ変異体」という用語は、天然のＦｃから改変されたがサルベージ受容体、ＦｃＲｎに対する結合部位をなお含有する分子又は配列を意味する。国際特許出願ＷＯ第９７／３４６３１号（１９９７年９月２５日公開）及びＷＯ第９６／３２４７８号において、典型的なＦｃ変異体、並びに、サルベージ受容体との相互作用が記載されているが、これらをあらゆる目的のために、参照により本明細書に組み込む。ある実施形態において、「Ｆｃ変異体」という用語は、非ヒト天然Ｆｃ由来のヒト化された分子又は配列を含む。ある実施形態において、天然のＦｃには、本発明の融合分子には必要ではない構造特性又は生物学的活性を与える部位であるため除去してもよい部位が含まれる。ある実施形態において、「Ｆｃ変異体」という用語は、（１）ジスルフィド結合形成、（２）選択したホスト細胞との不一致、（３）選択したホスト細胞における発現に対するＮ末端の不均一性、（４）グリコシル化、（５）相補体との相互作用、（６）サルベージ受容体以外のＦｃ受容体への結合、又は（７）抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）に影響を及ぼす、又は関与する１つ又は複数の天然Ｆｃ部位又は残基を欠失する分子又は配列を含む。あるＦｃ変異体については、２０００年５月４日公開の国際特許ＷＯ第００／２４７８２号でさらに詳しく記載されている（その全てをあらゆる目的で、参照により本明細書に組み込む。）。
「Ｆｃドメイン」という用語には、上記で定義される、天然のＦｃ及び、Ｆｃ変異体分子ならびに配列が包含される。Ｆｃ変異体及び天然Ｆｃに関して、「Ｆｃドメイン」という用語には、そのままの抗体を消化したものであれ、又は他の手段で生成されたものであれ、単量体又は多量体型の分子が含まれる。
「多量体」という用語は、Ｆｃドメイン又はＦｃドメインを含有する分子に適用する場合、共有結合、非共有結合又は、共有結合性及び非共有結合性両方の相互作用により会合する２個以上のポリペプチド鎖を有する分子を意味する。ＩｇＧ分子は、通常、２量体；ＩｇＭ、５量体；ＩｇＤ、２量体；及びＩｇＡ単量体、２量体、３量体又は４量体を形成する。ある実施形態において、多量体は、Ｆｃの天然Ｉｇ源の配列及びその結果得られる活性を生かすことにより、又は（下記で定義する）そのような天然Ｆｃ等の誘導体化により形成され得る。
「２量体」という用語は、Ｆｃドメイン又はＦｃドメインを含有する分子に適用する場合、共有結合又は非共有結合により会合する２個のポリペプチド鎖を有する分子を意味する。
「誘導体化する」及び「誘導体化」又は「誘導体化された」という用語は、次のうち少なくとも１つが存在する過程及びその結果得られた化合物をそれぞれ含む。（１）その化合物が環部分を有する；例えば、その化合物内のシステイニル残基の間の架橋結合；（２）その化合物が、架橋されているか又は架橋結合部位を有する；例えば、その化合物がシステイニル残基を有し、従って培養中又はインビボで架橋２量体を形成する；（３）１つ又は複数のぺプチジル結合が非ぺプチジル結合に置換されている；（４）Ｎ末端が、ＮＲＲ１、ＮＲＣ（Ｏ）Ｒ１、−ＮＲＣ（Ｏ）ＯＲ１、−ＮＲＳ（Ｏ）２Ｒ１、−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨＲ、スクシンイミド基又は置換された、若しくは非置換のベンジルオキシカルボニル−ＮＨ−で置き換えられている（式中、Ｒ及びＲ１及び環置換基は、後に定義するとおりである。）；（５）Ｃ末端が−Ｃ（Ｏ）Ｒ２又は−ＮＲ３Ｒ４で置き換えられている（式中、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は、後に定義するとおりである。）；（６）個々のアミノ酸部分が、選択した側鎖又は末端残基と反応可能な試薬で処理することにより修飾されている化合物。
「ペプチド」という用語は、２〜４０アミノ酸の分子を意味するが、これには、これらに限定されないが、３〜２０アミノ酸の分子及び６〜１５アミノ酸の分子が含まれる。ある実施形態において、ペプチドは、ペプチドライブラリ中にある（例えば、ファージディスプレイライブラリ）、又はタンパク質消化により得られる、本明細書中に引用する何れかの方法により無作為に生成され得る。
「無作為化された」という用語は、ペプチド配列に関して使用する場合、完全に無作為な配列（例えば、ファージディスプレイ法により選択される。）及び、天然に生じる分子の１つ又は複数の残基が、天然に生じる分子ではその場所にないアミノ酸残基で置換されている配列を意味する。ペプチド配列を同定する典型的な方法には、これらに限定されないが、ファージディスプレイ、Ｅ．コリディスプレイ、リボソームディスプレイ、酵母を用いたスクリーニング、ＲＮＡ−ペプチドスクリーニング、化学的スクリーニング、合理的設計、タンパク質構造解析等が含まれる。ある無作為化ペプチド及びそれらを生成するある方法は、例えば、２０００年５月４日公開の国際特許ＷＯ第００／２４７８２号（あらゆる目的のために、その全体を参照により本明細書に組み込む。）に記載されている。
「薬理学的に活性がある」という用語は、記載されている物質が、医学的パラメーター（例えば、Ｔ細胞増殖）又は疾患状態（例えば、癌、自己免疫疾患）に影響を与える活性を有すると判断されることを意味する。ある実施形態において、薬理学的に活性のある化合物には、下記で定義される、アゴニスト的又は模倣的、及びアンタゴニスト的な化合物が含まれる。
「医薬品（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ａｇｅｎｔ）又は薬物（ｄｒｕｇ）」という用語は、本明細書中で使用する場合、患者に対して適切に投与した場合、所望する治療効果を誘導することが可能な化学的化合物又は組成物を意味する。
「生物試料」という用語は、本明細書中で使用する場合、これらに限定されないが、生物（生きているもの）又は生きていたもの由来のあらゆる量の物質を含む。このような生物には、これらに限定されないが、ヒト、マウス、サル、ラット、ウサギ及び他の動物が含まれる。このような物質には、これらに限定されないが、血液、血清、尿、細胞、器官、組織、骨髄、リンパ節及び皮膚が含まれる。
本明細書中で使用する場合、「実質的に純粋」とは、対象の種が、主要な種として存在する（つまり、モル単位で、その組成物中の他のいかなる個々の種よりも量が多い。）ことを意味する。ある実施形態において、実質的に精製された断片は、対象となる種が、存在する全ての高分子種のうち少なくとも５０％（モル単位）を構成する組成物である。ある実施形態において、実質的に純粋な組成物は、その組成物中に存在する全ての高分子種のうち、約８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％を超える割合を占める。ある実施形態において、対象となる種は、本質的に均一になるまで精製され（従来の検出法により、混入した種が組成物中に検出され得ない。）、その組成物が、本質的に１種類の高分子種から成る。
「患者」という用語には、ヒト及び動物対象が含まれる。
「試薬」という用語は、本明細書において、化合物、化合物の混合物、生体高分子又は生体物質から調製した抽出物を表すために使用される。
本明細書中で使用する場合、「標識する」又は「標識された」という用語は、例えば、放射性標識されたアミノ酸の組み込み、又は、印を付されたアビジン（例えば、光学的方法又は比色法によって検出できる蛍光マーカー又は酵素活性を含有するストレプトアビジン）で検出することができるビオチン部分のポリペプチドへの結合により、検出可能なマーカーを組み込むことを意味する。ある実施形態において、標識又はマーカーが治療的でもあり得る。ポリペプチド及び糖タンパク質を標識する様々な方法が本分野で知られており、使用可能である。ポリペプチドに対する標識の例には、これらに限定されないが、次のもの：放射性同位体又は放射性核種（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）、蛍光標識（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニド蛍光物質）、酵素的標識（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、化学発光法、ビオチニル基、第２のレポーター（例えば、ロイシンジッパー対配列、第２の抗体に対する結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）により認識される予め定められたポリペプチドエピトープが含まれる。ある実施形態において、立体障害の可能性を減少させるために、様々な長さのスペーサーアームにより標識を連結する。
「アンタゴニスト」又は「阻害剤」という用語は、関心のある関連タンパク質の生物学的活性をブロック又は何らかの方法で妨害する分子、又は、関心のある関連タンパク質の既知のアンタゴニスト又は阻害剤に相当する生物学的活性を有する分子を意味する。
さらに、この発明の化合物の生理学的に許容可能な塩も本明細書中に包含される。「生理学的に許容可能な塩」とは、医薬適合性であることが分かっている、又は後に発見されるあらゆる塩を意味する。ある例には、これらに限定されないが、酢酸塩；トリフルオロ酢酸塩；塩酸塩、臭化水素酸塩等のハロゲン化水素；硫酸塩；クエン酸塩；酒石酸塩；グリコール酸塩；及びシュウ酸塩が含まれる。
「ポリヌクレオチド」という用語は、本明細書中で述べる場合、少なくとも１０塩基長のヌクレオチドの多量体型を意味する。ある実施形態において、この塩基とは、リボヌクレオチド若しくはデオキシリボヌクレオチド、又は何れかのタイプのヌクレオチドの修飾型であり得る。この用語には、１本鎖及び２本鎖のＤＮＡが含まれる。
「オリゴヌクレオチド」という用語には、本明細書中で述べる場合、天然に生じる及び／又は天然に生じないオリゴヌクレオチド結合により一緒に結合されている、天然に生じる、又は修飾されたヌクレオチドが含まれる。オリゴヌクレオチドは、一般に２００塩基長以下を含有するポリヌクレオチドのサブセットである。ある実施形態において、オリゴヌクレオチドは、１０〜６０塩基長である。ある実施形態において、オリゴヌクレオチドは、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０〜４０塩基長である。オリゴヌクレオチドは、例えば、遺伝子突然変異の構築において使用するための、１本鎖又は２本鎖であり得る。本発明のオリゴヌクレオチドは、センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドであり得る。
「天然に生じるヌクレオチド」という用語には、デオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドが含まれる。「修飾されたヌクレオチド」という用語には、修飾又は置換された糖類等を有するヌクレオチドが含まれる。「オリゴヌクレオチド結合」という用語には、ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、ホスホロセレノアート、ホスホロジセレノアート、ホスホロアニロチオアート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏａｎｉｌｏｔｈｉｏａｔｅ）、ホスホラニラダート（ｐｈｏｓｈｏｒａｎｉｌａｄａｔｅ）、ホスホロアミダート等のオリゴヌクレオチド結合が含まれる。例えば、ＬａＰｌａｎｃｈｅら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１４：９０８１（１９８６）；Ｓｔｅｃら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０６：６０７７（１９８４）；Ｓｔｅｉｎら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：３２０９（１９８８）；Ｚｏｎら、Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ ６：５３９（１９９１）；Ｚｏｎら、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ｐｐ．８７−１０８（Ｆ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，編、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｅｎｇｌａｎｄ（１９９１））；Ｓｔｅｃら、米国特許第５，１５１，５１０号；Ｕｈｌｍａｎｎ ａｎｄ Ｐｅｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ９０：５４３（１９９０）（あらゆる目的のために、参照により本明細書に組み込む。）を参照のこと。オリゴヌクレオチドには、検出用の標識が含有され得る。
関連物及びポリペプチドの同一性及び類似性は、既知の方法により容易に算出できる。そのような方法には、これらに限定されないが、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，編、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９３）；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ１，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．及びＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，編、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ（１９９４）；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９８７）；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．及びＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，編、Ｍ．Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９１）；及びＣａｒｉｌｌｏら、ＳＩＡＭ Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．，４８：１０７３（１９８８）に記載されているものが含まれる。
同一性を調べるある好ましい方法は、試験対象の配列間のマッチが最大になるように設計されている。同一性を調べる方法は、公に利用可能なコンピュータプログラムに記載されている。２つの配列間の同一性を決定するためのあるコンピュータプログラム法には、これらに限定されないが、ＧＡＰを含むＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．，１２：３８７（１９８４）；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＢＬＡＳＴＰ，ＢＬＡＳＴＮ及びＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３−４１０（１９９０））が含まれる。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）及び他のソース（ＢＬＡＳＴ Ｍａｎｕａｌ，Ａｌｔｓｃｈｕｌら、ＮＣＢ／ＮＬＭ／ＮＩＨ Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ ２０８９４；Ａｌｔｓｃｈｕｌら、上述（１９９０））から公に利用可能である。公知のＳｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムも、同一性を調べるために使用し得る。
２つのアミノ酸配列を整合させるためのあるアラインメントスキームを実行することにより、２つの配列の短い領域のみがマッチし得るが、この２つの全長配列間では顕著な関連がない場合でも、この小さな整合領域は、非常に高い配列同一性を有し得る。従って、ある実施形態において、選択した整合方法（ＧＡＰプログラム）により、標的ポリペプチドの少なくとも５０個の連続するアミノ酸にわたり整合が得られるであろう。
例えば、コンピュータアルゴリズムＧＡＰ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いて、配列同一性のパーセンテージを調べたい２つのポリペプチドを、それらの個々のアミノ酸が最大にマッチするように整合させる（アルゴリズムにより決定される「マッチした長さ」）。ある実施形態において、ギャップオープニングペナルティー（平均対角線の３ｘとして計算される。「平均対角線」は、使用している比較マトリックスの対角線の平均であり；「対角線」とは、特定の比較マトリックスにより各完全アミノ酸マッチに割り当てられたスコア又は数字である。）及びギャップ伸長ペナルティー（通常、ギャップオープニングペナルティーの１／１０である。）、並びにＰＡＭ２５０又はＢＬＯＳＵＭ６２等の比較マトリックスが、本アルゴリズムと併せて使用される。ある実施形態において、標準比較マトリックス（ＰＡＭ２５０比較マトリックスに対して、Ｄａｙｈｏｆｆら、Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，５（３）（１９７８）；ＢＬＯＳＵＭ６２比較マトリックスに対して、Ｈｅｎｉｋｏｆｆら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ，８９：１０９１５−１０９１９（１９９２）を参照のこと。）も、本アルゴリズムにより使用される。
ある実施形態において、ポリペプチド配列比較に対するパラメーターには、次のものが含まれる。
アルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８：４４３−４５３（１９７０）；
比較マトリックス：Ｈｅｎｉｋｏｆｆら、上述（１９９２）からのＢＬＯＳＵＭ６２；
ギャップペナルティー：１２
ギャップ長ペナルティー：４
類似性の閾値（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ ｏｆ Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）：０
ＧＡＰプログラムは、上記パラメータに有用であり得る。ある実施形態において、上述のパラメータは、ＧＡＰアルゴリズムを用いたポリペプチド比較（エンドギャップに対するペナルティーを伴わない）の初期設定のパラメータである。
本明細書中で使用される場合、２０個の従来のアミノ酸及びそれらの略語は、従来使用されているものに従う。Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ――Ａ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（第２版、Ｅ．Ｓ．Ｇｏｌｕｂ及びＤ．Ｒ．Ｇｒｅｎ，編，Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，Ｍａｓｓ．（１９９１））（あらゆる目的のために、参照により本明細書に組み込む。）を参照のこと。２０個の従来のアミノ酸、α−、α−二重置換アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、乳酸及び他の従来のものではないアミノ酸等の天然ではないアミノ酸の立体異性体（例えば、Ｄ−アミノ酸）もまた、本発明のポリペプチドの適切な成分であり得る。従来のものではないアミノ酸の例には、４−ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタメート、ε−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリジン、ε−Ｎ−アセチルリジン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリジン、σ−Ｎ−メチルアルギニン及び他の同様のアミノ酸及びイミノ酸（例えば４−ヒドロキシプロリン）が含まれる。本明細書中で使用されるポリペプチド表記法において、標準的使用法及び従来のものに従い、左方向がアミノ末端方向であり、右方向がカルボキシ末端方向である。
同様に、別段の定義がない限り、１本鎖ポリヌクレオチド配列の左方向末端は、５’末端であり、２本鎖ポリヌクレオチド配列の左方向は、５’方向と呼ぶ。初期のＲＮＡ転写の５’から３’への付加の方向は、転写方向と呼ぶ；そのＲＮＡと同等の配列を有するＤＮＡ鎖における配列領域で、ＲＮＡ転写の５’から５’末端のものは、「上流配列」と呼ぶ；そのＲＮＡと同等の配列を有するＤＮＡ鎖における配列領域で、ＲＮＡ転写の３’から３’末端のものは、「下流配列」と呼ぶ。
本明細書中で使用する場合、「モジュレータ」という用語は、分子の活性又は機能を変化させる又は変更する化合物である。例えば、モジュレータは、モジュレータが存在しない場合に見られる活性又は機能の程度と比較して、分子のある活性又は機能の程度を向上又は低下させ得る。ある実施形態において、モジュレータは阻害剤であり、分子の活性又は機能のうち少なくとも１つの程度を低下させる。分子のある典型的な活性及び機能には、これらに限定されないが、結合親和性、酵素活性及びシグナル伝達が含まれる。ある典型的な阻害剤には、これらに限定されないが、タンパク質、ペプチド、抗体、ぺプチボディ、炭水化物又は小さな有機分子が含まれる。ぺプチボディについては、例えば国際特許ＷＯ第０１／８３５２５号に記載されている。
本発明内において、あらゆる数の分子が特異的結合パートナーとして働き得る。典型的な分子には、これらに限定されないが、抗体、ペプチド及びＦｃ−ペプチド融合分子が含まれる。
「抗体」又は「抗体ペプチド」は、完全な抗体、又は特異的結合に対して完全な抗体と競合するその結合断片を意味する。ある実施形態において、結合断片を組み換えＤＮＡ技術により生成させる。ある実施形態において、結合断片は、そのままの抗体を酵素的又は化学的に切断することによって生成される。結合断片には、これらに限定されないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ及び１本鎖抗体が含まれる。
ある実施形態において、本発明は、抗体又はその抗原結合ドメイン、又はその断片、変異体若しくは誘導体を提供するが、それは、標的分子の何れかにおいてエピトープに結合し、部分的又は完全なアンタゴニスト活性を有する。ある実施形態において、標的分子は、ヒト等の哺乳類のものであり、可溶性又は細胞表面付随型、又はその断片、誘導体及び変異体であり得る。
数多くの抗体作製方法が本分野で知られている。このような方法は、本発明のある実施形態による有用な分子の生成に役立つ。ある実施形態において、標的分子（例えば、マウス又はヒトＢＣＭＡ又はＴＡＣＩ）、又は免疫原性断片、その誘導体若しくは変異体を動物に免疫することにより抗体を作製し得る。ある実施形態において、標的分子が発現されトランスフェクションした細胞の表面に付随するように標的分子をコードする核酸分子を含有するベクターをトランスフェクションした細胞で動物を免疫し得る。ある実施形態において、抗体又は抗原結合ドメイン配列を含有するライブラリを、標的分子への結合に関してスクリーニングすることにより、抗体である特異的結合パートナーを得ることができる。ある実施形態において、タンパク質又は、集められたファージ粒子の表面で発現し、そのファージ粒子内にコードＤＮＡ配列が含有されるバクテリオファージ外殻タンパク質とのペプチド融合物として、バクテリオファージにおいてライブラリを作製し得る（「ファージディスプレイライブラリ」と呼ばれる。）。ある実施形態において、ファージディスプレイライブラリには、可変軽鎖及び重鎖等のヒト抗体をコードするＤＮＡ配列が含有される。ある実施形態において、突然変異誘発及びスクリーニングを複数回繰り返すことにより、標的分子に結合する配列をさらに変化させることができる。
ある実施形態において、抗体又は抗原結合ドメインである特異的結合パートナーは、天然の抗体と同じく、４量体の糖タンパク質であり得るか、又は１本鎖抗体；例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’又はＦ（ａｂ）’断片、二重特異性抗体、異種抗体又は他の断片、変異体若しくはそれらの誘導体であり得、これらは、標的分子に結合可能であり、標的分子活性を部分的又は完全に中和する。ある実施形態において、抗体又は抗原結合ドメインは、ハイブリドーマ細胞株（例えば、マウス骨髄腫細胞に融合させた脾臓細胞等の抗体産生細胞）で産生させるか、又は、その抗体又は抗原結合ドメインをコードする核酸分子をトランスフェクションした異種の細胞株で産生させ得る。
典型的な抗体には、これらに限定されないが、ポリクローナル単一特異的ポリクローナル、モノクローナル、組み換え、キメラ、ヒト化、完全ヒト、１本鎖及び／又は二重特異性抗体が含まれる。ある実施形態において、抗体断片には、標的分子上のエピトープに結合する抗体のそれらの部分が含まれる。そのような断片の例には、これらに限定されないが、Ｆａｂ Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ）’、Ｆｖ及びｓＦｖ断片が含まれる。ある実施形態において、全長抗体の酵素的切断、又は、抗体可変領域をコードする核酸配列を含有する組み換えプラスミドの発現等、組み換えＤＮＡ技術により抗体を作製し得る。
ポリクローナル抗体は、抗原で免疫した動物の血清由来の不均一な抗体分子の集団である。ある実施形態において、抗原は、動物がその抗原のエピトープに結合可能な抗体をさらに産生するよう誘導できる、抗体結合可能な分子又は分子の一部である。抗原は、１つ又は複数のエピトープを有する。抗原が関与する特異的な反応とは、選択的な様式で、抗原がその対応する抗体と反応し、他の抗原により誘導され得る多数の他の抗体とは反応しないことを意味する。
ある実施形態において、標的分子及びアジュバントを複数回皮下又は腹腔内に注射することにより、標的分子に対するポリクローナル抗体を、動物（例えば、ウサギ又はマウス）で産生させる。ある実施形態において、標的分子又は変異体、断片又はその誘導体を、免疫を行う種において免疫原性のあるキャリアタンパク質とコンジュゲート形成させるが、それは、ある実施形態では、キーホールリンペットへモシアニン、血清、アルブミン、ウシサイログロブリン又はダイズトリプシン阻害剤等である。ある実施形態において、免疫反応を促進するために、ミョウバン等の凝縮薬を使用し得る。ある実施形態において、免疫後、動物から採血し、抗標的抗体力価について血清をアッセイすることができる。
モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）には、実質的に同じエピトープ結合部位を有する実質的に均一な抗体集団が含有される。このような抗体は、これらに限定されないが、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びそれらのあらゆるサブクラスを含むあらゆる免疫グロブリンクラスであり得る。ある実施形態において、本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマをインビトロ、インサイチュ又はインビボで培養し得る。ある実施形態において、あるものはインビボ又はインサイチュで高い力価を産み出す。
標的分子に向けたモノクローナル抗体は、一般的に、培養における継続的な細胞株による抗体分子産生を行わせるあらゆる方法を用いて産生される。典型的なモノクローナル抗体調製方法には、これらに限定されないが、Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ２５６，４９５−４９７（１９７５）のハイブリドーマ法、及びヒトＢ細胞ハイブリドーマ法、Ｋｏｚｂｏｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３３，３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５１−６３（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７）；及びＨａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）（これらのないよう全体を、あらゆる目的のために、参照により本明細書に組み込む。）が含まれる。
ある実施形態において、特異的結合パートナーには、その同系のリガンド又は受容体に対するヒト標的分子の結合を部分的又は完全に阻害するモノクローナル抗体、又は実質的に同じ結合特性を有する抗体、並びにそれらの断片及び領域が含まれる。競合的阻害によりモノクローナル抗体の特異性及び親和性を測定するある方法については、例えば、Ｈａｒｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８８）、Ｃｏｌｌｉｇａｎら、編、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．，（１９９２，１９９３），及びＭｕｌｌｅｒ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，９２：５８９−６０１（１９８３）を参照のこと。あらゆる目的のために、これらの各参考文献を、そのまま、参照により本明細書に組み込む。
ある実施形態において、ハイブリドーマ細胞株は、標的ポリペプチドと反応するモノクローナル抗体を産生する。
キメラ抗体は、各部が別の動物種由来の分子、例えば、可変領域がマウスモノクローナル抗体由来であり、定常領域がヒト免疫グロブリンであるというような分子である。ある実施形態において、適用時の免疫原性を低下させ、産生を向上させるために、キメラ抗体を使用し得る。ある実施形態において、マウスモノクローナル抗体は、ハイブリドーマからの回収量はより高いが、ヒトにおける免疫原性が高く、従って、ヒト／マウスキメラモノクローナル抗体を使用し得る。
あるキメラ抗体及びそれらのある産生方法は、本分野で既知である。例えば、Ｃａｂｉｌｌｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：３２７３−３２７７（１９８４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１−６８５５（１９８４）；Ｂｏｕｌｉａｎｎｅら、Ｎａｔｕｒｅ，３１２：６４３−６４６（１９８４）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ，３１４：２６８−２７０（１９８５）；Ｌｉｕら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４：３４３９−３４４３（１９８７）；及びＨａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）を参照のこと。あらゆる目的のために、これらの参考文献を参照によりそのまま本明細書に組み込む。
ある実施形態において、キメラモノクローナル抗体を治療用薬剤として使用し得る。ある実施形態において、所望する生物学的活性を示す限りは、重鎖及び／又は軽鎖の部分は、特定の種由来の抗体又はある特定の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一であるか又は相同であり、一方で、その鎖の残りの部分は、別の種由来の抗体又は別の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体、ならびにそのような抗体の断片において対応する配列と同一又は相同である（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８１，６８５１−６８５５（１９８５）を参照のこと。）。
本明細書中で使用される場合、「キメラ抗体」という用語には、１価、２価又は多価の免疫グロブリンが含まれる。１価のキメラ抗体は、ジスルフィド架橋を介してキメラＬ鎖と会合するキメラＨ鎖によって形成される２量体（ＨＬ）である。２価のキメラ抗体は、少なくとも１つのジスルフィド架橋を介して会合する２つのＨＬ２量体によって形成される３量体（Ｈ２Ｌ２）である。ある実施形態において、例えば、会合するＣＨ領域を用いることにより、多価のキメラ抗体を産生し得る（例えば、ＩｇＭ Ｈ鎖又はμ鎖から）。
ある実施形態において、マウス及びキメラ抗体、断片及び領域には、個々の重鎖（Ｈ）及び／又は軽鎖（Ｌ）免疫グロブリン鎖が含まれ得る。ある実施形態において、キメラＨ鎖には、標的分子に特異的な非ヒト抗体のＨ鎖由来の抗原結合領域が含まれるが、それは、ＣＨ１又はＣＨ２等のヒトＨ鎖Ｃ領域（ＣＨ）の少なくとも一部と連結している。
ある実施形態において、キメラＬ鎖には、標的分子に特異的な非ヒト抗体のＬ鎖由来の抗原結合領域が含まれ、これは、ヒトＬ鎖Ｃ領域（ＣＬ）の少なくとも一部と連結している。
ある実施形態において、同じ又は異なる可変領域結合特異性のキメラＨ鎖及びＬ鎖を有する、抗体、断片又は誘導体等の特異的結合パートナーは、既知の方法のステップに従って、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、編、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．（１９９３）、及びＨａｒｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８８）に従って、個々のポリペプチド鎖の適切な会合によっても調製し得る。これらの各参考文献の内容を、あらゆる目的のために、そのまま参照により本明細書に組み込む。ある実施形態において、キメラＨ鎖（又はその誘導体）を発現するホストは、キメラＬ鎖（又はその誘導体）を発現するホストとは分けて培養され、その免疫グロブリン鎖を分けて回収し、会合させる。ある実施形態において、そのホストを共培養し、その鎖を培養液中で自然に会合させ、その後編成された免疫グロブリン、断片又は誘導体を回収することができる。
ある実施形態において、本発明の特異的結合パートナー（例えば、キメラ抗体等）の抗原結合領域は、標的分子のヒトアナログに特異的な非ヒト抗体由来であり得る。ある実施形態において、非ヒト抗体をコードするＤＮＡのソースには、ハイブリドーマとして一般に知られているハイブリッド細胞株等、抗体を産生する細胞株が含まれる。
ある実施形態において、本発明は、抗−標的抗体の断片、変異体及び誘導体、ならびに融合物も提供する（ここで、「断片」、「変異体」、「誘導体」及び「融合物」は本明細書中で定義される）。ある実施形態において、本発明には、非修飾抗体と機能的に同等、つまり、非修飾抗体の活性のうち少なくとも１つを持つ、抗−標的抗体の断片、変異体、誘導体及び融合物が包含される。ある実施形態において、修飾には、植物及び細菌毒素等、細胞毒性タンパク質をコードする遺伝子配列の付加が含まれる。ある実施形態において、前記抗体の断片、変異体、誘導体及び融合物をあらゆるホストから産生させることができる。
「断片」という用語は、タンパク質の全長アミノ酸配列より短い部分を含むペプチド又はポリペプチドを意味する。そのような断片は、例えば、アミノ末端における短縮、カルボキシ末端における短縮、及び／又はアミノ酸配列からの残基の内部欠失から生じ得る。断片は、選択的ＲＮＡスプライシング又はインビボのプロテアーゼ活性により生じ得る。
「変異体」という用語は、天然又は非修飾配列と比較して、１つ又は複数のアミノ酸配列置換、欠失及び／又は付加を含むペプチド又はポリペプチドを意味する。変異体は、対立遺伝子多型又はスプライシング変異体等の天然に生じるものであり得るか、又は、人工的に構築したものであり得る。前記変異体をコードする対応する核酸分子からポリペプチド変異体を調製し得る。
「誘導体」という用語は、化学的に修飾された、ポリペプチド若しくはペプチド、又はそれらの変異体又は断片を意味する。その例には、これらに限定されないが、１つ又は複数のポリマーの共有結合、例えば水溶性ポリマー、Ｎ−結合型又はＯ−結合型炭水化物、糖類、リン酸塩及び／又は他のそのような分子が含まれる。ある実施形態において、誘導体は、分子結合のタイプ又は位置の何れかの点で、天然に生じるペプチド若しくはポリペプチド又は出発ペプチド若しくはポリペプチドとは異なる様式で修飾される。代表的な誘導体には、これらに限定されないが、そのペプチド又はポリペプチドに天然に存在する１つ又は複数の化学基の欠失が含まれる。
「融合」という用語は、ペプチド若しくはポリペプチド、又はそれらの断片、変異体及び／又誘導体と、異種由来のペプチド又はポリペプチドとの結合を意味する。
適切な断片には、これらに限定されないが、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ及びｓｃＦｖが含まれる。これらの断片は、完全な抗体のＦｃ断片を欠失しており、循環系からより迅速に消失し、完全な抗体よりも非特異的組織結合の可能性が少ない。Ｗａｈｌら、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．，２４：３１６−３２５（１９８３）を参照のこと。ある実施形態において、本分野で公知の方法を用いて、完全な抗体から断片を調製する。ある実施形態において、パパイン（Ｆａｂ断片を調製するため）又はペプシン（Ｆ（ａｂ’）２断片を調製するため）等の酵素を用いてタンパク質分解切断により完全な抗体から断片を調製する。ある例における本発明のモノクローナル抗体によって認識されるこれらの抗原結合領域及び／又はエピトープの同定により、本発明のある実施形態に匹敵する同様の結合特性及び治療又は診断での有用性を持つさらなるモノクローナル抗体を作製するために必要な情報が得られる。
ある実施形態において、特異的な結合パートナーの変異体も提供される。ある実施形態において、抗体及び抗原結合ドメインの変異体には、天然に生じる、又は組み換えＤＮＡ技術を用いた天然の配列のインビトロ操作により導入される、軽鎖及び／又は重鎖アミノ酸配列における変化が含まれる。ある実施形態において、天然に生じる変異体には、外来抗原に対する抗体反応が生じる間に、対応する生殖細胞系列のヌクレオチド配列においてインビボで生じる「体細胞」変異体が含まれる。
ある実施形態において、抗体及び抗原結合ドメインの変異体を、本分野で公知の突然変異誘発技術により調製し得る。ある実施形態において、抗体コード配列を介して、無作為にアミノ酸変化を導入することができ、標的分子に対する結合親和性等、所望する活性に関して得られた変異体をスクリーニングし得る。ある実施形態において、軽鎖及び／又は重鎖ＣＤＲｓ、フレームワーク領域等、抗体の選択した領域にアミノ酸変化を導入することができ、標的分子又はある他の活性について、得られた抗体をスクリーニングし得る。アミノ酸の変化には、ＣＤＲにおける１アミノ酸置換から、ＣＤＲ３等のある一定のＣＤＲ内の全ての可能なアミノ酸の置換に至る、１つ又は複数のアミノ酸置換が包含される。ある実施形態において、標的結合に対するＣＤＲ内の各残基の寄与について、ＣＤＲ内の少なくとも１残基をアラニンに置換することにより評価し得る（Ｌｅｗｉｓら、（１９９５）、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２：１０６５−７２）。ある実施形態において、より適した配列を決定するために、標的分子への結合に最適ではない残基を変更し得る。ある実施形態において、アミノ酸を挿入してＣＤＲ３等のＣＤＲの大きさを増やし、変異体を生成し得る。例えば、最も軽い鎖であるＣＣＲ３配列は、９アミノ酸長である。ある実施形態において、９残基よりも短い抗体における軽鎖ＣＤＲ３配列を、ＣＤＲを長くするために適切なアミノ酸を挿入することにより、標識抗体への結合に対して最適化し得る。
ある実施形態において、抗体又は抗原結合ドメイン変異体には、１つ又は複数の重鎖又は軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２又はＣＤＲ３の１つ又は複数におけるアミノ酸変異、及び場合によっては、１つ又は複数の重鎖又は軽鎖のフレームワーク領域、ＦＲ１、ＦＲ２又はＦＲ３におけるアミノ酸変異が含まれる。ある実施形態において、アミノ酸変化には、アミノ酸残基の置換、欠失及び／又は挿入が含まれる。
ある実施形態において、軽鎖又は重鎖の何れかの「鎖シャッフリング」により、変異体を調製し得る。Ｍａｒｋｓら、（１９９２）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：７７９−８３。ある実施形態において、１つの軽（又は重）鎖を、重（又は軽）鎖のレパートリーを有するライブラリと組み合わせ、得られた集団を所望する活性、例えば標的分子への結合等についてスクリーニングする。この技術により、１つの軽（又は重）鎖と組み合わせて、重鎖及び軽鎖両方のレパートリーを含むライブラリで可能であるものよりも、様々な重（又は軽）鎖のより大きな試料をスクリーニングすることができる。
ある実施形態において、本発明の特異的結合パートナーは、二重特異性であり得る。二重特異性の特異的結合パートナーの立体配置は、様々であり得る。ある実施形態において、二重特異性抗体は、１つの抗体（又は抗体断片）に似ているが、異なる２つの抗原結合部位（可変領域）を有する。ある実施形態において、化学的技術（Ｋｒａｎｚら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７８：５８０７（１９８１）参照のこと。）、「ポリドーマ」技術（Ｒｅａｄｉｎｇに対する米国特許第４，４７４，８９３号 を参照のこと。）により、又は組み換えＤＮＡ技術により、二重特異性抗体を産生させることができる。
ある実施形態において、本発明の特異的結合パートナーは、異種抗体でもあり得る。異種抗体は、異なる特異性を有する各抗体又は断片と結合している２つ以上の抗体、又は抗体結合断片（Ｆａｂ）である。
ある実施形態において、「ヒト化」抗体を提供する。ヒト化非ヒト抗体に対する方法は、本分野で公知である。一般に、ヒト化抗体は、非ヒトであるソースから、１つ又は複数のアミノ酸残基がヒト抗体に導入されている。一般に、非ヒト残基は、ＣＤＲに存在する。ある実施形態において、本分野で公知の方法（例えば、Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ ３２１，５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎら、Ｎａｔｕｒｅ，３３２，３２３−３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９，１５３４−１５３６（１９８８）を参照のこと。）に従って、ヒト抗体の対応する領域のかわりに、げっ歯類相補性決定領域（ＣＤＲ）に置換することにより、ヒト化を行うことができる。
酵母人工染色体（ＹＡＣ）では、メガベースサイズのヒト遺伝子座のクローニング及び再構成を行うことができ、マウス生殖細胞系列にそれらを導入することができるので、非常に大きい、又は大まかにマップされた遺伝子座を解明し、同時にヒト疾患の有用なモデルを作製するためのアプローチが可能となる。さらに、マウス遺伝子座をヒトのその同等物で置換するこのような技術を利用することにより、発生過程におけるヒト遺伝子産物の発現及び制御、他の系とのそれらのコミュニケーション、及び疾患の誘発及び進行におけるそれらの関与に関するユニークな事実の発見が行われるであろう。
このようなストラテジーの重要な実用化は、マウス液性免疫系の「ヒト化」である。内在性のＩｇ遺伝子が不活性化されているマウスへのヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子座の導入により、プログラムされた発現及び抗体の編成、ならびにＢ細胞発生におけるその役割の基礎をなす機構を研究することができるようになる。さらに、このようなストラテジーにより、完全ヒトモノクローナル抗体（ＭＡＢｓ）産生のためのソースが得られるであろう。ある実施形態において、完全ヒト抗体は、マウス又はマウス由来Ｍａｂｓに固有の免疫原性及びアレルギー性反応が最小限に抑えられている予想され、従って、投与した抗体の効果及び安全性が高い。ある実施形態において、抗体投与を繰り返すことが必要であり得る、骨粗しょう症、炎症、自己免疫及び癌等、慢性及び再発性ヒト疾患の治療において、完全ヒト抗体を使用し得る。
マウス抗体の不存在下においてマウスがヒト抗体を産生することを目論んで、ヒトＩｇ遺伝子座の大きな断片を有し、マウス抗体産生において欠失のあるマウス系列を作製することができる。大きなヒトＩｇ断片には、大きな可変遺伝子の多様性、ならびに抗体産生及び選択に対する適切な調整機構が維持され得る。抗体多様性及び選択に対するマウスの機構を十分に引き出し、ヒトタンパク質に対する免疫寛容性を欠失させることにより、これらのマウスにおいてヒト抗体のレパートリーを再生することで、ヒト抗原を含む関心のあるあらゆる抗原に対して高い親和性を有する抗体を得ることができる。ハイブリドーマ技術を用いて、所望する特異性を有する抗原特異的ヒトＭＡｂｓを産生させ選択し得る。
ある実施形態において、キメラ、ＣＤＲ−移植及びヒト化抗体を含む、特異的結合パートナーを、本分野で公知の組み換え法により産生することができる。ある実施形態において、本明細書中に記載の、及び本分野で公知の材料及び手段を用いて、その抗体をコードする核酸をホスト細胞に導入して発現させる。ある実施形態において、ＣＨＯ細胞等、哺乳類ホスト細胞でその抗体を産生させる。ある実施形態において、上述のように、ホスト細胞にトランスフェクションした組み換えＤＮＡを発現させることにより、又は、ハイブリドーマ細胞で発現させることにより、完全ヒト抗体を産生させ得る。
ある実施形態において、モノクローナル抗体の産生を飛び越えて進む、抗体分子の抗原結合領域の組み換えＤＮＡバージョンを作製する技術を提供する。ある実施形態において、抗体特異的メッセンジャーＲＮＡ分子を、免疫した動物から採取した免疫系細胞から抽出し、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に転写する。ある実施形態において、そのｃＤＮＡを細菌性発現系にクローニングする。ある実施形態において、Ｆａｂタンパク質を発現させ、細胞周辺腔（細菌の細胞膜と細胞壁との間）に移動させる、又は分泌させるリーダー配列を有するバクテリオファージラムダベクター系を使用し得る。ある実施形態において、抗原に結合するものについて、多数の機能的Ｆａｂ断片を速やかに生成させ、スクリーニングすることができる。このような標的分子特異的結合パートナー（標的分子に対して特異性を有するＦａｂ断片）は特に、本明細書中で定義され、検討され、請求される「抗体」という用語に包含される。
ある実施形態において、ヒト補体を活性化しＡＤＣＣを仲介する活性等の適切な生物学的活性のヒト抗体分子由来の遺伝子と一緒に、適切な抗原特異性のマウス抗体分子由来の遺伝子をスプライシングすることにより、キメラ抗体を産生させ得る（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８１：６８５１（１９８４）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ，３１２：６０４（１９８４））。ある実施形態において、Ｆｃ領域を異なるアイソタイプのもので置き換え得る。この技術により産生された抗体等の特異的結合パ―トナーは、本発明のある実施形態の範囲内である。
ある実施形態において、抗体は完全ヒト抗体である。ある実施形態において、標的分子に結合する抗体は、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン核酸配列の天然に生じた体細胞変異体、及びその断片、合成変異体、誘導体及び融合物である核酸配列によりコードされている。本分野で公知の何れかの方法により、このような抗体を調製し得る。ある実施形態において、内在的な免疫グロブリン産生を欠く状態で一連のヒト抗体を産生可能なトランスジェニック動物（例えば、マウス）を標的抗原（免疫反応を誘発可能なあらゆる標的ポリペプチド、及び、場合によっては担体とのコンジュゲート）を用いて免疫することにより、抗体を調製することができる。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｏ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９０，２５５１−２５５５（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ，３６２，２５５−２５８（１９９３）；Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎら、Ｙｅａｒ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，７，３３（１９９３）。
ある実施形態において、ファージディスプレイ抗体ライブラリのインビトロスクリーニングを介して、ヒト抗体を産生し得る。参照により本明細書に組み込まれる、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２７７，３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２，５８１（１９９１）を参照のこと。様々な抗体含有ファージディスプレイライブラリが記載されており、当業者は容易に調製することができる。ある実施形態において、ライブラリには、ヒトＦａｂ、Ｆｖ及びｓｃＦｖ断片等の多様なヒト抗体配列が含まれ得、適切な標的に対してスクリーニングし得る。ある実施形態において、ファージディスプレイライブラリには、標的分子の特異的結合パートナーを同定するためにスクリーニングし得る抗体以外のペプチド又はタンパク質が含まれ得る。
抗−イディオタイプ（抗−Ｉｄ）抗体は、抗体の抗原結合部位を一般に伴っているユニークな決定因子を認識する抗体である。Ｉｄ抗体は、抗−Ｉｄが調製しようとするモノクローナル抗体を用いてモノクローナル抗体のソースとして同種で遺伝子型が同じ動物（例えば、マウス系列）を免疫することにより調製し得る。免疫された動物は、これらのイディオタイプ的決定因子（抗Ｉｄ抗体）に対する抗体を産生することにより、免疫抗体のイディオタイプ決定因子を認識し反応する。例えば、米国特許第４，６９９，８８０号（あらゆる目的のために、その内容全体を参照により本明細書に組み込む。）を参照のこと。ある実施形態において、いわゆる抗Ｉｄ抗体を産生させるさらに別の動物において免疫反応を誘導するための「免疫原」としても抗Ｉｄ抗体を使用し得る。ある実施形態において、抗−抗−Ｉｄは、エピトープ的に、抗−Ｉｄを誘導したオリジナルのモノクローナル抗体と同一であり得る。従って、ある実施形態において、ｍＡｂのイディタイプ的な決定因子に対する抗体を用いることにより、同一の特異性の抗体を発現する他のクローンを同定することができる。
天然に生じる抗体構造単位には、一般に三量体が含まれる。そのような各三量体は通常、ポリペプチド鎖の２つの同一のペアから構成されているが、その各ペアは、１つの全長「軽鎖」（ある実施形態において約２５ｋＤ）及び１つの全長「重」鎖（ある実施形態において、約５０〜７０ｋＤ）を有する。各鎖のアミノ末端部分には通常、一般に抗原認識に関与する約１００〜１１０以上のアミノ酸の可変領域が含まれている。各鎖のカルボキシ末端部分は通常、エフェクター機能に関与し得る定常領域を規定する。ヒト軽鎖は通常、カッパ及びラムダ軽鎖として分類される。重鎖は、通常、ミュー、デルタ、ガンマ、アルファ又はイプシロンとして分類され、それぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＥといった抗体のアイソタイプを定義する。ＩｇＧには、これらに限定されないが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４を含むいくつかのサブクラスがある。ＩｇＭには、これらに限定されないが、ＩｇＭ１及びＩｇＭ２を含むサブクラスがある。ＩｇＡは、同様に、これらに限定されないが、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２を含むサブクラスにさらに分類される。全長軽鎖及び重鎖中では、通常、約１２以上のアミノ酸の「Ｊ」領域により可変領域及び定常領域が連結されており、重鎖にはまた、約１０以上のアミノ酸の「Ｄ」領域も含まれる。例えば、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｃｈ．７（Ｐａｕｌ，Ｗ．，編，第２版、Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９））（あらゆる目的のために、その内容全体を参照により組み込む。）を参照のこと。各軽／重鎖ペアの可変領域は通常、抗原結合部位を形成する。
可変領域は、相補性決定領域又はＣＤＲとも呼ばれる、３つの超可変領域により連結された比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）である、同じ一般構造を示す。各ペアの２つの鎖からのＣＤＲは通常、フレームワーク領域のそばに配置されており、特定のエピトープに結合可能であり得る。Ｎ末端からＣ末端まで、軽鎖及び重鎖両方の可変領域は通常、ドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３及びＦＲ４を含有する。各ドメインに対するアミノ酸の配置は通常、Ｋａｂａｔ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９８７及び１９９１））、又はＣｈｏｔｈｉａ＆Ｌｅｓｋ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−０１７（１９８７）；Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７８−８８３（１９８９）の定義に従う。
「重鎖」という用語には、抗原に対する特異性を与えるのに十分な可変領域配列を有するあらゆるポリペプチドが含まれる。「軽鎖」という用語は、抗原に対する特異性が与えられるのに十分な可変領域配列を有するあらゆるポリペプチドが含まれる。全長重鎖には、可変領域ドメイン、ＶＨ及び３つの定常領域ドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３が含まれる。ＶＨドメインは、ポリペプチドのアミノ末端にあり、ＣＨ３ドメインは、カルボキシ末端にある。「重鎖」という用語は、本明細書中で使用する場合、全長重鎖及びその断片を包含する。全長軽鎖には、可変領域ドメイン、ＶＬ及び定常領域ドメインＣＬが含まれる。重鎖のように、軽鎖の可変領域ドメインは、ポリペプチドのアミノ末端にある。「軽鎖」という用語は、本明細書中で使用する場合、全長軽鎖及びその断片を包含する。Ｆａｂ断片は、１つの軽鎖及びＣＨ１及び１つの重鎖の可変領域から成る。Ｆａｂ分子の重鎖は、他の重鎖とジスルフィド結合を形成できない。鎖間ジスルフィド結合が２つの重鎖間で形成することができ、Ｆ（ａｂ’）２分子が形成されるように、Ｆａｂ’断片には、そのＣＨ１とＣＨ２ドメインとの間により多くの定常領域を含有する１つの軽鎖及び１つの重鎖が含まれる。Ｆｖ領域には、重鎖及び軽鎖両方からの可変領域が含まれるが、定常領域がない。１本鎖抗体は、重鎖及び軽鎖可変領域がフレキシブルなリンカーで連結され、抗原結合部位を形成する１本のポリペプチド鎖を形成するＦｖ分子である。１本鎖抗体については、国際特許ＷＯ第８８／０１６４９及び米国特許第４，９４６，７７８号及び第５，２６０，２０３号で詳しく論じられている。
ある実施形態において、「多特異性の」又は「多機能性の」抗体以外の２価の抗体は通常、その結合部位のそれぞれが同一であると理解されたい。
過剰な抗体が、カウンター受容体への受容体結合量を、少なくとも約２０％、４０％、６０％、８０％、８５％以上低下させる（インビトロ非競合結合アッセイにおいて測定したもの）場合、抗体は、実質的に、受容体に対するリガンドの接着を阻害する。
「エピトープ」という用語には、免疫グロブリン又はＴ細胞受容体への特異的な結合を可能にするあらゆるポリペプチド決定因子が含まれる。ある実施形態において、エピトープ決定因子には、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル又はスルホニル等の分子の化学的に活性のある表面基が含まれ、ある実施形態においては、特異的な立体構造特性及び／又は特異的な電荷特性を有し得る。エピトープは、抗体が結合する抗原の領域である。ある実施形態において、抗体は、タンパク質及び／又は巨大分子の複雑な混合物中でその標的抗原を選択的に認識すると、抗原に特異的に結合すると言われている。ある実施形態において、抗体は、その解離定数が≦１μＭである場合、ある実施形態において、その解離定数が≦１００ｎＭである場合、及びある実施形態において、その解離定数が≦１０ｎＭである場合、抗原に特異的に結合すると言われる。
２０００年５月４日公開の特許出願、国際特許ＷＯ第００／２４７８２号において、様々なペプチド調製技術の詳細が記載されている。この特許出願において、さらに、様々な誘導体及び融合分子が記載されている。
ある実施形態において、特異的結合パートナーとして使用するペプチドは、式、
（Ｘ１）ａＦ１−（Ｘ２）ｂ
（式中、Ｆ１は、ビヒクルであり；
Ｘ１及びＸ２は、−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１、−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２、−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２−（Ｌ３）ｅ−Ｐ３及び−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２−（Ｌ３）ｅ−Ｐ３−（Ｌ４）ｆ−Ｐ４からそれぞれ独立して選択され、
Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３及びＰ４は、それぞれ独立してペプチド配列であり、ここで、少なくとも１つが特異的結合パートナーであり；
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３及びＬ４は、それぞれ独立してリンカーであり；
及び、ａ及びｂの少なくとも１つが１である限り、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ及びｆは、それぞれ独立して０又は１である。）の分子内に含まれ得る。
ある実施形態において、分子は、式
Ｘ１−Ｆ１
又は、
Ｆ１−Ｘ２
の構造を成す。
ある実施形態において、分子は、式：
Ｆ１−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１
の構造、又は、
Ｆ１−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２
の式（式中、
Ｐ１及び／又はＰ２は、標的分子に対する特異的な結合パートナーである。）の構造を成す。
ある実施形態において、ビヒクルは、Ｆｃドメインである。ある実施形態において、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ Ｆｃであり得る。ある実施形態において、ＩｇＧ Ｆｃドメインは、ＩｇＧ１であり得る。
あるＦｃドメイン、リンカー及び前述の分子の調製工程は、例えば、２０００年５月４日公開の国際特許ＷＯ第００／２４７８２号に記載されている。
特異的結合パートナーの別のクラスは、可溶性の受容体断片である。ある可溶性受容体断片は、図面において次のように同定される。
ａ．ＩＬ−１受容体（配列番号７）
ｂ．ＴＮＦＲＩ（配列番号８）
ｃ．ＴＮＦＲＩＩ（配列番号９）
ｄ．ＣＤ４０（配列番号１０）
ｅ．ＣＤ３０（配列番号１１）
ｆ．ＩＣＯＳ（配列番号１２）
ｇ．ＣＤ２８（配列番号１３）
ｈ．ＯＸ４０（配列番号１４）
ｉ．４−１−ＢＢ（配列番号１５）
ｊ．ＣＤ２７（配列番号１６）
ｋ．ＩＬ−１８受容体（配列番号１７）
ｌ．ＰＤ−１（配列番号１８）
前述のペプチドのように、ある実施形態において、これらの特異的結合パートナーは、ビヒクルに共有結合で結合させ得る。ある実施形態において、これらの特異的結合パートナーは、Ｆｃドメインに共有結合で結合させ得る。
ある実施形態において、ペプチド及びポリペプチド配列は、保存的及び／又は非保存的修飾を受けたある天然のの分子のアミノ酸配列由来の配列であり得る。
ある実施形態において、保存的修飾は、そのような修飾を行った元の分子と同じ機能的及び化学的特性を有する分子を産生し得る。その一方、ある実施形態において、（ａ）置換の領域における分子バックボーンの構造、例えばシート又はヘリックス構造、（ｂ）標的部位における分子の電荷又は疎水性、又は（ｃ）分子の大きさ、の維持に対する効果が著しく異なるアミノ酸配列における置換を選択することにより、その分子の機能的及び／又は化学的特性に対する実質的な修飾を行い得る。
例えば、ある実施形態において、「保存的アミノ酸置換」は、その位置でのアミノ酸の極性又は電荷にほとんど影響がない、又は全く影響がないような、非天然残基による天然アミノ酸残基の置換を含み得る。さらに、ある実施形態において、「アラニンスキャニング突然変異」に関して既に述べたように、ポリペプチドにおけるあらゆる天然の残基もまた、アラニンで置換され得る（例えば、ＭａｃＬｅｎｎａｎら、１９８８、Ａｃｔａ Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｓｃａｎｄ．Ｓｕｐｐｌ．６４３：５５−６７；Ｓａｓａｋｉら、１９９８，Ａｄｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３５：１−２４（アラニンスキャニング突然変異について考察している。）を参照のこと。）。
保存的アミノ酸置換は、天然に生じないアミノ酸残基を包含してもよく、一般に、生体システムにおける合成よりむしろ、化学ペプチド合成により組み込まれる。これらには、ペプチド類似物及びアミノ酸部分の他の逆型（ｒｅｖｅｒｓｅｄ ｆｏｒｍｓ）又は転位型（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｆｏｒｍｓ）が含まれる。
所望するアミノ酸置換（保存的であれ非保存的であれ）は、そのような置換が必要であるときに、当業者によって決定され得る。例えば、ある実施形態において、分子配列の中で重要な残基を同定するために、又は本明細書中に記載する分子の親和性を増減させるために、アミノ酸置換を使用することができる。
天然に生じる残基を、共通の側鎖の性質に基づいたクラスに分類し得る。
１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
５）鎖の配向性に影響を与える残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；及び
６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ
例えば、非保存的置換には、これらのあるクラスのメンバーが別のクラスのメンバーへと変換されることが含まれ得る。このような置換が行われた残基を、非ヒト抗体と相同であるヒト抗体の領域、又はその分子の非相同領域に導入し得る。
このような改変を行う場合、ある実施形態によると、アミノ酸のハイドロパシー指標（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ ｉｎｄｅｘ）が考慮され得る。各アミノ酸に対して、その疎水性及び電荷の特徴に基づいてハイドロパシー指標が割り当てられている。イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；スレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；及びアルギニン（−４．５）；である。
タンパク質に対する相互作用的な生体機能付与におけるハイドロパシーアミノ酸指標の重要性は、本分野で理解されている。Ｋｙｔｅら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５７：１０５−１３１（１９８２）。あるアミノ酸を同様なハイドロパシー指標又はスコアを有する他のアミノ酸で置換しても、同様な生体活性を保持していることが知られている。ハイドロパシー指標に基づいた改変を行う場合、ある実施形態において、ハイドロパシー指標が±２以内であるアミノ酸の置換が含まれる。ある実施形態において、±１以内の置換が含まれ、ある実施形態において、±０．５以内の置換が含まれる。
特にそれによって作られる生物学的に機能的なタンパク質又はペプチドを、本ケースにおいてのように、免疫学的実施形態で使用することを意図する場合、疎水性に基づいて、類似のアミノ酸の置換を効果的に行うことができることも本分野で理解されている。ある実施形態において、その隣接アミノ酸の親水性によって支配される場合、タンパク質の最大の局所的平均親水性は、その免疫原性及び抗原性、つまり、そのタンパク質の生物学的特性に相関する。
次の親水性値がこれらのアミノ酸残基に割り当てられている。アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；及びトリプトファン（−３．４）。同等の親水性の値に基づいた改変を行う場合、ある実施形態において、親水性の値が±２以内であるアミノ酸の置換が含まれ、ある実施形態において、±１以内の置換が含まれ、ある実施形態において、±０．５以内の置換が含まれる。親水性に基づいて一次アミノ酸配列からもまたエピトープを同定し得る。これらの領域は、「エピトープコア領域」とも言われる。
代表的なアミノ酸置換を表１で説明する。
Figure 2006517191
当業者は、公知の技術を用いて、本明細書中に記載のポリペプチドの適切な変異体を決定することができるであろう。ある実施形態において、当業者は、活性に重要でないと考えられる領域を標的とすることにより、活性を損なうことなく改変し得る分子の適切な領域を同定し得る。ある実施形態において、同様のポリペプチド中で保存されている分子の残基及び部分を同定することができる。ある実施形態において、生物学的活性又は構造に重要であり得る領域さえ、生物学的活性を損なうことなく、又はポリペプチド構造に悪影響を及ぼすことなく、ポリペプチド構造に保存的アミノ酸置換を行い得る。
さらに、当業者は、活性又は構造に重要である同様のポリペプチドにおいて残基を同定する構造−機能研究を再検討することができる。このような比較の見地から、同様のタンパク質における活性又は構造に重要であるアミノ酸残基に相当する、タンパク質におけるアミノ酸残基の重要性を予想することができる。当業者は、そのような重要と予想されるアミノ酸残基と化学的に同等のアミノ酸置換基を選び得る。
当業者はまた、同様のポリペプチドにおけるその構造に関して、立体構造及びアミノ酸配列を解析することもできる。このような情報の見地において、当業者は、その立体構造について、抗体のアミノ酸残基の配列を予想し得る。ある実施形態において、タンパク質表面にあると予想される残基は他の分子との重要な相互作用に関与し得るので、当業者は、そのタンパク質の表面にあると予想されるアミノ酸残基に対する根本的な改変を行わないように選択し得る。さらに、当業者は、所望する各アミノ酸残基において、１つのアミノ酸置換を含有する試験変異体を作製し得る。次に、当業者にとって公知の活性アッセイを用いて、その変異体をスクリーニングすることができる。適切な変異体に関する情報を集めるために、このような変異体を使用することができるであろう。例えば、特定のアミノ酸残基に対する変化により破壊、望ましくない還元、又は不適切な活性が生じることが判った場合、このような変化のある変異体を回避し得る。言い換えれば、このような所定の実験から集めた情報に基づいて、当業者は、さらなる単独の置換、又は他の突然変異と組み合わせた置換をすべきではないアミノ酸を容易に決定し得る。
二次構造の予想についての多数の科学出版物がある。Ｍｏｕｌｔ Ｊ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ． ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ．，７（４）：４２２−４２７（１９９６）、Ｃｈｏｕら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１３（２）：２２２−２４５（１９７４）；Ｃｈｏｕら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１１３（２）：２１１−２２２（１９７４）；Ｃｈｏｕら、Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．Ｒｅｌａｔ．Ａｒｅａｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４７：４５−１４８（１９７８）；Ｃｈｏｕら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，４７：２５１−２７６及びＣｈｏｕら、Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．，２６：３６７−３８４（１９７９）。さらに、現在、二次構造の予想を促進するために、コンピュータプログラムを利用することができる。ある二次構造予想方法は、ホモロジーモデリングに基づいたものである。例えば、３０％を超える配列同一性又は４０％を超える類似性を有する２つのポリペプチド又はタンパク質は、同様の構造トポロジーを持つことが多い。最近のタンパク質構造データベース（ＰＤＢ）の進歩により、ポリペプチド又はタンパク質の構造内で起こり得る折りたたみ数を含む、二次構造の予測性が向上した。Ｈｏｌｍら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．，２７（１）：２４４−２４７（１９９９）を参照のこと。ある一定のポリペプチド又はタンパク質における折り畳み数は決まっており、必要最低限の構造が分かれば、構造予測が劇的に正確になるであろうことが示唆されている（Ｂｒｅｎｎｅｒら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，７（３）：３６９−３７６（１９９７））。
二次構造を予想するさらなる方法には、「スレッディング」（Ｊｏｎｅｓ，Ｄ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，７（３）：３７７−８７（１９９７）；Ｓｉｐｐｌら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，４（１）：１５−１９（１９９６））、「プロファイル解析」（Ｂｏｗｉｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５３：１６４−１７０（１９９１）；Ｇｒｉｂｓｋｏｖら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｔｙｍ．，１８３：１４６−１５９（１９９０）；Ｇｒｉｂｓｋｏｖら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８４（１３）：４３５５−４３５８（１９８７））及び「進化的連鎖（ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｌｉｎｋａｇｅ）」（Ｈｏｌｍ、上述（１９９９）、及びＢｒｅｎｎｅｒ、上述（１９９７）参照）が含まれる。
ある実施形態において、抗体変異体には、親ポリペプチドのアミノ酸配列と比較して、グリコシル化部位の数及び／又はタイプが変化しているグリコシル化変異体が含まれる。ある実施形態において、タンパク質変異体では、Ｎ−結合グリコシル化部位の数が天然ののタンパク質よりも多く又は少なくなっている。Ｎ−結合グリコシル化部位の特徴は、配列：Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ又はＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒであり、この式中、Ｘで表されるアミノ酸残基は、プロリン以外のあらゆるアミノ酸であり得る。この配列を作るためのアミノ酸残基の置換により、Ｎ−結合炭水化物鎖が付加する可能性がある新しい部位が得られる。あるいは、この配列を排除する置換により、存在するＮ−結合炭水化物鎖が除去されるであろう。また、１つ又は複数の新しいＮ−結合グリコシル化部位（一般に、天然に生じるもの）が除去され、１つ又は複数の新しいＮ−結合部位が生成するといった、Ｎ−結合炭水化物鎖の再編成も起こるであろう。さらなる好ましい抗体変異体には、その親アミノ酸配列と比較して、１つ又は複数のシステイン残基が欠失している、又は他のアミノ酸（例えばセリン）に置換されているシステイン変異体が含まれる。不溶性封入体の単離の後等、抗体が生物学的活性を有する構造に再び折り畳まれなければならない場合に、システイン変異体は有用であり得る。システイン変異体は通常、天然のタンパク質よりもシステイン残基の数が少なく、通常、対にならないシステインによる相互作用を最低限に抑えるよう、偶数である。
ある実施形態によると、アミノ酸置換は、（１）タンパク質分解に対する感受性を低下させる、（２）酸化に対する感受性を低下させる、（３）タンパク質複合体形成に対する結合親和性を変化させる、（４）結合親和性を低下させる、及び／又は（４）そのようなポリペプチドに他の物理化学的又は機能的特徴を与えるものである。ある実施形態によると、天然に生じる配列（ある実施形態において、分子間接触を形成するドメイン外部のポリペプチド部分）において１個又は複数のアミノ酸置換（ある実施形態において、保存的アミノ酸置換）を行い得る。ある実施形態において、保存的アミノ酸置換は通常、親配列の構造特性を実質的に変化させないものであり得る（例えば、アミノ酸の置換により、親配列にあるへリックスを破壊しない、又は親配列の特徴となる他のタイプの二次構造を破壊しにくいものであるべきである。）。この分野で認識されているポリペプチドの二次及び三次構造の例は、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ 編、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８４））；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｃ．Ｂｒａｎｄｅｎ及びＪ．Ｔｏｏｚｅ編、Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９９１））；及びＴｈｏｒｎｔｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３５４：１０５（９９１）（これらは、それぞれ、参照により本明細書に組み込まれる。）に記載されている。
「ポリペプチド断片」という用語は、本明細書中で使用される場合、アミノ末端及び／又はカルボキシ末端欠失を有するポリペプチドを意味する。ある実施形態において、断片は、少なくとも５〜４６７アミノ酸長である。当然のことながら、ある実施形態において、断片は、少なくとも５、６、８、１０、１４、２０、５０、７０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００又は４５０アミノ酸長である。
ペプチドアナログは、医薬業界において、鋳型ペプチドの特徴と類似する特徴を有する非ペプチド薬として、一般に使用される。これらのタイプの非ペプチド化合物は、「ペプチド類似物（ｐｅｐｔｉｄｅ ｍｉｍｅｔｉｃｓ）」又は「ペプチド類似物（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ）」と呼ばれる。Ｆａｕｃｈｅｒｅ，Ｊ．Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ．Ｒｅｓ．１５：２９（１９８６）；Ｖｅｂｅｒ及びＦｒｅｉｄｉｎｇｅｒ ＴＩＮＳ ３９２頁（１９８５）；及びＥｖａｎｓら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３０：１２２９（１９８７）（あらゆる目的のために、参照により本明細書に組み込まれる。）を参照のこと。このような化合物は、コンピュータ化された分子モデリングの支援により開発されているものが多い。治療上有効なペプチドと構造的に同様であるペプチド類似物を使用して同様の治療効果又は予防効果を与えることができる。一般に、ペプチド類似物は、ヒト抗体等、典型的ポリペプチド（つまり、生化学的特徴又は薬理学的活性を有するポリペプチド）と構造的に類似しているが、場合によっては、本分野で公知の方法により、――ＣＨ２ＮＨ――、――ＣＨ２Ｓ――、――ＣＨ２−ＣＨ２――、――ＣＨ＝ＣＨ−（シス及びトランス）、――ＣＯＣＨ２――、――ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２――、及び――ＣＨ２ＳＯ――から選択される結合に置換されている、１つ又は複数のペプチド結合を有する。ある実施形態において、より安定なペプチドを得るために、同じタイプのＤ−アミノ酸によるコンセンサス配列の１つ又は複数のアミノ酸の組織的な置換（例えば、Ｌ−リジンの代わりにＤ−リジン）を行い得る。さらに、本分野で公知の方法（Ｒｉｚｏ及びＧｉｅｒａｓｃｈ Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６１：３８７（１９９２）（あらゆる目的のために、参照により本明細書に組み込まれる。）、例えば、ペプチドを環化する分子内ジスルフィド架橋を形成させることができる内部システイン残基の付加により、コンセンサス配列又は実質的に同一のコンセンサス配列変異を含有する自然にはないようなペプチドを生成させ得る。
タンパク質性の特異的結合パートナーを生成させる、様々な生物学的又は化学的方法が利用可能である。
ある実施形態において十分な量の特異的結合パートナーを生成させるために、生物学的方法を使用する。ある実施形態において、抗体及び抗原結合ドメイン産生に、標準的な組み換えＤＮＡ技術が有用である。ある発現ベクター、ホスト細胞及び発現産物を回収する方法については、下記で述べる。
ある実施形態において、抗体又は抗原結合ドメインをコードする核酸分子を、標準的なライゲーション技術を用いて適切な発現ベクターに挿入する。ある実施形態において、使用する特定のホスト細胞で機能的であるよう（つまり、遺伝子増幅及び／又は遺伝子発現が起こるように、そのベクターがホスト細胞の機構と適合する。）、ベクターを選択し得る。ある実施形態において、抗体をコードする核酸分子を、原核細胞、酵母、昆虫細胞（バキュロウイルス系）及び／又は真核ホスト細胞において増幅／発現させ得る。ある実施形態において、ホスト細胞の選択を行う際、抗体が翻訳後修飾されることになっているか否かということにも配慮する（例えば、グリコシル化及び／又はリン酸化）。ある実施形態において、翻訳後修飾を促進するように、酵母、昆虫又は哺乳類ホスト細胞を選択する。発現ベクターについてのまとめは、例えば、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．ｖ．１８５，（Ｄ．Ｖ．Ｇｏｅｄｄｅｌ編）、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）を参照のこと。
ある実施形態において、何れかのホスト細胞で使用する発現ベクターには、１つ又は複数の次の成分、即ち、プロモーター、１つ又は複数のエンハンサー配列、複製起点、転写終了配列、ドナー及びアクセプタースプライシング部位を含有する完全イントロン配列、分泌のためのリーダー配列、リボソーム結合部位、ポリアデニル化配列、発現させたいポリペプチドをコードする核酸配列を挿入するためのポリリンカー領域及び選択可能なマーカー成分が含まれる。そのような配列について、以下で詳しく考察する。
典型的なベクター成分には、これらに限定されないが、同種（つまり、ホスト細胞と同種及び／又は同系の株由来）、異種（つまり、ホスト細胞の種又は株と異なる種由来）、ハイブリッド（つまり、複数のソース由来の異なる配列の組み合わせ）、合成又は、通常、発現において免疫グロブリンを調節するように機能する天然の配列が含まれる。ある実施形態において、ホスト細胞の機構でその成分が機能的であり、活性化され得るならば、ベクター成分のソースは、あらゆる原核又は真核生物、あらゆる脊椎又は無脊椎生物、又はあらゆる植物であり得る。
ある実施形態において、発現に使用するホスト細胞のタイプに基づいて、複製起点を選択する。ある実施形態において、プラスミド ｐＢＲ３２２（製品番号 ３０３−３ｓ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）由来の複製起点は、ほとんどのグラム陰性細菌に対して適切であるが、その一方、ある実施形態において、ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、水疱性口内炎ウイルス（ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｓｔｏｍａｔｉｔｕｓ ｖｉｒｕｓ）（ＶＳＶ）又はパピローマウイルス（ＨＰＶ又はＢＰＶ等）由来の様々な起点が、哺乳類細胞におけるクローニングベクターに対して有用である。ある実施形態において、複製起点成分は、哺乳類発現ベクターに対して必要ではない（例えば、ＳＶ４０起点は、初期プロモーターを含有するという理由のみから使用されることが多い。）。
ある実施形態において、転写終了配列は、ポリペプチドコード領域の３’末端に位置し得、転写を終了させるために働く。ある実施形態において、原核細胞における転写終了配列は、Ｇ−Ｃリッチな断片であり、その後にポリＴ配列が続く。ある配列が容易にライブラリからクローニングされるか、又はベクターの一部として市販されているものを購入できる一方、ある実施形態において、上述の方法のような核酸合成方法を用いて、配列を容易に合成することもできる。
ある実施形態において、選択可能なマーカー遺伝子要素が、選択培地中におけるホスト細胞の生存及び増殖に必要なタンパク質をコードする。典型的な、しかしこれらに限定されない選択マーカー遺伝子には、（ａ）抗生物質又は他の毒素、例えば、原核ホスト細胞用のアンピシリン、テトラサイクリン又はカナマイシンに対する耐性を与える、（ｂ）その細胞の栄養要求性に対して欠乏しているものを補完する；又は（ｃ）複合培地から得られない必須の栄養素を供給する、タンパク質をコードするものが含まれる。典型的な選択可能マーカーには、これらに限定されないが、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子及びテトラサイクリン耐性遺伝子が含まれる。ある実施形態において、ネオマイシン耐性遺伝子は、原核及び真核ホスト細胞における選択に使用し得る。
ある実施形態において、発現されるであろう遺伝子を増幅させるために、他の選択遺伝子を使用し得る。増幅とは、増殖に必須のタンパク質の産生のために非常に必要とされる遺伝子が、組み換え細胞の継続的世代の染色体内でタンデムに反復するプロセスである。ある実施形態において、哺乳類細胞に対する選択可能なマーカーは、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）及びチミジンキナーゼであり得る。ある実施形態において、そのベクターに存在するマーカーにより、形質転換体のみが独自に生存するようになされている選択的圧力下に、哺乳類細胞形質転換体を置く。選択圧力は、培地中の選択パートナーの濃度が連続的に変化する条件下で形質転換された細胞を培養することにより与えられるが、それにより、選択遺伝子と抗体をコードするＤＮＡ両方が増幅されることとなる。ある実施形態において、増幅させたＤＮＡから、さらに大量の抗体が合成される。
リボソーム結合部位は、通常、ｍＲＮＡの翻訳開始のために存在し、Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列（原核生物）又はＫｏｚａｋ配列（真核生物）を特徴とする。そのエレメントは、一般に、プロモーターに対して３’、及び発現されるポリペプチドのコード配列に対して５’に位置する。Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列は、様々であるが、通常は、ポリプリン（つまり、Ａ−Ｇ含量が高い。）である。多くのＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列が同定され、上述の方法を用いてそのそれぞれが容易に合成可能であり、原核ベクターで使用可能である。
ある実施形態において、ポリペプチドを分泌に導くために、リーダー又はシグナル配列を使用し得る。ある実施形態において、シグナル配列は、ポリペプチドコード領域の５’末端内にあるか、又はまさに末端にある。多くのシグナル配列が同定されてきたが、ある実施形態にいおて、発現に使用するホスト細胞に基づいて選択し得る。ある実施形態において、シグナル配列は、抗体又は抗原結合ドメインをコードする核酸配列と相同（天然に生じる）であるか、又は非相同であり得る。ある実施形態において、選択された非相同シグナル配列は、認識されプロセシングされるもの、つまり、ホスト細胞によりシグナルぺプチダーゼで切断されるもの、であるべきである。天然の免疫グロブリンシグナル配列を認識せずプロセシングしない原核ホスト細胞に関与するある実施形態において、例えば、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ又は熱安定性エンテロトキシンＩＩリーダーから選択される原核性のシグナル配列で、そのシグナル配列を置換し得る。ある実施形態において、酵母の分泌に対して、天然の免疫グロブリンシグナル配列を、酵母リーダー配列で置換し得る。典型的な酵母リーダー配列には、これらに限定されないが、酵母転化酵素、アルファ因子又は酸性ホスファターゼリーダーが含まれる。ある実施形態において天然のシグナル配列を用いた哺乳類細胞発現は十分なものであり得る。ある実施形態において、他の哺乳類シグナル配列が適切であり得る。
ある実施形態において、ホスト細胞からの抗体又は抗原結合ドメインの分泌の結果、その抗体からシグナルペプチドが除去されるであろう。従って、このような実施形態において、成熟抗体は、何れのリーダー又はシグナル配列も失っているであろう。
グリコシル化が真核細胞発現系で必要である場合等、ある実施形態において、様々なプレ配列を操作して、グリコシル化又は回収率を向上させ得る。ある実施形態において、特定のシグナルペプチドのペプチダーゼ切断部位を変化させるか、又はプロ配列を付加し得るが、それはグリコシル化にも影響を与え得る。ある実施形態において、最終タンパク質産物が、−１の位置（成熟タンパク質の第一のアミノ酸に相当）において、発現に伴う１つ又は複数のさらなるアミノ酸を有するが、それは、全てが除去されないかもしれない。ある実施形態において、最終タンパク質産物には、ペプチダーゼ切断部位において見られ、Ｎ−末端に結合する、１つ又は２つのアミノ酸が含有され得る。ある実施形態において、いくつかの酵素切断部位を使用することにより、成熟ポリペプチド内のこのような領域で酵素による切断が起こる場合、所望するポリペプチドがわずかに短縮した形になり得る。
ある実施形態において、発現ベクターには、ホスト生物により認識され、抗体又は抗原結合ドメインをコードする核酸分子に作動可能に連結されるプロモーターが含まれ得る。ある実施形態において、所望するタンパク質の発現及び回収に使用するホスト細胞に依存して、天然又は異種プロモーターを使用し得る。
原核ホストとともに使用する典型的なプロモーターには、これらに限定されないが、ベータ−ラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系；アルカリホスファターゼ；トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系；及びｔａｃプロモーター等のハイブリッドプロモーターが含まれる。ある実施形態において、他の既知の細菌性プロモーターを使用し得る。既知の細菌性プロモーターの配列が公開されており、それによって、あらゆる望ましい制限部位供給の必要に応じてリンカー又はアダプターを用いて、当業者は所望するＤＮＡ配列にそれらをライゲーションすることができる。
酵母ホストで使用するための適切なプロモーターは、本分野において公知である。ある実施形態において、酵母エンハンサーは、酵母プロモーターとともに有利に使用される。哺乳類ホスト細胞内で使用するための適切なプロモーターが公知である。哺乳類細胞内で使用するための典型的なプロモーターには、これらに限定されないが、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（アデノウイルス２など）、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス及び最も好ましいシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）等のウイルスのゲノムから得られるものが含まれる。典型的な哺乳類プロモーターには、これに限定されないが、異種哺乳類プロモーターが含まれる。典型的な異種哺乳類プロモーターには、これらに限定されないが、熱ショックプロモーター及びアクチンプロモーターが含まれる。
特異的な結合パートナーの発現に使用し得る典型的なプロモーターには、これらに限定されないが、ＳＶ４０初期プロモーター領域（Ｂｅｎｏｉｓｔ及びＣｈａｍｂｏｎ（１９８１）、Ｎａｔｕｒｅ，２９０：３０４−３１０）；ＣＭＶプロモーター；ラウス肉腫ウイルス（Ｙａｍａｍｏｔｏら、（１９８０），Ｃｅｌｌ，２２：７８７−９７）の３’の長い末端反復配列に含有されるプロモーター；ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒら、（１９８１），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，７８：１４４４−５）；メタロチオニン遺伝子の制御配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら、（１９８２），Ｎａｔｕｒｅ，２９６：３９−４２）；ベータ−ラクタマーゼプロモーター等の原核の発現ベクター（Ｖｉｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆら、（１９７８），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，７５：３７２７−３１）；及びｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒら、（１９８３），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８０：２１−２５）が含まれる。
ある実施形態において、トランスジェニック動物において、組織特異性を示す動物の転写調節領域を使用し得る。トランスジェニック動物における組織特異的発現に使用するための典型的な転写調節領域には、これらに限定されないが、膵腺房細胞において活性があるエラスターゼＩ遺伝子調節領域（Ｓｗｉｆｔら、（１９８４），Ｃｅｌｌ．３８：６３９−４６；Ｏｒｎｉｔｚら、（１９８６），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５０：３９９−４０９；ＭａｃＤｏｎａｌｄ（１９８７）、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，７：：４２５−５１５）；膵臓ベータ細胞で活性のあるインスリン遺伝子調節領域（Ｈａｎａｈａｎ（１９８５），Ｎａｔｕｒｅ，３１５：１１５−１２２）；リンパ細胞で活性のある免疫グロブリン遺伝子調節領域（Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌら、（１９８４），Ｃｅｌｌ，３８：６４７−５８；Ａｄａｍｅｓら、（１９８５），Ｎａｔｕｒｅ，３１８：５３３−８；Ａｌｅｘａｎｄｅｒら、（１９８７），Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，７：１４３６−４４）；睾丸細胞、乳腺細胞、リンパ細胞及びマスト細胞で活性のあるマウス乳癌ウイルス調節領域（Ｌｅｄｅｒら、（１９８６），Ｃｅｌｌ，４５：４８５−９５）；肝臓において活性のあるアルブミン遺伝子調節領域（Ｐｉｎｋｅｒｔら、（１９８７），Ｇｅｎｅ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ．１：２６８−７６）；肝臓において活性のあるアルファフェトタンパク質遺伝子調節領域（Ｋｒｕｍｌａｕｆら、（１９８７），Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，５：１６３９−４８；Ｈａｍｍｅｒら、（１９８７），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３５：５３−５８）；肝臓において活性のあるアルファ１−抗トリプシン遺伝子調節領域（Ｋｅｌｓｅｙら、（１９８７）Ｇｅｎｅ ａｎｄ Ｄｖｅｌ．１：１６１−１７１）；骨髄性細胞において活性のあるベータ−グロブリン遺伝子調節領域（Ｍｏｇｒａｍら、（１９８５），Ｎａｔｕｒｅ，３１５：３３８−３４０；Ｋｏｌｌｉａｓら、（１９８６），Ｃｅｌｌ，４６：８９−９４）；脳のオリゴデンドロサイト細胞で活性のあるミエリン塩基性タンパク質遺伝子調節領域（Ｒｅａｄｈｅａｄら、（１９８７），Ｃｅｌｌ，４８：７０３−７１２）；骨格筋で活性のあるミオシン軽鎖−２遺伝子調節領域（Ｓａｎｉ（１９８５），Ｎａｔｕｒｅ，３１４：２８３−２８６）；及び視床下部において活性のある性腺刺激放出ホルモン遺伝子調節領域（Ｍａｓｏｎら、（１９８６），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３４：１３７２−８）が含まれる。
ある実施形態において、真核ホスト細胞での転写を促進するためにベクターにエンハンサー配列を挿入し得る。哺乳類遺伝子由来の典型的なエンハンサー配列には、これらに限定されないが、グロブリン、エラスターゼ、アルブミン、アルファ−フェト−タンパク質及びインスリンが含まれる。ある実施形態において、ウイルス由来のエンハンサーが使用されるであろう。真核プロモーターの活性化のための典型的なエンハンサー配列には、これらに限定されないが、ＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、ポリオーマエンハンサー及びアデノウイルスエンハンサーが含まれ、それらは典型的な促進エレメントである。ある実施形態において、エンハンサーは、ポリペプチドコード領域に対する５’又は３’の位置で、ベクターに挿入され得る。ある実施形態において、エンハンサーはプロモーターから５’の位置にある。
ある実施形態において、ベクターは、細菌、昆虫及び哺乳類ホスト細胞のうち少なくとも１つと適合するものである。典型的なベクターには、これらに限定されないが、ｐＣＲＩＩ、ｐＣＲ３及びｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、ｐＢＳＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｏｍｐａｎｙ．Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）、ｐＥＴ１５（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）、ｐＥＧＦＰ−Ｎ２（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）、ｐＥＴＬ（ＢｌｕｅＢａｃＩＩ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＤＳＲ−アルファ（ＰＣＴ 公開 国際特許ＷＯ第９０／１４３６３号）及びｐＦａｓｔＢａｃＤｕａｌ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）が含まれる。
典型的なベクターには、これらに限定されないが、選択したホスト細胞と適合するコスミド、プラスミド及び改変ウイルスが含まれる。ある実施形態において、ベクターには、これらに限定されないが、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｒ）プラスミド誘導体（コピー数の多いＣｏｌＥ１を用いたファージミド、Ｓｔｒａｔａｇｅｎ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）、Ｔａｑ増幅ＰＣＲ産物のクローニング用に設計されたＰＣＲクローニングプラスミド（例えば、ＴＯＰＯＴＭ ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｒ）キット、ＰＣＲ２．１（Ｒ）プラスミド誘導体、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）及びバキュロウイルス発現系（ｐＢａｃＰＡＫプラスミド誘導体、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ，ＣＡ）等、哺乳類、酵母又はウイルスベクターを含むプラスミドが含まれる。ある実施形態において、形質転換、トランスフェクション、感染、エレクトロポレーション又は他の公知の技術を用いて、組み換え分子をホスト細胞に導入し得る。
ある実施形態において、ホスト細胞は、原核ホスト細胞（Ｅ．コリ等）又は真核ホスト細胞（酵母細胞、昆虫細胞又は脊椎動物細胞）であり得る。ある実施形態において、Ｅ．コリ等の原核ホスト細胞は、例えば、非グリコシル化ｓｈＢＣＭＡ及び非グリコシル化ｓｈＴＡＣＩ等、非グリコシル化タンパク質を産生するが、それらは、グリコシル化された真核分子よりも利点を有する。ある実施形態において、適切な条件下で培養する場合、ホスト細胞は、本発明の抗体又は抗原結合ドメインを発現し、続いて、培養液から回収（ホスト細胞が産物を培地に分泌する場合）、又はそれを産生するホスト細胞から直接回収（ホスト細胞が産物を培地に分泌しない場合）することができる。ある実施形態において、適切なホスト細胞を選択する場合、所望する発現レベル、活性に望ましい又は必要であるポリペプチド修飾（グリコシル化又はリン酸化等）及び／又は生物学的に活性のある分子に折り畳まれやすいか等、様々な因子を考慮する。
本分野で多くの適切なホスト細胞が知られており、多くがＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡより入手可能である。典型的なホスト細胞には、これらに限定されないが、Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｈａｍｓｔｅｒ 卵巣細胞（ＣＨＯ）（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ６１）ＣＨＯ ＤＨＦＲ−細胞（Ｕｒｌａｕｂら、（１９８０），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７，４２１６−２０）、ヒト胎児腎臓細胞（ＨＥＫ）２９３又は２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１５７３）及び３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ９２）等の哺乳類細胞が含まれる。適切な哺乳類ホスト細胞及び形質転換、培養、増幅、スクリーニング及び産物産生及び精製方法の選択は、本分野で公知である。典型的なホスト細胞には、これらに限定されないが、サルＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１６５０）及びＣＯＳ−７細胞株（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１６５１）及びＣＶ−１細胞株（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ７０）が含まれる。典型的な哺乳類細胞には、これらに限定されないが、形質転換した細胞株を含む霊長類細胞及びげっ歯類細胞株が含まれる。典型的なホスト細胞には、これらに限定されないが、正常２倍体細胞、霊長類組織のインビトロ培養由来の細胞株及び初代外植が含まれる。ある実施形態において、候補となる細胞は、遺伝子型において選択遺伝子が欠失しているか、又は支配的に働く選択遺伝子を有し得る。典型的なホスト細胞には、これらに限定されないが、マウス神経芽細胞種Ｎ２Ａ細胞、ＨｅＬａ、マウスＬ−９２９細胞、Ｓｗｉｓｓ、Ｂａｌｂ−ｃ又はＮＩＨマウス由来の３Ｔ３株、ＢＨＫ又はＨａＫハムスター細胞株が含まれるが、これらはＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡから入手可能である。これらの各細胞株は、タンパク質発現分野の熟練者にとって公知であり利用可能である。
ある実施形態において、ホスト細胞は細菌細胞であり得る。典型的な細菌ホスト細胞には、これらに限定されないがＥ．コリの様々な株（例えば、ＨＢ１０１、（ＡＴＣＣ番号３３６９４）、ＤＨ５α、ＤＨ１０及びＭＣ１０６１（ＡＴＣＣ番号５３３３８）が含まれる。典型的なホスト細胞には、これらに限定されないが、シュードモナス ｓｐｐ．Ｂ．サブチリス、他のバチルスｓｐｐ．、ストレプトマイセスｓｐｐ．の他の様々な株も含まれる。
当業者により公知の酵母細胞の多くの株も、ポリペプチド発現用のホスト細胞として利用可能である。ある実施形態において、ホスト細胞は、サッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｉｖｉｓａｅ）であり得る。
ある実施形態において、昆虫細胞系を使用し得る。あるそのような系について、例えば、Ｋｉｔｔｓら、（１９９３）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１４：８１０−７，Ｌｕｃｋｌｏｗ（１９９３），Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，４：５６４−７２，及びＬｕｃｋｌｏｗら、（１９９３），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６７：４５６６−７９に記載されている。典型的な昆虫細胞には、これらに限定されないが、Ｓｆ−９及びＨｉ５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）が含まれる。
ある実施形態において、選択したホスト細胞への特異的な結合パートナーをコードする核酸分子の形質転換又はトランスフェクションを、塩化カルシウム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション又はＤＥＡＥ−デキストラン法等の方法を含む公知の方法により行い得る。ある実施形態において、選択する方法は、使用することになっているホスト細胞のタイプの機能に依存する部分がある。これらの方法及び他の適切な方法は、当業者によって公知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９））に記載されている。
ある実施形態において、抗体及び抗原結合ドメイン等のグリコシル化した特異的結合パートナーを発現させるために、トランスジェニック動物を使用し得る。ある実施形態において、トランスジェニックの乳汁産生動物（例えば、ウシ又はヤギ）を使用し、動物の乳汁中のグリコシル化結合パートナーを得ることができる。ある実施形態において、グリコシル化特異的結合パートナーを産生させるために植物を使用し得る。
（形質転換又はトランスフェクションによるもののように）標的分子の特異的結合パートナーをコードする発現ベクターを含有するホスト細胞を、当業者にとって公知の標準的培地を用いて培養し得る。ある実施形態において、培地には、細胞の増殖及び生存に必要な全ての栄養が含有され得る。ある実施形態において、Ｅ．コリ細胞を、Ｌｕｒｉａ Ｂｒｏｔｈ（ＬＢ）及び／又はＴｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ（ＴＢ）中で培養し得る。真核細胞培養用の典型的な培地には、これらに限定されないが、ＲＰＭＩ １６４０、ＭＥＭ、ＤＭＥＭ（これらには全て、培養する特定の細胞株によって、血清及び／又は成長因子を添加し得る。）が含まれる。ある実施形態において、イーストレート、ラクトアルブミン、加水分解物及び／又はウシ胎仔血清を添加したＧｒａｃｅ’ｓ培地において、昆虫細胞を培養し得る。
ある実施形態において、抗生物質、又は、トランスフェクション若しくは形質転換を行った細胞の選択的増殖に有用な他の化合物を、培地への補助物として添加する。ある実施形態において、ホスト細胞を形質転換するプラスミドに存在する選択可能なマーカーエレメントの観点から、使用する化合物を選択する。ある実施形態において、選択可能なマーカーエレメントがカナマイシン耐性である場合、培養液に添加する化合物は、カナマイシンとなる。選択的増殖のための典型的な化合物には、これらに限定されないが、アンピシリン、テトラサイクリン及びネオマイシンが含まれる。
ある実施形態において、ホスト細胞により産生される抗体又は抗原結合ドメインの量を、本分野で公知の標準的な方法を用いて評価することができる。典型的な方法には、これらに限定されないが、ウェスタンブロット分析、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、非変性ゲル電気泳動、ＨＰＬＣ分離、免疫沈降及び活性アッセイが含まれる。
ある実施形態において、細胞培地に分泌された特異的結合パートナーの精製を、アフィニティ、免疫アフィニティ又はイオン交換クロマトグラフィー、分子ふるいクロマトグラフィー、分取ゲル電気泳動又は等電点電気泳動法、クロマト分画及び高速液体クロマトグラフィーを含む様々な技術を用いて行うことができる。ある実施形態において、Ｆｃ領域を含有する抗体を、Ｆｃ領域を選択的に結合するプロテインＡを用いたアフィニティクロマトグラフィーにより都合よく精製し得る。ある実施形態において、カルボキシ又はアミノ末端の何れかにおいて、ヘキサヒスチジン又はＦＬＡＧ（Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ Ｃｏ．，Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ，ＣＴ）又はｍｙｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）など他の小さなペプチド等、アフィニティータグを付して抗体又は抗原結合ドメインの修飾型を調製し、１ステップのアフィニティカラムで精製し得る。ある実施形態において、ポリヒスチジンは、ニッケルに対して高い親和性で特異的に結合するので、ポリヒスチジンタグ付加の特異的な結合パートナーの精製に、ニッケルのアフィニティカラム（Ｑｉａｇｅｎ（Ｒ）ニッケルカラム等）を使用できる。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、編（１９９３）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｔｉｏｎ １０．１１．８，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮｅｗＹｏｒｋを参照のこと。ある実施形態において、複数の精製ステップを使用し得る。
ある実施形態において、原核ホスト細胞で発現される特異的結合パートナーが、細胞周辺腔又は細胞質の何れかにおいて可溶型で存在するか、又は不溶型で細胞内封入体の一部として存在し得る。ある実施形態において、当業者にとって公知の何れかの標準的技術を用いて、ホスト細胞から特異的な結合パートナーを抽出し得る。ある実施形態において、加圧型細胞破砕装置、ホモジェナイザー及び／又は超音波破砕装置を用い、ホスト細胞を細胞溶解して、細胞周辺腔／細胞質の内容物を放出させることができ、その後遠心を行う。
ある実施形態において、可溶型の抗体又は抗原結合ドメインは、細胞質に存在するか又は、細胞周辺腔から分泌されるかの何れかであるが、当業者に公知の方法を用いてそれをさらに精製し得る。ある実施形態において、Ｆａｂ断片は、浸透圧衝撃技術により細菌の細胞周辺腔から放出される。
抗体又は抗原結合ドメインが封入体を形成している場合、それらは細胞膜の内側及び／又は外側に結合し得ることが多く、従って、遠心後、主としてペレット物質にて見出されるであろう。ある実施形態において、封入体を放出、破砕及び可溶化するために、ペレット物質を極端なｐＨで、又は、界面活性剤、グアニジン、グアニジン誘導体、尿素又は尿素誘導体等のカオトロピックパートナーを用いてジチオスレイトール等の還元パートナー存在下でアルカリ性のｐＨにて、又はトリスカルボキシエチルホスフィンを用いて酸性のｐＨにて、処理し得る。ある実施形態において、ゲル電気泳動、免疫沈降等を用いて、可溶性の特異的結合パートナーを分析し得る。ある実施形態において、可溶化した抗体又は抗原結合ドメインを、下記及びＭａｒｓｔｏｎら、（１９９０），Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．，１８２：２６４−７５等の標準的方法を用いて単離し得る。
ある実施形態において、単離に際しては、抗体又は抗原結合ドメインが生物学的に活性のあるものでないことがある。ある実施形態において、ポリペプチドのその３次元構造への「再折り畳み」若しくは変換及びジスルフィド結合生成の方法を用いて、生物学的活性を復活させ得る。ある実施形態において、特定濃度のカオトロープ存在下で、通常７以上のｐＨに可溶化させたポリペプチドを曝露することにより、生物学的活性を復活させ得る。カオトロープの選択は、封入体可溶化で行った選択と非常に似ているが、ある実施形態において、カオトロープを低濃度で使用し、可溶化で用いたカオトロープと同じである必要はない。ある実施形態において、タンパク質のシステイン架橋形成で起こるジスルフィドシャッフリングを可能にする特定の酸化還元電位を生じさせるために、再折り畳み／酸化溶液には、還元パートナー又は、特定の割合の還元パートナーとその酸化型、も含有される。典型的な酸化還元カップルには、これらに限定されないが、システイン／シスタミン、グルタチオン（ＧＳＨ）／ジチオビスＧＳＨ、塩化第二銅、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）／ジチアンＤＴＴ及び２−メルカオプトエタノール（ｂＭＥ）／ジチオ−ｂ（ＭＥ）が含まれる。ある実施形態において、コソルベントを使用し得るか、又はコソルベントが再折り畳みの効率を向上させるために必要であり得、この目的のために使用される典型的なリパートナー（ｒｅｐａｒｔｎｅｒ）には、これらに限定されないが、グリセロール、様々な分子量のポリエチレングリコール、アルギニン及び関連分子が含まれる。
ある実施形態において、化学合成法により特異的結合パートナーを調製し得る。ある実施形態において、化学合成法に、固相ペプチド合成を組み込み得る。ある実施形態において、化学合成法には、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄら、（１９６３），Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，８５：２１４９；Ｈｏｕｇｈｔｅｎら、（１９８５），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：５１３２；及びＳｔｅｗａｒｔ及びＹｏｕｎｇ（１９８４），Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬに記載されているような本分野で公知の方法を使用し得る。ある実施形態において、アミノ末端のメチオニンを用いて、又は用いずに、ポリペプチドを合成し得る。ある実施形態において、これらの文献に記載されている方法を用いて、ジスルフィド架橋を形成させるために、化学的に合成した抗体及び抗原結合ドメインを酸化し得る。ある実施形態において、そのように調製された抗体は、天然の又は組み換えにより作製した抗体若しくは抗原結合ドメインと関連する少なくとも１つの生物学的活性を有しているであろう。
ある実施形態において、単独の抗サイトカイン療法又は抗サイトカイン療法の併用（ＴＮＦ、ＩＬ−１等の阻害剤）が効果的に使用されているが、活性化された免疫Ｔ及びＢ細胞によりその使用には限界がある。ある例において、これらの治療法は、慢性疾患の経過中の定期的な治療を伴う。
進行中の自己免疫反応に対して、ある例において、動物及びヒト炎症疾患において、Ｔ細胞活性化を抑制する阻害剤が使用されているが、効果は限られている。このような限界の理由の１つは、炎症部位における炎症性のサイトカイン環境である。良い例は、ＣＴＬＡ−４療法であるが、関節炎誘発時からマウスを処置した場合、これによりコラーゲン誘発性関節炎（ＣＩＡ）が緩和される。疾患発症時（又は、自己免疫反応が進行中）に開始した場合、この治療は効果が得られない可能性があるが、このことから、炎症時において、炎症性サイトカインがＴ細胞よりも重要であることが示唆される。あるいは、この段階で、ＣＴＬＡ−４によりＴ細胞の活性化を阻害することができない。
インターロイキン−１（ＩＬ−１）は、抗炎症サイトカインである。ある例において、ＩＬ−１は、多くの疾患及び医学的症状における介在物質である。ある例において、ＩＬ−１は、マクロファージ／単球系列の細胞により産生される。ある例において、ＩＬ−１は、ＩＬ−１アルファ（ＩＬ−１α）及びＩＬ−１ベータ（ＩＬ−１β）の２つの型で産生される。
自然発症性の、又は実験的に引き起こした疾患又は医学的症状が体液又は組織中のＩＬ−１レベル上昇と関連している場合、及び／又は、体から採取した細胞又は組織を培養した際にＩＬ−１産生レベルが上昇している場合、疾患又は医学的症状は、「インターロイキン１介在疾患」であると見なされる。ある実施形態において、そのようなインターロイキン１介在疾患は、次のさらなる２つの状態によっても認識される。（１）疾患又は医学的症状に関連する病理学的所見がＩＬ−１投与又はＩＬ−１発現の上方調節により動物において実験的に模倣可能である；及び（２）その疾患又は医学的症状の実験的動物モデルにおいて誘導された病変が、ＩＬ−１の作用を阻害する薬剤を用いた処置により緩和されるか、又はなくなる。ある実施形態において、ＩＬ−１介在疾患において、１つ又は複数の上記条件が適合する。ある実施形態において、ＩＬ−１介在疾患において、３つの全ての条件が適合する。
急性及び慢性インターロイキン−１（ＩＬ−１）介在疾患には、これらに限定されないが、次の、急性膵炎、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ又はルーゲーリック病）；アルツハイマー病；これらに限定されないが、ＡＩＤＳ誘発性悪液質を含む悪液質／食欲不振；喘息及び他の肺疾患；アテローム性動脈硬化症；自己免疫脈管炎；慢性疲労性症候群；クロストリジウム関連性の下痢を含む（これに限定されない）、クロストリジウム関連疾患；これらに限定されないがうっ血性心不全、冠動脈再狭窄、心筋梗塞、心筋機能障害（例えば、敗血症関連）及び冠状動脈バイパス移植を含む冠状動脈症状及び徴候；これらに限定されないが、多発性骨髄腫白血病及び骨髄性白血病（例えば、ＡＭＬ及びＣＭＬ）及び腫瘍転移を含む、これらに限定されないが白血病を含む癌；糖尿病（これらに限定されないが、インスリン依存性糖尿病を含む。）；子宮内膜症；発熱；線維筋痛；糸球体腎炎；移植片対宿主拒絶反応及び／又は移植拒絶反応；出血性ショック；痛覚過敏；炎症性腸疾患；これらに限定されないが、変形性関節症、乾癬性関節炎及び関節リウマチを含む関節の炎症症状；これらに限定されないが、例えば角膜移植と関連する疾患を含む炎症性の眼疾患；これらに限定されないが、脳虚血（これらに限定されないが、例えば外傷、てんかん、出血又は発作（それぞれが神経変性を誘発する。）の結果としての脳の損傷を含む。）を含む虚血；川崎病；学習障害；肺疾患（これらに限定されないが、急性呼吸窮迫症候群又はＡＲＤＳを含む）；多発性硬化症；ミオパシー（例えば、筋肉タンパク質代謝（これらに限定されないが、敗血症における筋肉タンパク質代謝を含む。））；神経毒性（これらに限定されないが、ＨＩＶによって誘発される状態等を含む。）；骨粗しょう症；これらに限定されないが、癌関連の疼痛を含む疼痛；パーキンソン病；歯周病；早産；乾癬；再灌流傷害；敗血性ショック；放射線療法による副作用；顎関節疾患；睡眠障害；ブドウ膜炎；及び例えば、筋違え、ねんざ、軟骨組織損傷、外傷性傷害、整形外科手術、感染又は他の疾患プロセスにより起こる炎症状態が含まれる。
ある実施形態において、ＩＬ−１阻害剤は、ＩＬ−１に対する細胞性受容体の活性化を特異的に妨害するいずれかのタンパク質又は分子であり得、それはいずれかの数の機構の結果であり得る。典型的な機構には、これらに限定されないが、ＩＬ−１産生の下方調節、遊離ＩＬ−１の結合、ＩＬ−１のその受容体への結合妨害、ＩＬ−１受容体複合体形成（つまり、ＩＬ−１受容体のＩＬ−１受容体付属タンパク質との会合）の妨害、及びその受容体に結合した後のＩＬ−１シグナル調節の妨害が含まれる。
あるインターロイキン−１阻害剤には、これらに限定されないが、ＫｉｎｅｒｅｔＴＭ、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−１ｒａ変異体及びＩＬ−１ｒａ誘導体（これらをまとめて「ＩＬ−１ｒａタンパク質」と呼ぶ。）；抗−ＩＬ−１受容体モノクローナル抗体（例えば、欧州特許ＥＰ第６２３６７４号を参照。これをあらゆる目的のために、参照により本明細書に組み込む。）；これらに限定されないが、可溶性ＩＬ−１受容体を含むＩＬ−１結合タンパク質（米国特許第５，４９２，８８８号、米国特許第５，４８８，０３２号及び米国特許第５，４６４，９３７号、米国特許第５，３１９，０７１号、及び米国特許第５，１８０，８１２号を参照のこと。これらをあらゆる目的のために、参照により本明細書に組み込む。）；抗−ＩＬ−１モノクローナル抗体（例えば、国際特許ＷＯ第９５０１９９７号、国際特許ＷＯ第９４０２６２７号、国際特許ＷＯ第９００６３７１号、米国特許第４，９３５，３４３号、欧州特許ＥＰ第３６４７７８号、欧州特許ＥＰ第２６７６１１号及び欧州特許ＥＰ第２２００６３号を参照のこと。これらをあらゆる目的のために、参照により本明細書に組み込む。）；ＩＬ−１受容体付属タンパク質及びそれらに対する抗体（国際特許ＷＯ第９６／２３０６７号及び国際特許ＷＯ第９９／３７７７３号）を参照のこと。これらをあらゆる目的のために、参照により本明細書に組み込む。）；インターロイキン−１ベータ変換酵素（ＩＣＥ）又はカスパーゼＩの阻害剤（国際特許ＷＯ第９９／４６２４８号、国際特許ＷＯ第９９／４７５４５号及び国際特許ＷＯ第９９／４７１５４号を参照のこと。これらをあらゆる目的のために、参照により本明細書に組み込む。）、これらはＩＬ−１ベータ産生及び分泌を阻害するために使用し得る。；インターロイキン−１ベータプロテアーゼ阻害剤；ＩＬ−１阻害ペプチド及び半減期を延長させるビヒクルと連結したペプチド；これらは、国際特許ＷＯ第９９／２５０４４号に記載されている；及び、ＩＬ−１のインビボ合成又は細胞外への放出を阻害する他の化合物ならびにタンパク質が含まれる。
典型的なＩＬ−１阻害剤は、例えば米国特許第５，７４７，４４４号；第５，３５９，０３２号、第５，６０８，０３５号、第５，８４３，９０５号、第５，３５９，０３２号、第５，８６６，５７６号、第５，８６９，６６０号、第５，８６９，３１５号、第５，８７２，０９５号、第５，９５５，４８０号、第５，９６５，５６４号；国際（ＷＯ）特許出願第９８／２１９５７号、第９６／０９３２３号、第９１／１７１８４号、第９６／４０９０７号、第９８／３２７３３号、第９８／４２３２５号、第９８／４４９４０号、第第９８／４７８９２号、第９８／５６３７７号、第９９／０３８３７号、第９９／０６４２６号、第９９／０６０４２号、第９１／１７２４９号、第９８／３２７３３号、第９８／１７６６１号、第９７／０８１７４号、第９５／３４３２６号、第９９／３６４２６号、第９９／３６４１５号；欧州（ＥＰ）特許出願第５３４９７８号及び第８９４７９５号；及び仏国特許出願第ＦＲ２７６２５１４号で開示されている。あらゆる目的のために、上述の参考文献全ての開示を、参照により本明細書に組み込む。
インターロイキン−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１ｒａ）は、インターロイキン−１の天然の阻害剤として働くヒトタンパク質であり、ＩＬ−１ファミリーの一員であるが、これには、ＩＬ−１α及びＩＬ−１βが含まれる。ＩＬ−１ｒａ及びその変異体ならびに誘導体を含むある受容体アンタゴニスト、ならびに、それらを調製し使用する方法について、米国特許第５，０７５，２２２号；国際特許ＷＯ第９１／０８２８５号；国際特許ＷＯ第９１／１７１８４号；オーストラリア国特許ＡＵ第９１７３６３６号；国際特許ＷＯ第９２／１６２２１号；国際特許ＷＯ第９３／２１９４６号；国際特許ＷＯ第９４／０６４５７号；国際特許ＷＯ第９４／２１２７５号；仏国特許ＦＲ第２７０６７７２号；国際特許ＷＯ第９４／２１２３５号；独国特許ＤＥ第４２１９６２６号；国際特許ＷＯ第９４／２０５１７号；国際特許ＷＯ第９６／２２７９３号；国際特許ＷＯ第９７／２８８２８号；及び国際特許ＷＯ第９９／３６５４１号（あらゆる目的のために、これらを参照により本明細書に組み込む。）に記載されている。ある実施形態において、ＩＬ−１受容体アンタゴニストをグリコシル化し得る。ある実施形態において、ＩＬ−１受容体アンタゴニストは、非グリコシル化物であり得る。
ＩＬ−１ｒａの３種類の型及びそれらの変異体について、米国特許第５，０７５，２２２号（‘２２２特許）に記載されている。第一の型であるＩＬ−１ｒａα（‘２２２特許において、「ＩＬ−１ｉ」と呼ばれている。）は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量が２２〜２３ｋＤであり、およその等電点が４．８の分子であり、トリス緩衝液、ｐＨ７．６中の５２ｍＭ前後の ＮａＣｌでＭｏｎｏＱ ＦＰＬＣカラムから抽出されることを特徴とする。第二の型であるＩＬ−１ｒａβは、２２〜２３ｋＤのタンパク質であり、４８ｍＭ ＮａＣｌでＭｏｎｏＱ ＦＰＬＣカラムから抽出されることを特徴とする。ＩＬ−１ｒａα及びＩＬ−１ｒａβは両方ともグリコシル化されている。第３の型であるＩＬ−１ｒａｘは、２０ｋＤのタンパク質であり、４８ｍＭ ＮａＣｌ前後でＭｏｎｏＱ ＦＰＬＣカラムから抽出され、非グリコシル化分子であることを特徴とする。‘２２２特許において、本阻害剤をコードする遺伝子を単離し、それらの遺伝子を適切なベクターにクローニングし、ある細胞タイプにそれらの遺伝子を形質転換及びトランスフェクションし、それらの遺伝子を発現させて阻害剤を産生させる、ある方法についても記載されている。
ＫＩＮ２は、Ｆｃ分子に融合させたＩＬ−１ｒａの変異体である。ＫＩＮ２の配列は、配列番号３で開示されている。ＫＩＮ２発現及び精製のさらなる情報については、米国特許第６，２９４，１７０号に記載されている。
ある実施形態において、欠失、挿入及び／又は置換（個別に、又はまとめて、「変異体」と呼ぶ。）は、ＩＬ−１ｒａのアミノ酸配列中で行われる。ある実施形態において、ＩＬ−１ｒａ変異体は、生物学的に活性を有する（例えば、ＩＬ−１に対する阻害能を保持する。）。
ある疾患及び医学的症状は、ＴＮＦにより媒介され、炎症状態に分類され得る。本明細書中で使用する場合、「ＴＮＦ介在疾患」には、これらに限定されないが、体液又は組織中のＴＮＦレベル上昇、及び／又は、体から採取した細胞又は組織の、培養におけるＴＮＦ産生レベル上昇に伴う、疾患又は医学的症状が含まれる。ある実施形態において、（１）疾患又は医学的症状に関連する病理学的所見がＴＮＦの投与又はＴＮＦ発現の上方調節により動物において実験的に模倣可能であること、及び／又は（２）その疾患又は医学的症状の実験動物モデルにおいて誘導される病変が、ＴＮＦの作用を阻害する薬剤を用いた処置により緩和される、又は消えるならば、疾患はＴＮＦ介在疾患であり得る。
ある急性及び慢性ＴＮＦ介在疾患には、これらに限定されないが、悪液質／食欲不振；これらに限定されないが白血病を含む癌；慢性疲労性症候群；これらに限定されないが、うっ血性心不全、冠動脈再狭窄、心筋梗塞、心筋機能障害（これらに限定されないが、敗血症に関連するそのような状態を含む。）及び冠状動脈バイパス移植を含む冠状動脈症状及び／又は徴候；うつ；これらに限定されないが、若年性１型糖尿病、糖尿病及びインスリン抵抗性（これに限定されないが肥満に関与するインスリン抵抗性を含む。）を含む糖尿病；子宮内膜症、子宮内膜炎及び関連症状；線維筋痛及び痛覚欠如；移植片対宿主拒絶反応；痛覚過敏；これらに限定されないが、クローン病及びクロストリジウム・ディフィシレ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）が関与する下痢を含む炎症性腸疾患；これに限定されないが脳虚血（これらに限定されないが、例えば外傷、てんかん、出血及び／又は発作の結果起こる脳の損傷を含む。）を含む虚血；これらに限定されないが、成人呼吸窮迫症候群、喘息及び肺線維症を含む肺疾患；多発性硬化症；神経炎症疾患；これらに限定されないが、角膜移植、角膜変性及びブドウ膜炎を含む眼疾患及び症状；これらに限定されないが、癌関連の疼痛を含む疼痛；膵炎；歯周病；毛孔性紅色粃糠疹（ＰＲＰ）；細菌性及び非細菌性前立腺炎を含む前立腺炎及び関連症状；乾癬及び関連症状；肺線維症；再灌流傷害；これらに限定されないが、関節リウマチ、変形性関節症、若年性関節炎（これらに限定されないが、若年性関節リウマチを含む。）、血清反応陰性の多発性関節炎、強直性脊椎炎、ライター症候群及び反応性関節炎、スティル病、乾癬性関節炎、炎症性腸疾患合併関節炎、多発性筋炎、皮膚筋炎、強皮症、全身性硬化症、脈管炎（例えば、川崎病）、脳の脈管炎、ライム病、ブドウ球菌誘発性（「敗血症性」）関節炎、シェーグレン症候群、リウマチ熱、多発性軟骨炎及びリウマチ性多発筋痛及び巨細胞性動脈炎を含む）リウマチ性疾患；敗血症ショック；放射線療法による副作用；全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）；顎関節疾患；甲状腺炎；及び、組織移植及び／又は例えば、筋違え、ねんざ、軟骨組織損傷、外傷性傷害、整形外科手術、感染（例えば、ＨＩＶ、クロストリジウムディフィシレ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）及び関連種）の結果起こる炎症症状又は他の疾患プロセスが含まれる。
ある実施形態において、ＴＮＦ阻害剤は、ＴＮＦ産生の下方調節又は阻害、遊離ＴＮＦの結合、ＴＮＦのその受容体への結合妨害、及びその受容体に結合した後のＴＮＦシグナル調節の妨害のうち少なくとも１つによって作用し得る。「ＴＮＦ阻害剤」という用語には、これらに限定されないが、可溶化ＴＮＦ受容体（これらに限定されないが、可溶性腫瘍壊死因子受容体タイプＩ（ｓＴＮＦＲ−Ｉ；ｐ５５受容体とも呼ばれる。）、可溶性腫瘍壊死因子受容体タイプＩＩ（ｐ７５受容体とも呼ばれる。）及びＥｎｂｒｅｌ（Ｒ）を含む。）；ＴＮＦに対する抗体（これらに限定されないが、ＲｅｍｉｃａｄｅＴＭ及びＤ２Ｅ７（例えば、米国特許第６，０９０，３８２号及び第６，２５８，５６２号を参照）が含まれる。）；ＴＮＦ受容体に対する抗体；ｓＴＮＦＲ−Ｉ（例えば、国際特許ＷＯ第９８／２４４６３号参照）、エタナーセプト（Ｅｎｂｒｅｌ（Ｒ））、ＡｖａｋｉｎｅＴＭ；ＴＮＦ−α変換酵素（ＴＡＣＥ）の阻害剤；及びＴＮＦ活性に影響を与える他の分子が含まれる。
典型的なＴＮＦ−α阻害剤は、例えば、欧州特許出願
Figure 2006517191
 に記載されている。上記の全ての開示は、あらゆる目的のために、参照により本明細書に組み込まれる。
欧州特許ＥＰ第３９３ ４３８号及び欧州特許ＥＰ第４２２ ３３９号において、可溶性ＴＮＦ受容体タイプＩ（ｓＴＮＦ−Ｉ又は３０ｋＤａ ＴＮＦ阻害剤としても知られている。）及び可溶性ＴＮＦ受容体タイプＩＩ（ｓＴＮＦＲ−ＩＩ又は４０ｋＤａ ＴＮＦ阻害剤としても知られている。）（これらはまとめて、「ｓＴＮＦＲｓ」と呼ばれる。）のアミノ酸及び核酸配列が記載されている。欧州特許ＥＰ第３９３ ４３８号及び欧州特許ＥＰ第４２２ ３３９号においてもまた、これらに限定されないが断片、機能的誘導体及び変異体を含む、ｓＴＮＦＲ−Ｉ及びｓＴＮＦＲ−ＩＩの改変型が記載されている。さらに、欧州特許ＥＰ第３９３ ４３８号及び欧州特許ＥＰ第 ４２２ ３３９号において、阻害剤をコードする遺伝子を単離し、その遺伝子を適切なベクターにクローニングし、ある細胞タイプにその遺伝子を形質転換又はトランスフェクションし、その遺伝子を発現させてその阻害剤を産生させる方法が記載されている。
ｓＴＮＦＲ−Ｉ及びｓＴＮＦＲ−ＩＩは、受容体の、神経成長因子／ＴＮＦ受容体のスーパーファミリーの一員であるが、このスーパーファミリーには、神経成長因子受容体（ＮＧＦ）、Ｂ細胞抗原ＣＤ４０、４−１ ＢＢ、ラットＴ細胞抗原ＭＲＣ ＯＸ４０、ｆａｓ 抗原及びＣＤ２７及びＣＤ３０抗原（Ｓｍｉｔｈら、（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４８：１０１９−１０２３）が含まれる。細胞表面受容体のそのグループで保存されている特性とは、システインリッチな細胞外リガンド結合ドメインであり、それは、よく保存された位置において、４〜６個のシステイン残基を含有する約４０アミノ酸の４つの反復モチーフに分けることができる（Ｓｍｉｔｈら、（１９９０）上述）。
欧州特許ＥＰ第３９３ ４３８号において、４０ｋＤａのＴＮＦ阻害剤 Δ５１及び４０ｋＤａのＴＮＦ阻害剤 Δ５３が教示されているが、それらは、全長組み換え４０ｋＤａ ＴＮＦ阻害剤タンパク質の短縮型である。Δ５１及びΔ５３は、５１又は５３個のアミノ酸をそれぞれ有しており、成熟タンパク質のカルボキシ末端で欠失が起こっている。
公開ＰＣＴ出願ＷＯ第９８／０１５５５号において、４番目のドメイン（ｓＴＮＦＲ−Ｉのアミノ酸残基、Ｔｈｒ１２７−Ａｓｎ１６１、及びｓＴＮＦＲ−ＩＩのアミノ酸残基Ｐｒｏ１４１−Ｔｈｒ１７９）；第３のドメインの一部（ｓＴＮＦＲ−Ｉのアミノ酸残基 Ａｓｎ１１１−Ｃｙｓ１２６、及びｓＴＮＦＲ−ＩＩのアミノ酸残基 Ｐｒｏ１２３−Ｌｙｓ１４０）を含有しないｓＴＮＦＲ−Ｉ及びｓＴＮＦＲ−ＩＩの短縮形；及び、場合によっては、第一のドメイン（ｓＴＮＦＲ−Ｉのアミノ酸残基 Ａｓｐ１−Ｃｙｓ１９及びｓＴＮＦＲ−ＩＩのアミノ酸残基 Ｌｅｕ１−Ｃｙｓ３２）を含有しないｓＴＮＦＲ−Ｉ及びｓＴＮＦＲ−ＩＩの短縮形が記載されている。ある実施形態において、短縮ｓＴＮＦＲｓには、式、Ｒ１−［Ｃｙｓ１９−Ｃｙｓ１０３］−Ｒ２及びＲ４−［Ｃｙｓ３２−Ｃｙｓ１１５］−Ｒ５で表されるタンパク質が含まれる。これらのタンパク質はそれぞれ、ｓＴＮＦＲ−Ｉ及びｓＴＮＦＲ−ＩＩの短縮型である。
本明細書で使用する場合、「Ｒ１−［Ｃｙｓ１９−Ｃｙｓ１０３］−Ｒ２」は、１つ又は複数のタンパク質を表す（式中、［Ｃｙｓ１９−Ｃｙｓ１０３］は、ｓＴＮＦＲ−Ｉの残基１９から１０３であり、その配列は、国際特許ＷＯ第９８／０１５５５号の図１で示されている；Ｒ１は、Ｃｙｓ１９又はＣｙｓ１８からＡｓｐ１の間から選択される１つ若しくは複数のアミノ末端アミノ酸残基のメチオニン化又は非メチオニン化アミン基を表し；Ｒ２は、Ｃｙｓ１０３又は、Ｐｈｅ１０４からＬｅｕ１０の間から選択される１つ若しくは複数のカルボキシ末端アミノ酸残基のカルボキシル基を表す。）。
本発明の典型的な短縮型ｓＴＮＦＲ−Ｉには、これらに限定されないが、メチオニン化又は非メチオニン化の何れかの、ｓＴＮＦＲ−Ｉ ２．６Ｄ／Ｃ１０５、ｓＴＮＦＲ−Ｉ ２．６Ｄ／Ｃ１０６、ｓＴＮＦＲ−Ｉ ２．６Ｄ／Ｎ１０５、ｓＴＮＦＲ−Ｉ ２．３Ｄ／ｄ８、ｓＴＮＦＲ−Ｉ ２．３Ｄ／ｄ１８、ｓＴＮＦＲ−Ｉ ２．３Ｄ／ｄ１５、及びそれらの変異体ならびに誘導体が含まれる。ある典型的な短縮型ｓＴＮＦＲ−１’ｓは、例えば、公開ＰＣＴ出願ＷＯ第９８／０１５５５号において記載されている。
本明細書中で使用する場合、「Ｒ３−［Ｃｙｓ３２−Ｃｙｓ１１５］−Ｒ４」は、１つ又は複数のタンパク質を表す（式中、［Ｃｙｓ３２−Ｃｙｓ１１５］は、ｓＴＮＦＲ−ＩＩの残基 Ｃｙｓ３２からＣｙｓ１１５であり、その配列は、国際特許ＷＯ第９８／０１５５５号の図８で示されており；Ｒ３は、Ｃｙｓ３２又はＣｙｓ３１からＬｅｕ１の間から選択される１つ若しくは複数のアミノ末端アミノ酸残基のメチオニン化又は非メチオニン化アミン基を表し；Ｒ４は、Ｃｙｓ１１５又は、Ａｌａ１１６からＡｒｇ１２２の間から選択される１つ若しくは複数のカルボキシ末端アミノ酸残基のカルボキシル基を表す。）。
ある実施形態において、ｓＴＮＦＲ−Ｉは、ＰＥＧ修飾され得る。ｓＴＮＦＲ−１のある典型的なＮ末端ＰＥＧ修飾型については、例えば公開ＰＣＴ出願ＷＯ第９８／０１５５５号に記載されている。
インターフェロン（ＩＦＮｓ）の名前は元来、ホスト細胞のウイルス感染を妨害する能力に由来する（Ｉｓｓａｃｓ及びＬｉｎｄｅｎｍａｎ、１９５７、Ｐｒｏｃ．Ｒ．Ｓｏｃ．１４７：２８−２６７）。その発見から、抗ウイルス防御に加えて、多くのインターフェロンファミリーのメンバーが、細胞増殖及び細胞免疫を含む様々な生物学的役割を有することで同定されてきた。ＩＦＮファミリーのメンバーは、細胞又は組織の由来：白血球、繊維芽細胞及び免疫、から元来、３つのグループに分類されていた。その後、これらのインターフェロン種は、ＩＦＮ−α、ＩＮＦ−β及びＩＮＦ−γとしてそれぞれ知られるようになった（Ｐｅｓｔｋａら、１９９７、Ｓｅｍｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２４（ｓｕｐｐｌ ９）：Ｓ９−４−Ｓ９−１７）。さらなるＩＦＮ種が発見され、現在、インターフェロンは共通する受容体タイプ、タイプＩ ＩＦＮ受容体又はタイプＩＩ ＩＦＮ受容体、に基づく２つのクラスに分けられている（Ｈａｑｕｅ及びＷｉｌｌｉａｍｓ，１９９８、Ｓｅｍｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２５（ｓｕｐｐｌ １）：１４−２２；Ａｇｕｅｔら、１９８４、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １３２：２１１−２１６；Ｍｅｒｌｉｎら、１９８５、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６６：１１４９−１１５２）。インターフェロンタイプ ＩＦＮ−α、ＩＮＦ−β、ＩＮＦ−ω及びＩＦＮ−τは、タイプＩのＩＦＮ受容体に結合するが、一方、ＩＦＮ−γは、タイプＩＩ ＩＦＮ受容体に結合する（Ｐｆｅｆｆｅｒら、１９９８，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５８：２４８９−２４９９）。タイプＩ ＩＦＮｓは、実質的にあらゆる細胞タイプで産生され、ウイルス、２本鎖ＲＮＡ、ポリペプチド及びサイトカインへの曝露で誘導されうる（Ｊｏｎａｓｃｈ及びＨａｌｕｓｋａ，２００１，Ｔｈｅ Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ ６：３４−５５）。タイプＩＩのＩＦＮ−γは、主に、Ｔリンパ球及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞で産生され、多くの免疫刺激で誘導され得る（同文献）。
ＩＦＮ−γシグナリングは、少なくとも５つの異なる個別のタンパク質、ＩＦＮＧＲ１及びＩＦＮＧＲ２（ＩＦＮ−γ受容体のサブユニット）、Ｊａｋ１、Ｊａｋ２及び転写因子ＳＴＡＴ１、に依存する（Ｓｃｈｉｎｄｌｅｒ及びＤａｒｎｅｌｌ，１９９５，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６４：６２１−６５１；Ｂａｃｈら、１９９７，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：５６３−５９１）。ＩＦＮ−γ受容体は、成熟赤血球を除くほとんどの細胞タイプで見出される（Ｆａｒｒａｒ及びＳｃｈｒｅｉｂｅｒ，１９９３，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１：５７１−６１１）。Ｊａｋ１、Ｊａｋ２及びＳＴＡＴ１タンパク質は、ＩＦＮ−γシグナリングを仲介する。
ＩＦＮ−γは、抗ウイルス反応、細胞増殖及び腫瘍抑制等、様々な生物学的機能を制御する。抗ウイルス活性は、侵入、脱殻、転写、ＲＮＡ安定化、翻訳、成熟及びアセンブリーならびに放出を含む、ウイルス感染の全てのフェーズに影響を及ぼすと思われる（同文献）。ＩＦＮ−γは、細胞タイプに依存して、アポプトーシスを誘導又は阻害することによって、細胞増殖を制御する。例えば、ＩＦＮ−γは、マウスプレ−Ｂ細胞のアポプトーシスを誘導するが、Ｂ急性リンパ性白血病細胞のアポプトーシスを阻害する（Ｇｒａｗｕｎｄｅｒら、１９９３、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：５４４−５５１；Ｒｏｊａｓら、１９９６，Ｌｅｕｋｅｍｉａ １０：１７８２−１７８８；Ｂｕｓｃｈｌｅら、１９９３，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７７：２１３−２１８）。増殖及び他の状態に依存して、ＩＦＮ−γは、悪性のヒトＴ細胞における細胞増殖又はアポプトーシスの何れかをも促進する（Ｎｏｖｅｌｌｉら、１９９４、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：４９６−５０４）。
多くの文献により、ＩＦＮ−γの上昇又はそのエフェクター分子がヒト自己免疫疾患で見られる病理の一因となっているという仮説が支持される。例えば、ＩＦＮ−γ又はその発現がＩＦＮ−γにより上方調節される分子、ＩＰ−１０、ＨＬＡ ＤＱ及びネオプテリン等、が全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）患者において、特にループス腎炎を伴う場合、レベルが上昇しているという証拠が挙げられている（Ｆｕｎａｕｃｈｉら、１９９１，Ｔｏｈｏｋｕ Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６４：２５９−２６７；Ｙｏｋｏｙａｍａら、１９９２，Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ．４２：７５５−７６３；Ａｌ−Ｊａｎａｄｉら、１９９３、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １３：５８−６７；Ｎａｒｕｍｉら、２０００、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ １２：１５６１−１５６５；Ｌｉｍら、１９９３、Ａｎｎ．Ｒｈｅｕｍ．Ｄｉｓ．５２：４２９−４３５；Ｓａｍｓｏｎｏｖら、１９９５、Ｌｕｐｕｓ ４：２９−３２）。ループス腎炎患者由来の組織の組織学的解析からさらなる証拠が得られているが、この解析結果によると、健常対照群と比較して、ＷＨＯクラスＩＶ患者由来の腎臓のバイオプシーにおいて、末梢血のＴｈ１：Ｔｈ２比が高くなっており、免疫反応性のようにマクロファージ数及びＩＦＮ−γが大幅に上昇していた（Ｍａｓｕｔａｎｉら、２００１，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ａｎｄ Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ ４４：２０９７−２１０６）。他に、ＳＬＥの発生率上昇に関与するＩＦＮ−γ受容体における多型の同定において、関連性が見られる（Ｎａｋａｓｈｉｍｉら、１９９９、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ４５３：１８７−１９０）。
ＩＦＮ−γを阻害する薬剤を用いて、ループス腎炎のいくつかの様々な動物モデルが試験されてきた。これらの動物モデルの包括的な説明については、Ｔｈｅｏｆｉｌｏｐｏｕｌｏｓ及びＤｉｘｏｎ（１９８５、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ３７：２６９−）で見出すことができる。ヒトループス腎炎に相当すると考えられるマウスの２つの系列／モデル両方で、ＩＮＦの阻害により有益な効果が示された。これらの２つのモデルは、ＮＺＢ／ＮＺＷ Ｆ１（ＢＷＦ１）マウス系列及びＭＲＬ Ｆａｓｌｐｒマウス系列である。両マウス系列では自然に疾患が進行するが、最近の報告において、インターフェロン誘発性遺伝子が、ＮＺＢマウス系列における疾患に対する素因と関与する候補遺伝子として同定された（Ｒｏｚｚｏら、２００１、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １５：４３５−４３）。両マウス系列において、ＴＮＦ−γに対する抗体、ＩＮＦ−γに対する可溶性受容体（タンパク質及びＤＮＡ構築物の両方）を含む様々な薬剤及び遺伝子ノックアウトを用いてＩＦＮ−γ調節／妨害が行われてきた。自己抗体産生、蛋白尿、組織学的観察及び生存率により評価した場合、好ましい効果が繰り返し発表されてきた（Ｔｈｅｏｐｈｉｌｏｐｏｕｌｏｓら、２００１、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｅｓ．３：１３６−）。
ＩＮＦ−γ活性は、免疫反応の適切な制御において必須のものである。しかし、ＩＦＮ−γ活性が上昇することにより、炎症、感染及び自己免疫疾患等の病的状態が起こり得る。過剰なＩＦＮ活性の阻害は、ＩＦＮ−γ介在疾患の患者の治療に対する、有望なストラテジーである。
ＩＬ−１８は、インターフェロン−γを誘発することが明らかになった炎症性のサイトカインであり、以前はインターフェロンガンマ誘導因子（ＩＧＩＦ）と呼ばれていた。ある例において、ＩＬ−１がＩＬ−１８産生を上方調節し、ＩＬ−１８が、ＩＬ−６及びＭＭＰ−１等を含む多くの炎症性サイトカインの産生を誘発することが示された。例えば、Ｄｉｎａｒｅｌｌｏら、（１９９８）、Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｂｉｏｌ．６３：６５８−６４を参照のこと。ある例において、カスパーゼＩもまた。ＩＬ−１８産生に対して重要である。ＴＮＦ−αがＩＬ−１８産生を制御すること、及びＴＮＦ−α及びＩＬ−１８を同時に阻害することで、肝臓毒性から防御されるということも実験により示唆されている。例えば、Ｆａｇｇｉｏｎｉら、（２０００），ＰＮＡＳ ９７：２３６７−７２を参照のこと。
ＩＬ−１８は、インビボにおいて、ＩＬ−１系と似た受容体系を介して働く。ＩＬ−１８は、細胞表面受容体（ＩＬ−１８Ｒ）と相互作用し、ＩＬ−１８Ｒは付属タンパク質（ＩＬ−１８ＲＡｃＰ）と相互作用する。ＩＬ−１８を介するシグナリングは、ＩＬ−１８、ＩＬ−１８Ｒ及びＩＬ−１８ＲＡｃＰの複合体形成を進行させる。ＩＬ−１８に対する天然の阻害剤は、ＩＬ−１８ｂｐである。ある実施形態において、ＩＬ−１８ｂｐは、ＩＬ−１８分子に結合し、ＩＬ−１８Ｒとの相互作用を妨害することにより、「おとり受容体」として働く。
ある実施形態において、本発明は、少なくとも１つのＩＬ−１８阻害剤及びＢ７阻害剤、ＣＤ２８阻害剤、又はその両方を含む処置、及びそのような処置を用いる治療方法に向けられる。ある実施形態において、治療には、ＩＬ−１８阻害剤及び、本明細書中に記載の少なくとも１つのさらなる分子が含まれる。ある実施形態に従って処置し得る典型的な症状には、これらに限定されないが、炎症、自己免疫疾患、ＩＬ−１介在疾患及びＴＮＦ介在疾患が含まれる。ある実施形態に従って、少なくとも１つのＩＬ−１８阻害剤及び本明細書中に記載の少なくとも１つの分子を用いて処置し得る典型的な症状には、これらに限定されないが、関節炎（これらに限定されないが、関節リウマチを含む。）；全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）；移植片対宿主拒絶反応（ＧｖＨＤ）；肝炎；敗血症；及びこれらの疾患を伴う骨及び軟骨損失が含まれる。
典型的なＩＬ−１８阻害剤には、これらに限定されないが、ＩＬ−１８に結合する抗体；ＩＬ−１８Ｒに結合する抗体；ＩＬ−１８ＲＡｃＰに結合する抗体；ＩＬ−１８ｂｐ；ＩＬ−１８Ｒ断片（例えば、ＩＬ−１８受容体の可溶化した細胞外ドメイン）；ＩＬ−１８に結合し、ＩＬ−１８Ｒとのその相互作用を抑制する又は妨害するペプチド；ＩＬ−１８Ｒに結合し、ＩＬ−１８又はＩＬ−１８ＲＡｃＰとのその相互作用を抑制する、又は妨害するペプチド；ＩＬ−１８ＲＡｃＰに結合し、ＩＬ−１８Ｒとのその相互作用を抑制する、又は妨害するペプチド；及びＩＬ−１８の産生又はＩＬ−１８、ＩＬ−１８Ｒ及びＩＬ−１８ＲＡｃＰの何れかの間の相互作用を抑制する、又は妨害する小分子が含まれる。
あるＩＬ−１８阻害剤は、例えば、米国特許第５，９１２，３２４号（１９９４年７月１４日発行）；欧州特許ＥＰ第０ ９６２ ５３１号（１９９９年１２月８日公開）；欧州特許ＥＰ第７１２ ９３１号（１９９４年１１月１５日公開）；米国特許第５,９１４，２５３号（１９９４年７月１４日発行）；国際特許ＷＯ第９７／２４４４１号（１９９７年７月１０日公開）；米国特許第６，０６０，２８３号（２０００年５月９日発行）；欧州特許ＥＰ第８５０ ９５２号（１９９６年１２月２６日公開）；欧州特許ＥＰ第８６４ ５８５号（１９９８年９月１６日公開）；国際特許ＷＯ第９８／４１２３２号（１９９８年９月２４日公開）；米国特許第６，０５４，４８７号（２０００年４月２５日発行）；国際特許ＷＯ第９９／０９０６３号（１９９７年８月１４日公開）；国際特許ＷＯ第９９／２２７６０号（１９９７年１１月３日公開）；国際特許ＷＯ第９９／３７７７２号（１９９８年１月２３日公開）；国際特許ＷＯ第９９／３７７７３号（１９９８年３月２０日公開）；欧州特許ＥＰ第０ ９７４ ６００号（２０００年１月２６日公開）；国際特許ＷＯ第００／１２５５５号（２０００年３月９日公開）；日本国特許ＪＰ第１１１，３９９／９４（１９９７年１０月３１日公開）；イスラエル国特許出願ＩＬ第１２１５５４ Ａ０（１９９８年２月８日公開）（あらゆる目的のために、これらを参照により本明細書に組み込む。）に記載されている。
Ｂ７は、Ｔ細胞の副刺激を仲介する受容体である。Ｂ７は、２つの別個のリガンド、ＣＤ２８及びＣＴＬＡ４に結合する。Ｂ７及びＣＤ２８の相互作用により、Ｔ細胞が活性化される。ＣＴＬＡ４は、この活性化の負の調節因子である。Ｂ７．１及びＢ７．２と呼ばれる、少なくとも２つのＢ７受容体がある。
本明細書中で使用する場合、「Ｂ７」という用語は、Ｂ７．１、Ｂ７．２、又はＢ７．１及びＢ７．２の両方を意味する。
ある実施形態において、可溶性Ｂ７分子を、副刺激経路を調節するために使用し得る。ある実施形態において、可溶性ＣＴＬＡ４分子を、副刺激経路を調節するために使用し得る。Ｂ細胞−Ｔ細胞副刺激経路のある調節因子には、これらに限定されないが、ＣＤ２８、Ｂ７．１及びＢ７．２の阻害剤が含まれる。ある例には、これらに限定されないが、可溶型のＢ７．１若しくはＢ７．２、及びＣＴＬＡ４が含まれる。
Ｂ７．１配列及び、Ｂ細胞−Ｔ細胞副刺激経路の、あるＢ７．１由来阻害剤について、Ｆｒｅｅｍａｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４３，２７１４−２７２２（１９８９）に記載されている。
Ｂ７．２配列及び、Ｂ細胞−Ｔ細胞副刺激経路の、あるＢ７．２由来阻害剤について、米国特許第５，９４２，６０７号に記載されている。
Ｂ７受容体についても、国際特許ＷＯ第９２／０００９２号及び国際特許ＷＯ第９８／５８９６５号に記載されている。
ＣＤ２８配列は、Ａｒｕｆｆｏら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４，８５７３−８５７９（１９８７）で開示されている。ＣＤ２８分子も、国際特許ＷＯ第９０／０５５４１号、国際特許ＷＯ第９３／１９７６７号、国際特許ＷＯ第９４／２８９１２号及び欧州特許ＥＰ第０ ４４５ ２２８号で開示されている。
Ｂ７．１（ＣＤ８０）及びＢ７．２（ＣＤ８６）とのＣＤ２８の相互作用が関与するＢ細胞／Ｔ細胞副刺激経路及びＣＴＬＡ４によるこの相互作用の調節に関する多くの文献がある。Ｂ７．１及びＢ７．２は、活性化Ｂリンパ球の表面で発現される（Ｌｉｎｓｌｅｙら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３，７２１−７３０（１９９１）；Ｆｒｅｅｍａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６２，９０９−９１１（１９９３））。Ｂ７．１及びＢ７．２の両方が、Ｔリンパ球で発現される２つのリガンド、ＣＤ２８及びＣＴＬＡ４に対する受容体である。ＣＤ２８は、静止Ｔ細胞で構成的に発現され、活性化後に増加するが、一方、ＣＴＬＡ４は、休止Ｔ細胞では発現されないが、活性化後に現れる（Ｂｒｕｎｅｔら、Ｎａｔｕｒｅ ３２８，２６７−２７０（１９８７））。Ｂ７．１及びＢ７．２とのＣＤ２８の相互作用により、Ｔ細胞活性化への刺激シグナルが起こるが、一方で、Ｂ７．１及びＢ７．２に結合するＣＴＬＡ４はその反応を減衰させる。ＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質を構築し、これを用いて、Ｂ７．１及びＢ７．２に対するＣＴＬＡ４結合の影響を調べた（例えば、国際特許ＷＯ第９３／００４３１号及び国際特許ＷＯ第９７／２８２６７号を参照のこと。）。Ｂ７：ＣＤ２８／ＣＴＬＡ４副刺激経路は、Ｔ細胞介在免疫反応に関与しており、その経路を操作することは、関節リウマチ、移植片対宿主拒絶反応、狼瘡、多発性硬化症、乾癬及び他の疾患、例えば、本明細書中で言及するＩＬ−１及びＴＮＦ−α介在疾患等を含む様々な疾患の予防及び治療において有用である。
Ｂ細胞／Ｔ細胞副刺激経路が介在する免疫反応を、ＣＤ２８／Ｂ７経路の阻害剤によって調節し得る。上述のように、あるそのような阻害剤は、ＣＴＬＡ４である。ある実施形態において、ＣＴＬＡ４を、直接又は１つ若しくは複数のリンカー部分を介しての何れかで、ヒト免疫グロブリン領域に融合させる。ある実施形態において、ＣＴＬＡ４は、Ｂ７．１及び／又はＢ７．２を結合し、ＣＤ２８／Ｂ７経路が介在する免疫反応をある程度又は完全に阻害するＣＴＬＡ４の細胞外ドメインを含有する。ある実施形態において、ＣＴＬＡ４細胞外ドメインには、配列番号２で示すように、概して、アミノ酸残基１（メチオニン）から１２４（アスパラギン酸）までが含まれる。他の典型的なＣＴＬＡ４ポリペプチドには、これらに限定されないが、少なくともＣＴＬＡ４細胞外ドメインの一部を包含する断片が含まれるが、その断片はＢ７．１及び／又はＢ７．２と結合し、ＣＤ２８／Ｂ７経路が介在する免疫反応を部分的又は完全に阻害する。ある実施形態において、直接又は１つ若しくは複数のリンカー部分を介しての何れかで、ＣＴＬＡ４細胞外ドメインをヒト免疫グロブリン領域に融合させ得る。
ある実施形態において、ＣＴＬＡ４ポリペプチドには、配列番号２で示される配列において、１つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失又は挿入がある変異体が含まれる。非限定例として、ＣＴＬＡ４変異体は、２５番の位置にあるセリン、２９番のアラニン、３０番のスレオニン、１０４番のロイシン及び／又は１０５番のグリシンに対する様々なアミノ酸の置換を有し得る。ある非限定的なＣＴＬＡ４変異体については、国際特許ＷＯ第０２／０２６３８号に記載されるとおりである。ある実施形態において、ＣＴＬＡ４変異体は、配列番号２で示される配列の２９番の位置のアラニンがチロシンに置換され、１０４番のロイシンがグルタミン酸に置換されている。ある実施形態において、上述のＣＴＬＡ４変異体は、ヒト免疫グロブリン領域に融合させた、およそ残基１−１２４の細胞外ドメインにある。
典型的なＢ７及びＣＤ２８阻害剤には、これらに限定されないが、ＣＴＬＡ４、ＣＴＬＡ４−Ｆｃ、可溶型のＢ７．１、可溶型のＢ７．２、アンタゴニストＣＤ２８抗体及びアンタゴニストＢ７抗体が含まれる。
ある実施形態において、治療には、ＩＣＯＳ及びＢ７ＲＰ１のうち少なくとも１つが含有される。ある例には、これらに限定されないが、可溶型ＩＣＯＳが含まれる。Ｂ７ＲＰ１及びＩＣＯＳ配列は、ＰＣＴ公開出願ＷＯ第００／４６２４０号で開示されている。
ある実施形態において、治療には、ＣＤ４０及びＣＤ４０Ｌのうち少なくとも１つが含有される。ある例には、これらに限定されないが、可溶型ＣＤ４０が含まれる。ＣＤ４０Ｌ配列は、国際特許ＷＯ第９３／０８２０７号及び米国特許第５，９８１，７２４号で開示されている。ＣＤ４０配列は、Ｓｔａｍｅｎｋｏｖｉｃら、ＥＭＢＯ Ｊ．８，１４０３（１９８９）で開示されている。ＣＤ４０ Ａｂｓ（アンタゴニストＡｂｓを含む。）は、国際特許ＷＯ９５／０９６５３号で開示されている。ＣＤ４０リガンドＡｂｓ（アンタゴニストＡｂｓを含む。）は、国際特許ＷＯ第９６／４０９１８号で開示されている。
ある実施形態において、治療には、ＣＤ３０及びＣＤ３０Ｌのうち少なくとも１つが含有される。ヒトＣＤ３０の配列は、Ｄｕｒｋｏｐら、Ｃｅｌｌ ６８，４２１（１９９２）で開示されている。ヒトＣＤ３０リガンドの配列は、国際特許ＷＯ第９３／２４１３５号で開示されている。
ある実施形態において、治療には、ＣＤ２７及びＣＤ２７Ｌのうち少なくとも１つが含有される。ヒトＣＤ２７の配列は、Ｃａｍｅｒｉｎｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７，３１６５（１９９１）で開示されている。ヒトＣＤ２７リガンドの配列は、国際特許ＷＯ第９４／０５６９１号で開示されている。
ある実施形態において、治療には、ＯＸ４０及びＯＸ４０Ｌのうち少なくとも１つが含有される。ある例には、可溶型ＯＸ４０が含まれる。ヒトＯＸ４０リガンドの配列は、Ｍｉｕｒａら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ １１，１３１３（１９９１）で開示されている。
ある実施形態において、治療には、４−１−ＢＢ及び４−１−ＢＢリガンドのうち少なくとも１つが含有される。ある例には、可溶型４−１−ＢＢが含まれる。４−１−ＢＢ及び４−１−ＢＢリガンドならびにそれらのある阻害剤の構造は、国際特許ＷＯ第９４／２６２９０号及び米国特許第５，６７４，７０４号及び第６，３５５，７７９号で開示されている。
ある実施形態において、治療には、ＴＡＣＩ、ＢＡＦＦＲ及びＡＧＰ３のうち少なくとも１つが含有される。ある例には、これらに限定されないが、可溶型ＴＡＣＩ、ＢＡＦＦＲ、ＡＧＰ３ペプチボディ（ＡＧＰタンデム二量体ペプチド−Ｆｃ融合物）、及び抗ＢｌｙＳ抗体が含まれる。ＡＧＰ３ペプチボディは、国際特許ＷＯ第０２／９２６２０号で開示されている。ＡＧＰ３、ＴＡＣＩ及びＢＡＦＦＲに関する情報は、国際特許ＷＯ第０１／８７９７７号で利用可能である。ヒトＴＡＣＩの配列は、国際特許ＷＯ第９８／３９３６１号で開示されている。ＴＡＣＩに対するリガンド及び、ＴＡＣＩとそのリガンドとの相互作用阻害に関するスクリーニング法は、国際特許ＷＯ第００／６７０３４号で開示されている。ＡＧＰ−３、ＴＡＣＩ及びＢＡＦＦＲ、ならびにそれらの阻害剤は、例えば、国際特許ＷＯ第００／４７７４０号、国際特許ＷＯ第０１／８５７８２号、国際特許ＷＯ第０２／１５２７３号、国際特許ＷＯ第９８／３９３６１号、及びｖｏｎ Ｂｕｌｏｗ及びＢｒａｍ（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７８：１３８−１４０に記載されている。
典型的なＴＡＣＩ、ＢＡＦＦＲ及びＡＧＰ３阻害剤には、これらに限定されないが、可溶型ＴＡＣＩ、可溶型ＢＡＦＦＲ、ＡＧＰ３ペプチボディ、抗−ＢｌｙＳ抗体、ＴＡＣＩ−Ｆｃ、抗−ＢＬＩＳ抗体、ＢＣＭＡ−Ｆｃ及びＢＡＦＦＲ−Ｆｃが含まれる。
ある実施形態において、治療には、ＰＤ−１及びＰＤ−１Ｌのうち少なくとも１つが含有される。ＰＤ−１は、国際特許ＷＯ第９３／０８２０７号に記載されている。ＰＤ−１Ｌは、国際特許ＷＯ第０１／３９７２２号に記載されている。
ある実施形態において、治療には、抗−ＣＤ２０抗体が含有される。
ある実施形態において、治療には、上記で定義する炎症又は自己免疫症状（これらに限定されないが、リウマチ疾患等の急性及び慢性炎症（例えば、ライム病、若年性（リウマチ性）関節炎、変形性関節症、乾癬性関節炎、関節リウマチ及びブドウ球菌誘発（「敗血性」）関節炎）；及び多発性硬化症を含む。）の治療用の、遅効性抗リウマチ薬（ＳＡＡＲＤｓ）又は予防維持抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤＳ）、プロドラッグエステル、又は医薬適合性のそれらの塩のうち何れか１つ以上が含まれる。典型的な、ＳＡＡＲＤｓ又はＤＭＡＲＤＳ、プロドラッグエステル及び医薬適合性のその塩には、これらに限定されないが、アロクプレイドナトリウム、オーラノフィン、金チオグルコース、金チオグリカニド、アザチオプリン、ブレキナーナトリウム（ｂｒｅｑｕｉｎａｒ ｓｏｄｉｕｍ）、ブシラミン、カルシウム３−金チオ−２−プロパノール−１−スルホネート、クロランブシル、クロロキン、クロブザリット、クプロキソリン（ｃｕｐｒｏｘｏｌｉｎｅ）、シクロホスファミド、シクロスポリン、ダプソン、１５−デオキシスパガリン、ジアセレイン、グルコサミン、金塩（例えば、シクロキン金塩、金チオリンゴ酸ナトリウム、金チオ硫酸ナトリウム）、ヒドロキシクロロキン、ヒドロキシ尿素、ケブゾン、レバミソール、ロベンザリット、メリチン、６−メルカプトプリン、メトトレキセート、ミゾリビン、ミコフェノール酸モフェチル、ミオラル、窒素マスタード、Ｄ−ペニシラミン、ＳＫＮＦ８６００２及びＳＢ２０３５８０等のピリジノールイミダゾール、ラパマイシン、チオール、チモポイエチン及びビンクリスチンが含まれる。ある実施形態において、構造的に関連のある、類似の鎮痛及び抗炎症特性を有するＳＡＡＲＤｓ又はＤＭＡＲＤｓも、これらのグループに包含されることを意図する。
メトトレキセートは、抗代謝及び免疫抑制薬である。ある実施形態において、メトトレキセートは、重症であり障害を引き起こす乾癬及び関節リウマチの治療に有効性のある効果的な抗炎症薬である（Ｈｏｆｆｍｅｉｓｔｅｒ（１９８３）、Ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，３０：６９−７３及びＪａｆｆｅ（１９８８），Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ａｎｄ Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ，３１：２９９）。メトトレキセートは、Ｎ−［４−［２，４−ジアミノ−６−プテリジニル］メチルアミノ］ベンゾイル］−Ｌ−グルタミン酸であり、構造式：
Figure 2006517191
 を有する。
次の参考文献において、メトトレキセートの調製（Ｓｅｅｇｅｒら、（１９４９），Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．７１：１７５３；メトトレキセートの代謝（Ｆｒｅｅｍａｎ（１９５８），Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ，１２２：１５４及びＨｅｎｄｅｒｓｏｎら、（１９６５），Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，２５：１００８）；メトトレキセートの毒性（Ｃｏｎｄｉｔら、（１９６０），Ｃａｎｃｅｒ，１３：２２２−２４９；メトトレキセートの薬物動態モデル（Ｂｉｓｃｈｏｆｆら、（１９７０），Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，５９：１４９）；メトトレキセートの代謝及び薬物動態（Ｅｖａｎｓ（１９８０），Ａｐｐｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ．，Ｗｉｌｌｉａｍｓら（編）、ｐｐ．５１８−５４８（Ａｐｐｌ．Ｔｈｅｒ．，Ｉｎｃ．）；メトトレキセートの臨床薬理学（Ｂｅｒｔｉｎｏ（１９８１），Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．，３：３５９−３７５及びＪｏｌｉｖｅｔら、（１９８３），Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３０９：１０９４−１１０４）；及び関節リウマチにおけるメトトレキセートの臨床経験（Ｗｅｉｎｂｌａｔｔら、（１９８５），Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３１２：８１８−８２２；Ｆｕｒｓｔ（１９８５），Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．，１２（１２）：１−１４；Ｗｉｌｌｉａｍｓら、（１９８５），Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．，２８：７２１−７３０及びＳｅｉｔｚら、（１９９５），Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ，３４：６０２−６０９）について記載されている。さらに、活性薬物メトトレキセート及びメトトレキセート合成方法又はメトトレキセート合成における潜在能力のある中間体を開示する多くの特許が発行されている：米国特許第２，５１２，５７２号、第３，８９２，８０１号、第３，９８９，７０３号、第４，０５７，５４８号、第４，０６７，８６７号、第４，０７９，０５６号、第４，０８０，３２５号、第４，１３６，１０１号、第４，２２４，４４６号、第４，３０６，０６４号、第４，３７４，９８７号、第４，４２１，９１３号及び第４，７６７，８５９号。
その有用性に寄与すると思われるメトトレキセートの様々な活性が発表されてきた（Ｓｅｇａｌら、（１９９０）、Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ａｎｄ Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ，２０：１９０−１９８）。メトトレキセートに対する次の作用機構が主張されている：葉酸依存性経路及びタンパク質代謝の阻害（Ｍｏｒｇａｎら（１９８７）、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ａｎｄ Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ，３０：１３４８−１３５６）；関節炎発症関節への好中球移動の阻害（Ｖａｎ ｄｅ Ｋｅｒｋｈｏｆら、（１９８５），Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ，１１３：２５１−２５５；Ｔｅｒｎｏｗｉｔｚら、（１９８７），Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ，８９：１９２−１９６及びＳｐｅｒｌｉｎｇ（１９９２），Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ａｎｄ Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ，３５：３７６−３８４）；ＩＬ−６阻害活性（Ｓｅｇａｌ（１９９１），Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ａｎｄ Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ，３４（２）：１４６−１５２）及び関節炎に関与する細胞における局所特異的抗増殖効果（Ｒｏｄｅｎｈｕｉｓら、（１９８７），Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ａｎｄ Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ，３０：３６９−３７４）。メトトレキセートは、インターロイキン１ベータ／インターロイキン−１受容体経路を阻害することが示されている（Ｂｒｏｄｙら、（１９９３），Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３１（１０）：６６７−６７４）；しかし、ある患者においては、短期間の間、メトトレキセートがＩＬ−１の増殖効果を阻害し、単球ＩＬ−１産生を低下させるにもかかわらず、この効果は持続せず、メトトレキセートの長期的効果を説明するものではないと思われる（Ｂａｒｒｅｒａら、（１９９６），Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ａｎｄ Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ，２５（４）：２３４−２５３）。
ある実施形態において、これらに限定されないが、ＩＬ−１阻害剤、ＴＮＦ阻害剤、ＩＦＮ−γ阻害剤、ＩＬ−１８阻害剤、Ｂ７／ＣＤ２８経路の阻害剤、ＩＣＯＳ／Ｂ７ＲＰ１経路の阻害剤、ＣＤ４０経路の阻害剤、ＣＤ３０経路の阻害剤、ＣＤ２７経路の阻害剤、ＯＸ４０経路の阻害剤、４−１−ＢＢ経路の阻害剤、ＴＡＣＩ ，ＢＡＦＦＲ、ＡＧＰ３経路の阻害剤、ＰＤ−１経路の阻害剤、ＣＤ２０経路の阻害剤及び炎症又は自己免疫症状を治療するために使用し得る他の化合物を含む、１つ又は複数の化合物と組み合わせてメトトレキセートを投与する。
ある実施形態において、メトトレキセートを、経口、腹腔内、皮下又は静脈内投与する。例えば、ある実施形態において、メトトレキセートと、ＣＴＬＡ４−Ｆｃ又は他のＢ７／ＣＤ２８経路阻害剤を組み合わせてヒト患者を治療しうる。ある実施形態において、患者が、週に３回、１週間の総用量が５〜５０ｍｇ／週となるように、メトトレキセートの錠剤又はカプセルを摂取する。あるそのような実施形態において、１日の用量が０．１ｍｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇの間になるように、ＣＴＬＡ４−Ｆｃを患者に静脈内投与する。ある実施形態において、有害反応が現れた患者に対して、特定の使用化合物の開始用量を減少させる。ある実施形態において、例えば、様々な処方、経路、投与計画又は、、これらに限定されないが個々の患者の薬物耐性、その効果及び毒性を含む、当業者にとって公知の他の不定要素に依存して、併用する１つ又は複数の薬物を変更することができる。
ある実施形態において、週あたりのメトトレキセートの開始用量が５ｍｇから７．５ｍｇの間（経口又は筋肉内）、及びＣＴＬＡ４−Ｆｃの１日あたりの用量が０．１ｍｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇの間（静脈内）になるようにして、患者を治療する。ある実施形態において、メトトレキセートの投与量を２〜３週間ごとに５ｍｇ増量させる。ある実施形態において、患者の状態が改善する点において最大投与量レベルを決定するが、それは通常、１週間あたりのメトトレキセートが約２５ｍｇ未満であり、ある実施形態においては、１週間あたりのメトトレキセートが５〜２５ｍｇである。ある実施形態において、５日間の期間終了時に、患者の状態を評価する。ある実施形態において、その評価項目には、身体診察及び広範囲に及ぶ臨床検査が含まれる。ある実施形態において、そのテストには、毒性評価が含まれる。ある実施形態において、メトトレキセートの場合のさらなる臨床検査モニタリングには全血球計算が含まれるが、最初の３ヶ月間は２週間ごとに行い、その後は毎月行う。ある実施形態において、さらなる予防措置には、血清アルブミン、アラニンアミノトランスフェラーゼ、ビリルビン、クレアチニン及び血中尿素窒素レベルの月に１度の測定が含まれる。ある実施形態において、月に１度、検尿を行う。
ある実施形態において、炎症及び／又は自己免疫疾患の治療方法を提供する。ある実施形態において、医薬組成物を提供する。
ある実施形態において、サイトカイン阻害剤と一緒に副刺激因子を使用し得る。関心のある、ある典型的なサイトカイン阻害剤には、これらに限定されないが、ＩＬ−１阻害剤及びＴＮＦ−α阻害剤が含まれる。ある実施形態において、ＩＬ−１介在疾患を治療するための方法を提供するが、それには、治療上有効量のＩＬ−１阻害剤及びＴ細胞又はＢ細胞活性化の阻害剤の投与が含まれる。ある実施形態において、ＴＮＦ−α介在疾患を治療するための方法を提供するが、それには、治療上有効量のＴＮＦ−α阻害剤及びＴ細胞又はＢ細胞活性化の阻害剤の投与が含まれる。ある実施形態において、炎症又は自己免疫症状を治療するための方法を提供するが、それには、治療上有効量のＩＬ−１阻害剤、治療上有効量のＴＮＦ−α阻害剤及びＴ細胞又はＢ細胞活性化の阻害剤の投与が含まれる。
関節リウマチ（ＲＡ）は、炎症過程のいくつかの成分が関与する原因不明の疾患である。臨床及び実験的研究により、免疫細胞（Ｔ及びＢ）が炎症性サイトカインとともに、生体システムのバランスを狂わせ、関節で局所的炎症を引き起こすことが明らかになっている。ＩＬ−１の阻害（ＩＬ−１Ｒａ又はキネレットＴＭによる）又はＴＮＦ−αの阻害（可溶性ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２又は抗ＴＮＦ−α抗体による）は、関節炎の実験的モデル及びＲＡ患者において有益であることが示されている。臨床及び実験的研究により、Ｔ細胞及びＢ細胞が罹患組織に存在することも明らかになっている。ＣＴＬＡ−４−Ｉｇ等のＴ細胞及びＢ細胞の阻害剤は、関節炎の誘発時から使用した場合、実験的動物モデルにおいて有効性を示した。炎症性関節炎の臨床所見が現れてから治療を開始した場合には、ＣＴＬＡ−４−Ｉｇが実験的動物モデル（コラーゲン誘発性関節炎）において有効ではないことが研究から明らかになっている。実験的関節炎モデルにおける、抗炎症性サイトカイン薬物療法を用いてＴ細胞又はＢ細胞機能を調節するという併用治療の役割については、実施例１から３で考察する。関節リウマチと同様、Ｔ細胞、Ｂ細胞及び炎症性サイトカインは、マウスのコラーゲン誘発性関節炎に関与する。
本発明のある実施形態において、次の何れか１つ又は複数の症状を治療し得る。細菌、真菌、原生動物及びウイルス感染等の感染、特にＨＩＶ−１又はＨＩＶ−２；下痢；乾癬；炎症；アレルギー；アトピー性皮膚炎；喘息、アレルギー性鼻炎、過敏性肺疾患、過敏性肺炎、好酸球性肺炎（例えば、レフラー症候群、慢性好酸球性肺炎、間質性肺炎（ＬＩＤ）（例えば、特発性肺繊維症、又は関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、強直性脊椎炎、全身性硬化症、シェーグレン症候群、多発性筋炎又は皮膚筋炎関連ＩＬＤ等）の呼吸器のアレルギー疾患；全身性アナフィラキシー又は過敏性反応；薬物アレルギー；昆虫刺傷アレルギー；クローン病及び潰瘍性大腸炎等の炎症性腸疾患；脊椎関節症；強皮症；乾癬；皮膚炎、湿疹、アトピー性皮膚炎、アレルギー性接触性皮膚炎、蕁麻疹、脈管炎（例えば、壊死性の皮膚及び過敏性脈管炎）、好酸球性筋炎及び好酸球性筋膜炎等の炎症性皮膚疾；関節リウマチ、乾癬性関節炎、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、重症筋無力症、若年性糖尿病、糸球体腎炎、自己免疫性甲状腺炎及びベーチェット病等の自己免疫疾患；同種移植片拒絶又は移植片対宿主拒絶反応を含む移植片拒絶；皮膚又は器官への白血球浸潤を伴う癌；再灌流障害；アテローム性動脈硬化症；ある血液悪性腫瘍；敗血性ショック及び内毒素性ショックを含むショック。
ある実施形態において、遺伝子治療を行い得る。ある実施形態において、「遺伝子治療ＤＭＡ構築物」を形成するために、標的分子の特異的結合パートナーをコードする遺伝子（ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ及び／又は合成ＤＮＡの何れか）、又はそれらの断片、変異体、若しくは誘導体を、構成的又は機能的なプロモーターと作動可能に連結し得る。ある実施形態において、その構築物が挿入される細胞又は組織タイプにおいて活性があるならば、プロモーターは、その特異的結合パートナーをコードする遺伝子と相同的又は非相同的であり得る。遺伝子治療ＤＮＡ構築物の他の成分には、これらに限定されないが、部位特異的組み込み用に設計されたＤＮＡ分子（例えば、相同組み換えに有用な、内在性の隣接配列）、組織特異的プロモーター、エンハンサー又はサイレンサー、親細胞を超える選択的長所を与えることが可能なＤＮＡ分子、形質転換された細胞を同定するための標識として有用なＤＮＡ分子、ネガティブ選択系、細胞特異的結合化合物（例えば、細胞ターゲティング用として）、細胞特異的内在化因子及び、ベクターによる発現を促進するための転写因子ならびにベクター作製を可能にする因子が含まれる。
ある実施形態において、患者の細胞に、（エクスビボ又はインビボ何れかで）遺伝子治療ＤＮＡ構築物を導入し得る。ある実施形態において、遺伝子治療ＤＮＡ構築物を、ウイルスベクターを介して導入し得る。遺伝子治療ＤＮＡ構築物の輸送に使用する典型的なウイルスベクターには、これらに限定されないが、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、単純ヘルペスウイルス、レンチウイルス、パピローマウイルス及びレトロウイルスベクターが含まれる。ある実施形態において、レトロウイルスベクター等、これらのベクターのあるものは遺伝子治療ＤＮＡ構築物を患者の細胞の染色体ＤＮＡに輸送し、遺伝子治療ＤＮＡ構築物を染色体ＤＮＡに組み込むことが可能である。ある実施形態において、他のベクターは、エピソームとして機能し、遺伝子治療ＤＮＡ構築物は細胞質中に残留することになる。遺伝子治療ベクターの使用について、例えば、米国特許第５，６７２，３４４，号、第５，３９９．３４６号に記載されている。
ウイルスベクターを用いずに遺伝子治療ＤＮＡ構築物を患者の細胞に輸送する典型的な方法には、これらに限定されないが、リポソーム介在輸送、裸のＤＮＡの直接注入、受容体介在輸送（リガンド−ＤＮＡ複合体）、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿及び微小粒子ボンバードメント（例えば、遺伝子銃）が含まれる。米国特許第４，９７０，１５４号、国際特許ＷＯ第９６／４０９５８号、米国特許第５，６７９，５５９号、第５，６７６，９５４号、第５，５９３，８７５号を参照のこと。
ある実施形態において、１つ又は複数のエンハンサーエレメントをプロモーターに挿入することにより、遺伝子治療を介して、細胞における特異的結合パートナーの発現レベルを上昇させ得る。ある実施形態において、その遺伝子を活性化したい組織に基づいて、使用するエンハンサーエレメントを選択することができ、その組織においてプロモーター活性化をもたらすことが知られているエンハンサーエレメントを選択することが可能であろう。ある実施形態において、Ｔ細胞において発現されるべき特異的結合パートナーの発現を上昇させるために、ｌｃｋプロモーターエンハンサーエレメントを使用し得る。ある実施形態において、標準的なクローニング技術を用いて、付加すべき転写エレメントの機能部分を、特異的結合パートナーに対するプロモーターを含有するＤＮＡ断片に挿入し得る。この構築物は、「相同的組み換え構築物」として知られているが、これをエクスビボ又はインビボの何れかで、所望する細胞に導入することができる。
ある実施形態において、内在性プロモーターのヌクレオチド配列を調節することにより、標的分子の発現を低下させるために遺伝子治療を使用することができる。ある実施形態において、相同的組み換え法を介して調節を行い得る。ある実施形態において、標的分子をコードする遺伝子のプロモーターの全て、又は一部を含むＤＮＡ分子を処理して、転写を制御するプロモーターの一部を除去及び／又は置換し得る。ある実施形態において、標準的分子生物学的技術を用いて、ＴＡＴＡボックス及び／又はプロモーターの転写アクチベーターの結合部位を欠失させ得る。そのような欠失により、プロモーター活性を阻害することができ、それによって、対応する標的分子遺伝子の転写が抑制される。ある実施形態において、ＴＡＴＡボックス又はアクチベーター結合部位が活性を低下させるように、又は完全に不活性になるように、ＴＡＴＡボックス又は転写アクチベーター結合部位ヌクレオチドの１つ又は複数が１つ又は複数のヌクレオチドの置換、欠失及び／又は挿入により突然変異させられているプロモーターの全て又は当該部分を含有する、ＤＮＡ構築物を作製することにより、プロモーターにおけＴＡＴＡボックス又は、転写アクチベーター結合部位の欠失を遂行し得る。ある実施形態において、この構築物には、改変されたプロモーターセグメントの天然の（内因性）５’及び３’隣接領域に対応する少なくとも約５００塩基のＤＮＡが含まれ得、適切な細胞に、（エクスビボ又はインビボの何れかで）直接又は上述のようにウイルスベクターを介して導入し得る。ある実施形態において、細胞のゲノムＤＮＡへと相同的組み換えを介して構築物を組み込み得るが、その際、プロモーター構築物における５’及び３’隣接ＤＮＡ配列を、ハイブリダイゼーションを介した内在性染色体ＤＮＡへの改変プロモーター領域の組み込み促進のために使用することができる。
ある実施形態において、１つ又は複数の標的分子を阻害することが望ましい場合、他の遺伝子治療法を使用することもできる。ある実施形態において、選択した標的分子遺伝子の少なくとも一部と相補的な配列を有するアンチセンスＤＮＡ又はＲＮＡ分子を細胞に導入し得る。ある実施形態において、このような各アンチセンス分子は、各選択標的分子遺伝子の開始部位（５’末端）と相補的であろう。アンチセンス分子が、標的分子をコードする、対応するｍＲＮＡとハイブリダイズすると、このｍＲＮＡの翻訳が妨害される。
ある実施形態において、１つ又は複数の標的分子のドミナントネガティブ阻害剤を生成させるために遺伝子治療を使用し得る。ある実施形態において、各選択標的分子の突然変異全長又は短縮型ポリペプチドをコードするＤＮＡを調製し、上述のウイルス又は非ウイルス法により、患者の細胞に導入することができる。ある実施形態において、その生物学的役割において内在性の標的分子と競合するように、各突然変異を設計し得る。
ある実施形態において、本発明は、医薬適合性の希釈剤、担体、可溶化剤、乳化剤、保存剤及び／又はアジュバントと一緒に、治療上有効量のある特定分子を含有する医薬組成物を提供する。
ある実施形態において、本発明は、医薬適合性の希釈剤、担体、可溶化剤、乳化剤、保存剤及び／又はアジュバントと一緒に、ある特定分子を含有する医薬組成物を提供する。
ある実施形態において、許容可能な処方物質は、用いる投与量及び濃度の点で、服用者に対して非毒性であることが好ましい。
ある実施形態において、医薬組成物は、例えば、ｐＨ、浸透圧、粘性、透明度、色、当張性、臭気、無菌性、安定性、溶解速度又は放出速度、組成物の吸収又は浸透性を変更、維持又は保存するための処方物質を含有しうる。ある実施形態において、適切な処方物質には、これらに限定されないが、アミノ酸（グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリジン等）；抗菌薬；抗酸化剤（アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウム又は亜硫酸水素ナトリウム等）；緩衝液（ホウ酸、重炭酸、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、クエン酸、リン酸又は他の有機酸等）；容積補充剤（マンニトール又はグリシン等）；キレート剤（エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）等）；錯化剤（カフェイン、ポリビニルピロリドン、β−シクロデキストリン又はヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン等）；充填剤；単糖類；２糖類；及び他の炭水化物（グルコース、マンノース又はデキストリン等）；タンパク質（血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン等）；着色剤、香味剤及び希釈剤；乳化剤；親水性ポリマー（ポリビニルピロリドン）；低分子量ポリペプチド；塩形成対イオン（ナトリウム等）；保存剤（塩化ベンズアルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェンチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸又は過酸化水素等）；溶剤（グリセリン、プロピレングリコール又はポリエチレングリコール等）；糖アルコール（マンニトール又はソルビトール等）；懸濁剤；界面活性剤又は湿潤剤（プルロニック、ＰＥＧ、ソルビタンエステル、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０等のポリソルベート、トライトン、トロメタミン、レシチン、コレステロール、チロキサポール等）；安定促進剤（スクロース又はソルビトール等）；等張化促進剤（ハロゲン化アルキル金属等、好ましくは、塩化ナトリウム又は塩化カリウム、マンニトールソルビトール）；送達媒体；希釈剤；補形剤及び／又は医薬アジュバント（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８版，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，編、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ（１９９０）が含まれる。
ある実施形態において、１つ又は複数の分子を、本分野で公知の半減期を延長させるビヒクルと連結させる。そのようなビヒクルには、これらに限定されないが、Ｆｃドメイン、ポリエチレングリコール及びデキストランが含まれる。そのようなビヒクルについて、例えば、公開ＰＣＴ出願ＷＯ第００／２４７８２号（あらゆる目的のために、参照により本明細書に組み込む。）に記載されている。
ある実施形態において、例えば、意図する投与経路、送達形式及び所望する用量に依存して、最適の医薬組成物が当業者により決定されるであろう。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，上述、を参照のこと。ある実施形態において、そのような組成物は、本発明抗体の物理的状態、安定性、インビボ放出速度及びインビボのクリアランス速度に影響を与え得る。
ある実施形態において、医薬組成物中の主要なビヒクル又は担体は、事実上、水性又は非水性の何れかであり得る。例えば、ある実施形態において、適切なビヒクル又は担体は、注射用の水、生理食塩水又は人工脳脊髄液であり得、非経口投与用組成物によく使用される他の物質が追加されることもある。ある実施形態において、さらなる典型的なビヒクルとして、中性の緩衝食塩水又は血清アルブミンを混合した食塩水が挙げられる。ある実施形態において、医薬組成物には、ｐＨが約７．０〜８．５のトリス緩衝液又はｐＨが約４．０〜５．５の酢酸緩衝液が含有されるが、これらには、さらにソルビトール又は適切なその代替物が含まれる。ある実施形態において、凍結乾燥ケーキ又は水溶液の形で、所望する精製度の選択組成物を任意の処方剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，上述）と混合することにより、特定の分子を含有する組成物を保存用に調製し得る。さらに、ある実施形態において、スクロース等の適切な補形剤を用いて凍結乾燥物として、ある特定の分子を含有する組成物を処方し得る。
ある実施形態において、非経口送達のために、本発明の医薬組成物を選択することができる。ある実施形態において、吸入又は、経口等の消化管を介した送達のために、本組成物を選択し得る。このような医薬適合性の組成物の調製は、当業者の技術の範囲内である。
ある実施形態において、処方成分は、投与部位に対して許容できる濃度で存在する。ある実施形態において、組成物を生理的ｐＨ、又はそれよりわずかに低いｐＨに維持するために緩衝液を使用するが、その典型的なｐＨ範囲は、約５から約８である。
ある実施形態において、非経口投与を考える場合、治療用組成物は、発熱性物質フリーの医薬適合性のビヒクル中に所望するある特定の分子を含有する非経口適合性の水溶液の形式であり得る。ある実施形態において、非経口注射用のビヒクルは、適切に保存された滅菌、等張溶液としてある特定分子が処方されている、滅菌蒸留水である。ある実施形態において、調製品には、蓄積注射を介して送達され得る薬物の制御放出又は持続放出を可能にする、注射用ミクロスフィア、生物浸食可能な（ｂｉｏ−ｅｒｏｄｉｂｌｅ）粒子、高分子化合物（ポリ乳酸又はポリグリコール酸等）、ビーズ又はリポソーム等の薬剤を用いた所望する分子の処方が含まれ得る。ある実施形態において、ヒアルロン酸も使用し得るが、これは、循環系における持続時間を向上させる効果を持ち得る。ある実施形態において、所望する分子を導入するために、埋め込み可能な薬物送達装置を使用し得る。
ある実施形態において、吸入用に医薬組成物を処方し得る。ある実施形態において、吸入用のドライパウダーとしてある特定の分子を処方し得る。ある実施形態において、エアロゾル送達用に、噴射剤とともに特定の分子を含有する吸入溶液を処方し得る。ある実施形態において、溶液を霧状にし得る。肺への投与について、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ９４／００１８７５号（化学的修飾を行ったタンパク質の肺への送達について記載している。）でさらに記載されている。
ある実施形態において、処方物を経口投与し得ると考えられる。ある実施形態において、錠剤及びカプセル等の固形の剤型の調製に通例使用される担体有り又は無しで、この様式で投与するある特定の分子を処方し得る。ある実施形態において、カプセルは、生体内利用を最大にし、全身循環前の分解（ｐｒｅ−ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）を最低限に抑える場合、胃腸管で処方物の有効成分を放出するように設計され得る。ある実施形態において、ある特定分子の吸収を促進させるために、最低１つのさらなる薬剤を含有させることができる。ある実施形態において、希釈剤、香味剤、低融点ワックス、植物油、潤滑剤、懸濁剤、錠剤崩壊剤及び結合剤も使用し得る。
ある実施形態において、医薬組成物には、錠剤の製造に適した非毒性補形剤と混合して、ある特定分子が有効量含まれ得る。ある実施形態において、錠剤を滅菌水又は別の適切なビヒクルに溶解させることにより、最小投薬単位型で溶液を調製し得る。ある実施形態において、適切な補形剤には、これらに限定されないが、不活性希釈剤（炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム又は重炭酸ナトリウム等）、ラクトース又はリン酸カルシウム；又は結合剤（デンプン、ゼラチン又はアカシア等）；又は潤滑剤（ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸又はタルク等）が含まれる。
持続又は調節送達処方にてある特定分子を含有する処方物を含む、さらなる医薬組成物が当業者にとって明らかであろう。ある実施形態において、リポソーム担体、生体浸食可能な（ｂｉｏ−ｅｒｏｄｉｂｌｅ）微小粒子又は多孔性ビーズ及び蓄積注射等、様々な他の持続又は調節送達法に対する処方技術も当業者にとって公知である。例えば、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ９３／００８２９号（医薬組成物送達のための、多孔性高分子微小粒子の制御放出が記載されている。）を参照のこと。ある実施形態において、徐放調製物には、例えばフィルム等、成型品の形の半透性ポリマーマトリクス又はマイクロカプセルが含まれ得る。徐放マトリクスには、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号及び欧州特許ＥＰ第０５８，４８１号）、Ｌ−グルタミン酸及びγエチル−Ｌ−グルタミン酸の共重合体（Ｓｉｄｍａｎら、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，２２：５４７−５５６（１９８３））、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）（Ｌａｎｇｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．，１５：１６７−２７７（１９８１）及びＬａｎｇｅｒ，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．，１２：９８−１０５（１９８２））、エチレン酢酸ビニル（Ｌａｎｇｅｒら、上述）又はポリ−Ｄ−３−ヒドロキシ酪酸（欧州特許ＥＰ第１３３，９８８号）が含まれる。ある実施形態において、徐放組成物には、リポソームも含まれ得るが、これは、本分野で公知のいくつかの方法のうちの何れかで調製することができる。Ｅｐｐｓｔｅｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：３６８８−３６９２（１９８５）；欧州特許ＥＰ第０３６，６７６号；欧州特許ＥＰ第０８８，０４６号及び欧州特許ＥＰ第１４３，９４９号を参照のこと。
インビボ投与用に使用する医薬組成物は通常、滅菌状態である。ある実施形態において、濾過滅菌膜を用いてこれを行い得る。ある実施形態において、組成物が凍結乾燥されている場合、凍結乾燥及び再構成の前又は後の何れかでこの方法を用いた滅菌を行い得る。ある実施形態において、凍結乾燥させた状態、又は溶液状態で非経口投与用組成物を保存し得る。ある実施形態において、非経口組成物は一般に、滅菌アクセスポートを備える容器、例えば静脈注射用溶液バッグ又は皮下注射針を通すことができるストッパーを備えるバイアに入れられている。
ある実施形態において、一旦医薬組成物を処方した後、溶液、懸濁液、ジェル、乳液、固体又は乾燥若しくは凍結乾燥粉末として滅菌バイアルにそれを保存し得る。ある実施形態において、すぐに使用できる形又は投与前に再構成する形（例えば凍結乾燥）の何れかで、このような処方物を保存し得る。
ある実施形態において、本発明は、単回投与の投与単位を調製するためのキットに向けられる。ある実施形態において、本キットは、それぞれ、乾燥タンパク質が入った第一の容器と水性処方物の入った第二の容器との両方を含有する。本発明のある実施形態において、１つ又は複数の区画がある、プレフィルドシリンジ（例えば、液体シリンジ及び分散シリンジ（ｌｙｏｓｙｒｉｎｇｅ））を含有するキットが含まれる。
ある実施形態において、治療のために用いられるある特定分子を含有する医薬組成物の有効量は、例えば、治療状況及び目的に依存することになろう。従って、当業者は、ある実施形態に従い、用量を決定する要因の一部として送達させる分子、ある特定分子を使用している徴候、投与経路及び、患者の体格（体重、体表面又は器官サイズ）及び／又は状態（年齢及び全般的な健康状態）に依存して、治療に対する適切な用量レベルが様々となることを理解するであろう。ある実施形態において、臨床医学者は、最大の治療効果を得るために、適切になるように用量を決定し、投与経路を変更し得る。ある実施形態において、一般的な用量は、約０．１μｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇ以上の範囲で有り得るが、これは、上述の要因に依存する。ある実施形態において、用量は、０．１μｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇ；又は１μｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇ；又は５μｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇtの範囲であり得る。
ある実施形態において、投与頻度は、使用する処方におけるある特定分子の薬物動態パラメーターを考慮に入れる。ある実施形態において、臨床医学者は、投与量が所望する効果を達成する量になるまで、組成物を投与するであろう。従って、ある実施形態において、単回投与として、又は、長期にわたる２回以上の投与（所望する分子を同量含有していても良いし、同量含有しなくてもよい。）として、又は、埋め込み装置もしくカテーテルを介した持続注入として、本組成物を投与し得る。当業者により、通常どおりに、適切な用量がさらに改善されるが、これは当業者により通常行われる職務の範囲内である。ある実施形態において、適切な用量反応データを使用することにより、適切な用量を確定し得る。
ある実施形態において、医薬組成物の投与経路は、例えば、経口、静脈内注射、腹腔内注射、脳内投与（実質内投与）、脳室内注入、筋肉内注射、眼内注射、動脈内投与、門脈内投与又は病巣内投与等；徐放システムによる投与、又は埋め込み装置による投与等、既知の方法に従う。ある実施形態において、蓄積注射又は輸液による連続投与により、又は埋め込み装置により、組成物を投与し得る。
ある実施形態において、所望する分子を吸収又は封入した膜、スポンジ又は他の適切な物質の埋め込みを介して、局所的に本組成物を投与し得る。ある実施形態において、埋め込み装置を使用する場合、何れかの適切な組織又は器官にその装置を埋め込むことができ、拡散、徐放ボーラス又は連続投与を介して、その所望する分子の送達が行われ得る。
ある実施形態において、エクスビボ様式である特定分子を含有する医薬組成物を使用することが好ましいものであり得る。このような例において、患者から除去した細胞、組織及び／又は器官を、ある特定分子を含有する医薬組成物に曝露し、その後、その細胞、組織及び／又は器官を患者の体に移植し返す。
ある実施形態において、本ポリペプチドを発現させ分泌させるために、本明細書中に記載したような方法を用いて遺伝子工学的に操作したある細胞を移植することにより、ある特定分子を送達することができる。ある実施形態において、そのような細胞は、動物又はヒトの細胞であり得、自系、異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ又はｘｅｎｏｇｅｎｅｉｃ）であり得る。ある実施形態において、その細胞は不死化したものであり得る。ある実施形態において、免疫反応が起こる可能性を減少させるために、周囲の組織への浸潤を防ぐように細胞を封入し得る。ある実施形態において、封入物質は、通常、タンパク質産物は放出できるが、患者の免疫系による、又は周囲組織からの他の有害因子による崩壊を防ぐ、生体適合性の半透性高分子封入物又は膜である。
（実施例）
次の実施例において、マウスＣＴＬＡ４−Ｆｃは、マウスＣＴＬＡ４（配列番号１９）由来である。次の実施例のために、フロイドの完全アジュバント（ＣＦＡ）をＤｉｆｃｏ（Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）より入手した。次の実施例のために、免疫付与グレードのブタタイプＩＩコラーゲンをＧｒｉｆｆｉｔｈ’ｓ ｌａｂ（ユタ大学、Ｓａｌｔ Ｌａｋｅ Ｃｉｔｙ）より購入した。
関節炎発症性Ｂ１０．ＲＩＩＩマウスにおけるＫＩＮ２及びＣＴＬＡ４−Ｆｃを用いた併用療法
本研究で用いるマウスＣＴＬＡ４−Ｆｃ及びＫＩＮ２（配列番号２）は、Ａｍｇｅｎで生成された。
Ａ．ＫＩＮ２の典型的調製
米国特許第６，２９４，１７０Ｂ１号（‘１７０特許）において全般的に記載されているようにしてＫＩＮ２を調製し得る。‘１７０で論じているＦｃ−ＩＬ−１ｒａ融合タンパク質は、本明細書中で考察するＫＩＮ２と同じものである。
‘１７０特許における典型的な組み換えヒトＩＬ−１ｒａ
‘１７０特許において、他の発現ベクターから酵素によって切断し、発現ベクターｐＡＭＧ２１にライゲーションしたＩＬ−１ｒａ遺伝子断片について論じている（欧州特許出願第９６３０９３６３．８号）
ＩＬ−１ｒａのアミノ酸配列は、以下のとおりである。
Figure 2006517191
‘１７０特許において、得られたプラスミド、ｐＡＭＧ２１−ＩＬ−１ｒａを精製し、ＩＬ−１ｒａ遺伝子の配列をシークエンシングにより確認したことについて論じている。‘１７０特許において、そのプラスミド（ｐＡＭＧ２１−ＩＬ−１ｒａ）（欧州特許出願第９６３０９３６３．８号）を後にｒｈｕＩＬ−１ｒａ−Ｆｃタンパク質のクローニングに使用したことについて論じている。‘１７０特許において、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域をヒトＩＬ−１ｒａのＮ末端に融合させて、ｒｈｕＩＬ−１ｒａ融合タンパク質を構築したことについて述べている。‘１７０特許において融合のために選択したＦｃ配列を下記に示す。その機能的Ｆｃ領域のＮ末端に８個の余分なアミノ酸残基、ＡＡＡＥＰＫＳＳが存在する。
Ｆｃ３Ａ Ｃ８Ｓのアミノ酸配列：
Figure 2006517191
下線を付した配列がＦｃ領域に付加された。
‘１７０特許におけるＥ．コリホスト株の典型的説明
‘１７０特許において、Ｅ．コリ Ｗ１４８５（Ｋ１２株）の派生物を、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ（Ｙａｌｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎｅｗ Ｈａｅｖｅｎ ＣＴ（ＣＧＳＣ株 ＃６１５９）から入手したことについて論じている。その株は、原栄養性であり、ラムダプロファージを含有せず、性因子Ｆを回復している。
‘１７０特許において、発酵実験を行った際に生じたファージ発生から単離した４種類の様々なファージに対する自然耐性に関して選択することにより、ＣＧＳＣ株 ＃６１５９を改変したことについて述べている。‘１７０特許において、４種類のファージのうち２種類に対して耐性を同時に与えた第１回目のファージ耐性突然変異の単離を行ったことについて述べている。‘１７０特許において、ファージ耐性のある生存株を選択するために、ファージのうち１つの試料を希釈し、感受性株の培養物と混合し、液体培養として３７℃にて１６〜２４時間インキュベーションしたことが述べられている。‘１７０特許において、シングルコロニーから候補を単離し、ファージ耐性及び最小培地中での増殖能を確認するために試験を行ったことが述べられている。‘１７０特許において、その株がファージＴ５及びΦ８０に対する耐性を同時に獲得した点で、第一回目の選択で得た突然変異体がｔｏｎＡ突然変異体のある一定の性質を示すことが述べられている。
‘１７０特許において、１９８４年５月１５日に、第３のファージに対する耐性を与える第２のファージ耐性選択を行ったことについて述べている。‘１７０特許において、プレート法を用いて自然発生ファージ突然変異が得られたことが述べられている。感受性のある細菌の菌叢にファージ懸濁液をスポットし、３７℃にて２日間インキュベーションした。溶菌ゾーンにおいて、コロニーから、生き残ったものを単離した。それらを最小培地での増殖、プラスミド形質転換の正常効率、複合培地における正常増殖速度及び産物合成の正常レベルについて試験した。‘１７０特許において、Ｅ．コリのｂｔｕ遺伝子座にこのファージに対する耐性を与える突然変異をマッピングしたことが述べられている。
‘１７０特許において、上述のプレート法を用いて行った第３回目のファージ耐性選択についても論じられている。‘１７０特許において、精製した突然変異体が、上記で概説した基準（最小培地及び複合培地での増殖、形質転換効率及び産物合成レベル）により、正常であると思われることについて述べられている。
‘１７０特許におけるＦｃ−ｒｈｕＩＬ−１ｒａの典型的な調製
‘１７０特許において、Ｆｃ領域のユニークなＳａｃＩＩ部位及びＩｌ−１ｒａ遺伝子のユニークなＳａｃＩ部位をクローニングに使用したことが述べられている。標準的なＰＣＲ技術を用いて、ＳａｃＩＩ−ＳａｃＩ断片を合成した。ＰＣＲ反応用テンプレートは、標的遺伝子を含有するプラスミド調製物（ｐＡＭＧ２１−ＯＰＧ−Ｆｃ及びｐＡＭＧ２１−ＩＬ−１ｒａ）であった。‘１７０特許において、Ｆｃ遺伝子のＣ末端部分をＩＬ−１ｒａ遺伝子のＮ末端と結合するように、重複するオリゴを設計したことについて述べられている。‘１７０特許において、この工程により、適切なＰＣＲ反応を行った後、正しい読み枠で２つの遺伝子を融合させることができたことが述べられている。最初に、各遺伝子に対する１つの「融合」オリゴ、Ｆｃに対してオリゴ＃１５６１−５７、ＩＬ−１ｒａに対して＃１５６１−５６、を、ＦｃのＳａｃＩＩ（＃１５６１−５５）、又はＩＬ−１ｒａのＳａｃＩ部位（＃１５６１−５８）に対するプライマー５’とともに、ＰＣＲ反応に導入した。この第一のＰＣＲ反応終了時に、２つの別個の産物を得たが、個々の遺伝子はそれぞれ、融合部位を有していた。第２のＰＣＲにおいて、２つの外側のプライマー（＃１５６１−５５及び＃１５６１−５８）を用いて第一の２つのＰＣＲ産物を連結させ、全長融合ＤＮＡ配列を調製した。
‘１７０特許において、最終ＰＣＲ遺伝子産物を制限エンドヌクレアーゼ、ＳａｃＩＩ及びＳａｃＩで消化し、ｐＡＭＧ２１−Ｆｃ−ＯＰＧから分離した部分的なｐＡＭＧ２１配列を伴うＣｌａＩ−ＳａｃＩＩ Ｆｃ断片、及び、ｐＡＭＧ２１−ＩＬ−１ｒａから分離した部分的なＩＬ−１ｒａ配列を伴うベクターＣｌａＩ−ＳａｃＩ断片を用いて、３者を連結するライゲーションを行ったことについて述べている。使用説明書を利用して、エレクトロポレーションにより、ライゲーション混合液をＥ．コリホストに形質転換した。‘１７０特許において、組み換えＦｃ−ｒｈｕＩＬ−１ｒａの産生能及び正しいヌクレオチド配列を有する遺伝子融合物保持能についてクローンをスクリーニングしたことが述べられている。Ｆｃ領域及びｒｈｕＩＬ−１ｒａの連結点にメチオニン残基が付加されたが、これによりこの融合タンパク質の活性は妨害されなかった。
‘１７０特許において、このＦｃ−ｒｈｕＩＬ−１ｒａの構築に使用した次のプライマーについて述べられている。
Figure 2006517191
‘１７０特許のＥ．コリにおけるＦｃ−ＩＬ−１ｒａ融合タンパク質の典型的な発現
‘１７０特許において、Ｆｃ−ＩＬ−１ｒａ融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列をｐＡＭＧ２１のｌｕｘＰＲプロモーターの制御下に置いたことが述べられている（米国特許第５，１６９，３１８号（ｌｕｘ発現系について記載。）。
‘１７０特許においてｐＡＭＧ２１−Ｆｃ−ＩＬ−１ｒａ及びＥ．コリホストの培養は、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＴｅｒｒｉｆｉｃ ｂｒｏｔｈ培地（Ｔａｒｔｏｆ及びＨｏｂｂｓ（１９８７），Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓ．Ｌａｂ．Ｆｏｃｕｓ，９：１２）で行い、誘導前に、３０℃にてＯＤ６００が約０．８になるまでインキュベーションしたことが述べられている。合成オートインデューサー、Ｎ−（３−オキソヘキサノイル）−ＤＬ−ホモセリンラクトンを最終濃度３０ｎｇ／ｍｌになるように培養液へ添加し、３７℃にてさらに６時間インキュベーションを行った後、ベクターｐＡＭＧ２１のｌｕｘＰＲプロモーターからの組み換え遺伝子産物発現誘導を行った。６時間後、細菌培養物を遠心により沈殿させた。沈殿させた培養物を再懸濁し、超音波破砕により細胞溶解させ、可溶性及び不溶性分画を遠心により分離した。全細胞溶解物、及び可溶性及び不溶性分画をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動及びウェスタンブロットにより解析した。‘１７０特許において、３７℃における誘導培養物に封入体が含まれ、生成物の７０％超が不溶性分画であることが述べられている。
Ｆｃ−ＩＬ−１ｒａ融合タンパク質の典型的精製
封入体（ＩＢ）を、８Ｍグアニジン塩酸塩、３ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ ジチオエリスリトール及び１０ｍＭ ２−ｎ−シクロヘキシルアミノ−エタンスルホン酸、ｐＨ９．３の溶液と、１：１０（重量／体積）の濃度で混合し、室温にて２０分間撹拌し得る。次に、最終尿素濃度が４Ｍになるように、固形の尿素を添加し得る。さらにその混合物を室温にて４０分間撹拌し得る。
撹拌しながら、可溶化した封入体を２．５Ｍ １，３−ジメチル−尿素、０．２Ｍ Ａｒｇ、４．５ｍＭ システイン及び１ｍＭ シスタミン二塩酸塩、ｐＨ８．８の再折り畳み緩衝液に、ゆっくりと滴下しながら、１：２０（体積／体積）の濃度に希釈し得る。次に、その混合物を４℃にて、撹拌せずに一晩静置し得る。
再び折り畳まれた混合物を１時間、Ｊ６−Ｂ遠心機で遠心し得る。限外濾過システムを用いて、得られた上清を３回濃縮し、２５ｍＭ トリス ｐＨ８．８にバッファー交換し得る。残留物を６Ｍ ＨＣｌでｐＨ６．５まで滴定し得る。ｐＨ６．５で一部が沈殿物を形成し得るが、Ｊ６−Ｂ遠心機で１時間遠心した後、これを捨ててよい。
超遠心により得た上清を、２０ｍＭ ２−ｎ−モルホリノエファン−スルホン酸、ｐＨ６．５緩衝液により予め平衡化した、Ｑ Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ（ＱＨＰ）（１５ｇ ＩＢ’ｓ／５０ｍｌ）レジン（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）カラムに通し得る。ＱＨＰ（ＱＦＴ）からのフロースルー及び産物を含有するＱＨＰカラムからの初期の溶出分画を回収し得る。
Ｑ−ＦＴプールに、濃度が０．７Ｍになるように固形の硫酸アンモニウムを添加し得る。次に、２０ｍＭ リン酸ナトリウム ｐＨ７．０中の０．７Ｍ 硫酸アンモニウムで予め平衡化したフェニル−ｔｏｙｏ−カラム（Ｔｏｓｏ Ｈａａｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）（１５ｇ ＩＢ’ｓ／１５ｍｌレジン）にその試料を添加し得る。０．７Ｍ 硫酸アンモニウムで洗浄した後、２０ｍＭ リン酸ナトリウム ｐＨ７．０中の０．７Ｍ 硫酸アンモニウムから０．２Ｍ 硫酸アンモニウムの直線的勾配でそのカラムを溶出し得る。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析に基づいて、産物を含有する分画を集め得る。
ＨＩＣプールを２５ｍＭ リン酸ナトリウム、ｐＨ７．０に透析し得る。透析した試料を２Ｍ クエン酸によりｐＨ５．０になるように滴定し、次に、２０ｍＭ クエン酸 ｐＨ５．０で予め平衡化したＳＯＨＯカラム（１５ｇ ＩＢ’ｓ／７ｍｌレジン）に添加し得る。２５ｍＭ クエン酸 ｐＨ５．０及びｐＨ６．０緩衝液で洗浄した後、２５ｍＭ クエン酸 ｐＨ６．０緩衝液中の０Ｍから０．７Ｍ ＮａＣｌの直線的勾配でそのカラムから溶出させ得る。
産物を含有する分画を集め得る。
Ｂ．マウスにおける治療
ブタタイプＩＩコラーゲンを、濃度が２ｍｇ／ｍｌになるように０．０１Ｎ 酢酸に溶解し、次にＣＦＡ（Ｄｉｆｃｏ）により１：１の比で乳化した。関節炎発症性Ｂ１０．ＲＩＩＩ（Ｈ−２ｒ）マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂ，Ｂａｒ ｈａｒｂｏｒ，Ｍａｉｎｅ，ＵＳＡより。）に対して、乳液１００μｌを尾の基部に皮内投与して免疫した（Ｎａｂｏｚｎｙら、Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ ２０，３９−４９（１９９５））。
１日１回、マウスの関節炎の進行具合を観察した。評点方式を用いて、次のようにして、各肢に対する関節炎の重症度を決定した（Ｋｈａｒｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５５：３６５３−３６５９，１９９５）。０：関節炎なし；１：１〜３の肢指に発赤又は腫れがある；２：肢に重篤な腫れがある；３：関節硬直。各肢のスコアを集計したところ、各動物に対して０〜１２の範囲の重症度が当てられた。マウスに対するそのスコアを合計してマウス総数で割り、平均関節炎スコアを算出した。マウスの疾患発症時に、マウスを無作為に試験群（９〜１０匹のマウス／群）に分け、処置を開始した。
注射前に、ＫＩＮ２をＡ５Ｓ（Ａ５Ｓ緩衝液には、１０ｍＭ 酢酸及び５％ ソルビトール、ｐＨ５．０が含まれる。）に懸濁し、マウスＣＴＬＡ４−Ｆｃをリン酸緩衝食塩水溶液（ＰＢＳ）に懸濁した。疾患の臨床的発症後第０、＋１、＋２、＋４、＋６、＋８及び＋１０日に、ＫＩＮ２ １００μｇ、マウスＣＴＬＡ４−Ｆｃ １００μｇ、又はＫＩＮ２及びマウスＣＴＬＡ４−Ｆｃ各１００μｇを注射してマウスを処置した。１００μｇは、動物の体重１ｋｇあたりの治療剤５ｍｇに相当する（５ｍｇ／ｋｇ）。併用実験以外では、１００μｌの体積をマウスに注射したが、併用実験の場合は、マウスに対して各１００μｌ体積の２種類の別個の注射を行った。対照として、ＰＢＳの注射を使用した。毎日１回、マウスを観察し、平均関節炎スコアを算出した。
ＫＩＮ２は、単独投与の場合、マウスにおけるコラーゲン誘発性関節炎の重症度を低下させたが、一方で、マウスＣＴＬＡ４−Ｆｃのみ単独投与の場合、ＰＢＳ対照と比較して効果がなかった。図１に示すように、ＫＩＮ２単独投与の場合と比較して、ＫＩＮ２及びマウスＣＴＬＡ４−Ｆｃの併用により、長期間にわたりコラーゲン誘発性関節炎が緩和された。
関節炎発症性Ｂ１０．ＲＩＩＩマウスにおける、ＰＥＧｓＴＮＦＲ−１及びＣＴＬＡ４−Ｆｃを用いた併用療法
研究で使用するＰＥＧｓＴＮＦＲ−１ ２．６Ｄ、マウス ＣＴＬＡ４−Ｆｃ及びＦｃは、Ａｍｇｅｎで作成された。
Ａ．ｓＴＮＦＲ−Ｉの典型的ＰＥＧ化
ｓＴＮＦＲ−１ ２．６Ｄ分子に、ＰＥＧを付加し、ＰＥＧｓＴＮＦＲ−１ ２．６Ｄを構築した。ｓＴＮＦＲ−１ ２．６Ｄ 分子には、これらに限定されないが、ｓＴＮＦＲ−１ ２．６Ｄ／Ｃ１０５、ｓＴＮＦＲ−１ ２．６Ｄ／Ｃ１０６及びｓＴＮＦＲ−１ ２．６Ｄ／Ｎ１０５（配列番号４）が含まれる。公開ＰＣＴ出願ＷＯ第９８／０１５５５号（ＰＣＴ‘５５５）において全般的に述べられている、ｓＴＮＦＲ−１ ２．６Ｄ／Ｎ１０５にＰＥＧを添加し得る方法と同様にして、ｓＴＮＦＲ−１ ２．６Ｄ分子にＰＥＧを付加し得る。
ＰＣＴ‘５５５におけるｓＴＮＦＲ−Ｉ ２．６Ｄ／Ｎ１０５−ｔ−ＢｕＰＥＧ（３３ｋＤ）の典型的調製
ＰＣＴ‘５５５において、５０ｍＭ 酢酸ナトリウム、ｐＨ４中のｓＴＮＦＲ−Ｉ ２．６Ｄ／Ｎ１０５（配列番号４）（３．５ｍｇ／ｍｌ）の冷却（４℃）撹拌溶液に、３倍モル濃度の過剰なｔ−ＢｕＰＥＧ（モノ−ｔ−ブトキシ−ポリエチレングリコール、平均ＭＷ＝３３ｋＤａ、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｉｎｃ．）を添加することについて述べられている。最終濃度２０ｍＭになるようにＮａＣＮＢＨ３を添加し、その反応混合物を７℃にて１８〜２４時間撹拌する。
ＰＣＴ‘５５５において、反応過程中のタンパク質修飾の進行を、ＴＳＫＧ３０００ｓｗＸＬカラム（Ｔｏｓｏ Ｈａａｓ，Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＰＡ）を用いてＳＥＣ ＨＰＬＣにより、０．１Ｍ リン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．９、０．５Ｍ ＭａＣｌ及び１０％ エタノール、０．７ｍｌ／分（Ｔｏｓｏ Ｈａａｓ，Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＰＡ）で抽出し、モニタリングすることについて述べられている。
ＰＣＴ’５５５において、１Ｍ ＨＣｌで反応混合物のｐＨを約３．５に調整し、最終タンパク質濃度が１．５ｍｇ／ｍｌになるようにその反応混合物を水で希釈することについて述べられている。
ＰＣＴ‘５５５において、ＳＰ セファロース ＨＰ １６／１０ＴＭイオン交換クロマトグラフィー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用いることにより、ｓＴＮＦＲ−Ｉ ２．６Ｄ／Ｎ１０５−ｔ−ＢｕＰＥＧ（３３ｋＤ）を過剰のｔ−ＢｕＰＥＧ及び他の反応副産物から分離することが述べられている。
ＰＣＴ‘５５５において、前記カラムにその反応混合物を添加し、未反応ｔ−ＢｕＰＥＧを３カラム体積の出発緩衝液Ａ（２０ｍＭ 酢酸ナトリウム、ｐＨ４．０）で溶出することが述べられている。ｓＴＮＦＲ−Ｉ ２．６Ｄ／Ｎ１０５−ｔ−ＢｕＰＥＧ（３３ｋＤ）を、直線勾配の、０−３０％ 緩衝液Ｂ（２０ｍＭ 酢酸、ｐＨ４．０中の１Ｍ ＮａＣｌ）２０カラム体積で溶出する。２８０ｎｍで溶出物をモニタリングする。ｓＴＮＦＲ−Ｉ ２．６Ｄ／Ｎ１０５−ｔ−ＢｕＰＥＧ（３３ｋＤ）を含有する各分画を、４−２０％プレキャスト勾配ゲル（Ｎｏｖｅｘ，Ｓａｎｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析する。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析の結果に基づいて、分画を集め、濃縮し、濾過滅菌する。精製したｓＴＮＦＲ−Ｉ ２．６Ｄ／Ｎ１０５−ｔ−ＢｕＰＥＧ（３３ｋＤ）の各最終収集物を再びＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＳＥＣ ＨＰＬＣで解析する。このタンパク質を、１０ｍＭ リン酸ナトリウム、ｐＨ６．５及び２０ｍＭ ＮａＣｌ中で調合する。
ＰＣＴ‘５５５におけるｓＴＮＦＲ−Ｉ ２．６Ｄ／Ｎ１０５−３３ｋＤａ（ＭｅＰＥＧ）の典型的な調製
ＰＣＴ‘５５５において、ｓＴＮＦＲ−２．６Ｄ／Ｎ１０５の冷却（７℃）撹拌溶液（４ｍｇ／ｍｌ）に対して、ｐＨが５．０になるまで１０％酢酸を添加することが述べられている。この溶液に対して、１５ｍＭ ＮａＣＮＢＨ３及び２倍モル濃度の過剰なｔ−ブトキシＰＥＧ（ｔ−ブトキシポリエチレングリコール、平均ＭＷ＝３３ｋＤａ、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｉｎｃ．）を添加する。同じ温度にて、その反応混合物を短時間撹拌し、次に１８時間インキュベーションする。
ＰＣＴ‘５５５において、１８時間後、反応混合物中のタンパク質濃縮物をクエン酸でｐＨ３．０に調整することが述べられている。
ＰＣＴ‘５５５において、ＳＰ セファロース ＨＰＴＭカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用いたイオン交換クロマトグラフィーにより、ｓＴＮＦＲ−Ｉ ２．６Ｄ／Ｎ１０５−ＭｅＰＥＧ（３３ｋＤａ）を過剰のＭｅＰＥＧ及び他の反応副産物から分離することが述べられている。
ＰＣＴ‘５５５において、前記カラムにその反応混合物を添加し（８ｍｇ／ｍｌレジン程度）、未反応ＭｅＰＥＧを３カラム体積の出発緩衝液Ａ（２０ｍＭ クエン酸ナトリウム、ｐＨ３．０）で溶出することが述べられている。ｓＴＮＦＲ−Ｉ ２．６Ｄ／Ｎ１０５−ＭｅＰＥＧ（３３ｋＤａ）を直線勾配の、２０ｍＭ クエン酸、ｐＨ３．０中の０．１Ｍ−０．５Ｍ ＮａＣｌ、１６カラム体積で溶出する。２８０ｎｍで溶出物をモニタリングする。ｓＴＮＦＲ−Ｉ ２．６Ｄ／Ｎ１０５−ＭｅＰＥＧ（３３ｋＤａ）を含有する各分画を、４−２０％プレキャスト勾配ゲル（Ｎｏｖｅｘ，Ｓａｎｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析する。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析結果に基づいて、分画を集め、濃縮し、濾過滅菌する。精製したｓＴＮＦＲ−Ｉ ２．６Ｄ／Ｎ１０５−ＭｅＰＥＧ（３３ｋＤａ）の各最終収集物を再びＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＳＥＣ ＨＰＬＣで解析する。精製したｓＴＮＦＲ−Ｉ ２．６Ｄ／Ｎ１０５−ＭｅＰＥＧ（３３ｋＤａ）を５〜２０ｍｇ／ｍｌに濃縮し、ＰＢＳ、ｐＨ６．５（１０ｍＭ リン酸ナトリウム、３５〜１００ｍＭ ＮａＣｌ）又は２０ｍＭ 酢酸、１００ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ５．０の何れかで調合する。
Ｂ．マウスにおける治療
実施例１で述べたようにして、ブタタイプＩＩコラーゲンを注射してＢ１０．ＲＩＩＩマウスに対して関節炎を誘発した。この注射前に、マウスＣＴＬＡ４−Ｆｃ及びＰＥＧｓＴＮＦＲ−１ ２．６ＤをＰＢＳに懸濁した。疾患の臨床的発症後第０、＋１、＋２、＋４、＋６、＋８及び＋１０日に、ＰＥＧｓＴＮＦＲ−１ ２．６Ｄ １００μｇ、マウスＣＴＬＡ４−Ｆｃ １００μｇ、又はＰＥＧｓＴＮＦＲ−１ ２．６Ｄ及びマウスＣＴＬＡ４−Ｆｃ 各１００μｇを注射してマウスを処置した。１００μｇは、動物の体重１ｋｇあたりの治療剤５ｍｇに相当する（５ｍｇ／ｋｇ）。１００μｌの体積をマウスに注射した。対照として、ＰＢＳ及びヒトＩｇＧＦｃ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ａｍｇｅｎ，Ｔｈｏｕｓａｎｄ Ｏａｋｓ，ＣＡ）の注射を使用した。実施例１で述べたように、毎日１回、マウスを観察し、平均関節炎スコアを算出した。
ＰＥＧｓＴＮＦＲ−１ ２．６Ｄは、単独投与の場合、マウスにおけるコラーゲン誘発性関節炎の重症度を低下させたが、一方で、マウスＣＴＬＡ−Ｆｃのみ単独投与した場合は、ＰＢＳ対照と比較して効果がなかった。図２に示すように、ＰＥＧｓＴＮＦＲ−１ ２．６Ｄ単独投与の場合と比較して、ＰＥＧｓＴＮＦＲ−１ ２．６Ｄ及びマウスＣＴＬＡ４−Ｆｃの併用により、長期間にわたりコラーゲン誘発性関節炎が緩和された。
図２で示す実験終了時から１０日後に血清試料を採取し、タイプＩＩコラーゲン特異的抗体についてアッセイした。簡潔に述べると、２μｇ／ｍｌのブタタイプＩＩコラーゲンで高結合性プレート（Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ Ｉｎｔｌ．，Ｄｅｎｍａｒｋ）を一晩被覆した。そのプレートをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄し、ＰＢＳ中の１％ ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）でブロッキングした。希釈率１：１００から１：６４００の範囲で血清試料をそのプレートに添加し、室温にて３時間インキュベーションした。インキュベーション後、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０で過剰な血清をプレートから洗い去った。ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）で標識した抗−ＩｇＧ１及び抗−ＩｇＧ２ｂ抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）をそのプレートに添加し、１〜２時間インキュベーションした。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０でプレートから過剰な液を洗い去った。その反応を、３，３’，５，５’−テトラメチル−ベンジジン（ＴＭＢ）溶液（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を用いて発色させ、４５０ｎｍで光学密度を測定した。得られた光学密度の値を、タイプＩＩコラーゲン免疫マウス由来の標準血清と比較した。
タイプＩＩコラーゲン特異的抗体のレベルは、抗−ＩｇＧ１抗体により測定した場合、マウスＣＴＬＡ４−Ｆｃを単独で注射した動物と比較して、ＰＥＧｓＴＮＦＲ−１ ２．６Ｄ及びマウスＣＴＬＡ４−Ｆｃを注射した動物において低下しており、図３Ａで示される。タイプＩＩコラーゲン特異的抗体のレベルは、抗−ＩｇＧ２ｂ抗体により測定した場合、ＰＥＧｓＴＮＦＲ−１ ２．６Ｄを単独で注射した動物とマウスＣＴＬＡ４−Ｆｃを単独で注射した動物との両方と比較して、ＰＥＧｓＴＮＦＲ−Ｉ ２．６Ｄ及びマウスＣＴＬＡ４−Ｆｃを注射した動物において低下しており、それは図３Ｂで示される。
ＩＬ−１ｒａ、ｓＴＮＦＲ−Ｉ及び／又はＣＴＬＡ４を発現するウイルスベクターを用いた併用療法
ベクター構築
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）クローニングベクターは、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ ＩＩベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）に基づくものであった。ＢｇｌＩＩ部位を含有するオリゴヌクレオチドリンカー（ＣＧＣＧＡＧＡＴＣＴＴＧＣＧＣＡＡＧＡＴＣＴ（配列番号２８））を、ｐＢＳＳＫＩＩの２つのＢｓｓＨＩＩ部位の間に挿入した。隣接ＢｇｌＩＩ部位を有するＡＡＶ２ゲノムＤＮＡ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号３７２１５で入手可能；Ｌａｕｇｈｌｉｎら、Ｇｅｎｅ ２３，６５−７３（１９８３）も参照のこと。）を、そのリンカーに挿入した。ＮｒｕＩ部位及びＸｈｏＩ部位を、部位特異的突然変異誘発法によりＡＡＶ２ヌクレオチド配列のポジション１４５及び４５３０にそれぞれ導入した（Ｓｒｉｖａｓｔａｖａら、Ｊ．Ｖｉｏｌ．４５，５５５−５６４（１９８３）及びＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号 ＮＣ−００１４０１）。得られた構築物をＮｒｕＩ及びＸｈｏＩで消化し、ヌクレオチド１４６からヌクレオチド４５３４のＡＡＶ２配列を除去した。サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期遺伝子プロモーター／エンハンサー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）又はＥＦＩａプロモーター（ＰＥＦ１ ＨｉｓＡ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の何れかを含有し、その後にｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）由来の多重クローニング部位があるＤＮＡ断片を、ＡＡＶ２配列の残っているヌクレオチド１４５と４５３５との間に挿入した。ｐｃＤＮＡ３．１由来のウシ成長ホルモンポリアデニル化部位を、多重クローニング部位の下流に挿入した。標準的クローニング技術を用いて、ヒトＩＬ−１ｒａ（配列番号２０）、ラットｓＴＮＦＲ−１、ヒトＣＴＬＡ４（配列番号２）又はβ−ガラクトシダーゼ（Ｈｅｒｚら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９０，２８１２−２８１６（１９９３）の何れかをコードするｃＤＮＡを、ＮｈｅＩ及びＮｏｔＩ部位にそれぞれクローニングした。ラットｓＴＮＦＲ−１は、ラットＴＮＦＲ−１（配列番号２１）由来であった。
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ＋ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を用いてパッケージングプラスミド ｐＴｒａｎｓを構築した。ＣｌａＩ及びＳｎａＢＩを用いて消化することにより、ＡＡＶ２ゲノムのヌクレオチド１９１−４４９７に及ぶＡＡＶ２ゲノム断片を得て、その断片を、ＣｌａＩ及びＥｃｏＲＶで消化したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ＋に挿入した。標準的なクローニング法を用いて、ＡＡＶ２ヌクレオチド配列１８４９−２２０２を、ヌクレオチド３２０においてＡＡＶ２ヌクレオチド配列に挿入した。標準的なクローニング法を用いて、アデノウイルス５のアデノウイルスＥ２ａ、Ｅ４ｏｒｆ６及びＶＡ配列を含有するアデノウイルスヘルパープラスミド（Ｇｏｍｅｚ−Ｆｏｉｘら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７，２５１２９−２５１３４（１９９２））を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ＋にクローニングした。
アデノ随伴ウイルス生成
１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清を添加した培養液Ａ（１００ユニット／ｍｌ ペニシリン及び１００μｇ／ｍｌ ストレプトマイシン硫酸塩を含有するダルベッコ改変イーグル培地）中で、５％ＣＯ２、３７℃にて、ヒト胎児腎臓２９３Ｔ細胞を単層で培養した。リン酸カルシウム沈殿法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，上述）を用いて、ＡＡＶクローニングベクター、ｐＴｒａｎｓ及びｐＨｅｌｐｅｒプラスミドを１：１：３の比で共トランスフェクションした。細胞を回収し、凍結融解を繰り返してウイルスを放出させた。ヘパリン硫酸クロマトグラフィーを用いてウイルスを精製し、Ａｕｒｉｃｃｈｉｖら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １２，７１−７６に記載されているドットブロット法を用いてタイターを調べた。
動物への投与
６〜８週齢のオスＢ１０．ＲＩＩＩマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）を無作為に治療群（ｎ＝１０）に割り当て、尾の基部において皮内に、１ｘＣＦＡ中の１００μｇブタタイプＩＩコラーゲンを尾静脈を介して注射した。１９日目に、β−ｇａｌ、ＩＬ−１ｒａ、ｓＴＮＦＲ−１、ＣＴＬＡ−４又はそれらの組み合わせを担う組み換えＡＡＶ粒子、７ｘ１０１２個を含有するＰＢＳ １００μｌをマウスに静脈注射した。ＥＬＩＳＡ用に尾静脈から血液を採取し、タンパク質発現レベルを定量した。２１日目に、マウスに対して、１ｘＣＦＡ中の１００μｇのブタタイプＩＩコラーゲンを皮内注射して、さらに追加免疫した。
ベータガラクトシダーゼ対照と比較して、ベクターを個々に投与した場合、ヒトＩＬ−１ｒａ、ラットｓＴＮＦＲ−Ｉ及びヒトＣＴＬＡ−４の発現により、マウスにおけるコラーゲン誘発関節炎の発症率及び重症度が低下していた。図４及び５で示すように、ベクターの共投与によりｓＴＮＦＲ−１及びＣＴＬＡ−４発現を組み合わせた場合、これらのタンパク質を個々に発現させた場合よりも、コラーゲン誘発関節炎の重症度及び発症率はさらに大きく低下した。
図４で示すマウスの治療群から得た血清試料を、ブタタイプＩＩコラーゲンで追加免疫してから数週間後に採取し、抗−ＩｇＧ３抗体を用いたこと以外は上記実施例２で述べたようにして、タイプＩＩコラーゲン特異的抗体のレベルをアッセイした。
抗−ＩｇＧ３抗体により測定した場合、タイプＩＩコラーゲン特異的抗体のレベルは、ｓＴＮＦＲ−１を単独で投与した動物と比較して、ｓＴＮＦＲ−１及びＣＴＬＡ−４ベクターを投与した動物において低下しており、それは図６で示すとおりである。抗−ＩｇＧ３抗体により測定した場合、タイプＩＩコラーゲン特異的抗体のレベルは、ＩＬ−１ｒａベクターを単独で投与した動物及びＣＴＬＡ−４ベクターを単独で投与した動物両方と比較して、ＩＬ−１ｒａ及びＣＴＬＡ−４ベクターを投与した動物において低下しており、それは図６で示すとおりである。
狼瘡マウスにおけるＡＧＰ３ Ｐｂ及びＣＴＬＡ４−Ｆｃを用いた併用療法
ＣＴＬＡ４−Ｆｃタンパク質及びＡＧＰ３ペプチボディ（ＡＧＰ３タンデム２量体ペプチド−Ｆｃ融合物）（「ＡＧＰ３ Ｐｂ」）（配列番号１）は、Ａｍｇｅｎで生成された。
Ａ．ＡＧＰペプチボディの典型的な調製方法
公開ＰＣＴ出願ＷＯ第０２／０９６２６２０号（ＰＣＴ‘６２０）において全般的に記載されているようにして、ＡＧＰ３ Ｐｂを調製し得る。
ＰＣＴ‘６２０において、インフレームでペプチドのタンデム２量体をヒトＩｇＧ１のＦｃ領域に融合させた、抑制性のＡＧＰ３ Ｐｂを構築したことが論じられている。ＰＣＴ‘６２０において、そのペプチド及びＮｄｅＩからＳａｌＩ断片としてグリシン残基５個及びバリン残基１個を含有するリンカーをコードする２本鎖を作るために、オリゴヌクレオチドの対をアニーリングすることにより、抑制性のペプチボディを構築し得ることが述べられている。
ＰＣＴ‘６２０において、これらの２本鎖分子を、ヒトＦｃ遺伝子を含有する、ＮｄｌＩ及びＳａｌＩで消化されたベクター（ｐＡＭＧ２１−ＲＡＮＫ−Ｆｃ、ＰＣＴ‘６２０に記載）にライゲーションしたことが述べられている。ＰＣＴ‘６２０において、得られたライゲーション混合物をエレクトロポレーションによりＥ．コリ株 １５９６細胞（ＧＭ２２１、ＰＣＴ‘６２０に記載）に形質転換したことが述べられている。ＰＣＴ‘６２０において、組み換えタンパク質産物産生能及び正しいヌクレオチド配列を有する遺伝子融合物保持能についてクローンをスクリーニングしたことが述べられている。ＰＣＴ‘６２０において、各ペプチボディに対してこのようなクローンを１個選択したことが述べられている。
国際特許ＷＯ第０２／０９２６２０号に記載されているように、ｐＡＭＧ２１−ＲＡＮＫ−Ｆｃ融合構築物をＥ．コリで発現させ得る。
Ｂ．マウスにおける治療
（ＮＺＢｘＮＺＷ）Ｆ１マウスは、６〜９ヶ月齢で狼瘡様の症状を自然に発症し、通常、１０〜１２ヶ月齢で死亡する（Ｖｙｓｅら、Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６，２６１−２９２（１９９８））。治療前に、Ａｌｂｕｓｔｉｘ（Ｒ）試薬ストリップ（Ｂａｙｅｒ Ｃｏｒｐ．Ｅｌｋｈａｒｔ，ＩＮ）を用いて、尿中タンパク質について、マウスに対してプレスクリーニングを行い、尿中タンパク質が１００ｍｇ／ｄｌを超えるマウスを実験から除外した。注射前に、マウスＣＴＬＡ４−Ｆｃ及びＡＧＰ３ ＰｂをＰＢＳ中で懸濁した。週に３回、６０日間にわたり、１００μｇ（４ｍｇ／ｋｇ）ＡＧＰ３ Ｐｂ、５０μｇ（２ｍｇ／ｋｇ）マウスＣＴＬＡ４−Ｆｃ、又はそれらを組み合わせたものを、６ヶ月齢（ＮＺＢｘＮＺＷ）Ｆ１マウスに腹腔内投与して処置した。１００μｇは、動物の体重１ｋｇあたりの治療剤４ｍｇに相当する（４ｍｇ／ｋｇ）。５０μｇは、動物の体重１ｋｇあたりの治療剤２ｍｇに相当する（２ｍｇ／ｋｇ）。対照として、ヒトＩｇＧ１Ｆｃタンパク質１００μｇ又は１００μｌのＰＢＳの投与を行った。実験期間中、月に１回、尿中タンパク質を測定した。図７で示すように、ＡＧＰ３ Ｐｂ及びマウスＣＴＬＡ４−Ｆｃの併用により、ＡＧＰ３ Ｐｂ又はマウスＣＴＬＡ４−Ｆｃを単独で使用した場合と比較して、生存率が著しく向上した。
Ａｌｂｕｓｔｉｘ（Ｒ）試薬ストリップ（Ｂａｙｅｒ Ｃｏｒｐ．Ｅｌｋｈａｒｔ，ＩＮ）を用いて、治療群における狼瘡傾向のマウスの蛋白尿を３０日ごとにアッセイした。図８は、治療開始から様々な時間経過後における、蛋白尿が３００ｍｇ／ｄｌを超えるマウスの割合を示す。図８で示すように、ＡＧＰ３ Ｐｂ及びマウスＣＴＬＡ４−Ｆｃの併用療法により、ＡＧＰ３ Ｐｂ又はマウスＣＴＬＡ４−Ｆｃを単独で投与した場合と比較して、重症度が低下し、蛋白尿の出現が遅くなった。
ＡＧＰ３ Ｐｂ、マウスＣＴＬＡ４−Ｆｃ又はそれらの組み合わせによる治療開始から６０日後に、図７に示す各実験群から無作為に選択した３匹の狼瘡傾向のマウスから血液採取し、Ｂ２２０−陽性細胞の有無についてその血液試料を試験した。Ｂ２２０抗体は、Ｂ細胞を検出する。赤血球を細胞溶解し、蛍光イソチアシネート標識ＣＤ４（抗−ＣＤ４−ＦＩＴＣ）、フィコエリスリン（ＰＥ）標識ＣＤ８（抗−ＣＤ８−ＰＥ）及びシクロム（ｃｙｃｈｒｏｍｅ）標識Ｂ２２０（Ｂ２２０−ｃｙｃ）（全て、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）より購入）で、４℃にて３０分間、白血球細胞を染色した。インキュベーション後、パラホルムアルデヒドを含有するＦＡＣＳ緩衝液で細胞を２〜３回洗浄し固定した。Ｋｈａｒｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０，１０１−１０６（１９９８）に記載の標準的プロトコールを用いて、染色及び解析を行った。
図９Ａで示すように、Ｂ２２０陽性細胞の割合は、ＡＧＰ３ Ｐｂ及びマウスＣＴＬＡ４−Ｆｃ両方を投与したマウスにおいて、個別に投与した場合と比較してはっきりと低下していた。さらに、図９Ｂで示すように、ＡＧＰ３ Ｐｂ及びマウスＣＴＬＡ４−Ｆｃの最終投与から３０日間、この低下状態が持続した。
２本鎖ＤＮＡに対する抗体の有無について、０、３０、６０、９０日において様々な治療群のマウスから採取した血清試料をアッセイした。ＰＢＳで希釈した１μｇ／ｍｌプラスミドＤＮＡ（Ｉｍｍｕｎｏｖｉｓｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｄａｌｅ，ＡＺ）と、水で溶解させた１ｍｇ／ｍｌ メチル化ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）の１：１溶液、５０μｌで吸着性プレートを４℃にて一晩被覆した。ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０で３回、プレートを穏やかに洗浄し、最大２時間、２％ＢＳＡ／ＰＢＳ ７５μｌでブロッキングした。希釈した試料、２５μｌを、最終希釈係数が１００、４００、１６００及び６４００倍になるようにそのプレートに添加した。ＴＡＬＬ−１トランスジェニックマウス（Ｋｈａｒｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７，３３７０−３３７５（２０００））の血清を標準物質として使用した。再び洗浄してすぐに、試料を数時間、又は一晩インキュベーションした。ＨＲＰで標識した抗−マウスＩｇＧ及び抗−マウスＩｇＭ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）を、１：２０００に希釈し、そのプレートに添加した。ＨＲＰ標識した抗体を約１時間インキュベーションした。インキュベーション後、プレートを洗浄し、ＴＭＢ溶液で発色させ、４５０ｎｍで光学密度を測定した。
図１０に示すように、治療から３０日及び６０日後、抗−ＩｇＧ抗体により測定した場合、ＡＧＰ３ Ｐｂを単独で投与した動物と比較して、ｍＣＴＬＡ４−Ｆｃ及びＡＧＰ３ Ｐｂを投与した動物において２本鎖ＤＮＡ特異的抗体レベルが低下していた。
抗−ＩｇＭ抗体により測定した場合の２本鎖ＤＮＡ特異的抗体のレベルは、図１１で示す。
関節炎発症性Ｂ１０．ＲＩＩＩマウスにおけるＰＥＧｓＴＮＦＲ−１及びＡＧＰ３ Ｐｂを用いた併用療法
本研究で用いるＰＥＧｓＴＮＦＲ−１ ２．６Ｄ、ＡＧＰ３ Ｐｂ（ＡＧＰ３タンデム２量体ペプチド−Ｆｃ融合物）及びＦｃは、Ａｍｇｅｎで生成された。典型的なＰＥＧｓＴＮＦＲ−１ ２．６Ｄ生成方法は実施例２に記載されている。典型的なＡＧＰ３ Ｐｂ生成方法は実施例４に記載されている。
マウスにおける治療
実施例１に記載したようにして、ブタタイプＩＩコラーゲンを注射して、Ｂ１０．ＲＩＩＩマウスに関節炎を誘発した。
注射前に、ＡＧＰ３ ＰｂをＰＢＳに懸濁し、ｓＴＮＦＲ−１ ２．６ＤをＰＢＳに懸濁した。疾患の臨床的発症後第０、＋１、＋２、＋４、＋６、＋８及び＋１０日に、ＰＥＧｓＴＮＦＲ−１ ２．６Ｄ １００μｇ、ＡＧＰ３ Ｐｂ １００μｇ、又はＰＥＧｓＴＮＦＲ−１ ２．６Ｄ及びＡＧＰ３ Ｐｂ 各１００μｇを注射によりマウスに投与した。１００μｇは、動物の体重１ｋｇあたりの治療剤５ｍｇに相当する（５ｍｇ／ｋｇ）１００μｌの体積をマウスに注射した。対照として、ＰＢＳ及びヒトＩｇＧ１ Ｆｃ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ａｍｇｅｎ，Ｔｈｏｕｓａｎｄ Ｏａｋｓ，ＣＡ）を使用した。実施例１に記載したように、毎日１回、マウスを観察し、平均関節炎スコアを算出した。
図１２に示すように、ＰＥＧｓＴＮＦＲ−Ｉ ２．６Ｄ及びＡＧＰ３ Ｐｂを併用した場合、Ｆｃ対照、ＰＥＧｓＴＮＦＲ−１ ２．６Ｄ単独投与及びＡＧＰ３ Ｐｂ単独投与の場合と比較して、長期間にわたりコラーゲン誘発性関節炎が緩和された。
関節炎発症性Ｂ１０．ＲＩＩＩマウスにおけるＡＧＰ３ Ｐｂ及びＫＩＮ２を用いた併用療法
本研究で用いるＡＧＰ３ Ｐｂ（ＡＧＰ３タンデム２量体ペプチド−Ｆｃ融合物）及びＫＩＮ２は、Ａｍｇｅｎで生成された。典型的なＫＩＮ２生成方法は実施例１に記載されている。典型的なＡＧＰ３ Ｐｂ生成方法は実施例４に記載されている。
マウスにおける治療
実施例１に記載したようにして、ブタタイプＩＩコラーゲンを注射して、Ｂ１０．ＲＩＩＩマウスに関節炎を誘発した。
注射前に、ＫＩＮ２をＡ５Ｓに懸濁し、ＡＧＰ３ ＰｂをＰＢＳに懸濁した。疾患の臨床的発症後第０、＋１、＋２、＋４、＋６、＋８及び＋１０日に、ＫＩＮ２ １００μｇ、ＡＧＰ３ Ｐｂ １００μｇ又はＫＩＮ２及びＡＧＰ３ Ｐｂ各１００μｇの注射を行いマウスを処置した。１００μｇは、動物の体重１ｋｇあたりの治療剤５ｍｇに相当する（５ｍｇ／ｋｇ）。併用実験以外では、１００μｌの体積をマウスに注射したが、併用実験の場合は、マウスに対して、各１００μｌ体積の２種類の別個の注射を行った。対照として、ＰＢＳ及びＦｃの注射を使用した。実施例１に記載したように、毎日１回、マウスを観察し、平均関節炎スコアを算出した。
ＫＩＮ２は、単独投与の場合、マウスにおけるコラーゲン誘発性関節炎の重症度を低下させたが、一方で、ＡＧＰ３ Ｐｂ単独投与の場合、ＰＢＳ対照と比較してごくわずかの効果しかなかった。図１３に示すように、ＫＩＮ２単独投与の場合と比較して、ＫＩＮ２及びＡＧＰ３ Ｐｂの併用により、長期間にわたりコラーゲン誘発性関節炎が緩和された。
関節炎発症性ＤＢＡ／１マウスにおけるＫＩＮ２及び抗−ＯＸ４０Ｌ抗体を用いた併用療法
本研究で用いるＫＩＮ２は、Ａｍｇｅｎで生成された。典型的なＫＩＮ２生成方法は実施例１に記載されている。本研究で用いる抗−ＯＸ４０Ｌ抗体（ＲＭ１３４Ｌ）は、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）より購入した。抗−ＯＸ４０Ｌ抗体の典型的な作製方法は、Ａｋｉｂａら（Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９９９，１６２：７０５８−７０６６）で要約されている。ラットＩｇＧは、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）より購入した。
マウスにおける治療
１ｘ完全フロイドアジュバントで乳化させたウシタイプＩＩコラーゲンでＤＢＡ／１マウスを免疫した。３週間後、非関節炎マウスに対して、不完全フロイドアジュバントで乳化させたウシタイプＩＩコラーゲンでさらに追加免疫した。実施例１で記載しているように、マウスの関節炎の進行を観察した。
注射前に、ＫＩＮ２をＡ５Ｓに懸濁し、抗−ＯＸ４０Ｌ抗体をＰＢＳに懸濁した。疾患の臨床的発症後第０、＋１、＋２、＋４、＋６、＋８及び＋１０日に、ＫＩＮ２ １００μｇ、抗−ＯＸ４０Ｌ抗体 １００μｇ、又はＫＩＮ２及び抗−ＯＸ４０Ｌ抗体 各１００μｇ、又はＫＩＮ２及び抗−ＯＸ４０Ｌ抗体 各１００μｇの注射を行いマウスを処置した。１００μｇは、動物の体重１ｋｇあたりの治療剤５ｍｇに相当する（５ｍｇ／ｋｇ）。併用実験以外では、１００μｌの体積をマウスに注射したが、併用実験の場合は、マウスに対して、各１００μｌ体積の２種類の別個の注射を行った。対照として、ＰＢＳ及びラットＩｇＧの注射を使用した。実施例１に記載したように、毎日１回、マウスを観察し、平均関節炎スコアを算出した。
ＫＩＮ２は、単独投与の場合、マウスにおけるコラーゲン誘発性関節炎の重症度を低下させたが、一方で、抗−ＯＸ４０Ｌ抗体単独投与の場合、ＰＢＳ対照と比較してごくわずかな効果しかなかった。図１４に示すように、 ＫＩＮ２単独投与の場合と比較して、ＫＩＮ２及び抗−ＯＸ４０Ｌ抗体の併用により、長期間にわたりコラーゲン誘発性関節炎が緩和された。
関節炎発症性ＤＢＡ／１マウスにおけるＰＥＧ ｓＴＮＦＲ−１及び抗−ＯＸ４０Ｌ抗体を用いた併用療法
本研究で用いるＰＥＧ ｓＴＮＦＲ−１ ２．６Ｄ及びＦｃは、Ａｍｇｅｎで生成された。典型的なＰＥＧ ｓＴＮＦＲ−１ ２．６Ｄ生成方法は実施例２に記載されている。抗−ＯＸ４０Ｌ抗体は、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎより購入した。ラットＩｇＧは、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）より購入した。
マウスにおける治療
実施例７に記載するように、ＤＢＡ／１マウスにおいて、ウシタイプＩＩコラーゲンを用いて注射を行い、関節炎を誘発した。
注射前に、抗−ＯＸ４０Ｌ抗体をＰＢＳに懸濁し、ＰＥＧ ｓＴＮＦＲ−１ ２．６ＤをＰＢＳに懸濁した。疾患の臨床的発症後第０、＋１、＋２、＋４、＋６、＋８及び＋１０日に、ＰＥＧ ｓＴＮＦＲ−１ ２．６Ｄ １００μｇ、抗−ＯＸ４０Ｌ抗体 １００μｇ、又は、ＰＥＧ ｓＴＮＦＲ−１ ２．６Ｄ及び抗−ＯＸ４０Ｌ抗体 各１００μｇを注射によりマウスに投与した。１００μｇは、動物の体重１ｋｇあたりの治療剤５ｍｇに相当する（５ｍｇ／ｋｇ）。１００μｌの体積をマウスに注射した。対照として、ＰＢＳ及びラットＩｇＧの注射を使用した。実施例１に記載するように、毎日１回、マウスを観察し、平均関節炎スコアを算出した。
ＰＥＧ ｓＴＮＦＲ−１ ２．６Ｄは、単独投与の場合、マウスにおけるコラーゲン誘発性関節炎の重症度を低下させたが、一方で、抗−ＯＸ４０Ｌ抗体単独投与の場合、ＰＢＳ対照と比較してごくわずかな効果しかなかった。図１４に示すように、ＰＥＧ ｓＴＮＦＲ−１ ２．６Ｄ単独投与の場合と比較して、ＰＥＧ ｓＴＮＦＲ−１ ２．６Ｄ及び抗−ＯＸ４０Ｌ抗体の併用により、長期間にわたりコラーゲン誘発性関節炎が緩和された。
尿中タンパク質が１００ｍｇ／ｄｌを超えるマウスにおけるＡＧＰ３ Ｐｂ及びＣＴＬＡ４−Ｆｃを用いた併用療法
本研究で用いるＣＴＬＡ４−Ｆｃタンパク質及びＡＧＰ３ Ｐｂ（ＡＧＰ３タンデム２量体ペプチド−Ｆｃ融合物）は、Ａｍｇｅｎで生成された。典型的なＡＧＰ３ Ｐｂ生成方法は実施例４に記載されている。
マウスにおける治療
実施例４に記載するようにして、（ＮＺＢｘＮＺＷ）Ｆ１マウスに狼瘡様症状を発症させた。
治療前に、Ａｌｂｕｓｔｉｘ（Ｒ）試薬ストリップ（Ｂａｙｅｒ Ｃｏｒｐ．Ｅｌｋｈａｒｔ，ＩＮ）を用いて、尿中タンパク質に関して、マウスに対してプレスクリーニングを行い、尿中タンパク質が１００ｍｇ／ｄｌを超えるマウスを実験に使用した。注射前に、マウスＣＴＬＡ４−ＦｃをＰＢＳ中で懸濁し、ＡＧＰ３ ＰｂをＰＢＳ中で懸濁した。週に３回、１２週間にわたり、１００μｇ（４ｍｇ／ｋｇ）ＡＧＰ３ Ｐｂ、５０μｇ（２ｍｇ／ｋｇ）マウスＣＴＬＡ４−Ｆｃ、又は１００μｇ（４ｍｇ／ｋｇ）ＡＧＰ３ Ｐｂ及び５０μｇ（２ｍｇ／ｋｇ）マウスＣＴＬＡ４−Ｆｃを組み合わせたものを６ヶ月齢（ＮＺＢｘＮＺＷ）Ｆ１マウスに腹腔内投与して処置した。１００μｇは、動物の体重１ｋｇあたりの治療剤４ｍｇに相当する（４ｍｇ／ｋｇ）。５０μｇは、動物の体重１ｋｇあたりの治療剤２ｍｇに相当する（２ｍｇ／ｋｇ）。対照として、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃタンパク質１００μｇ又は１００μｌのＰＢＳの投与を行った。
実験期間中、週に１回、Ａｌｂｕｓｔｉｘ（Ｒ）試薬ストリップ（Ｂａｙｅｒ Ｃｏｒｐ．Ｅｌｋｈａｒｔ，ＩＮ）を用いて尿中タンパク質を測定した。図１５で示すように、ＡＧＰ３ Ｐｂ又はマウスＣＴＬＡ４−Ｆｃを単独で使用した場合と比較して、ＡＧＰ３ Ｐｂ及びマウスＣＴＬＡ４−Ｆｃの併用により生存率が著しく向上した。
Ａｌｂｕｓｔｉｘ（Ｒ）試薬ストリップ（Ｂａｙｅｒ Ｃｏｒｐ．Ｅｌｋｈａｒｔ，ＩＮ）を用いて、治療群において選択したマウスの蛋白尿を毎週アッセイした。毎週、蛋白尿が悪化した場合（＞１００ｍｇ／ｄｌから＞３００ｍｇ／ｄｌ）、＋１のスコアを与え、蛋白尿が変化しなかった場合は、スコア０とし、蛋白尿が改善（＜１００ｍｇ／ｄｌ）した場合はスコア−１とした。１４匹のマウスの群の平均スコアを、図１６でグラフ化している。
図１６は、４１週間の経過にわたる、蛋白尿の重症度を示す。図１６で示すように、ＡＧＰ３ Ｐｂ又はマウスＣＴＬＡ４−Ｆｃを単独で投与した場合と比較して、ＡＧＰ３ Ｐｂ及びマウスＣＴＬＡ４−Ｆｃの併用療法により蛋白尿の重症度が低下した。
尿中タンパク質が３００ｍｇ／ｄｌを超えるマウスにおけるＡＧＰ３ Ｐｂ及びＣＴＬＡ４−Ｆｃを用いた併用療法
本研究で用いるＣＴＬＡ４−Ｆｃタンパク質及びＡＧＰ３ Ｐｂ（ＡＧＰ３タンデム２量体ペプチド−Ｆｃ融合物）は、Ａｍｇｅｎで生成された。ＡＧＰ３ Ｐｂ生成方法は実施例４に記載されている。
マウスにおける治療
実施例４に記載するようにして、（ＮＺＢｘＮＺＷ）Ｆ１マウスに狼瘡様症状を発症させた。
治療前に、Ａｌｂｕｓｔｉｘ（Ｒ）試薬ストリップ（Ｂａｙｅｒ Ｃｏｒｐ．Ｅｌｋｈａｒｔ，ＩＮ）を用いて、尿中タンパク質に関して、マウスに対してプレスクリーニングを行い、尿中タンパク質が３００ｍｇ／ｄｌを超えるマウスを実験に使用した。注射前に、マウスＣＴＬＡ４−ＦｃをＰＢＳ中で懸濁し、ＡＧＰ３ ＰｂをＰＢＳ中で懸濁した。週に３回、１２週間にわたり、１００μｇ（４ｍｇ／ｋｇ）ＡＧＰ３ Ｐｂ、５０μｇ（２ｍｇ／ｋｇ）マウスＣＴＬＡ４−Ｆｃ、又は１００μｇ（４ｍｇ／ｋｇ）ＡＧＰ３ Ｐｂ及び５０μｇ（２ｍｇ／ｋｇ）マウスＣＴＬＡ４−Ｆｃを組み合わせたものを６ヶ月齢（ＮＺＢｘＮＺＷ）Ｆ１マウスに腹腔内投与して処置した。１００μｇは、動物の体重１ｋｇあたりの治療剤４ｍｇに相当する（４ｍｇ／ｋｇ）。５０μｇは、動物の体重１ｋｇあたりの治療剤２ｍｇに相当する（２ｍｇ／ｋｇ）。対照として、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃタンパク質１００μｇ又は１００μｌのＰＢＳの投与を行った。実験期間中、週に１回、Ａｌｂｕｓｔｉｘ（Ｒ）試薬ストリップ（Ｂａｙｅｒ Ｃｏｒｐ．，Ｅｌｋｈａｒｔ，ＩＮ）を用いて尿中タンパク質を測定した。図１７で示すように、ＡＧＰ３ Ｐｂ又はＣＴＬＡ４−Ｆｃを単独で使用した場合と比較して、ＡＧＰ３ Ｐｂ及びマウスＣＴＬＡ４−Ｆｃの併用により生存率が著しく向上した。
Ａｌｂｕｓｔｉｘ（Ｒ）試薬ストリップ（Ｂａｙｅｒ Ｃｏｒｐ．Ｅｌｋｈａｒｔ，ＩＮ）を用いて、治療群において選択したマウスの蛋白尿を毎週アッセイした。毎週、死亡した場合は＋２のスコアを、蛋白尿が悪化した場合（＞２０００ｍｇ／ｄｌ）は＋１のスコアを与え、蛋白尿が変化しなかった場合（３００ｍｇ／ｄｌから２０００ｍｇ／ｄｌ）はスコア０を、蛋白尿が改善した場合（＜３００ｍｇ／ｄｌから１００ｍｇ／ｄｌ）はスコア−１を、蛋白尿が劇的に改善した場合（＜１００ｍｇ／ｄｌ）はスコア−２をマウスに与えた。１３匹のマウスの群の平均スコアを、図１８でグラフ化する。
図１８は、２０週間の経過にわたる、蛋白尿の重症度を示す。図１８で示すように、ＡＧＰ３ Ｐｂ又はマウスＣＴＬＡ４−Ｆｃを単独で投与した場合と比較して、ＡＧＰ３ Ｐｂ及びマウスＣＴＬＡ４−Ｆｃの併用療法により蛋白尿の重症度が低下した。
関節炎発症性Ｂ１０．ＲＩＩＩマウスにおけるＣＴＬＡ４−Ｆｃ及びＫＩＮ２を用いた断続的併用療法
以下は、ＫＩＮ２及びＣＴＬＡ４−Ｆｃを併用した断続療法が、ＣＴＬＡ４−Ｆｃ単独及びＫＩＮ２単独の場合と比較して、長期にわたり、コラーゲン誘発性関節炎を緩和するという、机上の実施例である。
マウスにおける治療
実施例１に記載したようにして、ブタタイプＩＩコラーゲンを注射して、Ｂ１０．ＲＩＩＩマウスに関節炎を誘発する。
マウスを２群に分ける。第一の群において、注射前に、ＫＩＮ２をＡ５Ｓに懸濁し、ＣＴＬＡ４−ＦｃをＰＢＳに懸濁する。疾患の臨床的発症後第０日から９日に、ＫＩＮ２ １００μｇ、ＣＴＬＡ４−Ｆｃ １００μｇ、又はＫＩＮ２及びＣＴＬＡ４−Ｆｃ 各１００μｇを注射してマウスを処置する。１００μｇは、動物の体重１ｋｇあたりの治療剤５ｍｇに相当する（５ｍｇ／ｋｇ）。併用実験以外では、１００μｌの体積をマウスに注射するが、併用実験の場合は、マウスに対して、各１００μｌの体積の２種類の別個の注射を行う。対照として、ＰＢＳ及びＦｃの注射を使用する。実施例１に記載したように、毎日１回、マウスを観察し、平均関節炎スコアを算出する。
平均関節炎スコアが１以上のマウスに対して、さらに３日間、ＫＩＮ２ １００μｇ、ＣＴＬＡ４−Ｆｃ １００μｇ、又はＫＩＮ２及びＣＴＬＡ４−Ｆｃ 各１００μｇの注射を行い第２回目の処置を行う。第２回目の処置後、マウスの関節炎スコアが１以上である場合は必ず、３日間の処置を繰り返す。実験期間中、必要な限り処置を繰り返す。
第２の群において、注射前に、ＫＩＮ２をＡ５Ｓに懸濁し、ＣＴＬＡ４−ＦｃをＰＢＳに懸濁する。疾患の臨床的発症後第０日から＋２日に、ＫＩＮ２ １００μｇ、ＣＴＬＡ４−Ｆｃ １００μｇ、又はＫＩＮ２及びＣＴＬＡ４−Ｆｃ 各１００μｇを注射することによりマウスを処置する。１００μｇは、動物の体重１ｋｇあたりの治療剤５ｍｇに相当する（５ｍｇ／ｋｇ）。併用実験以外では、１００μｌの体積をマウスに注射するが、併用実験の場合は、マウスに対して、各１００μｌの体積の２種類の別個の注射を行う。対照として、ＰＢＳ及びＦｃの注射を使用する。処置後、実施例１に記載したように、毎日マウスを評価し、平均関節炎スコアを算出する。
平均関節炎スコアが１以上のマウスに対して、さらに３日間、ＫＩＮ２ １００μｇ、ＣＴＬＡ４−Ｆｃ １００μｇ、又はＫＩＮ２及びＣＴＬＡ４−Ｆｃ 各１００μｇの維持量を注射し、第２回目の処置を行う。
第２回目の処置後、マウスの関節炎スコアが１以上である場合は必ず、３日間の維持量による処置を繰り返す。実験期間中、維持量による処置を必要な限り繰り返す。
実験を２ヶ月間継続する。
関節炎発症性Ｂ１０．ＲＩＩＩマウスにおける、ＣＴＬＡ４−Ｆｃ及びＰＥＧｓＴＮＦＲ−１を用いた断続的併用療法
以下は、ＣＴＬＡ４−Ｆｃ単独又はＰＥＧｓＴＮＦＲ−１ ２．６Ｄ単独投与と比較して、ＰＥＧｓＴＮＦＲ−１ ２．６Ｄ及びＣＴＬＡ４−Ｆｃを併用した断続治療が、長期にわたりコラーゲン誘発性関節炎を緩和するという、机上の実施例である。
マウスにおける治療
実施例１に記載したようにして、ブタタイプＩＩコラーゲンを注射して、Ｂ１０．ＲＩＩＩマウスに関節炎を誘発する。
マウスを２群に分ける。第一の群において、注射前に、ＰＥＧｓＴＮＦＲ−１ ２．６ＤをＰＢＳに懸濁し、ＣＴＬＡ４−ＦｃをＰＢＳに懸濁する。疾患の臨床的発症後第０日から＋９日に、ＰＥＧｓＴＮＦＲ−１ ２．６Ｄ １００μｇ、ＣＴＬＡ４−Ｆｃ １００μｇ又はＰＥＧｓＴＮＦＲ−１ ２．６Ｄ及びＣＴＬＡ４−Ｆｃ 各１００μｇの注射を行いマウスを処置する。１００μｇは、動物の体重１ｋｇあたりの治療剤５ｍｇに相当する（５ｍｇ／ｋｇ）。１００μｌの体積をマウスに注射する。対照として、ＰＢＳ及びＦｃの注射を使用する。実施例１に記載したように、毎日１回、マウスを観察し、平均関節炎スコアを算出する。
平均関節炎スコアが１以上のマウスに対して、さらに３日間、ＰＥＧｓＴＮＦＲ−１ ２．６Ｄ １００μｇ、ＣＴＬＡ４−Ｆｃ １００μｇ、又はＰＥＧｓＴＮＦＲ−１ ２．６Ｄ及びＣＴＬＡ４−Ｆｃ 各１００μｇの維持量で注射を行い第２回目の処置を行う。
第２回目の処置後、マウスの関節炎スコアが１以上である場合は必ず、３日間の維持量による処置を繰り返す。実験期間中、必要な限り、維持量による処置を繰り返す。
第２の群において、注射前に、ＰＥＧｓＴＮＦＲ−１ ２．６ＤをＰＢＳに懸濁し、ＣＴＬＡ４−ＦｃをＰＢＳに懸濁する。疾患の臨床的発症後第０日から＋２日に、ＰＥＧｓＴＮＦＲ−１ ２．６Ｄ １００μｇ、ＣＴＬＡ４−Ｆｃ １００μｇ、又はＰＥＧｓＴＮＦＲ−１ ２．６Ｄ及びＣＴＬＡ４−Ｆｃ 各１００μｇの注射を行いマウスを処置する。１００μｇは、動物の体重１ｋｇあたりの治療剤５ｍｇに相当する（５ｍｇ／ｋｇ）。１００μｌの体積をマウスに注射する。対照として、ＰＢＳ及びＦｃの注射を使用する。実施例１に記載したように、毎日１回、マウスを観察し、平均関節炎スコアを算出する。
平均関節炎スコアが１以上であるマウスに対して、さらに３日間、ＰＥＧｓＴＮＦＲ−１ ２．６Ｄ １００μｇ、ＣＴＬＡ４−Ｆｃ １００μｇ、又はＰＥＧｓＴＮＦＲ−１ ２．６Ｄ及びＣＴＬＡ４−Ｆｃ 各１００μｇの維持量で注射を行い第２回目の処置を行う。
第２回目の処置後、マウスの関節炎スコアが１以上である場合は必ず、３日間の維持量による処置を繰り返す。実験期間中、必要な限り、維持量による処置を繰り返す。
実験を２ヶ月間継続する。
関節炎発症性Ｂ１０．ＲＩＩＩマウスにおける、エタナーセプト及びＣＴＬＡ４−Ｆｃを用いた併用療法
以下は、エタナーセプト及びＣＴＬＡ４−Ｆｃを併用した治療が、ＣＴＬＡ４−Ｆｃ単独又はエタナーセプト単独の場合と比較して、長期にわたりコラーゲン誘発性関節炎を緩和するという、机上の実施例である。エタナーセプトは、Ｅｎｂｒｅｌ（Ｒ）という商標で市販されている。
マウスにおける治療
実施例１に記載したようにして、ブタタイプＩＩコラーゲンを注射して、Ｂ１０．ＲＩＩＩマウスに関節炎を誘発する。
注射前に、マウスＣＴＬＡ４−ＦｃをＰＢＳに懸濁し、エタナーセプトをＰＢＳに懸濁した。疾患の臨床的発症後第０、＋１、＋２、＋４、＋６、＋８及び＋１０日に、エタナーセプト １００μｇ、マウスＣＴＬＡ４−Ｆｃ １００μｇ、又はエタナーセプト及びマウスＣＴＬＡ４−Ｆｃ 各１００μｇをマウスに注射することにより投与する。１００μｇは、動物の体重１ｋｇあたりの治療剤５ｍｇに相当する（５ｍｇ／ｋｇ）。１００μｌの体積をマウスに注射する。対照として、ＰＢＳ及びヒトＩｇＧ１ Ｆｃ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ａｍｇｅｎ，Ｔｈｏｕｓａｎｄ Ｏａｋｓ，ＣＡ）の注射を使用する。実施例１に記載するように、毎日１回、マウスの平均関節炎スコアを評価する。
疾患の臨床的発症後、４０日間、実験を継続する。
図１は、コラーゲン誘発性関節炎（ＣＩＡ）動物における、ＩＬ−１阻害剤（ＫＩＮ２）（配列番号３）、マウスＣＴＬＡ４−Ｆｃ融合タンパク質及びそれらの組み合わせを用いて行った治療中及び治療後の平均関節炎スコアを示す。矢印は、疾患発症後第０、＋１、＋２、＋４、＋６、＋８及び＋１０日に、ＫＩＮ２ １００μｇ、１００μｇのマウスＣＴＬＡ４−Ｆｃ、又はＫＩＮ２及びマウスＣＴＬＡ４−Ｆｃ各１００μｇを動物に注射して投与を行ったことを示す。１００μｇは、動物の体重１ｋｇあたりの治療剤５ｍｇに相当する（５ｍｇ／ｋｇ）。リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を対照として用いた。エラーバーは、平均からの標準誤差を示す。 図２は、ＣＩＡ動物における、ＴＮＦ−アルファ阻害剤（ＰＥＧｓＴＮＦＲ−１２．６Ｄ）、マウスＣＴＬＡ４−Ｆｃ融合タンパク質及びそれらの組み合わせを用いた治療中及び治療後の平均関節炎スコアを示す。矢印は、疾患発症後第０、＋１、＋２、＋４、＋６、＋８及び＋１０日に、ＰＥＧｓＴＮＦＲ−１ ２．６Ｄ １００μｇ又は、１００μｇのマウスＣＴＬＡ４−Ｆｃ、又はＰＥＧｓＴＮＦＲ−１ ２．６Ｄ及びマウスＣＴＬＡ４−Ｆｃ各１００μｇを動物に注射して投与したことを示す。１００μｇは、動物の体重１ｋｇあたりの治療剤５ｍｇに相当する（５ｍｇ／ｋｇ）。リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）及びＦｃを対照として用いた。 図３Ａ及び図３Ｂは、図２で示す実験終了から１０日後に採取した血清試料中に存在するタイプＩＩコラーゲン（ＣＩＩ）特異的抗体レベルを示す。（Ａ）ＩｇＧ１抗体レベル；（Ｂ）ＩｇＧ２ｂ抗体レベル。実施例２で述べるようにして抗体をアッセイした。 図３Ａ及び図３Ｂは、図２で示す実験終了から１０日後に採取した血清試料中に存在するタイプＩＩコラーゲン（ＣＩＩ）特異的抗体レベルを示す。（Ａ）ＩｇＧ１抗体レベル；（Ｂ）ＩｇＧ２ｂ抗体レベル。実施例２で述べるようにして抗体をアッセイした。 図４は、ＩＬ−１ｒａ、ｓ−ＴＮＦＲＩ（配列番号４）及び／又はＣＴＬＡ−４（配列番号２）を発現するベクターで改変した、ＣＩＡオスＢ１０．ＲＩＩＩマウスにおける、平均関節炎スコアを示す。ブタ タイプＩＩコラーゲンで追加免疫してから１９日後に、マウスに対して、ＩＬ−１ｒａ、ｓ−ＴＮＦＲＩ、ＣＴＬＡ−４をコードするウイルスベクター、又は対照としてβ−ガラクトシダーゼをコードするウイルスベクターを投与した。併用療法の場合は、ＩＬ−１ｒａ及びＣＴＬＡ−４ベクターの両方、ｓ−ＴＮＦＲＩ及びＣＴＬＡ−４ベクターの両方、又はＩＬ−１ｒａ及びｓ−ＴＮＦＲＩベクターの両方をマウスに投与した。 図５は、図４と同じ群における関節炎のパーセント発生率を示す。 図６は、図４と同じ群から採取した血液に存在するタイプＩＩコラーゲン（ＣＩＩ）特異的抗体のレベルを示す。ブタタイプＩＩコラーゲンで追加免疫してから数週間後に、マウスから血液を採取し、実施例３に記載するようにして抗体をアッセイした。 図７は、ＡＧＰ３ぺプチボディ（ＡＧＰ３ タンデム２量体ペプチド−Ｆｃ融合）（「ＡＧＰ３Ｐｂ」）（配列番号１２）１００μｇ、マウスＣＴＬＡ４−Ｆｃ ５０μｇ、又はＡＧＰ３Ｐｂ １００μｇとマウスＣＴＬＡ４−Ｆｃ ５０μｇとの組み合わせ物を、２ヶ月にわたり、週に３回注射した、６ヶ月齢の（ＮＺＢｘＮＺＷ）Ｆ１マウスのパーセント生存率を示す。１００μｇは、動物の体重１ｋｇあたりの治療剤４ｍｇ（４ｍｇ／Ｋｇ）に相当する。５０μｇは、動物の体重１ｋｇあたりの治療剤２ｍｇ（２ｍｇ／Ｋｇ）に相当する。Ｆｃ及びＰＢＳを対照として用いた。 図８は、図７の治療群における、蛋白尿が３００ｍｇ／ｄｌを超えるマウスの割合を示す。Ａｌｂｕｓｔｉｘ（Ｒ）市販アッセイ（Ｂａｙｅｒ ＡＧ）を用いて３０日ごとに、狼瘡傾向のマウスの蛋白尿を調べた。 図９Ａ及び図９Ｂは、図７で示した治療群のマウス末梢血液中のＢ２２０−陽性Ｂ細胞の割合を示す。Ｂ２２０陽性Ｂ細胞は、ＦＡＣＳ染色により調べた。（Ａ）治療期間の最後に、末梢血液中のＢ２２０＋細胞の割合を調べた。（Ｂ）治療期間終了から１ヵ月後に末梢血液中のＢ２２０＋細胞の割合を調べた。 図９Ａ及び図９Ｂは、図７で示した治療群のマウス末梢血液中のＢ２２０−陽性Ｂ細胞の割合を示す。Ｂ２２０陽性Ｂ細胞は、ＦＡＣＳ染色により調べた。（Ａ）治療期間の最後に、末梢血液中のＢ２２０＋細胞の割合を調べた。（Ｂ）治療期間終了から１ヵ月後に末梢血液中のＢ２２０＋細胞の割合を調べた。 図１０は、ＡＧＰ３ Ｐｂ（ＡＧＰ３タンデム２量体ペプチド−Ｆｃ融合物）、マウスＣＴＬＡ４−Ｆｃ又はそれらの組み合わせ物の何れかを用いた初回治療から３０、６０及び９０日後に回収した血清中のＩｇＧ特異的２本鎖ＤＮＡレベルの変化を示す。ｄｓＤＮＡ抗体レベルの変化は、３０日、６０日、９０日の抗体レベルを、全１０匹のマウスに対する治療前０日の抗体レベルで割ることにより調べた（平均＋／−標準誤差）。これらの日に血清を回収し、実施例４に記載するようにしてＥＬＩＳＡ法によりｄｓＤＮＡ抗体レベルを測定した。 図１１は、ＡＧＰ３ Ｐｂ（ＡＧＰ３タンデム２量体ペプチド−Ｆｃ融合物）、マウスＣＴＬＡ４−Ｆｃ又はそれらの組み合わせ物の何れかを用いた初回治療から３０、６０及び９０日後に回収した血清におけるＩｇＭ特異的２本鎖ＤＮＡレベルの変化を示す。ＩｇＭ特異的ｄｓＤＮＡを検出したこと以外は実施例１０で述べるようにして、ｄｓＤＮＡレベル及びｄｓＤＮＡ抗体レベルの変化を調べた。 図１２は、ＴＮＦ−アルファ阻害剤（ＰＥＧｓＴＮＦＲ−１ ２．６Ｄ）、ＡＧＰ３ Ｐｂ（ＡＧＰ３タンデム２量体ペプチド−Ｆｃ融合物）及びそれらの組み合わせを用いて行った治療中及び治療後のＣＩＡ動物における平均関節炎スコアを示す。疾患発症後第０、＋１、＋２、＋４、＋６、＋８及び＋１０日に、ＰＥＧｓＴＮＦＲ−１ ２．６Ｄ １００μｇ又は、１００μｇのＡＧＰ３ Ｐｂ、又はＰＥＧｓＴＮＦＲ−１ ２．６Ｄ及びＡＧＰ３ Ｐｂ各１００μｇを動物に対して投与した。１００μｇは、動物の体重１ｋｇあたりの治療剤５ｍｇに相当する（５ｍｇ／ｋｇ）。リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）及びＦｃを対照として用いた。 図１３は、ＩＬ−１阻害剤（ＫＩＮ２）、ＡＧＰ３ Ｐｂ（ＡＧＰ３タンデム２量体ペプチド−Ｆｃ融合）配列番号３）及びそれらの組み合わせを用いて行った治療中及び治療後のＣＩＡ動物における平均関節炎スコアを示す。疾患発症後第０、＋１、＋２、＋４、＋６、＋８及び＋１０日に、ＫＩＮ２ １００μｇ、１００μｇのＡＧＰ３ Ｐｂ、又はＫＩＮ２及びＡＧＰ３ Ｐｂ各１００μｇを注射により動物に投与した。１００μｇは、動物の体重１ｋｇあたりの治療剤５ｍｇに相当する（５ｍｇ／ｋｇ）。リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）及びＦｃを対照として用いた。 図１４は、ＫＩＮ２、ＰＥＧｓＴＮＦＲ−１ ２．６Ｄ、抗−ＯＸ４０Ｌ抗体、抗−ＯＸ４０Ｌ抗体とＫＩＮ２との組み合わせ、及び抗−ＯＸ４０Ｌ抗体とＰＥＧｓＴＮＦＲ−１ ２．６Ｄとの組み合わせを用いた治療中及び治療後のＣＩＡ動物における平均関節炎スコアを示す。疾患発症後第０、＋１、＋２、＋４、＋６、＋８及び＋１０日に、ＫＩＮ２ １００μｇ、ＰＥＧｓＴＮＦＲ−１ ２．６Ｄ １００μｇ、抗−ＯＸ４０Ｌ抗体１００μｇ、ＫＩＮ２及び抗−ＯＸ４０Ｌ抗体各１００μｇ、又はＰＥＧｓＴＮＦＲ−１ ２．６Ｄ及び抗−ＯＸ４０Ｌ抗体各１００μｇを注射により動物に投与した。１００μｇは、動物の体重１ｋｇあたりの治療剤５ｍｇに相当する（５ｍｇ／ｋｇ）。リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）及びラットＩｇＧを対照として用いた。 図１５は、尿中のタンパク質が１００ｍｇ／ｄｌを超えるという基準でプレスクリーニングした６ヶ月齢の（ＮＺＢｘＮＺＷ）Ｆ１マウスのパーセント生存率を示す。週に３回、２ヶ月にわたり、ＡＧＰ３Ｐｂ（ＡＧＰ３ タンデム２量体ペプチド−Ｆｃ融合物）１００μｇ、マウスＣＴＬＡ４−Ｆｃ ５０μｇ、又はＡＧＰ３Ｐｂ １００μｇとマウスＣＴＬＡ４−Ｆｃ ５０μｇとを組み合わせて、プレスクリーニングしたマウスに注射した。１００μｇは、動物の体重１ｋｇあたりの治療剤４ｍｇ（４ｍｇ／Ｋｇ）に相当する。５０μｇは、動物の体重１ｋｇあたりの治療剤２ｍｇ（２ｍｇ／Ｋｇ）に相当する。Ｆｃ及びＰＢＳを対照として用いた。 図１６は、尿中のタンパク質が１００ｍｇ／ｄｌを超えるという基準でプレスクリーニングした（ＮＺＢｘＮＺＷ）Ｆ１マウスにおける、蛋白尿の重症度を示す。週に３回、１２週間にわたり、ＡＧＰ３Ｐｂ（ＡＧＰ３ タンデム２量体ペプチド−Ｆｃ融合物）１００μｇ、マウスＣＴＬＡ４−Ｆｃ ５０μｇ、又はＡＧＰ３Ｐｂ １００μｇとマウスＣＴＬＡ４−Ｆｃ ５０μｇとを組み合わせて、プレスクリーニングしたマウスに注射した。１００μｇは、動物の体重１ｋｇあたりの治療剤４ｍｇ（４ｍｇ／Ｋｇ）に相当する。５０μｇは、動物の体重１ｋｇあたりの治療剤２ｍｇ（２ｍｇ／Ｋｇ）に相当する。Ｆｃ及びＰＢＳを対照として用いた。Ａｌｂｕｓｔｉｘ（Ｒ）市販アッセイ（Ｂａｙｅｒ ＡＧ）を用いて毎週、マウスの蛋白尿を調べた。 図１７は、尿中のタンパク質が３００ｍｇ／ｄｌを超えるという基準でプレスクリーニングした（ＮＺＢｘＮＺＷ）Ｆ１マウスのパーセント生存率を示す。週に３回、２ヶ月にわたり、ＡＧＰ３Ｐｂ（ＡＧＰ３ タンデム２量体ペプチド−Ｆｃ融合物）１００μｇ、マウスＣＴＬＡ４−Ｆｃ ５０μｇ、又はＡＧＰ３Ｐｂ １００μｇとマウスＣＴＬＡ４−Ｆｃ ５０μｇとを組み合わせて、プレスクリーニングしたマウスに注射した。１００μｇは、動物の体重１ｋｇあたりの治療剤４ｍｇ（４ｍｇ／Ｋｇ）に相当する。５０μｇは、動物の体重１ｋｇあたりの治療剤２ｍｇ（２ｍｇ／Ｋｇ）に相当する。Ｆｃ及びＰＢＳを対照として用いた。 図１８は、尿中のタンパク質が３００ｍｇ／ｄｌを超えるという基準でプレスクリーニングした（ＮＺＢｘＮＺＷ）Ｆ１マウスにおける、蛋白尿の重症度を示す。週に３回、３６週間にわたり、ＡＧＰ３Ｐｂ（ＡＧＰ３ タンデム２量体ペプチド−Ｆｃ融合物）１００μｇ、マウスＣＴＬＡ４−Ｆｃ ５０μｇ、又はＡＧＰ３Ｐｂ １００μｇとマウスＣＴＬＡ４−Ｆｃ ５０μｇとを組み合わせて、プレスクリーニングしたマウスに注射した。１００μｇは、動物の体重１ｋｇあたりの治療剤４ｍｇ（４ｍｇ／Ｋｇ）に相当する。５０μｇは、動物の体重１ｋｇあたりの治療剤２ｍｇ（２ｍｇ／Ｋｇ）に相当する。Ｆｃ及びＰＢＳを対照として用いた。Ａｌｂｕｓｔｉｘ（Ｒ）市販アッセイ（Ｂａｙｅｒ ＡＧ）を用いて毎週、マウスの蛋白尿を調べた。 図１９は、ＡＧＰ３ぺプチボディアミノ酸配列（配列番号１）を示す。 図２０は、ヒトＣＴＬ４アミノ酸配列（配列番号２）を示す。 図２１は、ＫＩＮ２（ＦｃＩＬ−１ｒａ）ヌクレオチド（配列番号５）及び対応するアミノ酸配列（配列番号３）を示す。 図２２は、ｓＴＮＦＲ−Ｉヌクレオチド（配列番号６）及び対応するアミノ酸配列（配列番号４）を示す。 図２３は、ＩＬ−１受容体アミノ酸配列（配列番号７）を示す。 図２４は、ＴＮＦＲ−Ｉアミノ酸配列（配列番号８）を示す。 図２５は、ＴＮＦＲ−ＩＩアミノ酸配列（配列番号９）を示す。 図２６は、ＣＤ４０アミノ酸配列（配列番号１０）を示す。 図２７は、ＣＤ３０アミノ酸配列（配列番号１１）を示す。 図２８は、ＩＣＯＳアミノ酸配列（配列番号１２）を示す。 図２９は、ＣＤ２８アミノ酸配列（配列番号１３）を示す。 図３０は、ＯＸ４０アミノ酸配列（配列番号１４）を示す。 図３１は、４−１−ＢＢアミノ酸配列（配列番号１５）を示す。 図３２は、ＣＤ２７アミノ酸配列（配列番号１６）を示す。 図３３は、ＩＬ−１８受容体アミノ酸配列（配列番号１７）を示す。 図３４は、ＰＤ−１アミノ酸配列（配列番号１８）を示す。 図３５は、ラットＴＮＦＲ−Ｉアミノ酸配列（配列番号２１）を示す。 図３６は、マウスＣＴＬＡ４アミノ酸配列（配列番号１９）を示す。 図３７は、ＴＡＣＩアミノ酸配列（配列番号２７）を示す。
【配列表】
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Claims (165)

  1. 治療上有効な量の、ＩＬ−１阻害剤と、Ｂ７阻害剤及びＣＤ２８阻害剤のうち少なくとも１つとを投与することを含む、ＩＬ−１介在疾患の治療方法。
  2. 前記ＩＬ−１阻害剤が、ＩＬ−１ｒａポリペプチドを含む、請求項１に記載の方法。
  3. 前記ＩＬ−１阻害剤が、ヒト免疫グロブリン定常領域に融合したＩＬ−１ｒａポリペプチドを含む、請求項１に記載の方法。
  4. 前記ＩＬ−１阻害剤が、ＩＬ−１受容体に対する抗体を含む、請求項１に記載の方法。
  5. 前記ＩＬ−１阻害剤が、ＩＬ−１βに対する抗体を含む、請求項１に記載の方法。
  6. 前記ＩＬ−１阻害剤が、Ｆｃ ＩＬ−１ｒａを含む、請求項１に記載の方法。
  7. 前記ＩＬ−１阻害剤が、配列番号３のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
  8. 前記ＩＬ−１阻害剤が、アナキンラを含む、請求項１に記載の方法。
  9. 前記Ｂ７阻害剤が、Ｂ７のＣＤ２８との結合を妨害する、請求項１から８の何れか一項に記載の方法。
  10. 前記ＣＤ２８阻害剤が、Ｂ７のＣＤ２８との結合を妨害する、請求項１から８の何れか一項に記載の方法。
  11. 前記Ｂ７阻害剤及び前記ＣＤ２８阻害剤のうち少なくとも１つが、ＣＴＬＡ４、ＣＴＬＡ４−Ｆｃ、アンタゴニストＣＤ２８抗体及びアンタゴニストＢ７抗体のうち少なくとも１つから選択される、請求項１から８の何れか一項に記載の方法。
  12. 前記Ｂ７阻害剤及び前記ＣＤ２８阻害剤のうち少なくとも１つが、配列番号２のアミノ酸配列を含む、請求項１から８の何れか一項に記載の方法。
  13. 前記ＩＬ−１介在疾患が、関節リウマチ、乾癬性関節炎、全身性エリテマトーデス、移植片拒絶、乾癬及び炎症性腸疾患から選択される、請求項１に記載の方法。
  14. 前記投与を少なくとも１日中断し、その後再開する、請求項１に記載の方法。
  15. 再発性の炎症又は自己免疫症状を治療するために前記投与を再開する、請求項１４に記載の方法。
  16. 治療上有効な量の、ＴＮＦ−α阻害剤と、Ｂ７阻害剤及びＣＤ２８阻害剤のうち少なくとも１つとを投与することを含む、ＴＮＦ−α介在疾患の治療方法。
  17. 前記ＴＮＦ−α阻害剤が、Ｆｃ領域に連結されたｓＴＮＦＲ−Ｉ、Ｆｃ領域に連結されたｓＴＮＦＲ−ＩＩ及びＦｃ領域に連結されたｓＴＮＦＲ−Ｉ若しくはｓＴＮＦＲ−ＩＩの断片のうち少なくとも１つから選択される、請求項１６に記載の方法。
  18. 前記ＴＮＦ−α阻害剤が、３０ｋＤ ＰＥＧｓＴＮＦＲ−Ｉを含む、請求項１６に記載の方法。
  19. 前記ＴＮＦ−α阻害剤が、２．６Ｄ ｓＴＮＦＲ−Ｉ断片を含む、請求項１６に記載の方法。
  20. 前記２．６Ｄ ｓＴＮＦＲ−Ｉ断片が、３０ｋＤ ＰＥＧを含む、請求項１９に記載の方法。
  21. 前記ＴＮＦ−α阻害剤が、Ｆｃ領域に連結されたｓＴＮＦＲ−ＩＩを含む、請求項１６に記載の方法。
  22. 前記ＴＮＦ−α阻害剤が、エタナーセプト、インフレキシマブ及びＤ２Ｅ７のうち少なくとも１つから選択される、請求項１６に記載の方法。
  23. 前記ＴＮＦ−α阻害剤が、配列番号４のアミノ酸配列を含む、請求項１６に記載の方法。
  24. 前記ＴＮＦ−α阻害剤が、ＰＥＧｓＴＮＦＲ−１を含む、請求項１６に記載の方法。
  25. 前記Ｂ７阻害剤が、Ｂ７のＣＤ２８との結合を妨害する、請求項１６から２４の何れか一項に記載の方法。
  26. 前記ＣＤ２８阻害剤が、Ｂ７のＣＤ２８との結合を妨害する、請求項１６から２４の何れか一項に記載の方法。
  27. 前記Ｂ７阻害剤及び前記ＣＤ２８阻害剤のうち少なくとも１つが、ＣＴＬＡ４、ＣＴＬＡ４−Ｆｃ、アンタゴニストＣＤ２８抗体及びアンタゴニストＢ７抗体のうち少なくとも１つから選択される、請求項１６から２４の何れか一項に記載の方法。
  28. 前記Ｂ７阻害剤及び前記ＣＤ２８阻害剤のうち少なくとも１つが、配列番号２のアミノ酸配列を含む、請求項１６から２４の何れか一項に記載の方法。
  29. 治療する前記ＴＮＦ−α介在疾患が、関節リウマチ、乾癬性関節炎、全身性エリテマトーデス、移植片拒絶、乾癬及び炎症性腸疾患から選択される、請求項１６に記載の方法。
  30. 前記投与を少なくとも１日中断し、その後再開する、請求項１６に記載の方法。
  31. 再発性の炎症又は自己免疫症状を治療するために前記投与を再開する、請求項３０に記載の方法。
  32. 治療上有効な量の、ＩＬ−１阻害剤と、Ｂ７阻害剤及びＣＤ２８阻害剤のうち少なくとも１つとを投与することを含む、炎症又は自己免疫症状の治療方法。
  33. 前記ＩＬ−１阻害剤が、ＩＬ−１ｒａポリペプチドを含む、請求項３２に記載の方法。
  34. 前記ＩＬ−１阻害剤が、ヒト免疫グロブリン定常領域に融合したＩＬ−１ｒａポリペプチドを含む、請求項３２に記載の方法。
  35. 前記ＩＬ−１阻害剤が、ＩＬ−１受容体に対する抗体を含む、請求項３２に記載の方法。
  36. 前記ＩＬ−１阻害剤が、ＩＬ−１βに対する抗体を含む、請求項３２に記載の方法。
  37. 前記ＩＬ−１阻害剤が、Ｆｃ ＩＬ−１ｒａを含む、請求項３２に記載の方法。
  38. 前記ＩＬ−１阻害剤が、配列番号３のアミノ酸配列を含む、請求項３２に記載の方法。
  39. 前記ＩＬ−１阻害剤が、アナキンラを含む、請求項３２に記載の方法。
  40. 前記Ｂ７阻害剤が、Ｂ７のＣＤ２８との結合を妨害する、請求項３２から３９の何れか一項に記載の方法。
  41. 前記ＣＤ２８阻害剤が、Ｂ７のＣＤ２８との結合を妨害する、請求項３２から３９の何れか一項に記載の方法。
  42. 前記Ｂ７阻害剤及び前記ＣＤ２８阻害剤のうち少なくとも１つが、ＣＴＬＡ４、ＣＴＬＡ４−Ｆｃ、アンタゴニストＣＤ２８抗体及びアンタゴニストＢ７抗体の少なくとも１つから選択される、請求項３２から３９の何れか一項に記載の方法。
  43. 前記Ｂ７阻害剤及び前記ＣＤ２８阻害剤のうち少なくとも１つが、配列番号２のアミノ酸配列を含む、請求項３２から３９の何れか一項に記載の方法。
  44. 治療を行う前記症状が、関節リウマチ、乾癬性関節炎、全身性エリテマトーデス、移植片拒絶、乾癬及び炎症性腸疾患から選択される、請求項３２に記載の方法。
  45. 前記投与を少なくとも１日中断し、その後再開する、請求項３２に記載の方法。
  46. 再発性の炎症又は自己免疫症状を治療するために前記投与を再開する、請求項４５に記載の方法。
  47. 治療上有効な量の、ＴＮＦ−α阻害剤と、Ｂ７阻害剤及びＣＤ２８阻害剤のうち少なくとも１つとを投与することを含む、炎症又は自己免疫症状の治療方法。
  48. 前記ＴＮＦ−α阻害剤が、Ｆｃ領域に連結されたｓＴＮＦＲ−Ｉ、Ｆｃ領域に連結されたｓＴＮＦＲ−ＩＩ及びＦｃ領域に連結されたｓＴＮＦＲ−Ｉ若しくはｓＴＮＦＲ−ＩＩの断片、のうち少なくとも１つから選択される、請求項４７に記載の方法。
  49. 前記ＴＮＦ−α阻害剤が、３０ｋＤ ＰＥＧｓＴＮＦＲ−Ｉを含む、請求項４７に記載の方法。
  50. 前記ＴＮＦ−α阻害剤が、２．６Ｄ ｓＴＮＦＲ−Ｉ断片を含む、請求項４７に記載の方法。
  51. 前記２．６Ｄ ｓＴＮＦＲ−Ｉ断片が、３０ｋＤ ＰＥＧを含む、請求項５０に記載の方法。
  52. 前記ＴＮＦ−α阻害剤が、Ｆｃ領域に連結されたｓＴＮＦＲ−ＩＩが含まれる、請求項４７に記載の方法。
  53. 前記ＴＮＦ−α阻害剤が、エタナーセプト、インフレキシマブ及びＤ２Ｅ７のうち少なくとも１つから選択される、請求項４７に記載の方法。
  54. 前記ＴＮＦ−α阻害剤が、配列番号４のアミノ酸配列を含む、請求項４７に記載の方法。
  55. 前記ＴＮＦ−α阻害剤が、ＰＥＧｓＴＮＦＲ−１を含む、請求項４７に記載の方法。
  56. 前記Ｂ７阻害剤が、Ｂ７のＣＤ２８との結合を妨害する、請求項４７から５５の何れか一項に記載の方法。
  57. 前記ＣＤ２８阻害剤が、Ｂ７のＣＤ２８との結合を妨害する、請求項４７から５５の何れか一項に記載の方法。
  58. 前記Ｂ７阻害剤及び前記ＣＤ２８阻害剤のうち少なくとも１つが、ＣＴＬＡ４、ＣＴＬＡ４−Ｆｃ、アンタゴニストＣＤ２８抗体及びアンタゴニストＢ７抗体のうち少なくとも１つから選択される、請求項４７から５５の何れか一項に記載の方法。
  59. 前記Ｂ７阻害剤及び前記ＣＤ２８阻害剤のうち少なくとも１つが、配列番号２のアミノ酸配列を含む、請求項４７から５５の何れか一項に記載の方法。
  60. 治療を行う前記症状が、関節リウマチ、乾癬性関節炎、全身性エリテマトーデス、移植片拒絶、乾癬及び炎症性腸疾患から選択される、請求項４７に記載の方法。
  61. 前記投与を少なくとも１日中断し、その後再開する、請求項４７に記載の方法。
  62. 再発性の炎症又は自己免疫症状を治療するために前記投与を再開する、請求項６１に記載の方法。
  63. 治療上有効な量の、（ｉ）ＡＧＰ３阻害剤、ＢＡＦＦＲ阻害剤及びＴＡＣＩ阻害剤のうち少なくとも１つと、（ｉｉ）Ｂ７阻害剤及びＣＤ２８阻害剤のうち少なくとも１つとを投与することを含む、炎症又は自己免疫症状の治療方法。
  64. 前記ＡＧＰ３阻害剤が、ＡＧＰ３のＢＡＦＦＲ及びＴＡＣＩとの結合を妨害する、請求項６３に記載の方法。
  65. ＢＡＦＦＲ阻害剤及びＴＡＣＩ阻害剤を含み、前記ＢＡＦＦＲ阻害剤及び前記ＴＡＣＩ阻害剤が、ＡＧＰ３のＢＡＦＦＲ及びＴＡＣＩとの結合を妨害する、請求項６３に記載の方法。
  66. 前記ＡＧＰ３阻害剤、前記ＢＡＦＦＲ阻害剤及び前記ＴＡＣＩ阻害剤のうち少なくとも１つが、ＴＡＣＩ可溶性受容体分子を含む、請求項６３に記載の方法。
  67. 前記ＡＧＰ３阻害剤、前記ＢＡＦＦＲ阻害剤及び前記ＴＡＣＩ阻害剤のうち少なくとも１つが、ＡＧＰ３のペプチド阻害剤を含む、請求項６３に記載の方法。
  68. 前記ＡＧＰ３阻害剤、前記ＢＡＦＦＲ阻害剤及び前記ＴＡＣＩ阻害剤のうち少なくとも１つが、ＡＧＰ３ぺプチボディを含む、請求項６３に記載の方法。
  69. 前記ＡＧＰ３阻害剤、前記ＢＡＦＦＲ阻害剤及び前記ＴＡＣＩ阻害剤のうち少なくとも１つが、配列番号１でコードされるタンパク質を含む、請求項６３に記載の方法。
  70. 前記Ｂ７阻害剤が、Ｂ７のＣＤ２８との結合を妨害する、請求項６３から６９の何れか一項に記載の方法。
  71. 前記ＣＤ２８阻害剤が、Ｂ７のＣＤ２８との結合を妨害する、請求項６３から６９の何れか一項に記載の方法。
  72. 前記Ｂ７阻害剤及び前記ＣＤ２８阻害剤のうち少なくとも１つが、ＣＴＬＡ４、ＣＴＬＡ４−Ｆｃ、アンタゴニストＣＤ２８抗体及びアンタゴニストＢ７抗体のうち少なくとも１つから選択される、請求項６３から６９の何れか一項に記載の方法。
  73. 前記Ｂ７阻害剤及び前記ＣＤ２８阻害剤のうち少なくとも１つが、配列番号２のアミノ酸配列を含む、請求項６３から６９の何れか一項に記載の方法。
  74. 治療する前記症状が、関節リウマチ、乾癬性関節炎、全身性エリテマトーデス、移植片拒絶、乾癬及び炎症性腸疾患から選択される、請求項６３に記載の方法。
  75. 前記投与を少なくとも１日中断し、その後再開する、請求項６３に記載の方法。
  76. 再発性の炎症又は自己免疫症状を治療するために前記投与を再開する、請求項７５に記載の方法。
  77. 治療上有効な量の、ＩＬ−１阻害剤と、治療上有効な量のＴＮＦ−α阻害剤と、Ｂ７阻害剤及びＣＤ２８阻害剤のうち少なくとも１つとを投与することを含む、炎症又は自己免疫症状の治療方法。
  78. 前記ＴＮＦ−α阻害剤が、ｓＴＮＦＲ−Ｉ、ｓＴＮＦＲ−ＩＩ、ｓＴＮＦＲ断片及びｓＴＮＦＲ−Ｆｃのうち少なくとも１つを含む、請求項７７に記載の方法。
  79. 前記ＴＮＦ−α阻害剤が、３０ｋＤ ＰＥＧｓＴＮＦＲ−Ｉを含む、請求項７７に記載の方法。
  80. 前記ＴＮＦ−α阻害剤が、２．６Ｄ ｓＴＮＦＲ−Ｉ断片を含む、請求項７７に記載の方法。
  81. 前記２．６Ｄ ｓＴＮＦＲ−Ｉ断片が、３０ｋＤ ＰＥＧを含む、請求項８０に記載の方法。
  82. ＴＮＦ−α阻害剤が、Ｆｃ領域に連結したｓＴＮＦＲ−ＩＩを含む、請求項７７に記載の方法。
  83. 前記ＴＮＦ−α阻害剤が、エタナーセプト、インフレキシマブ及びＤ２Ｅ７から選択される、請求項７７に記載の方法。
  84. 治療する前記症状が、関節リウマチ、乾癬性関節炎、全身性エリテマトーデス、移植片拒絶、乾癬及び炎症性腸疾患から選択される、請求項７７に記載の方法。
  85. 前記投与を少なくとも１日中断し、その後再開する、請求項７７に記載の方法。
  86. 再発性の炎症又は自己免疫症状を治療するために前記投与を再開する、請求項８５に記載の方法。
  87. 治療上有効な量の、（ｉ）ＡＧＰ３阻害剤、ＢＡＦＦＲ阻害剤及びＴＡＣＩ阻害剤のうち少なくとも１つと、（ｉｉ）ＩＬ−１阻害剤とを投与することを含む、炎症又は自己免疫症状の治療方法。
  88. 前記ＩＬ−１阻害剤が、ＩＬ−１ｒａポリペプチドを含む、請求項８７に記載の方法。
  89. 前記ＩＬ−１阻害剤が、ヒトイムノグロブリン定常領域に融合したＩＬ−１ｒａポリペプチドを含む、請求項８７に記載の方法。
  90. 前記ＩＬ−１阻害剤が、ＩＬ−１受容体に対する抗体を含む、請求項８７に記載の方法。
  91. 前記ＩＬ−１阻害剤が、ＩＬ−１βに対する抗体を含む、請求項８７に記載の方法。
  92. 前記ＩＬ−１阻害剤が、Ｆｃ ＩＬ−１ｒａを含む、請求項８７に記載の方法。
  93. 前記ＩＬ−１阻害剤が、配列番号３のアミノ酸配列を含む、請求項８７に記載の方法。
  94. 前記ＩＬ−１阻害剤が、アナキンラを含む、請求項８７に記載の方法。
  95. 前記ＡＧＰ３阻害剤が、ＡＧＰ３のＢＡＦＦＲ及びＴＡＣＩとの結合を妨害する、請求項８７から９４の何れか一項に記載の方法。
  96. ＢＡＦＦＲ阻害剤及びＴＡＣＩ阻害剤を含み、前記ＢＡＦＦＲ阻害剤及び前記ＴＡＣＩ阻害剤が、ＡＧＰ３のＢＡＦＦＲ及びＴＡＣＩとの結合を妨害する、請求項８７から９４の何れか一項に記載の方法。
  97. 前記ＡＧＰ３阻害剤、前記ＢＡＦＦＲ阻害剤及び前記ＴＡＣＩ阻害剤のうち少なくとも１つが、ＴＡＣＩ可溶性受容体分子を含む、請求項８７から９４の何れか一項に記載の方法。
  98. 前記ＡＧＰ３阻害剤、前記ＢＡＦＦＲ阻害剤及び前記ＴＡＣＩ阻害剤のうち少なくとも１つが、ＡＧＰ３のペプチド阻害剤を含む、請求項８７から９４の何れか一項に記載の方法。
  99. 前記ＡＧＰ３阻害剤、前記ＢＡＦＦＲ阻害剤及び前記ＴＡＣＩ阻害剤のうち少なくとも１つが、ＡＧＰ３ぺプチボディを含む、請求項８７から９４の何れか一項に記載の方法。
  100. 前記ＡＧＰ３阻害剤、前記ＢＡＦＦＲ阻害剤及び前記ＴＡＣＩ阻害剤のうち少なくとも１つが配列番号１でコードされるタンパク質を含む、請求項８７から９４の何れか一項に記載の方法。
  101. 治療する前記症状が、関節リウマチ、乾癬性関節炎、全身性エリテマトーデス、移植片拒絶、乾癬及び炎症性腸疾患から選択される、請求項８７に記載の方法。
  102. 前記投与を少なくとも１日中断し、その後再開する、請求項８７に記載の方法。
  103. 再発性の炎症又は自己免疫症状を治療するために前記投与を再開する、請求項１０２に記載の方法。
  104. 治療上有効な量の、（ｉ）ＡＧＰ３阻害剤、ＢＡＦＦＲ阻害剤及びＴＡＣＩ阻害剤のうち少なくとも１つと、（ｉｉ）ＴＮＦ−α阻害剤とを投与することを含む、炎症又は自己免疫症状の治療方法。
  105. 前記ＴＮＦ−α阻害剤が、Ｆｃ領域に連結されたｓＴＮＦＲ−Ｉ、Ｆｃ領域に連結されたｓＴＮＦＲ−ＩＩ、及びＦｃ領域に連結されたｓＴＮＦＲ−Ｉ若しくはｓＴＮＦＲ−ＩＩの断片、の少なくとも１つから選択される、請求項１０４に記載の方法。
  106. 前記ＴＮＦ−α阻害剤が、３０ｋＤ ＰＥＧｓＴＮＦＲ−Ｉを含む、請求項１０４に記載の方法。
  107. 前記ＴＮＦ−α阻害剤が、２．６Ｄ ｓＴＮＦＲ−Ｉ断片を含む、請求項１０４に記載の方法。
  108. 前記２．６Ｄ ｓＴＮＦＲ−Ｉ断片が、３０ｋＤ ＰＥＧを含む、請求項１０４に記載の方法。
  109. 前記ＴＮＦ−α阻害剤が、Ｆｃ領域に連結されたｓＴＮＦＲ−ＩＩを含む、請求項１０４に記載の方法。
  110. 前記ＴＮＦ−α阻害剤が、エタナーセプト、インフレキシマブ及びＤ２Ｅ７のうち少なくとも１つから選択される、請求項１０４に記載の方法。
  111. 前記ＴＮＦ−α阻害剤が、配列番号４のアミノ酸配列を含む、請求項１０４に記載の方法。
  112. 前記ＴＮＦ−α阻害剤が、ＰＥＧｓＴＮＦＲ−１を含む、請求項１０４に記載の方法。
  113. 前記ＡＧＰ３阻害剤が、ＡＧＰ３のＢＡＦＦＲ及びＴＡＣＩとの結合を妨害する、請求項１０４から１１２の何れか一項に記載の方法。
  114. ＢＡＦＦＲ阻害剤及びＴＡＣＩ阻害剤を含み、前記ＢＡＦＦＲ阻害剤及び前記ＴＡＣＩ阻害剤が、ＡＧＰ３のＢＡＦＦＲ及びＴＡＣＩとの結合を妨害する、請求項１０４から１１２の何れか一項に記載の方法。
  115. 前記ＡＧＰ３阻害剤、前記ＢＡＦＦＲ阻害剤及び前記ＴＡＣＩ阻害剤のうち少なくとも１つが、ＴＡＣＩ可溶性受容体分子を含む、請求項１０４から１１２の何れか一項に記載の方法。
  116. 前記ＡＧＰ３阻害剤、前記ＢＡＦＦＲ阻害剤及び前記ＴＡＣＩ阻害剤のうち少なくとも１つが、ＡＧＰ３のペプチド阻害剤を含む、請求項１０４から１１２の何れか一項に記載の方法。
  117. 前記ＡＧＰ３阻害剤、前記ＢＡＦＦＲ阻害剤及び前記ＴＡＣＩ阻害剤のうち少なくとも１つが、ＡＧＰ３ぺプチボディを含む、請求項１０４から１１２の何れか一項に記載の方法。
  118. 前記ＡＧＰ３阻害剤、前記ＢＡＦＦＲ阻害剤及び前記ＴＡＣＩ阻害剤のうち少なくとも１つが、配列番号１でコードされるタンパク質を含む、請求項１０４から１１２の何れか一項に記載の方法。
  119. 治療する前記症状が、関節リウマチ、乾癬性関節炎、全身性エリテマトーデス、移植片拒絶、乾癬及び炎症性腸疾患から選択される、請求項１０４に記載の方法。
  120. 前記投与を少なくとも１日中断し、その後再開する、請求項１０４に記載の方法。
  121. 再発性の炎症又は自己免疫症状を治療するために前記投与を再開する、請求項１２０に記載の方法。
  122. 治療上有効な量のＴＮＦ−α阻害剤とＯＸ４０リガンド阻害剤とを投与することを含む、炎症又は自己免疫症状を治療する方法。
  123. 前記ＴＮＦ−α阻害剤が、Ｆｃ領域に連結されたｓＴＮＦＲ−Ｉ、Ｆｃ領域に連結されたｓＴＮＦＲ−ＩＩ、及びＦｃ領域に連結されたｓＴＮＦＲ−Ｉ若しくはｓＴＮＦＲ−ＩＩの断片、の少なくとも１つから選択される、請求項１２２に記載の方法。
  124. 前記ＴＮＦ−α阻害剤が、３０ｋＤ ＰＥＧｓＴＮＦＲ−Ｉを含む、請求項１２２に記載の方法。
  125. 前記ＴＮＦ−α阻害剤が、２．６Ｄ ｓＴＮＦＲ−Ｉ断片を含む、請求項１２２に記載の方法。
  126. 前記２．６Ｄ ｓＴＮＦＲ−Ｉ断片が、３０ｋＤ ＰＥＧを含む、請求項１２５に記載の方法。
  127. 前記ＴＮＦ−α阻害剤が、Ｆｃ領域に連結されたｓＴＮＦＲ−ＩＩを含む、請求項１２２に記載の方法。
  128. 前記ＴＮＦ−α阻害剤が、エタナーセプト、インフレキシマブ及びＤ２Ｅ７のうち少なくとも１つから選択される、請求項１２２に記載の方法。
  129. 前記ＴＮＦ−α阻害剤が、配列番号４のアミノ酸配列を含む、請求項１２２に記載の方法。
  130. 前記ＴＮＦ−α阻害剤が、ＰＥＧｓＴＮＦＲ−１を含む、請求項１２２に記載の方法。
  131. 前記ＯＸ４０リガンド阻害剤が、抗−ＯＸ１４０リガンド抗体である、請求項１２２から１３０の何れか一項に記載の方法。
  132. 治療する前記症状が、関節リウマチ、乾癬性関節炎、全身性エリテマトーデス、移植片拒絶、乾癬及び炎症性腸疾患から選択される、請求項１２２に記載の方法。
  133. 前記投与を少なくとも１日中断し、その後再開する、請求項１２２に記載の方法。
  134. 再発性の炎症又は自己免疫症状を治療するために前記投与を再開する、請求項１３３に記載の方法。
  135. 治療上有効な量のＩＬ−１阻害剤とＯＸ４０リガンド阻害剤とを投与することを含む、炎症又は自己免疫症状を治療する方法。
  136. 前記ＩＬ−１阻害剤がＩＬ−１ｒａポリペプチドを含む、請求項１３５に記載の方法。
  137. 前記ＩＬ−１阻害剤が、ヒト免疫グロブリン定常領域に融合したＩＬ−１ｒａポリペプチドを含む、請求項１３５に記載の方法。
  138. 前記ＩＬ−１阻害剤が、ＩＬ−１受容体に対する抗体を含む、請求項１３５に記載の方法。
  139. 前記ＩＬ−１阻害剤が、ＩＬ−１βに対する抗体を含む、請求項１３５に記載の方法。
  140. 前記ＩＬ−１阻害剤が、Ｆｃ ＩＬ−１ｒａを含む、請求項１３５に記載の方法。
  141. 前記ＩＬ−１阻害剤が、配列番号３のアミノ酸配列を含む、請求項１３５に記載の方法。
  142. 前記ＩＬ−１阻害剤が、アナキンラを含む、請求項１３５に記載の方法。
  143. 前記ＯＸ４０リガンド阻害剤が、抗−ＯＸ４０リガンド抗体である、請求項１３５から１４３の何れか一項に記載の方法。
  144. 治療する前記症状が、関節リウマチ、乾癬性関節炎、全身性エリテマトーデス、移植片拒絶、乾癬及び炎症性腸疾患から選択される、請求項１３５に記載の方法。
  145. 前記投与を少なくとも１日中断し、その後再開する、請求項１３５に記載の方法。
  146. 再発性の炎症又は自己免疫症状を治療するために前記投与を再開する、請求項１４５に記載の方法。
  147. 治療上有効な量の、ＩＬ−１阻害剤と、Ｂ７阻害剤及びＣＤ２８阻害剤のうち少なくとも１つとを投与することを含み、前記ＩＬ−１阻害剤と、前記Ｂ７阻害剤及びＣＤ２８阻害剤のうち少なくとも１つとが、治療開始時に所定の初期量で１ないし１０日間にわたって投与され、および１又は複数の所定の維持量で１ないし１０日間にわたって投与され、（ａ）初期量と第一の維持量との投与間隔が約１週間より長いか、（ｂ）何れか２つの維持量の投与間隔が約１週間より長いか、又は（ｃ）初期量と第一の維持量との投与間隔が約１週間より長く、且つ、何れか２つの維持量の投与間隔も約１週間より長い、ＩＬ−１介在疾患の治療方法。
  148. （ａ）初期量と第一の維持量との投与間隔が約２週間より長いか、（ｂ）何れか２つの維持量の投与間隔が約２週間より長いか、又は（ｃ）初期量と第一の維持量との投与間隔が約２週間より長く、且つ、何れか２つの維持量の投与間隔も約２週間より長いか、の何れかである、請求項１４７に記載の方法。
  149. （ａ）初期量と第一の維持量との投与間隔が約１ヶ月より長いか、（ｂ）何れか２つの維持量の投与間隔が約１ヶ月より長いか、又は（ｃ）初期量と第一の維持量との投与間隔が約１ヶ月よりも長く、且つ、何れか２つの維持量の投与間隔も約１ヶ月より長いか、の何れかである、請求項１４７に記載の方法。
  150. （ａ）初期量と第一の維持量との投与間隔が約２ヶ月より長いか、（ｂ）何れか２つの維持量の投与間隔が約２ヶ月より長いか、又は（ｃ）初期量と第一の維持量との投与間隔が約２ヶ月よりも長く、且つ、何れか２つの維持量の投与間隔も約２ヶ月より長いか、の何れかである、請求項１４７に記載の方法。
  151. （ａ）初期量と第一の維持量との投与間隔が約３ヶ月より長いか、（ｂ）何れか２つの維持量の投与間隔が約３ヶ月より長いか、又は（ｃ）初期量と第一の維持量との投与間隔が約３ヶ月よりも長く、且つ、何れか２つの維持量の投与間隔も約３ヶ月より長いか、の何れかである、請求項１４７に記載の方法。
  152. 前記ＩＬ−１阻害剤がＫＩＮ２であり、前記Ｂ７阻害剤がＣＴＬＡ−４Ｆｃを含む、請求項１４７の方法。
  153. 治療上有効量のＴＮＦ−α阻害剤と、Ｂ７阻害剤及びＣＤ２８阻害剤のうち少なくとも１つとを投与することを含み、前記ＴＮＦ−α阻害剤と、前記のＢ７阻害剤及びＣＤ２８阻害剤のうち少なくとも１つとが、治療開始時に１ないし１０日間にわたって所定の初期量で投与され、および１又は複数の所定の維持量で１ないし１０日間にわたって投与され、（ａ）初期量と第一の維持量との投与間隔が約１週間より長いか、（ｂ）何れか２つの維持量の投与間隔が約１週間より長いか、又は（ｃ）初期量と第一の維持量との投与間隔が約１週間よりも長く、且つ、何れか２つの維持量の投与間隔も約１週間より長い、ＴＮＦ介在疾患の治療方法。
  154. （ａ）初期量と第一の維持量との投与間隔が約２週間より長いか、（ｂ）何れか２つの維持量の投与間隔が約２週間より長いか、又は（ｃ）初期量と第一の維持量との投与間隔が約２週間よりも長く、且つ、何れか２つの維持量の投与間隔も約２週間より長いか、の何れかである、請求項１５３に記載の方法。
  155. （ａ）初期量と第一の維持量との投与間隔が約１ヶ月より長いか、（ｂ）何れか２つの維持量の投与間隔が約１ヶ月より長いか、又は（ｃ）初期量と第一の維持量との投与間隔が約１ヶ月よりも長く、且つ、何れか２つの維持量の投与間隔も約１ヶ月より長いか、の何れかである、請求項１５３に記載の方法。
  156. （ａ）初期量と第一の維持量との投与間隔が約２ヶ月より長いか、（ｂ）何れか２つの維持量の投与間隔が約２ヶ月より長いか、又は（ｃ）初期量と第一の維持量との投与間隔が約２ヶ月よりも長く、且つ、何れか２つの維持量の投与間隔も約２ヶ月より長いか、の何れかである、請求項１５３に記載の方法。
  157. （ａ）初期量と第一の維持量との投与間隔が約３ヶ月より長いか、（ｂ）何れか２つの維持量の投与間隔が約３ヶ月より長いか、又は（ｃ）初期量と第一の維持量との投与間隔が約３ヶ月よりも長く、且つ、何れか２つの維持量の投与間隔も約３ヶ月より長いか、の何れかである、請求項１５３に記載の方法。
  158. 前記ＴＮＦ−α阻害剤が、ＰＥＧ−ｓＴＮＦＲＩ ２．６Ｄを含み、Ｂ７阻害剤及びＣＤ２８阻害剤の少なくとも１つがＣＴＬＡ−４Ｆｃを含む、請求項１５３に記載の方法。
  159. 前記ＴＮＦ−α阻害剤がエタナーセプトを含み、Ｂ７阻害剤及びＣＤ２８阻害剤の少なくとも１つがＣＴＬＡ−４Ｆｃを含む、請求項１５３に記載の方法。
  160. 治療上有効量の（ｉ）ＡＧＰ３阻害剤、ＢＡＦＦＲ阻害剤及びＴＡＣＩ阻害剤のうち少なくとも１つと、（ｉｉ）Ｂ７阻害剤及びＣＤ２８阻害剤のうち少なくとも１つとを投与することを含み、前記ＡＧＰ３阻害剤、ＢＡＦＦＲ阻害剤及びＴＡＣＩ阻害剤のうち少なくとも１つと、前記Ｂ７阻害剤及びＣＤ２８阻害剤のうち少なくとも１つとが、治療開始時に１ないし１０日間にわたり所定の初期量で投与され、且つ１ないし１０日間にわたり１又は複数の所定の維持量で投与され、（ａ）初期量と第一の維持量との投与間隔が約１週間より長いか、（ｂ）何れか２つの維持量の投与間隔が約１週間より長いか、又は（ｃ）初期量と第一の維持量との投与間隔が約１週間より長く、且つ、何れか２つの維持量の投与間隔も約１週間より長い、炎症又は自己免疫症状の治療方法。
  161. （ａ）初期量と第一の維持量との投与間隔が約２週間より長いか、（ｂ）何れか２つの維持量の投与間隔が約２週間より長いか、又は（ｃ）初期量と第一の維持量との投与間隔が約２週間より長く、且つ、何れか２つの維持量の投与間隔も約２週間より長いか、の何れかである、請求項１６０に記載の方法。
  162. （ａ）初期量と第一の維持量との投与間隔が約１ヶ月より長いか、（ｂ）何れか２つの維持量の投与間隔が約１ヶ月より長いか、又は（ｃ）初期量と第一の維持量との投与間隔が約１ヶ月よりも長く、且つ、何れか２つの維持量の投与間隔も約１ヶ月より長いか、の何れかである、請求項１６０に記載の方法。
  163. （ａ）初期量と第一の維持量との投与間隔が約２ヶ月より長いか、（ｂ）何れか２つの維持量の投与間隔が約２ヶ月より長いか、又は（ｃ）初期量と第一の維持量との投与間隔が約２ヶ月よりも長く、且つ、何れか２つの維持量の投与間隔も約２ヶ月より長いか、の何れかである、請求項１６０に記載の方法。
  164. （ａ）初期量と第一の維持量との投与間隔が約３ヶ月より長いか、（ｂ）何れか２つの維持量の投与間隔が約３ヶ月より長いか、又は（ｃ）初期量と第一の維持量との投与間隔が約３ヶ月よりも長く、且つ、何れか２つの維持量の投与間隔も約３ヶ月より長いか、の何れかである、請求項１６０に記載の方法。
  165. ＡＧＰ３阻害剤、ＢＡＦＦＲ阻害剤及びＴＡＣＩ阻害剤のうち少なくとも１つが、ＡＧＰ３のペプチド阻害剤を含み、Ｂ７阻害剤及びＣＤ２８阻害剤の少なくとも１つがＣＴＬＡ−４Ｆｃを含む、請求項１６０に記載の方法。
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