MXPA05006523A - Procesos de cultivo de celulas de mamiferos para la produccion de proteinas. - Google Patents

Abstract

La presente invencion describe metodos y procesos para la produccion de proteinas, particularmente glicoproteinas, por celulas animales o cultivos celulares de mamifero, preferiblemente, pero no limitado a, cultivos celulares de lote alimentado. En un aspecto, los metodos comprenden al menos dos cambios de temperatura realizados durante el periodo de cultivo, en el cual la temperatura es menor al final del periodo de cultivo que al momento de iniciar el cultivo celular. A lo largo de su duracion, el proceso de cultivo celular de la invencion involucra dos o mas cambios de temperatura descendentes, sosteniendo una viabilidad celular alta, y puede permitir una concentracion final mejorada del producto de proteina y una alta calidad del producto de proteina como se determina por ejemplo, por el contenido de acido sialico de la proteina producida. En otro aspecto, los metodos comprenden la adicion retardada de compuesto polianionico durante el periodo de cultivo. La adicion retardada del compuesto polianionico sostiene una alta viabilidad de las celulas cultivadas, y puede prolongar la fase de crecimiento, retrasando el comienzo de la fase de muerte y suspender la fase muerte.

Description

PROCESOS DE CULTIVO DE CELULAS DE MAMÍFEROS PARA LA PRODUCCION DE PROTEÍNAS CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se refiere a nuevos métodos y procesos para cultivo celulars de mamíferos que producen un producto de proteína, preferiblemente un producto de proteína glicosilado. El desempeño de los métodos de cultivo celulars y los procesos resultan en una elevada viabilidad celular y también pueden resultar en una alta cantidad y calidad de producto, extensión de la fase de crecimiento, retardo en el comienzo de la fase de muerte y detención de la fase de muerte .

ANTECEDENTES DE LA INVENCION El cultivo celulars animales, notablemente cultivo celulars de mamíferos, se usa preferiblemente para la expresión de proteínas glicosiladas producidas recombinantemente para aplicaciones terapéuticas o profilácticas. Los patrones de glicosilación de las glicoproteínas recombinantes son importantes debido a que las cadenas laterales de oligosacáridos de las glicoproteínas afectan la función de proteína, así como las interacciones intramoleculares entre diferentes regiones de una proteína. Tales interacciones intramoleculares se involucran en la conformación de proteína y en la estructura terciaria de la glicoproteína. (Ver, por ejemplo, A. Wittwer et al., 1990, Biochemistry, 29:4175-4180; Hart, 1992, Curr. Op. Cell Biol., 4:1017-1023; Goochee et al., 1991, Bio/Technol . , 9:1347-1355; y R.B. Parekh, 1991, Curr. Op. Struct. Biol., 1:750-754). Además, los oligosacáridos pueden funcionar para dirigir un polipéptido particular a ciertas estructuras basadas en los receptores de carbohidratos celulares específicos. (M.P. Bevilacgua et al., 1993, J. Clin. Invest . , 91:379-387; R.M. Nelson et al., 1993, J. Clin. Invest., 91:1157-1166; K.E. Norgard et al., 1993, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 90:1068-1072; e Y. Imai et al., 1993, Nature, 361-555-557). El componente terminal de ácido siálico de una cadena lateral de oligosacáridos de glicoproteína se sabe que tiene un efecto en diversos aspectos y propiedades de una glicoproteína, incluyendo la absorción, solubilidad, estabilidad térmica, vida media de suero, depuración del suero, así como su estructura/comportamiento físico y químico y su inmunogenicidad. (A. Varki, 1993, Glycobiology, 3:97-100; R.B. Parekh, Id., Goochee et al., Id., J. Paulson et al., 1989, TIBS, 14:272-276; y A. obata, 1992, Eur. J. Biochem. , 209:483-501; E.Q. Lawson et al., 1983, Aren. Biochem. Biophys . , 220:572-575; y E. Tsuda et al., 1990, Eur. J. Biochem., 188:405-411). En general los niveles de expresión de proteínas en sistemas basados en el cultivo celulars de mamíferos, son considerablemente menores que en los sistemas de expresión microbianos, por ejemplo, los sistemas de expresión de bacterias o levaduras. Sin embargo, las células de bacterias y de levadura se limitan en su capacidad para expresar óptimamente los productos de proteínas de alto peso molecular para plegar adecuadamente una proteína que tenga una estructura estérica compleja, y/o para suministrar las modificaciones necesarias post-traduccionales para madurar una glicoproteína expresada, con lo cual se afecta la inmunogenicidad y tasa de depuración del producto. Como consecuencia de las limitaciones del cultivo de las células animales o de mamíferos, particularmente células de animales o de mamíferos que producen productos recombinantes , se ha investigado la manipulación de una diversidad de parámetros, incluyendo el empleo de recipientes de cultivo a gran escala; alterar las condiciones básicas de cultivo, tales como la temperatura de inoculación, concentración de oxígeno disuelto, pH y similares; el uso de diferentes tipos de medios y aditivos al medio; e incrementar la densidad de las células cultivadas. Además, el desarrollo de proceso para el cultivo celulars de mamífero se beneficiaría de los avances en la capacidad para extender los tiempos de corrida para incrementar la concentración final de producto mientras se mantiene una alta calidad de producto. Un parámetro de calidad de producto importante es el grado e integridad de la estructura de glicosilación de un producto de polipéptido, con un contenido de ácido siálico comúnmente utilizado como una medida de calidad de la glicoprotelna. Los tiempos de corrida de los procesos de cultivo celulars, particularmente los procesos no continuos, se limitan usualmente por la viabilidad remanente de las células lo cual declina típicamente con el curso de la corrida. Se desea por lo tanto, la extensión máxima posible de viabilidades elevadas de células. Las preocupaciones de calidad de producto también producen una motivación para minimizar las disminuciones en la densidad de células viables y mantener una elevada viabilidad celular, ya que la muerte celular puede liberar sialidasas al sobrenadante de cultivo, lo cual puede reducir el contenido de ácido siálico de la proteína expresada. Las preocupaciones sobre la purificación de proteína ofrecen todavía otra motivación para minimizar las disminuciones en densidad de células viables y mantener una alta viabilidad celular. La presencia de los desechos celulares y los contenidos de las células muertas en el cultivo pueden impactar negativamente la capacidad de aislar y/o purificar el producto de proteína al final de la corrida de cultivo. Al mantener las células viables por un periodo mayor de tiempo en cultivo, existe así una reducción concomitante en la contaminación en el medio de cultivo por proteínas y enzimas celulares, por ejemplo proteasas y sialidasas celulares, que pueden provocar la degradación y la reducción final en calidad de la glicoproteína deseada producida por las células . Se han investigado diversos parámetros para lograr una alta viabilidad celular en cultivos de células . Un parámetro involucra una disminución sencilla de la temperatura de cultivo que sigue a un cultivo inicial a 37°C (por ejemplo, Roessler et al., 1996, Enzyme and Microbial Technology, 18:423-427; Patente E.U.A. Nos. 5,705,364 y 5,721,121, para T. Etcheverry et al., 1998; Patente E.U.A. No. 5,976,833 para K. Furukawa et al., 1999; Patente E.U.A. No. 5,851,800 para L. Adamson et al.; WO 99/61650 y WO 00/65070 para Genentech, Inc.; WO 00/36092 para Biogen, Inc.; y Patente E.U.A. No. 4,357,422 para Girard et al.). Otros parámetros investigados involucran la adición de componentes al cultivo. La suramina inhibidora del factor de crecimiento se demuestra que evita la apoptosis durante el crecimiento exponencial de las células CHO KlrCycE (Zhangi et al., Biotechnol. Prog 2000, 16, 319-325). Sin embargo, la suramina no protegió contra la apoptosis durante la fase de muerte. Como resultado, la suramina pudo mantener una alta viabilidad durante la fase de crecimiento, pero no permitió una extensión de la longevidad del cultivo. Los mismos autores reportan que para la línea celular de CHO 111-10PF el sulfato de dextrano y el sulfato de polivinilo pueden, similarmente a la suramina, incrementar la densidad de células viables en el día 3 y la viabilidad relativa al cultivo de control. El efecto del sulfato de dextrano o el sulfato de polivinilo durante la fase de muerte no se reporta sin embargo. También se reportaron la suramina, sulfato de dextrano y sulfato de polivinilo por ser efectivos en evitar la agregación celular. La heparina se ha complementado a los medios de cultivo celulars animales con objeto de adaptar líneas celulares dependientes del anclaje a las condiciones de suspensión (por ejemplo, Patente E.U.A. No. 5,348,877 para McKenna and Granados, 1994) . La heparina también se conoce que se enlaza a factores de crecimiento tales como el factor de crecimiento del tipo EGF que se enlaza a la heparina (HB-EGF; Raab and lagsbrun, Biochim, Biophys . Acta 1997, 1333, F179-F199) . Los proteoglicanos de sulfato de heparano en la superficie celular (HSPG) según se dice mejoran el enlace y la bioactividad de HB-EGF para ciertos tipos de células, incluyendo las células CHO de tipo silvestre (Raab and klagsbrun, 1997) . [El sulfato de heparano solamente difiere de la heparina en que tiene menos grupos de sulfato N y O y más grupos N-acetilo (McKenna and Granados, 1994) . Para el propósito de esta descripción, la heparina y el sulfato de heparano se consideran equivalentes y se referirán genéricamente como heparina] . Se ha propuesto, para el factor de crecimiento de enlace de heparina FGF-2 que el enlace a HSPG incrementa la concentración local de FGF-2 en la superficie celular, lo cual a su vez incrementa la probabilidad del enlace de FGF-2 a los receptores de tirosina cinasa de las células. ( aab and Klagsbrun, 1997). Se ha demostrado que el polisulfato de pentosano puede bloquear la acción y los factores de crecimiento de enlace a la heparina en células cultivadas (Zugmaier et al., J. Nat. C ncer Inst. 1992, 84, 1716-1724. La literatura de patentes sobre el uso de sulfato de dextrano en cultivo celulars animales se refiere a la complementación de sulfato de dextrano a un medio con objeto de: 1) mejorar la tasa de crecimiento e incrementar el número de dobleces en la población antes de la senescencia de las células endoteliales humanas (Patente EUA No. 4,994,387 y 5,132,223 para Levine et al., 1991, 1992); 2) para incrementar el rendimiento de proteína recombinante en líneas celulares de mamíferos (Patente de EUA No. 5,318,898 para Israel, 1994) ; 3) para inducir la suspensión de células sencillas en líneas celulares de insecto (Patente de EUA No. 5,728,580 para Shuler and Dee, 1996); 4) para incrementar la actividad promotora del crecimiento del factor de crecimiento de hepatocitos humanos y suprimir su degradación (Patentes de EUA Nos. 5,545,722 y 5,736,506 para Naka, 1996 y 1998); 5) para incrementar la densidad celular viable y la expresión de proteína recombinante (WO 98/08934 para Gorfien et al., 1997) . En todos los casos reportados que se refieren a la presencia o complementación del sulfato de dextrano en un medio, el sulfato de dextrano estuvo presente a lo largo del tiempo de cultivo en ese medio dado. En ningún caso estuvieron reportados los beneficios de una adición retardada. Más aún, nunca ha sido reportado que el sulfato de dextrano pueda retrasar el comienzo de la fase de muerte, extender la fase de crecimiento o suspender la fase de muerte . Con una concentración creciente de producto en el cultivo, se puede observar en los procesos de cultivo celular que disminuye la calidad de producto como se determina por el contenido medido de ácido siálico de la glicoestructura del oligosacárido . Usualmente, un límite inferior para un contenido aceptable de ácido siálico existe como se determina por estudios de depuración de fármaco. Una alta abundancia de una proteína producida por células en cultivo se acompaña óptimamente por una alta calidad de la proteína que se recupera finalmente para un uso pretendido. Los productos de proteína producidos recombinantemente se están volviendo crecientemente importantes médica y clínicamente para su uso como terapéuticos, tratamientos y profilácticos. Por lo tanto, el desarrollo de procesos de cultivo celulars confiables que alcancen económica y eficientemente una concentración creciente de producto de proteína final, en conjunto con un alto nivel de calidad de producto tal como el que se determina por el contenido de ácido siálico, cumple con una meta deseada y necesaria en el arte.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION La presente invención proporciona nuevos procesos para la producción de proteínas, preferiblemente productos de proteínas recombinantes, más preferiblemente productos de glicoproteínas , por cultivos de células de animales o de mamíferos . Estos nuevos procesos logran una viabilidad celular creciente . Un aspecto de esta invención se refiere al uso de dos o más cambios de temperatura. En este aspecto, los procesos de cultivos de células de esta invención pueden lograr ventajosamente una concentración o título final mejorado de producto, por ejemplo, glicoproteína, así como un contenido mejorado de ácido siálico de la glicoproteína producida por las células cultivadas. Más específicamente de conformidad con esta invención, dos o más cambios de temperatura durante el periodo de cultivo celulars mantienen una alta viabilidad celular de las células en el cultivo y pueden proporcionar una alta cantidad y calidad de producto producido a lo largo de una corrida completa de cultivo. También de acuerdo a un aspecto de la invención, los dos o más cambios de temperatura que comprenden los procesos de cultivo pueden permitir ventajosamente una extensión de la fase de producción de cultivo. Durante la fase de producción prolongada, la concentración del producto deseado se aumenta, la calidad del producto como se caracteriza por el contenido de ácido siálico se mantiene a un alto nivel y también se mantiene la viabilidad celular a un alto nivel. Además, la frase de producción prolongada asociada con los procesos de cultivo de la invención permite la producción del producto más allá de la cual se produce durante una frase de producción estándar.

En un aspecto de la presente invención, los cambios de temperatura multietapa, preferiblemente, los cambios de temperatura multietapa programados, que comprenden dos o más cambios de temperatura descendentes, se usan en el cultivo celulars de mamíferos para producir un producto de proteína deseado, particularmente un producto de glicoproteína. Dos o más cambios de temperatura (esto es, al menos dos) que se pueden efectuar después de la fase de crecimiento de cultivo comprenden los procesos de este aspecto de la invención. Con los al menos dos cambios de temperatura, preferiblemente con aproximadamente incrementos de cuatro días entre los cambios, se puede lograr un alto rendimiento de proteína con un contenido concomitante alto de ácido siálico del producto de proteína deseado. Los cambios de temperatura múltiples que comprenden los métodos de cultivo pueden alcanzar tanto un producto de alta calidad como cantidad de proteína, así como mantener una viabilidad celular por la duración de un periodo de cultivo. De acuerdo con otro aspecto de esta invención, los procesos de cultivo (métodos) que involucran dos o más cambios de temperatura pueden permitir que se mantengan las células en cultivo por un periodo de tiempo que ventajosamente extiende la corrida de cultivo para lograr una alta calidad y cantidad de la producción de proteínas. Tal extensión de la fase de producción de proteína ventajosamente suministrada por esta invención, se refiere a una fase de producción que se puede llevar a cabo más allá de la producción de proteína que se logra cuando no se usa cambio de temperatura o solamente un cambio de temperatura en la corrida de cultivo. La fase de producción extendida se asocia con cambios múltiples de temperatura que comprenden los métodos de cultivo celulars descritos. De acuerdo con los nuevos métodos de cultivo celulars con cambio de temperatura de esta invención, la combinación de un segundo, tercero, cuarto o un cambio adicional ascendente en la temperatura con un cambio de una primera temperatura, permite que los cultivos de células mantengan una alta viabilidad celular y proporciona, en una modalidad de la invención, una fase de producción prolongada durante la cual se incrementa la concentración del producto de proteína y la calidad del producto, como se caracteriza por el contenido de ácido siálico, permaneciendo alta hasta el final de la corrida de cultivo. Una corrida de cultivo como se usa en la presente se refiere a un periodo de cultivo preferiblemente el periodo de cultivo completo. Para una corrida de cultivo que comprende dos o más cambios de temperatura como se proporciona recientemente por esta invención, la extensión de una corrida de cultivo completa puede durar desde tan poco como solo después del segundo cambio de temperatura (por ejemplo, alrededor de 10 a 14 días) hasta tanto como alrededor de 28 a 30 días o más. Para una corrida de cultivo que comprende tres (o más) cambios de temperatura, la extensión de la corrida completa puede durar desde tan poco como justo después del tercer cambio de temperatura (o el último) (por ejemplo, alrededor de 14 a 21 días) , hasta tanto como alrededor de 28 hasta 30 días o más. Así, de acuerdo con los métodos de la presente invención, las células se pueden cultivar para un periodo total de corrida de más de 10 días, más de 14 días o más de 21 días. Preferiblemente, la corrida de cultivo dura de por al menos alrededor de 10 a 14 días hasta alrededor de 21 a 30 días o más.

La corrida de cultivo total puede comprender dos , tres , cuatro o más cambios de temperatura por etapas . Como un ejemplo no limitativo, un cambio de temperatura de dos etapas se lleva a cabo como sigue: la temperatura de cultivo se mantiene inicialmente a 37°C o cerca de 37°C, desde el día 0 hasta alrededor del día 6; desde alrededor del día 6 hasta alrededor del día 10, la temperatura de cultivo se mantiene a 34 °C o cerca de 34 °C y desde alrededor del día 10 en adelante por ejemplo hasta alrededor del día 14 a 28, hasta alrededor del día 14 a 18, o al final de la corrida de cultivo, la temperatura de cultivo se mantiene a 32°C o cerca de 32°C. Un procedimiento de cultivo con cambio de temperatura de 3 etapas de acuerdo con esta invención comprende el siguiente formato no limitativo ejemplificante: la temperatura de cultivo celulars se controla a 37°C o cerca de 37 °C desde el día 0 hasta alrededor del día 6, desde alrededor del día 6 hasta alrededor del día 10, la temperatura de cultivo de mantiene a 34°C o cerca de 34°C desde alrededor del día 10 hasta alrededor del día 14, la temperatura de cultivo de mantiene a 32 °C o cerca de 32 °C y desde alrededor del día 14 en adelante, por ejemplo hasta alrededor del día 21 al día 30, o más esto es hasta el final de la corrida, la temperatura de cultivo se mantiene a 30 °C o cerca de 30 °C. Así, el empleo de los métodos de cultivo celulars actuales que comprenden dos o más cambios de temperatura en los cuales una elevada cantidad y calidad de producción de proteína se alcanza, es benéfico no solamente para las corridas de cultivo que tienen duraciones "más cortas" , por ejemplo estándar (por ejemplo alrededor de 10 hasta alrededor de 14 días) , sino también para corridas de cultivo que pueden durar más que la corrida de producción estándar. Tales corridas de cultivo de duración mayor se logran debido a que los métodos de esta invención proporcionan una extensión de la fase de producción inicial o estándar de la producción de proteína por las células cultivadas (la fase de producción inicial o estándar sucede, en general, alrededor de los días 6 a 14) . Por ejemplo, al emplear los dos, tres o más cambios de temperatura en la corrida de cultivo de acuerdo con esta invención, se puede mantener una alta calidad y cantidad de producción de proteína y viabilidad celular y mantenerse por un tiempo total de corrida de alrededor de 10-14 días hasta un tiempo total de corrida de 21 hasta 28 días o más, comparado con la producción de proteína y la calidad de producto de los cultivos que no emplean cambio de temperatura o como máximo un cambio de temperatura. En otro de sus aspectos, la presente invención proporciona métodos de cultivo celulars que comprenden más de dos o tres cambios de temperatura como se describen arriba. - En tales corridas de cambio de temperatura muítietapa, las células se cultivan esencialmente como se describen para un periodo de cultivo de tres etapas y se llevan a cabo cambios de temperatura descendentes adicionales hasta el final del periodo de cultivo. Por ejemplo, un cuarto cambio de temperatura descendente, esto es disminución de temperatura se puede llevar a cabo siguiendo el tercer periodo de cultivo de cambio de temperatura en el cual la temperatura de cultivo celular se cambia además desde alrededor de 30 °C, hasta alrededor de 28 °C o 29°C, preferiblemente alrededor de 29 °C, en o alrededor de los días 15-19, preferiblemente el día 18 desde el inicio del cultivo. Se pueden incluir cambios de temperatura adicionales en el método de cultivo celular en donde las células se mantienen a una temperatura inferior, por ejemplo <29°C para extender además la producción de proteína hasta el final de la corrida preferiblemente por más de 28-30 días. En todos los casos, la proteína producida por las células al final del periodo de cultivo se recupera típicamente, por ejemplo se aisla y/o se purifica substancialmente como se desee empleando técnicas practicadas rutinariamente en el arte como se describe en la presente . Además el contenido de ácido siálico se evalúa por métodos convencionales . En un aspecto particular, la presente invención proporciona un proceso (o método) en el cual la concentración final de productos se mejora y el contenido de ácido siálico de la glicoproteína producida es mayor por el uso de un proceso de cambio de temperatura de dos o más etapas . De acuerdo con este aspecto en particular, la combinación de dos o más cambios de temperatura programados mantienen una alta viabilidad celular del cultivo, permitiendo con ello una fase de producción prolongada durante la cual la concentración del producto preferiblemente el producto recombinante se incrementa y la calidad de producto como se caracteriza por el producto de ácido siálico se mantiene en alto nivel. Tal cambio de temperatura de dos o más etapas puede minimizar la descompensación prevaleciente entre la concentración de proteína y el contenido de ácido siálico en la producción de producto durante el proceso de cultivo celular. Así, los cambios de temperatura proporcionan un efecto positivo en mejorar un parámetro de desempeño importante del proceso de cultivo, esto es, el producto matemático de "concentración terminal (esto es final)" x "ácido siálico terminal (esto es final)" ("concentración terminal x ácido siálico terminal").

En consecuencia, en otro aspecto particular para un método de cultivo de dos etapas como se describe en la presente, las células se mantienen en cultivo desde el día 0 en adelante o alrededor del día 6 a una temperatura de 37 °C o cerca de 37°C, en o alrededor del día 6, la temperatura del cultivo celular se disminuye a 34°C o cerca de 34 °C y o sobre alrededor de día 10 se disminuye nuevamente hasta 32°C o cerca de 32 °C. En una modalidad de tal método de cambio de temperatura de dos etapas, la fase de producción se extiende más allá de alrededor del día 14 y continua hasta el final de la corrida de cultivo, por ejemplo, hasta alrededor del día 21 hasta alrededor del día 28 hasta 30 tiempo durante el cual las células se mantienen en cultivo a una temperatura inferior de 32 °C o cercana de 32 °C. El producto de proteína se puede recuperar al final de la fase de producción prolongada como se describe adicionalmente en la presente. En todavía otro aspecto de la presente invención, se proporciona un método para incrementar la viabilidad de las células en cultivo al someter las células a dos o más cambios en temperatura durante la corrida de cultivo. Una condición, tal como dos o más cambios en temperatura provoca una viabilidad celular creciente si la viabilidad celular en el cultivo es mayor por un periodo de tiempo en presencia de la condición que en ausencia de la condición. De acuerdo con este aspecto, los dos o más métodos de cultivo celulars con cambio de temperatura como se describe, permiten que las células permanezcan viables por periodos de tiempo crecientes tal como más allá del periodo estándar de producción. Como se discute en la presente, una consecuencia benéfica de la viabilidad celular creciente de las células cultivadas puede ser que las grandes cantidades de producto (de alta calidad) se produzcan al final del periodo de cultivo bajo condiciones que conducen al mantenimiento de células viables.

Otro aspecto de esta invención es que la viabilidad celular creciente que resulta de la .práctica de dos o más métodos de cultivo celulars con cambio de temperatura, se correlaciona con una cantidad decreciente de desechos celulares y contenidos liberados de células muertas o que están muriendo con el tiempo en el cultivo. La presencia de desechos celulares y los contenidos de las células muertas en el cultivo pueden tener un impacto negativamente en la capacidad de aislar y/o purificar el producto de proteína al final de la corrida de cultivos . Al mantener las células viables por un periodo más prolongado de tiempo de cultivo, existe así una reducción concomitante en la contaminación en el medio de cultivo por proteínas y enzimas de células por ejemplo, proteasas y sialidasas celulares que pueden provocar la degradación y la reducción final en calidad de la glicoproteína deseada producida por las células . Otro aspecto de esta invención se refiere a la adición retardada de compuesto polianiónico al cultivo celular. La adición retardada de compuesto polianiónico alcanza una viabilidad celular aumentada. El compuesto polianiónico es preferiblemente sulfato de dextrano. Se agrega el compuesto polianiónico al cultivo en un tiempo después de la inoculación. En un aspecto de esta invención se agrega el compuesto polianiónico a un cultivo en un momento después de la inoculación que está antes del comienzo de la fase inicial de muerte o está durante la fase inicial de crecimiento, o está durante la segunda mitad de la fase de crecimiento inicial, o está en o alrededor del final de la fase de crecimiento inicial. De acuerdo con este aspecto de la invención, la fase de crecimiento se prolonga y/o se retarda el comienzo de la fase de muerte por un periodo de tiempo tal como, varios días. Adicionalmente , una vez que ha comenzado la fase de muerte, se reduce ampliamente la velocidad de muerte. En otro aspecto de esta invención, se agrega el compuesto polianiónico a un cultivo durante la fase inicial de muerte. De acuerdo con este aspecto de la invención la muerte celular se suspende por un periodo de tiempo tal como varios días . En otro aspecto preferido de esta invención y como se describe además en la presente, los procesos de cultivo celular recientemente desarrollados, tanto aquellos que involucran dos o más cambios de temperatura como aquellos que involucran la adición retardada de compuestos polianiónicos, son especialmente adecuados para la producción de moléculas solubles CTLA4 y molécula mutante soluble en CTLA4, tal como CTLA4Ig y L104EA29Yig, por células hospedadoras preparadas por ingeniería genética para expresar y producir estas proteínas. (Ver ejemplos 1 hasta 11). Las modalidades preferidas de la presente invención abarcan el cultivo celulars que producen CTLA4Ig y L104EA29YIg usando cambios múltiples de temperatura durante la corrida de cultivo para lograr grandes cantidades de producto de calidad CTLA4Ig y L104EA29YIg como se determina por la medición de ácido siálico de los productos finales . Las modalidades preferidas de la presente invención abarcan el cultivo celulars que producen CTLA4Ig y L104EA29YIg usando la adición retardada de compuesto polianiónico. Aspectos adicionales, características y ventajas de la presente invención se apreciaran con una lectura de la descripción detallada de la invención y una consideración de los dibujos/figuras .

DESCRIPCION DE LAS FIGURAS La figura 1 muestra el impacto de perfiles diferentes de cambio de temperatura en la viabilidad celular para células cultivadas en una escala de reactor de 5 litros (5 L) . Estos resultados se obtuvieron de los experimentos descritos en el ejemplo 3 en la presente. Se hace una comparación entre los métodos de cultivo que no involucran cambio de temperatura ("sin cambio T" ) , un cambio de temperatura sencillo ("cambio T sencillo" ) y dos cambios de temperatura descendientes (cambio T doble") . La figura 2 muestra el impacto de diferentes perfiles de cambio de temperatura en la viabilidad celular para células cultivadas en un esquema de reactor de 50 litros (50 L) . Estos resultados se obtuvieron de los experimentos descritos en el ejemplo 3 en la presente. Se hace una comparación entre los métodos de cultivo que involucran tres cambios de temperatura descendentes ("cambio T triple") y dos cambios de temperatura descendentes ("cambio t doble"). La figura 3 detalla una secuencia de nucleótido (SEQ ID NO:l) y una secuencia de aminoácido codificadas (SEQ ID NO: 2) de un CTLA4Ig que tiene un péptido de señal, una secuencia de aminoácido de tipo silvestre del dominio extracelular CTLA4, partiendo de la metionina en la posición +1 hasta el ácido aspártico en la posición +124 , o partiendo de la alanina en la posición -1 hasta el ácido aspártico en la posición +124, y una región Ig. La figura 4 detalla una secuencia de nucleótido (SEQ ID NO: 3) y una secuencia codificada de aminoácidos (SEQ ID NO: 4) de una molécula mutante de CTLA4 (L104EA29YIg) que tiene un péptido de señal, un dominio extracelular mutado de CTLA4 partiendo en la metionina en la posición +1 y terminando en el ácido aspártico en la posición +124, o partiendo de la alanina en la posición -1 y terminando en el ácido aspártico en la posición +124, y una región Ig. La figura 5 detalla la secuencia de ácido nucleico (SEQ ID NO: 5) y una secuencia de aminoácido completa codificada (SEQ ID NO: 6) del receptor humano CTLA4 (referido como CTLA4 "tipo silvestre" en la presente) fusionado al péptido de señal de oncostatina M (posición -26 hasta -2) (patentes de E.U.A. Nos. 5,343,131 y 5,844,095). La figura 6 muestra el impacto de la adición retrasada de sulfato de dextrano en la densidad celular viable, densidad celular total y viabilidad en un cultivo en el cual se agrega sulfato de dextrano al final de la fase inicial de crecimiento. Estos resultados se obtuvieron a partir de los experimentos descritos en el ejemplo 6 en la presente. Se hace la comparación entre los cultivos en los cuales se agrega sulfato de dextrano al final de la fase inicial de crecimiento y cultivos en los cuales no se agrega sulfato de dextrano. Se grafican los valores promedio, las barras de error representan la desviación estándar. La figura 7 muestra el impacto de la adición retrasada de sulfato de dextrano en la tasa de muerte. Es una representación logarítmica de las densidades viables de células como una función del tiempo. Estos resultados se obtuvieron de los experimentos descritos en el ejemplo 6 en la presente. Se hizo comparación entre los cultivos en los cuales se agrega sulfato de dextrano al final de la fase inicial de crecimiento, y cultivos en los cuales no se agregó sulfato de dextrano. Se grafican los valores promedio. Las barras de error representan la desviación estándar. La figura 8 muestra el impacto de la adición retrasada de sulfato de dextrano en la densidad celular viable, densidad celular total y. viabilidad en un cultivo en el cual se agrega sulfato de dextrano durante la fase inicial de muerte . Esto resultados se obtuvieron de los experimentos descritos en el ejemplo 7 en la presente. Se hace comparación entre un cultivo en el cual se agrega sulfato de dextrano durante la fase inicial de muerte y un cultivo en el cual no se agrega sulfato de dextrano. La figura 9 muestra el impacto de la adición retardada de sulfato de dextrano en la densidad celular viable, densidad celular total y viabilidad en cultivo en el cual se agrega un cultivo de dextrano durante la fase inicial de muerte. Estos resultados se obtuvieron de los experimentos descritos en el ejemplo 8 en la presente. Se hace la comparación entre un cultivo en el cual se agrega sulfato de dextrano durante la fase inicial de muerte y un cultivo en el cual no se agrega sulfato de dextrano. La figura 10 muestra una densidad celular viable, densidad celular total y viabilidad en cultivos en los cuales se agrega sulfato de dextrano al día cero del cultivo. Estos resultados se obtuvieron de los experimentos descritos en el ejemplo 9 en la presente. La figura 11 muestra una densidad celular viable y viabilidad en cultivos en los cuales se agrega sulfato de dextrano en tres tiempos diferentes (día 3, día 4, y día 5) de la fase de crecimiento inicial. Estos resultados se obtuvieron de los experimentos descritos en el ejemplos 10 en la presente. La figura 12 muestra el impacto de los perfiles de cambio de temperatura diferentes en la densidad celular viable . Estos resultados se obtuvieron de los experimentos descritos en el ejemplo 11 en la presente. Se hace la comparación entre los métodos de cultivo que involucran ningún cambio de temperatura ("sin cambio T" ) , un cambio de temperatura sencillo ( "un cambio T" ) y dos cambios de temperatura descendentes ("dos cambios T") . La figura 13 muestra el impacto de diferentes perfiles de cambio de temperatura sobre la viabilidad. Se obtuvieron esto resultados de los experimentos descritos en el ejemplo 11 en la presente. Se hace una comparación entre los métodos de cultivo que no involucran un cambio de temperatura ("sin cambio T" ) , un cambio de temperatura sencillo ( "un cambio T" ) y dos cambios de temperatura descendente ("dos cambios T" ) . La figura 14 muestra el impacto de diferentes perfiles de cambio de temperatura en la concentración. Estos resultados se obtuvieron de los experimentos descritos en el ejemplo 11 en la presente. Se hace una comparación entre los métodos de cultivo que no involucran cambio de temperatura (¾sin cambio T" ) , un cambio de temperatura sencillo ("un cambio T" ) y dos cambios de temperatura descendentes ("dos cambios T" ) .

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION La presente invención describe nuevos procesos para la producción de proteínas, preferiblemente productos recombinantes de proteína, más preferiblemente productos de glicoproteinas en cultivos de células animales o de mamíferos. Estos procesos alcanzan una viabilidad celular creciente .

Procesos de cultivo celulars que involucran dos o más cambios de temperatura Los procesos de cultivos de células de conformidad con esta invención involucran dos o más cambios de temperatura, alcanzan una viabilidad celular creciente y pueden lograr una concentración o título final mejorado del producto producido por las células en cultivo. Además, el contenido de ácido siálico de la glicoproteína producida por las células cultivadas puede ser alto indicando así una alta calidad del producto de proteína que se produce durante el periodo de cultivo. Más específicamente de conformidad con esta invención, dos o más cambios de temperatura durante la corrida de cultivo celulars mantienen y sostienen una alta viabilidad celular de las células en cultivo por ejemplo, alcanzan una viabilidad celular aumentada y pueden proporcionar una alta cantidad y calidad de producto producido a lo largo de la corrida de cultivo. También, de acuerdo con la invención, los dos o más cambios de temperatura pueden permitir ventajosamente una extensión de la fase de producción de cultivo. Durante la fase de producción prolongada, se mantiene la viabilidad celular, la concentración del producto deseado se incrementa y la calidad de producto como se caracteriza por el contenido de ácido siálico se mantiene a alto nivel. De acuerdo con esta invención, dos o más cambios de temperatura, preferiblemente cambios de temperatura descendentes, durante el periodo de cultivo celular pueden permitir una ata cantidad y calidad del producto de proteína que se produzca al final del periodo de cultivo en comparación con los métodos de cultivo que no involucran cambio de temperatura o solamente un cambio de temperatura. Ilustrativamente, como se muestra en el ejemplo 3, un proceso de cultivo con dos o tres cambios de temperatura de acuerdo con la presente invención producen un incremento en la cantidad de proteína (por ejemplo, concentración final) en comparación con ningún cambio de temperatura o solamente un cambio de temperatura independientemente de la duración total de la corrida de cultivo. Además, los métodos y procesos de la presente invención son particularmente adecuados para células que crecen y se mantienen como cultivo de lote alimentado como se describe en la presente además . Debido a que los dos o más cambios de temperatura de los métodos de cultivo también mantienen y sostienen una alta viabilidad de las células en cultivo, los procesos de cultivo . pueden extender la fase de producción para la proteína. En particular, durante los métodos de cultivo celular que comprenden una fase de producción extendida, la viabilidad celular permanece alta, se incrementa la concentración del producto deseado y la calidad del producto, como se caracteriza por un contenido movible de ácido siálico también se mantiene a un alto nivel . Como se suministra recientemente por esta invención, los métodos de cultivo celular comprenden una fase de producción que se extiende más allá de la producción que se produce por los procedimientos de cultivo que no involucran cambios de temperatura o como máximo solamente un cambio de temperatura.

Métodos de cultivo celular que involucran cambios múltiples de temperatura En modalidades de la presente invención, los cambios de temperatura de paso múltiple se usan en el cultivo celulars mamíferas para producir un producto de proteína deseado, particularmente, un producto de glicoproteína. Más preferiblemente, las células producen una proteína producida recombinantemente, producto de proteína o polipéptido. Sin embargo, en algunos casos, las células pueden producir activamente, o sobre producir, un producto endógeno o natural el cual se puede cosechar o recuperar siguiendo la práctica de la presente invención. Como se describe aquí, dos o más cambios de temperatura, preferiblemente cambios de temperatura hacia abajo controlados, llevados a cabo en intervalos de tiempo apropiados durante el periodo de cultivo, se pueden usar en los procesos de esta invención para lograr un rendimiento de proteína alto con un contenido de ácido siálico alto concomitante. De acuerdo con los métodos y procesos de cultivo de esta invención (también referidos como corridas de producción o fermentación) , las células cultivadas en conjunto con dos o más cambios de temperatura durante una corrida de cultivo pueden producir una alta cantidad y calidad de producto durante la corrida, como medida por la titulación final y el contenido de ácido siálico al final de la corrida. La alta cantidad y calidad de producción de proteína, asociada con los métodos de esta invención se obtiene relativa a métodos en los cuales no hay cambio de temperatura, o cuando mucho, se usa un cambio de temperatura, a pesar de si una corrida de cultivo se lleva a cabo por un tiempo de corrida total de alrededor de 10-14 días o por más de 14 días. Más aún, como resultado de los dos o más cambios de temperatura durante el proceso de cultivo, las células se pueden mantener en cultivo por un período de tiempo que extiende esencialmente la fase de producción estándar o inicial. Una fase de producción estándar o inicial comúnmente es alrededor de 6 a 14 días . La producción incrementada de la proteína de calidad alta, además de la viabilidad de la célula sostenida, se logra durante la fase de producción extendida de los métodos de cultivo presentes que involucran dos o más cambios de temperatura. También de acuerdo con los métodos de cultivo presentes, las células se pueden cultivar para un período de corrida total más grande que alrededor de 10 días, más grande que alrededor de 14 días, más grande que alrededor de 21 días, o más grande que alrededor de 28 días, preferiblemente alrededor de 14 a 30 días, o más. Por ejemplo, en una corrida de cultivo de esta invención que comprende dos o más cambios de temperatura, la duración de la corrida completa puede ser tan corto como justo después del segundo (o último) cambio e temperatura (por ejemplo, alrededor de 14 días) hasta tan largo como alrededor de 21 a 30 días o más, preferiblemente alrededor de 28 días o más. En una modalidad de la presente invención, la fase de producción prolongada se asocia con los múltiples cambios de temperatura que comprenden los métodos de cultivo celulars de esta invención. De conformidad con los nuevos métodos de cultivo celular de esta invención, la combinación de un segundo, tercero, o más cambios de temperatura con un primer cambio de temperatura no solamente permite a los cultivos de célula producir alta cantidad y calidad del producto durante todo el período de duración de la corrida de cultivo, sino que también permite al cultivo sostener una viabilidad de célula alta durante toda la corrida y/o durante toda una fase de producción prolongada hasta la terminación de la corrida de cultivo. Durante la corrida de cultivo, incluyendo la fase de producción prolongada, la titulación del producto de proteína se aumenta y la calidad del producto se mantiene alta como se caracteriza por el contenido de ácido siálico. Más particularmente, en una de sus modalidades específicas, la presente invención abarca métodos de cultivo celular que prolongan la fase de producción inicial de producción de proteína mediante células cultivadas (esto es, la fase de producción estándar que abarca alrededor de los días 6-14 se prolonga) . Mediante el empleo de dos o más cambios de temperatura en la corrida de cultivo de acuerdo con esta invención, se logra una fase de producción prolongada en alrededor de 14-21 días. Con tres (o más) cambios de temperatura en la corrida de cultivo, la corrida de cultivo se prolonga además a alrededor de 21-28 ó 30 días, o más, con rendimientos más altos concomitantemente de producto de proteína de alta calidad (por ejemplo, contenido de ácido siálico alto) , (por ejemplo, Ejemplo 3) . En otra modalidad particular de esta invención, el proceso de cultivo celular (o fermentación) abarca un cambio de temperatura hacia abajo de dos etapas en el cual las células se mantienen en tres diferentes temperaturas durante la corrida de cultivo total . En esta modalidad, el período de cultivo celular total es mayor que alrededor de 10 dias, más específicamente, alrededor de 14 a 28 días o más, esto es, alrededor de dos a tres semanas o más, antes de obtener el producto de proteína final (y medir el contenido de ácido siálico) . Por ejemplo, en tal método de dos etapas, las células se mantienen en una primera temperatura de alrededor de 36°C a 38°C, preferiblemente, 37°C, o cerca de 37°C, por un período de cultivo inicial de desde el día 0 hasta alrededor del día 6. De ahí en adelante, desde alrededor del día 5 hasta el día 7, preferiblemente el día 6, hasta alrededor del día 10, la temperatura de cultivo se mantiene en una segunda temperatura de alrededor de 33°C hasta 35°C, preferiblemente, 3 °C, o cerca de 34 °C. Siguiendo el cultivo celular a o cerca de 34°C, la temperatura se cambia una segunda vez (cambio T secundario) hasta una tercera temperatura de alrededor de 3l°C hasta 33 °C, preferiblemente, 32°C, o cerca de 32 °C. El cambio T secundario ocurre en o alrededor del día 6 hasta alrededor del día 14 , preferiblemente desde alrededor del día 10 hasta alrededor del día 14, más preferiblemente, en o alrededor del día 10, el cual en varias modalidades puede estar durante la fase de producción estándar, durante la fase de crecimiento, o durante la fase de muerte. Preferiblemente hay aproximadamente cuatro incrementos diarios entre el primer y el segundo cambio de temperatura, más preferiblemente cuatro incrementos diarios . Las células se mantienen a una temperatura de 32 °C, o cerca de 32 °C hasta la terminación de la corrida de cultivo total, por ejemplo, para más prolongado que alrededor del día 10, más específicamente, hasta alrededor de los días 12-18 o hasta alrededor de los días 14-18, o hasta alrededor de los días 14-28 ó 30, o más. En la terminación del proceso de cultivo, el producto de proteína se aisla comúnmente y/o se purifica, por ejemplo, desde el sobrenadante de cultivo, si el producto se secreta en el medio de cultivo . Alternativamente en los métodos de cultivo de cambio de temperatura múltiple de esta invención, la temperatura puede ser primero bajada con base en la fase del cultivo. El primer cambio de temperatura preferiblemente ocurre antes del inicio de la fase de muerte. En una modalidad, la temperatura se baja primero consecuentemente con el alentamiento del crecimiento de la célula. Por ejemplo, la temperatura se cambia desde 37 °C, o cerca de 37 °C, hasta 34°C, o cerca de 34 °C, cuando las células no se prolongan en su fase de crecimiento exponencial y el cultivo está en la fase estacionaria, por ejemplo, en o alrededor del día 6 del cultivo. En este momento, la concentración de célula viable ha alcanzado una densidad de célula apropiada para la producción de proteína, preferiblemente la producción de proteína mejorada, por ejemplo, alrededor de 2-12 x 106 células/mL, tal como 2-9 x 106 células/mL, 3-7 x 10s células/mL, 4-5 x 106 células/mL, 3-4 x 106 células/mL, 2-4 x 106 células/mL, 4-6 x 106 células/mL, 6-8 x 106 células/mL, 8-10 x 10s células/mL, ó 10-12 x 10s células/mL. Sin desear estar limitados por la teoría, es posible que la reducción del crecimiento de la célula se correlacione con la reducción de nutrientes y/o componentes particulares del medio de cultivo celular, por ejemplo, una limitación de nitrógeno en el medio. En otra modalidad, el primer cambio en la temperatura ocurre durante la fase de crecimiento, por ejemplo cuando la concentración de célula viables es alrededor de 2-12 x 106 células/mL, tal como 2-9 x 10e células/mL, 3-7 x 10e células/mL, 4-5 x 10s células/mL, 3-4 x 10s células/mL, 2-4 x 10s células/mL, 4-6 x 10s células/mL, 6-8 x 106 células/mL, 8-10 x 106 células/mL, ó 10-12 x 106 células/mL. Todavía en otra modalidad específica que abarca el proceso de cultivo de cambio de temperatura de dos etapas, las células se cultivan por una corrida de 14 días en la cual la temperatura del cultivo se mantiene en o cerca de 37 °C desde el día 0 hasta el día 6. Desde alrededor del día 6 hasta alrededor del día 10, la temperatura de cultivo se mantiene en o cerca de 34 °C; y desde alrededor del día 10 hasta alrededor del día 14, la temperatura del cultivo se mantiene en o cerca de 32 °C. Como otra modalidad, las células se cultivan desde alrededor de un período de 21 días en el cual la temperatura de cultivo se mantiene en o cerca de 37 °C desde el día 0 hasta alrededor del día 6; desde alrededor del día 6 hasta alrededor del día 10, la temperatura de cultivo se mantiene en o cerca de 34 °C; y desde alrededor del día 10 hasta alrededor del día 21, la temperatura de cultivo se mantiene en o cerca de 32 °C. Como todavía otra modalidad, las células se cultivan por alrededor de un período de 28 días en el cual la temperatura de cultivo se mantiene en o cerca de 37°C desde el día 0 hasta alrededor del día 6; desde alrededor del día 6 hasta alrededor del día 10, la temperatura de cultivo se mantiene en o cerca de 34 °C; y desde alrededor del día 10 hasta alrededor del día 28, la temperatura de cultivo se mantiene en o cerca de 32°C. La presente invención también abarca modalidades en las cuales los métodos de cultivo celular comprenden tres o más cambios de temperatura. En una modalidad que involucra un proceso de cultivo de cambio de temperatura de tres etapas, las células se cultivan inicialmente en una primer temperatura de alrededor de 36°C a 38°C, preferiblemente, en o cerca de 37 °C por alrededor de 6 días; de ahí en adelante, la temperatura de cultivo se cambia y se mantiene en alrededor de 33°C a 35°C, preferiblemente, en o cerca de 34°C por un período de tiempo dado; un segundo cambio a una temperatura de alrededor de 31°C a 33°C, preferiblemente, en o cerca de 32°C ocurre de ahí en adelante. Un tercer cambio de temperatura a una temperatura de alrededor de 29°C a 31°C, preferiblemente en o cerca 30 °C, sigue el periodo de cultivo en 32 °C o cerca de 32 °C; la temperatura se mantiene luego en o cerca de 30 °C hasta la terminación de la corrida. En otras modalidades, se pueden realizar más cambios de temperatura, preferiblemente cambios de temperatura descendentes, siguiendo el tercer cambio de temperatura del método de cultivo. Por ejemplo, un cuarto cambio de temperatura puede seguir al tercer cambio en o alrededor del día 15-20, preferiblemente alrededor del día 18 desde el inicio del cultivo. El cuarto cambio descendente mantiene la temperatura de cultivo en o cerca de 28°C a 29°C, preferiblemente, alrededor de 29°C, e incrementa la corrida de cultivo a más que alrededor de 29 días, por ejemplo, hasta alrededor de 28-32 días o más, en el cual se obtiene producto en el tiempo. Como en el procedimiento de corrida de cultivo de cambio de temperatura de dos etapas de acuerdo con esta invención, el primer cambio en la temperatura en los procesos de cambio de temperatura múltiples de la presente invención puede ocurrir cuando las células han detenido esencialmente el crecimiento y se han vuelto estacionarias o próximas a eso. Ilustrativamente, el cambio de temperatura se realiza cuando la concentración de célula viable es alrededor de 2-12 x 106 células/mL, tal como 2-9 x 106 células/mL, 3-7 x 106 células/mL, 4-5 x 106 células/mL, 3-4 x 106 células/mL, 2-4 x 106 células/mL, 4-6 x 106 células/mL, 6-8 x 10e células/mL, 8-10 x 10s células/mL, ó 10-12 x 106 células/mL. Alternativamente, el primer cambio en temperatura ocurre durante la fase de crecimiento, por ejemplo cuando la concentración de célula viable es alrededor de 2-12 x 10e células/mL, tal como 2-9 x 106 células/mL, 3-7 x 106 células/mL, 4-5 x 10s células/mL, 3-4 x 106 células/mL, 2-4 x 106 células/mL, 4-6 x 106 células/mL, 6-8 x 106 células/mL, 8-10 x 106 células/mL, ó 10-12 x 106 células/mL. En otra modalidad preferida, el proceso de cultivo celular de múltiples etapas comprende tres cambios de temperatura medidos y controlados durante un período de cultivo de alrededor de tres a cuatro semanas, por ejemplo, 21-30 días o más, preferiblemente de 28 días o más, proveyendo producción prolongada del producto por las células en cultivo. Para ilustrar, el proceso de cambio de temperatura de tres etapas comprende un periodo de cultivo inicial desde 0 hasta alrededor de 6 días, preferiblemente 6 días, durante el cual las células de tiempo se cultivan a una temperatura de 37 °C, o cerca de 37 °C. Desde alrededor del día 6 hasta alrededor del día 10, las células se cultivan a 34°C, o cerca de 34°C. Desde alrededor del día 10 hasta alrededor del día 14, la temperatura de cultivo se mantiene en 32°C, o cerca de 32 °C; y desde alrededor del día 14 hacia adelante, esto es, hasta alrededor del día 21 hasta el día 30 o más, o hasta la terminación de la corrida, la temperatura de cultivo se mantiene en 30 °C, o cerca de 30 °C. En consecuencia, en el proceso de cultivo de cambio de temperatura de tres etapas de esta invención, la fase de producción también se puede prolongar para producir una titulación final mayor de proteína y viabilidad de célula mayor por un período de tiempo mayor que alrededor de 14 días, en contraste con la fase de producción estándar de alrededor de 6 a 14 días con solamente uno o ningún cambio de temperatura. Provechosamente, la fase de producción y viabilidad de la célula se puede prolongar más por el método de cambio de T de tres etapas, esto es, hasta alrededor de tres semanas o más, con acompañamiento de alta calidad del producto, como se mide por el contenido de ácido siálico. En varias modalidades de la presente invención, el segundo cambio de temperatura a 32 °C, o cerca de 32 °C permite mayor cantidad y calidad de la proteína en la terminación de la corrida de cultivo, y también se asocia con la producción de proteína prolongada durante una corrida que puede durar por más de alrededor de dos semanas. Los dos o más cambios en temperatura permiten al cultivo estabilizar un decaimiento lento en la viabilidad de la célula la cual puede ocurrir durante las dos semanas previas en cultivo. Todavía otro cambio de temperatura desde 32 °C, o cerca de 32 °C, hasta 30°C, o cerca de 30°C, medido en alrededor de dos semanas, o por ahí, provee una extensión más de la fase de producción, prolongando así la fase de producción del cultivo celular al final de la corrida del cultivo, por ejemplo, hasta alrededor del día 21 hasta el día 30 o más, mientras mantiene la viabilidad de la célula sin sacrificar la calidad (como se determinó por medición de la sialilación) del producto producido. (Ver Ejemplo 3, Tablas 2 y 3) . Los cambios de temperatura adicionales pueden prolongar la producción de célula más allá que de las corridas de dos y tres cambios de temperatura. En otras modalidades, la presente invención se dirige a (i) un proceso de cultivo celular, (ii) un método de incremento de producción de proteína, preferiblemente asociado con viabilidad de célula incrementada, (iii) un método de mejoramiento de sialilación de un producto de proteína, (iv) un método de mejoramiento de viabilidad de célula, o (v) un método de alargamiento de producción de proteína, que involucra dos o más cambios de temperatura, que comprenden: cultivo celulars hospedadoras que expresan una proteína de interés a una temperatura en o cerca de 37 °C bajo condiciones y por un periodo de tiempo que permite el crecimiento de la célula; disminuyendo la temperatura del cultivo celular y cultivando las células en una segunda temperatura en o cerca de 34 °C cuando el cultivo está en la fase estacionaria; nuevamente disminuyendo la temperatura del cultivo celular y cultivando las células en una tercera temperatura en o cerca de 32 °C en un tiempo durante la producción estándar de la fase de alrededor del día 6 al día 14, por ejemplo, en o alrededor de diez días desde el inicio del cultivo, hasta el final del período de cultivo. Como se ha notado aquí, el periodo de cultivo puede comprender un tiempo de corrida total de más grande que 10 días, mayor que 14 días, mayor que 21 días, o mayor que 28-30 días. Siguiendo el cultivo de las células en 32 °C, esto es, al final de la corrida de cultivo, se obtiene el producto de proteína producido, preferiblemente una glicoproteína. En otras modalidades, la presente invención se dirige a (i) un proceso de cultivo celular, (ii) un método de incremento de producción de proteína, preferiblemente asociado con la viabilidad de célula incrementada, (iii) un método de mejoramiento de sialilación de un producto de proteína, (iv) un método de mejoramiento de viabilidad de célula, o (v) un método de prolongación de la producción de proteína, que involucra dos o más cambios de temperatura, que comprende : cultivo celulars hospedadoras las cuales expresan una proteína de interés a una temperatura de o cerca de 37 °C bajo condiciones y por un periodo de tiempo que permite para el crecimiento de la célula: disminuyendo la temperatura del cultivo celular y cultivando las células a una segunda temperatura de o cerca de 3 °C iniciando alrededor del día 5 hasta el día 7; nuevamente disminuyendo la temperatura del cultivo celular y cultivando las células a una tercera temperatura en o cerca de 32°C iniciando alrededor del día 6 hasta el día 14, por ejemplo, en o alrededor de diez días desde el inicio del cultivo, hasta la terminación del período de cultivo. Como se ha notado aquí, el período de cultivo puede comprender un tiempo de corrida total más grande que 10 días, más grande que 14 días, más grande que 21 días, o más grande que 28-30 días. Siguiendo el cultivo de las células en 32 °C, esto es, al final de la corrida del cultivo, se obtiene el producto de proteína producido, preferiblemente una glicoproteína. En otra de sus modalidades, la presente invención provee más métodos de cultivo que comprenden otro cambio de descenso de temperatura desde en o cerca de 32 °C hasta en o cerca de 30 °C en o alrededor de 14 días desde el inicio del cultivo hasta la terminación del proceso de cultivo, de esa manera se prolonga el periodo de cultivo bien más allá de una fase de producción estándar. Para prolongar más la producción de proteína durante el proceso de cultivo, además la viabilidad de la célula, el método puede comprender un cuarto cambio de descenso de temperatura desde en o cerca de 30°C hasta en o cerca de 29°C en o alrededor de 15 a 19 días, preferiblemente 18 días, desde el inicio del cultivo hasta la terminación del proceso de cultivo. Los cambios de temperatura de esta invención comúnmente están en o alrededor del día 6 del período de cultivo, lo cual puede ser durante o después de la fase de crecimiento del cultivo, y de ahí en adelante en aproximadamente incrementos del día 4 , preferiblemente incrementos de 4 días . En algunas modalidades, la medición del tiempo de los cambios en la temperatura puede aproximar el inicio (por ejemplo, en o alrededor del día 6) , la mitad (por ejemplo, en o alrededor del día 10) y el final (por ejemplo, en o alrededor del día 14) de la fase de producción estándar. En los procesos o métodos de cultivo de acuerdo con esta invención en la cual la titulación final y el contenido de ácido siálico de una glicoproteína producida se mejora mediante el uso de un perfil de cambio de temperatura de paso múltiple (por ejemplo, dos etapas, tres etapas, o más), la combinación de por lo menos dos, los cambios de temperatura cronometrados permuten una corrida de cultivo total para llevarse a cabo por más que 10 días, mayor que 14 días, mayor que 21 días, o mayor que 28 o más días, sin sacrificar la titulación final y la sialilación del producto. De acuerdo con los procesos de cultivo de esta invención, dos o más cambios de temperatura sostienen una viabilidad de célula alta del cultivo y pueden permitir más proteína de titulación alta y de alta calidad para ser producida en una corrida de cultivo con una corrida que ocurre por el mismo periodo de tiempo, pero no incluye dos o más cambios de temperatura. También, los dos o más cambios de temperatura puede permitir prolongar la fase de producción del cultivo más allá que de una fase de producción estándar y/o más allá la producción de un cultivo que no tiene cambio de temperatura, o al menos, un cambio de temperatura. Tales cambios de temperatura etapa múltiple, tal como el cambio de temperatura de dos o más pasos, puede minimizar la descompensación dominante entre la titulación ("titulación final") y el contenido de ácido siálico en la producción del producto de proteína en el proceso de cultivo celular. Así, los cambios de temperatura proveen un efecto positivo en el mejoramiento del producto matemático de "titulación final x ácido siálico final", lo cual mejora en el proceso de producción de proteína.

Modalidades adicionales de acuerdo con la invención de procesos de cultivo celulars que involucran dos o más cambios de temperatura En una modalidad, la invención se dirige a un proceso de cultivo celulars que comprende el cultivo celulars hospedadoras las cuales expresan una proteína de interés a una primera temperatura de o cercana a 37 °C bajo condiciones y por un tiempo que permite el crecimiento de la célula. Seguido del periodo de crecimiento de la célula, las células se cultivan a una segunda temperatura de o cercana a 34°C cuando el crecimiento de la célula ha disminuido y se vuelve aproximadamente estacionario. De ahí en adelante, las células se cultivan a una tercera temperatura de o cercana a 32°C durante la fase de producción estándar de cultivo, esto es, en o alrededor del día 6 al día o cercano al día 14. Las células se alimentan diariamente. Al final del proceso de cultivo, se puede obtener el producto de proteína producido.

De acuerdo con una modalidad preferida de esta invención, las células se cultivan en un proceso de lote alimentado que comprende diferentes fases, a saber, una fase de crecimiento, durante el cual las células se cultivan a una primer temperatura de o cercana a 37 °C; una fase de producción inicial o estándar, durante la cual las células se cultivan a una segunda temperatura de o cercana a 34 °C y una tercer temperatura de o cercana a 32 °C tal como para proveer una fase de producción de proteína prolongada, la cual puede incluir un a cuarta temperatura de o cercana a 30°C, y opcionalmente de ahí en adelante, temperaturas menores adicionales, tal como de o cercana a 29°C. En los casos de las corridas de cambio de temperatura de dos o más pasos de esta invención, la extensión de producción de proteína se relaciona con los dos o más cambios descendentes en temperatura. Los cultivos preferiblemente se alimentan con medio de alimentación que contiene D-galactosa en una base diaria o continua. Como se describe aquí, una fase de producción prolongada comprende una disminución sucesiva de la temperatura del cultiva de intervalos diferentes de dos o más veces seguida del primer intercambio de temperatura desde de o cercana a 37°C hasta de o cercana a 34°C. Por la práctica de estos métodos que involucran dos o más cambios de temperatura descendentes durante la corrida de cultivo, la producción de proteína se incrementa y se consigue alta calidad de producto (como se mide por el contenido de ácido siálico del producto final) , con relación a la ausencia de cambio de temperatura, o solamente un cambio de temperatura.

Durante la fase de crecimiento de cultivo celular, por ejemplo, desde el día 0 hasta el día 6, la densidad de la célula en el cultivo aumenta conforme las células se dividen rápidamente de forma común en este período de crecimiento de célula exponencial, o fase logarítmica. En el cultivo celular asociado al no crecimiento y métodos de producción de proteína presentes en .algunos aspectos de esta invención, cantidades insignificantes de producto de proteína se producen durante la fase de crecimiento en la cual el crecimiento de la célula se maximiza esencialmente bajo condiciones de crecimiento apropiadas. Así, como consecuencia de las limitaciones de nutrientes en el cultivo, las células comúnmente entran en una fase estacionaria en alrededor de los días 4, a 6, en la cual el crecimiento rápido de la célula se estabiliza o declina: En estos métodos de cultivo, la fase de producción de proteína inicia cuando el crecimiento de la célula esencialmente ha terminado (por ejemplo, en alrededor del día 6 hasta alrededor del día 10) . (Ejemplo 3) . De acuerdo con el método de cultivo de una modalidad preferida, cuando las células alcanzan fase estacionaria en alrededor del día 6, la temperatura se cambia descendiéndola desde en o cercana a 37 °C hasta de -o cercana a 34°C. De ahí en adelante, una vez que está cerca del punto medio entre el primer cambio de temperatura (alrededor del día 6) y el comienzo de la fase de producción prolongada (alrededor del día 14) , la temperatura del cultivo nuevamente se disminuye desde en o cercana a 34 °C hasta en o cercana a 32°C. El segundo cambio de temperatura permite al cultivo estabilizar la viabilidad de la célula, la cual comúnmente declina a través de alrededor del día 14; de ahí en adelante, una extensión de la fase de producción inicia (en alrededor del día 14 hasta alrededor del día 21 hasta el día 30 o mayor, preferiblemente hasta alrededor del día 21 hasta el día 28 o mayor) . Como se describe anteriormente, se pueden emplear otros cambios de temperatura, por ejemplo, tercero, cuarto o más, durante la fase de producción prolongada de la corrida de cultivo.

Métodos de cultivo celulars que involucran la adición retardada de un compuesto polianiónico De acuerdo con la presente invención, se proporciona un proceso de cultivo celular que involucra la adición retardada de compuesto polianiónico. El proceso comprende la adición de compuesto polianiónico a un cultivo celular a un tiempo después de inoculación. La adición retardada del compuesto polianiónico logra viabilidad de la célula incrementada en comparación con aquella observada en la ausencia de adición del compuesto polianiónico, o comparada con aquella observada cuando el compuesto polianiónico se agrega en inoculación. Así, en una modalidad, la invención se dirige a un proceso de cultivo celular que comprende: cultivo celulars hospedadoras las cuales expresan una proteína de interés; y la adición de compuesto polianiónico al cultivo celular a un tiempo después de inoculación.

Se ha encontrado (ver Ejemplo 6) que cuando se lleva a cabo la presente invención el porcentaje de viabilidad de la célula del cultivo celular se incrementa. El porcentaje de viabilidad de la célula, también conocido como viabilidad de célula, es el porcentaje de células viables en el número total de células. Una condición, tal como adición retardada de compuesto polianiónico, provoca viabilidad de célula incrementada si la viabilidad de célula en el cultivo es mayor por un período de tiempo en la presencia de la condición que en la ausencia de la condición. Así, en otras modalidades, la invención se dirige a (1) un proceso de cultivo celular, y (2) un método de incremento de la viabilidad de célula en un cultivo que comprende : cultivo celulars hospedadoras las cuales expresan una proteína de interés; y la adición de compuesto polianiónico al cultivo celular en un tiempo después de inoculación; en donde la viabilidad de célula del cultivo celular se incrementa. Los compuestos polianiónicos incluyen, pero no están limitados a, sulfato de dextrano (disponible de Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) , heparina (disponible de Sigma-Aldrich) , sulfato de heparano (disponible de Sigma-Aldrich) , sulfano de mañano, sulfato de condroitina (disponible de Sigma-Aldrich) , sul ato de dermatano (disponible de Sigma-Aldrich) , sulfato de keratano (disponible de Sigma-Aldrich) , hialuronato (disponible de Sigma-Aldrich.) , poli (vinil sulfato) (disponible de Sigma-Aldrich) , kappa-carragenano (disponible de Sigma-Aldrich) , y suramin (disponible de Sigma-Aldrich) . Los compuestos están fácilmente disponibles de las fuentes listadas, o fácilmente obtenibles a través de los medios conocidos por un experto en la técnica. Estos compuestos frecuentemente están disponibles en la forma de una sal, que incluye pero no está limitada a sal de sodio, pero también se puede usar en forma diferentas a la sal. Un compuesto polianiónico incluye todas las formas de este, incluyendo pero no limitado a formas de sal, tal como sales de sodio. Los compuestos polianiónicos preferidos son compuestos polisulfatados , que incluyen pero no están limitados a: sulfato de dextrano, heparina, sulfato de heparano, sulfato de mañano, sulfato de condroitina, sulfato de dermatano, sulfato de keratan, poli (vinil sultafo) , kappa-carragenina, y suramina. El más preferido es sulfato de dextrano. El sulfato de dextrano puede tener un peso molecular promedio de 5,000 a 500,000 Da. El preferido es el sulfato de dextrano con un peso molecular de 5,000 Da. De acuerdo con la invención, el compuesto polianiónico se agrega a un tiempo después de inoculación, esto es, no está presente en el medio basal y no está presente en la inoculación. Preferiblemente, el compuesto polianiónico se agrega en el día 1 del cultivo o después. La inoculación tiene lugar en el día 0. De acuerdo con la invención, el compuesto polianiónico se puede agregar al cultivo celular una vez, dos veces, tres veces, o cualquier número de veces durante el período de tiempo específico (por ejemplo, en un tiempo después e inoculación) . Se pueden usar uno o más compuestos polianiónicos en conjunto. Esto es, cualquier adición simple dada de un compuesto polianiónico puede incluir la adición de uno o más de otros compuestos polianiónicos. Similarmente, si hay más de una adición de un compuesto polianiónico, los compuestos polianiónicos diferentes se pueden agregar a las diferentes adiciones. Los compuestos y sustancias adicionales, incluyendo compuestos polianiónicos, se pueden agregar al cultivo antes, con o después de la adición de cualquier compuesto polianiónico durante o no durante el período de tiempo especificado. En una modalidad preferida, hay una adición única del compuesto polianiónico, esto es, una vez. En una modalidad preferida, se agrega un compuesto polianiónico. De acuerdo con la invención, el compuesto polianiónico se puede agregar al cultivo celular por cualquier medio. Los medios de adición del compuesto polianiónico incluyen, pero no están limitados a, disolución en agua, disolución en medio de cultivo, disolución en medio de alimentación, disolución en medio apropiado, y en la forma en la cual este se obtiene. Preferiblemente, el compuesto polianiónico se agrega disuelto en agua. De acuerdo con la invención, el compuesto polianiónico se agrega para llevar la concentración en el cultivo a un nivel apropiado. Como ejemplos sin limitación, el compuesto polianiónico se agrega a una concentración de 1-1000 mg/L, 1-200 mg/L, 1-100 mg/L, o 25-75 mg/L. Preferiblemente el compuesto polianiónico se agrega a una concentración de 25-200 mg/L o 25-100 mg/L, más preferiblemente alrededor de 50-100 mg/1 o 50-100 mg/L, más preferiblemente 50 mg/L o alrededor de 100 mg/L, más preferiblemente 50 mg/L o 100 mg/L. De acuerdo con la invención, el cultivo se puede correr por cualquier duración de tiempo después de la adición del compuesto polianiónico. El tiempo de corrida del cultivo se puede determinar por un experto en la técnica, con base en factores relevantes tales como la cantidad y calidad de la proteína recuperable, y el nivel de especies celulares que contaminan (por ejemplo, proteínas y ADN) en el sobrenadante que resulta de la lisis de la célula, lo cual complicará la recuperación de la proteína de interés . En modalidades particulares del proceso y método de cultivo celular de incremento de viabilidad de célula de la invención, el compuesto polianiónico se agrega un tiempo después de inoculación que es antes del inicio de la fase de muerte inicial. Preferiblemente, el compuesto polianiónico se agrega en un tiempo después de inoculación es durante la fase de crecimiento inicial. Más preferiblemente, el compuesto polianiónico se agrega durante la segunda mitad de la fase de crecimiento. Más preferiblemente, el compuesto polianiónico se agrega en o alrededor del final de la fase de crecimiento inicial . La fase de crecimiento inicial se refiere a la fase de crecimiento que se observa en la ausencia de la adición especificada del compuesto polianiónico. La fase de muerte inicial se refiere a la fase de muerte que se observa en la ausencia de la adición especificada del compuesto polianiónico . La fase de crecimiento inicial puede terminar cuando la fase de muerte inicial empieza, o puede haber una fase estacionaria de cualquier duración entre la fase de crecimiento inicial y la fase de muerte inicial . En una modalidad específica, en un cultivo celular en el cual la fase de crecimiento es desde el día 0 hasta el día 6 y la fase de muerte inicial empieza en el día 7, en un compuesto polianiónico de modalidad particular se agrega a un tiempo después de inoculación y antes del día 7. En una modalidad específica, el compuesto polianiónico se agrega después de inoculación y por el día 6. En una modalidad especifica, el compuesto polianiónico se agrega entre los días 1 y 6. En otra modalidad específica, el compuesto polianiónico se agrega en el día 4 , 5 ó 6. En otras modalidades específicas, el compuesto polianiónico se agrega en alrededor del día 6, o en el día 6. Se ha encontrado (ver Ejemplos 6 y 10) , que cuando el compuesto polianiónico se agrega en un tiempo después de inoculación y antes del comienzo de la fase de muerte inicial, la fase de crecimiento se puede prolongar más allá de la fase de crecimiento inicial . Una fase de crecimiento que se extiende más allá de la fase de crecimiento inicial tiene una duración más larga que la fase de crecimiento inicial, esto es, más grande que la fase de crecimiento observada en la ausencia de la adición del compuesto polianiónico. Preferiblemente, durante la fase de crecimiento prolongado se logra una densidad de célula viable máxima más grande que la densidad de célula viable máxima lograda durante la fase de crecimiento inicial. Así, en otras modalidades, la invención se dirige a (1) un proceso de cultivo celular, y (2) un proceso para alargamiento de la fase de crecimiento de un cultivo celular que comprende : cultivar células hospedadoras las cuales expresan una proteína de interés; y la adición del compuesto polianiónico al cultivo celular en un tiempo después de la inoculación que es antes del inicio de la fase de muerte inicial; en donde la fase de crecimiento se prolonga. En modalidades más particulares, la invención se dirige a (1) un proceso de cultivo celular, y (2) proceso para alargamiento de la fase de crecimiento de un cultivo celular que comprende: células hospedadoras de cultivo las cuales expresan una proteína de interés; y la adición del compuesto polianiónico al cultivo celular en un tiempo de inoculación después que es durante la fase de crecimiento inicial; en donde la fase de crecimiento se prolonga. En modalidades más particulares la invención se dirige a (1) un proceso de cultivo celular, y (2) un proceso para alargamiento de la fase de crecimiento de un cultivo celular que comprende: cultivar células hospedadoras las cuales expresan una proteína de interés ; y la adición del compuesto polianiónico al cultivo celular durante la segunda mitad de la fase de crecimiento inicial; en donde la fase de crecimiento se prolonga. En otras modalidades particulares, la invención se dirige a (1) un proceso de cultivo celular, y (2) un proceso para alargamiento de la fase de crecimiento de un cultivo celular que comprende: cultivo celulars hospedadoras las cuales expresan una proteina de interés; y adición de compuesto polianiónico al cultivo celular en o alrededor del final de la fase de crecimiento inicial; en donde la fase de crecimiento se prolonga. La fase de crecimiento se puede prolongar por cualquier periodo de tiempo más allá de la duración de la fase de crecimiento inicial. A manera de ejemplo solamente, la fase de crecimiento se puede prolongar de 1-10 días, por 2-9 días, por 3-8 días, o por alrededor de 5 días. Preferiblemente, la fase de crecimiento se prolonga por uno o más días, más preferiblemente por dos o más días, más preferiblemente por tres o más días , más preferiblemente por cuatro o más días . Por ejemplo, en el Ejemplo 6 la fase de crecimiento se extiende al día 11 donde la fase de crecimiento inicial es hasta el día 6. Así, en el Ejemplo 8 la fase de crecimiento se ha prolongado por 5 días más allá de la duración de la fase de crecimiento inicial . La fase de crecimiento prolongada puede ser sucedida por una fase de muerte o por una fase estacionaria. De la misma manera, la fase de crecimiento inicial puede ser sucedida por una fase de muerte o por una fase estacionaria. Se ha encontrado (ver Ejemplos 6 y 10) , que cuando el compuesto polianiónico se agrega en un tiempo después de inoculación y antes del inicio de la fase de muerte inicial, el comienzo de la fase de muerte se puede retardar más allá del comienzo de la fase de muerte inicial, esto es más allá del comienzo de la fase de muerte observada en la ausencia de la adición del compuesto polianiónico. Una fase de muerte cuyo comienzo se retarda iniciando en un tiempo más tarde que la fase de muerte inicial.

Así, en otras modalidades, la invención se dirige a (1) un proceso de cultivo celular, y (2) un proceso de retardo de la fase de muerte de un cultivo celular que comprende: cultivar células hospedadoras las cuales expresan una proteína de interés; y agregando compuesto polimérico al cultivo celular en un tiempo después de inoculación que es antes del inicio de la fase de muerte inicial; en donde el comienzo de la fase de muerte se retarda. En modalidades más particulares, la invención se dirige a (1) un proceso de cultivo celular, y (2) un proceso para retardar la fase de muerte de un cultivo celular que comprende: cultivar células hospedadoras las cuales expresan una proteína de interés; y la adición del compuesto polianiónico al cultivo celular en un tiempo después de inoculación que es durante la fase de crecimiento inicial; en donde el comienzo de la fase de muerte se retarda. En modalidades más particulares la invención se dirige a (1) un proceso de cultivo celular, y (2) un proceso para retardar la fase de muerte de un cultivo celular que comprende: cultivar células hospedadoras las cuales expresan una proteína de interés y la adición del compuesto polianiónico al cultivo celular durante la segunda mitad de la fase de crecimiento inicial; en donde el comienzo de la fase de muerte se retarda. En otras modalidades particulares la invención se dirige a un proceso para retardar la fase de muerte de un cultivo celular que comprende: células hospedadoras de cultivo que expresan una proteína de interés; y la adición del compuesto polianiónico al cultivo celular en o alrededor del final de la fase de crecimiento inicial; en donde se retarda el comienzo de la fase de muerte . El comienzo de la fase de muerte se puede retardar por cualquier periodo de tiempo. A manera de ejemplo solamente, el comienzo de la fase de muerte se puede retrasar por 1-10 días, por 2-9 días, por 3-8 días, o por alrededor de 5 días. Preferiblemente, el comienzo de la fase de muerte se retarda por uno o más días, más preferiblemente por dos o más días, más preferiblemente por tres o más días, más preferiblemente por cuatro o más días . En otra modalidad particular del proceso y método de cultivo celular de incremento de viabilidad de célula de la invención descrito anteriormente, el compuesto polianiónico se agrega en un tiempo después de inoculación que es durante la fase de muerte inicial . Se ha encontrado (ver Ejemplos 7 y 8) que cuando el compuesto polianiónico se agrega durante la fase inicial de muerte, la fase de muerte se puede detener. Detener la fase de muerte significa parar, por algún período de tiempo, la declinación en la densidad de célula viable observada en la ausencia de la adición del compuesto polianiónico. La detención puede ocurrir inmediatamente después de la adición del compuesto polianiónico. La detención puede ocurrir inmediatamente después de la adición del compuesto polianiónico, o puede ocurrir en un tiempo posterior. Cuando la fase de muerte se detiene, lo que sigue puede ser ya sea una fase de crecimiento o una fase estacionaria. Eventualmente, por supuesto, el cultivo nuevamente entrará en una fase de muerte . Así, en otras modalidades, la invención se dirige a (1) un proceso de cultivo celular, y (2) un proceso para detener la fase de muerte de un cultivo celular que comprende: cultivar células hospedadoras las cuales expresan una proteína de interés; y la adición del compuesto polianiónico al cultivo celular en un tiempo durante la fase de muerte inicial ; en donde la fase de muerte se detiene . La fase de muerte se puede detener por cualquier período de tiempo antes de que se vuelva a entrar en la fase de muerte. A manera de ejemplo solamente, la fase de muerte puede ser detenida por 1-20 días, por 2-18 días, por 5-15 días, o por 8-13 días. Preferiblemente, la fase de muerte se detiene por uno o más días, más preferiblemente por dos o más días, más preferiblemente por tres o más días, más preferiblemente por cuatro o más días . La continuidad de la detención de la muerte no necesariamente está implicada, esto es, puede haber decrecimientos "locales" en el perfil de densidad de la célula viable entre dos extensiones de densidad de célula viable constante o en incremento.

Los tiempos de corrida de los procesos de cultivo celular, particularmente procesos no continuos, usualmente están limitados por la densidad de célula viable que permanece, la cual decrece durante la fase de muerte. Los tiempos de corrida más grandes pueden permitir titulaciones de producto mayores a lo logrado. El retraso de la fase de muerte, que incluye la prolongación de la fase de crecimiento, tanto como sea posible, o deteniendo la fase de muerte, que por consiguiente es deseable. La calidad del producto también trata de ser una motivación para el retraso o detención de la fase de muerte, ya que la muerte de la célula puede liberar sialidasas al sobrenadante del cultivo, lo cual puede reducir el contenido de ácido siálico contenido de la proteína expresada. La purificación de la proteina trata de ofrecer todavía otra motivación para el retardo o detención de la fase de muerte . La presencia de los restos de célula y los contenidos de células muertas en el cultivo pueden impactar negativamente en la capacidad para aislar y/o purificar el producto de proteína al final de la corrida de cultivo. En modalidades particulares, cualquiera de los procesos de cultivo celular descritos aquí involucran dos o más cambios de temperatura y cualquiera de los procesos de cultivo celular descritos aquí involucran adición retardada de compuesto polianiónico que se usan juntos en un cultivo celular. En modalidades particulares, la invención se dirige a (i) un proceso de cultivo celular, y (ii) un proceso para incrementar la viabilidad de célula, que comprende: a) cultivar células hospedadoras lo cual produce una proteína de interés a una temperatura de o cercana a 37 °C bajo condiciones y por un período de tiempo que permita el crecimiento de la célula; b) disminución de la temperatura del cultivo de la célula y cultivo de las células en una segunda temperatura en o cerca de 34 "C iniciando alrededor del día 5 hasta el día 7; (c) nuevamente disminuyendo la temperatura del cultivo celular y cultivando las células a una tercera temperatura en o cerca de 32 °C iniciando alrededor del día 6 hasta el día 14; y (d) la adición del compuesto polianiónico al cultivo de la célula en una vez después de inoculación.

Técnicas y procedimientos relacionados con la purificación y análisis de glicoproteína. En los métodos de cultivo abarcados por la presente invención (tanto los métodos de cultivo celulars que involucran dos o más cambios de temperatura y los métodos de cultivo celular que involucran la adición retardada de compuesto polianiónico) , la proteína producida por las células se recolecta, recupera, aisla, y/o purifica comúnmente, o se purifica sustancialmente, como se desee, al final del período de cultivo celular total usando métodos de aislamiento y purificación tan conocidos y practicados en la técnica. Preferiblemente, la glicoproteína que se secreta de las células cultivadas se aisla del medio o sobrenadante de cultivo; sin embargo, la proteína también se puede recuperar de las células hospedadoras , por ejemplo, lisados de célula, usando métodos que se conocen y practican en la técnica y además como se describe a continuación. El carbohidrato complejo que comprende la glicoproteína producida por los procesos de esta invención se pueden analizar rutinariamente, si se desea, por técnicas convencionales de análisis de carbohidratos. Por ejemplo, técnicas tales como manchado de lectina, bien conocida en la técnica, revelan proporciones de mañosa terminal u otros azúcares como galactosa. La terminación de mono-, bi-, tri-, o tetra-antenario oligasacárido por ácidos siálicos se puede confirmar por liberación de azúcares de la proteína usando hidrazina anhidra o métodos enzimáticos y fraccionamiento de oligosacáridos por cromatografía de intercambio de ión, cromatografía de exclusión de tamaño, u otros métodos que son bien conocidos en la técnica. También se puede medir el pl de la glicoproteína, antes y después del tratamiento con neuraminidasa, para remover ácidos siálicos. Un incremento en el pl después del tratamiento de neuraminidasa indica la presencia de ácidos siálicos en la glicoprotelna. Las estructuras de carbohidratos comúnmente se presentan en la proteína expresada como carbohidratos N-ligados u O-ligados. Los carbohidratos N-ligados u O-ligados difieren primeramente en sus estructuras de núcleo. La glicosilación N-ligada se refiere al acoplamiento de la porción de carbohidratos vía GlcNAc a un residuo de asparagina en la cadena de péptido. Los carbohidratos N-ligados contienen todos una estructura de núcleo Manl-6 (Manl-3) ???ß1-4T1????ß1-4T1???sß-? común, donde R en esta estructura de núcleo representa un residuo de asparagina. La secuencia de péptido de la proteína producida contendrá una asparagina-X-serina, asparagina-X-treonina, y asparagina-X-cisteína, en donde X es cualquier aminoácido excepto prolina. En contraste, los carbohidratos O-ligados se caracterizan por una estructura de núcleo común, la cual es GalNAc acoplada al grupo hidroxilo de una treonina o serina-. De los carbohidratos N-ligados u O-ligados, lo más importante son los carbohidratos N-ligados u O-ligados complejos. Tales carbohidratos complejos contienen varias estructuras antenarias . Las estructuras mono-, bi-, tri-, y tetra-, exteriores son importantes para la adición de ácidos siálicos terminales . Tales estructuras de cadena exterior proveen para sitios adicionales para los azúcares y ligas específicos que comprenden los carbohidratos de los productos de proteína.

Los carbohidratos que resultan se pueden analizar mediante cualquier método conocido en la técnica. Varios métodos se conocen en la técnica para análisis de glicosilación y son útiles en el contexto de la presente invención. Estos métodos proveen información que considera la identidad y la composición del oligosacárido anexado al péptido producido. Los métodos para análisis de carbohidratos útiles en conexión con la presente invención incluye, pero no se limitan a, cromatografía de lectina; HPAEC-PAD, la cual usa cromatografía de intercambio de anión de pH alto para separar los oligosacáridos basados en la carga; MR; espectrometría de masa; CLAP; CPG; análisis de composición de monosacárido; y digestión enzimática secuencial. Además, los métodos para liberación de oligosacáridos se conocen y practican en la técnica. Estos métodos incluyen 1) métodos enzimáticos, los cuales se realizan comúnmente usando péptido-N-glicosidasa F/endo- -galactosidasa; 2) métodos de eliminación ß, usando un ambiente alcalino duro para liberar principalmente estructuras O-ligadas; y 3) métodos químicos que usan hidracina anhidra para liberar ambos oligosacáridos N- y O-ligados. Los análisis se pueden realizar usando los siguientes pasos: 1. Diálisis de la muestra contra agua desionizada para remover todas las sales de las solución amortiguadora, seguida de liofilización. 2. Liberación de cadenas de oligosacáridos intactas con hidrazina anhidra. 3.

El tratamiento de las cadenas de oligosacáridos intactas con HC1 metabólico anhidro para liberar monosacáridos individuales como derivados de O-metilo. 4. La N-acetilación de cualquiera de los grupos amino primarios . 5. Derivación para producir glicósidos de metil per-O-trimetilsililo . 6. Separación de estos derivados por cromatografía de gas-liquido capilar (GLC) en una columna CP-SIL8. 7. Identificación de derivados de glicósido individuales por retención de tiempo desde el GLC y espectrometría de masa, comparada con estándares conocidos. 8. Cuantificación de derivados individuales por FID con un estándar interno (13-0-metil-D-glucosa) . Los azúcares neutrales y amino se pueden determinar por cromatografía de intercambio de anión de alta resolución combinada con detección amperométrica pulsada (HPAE-PAD Carbohidrate System; Dionex Corp.). Por ejemplo, los azúcares se pueden liberar por hidrólisis en ácido trifluoroacético 20% (v/v) a 100 °C por 6 horas. Los hidrolisados se secan luego por liofilización o con Speed-Vac (Savant Instruments) . Los residuos se disuelven luego en solución de trihidrato de acetato de sodio 1% y se analizan en una columna de CLAP-AS6 (como se describe por Anumula y colaboradores, 1991, Anal. Biochem. 195; 269-280) . Alternativamente, se puede realizar el análisis de carbohidratos de inmunotransferencia . En este procedimiento los carbohidratos enlazados a proteina se detectan usando un sistema de detección de glicano comercial (Boehringer) , el cual se basa en el procedimiento de inmunotransferencia oxidante descrito por Haselbeck y colaboradores, (1993, Glicoconjugate J. , 7:63). Se sigue el protocolo de teñido recomendado por el fabricante excepto que la proteína se transfiere a una membrana de difluoruro de polivinildieno en lugar de una membrana de nitrocelulosa y las soluciones amortiguadoras de bloque contienen albúmina de suero bovino al 5% en solución amortiguadora Tris 10 mM, pH 7.4, con 0.9% de cloruro de sodio. La detección se lleva a cabo con anticuerpos anti-digoxigenina ligados con un conjugado de fosfato alcalino (Boehringer), dilución 1:1000 en solución salina amortiguada Tris usando los sustratos de fosfatasa, cloruro de 4-nitroazul tetrazolio, 0.03% (p/v) y 5-bromo-4-cloro-3-indoil-fosfato 0.03% (p/v) en 100 mM de solución amortiguadora Tris, pH 9.5, que contiene 100 mM de cloruro de sodio y 50 mM de cloruro de magnesio. Las bandas de proteína que contienen carbohidratos se visualizan usualmente en alrededor de 10 a 15 minutos. Los carbohidratos asociados con proteína también se pueden analizar por digestión con péptido-N-glicosidasa F. De acuerdo con este procedimiento el residuo se suspende en 14 µL de una solución amortiguadora que contiene 0.18% SDS, 18 mM beta-mercaptoetanol, 90 mM de fosfato, 3.6 mM EDTA, en pH 8.6, y se calienta a 100 °C por 3 minutos. Después de enfriamiento a temperatura ambiente, la muestra se divide en dos partes iguales. Una parte, la cual no se trata más, sirve como un control. La otra parte se ajusta a alrededor de 1% de detergente NP-40 seguido por la adición de 0.2 unidades de péptido-N-glicosidasa F (Boehringer) . Ambas muestras se calientan a 37 °C por 2 horas y luego se analizan por electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida. Además, el contenido de ácido siálico del producto de glicoproteina se evalúa por métodos convencionales . Por ejemplo, el ácido siálico se puede determinar separadamente por un método colorimétrico directo (Yao y colaboradores, , 1989, Anal. Biochem. 179:332-335), preferiblemente usando muestras triplicadas . Otro método de determinación de ácido siálico involucra el uso de ácido tiobarbatúrico (TBA) , como se describe por Warren y colaboradores, 1959, J. Biol. Chem. , 234:1971-1975. Todavía otro método involucra cromatografía de alta resolución, tal como se describe por H. K. Ogawa y colaboradores, 1993, J. Chromatography, 612:145-149. Ilustrativamente, para recuperar, aislar y/o purificar, la glicoproteina, el medio de cultivo celular o el lisado de célula se centrifuga para remover células de partícula y desechos de célula. El producto del polipéptido deseado se aisla o purifica de proteínas y polipéptidos solubles que contaminen por técnicas de purificación apropiadas. Los siguientes procedimientos proveen ejemplarmente, todavía métodos de purificación no limitantes para proteínas : separación o fraccionamiento en columnas de inmunoafinidad o intercambio de ión; precipitación de etanol; CLAP de fase inversa; la cromatografía en una resina, tal como sílice, o resina de intercambio de catión, por ejemplo, DEAE; cromatofocalización; SDS-PAGE; precipitación de sulfato de amonio; usando filtración de gel, por ejemplo, Sephadex G-75, Sepharose; cromatografía de sefarosa de proteína A para remoción de contaminantes de inmunoglobulina; y similares. Se pueden usar otros aditivos, tales como inhibidores de proteasa (por ejemplo, PMSF o proteinasa K) para inhibir la degradación proteolítica durante la purificación. Se debe entender por el practicante experto que los métodos de purificación para un polipéptido dado de interés pueden requerir modificaciones las cuales permiten cambios en el polipéptido expresado recombinantemente en el cultivo celular. Se prefieren particularmente aquellos procedimientos de purificación que pueden seleccionar para carbohidratos y enriquecer para ácido siálico, por ejemplo cromatografía de gel suave de intercambio de ión, o CLAP que usa resinas de intercambio de catión o anión, en la cual se recolecta (n) la(s) fracción (es) más ácidas .

Células, proteínas y cultivo celular.

En los procesos de cultivo celular o métodos de esta invención (tanto los métodos de cultivo celulars que involucran dos o más cambios de temperatura y los métodos de cultivo celulars que involucran la adición retardada de compuesto polianiónico) , las células se pueden mantener en una variedad de medio de cultivo celular, esto es, medio de cultivo basal, como se conoce convencionalmente en la técnica. Por ejemplo, los métodos son aplicables para uso con volúmenes grandes de células mantenidas en medio de cultivo celular, el cual se puede complementar con nutrientes y similares. Comúnmente, "medio de cultivo celular" (también llamado "medio de cultivo" ) es un término que se entiende por el practicante en el arte y se conoce para referirse a una solución de nutriente en la cual las células, preferiblemente células animales o mamíferas, se crecen y el cual generalmente provee por lo menos uno o más componentes de los siguientes : una fuente de energía (usualmente en la forma de un carbohidratos tal como glucosa) ; todos los aminoácidos esenciales, y generalmente los veinte aminoácidos básico, más cisteína; vitaminas y/u otros compuestos orgánicos comúnmente requeridos en concentraciones bajas; lípidos o ácidos grasos libres, por ejemplo, ácido linoleico; y elementos de traza, por ejemplo, compuestos inorgánicos o elementos que ocurren naturalmente que se requieren comúnmente en todas las concentraciones muy bajas, usualmente en el rango micromolar.

El medio de cultivo celular también se puede complementar para contener una variedad de componentes opcionales, tal como hormonas y otros factores de crecimiento, por ejemplo, insulina, transferrina, factor de crecimiento epidermal, suero, y lo similar; sales, por ejemplo, calcio magnesio y fosfato, y soluciones amortiguadores, por ejemplo, HEPES; nucleósidos y bases, por ejemplo, adenosina, timidita, hipoxantina; y proteina e hidrolisados de tejido, por ejemplo, proteina animal hidrolizada (peptona o mezclas de peptona, la cual se puede obtener de subproductos animales, gelatina purificada o material de planta) ; antibióticos, por ejemplo, gentamicina; y agentes protectores de célula, por ejemplo, un poliol Plurónico (Pluronic F68) . Se prefiere un medio de nutrición de célula que sea libre de suero y libre de productos o ingredientes de origen animal . Como se aprecia por el practicante, las células de animal o mamíferas se cultivan en un medio apropiado para las células particulares que se cultivan y lo cual se puede determinar por la persona de experiencia en la técnica sin experimentación excesiva. Se puede utilizar el medio comercialmente disponible e incluye, por ejemplo, medio Mínimo Esencial (MEM, Sigma, St. Louis, MO) ; medio Ham FIO (Sigma) ; Medio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM, Sigma) ; Medio RPMI-1640 (Sigma) ; medio de cultivo celular HyClone (HyClone, Logan, UT) ; y medio definido químicamente (CD) , el cual se formula para tipos de célula particulares, por ejemplo, Medio CD-CHO (Invitrogen, Carlsbad, CA) . Al medio ejemplar anterior se le puede agregar los componentes o ingredientes complementarios descritos anteriormente, que incluyen componentes opcionales, en concentraciones o cantidades apropiadas, como sea necesario o se desee, y como podría ser conocido y practicado por aquellos que tienen experiencia rutinaria en la técnica. Además, las condiciones de cultivo celular apropiadas para los métodos de la presente invención son aquellas que se emplean comúnmente y conocidas por lote, lote alimentado, o cultivo continuo de células, con atención pagada a pH, por ejemplo, alrededor de 6.5 hasta alrededor de 7.5; oxigeno disuelto (02) , por ejemplo, entre alrededor de 5-90% de saturación de aire y dióxido de carbono (C02) , agitación y humedad, además de temperatura. Como un ejemplo ilustrativo, no limitante, un medio de cultivo celular apropiado para los procesos de lote alimentado de la presente invención comprende un medio CD-CHO modificado (Invitrogen, Carlsbad, CA) , por ejemplo, ejemplo 1. También se puede emplear un medio de alimentación, tal como medio eRDF modificado (Invitrogen, Carlsbad, CA) , por ejemplo, Ejemplo 1 y Ejemplo 7. Se prefiere un medio de alimentación que también contiene D-galactosa. Las células de animal, células de mamífero, células de cultivo, células hospedadoras de animal o mamífero, células hospedadoras, células recombinantes , células hospedadoras recombinantes, y similares son todos términos para las células que se pueden cultivar de acuerdo con los procesos de esta invención. Tales células comúnmente son líneas de célula obtenidas o derivadas de mamíferos y son capaces de crecer y sobrevivir cuando se colocan ya sea en cultivo monocapa o cultivo de suspensión en medio que contiene nutrientes apropiados y/o factores de crecimiento. Los factores de crecimiento y nutrientes que son necesarios para el crecimiento y mantenimiento de cultivos de células particulares están disponibles para ser determinados fácilmente de forma empírica por aquellos que tiene experiencia en la técnica pertinente, tal como se describe, por ejemplo, por Barnes and Sato (1980, Cell, 22:649); en Mammalian Cell Culture, Ed. J.P. Mather, Plenum Press, NY, 1984; y en la Patente de EUA No. 5,721,121. Numerosos tipos de células se pueden cultivar de acuerdo con los métodos de la presente invención. Las células comúnmente son células animales o mamíferas que pueden expresar o secretar, o que pueden ser diseñadas molecularmente para expresar y secretar, grandes cantidades de una proteína particular, más particularmente, una glicoproteína de interés, en el medio de cultivo. Se entiende que la glicoproteína producida por una célula hospedadora puede ser endógena u homologa a la célula hospedadora. Alternativamente, y preferiblemente, la glicoproteina es heteróloga, esto es, externa a la célula hospedadora, por ejemplo, una glicoproteina humana producida y secretada por una célula hospedadora de ovario de hámster chino (CHO) . Preferiblemente también, las glicoproteínas mamíferas, esto es, aquellas originalmente obtenidas o derivadas de un organismo mamífero, se logran por los métodos de la presente invención y preferiblemente son secretados por las células en el medio de cultivo. Los ejemplos de glicoproteínas mamíferas que se pueden producir provechosamente por los métodos de esta invención incluyen, sin limitación citocinas, receptores de citosina, factores de crecimiento (por ejemplo, EGF, HER-2, FGF-a, FGF-ß, TGF-o¡, TGF-ß, PDGF. IGF-1, IGF-2, NGF, NGF-ß) ; receptores de factor de crecimiento, que incluyen proteínas de fusión o quiméricas. Otros ejemplos no limitantes incluyen hormonas de crecimiento (por ejemplo, hormona de crecimiento humana, hormona de crecimiento bovina) ; insulina (por ejemplo, cadena de insulina A y cadena de insulina B) , proinsulina; eritropoietina (EPO) ; factores de estimulación de colonia (por ejemplo, G-CSF, GM-CSF, M-CSF) ; interleucinas (por ejemplo, IL-1 a través de IL-12) ; factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y su receptor (VEGF-R) ; interferonas (por ejemplo, INF-a, ß, ó ?) ; factor de necrosis de tumor (por ejemplo, TNF-OÍ y TNF-ß) y sus receptores, TNFR-1 y TNFR-2; trom opoyetina (TPO) ; trombina; péptido natriurético de cerebro (BNP) ; factores de coagulación (por ejemplo, Factor VIII, Factor IX, factor von Willebrands, y similares) ; factores de anti-coagulación; activador del plasminógeno de tejido (TPA), por ejemplo, urocinasa u orina humana o tipo de tejido TPA; hormona estimulante del folículo (FSH) ; hormona de luteinización (LH) ; calcitonina; proteínas-CD (por ejemplo, CD3 , CD4 , CD8, CD28, CD19, etc.); proteínas CTLA (por ejemplo, CTLA4) ; proteínas receptoras de célula T y célula B; proteínas morfogénicas de hueso (BNP, por ejemplo, BMP-1, BMP-2, BMP-3, etc.); factores neurotróficos, por ejemplo, factor neurotrófico derivado de hueso (BDNF) ; neurotrófinas, por ejemplo, 3-6; renina; factor reumatoide; RANTES; albúmina; relaxina; proteína inhibidora de macrófago (por ejemplo, MIP-1, MIP-2) ; proteínas o antígenos virales; proteínas de membrana de superficie; proteínas de canal de ion; enzimas; proteínas reguladoras; anticuerpos; proteínas inmunomoduladoras , (por ejemplo, HLA, MHC, la familia B7) ; receptores de alojamiento; proteínas de transporte; dismutasa de superóxido (SOD) ; proteínas de receptor acopladas a proteína G (GPCR) ; proteínas neuromoduladoras ; proteínas y péptidos asociados con la Enfermedad de Alzheimer, (por ejemplo. A-beta) , y otros como los conocidos en la técnica. Las proteínas y polipéptidos de fusión, proteínas y polipéptidos quiméricos, además de fragmentos o porciones, o imitantes, variantes, o análogos de cualquiera de las proteínas y polipéptidos antes mencionadas también se incluyen entre las proteínas, polipéptidos y péptidos apropiados que se pueden producir por los métodos de la presente invención. Los ejemplos no limitantes de células hospedadoras de animales o mamíferos apropiadas para alojar, expresar, y producir proteínas para aislamiento y/o purificación subsiguiente incluyen células de ovario de hámster Chino (CHO) , tal como CHO- 1 (ATCC CCL-61) , DG44 (Chasin y colaboradores, 1986, Som. Cell Molec . Genet., 12:555-556; Kolkekar y colaboradores, 1997, Biochemistry, 36:10901-10909; y WO 01/92337 A2) , células CHO negativas de reductasa de dihidrofolato (CHO/-DHFR, Urlaub y Chasin, 1980, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 77:4216), y células dp 12. CHO (Patente de EÜA No. 5,721,121); células CVl de riñon de mono transformadas por SV40 (células COS, COS-7, ATCC CRL-1651) ; células de riñon embriónicas humanas (por ejemplo, células 293, ó células 293 subclonadas para crecimiento en cultivo de suspensión, Graham y colaboradores, 1977, J. Gen. Virol . , 36:59); células de riñon de hámster bebé (BHK, ATCC CCL-10) ; células de riñon de mono (CVl, ATCC CCL-70) ; células de riñon de mono (CVl, ATCC CCL-70) ; células de riñon de mono verde de África (VERO-76, ATCC CRL-1587; VERO, ATCC CCL-81) ; células sertoli de ratón (TM4, Mat er, 1980, Biol. Reprod., 23:243-251) ; células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL-2) ; células de riñon canino (MDC , ATCC CCL-34) ; células de pulmón humano (W138, ATCC CCL-75) ; células de hematoma humano (HEP-G2, HB 8065) células de tumor de mamario de ratón ( MT 060562, ATCC CCL-51) ; células de hígado de rata búfalo (BRL 3A, ATCC CRL-1442) ; células TRI (Mather, 1982, Annals NY Acab. Sci., 383:44-68); células MCR 5; células FS4. Las células preferidas con CHO, particularmente células CHO/-DHFR. Las células apropiadas para cultivarse en los métodos y procesos de la presente invención pueden contener introducidos, por ejemplo, por vía de transformación transfección y infección, o inyección, vectores de expresión (constructos) tal como plásmidos y similares, que portan secuencias codificantes, o porciones de las mismas, que codifican las proteínas para expresión y producción en los procesos de cultivo. Tales vectores de expresión contienen los elementos necesarios para la transcripción y traducción de la secuencia modificada insertada. Los métodos que son bien conocidos y practicados por aquellos expertos en el arte pueden usarse para construir vectores de expresión que contienen las secuencias que codifican las proteínas y polipéptidos producidos, así como los elementos de control transcripcional y traduccional . Estos métodos incluyen las técnicas de ADN recombinante in vitro, técnicas sintéticas, y de recombinación genética in vivo. Tales técnicas se describen en J. Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y. y en F.M.Ausubel et al., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y. Los elementos del control o secuencias reguladoras son aquellas regiones no traducidas del vector, por ejemplo, aumentadores, promotores, regiones no traducidas 5' y 3', que interactúan con las proteínas celulares hospedadoras para llevar a cabo la transcripción y traducción. Tales elementos pueden variar en su fuerza y especificidad. Dependiendo del sistema vector y la células hospedadora utilizada, cualquier número de elementos de transcripción y traducción apropiados, incluyendo promotores constitutivos e inducibles, pueden usarse. En los sistemas de células de mamífero, los promotores de genes de mamífero o de virus de mamífero se prefieren. Los constructos para usarse en los sistemas de expresión de proteínas se designan para contener al menos un promotor, una secuencia aumentadora (opcional, para sistemas de expresión de mamíferos) , y otras secuencias como sea necesario o como se requiera para la transcripción y regulación apropiada de la expresión del gen (por ejemplo, secuencias de terminación de inicio transcripcional, origen de sitios de replicacion, secuencias de poliadenilación, por ejemplo, secuencia poli ? de la hormona de crecimiento de bovino (BGH) . Como se apreciará por aquellos expertos en el arte, la selección del vector apropiado, por ejemplo, plásmido, componentes para la transcripción apropiada, expresión, y asilado de proteínas producidas en sistemas de expresión eucarióticos (por ejemplo, mamíferos) , se conoce y se determina rutinariamente por aquellos que tiene experiencia en el arte. La expresión de proteínas por las células cultivas de conformidad con los métodos de esta invención puede colocarse bajo el control de promotores tales como promotores virales, por ejemplo, citomegalovirus (CMV) , virus de sarcoma de ous (RSV) , fosfoglicerol cinasa (PGK) , timidina cinasa (TK) , o el promotor -actina. Además, los promotores reguladores que confieren inducibilidad por compuestos o moléculas particulares, por ejemplo, el elemento de respuesta glucocorticoide (GRE) del virus de tumor de mamífero ratón (MMTV) se induce por glucocorticoides (V. Chandler et al., 1983, Cell, 3_3: 89-499) . También, los promotores específicos de tejido o elementos reguladores pueden usarse (G. Swift et al., 1984, Cell, 38: 639-646), si es necesario o se desea.

Los constructos de expresión pueden introducirse en las células en una variedad de métodos de transferencia de genes conocidos por aquellos expertos en el arte, por ejemplo, métodos de transfección de genes convencional, tales como co-precitación de fosfato de calcio, transfección liposomal, microinyección, electroporación, e infección o transducción viral. La elección del método está dentro de la competencia del practicante habilidoso en el arte. Será aparente para aquellos expertos en el arte que uno o más constructos que portan las secuencias de ADN para la expresión en células pueden transfectarse en las células de tal manera que los productos de expresión se producen posteriormente en y/o se obtienen de las células . En un aspecto particular, los sistemas de expresión de mamífero que contienen la secuencia de control y reguladora apropiadas se prefieren para usarse en las células de mamífero que expresan la proteína de la presente invención. Las secuencias de control eucarióticas comúnmente usadas para generar vectores de expresión mamíferos, incluyen secuencias promotoras y de control compatibles con células de mamífero tales como, por ejemplo, el promotor citomegalovirus (CMV) (vector CDM8) y el vector nLN del virus de sarcoma de ave (ASV) . Otros promotores comúnmente usados incluyen los promotores temprano y tardío del virus 40 de simio (SV40) (Fiers et al., 1973, Nature, 273;113), u otros promotores virales tales como aquellos derivados del polioma, Adenovirus 2, y virus del papiloma de bovino. Un promotor inducible tal como hMTII (Karin et al., 1982. Nature, 299:797-802) puede también usarse. Los ejemplos de vectores de expresión apropiados para células hospedadoras eucarióticas incluyen, pero no se limitan a, vectores para células hospedadoras de mamífero (por ejemplo, BPV-1, pHyg, pRSV, pSV2, pTK2 (Maniatis) ; plRES (Clontech) ; pRc/CMV2, pRc/RSV, pSFVl (Life Technologies); vectores pVPakc, vectores pCMV, vectores pSG5 (Stratagene) , vectores retrovirales (por ejemplo, vectores pFB (Stratagene)), pcADN-3 (Invitrogen) vectores adenovirales ; vectores de virus asociados con adeno; vectores de baculovirus, vectores de levadura (por ejemplo, vectores pESC (Stratagene) ) , o formas modificadas de cualesquiera de los anteriormente mencionados. Los vectores también pueden contener secuencias aumentadores en dirección ascendente o dirección descendente de la secuencia de región de promotor para optimizar la expresión del gen. Un marcador seleccionable puede usarse en un vector recombinante (por ejemplo, un plásmido) para conferir resistencia a las células que forman (preferiblemente, que tienen establemente integrado) el vector para permitir su selección en un medio de selección apropiado. Un número de sistemas de selección pueden usarse, incluyendo pero no limitado a, los genes de la timidina cinasa del virus de herpes simplex (HSV T ) , (Wingler et al., 1977, Cell, 11:223), la hipoxantina-guanina fosforibosiltransferasa (HGPRT) , (Szybalska and Szyblaski, 1992, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 48.202), y la adenina fosforibosiltransferasa (Lowy et al., 1980, Cell, 22:817) que pueden emplearse en células tk-, hgprt-, o aprt- (APRT) , respectivamente. La resistencia anti-metabolito también puede usarse para la base de selección para los siguientes ejemplos no limitantes de genes marcadores: dhfr que contiene resistencia al metotrexato (Wingler et al., 1980, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 77:357; y O'Hare et al., 1981, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 78:1527); gpt , que confiere resistencia al ácido micofenólico (Mulligan and Berg, 1981, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 78:2072); neo, que contiene resistencia al aminoglicosido G418 (Clinical Pharmacy, 12:488-505; Wu and Wu, 1991, Biotherapy, 3:87-95; Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol . Toxicol., 32:573-596; Mulligan, 1993, Science, 260:926-932; Anderson, 1993, Ann. Rev. Biochem. , 62:191-21; Mayo 1993, TIB TECH, 11(5): 155-215; e higro, que confiere resistencia a la higromicina (Santerre et al., 1984, Gene, 30:147). Los métodos comúnmente usados en el arte de la tecnología de ADN recombinante pueden aplicarse rutinariamente para seleccionar los clones celulares recombinantes deseados, y tales métodos se describen, por ejemplo, en Ausuble et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993) ; Kriegler, 1990, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY; en los capítulos 12 y 13, Dracopoli et al. (eds), Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY (1994); Colberre-Garapin et al., 1981. J. Mol. Biol . , 150:1, que se incorporan para referencia en la presente en su totalidad. Además, los niveles de expresión de una molécula de proteina expresada pueden incrementarse por la amplificación del vector (para una revisión, ver Bebbington and Hentschel "The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning", Vol . 3, Academic Press, New York, 1987). Cuando un marcador en el sistema vector que expresa una proteína es amplificable, un incremento en el nivel de inhibidor presente en el cultivo celulars hospedadoras, incrementará el número de copias del gen marcador. Ya que la región amplificada se asocia con el gen que codifica la proteína, la producción de la proteína se incrementa concomitantemente (Crouse et al., 1983, Mol. Cell. Biol., 3:257). Los vectores que alojan el ácido nucleico que codifica la glutamina sintasa (GS) o dihidrofolato reductasa (DHFR) como los marcadores seleccionables , pueden modificarse en presencia de los fármacos de metionina sulfoximina o metotrexato, respectivamente. Una ventaja de los vectores basados en glutamina sintasa es la disponibilidad de líneas celulares (por ejemplo, la línea celular de mieloma de murino, NSO) que son de glutamina sintasa negativa. Los sistemas de expresión de glutaminas sintasa también funcionan en células que expresan glutamina sintasa (por ejemplo, células CHO) al proporcionar un inhibidor adicional para prevenir la funcionalidad el gen endógeno. Los vectores que expresan DHFR como el marcador seleccionable incluyen, pero no se limitan a, el plásmido pSV2-dhfr (Subramani et al., Mol. Cell. Biol . 1:854 (1981). Los vectores que expresan la glutamina sintasa como el marcador seleccionable incluyen, pero no se limitan a, el vector de expresión pEE6 descrito en Stephens and Cockett, 1989, Nucí, Acids . Res., 17:7110. Un sistema de expresión de glutamina sintasa y los componentes de la misma se detallan en las publicaciones PCT: W087/04462; 086/05807; W089/01036; 089/10404; y W091/06657 que se incorporan para referencia en la presente en su totalidad. Además, los vectores de expresión de glutamina sintasa que pueden usarse de conformidad con la presente invención están comercialmente disponibles de distribuidores que incluyen, por ejemplo, Lonza Biologics, Inc. (Portsmouth, NH) . En una modalidad particular, una secuencia de ácido nucleico que codifica una molécula CTLA4 soluble o una molécula mutante CTLA4 soluble pueden insertarse en el vector designado para expresar las secuencias anteriores en un hospedador eucariótico. Los elementos reguladores del vector pueden variar de conformidad con el hospedador eucariótico particular. Los vectores que expresan la CTLA4 soluble o el mutante CTLA4 soluble en células hospedadores eucarióticas pueden incluir secuencias aumentadoras para optimizar la expresión de proteína.

Tipos de cultivos celulares . Para los propósitos de entendimiento, aún sin limitación, se apreciará por el practicante experimentado que los cultivos de células y las corridas de cultivo para la producción de proteína pueden incluir tres tipos generales; nominalmente, cultivo continuo, cultivo intermitente y cultivo de lote alimentado. En un cultivo continuo, por ejemplo, se suministra un complemento del medio de cultivo fresco (esto es, medio de alimentación) a la célula durante el periodo de cultivo, mientras que el medio de cultivo viejo se elimina diariamente y el producto se cosecha, por ejemplo, diaria o continuamente. En cultivo continuo, se puede agregar diariamente el medio de alimentación y se puede agregar continuamente, esto es, como una inmersión o infusión. Para el cultivo continuo, las células pueden permanecer en cultivo tanto como se desee, de manera que las células permanezcan vivas y se mantengan las condiciones ambientales y de cultivo . En cultivo intermitente, las células se cultivan inicialmente en un medio y este medio ni se elimina, reemplaza, ni se complementa, esto es, las células no se "alimentan" con nuevo medio, durante o antes del final de la corrida de cultivo. El producto deseado se cosecha al final de la corrida de cultivo. Para cultivos de lote alimentado, el tiempo de corrida del cultivo se incrementa al complementar el medio de cultivo una o más veces diariamente (o continuamente) con medio fresco durante la corrida, esto es, las células se "alimentan" con un nuevo medio ("medio de alimentación") durante el periodo de cultivo. Los cultivos de lote alimentado pueden incluir los diversos regímenes de alimentación y tiempos como se describen arriba, por ejemplo, diariamente, cada tercer día, cada dos días, etc, más de una vez por día, o menos de una vez por día, y así sucesivamente. Además, los cultivos de lote alimentado se pueden alimentar continuamente con un medio de alimentación. El producto deseado luego se cosecha al final de la corrida de producción/cultivo . La presente invención abarca preferiblemente cultivos de células de lote alimentado, en los cuales los dos o más cambios de temperatura durante el periodo de cultivo producen una producción creciente de una proteina de calidad y pueden prolongar la fase de producción · de proteínas mas allá de la cual sucede cuando no se usa un cambio de temperatura, o cuando solamente se usa un cambio de temperatura. La presente invención abarca preferiblemente cultivos de células de lote intermitente en el cual el compuesto polianiónico se agrega en un tiempo después de la inoculación. También se vislumbra que en los métodos de cultivo de la presente invención, el medio de alimentación se puede complementar para que contenga D-galactosa o D-galactosa se puede alimentar al cultivo a través de algunos medios diferentes al medio de cultivo. La alimentación con un medio de alimentación que contiene galactosa, u otra forma de alimentación, sucede preferiblemente en una base diaria (o continuamente) durante y hasta el final de la corrida de cultivo, aunque pueden aplicar otros programas de alimentación. En tal régimen de alimentación continuo los cultivos reciben D-galactosa preferiblemente de un medio de alimentación por ejemplo, como una "inmersión" suministrada continuamente o infusión u otra adición automatizada al cultivo, en una forma de tiempo, regulada y/o programada de manera de lograr y mantener la cantidad adecuada de galactosa en el cultivo. Es más preferido un régimen de alimentación que comprende una alimentación de bolo de una vez al día con un medio de alimentación que contiene galactosa cada día de la corrida de cultivo desde el comienzo de la corrida de cultivo al día de la cosecha de las células . De acuerdo con los métodos de esta invención que involucran alimentación con galactosa, la concentración de galactosa en el medio de alimentación se suministra preferiblemente en una cantidad que permite un nivel sostenido o mantenido de D-galactosa en el cultivo o reactor durante el proceso de cultivo. Una cantidad de D-galactosa adecuada para su uso en el medio de alimentación comprende desde alrededor de 1 g/L hasta alrededor de 50 g/L, preferiblemente alrededor de 3 g/L hasta alrededor de 25 g/L, más preferiblemente alrededor de 3 g/L hasta alrededor de 20 g/L. Como un ejemplo específico aún no limitativo, 12.5 g/L de D-galactosa en el medio de alimentación es adecuado para su uso en el método de cultivo de la invención, particularmente, por ejemplo, para una escala de reactor de 50 L. Además, se prefiere que la concentración residual de galactosa en el medio de cultivo usado para cultivo celulars (por ejemplo en un recipiente de cultivo o reactor) se mantiene y sostiene a lo largo de la corrida de cultivo en una cantidad de alrededor de 0.1-10 g/L, preferiblemente alrededor de 0.1-5 g/L, más preferiblemente alrededor de 0.2-5 g/L, más preferiblemente alrededor de 0.2-2.5 g/L, aún más preferiblemente 0.5-2 g/L y más preferiblemente alrededor de 0.5-1.0 g/L. (Ver las solicitudes de patente cedidas comúnmente con número de serie US No. 60/436,050, presentada el 23 de diciembre de 2002 y el número de serie 10/ , presentada en paralelo con la presente, los contenidos de las cuales se incorporan en la presente como referencia en su totalidad) . En los aspectos de la invención que involucran dos o más cambios de temperatura, los dos o más cambios de temperatura comprenden los procesos de cultivo celulars de esta invención resultan en células más viables que sobreviven en cultivo hasta el final de la corrida de proceso o de producción. Entre mayor el número de células que sobreviven, mayor la cantidad de producto de proteína que se produce en un proceso no asociado al crecimiento de la producción de proteína, tal como alguno de aquellos aquí ejemplificados. Así en tales casos, una mayor cantidad acumulada de un producto deseado resulta al final del proceso. De acuerdo con la presente invención, la tasa de producción de proteína o glicoproteina por las células individuales en el cultivo (esto es, la productividad específica de células) no se afecta o incrementa por los procesos de cultivo con cambio de temperatura de la invención (por ejemplo, ver a continuación y Ejemplo 4) . De acuerdo con la presente invención, el cultivo celulars se puede llevar a cabo, y las glicoproteínas se pueden producir por las células, bajo las condiciones para la producción a gran o pequeña escala de las proteínas, usando recipientes de cultivo y/o aparatos de cultivo que se emplean convencionalmente para cultivo celulars animales o mamíferas . Como se aprecia por aquellos que tienen experiencia en la técnica, los platos de cultivo de tejido, matraces T y matraces giratorios se usan típicamente a una escala de laboratorio. Para cultivar una escala mayor (por ejemplo, 500 L, 5000 L, y similares, como se describe en la solicitud de patente cedida comúnmente con número de serie US No. 60/436,050, presentada el 23 de diciembre de 2002 y el número de serie US 10/ , presentada en paralelo con la presente, los contenidos de las cuales se incorporan en la presente como referencia en su totalidad) , los procedimientos incluyen, pero no se limitan a, un bioreactor de lecho fluidizado, un bioreactor de fibra hueca, un cultivo en botella de rodillo, o sistemas de bioreactor de tanque agitado se pueden usar. Se pueden o no usar microportadores con .ros sistemas de bioreactor de tanque agitado o de botella de rodillo. Los sistemas se pueden operar en un modo intermitente, continuo o intermitente alimentado. Además, el aparato o sistema de cultivo puede o no equiparse con un separador de células usando filtro, gravedad, fuerza centrífuga y similares.

Fases del cultivo celular y parámetros asociados El término "inoculación" se refiere a la adición de células al medio de partida para comenzar el cultivo. La fase de crecimiento de cultivo es la fase durante la cual la densidad de células viable en cualquier punto de tiempo es mayor que cualquier punto de tiempo previo. La fase estacionaria de un cultivo es la fase durante la cual la densidad de células viables es aproximadamente constante (esto es, dentro del error de medición) durante un periodo de tiempo de cualquier duración. La fase de muerte de un cultivo es la fase que viene después de la fase de crecimiento o después de la fase de crecimiento y la fase estacionaria, y durante la cual la densidad de células viables en cualquier punto de tiempo es menor que en cualquier punto de tiempo previo durante esa fase. En un proceso de cultivo asociado con el crecimiento, tales como los casos en donde un compuesto polianiónico provoca una fase jje crecimiento extendida, la fase de producción pueden comenzar durante la fase de crecimiento extendida.

En un proceso de cultivo no asociado con el crecimiento, la fase de producción del cultivo celular puede ser la fase estacionaria. Preferiblemente, el medio de cultivo se complementa ( "alimenta" ) durante la fase de producción para soportar una producción continua de proteínas, particularmente en una fase de producción prolongada, y para alcanzar cantidades amplias de producto de glicoproteína de alta calidad (como se ejemplifica y/o determina en un alto nivel del contenido final del ácido siálico con la recuperación de proteínas) . La alimentación puede suceder en un base diaria, o de acuerdo con otros programas para soportar la viabilidad celular y la producción de proteínas . Durante una fase de producción prolongada a temperaturas que se cambian para hacer sucesivamente inferiores que la temperatura y las fases de producción estándar (inicial) y crecimiento, las células se alimentan y permanecen viables. Esto resulta en la producción del producto de proteína deseado por un periodo total prolongado o extendido de tiempo que sucede a una temperatura de cultivo inicial, o cuando la temperatura se cambia desde la temperatura de cultivo inicial solamente una vez. El proceso de cultivo de acuerdo con la presente invención, puede resultar en una supervivencia celular más viable hasta el final del periodo de cultivo. En consecuencia, en algunas modalidades, entre más células sobrevivan, más células que están produciendo el producto deseado. Esto, a su vez, resulta en una cantidad mayor acumulada del producto al final del proceso de cultivo, con la velocidad de producción con la proteína por las células individuales, esto es, productividad específica de células, que permanece igual (ver, por ejemplo, Ejemplo 4) . La productividad específica de la célula o velocidad específicas de células, como se conoce en el arte, se refiere típicamente a la velocidad de expresión específica del producto producido por célula, o por medida de masa o volumen celular, la productividad específica de células se mide en gramos de proteína producidos por células por día, por ejemplo, y se puede medir de acuerdo con un método integral que involucra las siguientes fórmulas: dP/dt = qp X, o donde qp es la constante de productividad específica de células; X es el número de células o volumen celular, o equivalentes de masa celular; y dP/dt es la velocidad de producción de proteína. Así, qp se puede obtener a partir de una gráfica de concentración de producto contra la integral de tiempo de las células viables (Jo*1 Xdt "días de células viables") . De acuerdo con esta fórmula, cuando la cantidad de producto de glicoproteína producida se gráfica contra los días de células viables, la pendiente es equivalente a la velocidad específica de las células . Las células viables se pueden determinar por diversas medidas, por ejemplo, biomasa, velocidad de absorción de 02, deshidrogenasa lactasa (LDH) , volumen o turbidez de células empacadas, (por ejemplo, patente de E.U.A No. 5,705,364 para T Etcheverry et al.) Producción de moléculas solubles CTLA4 y moléculas mutantes solubles CTLA4 por los métodos de cultivo de la presente invención. En otras modalidades abarcadas por la presente invención, se utilizan los métodos de cultivo celulars para producir una molécula soluble CTLA4 o una molécula mutante soluble CTLA4, como se describe a continuación. Una molécula soluble CTLA4 es preferiblemente una proteina de fusión CTLA4 , preferiblemente una CTLA4Ig. Más preferido es CTLA Ig que comprende los aminoácidos -1 hasta 357 o + 1 hasta 357 como se muestra en la Figura 8. Una molécula mutante soluble CTLA4 es preferiblemente L104EA29YIg que comprende los aminoácidos -1 hasta 357 o +1 hasta 357 como se muestra en la Figura 9, más preferiblemente que consisten de los aminoácidos -1 hasta 357 o +1 hasta 357 como se muestra en la Figura 9. Los métodos de cultivo celulars con cambio de temperatura de dos y tres etapas que involucran fases de producción prolongadas para el producto de proteína y alimentación con un medio que contiene D-galactosa, son especialmente adecuados para la generación de cantidades grandes y de alta calidad de las moléculas solubles CTLA4 y las moléculas mutantes solubles CTLA4, por sus células hospedadoras en cultivo. En una modalidad preferida CTLA4Ig se produce por células hospedadoras preparadas recombinantemente por ingeniería. La proteína de fusión CTLA4Ig se puede producir recombinantemente por células CHO transfectadas con un vector que contiene la secuencia de ADN que codifica CTLA4Ig (ver patente de E.U.A No. 5,844,095 para P.S Linsley et al., y los Ejemplos en la presente) . La proteína de fusión CTLA4Ig se producen en alta cantidad y se sialila adecuadamente cuando se cultiva de acuerdo con los procesos de cambio de temperatura de etapas múltiples de esta invención. La invención permite la producción de altos niveles de producto de proteína recuperable, por ejemplo, producto de proteína sialilada CTLA4Ig. En otra modalidad preferida, la molécula mutante soluble CTLA4 L104EA29YIg que comprende los aminoácidos -1 hasta 357 o +1 hasta 357 como se muestra en la Figura 9, se produce por los métodos de cultivo celulars de la presente invención. Un ligando para CTLA4 es una molécula B7. Como se usa en la presente, "ligando" se refiere a una molécula que reconoce específicamente y se enlaza con otra molécula. La interacción de una molécula y su ligando se puede regular por los productos de los procesos de cultivo de esta invención. Por ejemplo, la interacción CTLA4 con su ligando B7 puede bloquearse por la administración de moléculas CTLA4Ig. Como otros ejemplos, la interacción del factor de necrosis de tumor (TNF) con su ligando, el receptor TNF (TNFR) , se puede bloquear por la administración de etanercept u otras moléculas bloqueadoras de TNF/TNFR. El CTLA4 de tipo silvestre o "CTLA4 no mutado" , tiene la secuencia de aminoácidos de CTLA4 de longitud completa, que se presenta naturalmente, como se muestra en la Figura 10 (y también como se describe en las patentes de E.U.A Nos. 5,434,131, 5,844,095, y 5,851,795, que se incorporan en la presente como referencia en su totalidad) o cualquier porción de la misma que reconoce y enlaza a una molécula B7, o interfiere con una molécula B7 de manera que el enlace a CD28 y/o CTLA4 (por ejemplo, CD28 y/o CTLA4 endógeno) se bloquea. El CTLA4 de tipo silvestre comprende porciones particulares, que incluyen, por ejemplo, el dominio extracelular del tipo silvestre CTLA4 que comienza con la metionina en la posición + 1 y finaliza en el ácido aspártico en la posición +124, o el dominio extracelular del tipo silvestre CTLA4 que comienza con la alanina en la posición -1 y termina en el ácido aspártico en la posición +124 como se muestra en la Figura 10. El CTLA4 de tipo silvestre que se presenta naturalmente es una proteína de superficie celular que tiene un dominio extracelular en la terminal N, un dominio de transmembrana, y un dominio citoplásmico en la terminal C. El dominio extracelular se enlaza a una molécula objetivo, tal como una molécula B7. En una célula, la proteína CTLA4 de tipo silvestre que se presenta naturalmente se traduce como un polipéptido inmaduro, que incluye un péptido de señal en la terminación amino en la terminal N, final. El polipéptido inmaduro se somete a un procesamiento postraduccional, que incluye desdoblamiento y eliminación del péptido de señal para generar un producto de desdoblamiento CTLA4 que tiene una extremo terminal N recientemente generado que difiere de el extremo terminal N en la forma inmadura. Alguien experto en el arte apreciará que puede suceder el procesamiento adicional postraduccional, que elimina uno o más de los aminoácidos del extremo terminal N recientemente generado del producto de desdoblamiento CTLA4. La proteína madura CTLA4 puede comenzar en la metionina en la posición +1 o en la alanina en la posición -1. La forma madura de la molécula CTLA4 incluye el dominio extracelular o cualquier porción del mismo que se enlaza a B7. Una molécula mutante CTLA4 , como se usa en la presente, se refiere a una molécula que comprende la CTLA4 de tipo silvestre como se muestra en la Figura 5, o cualquier porción o derivado de la misma, que tiene una mutación, o mutaciones múltiples, en la secuencia CTLA4 de tipo silvestre, preferiblemente en el dominio extracelular del CTLA4 de tipo silvestre, y se enlaza a B7. Una molécula mutante CTLA4 tiene una secuencia que es similar, pero no idéntica, a la secuencia de la molécula CTLA4 de tipo silvestre, pero se enlaza todavía a B7. Las mutaciones pueden incluir uno o más residuos de aminoácidos substituidos con un aminoácido que tiene una estructura conservadora (por ejemplo, una leucina substituida por una isoleucina) o no conservadora (por ejemplo, una glicina substituida con un triptofano) o propiedades químicas, eliminaciones de aminoácidos, adiciones, cambios de estructura, o truncamientos. Las moléculas mutantes CTLA4 pueden incluir una molécula que no es de CTLA4 en ella o colocada a ella, esto es, proteínas de fusión mutantes CTLA . Las moléculas mutantes pueden ser solubles (esto es, en circulación) o se pueden enlazar a una superficie celular (enlazada por membrana) . Las moléculas mutantes CTLA4 incluyen L104EA29YIg y aquellas descritas en la solicitud de patente de E.U.A Nos de serie 09/865,321, 60/214,065 y 60/287,576, en WO 01/92337 A2; en la patente de E.U.A No. 6,090,914, 5,844,095 y 5,773,253; y como se describe en R.J. Peach et al., 1994, J. Exp Med, 180:2049-2058. Las moléculas mutantes CTLA4 se pueden producir sintéticamente o recombinantemente . La CTLA4Ig es una proteína de fusión soluble que comprende un dominio extracelular de CTLA4 de tipo silvestre, o una porción del mismo que se enlaza a B7, unido a una molécula de inmunoglobulina (Ig) , o una porción de la misma. El dominio extracelular de CTLA4 o una porción del mismo se une a una porción Ig que comprende todo o una porción de una molécula de inmunoglobulina, preferiblemente todo o una porción de una región constante de inmunoglobuilina tal como todo o una porción de IgCyl (IgCgammal) , IgCy2 (IgCgamma2) , IgCy3 (IgCgamma3), IgCy4 (IgCgamma4 ) , ¾0µ (¾??µ) , IgCal (IgCalfal) , IgCoc2 (IgCalfa2) , IgC6 (IgCdelta) , o IgCs (IgCepsilon) , que producen la molécula de fusión soluble. La porción Ig puede incluir los dominios de articulación, CH2 y CH3, o los dominios CH1, articulación, CH2 y CH3 , de las regiones constantes anteriormente mencionadas o de otras regiones constantes. Preferiblemente, la porción Ig es humana o de mono y comprende los dominios de articulación, CH2 y CH3. Más preferiblemente la porción Ig comprende los dominios de articulación, CH2 y CH3 del IgCyl humano, o consiste de los dominios de articulación, CH2 y CH3 del IgCyl humano. En una porción Ig de CTLA4Ig, la región constante de Ig o porción de la misma se puede mutar, resultando así en una reducción de sus funciones del efector (ver, por ejemplo, las patentes de E.U.A. Nos. 5,637,481, 5,844,095 y 5,434,131). Como se usa en la presente, los términos porción Ig, región constante Ig, dominio Ig C (constante) , IgCyl (IgCgammal) , IgCy2 (IgCgamma2) , IgCy3 (IgCgamma3) , IgCy4 (IgCgamma4) , ¾0µ (¾??µ) , IgCal (IgCalfal) , IgCa2 (IgCalfa2) , IgC5 (IgCdelta) , o IgCs (IgCepsilon) , incluyen tanto secuencias nativas como secuencias que han sido imitadas, tales como, por ejemplo, secuencias que tiene mutaciones en la región constante que reduce la función del efector. Una modalidad particular relacionada con CTLA4 comprende el dominio extracelular del CTLA4 de tipo silvestre partiendo de la metionina en la posición +1 y terminando en el ácido aspártico en la posición +124, o partiendo de la alanina en la posición -1 hasta el ácido aspártico en la posición +124; una glutamina de un residuo de aminoácido de unión en la posición +125 y una porción de inmunoglobulina que abarca el ácido glutámico en la posición +12S a través de la lisina a la posición +357, como se muestra en la Figura 8. El ADN que codifica esta CTLA4Ig se depositó el 31 de Mayo de 1991, en la American Type Culture Collection (ATCC) , 10801 University Blvd. , Manassas, VA 20110-2209, bajo las disposiciones del tratado de Budapest, y de esta manera se acordó un número ATCC de acceso ATCC 68629; P. Linsley et al., 1994, Immunity 1:793-80. Una linea celular CHO que expresa CTLA4Ig se depositó el 31 de Mayo de 1991 en la ATCC bajo el número de identificación CRL-10762. Las moléculas solubles CTLA Ig producidas de acuerdo con los métodos aqui descritos pueden o no incluir una secuencia de péptidos de señal (líder) . Las Figuras 8 y 9 incluyen una ilustración de una secuencia de péptido de señal (líder) . Típicamente, las moléculas no incluyen una secuencia de péptido de señal . La L104EA29YIg es una proteína de fusión que es una molécula mutante soluble CTLA4 que comprende un dominio extracelular de CTLA4 de tipo silvestre con cambios de aminoácidos A29Y (un residuo de aminoácido de tirosina substituido por una alanina en la posición 29) y L104E (un residuo de aminoácido glutámico que se substituye por una leucina en la posición +104) unido a un extremo Ig. La Figura 9 ilustra la L104EA29YIg. La secuencia de aminoácido de L104EA29YIg comprende alanina en la posición -1 del aminoácido hasta lisina en la posición de aminoácido +357 como se muestra en la Figura 9. Alternativamente, la secuencia de aminoácido de L104EA29YIg comprende metionina en la posición de aminoácido +1 hasta la lisina en la posición de aminoácidos +357 como se muestra en la Figura 9. La L104EA29YIg comprende una glutamina en el residuo de aminoácido de unión en la posición +125 y una porción Ig que abarca el ácido glutámico en la posición +126 a través de la lisina en la posición +357. El ADN que codifica la L104EA29YIg se depositó el 20 de Junio de 2000 en la American Type Culture Collection (ATCC) bajo las disposiciones del tratado de Budapest y se le acordó el número de acceso ATCC PTA-2104. La 104EA29Y-Ig se describe en la solicitud de patente de E.U. copendiente Números de serie 09/579,927, 60/287,576 y 60/214,065 y en WO/01/923337 A2, que se incorporan como referencia en la presente en sus totalidades. Las moléculas solubles L104EA29YIg producidas por los métodos de cultivo de esta invención pueden o no incluir una secuencia de un péptido de señal (líder) . Típicamente, las moléculas producidas de acuerdo con la invención, no incluyen una secuencia de péptido de señal . Como se usa en la presente, el término soluble se refiere a cualquier molécula o fragmento de la misma no enlazada o colocada a una célula, esto es circulante. Por ejemplo, CTLA4, B7 o CD28 se puede hacer soluble al colocar una porción Ig al dominio extracelular de CTLA4, B7 o CD28, respectivamente. Alternativamente, una molécula tal como CTLA4 se puede hacer soluble al retirar su dominio de transmembrana. Típicamente, las moléculas solubles producidas de acuerdo con la invención no incluyen una secuencia de señal (o líder) . Una molécula soluble de CTLA4 se refiere a una molécula de enlace a la superficie no celular (esto es en circulación) que comprende CTLA4 de tipo silvestre o cualquier porción o derivado que se enlaza a B7, incluyendo pero no limitado a, proteínas de fusión CTLA4 solubles; proteínas de fusión CTLA4 solubles tales como proteínas de fusión CTLA4Ig (por ejemplo ATCC 68629) , en donde el dominio extracelular de CTLA4 se fusiona a una porción de Ig que es todo o una porción de una molécula Ig, preferiblemente todo o una porción de una región constante Ig tal como todo o una porción de IgCyl (IgCgammal) , IgCy2 (IgCgamma2) , IgCy3 (IgCgamma3), IgCy4 (IgCgamma4), (IgCmu) , IgCocl (IgCalfal) , IgCa2 (lgCalfa2) , IgCó (igCdelta) o igCs (igCepsilon) , haciendo a la molécula de fusión soluble; proteína de fusión CTLA4 solubles en las cuales el dominio extracelular se fusiona o se une con una porción de una proteína químicamente o biológicamente activa tal como el producto del gen E7 del virus del papiloma (CTLA4-E7) , el antígeno p97 asociado con el melanoma (CTLA4-p97) o la proteína env del VIH (CTLA -env gp 120) como se describe en la Patente de EUA No. 5,844,095 que se incorpora en la presente como referencia en su totalidad; proteínas de fusión híbridas (quiméricas) tal como CD28/CTLA4Ig como se describe en la Patente de EUA No. 5,434,131 que se incorpora aquí como referencia en su totalidad; moléculas CTLA4 con el dominio de transmembrana retirado para hacer a la proteína soluble (ver, por ejemplo, M. K. Oaks et al., 2000, Cellular Immunology, 201:144-153 que se incorpora aquí en la presente como referencia en su totalidad; la molécula mutante soluble CTLA4 L104EA29Ylg. Una molécula soluble CTLA4 también puede ser una molécula mutante soluble CTLA4. Las moléculas solubles CTLA4 producidas de acuerdo con esta invención puede o no incluir una secuencia de péptido de señal. (líder) . El péptido de señal puede ser cualquier . secuencia que permitirá la secreción de la molécula, incluyendo el péptido de señal de la oncostatina M (Malik et al., 1989, Molec. Cell. Biol., 9:2847-2853), o CD5 (N. H. Jones et al., 1986, Nature, 323:346-349) o el péptido de señal de cualquier proteína extracelular. La molécula soluble CTLA4 producida por los procesos de cultivo de la invención pueden incluir el péptido de señal de oncostatina M ligado al extremo en la terminal N del dominio extracelular de CTLA . Típicamente, en la invención las moléculas no incluyen una secuencia del péptido de señal . La proteina de fusión CTLA4 como se usa en la presente, se refiere a una molécula que comprende el dominio extracelular de CTLA4 de tipo silvestre o una porción del mismo que se enlaza de B7 fusionado a la porción non-CTLA4 que hace a la molécula CTLA4 soluble tal como una porción Ig. Por ejemplo, una proteína de fusión CTLA4 puede incluir el dominio extracelular de CTLA4 fusionado a todo o una porción de una región constante Ig. Los ejemplos de los dominios constantes Ig (o porciones de los mismos) que se pueden fusionar a CTLA4 incluyen todos pero no se limitan a aquellos enlistados hasta aquí. Una proteína de fusión CTLA4 también puede ser una molécula mutante CTLA4. Como se usa en la presente, "porción que no es CTLA4" se refiere a un molécula o una porción de la misma que no se enlaza a CD80 y/o CD86 y que no interfiere con el enlace de CTLA4 a su ligando. Ejemplos incluyen pero no se limitan a una porción Ig que es todo o una porción de la molécula Ig, una porción de una proteína químicamente activa o biológicamente activa tal como el producto del gen E7 del virus del papiloma (CTLA4-E7) , antígeno asociado al melanoma p97 (CTLA4-97) o proteína env del VIH (CTLA4-env gpl20) (como se describe en el No. de Serie EUA 5,844,095 que se incorpora en la presente como referencia en su totalidad) . Los ejemplos de las porciones Ig incluyen todo o una porción de un dominio constante de inmunoglobulina tal como IgCyl (IgCgammal) , IgCy2 (IgCgamma2) , IgCy3 (IgCgamma3) , IgCy4 (IgCgamma4) , lq µ (IgCmu) , IgCal (IgCalfal) , IgC 2 (IgCalfa2) , IgCó (IgCdelta) o IgCs (IgCepsilon) . La porción Ig puede incluir los dominios de articulación CH2 y CH3 o los dominios CH1, articulación y CH2 y CH3 de las regiones constantes antes mencionadas u otras regiones constantes. Preferiblemente, la porción Ig es humana o de mono e incluye los dominios de articulación, CH2 y CH3. Más preferiblemente la porción Ig incluye los dominios CH2 y CH3 y de articulación del IgCyl humano o son los dominios CH2 y CH3 y de articulación del IgCyl humano. En una porción Ig la región constante Ig o una porción del mismo puede mutar de manera que reduzca sus funciones de efector (ver por ejemplo Patentes de EUA Nos. 5,637,481 5,844,095 y 5,434, 131. ) . El dominio extracelular de CTLA4 se refiere a cualquier porción del CTLA4 de tipo silvestre que reconoce y enlaza a B7. Por ejemplo, un dominio extracelular de CTLA4 comprende metionina en la posición +1 hasta el ácido aspártico en la posición +124 (FIG 5] . Por ejemplo, un dominio extracelular de CTLA4 comprende alanina en la posición -1 hasta el ácido aspártico en la posición +124 (Fig. 10) . Como se usa en la presente, el término mutación se refiere a un cambio en la secuencia de nucleótido o aminoácido de una molécula de tipo silvestre, por ejemplo, un cambio en el ADN y/o las secuencias de aminoácido del dominio extracelular CTLA4 de tipo silvestre. Una mutación en el ADN puede cambiar un codon que conduce un cambio en la secuencia codificada de aminoácido. Un cambio de ADN puede incluir substituciones, eliminaciones, inserciones, emplame alternativo o truncamiento. Un cambio de aminoácido puede incluir substituciones, eliminaciones, inserciones, adiciones, truncamientos, o errores de desdoblamiento o procesamientos de la proteína. Alternativamente, las mutaciones en una secuencia de nucleótidos pueden resultar en una mutación silente en la secuencia de aminoácidos como es bien entendido en el arte. Como también es entendido, ciertos codones de nucleótidos codifican el mismo aminoácido. Los ejemplos incluyen los codones de nucleótidos de CGU, CGG, CGC y CGA que codifican al aminoácido arginina (R) o los codones GAU y GAC que codifican al aminoácido ácido aspártico (D) . Asi, se puede codificar una proteína por una o más moléculas de ácido nucleico que difieren en su secuencia específica de nucleótidos pero que codifican todavía moléculas de proteína que tienen secuencias idénticas. La molécula mutante puede tener una o más de una multación. Para guía, la secuencia de codificación de aminoácido es como sigue: Aminoácido Símbolo Símbolo de Codones una letra Alanina Ala A GCU,GCC, GCA, GCG Cisterna Cys C UGU, UGC Ácido aspártico Asp D GAU, GAC Ácido glutámico Glu E GAA. GAG Fenilalanina Phe F UUU, UUC Glicina Gly G GGU, GGC, GGA, GGG Histidina His H CAÜ, CAC Aminoácido Símbolo Símbolo de Codones una letra Isoleucina lie I AUU, AUC, AUA Lisina Lys K AAA, AAG Leucina Leu L UUA, UÜG, CUU, CUC, CUA, CUG Metionina Met M AUG Asparagina Asn N AAU, AAC Prolina Pro P CCU, CCC, CCA, CCG Glutamina Gln Q CAA, CAG Arginina Arg R CGU, CGC, CGA, CGG, AGA, AGG Serina Ser S ÜCU, ÜCC, UCA, UCG, AGÜ, AGC Treonina Thr T ACU, ACC, ACA, ACG Valina Val V GUU, GUC, GUA, GUG Triptofano Trp w UGG Tirosina Tyr Y AUU, UAC Como se usa en la presente, un fragmento o porción es cualquier parte o segmento de una molécula. Para CTLA4 o CD28, un fragmento o porción es preferiblemente el dominio extracelular de CTLA4 o CD28, o una parte o segmento del mismo, que reconoce y enlaza a B7 o interfiere con un B7 de manera que bloquea el enlace a CD28 y/o CTLA4. También, como se usa en la presente, "correspondiente" significa compartir la identidad de secuencia. B7, como se usa en la presente, se refiere a cualquier miembro de la familia B7 de moléculas que incluyen pero no se limitan a B7-1 (CD80) (Freeman et al., 1989, J Immunol . , 143:2714-2722, incorporada en la presente como referencia en su totalidad), B7-2 (CD86) (Freeman et al., 1993, Science, 262: 909-911, incorporada en la presente como referencia en su totalidad; Azuma et al., 1993, Nature, 366:76-79, incorporada en la presente como referencia en su totalidad) que reconocen y enlazan a CTLA4 y/O CD28. El CD28 se refiere a la molécula que reconoce y enlaza a B7 como se describe en la patente de EUA No. de serie 5,580,756 y 5,521,288 (que se incorpora en la presente como referencia en sus totalidades) . Como se usa en la presente, las células positivas B7 incluyen cualesquiera células con uno o más tipos de las moléculas B7 expresadas en la superficie celular. Como se usa en la presente, un "derivado" es una molécula que comparte una similitud de secuencia y actividad de su molécula precursora. Por ejemplo, un derivado de CTLA4 incluye una molécula soluble CTLA4 que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 70% similar al dominio extracelular del CTLA4 de tipo silvestre y que reconoce y enlaza a B7 por ejemplo CTLA4Ig o la molécula mutante soluble CTLA4 L104EA29YIg. ün derivado significa cualquier cambio a la secuencia de aminoácidos y/o la calidad química del aminoácido, por ejemplo, análogos de aminoácido. Como se usa en la presente, para regular una respuesta inmune es activar, estimular, sobreregular, inhibir, bloquear, reducir, atenuar, subregular, o modificar la respuesta inmune. Una diversidad de enfermedades, por ejemplo, las enfermedades autoinmunes, se pueden tratar al regular una respuesta inmune, por ejemplo, al regular las interacciones de células positivas CTLA4 y/o CD28 funcionales con las células positivas B7. Por ejemplo, un método de regulación de una respuesta inmune comprende poner en contacto las células positivas B7 con una molécula soluble CTLA4 , tal como aquella producida de acuerdo con esta invención, para formar complejos solubles CTLA4/B7 en donde la molécula soluble CTLA4 interfiere con la reacción de una molécula endógena CTLA4 y/o CD28 con la molécula B7. Para bloquear o inhibir un receptor, señal o molécula como se refiere en la presente, significa interferir con la activación del receptor, señal o molécula como se detecta por una prueba reconocida en el arte. El bloqueo o inhibición puede ser total o parcial. Como se usa en la presente, "bloqueo de la interacción B7" se refiere a interferir con el enlace de B7 a sus ligandos tal como CD28 y/o CTLA4, con lo cual se obstruye las interacciones de células positivas B7 y células T. Los ejemplos de los agentes que bloquean las interacciones B7, incluyen pero no se limitan a, moléculas tales como un anticuerpo (o porción del mismo) que reconoce y se enlaza a cualquiera de las moléculas CTLA4, CD28 o B7 (por ejemplo B7-1, B7-2) ; una forma soluble (o porción del mismo) de las moléculas tales como CTLA4 soluble; un fragmento de péptidos u otra molécula pequeña diseñada para interferir con la señal celular a través de una interacción mediada por CTLA4/CD28/B7. En una modalidad preferida, el agente de bloqueo es una molécula CTLA4 soluble, tal como CTLA4Ig (ATCC 68629) o L104EA29YIg (ATCC PTA-2104); una molécula soluble CD28 tal como CD28Ig (ATCC 68628) ; una molécula B7, tal como B7-Ig (ATCC 68627) ; un anticuerpo monoclonal anti-B7 (por ejemplo ATCC HB-253, ATCC CRL-2223, ATCC CRL-2226, ATCC HB-301, ATCC HB-11341 y anticuerpos monoclonales como se describen en la Patente de EUA No. 6,113,898, o en Yokochi et al., 1982, J. Immunol., 128 (2) : 823-827) ; un anticuerpo monoclonal anti-CTLA4 (por ejemplo, ATCC HB-304, y unos anticuerpos monoclonales como se describen en las referencias 82-83) ; y/o un anticuerpo monoclonal CD28 (por ejemplo ATCC HB 11944 y- Mab 9.3 como se describen en Hansen et al., 1980, Immunogenetics, 10:247-260, o Martin et al., 1984, J. Clin Immunol., 4(l):18-22). Las interacciones de bloqueo B7 se pueden detectar por pruebas reconocidas en el arte, tales como la determinación de la reducción de la enfermedad inmune (por ejemplo enfermedad reumáticas) , síntomas asociados, al determinar una reducción en las interacciones de células B7/célula T, o al determinar una reducción en la interacción de B7 con CTLA4/CD28. El bloqueo puede ser total o parcial. Como se usa en la presente, un cantidad efectiva de una molécula se refiere a una cantidad que bloquea la interacción de la molécula con sus ligandos . Por ejemplo, una cantidad efectiva de una molécula que bloquea la interacción de B7 con CTLA4 y/o CD28 es la cantidad de la molécula que cuando se enlaza a las moléculas B7 en células positivas B7 inhiben las moléculas B7 de su enlace a ligandos endógenos, tales como CTLA4 y CD28. Alternativamente, una cantidad efectiva de una molécula que bloquea la interacción de B7 con CTLA4 y/o CD28 es la cantidad de la molécula que, cuando se enlaza a las moléculas CTLA4 y/o CD28 en las células T, inhibe las moléculas B7 del enlace a ligandos endógenos tales como CTLA4 y CD28. La inhibición o bloqueo puede ser parcial o completa.

Para los protocolos clínicos, se prefiere que la porción Ig de una proteína de fusión tal como CTLA4Ig o un CTLA4lg mutante no produzca una respuesta inmune perjudicial en un sujeto. La porción preferida es toda o una porción de la región constante Ig, incluyendo regiones constantes Ig de primates humanos y no humanos . Los ej emplos de las regiones adecuadas Ig incluyen IgCyl (IgCgammal) , IgCy2 (IgCgamma2) , IgCy3 (IgCgamma3), IgCy4 (IgCgamma4) , (IgCmu) , IgC l (IgCalfal) , IgCcc2 (IgCalfa2) , IgC5 (IgCdelta) o IgCs (IgCepsilon) incluyendo los dominios de articulación, CH2 y CH3 o los dominios CH1, articulaciones CH2 y CH3 , que están involucrados en las funciones del efector tales como el enlace a los receptores Fe, citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) o citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos (ADCC) . La porción Ig puede tener una o más mutaciones en ella (por ejemplo, en el dominio CH2 para reducir las funciones del efector tales como CDC o ADCC) en donde la mutación modula la capacidad del Ig para enlazarse a su ligando al incrementar o disminuir la capacidad del Ig para enlazarse a los receptores Fe. Por ejemplo las mutaciones en la porción Ig pueden incluir cambios en algunos o todos los residuos de cisteína dentro del dominio de articulación. Por ejemplo, como se muestra en la Figura 8, las cisteínas en las posiciones +130, +136, y +139 se substituyen con serina. La porción Ig puede también incluir la prolina en la posición +148 substituida con una serina como se muestra en la Figura 8. Además, las mutaciones en la porción Ig pueden incluir tener la leucina en la posición +144 substituida con fenilalanina; leucina en la posición +145 substituida con ácido glutámico, o glicina en la posición +147 substituida con alanina.

EJEMPLOS Los siguientes ejemplos establecen aspectos específicos de la invención para ilustrar la invención y proporcionar una descripción de los métodos actuales para aquellos expertos en la técnica. Los ejemplos no se deben constituir como limitantes de la invención ya que los ejemplos solamente proporcionan una metodología específica y e emplificación que son útiles en el entendimiento y práctica de la invención y sus diversos aspectos . Los Ejemplos 1-4 como se establecen a continuación, describen experimentos que se refieren a procesos de cultivo celulars que involucran cambios de temperatura durante la corrida de cultivo. Los ejemplos 6-11 describen experimentos que se refieren a procesos de cultivo celulars que involucran la adición retardada de compuesto polianiónico al cultivo.

EJEMPLO 1 Este ejemplo proporciona materiales y reactivos empleados en los procesos de la presente invención para el cultivo celulars recombinantes que producen las proteína de fusión CTLA4Ig ejemplificadas como se describen en la presente en los ejemplos 2-4. 1. Medio de Cultivo Celular El medio de cultivo celular basal usado para todas las fases de generación de inoculo celular y para crecimiento de cultivos en bioreactores, incluyendo los reactores de producción de 5 litros (5 L) y 50 litros (50 L) , fue medio CD-CHO modificado que contiene glutamina, bicarbonato de sodio, insulina y metotrexato (Invitrogen, Carlsbad, CA; ver Tabla 1) . El pH del medio se ajustó hasta 7.0 con HCl 1N.

Tabla 1 Componente de medio CD-CHO Concentración modificado CD-CHO 25x ácidos I (Invitrogen, 40 ml/L Carisbad, CA) CD-CHO 25x ácidos II (Invitrogen, 40 ml/L Carisbad, CA) CD-CHO 25x sales I (Invitrogen, 40 ml/L Carisbad, CA) CD-CHO 25x sales II (Invitrogen, 40 ml/L Carisbad, CA) L-glutamina (Invitrogen) 0.585 g/L Insulina r-humana (10 mg/mL) 0.1 ml/L (Invitrogen) etotrexato (solución 20 m ) (ICN, 5 µ?/L Costa Mesa, CA) Bicarbonato de sodio, (Mallenkrodt 2.22 g/L Baker, Phillipsburg, NJ) Para alimentar células en el proceso de lote alimentado, un medio de alimentación modificado, esto es, medio eRDF-l (Invitrogen) , que contiene glucosa, glutamina, insulina y TC Levadurolato (Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ) , (Tabla 2) , se emplea. El pH del medio de alimentación se ajusta hasta 7.0 con NaOH 1 N después de la adición de todos los componentes . Tabla 2 Componente del medio eRDF Concentración modificado ERDF-I (Invitrogen, Carlsbad, CA) 16.8 g/1 Dextrosa (VWR-Mallenkrodt Baker) 30.94 g/L L-glutamina (Invitrogen) 4.1 g/L Insulina r-humana (10 mg/mL) 1 ml/L (Invitrogen) TC levadurolato (Becton Dickinson, 5 g/L Franklin Lakes, NJ) 2. Fase de Producción en el Bioreactor. El bioreactor de producción se opera inicialmente como un reactor de lote con temperatura, presión, pH y concentración de oxígeno disuelto cercanamente monitoreada y controlada. La condición del cultivo se evalúa al medir la densidad celular viable y la concentración de varios metabolitos claves. El proceso de alimentación se inicia un día después de la inoculación. El resto de la fermentación se conduce en un modo de lote alimentado. Los bioreactores de escala 5 L (reactor de vidrio con un propulsor marino) y escala de 50 L (reactor de acero inoxidable con dos propulsores marinos) se usan, (ver Ejemplo 4) . ün sistema de captura de datos (Intellution Fix 32) registra la temperatura, pH y oxígeno disuelto (DO) a través de las corridas. Se controlan los flujos de gas por medio de un rotámetro. Se burbujea aire en el reactor por medio de una frita sumergida (tamaño de poro 5 µp?) y a través del espacio de domo del reactor para remover el C02. Se burbujea oxígeno molecular a través de la misma frita para control de DO. Se burbujea C02 a través de la misma frita como se usa para el control del pH. 3. Estrategia de Alimentación A 24 horas después de la inoculación, un mínimo diario de 1% de volumen de cultivo de medio de alimentación eRDF-I modificado se agregó en el bioreactor si la concentración de glucosa es de > 3.0 g/L. En casos en los cuales la concentración de glucosa está debajo de 3 g/L, el volumen de la alimentación por bolo diaria se calcula para llevar la concentración de glucosa hasta 3.0 g/L. La cantidad de alimentación diaria se registra en hojas de grupo. 4. Muestreo Se removieron muestras de células del reactor en una base diaria. La muestra usada para conteo celular se tiñe con azul de tripano (Sigma, St . Louis, MO) . El conteo celular y la determinación de viabilidad celular se realizan por medio de hemocitometría usando un microscopio. Para análisis de metabolitos, una muestra adicional se centrifugo durante 20 minutos a 2000 rpm (4°C) para separación celular. El sobrenadante se analizó por los siguientes parámetros: titulación, ácido siálico, glucosa, lactato, glutamina, glutamato, pH, p02, pC02, amoniaco, y, opcionalmente, lactato deshidrogenasa (LDH) . Muestras de respaldo adicionales se congelan a -20°C.

EJEMPLO 2 Este ejemplo describe la producción de CTLA4Ig, mostrado como -1 hasta 357 ó +1 hasta 357 en la Figura 3, (ADN codificante depositado como ATCC 686929) , a partir de células CHO cultivadas. El Ejemplo describe además un proceso de esta invención para producir proteína CTLA4Ig tanto en alta calidad como alta cantidad, que involucra corridas de cultivo que tienen cambios de temperatura de dos o tres etapas y tiempos de corrida totales de 14, 21, ó 28-30 días. Un cambio de temperatura (cambio T) desde 37°C hasta 34 °C se presenta el día 6 (final de la fase de crecimiento logarítmico) y un segundo cambio T desde 34°C hasta 32°C se presenta el día 10. La corrida finaliza el día 14, día 21, ó día 28, y para el cambio de dos etapas, la temperatura se controla a 32°C desde el cambio en el día 10 hasta el final de la corrida. Para el cambio de tres etapas, la temperatura se controla a 30°C desde el día del cambio hasta el final de la corrida. El proceso descrito resulta en una titulación final incrementada del producto de proteína. Una viabilidad celular final incrementada, y una productividad volumétrica, en comparación con corridas con un cambio de temperatura sencillo o sin cambio de temperatura. De conformidad con la invención, los segundo y tercero cambios T extienden el tiempo de corrida del proceso de fermentación estándar (cultivo) hasta dos a tres semanas (o mayor) , mientras mantiene las viabilidades celulares altas . Un incremento cercano al lineal de la titulación del producto se observa a través del periodo de producción.

Las células CHO usadas para la expresión de CTLA4Ig se expanden en medio CD-CHO modificado que contiene glutamina, bicarbonato de sodio, insulina, y metotrexato (ver Ejemplo 1) usando matraces T-75 (Corning, Corning, NY) y recipientes giratorios de 250 y 500 mL (Bélico, Vineland, NJ) . Los matraces T y los recipientes giratorios se incuban a 37°C en C02 al 6%. Después de que se generó un inoculo suficiente, el cultivo se transfiere a un bioreactor ya sea de 5 L (Applikon, Foster City, CA) o de 50 L (Feldmeier, Syracuse, NY) con un volumen de trabajo de 3L ó 30L, respectivamente, del medio descrito arriba. La densidad de sembrado inicial fue de alrededor de 2 x 105 células viables/mL. El recipiente de 5L fue un reactor de vidrio equipado con un propulsor marino (Applikon, Foster City, CA) ; el recipiente de 50L fue un reactor de acero inoxidable (Feldmeier, Syracuse, NY) equipado con dos propulsores marinos. El sistema de adquisición de datos usando Interllution Fix32 (Interllution, Foxboro, A) registra la temperatura, pH, y oxígeno disuelto (DO) a través de las corridas. Los flujos de gas se controlan por medio de rotámetros (Colé Parmer, Vernon Hills, IL) . Se burbujea aire en el reactor por medio de una frita sumergida (tamaño de poro 5 µt?) y a través del espacio de domo del reactor para remover el C02. Se burbujeó oxígeno molecular a través de la misma frita para control DO. Se burbujeó C02 a través de la misma frita para un control de pH lateral alto. Se realiza un control de pH lateral bajo por la adición de NaOH 1 N. Sin limitación, los rangos aceptables para el pH fueron 6-9, preferiblemente 6.8-7.2, y para osmolaridad fueron 200-500 mOsm, preferiblemente, 280-340 mOsm. El cultivo en el bioreactor se da en alimentación de bolo diariamente usando medio eRDF modificado, como se describe en el Ejemplo 1, Tabla 2 como sigue: iniciando una inoculación posterior de un día, un mínimo de un volumen de cultivo al 1% se agregó, o si el nivel de glucosa está debajo de 3 g/L, se agrega un volumen calculado para llevar el nivel de glucosa hasta 3 g/L. El proceso de fermentación tuvo una duración de 21 días a una escala de 5 L y 28 días a una escala de 50 L. La duración más larga de la corrida de cultivo a una escala de 50 L se correlaciona con el cambio de temperatura agregado para tal corrida. Las muestras se toman en una base diaria del reactor para el análisis. Por ejemplo, la muestra usada para el conteo celular se tiñe con azul de tripano (Sigma, St. Louis, MO) . El conteo celular y la determinación de viabilidad celular se realizan usando un hemocitómetro y contador de células teñidas viables bajo un microscopio. Para el análisis de metabolitos, se centrífuga una muestra de alícuota adicional durante 20 minutos a 2000 rpm (4°C) para peletizar las células. El sobrenadante se analizó para titulación de proteína, ácido siálico, glucosa, lactato, glutamina, glutamato, pH, p02, pC02, amoniaco, y LDH, usando técnicas y protocolos convencionales practicados en el arte .

EJEMPLO 3 Este Ejemplo describe y presenta los resultados de evaluaciones comparativas para evaluar varios procedimientos de cultivo de cambio de temperatura, incluyendo los métodos de cultivo de etapas múltiples, llevados a cabo de conformidad con un aspecto de la presente invención. La titulación final (en g/L) del producto de glicoproteína se determina, así como el contenido de ácido siálico titulado final de la proteína, la viabilidad celular al final de las corridas (viabilidad celular final) y la densidad celular al final de las corridas (densidad celular final viable) . Los experimentos I-A, I-B y I-C; II-A, II-B y II-C; y III-A, III-B y III-C se refieren a la misma corrida de cultivo celular con el mismo perfil de cambio de temperatura evaluado a diferentes tiempos, esto es, para I-A, II-A, III-A, el producto y los parámetros celulares se evalúan después de 14 días, para I-B, II-B y iil-B después de 21 días, y para I-C, II-C y Ill-C después de 28 días. Estos experimentos se realizan en un bioreactor de 5 L en el cual las condiciones de cultivo se controlan como sigue: pH a 7.0; oxígeno disuelto a 40%; agitación a 60 rpm; y temperatura inicial a 37°C. Los datos obtenidos de las fermentaciones de cultivo celular de lote alimentado están de conformidad con los métodos de la presente invención. Los experimentos I, II y III se diseñaron como sigue: Experimento I : la temperatura de cultivo celular se controla a 37°C desde el día 0 hasta el día 21 (sin cambio de temperatura) . Experimento II : la temperatura de cultivo celular se controla a 37°C desde el día 0 hasta el día 6; y a 34°C desde el día 6 hasta el día 21 (cambio de temperatura sencillo) . Experimento III : la temperatura de cultivo celular se controla a 37°C desde el díaO hasta el día 6; a 34°C desde el día 6 hasta el día 10; y a 32°C desde el día 10 hasta el día 21 (procedimiento de cambio de temperatura de dos etapas de la presente invención) . Los experimentos IV-A y V-A muestran los resultados de la titulación del producto, viabilidad celular final y densidad celular final viable evaluados después de una corrida de cultivo de 14 días con una fase de producción inicial (estándar) ; los Experimentos IV-B y V-B muestran estos resultados evaluados después de una corrida de cultivo de 21 días con una fase de producción extendida; y los Experimentos IV-C y V-C muestran los resultados evaluados después de una corrida de cultivo de 28 días con una segunda fase de producción extendida. Los Experimentos IV y V se realizan en un bioreactor de 50 L en el cual las condiciones de cultivo se controlan como sigue: pH a 7.0; oxígeno disuelto a 40%; agitación a 30 rpm; y temperatura inicial a 37°C. Los Experimentos IV y V se designan como sigue: Experimento IV: la temperatura de cultivo celular se controla a 37°C desde el día 0 hasta el día 6; a 34 °C desde el día 6 hasta el día 10; y a 32°C desde el día 10 hasta el día 28 (procedimiento de cambio de temperatura de dos etapas de la presente invención) . Experimento V: la temperatura de cultivo celular se controló a 37°C desde el día 0 hasta el día 6; a 34°C desde el día 6 hasta el día 10; a 32 °C desde el día 10 hasta el día 14; y a 30°C desde el día 14 hasta el día 28 (procedimiento de cambio de temperatura de tres etapas de la presente invención) . Los Experimentos V-A, V-B y V-C se refiere a la misma corrida de cultivo celular con el mismo perfil de cambio de temperatura evaluados en diferentes momentos, esto es, para V-A, el producto y los parámetros celulares se evalúan después de 14 días, para V-B, después de 21 días, y para V-C, después de 28 días. Los Experimentos I-V representan cinco corridas de cultivo diferentes como se describe arriba. Como se describe, las corridas de 14 días se designan WA" ; las corridas de 21 días se designan "B" , mientras que las corridas de 28 días se designan ¾C" .

La Tabla 3 presenta los resultados de Experimentos que demuestran el impacto de los diferentes perfiles de cambio de temperatura en la producción de CTLA4Ig por las células en cultivo en la escala de reactor de 5 L.

Tabla 3 la titulación del prodii to, viabilidad nplnlar final y dpmiriarf nplnlar final viable se evalúan después de una corrida de 14 días con fase de producción j-niciril (estándar) 37°C (días I-A 5 0-14 -sin 0.73 100 7.3 5.3 56 0.8 cambio T- 37°C (días II-A 5 0-6) 34°C 1.30 178 8.1 10.5 82 1.5 (días 6-14) -cambio T de una etapa- 37°C (días III-A 5 0-6) 34°C 2.30 315 7.6 17.5 81 3.1 (días 6-10) 32°C (días 10-14) - cambio T de dos etapas) Experimento Escala Carrfaio de Titulación Titulación SA final Titiilación Viahi 1-¡.dad Densidad # del final final (%) (N8NA*) final *SA celular celular reactor (g/L) (Exp I-A (relación final final (%) final (L> mineado a molar) (NStB viable a 100%) (xlO6 células/rnL) La titri1a<-inn del producto, viahi 1idad ORlnlar final y dm.Tiriad oplnlar final viable se evalúan después de una corrida de 21 días coa fase de prodi.icc.inn extendida 37°C (días I-B 5 0-21 -sin 1.30 178 6.6 8.6 20 0.3 cantoio T- 37°C (días II-B 5 0-6) 34°C 2.70 370 5.3 14.3 28 0.4 (días 6-21) -canbio T de una etapa- 37°C (días III-B 5 0-6) 34°C 3.50 480 6.5 22.8 57 1.7 (días 6-10) 32°C (días 10-21] - cambio T de dos etapas) "NANA" (ácido N-amino-N-neuramínico) se refiere al ácido siálico (SA) . "NANA Final" se refiere al NANA del producto al final del cultivo.

La Tabla 4 representa los resultados de los Experimento que demuestran el impacto de los diferentes perfiles d cambio de temperatura en la producción de CTLA4Ig por célula en cultivo en la escala de reactor de 50 L. Tabla 4 La titulación del producto, viabilidad celul r final y densidad celul r final vable se evalúan después de una corrida de 14 días con fase de p odiTcción inicial (estándar) 37°C (días 0-6); 34°C (días 6-10 días) ; IV-A 50 1.4 95 5.5 32°C (días 10-14) -cantoio T de dos etapas- 37°C (días 0-6); 34°C (días 6-10 días); V-A 50 1.4 91 5.4 32°C (días 10-14); 30°C (días 14-21) -cartfciio T de tres etapas- Ta -Htriaoirn rlol prrrtv+n, iHa i 1 -irtaH nalnla-r -Final y A-nairiari nolula-r -Final wiaMo 8 maliia después de una uuixida de 21 días con fase de producción extendida 37°C (días 0-6) ; 34°C (días 6-10 días); 1V-B 50 2.5 67 2.5 32°C (días 10-21) -caitbio T de dos etapas- 37°C (días 0-6) ; 3 °C (días 6-10 días); V-B 50 2.6 82 3.2 32°C (días 10-14); 30°C (días 14-21) -canfoio T de tres etapas- Escala del Cambio de T tulación Viabilidad Densidad celular # reactor tenperafcura final final viable (xlO6 (L) (g/D final (%) células/mii) la titulación del. producto, viabilirlfr! celular final y c%=nsiri?v1 n?lu]ar final viable se evalúan después de una corrida de 28 días coa una extensión adicional de la fase de producción 37°C (días 0-6) ; IV-C 50 34°C (días 6-10 días); 2.8 47 1.1 32°C (días 10-28) -canbio T de dos etapas- 37°C (días 0-6) ; V-C 50 34°C (días 6-10 días) ; 3.1 69 1.4 32°C (días 10-14) ; 30°C (días 14-28) -canbio T de tres etapas- Como se ha demostrado por los experimentos en este Ejemplo, los perfiles de cambio de temperatura múltiples se encuentran que mantienen una alta viabilidad celular a través del proceso de cultivo. Específicamente, en la Tabla 3 , el Experimento III-B muestra que el uso de un perfil de cambio de temperatura de dos etapas de duración determinada mantiene una alta viabilidad celular (ver también figura 1 ) durante el proceso de cultivo de 21 días (incluyendo la fase de producción extendida) , lo que permite que la titulación alcance 3 . 5 g/L a un contenido de ácido siálico alto de 6 . 5 [relación molar] . El éxito del procedimiento de cultivo de dos etapas también puede evidenciarse en el alto valor del producto matemático de la titulación final x ácido siálico final' . En contraste, el proceso de cultivo no involucra cambio de temperatura (Tabla 3, Experimento I-B) lo que lleva a una reducción temprana en la viabilidad celular. Adicionalmente, el uso de un cambio de temperatura de una etapa (Tabla 3, Experimento II-B) se encuentra que proporciona una titulación final menor, ácido siálico final, y 'titulación final x ácido siálico final' -producto matemático en comparación con el perfil y proceso de cambio de temperatura de dos etapas de conformidad con esta invención. Además, los resultados presentados en la Tabla 4 involucran cultivos celulares realizados a una escala de reactor de 50 L que demuestra las ventajas de la técnica de cultivo de cambio de temperatura de etapas múltiples de esta invención. El tercer cambio de temperatura hasta 30°C se hace de duración determinada para que tome lugar el día 14. en particular, los beneficios de un cambio de temperatura ambiente triple en la viabilidad celular y la titulación final (Tabla 4, Experimento V-C; también Figura 2) pueden compararse con un cambio de temperatura doble . De conformidad con los presentes métodos, el cambio de temperatura triple extiende adicionalmente la viabilidad celular y de esta manera, la producción de proteina con relación a los métodos sin cambio o con un cambio. Debido al efecto de escala, que es usual en el cultivo celular, la generación de titulación en la escala de reactor de 50 L se encuentra que algunas veces es más lenta que la escala de 5 L. Sin embargo, ya se aprecia que tal efecto no está en contra de las ventajas de las corridas de cultivos de dos o más cambios de temperatura como se proporciona por esta invención. Como se hace evidente por los resultados presentados en el Ejemplo 3, para aquellas corridas en las cuales se realiza un cambio de temperatura el día 6, esto es, al final de la fase de crecimiento logarítmico, se obtienen mucho mejores resultados en la titulación final y la viabilidad celular, en comparación con las corridas de control en ausencia de un cambio de temperatura. Como se observa de los resultados, la productividad volumétrica se incrementa dos veces por el uso de un cambio de temperatura sencillo. Un segundo cambio de temperatura el día 10 proporciona una viabilidad celular mayor e incrementa además la productividad volumétrica (aproximadamente 3 veces en comparación con las corridas sin cambio T) , mientras que la calidad del producto se mantiene alta, como se determina por el contenido de ácido siálico del producto de glicoproteína.

EJEMPLO 6 Este ejemplo presenta los datos que muestran que el proceso de cultivo celular que comprende dos cambios de temperatura descendentes de conformidad con esta invención no tiene un efecto estadísticamente importante en la cantidad de proteína, por ejemplo CTLA4Ig en este ejemplo, que se produce por célula por tiempo unitario. De conformidad con los métodos de cultivo celular (fermentación) recientemente presentados de esta invención, la producción general de la proteína en el proceso es el resultado de células más viables que sobreviven hasta el final del proceso. Debido a que más células sobreviven durante un tiempo de producción extendido, más células viables producen la proteína deseada al final del proceso. Esto, de nuevo, proporciona una cantidad mayor del producto de proteína deseado al final del proceso o corrida de cultivo. La Tabla 5 ilustra la productividad específica celular a varios tiempos en el proceso abarcado por la presente invención. La productividad específica celular se determina por la fórmula como se presenta supra. El proceso de cultivo designado para la producción de CTLA4Ig, otras moléculas CTLA4 soluble, y moléculas mutantes CTLA4 soluble de esta manera es un proceso no asociado con el crecimiento en el cual la producción de proteína inicia en o alrededor del día 6, esto, aproximadamente al inicio de la fase estacionaria, siguiendo un crecimiento celular exponencial. Los datos presentados en la Tabla 5 se refieren a los experimentos conducidos en el Ejemplo 3.

Tabla 5 La productividad específica celular en la Tabla 5 se calcula usando la densidad celular y mediciones de titulación, como se describe anteriormente. Se apreciará por el practicante habilidoso en el arte, las mediciones de densidad celular usualmente tienen alrededor de 10-20% de desviación estándar (SD) , esto es, un SD alto, y son imprecisas. Por lo tanto, la determinación de productividad específica celular tiene una desviación estándar del 10-20% correspondiente. De esta manera, en vista de que la SD alta está involucrada en estos tipos de cálculos, la cantidad de producto producida por célula por día para los diferentes tiempos de corrida no difiere significativamente entre el proceso que no tiene cambio T, un cambio T, o dos cambios T. los niveles altos de producto de protexna de alta calidad producido por el proceso de cultivo celular recientemente proporcionado de esta invención, y el incremento general en la producción de proteína, son atribuibles a los números más altos de células viables que sobreviven a través del proceso de cultivo completo que comprende cambios de temperatura descendentes múltiples.

EJEMPLO 5 Ejemplo 5A Este Ejemplo proporciona materiales y reactivos empleados en el proceso de la presente invención para el cultivo celulars recombinantes que producen el L104EA29YIg ejemplificado como se describe en la presente en los Ejemplos 5B-16. 1 Medio de Cultivo Celular El medio de cultivo celular basal usado para todas las fases de generación de inoculo celular fue medio CD-CHO modificado que contiene glutamina, bicarbonato de sodio, insulina y metotrexato (Invitrogen, Carlsbad, CA) , como se ejemplifica en la Tabla 6. El pH del medio se ajustó hasta 7.0 con HC1 1N. El medio de cultivo celular basal usado para el crecimiento de cultivos en bioreactores , incluyendo reactores de producción de 5 litros (5L) , 10 litros (10L) y 50 litros (50L) , fue también el medio CD-CHO modificado mostrado en la Tabla 6, excepto que fue sin metotrexato. El pH del medio se ajustó hasta 7.0 con HCl 1N.

Tabla 6 Componente del Medio CD-CHO Concentración Modificado CD-CHO 25x Ácidos I 40 ml/L (Invitrogen, Carlsbad, CA) CD-CHO 25x Ácidos II 40 ml/L (Invitrogen, Carlsbad, CA) CD-CHO 25x Sales I 40 ml/L (Invitrogen, Carlsbad, CA) CD-CHO 25x Sales II 40 ml/L (Invitrogen, Carlsbad, CA) L-glutamina 0.585 g/L (Invitrogen) Insulina r-humana 0.1 ml/L (10 mg/mL) (Invitrogen) Metotrexato 5µ1/?_ (solución 20 m ) (ICN, Costa Mesa, CA) Bicarbonato de sodio 2.22 g/L (Mallenkrodt Baker, Phillpsburg, NJ) En todos los Ejemplos, excepto el Ejemplo 8, para células de alimentación en el proceso de lote alimentado, un medio de alimentación modificado, esto es, medio eRDF-1 (Invitrogen) , que contiene glucosa, glutamina, insulina y TC Levadurolato (Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ) se empleó, como se muestra en la Tabla 8. El pH del medio de alimentación se ajustó hasta 7.0 con NaOH 1 N después de la adición de todos los componentes.

Tabla 7 Para el Ejemplo 8, el medio de alimentación fue el que se describe arriba con una modificación: eRDF-1 fue a una concentración de 25.2 g/L. 2. Fase de Producción en Bioreactor El bioreactor de producción se opera inicialmente como un reactor de lote, con temperatura, presión, pH y concentración de oxígeno disuelta cercanamente monitoreada y controlada. La condición del cultivo se evaluó y se midió la densidad celular viable y la concentración de varios metabolitos clave. El proceso de alimentación se inicia un día después de la inoculación. El resto de la fermentación se conduce en el modo de lote alimentado. Los bioreactores de escala de 5 L (reactor de vidrio con un propulsor marino) , escala de 10 L (reactor de vidrio con dos propulsores marinos) y escala de 50 L (reactor de acero inoxidable con dos propulsores marinos) se usaron (ver Ejemplo 2) . El sistema de adquisición de datos (Intellution Fix 32) temperatura registrada, pH, y oxígeno disuelto (DO) a través de las corridas. Los flujos de gas se controlan por medio de rotámetros . Se burbujea aire en el reactor por medio de una frita sumergida (tamaño de poro 5 µp?) y a través del espacio de domo del reactor para remover el C02. El oxígeno molecular se burbujeó a través de la misma frita para control DO. El C02 se burbujeó a través de la misma frita como se usa para control de pH. 3. Estrategia de Alimentación A 24 horas después de la inoculación, un mínimo diario de 1% de volumen de cultivo de medio de alimentación eRDF-I modificado se agregó en el bioreactor si la concentración de glucosa es de > 3.0 g/L. En casos en los cuales la concentración de glucosa está debajo de 3 g/L, el volumen de la alimentación por bolo diaria se calcula para llevar la concentración de glucosa hasta 3.0 g/L . La cantidad de alimentación diaria se registra en hojas de grupo.

. Muestreo Se removieron muestras de células del reactor en una base diaria. La muestra usada para conteo celular se tiñe con azul de tripano (Sigma, St . Louis, MO) . El conteo celular y la determinación de viabilidad celular se realizan por medio de hemocitometria usando un microscopio o por medio de un contador celular automático Cedes (Innovatis AG, Bielefeld, Alemania) . Para análisis de metabolitos, una muestra adicional se centrífugo durante 20 minutos a 2000 rpm (4°C) para separación celular. El sobrenadante se analizó por los siguientes parámetros: titulación, ácido siálico, glucosa, lactato, glutamina, glutamato, pH, p02/ pC02, amoniaco, y, opcionalmente, lactato deshidrogenasa (LDH) . Muestras de respaldo adicionales se congelan a -20°C.

Ejemplo 5B Este Ejemplo 5B describe la producción de L104EA29YIg, mostrado como -1 hasta 357 ó +1 hasta 357 en la Figura 4, (ADN codificante depositado con el ATCC como PTA-2104) , de células CHO cultivadas . Este Ejemplo 5B también describe un proceso de esta invención que involucra la adición del compuesto polianiónico, más específicamente sulfato de dextrano, a un cultivo celular. Las células CHO usadas para la expresión de L104EA29YIg se expanden en medio CD-CHO modificado (Invitrogen, CA) , que contiene glutamina, bicarbonato de sodio, insulina, y metotrexato usando matraces T-75 y matraces de agitación. Los matraces T y los matraces de agitación se incuban a 37°C y C02 al 6%. Después de que se generó suficiente inoculo, el cultivo se transfirió en bioreactores de 5 ó 10L usando medio CD-CHO modificado como se describe arriba, excepto que fue sin metotrexato. La densidad de sembrado inicial fue 200,000 células viables/mL o 10e células/mL. Los recipientes de 5L y 10L fueron reactores de vidrio equipados con uno y dos propulsores marinos respectivamente (Applikon, CA) . Se controlan los flujos de gas por medio de rotámetros . Se burbuj ea aire en el reactor por medio de una frita sumergida (tamaño de poro 5 µp?) y a través del espacio de domo del reactor para remover el C02. Se burbujeó oxígeno molecular a través de la misma frita para control DO. Se burbujeó C02 a través de la misma frita para un control de pH lateral alto. Se realiza un control de pH lateral bajo por la adición de NaOH o Na2C03 1 N. El cultivo en el bioreactor se da en alimentación de bolo diariamente usando medio eRDF modificado (Invitrogen, CA) con glucosa, glutamina, insulina, y TC Levadurolato (Becton Dickinson) , de la siguiente manera: iniciando una inoculación posterior de un día, un mínimo de un volumen de cultivo al 1% se agregó, o si el nivel de glucosa está debajo de 3 g/L, se agrega un volumen calculado para llevar la glucosa hasta 3 g/L. En todos los ejemplos, excepto el Ejemplo 11, la temperatura se controla a 37°C desde el día 0 hasta 6; a 34°C desde el día 6 hasta 10; a 32 °C desde el día 10 en adelante. El proceso de fermentación tiene una duración de 14-19 días . Las muestras se toman en una base diaria del reactor . La muestra usada para el conteo celular se tiñe con azul de tripano (Sigma, MO) . El conteo celular y las determinaciones de viabilidad celular se realizan usando un contador celular automático Cedes (Innovatis AG, Bielefeld, Alemania) . El sobrenadante se analizó para titulación de LEA29Y, glucosa, lactato, glutamina, glutamato, pH, p02, pC02, amoniaco. El sulfato de dextrano (sal de sodio, del dextrano de peso molecular promedio 5000Da, Sigma, MO) se disolvió en agua o en el medio. La solución se filtró de forma estéril y se agregó al reactor a una concentración de 50 mg/L. El volumen de la adición constituye como más el 2% del volumen de trabajo del reactor al momento de que la adición toma lugar.

EJEMPLO 6 Este Ejemplo describe y presenta los resultados de un estudio comparativo para evaluar el efecto de la adición del compuesto polianiónico, más específicamente sulfato de dextrano, al momento después de la inoculación. Se inoculan bioreactores de 5L y 10L con 0.2 x 10s células/mL de células que producen L104EA29Y. Los experimentos 6-a y 6-b se diseñan como sigue: Ejemplo 6-a: no se agrega sulfato de dextrano a los cultivos (cultivos de x control' : 4 cultivos en bioreactores de 5L, 4 cultivos en bioreactores de 10L) .

. Ejemplo 6-b: se agregó sulfato de dextrano a una concentración de 50 mg/L a los cultivos el día 6 (cultivos 'DS día 6' : 2 cultivos en bioreactores de 5L, 1 cultivo en un bioreactor de 10L) . La viabilidad promedio, densidad de célula viable, y perfiles de densidad celular total, y sus desviaciones estándar para los Ejemplos 8-a y 8-b se reportan en la Figura 11. En los cultivos de control, se observa una densidad celular viable en las placas entre los días 6 y 7, lo que corresponde a la fase estacionaria. Una reducción en la densidad celular viable y la viabilidad se observa después del día 7 (en promedio) para los cultivos de control, lo que corresponde a la fase de muerte. Cuando se agrega sulfato de dextrano a los cultivos el día 6, la fase de crecimiento se extiende hasta el día 11. La densidad celular viable alcanza un promedio de 5.2 x 106 células/mL, contra 3.5 x 105 células/mL para el control. La viabilidad se mantiene arriba del 90% durante esta fase de crecimiento extendida. Después del día 11, la densidad celular viable y la densidad celular total se reducen de manera proporcional, lo que indica que la lisis celular, y, como resultado, el índice de viabilidad se mantiene arriba del 90% hasta el día 15. La Figura 7 es una representación logarítmica de las densidades celulares viables como una función del tiempo para cultivos con adición de sulfato de dextrano y para corridas de control. Las relaciones de muerte (dadas por las inclinaciones de las densidades celulares viables en la Figura 2) difieren dependiendo de la presencia o no de sulfato de dextrano. En presencia de sulfato de dextrano, la relación de muerte fue aproximadamente constante entre el día 12 y el día 19, a un valor de 0.0012 h"1. En contraste, la relación de muerte en el promedio de los controles fue, entre los días 8 y 12 donde está al máximo, 0.0024 h"1. De esta manera, agregar sulfato de dextrano el día 6 reduce la relación de muerte celular durante la fase de muerte por un factor de dos. Independientemente de los efectos benéficos del sulfato de dextrano descritos arriba, la titulación del producto L104EA29YIg fue similar con o sin la adición de sulfato de dextrano (Tabla 8) .

Tabla 8 : impacto de la adición de sulfato de dextrano del día 6 en la titulación del producto L104EA29YIg el día 14.

El grado de la sialilación L104EA29YIg para diferentes corridas se reporta en la Tabla 10. Dada la variabilidad de corrida a corrida relativamente grande, la sialilación L104EA29YIg puede considerarse que no se afecta de forma importante por la adición de sulfato de dextrano el día 6.

Tabla 9 : impacto de la adición de sulfato de dextrano del día 6 en la adición del producto de sialilación L104EA29YIg EJEMPLO 7 Este ejemplo muestra el efecto de agregar sulfato de dextrano a un cultivo celular que está en la fase de muerte. Un bioreactor de 5L de células que produce L104EA29YIg se inocula a una densidad de 10s células/mL, y la fase de muerte inicia el día 5. Se agrega el sulfato de dextrano el día 6. La viabilidad, densidad de célula viable, y perfil de densidad celular total se presentan en la Figura 8. La adición del sulfato de dextrano el dia 6 a tal cultivo, podrá prevenir la presentación de .una reducción mayor en la densidad celular viable hasta el día 17. De esta manera, cuando se agrega sulfato de dextrano durante la fase de muerte, la muerte celular puede detenerse durante varios días . En esta corrida, una titulación de 1.9 g/L con relación molar NANA de 6.6 se obtiene el día 14.

EJEMPLO 8 Este ejemplo muestra el efecto de agregar sulfato de dextrano a un cultivo celular que está en fase de muerte. Se inoculó un bioreactor de 10L con 0.2 x 106 células/mL de células que producen L104EA29YIg. En este ejemplo particular, la alimentación diaria fue de una formulación más concentrada, y como resultado el inicio de la fase de muerte se retardó hasta el día 10 (Figura 14) . El sulfato de dextrano no se agregó hasta el día 14. La viabilidad, densidad celular viable, y perfil de densidad celular total se presentan en la Figura 14. La adición de sulfato de dextrano el día 14 permite una estabilización de la densidad celular viable durante un periodo de 4 días, después de lo cual el cultivo se descontinú . Este ejemplo es otra ilustración de la detención de la muerte celular durante la fase de muerte en la adición de sulfato de dextrano al cultivo. EJEMPLO 9 Este ejemplo muestra el efecto de agregar sulfato de dextrano el día 0. El efecto de la adición- retardada, de sulfato de dextrano puede apreciarse al comparar el efecto observado en este experimento con los efectos observados en otros experimentos en los cuales la adición de sulfato de dextrano se retarda. Se inoculan dos bioreactores de 5L repetidos con 0.2 x 106 células/mL de células que producen L104EA29YIg, y se agrega sulfato de dextrano a una concentración de 50 mg/L el mismo día como la inoculación (día 0) . Los perfiles de viabilidad, densidad celular viable, y densidad celular total se presentan en la Figura 15. Ninguno - de los cultivos alcanza una densidad celular mayor a los cultivos desprovistos de sulfato de dextrano (Comparar Figuras 6 y 10) . Las células que entran en la fase de muerte el día 7 u 8 , al contrario del día 11 cuando el sulfato de dextrano se agrega el día 6 (Comparar Figuras 6 y 10) . Las titulaciones de L104EA29YIg obtenidas el día 14 de estas corridas fueron 0.57 g/L (corrida #1) y 0.86 g/L (corrida #2) , que son significativamente menores que las titulaciones obtenidas en el proceso de control o en el proceso con la adición de sulfato de dextrano del día 6 (ver Ejemplo 6) .

Estos resultados demuestran la importancia de la duración determinada de la adición de sulfato de dextrano en el resultado de la adición. Sin estar apegado a la teoría, se ha propuesto que los efectos observados de la adición de sulfato de dextrano y su dependencia en la duración determinada de la adición pueden explicarse por el enlace del sulfato de dextrano a diversos factores autocrinos, de una manera similar al enlace del polisulfato de pentosan a los factores de crecimiento dependientes de la heparina (Zugmeier et al., 1992). Se ha propuesto que el sulfato de dextrano se enlace a estos factores en el dominio de enlace de heparina, que no está disponible para enlazarse a la superficie celular de proteoglicanos de sulfato de heparano. Como resultado, los factores enlazados al sulfato de dextrano fallan para concentrarse en la superficie celular, que reduce mayormente la probabilidad de enlazarse a sus receptores . El efecto puro es que estos factores ya no ejercen su acción normal en las células. En los muy primeros días después de la inoculación, las células producen ciertos factores de crecimiento, cuya función es señalar el crecimiento celular. Al agregar sulfato de dextrano el día 0 irreversiblemente se enlaza por aquellos factores como se producen. El enlace del sulfato de dextrano de estos factores no afecta, sin embargo, mayormente el crecimiento celular de manera adversa, posiblemente debido a que las células son capaces de responder incrementando la producción de factor de crecimiento. Más tarde durante la fase de crecimiento, la producción de factores de crecimiento cesa, y las células inician la producción de factores autocrinos de un tipo diferente, cuyo efecto a una alta concentración es señal del final de la fase de crecimiento y el inicio de la muerte celular. Estos factores se acumulan desde una baja concentración el día 0 hasta una alta concentración en un tiempo más tarda. En este punto, estos factores efectivamente señalan las células que detienen el ¦crecimiento y que entran a las fases estacionaria y de muerte. Se ha propuesto que el sulfato de dextrano se enlaza preferiblemente a estos factores que señalizan la muerte, de esta manera deshabilitando su función señalizadora y permitiendo una extensión de la fase de crecimiento. La inducción continua por estos factores parece necesitar que la muerte celular proceda, con el resultado que las células que han entrado a la fase de muerte puedan remontarse en la fase estacionaria cuando los factores que señalan la muerte se deshabilitan por el sulfato de dextrano (Ejemplos 7 y 8) , aún más tarde que el día 14 de cultivo. A la inversa, agregar sulfato de dextrano el día 0, que se enlaza a los factores de crecimiento, todavía se enlaza a estos factores al final de la fase de crecimiento, haciendo que no esté disponible para enlazarse a las moléculas que señalan la muerte. De esta manera, la extensión de la fase de crecimiento y el inicio retardado de la muerte celular no se presenta en el caso de cultivos donde el sulfato de dextrano se agrega el dia 0 (Ejemplo 9) de la misma manera cono se hace en el caso donde el sulfato de dextrano se agrega al final de la fase de crecimiento. La detención del crecimiento celular y el inicio de la muerte celular el día 11 en cultivos complementados con sulfato de dextrano el día 6 en el Ejemplo 6 se hace en hipótesis para resultar de mecanismos diferentes de la inducción por factores autocrinos enlazados al sulfato de dextrano. Posiblemente, el agotamiento de nutrientes particulares en el medio después de 11 días de crecimiento puede contar para el final de la fase de crecimiento en estos cultivos .

EJEMPLO 10 Este Ejemplo compara el efecto de la adición de sulfato de dextrano a tres diferentes tiempos durante la fase de crecimiento inicial. Se inoculan cultivos de células que producen L104EA29YIg a 106 células/mL en bioreactores de 5L. Se agrega sulfato de dextrano a los cultivos a una concentración de 50 mg/L a diferentes tiempos. En un cultivo, se agrega sulfato de dextrano el día 3, en otro el día 4, y en un tercero el día 5. Los perfiles de viabilidad y densidad celular viable se reportan en la Figura 11. Las densidades de célula viable altas (> 107 células/mL) se alcanzan en los tres casos de adicionales (día 3, 4 ó 5) , pero las adiciones más tempranas (día 3 ó 4) no previenen una reducción en la densidad celular viable inmediatamente después de la fase de crecimiento. En contraste, el día 5 de la adición estabiliza la densidad celular viable por 4 días después de la fase de crecimiento. En puntos de tiempo que pasan las 250 h, la densidad celular viable en la adición de cultivo de sulfato de dextrano del día 5 siempre es igual o mayor (dentro del error de medición) que en el cultivo de adición de sulfato de dextrano del día 4, y la densidad celular viable en el cultivo de adición de sulfato de dextrano del día 4 siempre es mayor o igual (dentro del error de medición) que el cultivo de adición de sulfato de dextrano del día 3. De esta manera, se aprecia de este ejemplo que el tiempo óptimo para la adición de sulfato de dextrano es al final de la fase de crecimiento inicial (con referencia a la fase de crecimiento que deberá observarse en ausencia de cualquier adición de sulfato de dextrano) . La adición más temprana puede extender la fase de crecimiento pero no es efectiva para estabilizar la densidad celular viable después de la fase de crecimiento extendida inducida por sulfato de dextrano, mientras que la adición más tardía (durante la fase de muerte) estabilizará la densidad celular viable pero falla para proporcionar un incremento substancial en la densidad celular viable (ver Ejemplos 7 y 8). En consecuencia, el día 14 una titulación de 2.7 g/L se obtiene con la adición de sulfato de dextrano del día 5, mientras que titulaciones del día 14 de 2.6 g/L se obtienen en la adición de sulfato de dextrano del día 3 ó día 4, y una titulación del día 14 de 1.9 g/L se obtienen con la adición de sulfato de dextrano del día 6 (en el Ejemplo 7) . Las relaciones molares NANA fueron 6.3, 6.6, 6.0, y 6.6 respectivamente en las corridas mencionadas arriba, lo que muestra que las titulaciones más altas obtenidas con la duración determinada óptima de la adición de sulfato de dextrano están con un nivel consistente de sialilación.

EJEMPLO 11 Este ejemplo muestra el efecto de uno y dos cambios de temperatura en un cultivo que produce L104EA29YIg. El cultivo se somete también a la adición retardada de sulfato de dextrano. Se inocularon reactores de 5L a una densidad de 200,000 células/mL . Se aplican dos, uno o ningunos cambios T. Para un cambio de temperatura, la temperatura se cambia desde 37°C hasta 34°C el día 6. Para dos cambios de temperatura, la temperatura se cambia desde 37°C hasta 34°C el día 6, y desde 34°C hasta 32°C el día 10. En todos los casos, se agrega sulfato de dextrano el día 6. El caso de los dos cambios T es el promedio de tres corridas, y las desviaciones estándar se muestran con barras . La densidad celular viable, viabilidad, y titulación se reportan en las Figuras 17, 18, y 14 respectivamente. Los resultados muestran los beneficios de aplicar al menos un cambio de temperatura. En el caso donde la temperatura se mantiene a 37°C a través de la corrida, el cultivo entra en la fase de muerte el día 10, y la reducción en la densidad celular viable y viabilidad es la pendiente. Como resultado, hay una clara reducción en la productividad volumétrica L104EA29YIg después de 12 días de cultivo. Para los tiempos de cultivo de 14 días y mayores, es claro que los cultivos que tiene uno o dos cambios de temperatura sobresaldrán el cultivo de temperatura constante en términos de titulación. En el caso donde sólo un cambio de temperatura se implementa (el día 6, a 34°C) , una reducción en las etapas en la densidad celular viable y la viabilidad se observa después del día 16. El cultivo donde un segundo cambio de temperatura (el día 10, a 32 °C) se implementa además del primero, no se muestra como pendiente una reducción en la densidad celular viable y viabilidad después del día 16. A tiempos de cultivo que pasan los 18 días, la productividad volumétrica en el cultivo de un cambio T es claramente inferior que en el cultivo de dos cambios T. En contraste, la productividad volumétrica en el cultivo con un cambio T es superior a la que hay en el cultivo de dos cambios T a tiempos de cultivo entre el día 11 y el día 15. En conclusión, el primer cambio de temperatura es benéfico independientemente del tiempo de cosecha deseado, mientras que el beneficio del segundo cambio de temperatura depende del tiempo de cosecha pretendido y los requerimientos de viabilidad para un procesamiento descendente efectivo. La ausencia de un segundo cambio de temperatura permitirá alcanzar una titulación de producto más alta hasta el día 20, pero para cultivos que se corren por más de 20 días, la corrida con dos cambios de temperatura sobresaldrá la corrida con un cambio de temperatura en términos de titulación. Además, deberá considerarse que las cosechas que pasan del día 12 contendrán cantidades más altas de productos de lisis celular en el caso de un cambio T que en el caso de dos cambios T, lo que puede complicar el procesamiento descendente. La reducción marcada en la densidad celular viable observada después del día 12 en el caso del perfil de un cambio T, puede concernir a la calidad del producto, ay que la muerte celular correspondiente puede liberar en el sobrenadante una carga importante de sialidasas que pueden reducir la sialilacion del producto. Los contenidos de todas las patentes publicadas y otorgadas, solicitudes de patente, solicitudes PCT y E.U.A. publicadas, artículos, libros, referencias, manuales de referencia e instrucción, y resúmenes que se hace referencia o se citan en la presente, se incorporan por ello para referencia en su totalidad para describir más completamente el estado del arte al cual concierne la invención. Como pueden hacerse varios cambios en la materia objeto arriba descrita sin salirse del alcance y espíritu de la presente invención, se pretende que toda la materia objeto contenida en la descripción anterior, o definida en las reivindicaciones adjuntas, puede interpretarse como descriptiva e ilustrativa de la presente invención. Muchas modificaciones y variaciones de la presente invención son posibles a la luz de las enseñanzas anteriores . Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (52)

1. REIVINDICACIONES ; Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones . 1. Un proceso de cultivo celular, caracterizado porque comprende : a) cultivar células hospedadoras que producen una proteína de interés a una temperatura de o cercana a 37°C bajo condiciones y por un periodo de tiempo que permita el crecimiento celular; b) luego cultivar las células a una segunda temperatura en o cerca de 34°C, y c) luego cultivar las células a una tercera temperatura en o cerca de 32° .
2. 2. El proceso de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque las células se cultivan a una segunda temperatura que comienza alrededor del día 5 al día 7 del cultivo, y en donde las células se cultivan a una tercera temperatura partiendo de alrededor del día 6 al día 14 del cultivo.
3. 3. El proceso de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque las células se cultivan a una segunda temperatura que comienza alrededor del día 6 del cultivo, y en donde las células se cultivan a una tercera temperatura partiendo de alrededor del día 10 del cultivo.
4. 4. El proceso de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque existen aproximadamente incrementos de cuatro días entre el comienzo de la segunda temperatura y el comienzo de la tercera temperatura.
5. 5. El proceso de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque comprende además, después de la etapa c) , la etapa de cultivar las células a una cuarta temperatura a o cerca de 30 °C partiendo en o alrededor de dos semanas desde el inicio del cultivo hasta el final del proceso de cultivo .
6. 6. El proceso de conformidad con la reivindicación 2 , caracterizado porque la proteína de interés es una glicoproteín .
7. 7. El proceso de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque la proteína de interés es una molécula CTLA4 soluble .
8. 8. El proceso de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque la molécula CTLA4 soluble es una proteína de fusión CTLA4.
9. 9. El proceso de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque la proteína de fusión CTLA4 soluble es una CTLA Ig .
10. 10. El proceso de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque la proteína de fusión CTLA4 soluble es CTLA4Ig que comprende aminoácidos -1 hasta 357 ó +1 hasta 357 como se muestra en la Figura 3.
11. 11. El proceso de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque la molécula CTLA4 soluble es una molécula mutante CTLA4 soluble.
12. 12. El proceso de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque la molécula mutante CTLA4 soluble es L104EA29YIg que comprende aminoácidos -1 hasta 357 ó +1 hasta 357 como se muestra en la Figura 4.
13. 13. El proceso de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el proceso de cultivo celulars es un proceso de lote alimentado o un proceso continuo.
14. 14. El proceso de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque las células se cultivan a 34°C desde el día 6 al día 10 y se cultivan a 32°C desde el día 10 en adelante .
15. 15. El proceso de conformidad con la reivindicación 14 , caracterizado porque la proteína que es una proteína de fusión soluble CTLA4 es CTLA Ig que comprende los aminoácidos -1 a 357 o +1 a 357 como se muestra en la Fig. 3 o una molécula mutante soluble CTLA4 L104EA29Yig que comprende los aminoácidos -1 a 357 ó +1 a 357 como se muestra en la Fig. 4.
16. 16. El proceso de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la temperatura del cultivo cambia desde en o cerca de 37°C hasta en o cerca de 34 °C cuando la concentración celular en el cultivo es de alrededor de 2-12 x 10s células/mL .
17. 17. El proceso de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la temperatura del cultivo se cambia desde en o cerca de 37°C hasta en o cerca de 3 °C cuando el cultivo está en la fase estacionaria.
18. 18. El proceso de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque la sialilación de la proteína producida se aumenta durante el cultivo celular.
19. 19. El proceso de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque las células son células de mamíferos .
20. 20. El proceso de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque las células de mamíferos son células CHO.
21. 21. El proceso de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque se aumenta la producción de proteína.
22. 22. El proceso de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque se aumenta la viabilidad celular.
23. 23. Un proceso de cultivo celular, caracterizado porque comprende : a) cultivar células CHO que producen una molécula CTLA4 soluble a 37°C bajo condiciones y por un periodo de tiempo que permita el crecimiento celular; b) luego cultivar las células a 34°C, partiendo el día 6 del cultivo y c) luego cultivar las células a 32 °C, partiendo del día 10 del cultivo.
24. 24. Un proceso de cultivo celulars caracterizado porgue comprende : a) cultivar las células hospedadoras que producen una proteína de interés ; y b) agregar el compuesto polianiónico al cultivo celular al tiempo después de la inoculación.
25. 25. El proceso de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque, el compuesto polianiónico se selecciona del grupo que consiste de sulfato de dextrano, heparina, sulfato de heparano, sulfato de mañano, sulfato de condroitina, sulfato de dermatan, sulfato de queratano, hialuronato, poli (vinil sulfato), kappa-carragenina y suramina.
26. 26. El proceso de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque, el compuesto polianiónico es un compuesto polisulfatado.
27. 27. El proceso de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque, el compuesto polisulfatado es sulfato de dextrano.
28. 28. El proceso de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque, el compuesto polianiónico se agrega el día 1 del cultivo o después .
29. 29. El proceso de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque, el compuesto polianiónico se agrega para llevar la concentración en cultivo hasta 1-1000 mg/L.
30. 30. El proceso de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque, la proteína de interés es una glicoproteín .
31. 31. El proceso de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque, las células son células mamiferas.
32. 32. El proceso de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque las células de mamífero son células CHO.
33. 33. El proceso de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque la proteína de interés es una molécula CTLA4 soluble.
34. 34. El proceso de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque la molécula CTLA4 soluble es una proteína de fusión CTLA4.
35. 35. El proceso de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado porque la proteína de fusión CTLA4 soluble es una CTLA4Ig.
36. 36. El proceso de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado porque la proteína de fusión CTLA4 soluble es CTLA4Ig que comprende aminoácidos -1 hasta 357 ó +1 hasta 357 como se muestra en la Figura 3.
37. 37. El proceso de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque la proteína de interés es una molécula mutante CTLA4 soluble.
38. 38. El proceso de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado porque la molécula mutante CTLA4 soluble es L104EA29YIg que comprende aminoácidos -1 hasta 357 ó +1 hasta 357 como se muestra en la Figura 4.
39. 39. El proceso de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque el compuesto polianiónico se agrega en un tiempo después de la inoculación que está antes del comienzo de la fase inicial de muerte.
40. 40. El proceso de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque el compuesto polianiónico se agrega en un momento después de la inoculación que está durante la fase inicial de crecimiento.
41. 41. El proceso de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado porque el compuesto polianiónico se agrega durante la segunda mitad de la fase inicial de crecimiento.
42. 42. El proceso de conformidad con la reivindicación 41, caracterizado porque el compuesto polianiónico se agrega en o alrededor del final de la fase inicial de crecimiento.
43. 43. El proceso de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque el compuesto polianiónico se agrega un tiempo después de la inoculación que está durante la fase inicial de muerte .
44. 44. El proceso de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque se prolonga la fase de crecimiento.
45. 45. El proceso de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado porque la densidad celular viable de pico que se alcanza durante la fase de crecimiento prolongada es superior que la densidad celular viable de pico alcanzada durante la fase inicial de crecimiento.
46. 46. El proceso de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque el comienzo de la fase de muerte se retrasa .
47. 47. El proceso de conformidad con la reivindicación 43, caracterizado porque se suspende la fase de muerte.
48. 48. El proceso de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque se incrementa la viabilidad celular.
49. 49. Un proceso de cultivo celular caracterizado porque comprende : a) cultivo celular CHO que producen una molécula soluble de CTLA4; y b) agregar sulfato de dextrano al cultivo celular en el momento después de la inoculación.
50. 50. El proceso de conformidad con la reivindicación 49, caracterizado porque el comienzo de la fase de muerte se retarda .
51. 51. El proceso de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque comprende además: a) cultivar células hospedadoras a una temperatura de o cercana a 37 °C bajo condiciones y por un periodo de tiempo que permita el crecimiento celular; b) -luego cultivar las células a una segunda temperatura en o cerca de 34 °C, y c) luego cultivar las células a una tercera temperatura en o cerca de 32°C.
52. 52. El proceso de conformidad con la reivindicación 48, caracterizado porque comprende además : c) cultivar células CHO a una temperatura de o cerca a 37°C bajo condiciones y por un periodo de tiempo que permita el crecimiento celular; b) cultivar las células CHO a una segunda temperatura a o cerca a 3 °C, partiendo el día 6 del cultivo y c) cultivar las células CHO a una tercera temperatura a o cerca de 32 °C, partiendo del día 10 del cultivo.