CN102634476A

CN102634476A - 高耐受细胞株的筛选方法

Info

Publication number: CN102634476A
Application number: CN2012100511192A
Authority: CN
Inventors: 屈颖; 陈小春
Original assignee: JIANGSU PACIFIC MEINUOKE BIOPHARMACEUTICAL CO Ltd
Current assignee: JIANGSU PACIFIC MEINUOKE BIOPHARMACEUTICAL CO Ltd
Priority date: 2012-03-01
Filing date: 2012-03-01
Publication date: 2012-08-15
Also published as: CN105505852A

Abstract

本申请涉及生物工程技术，尤其涉及筛选高耐受细胞株的方法。在本申请的一个方面，本申请提供了一种高耐受细胞株的筛选方法，该方法包括：选取可生长细胞株，将其进行体外培养，改变细胞培养条件从而迫使细胞在不良生长环境中生长代谢，进而筛选获得适应于所述不良生长环境的高耐受细胞株，所述改变的细胞培养条件包括细胞培养液的渗透压、乳酸浓度、氨浓度、pH值、溶氧浓度或搅拌速度，或者所述细胞培养条件的两种或两种以上的任意组合。通过本申请筛选得到的高耐受细胞株特别适用于生物反应器的大规模培养。

Description

高耐受细胞株的筛选方法

技术领域

本申请涉及生物工程技术，特别是适合于大规模生产用的高耐受细胞株的筛选和培养方法。

背景技术

生物反应器在动物细胞规模化培养中的应用也是生物制药领域的发展趋势，很多生物制药公司均致力于开发相关产品的发酵工艺，以满足公司产品能够在低成本大规模情况下进行产品的制备。随着全球对生物制品的需求量的增大，生物反应器的规模也不断地提高。此时，动物细胞大规模培养也就成了生物制药领域最重要的关键技术之一。

但是，在发酵规模不断放大的过程中，细胞生长的微环境发生了很大的变化，细胞生长受到显著影响，甚至导致细胞死亡。当细胞高密度生长达到一定程度，由于其自身特性不同，其工艺参数耐受情况也不尽相同。随着细胞密度的增长，主要底物氧化还原代谢加剧，传质及传热过程需要进行调整，加大搅拌及提高通气量是最主要的手段，伴随而来的是细胞不可避免的受到的一系列物理损伤。底物的大量消耗会导致副产物的大量产生，对各类细胞有较高的毒性，同时，底物耗竭会造成细胞生长代谢停滞进而导致大量细胞快速死亡。

因此，工艺参数是限制发酵规模的重要问题，各种工艺的开发依赖于细胞株能够耐受微环境各项参数指标的变化，筛选获得能够在生物反应器中的高耐受细胞株显得尤为重要。

采用高耐受细胞株，不仅能够实现细胞株在无血清、无蛋白或者化学成分限定培养基中的生长代谢和产物表达，同时，还能大幅度的提高细胞株的生长代谢机能，增强细胞株抵抗微环境的各种恶劣变化，以此实现控制细胞增殖水平、延长细胞培养周期，解决规模化放大参数的限制、降低成本等目标，进而提高规模化培养的效能。

发明内容

本申请涉及适合于大规模生产用的高耐受细胞株的制备和筛选方法。

本申请的一方面提供了一种高耐受细胞株的筛选方法，包括：选取可生长细胞株，将其进行体外培养，改变细胞培养条件从而迫使细胞在不良生长环境中生长代谢，进而筛选获得适应于所述不良生长环境的高耐受细胞株，其特征在于，所述改变的细胞培养条件包括：细胞培养液的渗透压、乳酸浓度、氨浓度、pH值、溶氧浓度或搅拌速度，或所述细胞培养条件的两种或两种以上的任意组合。

在一些实施方式中，本申请的高耐受细胞株的筛选方法包括改变两种或两种以上选自以下组的细胞培养条件：细胞培养液的渗透压、乳酸浓度、氨浓度、pH值、溶氧浓度以及搅拌速度。在一些实施方式中，可改变三种或三种以上所述的细胞培养条件。在一些实施方式中，可改变四种或四种以上所述的细胞培养条件。在一些实施方式中，可改变五种或五种以上所述的细胞培养条件。在一些实施方式中，可改变六种或六种以上所述的细胞培养条件。

如果通过改变或调整多种细胞培养条件来筛选高耐受细胞株，所述细胞培养条件可同时改变或调整，也可分先后分别改变或调整，也可以有些培养条件同时改变，有些培养条件单独改变。例如，在一些实施方式中，可同时改变细胞培养液的渗透压、乳酸浓度、氨浓度、pH值、溶氧浓度以及搅拌速度，将细胞进行培养，挑选出适应于改变后的培养条件的高耐受细胞株。在一些实施方式中，在细胞培养过程中可以按预定的顺序依次改变培养条件，比如先改变渗透压，再改变乳酸浓度，再改变氨浓度，再改变pH值，再改变溶氧浓度，再改变搅拌速度等，又比如先改变渗透压，再改变搅拌速度，再改变乳酸浓度和氨浓度等，又比如先改变渗透压和pH值，再改变搅拌速度，再改变乳酸浓度和氨浓度等。在一些实施方式中，在细胞培养过程中改变的细胞培养条件中至少有两种分别进行改变，即不是同时改变。例如，在一些实施方式中，先改变初始细胞密度、渗透压、pH值和搅拌速度，然后再改变乳酸浓度和氨浓度。

在一些实施方式中，改变细胞培养条件可以是逐步提高渗透压使得预定的细胞生长参数达到预定的极限值。在一些实施方式中，以预定的梯度，比如50mΩ或100mΩ，逐步提高渗透压。在一些实施方式中，培养液中初始的渗透压为大约280mΩ或320mΩ。在一些实施方式中，培养条件中渗透压改变的范围为300～600mΩ。在一些实施方式中，培养液中渗透压被一次性调整到预定的极限渗透压值，例如400mΩ、500mΩ或600mΩ，直接筛选出可在极限渗透压值条件下存活的、生长代谢状态良好的高耐受细胞株。

在一些实施方式中，改变细胞培养条件可以是逐步降低溶氧浓度使得预定的细胞生长参数达到预定的极限值。在一些实施方式中，以预定的梯度，比如5％或10％，逐步降低溶氧浓度。在一些实施方式中，培养液中初始溶氧浓度为80％或70％。在一些实施方式中，培养液中溶氧浓度的范围在10％-80％、20％～80％、或者30％-80％。在一些实施方式中，培养液中溶氧浓度被一次性调整到预定的极限溶氧浓度值，例如10％或15％，直接筛选出可在极限溶氧浓度条件下存活的、生长代谢状态良好的高耐受细胞株。

在一些实施方式中，改变细胞培养条件可以是逐步提高乳酸浓度使得预定的细胞生长参数达到预定的极限值。在一些实施方式中，以预定的梯度，比如5mM、10mM、20mM、40mM或80mM，逐步提高乳酸浓度。在一些实施方式中，培养液中初始乳酸浓度为0mM。在一些实施方式中，细胞培养条件中乳酸浓度的改变范围为0～60mM，0～80mM，0～100mM或1～120mM等。在一些实施方式中，培养液中乳酸浓度被一次性调整到预定的极限乳酸浓度值，例如110mM或120mM，直接筛选出可在极限乳酸浓度条件下存活的、生长代谢状态良好的高耐受细胞株。

在一些实施方式中，改变细胞培养条件可以是逐步提高氨浓度使得预定的细胞生长参数达到预定的极限值。在一些实施方式中，以预定的梯度，比如2mM、4mM、6mM、8mM、10mM，逐步提高氨浓度。在一些实施方式中，培养液中初始氨浓度为0mM。在一些实施方式中，细胞培养条件中氨浓度的改变范围为0～10mM，0～15mM，或0～20mM等。在一些实施方式中，培养液中氨浓度被一次性调整到预定的极限氨浓度值，例如10mM或20mM，直接筛选出可在极限氨浓度条件下存活的、生长代谢状态良好的高耐受细胞株。

在一些实施方式中，改变细胞培养条件可以是同时逐步提高乳酸浓度和氨浓度使得预定的细胞生长参数达到预定的极限值。在一些实施方式中，改变细胞培养条件可以是同时逐步提高乳酸浓度、氨浓度以及渗透压使得预定的细胞生长参数达到预定的极限值。在一些实施方式中，改变细胞培养条件可以是同时逐步提高乳酸浓度、氨浓度以及pH值使得预定的细胞生长参数达到预定的极限值。

在一些实施方式中，改变细胞培养条件可以是逐步提高pH值使得预定的细胞生长参数达到预定的极限值。在一些实施方式中，培养液中初始pH值为6.5。在一些实施方式中，细胞培养条件中pH值的变化范围可以为6.5～7.8。在一些实施方式中，培养液中pH值被一次性调整到预定的极限pH值，例如7.8，直接筛选出可在极限pH值条件下存活的、生长代谢状态良好的高耐受细胞株。

在一些实施方式中，改变细胞培养条件可以是逐步提高搅拌速度使得预定的细胞生长参数达到预定的极限值。在一些实施方式中，以预定的梯度逐步提高搅拌速度，比如40rpm、50rpm、60rpm、70rpm、80rpm、90rpm、100rpm、110rpm、120rpm、130rpm、140rpm、150rpm。在一些实施方式中，培养液初始搅拌速度为40rpm、60rpm、80rpm或100rpm。在一些实施方式中，细胞培养条件中搅拌速度的变化范围可以为40～150rpm，40～200rpm，40～250rpm，或40～300rpm等。在一些实施方式中，搅拌速度被一次性调整到预定的极限搅拌速度，例如200rpm或300rpm，直接筛选出可在极限搅拌速度条件下存活的、生长代谢状态良好的高耐受细胞株。

在一些实施方式中，可以在营养物低浓度条件下筛选高耐受细胞株。比如，营养物浓度低于该细胞常规培养条件下起始营养物浓度的50％、30％或者更低的浓度。常规起始营养物浓度例如可以是，新鲜的EX-302无血清培养基(JRH BIOSCIENCE公司，货号：24326C)所含的营养物浓度，新鲜的EX-

620无血清培养基(JRH BIOSCIENCE公司，货号：14621C)所含的营养物浓度。

在一些实施方式中，可以在高细胞密度条件下筛选高耐受细胞株。比如，细胞密度高于10⁷细胞/mL、2×10⁷细胞/mL或5×10⁷细胞/mL。在一些实施方式中，细胞起始培养密度可以是0.5～10×10⁵细胞/mL，或1～10×10⁵细胞/mL，或2～10×10⁵细胞/mL，或3～10×10⁵细胞/mL，或4～10×10⁵细胞/mL，或5～10×10⁵细胞/mL，或9～10×10⁵细胞/mL等。

在一些实施方式中，预定的细胞生长代谢参数是指细胞活性，预定的极限值是指细胞活性低于大约60％、50％、40％或30％等。

在一些实施方式中，预定的细胞生长代谢参数是指细胞倍增时间，预定的极限值是指细胞倍增期无法保持稳定，例如群体细胞倍增时间缩短或延长40％以上、50％以上、或者60％以上。

在一些实施方式中，预定的细胞生长代谢参数是指细胞的产物表达量，预定的极限值是指细胞产物表达量低于常规培养条件下的表达量的90％、80％、70％或60％等。

在一些实施方式中，用无血清克隆化方法进一步对改变培养条件后获得的细胞进行筛选，获得生长代谢稳定的高耐受细胞株。在一些实施方式中，在改变一种或多种细胞培养条件后，进行无血清培养和筛选，然后再进一步改变细胞培养条件，再次进行无血清培养和筛选，这样交替进行改变培养条件的培养和筛选。有关无血清克隆化的典型方法可以参见米力和屈颖等人的中国专利第CN200810150056.X号，其公开日为2008年12月31日，该专利公开的全部内容通过引用方式并入到本申请中。

在一些实施方式中，所述细胞株是动物细胞株。在一些实施方式中，所述细胞株是哺乳动物细胞株，例如中围仓鼠卵巢细胞(CHO)。在一些实施方式中，所述细胞株带有可表达的重组外源基因。在一些实施方式中，所述重组外源基因编码外源蛋白例如抗体蛋白。在一些实施方式中，高耐受细胞株可表达重组蛋白。在一些实施方式中，高耐受细胞株表达的重组蛋白的质量与未进过筛选的细胞株表达的一致。在一些实施方式中，高耐受细胞株表达的重组蛋白的纯度与未进过筛选的细胞株表达的一致或相差不超过5％、10％或20％。

在一些实施方式中，所述筛选方法所采用的起始细胞株是生长状态良好的细胞株。在一些实施方式中，所述筛选方法所采用的起始细胞株是处于对数生长期的细胞。在一些实施方式中，所述筛选方法所采用的起始细胞可以是正常的未经高耐受筛选的细胞，也可以是经过一次或多次高耐受筛选的细胞株。

在一些实施方式中，筛选的周期可以是10～40天，20～40天，30～40天等。

附图说明

图1示出了实施例1筛选获得的高耐受细胞株跟原始细胞株在相同培养条件下培养基中L-谷氨酰胺浓度随着时间的变化情况。

图2示出了实施例1筛选获得的高耐受细胞株跟原始细胞株在相同培养条件下培养基中葡萄糖浓度随着时间的变化情况。

图3示出了实施例1筛选获得的高耐受细胞株跟原始细胞株在相同培养条件下细胞密度随着时间的变化情况。

图4示出了实施例1筛选获得的高耐受细胞株跟原始细胞株在相同培养条件下细胞活性随着时间的变化情况。

具体实施方式

以下结合附图对本申请作进一步的详细说明。

以下描述的实施方式仅为说明目的而并非旨在限定。在不偏离本申请的主题的精神或范围的情况下，可以采用其他实施方式，并且可以做出其他变化，所有这些都在本申请范围之内，并构成本申请内容的一部分。

实施例1：通过调整渗透压、搅拌速度、pH、高细胞密度和营养物浓度等筛选高耐受细胞株的方法

1)细胞株和培养基

起始细胞株是带有重组目标基因的中国仓鼠卵巢细胞，该细胞株命名为CERC-10(中国人民解放军第四军医大学细胞工程中心构建)。

本实施例中所用的新鲜的EX-

302无血清培养基购自JRH BIOSCIENCE公司(货号：24326C)。

本实施例中所用的条件培养基为新鲜的EX-

302无血清培养基与细胞培养后离心所得培养基上清液以一定比例混合获得。例如，条件培养基可通过以下步骤获得：将待培养细胞接种到新鲜的EX-302无血清培养基中，在5％CO₂、饱和湿度的培养箱中培养至预期的时间或细胞密度，然后以1200rpm离心5分钟除去细胞获得培养上清液；将培养上清液按照一定比例跟新鲜的EX-302无血清培养基混合形成条件培养基。

本实施例中无血清克隆化步骤所用的无血清低密度培养基通过以下步骤制得：准备EX-

302无血清培养基作为基础培养基；添加胰岛素至15mg/L、添加转铁蛋白至5mg/L、添加***-1至100ug/L、添加乙醇胺至10mol/L以及添加***钠至60nmol/L从而制备得到无血清低密度培养基(所述浓度都是这些添加物最终在培养基中的浓度)。

2)检测方法和仪器

细胞密度和细胞活性采用台盼蓝拒染法进行检测，其中，在不同时段从培养基中取出细胞，将等量的细胞悬液与台盼蓝染液均匀混合，1分钟后，将已染色的细胞悬液加入血球计数板中，在光学显微镜下对活细胞和死细胞分别进行计数。细胞活性＝活细胞数/(活细胞数+死细胞数)。

采用夹心酶标记免疫吸附测定法(ELISA)检测上清液中的表达产物，其中，采用Fab双段(购自Corning公司，货号：XH329)包被96孔板，浓度为100μg/mL；二抗采用辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗人二抗(购自PIERCE公司，货号：HC002)，浓度为1：8000。显色液显色后采用酶标仪进行读值。

葡萄糖浓度和L-谷氨酰胺浓度采用生化分析仪(YSI公司，YSI 2700型号)进行检测。

生物反应器采用德围贝朗公司(B.Braun Biotech)的B5L生物搅拌通气式生物反应器。生物反应器中的表达产物采用AKTA蛋白纯化***(GE Healthcare Life Sciences，AKTAexplorer型号)通过Protein A亲和层析柱进行回收纯化。表达产物的纯度使用高效液相色谱仪HPLC(Waters 600)进行检测，回收到的表达产物纯度为约95％。

3)采用如下步骤建立高耐受细胞株：

1.将20毫升CERC-10细胞接种于80毫升新鲜的EX-

302无血清培养基，细胞起始密度为5×10⁵细胞/毫升左右，用氯化钠溶液将渗透压调整至400mΩ，调节pH至7.0，置于5％C0₂、饱和湿度培养箱中进行培养，并将转速设置为80rpm/min。

2.3天后，将上一步所得细胞离心，并收集细胞稀释于条件培养基中(新鲜的EX-

302无血清培养基：上一步所得的培养上清液＝1∶1混合而得)，使得细胞密度调整至约2×10⁶细胞/毫升，采用氯化钠将渗透压调整到450mΩ，采用5mM氢氧化钠将pH调节为7.5，置于5％CO₂、饱和湿度培养箱中进行培养，并将转速设置为90rpm/min。

3.6天后，将上一步所得细胞离心，并收集细胞稀释于条件培养基中(新鲜的EX-

302无血清培养基：上一步所得的培养上清液＝1∶3混合而得)，使得细胞密度调整至约5×10⁶细胞/毫升，采用氯化钠将渗透压调整到500mΩ，置于5％CO₂、饱和湿度培养箱中进行培养，并将转速设置为100rpm/min。

4.9天后，将上一步所得细胞离心，并收集细胞稀释于条件培养基中(新鲜的EX-

302无血清培养基：上一步所得的培养上清液＝1∶5混合)，使得细胞密度调整至约10×10⁶细胞/毫升，采用氯化钠将渗透压调整到550mΩ，置于5％CO₂、饱和湿度培养箱中进行培养，并将转速设置为110rpm/min。

5.12天后，将上一步所得细胞离心，并收集细胞稀释于条件培养基中(新鲜的EX-

302无血清培养基：上一步所得的培养上清液＝1∶9混合)，使得细胞密度调整至约20×10⁶细胞/毫升，采用氯化钠将渗透压调整到500mΩ，用5mM盐酸将pH调整为6.8，置于5％CO₂、饱和湿度培养箱中进行培养，并将转速设置为120rpm/min。

6.18天后，采用有限稀释法进行无血清克隆化，培养7-14天。该方法包括以下步骤：使用无菌纯水配制100mg/L的D-多聚赖氨酸，室温包被96孔板2h，使用无菌水冲洗包被孔3次；将步骤5的细胞悬液与无血清低密度培养基按照1∶100的比例连续稀释直至细胞密度为50细胞/毫升，以100μL/孔的比例接种24个孔；继续稀释细胞悬液至细胞密度为20细胞/毫升，以100μL/孔的比例接种24个孔；继续稀释细胞悬液至细胞密度为10细胞/毫升，以100μL/孔的比例接种48个孔；最后经过7-14天培养后，筛选出生长和产物表达均理想的克隆株。生长和产物表达均理想的克隆株应满足生长代谢稳定，表达的目标产物质量优良的标准，并且与原始细胞株的生长代谢基本一致。

7.在显微镜下观察单克隆生长情况，同时用夹心ELISA方法检测上清液中目标产物的表达情况，综合考虑生长和表达两方面的结果，筛选生长和表达都较理想的耐受克隆株。

8.准备5L生物反应器和新鲜的EX-

302无血清培养基，将3L新鲜的培养基加入到反应器中。

9.以约5×10⁵细胞/毫升的初始细胞密度将步骤7筛选得到的耐受细胞接种于上述5L生物反应器中，起步转速为80rpm，pH为7.5。

10.将转速按照80、90、100、110、120、130、140、150rpm的梯度不断升高，以不同的细胞密度来控制搅拌的速度。初始细胞密度在5×10⁵细胞/毫升至1×10⁶细胞/毫升，搅拌以80rpm开始；细胞密度达到5×10⁶细胞/毫升时，搅拌可以调整至120rpm；细胞密度达到1×10⁷细胞/毫升以上时，搅拌速度可以调整至150rpm。在此范围间的搅拌速度可以根据细胞的粘附情况(细胞与细胞之间的粘附，以及细胞跟生物反应器内壁之间的粘附)来进行调整，例如当细胞粘附加剧(比如出现了结团、聚集或者粘附到生物反应器内壁)时，可以考虑调高搅拌速度。

11.在细胞密度达到5×10⁶细胞/毫升之后，每天逐步提高乳酸和氨的浓度，乳酸的浓度梯度为：5，10，20，40，80mM，氨的浓度梯度为：2，4，6，8，10mM。乳酸浓度可以通过200mM乳酸进行调整，氨的浓度可以通过200mM氯化铵进行调整。

12.继续培养使细胞密度不断升高，直至细胞密度达到约2×10⁷细胞/毫升。

13.不断检测5L生物反应器中的细胞活性，当细胞活性下降到50％左右时，无菌取样。

14.按照跟步骤6相同的方式采用有限稀释法进行无血清克隆化筛选，从中筛选出生长和产物表达均理想的克隆株。

4)结果：

采用无血清克隆化的方法进行高耐受细胞株亚克隆的筛选，其克隆率为33.7％，且阳性率100％。由附图1和附图2可以看出，本实施例筛选获得的高耐受亚克隆细胞株(简称“高耐受细胞株”)与原始细胞株在相同培养条件下在L-谷氨酰胺和葡萄糖的代谢速度和趋势上基本一致。在整个生长过程中，底物L-谷氨酰胺和葡萄糖基本维持在设定区间范围内，谷氨酰胺浓度维持在约1-4mM，葡萄糖维持在约2-6g/L。流加L-谷氨酰胺和葡萄糖24小时内浓度均满足设定的极限值，其中谷氨酰胺设置低限为1mM，葡萄糖设置低限为1g/L。

由附图3可以看出，高耐受细胞株和原始细胞株的最高细胞密度分别为约9.3×10⁶细胞/毫升和约8.5×10⁶细胞/毫升(均在培养第5天左右达到最高细胞密度)，两者无显著差异。从附图3还可以看出，在对数生长期(第1-4天左右)，高耐受细胞株和原始细胞株在细胞密度方面无显著差异；高耐受细胞株的平台期(第4-6天左右)比原始细胞株(第4-5天左右)延长了一天。

由附图4可以看出，在衰亡期(第5天或第6天起)，高耐受细胞株的细胞活性下降速度要比原始细胞株的细胞活性下降速度慢。另外，高耐受细胞株的培养周期要比原始细胞株的培养周期延长两天，从8天延长至10天。根据ELISA检测结果，高耐受细胞株在第10天表达产物浓度达到最高值，为约280.2mg/L。

Claims

1.一种高耐受细胞株的筛选方法，包括：选取可生长细胞株，将其进行体外培养，改变细胞培养条件从而迫使细胞在不良生长环境中生长代谢，进而筛选获得适应于所述不良生长环境的高耐受细胞株，其特征在于，所述改变的细胞培养条件包括：细胞培养液的渗透压、乳酸浓度、氨浓度、pH值、溶氧浓度或搅拌速度，或者所述细胞培养条件的两种或两种以上的任意组合。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，改变两种或两种以上所述的细胞培养条件。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的改变的细胞培养条件中至少有两种分别进行改变。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，改变细胞培养条件是逐步提高渗透压使得预定的细胞生长参数达到预定的极限值。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，改变细胞培养条件是逐步提高乳酸浓度使得预定的细胞生长参数达到预定的极限值。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，改变细胞培养条件是逐步提高氨浓度使得预定的细胞生长参数达到预定的极限值。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，改变细胞培养条件是同时逐步提高乳酸浓度和氨浓度使得预定的细胞生长参数达到预定的极限值。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，改变细胞培养条件是逐步提高pH值使得预定的细胞生长参数达到预定的极限值。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，改变细胞培养条件是逐步提高搅拌速度使得预定的细胞生长参数达到预定的极限值。

10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，把所述的细胞培养条件直接调整到预定的值。

11.如权利要求4至9的任意一个所述的方法，其特征在于，所述预定的细胞生长参数为细胞活性，预定的极限值是指细胞活性低于50％。

12.如权利要求4至9的任意一个所述的方法，其特征在于，所述预定的细胞生长参数为细胞倍增期，预定的极限值是指细胞倍增期无法保持稳定。

13.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞株是哺乳动物细胞株。

14.如权利要求1所述的方法，其特征在于，进一步用无血清克隆化方法对获得的细胞进行筛选，获得生长代谢稳定的高耐受细胞株。

15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述高耐受细胞株所表达的产物质量合格。

16.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在低营养物浓度的条件下对所述细胞株进行筛选。

17.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在高细胞密度的条件下对所述细胞株进行筛选。