MXPA05001978A - Nuevas lipasas y usos de las mismas. - Google Patents

Abstract

Una secuencia de polinucleotidos recientemente identificada que comprende un gen que codifica una nueva enzima lipolitica de Aspergillus Niger. La invencion ofrece la secuencia de nucleotidos de longitud completa del nuevo gen, la secuencia de ADNc que comprende la secuencia de codificacion de longitud completa de la nueva enzima lipolitica, asi como la secuencia de aminoacidos de la proteina funcional de longitud completa y equivalentes funcionales de las mismas. La invencion tambien se relaciona con metodos para usar estas enzimas en procesos industriales y metodos de diagnostico de infecciones fungicas. La invencion tambien incluye celulas transformadas con un polinucleotido acorde con la invencion y celulas en las cuales la enzima lipolitica acorde con la invencion esta modificada geneticamente para aumentar su actividad y/o nivel de expresion.

Description

NUEVAS LIPASAS Y USOS DE LAS MISMAS Campo de la invención La invención se relaciona con secuencias de polinucleótidos recientemente identificadas que comprenden un gen que codifica una nueva enzima lipolítica de Aspergillus niger. La invención abarca la secuencia de nucleótidos de longitud completa del nuevo gen, la secuencia de ADNc que comprende la secuencia de codificación de longitud completa de la nueva enzima lipolítica así como la secuencia de aminoácidos de la enzima lipolítica de longitud completa y equivalentes funcionales de la misma. La invención también se relaciona con métodos para usar estas enzimas en procesos industriales y métodos de diagnóstico de infecciones fúngicas. También están incluidas en la invención células transformadas con un polinucleotido acorde con la invención y células en las cuales la enzima lipolítica acorde con la invención está modificada genéticamente para aumentar su actividad y/o nivel de expresión.

Antecedentes de la invención Los productos horneados se preparan a partir de una masa elaborada habitualmente con los ingredientes básicos de harina, agua y, optativamente, sal. Según los productos horneados, otros ingredientes opcionales son azúcares, saborizantes , etcétera. Para los productos que contienen levadura, se usa primariamente levadura de panadería junto con sistemas químicos de fermentado, tal como una combinación de un ácido (compuesto generador) y bicarbonato . Con el fin de mejorar las propiedades de manejo de la masa y/o las propiedades finales de los productos horneados, continuamente se realizan esfuerzos para desarrollar adyuvantes de procesamiento con mejores propiedades . Los adyuvantes de procesamiento se definen aquí como compuestos que mejoran las propiedades de manejo de la masa y/o las propiedades finales de los productos horneados. Las propiedades de la masa a mejorar comprenden maquinabilidad, capacidad de retención de gases, menor pegajosidad, elasticidad, extensibilidad, capacidad de moldeado, etcétera. Las propiedades de los productos horneados que se pueden mejorar comprenden volumen de la hogaza de pan, tostado de la corteza, textura y suavidad de la miga, sabor y gusto, endurecimiento relativo y vida en estante. Estos adyuvantes de procesamiento mejoradores de la masa y/o del producto horneado se pueden dividir en dos grupos: aditivos químicos y enzimas (también denominadas enzimas de horneado) . La levadura, las enzimas y los aditivos químicos se agregan generalmente por separado a la masa. La levadura se pueden agregar como una suspensión líquida, en una forma comprimida o como una levadura seca activa (ADY) o seca instantánea (IDY) . La diferencia entre estas formulaciones de levadura es el contenido de agua y materia seca de levadura. La levadura líquida tiene un contenido de materia seca de levadura menor que un 25% (p/v) . La levadura cremosa es una forma particular de levadura líquida y tiene un contenido de materia seca entre 17 y 23% (p/v) . La levadura comprimida tiene un contenido de materia seca de levadura entre 25-35% (p/v) , en tanto las formulaciones de levadura seca tienen un contenido de materia seca de levadura entre un 92-98% (p/v) . Las enzimas se pueden agregar en una forma seca, por ejemplo una forma granulada, o en una forma líquida. Los aditivos químicos se agregan en la mayoría de los casos en la forma de un polvo. Además, las composiciones de adyuvante de procesamiento que están adaptadas a aplicaciones de horneado específicas, pueden estar compuestas de una mezcla dedicada de aditivos químicos y enzimas . La preparación de una masa a partir de los ingredientes y adyuvantes de procesamiento descritos previamente es bien conocida en el arte y comprende el mezclado de dichos ingredientes y adyuvantes de procesamiento y uno o varios pasos de moldeado y fermentación. La preparación de productos horneados a partir de dichas masas también es bien conocida en el arte y puede comprender los pasos de moldear y dar forma y una fermentación adicional de la masa seguido del horneado a las temperaturas y tiempos de horneado requeridas . Los aditivos químicos con propiedades mejoradas comprenden agentes oxidantes tal como ácido ascórbico, bromato y azodicarbonato, agentes reductores, tal como L-cisterna y glutatión, emulsionantes que actúan como acondicionadores de la masa tal como esteres diacetil tartáricos de mono/diglicéridos (DATEM) , estearoíl lactilato de sodio (SSL) o estearoíl lactilato de calcio (CSL) , o que actúan como suavizantes de la miga tal como monoestearato de glicerol (GMS) , etcétera, materiales grasos tal como triglicéridos (grasa) o lecitina y otros. Como resultado de la necesidad de los consumidores de reemplazar los aditivos químicos por productos más naturales, se han desarrollado varias enzimas de horneado con propiedades mejoradas para la masa y/o el producto horneado y que se usan en todas las combinaciones posibles según las condiciones específicas de la aplicación de horneado. Las enzimas adecuadas incluyen enzimas degradadoras del almidón, arabinoxilano y otras enzimas degradadoras de hemicelulosa, enzimas degradadoras de celulosa, enzimas oxidantes, enzimas fraccionadoras de materia grasa, enzimas degradadoras, modificadoras o entrecruzadoras de proteínas . Las enzimas degradadoras del almidón comprenden, por ejemplo, enzimas que actúan en forma endo, tal como alfa-amilasa, amilasa maltogénica, pullulanasa u otras enzimas desramificadoras y enzimas que actúan en forma exo que separan glucosa (amiloglucosidasa) , maltosa (beta-amilasa) , maltotriosa, maltotetraosa y oligosac ridos superiores. Las enzimas degradadoras de arabinoxilano y otras enzimas degradadoras de hemicelulosa son por ejemplo xilanasas, pentosanasas, hemicelulasa, arabinofuranosidasa, glucanasa y otras . Las enzimas degradadoras de celulosa son, por ejemplo, celulasa, celobiohidrolasa y beta-glucosidasa. Las enzimas oxidantes son, por ejemplo, glucosa oxidasa, hexosa oxidasa, piranosa oxidasa, sulfhidrilo oxidasa, lipoxigenasa, laccasa, polifenol oxidasas y otras.

Las enzimas fraccionadoras de materia grasa son, por ejemplo, enzimas lipolíticas tal como triacilglicerol lipasas, fosfolipasas (tal como Alr A2, B, G y D) y galactolipasas . Las enzimas degradadoras, modificadoras o entrecruzadoras de proteínas son, por ejemplo, proteasas que actúan en forma endo (serina proteasas, metaloproteasas , aspartilo proteasas, tiol proteasas) , peptidasas que actúan en forma exo olivando un aminoácido o dipéptido, tripéptido, etcétera del extremo N-terminal (aminopep idasas) o extermina! (carboxipeptidasas) de la cadena de polipéptidos , enzimas deamidantes de asparaginas o glutamina, tal como deamidasa y peptidoglutaminasa o enzimas entrecruzadoras , tal como transglutaminasa . Las enzimas de horneado se pueden producir convenientemente en microorganismos . Las enzimas de horneado microbianas se pueden obtener de numerosas fuentes; las especies de Bacillus constituyen una fuente común de enzimas bacterianas, en tanto las enzimas fúngicas se producen comúnmente en especies de Aspergillus . Las enzimas de horneado se pueden usar en infinidad de bienes de consumo horneados. El término "bienes de consumo horneados", tal como se define aquí, comprende productos horneados tal como pan de molde, hogazas de pan, pan francés, así como panecillos, tortas, tartas, pastelitos, buñuelos tipo torta con levadura y semejantes. En los procesos anteriores, resulta ventajoso usar enzimas de horneado obtenidas mediante técnicas de ADN recombinante . Dichas enzimas recombinantes presentan numerosas ventajas con respecto a sus contrapartes purificadas de la manera tradicional . Las enzimas recombinantes se pueden producir a un bajo costo, con un gran rendimiento, libres de agentes contaminantes como bacterias o virus pero también libres de toxinas bacterianas u otras actividades enzimáticas contaminantes.

Sumario de la invención Uno de los objetos de la invención consiste en proveer polinucleótidos nuevos que codifican las nuevas enzimas lipolíticas con propiedades mejoradas. Otro objeto consiste en proveer enzimas lipolxticas producidas de forma natural y recombinante, así como cepas recombinantes productoras de las mismas. También son parte de la invención los polipéptidos de fusión, así como los métodos para obtener y usar los polinucleótidos y polipéptidos acordes con la invención . También constituye un objeto de la invención la provisión de nuevas enzimas lipolíticas, que permiten resolver al menos uno de los problemas mencionados previamente o la provisión de nuevas enzimas lipolíticas, que presentan una o varias propiedades mejoradas si se usan en una masa y/o en productos horneados, seleccionadas del grupo de mayor fuerza de la masa, mayor elasticidad de la masa, mayor estabilidad de la masa, menor pegajosidad de la masa, mayor extensibilidad de la masa, mayor maquinabilidad de la masa, mayor volumen del producto horneado, mejor estructura de la corteza del producto horneado, mayor suavidad del producto horneado, mayor sabor del producto horneado, mayor retardo en el endurecimiento del producto horneado, mejor color del producto horneado, mejor corteza del producto horneado o que presenta una especificidad de sustrato muy amplia. La invención provee polinucleótidos nuevos que codifican nuevas enzimas lipolíticas . Más particularmente, la invención provee polinucleótidos que poseen una secuencia de nucleótidos que se hibridiza preferentemente bajo condiciones muy severas con una secuencia seleccionada del grupo formado por las SEQ ID N° : 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 13, 14, 16, 17, 19, 20, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 31, 32, 34, 35, 37 y 38. En consecuencia, la invención provee ácidos nucleicos que son más de un 40%, tal como aproximadamente un 60%, preferentemente un 65%, más preferentemente un 70%, más preferentemente aún un 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% homologa de las secuencias seleccionadas del grupo formado por las SEQ ID N° : 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 13, 14, 16, 17, 19, 20, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 31, 32, 34, 35, 37 y 38. En una forma de realización más preferida, la invención provee dicho polinucleotido aislado que se puede obtener de un hongo filamentoso, en particular se prefiere que sea de Aspergillus niger. En una forma de realización, la invención provee un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipeptido con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo formado por las SEQ ID N° : 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36 y 39 o equivalentes funcionales de las mismas. En otra forma de realización preferida, la invención provee un polinucleótido aislado que codifica al menos un dominio funcional de un polipéptido seleccionado del grupo formado por las SEQ ID N° : 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36 y 39 o equivalentes funcionales de las mismas. En una forma de realización preferida, la invención provee un gen de una enzima lipolítica seleccionado del grupo formado por las SEQ ID N° : 1, 4, 7, 10, 13, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34 y 37. En otro aspecto la invención provee un polinucleótido, preferentemente un ADNc que codifica una enzima lipolítica de Aspergillus niger cuya secuencia de aminoácidos se selecciona del grupo formado por las SEQ ID N° -. 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36 y 39 o variantes o fragmentos de dicho polipéptido. En una forma de realización preferida el ADNc posee una secuencia seleccionada del grupo formado por las SEQ ID N° : 2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23, 26, 29, 32, 35 y 38 o equivalentes funcionales de las mismas. En aún otra forma de realización preferida, la invención provee un polinucleótido que comprende la secuencia de codificación de los polinucleotidos acordes con la invención, siendo preferida la secuencia de polinucleotidos seleccionada del grupo formado por las SEQ ID N°: 2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23, 26, 29, 32, 35 y 38. La invención también se relaciona con vectores que comprenden una secuencia de polinucleotidos acorde con la invención y cebadores, sondas y fragmentos que se pueden usar para amplificar o detectar el ADN acorde con la invención . En otra forma de realización preferida, se provee un vector en el cual la secuencia de polinucleotidos acorde con la invención está ligada funcionalmente con secuencias reguladoras adecuadas para la expresión de la secuencia de aminoácidos codificada en una célula huésped adecuada, tal como Aspergillus niger o Aspergillus oryzae. La invención también provee métodos para preparar los polinucleotidos y vectores acordes con la invención. La invención también se relaciona con células huésped producidas de forma recombinante que contienen los polinucleotidos heterólogos u homólogos acordes con la invención. En otra forma de realización, la invención provee células huésped recombinantes en las cuales está aumentada significativamente la expresión de una enzima lipolítica acorde con la invención o en las cuales está aumentada la actividad de la enzima lipolítica. En otra forma de realización, la invención provee una célula huésped producida de forma recombinante que contiene el polinucleótido heterólogo u homólogo acorde con la invención y donde dicha célula puede producir una enzima lipolítica funcional acorde con la invención, preferentemente es una célula capaz de sobreexpresar la enzima lipolítica acorde con la invención, por ejemplo una cepa de Aspergillus que comprende un mayor número de copias de un gen o ADNc acorde con la invención. En aún otro aspecto de la invención, se provee un polipéptido purificado. Los polipéptidos acordes con la invención incluyen los polipéptidos codificados por los polinucleótidos acordes con la invención. Se prefiere especialmente un polipéptido seleccionado del grupo formado por las SEQ ID N° : 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36 y 39 o equivalentes funcionales de las mismas. Por consiguiente, en un aspecto la presente invención provee una composición de enzimas lipolíticas que contiene como ingrediente activo una enzima seleccionada del grupo formado por las SEQ ID N° : 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36 y 39 o equivalentes funcionales de las mismas. En otro aspecto, la invención provee un método para elaborar bienes de consumo horneados, donde se ha incorporado en la masa usada para obtener dichos bienes de consumo horneados una o varias enzimas seleccionadas del grupo formado por las SEQ ID N° : 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36 y 39 o equivalentes funcionales de las mismas . Las proteínas de fusión que comprenden un polipéptido acorde con la invención también pertenecen al alcance de la invención. La invención también provee métodos para obtener los polipéptidos acordes con la invención. La invención también se relaciona con el uso de la enzima lipolítica acorde con la invención en cualquiera de los procesos industriales descritos en la presente.

Descripción detallada de la invención Una enzima lipolítica se define aquí como una enzima que presenta por lo menos una y preferentemente dos o tres o cuatro o m s de las siguientes actividades lipolíticas: triacilglicerol lipasa, fosfolipasa Alr fosfolipasa A2, fosfolipasa B, fosfolipasa C, fosfolipasa D, lisofosfolipasa y galactolipasa . Polinucleótidos La presente invención provee polinucleótidos que codifican enzimas lipolíticas que poseen una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo formado por las SEQ ID N° : 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36 y 39 o equivalentes funcionales de las mismas . Se determinaron las secuencias de los siete genes que codifican las enzimas lipolíticas NBE028, NBE029, NBE030, NBE031, NBE032, NBE033, NBE034, NBE036, NBE038, NBE039, NBE043, NBE045 y NBE042 respectivamente por secuenciación de clones genómicos obtenidos de Aspergillus niger. La invención provee secuencias de polinucleótidos que comprenden los genes que codifican las enzimas lipolíticas BE028, NBE029, NBE030, NBE031, NBE032, NBE033, NBE034, NBE036, NBE038, NBE039, NBE043, NBE045 y NBE042 así como las secuencias de ADNc completas y las correspondientes secuencias de codificación (Tabla 1) . Por consiguiente, la invención se relaciona con polinucleótidos aislados que comprenden las secuencias de nucleótidos seleccionadas del grupo formado por las SEO ID N°: 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 13, 14, 16, 17, 19, 20, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 31, 32, 34, 35, 37 y 38 o equivalentes funcionales de las mismas.

Tabla 1. enzima Secuencia (SEQ ID N°) lipolítica NBE xxx Genómica ADNc Aminoácidos NBE028 1 2 3 NBE029 4 5 6 NBE030 7 8 9 NBE031 10 11 12 NBE032 13 14 15 NBE033 16 17 18 NBE034 19 20 21 Tabla 1. (continuación) Más particularmente, la invención se relaciona con un polinucleótido aislado que se puede hibridizar bajo condiciones severas, preferentemente bajo condiciones muy severas, con un polinucleótido seleccionado del grupo formado por las SEQ ID N°: 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 13, 14, 16, 17, 19, 20, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 31, 32, 34, 35, 37 y 38. Convenientemente, dichos polinucleótidos se pueden obtener a partir de hongos filamentosos, en particular a partir de Aspergillus niger. Más específicamente, la invención se relaciona con un polinucleótido aislado que posee una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo formado por las SEQ ID N° : 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 13, 14, 16, 17, 19, 20, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 31, 32, 34, 35, 37 y 38.

La invención también se relaciona con un polinucleótido aislado que codifica al menos un dominio funcional de un polipéptido que posee una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo formado por las SEQ ID N° : 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36 y 39 o equivalentes funcionales de las mismas. Tal como se usa aquí, los términos "gen" y "gen recombinante" se refieren a moléculas de ácido nucleico que se pueden aislar de ADN cromosomico, que incluyen un marco de lectura abierto que codifica una proteína, por ejemplo una enzima lipolítica de Aapergillus niger. El gen puede incluir secuencias codificadoras, secuencias no codificadoras, intrones y secuencias reguladoras. Más aún, un gen se refiere a una molécula de ácido nucleico aislada, como se definió en este documento. Una molécula de ácido nucleico de la presente invención, tal como una molécula de ácido nucleico que posee una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo formado por las SEQ ID N° : 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 13, 14, 16, 17, 19, 20, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 31, 32, 34, 35, 37 y 38 o un equivalente funcional de las mismas, se puede aislar usando técnicas de biología molecular estándar y la información de secuencia provista aquí. Por ejemplo, utilizando todo o una porción de una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo formado por las SEQ ID N° : 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 13, 14, 16, 17, 19, 20, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 31, 32, 34, 35, 37 y 38 con una sonda de hibridación, se pueden aislar moléculas de ácido nucleico acordes con la invención con las técnicas de hibridación y clonación estándar (por ejemplo, como se describe en Sambrook, J. , Fritsh, E. F. y Maniatis, T. Molecular Cloníng: A Laboratory Manual. 2a, ed. , Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) . Más aún, se puede aislar una molécula de ácido nucleico que abarca todo o una porción de una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo formado por las SEQ ID N° : 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 13, 14, 16, 17, 19, 20, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 31, 32, 34, 35, 37 y 38 mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando cebadores de oligonucleotidos sintéticos diseñados sobre la base de la información de secuencia contenida en una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo formado por las SEQ ID N° : 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 13, 14, 16, 17, 19, 20, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 31, 32, 34, 35, 37 y 38. Se puede amplificar un ácido nucleico de la invención usando 7AD c, ARNm o, como alternativa, 7ADN genómico, como templado y los cebadores de oligonucleotidos apropiados de acuerdo con las técnicas de amplificación con PCR estándar. El ácido nucleico así amplificado se puede clonar en un vector apropiado y caracterizar mediante análisis de la secuencia de ADN. Aún más, los oligonucleótidos correspondientes a o que se pueden hibridizar con las secuencias de nucleótidos acordes con la invención se pueden preparar mediante técnicas de síntesis estándar, por ejemplo, usando un sintetizador de ADN automático. En una forma de realización preferida, la molécula de ácido nucleico aislada de la invención comprende la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEQ ID N° : 2. La secuencia de la SEQ ID N° : 2 corresponde a la región de codificación del gen de Aspergillus niger provisto en la SEQ ID N°: 1. Este ADNc comprende una secuencia que codifica el polipéptido NBE028 de Aspergillus niger que se muestra en la SEQ ID N° : 3. En una segunda forma de realización preferida, la molécula de ácido nucleico aislada de la invención comprende la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEQ ID N°: 5. La secuencia de la SEQ ID N° : 5 corresponde a la región de codificación del gen de Aspergillus niger provisto en la SEQ ID N° : 4. Este ADNc comprende la secuencia que codifica el polipéptido NBE029 de Aspergillus niger que se muestra en la SEQ ID N°: 6. En una tercera forma de realización preferida, la molécula de ácido nucleico aislada de la invención comprende la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEQ ID N° : 8. La secuencia de la SEQ ID N°: 8 corresponde a la región de codificación del gen de Aspergillus niger provisto en la SEQ ID N° : 7. Este ADNc comprende la secuencia que codifica el polipeptido NBE030 de Aspergillus niger que se muestra en la SEQ ID N° : 9. En una cuarta forma de realización preferida, la molécula de ácido nucleico aislada de la invención comprende la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEQ ID N° : 11. La secuencia de la SEQ ID N° : 11 corresponde a la región de codificación del gen de Aspergillus niger provisto en la SEQ ID N° : 10. Este ADNc comprende la secuencia que codifica el polipeptido NBE031 de Aspergillus niger que se muestra en la SEQ ID N° : 12. En una quinta forma de realización preferida, la molécula de ácido nucleico aislada de la invención comprende la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEQ ID N° : 14. La secuencia de la SEQ ID N° : 14 corresponde a la región de codificación del gen de Aspergillus niger provisto en la SEQ ID N° : 13. Este ADNc comprende la secuencia que codifica el polipeptido NBE032 de Aspergillus niger que se muestra en la SEQ ID N° : 15. En una sexta forma de realización preferida, la molécula de ácido nucleico aislada de la invención comprende la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEQ ID N° : 17. La secuencia de la SEQ ID H° : 17 corresponde a la región de codificación del gen de Aspergillus niger provisto en la SEQ ID N° : 16. Este ADNc comprende la secuencia que codifica el polipeptido NBE033 de Aspergillus niger que se muestra en la SEQ ID JST° : 18. En una séptima forma de realización preferida, la molécula de ácido nucleico aislada de la invención comprende la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEQ ID N° : 20. La secuencia de la SEQ ID N°: 20 corresponde a la región de codificación del gen de Aspergillus niger provisto en la SEQ ID N°: 19. Este ADNc comprende la secuencia que codifica el polipeptido NBE034 de Aspergillus niger que se muestra en la SEQ ID N° : 21. En una octava forma de realización preferida, la molécula de ácido nucleico aislada de la invención comprende la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEQ ID N°: 23. La secuencia de la SEQ ID N°: 23 corresponde a la región de codificación del gen de Aspergillus niger provisto en la SEQ ID N° : 22. Este ADNc comprende la secuencia que codifica el polipeptido NBE034 de Aspergillus niger que se muestra en la SEQ ID JSTG : 2 . En una novena forma de realización preferida, la molécula de ácido nucleico aislada de la invención comprende la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEQ ID F: 26. La secuencia de la SEQ ID F: 26 corresponde a la región de codificación del gen de Aspergillus niger provisto en la SEQ ID N° : 25. Este ADNc comprende la secuencia que codifica el polipéptido NBE034 de Aspergillus niger que se muestra en la SEQ ID N° : 27. En una décima forma de realización preferida, la molécula de ácido nucleico aislada de la invención comprende la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEQ ID N° : 29. La secuencia de la SEQ ID N° : 22 corresponde a la región de codificación del gen de Aspergillus niger provisto en la SEQ ID N° : 28. Este ADNc comprende la secuencia que codifica el polipéptido NBE034 de Aspergillus niger que se muestra en la SEQ ID N°: 30. En una undécima forma de realización preferida, la molécula de ácido nucleico aislada de la invención comprende la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEQ ID N° : 32. La secuencia de la SEQ ID N° : 32 corresponde a la región de codificación del gen de Aspergillus niger provisto en la SEQ ID N° : 31. Este ADNc comprende la secuencia que codifica el polipéptido NBE034 de Aspergillus niger que se muestra en la SEQ ID N° : 33. En una duodécima forma de realización preferida, la molécula de ácido nucleico aislada de la invención comprende la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEQ ID N° : 35. La secuencia de la SEQ ID N° : 35 corresponde a la región de codificación del gen de Aspergillus niger provisto en la SEQ ID N° : 34 Este ADNc comprende la secuencia que codifica el polipéptido NBE034 de Aspergillus niger que se muestra en la SEQ ID N°: 36. En una decimotercera forma de realización preferida, la molécula de ácido nucleico aislada de la invención comprende la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEQ ID N° : 38. La secuencia de la SEQ ID N° : 38 corresponde a la región de codificación del gen de Aspergillus niger provisto en la SEQ ID N° -. 37. Este ADNc comprende la secuencia que codifica el polipéptido NBE034 de Aspergillus niger que se muestra en la SEQ ID N° : 39. En otra forma de realización preferida, la molécula de ácido nucleico aislada de la invención comprende una molécula de ácido nucleico que es el complemento de una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo formado por SEQ ID N° : 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 13, 14, 16, 17, 19, 20, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 31, 32, 34, 35, 37 y 38 o un equivalente funcional de estas secuencias de nucleótidos . La molécula de ácido nucleico, que es complementaria de otra secuencia de nucleótidos, será suficientemente complementaria de la otra secuencia de nucleótidos como para hibridizarse con dicha otra secuencia de nucleótidos formando una dupla estable. Un aspecto de la invención se refiere a moléculas aisladas de ácido nucleico que codifican un polipéptido de la invención o un equivalente funcional del mismo, tal como un fragmento o dominio biológicamente activo, así como moléculas de ácido nucleico suficientes como para usarlas como sondas de hibridación para identificar moléculas de ácido nucleico codificadoras de un polipéptido de la invención y fragmentos de dichas moléculas de ácido nucleico adecuados para su uso como cebadores para PCR en la amplificación o mutación de moléculas de ácido nucleico. Un "polinucleótido aislado" o "ácido nucleico aislado" es un ADN o ARN que no es inmediatamente contiguo de ambas secuencias de codificación de las cuales es inmediatamente contiguo (una por el extremo 5' y una por el extremo 3') en el genoma natural del organismo del cual deriva. Así, en una forma de realización, un ácido nucleico aislado incluye parte o todas las secuencias no codificadoras 5' (por ejemplo, promotoras) que son inmediatamente contiguas de la secuencia de codificación. El término incluye entonces, por ejemplo, un ADN recombinante que se ha incorporado en un vector, en un plásmido de recombinación autónoma o en un virus o en el ADKT genómíco de un procarionte o eucarionte, o que existe como una molécula separada (por ejemplo, un ADNc o un fragmento de ADN genómico producido por PCR o tratamiento con endonucleasas de restricción) independiente de otras secuencias . También incluye un ADN recombinante que forma parte de un gen híbrido que codifica un polipéptido adicional que est sustancialmente libre de material celular, material viral o medio de cultivo (cuando es producido mediante técnicas de ADN recombinante) o precursores químicos u otras sustancias químicas (cuando es sintetizado químicamente) . Más aún, un "fragmento de ácido nucleico aislado" es un fragmento de ácido nucleico que no aparece naturalmente como un fragmento y que no aparece así en el estado natural . Tal como se usan aquí, los términos "polinucleótido" o "molécula de ácido nucleico" pretenden incluir moléculas de ADN (por ejemplo, ADNc o ADN genómico) y moléculas de ARN (por ejemplo, ARNm) y análogos del ADN o ARN generado usando análogos de los nucleótidos. La molécula de ácido nucleico puede ser de cadena simple o doble, pero preferentemente es ADN de cadena doble. El ácido nucleico puede ser sintetizado usando análogos o derivados (por ejemplo, los nucleótidos inosina o fosforotioato) de oligonucleótidos . Dichos oligonucleótidos se pueden usar, por ejemplo, para preparar ácidos nucleicos que presentan alteraciones en el apareamiento de bases o mayor resistencia a nucleasas. Otra forma de realización de la invención provee una molécula de ácido nucleico aislada que es de orientación antisentido con respecto a la molécula de ácido nucleico acorde con la invención. También están incluidas en el alcance de la invención las cadenas complementarias de las moléculas de ácido nucleico que se describen aquí.

Errores de secuencia La información de secuencia provista aquí no se debe interpretar tan estrechamente como para requerir la inclusión de bases erróneamente identificadas. Las secuencias específicas que se describen aquí se pueden emplear fácilmente para aislar un gen completo de hongos filamentosos, en particular Aspergillus niger, que a su vez puede ser sometido a análisis de secuencia adicionales que permitan identificar de esa manera los errores de secuencia . A menos que se indique lo contrario, todas las secuencias de nucleótidos determinadas aquí por secuenciación de una molécula de ADN se obtuvieron usando un secuenciador automático de ADN y todas las secuencias de aminoácidos de los polipéptidos codificados por las moléculas de ADN determinadas aquí fueron predichas por traducción de la secuencia de ADN determinada previamente . Por ello, como es de conocimiento en el arte para cualquier secuencia de ADN determinada con este enfoque automático, todas las secuencias de nucleótidos determinadas aquí pueden contener algunos errores. Las secuencias de nucleótidos determinadas automáticamente son típicamente al menos un 90% idénticas aproximadamente, más típicamente entre al menos un 95% aproximadamente y al menos un 99,9% idénticas aproximadamente a la secuencia de nucleótidos real de la molécula de ADN. La secuencia real puede ser determinada con mayor precisión utilizando otros enfoques, incluyendo los métodos de secuenciacion manual de ADN bien conocidos en el arte . Como también es de conocimiento en el arte, una sola inserción o supresión en una determinada secuencia de nucleótidos en comparación con la secuencia real causará un desplazamiento del marco durante la traducción de la secuencia de nucleótidos, de modo que la secuencia de aminoácidos predicha codificada por una determinada secuencia de nucleótidos será completamente diferente de la secuencia de aminoácidos codificada realmente por la molécula de ADN secuenciada, que comienza en el lugar de dicha inserción o supresión. El especialista en el arte puede identificar dichas bases identificadas erróneamente y sabe como corregir dichos errores . Fragmentos, sondas y cebadores de ácido nucleico La molécula de ácido nucleico acorde con la invención puede comprender solamente una porción o un fragmento de una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo formado por las SEQ ID N° : 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 13, 14, 16, 17, 19, 20, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 31, 32, 34, 35, 37 y 38, por ejemplo un fragmento que se pueda usar como sonda o cebador o un fragmento codificador de una porción de proteína acorde con la invención. La secuencia de nucleótidos determinada por la clonación de gen y ADNc de la enzima lipolítica permite la generación de sondas y cebadores diseñados para identificar y/o clonar otros miembros de la familia de enzimas lipolíticas, así como homólogos de enzimas lipolíticas de otras especies. La sonda/el cebador comprende típicamente un oligonucleótido sustancialmente purificado que comprende típicamente una región de la secuencia de nucleótidos que se hibridíza con preferencia bajo condiciones muy severas con al menos 12 ó 15 aproximadamente, con preferencia con 18 ó 20 aproximadamente, con preferencia con 22 ó 25 aproximadamente, con mayor preferencia con 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 6 75 o más nucleótidos consecutivos de una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo formado por las SEQ ID N° : 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 13, 14, 16, 17, 19, 20, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 31, 32, 34, 35, 37 y 38 o de una equivalente funcional de las mismas. Las sondas basadas en las secuencias de nucleótidos provistas aquí se pueden usar para detectar trasncritos o secuencias genómicas que codifican las mismas proteínas o proteínas homologas, por ejemplo, en otros organismos. En realizaciones preferidas, la sonda comprende además un grupo marcador unido a la misma, por ejemplo, el grupo marcador puede ser un radioisótopo, un compuesto fluorescente, una enzima o un cofactor de una enzima. Dichas sondas también se pueden usar como parte de un conjunto de elementos de diagnóstico para células que expresan una enzima lipolítica. Identidad y homología Los términos "homología" o "porcentaje de identidad" se usan indistintamente en este documento. A los efectos de esta invención, se define aquí que con el fin de determinar el porcentaje de identidad de dos secuencias de aminoácidos o de dos secuencias de ácidos nucleicos, se alinean las secuencias para lograr una comparación óptima (por ejemplo, se pueden introducir faltas de coincidencia o huecos en la secuencia de una primera secuencia de aminoácidos o de ácido nucleico para lograr una alineación óptima con una segunda secuencia de aminoácidos o de ácidos nucleicos) . Luego se comparan los residuos de aminoácidos o de nucleótidos en las correspondientes posiciones de aminoácidos o de nucleótidos . Cuando una posición en la primera secuencia es ocupada por el mismo residuo de aminoácido o nucleótido en la posición correspondiente en la segunda secuencia, entonces las moléculas son idénticas en dicha posición. El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una función de la cantidad de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (es decir, % identidad = cantidad de posiciones idénticas/cantidad total de posiciones (es decir, posiciones superpuestas) x 100) . Se prefiere que las dos secuencias sean de la misma longitud. El especialista tendrá en cuenta el hecho que existen numerosos programas para computadora diferentes para determinar la homología entre dos secuencias. Por ejemplo, la comparación de secuencias y la determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias se pueden llevar a cabo usando un algoritmo matemático. En una realización preferida, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos se determina usando el algoritmo de Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol . (48): 444-453 (1970)) que se ha incorporado en el programa GAP del paquete de software GCG (disponible en http: // ww.gcg.com) , usando ya sea una matriz Blossom 62 o una matriz PAM250 y un peso de faltas de coincidencia de 16, 14, 12, 10, 8, 6 ó 4 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5 ó 6. El especialista tendrá en cuenta asimismo que con todos estos parámetros diferentes se obtendrán resultados ligeramente distintos pero que el porcentaje de identidad general de las dos secuencias no se altera significativamente cuando se usan algoritmos diferentes. En aún otra realización, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de nucleótidos se determina usando el programa GAP del paquete de software GCG (disponible en http: //www. gcg.com) , usando la matriz NWSgapdna . CMP y un peso de faltas de coincidencia de 40, 50, 60, 70 ú 80 y un peso de longitud de l, 2, 3, 4, 5 ó 6. En otra realización, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos o de nucleótidos se determina usando el algoritmo de E. Meyers y W. Miller (CABIOS, 4: 11-17 (1989) que se lia incorporado en el programa ALIGN (versión 2,0) (disponible en: http: //vega . igh. cnrs . fr/bin/align-guess.cgi) con la tabla de pesos de residuos PAM120, una restricción para la longitud de faltas de coincidencia de 12 y restricción para las faltas de coincidencia de 4. Las secuencias de aminoácidos y de proteínas de la presente invención se pueden usar además como "secuencias de consulta" para llevar a cabo búsquedas en bases de datos públicas, por ejemplo, para identificar otros miembros de la familia o secuencias relacionadas . Dichas búsquedas se pueden llevar a cabo usando los programas BLASTN y BLASTX (versión 2.0) de Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol . 215: 403-10. Las búsquedas de nucleótidos BLAST se pueden llevar a cabo con el programa BLASTN, calificación = 100, longitud de palabra = 12 para obtener secuencias de nucleótidos homologas de las moléculas de ácido nucleico PLP03 de la invención. Las búsquedas de proteínas BLAST se pueden llevar a cabo con el programa BLASTX, calificación = 50, longitud de palabra = 3 , para obtener secuencias de aminoácidos homólogas de las moléculas de la proteína PLP03 de la invención. Para obtener alineaciones con faltas de coincidencia a efectos comparativos, se puede utilizar el programa Gapped BLAST como se describe en Altschul et al . , (1997) Nucleic Acids Res. 25(17): 3389-3402. Cuando se utilizan los programas BLAST y Gapped BLAST, se pueden emplear los parámetros predeterminados de los respectivos programas (por ejemplo, BLASTX y BLASTN) . Véase htt : //www . ncbi . nlm.nih . gov. Hibridación Tal como se utiliza aquí, el término "hibridizante" pretende describir las condiciones de hibridación y lavado bajo las cuales las secuencias de nucleótidos que son al menos un 50% aproximadamente, al menos un 60% aproximadamente, al menos un 70% aproximadamente, más preferentemente al menos un 80% aproximadamente, más preferentemente aún al menos entre un 85% y 90% aproximadamente, más preferentemente al menos un 95% homólogas entre sí permanecen típicamente hibridizadas entre sí. Un ejemplo preferido, no limitante, de dichas condiciones de hibridación comprenden una hibridación en cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) 6x a 45 °C aproximadamente, seguido de uno o varios lavados en SSC lx, SDS 0.1% a 50 °C, preferentemente a 55 °C, preferentemente a 60 °C y más preferentemente aún a 65 °C. Las condiciones de gran severidad incluyen, por ejemplo, una hibridación a 68 °C en SSC 5x / solución de Denhardt 5x / SDS 1.0% y lavado en SSC 0.2x / SDS 0.1% a temperatura ambiente. Como alternativa, el lavado se puede llevar a cabo a 42 °C. El especialista conoce las condiciones que debe aplicar para lograr condiciones de hibridación severas y de gran severidad. En el arte se dispone de lineamientos adicionales con respecto a dichas condiciones, por ejemplo, en Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y. ; y Ausubel et al. (eds.), 1995, Current Protocole in Molecular Biology, (John Wiley & Sons, N.Y. ) . Por supuesto, no se incluirá un polinucleótido que solamente se hibridiza con una secuencia poli A (tal como la extensión poli (A) 3' terminal de los ARNm) o con una extensión complementaria de residuos T (o U) en el polinucleótido de la invención usado para hibridizarse específicamente con una porción de un ácido nucleico de la invención, dado que dicho polinucleótido se hibridizará con cualquier molécula de ácido nucleico que contenga una extensión poli (A) o el complemento de la misma (por ejemplo, prácticamente cualquier clon de ADNc de cadena doble) .

Obtención de ADN de longitud completa de otros organismos En un enfoque típico, se pueden efectuar búsquedas y examinar bibliotecas de ADNc construidos a partir de otros organismos, por ejemplo hongos filamentosos, en particular de especies de Aspergillus. Por ejemplo, se pueden examinar cepas de Aspergillus por la presencia de polinucleotidos homólogos mediante análisis de transferencia Northern. Una vez detectados los trasncritos homólogos de los polinucleotidos acordes con la invención, se pueden construir bibliotecas de ADNc a partir del ARN aislado de la cepa apropiada, utilizando técnicas estándar bien conocidas por los especialistas en el arte. Como alternativa, se puede examinar una biblioteca de ADN genómico total usando una sonda capaz de hibridizarse con un polinucleótido acorde con la invención. Se pueden aislar las secuencias de los genes homólogos, por ejemplo, efectuando una PCR usando dos agrupaciones de cebadores de oligonucleótidos degenerados diseñados sobre la base de las secuencias de nucleótidos descritas aquí. El templado de la reacción puede ser ADNc obtenido por transcripción inversa del ARNm preparado a partir de cepas conocidas o sospechadas de expresar un polinucleótido acorde con la invención. El producto de la PCR se puede subclonar y secuenciar para asegurar que las secuencias amplificadas representan las secuencias de una nueva secuencia de ácido nucleico PLP03 o un equivalente funcional de las mismas . El fragmento de la PCR se puede usar después para aislar un clon de ADNc de longitud completa utilizando diversos métodos conocidos. Por ejemplo, el fragmento amplificado se puede marcar y usar para examinar una biblioteca de ADNc de bacteriófagos o cósmidos. Como alternativa, el fragmento marcado se puede emplear para examinar una biblioteca genómica. La tecnología de PCR también se puede utilizar para aislar las secuencias de ADNc de longitud completa de otros organismos. Por ejemplo, se puede aislar el ARN, con el uso de procedimientos estándar, de una fuente celular o tisular apropiada. La reacción de transcripción inversa con el ARN se puede llevar a cabo empleando un cebador de oligonucleótidos específico para el extremo más 51 del fragmento amplificado para cebar la síntesis de la primera cadena . Luego se pueden "añadir colas" (por ejemplo, con guaninas) al híbrido de ARN/ADN resultante utilizando una reacción transferasa terminal estándar, el híbrido se puede digerir con KNasa H y a continuación se puede cebar la síntesis de la segunda cadena (por ejemplo, con un cebador poli-C) . De esta manera se pueden aislar fácilmente las secuencias de ADNc ubicadas 5' con respecto al fragmento amplificado. Por una revisión sobre las estrategias de clonación que son de utilidad, véase, por ejemplo, Sambrook et al., supra; y Ausubel et al., supra. Vectores Otro aspecto de la invención se refiere a vectores, preferentemente vectores de expresión, que contienen un ácido nucleico que codifica una proteína acorde con la invención o un equivalente funcional de la misma. Tal como se utiliza aquí, el término "vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al cual ha sido ligado. Un tipo de vector es un "plásmido" , que se refiere a un bucle de ADN circular de cadena doble en el cual se pueden ligar segmentos de ADN adicionales. Otro tipo de vector es un vector viral, mediante el cual se pueden ligar segmentos de ADN adicionales en el genoma viral . Algunos vectores son de replicacion autónoma en la célula huésped en la cual son introducidos (por ejemplo, vectores bacterianos que poseen un origen de replicacion bacteriano y vectores episómicos de mamíferos) . Otros vectores (por e emplo, vectores no episómicos de mamíferos) se integran en el genoma de la célula huésped después de su introducción en dicha célula huésped y de esa manera se replican junto con el genoma huésped. Más aún, algunos vectores pueden dirigir la expresión de los genes a los cuales están ligados operativamente. Aqui dichos vectores se denominan "vectores de expresión". En general, los vectores de expresión que son de utilidad en las técnicas de ADN recombinante a menudo se encuentran en la forma de plasmidos . Los términos "plásmido" y "vector" se pueden usar indistintamente aquí, dado que el plásmido es la forma de vector más comúnmente usada. Sin embargo, la invención pretende incluir otras formas de vectores de expresión, tal como vectores virales (por ejemplo, retrovirus de replicación defectuosa, adenovirus y virus adeno-asociados) , que cumplen funciones equivalentes . Los vectores de expresión recombinantes de la invención comprenden un ácido nucleico de la invención en una forma adecuada para la expresión de dicho ácido nucleico en una célula huésped, lo cual significa que el vector de expresión recombinante incluye una o varias secuencias reguladoras, seleccionadas sobre la base de las células huésped que se utilizarán para la expresión, que están ligadas operativamente a la secuencia de ácido nucleico a expresar. En el contexto de un vector de expresión recombinante, el término "ligado operativamente" significa que la secuencia de nucleótidos de interés está ligada a una o varias secuencias reguladoras de una manera que permite expresar la secuencia de nucleótidos (por ejemplo, en un sistema de transcripción/traducción in vitro o en una célula huésped cuando el vector es introducido en dicha célula huésped) . El término "secuencia reguladora" incluye promotores, potenciadores y otros elementos de control de la expresión (por ejemplo, una señal de poliadenilación) . Dichas secuencias reguladoras se describen, por ejemplo, en Goeddel ,- Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990) . Las secuencias reguladoras incluyen aquellas que dirigen la expresión constitutiva o inducible de una secuencia de nucleótidos en muchos tipos de células huésped y aquellas que dirigen la expresión de la secuencia de nucleótidos solamente en una determinada célula huésped (por ejemplo secuencias reguladoras específicas de tejidos) . Los especialistas en el arte comprenderán que el diseño del vector de expresión depende de factores tales como la elección de la célula huésped a transformar, el nivel de expresión de la proteína deseada, etc. Los vectores de expresión de la invención se pueden introducir en las células huésped para de esa manera producir proteínas o péptidos, codificados por los ácidos nucleicos que se describen aquí (por ejemplo, enzimas lipolíticas, enzimas lipolíticas imitantes, fragmentos de las mismas, variantes o equivalentes funcionales de las mismas, proteínas de fusión, etc.) . Los vectores de expresión recombinantes de la invención se pueden diseñar para la expresión de las enzimas lipolíticas en células procariontes o eucariontes . Por ejemplo, la proteína acorde con la invención se puede expresar en células bacterianas, tal como especies de E. coli y Bacillus, células de insectos (usando vectores de expresión de baculovirus) , células de levadura o células de mamífero. Las células huésped adecuadas se describen con mayor detalle en Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990) . Como alternativa, el vector de expresión recombinante se puede transcribir y traducir in vitro, por ejemplo usando las secuencias reguladoras promotoras T7 y T7 polimerasas. Los vectores de expresión que son de utilidad en la presente invención incluyen vectores cromosómicos, episómicos y derivados de virus, por ejemplo, vectores derivados de plásmidos bacterianos, bacteriófagos, episomas de levadura, elementos cromosómicos de levadura; virus, tal como baculovirus, papova virus, virus vaccinia, adenovirus, virus pox de aves, virus de pseudorrabia y retrovirus; y vectores derivados de combinaciones de los mismos, tal como los que derivan de elementos genéticos de plásmidos y bacteriófagos, tal como cósmidos y fagemidos. El inserto de ADN se debe ligar operativamente a un promotor apropiado, tal como el promotor PL del fago lambda, los promotores lac, trp y tac de E. coli, los promotores SV40 tempranos y tardíos y los promotores de LTR retrovirales , para sólo mencionar unos pocos. El especialista también conoce otros promotores adecuados . En una realización especifica, se prefieren los promotores que pueden dirigir un alto nivel de expresión de enzimas lipolíticas en hongos filamentosos . Dichos promotores son conocidos en el arte . Las construcciones de expresión pueden contener sitios de inicio de la transcripción, la terminación y, en la región trasncrita, un sitio de unión a ribosomas para la traducción. La porción de codificación de los trasncritos maduros expresados por las construcciones incluirá el codón AXJG de inicio de la traducción al comienzo y un codón de terminación ubicado apropiadamente al final del polipéptido a traducir. El ADN del vector se puede introducir en células procariontes o eucariontes por medio de técnicas de transformación o transfección convencionales . Tal como se utiliza aquí, los términos "transformación" y "transfección" se refieren a diversas técnicas reconocidas en el arte para introducir un ácido nucleico extraño (por ejemplo, ADN) en una célula huésped, incluyendo co-precipitación por fosfato de calcio o cloruro de calcio, transfección mediada por DEAE-dextrano, transducción, infección, lipofección, transfección catiónica mediada por lípidos o electroporación. Los métodos de transformación o transfección de células huésped adecuados se pueden consultar en Sambrook, et al. {Molecular Cloning: A Laboratory Manual, ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989), Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology (1986) y otros manuales de laboratorio. En una transfección de células de mamífero estable, se sabe que, dependiendo del vector de expresión y la técnica de transfección usada, solamente una pequeña fracción de células integrará el ADN extraño en su genoma. Con el fin de identificar y seleccionar estos integrantes, generalmente se introduce un gen que codifica un marcador seleccionable (por ejemplo, de resistencia a antibióticos) en las células huésped junto con el gen de interés. Los marcadores seleccionables preferidos incluyen los que confieren resistencia a fármacos, tal como G418, higromicina y metatrexato. El ácido nucleico que codifica el marcador seleccionable se introduce preferentemente en la célula huésped sobre el mismo vector que el que codifica la pxoteína acorde con la invención o bien se puede introducir sobre un vector separado. Las células transfectadas de forma estable con el ácido nucleico introducido se pueden identificar mediante selección con fármacos (por ejemplo, las células que han incorporado el gen del marcador seleccionable sobrevivirán, en tanto las demás células morirán) . La expresión de proteínas en procariontes a menudo se lleva a cabo en E. coli con vectores que contienen promotores constitutivos o inducibles para dirigir la expresión de proteínas de fusión o que no son de fusión. Los vectores de fusión agregan una cantidad de aminoácidos a la proteína codificada aquí, por ejemplo al extremo amino terminal de la proteína recombinante. Dichos vectores de fusión sirven típicamente tres propósitos: 1) incrementar la expresión de la proteína recombinante; 2) incrementar la solubilidad de la proteína recombinante; y 3) ayudar en la purificación de la proteína recombinante al actuar como un ligando en la purificación por afinidad. A veces, en los vectores de expresión de fusión, se introduce un sitio de clivaje proteolítico en la unión de la porción de fusión con la proteína recombinante a fin de permitir la separación de la proteína recombinante de la porción de fusión después del paso de purificación de la proteína de fusión. Dichas enzimas, y las secuencias de reconocimiento conocidas, incluyen Factor Xa, trombina y enteroquinasa . Como ya se indicó, los vectores de expresión contienen preferentemente marcadores seleccionables . Dichos marcadores incluyen resistencia a dihxdrofolato reductasa o neomicina para cultivos de células eucariontes y resistencia a tetraciclina o ampicilina para cultivos de E. coli y otras bacterias. Los ejemplos representativos de huéspedes apropiados incluyen células bacterianas, tal como E. coli, Streptomyces y Salmonella typhimurium; células fúngicas, tal como levadura; células de insectos, tal como S2 de Drosophila y Sf9 de Spodoptera; células animales tal como CHO, COS y melanoma de Bowes; y células vegetales. Los medios de cultivo y las condiciones apropiados para las células huésped descritas previamente son conocidos en el arte. Entre los vectores preferidos para su uso en bacterias se pueden mencionar los vectores pQE70, pQE60 y PQE-9, disponibles de Qiagen; vectores pBS, vectores Phagescript, vectores Bluescript, los vectores pNH8A, p H16A, pNH18A, p H46A, disponibles de Stratagene; y los vectores ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5, disponibles de Pharmacia. Entre los vectores preferidos para eucariontes se pueden mencionar los vectores PWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pZTl y pSG, disponibles de Stratagene; y los vectores pSVK3, pBPV, pMSG y pSVL disponibles de Pharmacia. El especialista en el arte conoce otros vectores adecuados . Los promotores bacterianos conocidos para su uso en la presente invención incluyen los promotores lacl y IacZ de E. coli , los promotores T3 y T7, el promotor gpt, los promotores PR, PL lambda y el promotor trp, el promotor HSV de tinaidina quinasa, los promotores SV40 temprano y tardío, los promotores de LTR retrovirales , tal como los del virus del sarcoma de Rous ("RSV") y los promotores de metalotioneína, tal como el promotor de la metalotioneína-I de ratón. La inserción de una secuencia potenciadora en el vector puede incrementar la transcripción del ADN que codifica los polipéptidos de la presente invención por eucariontes superiores. Los potenciadores son elementos de ADN que actúan en cis, que habitualmente comprenden entre 10 y 300 bp aproximadamente, que actúan incrementando la actividad de transcripción de un promotor en un tipo de célula huésped dado. Los ejemplos de potenciadores incluyen el potenciador SV40, que está ubicado del lado tardío del origen de replicacion entre los bp 100 y 270, el potenciador del promotor temprano de citomegalovirus, el potenciador de polioma del lado tardío del origen de replicacion y los potenciadores de adenovirus. Para la secreción de la proteína traducida hacia la luz del retículo endoplasmático, hacia el espacio periplasmático o hacia el entorno extracelular, se puede incorporar una señal de secreción apropiada en el polipeptido expresado. Las señales pueden ser endógenas para el polipeptido o pueden ser señales heterólogas . El polipeptido se puede expresar en una forma modificada, tal como una proteína de fusión, y puede incluir no sólo señales de secreción sino también regiones heterólogas funcionales adicionales. Así, por ejemplo, se puede agregar una región de aminoácidos adicionales, en particular de aminoácidos con carga, al extremo N-terminal del polipeptido para aumentar la estabilidad y persistencia en la célula huésped, durante la purificación o durante el subsiguiente manejo y almacenamiento. Además, se pueden agregar porciones de peptidos al polipeptido para facilitar la purificación. Polipéptidos acordes con la invención La invención provee un polipéptido aislado que posee una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo formado por las SEQ ID N": 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36 y 39, una secuencia de aminoácidos que se puede obtener por expresión de un polinucleótido seleccionado del grupo formado por las SEQ ID N° : 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 13, 14, 16, 17, 19, 20, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 31, 32, 34, 35, 37 y 38 en un huésped apropiado. Además, un péptido o polipéptido que comprende un equivalente funcional de los polipéptidos mencionados está comprendido en la presente invención. Los polipéptidos anteriores se incluyen colectivamente en el término "polipéptidos acordes con la invención" . Los términos "péptido" y "oligopéptido" se consideran sinónimos (como es de uso común) y cada término se puede usar indistintamente según lo requiera el contexto para indicar una cadena de al menos dos aminoácidos acoplada mediante enlaces de peptidilo. La palabra "polipéptido" se usa aquí para cadenas que contienen más de siete residuos de aminoácidos . Todas las f rmulas o secuencias de oligopéptidos y polipéptidos indicadas aquí se escriben de izquierda a derecha y en dirección desde el extremo amino terminal hacia el extremo carboxilo terminal. El código de una letra para aminoácidos que se usa aqui es conocido comúnmente en el arte y se puede consultar en Sambrook, et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) . Un polipéptido o proteína "aislado" se refiere a un polipéptido o una proteína que ha sido separado de su entorno nativo. Por ejemplo, los polipéptidos y proteínas producidos de forma recombinante expresados en las células huésped se consideran aislados a los efectos de la invención como polipéptidos nativos o recombinantes que han sido purificados sustancialmente mediante cualquier técnica adecuada tal como, por ejemplo, el método de purificación de un solo paso que se describe en Smith y Johnson, Gene 67 : 31-40 (1988) . La enzima lipolítica acorde con la invención se puede recuperar y purificar a partir de cultivos de células recombinantes mediante métodos bien conocidos, incluyendo precipitación por sulfato de amonio o etanol, extracción ácida, cromatografía de intercambio de aniones o cationes, cromatografía sobre fosfocelulosa, cromatografía por interacción hidrofóbica, cromatografía de afinidad, cromatografía sobre hidroxilapatita y cromatografía sobre lectina. Con mayor preferencia, se emplea cromatografía líquida de alta presión ("HPLC") para la purificación. Los polipéptidos de la presente invención incluyen productos purificados naturalmente, productos de procedimientos de síntesis química y productos obtenidos mediante técnicas recombinantes de un huésped procarionte o eucarionte, incluyendo, por ejemplo, células bacterianas, de levadura, de hongos, de plantas superiores, de insectos y de mamíferos. Según el huésped empleado en el procedimiento de producción recombinante, los polipéptidos de la presente invención pueden ser glicosilados o no glicosilados . Además, los polipéptidos de la invención también incluyen un residuo metionina inicial modificado, en algunos casos como resultado de procesos mediados por el huésped . La enzima lipolítica acorde con la invención se puede emplear convenientemente en los procesos de horneado. La cantidad de enzima que se agregará a la masa se determinará empíricamente. Puede depender de la calidad de la harina usada, del grado de mejora requerido, del tipo de pan o de bienes de consumo horneados, del método de preparación de la masa, de la proporción de otros ingredientes, etcétera. Fragmentos de proteína La invención también comprende los fragmentos biológicamente activos de los polipéptidos acordes con la invención . Los fragmentos biológicamente activos de un polipéptido de la invención incluyen polipéptidos que comprenden secuencias de aminoácidos que son suficientemente idénticas o que derivan de la secuencia de aminoácidos de una enzima lipolítica (por ejemplo, la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo formado por las SEQ ID N°: 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36 y 39) , que incluyen menos aminoácidos que la proteína de longitud completa y presentan al menos una de las actividades biológicas de la correspondiente proteína de longitud completa. Típicamente, los fragmentos biológicamente activos comprenden un dominio o motivo con al menos una actividad de la correspondiente proteína de longitud completa. El fragmento biológicamente activo de la proteína de la invención puede ser un polipéptido que tiene, por ejemplo, 10, 25, 50, 100 o más aminoácidos de longitud. Más aún, se pueden preparar porciones biológicamente activas, en las cuales están suprimidas otras regiones de la proteína, utilizando técnicas recombinantes y luego pueden ser evaluadas por una o más de las actividades biológicas de la forma nativa del polipéptido de la invención. La invención también comprende fragmentos de ácido nucleico que codifican los fragmentos biológicamente activos mencionados previamente de la enzima lipolítica. Proteínas de fusión Las proteínas de la presente invención, o los equivalentes funcionales de las mismas, por ejemplo, porciones biológicamente activas de las mismas, se pueden ligar operativamente a un polipéptido que no es de una enzima lipolítica (por ejemplo, secuencias de aminoácidos heterólogas) para formar proteínas de fusión. Tal como se utiliza aquí, una "proteína quimérica" o ¾proteína de fusión" de una enzima lipolítica comprende un polipéptido de enzima lipolítica ligado operativamente a un polipéptido que no es de una enzima lipolítica. Un "polipéptido de una enzima lipolítica" se refiere a un polipéptido que posee una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo formado por las SEQ ID N° : 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36 y 39, en tanto un "polipéptido que no es una enzima lipolitica" se refiere a un polipéptido que posee una secuencia de aminoácidos correspondiente a una proteína que no es sustancialmente homologa de la enzima lipolitica, por ejemplo, una proteína que es diferente de la enzima lipolitica y que deriva del mismo organismo o de uno diferente. Dentro de la proteína de fusión de la enzima lipolitica, el polipéptido de la enzima lipolitica puede corresponder a todo o a una porción de una enzima lipolitica. En una forma de realización preferida, la proteína de fusión de enzima lipolitica comprende al menos un fragmento biológicamente activo de una enzima lipolitica. En otra forma de realización preferida, la proteína de fusión de lipasa comprende al menos dos porciones biológicamente activas de una enzima lipolitica. Dentro de la proteína de fusión, el término "ligado operativamente" indica que el polipéptido de una enzima lipolitica y el polipéptido que no es de una enzima lipolitica están fusionados en-marco entre sí. El polipéptido que no es una enzima lipolitica se puede fusionar al extremo M-terminal o C-terminal del polipéptido de una enzima lipolitica. Por ejemplo, en una realización, la proteína de fusión es una proteína de fusión de una enzima lipolítica GST en la cual las secuencias de la enzima lipolítica está fusionada al extremo C-terminal de la secuencia GST. Dichas proteínas de fusión pueden facilitar la purificación de la enzima lipolítica recombinante . En otra realización, la proteína de fusión es una enzima lipolítica que contiene una secuencia señal heteróloga por su extremo N-terminal. En algunas células huésped (por ejemplo, células huésped de mamíferos y de levadura), la expresión y/o secreción de la enzima lipolítica se puede incrementar mediante el uso de una secuencia señal heteróloga. En otro ejemplo, se puede usar la secuencia secretora gp67 de la proteína de la envoltura de baculovirus como secuencia señal heteróloga {Current Protocole in Molecular Biology, Ausubel et al., eds . , John Wiley & Sons, 1992) . Otros ejemplos de secuencia señal heterólogas de eucariontes incluyen las secuencias secretoras de melitina y fosfatasa alcalina de placenta humana (Stratagene ; La Jolla, California) . En aún otro ejemplo, la secuencia señal heteróloga procarionte que es de utilidad incluye la señal secretora phoA (Sambrook et al., supra) y la señal secretora de la proteína A (Pharmacia Biotech; Piscataway, Nueva Jersey) . La secuencia señal se puede usar para facilitar la secreción y el aislamiento de una proteína o polipéptido de la invención. Las secuencias señal se caracterizan típicamente por un núcleo de aminoácidos hidrofóbicos que en general se olivan de la proteína madura durante la secreción en uno o varios eventos de clivaje. Dichos péptidos señal contienen sitios de procesamiento que permiten el clivaje de la secuencia señal de la proteína madura a medida que pasan por la vía secretora. La secuencia señal dirige la secreción de la proteína, tal como de un huésped eucarionte en el cual se ha transformado el vector de expresión, y la secuencia señal se cliva posteriormente o concurrentemente. Después la proteína se puede purificar fácilmente del medio extracelular mediante métodos conocidos en el arte. Como alternativa, la secuencia señal se puede ligar a la proteína de interés usando una secuencia que facilita la purificación, tal como con un dominio GST. Así, por ejemplo, la secuencia que codifica el polipeptido se puede fusionar a una secuencia marcadora, tal como una secuencia que codifica un péptido que facilita la purificación del polipeptido fusionado. En algunas realizaciones preferidas de este aspecto de la invención, la secuencia marcadora es un péptido de hexa-histidina, tal como la marca provista en el vector pQE (Qiagen, Inc.), entre otros, muchos de los cuales se encuentran disponibles comercialmente . Tal como se describe en Gentz et al, Proc. Nati. Acad. Scí . EE.UU. 86: 821-824 (1989), por ejemplo, la hexa-histidina provee una purificación conveniente de la proteína de fusión. La marca HA es otro péptido de utilidad para la purificación que corresponde a un epitope derivado de la proteína emaglutinina de la influenza, que fue descrita, por ejemplo, por Wilson et al., Cell 37: 767 (1984). Preferentemente, la proteína quimérica o de fusión de la invención es producida mediante técnicas de ADN recombinante estándar. Por ejemplo, los fragmentos de ADN que codifican las diferentes secuencias de polipéptidos se ligan junto en-marco de acuerdo con técnicas convencionales, por ejemplo mediante el empleo de extremos cohesivos o escalonados para una posterior ligación, digestión con enzimas de restricción para proveer los extremos apropiados, rellenado de los extremos cohesivos según necesidad, tratamiento con fosfatasa alcalina para evitar uniones no deseadas y ligación enzimática. En otra realización, el gen de fusión se puede sintetizar mediante técnicas convencionales, incluyendo sintetizadores automáticos de ADN. Como alternativa, la amplificación por PCR de los fragmentos de genes se puede llevar a cabo usando cebadores de anclaje que dan lugar a superposiciones complementarias entre dos fragmentos de genes consecutivos que posteriormente se pueden alinear y reamplificar para generar una secuencia genética quimérica (véase, por ejemplo, Current Protocole in Molecular Biology, eds . Ausubel et al. John Wiley & Sons : 1992) . Más aún, existen muchos vectores de expresión disponibles comercxalmente que ya codifican un grupo de fusión (por ejemplo, un polipéptido GST) . El ácido nucleico que codifica una enzima lipolítica se puede clonar en dicho vector de expresión de manera tal que el grupo de fusión está ligado en-marco a dicha enzima lipolitica. Equivalentes funcionales Aquí los términos "equivalentes funcionales" y "variantes funcionales" se usan indistintamente. Los equivalentes funcionales del ADN que codifica una enzima lipolítica son fragmentos aislados de ADN que codifican un polipéptido que presenta una función particular de la enzima lipolítica de Aspergillus niger definida aquí. Un equivalente funcional de un polipéptido de una enzima lipolítica acorde con la invención es un polipéptido que presenta al menos una de las funciones de una enzima lipolítica de Aspergillus niger, definida previamente. Entonces, los equivalentes funcionales comprenden también fragmentos biológicamente activos . Los equivalentes funcionales de proteínas o polipéptidos pueden contener solamente sustituciones conservadoras de uno o varios aminoácidos en la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo formado por las SEQ ID N° : 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36 y 39 o sustituciones, inserciones o supresiones de aminoácidos no esenciales. Por consiguiente, el aminoácido no esencial es el residuo que puede ser alterado en la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo formado por las SEQ ID N°: 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36 y 39 sin alterar sustancialmente la función biológica. Por ejemplo, se prevé que los residuos de aminoácidos que están conservados entre las enzimas lipolíticas de la presente invención, son muy poco favorables para una alteración. Aún más, los aminoácidos conservados entre las enzimas lipolíticas acordes con la presente invención y otras enzimas lipolíticas no son muy favorables para una alteración. El término "sustitución conservadora" se refiere a una sustitución en la cual un residuo de aminoácido es reemplazado por un residuo de aminoácido que posee una cadena lateral similar. Estas familias son conocidas en el arte e incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo lisina, arginina e histidina) , cadenas laterales acídicas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico) , cadenas laterales polares sin carga (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína) , cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano) , cadenas laterales ramificadas en posición beta (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina) . Los equivalentes de ácido nucleico funcionales contienen típicamente mutaciones silentes o mutaciones que no alteran la función biológica del polipeptido codificado. Por consiguiente, la invención provee moléculas de ácido nucleico que codifican enzimas lipolíticas que contienen cambios en los residuos de aminoácidos que no son esenciales para una actividad biológica particular. Dichas enzimas lipolíticas difieren en cuanto a la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo formado por las SEQ ID N° : 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36 y 39 aunque retienen al menos una actividad biológica. En una realización, la molécula aislada de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína, donde dicha proteína comprende una secuencia de aminoácidos sustancialmente homóloga de aproximadamente al menos un 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de homología con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo formado por las SEQ ID N° : 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36 y 39. Por ejemplo, los lineamientos acerca de cómo efectuar sustituciones de aminoácidos fenotípicamente silentes se proveen en Bowie, J.U. et al., Science 247: 1306-1310 (1990) . donde los autores indican que hay dos enfoques principales para estudiar la tolerancia de una secuencia de aminoácidos a los cambios . El primer método se basa en un proceso de evolución, donde las mutaciones son aceptadas o rechazadas por selección natural . El segundo enfoque emplea ingeniería genética para introducir cambios de aminoácidos en posiciones específicas de un gen clonado y luego efectúa una selección o examen para identificar las secuencias que conservan su funcionalidad. Tal como lo establecen los autores, estos estudios han revelado que las proteínas son inesperadamente tolerantes a las sustituciones de aminoácidos . Los autores indican además los cambios que pueden ser tolerados en una determinada posición de la proteína. Por ejemplo, los residuos de aminoácidos más profundos requieren de cadenas laterales no polares, en tanto generalmente se conservan pocas características de las cadenas laterales de superficie. Otras de dichas sustituciones fenotípicamente silentes se describen en Bowie et al, supra, y las referencias citadas en dicha publicación . La molécula aislada de ácido nucleico que codifica una proteína homologa de la proteína seleccionada del grupo formado por las SEQ ID N° : 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36 y 39 se puede crear introduciendo una o varias sustituciones, adiciones o supresiones de nucleótidos en las correspondientes secuencias de nucleótidos codificadoras (Tabla 1) de modo tal que se introducen una o varias sustituciones, supresiones o inserciones de aminoácidos en la proteína codificada. Dichas mutaciones se pueden introducir mediante técnicas estándar, tal como mutagénesis dirigida al sitio y mutagénesis mediada por PCR. El término "equivalentes funcionales" también abarca los ortólogos de las enzimas lipolíticas de Aspergillus niger provistas en este documento. Los ortólogos de las enzimas lipolíticas de Aspergillus niger son proteínas que se pueden aislar de otras cepas o especies y que poseen una actividad biológica similar o idéntica. Dichos ortólogos se pueden identificar fácilmente como aquellas que comprenden una secuencia de aminoácidos que es sustancialmente homologa de las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo formado por las SEQ ID N° : 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36 y 39. Tal como se define aquí, el término "sustancialmente homólogo" se refiere a una primera secuencia de aminoácidos o nucleótidos que contiene una cantidad suficiente o mínima de aminoácidos o nucleótidos idénticos o equivalentes (por ejemplo, con cadenas laterales similares) de una segunda secuencia de aminoácidos o nucleótidos de modo tal que la primera y la segunda secuencia de aminoácidos o de I nucleótidos poseen un dominio común. Por ejemplo, las secuencias de aminoácidos o nucleótidos que contienen un dominio común que poseen aproximadamente un 60%, preferentemente un 65%, más preferentemente un 70%, más preferentemente aún un 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad o más se definen aquí como suficientemente idénticas . Además, los ácidos nucleicos que codifican otros miembros de la familia de las enzimas lipolíticas, que entonces poseen una secuencia de nucleótidos que difiere de una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo formado por las SEQ ID ?G : 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 13, 14, 16, 17, 19, 20, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 31, 32, 34, 35, 37 y 38, se encuentran dentro del alcance de la invención. Más aún, los ácidos nucleicos que codifican enzimas lipolíticas de diferentes especies que entonces poseen una secuencia de nucleótidos que difiere de una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo formado por las SEQ ID N° : 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 13, 14, 16, 17, 19, 20, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 31, 32, 34, 35, 37 y 38 se encuentran dentro del alcance de la invención. Las moléculas de ácido nucleico correspondientes a variantes (por ejemplo variantes alélicas naturales) y homólogos de los polinucleótidos acordes con la invención se pueden aislar sobre la base de su homología con los ácidos nucleicos que se describen aquí usando los ADNc de la invención, o un fragmento adecuado de los mismos, como sondas de hibridación de acuerdo con las técnicas de hibridación estándar, preferentemente bajo condiciones de hibridación de gran severidad. Además de las variantes alélicas naturales de las secuencias de Aspergíllus niger provistas aquí, el especialista comprenderá que se pueden introducir cambios por mutación en las secuencias de nucleótidos seleccionadas del grupo formado por las SEQ ID N° : 1, 2, 4, 5, 7, 8; 10, 11, 13, 14, 16, 17, 19, 20, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 31, 32, 34, 35, 37 y 38 lo cual conduce a cambios en la secuencia de aminoácidos de la enzima lipolítica sin alterar sustancialmente la función de la proteína. En otro aspecto de la invención, se proveen enzimas lipolíticas mejoradas. Las enzimas lipolíticas mejoradas son proteínas donde se ha mejorado al menos una actividad biológica. Dichas proteínas se pueden obtener introduciendo aleatoriamente mutaciones a lo largo de toda o parte de la secuencia de codificación de la enzima lipolítica, tal como por mutagénesis de saturación, y los mutantes resultantes se pueden expresar de forma recombinante y luego se puede examinar su actividad biológica. Por ejemplo, en el arte se proveen los ensayos estándar para medir la actividad enzimática de las enzimas lipolíticas y de esta manera se pueden seleccionar fácilmente las proteínas mejoradas. En una forma de realización preferida la enzima lipolitica posee una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo formado por las SEQ ID N°: 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36 y 39. En otra forma de realización, la enzima lipolitica es sustancialmente homologa de una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo formado por SEQ ID N° : 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36 y 39 y retiene al menos una actividad biológica de un polipéptido seleccionado del grupo formado por las SEQ ID N° : 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36 y 39, aunque difiera en cuanto a secuencia de aminoácidos debido a variaciones naturales o mutagénesis como se describió previamente. En aún otra forma de realización preferida, la enzima lipolitica posee una secuencia de aminoácidos codificada por un fragmento de ácido nucleico aislado capaz de hibridizarse con un ácido nucleico seleccionado del grupo formado por las SEQ ID N° : 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 13, 14, 16, 17, 19, 20, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 31, 32, 34, 35, 37 y 38, preferentemente bajo condiciones de hibridación muy severas . Por consiguiente, la enzima lipolitica es una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% aproximadamente o más homologa de una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo formado por las SEQ ID N°: 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36 y 39 y retiene al menos una actividad funcional de un polipeptido seleccionado del grupo formado por las SEQ ID N° : 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36 y 39. En particular, la enzima lipolítica es una proteina que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% aproximadamente o más homologa de la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID N° ·. 3 o la enzima lipolítica es una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% aproximadamente o más homologa de la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID N°: 6, o la enzima lipolítica es una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% aproximadamente o más homóloga de la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID N° : 9, o la enzima lipolítica es una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% aproximadamente o más homóloga de la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID N" : 12 o la enzima lipolitica es una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% aproximadamente o más homologa de la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID N° : 15, o la enzima lipolitica es una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% aproximadamente o más homologa de la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID N° : 18 o la enzima lipolitica es una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% aproximadamente o más homologa de la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID N° : 21, o la enzima lipolitica es una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% aproximadamente o más homologa de la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID N° : 24 o la enzima lipolitica es una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% aproximadamente o más homologa de la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID N°: 27, o la enzima lipolitica es una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% aproximadamente o más homologa de la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID N° : 30 o la enzima lipolitica es una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% aproximadamente o más homóloga de la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID : 33, o la enzima lipolitica es una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% aproximadamente o más homóloga de la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID N° : 36 o la enzima lipolitica es una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% aproximadamen e o más homóloga de la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID N° : 39. Los equivalentes funcionales de una proteína acorde con la invención también se pueden identificar examinando bibliotecas combinatorias de mutantes, por ejemplo mutantes de truncamiento, de la proteína de la invención por una actividad de una enzima lipolítica. En una realización, se genera una biblioteca variegada de variantes por mutagénesis combinatoria a nivel de ácido nucleico. La biblioteca variegada de variantes se puede producir, por ejemplo, ligando enzimáticamente una mezcla de oligonucleótidos sintéticos en las secuencias genéticas de modo tal que un conjunto degenerado de secuencias proteicas potenciales se pueda expresar como polipéptidos individuales, o como alternativa, como un conjunto de proteínas de fusión más grande (por ejemplo, para la expresión en fagos) . Existen numerosos métodos que se pueden usar para producir bibliotecas de potenciales variantes de los polipéptidos de la invención a partir de una secuencia de oligonucleótidos degenerada. Los métodos para sintetizar oligonucleótidos degenerados son conocidos en el arte (véase, por ejemplo, Narang (1983) Tetrahedron 39: 3; Itakura et al. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53: 323; Itakura et al. (1984) Science 198: 1056; Ike et al. (1983) Nucleic Acid Res. 11: 477). Además, se pueden usar bibliotecas de fragmentos de la secuencia de codificación de un polipéptido de la invención para generar una población variegada de polipéptidos y examinar una subsiguiente selección de variantes. Por ejemplo, se puede generar una biblioteca de fragmentos de secuencias de codificación por tratamiento de un fragmento de PCR de cadena doble de la secuencia de codificación de interés con una nucleasa bajo condiciones donde solamente se produzcan cortes [nicking] una vez aproximadamente por molécula, desnaturalización del ADN de cadena doble, renaturalización del ADN para formar un ADN de cadena doble que puede incluir pares orientados en el sentido del marco de lectura/antisentido a partir de diferentes productos cortados [nícked] , eliminación de las porciones de cadena simple de las duplas reformadas mediante tratamiento con la nucleasa SI y ligación de la biblioteca de fragmentos resultante en un vector de expresión. Mediante este método, se puede derivar una biblioteca de expresión que codifica fragmentos N-terminales e internos de distintos tamaños de la proteína de interés . Existen numerosas técnicas que son conocidas en el arte para examinar productos genéticos de bibliotecas combinatorias obtenidas con mutaciones puntuales de truncamientos y para examinar bibliotecas de ADNc por productos genéticos que poseen una propiedad determinada. Las técnicas de mayor uso, que son favorables para un análisis de gran rendimiento, para examinar grandes bibliotecas genéticas incluyen típicamente la clonación de la biblioteca de genes en vectores de expresión replicables, la transformación de las células apropiadas con la biblioteca de vectores resultante y la expresión de los genes combinatorios bajo condiciones en las cuales la detección de una determinada actividad facilita el aislamiento del vector que codifica el gen cuyo producto fue detectado. Se puede emplear mutagénesis de ensamblaje recursiva (RE ) , una técnica que aumenta la frecuencia de mutantes funcionales en las bibliotecas, en combinación con los ensayos de rastreo y examen para identificar las variantes deseadas de la proteína de la invención (Arkin y Yourvan (1992) Proc . Nati. Acad. Sci. EE.UU. 89: 7811-7815; Delgrave et al. (1993) Protein Engineering 6(3): 327-331).

Será evidente para el especialista en el arte que pueden existir polimorfismos en la secuencia de ??? que pueden conducir a cambios en la secuencia de aminoácidos de la enzima lipolítica en una población dada. Dichos polimorfismos genéticos pueden existir en células de diferentes poblaciones o dentro de una población debido a variaciones alélicas naturales . Las variantes alélicas también incluyen equivalentes funcionales. Los fragmentos de un polinucleótido acorde con la invención también comprenden polinucleótidos que no codifican polipeptidos funcionales. Dichos polinucleótidos pueden funcionar como sondas o cebadores para una reacción de PCR. Los ácidos nucleicos acordes con la invención, independientemente de si codifican polipeptidos funcionales o no funcionales, se pueden usar como sondas de hibridación o como cebadores para la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) . Los usos de las moléculas de ácido nucleico de la presente invención que no codifican un polipéptido con actividad de una enzima lipolítica incluyen, entre otros, (1) aislamiento del gen que codifica la enzima lipolítica de la invención, o variantes alélicas del mismo a partir de una biblioteca de ADNc, por ejemplo, de otros organismos distintos de Aspergillus niger; (2) hibridación in sí tu (por ejemplo, FISH) de extendidos cromosómicos en metafase para proveer una ubicación cromosómica precisa del gen de la enzima lipolítica como se describe en Verma et al., Human Chromosomes: a Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, Nueva York (1988) ; (3) análisis de transferencia Northern para detectar la expresión del ARNm de la enzima lipolítica en tejidos y/o células específicos y 4) sondas y cebadores que se pueden usar como una herramienta de diagnóstico para analizar la presencia de un ácido nucleico capaz de hibridizarse con la sonda de una enzima lipolítica en una muestra biológica dad (por ejemplo un tejido) . La invención también abarca un método para obtener un equivalente funcional de un gen o ADNc que codifica una enzima lipolítica. Dicho método comprende la obtención de una sonda marcada que incluye un ácido nucleico aislado codificador de toda o una porción de una secuencia seleccionada del grupo formado por las SEQ ID N°: 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36 y 39 o una variante de las mismas; búsqueda y examen de una biblioteca de fragmentos de ácido nucleico con dicha sonda marcada bajo condiciones que permitan la hibridación de dicha sonda con los fragmentos de ácido nucleico en la biblioteca, formando de esa manera duplas de ácido nucleico, y preparación de una secuencia genética de longitud completa a partir de los fragmentos de ácido nucleico de cualquiera de las duplas marcadas para obtener un gen relacionado con el gen de la enzima lipolítica. En una forma de realización, el ácido nucleico de la invención es al menos un 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más homólogo de una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo formado por las SEQ ID N° : 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 13, 14, 16, 17, 19, 20, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 31, 32, 34, 35, 37 y 38 o el complemento de las mismas . En otra forma de realización preferida, un polipéptido de la invención es al menos un 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más homólogo de una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo formado por las SEQ ID N° : 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36 y 39. Células huésped En otra realización, la invención ofrece células, por ejemplo, células huésped transformadas o células huésped recombinantes que contienen un ácido nucleico comprendido por la invención. Una "célula transformada" o una "célula recombinante" es una célula (o un ancestro de la misma) en la cual se ha introducido, por medio de técnicas de ADN recombinante, un ácido nucleico acorde con la invención. Se incluyen células procariontes y eucariontes, por ejemplo, bacterias, hongos, levaduras y semejantes, y se prefieren especialmente células de hongos filamentosos, en particular de Aspergillus niger. Se pueden elegir células huésped que modulan la expresión de las secuencias insertadas o que modifican y procesan el producto genético de una manera específica, deseada. Dichas modificaciones (por ejemplo, glicosilación) y procesamientos (por ejemplo, elivaje) de los productos proteicos puede facilitar el funcionamiento óptimo de la proteína. Hay numerosas células huésped que poseen mecanismos característicos y específicos para el procesamiento de post -traducción y la modificación de productos genéticos y proteicos. Se pueden elegir entre los sistemas de huéspedes o líneas celulares apropiados que son familiares para los especialistas en el arte de la biología molecular y/o microbiología para asegurar la modificación y el procesamiento deseados y correctos de la proteína extraña expresada. Para tal fin, se pueden usar células huésped eucariontes que poseen la maquinaria celular para un procesamiento apropiado del trasncrito primario, glicosilacion y fosforilación del producto genético. Dichas células huésped son bien conocidas en el arte. Las células huésped también incluyen, por ejemplo, líneas de células de mamífero, tal como las líneas celulares CHO, VERO, BHK, HeLa, COS, MDCK, 293, 3T3 , WI38 y del plexo coroideo. Si se deseara, es posible producir los polipéptidos acordes con la invención con una línea celular transfectada de forma estable. Existen numerosos vectores adecuados para una transfección estable de células de mamífero disponibles al público, así como métodos para construir dichas líneas celulares también conocidos públicamente, por ejemplo, en Ausubel et al. (supra.) . Anticuerpos La invención ofrece además anticuerpos, tal como anticuerpos monoclonales o policlonales que se unen específicamente a las proteínas de enzimas lipolíticas acordes con la invención. Tal como se utiliza aquí, el término "anticuerpo" (Ab) o "anticuerpo monoclonal" (Mab) incluye moléculas intactas asi como fragmentos de anticuerpos (tal como, por ejemplo, los fragmentos Fab y F(ab')2) que tienen la capacidad de unirse específicamente con la enzima lipolítica. Los fragmentos Fab y F(ab')2 no contienen el fragmento Fe del anticuerpo intacto, se depuran más rápidamente de la circulación y pueden presentar menos unión no específica a los tejidos que el anticuerpo intacto (Wahl et al., J. Nucí. Med. 24: 316-325 (1983)). Por consiguiente, se prefiere el uso de estos fragmentos. Los anticuerpos de la presente invención se pueden preparar utilizando cualquiera de numerosos métodos. Por ejemplo, se pueden administrar células que expresan la enzima lipolítica o un fragmento antigénico de la misma a un animal con el fin de inducir la producción de suero que contenga anticuerpos policlonales. En un método preferido, la preparación de la enzima lipolítica se obtiene y purifica de manera tal que está sustancialmente libre de contaminantes naturales. Dicha preparación se introduce luego en un animal con el fin de producir antisueros policlonales de mayor actividad específica. En el método más preferido, los anticuerpos de la presente invención son anticuerpos monoclonales (o fragmentos de unión a la enzima lipolítica de los mismos) . Dichos anticuerpos monoclonales se pueden preparar usando la tecnología de los hibridomas ( ohler et al., Nature 256: 495 (1975); Kohler et al., Eur. J. Immunol . 6: 511 (1976); Hammerling et al., En: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, Elsevier, N.Y., págs . 563-681 (1981)). En general, dichos procedimientos comprenden la inmunización de un animal (preferentemente un ratón) con un antígeno de la enzima lipolítica o con una célula que expresa la enzima lipolítica. Luego se extraen los esplenocitos de dichos ratones y se fusionan con una línea de células de mieloma adecuada. Se puede emplear cualquier línea de células de mieloma adecuada de acuerdo con la presente invención; sin embargo, se prefiere el uso de la línea de células de mieloma progenitora (SP20) , disponible de American Type Culture Collection, ockville, Maryland. Después de la fusión, las células de hibridoma resultantes se mantienen selectivamente en medio HAT y luego se clonan por dilución limitada como describen Wands et al. (Gastro-enterology 80: 225-232 (1981) ) . Las células de hibridoma obtenidas con dicha selección se evalúan luego para identificar los clones que secretan anticuerpos capaces de unirse al antígeno de la enzima lipolítica. En general, los polipéptidos se pueden acoplar a una proteína transportadora, tal como KLH, como se describe en Ausubel et al., su ra, mezclada con un adyuvante, y luego se inyectan en el mamífero huésped.

En particular, se pueden inmunizar diversos animales huésped por inyección de un polipéptido de interés. Los ejemplos de animales huésped adecuados incluyen conejos, ratones, cobayos y ratas. Se pueden emplear diversos adyuvantes para incrementar la respuesta inmunológica, dependiendo de la especie del huésped, incluyendo, por ejemplo, medio de Freund (completo e incompleto) , adyuvantes de geles minerales tal como hidróxido de aluminio, sustancias tensioactivas tal como lisolecitina, polioles plurónicos, polianiones, péptidos, emulsiones oleaginosas, hemocianina de lapa, dinitrofenol , BCG (bacillo de Calmette-Guerin) y Corynehacterium parvum. Los anticuerpos policlonales son poblaciones heterogéneas de moléculas de anticuerpos derivadas de los sueros de los animales inmunizados. Dichos anticuerpos pueden pertenecer a cualquier clase de inmunoglobulinas, incluyendo IgG, IgM, IgE, IgA, IgD y cualquier subclase de las mismas . Los hibridomas productores de los mAbs de esta invención se pueden cultivar in vitro o in vivo. Una vez producidos, se evalúan los anticuerpos policlonales o monoclonales por su capacidad de reconocimiento específico de una proteína acorde con la invención o un equivalente funcional de la misma en un inmunoensayo, tal como una transferencia Western o análisis de inmunoprecipi ación usando técnicas estándar, por e emplo, como se describe en Ausubel et al., supr . Los anticuerpos que se unen específicamente a una proteína acorde con la invención, o equivalentes funcionales de la misma, son de utilidad en la invención. Por ejemplo, dichos anticuerpos se pueden usar en un ínmunoensayo para detectar una proteína acorde con la invención en cepas patogénicas o no patogénicas de Aspergillus (por ejemplo, en extractos de Aspergillus) . Preferentemente, los anticuerpos de la invención se producen usando fragmentos de la proteína acorde con la invención que tienen probabilidad de ser antigénicos, según criterios tales como una gran frecuencia de residuos con carga. Por ejemplo, dichos fragmentos se pueden generar mediante técnicas estándar de PCR y luego se pueden clonar en el vector de expresión pGEX (Ausubel et al . , supra.) . Las proteínas de fusión se pueden expresar posteriormente en E. coli y purificar usando una matriz de afinidad de glutatión-agarosa como se describe en Ausubel, et al., supra . Si se deseara, se pueden generar varios (por ejemplo, dos o tres) fusiones por cada proteína y cada fusión se puede inyectar en al menos dos conejos. Se pueden generar antisueros mediante inyecciones en una serie que típicamente incluye al menos tres inyecciones de refuerzo. Típicamente, se comprueban los antisueros por su capacidad para inmunoprecipitar' una proteína acorde con la invención, o equivalentes funcionales de la misma, mientras que las proteínas no relacionadas pueden servir como control para la especificidad de la reacción inmune . Como alternativa, es posible adaptar las técnicas descritas para la producción de anticuerpos de cadena simple (Patentes de EE.UU. N° : 4.946.778 y 4.704.692) para producir anticuerpos de cadena simple contra una proteina acorde con la invención, o equivalentes funcionales del mismo. Hay conjuntos de elementos [ ts] para generar y examinar bibliotecas de expresión en fagos que se encuentran disponibles comercialmente, por ejemplo de Pharmacia . Además, se pueden consultar ejemplos de métodos y reactivos que son particularmente adecuados para su uso en la generación y el examen de bibliotecas de expresión de anticuerpos, por ejemplo, en la Patente de EE.UU. N° : 5.223.409; Publicación PCT N° : WO 92/18619; Publicación PCT N° : WO 91/17271; Publicación PCT N° : WO 20791; Publicación PCT Nc : WO 92/20791; Publicación PCT N°: WO 92/15679; Publicación PCT N° : WO 93/01288; Publicación PCT N° : WO 92/01047; Publicación PCT N° : WO 92/09690; Publicación PCT N° : WO 90/02809; Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9: 1370-1372; Hay et al. (1992) Hu . Antibod. Hybridomas 3: 81-85; Huse et al. (1989) Science 246: 1275-1281; Griffiths et al. (1993) EMBO J. 12: 725-734. Los anticuerpos policlonales y monoclonales que se unen específicamente a una proteína acorde con la invención, o equivalentes funcionales del mismo, se pueden usar, por ejemplo, para detectar la expresión de un gen que codifica una proteína acorde con la invención, o un equivalente funcional del mismo, tal como en otra cepa de Aspergillus. Por ejemplo, la proteína acorde con la invención puede ser detectada rápidamente en inmunoensayos convencionales con células o extractos de Aspergillus. Los ejemplos de ensayos adecuados incluyen, sin limitaciones, transferencia Western, ensayos ELISA, radioinmunoensayos (RIA) y seme antes. El término "se une específicamente" significa que un anticuerpo reconoce y se une a un antígeno particular, por ejemplo, una proteína acorde con la invención, pero no reconoce ni se une sustancialmente a otras moléculas no relacionadas en una muestra. Los anticuerpos se pueden purificar, por ejemplo, con métodos de cromatografía de afinidad en los cuales el antígeno del polipéptido es inmovilizado sobre una resina.

Se puede usar un anticuerpo (por ejemplo un anticuerpo monoclonal) dirigido contra un polipéptido de la invención para aislar el polipéptido mediante técnicas estándar, tal como cromatografía de afinidad o inmunoprecipitación . Más aún, dicho anticuerpo se puede usar para detectar la proteína (por ejemplo, en un lisado celular o sobrenadante de células) con el fin de evaluar la abundancia y el patrón de expresión del polipéptido. Los anticuerpos también se pueden usar como medio de diagnóstico para efectuar un seguimiento de los niveles de proteína en células o tejidos como parte de un procedimiento de evaluación clínica, por ejemplo, para determinar la eficacia de un régimen de tratamiento dado o para el diagnóstico de aspergillosis . El acoplamiento del anticuerpo a una sustancia detectable puede facilitar la detección. Los ejemplos de sustancias detectables incluyen diversas enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, materiales bioluminiscentes y materiales radioactivos. Los ejemplos de enzimas adecuadas incluyen peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, ß-galactosidasa o acetilcolinesterasa; los ejemplos de materiales fluorescentes adecuados incluyen umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, fluoresceína de diclorotriazinilamina, cloruro de dansilo o ficoeritrina; un ejemplo de un material luminiscente es el luminol ; los ejemplos de materiales bioluminiscentes incluyen luciferasa, luciferina y acuorina y los ejemplos de materiales radioactivos adecuados incluyen 125I, 1311 , 35S o 3H.

Los epitopes preferidos comprendidos por el péptido antigénicos so regiones que están ubicados sobre la superficie de la proteína, por ejemplo, regiones hidrofílicas . Se pueden usar las curvas de hidrofobicidad de las proteínas para identificar regiones hidrofílicas . El péptido antigénico de la proteína de la invención comprende al menos 7 (preferentemente 10, 15, 20 ó 30) residuos contiguos de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo formado por las SEQ ID N° : 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36 y 39 y abarca un epitope de la proteína de modo tal que el anticuerpo generado contra el péptido forma un complejo inmune específico con la proteína. Los epitopes preferidos comprendidos por el péptido antigénico son regiones de la proteína acorde con la invención que están ubicadas sobre la superficie de la proteína, por ejemplo, regiones hidrofílicas , regiones hidrofobleas, regiones que contienen alfa-hélices, regiones que contienen cadenas o láminas beta, regiones enrolladas, regiones con giros y regiones flexibles . Inmunoensayos La determinación cualitativa o cuantitativa de un polipéptido acorde con la presente invención en una muestra biológica se puede realizar utilizando cualquier método conocido en el arte. Las técnicas basadas en anticuerpos proveen ventajas especiales para evaluar los niveles de polipéptidos específicos en una muestra biológica. En las mismas, el reconocimiento específico se logra con el anticuerpo primario (policlonal o monoclonal) pero el sistema de detección secundario puede emplear anticuerpos fluorescentes, enzimas u otros anticuerpos secundarios conjugados. Como resultado de ello, se obtiene un complejo inmunológico . Por consiguiente, la invención provee un método de diagnóstico para determinar si un organismo está infectado con Aspergill s que comprende los pasos de: • aislar una muestra biológica de dicho organismo sospechado de estar infectado con Aspergillus, • hacer reaccionar dicha muestra biológica con un anticuerpo acorde con la invención, • determinar si se formaron inmunocomplejos . También se pueden extraer los tejidos, por ejemplo, con urea y detergente neutro, para liberar la proteína para el ensayo de transferencia Western o de transferencia puntual/en ranura. Esta técnica también se puede aplicar a los fluidos corporales. Otros métodos basados en anticuerpos que son de utilidad para detectar una proteína acorde con la invención incluyen inmunoensayos , tal como el ensayo de inmunoabsorción ligado a enzima (ELISA) y el radioinmunoensayo (RIA) . Por ejemplo, se pueden usar anticuerpos monoclonales contra una proteína acorde con la invención ya sea como una sonda de inmunoabsorción o como una sonda marcada con enzima para detectar y cuantificar la proteína acorde con la invención. La cantidad de proteína específica presente en la muestra se puede calcular con referencia a la cantidad presente en una preparación estándar usando un algoritmo de regresión lineal para computadora. En otro ensayo de ELISA, se pueden usar dos anticuerpos monoclonales distintos específicos para detectar una proteína acorde con la invención en un fluido biológico. En este ensayo, uno de los anticuerpos se usa como sonda de inmunoabsorción y el otro como sonda marcada con la enzima. Las técnicas anteriores se pueden realizar esencialmente como ensayos de "un solo paso" o "de dos pasos" . El ensayo de "un solo paso" comprende el contacto de una proteína acorde con la invención con el anticuerpo inmovilizado y, sin un lavado, el contacto de la mezcla con el anticuerpo marcado. El ensayo de "dos pasos" comprende un lavado antes de poner la mezcla en contacto con el anticuerpo marcado. También se pueden emplear otros métodos convencionales según necesidad. Habitualmente resulta deseable inmovilizar un componente del sistema de ensayo sobre un soporte, permitiendo de esa manera que los demás componentes del sistema tomen contacto con dicho componente y que sean eliminados fácilmente de la muestra. Las marcas enzimáticas adecuadas incluyen, por ejemplo, las del grupo de las oxidasas , que catalizan la producción de peróxido de hidrógeno por reacción con el sustrato. La actividad de la marca de oxidasa se puede evaluar midiendo la concentración del peróxido de hidrógeno formado en la reacción de anticuerpo marcado con la enzima/sustrato . Además de las enzimas, hay otras marcas adecuadas que incluyen radioisótopos, tal como yodo (125I, 13II) , carbono (1C) , azufre (35S) , tritio (¾) , indio (112In) y tecnecio (99mTc) , y marcas fluorescentes, tal como fluoresceína y rodamina, y biotina. La unión específica de un compuesto de prueba con una proteína acorde con la invención se puede detectar, por ejemplo, ín vitro por inmovilización reversible o irreversible de la proteína acorde con la invención sobre un sustrato, por ejemplo, la superficie de una cavidad de una placa para microtitulacion de poliestireno de 96 cavidades. Los métodos para inmovilizar polipéptidos y otras moléculas pequeñas son bien conocidas en el arte. Por ejemplo, las placas para microtitulacion se pueden recubrir con una proteína acorde con la invención por adición de la proteína en una solución (típicamente, a una concentración entre 0.05 y 1 mg/ml en un volumen de 1-100 µ?) a cada cavidad, y posterior incubación de las placas entre temperatura ambiente y 37 °C durante 0.1 a 36 horas. Las proteínas que no están unidas a la placa se pueden eliminar por agitación del exceso de solución de la placa y posterior lavado de la placa (una vez o repetidamente) con agua o una solución amortiguadora. Típicamente, la proteína está contenida en el agua o la solución amortiguadora. Luego se lava la placa con una solución amortiguadora que no contiene a la proteína unida. Para bloquear los sitios de unión de la proteína libres sobre las placas, dichas placas se bloquean con una proteína que no está relacionada con la proteína unida. Por ejemplo, son adecuados 300 µ? de albúmina de suero bovino (BSA) a una concentración de 2 mg/ml en Tris-HCl. Los sustratos adecuados incluyen aquellos sustratos que contienen una química de entrecruzamiento definida (por ejemplo, sustratos de plástico, tal como los sustratos de poliestireno, estireno o polipropileno de Corning Costar Corp. (Cambridge, MA) ) . Si se deseara, se pueden usar partículas esféricas, por ejemplo, esferas de agarosa o esferas de Sefarosa, como sustrato . La unión del compuesto de prueba a los polipéptidos acordes con la invención se puede detectar mediante cualquiera de numerosos métodos conocidos en el arte. Por ejemplo, se puede emplear un anticuerpo específico en el inmunoensayo . Si se deseara, el anticuerpo puede ser marcado (por ejemplo, por fluorescencia o con un radioisótopo) y detectar directamente (véase, por ejemplo, West y McMahon, J". Cell Biol . 74: 264, 1977). Como alternativa, se puede usar un segundo anticuerpo para la detección (por ejemplo, un anticuerpo marcado que se une a la porción Fe de un anticuerpo anti~A 97) . En un método de detección alternativo, la proteína acorde con la invención se marca y dicha marca es detectada (por ejemplo, marcando una proteína acorde con la invención con un radioisótopo, fluoróforo, cromóforo o semejantes) . En aún otro método, la proteína acorde con la invención se produce como una proteína de fusión con una proteína que puede ser detectada ópticamente, por ejemplo, la proteína fluorescente verde (que se puede detectar bajo luz UV) . En un método alternativo, la proteína acorde con la invención se puede unir covalentemente o fusionar con una enzima que presenta una actividad enzimática detectable, tal como peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, alfa-galactosidasa o glucosa oxidasa. Los genes que codifican todas estas enzimas han sido clonados y se encuentran fácilmente disponibles para su uso por el especialista en el arte. Si se deseara, la proteína de fusión puede incluir un antígeno y dicho antígeno puede ser detectado y medido con un anticuerpo policlonal o monoclonal usando métodos convencionales. Los antígenos adecuados incluyen enzimas (por ejemplo, peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina y alfa-galactosidasa) y polipéptidos no enzimáticos (por ejemplo, proteínas séricas, tal como BSA y globulinas y proteínas lácteas, tal como caseínas) . Epitopes, antígenos e inmunógenos . En otro aspecto, la invención provee un péptido o polipéptido que comprende una porción que lleva un epitope de un polipéptido de la invención. El epitope de esta porción de polipéptido es un epitope inmunogénico o antigénico de un polipéptido de la invención. Un "epitope inmunogénico" se define como una parte de una proteína que genera una respuesta de un anticuerpo cuando la proteína completa es el inmunógeno. Se considera que estos epitopes inmunogénicos están confinados a unos pocos loci sobre la molécula. Por otro lado, la región de una molécula proteica a la cual se puede unir un anticuerpo se define aquí como un "epitope antigénico" . La cantidad de epitopes inmunogénicos de una proteína es menor en general que la cantidad de epitopes antigénicos . Véase, por ejemplo, Geysen, H. M. et al., Proc . Nati. Acad. Sci . EE.UU. 81: 3998-4002 (1984) . Con respecto a la selección de péptidos o polipéptidos que llevan un epitope antigénico (es decir, que contienen una región de una molécula proteica a la cual se puede unir un anticuerpo) , se sabe en el arte que hay péptidos sintéticos relativamente cortos que imitan dicha parte de la secuencia proteica que habitualmente tienen la capacidad de generar un antisuero que reacciona con la proteína parcialmente mimetizada. Véase, por ejemplo, Sutcliffe, J. G. et al., Science 219: 660-666 (1984). Los péptidos capaces de generar sueros reactivos con proteínas están representados frecuentemente en la secuencia primaria de una proteína, pueden ser caracterizados por un conjunto de reglas químicas simples y no están confinados a las regiones inmunodominantes de las proteínas intactas (es decir, epitopes inmunogénicos) ni a los extremos amino o carboxilo terminales . Los péptidos que son extremadamente hidrofóbicos y los que son de seis residuos o menos son en general ineficaces para inducir anticuerpos capaces de unirse a la proteína mimetizada; habitualmente son eficaces los péptidos solubles, de mayor longitud, en especial los que contienen residuos de prolina. Sutcliffe et al., supra, en 661. Por ejemplo, 18 de 20 péptidos diseñados de acuerdo con estos lineamientos, que contienen 8-39 residuos que abarcan el 75% de la secuencia de la cadena de polipéptidos de la hemaglutinina Hal del virus de la influenza, indujeron anticuerpos que reaccionaron con la proteína HAl o con el virus intacto; y 12/12 péptidos de la MuLV polimerasa y 18/18 de la glucoprotelna de rabies indujeron anticuerpos que hicieron precipitar las respectivas proteínas . Los péptidos y polipéptidos de la invención que llevan un epitope antigénico son entonces de utilidad para generar anticuerpos, incluyendo anticuerpos monoclonal que se unen específicamente a un polipéptido de la invención. Por consiguiente, una proporción alta de los hibridomas obtenidos por fusión de las células de bazo de donantes inmunizados con un péptido antigénico que lleva un epitope secreta generalmente anticuerpos reactivos con la proteína nativa. Sutcliffe et al., supra, en 663. Los anticuerpos generados por los péptidos o polipéptidos que llevan un epitope antigénico son de utilidad para detectar la proteína mimetizada y se pueden emplear anticuerpos contra diferentes péptidos para efectuar un seguimiento de las distintas regiones de una proteína precursora que sufren el procesamiento de post-traducción. Los péptidos y anticuerpos anti-péptido se pueden usar en diversos ensayos cualitativos o cuantitativos para la proteína mimetizada, por ejemplo en ensayos de competencia dado que se ha demostrado que aún los péptidos cortos (por ejemplo, de 9 aminoácidos aproximadamente) se pueden unir y desplazar a los péptidos más grandes en ensayos de inmunoprecipitación . Véase, por ejemplo, Wilson, I.A. et al., Cell 37: 767-778 en 777 (1984) . Los anticuerpos anti-peptidos de la invención también son de utilidad para la purificación de la proteína mimetizada, por ejemplo, mediante cromatografía de adsorción usando métodos bien conocidos en el arte. Los peptidos y polipéptidos de la invención que llevan un epitope antigénico diseñado de acuerdo con los lineamientos anteriores contienen preferentemente una secuencia de al menos siete, más preferentemente al menos nueve y con mayor preferencia entre aproximadamente 15 y aproximadamente 30 aminoácidos contenidos dentro de la secuencia de aminoácidos de un polipéptido de la invención. Sin embargo, los peptidos o polipéptidos que comprenden una porción más grande de la secuencia de aminoácidos de un polipéptido de la invención, que contienen entre aproximadamente 30 y aproximadamente 50 aminoácidos, o cualquier longitud hasta la secuencia de aminoácidos completa de un polipéptido de la invención, también se consideran como péptidos o polipéptidos de la invención que llevan un epitope y también son de utilidad para inducir anticuerpos que reaccionan con la proteína mimetizada. Preferentemente, se selecciona una secuencia de aminoácidos del péptido que lleva un epitope para proveer una solubilidad sustancial en solventes acuosos (es decir, la secuencia incluye residuos relativamente hidrofílicos y preferentemente se evita el uso de secuencias muy hidrofóbicas) ; y las secuencias que contienen residuos de prolina son particularmente preferidas. Los peptidos y polipéptidos de la invención que llevan un epitope se pueden producir utilizando cualquier medio convencional para obtener peptidos o polipéptidos, inclusive medios recombinantes con las moléculas de ácido nucleico de la invención. Por ejemplo, se puede fusionar una secuencia de aminoácidos corta que lleva un epitope a un polipéptido más grande que actúa como transportador durante la producción recombinante y purificación, así como durante la inmunización, para producir los anticuerpos anti-péptidos . Los peptidos que llevan un epitope también se pueden sintetizar usando métodos conocidos de síntesis química. Por ejemplo, Houghten ha descrito un método simple para la síntesis de grandes cantidades de péptidos, tal como 10-20 mg de 248 péptidos diferentes de 13 residuos que representan variantes de un solo aminoácido de un segmento del polipéptido HAl que se prepararon y caracterizaron (con estudios de unión de tipo ELISA) en menos de cuatro semanas. Houghten, R. A., Proc . Nati. Acad. Sci . EE.UU. 82: 5131-5135 (1985) . Este proceso de "Síntesis Simultánea de Múltiples Péptidos (SMPS)" se describe también en la Patente de EE.UU. N": 4.631.211 de Houghten et al. (1986). En este procedimiento las resinas individuales para la síntesis en fase sólida de numerosos péptidos están contenidas en paquetes separados permeables al solvente, lo cual permite emplear muchos pasos repetitivos idénticos en los métodos en fase sólida. Un procedimiento completamente manual permite llevar a cabo 500-1000 o más síntesis de forma simultánea. Houghten et al., supra, en 5134. Los péptidos y polipéptidos de la invención que llevan un epitope se pueden usar para inducir anticuerpos de acuerdo con métodos bien conocidos en el arte. Véase, por ejemplo, Sutcliffe et al., supra; Wilson et al., supra; Chow, M. et al., Proc . Nati. Acad. Sci . EE.UU. 82: 910-914; y Bittle, F.J. et al., J. Gen. Virol . 66: 2347-2354 (1985). En general, los animales se pueden inmunizar con el péptido libre; sin embargo, se puede reforzar el título del anticuerpo anti-péptido por acoplamiento del péptido con un transportador macromolecular, tal como la hemocianina de lapa (KLH) o el toxoide del tétano. Por ejemplo, se pueden acoplar péptidos que contienen cisteína a un transportador usando un ligador, tal como éster de maleimidobenzoíl-N-hidroxisuccinimida (MBS) , en tanto otros péptidos se pueden acoplar al transportador usando un agente ligador más general, tal como glutaraldehído . Los animales, tal como conejos, ratas y ratones, son inmunizados con péptidos libres o acoplados a un transportador, por ejemplo, mediante inyección intraperitoneal y/o intradérmica de emulsiones que contienen aproximadamente 100 \ig de peptido o proteína transportadora y adyuvante de Freund. Es probable que se necesiten varias inyecciones de refuerzo, por ejemplo, a intervalos de aproximadamente dos semanas, para proveer un titulo útil del anticuerpo anti-péptido que pueda ser detectado, por ejemplo, mediante un ensayo de ELISA usando el peptido libre adsorbido sobre una superficie sólida. El título de los anticuerpos anti-péptido en el suero de un animal inmunizado se puede incrementar por selección de los anticuerpos anti-péptido, por ejemplo, por adsorción del péptido sobre un soporte sólido y elución de los anticuerpos seleccionados de acuerdo con métodos bien conocidos en el arte. Los péptidos de la invención que llevan un epitope inmunogénico, es decir, aquellas partes de una proteína que generan una respuesta de anticuerpo cuando la proteína completa es el inmunógeno, se pueden identificar de acuerdo con métodos conocidos en el arte. Por ejemplo, Geysen et al., 1984, supra, describe un procedimiento para una síntesis concurrente rápida sobre soportes sólidos de cientos de péptidos de pureza suficiente como para reaccionar en un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas. La interacción de los péptidos sintetizados con los anticuerpos se detecta posteriormente con facilidad sin separarlos del soporte. De esta manera es posible para el especialista en el arte identificar un peptido que lleva un epitope inmunogénico de la proteína deseada de manera rutinaria. Por ejemplo, Geysen et al. localizaron el epitope inmunológicamente importante en la proteína de recubrimiento del virus de la enfermedad de fiebre aftosa, con una resolución de siete aminoácidos mediante la síntesis de un conjunto de superposiciones de todos los 208 hexapéptidos posibles que abarca la secuencia completa de 213 aminoácidos de la proteína. Después, se sintetizó un conjunto de péptidos de reemplazo completo en los cuales los 20 aminoácidos fueron sustituidos a su vez en cada posición dentro del epitope y se determinaron los aminoácidos particulares que conferían especificidad por la reacción con el anticuerpo. Por lo tanto, se pueden elaborar análogos peptídicos de los péptidos de la invención que llevan un epitope de manera rutinaria con el uso de este método. En la Patente de EE.UU. N° : 4.708.781 de Geysen (1987) se describe con mayor detalle este método de identificación de un péptido que lleva un epitope inmunogénico de una proteína deseada. Aún más, en la Patente de EE.UU. N° : 5.194.392 de Geysen (1990) se describe un método general para detectar o determinar la secuencia de monómeros (aminoácidos u otros compuestos) , que constituye un equivalente topológico del epitope (es decir, un "mimotope") que es complementario de un paratope particular (sitio de unión al antígeno) del anticuerpo de interés. Más generalmente, en la Patente de EE.UU. N° : 4.433.092 de Geysen (1989) se describe un método para detectar o determinar una secuencia de monómeros que constituye un equivalente topográfico de un ligando que es complementario del sitio de unión al ligando de un receptor de interés particular. De manera similar, en la Patente de EE.UU. N° : 5.480.971 de Houghten, R. A. et al. (1996) sobre Peralkyla ted Oligopeptide Mixtures [Mezclas de Oligopéptidos Peralquilados] se describen oligopéptidos peralquilados de Cl-C7-alquilo lineales y conjuntos y bibliotecas de dichos péptidos, así como métodos de uso de dichos conjuntos y bibliotecas de oligopéptidos en la determinación de la secuencia de un oligopéptido peralquilado que se une preferencialmente a una molécula aceptora de interés. Por consiguiente, los análogos no peptídicos de los péptidos de la invención que llevan un epitope también se pueden obtener rutinariamente utilizando estos métodos . Uso de enzimas lipolíticas en procesos industriales La invención también se relaciona con el uso de la enzima lipolítica acorde con la invención en una cantidad selecta de procesos industriales. A pesar de la experiencia prolongada con estos procesos, la enzima lipolítica acorde con la invención ofrece una cantidad de ventajas significativas con respecto a las enzimas en uso actualmente. Según la aplicación específica, estas ventajas incluyen aspectos tales como menores costos de producción, mayor especificidad por el sustrato, menor antigenicidad, menos actividades secundarias no deseadas, mayores rendimientos cuando son producidas en un microorganismo adecuado, rangos de pH y temperatura más adecuados, mejor sabor del producto final, asi como aspectos de grado, alimentario y kosher. La presente invención también se relaciona con métodos para preparar una masa o un producto horneado que comprende la incorporación en la masa de una cantidad eficaz de una enzima lipolítica de la presente invención lo cual mejora una o varias propiedades de la masa o del producto horneado obtenido a partir de la masa con relación a la masa o al producto horneado en los cuales no se ha incorporado el polipéptido . La frase "incorporar en la masa" se define aquí como la adición de la enzima lipolítica acorde con la invención a la masa, a cualquier ingrediente con la cual se preparará la masa y/o cualquier mezcla de ingredientes de masa con la cual se preparará dicha masa. En otras palabras, la enzima lipolítica acorde con la invención se puede agregar en cualquier paso de la preparación de la masa y se puede agregar en uno, dos o más pasos. La enzima lipolítica acorde con la invención se agrega a los ingredientes de una masa que será amasada y horneada para obtener un producto horneado usando métodos bien conocidos en el arte. Véase, por ejemplo, Patente de EE.UU. N° : 4,567,046, EP-A-426, 211, JP-A-60-78529, JP-A-62-111629 y JP-A-63-258528. El término "cantidad eficaz" se define aquí como la cantidad de la enzima lipolítica acorde con la invención necesaria para proveer un efecto medible sobre al menos una propiedad de interés de la masa y/o producto horneado. El término "propiedad mejorada" se define aquí como cualquier propiedad de una masa y/o de un producto obtenido con dicha masa, en particular un producto horneado, que es mejorado por acción de la enzima lipolítica acorde con la invención con relación a una masa o producto en los cuales no se ha incorporado la enzima lipolítica acorde con la invención. Dicha propiedad mejorada puede incluir, por ejemplo, mayor fuerza de la masa, mayor elasticidad de la masa, mayor estabilidad de la masa, menor pegajosidad de la masa, mayor extensibilidad de la masa, mejor gusto del producto horneado, mayor retardo en el endurecimiento del producto horneado . La propiedad mejorada se puede determinar por comparación de una masa y/o un producto horneado preparado con y sin la adición de un polipéptido de la presente invención de acuerdo con los métodos de la presente invención que se describen más adelante en los Ejemplos. Las cualidades organolépticas se pueden evaluar usando procedimientos bien establecidos en la industria panadera, y pueden incluir, por ejemplo, el uso de un panel de degustadores entrenados . El término "mayor fuerza de la masa" se define aquí como la propiedad de una masa . que en general presenta propiedades más elásticas y/o que requiere más trabajo para moldearla y darle forma . El término "mayor elasticidad de la masa" se define aquí como la propiedad de una masa que tiene una mayor tendencia para recobrar su forma original después de haber sido sometida a una determinada fuerza física. El término "mayor estabilidad de la masa" se define aquí como la propiedad de una masa que es menos susceptible al abuso mecánico lo cual le permite entonces conservar mejor su forma y volumen. El término "menor pegajosidad de la masa" se define aquí como la propiedad de una masa que tiene menos tendencia de adherirse a las superficies, por ejemplo, de las máquinas de producción de la masa y es evaluada ya sea empíricamente por el especialista panadero o es medida mediante el uso de un analizador de textura (por ejemplo, TAXT2) conocido en el arte. El término "mayor extensibilidad de la masa" se define aquí como la propiedad de una masa que puede ser sometida a una mayor fuerza o estiramiento sin provocar rotura de dicha masa. El término "mayor maquinabilidad de la masa" se define aquí como la propiedad de una masa que en general es menos pegajosa y/o más firme y/o más elástica. El término "mayor volumen del producto horneado" se mide como el volumen específico de una hogaza de pan dada (volumen/peso) determinado típicamente por el método tradicional de desplazamiento de colza. El término "mejor estructura de la miga del producto horneado" se define aquí como la propiedad de un producto horneado con paredes de celda más finas y/o más delgadas en la miga y/o una distribución uniforme/homogénea de las celdas en la miga y que habitualmente es evaluado empíricamente por el especialista panadero. El término "mayor suavidad del producto horneado" es el opuesto de "firmeza" y se define aquí como la propiedad de un producto horneado que se puede comprimir con mayor facilidad y es evaluada ya sea empíricamente por el especialista panadero o se mide mediante el uso de un analizador de la textura (por ejemplo, TAXT2) conocido en el arte.

El término "mejor gusto del producto horneado" es evaluado por un panel de prueba entrenado. El término "mayor retardo en el endurecimiento del producto horneado" se define aquí como la propiedad de un producto horneado que posee un índice menor de deterioro de los parámetros de calidad, por ejemplo, suavidad y/o elasticidad, durante el almacenamiento. El término "masa" se define aquí como una mezcla de harina y otros ingredientes, suficientemente firme como para ser amasada o enrollada. La masa puede ser fresca, congelada, pre-enrollada o pre-horneada . La preparación de masas congeladas fue descrita por Kulp y Lorenz en Frozen and Refrigerated Doughs and Batters. El término "producto horneado" se define aquí como cualquier producto preparado con una masa, ya sea de carácter suave o crujiente. Los ejemplos de productos horneados, ya sean de tipo blanco, claro u oscuro, que pueden ser producidos ventajosamente con la presente invención son pan (en particular pan blanco, de grano entero o de centeno) , típicamente en la forma de hogazas o rollos, pan francés de tipo baguette, pasta, pan pita, tortillas, tacos, tortas, panqueques, galletas, galletitas, tapas de tarta, pan al vapor y pan crocante y semejantes. Las enzimas lipolíticas de la presente invención y/o las enzimas adicionales que se pueden usar en los métodos de la presente invención se pueden encontrar en cualquier forma adecuada para el uso en cuestión, por ejemplo, en la forma de un polvo seco, polvo aglomerado o granulado, en particular un granulado no espolvoreable , un líquido, en particular un líquido estabilizado, o de una enzima protegida como se describe en WOOl/11974 y WO02/26044. Los granulados y polvos aglomerados se pueden preparar con métodos convencionales, por ejemplo, por rociado de la enzima lipolítica acorde con la invención sobre un vehículo en un granulador de lecho fluido. El vehículo puede consistir de núcleos particulados de un tamaño de partícula adecuado. El vehículo puede ser soluble o insoluble, por ejemplo, una sal (tal como NaCl o sulfato de sodio) , un azúcar (tal como sacarosa o lactosa) , un alcohol de un azúcar (tal como sorbitol) , almidón, arroz, granulos de maíz o soja. La enzima lipolítica acorde con la invención y/o las enzimas adicionales pueden estar contenidas en formulaciones de liberación lenta. Los métodos para preparar las formulaciones de liberación lenta son bien conocidos en el arte. La adición de estabilizadores aceptables para fines nutricionales , tal como azúcar, alcohol de azúcar u otro poliol, y/o ácido láctico u otro ácido orgánico acorde con los métodos establecidos sirve para estabilizar, por ejemplo, preparaciones de enzimas líquidas.

La enzima lipolítica acorde con la invención también se puede incorporar en composiciones que comprenden levadura, tal como se describe en EP-A-0619947, EP-A-0659344 y WO02/49441. Para su inclusión en premezclas de harina resulta ventajoso que el polipéptido acorde con la invención se encuentre en la forma de un producto seco, por ejemplo, un granulado no espolvoreable , en tanto para su inclusión junto con un líquido resulta ventajoso una forma líquida. También es posible incorporar una o más enzimas adicionales en la masa. La enzima adicional puede ser de cualquier origen, incluyendo de mamíferos y plantas, y preferentemente de microbios (bacterias, levaduras u hongos) y se puede obtener con las técnicas usadas convencionalmente en el arte. En una realización preferida, la enzima adicional puede ser una amilasa, tal como una alfa-amilasa (de utilidad para proveer azúcares fermentables por levaduras y retardo del endurecimiento) o una beta-amilasa, ciclodextrina glucanotransferasa, peptidasa, en particular, una exopeptidasa (de utilidad para mejorar el gusto), transglutaminasa, lipasa (de utilidad para modificar los lípidos presentes en la masa o en los constituyentes de la masa con el fin de ablandar dicha masa) , fosfolipasa, celulasa, hemicelulasa , en particular una pentosanasa tal como xilanasa (de utilidad para una hidrólisis parcial de pentosanos que incrementa la extensibilidad de la masa) , proteasa (de utilidad para debilitar el gluten, en particular cuando se usa harina de trigo duro) , proteína disulfuro isomerase, por ejemplo, la proteína disulfuro isomerasa que se describe en WO 95/00636, glicosiltransferasa, peroxidasa (de utilidad para mejorar la consistencia de la masa) , laccasa u oxidasa, por ejemplo, una glucosa oxidasa, hexosa oxidasa, aldosa oxidasa, piranosa oxidasa, lipoxigenasa o L-aminoácido oxidasa (de utilidad para mejorar la consistencia de la masa) . Cuando se agrega una o más actividades enzimáticas adicionales de acuerdo con los métodos de la presente invención, estas actividades se pueden agregar por separado o junto con el polipéptido acorde con la invención, optativamente como uno o varios constituyentes de una composición mejoradora de pan y/o de masa. Las otras actividades enzimáticas pueden comprender cualquiera de las enzimas descritas previamente y se pueden dosificar de acuerdo con la práctica panadera establecida. La presente invención también se relaciona con métodos para preparar un producto horneado que comprende el horneado de una masa obtenida con un método de la presente invención para producir un producto horneado. El horneado de la masa para producir un producto horneado se puede llevar a cabo usando métodos bien conocidos en el arte. La presente invención también se relaciona con masas y productos horneados, respectivamente, producidos con los métodos de la presente invención. La presente invención se relaciona además con una premezcla, por ejemplo, en la forma de una composición de harina, para masas y/o productos horneados elaborados a partir de una masa, donde dicha premezcla comprende un polipéptido de la presente invención. El término "premezcla" se define aquí con su significado convencional, es decir, como una mezcla de agentes de horneado, en general con harina, que no sólo se puede usar en instalaciones/plantas de horneado industriales, sino también en las panaderías minoristas. La premezcla se puede preparar mezclando el polipéptido o la composición mej oradora de pan y/o mej oradora de masa de la invención que comprende al polipéptido con un vehículo adecuado tal como harina, almidón, un azúcar o una sal. La premezcla puede contener otros aditivos mej oradores de masa y/o mej oradores de pan, por ejemplo, cualquiera de los aditivos, incluyendo las enzimas, mencionados previamente.

La presente invención se relaciona además con aditivos de horneado en la forma de un granulado o polvo aglomerado, que comprende un polipéptido de la presente invención. El aditivo de horneado posee preferentemente una distribución estrecha de tamaño de partícula, con más de un 95% (en peso) de las partículas en un rango entre 25 y 500 µ?a. En la elaboración de la masa y del pan, la presente invención se puede usar en combinación con los adyuvantes de procesamiento definidos previamente en este documento, tal como los adyuvantes de procesamiento químicos como agentes oxidantes (por ejemplo, ácido ascórbico) , agentes reductores (por ejemplo, L-cisteína) , oxidorreductasas (por ejemplo, glucosa oxidasa) y/u otras enzimas, tal como enzimas modificadoras de polisacáridos (por ejemplo ?~amilasa, hemicelulasa, enzimas ramificadoras , etc.) y/o enzimas modificadoras de proteínas (endoproteasas , exoproteasas, enzimas ramificadoras , etc.). EJEMPLO 1 Fermentación de Aspergillus niger Las enzimas lipolíticas codificadas por la secuencia de nucleótidos provista aquí se obtuvieron construyendo plásmidos de expresión que contenían las secuencias de ADN, transformando una cepa de A. niger con este plásmido y cultivando las cepas de Aspergillus niger de la siguiente manera . Se inocularon esporas frescas (10s-107) de cepas de A. nicrer en 20 mi de medio CSL (frasco de 100 mi, deflector) y se cultivaron durante 20-24 horas a 34 °C y 170 rpm.

Después de inocular 5-10 mi de precultivo CSL en 100 mi de medio CSM (frasco de 500 mi, deflector) las cepas fueron fermentadas a 34 °C y 170 rpm durante 3-5 días. Se obtuvieron sobrenadantes libres de células por centrifugación en tubos de Greiner de 50 mi (30 minutos, 5000 rpm) . Los sobrenadantes se prefiltraron por un filtro de microfibras GF/A Whatman Glass (150 ram £) para eliminar las partículas más grandes, se les ajustó el pH en 5 con KOH 4 N (si fuera necesario) y se filtraron bajo condiciones de esterilidad por un filtro de 0.2 µta (punta de botella) con succión para eliminar el material fúngico. Los sobrenadantes se guardaron a 4 °C (0 -20 °C) . El medio CSL consistía de (en cantidad por litro) : 100 g de sólidos de maíz remojado ( oquette) , 1 g de NaH2P04*H20, 0.5 g de MgS04*7H20, 10 g de glucosa*¾0 y 0.25 g de Basildon (antiespumante) . Los ingredientes se disolvieron en agua desmineralizada (demi-agua) y el pH se ajustó en pH 5.8 con NaOH o H2S0 ; se llenaron frascos con deflector y bolilla antiespuma de 100 mi con 20 mi de caldo de fermentación y se esterilizaron durante 20 minutos a 120 °C después de lo cual se agregaron 200 µ? de una solución que contenía penicilina 5000 IU/ml y estreptomicina 5 mg/ml a cada frasco una vez enfriados a temperatura ambiente. El medio CSM consistía (en cantidad por litro) de: 150 g de maltosa*H20, 60 g de Soytone (peptona) , 1 g de Na¾P04*H20, 15 g de MgS04*7H20, 0.08 g de Tween 80, 0.02 g de Basildon (antiespumante) , 20 g de MES, 1 g de L-arginina. Los ingredientes se disolvieron en demi-agua y el pH se ajustó en 6.2 con NaOH o ¾S0 ; se llenaron frascos con deflector y bolilla antiespumante de 500 mi con 100 mi de caldo de fermentación y se esterilizaron durante 20 minutos a 120 °C, después de lo cual se agregó 1 mi de una solución que contenía penicilina 5000 IU/ml y estreptomicina 5 mg/ml a cada frasco una vez enfriados a temperatura ambiente. EJEMPLO 2 Purificación de las enzimas lipolíticas de la invención Paso 1 - Preparación de ultrafiltrados Se ultrafiltraron los sobrenadantes de los cultivos, obtenidos en el Ejemplo 1, para eliminar los contaminantes de bajo peso molecular que pudieran interferir con las determinaciones de la actividad enzimática y las pruebas de horneado. La ultrafiltración de 30 mi de sobrenadante se llevó a cabo con un sistema Millipore Labscale TFF equipado con un filtro con un valor de corte de 10 kDa. Dependiendo del color, las muestras se lavaron 3-5 veces con volúmenes de 40 mi de solución amortiguadora de fosfato 100 mM fría a pH 6,0 que contenía CaCl2 0.5 M. El volumen final de la solución enzimática fue de 30 mi y se denomina "ultrafiltrado" de aquí en adelante. Paso 2 - Determinación de la concentración de las enzimas lipolíticas por A280 y HPSEC. La concentración de las enzimas lipolíticas en el ultrafiltrado se calculó a partir del valor de extinción a 280 nm (?280) atribuible a las enzimas lipolíticas y el coeficiente de extinción molecular calculado de las enzimas lipolíticas. La medición de la ?280 se llevó a cabo con un espectrofotómetro Uvikon XL Secomam (Beun de Ronde, Abcoude, Países Bajos) . El coeficiente de extinción molecular de la enzima se puede calcular a partir de la cantidad de residuos de tirosina, triptofano y cisteína por molécula de enzima (S.C. Gilí y P.H. von Hippel, Anal. Bíochem. 182, 319-326 (1989) ) . El coeficiente de extinción molecular para estos aminoácidos es: 1280, 5690 y 120 M^1.cm"1, respectivamente. La cantidad de residuos de tirosina, triptofano y cisteína en las enzimas lipolíticas de la invención se puede deducir a partir de las secuencias proteicas seleccionadas del grupo formado por las SEQ ID N° : 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36 y 39. Los coeficientes de extinción molecular calculados de las enzimas lipolíticas de la invención se resumen en la Tabla 2.

Tabla 2 La extinción del ultrafiltrado a 280 nm (A280) que es atribuible a las enzimas lipoliticas depende de la pureza de la muestra de enzima. Esta pureza se determinó usando HPSEC (cromatografía por exclusión de tamaño de gran rendimiento) con una columna TS SW-XL (300*7.8 mm; rango de PM: 10-300 kDa) . La solución amortiguadora de elución consistía de solución amortiguadora de fosfato de sodio 25 mM, pH 6.0, y se usó con una velocidad de flujo de 1 ml/min. Se inyectaron muestras de 5-100 µ? . Se midió la absorbancia a 280 nm. La A280 del ultrafiltrado atríbuible a la enzima lipolitica de la invención se obtuvo por la relación entre la superficie del pico de la enzima lipolitica respectiva en el cromatograma y la superficie total de los picos con absorción a 280 nm. Luego se calculó la concentración de enzima lipolitica en el ultrafiltrado multiplicando la A280 del ultrafiltrado por la relación descrita previamente y dividiendo todo por el coeficiente de extinción calculado (solución 1 mg/ml; Tabla 2; columna más a la derecha) para cada enzima lipolitica. EJEMPLO 3 Mediciones de la actividad Los sobrenadantes libres de células obtenidos en el Ejemplo 1 fueron sometidos a los ensayos de lipasa, fosfolipasa y galactolipasa resumidos en la Tabla 3.

Tabla 3. Actividades de las enzimas lipoliticas en los sobrenadantes libres de células preparados en el Ejemplo 1. enzima Fosfolipasa Lisofosfoli lipoli Lipasa Galactolipasa A pasa tica NBE028 + + + 0 NBE029 + + + 0 NBE031 +++ + + + NBE032 ++ + + 0 Tabla 3. Actividades de las enzimas lipoliticas en los sobrenadantes libres de células preparados en el Ejemplo 1. (continuación) 0 = no es diferente del blanco; +/++/+++ = valor mál alto que el blanco. La actividad lipasa se determinó por espectrofotometría usando 2 , 3-mercapto-l-propanol~ tributirato (TBDMP) como sustrato. La lipasa hidroliza el enlace sulfuro del TBDMP liberando ácido tio-butanoico que en una reacción posterior con 4 , 4-ditiopiridina (DTDP) forma 4-tiopiridona . Esta última se encuentra en equilibrio tautomérico con la 4-mercaptopiridina que se absorbe a 334 nm. La reacción se lleva a cabo en solución amortiguadora de acetato 0.1 M, pH 5.0, que contiene Triton-X100 0.2%, TBDMP 0.65 mM y DTDP 0.2 mM a 37 °C. Una unidad de lipasa se define como la cantidad de enzima que libera 1 micromol de ácido 4-tio-butanoico por minuto bajo las condiciones de reacción establecidas.

La fosfolipasa A se determinó por espectrofotometría utilizando 1, 2-ditiodioctanoíl-fosfatidilcolina como sustrato. La fosfolipasa A hidroliza el enlace sulfuro en la posición 1 (PLA1) o en la posición 2 (PLA2) , liberando así ácido 4-tio-octanoico que, en una reacción subsiguiente reacciona con 4 , 4 ' -ditiopiridina para formar 4-tiopiridona . Éste último se encuentra en equilibrio tautomérico con 4-mercapto iridina, con una absorción a 334 nm. La reacción se lleva a cabo en solución amortiguadora de acetato 0.1 M, pH 4.0, que contenía Triton-X100 0.2%, sustrato 0.65 mM y DTDP 0.2 mM a 37° C. Una unidad de fosfolipasa A (PLA) se define como la cantidad de enzima que libera 1 micromol de ácido 4 tio-octanoico por minuto bajo las condiciones de reacción establecidas. La actividad lisofosfolipasa se determinó por espectroscopia 31P-NMR utilizando lisofosfatidil-colina como sustrato. La lisofosfolipasa hidroliza el enlace éster liberando así el ácido graso del grupo glicerol . La glicerolfosfocolina así formada se cuantifica usando N R. La reacción se lleva a cabo en solución amortiguadora con ácido acético 50 mM a pH 4.5 que además contiene lisofosfatidilcolina 1 mg/ml y CaCl2 5 mM durante 30 minutos a 55° C. Una unidad de lisofosfolipasa (LPC) se define como la cantidad de enzima que forma 1 micromol de 4-glicerolfosfocolina por minuto bajo las condiciones de reacción establecidas . La actividad galactolipasa se determinó con espectroscopia de H-NMR usando digalactosildiglicerido como sustrato, de acuerdo con el método descrito por Hirayama y Matsuda (1972) Agrie. Biol . Chem. 36, 1831. La galactolipasa hidroliza el enlace éster entre los ácidos grasos y la estructura principal de glxcerol liberando así uno o ambos ácidos grasos . La reacción se lleva a cabo en solución amortiguadora con ácido acético 50 mM a pH 4.5 que además contiene CaCl2 4 mM, Tritón X-100 0.2% y digalactosildiglicérido 1 mg/ml (Lipid Products) durante 30 minutos a 30° C. Una unidad galactolipasa se define como la cantidad de enzima que forma 1 micromol de ácido graso por minuto bajo las condiciones de reacción establecidas . Los ultrafiltrados obtenidos en el Ejemplo 2, fueron sometidos a medición de actividad de la enzima FAU. La actividad de la alfa-amilasa fúngica se midió usando las tabletas de prueba para amilasa Phadebas (Pharmacia) . Las tabletas Phadebas contienen un sustrato de almidón insoluble en agua y un colorante azul, unido por entrecruzamiento al sustrato. El sustrato es hidrolizado por la amilasa fúngica, liberando maltodextrinas solubles teñidas que entran en la solución. Se preparó una curva de calibración con una solución que contenía actividad alfa-amilasa fúngica de referencia. A partir de las muestras de referencia y desconocidas se prepararon diluciones apropiadas en solución amortiguadora con ácido málico 50 mM a pH 5.5. Se incubaron muestras de 5 mi a 30 °C durante 5 minutos, se agregó una tableta Phadebas y después de 15 minutos la reacción se detuvo por adición de 1.0 mi de hidróxido de sodio 0.5 N. Se dejó que las mezclas se enfriaran hasta temperatura ambiente durante 5 minutos, después de lo cual se agregaron 4.0 mi de agua, se agitaron manualmente y después de 15 minutos las muestras se centrifugaron a 4700 rpm durante 10 minutos. Se midió la extinción de las capas superiores a 620 nm. La DO a 620 nm es una medida de la actividad alfa-amilasa fúngica. Una unidad de amilasa fúngica (FAU) se define aquí como la cantidad de enzima que convierte 1 gramo de almidón (100% de materia seca) por hora en un producto que posee una transmisión a 620 nm después de reaccionar con una solución de yodo de fuerza conocida bajo las condiciones de reacción establecidas.

Tabla 4. Actividades lipoliticas ultrafiltrados preparados en Ejemplo 2.

Además de las actividades mencionadas en la Tabla 4, también se determinaron actividades menores de glucoamilasa, sin embargo dichas cantidades bajas de estas enzimas no interfirieron con los experimentos de horneado que se describen en el ejemplo 4. EJEMPLO 4 Experimentos de horneado 1: hogazas de panecillos de molde Se hornearon hogazas de panecillos de molde con bollos de 150 gramos de masa obtenidos mezclando 200 g de harina ( olibri™/lbis™ en una proporción de 80/20), 1.4 g de levadura de panadería seca (Fermipan°) , 4 g de sal, 3 g de azúcar, 10 mg de ácido ascórbico, 116 g de agua y 2 g de grasas. Después de mezclar durante 6 minutos y 15 segundos en un mezclador de barra, la masa se dividió en bollos de 150 gramos y se dejaron fermentar durante 45 minutos a 30 °C, se pincharon, se dejaron fermentar durante otros 25 minutos, se moldearon y se colocaron sobre placas. El fermentado tuvo lugar a una humedad relativa de 90-100%. Después de un fermentado final de 70 minutos a 30 °C, la masa se horneó durante 20 minutos a 225 °C. Los distintos efectos (Tablas 5 y 6) de las diferentes enzimas lipolíticas en los experimentos de horneado fueron comparados con un control que contenía la misma cantidad de amilasa fúngica que se había agregado con la dosificación del ultrafiltrado (por datos sobre la actividad amilasa fúngica en los ultrafiltrados , véase la Tabla 4) . Esto fue necesario dado que las cantidades de amilasa fúngica que se agregaron con las enzimas lipolíticas afectaron particularmente el volumen de la hogaza de pan, no los demás parámetros . El volumen de los panes con la cantidad de amilasa fúngica control agregada se consideró como el 100%.

Tabla 5.

El volumen de la hogaza de pan se determinó con el Medidor de Volumen de Pan [Bread Volume Measurer] BVM-3 (RI Cards Instruments AB, Viken, Suecia) . El principio de esta medición se basa en la reflexión de ultrasonido medida por un sensor ubicado alrededor de una placa 'rotatoria. Se tomó un tiempo de medición de 45 segundos. La pegajosidad y extensibilidad, de la" masa fueron evaluadas por un panadero calificado con la escala representada en la Tabla 5. Se midió un promedio de 2 hogazas por objeto. Después de .estas pruebas, los bollos de masa fueron moldeados y se llevó a cabo un primer fermentado durante 45 minutos a 30 °C y después de ello la masa se pinchó, se moldeó, se colocó sobre placas, se dejó fermentar durante 75 minutos a 30 °C. La humedad relativa durante los fermentados se definió en 85%. A continuación se evaluó la estabilidad de la masa fermentada por la presencia de alvéolos, corteza rasgada y superficies curvadas irregulares de la corteza. Los trozos de masa se hornearon durante 20 minutos a 225 °C. El volumen de las hogazas de pan se determinó por el método BVM-3: en la tabla, se muestra el promedio de 2 panes horneados con el mismo objeto. La estructura de la miga fue evaluada por un panadero calificado usando la escala que se muestra en la Tabla 5. Después de guardar las hogazas durante tres días en bolsas de polietileno a temperatura ambiente, se midió la firmeza de la miga usando un analizador de textura Stevens . Se analizaron dos rodajas de 2 cm de espesor del centro de cada hogaza con el analizador de textura usando una sonda de 1,5 pulgadas de diámetro, un profundidad de compresión de 5 mm (25%) y una velocidad de compresión de 0.5 mm/seg. En la tabla se muestra el promedio de dos mediciones. El color de la corteza fue evaluado por un panadero calificado de acuerdo con la escala que se muestra en la Tabla 5. Como referencia, se usó la receta estándar para el pan de molde holandés .

El color de la miga fue evaluado por un panadero calificado de acuerdo con la escala que se muestra en la Tabla 5. El color de la miga de los panes control fue evaluado como normal (3) . Como control positivo, se usaron los panes de 2 objetos con la misma composición que el control más harina de soja 0.5%. Los procedimientos de fermentado y horneado fueron los mismos que los del control sin harina de soja. Éste último se consideró como "excelente" . La parte sobresaliente del pan fue evaluada por el derrame del pan con relación al molde de horneado, cuanto más bajo eran los bordes de la parte derramada, menor era el puntaje. Un derrame menor significa un puntaje mayor. El endurecimiento del pan fue evaluado por determinación de la firmeza de la miga de rodajas del pan. Antes del corte en rodajas, el pan se guardó en una bolsa de plástico a temperatura ambiente durante 4 días. Cuanto más blando era la miga de las rodajas, mejor era la evaluación.

Tabla 6. Rendimiento de horneado de las enzimas lipoliticas de la invención EJEMPLO 5 Experimentos de horneado 2: batard El rendimiento de horneado de las enzimas lipoliticas acordes con la invención fue evaluado con el tipo de pan francés denominado "batard". Se prepararon panes tipo batard con un proceso de horneado estándar mezclando 3000 g de harina de trigo aproximadamente a 20 °C, 70 g de levadura comprimida, 60 g de sal, 68 ppm de ácido ascórbico, 30 ppm de Bakezymes HS2ooo (hemicelulasa fúngica) , 7 ppm de Bakezymes P500 (alfa-amilasa fúngica) y 1680 mi de agua (8-10 °C) en un mezclador en espiral (Diosna: 2 minutos en velocidad 1; 100 Wh de entrada en velocidad 2) . La temperatura de la masa era de 27° C. La maquinabilidad de la masa fue analizada a mano por un panadero. La masa recibió un fermentado en bollo de 15 minutos en un gabinete de fermentado a 32 °C y 90% de HR. A continuación, la masa se dividió en 6 trozos de 350 g, se moldeó y se levó durante 15 minutos a 32° C y 90% de HR. Al finalizar este período, los trozos de masa fueron moldeados y se les dio forma y luego recibieron un fermentado final de 90 minutos a 32° C y 90% de HR. Las masas completamente fermentadas se cortaron en la longitud del trozo de masa y se hornearon en un horno a 240° C durante 30 minutos con la adición de vapor inicial. Después de enfriar a temperatura ambiente, se determinaron los volúmenes de las hogazas por el método BVM (véase el e emplo 4) . Las características de rotura, formación de miga y forma de los panes fueron analizadas directamente después del enfriamiento hasta temperatura ambiente por un panadero calificado usando la calificación indicada en la Tabla 7. Después de 16 horas (toda la noche) de almacenamiento en una caja cerrada a temperatura ambiente, la calidad de la miga fue evaluada por un panadero calificado. El valor de los panes (Tabla 8) deriva de 1 objeto.

Tabla 7 Tabla 8. Rendimiento de horneado de las enzimas lipoliticas de la invención Parámetro Volumen Rotura y enzima lipolítica de la Estructu Dosifica forma hogaza Forma ra de la ción* ción de de pan miga miga (%) Ninguna 0 100 3 3 3 NBE028 0.75 3 4 4 4 NBE030 3 103 4 4 3 Tabla 8. Rendimiento de horneado de las enzimas lipoliticas de la invención (continuación) 5 '10 15 * en ppm basado en el peso de la harina y el peso de la enzima determinado por el método A280

Claims (1)

1. NOVEDAD DE LA INVENCION Habiendo descrito la presente invención, se considera como novedad, y por lo tanto se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes : REIVINDICACIONES : 1. Un polinucleótido aislado, CARACTERIZADO PORQUE se puede hibridizar con un polinucleótido seleccionado del grupo formado por las SEQ ID N° : 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 13, 14, 16, 17, 19, 20, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 31, 32, 34, 35, 37 y 38. 2. El polinucleótido aislado acorde con la cláusula 1, CARACTERIZADO PORQUE se puede hibridizar bajo condiciones muy severas con un polinucleótido seleccionado del grupo formado por las SEQ ID N° : 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 13, 14, 16, 17, 19, 20, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 31, 32, 34, 35, 37 y 38. 3. El polinucleótido aislado acorde con las cláusulas 1 ó 2, CARACTERIZADO PORQUE se puede obtener de un hongo filamentoso. 4. El polinucleótido aislado acorde con la cláusula 3, CARACTERIZADO PORQUE se puede obtener de Aspergxllus niger. 5. Un polinucleótido aislado, CARACTERIZADO PORQUE codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo formado por las SEQ ID N° : 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36 y 39 o equivalentes funcionales de las mismas . 6. Un polinucleótido aislado, CARACTERIZADO PORQUE codifica al menos un dominio funcional de un polipéptido seleccionado del grupo formado por las SEQ ID N° : 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36 y 39 o equivalentes funcionales de las mismas . 7. Un polinucleótido aislado, CARACTERIZADO PORQUE comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo formado por las SEQ ID N°: 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 13, 14, 16, 17, 19, 20, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 31, 32, 34, 35, 37 y 38 o equivalentes funcionales de las mismas. 8. Un polinucleótido aislado, CARACTERIZADO PORQUE se selecciona del grupo formado por las SEQ ID N° : 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 13, 14, 16, 17, 19, 20, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 31, 32, 34, 35, 37 y 38. 9. Un vector, CARACTERIZADO PORQUE comprende una secuencia de polinucleótidos acorde con las cláusulas 1 a 8. 10. Un vector acorde con la cláusula 9, CARACTERIZADO PORQUE dicha secuencia de polinucleótidos acorde con las cláusulas 1 a 8 está ligada operativamente con secuencias reguladoras adecuadas para la expresión de dicha secuencia de polinucleótidos en una célula huésped adecuada. 11. El vector acorde con la cláusula 10, CARACTERIZADO PORQUE dicha célula huésped adecuada es un hongo filamentoso . 12. Un método para elaborar un polinucleótido acorde con las cláusulas 1 - 8 o un vector acorde con las cláusulas 9 a 11, CARACTERIZADO PORQUE comprende los pasos de cultivar una célula huésped transformada con dicho polinucleótido o dicho vector y aislar dicho polinucleótido o dicho vector de dicha célula huésped. 13. Una enzima lipolítica aislada, CARACTERIZADA PORQUE se selecciona del grupo formado por las SEQ ID Io: 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36 y 39 o equivalentes funcionales de las mismas . 14. La enzima lipolítica aislada acorde con la cláusula 13, CARACTERIZADA PORQUE se puede obtener de Aspergillus niger. 15. Una enzima lipolítica aislada, CARACTERIZADA PORQUE se puede obtener por expresión de un polinucleótido acorde con las cláusulas 1 a 8 o un vector acorde con las cláusulas 9 a 11 en una célula huésped apropiada, por ejemplo Aspergillus niger. 16. Una enzima lipolítica recombinante, CARACTERIZADA PORQUE comprende un dominio funcional de cualquiera de las enzimas lipolíticas acordes con las cláusulas 13-15. 17. El método para elaborar una enzima lipolítica acorde con las cláusulas 13 a 16, CARACTERIZADO PORQUE comprende los pasos de transformar una célula huésped adecuada con un polinucleótido aislado acorde con las cláusulas 1 a 8 o un vector acorde con las cláusulas 9 a 11, cultivar dicha célula bajo condiciones que permitan la expresión de dicho polinucleótido y, optativamente, purificar el polipéptido codificado a partir de dicha célula o medio de cultivo. 18. Una célula huésped recombinante , CARACTERIZADA PORQUE comprende un polinucleótido acorde con las cláusulas 1 a 8 o un vector acorde con las cláusulas 9 a 11. 19. Una célula huésped recombinante, CARACTERIZADA PORQUE expresa una enzima lipolítica acorde con las cláusulas 13 a 16. 20. Anticuerpos purificados, CARACTERIZADOS PORQUE son reactivos con la enzima lipolítica acorde con las cláusulas 13 a 16. 21. Una proteína de fusión, CARACTERIZADA PORQUE comprende una secuencia de la enzima lipolítica acorde con las cláusulas 13 a 16. 22. Un proceso para la producción de una masa, CARACTERIZADO PORQUE comprende la adición de una enzima lipolítica acorde con cualquiera de las cláusulas 13-16. 23. Un proceso para la producción de un producto horneado, CARACTERIZADO PORQUE comienza con una masa preparada por el proceso de la cláusula 22. 24. El uso de una enzima lipolítica acorde con cualquiera de las cláusulas 13-16, CARACTERIZADO PORQUE es para la preparación de una masa y/o de un producto horneado con la misma .