JP5118651B2 - 新規のリパーゼおよびその使用 - Google Patents

Description

発明の詳細な説明

［発明の分野］
本発明は、新規の脂肪分解酵素をコードする遺伝子を含む新規に同定されたポリヌクレオチド配列に関する。酵素は、マグナポルテ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓａｅ、イネいもち病菌）から単離することができる。本発明は、新規の遺伝子の全長コード配列、および全長機能性タンパク質のアミノ酸配列、ならびにこの遺伝子またはアミノ酸配列の機能性等価物を特徴とする。また本発明は、工業的過程において、例えばベーキング工業においてこれらのタンパク質を使用する方法にも関する。また、これらのタンパク質および細胞を産生するのに適した本発明に従うポリヌクレオチドで形質転換された細胞も本発明に含まれ、本発明に従うタンパク質は、その活性および／または発現レベルを増強または低減するために遺伝子改変されている。

［発明の背景］
生地（ｄｏｕｇｈ）の取扱い特性および／または焼成製品の最終特性を改善するために、改善特性を有する加工助剤を開発する絶え間ない努力が行われている。加工助剤は、本明細書では、生地の取扱い特性および／または焼成製品の最終特性を改善する化合物と定義される。改善され得る生地の特性には、安定性、機械加工性、気体保持能力、低減した気泡形成（ｂｌｉｓｔｅｒｉｎｇ）、低減した粘着性、弾力性、伸展性、成形性などが含まれる。改善され得る焼成製品の特性には、ローフ体積、クラストのクリスピー性、クラム組織、クラム構造、クラム柔軟性、風味、相対老化および貯蔵期間が含まれる。これらの生地および／または焼成製品を改善する加工助剤は、化学添加剤および酵素（ベーキング酵素（ｂａｋｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ）とも称される）の２つのグループに分けることができる。

改善特性を有する化学添加剤には、アスコルビン酸、ブロメートおよびアゾジカルボネートなどの酸化剤、Ｌ−システインおよびグルタチオンなどの還元剤、モノ／ジグリセリドのジアセチル酒石酸エステル（ＤＡＴＥＭ）、ステアロイルラクチル酸ナトリウム（ＳＳＬ）またはステアロイルラクチル酸カルシウム（ＣＳＬ）などの生地調整剤の役割を果たす乳化剤、またはモノステアリン酸グリセロール（ＧＭＳ）などのクラム柔軟剤の役割を果たす乳化剤、トリグリセリド（脂肪）またはレシチンなどの脂肪材料などが含まれる。

化学添加剤の代わりにより天然の製品を用いることに対する消費者による要求の結果として、生地および／または焼成製品を改善する特性を有し、特定のベーキング用途の条件に応じて全ての可能な組み合わせにおいて使用されるいくつかのベーキング酵素が開発されてきた。

ベーキング工業において適用される乳化剤は、クラム軟化剤あるいは生地強化剤に大別することができる。蒸留モノグリセリドは、主に、クラム軟化のために使用される。モノグリセリドとデンプンとの複合体の形成によって、デンプンの完全な再結晶が防止され、その結果初期のクラム柔軟性が得られ、および／または焼成製品の貯蔵期間中にクラムの堅くなる速度が低下する。生地強化のためには、ＤＡＴＥＭ、ＣＳＬおよびＳＳＬなどの極性脂質の数個の異なる合成類似体が適用される。製パンにおけるこれらの効果は、生地の安定性を改善し、ローフ体積を増大させ、そして微細で均一なクラム構造を生じさせることである。この後者の態様に関して、これらの乳化剤が適用される場合にはクラムの軟化も生じることに注意すべきである。また、生地の粘着性の低下、生地の機械加工性の改善、焼成製品のローフ体積の増大、クラム構造の改善、クラム柔軟性の改善、クラストのクリスピー性の改善を得ることができる。

乳化剤は、その極性および無極性部分のために、油−水および気体−水の界面に濃縮することができる。製パンにおいて、気泡（ｇａｓ ｃｅｌｌ）は最初にグルテン−デンプンマトリックス内に封入されるが、発酵中に気泡は体積が増大し、気泡の間の界面には表面活性材料の液膜だけが含まれる。小麦粉の内在性の極性脂質は、これらの液膜および添加された乳化剤中に存在する。ジアシルグリセロールから製造されるレシチンまたはＤＡＴＥＭなどの極性ジアシルグリセロールは、そのモノアシルグリセロール対応物と比較したときに、製パンにおいて限られた効果しかないことが知られている。

例えば、Ｌ．クリスティアンセン（Ｃｈｉｒｓｔｉａｎｓｅｎ）らによってＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｔｈｉｒｄ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｅｎｚｙｍｅｓ ｉｎ Ｇｒａｉｎ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ、２５−２７ ２００２年９月、２６９−２７４頁に開示されているように、ＤＡＴＥＭ代替物として特定の脂肪分解酵素を使用できることは当該技術分野において知られている。

脂肪分解酵素は、脂質基質におけるエステル結合の加水分解を触媒する酵素である。脂肪分解酵素は、グリセリド（例えば、トリグリセリド）からリン脂質、スフィンゴ脂質（ｓｐｈｉｎｇｏｐｌｉｐｉｄ）またはガラクト脂質などの糖脂質に及ぶいくつかの種類の脂質に作用することができる。

グリセリドは、グリセロールおよび脂肪酸のエステルである。トリグリセリド（トリアシルグリセロールまたはトリアシルグリセリドとしても知られている）は、大部分は植物油および動物性脂肪中に存在する。リパーゼ（ＥＣ３．１．１．３）は、本明細書では、脂質からの脂肪酸のうちの１つまたは複数を加水分解する酵素と定義され、より具体的には、これらは脂肪酸とグリセロールのヒドロキシル基との間のエステル結合を加水分解する。

ガラクト脂質は外側（ｓｎ−１）および中央（ｓｎ−２）位置に２つのエステル化脂肪酸を有するグリセロール骨格からなるが、第３のヒドロキシル基は、例えばモノガラクトシル（ｍｏｎｏｇａｌａｃｏｓｙｌ）ジグリセリドまたはジガラクトシルジグリセリドのようにガラクトースなどの糖残基に結合されている。ガラクトリパーゼ（ＥＣ３．１．１．２６）は、ガラクトシルジグリセリドからのそれぞれｓｎ−１およびｓｎ−２位置の一方または両方の脂肪族アシル基の加水分解を触媒する。

リン脂質は外側（ｓｎ−１）および中央（ｓｎ−２）位置に２つのエステル化脂肪酸を有するグリセロール骨格からなるが、グリセロールの第３のヒドロキシル基はリン酸でエステル化されている。リン酸は次に、例えば、エタノールアミン（ホスファチジルエタノールアミン）、コリン（ホスファチジルコリン）のようなアミノアルコールにエステル化され得る。ホスホリパーゼは、本明細書では、リン脂質内の１つまたは複数の結合の加水分解に関与する酵素と定義される。

脂肪分解酵素は、作用を与える基質に応じて、例えばリパーゼ、ガラクトリパーゼおよびホスホリパーゼ（例えば、ホスホリパーゼＡ１、Ａ２およびリゾホスホリパーゼなど）を含む。

パンの製造においてＤＡＴＥＭ、ＣＳＬおよびＳＳＬなどの化学乳化剤の代替物として使用することができる改善された脂肪分解酵素が絶えず必要とされている。

［発明の目的］
本発明の目的は、化学乳化剤の酵素代用品として使用するのに適した新規の脂肪分解酵素を提供することである。さらに、本発明の目的は、新規の脂肪分解酵素をコードする新規のポリヌクレオチドを提供することである。更なる目的は、天然および組換えで産生された脂肪分解酵素ならびにこれらを産生する組換え菌株を提供することである。また、融合ポリペプチドも、本発明に従うポリヌクレオチドおよびポリペプチドの製造および使用方法と同様に本発明の一部である。

［発明の概要］
本発明は、化学乳化剤の酵素代用品として使用するのに適した新規の脂肪分解酵素を提供する。意外にも、新規の脂肪分解酵素は、生地の中で使用したときに酵素がその場で以下の特性のうちの少なくとも１つを有するので、化学乳化剤の代用品として使用するために極めて適切である。
・ 無極性脂質に対する比較的低い活性
・ 極性ジアシル−脂質、少なくともジアシルガラクト脂質に対する比較的高い活性
・ 極性モノアシル化合物に対する比較的低い活性

例えば、本発明に従う酵素は、その場で、比較的低いリゾホスホリパーゼ活性および比較的低いリパーゼ活性を示すことができる。これらの予想外の特性は全て、生地の中で化学乳化剤の代替物として使用するときに有利であることが分かった。

新規の脂肪分解酵素は、本明細書において使用される場合、増大した生地の強度、増大した生地の弾力性、増大した生地の安定性、低減した生地の粘着性、改善された生地の伸展性、改善された生地の機械加工性、増大した焼成製品の体積、改善された焼成製品のクラム構造、低減した焼成製品の気泡形成、改善された焼成製品の柔軟性、改善された焼成製品の老化防止（ａｎｔｉ−ｓｔａｌｉｎｇ）、改善された焼成製品のクラストの群から選択される１つまたは複数の改善された生地および／または焼成製品の特性をもたらすか、あるいは広範な基質特異性を有する。

本発明はさらに、新規の脂肪分解酵素をコードする新規のポリヌクレオチドを提供する。

特に、本発明は、好ましくは高ストリンジェント条件下で、配列番号２、配列番号３または配列番号４（以下、「配列番号２〜４」と称する）のいずれか１つに従う配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを提供する。その結果として、本発明は、配列番号２、配列番号３または配列番号４に従う配列に対して少なくとも８５％、好ましくは少なくとも８８％、より好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％相同である核酸を提供する。

１つの実施形態では、本発明は、糸状菌から得られるこのような単離ポリヌクレオチドを提供し、特にマグナポルテ（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）が好ましく、さらにより好ましくはマグナポルテ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓａｅ）である。

さらなる実施形態では、このような単離ポリヌクレオチドは、当業者に知られている方法によって合成で得ることができる。

さらにもう１つの実施形態では、本発明は、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４（以下、「配列番号５〜１４」と称する）において示されるようなアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはこれらのいずれかの機能性等価物をコードする核酸配列を含む単離ポリヌクレオチドを提供する。

さらなる実施形態では、本発明は、配列番号５〜１４のいずれか１つに従うポリペプチドまたはこれらの機能性等価物の少なくとも１つの機能性ドメインをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。

もう１つの実施形態では、本発明は、配列番号２〜４のいずれか１つに従う脂肪分解酵素遺伝子、あるいは活性酵素をまだコードしているその変異形または断片を提供する。

本発明は、本発明に従うポリヌクレオチド配列を含むベクター、ならびに本発明に従うＤＮＡを増幅または検出するために使用することができるプライマー、プローブおよび断片にも関する。

さらに好ましい実施形態では、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、より具体的にはアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、クロコウジカビ）、アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）またはアスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）などの適切な宿主細胞においてコード化アミノ酸配列を発現させるのに適した少なくとも１つの制御配列に、本発明に従うポリヌクレオチド配列が機能性に連結されているベクターが提供される。好ましくは、宿主細胞はアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）である。また本発明は、本発明に従うポリヌクレオチドおよびベクターを調製するための方法も提供する。

また本発明は、本発明に従う異種または相同ポリヌクレオチドを含有する組換えで産生された宿主細胞にも関する。

もう１つの実施形態では、本発明は、本発明に従う脂肪分解酵素の発現が著しく増大されるか、あるいは脂肪分解酵素の活性が増大された組換え宿主細胞を提供する。

もう１つの実施形態では、本発明は、本発明に従う異種または相同ＤＮＡを含有する組換えで産生された宿主細胞を提供し、この細胞は本発明に従う機能性脂肪分解酵素を産生することができ、好ましくは、本発明に従う脂肪分解酵素を過剰発現することができる細胞、例えば、本発明に従う遺伝子の増大したコピー数を含むアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）株である。

本発明のさらにもう１つの態様では、精製ポリペプチドが提供される。本発明に従うポリペプチドは、本発明に従うポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチドを含む。特に好ましいのは、配列番号５〜１４のいずれか１つに従うポリペプチドまたはこれらのいずれかの機能性等価物である。

本発明に従うポリペプチドを含む融合タンパク質も本発明の範囲内である。本発明は、本発明に従うポリペプチドの製造方法も提供する。

また本発明は、本発明に従う脂肪分解酵素の、本明細書において記載されるような工業的過程における使用にも関する。

［発明の詳細な説明］
［ポリヌクレオチド］
１つの実施形態では、本発明は、配列番号５、配列番号６、配列番号７（以下、「配列番号５〜７」と称する）のいずれか１つに従うアミノ酸配列を有し、暫定的にＬＩＰ０１と呼ばれる脂肪分解酵素をコードするポリヌクレオチドまたはこれらのいずれかの機能性等価物を提供する。もう１つの実施形態では、本発明は、配列番号８、配列番号９（以下、「配列番号８〜９」と称する）のいずれか１つに従うアミノ酸配列を有し、暫定的にＬＩＰ０２と呼ばれる脂肪分解酵素をコードするポリヌクレオチド、またはこれらのいずれかの機能性等価物を提供する。さらなる実施形態では、本発明は、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４（以下、「配列番号１０〜１４」と称する）のいずれか１つに従うアミノ酸配列を有し、暫定的にＬＩＰ０３と呼ばれる脂肪分解酵素をコードするポリヌクレオチド、またはこれらのいずれかの機能性等価物を提供する。

ＬＩＰ０１をコードする遺伝子の配列は、配列番号１に従うマグナポルテ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓａｅ）から得られたゲノムクローンを配列決定することによって決定した。ＬＩＰ０２およびＬＩＰ０３をコードする遺伝子の配列は、配列番号１に従うマグナポルテ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓａｅ）から得られたゲノムクローンを変異させることによって得た。ＬＩＰ０２は、ＬＩＰ０１に関する点変異で構成される。本発明は、ＬＩＰ０１〜ＬＩＰ０３脂肪分解酵素をコードする遺伝子およびそのコード配列を含むポリヌクレオチド配列を提供する。従って、本発明は、配列番号２〜４のいずれか１つに従うヌクレオチド配列またはその機能性等価物を含む単離ポリヌクレオチドに関する。

特に、本発明は、ストリンジェント条件下、好ましくは高ストリンジェント条件下で配列番号２〜４に従うポリヌクレオチドとハイブリダイズすることができる単離ポリヌクレオチドに関する。

有利に、このような単離ポリヌクレオチドは、糸状菌、特にマグナポルテ（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）、例えばグリセア（ｇｒｉｓａｅ）、オリゼー（ｏｒｙｚａｅ）、ポア（ｐｏａｅ）、リゾフィラ（ｒｈｉｚｏｐｈｉｌａ）、サルビニー（ｓａｌｖｉｎｉｉ）などのマグナポルテ科（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈａｃｅａｅ）、好ましくはマグナポルテ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓａｅ）から得ることができる。さらに具体的には、本発明は、配列番号２に従うヌクレオチド配列を有する単離ポリヌクレオチドに関する。

本発明に従うもう１つの実施形態では、本発明は、ストリンジェント条件下、好ましくは高ストリンジェント条件下で配列番号３または配列番号４に従うポリヌクレオチドとハイブリダイズすることができる単離ポリヌクレオチドに関する。このような単離ポリヌクレオチドは、当業者に知られている方法により合成で得ることもできる。さらにより有利に、このような単離ポリヌクレオチドは、糸状菌、特にマグナポルテ（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）、例えばグリセア（ｇｒｉｓａｅ）、オリゼー（ｏｒｙｚａｅ）、ポア（ｐｏａｅ）、リゾフィラ（ｒｈｉｚｏｐｈｉｌａ）、サルビニー（ｓａｌｖｉｎｉｉ）などのマグナポルテ科（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈａｃｅａｅ）、好ましくはマグナポルテ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓａｅ）から得られるポリヌクレオチド、そして最も好ましくは配列番号１または配列番号２に従うヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを変異させることによって得ることもできる。

また本発明は、配列番号５〜１４のいずれか１つに従うポリペプチドまたはこれらのいずれかの機能性等価物の少なくとも１つの機能性ドメインをコードする単離ポリヌクレオチドにも関する。

本明細書において使用される場合、「遺伝子」および「組換え遺伝子」という用語は、染色体ＤＮＡから単離され得る核酸分子を指し、タンパク質、例えばマグナポルテ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓａｅ）脂肪分解酵素をコードするオープンリーディングフレームが含まれる。遺伝子は、コード配列、非コード配列、イントロンおよび制御配列を含むことができる。さらに、遺伝子は、本明細書において定義される単離核酸分子を指す。

配列番号２〜４のいずれか１つのヌクレオチド配列またはその機能性等価物を有する核酸分子などの本発明の核酸分子は、標準的な分子生物学技法、および本明細書において提供される配列情報を用いて単離することができる。例えば、配列番号２〜４のいずれか１つの核酸配列の全てまたは一部をハイブリダイゼーションプローブとして用いると、本発明に従う核酸分子は、標準的なハイブリダイゼーションおよびクローニング技法を用いて単離することができる（例えば、Ｊ．サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）、Ｅ．Ｆ．フリッチェ（Ｆｒｉｔｓｈ）、およびＴ．マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）、分子クローニング、実験室マニュアル、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ニューヨーク、１９８９年に開示される）。

さらに、配列番号２〜４のいずれか１つの全てまたは一部を包含する核酸分子は、配列番号２〜４のいずれか１つに含有される配列情報に基づいて設計された合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって単離することができる。

本発明の核酸は、テンプレートとしてｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、あるいはゲノムＤＮＡ、そして適切なオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、標準ＰＣＲ増幅技法に従って増幅することができる。そのようにして増幅された核酸は、適切なベクター中にクローン化してＤＮＡ配列解析によって特徴付けることができる。

さらに、本発明に従うヌクレオチド配列に相当するオリゴヌクレオチド、あるいは本発明に従うヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドは、標準合成技法によって、例えば自動ＤＮＡ合成機を用いて調製することができる。

好ましい実施形態では、本発明の単離核酸分子は、配列番号２〜４のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を含む。配列番号２の配列は、配列番号１に従うゲノムＤＮＡに基づく脂肪分解酵素ｃＤＮＡのコード領域に相当する。このｃＤＮＡは、配列番号５〜７のいずれか１つに従うマグナポルテ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓａｅ）ＬＩＰ０１をコードする配列を含む。

もう１つの好ましい実施形態では、本発明の単離核酸分子は、配列番号２〜４に示されるヌクレオチド配列の補体またはこれらのヌクレオチド配列の機能性等価物である核酸分子を含む。

他のヌクレオチド配列に相補的な核酸分子は、他のヌクレオチド配列とハイブリダイズし、それにより安定な二重鎖を形成することができるように他のヌクレオチド配列に対して十分に相補的なものである。

本発明の１つの態様は、本発明のポリペプチドあるいは生物学的に活性な断片またはドメインなどのその機能性等価物をコードする単離核酸分子、ならびに本発明のポリペプチドをコードする核酸分子を同定するためにハイブリダイゼーションプローブとしての使用に十分な核酸分子、そして核酸分子の増幅または変異のためのＰＣＲプライマーとしての使用に適したこのような核酸分子の断片に関する。

「単離ポリヌクレオチド」または「単離核酸」は、それが由来する生物体の天然に存在するゲノムにおいて直接隣接するコード配列（５’端部に１つ、そして３’端部に１つ）の両方と直接隣接しないＤＮＡまたはＲＮＡである。従って、１つの実施形態では、単離核酸は、コード配列に直接隣接する５’非コード（例えば、プロモーター）配列のいくつかまたは全てを含む。そのためこの用語は、例えば、ベクター内、自己複製プラスミドまたはウィルス内、あるいは原核生物または真核生物のゲノムＤＮＡ内に取り込まれた組換えＤＮＡ、あるいは他の配列とは独立して別個の分子（例えば、ＰＣＲまたは制限エンドヌクレアーゼ処理によって産生されたｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ断片）として存在する組換えＤＮＡを含む。細胞材料、ウィルス材料、または培地（組換えＤＮＡ技法により産生される場合）、あるいは化学前駆体または他の化学物質（化学合成される場合）を実質的に含まない追加のポリペプチドをコードするハイブリッド遺伝子の一部である組換えＤＮＡも含まれる。さらに、「単離核酸断片」は、断片として天然に存在せず、自然な状態では見出され得ない核酸断片である。

本明細書において使用される場合、「ポリヌクレオチド」または「核酸分子」という用語は、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）およびＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）ならびにヌクレオチド類似体を用いて生成されたＤＮＡまたはＲＮＡの類似体を含むことが意図される。核酸分子は一本鎖でも二本鎖でもよいが、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。核酸は、オリゴヌクレオチド類似体または誘導体（例えば、イノシンまたはホスホロチオエートヌクレオチド）を用いて合成することができる。このようなオリゴヌクレオチドを用いて、例えば、塩基対形成能力が変更されるかあるいはヌクレアーゼ耐性が増大された核酸を調製することができる。

本発明のもう１つの実施形態は、ＬＩＰ０１〜ＬＩＰ０３核酸分子、例えばＬＩＰ０１〜ＬＩＰ０３核酸分子のコード鎖に対してアンチセンスである単離核酸分子を提供する。また、本明細書に記載される核酸分子の補体鎖も本発明の範囲内に含まれる。

［配列決定エラー］
本明細書において提供される配列情報は、誤って同定された塩基の包含が要求されるように、あまり狭義に解釈されてはならない。本明細書で開示される特定の配列を容易に使用して、糸状菌、特にマグナポルテ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓａｅ）から完全遺伝子を単離することができ、これは次に、さらなる配列解析を容易に受けることができ、それにより配列決定エラーが同定される。

他に指示されない限り、本明細書においてＤＮＡ分子を配列決定することによって決定された全てのヌクレオチド配列は自動ＤＮＡ配列決定装置を用いて決定したものであり、本明細書において決定されたＤＮＡ分子によってコードされるポリペプチドの全てのアミノ酸配列は、上記のように決定されたＤＮＡ配列の翻訳によって予測したものである。従って、この自動アプローチにより決定されるＤＮＡ配列について当該技術分野において知られているように、本明細書において決定されたヌクレオチド配列はどれもいくらかのエラーを含有し得る。自動で決定されたヌクレオチド配列は、一般には、配列決定されるＤＮＡ分子の実際のヌクレオチド配列と少なくとも約９０％同一であり、より一般的には少なくとも約９５％〜少なくとも約９９．９％同一である。実際の配列は、当該技術分野においてよく知られている手動ＤＮＡ配列決定法を含む他のアプローチによってより正確に決定することができる。当該技術分野において同様に知られているように、実際の配列と比較して、決定されたヌクレオチド配列における単一の挿入または欠失はヌクレオチド配列の翻訳におけるフレームシフトを引き起こすので、決定されたヌクレオチド配列によりコードされる予測アミノ酸配列は、このような挿入または欠失点から始まって、配列決定されたＤＮＡ分子によって実際にコードされるアミノ酸配列とは完全に異なるであろう。

当業者はこのように誤って同定された塩基を同定することができ、このようなエラーを補正する方法が分かる。

［核酸断片、プローブおよびプライマー］
本発明に従う核酸分子は、配列番号２〜４のいずれか１つに従う核酸配列の一部だけまたは断片、例えばプローブまたはプライマーとして使用することができる断片、あるいはＬＩＰ０１〜ＬＩＰ０３タンパク質の一部をコードする断片を含み得る。ＬＩＰ０１〜ＬＩＰ０３遺伝子およびｃＤＮＡのクローニングから決定されたヌクレオチド配列は、他のＬＩＰ０１〜ＬＩＰ０３ファミリーメンバー、および他の種からのＬＩＰ０１〜ＬＩＰ０３相同体の同定および／またはクローニングにおいて使用するために設計されたプローブおよびプライマーの生成を可能にする。プローブ／プライマーは通常実質的に精製されたオリゴヌクレオチドを含み、これは通常、好ましくは高ストリンジェント条件下で、配列番号２〜４のいずれか１つに従うヌクレオチド配列またはその機能性等価物の少なくとも約１２または１５、好ましくは約１８または２０、好ましくは約２２または２５、より好ましくは約３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、または７５あるいはそれ以上の連続したヌクレオチドとハイブリダイズするヌクレオチド配列の領域を含む。

ＬＩＰ０１〜ＬＩＰ０３ヌクレオチド配列に基づくプローブを用いて、例えば他の生物体において同一または相同のタンパク質をコードする転写物またはゲノムＬＩＰ０１〜ＬＩＰ０３配列を検出することができる。好ましい実施形態では、プローブはこれに付着した標識基をさらに含み、例えば、標識基は放射性同位体、蛍光化合物、酵素、または酵素補因子であり得る。このようなプローブは、ＬＩＰ０１〜ＬＩＰ０３タンパク質を発現する細胞を同定するための診断テストキットの一部として使用することもできる。

［同一性および相同性］
「相同性」または「％同一性」という用語は、本明細書では同義的に使用される。本発明の目的では、２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列の％同一性を決定するために、最適な比較を目的として配列が整列されると本明細書では定義される（例えば、第２のアミノ酸または核酸配列との最適なアライメントのために、第１のアミノ酸または核酸配列の配列内にギャップが導入され得る）。対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置におけるアミノ酸残基またはヌクレオチドが次に比較される。第１の配列における位置が、第２の配列における対応の位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドによって占有される場合、分子はその位置において同一である。２つの配列間の％同一性は、配列により共有される同一位置の数の関数である（すなわち、％同一性＝同一位置の数／位置の総数（すなわち、重複位置）×１００）。好ましくは、２つの配列は同じ長さである。

当業者は、２つの配列間の相同性を決定するためにいくつかの異なるコンピュータプログラムが利用可能であるという事実を知っているであろう。例えば、２つの配列間の配列の比較および％同一性の決定は、数学アルゴリズムを用いて達成することができる。好ましい実施形態では、２つのアミノ酸配列間の％同一性は、Ａｃｃｅｌｒｙｓ ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｃｃｅｌｒｙｓ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｇｃｇ／で入手可能）のＧＡＰプログラムに組み込まれたニードルマン（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ）およびブンシュ（Ｗｕｎｓｃｈ）（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（４８）４４４−４５３頁（１９７０年））アルゴリズムを使用し、Ｂｌｏｓｓｏｍ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスのいずれか、ならびに１６、１４、１２、１０、８、６、または４のギャップ重量および１、２、３、４、５、または６の長さ重量を用いて決定される。当業者は、これらの全ての異なるパラメータはわずかに異なる結果をもたらし得るが、異なるアルゴリズムを用いたときに、２つの配列の全体の％同一性はあまり変化しないことを認識するであろう。

さらにもう１つの実施形態では、２つのヌクレオチド配列間の％同一性は、Ａｃｃｅｌｒｙｓ ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｃｃｅｌｒｙｓ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｇｃｇ／で入手可能）のＧＡＰプログラムを使用し、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックス、ならびに４０、５０、６０、７０、または８０のギャップ重量および１、２、３、４、５、または６の長さ重量を用いて決定される。もう１つの実施形態では、２つのアミノ酸またはヌクレオチド配列間の％同一性は、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）（ＧｅｎｅｓｔｒｅａｍサーバーＩＧＨ Ｍｏｎｔｐｅｌｌｅｒ Ｆｒａｎｃｅ ｈｔｔｐ：／／ｖｅｇａ．ｉｇｈ．ｃｎｒｓ．ｆｒ／ｂｉｎ／ａｌｉｇｎ−ｇｕｅｓｓ．ｃｇｉの配列データを用いてＡＬＩＧＮ Ｑｕｅｒｙで入手可能）に組み込まれたＥ．マイヤーズ（Ｍｅｙｅｒｓ）およびＷ．ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）のアルゴリズム（ＣＡＢＩＯＳ、４：１１−１７（１９８９年）を使用し、ＰＡＭ１２０重量残基表（ｗｅｉｇｈｔ ｒｅｓｉｄｕｅ ｔａｂｌｅ）、１２のギャップ長ペナルティおよび４のギャップペナルティを用いて決定される。

本発明の核酸およびタンパク質配列はさらに「問い合わせ配列」として使用して、公共データベースに対する検索を実行し、例えば他のファミリーメンバーまたは関連配列を同定することができる。このような検索は、アルトシュール（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら（１９９０年）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０頁のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を用いて実行することができる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索はＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２を用いて実行することができ、本発明のＬＩＰ０１〜ＬＩＰ０３核酸分子に相同であるヌクレオチド配列が得られる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３を用いて実施することができ、本発明のＬＩＰ０１〜ＬＩＰ０３タンパク質分子に相同であるアミノ酸配列が得られる。アルトシュール（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら、（１９９７年）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５（１７）：３３８９−３４０２頁に記載されるように、比較のためのギャップ化アライメントを得るためにギャップ化ＢＬＡＳＴを用いることができる。ＢＬＡＳＴおよびギャップ化ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合、それぞれのプログラムのデフォルトパラメータ（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）を使用することができる。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／の国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のホームページを参照されたい。

［ハイブリダイゼーション］
本明細書において使用される場合、「ハイブリダイズする」という用語は、互いに少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約８５％、さらにより好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも９５％相同であるヌクレオチド配列が通常互いにハイブリダイズされたままであるようなハイブリダイゼーションおよび洗浄のための条件を記述することが意図される。

このようなハイブリダイゼーション条件の好ましい非限定的な例は、約４５℃における６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中でのハイブリダイゼーション、それに続く５０℃、好ましくは５５℃、好ましくは６０℃、さらにより好ましくは６５℃における１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中での１回または複数回の洗浄である。

高ストリンジェント条件には、例えば、５×ＳＳＣ／５×デンハート液／１．０％ＳＤＳ中での６８℃におけるハイブリダイゼーション、そして室温における０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中での洗浄が含まれる。あるいは、洗浄は４２℃で実行されてもよい。

当業者は、ストリンジェントおよび高ストリンジェントのハイブリダイゼーション条件のために適用する条件が分かるであろう。このような条件に関する更なるガイダンスは、例えばサムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、１９８９年、分子クローニング、実験室マニュアル、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、およびオースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら（編）、１９９５年、分子生物学におけるカレント・プロトコル（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ニューヨーク）において、当該技術分野で容易に入手することができる。

当然ながら、ポリＡ配列（ｍＲＮＡの３’末端ポリ（Ａ）領域など）またはＴ（またはＵ）残基の相補的なストレッチのみとハイブリダイズするポリヌクレオチドは、本発明の核酸の一部と特異的にハイブリダイズさせるために使用される本発明のポリヌクレオチドには含まれないであろう。何故なら、このようなポリヌクレオチドは、ポリ（Ａ）ストレッチを含有する任意の核酸分子またはその補体（例えば、実際には任意の二本鎖ｃＤＮＡクローン）とハイブリダイズし得るからである。

［他の生物体からの全長ＤＮＡの取得］
典型的なアプローチにおいて、他の生物体、例えば糸状菌、特にマグナポルテ（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）種から構築されたｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることができる。

例えば、マグナポルテ（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）株は、ノーザンブロット分析により相同のＬＩＰ０１〜ＬＩＰ０３ポリヌクレオチドについてスクリーニングすることができる。本発明に従うポリヌクレオチドに相同の転写物が検出されたら、当業者に良く知られている標準技法を用いて、適切な菌株から単離されたＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを構築することができる。あるいは、全ゲノムＤＮＡライブラリーを、本発明に従うＬＩＰ０１〜ＬＩＰ０３ポリヌクレオチドとハイブリダイズ可能なプローブを用いてスクリーニングすることもできる。

相同の遺伝子配列は、例えば、本明細書において教示されるヌクレオチド配列に基づいて設計された２つの縮重オリゴヌクレオチドプライマープールを用いてＰＣＲを実行することによって単離することができる。

反応のためのテンプレートは、本発明に従うポリヌクレオチドを発現することが分かっているかまたは推測される菌株から調製されるｍＲＮＡの逆転写によって得られるｃＤＮＡであり得る。ＰＣＲ産物をサブクローニングおよび配列決定して、増幅された配列が新しいＬＩＰ０１〜ＬＩＰ０３核酸配列またはその機能性等価物の配列を表すことを保証することができる。

次にＰＣＲ断片を使用して、様々な既知の方法によって全長ｃＤＮＡクローンを単離することができる。例えば、増幅された断片は標識化され、バクテリオファージまたはコスミドｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために使用することができる。あるいは、標識断片は、ゲノムライブラリーをスクリーニングするために使用することができる。

またＰＣＲ技法は、他の生物体から全長ｃＤＮＡ配列を単離するために使用することもできる。例えば、ＲＮＡは、標準手順に従って適切な細胞または組織源から単離することができる。第１の鎖の合成の予備刺激のために、増幅断片の５’最端部に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ＲＮＡにおいて逆転写反応を実行することができる。

次に、得られたＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを、標準末端トランスフェラーゼ反応を用いて「テーリング」する（例えば、グアニンによる）ことができ、リボヌクレアーゼＨによりハイブリッドを消化し、そして第２の鎖の合成を予備刺激する（例えば、ポリ−Ｃプライマーによる）ことができる。従って、増幅断片の上流のｃＤＮＡ配列は、容易に単離することができる。有用なクローニング戦略の概説としては、例えば、上記のサムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、および上記のオースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）らを参照されたい。

［ベクター］
本発明のもう１つの態様は、ＬＩＰ０１〜ＬＩＰ０３タンパク質またはその機能性等価物をコードする核酸を含有するベクター、好ましくは発現ベクターに関する。本明細書において使用される場合、「ベクター」という用語は、そこに連結された別の核酸を輸送することができる核酸分子を指す。１つのタイプのベクターは「プラスミド」であり、プラスミドは、さらなるＤＮＡセグメントが連結され得る環状二本鎖ＤＮＡループを指す。もう１つのタイプのベクターはウィルスベクターであり、ウィルスゲノム内にはさらなるＤＮＡセグメントが連結され得る。特定のベクターは、導入された宿主細胞内で自律的に複製することができる（例えば、細菌の複製開始点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳類ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳類ベクター）は、宿主細胞への導入の際に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それによって宿主ゲノムと一緒に複製される。さらに、特定のベクターは、作動可能に連結された遺伝子の発現を指示することができる。このようなベクターは、本明細書では「発現ベクター」と称される。一般に、組換えＤＮＡ技法において有用な発現ベクターはプラスミドの形態であることが多い。プラスミドはベクターの最も一般に使用される形態なので、「プラスミド」および「ベクター」という用語は、本明細書では同義的に使用することができる。しかしながら、本発明は、等価の機能を果たすウィルスベクター（例えば、複製欠損レトロウィルス、アデノウィルスおよびアデノ関連ウィルス）などの他の形態の発現ベクターも含むことが意図される。

本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞における核酸の発現に適切な形態の本発明の核酸を含み、これは、組換え発現ベクターが、発現すべき核酸配列に作動可能に連結されて発現に使用すべき宿主細胞に基づいて選択される１つまたは複数の制御配列を含むことを意味する。組換え発現ベクター内で、「作動可能に連結された」とは、対象とするヌクレオチド配列が、このヌクレオチド配列の発現（例えば、インビトロ転写／翻訳系において、あるいはベクターが宿主細胞内に導入される場合には宿主細胞において）を可能にするような形で制御配列に連結されることを意味するものである。「制御配列」という用語は、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御要素（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むことが意図される。このような制御配列は、例えば、ゴーデル（Ｇｏｅｄｄｅｌ）、Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、カリフォルニア州サンディエゴ（１９９０年）において記載されている。制御配列には、多くのタイプの宿主細胞においてヌクレオチド配列の恒常的発現を指示するもの、そして特定の宿主細胞のみにおいてヌクレオチド配列の発現指示するもの（例えば、組織特異的制御配列）が含まれる。発現ベクターの設計が形質転換すべき宿主細胞の選択、所望されるタンパク質の発現レベルなどの因子に依存し得ることは、当業者によって認識されるであろう。本発明の発現ベクターを宿主細胞内に導入し、それによって本明細書に記載される核酸によってコードされるタンパク質またはペプチド（例えば、ＬＩＰ０１〜ＬＩＰ０３タンパク質、ＬＩＰ０１〜ＬＩＰ０３タンパク質の変異形態、これらの断片、変異形または機能性等価物、融合タンパク質など）を産生することができる。

本発明の組換え発現ベクターは、原核細胞のまたは真核細胞におけるＬＩＰ０１〜ＬＩＰ０３タンパク質の発現のために設計することができる。例えば、ＬＩＰ０１〜ＬＩＰ０３タンパク質は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの細菌細胞、昆虫細胞（バキュロウィルス発現ベクターを用いる）、酵母細胞または哺乳類細胞において発現させることができる。適切な宿主細胞は、ゴーデル（Ｇｏｅｄｄｅｌ）、Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、カリフォルニア州サンディエゴ（１９９０年）においてさらに議論されている。あるいは、組換え発現ベクターは、例えばＴ７プロモーター制御配列およびＴ７ポリメラーゼを用いて、インビトロで転写および翻訳することができる。

本発明において有用な発現ベクターには、染色体、エピソームおよびウィルス由来のベクターが含まれ、例えば、細菌プラスミド、バクテリオファージ、酵母エピソーム、酵母染色体要素、ウィルス（例えば、バキュロウィルス、パポバウィルス、ワクシニアウィルス、アデノウィルス、鶏痘ウィルス、仮性狂犬病ウィルスおよびレトロウィルスなど）に由来するベクター、ならびにプラスミドおよびバクテリオファージ遺伝要素（コスミドおよびファージミドなど）に由来するベクターなどのこれらの組み合わせに由来するベクターが含まれる。

ＤＮＡ挿入片は、数例を挙げると、ファージλＰＬプロモーター、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｌａｃ、ｔｒｐおよびｔａｃプロモーター、ＳＶ４０初期および後期プロモーター、ならびにレトロウィルスＬＴＲのプロモーターなどの適切なプロモーターに作動可能に連結されなければならない。その他の適切なプロモーターは当業者には分かるであろう。特定の実施形態では、糸状菌において脂肪分解酵素の高発現レベルを指示することができるプロモーターが好ましい。このようなプロモーターは当該技術分野において知られている。発現構築物は、転写開始、終了のための部位を含有し、そして転写領域には翻訳のためのリボソーム結合部位を含有することができる。構築物によって発現される成熟転写物のコード部分は、最初の翻訳開始ＡＵＧと、翻訳すべきポリペプチドの端部に適切に配置された終止コドンとを含むであろう。

ベクターＤＮＡは、従来の形質転換またはトランスフェクション技法によって原核細胞または真核細胞内に導入することができる。本明細書において使用される場合、「形質転換」および「トランスフェクション」という用語は、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈（ｃｏ−ｐｅｒｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、形質導入、感染、リポフェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクションまたはエレクトロポレーションを含む、外来性の核酸（例えば、ＤＮＡ）を宿主細胞内に導入するための技術的に認識された様々な技法を指すことが意図される。宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトするために適切な方法は、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら（分子クローニング：実験室マニュアル、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ニューヨーク、１９８９年）、ディビス（Ｄａｖｉｓ）ら、Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８６年）および他の実験室マニュアルにおいて見出すことができる。

哺乳類細胞の適切なトランスフェクションについて、使用される発現ベクターおよびトランスフェクション技法に依存して、ほんのわずかの細胞だけが外来性のＤＮＡをそのゲノム内に組み込むことができることが知られている。これらの組み込み体を同定および選択するために、通常、選択可能なマーカー（例えば、抗生物質耐性）をコードする遺伝子が対象とする遺伝子と一緒に宿主細胞内に導入される。好ましい選択可能なマーカーには、Ｇ４１８、ハイグロマイシンおよびメトトレキサート（ｍｅｔｈａｔｒｅｘａｔｅ）などの薬物に対する耐性を付与するものが含まれる。選択可能なマーカーをコードする核酸は、ＬＩＰ０１〜ＬＩＰ０３タンパク質をコードする核酸と同じベクターで宿主細胞内に導入することもできるし、別のベクターで導入することもできる。導入された核酸で安定的にトランスフェクトされた細胞は、薬物選択によって同定することができる（例えば、選択可能なマーカー遺伝子が導入された細胞は生存するが、他の細胞は死滅するであろう）。

原核生物におけるタンパク質の発現は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において、融合タンパク質または非融合タンパク質のいずれかの発現を指示する恒常的または誘導性プロモーターを含有するベクターを用いて実行されることが多い。融合ベクターは、その中にコードされたタンパク質、例えば組換えタンパク質のアミノ末端に多数のアミノ酸を付加する。このような融合ベクターは通常、１）組換えタンパク質の発現を増大させること、２）組換えタンパク質の溶解度を増大させること、そして３）アフィニティ精製におけるリガンドとして作用することによって組換えタンパク質の精製に役立つことの３つの目的を果たす。多くの場合、融合発現ベクターには、融合部分と組換えタンパク質の接合部にタンパク質分解性の切断部位が導入され、融合タンパク質の精製に続いて、融合部分からの組換えタンパク質の分離が可能になる。

記載したように、発現ベクターは、好ましくは選択可能なマーカーを含有するであろう。このようなマーカーには、真核（ｅｕｋａｒｏｔｉｃ）細胞培養のためのジヒドロ葉酸レダクターゼまたはネオマイシン耐性と、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）および他の細菌における培養のためのテトラサイクリン（ｔｅｔｒａｃｙｌｉｎｅ）またはアンピシリン（ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎｇ）耐性とが含まれる。適切な宿主の代表例としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）およびサルモネラ・チフィリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）などの細菌細胞、酵母などの真菌細胞、ドロソフィラ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）Ｓ２およびスポドプテラ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）Ｓｆ９などの昆虫細胞、ＣＨＯ、ＣＯＳおよびボウズ（Ｂｏｗｅｓ）メラノーマなどの動物細胞、ならびに植物細胞が挙げられる。上記の宿主細胞のための適切な培地および条件は当該技術分野において知られている。

細菌での使用に好ましいベクターは、例えば、参照によって本明細書に援用される国際公開第２００４／０７４４６８Ａ１号パンフレットにおいて開示されている。その他の適切なベクターは、当業者には容易に明らかであろう。

本発明における使用に適した既知の細菌プロモーターには、参照によって本明細書に援用される国際公開第２００４／０７４４６８Ａ１号パンフレットに開示されるプロモーターが含まれる。

より高等の真核生物による本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの転写は、エンハンサー配列をベクター内に挿入することによって増大することができる。エンハンサーは通常約１０〜３００ｂｐのＤＮＡのシス作用性要素であり、所与の宿主細胞タイプにおいてプロモーターの転写活性を増大させる作用をする。エンハンサーの例としては、ｂｐ１００〜２７０の複製起点の後期側に位置するＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウィルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウィルスエンハンサーが挙げられる。

小胞体の内腔、周辺質空間または細胞外環境の中に翻訳されたタンパク質の分泌のために、発現されるポリペプチドに適切な分泌シグナルが取り込まれてもよい。シグナルはポリペプチドに対して内在性でもよいし、あるいはこれらは異種シグナルでもよい。

ＬＩＰ０１〜ＬＩＰ０３ポリペプチドは、融合タンパク質などの改変された形態で発現されてもよく、分泌シグナルだけでなく追加の異種機能領域も含むことができる。従って、例えば、ポリペプチドのＮ−末端に追加のアミノ酸、特に荷電アミノ酸の領域を付加して、精製中またはその後の処理および貯蔵中の宿主細胞における安定性および残留性を改善することができる。また、ペプチド部分をポリペプチドに付加して、精製を容易にすることができる。

［本発明に従うポリペプチド］
本発明は、配列番号５〜１４のいずれか１つに従うアミノ酸配列を有する単離ポリペプチド、およびに配列番号２〜４のいずれか１つのポリヌクレオチドを適切な宿主において発現させることによって得られるアミノ酸配列を提供する。また、上記のポリペプチドの機能性等価物を含むペプチドまたはポリペプチドも本発明の範囲に含まれる。

当業者には知られているように、成熟中の加工エラーのために配列番号５〜１４のＮ末端は、配列番号５〜１４のＣ末端と同様に異種であることが可能である。特に、このような加工エラーは、ポリペプチドの過剰発現の際に生じ得る。さらに、エキソプロテアーゼ活性は、不均一性を引き起こし得る。不均一性が生じる程度は、使用される宿主および発酵手順にも依存する。このようなＣ末端加工アーチファクトは、配列番号５〜１４で示されるように、より短いポリペプチドまたはより長いポリペプチドを導き得る。このようなエラーの結果としてＮ末端も異種であり得る。

さらなる実施形態では、本発明は、追加の残基を含有し、位置１または位置２または位置３などで開始する、配列番号５〜１４のいずれか１つに従うポリペプチドの少なくとも１つの機能性ドメインをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。あるいは、特定の残基を欠いており、結果として位置２または位置３または位置４などで開始してもよい。

ＬＩＰ０１についてより具体的には、本発明の１つの実施形態において、配列番号５は、配列番号２で示されるようなｃＤＮＡから直接翻訳されるようなタンパク質を開示する。通常、このようなタンパク質は成熟したタンパク質をもたらす前に加工され、例えばシグナル配列を解放し、好ましくはそれによって配列番号６または７が得られるであろう。配列番号６および配列番号７で示されるようなアミノ酸配列について、追加の残基を含有する場合のＮ末端は、それぞれ位置１、位置２または位置３におけるＮ末端の開始に相当して、以下の追加のアミノ酸配列Ｒ、ＧＲまたはＥＧＲを含有し得る。類似のＣ末端加工アーチファクトは、より短いポリペプチドまたはより長いポリペプチドを導き得る。配列番号７の特定の場合には、追加の残基を含有する場合のＣ末端は好ましくは、それぞれ位置３１０＋１、＋２または＋３における延長Ｃ末端に相当して、以下の追加のアミノ酸配列Ｒ、ＲＲまたはＲＲＤを含有する。

ＬＩＰ０２についてより具体的には、さらにもう１つの実施形態において、本発明は、配列番号９に示されるようなアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはこれらのいずれかの機能性等価物をコードする核酸配列を含む単離ポリヌクレオチドを提供する。配列番号８は、配列番号３で示されるようなｃＤＮＡから直接翻訳されるようなタンパク質を開示する。通常、このようなタンパク質は成熟タンパク質が得られる前に加工され、例えばシグナル配列を解放して、好ましくはそれによって配列番号９が得られるであろう。得られるタンパク質のＣ末端およびＮ末端は、例えば、加工アーチファクトのために異種であるかもしれない。

ＬＩＰ０３についてより具体的には、さらにもう１つの実施形態において、配列番号１０は、配列番号４で示されるようなｃＤＮＡから直接翻訳されるようなタンパク質を開示する。通常、このようなタンパク質は成熟タンパク質が得られる前に加工され、例えばシグナル配列を解放して、好ましくはそれによって配列番号１１、１２、１３または１４が得られるであろう。

上記のポリペプチドは、「本発明に従うポリペプチド」という用語に集合的に含まれる。

「ペプチド」および「オリゴペプチド」という用語は同義である（一般に認識されるように）と考えられ、ペプチジル結合によって結合された少なくとも２つのアミノ酸の鎖を示すことが文脈で必要とされるのでそれぞれの用語は同義的に使用することができる。「ポリペプチド」という語は、本明細書では、７つよりも多いアミノ酸残基を含有する鎖ために使用される。本明細書における全てのオリゴペプチドおよびポリペプチドの式または配列は、左から右に、そしてアミノ末端からカルボキシ末端への方向に書かれている。本明細書で使用されるアミノ酸の１文字コードは当該技術分野において一般に知られており、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら（分子クローニング、実験室マニュアル、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ニューヨーク、１９８９年）において見出すことができる。

「単離」ポリペプチドまたはタンパク質とは、その天然環境から取り出されたポリペプチドまたはタンパク質が意図される。例えば、宿主細胞において発現された組換え産生ポリペプチドおよびタンパク質は、本発明の目的のために、例えばスミス（Ｓｍｉｔｈ）およびジョンソン（Ｊｏｈｎｓｏｎ）、Ｇｅｎｅ ６７：３１−４０頁（１９８８年）に開示される一段階精製法などの適切な技法によって実質的に精製された未変性または組換えポリペプチドであるように単離されると考えられる。

本発明に従うＬＩＰ０１〜ＬＩＰ０３脂肪分解酵素は、当該技術分野において既知の方法（ポール・カトラー（Ｐａｕｌ Ｃｕｔｌｅｒ）によるＰｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙシリーズ、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、２００４年）によって組換え細胞培養物から回収および精製することができる。

本発明のポリペプチドには、天然精製された産物、化学合成手順の産物、および組換え技法により原核宿主または真核宿主（例えば、細菌、酵母、高等植物、昆虫、および哺乳類細胞を含む）から産生された産物が含まれる。組換え産生手順において使用される宿主に応じて、本発明のポリペプチドはグリコシル化されてもよいし、グリコシル化されなくてもよい。さらに、本発明のポリペプチドは、場合によっては宿主媒介プロセスの結果として、最初の改変メチオニン残基を含んでもよい。

［タンパク質断片］
本発明は、本発明に従うポリペプチドの生物学的に活性な断片も特徴とする。

本発明のポリペプチドの生物学的に活性な断片には、ＬＩＰ０１〜ＬＩＰ０３タンパク質のアミノ酸配列（例えば、配列番号５〜１４のアミノ酸配列）と十分に同一であるか、あるいはこれらに由来するアミノ酸配列を含むポリペプチドが含まれ、これらは、全長タンパク質よりも少ないアミノ酸を含むが、対応する全長タンパク質の少なくとも１つの生物活性を示す。通常、生物学的に活性な断片は、ＬＩＰ０１〜ＬＩＰ０３タンパク質の少なくとも１つの活性を有するドメインまたはモチーフを含む。本発明のタンパク質の生物学的に活性な断片は、例えば、長さが１０、２５、５０、１００またはそれ以上のアミノ酸であるポリペプチドでよい。さらに、タンパク質の他の領域が欠失された他の生物学的に活性な部分を組換え技法によって調製することができ、本発明のポリペプチドの天然形態の生物学的活性の１つまたは複数について評価することができる。

また本発明は、ＬＩＰ０１〜ＬＩＰ０３タンパク質の上記の生物学的に活性な断片をコードする核酸断片も特徴とする。

［融合タンパク質］
本発明のタンパク質またはその機能性等価物、例えばその生物学的に活性な部分はＬＩＰ０１〜ＬＩＰ０３ではないポリペプチド（例えば、異種アミノ酸配列）に作動可能に連結されて、融合タンパク質を形成することができる。「ＬＩＰ０１〜ＬＩＰ０３でないポリペプチド」は、ＬＩＰ０１〜ＬＩＰ０３タンパク質に対して実質的に相同でないタンパク質に相当するアミノ酸配列を有するポリペプチドを指す。このような「ＬＩＰ０１〜ＬＩＰ０３でないポリペプチド」は、同じまたは異なる生物体に由来することができる。ＬＩＰ０１〜ＬＩＰ０３融合タンパク質内で、ＬＩＰ０１〜ＬＩＰ０３ポリペプチドは、ＬＩＰ０１〜ＬＩＰ０３タンパク質の全てまたは生物学的に活性な断片に相当することができる。好ましい実施形態では、ＬＩＰ０１〜ＬＩＰ０３融合タンパク質は、ＬＩＰ０１〜ＬＩＰ０３タンパク質の少なくとも２つの生物学的に活性な部分を含む。融合タンパク質内で、「作動可能に連結された」という用語は、ＬＩＰ０１〜ＬＩＰ０３ポリペプチドおよびＬＩＰ０１〜ＬＩＰ０３でないポリペプチドが互いにインフレームで融合されることを示すものとする。ＬＩＰ０１〜ＬＩＰ０３でないポリペプチドは、ＬＩＰ０１〜ＬＩＰ０３ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に融合させることができる。

例えば、１つの実施形態では、融合タンパク質はＧＳＴ−ＬＩＰ０１〜ＬＩＰ０３融合タンパク質であり、ＬＩＰ０１〜ＬＩＰ０３配列がＧＳＴ配列のＣ末端に融合されている。このような融合タンパク質は、組換えＬＩＰ０１〜ＬＩＰ０３の精製を容易にすることができる。もう１つの実施形態では、融合タンパク質は、そのＮ末端に異種シグナル配列を含有するＬＩＰ０１〜ＬＩＰ０３タンパク質である。特定の宿主細胞（例えば、哺乳類および酵母宿主細胞）では、ＬＩＰ０１〜ＬＩＰ０３の発現および／または分泌は、異種シグナル配列の使用によって増大させることができる。

もう１つの例では、バキュロウィルスエンベロープタンパク質のｇｐ６７分泌配列を異種シグナル配列として使用することができる（分子生物学におけるカレント・プロトコル、オースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、１９９２年）。真核生物異種シグナル配列のその他の例には、メリチンおよびヒト胎盤アルカリホスファターゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カリフォルニア州ラ・ホヤ）の分泌配列が含まれる。さらにもう１つの例では、有用な原核生物異種シグナル配列は、ｐｈｏＡ分泌シグナル（上記のサムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら）およびタンパク質Ａ分泌シグナル（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、ニュージャージー州ピスカタウェイ）を含む。

シグナル配列は、本発明のタンパク質またはポリペプチドの分泌および単離を容易にするために使用することができる。通常、シグナル配列は、一般に１つまたは複数の切断事象における分泌中に成熟タンパク質から切断される疎水性アミノ酸のコアによって特徴付けられる。このようなシグナルペプチドは、分泌経路を通過する際に成熟タンパク質からのシグナル配列の切断を可能にする加工部位を含有する。シグナル配列は、発現ベクターが形質転換されている真核宿主などからタンパク質の分泌を指示し、続いてあるいは同時に、シグナル配列は切断される。次に、タンパク質は、既知の方法によって細胞外培地から容易に精製することができる。あるいは、シグナル配列は、ＧＳＴドメインなどの精製を容易にする配列を用いて、対象とするタンパク質に結合させることができる。従って、たとえば、ポリペプチドをコードする配列は、融合ポリペプチドの精製を容易にするペプチドをコードする配列などのマーカー配列と融合され得る。本発明のこの態様の特定の好ましい実施形態では、マーカー配列は、とりわけｐＱＥベクター（Ｑｉａｇｅｎ、Ｉｎｃ．）において提供されるタグなどのヘキサヒスチジンペプチドであり、その多くは市販されている。例えばゲンツ（Ｇｅｎｔｚ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８２１−８２４頁（１９８９年）において記載されるように、ヘキサヒスチジンは、融合タンパク質の便利な精製を提供する。ＨＡタグは、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質に由来するエピトープに相当する精製に有用なもう１つのペプチドであり、例えばウィルソン（Ｗｉｌｓｏｎ）ら、Ｃｅｌｌ ３７：７６７頁（１９８４年）によって記載されている。

好ましくは、本発明のＬＩＰ０１〜ＬＩＰ０３融合タンパク質は、標準組換えＤＮＡ技法によって産生される。例えば、異なるポリペプチド配列をコードするＤＮＡ断片は、従来の技法に従って、例えば連結のための平滑末端またはねじれ末端の使用、適切な末端を提供するための制限酵素消化、適切な場合の付着末端の充填、望ましくない連結を回避するためのアルカリホスファターゼ処理、および酵素連結によって、インフレームで一緒に連結される。もう１つの実施形態では、融合遺伝子は、自動ＤＮＡ合成機を含む従来の技法によって合成することができる。あるいは、遺伝子断片のＰＣＲ増幅は、２つの連続した遺伝子断片の間の相補的なオーバーハングを引き起こすアンカープライマーを用いて実行することができ、続いてアニーリングおよび再増幅して、キメラ遺伝子配列を生成することができる（例えば、分子生物学におけるカレント・プロトコル、オースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、１９９２年を参照されたい）。さらに、既に融合部分（例えば、ＧＳＴポリペプチド）をコードする多くの発現ベクターが市販されている。ＬＩＰ０１〜ＬＩＰ０３をコードする核酸は、融合部分がＬＩＰ０１〜ＬＩＰ０３タンパク質にインフレームで連結されるように、このような発現ベクター内にクローニングすることができる。

［機能性等価物］
「機能性等価物」および「機能性変異形」という用語は、本明細書では同義的に使用される。ＬＩＰ０１〜ＬＩＰ０３ＤＮＡの機能性等価物は、本明細書において定義されるようなＬＩＰ０１〜ＬＩＰ０３脂肪分解酵素の特定の機能を示すポリペプチドをコードする単離ＤＮＡ断片である。本発明に従うＬＩＰ０１〜ＬＩＰ０３ポリペプチドの機能性等価物は、本明細書において定義されるようなマグナポルテ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓａｅ）脂肪分解酵素の少なくとも１つの機能を示すポリペプチドである。従って、機能性等価物は生物学的に活性な断片も包含する。

機能性タンパク質またはポリペプチド等価物は、配列番号５〜１４の１つまたは複数のアミノ酸の保存的置換のみ、あるいは非必須アミノ酸の置換、挿入または欠失を含有し得る。従って、非必須アミノ酸は、生物学的機能を実質的に変更することなく配列番号５〜１４において変更することができる残基である。例えば、本発明のＬＩＰ０１〜ＬＩＰ０３タンパク質の中で保存されるアミノ酸残基は特に変更を受け難いことが予想される。さらに、本発明に従うＬＩＰ０１〜ＬＩＰ０３タンパク質および他の脂肪分解酵素の中で保存されるアミノ酸も変更を受ける可能性が低い。

「保存的置換」という用語は、アミノ酸残基が同様の側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられる置換を示すことが意図される。これらのファミリーは当該技術分野において知られており、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニンおよびヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、無電荷極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分枝側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸が含まれる。

機能性核酸等価物は、通常、サイレント変異、すなわちコード化ポリペプチドの生物学的機能を変更しない変異を含有し得る。従って、本発明は、特定の生物活性にとって必須でないアミノ酸残基の変化を含有するＬＩＰ０１〜ＬＩＰ０３タンパク質をコードする核酸分子を提供する。このようなＬＩＰ０１〜ＬＩＰ０３タンパク質は、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６とはアミノ酸配列が異なるが、その少なくとも１つの生物活性を保持する。１つの実施形態では、単離核酸分子はタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、該タンパク質は、配列番号５〜１４に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも約６０％、好ましくは６５％、より好ましくは７０％、さらにより好ましくは７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の実質的に相同のアミノ酸配列、またはそれ以上に相同のアミノ酸配列を含む。

例えば、表現型的にサイレントなアミノ酸置換をどのようにして行うかについてのガイダンスは、ボウイ（Ｂｏｗｉｅ）、Ｊ．Ｕ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１３０６−１３１０頁（１９９０年）およびそこに引用される参考文献において提供される。著者らが述べているように、これらの研究によって、意外にもタンパク質はアミノ酸置換に寛容性であることが明らかにされた。さらに著者らは、タンパク質の特定の位置においてどの変化が許容的な可能性があるかを示している。

それぞれ、配列番号５〜７、配列番号８〜９、配列番号１０〜１４のいずれか１つに従うタンパク質に相同であるＬＩＰ０１〜ＬＩＰ０３タンパク質をコードする単離核酸分子は、１つまたは複数のアミノ酸置換、欠失または挿入がコード化タンパク質内に導入されるように、それぞれ配列番号２〜４のいずれか１つに従うコードヌクレオチド配列内に１つまたは複数のヌクレオチド置換、付加または欠失を導入することによって作成することができる。このような変異は、部位特異的変異誘発およびＰＣＲ媒介の変異誘発などの標準的な技法によって導入することができる。

「機能性等価物」という用語は、ＬＩＰ０１〜ＬＩＰ０３タンパク質のオルソログも包含する。ＬＩＰ０１〜ＬＩＰ０３タンパク質のオルソログは他の菌株または種から単離することができるタンパク質であり、類似または同一の生物活性を有する。このようなオルソログは、配列番号５〜１４に対して実質的に相同のアミノ酸配列を含むとして容易に同定することができる。

本明細書において定義されるように、「実質的に相同」という用語は、第１および第２のアミノ酸またはヌクレオチド配列が共通ドメインを有するように、第１のアミノ酸またはヌクレオチド配列が、第２のアミノ酸またはヌクレオチド配列に対して十分または最低限の数の同一または等価（例えば、同様の側鎖を有する）のアミノ酸またはヌクレオチドを含有することを指す。例えば、約６０％、好ましくは６５％、より好ましくは７０％、さらにより好ましくは７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性あるいはそれ以上を有する共通ドメインを含有するアミノ酸またはヌクレオチド配列は、本明細書では十分に同一であると定義される。

また、他のＬＩＰ０１〜ＬＩＰ０３ファミリーメンバーをコードし、従って配列番号２〜４とは異なるヌクレオチド配列を有する核酸も本発明の範囲内に含まれる。さらに、異なる種からのＬＩＰ０１−ＬＩＰ０３タンパク質をコードし、配列番号２〜４とは異なるヌクレオチド配列を有することができる核酸も本発明の範囲内に含まれる。

本発明のＬＩＰ０１−ＬＩＰ０３ＤＮＡの変異形（例えば、天然の対立遺伝子変異形）および相同体に相当する核酸分子は、標準ハイブリダイゼーション技法に従って、好ましくは高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、本明細書に開示されるｃＤＮＡまたはその適切な断片をハイブリダイゼーションプローブとして用いて、本明細書に開示されるＬＩＰ０１−ＬＩＰ０３核酸に対するその相同性に基づいて単離することができる。

ＬＩＰ０１〜ＬＩＰ０３配列の天然に存在する対立遺伝子変異形に加えて、配列番号２〜４のヌクレオチド配列への変異によって変化を導入でき、それによって、ＬＩＰ０１〜ＬＩＰ０３タンパク質の機能を実質的に変更することなくＬＩＰ０１〜ＬＩＰ０３タンパク質のアミノ酸配列の変化が生じることを当業者は認識するであろう。

本発明のもう１つの態様では、改善されたＬＩＰ０１〜ＬＩＰ０３タンパク質が提供される。改善されたＬＩＰ０１〜ＬＩＰ０３タンパク質は、少なくとも１つの生物活性が改善されたタンパク質である。このようなタンパク質は、飽和変異誘発などによって、ＬＩＰ０１〜ＬＩＰ０３コード配列の全てまたは一部に沿ってランダムに変異を導入することによって得られ、得られた変異体を組換えで発現させ、生物活性についてスクリーニングすることができる。例えば、当該技術では脂肪分解酵素の酵素活性を測定するための標準アッセイが提供され、従って、改善されたタンパク質を容易に選択することができる。

好ましい実施形態では、ＬＩＰ０１〜ＬＩＰ０３タンパク質は、それぞれ配列番号５〜７、配列番号８〜９、配列番号１０〜１４に従うアミノ酸配列を有する。もう１つの実施形態では、ＬＩＰ０１〜ＵＰ０３ポリペプチドは、配列番号５〜１４に従うアミノ酸配列に対して実質的に相同であり、配列番号５〜１４に従うポリペプチドの少なくとも１つの生物活性を保持するが、上記のように自然変異または変異誘発のためにアミノ酸配列が異なる。

さらに好ましい実施形態では、ＬＩＰ０１〜ＬＩＰ０３タンパク質は、好ましくは高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、それぞれ配列番号２〜４のいずれか１つに従う核酸とハイブリダイズすることができる単離核酸断片によってコードされるアミノ酸配列を有する。

従って、ＬＩＰ０１〜ＬＩＰ０３タンパク質は、好ましくは、配列番号５〜１４に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上相同であるアミノ酸配列を含み、配列番号５〜１４に従うポリペプチドの少なくとも１つの機能活性を保持するタンパク質である。

本発明に従うタンパク質機能性等価物は、例えば、本発明のタンパク質の変異体、例えば切断変異体のコンビナトリアルライブラリーを脂肪分解酵素活性についてスクリーニングすることによって同定することもできる。１つの実施形態では、核酸レベルにおけるコンビナトリアル変異誘発によって、変異形の多様化ライブラリーが作成される。変異形の多様化ライブラリーは、例えば、可能性のあるタンパク質配列の縮重セットが個々のポリペプチドとして、あるいはより大きい融合タンパク質のセットとして発現可能である（例えば、ファージディスプレイのために）ように合成オリゴヌクレオチドの混合物を遺伝子配列内に酵素により連結することによって生成することができる。縮重オリゴヌクレオチド配列から本発明のポリペプチドの可能性のある変異形のライブラリーを生成するために使用することができる様々な方法が存在する。縮重オリゴヌクレオチドを合成するための方法は当該技術分野において既知である（例えば、ナラン（Ｎａｒａｎｇ）（１９８３年）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ３９：３、イタクラ（Ｉｔａｋｕｒａ）ら（１９８４年）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３：３２３、イタクラ（Ｉｔａｋｕｒａ）ら（１９８４年）Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８：１０５６、イケ（Ｉｋｅ）ら（１９８３年）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１１：４７７を参照されたい）。

さらに、本発明のポリペプチドのコード配列の断片のライブラリーを使用して、その後の変異形の選択をスクリーニングするためのポリペプチドの多様化集団を作成することができる。例えば、ニッキングが分子につきほぼ１回しか起こらない条件下で、対象とするコード配列の二本鎖ＰＣＲ断片をヌクレアーゼで処理し、二本鎖ＤＮＡを変性し、ＤＮＡを再生して種々のニックの入った産物からセンス／アンチセンス対を含むことができる二本鎖ＤＮＡを形成し、Ｓ１ヌクレアーゼの処理によって再形成された二重鎖から一本鎖部分を除去し、得られた断片ライブラリーを発現ベクター内に連結することによって、コード配列断片のライブラリーを作成することができる。この方法によって、対象とするタンパク質の様々なサイズのＮ末端および内部の断片をコードする発現ライブラリーを誘導することができる。

切断の点変異によって作られたコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングするため、そして選択された特性を有する遺伝子産物についてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために、いくつかの技法が当該技術分野において知られている。大きい遺伝子ライブラリーをスクリーニングするために高処理分析に適した最も広く使用される技法は、一般に、遺伝子ライブラリーを複製可能な発現ベクター内にクローニングし、得られたベクターのライブラリーにより適切な細胞を形質転換し、そして所望の活性の検出によってその産物が検出された遺伝子をコードするベクターの単離が容易になる条件下でコンビナトリアル遺伝子を発現させることを含む。ライブラリー内の機能性変異体の頻度を高める技法である再帰的アンサンブル変異誘発（ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ ｅｎｓｅｍｂｌｅ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ、ＲＥＭ）はスクリーニングアッセイと組み合わせて使用して、本発明のタンパク質の変異形を同定することができる（アーキン（Ａｒｋｉｎ）およびユアヴァン（Ｙｏｕｒｖａｎ）（１９９２年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：７８１１−７８１５頁、デルグレイブ（Ｄｅｌｇｒａｖｅ）ら（１９９３年）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ６（３）：３２７−３３１頁）。

それぞれ配列番号２〜４で示されるＬＩＰ０１〜ＬＩＰ０３遺伝子配列に加えて、ＬＩＰ０１〜ＬＩＰ０３タンパク質のアミノ酸配列に変化をもたらし得るＤＮＡ配列多形性が所与の集団内に存在し得ることは当業者には明らかであろう。このような遺伝子多形性は、異なる集団からの細胞内、あるいは天然の対立遺伝子変異のために集団内にも在し得る。対立遺伝子変異形も機能性等価物を含み得る。

本発明に従うポリヌクレオチドの断片は、機能性ポリペプチドをコードしないポリヌクレオチドも含み得る。このようなポリヌクレオチドは、ＰＣＲ反応のためのプローブまたはプライマーとしての役割を果たすことができる。

本発明に従う核酸は、機能性または非機能性ポリペプチドのいずれをコードするかに関係なく、ハイブリダイゼーションプローブまたはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマーとして使用することができる。ＬＩＰ０１〜ＬＩＰ０３活性を有するポリペプチドをコードしない本発明の核酸分子の使用には、とりわけ、（１）ＬＩＰ０１〜ＬＩＰ０３タンパク質をコードする遺伝子、またはその対立遺伝子変異形を、例えばマグナポルテ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓａｅ）以外の生物体からのｃＤＮＡライブラリーから単離することと、（２）ベルマ（Ｖｅｒｍａ）ら、Ｈｕｍａｎ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ：ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク（１９８８年）に記載されるように、ＬＩＰ０１〜ＬＩＰ０３遺伝子の正確な染色***置を提供するための中期の染色体の広がりへのインサイチューハイブリダイゼーション（例えば、ＦＩＳＨ）と、（３）特定の組織および／または細胞におけるＬＩＰ０１〜ＬＩＰ０３ｍＲＮＡの発現を検出するためのノーザンブロット分析と、４）所与の生物学的（例えば、組織）サンプルにおいてＬＩＰ０１〜ＬＩＰ０３プローブとハイブリダイズ可能な核酸の存在を分析するための診断ツールとして使用することができるプローブおよびプライマーとが含まれる。

また、ＬＩＰ０１〜ＬＩＰ０３遺伝子の機能性等価物を取得する方法も本発明によって包含される。このような方法は、配列番号５〜１４に従うタンパク質配列またはこれらのいずれかの変異形の全てまたは一部をコードする単離核酸を含む標識プローブを取得することと、ライブラリー内の核酸断片へのプローブのハイブリダイゼーションを可能にする条件下で標識プローブを用いて核酸断片ライブラリーをスクリーニングし、それによって核酸二重鎖を形成することと、任意の標識二重鎖内の核酸断片から全長遺伝子配列を調製して、ＬＩＰ０１〜ＬＩＰ０３遺伝子に関連する遺伝子を取得することとを必要とする。

１つの実施形態では、本発明のＬＩＰ０１〜ＬＩＰ０３核酸は、それぞれ配列番号２〜４のいずれか１つに示される核酸配列またはその補体に対して、少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上相同である。

［宿主細胞］
もう１つの実施形態では、本発明は、本発明によって包含される核酸を含有する細胞、例えば形質転換宿主細胞、または組換え宿主細胞を特徴とする。「形質転換細胞」または「組換え細胞」は、組換えＤＮＡ技法によって本発明に従う核酸がその中に（あるいはその祖先の中に）導入された細胞である。原核細胞および真核細胞の両方、例えば細菌、真菌、酵母などが含まれ、特に好ましいのは、糸状菌、特にマグナポルテ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓａｅ）またはアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）またはオリゼー（ｏｒｙｚａｅ）などのアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）種からの細胞である。

挿入された配列の発現を調節する、あるいは特定の所望される形で遺伝子産物を改変および加工する宿主細胞を選択することができる。タンパク質産物のこのような改変（例えば、グリコシル化）および加工（例えば、切断）は、タンパク質の最適な機能を容易にすることができる。

様々な宿主細胞は、タンパク質および遺伝子産物の翻訳後加工および改変のために特徴的および特異的なメカニズムを有する。分子生物学および／または微生物学の当業者によく知られた適切な細胞株または宿主系を選択して、発現される外来性タンパク質の所望の正確な改変および加工を保証することができる。この目的のために、一次転写物の適切な加工、遺伝子産物のグリコシル化およびリン酸化のための細胞機構を有する真核宿主細胞を使用することができる。このような宿主細胞は当該技術分野においてよく知られている。

また、宿主細胞には、ＣＨＯ、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、ＷＩ３８、および脈絡叢細胞株などの哺乳類細胞株も含まれるが、これらに限定されない。

必要に応じて、安定にトランスフェクトされた細胞株は、本発明に従うポリペプチドを産生することができる。哺乳類細胞の安定なトランスフェクションに適した多数のベクターは公に入手可能であり、このような細胞株の構築方法も、例えばオースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら（上記）において公に知られている。

［ＬＩＰ０１〜ＬＩＰ０３脂肪分解酵素の工業的過程における使用］
意外にも、本発明に従う脂肪分解酵素はただ１つの特異的基質の加水分解に限定されるのではなく、異なるタイプの脂肪分解活性（ホスホリパーゼ、リパーゼおよびガラクトリパーゼ活性である）を有することができる。生地の組成、反応時間、ｐＨ、温度、含水量に応じて、本発明に従う脂肪分解酵素はこれらの活性を同時に示してもよいし、１つの活性との狭い特異性を有し、他の活性はあまりまたは全く持たなくてもよいし、あるいは１つの優勢活性とのより広い特異性を有し、より少ない他の活性を有してもよい。

その多様性のために、本発明に従う脂肪分解酵素は、ジガラクトシルジグリセリド含有源からのジガラクトシルモノグリセリドの産生またはリン脂質乳化剤の改変を含む多様な工業用途で使用され得る。リン脂質乳化剤の一例はレシチンであり、これは極性脂質および中性脂質の両方の混合物であり、極性脂質の含量は少なくとも６０％である。リン脂質乳化剤は多くの食品および非食品用途を有し、例えばエッグレシチンは、例えば乳製品、特にマヨネーズ、ドレッシング、ペストリーなどにおける乳化剤として使用され、例えばダイズレシチンは、例えば（低カロリー）ソース、パン、マーガリン、化粧品などにおける乳化剤として使用され、他のレシチンは例えばチョコレート、子牛の飼料において使用される。本発明に従う脂肪分解酵素によるリン脂質乳化剤の改変は、油／水混合物の乳化の増大を生じることができる。本発明に従う脂肪分解酵素によるリン脂質乳化剤の改変は、より広いまたは異なるｐＨおよび／または温度範囲について、改変されたリン脂質乳化剤の添加から得られるエマルジョンの安定性を増大することができる。本発明に従う脂肪分解酵素によるリン脂質乳化剤の改変は、Ｃａ^２＋またはＭｇ^２＋イオンの存在下で、改変されたリン脂質乳化剤の添加から得られるエマルジョンの安定性を増大することができる。

本発明に従う脂肪分解酵素の工業用途のもう１つの例は、植物油の脱ガムのためにこれらの油の加工において使用できることである。典型的な脱ガム過程では、とりわけ植物油の安定性を増大させるために、レシチンは、油相を水で洗浄することによって植物油、例えば大豆油、菜種（キャノーラ）油、アマニ油、ヒマワリ油から除去される。ここで、高せん断条件下での水と油の混合は、レシチンの大部分を水相内に追い込み、これは次にセパレータにおいて除去される。このいわゆる水脱ガム相中に、例えばホスファチジルコリン、ホスファチジルイノシトールおよびホスファチジルエタノールアミンなどの急速に水和可能なリン脂質だけが容易に除去される。５０％までのマグネシウムおよび／またはカルシウム塩からなる水和できないリン脂質／ホスファチド、主にリン脂質は、水脱ガムステップにおいて容易に除去することができない。水和できないリン脂質／ホスファチドを本発明に従う脂肪分解酵素にさらすと、これらのリン脂質はより水溶性になり、そのため水脱ガム相中に抽出するのが容易になる。

本発明に従う脂肪分解酵素の工業用途のもう１つの例は、グルコースシロップを製造するための小麦グルテンまたは小麦デンプンの糖化（α−アミラーゼおよびグルコアミラーゼを用いる）中に生じる沈殿物を除去することである。沈殿物の除去によって、次に行われる、得られたグルコースシロップのろ過がかなり加速される。

食品における本発明に従う脂肪分解酵素の工業用途のさらにもう１つの例は、生地または焼成製品の品質を改善するためのベーキング用途におけるその使用である。

意外にも、本発明に従うリパーゼは、生地中で使用される際（および言及した他の工業的過程においても）にその場で以下の特性の少なくとも１つを示す。
・ 無極性脂質に対する比較的低い活性
・ 極性ジアシル−脂質、少なくともジアシルガラクト脂質に対する比較的高い活性
・ 極性モノアシル化合物に対する比較的低い活性

例えば、本発明に従う酵素は、比較的低いリゾホスホリパーゼ活性および比較的低いリパーゼ活性をその場で示すことができる。これらの予想外の特性は全て、生地中の化学乳化剤の代替物として使用される場合に極めて有利であることが分かっている。

脂肪族アシル部分をグリセロール骨格に連結するエステル結合を加水分解するいくつかのタイプのホスホリパーゼ活性を識別することができる。
・ ホスホリパーゼＡ１（ＥＣ３．１．１．３２）およびＡ２（ＥＣ３．１．１．４）は、ジアシルグリセロリン脂質から、それぞれｓｎ−１およびｓｎ−２位置における１つの脂肪族アシル基の脱アシル化を触媒してリゾリン脂質を産生する。これは、乳化剤の置換のために望ましい活性である。
・ リゾホスホリパーゼ（ＥＣ３．１．１．５、Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（酵素の命名法（Ｅｎｚｙｍｅ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ）、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、１９９２年）によってホスホリパーゼＢとも呼ばれる）は、リゾリン脂質内に残存する脂肪族アシル基の加水分解を触媒する。ホスホリパーゼＢは、ペニシリウム・ノタータム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｎｏｔａｔｕｍ）（サイトー（Ｓａｉｔｏ）ら、１９９１年、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １９７：４４６−４５６頁）から報告されており、ジアシルグリセロリン脂質からの両方の脂肪酸の脱アシル化を触媒し、本質的にリゾホスホリパーゼ活性を有する。乳化剤置換のためにリゾホスホリパーゼ活性はあまり望ましくない。何故なら、これは極性ヘッドおよび無極性テールの組み合わせの欠失をもたらし、得られた産物が表面特性に影響できないようにするからである。意外にも、本発明に従うリパーゼは生地中で比較的低いリゾホスホリパーゼ活性を示すことが示された。

小麦粉は約２．２〜２．９％の脂質を含有する。小麦粉脂質は、デンプン脂質（０．８〜０．９％）および非デンプン脂質（１．４〜２．０％）に分けることができる。デンプン脂質は主に極性リゾリン脂質からなるが、非デンプン脂質は、約４０％の中性トリグリセリドおよび４０％の極性リン脂質および糖脂質からなる。小麦粉脂質の割合の最適化のために、本発明に従うリパーゼは、本発明に従うリパーゼを添加することによって生地中で極性脂質（リン脂質および糖脂質であり、より具体的にはガラクト脂質である）をその場で加水分解することができる。

国際公開第０４／１０４１９３号パンフレットは、ベーキング用途におけるマグナポルテ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓａｅ）からのホスホリパーゼＣの使用を開示する。しかしながら、ホスホリパーゼＣ活性は十分な表面活性化合物をもたらさないので、化学乳化剤の代替として使用される酵素のために望ましくない。さらに、配列番号３、４または５に対して非相同のホスホリパーゼＣは、国際公開第０４／１０４１９３号パンフレットに開示される。

国際公開第９８／４５４５３号パンフレットは、アスペルギルス・ツビゲンシス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｕｂｉｇｅｎｓｉｓ）に由来するリパーゼ活性を有するポリペプチドを開示しており、これは、ジガラクトシルジグリセリドに対する加水分解活性も示す。しかしながら、この酵素は、パンの中のその場で、ガラクトシルジグリセリドに対して比較的低い比活性であり、トリグリセリドに対しては比較的高い活性である（実施例１０）ことが欠点であり、これにより、この酵素は化学乳化剤の完全な代替品として使用するために適切でないとされる。

ベーキング酵素は多様な焼成製品において使用することができる。「焼成製品」という用語は、本明細書では、型焼きパン、一塊のパン、フランスパンおよびロールなどのパン製品、ケーキ、パイ、マフィン、酵母で膨らませたドーナツおよびケーキドーナツなどを含むと定義される。

本発明に従う脂肪分解酵素は、例えば、焼成製品において使用することができる。パンなどの焼成製品は、通常は基本原料（（小麦）粉、水、そして任意で塩）から作られる生地から調製される。焼成製品によって添加される他の原料は、砂糖、風味などであり得る。発酵製品については、酸（発生化合物）および重炭酸塩の組み合わせなどの化学膨張系の次に、主としてパン酵母が使用される。

酵母、酵素および化学添加剤は通常別々に生地に添加される。

酵素は乾燥形態、例えば顆粒形態で添加されても液体形態で添加されてもよい。化学添加剤はほとんどの場合粉末形態で添加される。また、特定のベーキング用途に合わせた加工助剤組成物は、化学添加剤および酵素の専用混合物で構成され得る。

上記の原料および加工助剤からの生地の調製は当該技術分野においてよく知られており、前記原料および加工助剤を混合するステップ、ならびに１回または複数回の成形および発酵ステップを含む。

このような生地からの焼成製品の調製も当該技術分野においてよく知られており、生地の成形および整形、そしてさらに発酵の後に、要求温度およびベーキング時間のベーキングを含むことができる。

本発明は、上記の問題の全てではなくても少なくとも１つに対処する。

本発明は、本発明に従う脂肪分解酵素の多数の工業的過程における使用にも関する。これらの過程で得られた長期にわたる経験にもかかわらず、本発明に従う脂肪分解酵素は、現在使用されている酵素を越えた多数の大きな利点を特徴とする。特定の用途に応じて、これらの利点は、より低い製造コスト、基質に対するより高い特異性、より低い抗原性、より少ない望ましくない副活性、適切な微生物で産生されるときのより高い収率、より適切なｐＨおよび温度範囲、最終製品のより優れた味覚、ならびに食品グレードおよび清浄性のような態様を含むことができる。

また本発明は、ポリペプチドが取り込まれていない生地または焼成製品に対して、生地または生地から得られる焼成製品の１つまたは複数の特性を改善する有効量の本発明の脂肪分解酵素を生地中に取り込むことを含む、生地または焼成製品の調製方法にも関する。

「生地中に取り込む」という用語は、本明細書では、生地、生地を作る原料、および／または生地を作る生地原料の混合物に本発明に従う脂肪分解酵素を添加することと定義される。換言すれば、本発明に従う脂肪分解酵素は、生地の調製のどのステップで添加されてもよく、１つ、２つまたはそれ以上のステップで添加されてもよい。本発明に従う脂肪分解酵素は、当該技術分野においてよく知られた方法を用いて焼成製品を製造するために混練および焼成される生地の原料に添加される。例えば、米国特許第４，５６７，０４６号明細書、ＥＰ−Ａ−４２６，２１１号明細書、特開昭６０−０７８５２９号公報、特開昭６２−１１１６２９号公報、および特開昭６３−２５８５２８号公報を参照されたい。

「有効量」という用語は、本明細書では、生地および／または焼成製品の対象とする少なくとも１つの特性に対する測定可能な効果を提供するのに十分な本発明に従う脂肪分解酵素の量と定義される。

「改善された特性」という用語は、本明細書では、本発明に従う脂肪分解酵素の作用によって、本発明に従う脂肪分解酵素が取り込まれていない生地または製品に対して改善された、生地および／または生地から得られる製品、特に焼成製品の任意の特性と定義される。改善された特性としては、増大した生地の強度、増大した生地の弾力性、増大した生地の安定性、低減した生地の粘着性、改善された生地の伸展性、改善された生地の機械加工性、増大した焼成製品の体積、改善された焼成製品の風味、改善された焼成製品のクラム構造、改善された焼成製品のクラム柔軟性、低減した焼成製品の気泡形成および／または改善された焼成製品の老化防止が挙げられるが、これらに限定されない。

改善された特性は、以下で実施例において記載される本発明の方法に従って、本発明のポリペプチドを添加して調製した生地および／または焼成製品と、添加せずに調製した生地および／または焼成製品とを比較することによって決定され得る。官能品質（ｏｒｇａｎｏｌｅｐｔｉｃ ｑｕａｌｉｔｙ）は、ベーキング工業において十分に確立された手順を用いて評価することができ、例えば、訓練された味覚試験者集団の使用が含まれる。

「増大した生地の強度」という用語は、本明細書では、概してより弾力特性を有し、および／または成形および整形するためにより多くの仕事量を必要とする生地の特性と定義される。

「増大した生地の弾力性」という用語は、本明細書では、特定の物理的な歪みを受けた後にその初めの形状を回復する傾向がより高い生地の特性と定義される。

「増大した生地の安定性」という用語は、本明細書では、機械的に乱暴に扱われることによる影響がより少なく、従ってその形状および体積をよりよく保持する生地の特性と定義され、標準および／または延長した試験の後にローフ断面の高さ：幅の比によって評価される。

「低減した生地の粘着性」という用語は、本明細書では、例えば生地の製造機械内で、表面に付着する傾向がより低い生地の特性と定義され、熟練したテストベーカーによって実験的に評価されるか、当該技術分野において知られている組織アナライザー（例えば、ＴＡＸＴ２）の使用によって測定されるかのいずれかである。

「改善された生地の伸展性」という用語は、本明細書では、破裂することなく増大した歪みまたは伸展にさらされることが可能な生地の特性と定義される。

「改善された生地の機械加工性」という用語は、本明細書では、概して粘着性が低く、および／またはより固く、および／またはより弾力性である生地の特性と定義される。

「増大した焼成製品の体積」という用語は、当該技術分野において既知の超音波またはレーザー検出を用いて、自動パン体積アナライザー（例えば、ＢＶＭ−３、ＴｅｘＶｏｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ ＡＢ、スウェーデン国ヴィーケン）によって決定される所与の一塊（ローフ）のパンの体積として測定される。

「低減した焼成製品の気泡形成」という用語は、本明細書では、視覚的に決定した、焼いたパンのクラストにおける気泡形成の低下と定義される。

「改善された焼成製品のクラム構造」という用語は、本明細書では、クラム内のより細かい気泡および／またはより薄い気泡の壁、ならびに／あるいはクラム内の気泡のより均一／均質な分布を有する焼成製品の特性と定義され、通常、ベーカーによって視覚的に、あるいは当該技術分野において既知のデジタル画像解析（例えば、Ｃ−ｃｅｌｌ、Ｃａｌｉｂｒｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｔｄ、英国ウォリントンのアップルトン）によって評価される。

「改善された焼成製品の柔軟性」という用語は「堅さ」の反対であり、本明細書では、より容易に圧縮される焼成製品の特性と定義され、熟練したテストベーカーによって実験的に評価されるか、当該技術分野において知られている組織アナライザー（例えば、ＴＡＸＴ２）の使用によって測定されるかのいずれかである。

「改善された焼成製品の風味」という用語は、訓練された試験集団によって評価される。

「改善された焼成製品の老化防止」という用語は、本明細書では、貯蔵中の品質パラメータ、例えば柔軟性および／または弾力性の劣化速度が低減した焼成製品の特性と定義される。

「生地」という用語は、本明細書では、混練または圧延するのに十分堅い小麦粉および他の原料の混合物と定義される。生地は、生でも冷凍でも、調理されていても、あるいは予め焼いてあってもよい。冷凍生地の調製は、カルプ（Ｋｕｌｐ）およびローレンツ（Ｌｏｒｅｎｚ）によってＦｒｏｚｅｎ ａｎｄ Ｒｅｆｒｉｇｅｒａｔｅｄ Ｄｏｕｇｈｓ ａｎｄ Ｂａｔｔｅｒｓで記載されている。

「焼成製品」という用語は、本明細書では、柔らかいまたはクリスピーな（パリパリした）特性のいずれかを有する、生地から調製された任意の製品と定義される。本発明によって有利に製造され得る白色、薄色または濃色タイプのいずれかの焼成製品の例は、通常はローフまたはロール形態のパン（特に、白パン、全粒パンまたはライ麦パン）、バゲット型のフランスパン、パスタ、めん類（ゆでるかまたは（強火で）炒めた）、ピタパン、トルティーヤ、タコス、ケーキ、パンケーキ、ビスケット、クッキー、ドーナツ、ベーグル（ｂａｇｌｅ）、パイの皮、蒸しパン、およびクリスプブレッドなどである。

本発明の方法で使用される本発明の脂肪分解酵素および／または追加の酵素は、問題となっている使用に適切な任意の形態、例えば、乾燥粉末、凝集粉末、または顆粒、特に非発塵性顆粒、液体、特に安定化液体、または国際公開第０１／１１９７４号パンフレットおよび国際公開第０２／２６０４４号パンフレットに記載されるような保護酵素の形態であり得る。顆粒および凝集粉末は、従来の方法、例えば流動床造粒機において本発明に従う脂肪分解酵素をキャリア上に噴霧することによって調製され得る。キャリアは、適切な粒径を有する微粒子コアからなることができる。キャリアは可溶性でも不溶性でもよく、例えば、塩（ＮａＣｌまたは硫酸ナトリウムなど）、糖（スクロースまたはラクトースなど）、糖アルコール（ソルビトールなど）、デンプン、米、コーングリット、または大豆である。本発明に従う脂肪分解酵素および／または追加の酵素は、遅延放出性の製剤に含有されてもよい。遅延放出性製剤の調製方法は当該技術分野においてよく知られている。糖、糖アルコールまたは別のポリオール、および／または乳酸または別の有機酸などの栄養的に許容可能な安定剤を確立された方法に従って添加すると、例えば、液体酵素調製物を安定化することができる。

本発明に従う脂肪分解酵素は、ＥＰ−Ａ−０６１９９４７号明細書、ＥＰ−Ａ−０６５９３４４号明細書および国際公開第０２／４９４４１号パンフレットに開示されるような酵母含有組成物中に取り込まれてもよい。

小麦粉のプレミックス中に含有させるためには、本発明に従うポリペプチドは、乾燥製品、例えば非発塵性顆粒の形態であることが有利であるが、液体と一緒に含有させるためには液体形態であるのが有利である。

１つまたは複数の追加の酵素が生地中に取り込まれてもよい。追加の酵素は哺乳類および植物を含む任意の起源、好ましくは微生物（細菌、酵母または真菌）起源を有することができ、当該技術分野において従来使用されている技法によって得ることができる。

好ましい実施形態では、追加の酵素は、アミラーゼ（α−アミラーゼ（酵母により発酵可能な糖を提供し、老化を遅延させるために有用）、β−アミラーゼ、マルトジェニックアミラーゼまたは非マルトジェニックアミラーゼなど）、シクロデキストリングルカノトランスフェラーゼ、ペプチダーゼ、特にエキソペプチダーゼ（風味の増強において有用）、トランスグルタミナーゼ、リパーゼ（生地または生地原料中に存在する脂質を、生地を柔らかくするように改変するために有用）、ガラクトリパーゼ、ホスホリパーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、特にキシラナーゼなどのペントサナーゼ（生地の伸展性を増大するペントサン、より具体的にはアラビノキシランの部分的な加水分解のために有用）、プロテアーゼ（特に強力粉を用いたときに、グルテンを弱めるために有用）、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ、例えば国際公開第９５／００６３６号パンフレットに開示されるようなタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、ペルオキシダーゼ（生地粘稠度を改善するために有用）、ラッカーゼ、またはオキシダーゼ、例えばグルコースオキシダーゼ、ヘキソースオキシダーゼ、アルドースオキシダーゼ、ピラノースオキシダーゼ、リポキシゲナーゼまたはＬ−アミノ酸オキシダーゼ（生地粘稠度の改善において有用）でよい。

１つまたは複数の追加の酵素活性を本発明の方法に従って添加すべき場合、これらの活性は別々に添加されてもよいし、本発明に従うポリペプチドと一緒に添加されてもよく、任意で、パン改善および／または生地改善組成物の成分として添加されてもよい。他の酵素活性は上記の酵素のいずれでもよく、確立されたベーキングの実施に従って投与することができる。

また本発明は、本発明の方法によって得ることができる生地を焼いて焼成製品を製造することを含む、焼成製品の調製方法にも関する。焼成製品を製造するための生地のベーキングは、当該技術分野においてよく知られた方法を用いて実施することができる。

また本発明は、本発明の方法によってそれぞれ製造される生地および焼成製品にも関する。

本発明はさらに、生地および／または生地から製造される焼成製品のためのプレミックス（例えば、小麦粉組成物の形態）に関し、該プレミックスは本発明のポリペプチドを含む。「プレミックス」という用語は、本明細書では、その従来の意味で理解されるように、すなわち通常小麦粉を含むベーキング剤の混合物と定義され、これは、工業的な製パン工場／施設だけでなく小売ベーカリーにおいても使用することができる。プレミックスは、ポリペプチドまたはポリペプチドを含む本発明のパン改善および／または生地改善組成物と、小麦粉、デンプン、糖、または塩などの適切なキャリアとを混合することによって調製することができる。プレミックスは、他の生地改善および／またはパン改善添加剤、例えば上記の酵素を含む添加剤のいずれかを含有してもよい。

本発明はさらに、本発明のポリペプチドを含む顆粒または凝集粉末の形態のベーキング添加剤に関する。ベーキング添加剤は好ましくは狭い粒径分布を有し、粒子の９５％（重量による）よりも多くが２５〜５００μｍの範囲内にある。

生地およびパンの製造において、本発明は、酸化剤（例えば、アスコルビン酸）、還元剤（例えば、Ｌ−システイン）、および／または乳化剤（例えば、ＤＡＴＥＭ、ＳＳＬおよび／またはＣＳＬ）のような化学加工助剤、ならびに／あるいは酸化還元酵素（例えば、グルコースオキシダーゼ）、多糖類改変酵素（例えば、α−アミラーゼ、ヘミセルラーゼ、分枝酵素など）および／またはタンパク質改変酵素（エンドプロテアーゼ、エキソプロテアーゼ、分枝酵素など）などの酵素加工助剤などの上記で定義した加工助剤と組み合わせて使用されてもよい。

上記した本発明に従う脂肪分解酵素の工業用途は数例を含むだけであり、このリストは限定的であることは意味しない。

ＬＩＰ０１〜ＬＩＰ０３脂肪分解酵素は、微生物において便利に（ｃｏｎｖｉｅｎｔｌｙ）産生することができる。上記の過程では、組換えＤＮＡ技法によって得られる脂肪分解酵素を使用することが有利である。このような組換え酵素は、伝統的に精製されたその対応物を越える多数の利点を有する。組換え酵素は低コスト、高収率で産生させることができ、細菌またはウィルスのような作用物質の汚染がなく、細菌毒素または他の酵素活性の汚染もない。

以下において、本発明は、以下の非限定的な例によって説明される。

［実施例］
［実施例１］
［アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）の発酵］
本明細書において提供されるヌクレオチド配列、配列番号２、配列番号３および配列番号４によってコードされる脂肪分解酵素は、ＤＮＡ配列を含有する発現プラスミドを構築し、このようなプラスミドでＡ．ニガー（ｎｉｇｅｒ）株を形質転換し、そしてアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）株を以下の方法で成長させることによって得た。

Ａ．ニガー（ｎｉｇｅｒ）株の新しい胞子（１０^６〜１０^７）を２０ｍｌのＣＳＬ培地（１００ｍｌフラスコ、バッフル）中に接種し、３４℃および１７０ｒｐｍで２０〜２４時間成長させた。５〜１０ｍｌのＣＳＬ前培養物を１００ｍｌのＣＳＭ培地（５００ｍｌフラスコ、バッフル）中に接種した後、３４℃および１７０ｒｐｍで３〜５日間菌株を発酵させた。

５０ｍｌのグライナー（Ｇｒｅｉｎｅｒ）チューブにおける遠心分離（３０分、５０００ｒｐｍ）によって無細胞の上澄みを得た。ＧＦ／Ａ Ｗｈａｔｍａｎ Ｇｌａｓｓマイクロファイバーフィルタ（１５０ｍｍ）に対して上澄みを予備ろ過してより大きい粒子を除去し、４ＮのＫＯＨを用いてｐＨ５に調整し（必要であれば）、０．２μｍの（ボトルトップ）フィルタに対して吸引して無菌ろ過して、真菌材料を除去した。上澄みは、４℃（または−２０℃）で貯蔵した。

ＣＳＬ培地は、１００ｇのＣｏｒｎ Ｓｔｅｅｐ Ｓｏｌｉｄｓ（Ｒｏｑｕｅｔｔｅ）、１ｇのＮａＨ_２ＰＯ４^＊Ｈ_２Ｏ、０．５ｇのＭｇＳＯ_４ ^＊７Ｈ_２Ｏ、１０ｇのグルコース^＊Ｈ_２Ｏおよび０．２５ｇのバシルドン（Ｂａｓｉｌｄｏｎ）（消泡剤）で構成された（１リットルあたりの量）。原料を脱塩水中に溶解し、ＮａＯＨまたはＨ_２ＳＯ_４を用いてｐＨをｐＨ５．８に調整し、バッフルおよびフォームボールを有する１００ｍｌのフラスコに２０ｍｌの発酵ブロスを充填し、１２０℃で２０分間滅菌し、その後室温まで冷却してから５０００ＩＵ／ｍｌのペニシリンおよび５ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含有する２００μｌの溶液を各フラスコに添加した。

ＣＳＭ培地は、１５０ｇのマルトース^＊Ｈ２Ｏ、６０ｇのＳｏｙｔｏｎｅ（ｐｅｐｔｏｎ）、１ｇのＮａＨ_２ＰＯ４^＊Ｈ_２Ｏ、１５ｇのＭｇＳＯ_４ ^＊７Ｈ_２Ｏ、０．０８ｇのトウィーン（Ｔｗｅｅｎ）８０、０．０２ｇのバシルドン（消泡剤）、２０ｇのＭＥＳ、１ｇのＬ−アルギニンで構成された（１リットルあたりの量）。原料を脱塩水中に溶解し、ＮａＯＨまたはＨ_２ＳＯ_４を用いてｐＨをｐＨ６．２に調整し、バッフルおよびフォームボールを有する５００ｍｌフラスコに１００ｍｌの発酵ブロスを充填し、１２０℃で２０分間滅菌し、その後室温まで冷却してから、５０００ＩＵ／ｍｌのペニシリンおよび５ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含有する１ｍｌの溶液を各フラスコに添加した。

［実施例２］
［本発明の脂肪分解酵素の精製］
［ステップ１−限外ろ過液の調製］
実施例１で得られた培養物の上澄みを限外ろ過して、酵素活性の決定およびベーキング試験を妨害し得る低分子汚染物を除去した。１０ｋＤａのカットオフを有するフィルタを備えたＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｌａｂｓｃａｌｅ ＴＦＦ系において３０ｍｌの上澄みの限外ろ過を実施した。

その色に応じて、０．５ｍＭのＣａＣｌ_２を含む４０ｍｌ体積の１００ｍＭの冷リン酸緩衝液ｐＨ６．０でサンプルを３〜５回洗浄した。酵素溶液の最終体積は３０ｍｌであった。これはさらに「限外ろ過液」と称される。

ブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）法を用いてサンプルの全タンパク質含有量を決定した（Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ、第２版、Ｊ．Ｍ．ウォーカー（Ｗａｌｋｅｒ）編、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ、Ｔｏｔｏｗａ ２００２年、１５−２１頁）。

［ステップ２−Ａ２８０およびＨＰＳＥＣによる脂肪分解酵素濃度の決定］
脂肪分解酵素に帰属する２８０ｎｍにおける吸光度（Ａ２８０）および算出した脂肪分解酵素の分子吸光係数から限外ろ過液中の脂肪分解酵素の濃度を算出した。Ａ２８０の測定は、Ｕｖｉｋｏｎ ＸＬ Ｓｅｃｏｍａｍ分光光度計（Ｂｅｕｎ ｄｅ Ｒｏｎｄｅ、オランダ国アブコーデ）において実行した。

酵素の分子吸光係数は、酵素分子あたりのチロシン、トリプトファンおよびシステイン残基の数から算出することができる（Ｓ．Ｃ．ギル（Ｇｉｌｌ）およびＰ．Ｈ．フォン・ヒッペル（ｖｏｎ Ｈｉｐｐｅｌ）、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８２、３１９−３２６頁（１９８９年））。これらのアミノ酸の分子吸光係数はそれぞれ１２８０、５６９０および１２０Ｍ^−１．ｃｍ^−１である。本発明の脂肪分解酵素中のチロシン、トリプトファンおよびシステイン残基の数は、配列番号５〜１４からなる群から選択されるタンパク質配列から推定することができる。算出された吸光係数は表１に示される。

脂肪分解酵素に帰属する２８０ｎｍにおける限外ろ過液の吸光度（Ａ２８０）は、酵素サンプルの純度に依存する。この純度は、ＴＳＫ ＳＷ−ＸＬカラム（３００^＊７，８ｍｍ、ＭＷ範囲１０〜３００ｋＤａ）によるＨＰＳＥＣ（高性能サイズ排除クロマトグラフィ）を用いて決定した。溶出緩衝液は２５ｍＭのナトリウムリン酸緩衝液ｐＨ６．０からなり、１ｍｌ／分の流量で使用した。５〜１００μｌのサンプルを注入した。２８０ｎｍにおける吸光度を測定した。

本発明の脂肪分解酵素に帰属する限外ろ過液のＡ２８０は、クロマトグラム中のそれぞれの脂肪分解酵素ピークのピーク表面と、２８０ｎｍで吸収するピークの総表面との比率から得た。次に、限外ろ過液のＡ２８０に上記の比率を乗じ、そして脂肪分解酵素の算出吸光係数（１ｍｇ／ｍｌ溶液−表１の最も右側の列）で割ることによって、限外ろ過液中の脂肪分解酵素の濃度を算出した。

［実施例３］
［活性測定］
脂肪分解酵素の特異性を確立するために、実施例２で得られた限外ろ過液に以下の酵素活性測定を受けさせることができる。
・ リパーゼ
・ ホスホリパーゼＡ_１またはＡ_２
・ リゾホスホリパーゼ
・ ガラクトリパーゼ活性

リパーゼ活性は、色素生産性基質ｐ−ニトロフェニルパルミテート（ｐＮＰＰ）を用いることにより分光光度的に決定した。このアッセイでは、色素生産性基質ｐ−ニトロフェニルパルミテート（ｐＮＰＰ）は２−プロパノール中に溶解され、０．１％のアラビアゴムおよび０．２５％のデオキシコール酸ナトリウムの存在下でリン酸緩衝液ｐＨ７．４中に懸濁される。リパーゼはこの基質溶液と共に３７℃でインキュベートされ、形成されたｐ−ニトロフェニル（ｐＮＰ）は、４０５ｎｍで２．６分間測定される。このアッセイは、リパーゼのｐＨ依存性を決定するために、異なるｐＨ値で適用させることもできる。異なるｐＨ値では異なる緩衝液が必要とされ得ること、あるいは基質を乳化させるために異なる洗剤が必要であり得ることは理解されるべきである。例えばｐＨ＝４において、１．０％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を有する１００ｍＭの酢酸緩衝液が使用される。１リパーゼ単位は、規定の反応条件で１分につき１マイクロモルのｐ−ニトロフェノールを遊離する酵素の量と定義される。異なるアッセイで決定された既知の活性を有する標準較正酵素溶液を用いて、所与のアッセイの活性を較正アッセイにおいて決定され得る単位と相関させることは、ルーチン分析において珍しい実施でないことは理解されるべきである。

あるいは、リパーゼ活性は、２，３−メルカプト−１−プロパノール−トリブチレート（ＴＢＤＭＰ）を基質として用いることにより決定することができる。リパーゼはＴＢＤＭＰのチオエステル結合を加水分解し、それによってブタン酸および２，３−メルカプト−１−プロパノール−ジブチレート、２，３−メルカプト−１−プロパノール−モノブチレートまたは２，３−メルカプト−１−プロパノールを遊離する。遊離したチオール基は次の反応で４，４，−ジチオジピリジン（ＤＴＤＰ）により滴定され、４−チオピリドンが形成される。後者は、３３４ｎｍで吸収する４−メルカプトピリジンと互変異性平衡状態にある。反応は、３７℃において０．２％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、０．６５ｍＭのＴＢＤＭＰおよび０．２ｍＭのＤＴＤＰを含有する０．１Ｍの酢酸緩衝液ｐＨ５．０中で実行される。１リパーゼ単位は、規定の反応条件で１分につき１マイクロモルの４−チオピリドンを遊離する酵素の量と定義される。

ホスホリパーゼＡ活性は、１，２−ジメルカプトジオクタノイル−ホスファチジルコリンを基質として用いることにより分光光度的に決定した。ホスホリパーゼＡは、１位置（ＰＬＡ１）または２位置（ＰＬＡ２）のチオエステル結合を加水分解し、それによってオクタン酸（ｏｃｔａｍｏｉｃ ａｃｉｄ）および１，２−ジメルカプト−モノ−オクタノイル−ホスファチジルコリンまたは１，２−ジメルカプト−ホスファチジルコリンを遊離する。遊離したチオール基は次の反応で４，４’−ジチオジピリジンにより滴定され、４−チオピリドンが形成される。後者は、３３４ｎｍで吸収する４−メルカプトピリジンと互変異性平衡状態にある。反応は、３７℃において０．１Ｍ酢酸緩衝液ｐＨ４．０＋０．２％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００中で実行される。１ホスホリパーゼＡ単位（ＡＰＬＵ）は、規定の反応条件で１分につき１マイクロモルの４−チオピリドンを遊離する酵素の量と定義される。

リゾホスホリパーゼ活性は、リゾホスファチジル−コリンを基質として用いて^３１Ｐ−ＮＭＲ分光法により決定することができる。リゾホスホリパーゼはエステル結合を加水分解し、それによりグリセロール部分から脂肪酸を遊離させる。そのように形成されたグリセロールホスホコリンは、ＮＭＲを用いて定量される。反応は、１ｍｇ／ｍｌのリゾホスファチジルコリンおよび５ｍＭのＣａＣｌ_２をさらに含有する５０ｍＭ酢酸緩衝液ｐＨ４．５中、５５℃で３０分間実行される。１リゾホスホリパーゼ単位（ＬＰＣ）は、規定の反応条件で１分につき１マイクロモルのグリセロールホスホコリンを形成する酵素の量と定義される。

ガラクトリパーゼ活性は、ヒラヤマ（Ｈｉｒａｙａｍａ）およびマツダ（Ｍａｔｓｕｄａ）（１９７２年）Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３６、１８３１頁によって記載される方法に従って、ジガラクトシルジグリセリドを基質として用いてＨ−ＮＭＲ分光法により決定した。ガラクトリパーゼは脂肪酸とグリセロール骨格とのの間のエステル結合を加水分解し、それによって、一方または両方の脂肪酸を遊離させる。反応は、４ｍＭのＣａＣｌ_２、０．２％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００および１ｍｇ／ｍｌのジガラクトシルジグリセリド（脂質産物）をさらに含有する５０ｍＭ酢酸緩衝液ｐＨ４．５中、３０℃で３０分間実行される。１ガラクトリパーゼ単位は、規定の反応条件で１分につき１マイクロモルの脂肪酸を形成する酵素の量と定義される。

分光光度的な測定に加えて、リパーゼ活性は、滴定による測定を用いて決定することもできる。例えば、脂肪分解酵素のエステラーゼ活性は、Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｄｅｘ、第４版、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ Ｐｒｅｓｓ、１９９６年、８０３頁に従って、基質としてのトリブチリンにおいて測定され得る。リパーゼ活性は、好ましくは、より長い脂肪酸、例えばパルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸を有するトリアシルグリセリド基質を用いて決定される。多くの場合、このようなアッセイではオリーブ油が適用される。ホスホリパーゼ、リゾホスホリパーゼおよびガラクトリパーゼも、原則として、滴定による方法を用いて分析することができる。

言及した脂肪分解活性に加えて、サンプルには非脂肪分解性の副活性、例えばα−アミラーゼ活性も存在し得る。真菌α−アミラーゼの活性は、ファデバス（Ｐｈａｄｅｂａｓ）アミラーゼテスト錠剤（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて測定することができる。ファデバス錠剤は、水に溶けないデンプン基質と、基質への架橋によって結合された青色染料とを含有する。基質は真菌アミラーゼによって加水分解され、染色された可溶性のマルトデキストリン（溶液中に入る）を遊離させる。較正曲線は、基準の真菌αアミラーゼ活性を含有する溶液を用いて作成した。

基準サンプルおよび未知のサンプルから、５０ｍＭリンゴ酸緩衝液ｐＨ５．５中の適切な希釈物を調製した。５ｍｌのサンプルを３０℃で５分間インキュベートし、ファデバス錠剤を添加し、そして１５分後に１．０ｍｌの０．５Ｎ水酸化ナトリウムの添加によって反応を停止させた。混合物を５分間室温まで冷却させ、その後、４．０ｍｌの水を添加し、手で振とうさせ、そして１５分後にサンプルを４７００ｒｐｍで１０分間遠心分離させた。上層の吸光度を６２０ｎｍで測定した。ＯＤ６２０ｎｍは真菌αアミラーゼ活性の尺度である。

１真菌アミラーゼ単位（ＦＡＵ）は、本明細書では、規定の反応条件で１時間につき１グラムのデンプン（１００％乾燥物質）を、ヨウ素溶液との反応後に既知の強度の６２０ｎｍの透過率を有する産物に転化する酵素の量と定義される。

言及した活性に加えて、グルコアミラーゼ、プロテアーゼおよびキシラナーゼの微量の活性も存在したが、非常に少量なのでこれらの酵素は以下の実施例で記載されるベーキング実験において妨害しなかった。表２に要約されるように、実施例１で得られた無細胞限外ろ過液にリパーゼ、ホスホリパーゼおよびガラクトリパーゼアッセイを受けさせた。

種々のアッセイにおいてただ１つの基質のみが存在すること、そして種々の脂質（ｌｉｐｏｉｄｉｃ）基質の混合物あるいは生地などの工業用途において活性数が実際の活性を予測しないことに注意すべきである。このような場合、基質に対する親和性または特異性が重要になる。

［酵素の特徴付け］
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分子量推定は、限外ろ過液サンプルにおいてＮｕＰａｇｅ４〜１２％ＭＥＳ Ｓｉｍｐｌｙ Ｂｌｕｅ Ｓａｆｅ Ｓｔａｉｎを用いて実施した。ＬＩＰ０１については推定Ｍｗ＝３３ｋＤである。ＬＩＰ０２については、推定Ｍｗ＝３３ｋＤである。ＬＩＰ０３については、Ｍｗ＝３３ｋＤおよびＭｗ＝４１ｋＤに相当する２つの主要なバンドを観察した。

［等電点電気泳動実験］
成熟ＬＩＰ０１の２７５アミノ酸タンパク質の算出ｐＩ：５。ＬＩＰ０１の翻訳遺伝子の算出ｐＩ：５．４。ＬＩＰ０２の翻訳遺伝子の算出ｐＩ：５．４。成熟２７６アミノ酸ＬＩＰ０２タンパク質の算出ｐＩ：５．５。ＬＩＰ０２のｐＩは、ゲル電気泳動および両性電解質範囲３〜１０を用いて実験的に決定した。ＩＥＦ実験は４〜５の範囲の多数のバンドを示し、主要なバンドはｐＩ＝４．７およびｐＩ＝４．３である。成熟２７６アミノ酸ＬＩＰ０３タンパク質の算出ｐＩ：５．１（配列１を用いる）。３４８アミノ酸の翻訳ＬＩＰ０３遺伝子の算出ｐＩ：５．１（配列１０を用いる）。３１４アミノ酸の翻訳ＬＩＰ０３遺伝子の算出ｐＩ：４．８（配列１４を用いる）。Ａ．ニガー（ｎｉｇｅｒ）で産生されたＬＩＰ０３リパーゼの等電点電気泳動は、ｐＩ＝４からｐＩ＝５．０までの範囲の多数のバンドを示し、主要なバンドはおよそｐＩ＝４．７およびｐＩ＝４．４であった。

［グリコシル化の決定］
グリコシル化はＰＡＡ−ＳＤＳゲルにおける観察分子量に影響を与え得る。通常、分子量は過剰評価される。ＬＩＰ０１〜０３タンパク質がグリコシル化されているかどうかを検証するため、そしてタンパク質の分子量を有効に決定するために、タンパク質サンプルをＰＮＧＡＳＥ−Ｆグリコシダーゼで処理して、タンパク質を脱グリコシル化した。続いて、処理サンプルおよび未処理サンプルの両方にＰＡＡ−ＳＤＳゲル電気泳動を受けさせた。２つの可能性のあるＮ−グリコシル化部位が、成熟２７５ＬＩＰ０１アミノ酸タンパク質に存在する：１２６ＮＬＴＦおよび２６４ＮＹＴＦ。１つの可能性のあるグリコシル化部位が、成熟２７６アミノ酸ＬＩＰ０２タンパク質に存在する：２６４ＮＹＴＦ。未処理のＬＩＰ０２はおよそ３３ｋＤのバンドを示すが、脱グリコシル化の後、バンドはおよそ３０ｋＤで観察される。１つの可能性のあるＮ−グリコシル化部位は、成熟２７６アミノ酸タンパク質に存在する：２６４ＮＹＴＦ。未処理のＬＩＰ０３は２つのバンドを示し、１つはおよそ３３ｋＤであり、１つはおよそ４１ｋＤである。脱グリコシル化の後、再度２つのバンドが観察され、１つはおよそ３０ｋＤであり、１つはおよそ３８ｋＤである。これらの結果は、いずれも同程度にグリコシル化された２つの形態のＬＩＰ０３が生じることを示唆する。

糖タンパク質の特徴付けおよび取扱いは、Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ、第２版、Ｊ．Ｍ．ウォーカー（Ｗａｌｋｅｒ）編、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ、Ｔｏｔｏｗａ ２００２年、第ＶＩ章に広範囲にわたって記載されている。

産生された脂肪分解酵素のそのままの質量（ｉｎｔａｃｔ ｍａｓｓ）は、以下の手順に従ってＬＣ／ＭＳを用いて決定することができる。

１３０００ｒｐｍ、４℃で１５分間の遠心分離により１０ｋＤａ遠心分離機フィルタ（Ｐａｌｌ）に対してろ過することによって、タンパク質サンプルを脱塩した。ペプチド−Ｎ−グリコシダーゼＦ（ＰＮＧａｓｅ、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ、独国マンハイム）を用いる酵素脱グリコシル化によって脱グリコシル化を行った。ＬＩＰ０１〜ＬＩＰ０３のろ液を１００ｍＭの重炭酸アンモニウム中に溶解し、９５℃で１０分間のインキュベーションによって変性させた。ＰＮＧＡＳＥ−Ｆ（２０単位）をサンプルに添加し、３７℃で一晩のインキュベーションによって脱グリコシル化を実行した。脱グリコシル化の後、１３０００ｒｐｍで１５分間の遠心分離により１０ｋＤａ遠心分離機フィルタ（Ｐａｌｌ）に対してサンプルをもう一度ろ過して糖を除去した。脱塩からのろ液および脱グリコシル化後のろ液を５０／５０／５のＡｃＮ／ＭＱ／ＦＡ中に溶解し、最終濃度を約１ｍｇ／ｍＬにした。サンプルを直接注入によりＱＴＯＦＩＩ質量分析計に注入し、Ｍａｓｓｌｙｎｘソフトウェア（バージョン４ｓｐ２、Ｗａｔｅｒｓ）においてＭａｘＥｎｔ１対数を用いてそのままの質量を算出した。

ＬＩＰ０２に対して、そのままのＬＩＰ０２サンプルのＭＳスペクトルの逆重畳積分によって３２２６５の分子量が算出された。脱グリコシル化ＬＩＰ０２に対して、２９９０５Ｄａのそのままの質量が算出され、これは、理論上のアミノ酸配列（配列番号２）の残基３５〜３１０に相当する。脱グリコシル化の前後に観察されたそのままの質量の違いは、おそらくタンパク質に付着した１２個のマンノース基および２個のＧｌｃＮＡＣ基に相当する。

脱グリコシル化ＬＩＰ０３に対して、そのままの質量が２つ以上観察された。Ｃ末端ペプチドを有するおよび有さないＬＩＰ０３のそのままの質量を両方とも算出し、それぞれＭＷ＝２９８３５（配列３、３５〜３１０）およびＭＷ＝３４１００（配列６、３５〜３４８）であった。さらに、残基３５〜３０９（配列４）および３５〜３０８（配列５）の質量も観察されたが、特に残基３５〜３０９は残基３５〜３１０と比べてかなり大きいので、ＭＷ＝２９８３５（配列３）断片のＣ末端は不規則である。これは、ＬＩＰ０３のＣ末端の切断が完全に特異的ではないことを示す。

［ｐＨ最適条件］
脂肪分解酵素のｐＨ最適条件依存性は、特定のタイプの脂肪分解活性を種々のｐＨ値で測定するアッセイを実行することによって決定することができる。最大活性が観察されるｐＨが特定の酵素のｐＨ最適条件である。ｐＨ最適条件は基質のタイプおよび適用されるアッセイ条件に依存し得るので、異なる基質が使用される場合、またはアッセイ条件が大幅に変化する場合には再確認されなければならない。

［温度最適条件］
脂肪分解酵素の温度最適条件は、所与のアッセイを種々の温度で実行することによって決定される。活性を温度の関数としてプロットすることによって、酵素の温度最適条件を決定することができる。

［熱安定性］
脂肪分解酵素の熱安定性は、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）によって決定することができる。代案として、熱安定性はＴ５０決定によって分析されてもよい。Ｔ５０は、脂肪分解酵素を所与の条件で２０分間加熱したときに活性の５０％が損失される温度と定義される。

貯蔵安定性は、特定の温度において特定の条件下で脂肪分解酵素を貯蔵することによって決定することができる。種々の期間の後、サンプルを取り、標準アッセイ条件下でこれらのサンプル中の残留活性が決定される。

［実施例４］
［ベーキング実験−ミニバタール］
２００ｇの小麦粉（Ｋｏｌｉｂｒｉ^ＴＭ）、４．６ｇの圧縮酵母、４ｇの塩、６８ｐｐｍのアスコルビン酸、１ｐｐｍのＢａｋｅｚｙｍｅ（登録商標）Ｐ５００（真菌α−アミラーゼ）、５ｐｐｍのＢａｋｅｚｙｍｅ（登録商標）ＨＳＰ６０００（真菌ヘミセルラーゼ）、および１１４ｍｌの水を混合することによって得られた１５０グラムの生地片からミニバタールを焼いた。ピンミキサー内で６分１５秒間混合した後、生地を１５０ｇの２つの片に分割し、丸めて、周囲温度および９０％の相対湿度で２５分間発酵させた。次に、生地片を成形して形作り、３２℃および８５％相対湿度で１００分間発酵させた。完全に発酵した生地片に切込みを入れ、初めに水蒸気を添加して、２４０℃のオーブンで２０分間焼いた。

異なる用量における脂肪分解酵素ＬＩＰ０１〜ＬＩＰ０３の様々な効果を、ブランクの余分な添加物を含有しないローフ、および０．３％のＤＡＴＥＭ（Ｐａｎｏｄａｎ（登録商標）８０ＣＰ）を含有する対照ローフと比較した。ローフを冷却した後、自動パン体積アナライザー（ＢＶＭ−３、ＴｅｘＶｏｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ ＡＢ、スウェーデン国ヴィーケン）によってローフ体積を決定した。表３に描かれるスケールに従って熟練したベーカーによりその他の効果を評価した。

［実施例５］
［ベーキング実験−フルスケールバタール］
脂肪分解酵素ＬＩＰ０１〜ＬＩＰ０２のベーキング性能はフルスケールバタールでも試験した。Ｄｉｏｓｎａミキサー内で、３０００ｇの小麦粉（Ｋｏｌｉｂｒｉ^ＴＭ）、７０ｇの圧縮酵母、６０ｇの塩、５０ｐｐｍのアスコルビン酸、２ｐｐｍのＢａｋｅｚｙｍｅ（登録商標）Ｐ５００（真菌α−アミラーゼ）、１５ｐｐｍのＢａｋｅｚｙｍｅ（登録商標）ＨＳＰ６０００（真菌ヘミセルラーゼ）および１７４０ｍｌの水を速度１で２分間混合し、速度２において１００Ｗｈで２７℃の最終生地温度にした。生地を３５０ｇの６片に分割し、丸めて、３２℃および９０％相対湿度で２０分間発酵させた。その後、生地片を成形して形作り、３４℃、９０％相対湿度で１００分間発酵させた。完全に発酵した生地片に切込みを入れ、初めに水蒸気を添加して、２４０℃のオーブンで３０分間焼いた。

生地および最終焼成製品の両方において、異なる用量における脂肪分解酵素の様々な効果を、ブランクの余分な添加物を含有しないローフ、および０．３％のＤＡＴＥＭ（Ｐａｎｏｄａｎ（登録商標）８０ＣＰ）を含有する対照ローフと比較した。室温まで冷却した後、自動パン体積アナライザー（ＢＶＭ−３、ＲＩ Ｃａｒｄｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ ＡＢ、スウェーデン国ヴィーケン）によってローフ体積を決定した。表６に描かれるスケールに従って熟練したベーカーにより、その他の効果を手動で視覚的に評価した。結果は表７および表８に示される。

［実施例６］
［ミニバタールの生地における脂質の転化の決定］
［極性脂質］
凍結乾燥および粉砕した完全発酵生地（実施例３を参照）を水飽和したブタノールと激しく振とうさせることによって脂質を抽出した。遠心分離の後、ＬｉＣｈｒｏｓｐｈｅｒ １００ＤＩＯＬ５μｍ（２５０×４．０ｍｍ）におけるＨＰＬＣで透明な上澄みが分析され、Ｅｖａｐｏｒａｔｉｖｅ Ｌｉｇｈｔ Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ（Ａｌｌｔｅｃｈ ＥＬＳＤ２０００ＥＳ）によって１．５ｌ／分の窒素流量、８０℃の温度、インパクターオンで、脂質（ｌｉｐｏｉｄｉｃ）成分を検出した。１．０ｍｌ／分の流量で２つの移動相を勾配プログラムで用いて溶出を行った。
Ａ：ヘプタン／イソプロパノール／ブタノール／テトラヒドロフラン／イソオクタン／水（６４．５／１７．５／７／５／５／１）
Ｂ：イソプロパノール／ブタノール／テトラヒドロフラン／イソオクタン／水（７３／７／５／５／１０）
両方の溶出溶液に、１リットルあたり７７μｌのアンモニア性溶液および７７μｌのトリフルオロ酢酸が添加される。
勾配プログラム：２０μｌの注入体積および８０℃のカラム温度において、２５分間で１００％Ａから１００％Ｂまで直線的、そして１００％Ｂで５分間、次に０．５分間で１００％Ｂから１００％Ａまで直線的勾配、そして最後に１００％Ａで５分間。

ガラクト脂質、リン脂質、トリ−、ジ−およびモノグリセリド、例えばモノガラクトシルジグリセリド、モノガラクトシルモノグリセリド、ジガラクトシルジグリセリド、ジガラクトシルモノグリセリド、ホスファチジルコリンおよびリゾホスファチジルコリンのリファレンスを用いて様々な化合物の溶出順序を示し、その応答因子および生地中の存在量を算出した。

表９および表１０には、様々な量のＬＩＰ０１〜ＬＩＰ０２を含有する完全発酵生地中の主な極性脂質の量が示される。これらの結果から、モノガラクトシルジグリセリドと比較して、そしてホスファチジルコリンとも比較してジガラクトシルジグリセリドを参照すると、ＬＩＰ０１〜ＬＩＰ０２が比較的低い用量でガラクトシルジグリセリドをガラクトシルモノグリセリドに効率的に転化させることは明らかである。

さらに、２．４ｐｐｍの用量（ブラッドフォードタンパク質）では、実施例４の最適なベーキング結果は、最も高レベルのジガラクトシルモノグリセリドと一致することも明らかである。

［無極性脂質］
凍結乾燥および粉砕した完全発酵生地（ベーキング実施例１を参照）を、１％酢酸を含有するヘプタンと激しく振とうさせることによって無極性脂質を抽出した。遠心分離の後、Ｓｐｈｅｒｉｓｏｒｂ Ｓ３ＣＮ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ ＯＯＤ−００９７−ＥＯ、１００×４．６ｍｍ）におけるＨＰＬＣで透明な上澄みが分析され、Ｅｖａｐｏｒａｔｉｖｅ Ｌｉｇｈｔ Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ（Ａｌｌｔｅｃｈ ＥＬＳＤ２０００ＥＳ）によって１．５ｌ／分の窒素流量、４０℃の温度、インパクターオフで、脂質（ｌｉｐｏｉｄｉｃ）成分が検出される。１．０ｍｌ／分の流量、２０μｌの注入体積および周囲カラム温度で２つの移動相（Ａ：ヘプタン、およびＢ：１％酢酸を含有するｔｅｒｔ−ブチルーメチルエーテル）を以下の直線的な勾配プログラムで用いて溶出を行った。

トリ−、ジ−、モノグリセリドおよび脂肪酸のリファレンスを用いて、様々な化合物の溶出順序を示し、その応答因子および生地中の存在量を算出した。

Claims (20)

1. （ａ）配列番号２の単離ポリヌクレオチド、
   （ｂ）配列番号２の単離ポリヌクレオチドと高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズ可能であり、脂肪分解酵素活性を有するポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド、
   （ｃ）配列番号５〜７のいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド、および
   （ｄ）配列番号５〜７のいずれかのアミノ酸配列において、１つまたは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは挿入されたアミノ酸配列からなり、脂肪分解酵素活性を有するポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド、
   からなる群から選択される単離ポリヌクレオチド。
2. （ａ）配列番号３の単離ポリヌクレオチド、および
   （ｂ）配列番号８又は９のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド、
   からなる群から選択される単離ポリヌクレオチド。
3. 合成的に製造された、請求項１又は２に記載の単離ポリヌクレオチド。
4. 請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド配列を含むベクター。
5. 請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドが、適切な宿主細胞における前記ポリヌクレオチドの発現に適した制御配列と作動可能に連結された請求項４に記載のベクター。
6. 前記適切な宿主細胞が糸状菌である請求項５に記載のベクター。
7. 請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドまたは請求項４〜６のいずれか一項に記載のベクターを製造するための方法であって、
   前記ポリヌクレオチドまたは前記ベクターで形質転換された宿主細胞を培養するステップと、
   前記ポリヌクレオチドまたは前記ベクターを前記宿主細胞から単離するステップと
   を含む方法。
8. （ａ）配列番号５〜７のいずれかのアミノ酸配列からなる単離ポリペプチド、
   （ｂ）配列番号５〜７のいずれかのアミノ酸配列において、１つまたは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは挿入されたアミノ酸配列からなり、脂肪分解酵素活性を有する単離ポリペプチド、
   （ｃ）適切な宿主細胞において請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドまたは請求項４〜６のいずれか一項に記載のベクターを発現させることによって得られる単離ポリペプチド、および
   （ｄ）配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有し、脂肪分解活性を有し、９４番目の位置にアスパラギン酸残基を有し、前記位置は配列番号９のアミノ酸配列に基づいて定義される、単離ポリペプチド、
   からなる群から選択される単離ポリペプチド。
9. 配列番号８又は９のアミノ酸配列からなる単離ポリペプチド。
10. 請求項８又は９に記載のポリペプチドを製造するための方法であって、
    請求項１〜３のいずれか一項に記載の単離ポリヌクレオチドまたは請求項４〜６のいずれか一項に記載のベクターで適切な宿主細胞を形質転換するステップと、
    前記ポリヌクレオチドの発現を可能にする条件下で前記細胞を培養するステップと、
    任意で、前記細胞または培地からコード化ポリペプチドを精製するステップと
    を含む方法。
11. 請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドまたは請求項４〜６のいずれか一項に記載のベクターを含む組換え宿主細胞。
12. 請求項８又は９に記載のポリペプチドを発現する組換え宿主細胞。
13. 請求項８又は９に記載の単離ポリペプチドの、生地の調製における使用。
14. 請求項８又は９に記載のポリペプチドを生地原料の少なくとも１つに添加するステップを含む、生地の調製法。
15. 請求項８又は９に記載のポリペプチドを含む生地。
16. 請求項１５に記載の生地を焼くステップを含む、焼成製品の調製法。
17. 請求項１６に従って得ることができる焼成製品。
18. パンである、請求項１７に記載の焼成製品。
19. 増大した体積、改善されたクラム構造、改善されたクラム柔軟性、低減した気泡形成および改善された老化防止からなる群から選択される、請求項８又は９に記載のポリペプチドを加える前と後とを比較することによって少なくとも１つの改善された特性を有する、請求項１７又は１８に記載の焼成製品。
20. ａ．焼成製品の調製、
    ｂ．ジガラクトシルジグリセリド含有源からのジガラクトシルモノグリセリドの製造、
    ｃ．小麦グルテンからのグルコースシロップの製造、
    ｄ．植物油の脱ガム、および
    ｅ．リン脂質乳化剤の改変
    からなる群から選択される工業的過程の１つにおける、請求項８又は９に記載の単離ポリペプチドの使用。