ANÁLISIS DE SEMEN Campo de la Invención Esta invención se refiere al análisis de semen. Antecedentes de la Invención De acuerdo con las estadísticas de WHO (por sus siglas en inglés) , 8-10% de todas las parejas casadas consultan a los profesionales médicos después de que no pueden concebir. Arriba de 40 millones de parejas están siendo tratadas actualmente por infertilidad. Entre estas parejas infértiles, se estima que la infertilidad en 40% de las parejas se debe a causas de origen masculino, y otro 20% se debe a causas de origen femenino y masculino combinadas. El análisis del semen es una técnica principal en la evaluación de las causas de origen masculino. El protocolo de análisis del semen estándar involucra la determinación de al menos tres parámetros del semen principales: 1. La concentración total del esperma (TSC (por sus siglas en inglés) ) ; 2. el porcentaje del esperma móvil, y 3. el porcentaje de morfologías del esperma normales. Para todos los propósitos prácticos, el análisis del semen, un factor clave en la medicina de la fertilidad de los seres humanos de sexo masculino, no ha cambiado desde los años 1930 y todavía se hace en el presente por inspección Ref .152124 microscópica. En efecto, es uno de los muy pocos análisis de fluido corporal que permanece in vitro, todavía efectuado casi solamente por medio de métodos manuales . Esta metodología manual involucra observar cuidadosamente las células del esperma, contarlas para determinar su concentración, clasificar su motilidad, identificar su morfología, etc. Este trabajo requiere una experiencia elevada, es de trabajo muy intenso y si se hace de acuerdo con los protocolos estándares, toma al menos una hora por prueba. Las evaluaciones manuales ya se sabe que van a ser inexactas debido a numerosas fuentes de error. Las principales fuentes de .error son: La subjetividad del observador. - Los criterios variables utili2ados en los diferentes laboratorios y por los diferentes observadores. Los grandes errores estadísticos debidos al número limitado del esperma analizado. El manual de la HO (WHO laboratory manual for the examination of human semen and sperm-cervical mucus interaction. 4/a. edición, Cambridge University Press, 1999) recomienda observar no menos de 200 espermas y clasificar la morfología y motilidad de cada uno. Este por sí mismo es un procedimiento de introducción de error debido a la naturaleza tediosa y que consume tiempo de la tarea. En la práctica, 50 hasta 100 células del esperiaa son analizadas cuando mucho. Aún si el observador no introduce errores, el error estadístico solo alcanza decenas de porcentajes. Como resultado de la metodología anterior, los resultados de prueba del análisis de semen se reconoce globalmente que van a ser- altamente subjetivos, inexactos y pobremente reproducibles . Las variaciones internas del laboratorio y de los técnicos internos son de tales proporciones que este asunto es de interés principal en la medicina de fertilidad de personas del sexo masculino y el tema no resuelto de la discusión en la vasta mayoría de conferencias, congresos y convenciones sobre el tema. Para superar estas dificultades, las compañías de instrumentación médica han introducido sistemas computarizados destinados basados en análisis de la imagen (CASA - Analizadores de Semen Auxiliados por Computadora) (por sus siglas en inglés) . Estos sistemas requieren una imagen de calidad extremadamente elevada a causa de que todos sus resultados están basados en el procesamiento de la imagen. Aunque estos sistemas han intentado reemplazar el análisis manual y establecer estándares aceptados en la industria, los mismos no han tenido éxito en ninguno de estos ob etivos . El primer objetivo podría no ser logrado a causa de que los resultados del análisis continúan siendo dependientes de ajustes manuales y de diferentes hechuras del equipo. Reemplazar el análisis de rutina normal es totalmente impracticable a causa de que los sistemas son extremadamente costosos, complejos y difíciles de usar. El hecho es que tales sistemas generalmente no son encontrados en el análisis del semen de rutina pero se ha establecido en lugar de esto su posición conveniente casi solamente en los centros de investigación, los hospitales universitarios y ocasionalmente en centros de fertilidad altamente especializados. Un método adicional para las mediciones del semen es descrito en las Patentes US Nos. 4,176,953 y 4,197,450, cuyos contenidos completos son incorporados aquí. Estas patentes describen un método de medición de la motilidad del esperma utilizando medios electro-ópticos y un analizador de señal analógica. Una suspensión de las células del esperma es examinada continuamente en un campo predeterminado para detectar las variaciones en la densidad óptica por el movimiento del esperma. Una señal eléctrica analógica modulada por la amplitud es generada en respuesta a las variaciones, y las crestas y valles de esta señal son contadas durante un período de tiempo predeterminado para proporcionar un parámetro abstracto llamado Indice de Motilidad del Esperma (SMI (por sus siglas en inglés) } . Este parámetro está relacionado con la motilidad y proporciona lecturas las cuales son proporcionales al número de células móviles multiplicadas por su respectiva velocidad. Un analizador automático del esperma llamado el Analizador de la Calidad del Esperma (SQA (por sus siglas en inglés)), el cual proporciona el parámetro SMI, ha estado en el mercado durante algunos años. El analizador es utilizado de la siguiente manera: un espécimen de esperma es recibido por una cámara desechable la cual tiene un bulbo de caucho en un extremo para aspirar la muestra, y un compartimiento de medición delgado en el otro extremo. Después de aspirar la muestra, el compartimiento de medición es insertado en el SQA y el SMI de la muestra es determinado automáticamente. El parámetro SMI, aunque útil en algunas aplicaciones, no fue aceptado significativamente por la comunidad médica como una alternativa viable para las mediciones convencionales microscópicas del semen. Es un conocimiento común que en algunos campos del análisis de fertilidad veterinaria, la concentración del esperma total (TSC) , es evaluada midiendo la turbidez óptica del espécimen. El principio físico debajo de este método es que las células del esperma son más opacas que el plasma seminal circundante, y la absorción de un haz de luz por el espécimen por lo tanto es proporcional a TSC. Por ejemplo, la Patente U.S. No. 4,632,562 describe un método de medición de la densidad del esperma midiendo la absorbancia óptica de una muestra que contiene el esperma y relacionando la señal de salida de la absorbancia con la densidad utilizando al menos tres canales de sumatoria. El método descrito está propuesto para su uso en la inseminación artificial en la industria de la cria de ganado, y mide la absorbancia óptica en la gama de 400-700 nm. Sin embargo, esta tecnología no pudo y no podría ser adoptada para uso humano por las siguientes razones: (1) Las concentraciones del esperma humano en el intervalo normal (y aún en casos más elevados que los normales) , son mayores que un orden de magnitud inferior que en la mayoría de sus contrapartes veterinarias - en donde esta tecnología ha sido adoptada. (2) Los casos humanos son tratados aún cuando las concentraciones del esperma estén demasiado abajo de sus niveles normales. Este por supuesto no es el caso para los animales . Los animales infértiles normalmente son desechados - en cualquier caso, los mismos no son tratados por infertilidad. (3) la TSC en los seres humanos es un parámetro, el cual por sí mismo, es totalmente insuficiente para investigaciones de fertilidad, y el análisis microscópico es requerido en cualquier caso para todos los otros datos en el protocolo del análisis del semen estándar. A un alto grado, esto también es mantenido para aplicaciones veterinarias. Esto hecho hace superfluas a las mediciones de absorción óptica, y no se ha invertido en esfuerzos reales en este campo . Existe asi una necesidad de una técnica objetiva, simple, para la medición de TSC en el semen humano. De acuerdo con el manual de WHO, la evaluación de la motilidad del esperma (considerada por la mayoría que va a ser el parámetro del semen único más importante) puede ser llevado a cabo manualmente utilizando un sistema de rejilla bajo el microscopio o, alternativamente, por el uso de CASA. CASA proporciona algunas ventajas sobre los métodos manuales. Sin embargo, la exactitud y provisión de los datos cuantitativos son totalmente dependientes de las técnicas de preparación precisa del semen y de los ajustes del instrumento. Estos factores (experiencia elevada y medio ambiente sofisticado) en compañía del costo prohibitivo de tal instrumentación excluyen para todos los propósitos prácticos su aplicación para el análisis del semen de rutina. La Patente U.S. No. 4,896,966 describe un explorador de la motilidad para la caracterización del movimiento del esperma, las bacterias y las partículas en el fluido. El explorador comprende un sistema óptico que incluye un lente de colimación, un lente de condensación, un lente de formación de imagen y un par de elementos reflejantes, una fuente de iluminación, medios sensibles a la radiación, medios de procesamiento de la señal, y medios de pantalla. El lente de formación de imágenes tiene una profundidad útil del campo en su plano del objeto de al menos aproximadamente 0.2 nnti. Breve Descripción de la Invención Es un objeto de la presente invención proporcionar un método para evaluar TSC.- Es un objeto adicional de la invención proporcionar un método para determinar la concentración del esperma móvil
(MSC (por sus siglas en inglés)) y el % de la motilidad. Todavía es un objeto adicional de la invención proporcionar un dispositivo de muestreo para su uso en la determinación de los parámetros del semen. Es otro objeto de la invención proporcionar un sistema para la determinación de los parámetros del semen. En un primer aspecto de la invención, se proporciona un método para la medición de la concentración total del esperma (TSC) en una muestra. El método comprende
(i) colocar la muestra en un recipiente transparente entre una fuente de luz pulsada sincrónicamente y un fotodetector, y (ii) medir la absorbancia óptica de la muestra en el intervalo de 800-1000 nm, la TSC de la muestra es proporcional a la absorbancia. El método de la invención proporciona una medición objetiva de TSC la cual no es dependiente del análisis de la imagen, y el cual puede medir la TSC humana. Sin embargo, el método también puede ser utilizado para medir la TSC de animales . En un segundo aspecto de la invención, se proporciona un dispositivo de muestreo para su uso en el análisis óptico de un fluido biológico, que comprende: (i) un aspirador para aspirar el fluido en el dispositivo; (ii) una cámara de medición delgada que tiene paredes superior e inferior, la distancia entre las paredes está en el intervalo de 100-500 micrones; (iii) una cámara de medición gruesa que tiene paredes superior e inferior, la distancia entre las paredes está en el intervalo de 0.5-3 cm; y (iv) medios para excluir el aire desde las cámaras de medición. En una modalidad preferida, el fluido biológico es el semen, más preferentemente el semen humano. El dispositivo sirve tanto como un dispositivo de muestreo como una cámara de prueba doble, haciendo posible la prueba simultánea de TSC y MSC. Ninguna dilución es requerida para cualquiera de las mediciones. Esto no solamente ahorra trabajo sino también elimina una fuente significativa de errores - especialmente, la inexactitud de la dilución. El dispositivo también hace posible (cuando se requiere) visualizaciones integradas del espécimen sin transferirlo a una cámara de observación separada. La cámara de medición gruesa también es referida como un densitómetro óptico . En un tercer aspecto de la invención, se proporciona un método para la medición de la concentración del esperma móvil (MSC) - en una muestra del semen, que comprende : (i) colocar la muestra en un recipiente transparente entre una fuente de luz y un fotodetector, en donde el movimiento del esperma en la muestra modula la luz transmitida a través del mismo, por lo cual se genera una señal; (ii) muestrear la señal para producir una pluralidad de muestras de la señal; (iü) seleccionar señales aceptables; (iv) calcular un valor absoluto para cada una de las muestras de la señal aceptable; (v) calcular una a promedio de los valores absolutos; y
(vi) calcular el MSC basado en a promedio. Ahora se ha descubierto que el análisis de las formas de las ondas de las señales analógicas derivadas de un rayo de luz que atraviesa una muestra de semen puede proporcionar una indicación del MSC. Usando criterios seleccionados apropiadamente, se encontró que existe una excelente correlación entre el área promediada cubierta por la forma de la onda y la MSC. La MSC de una muestra de esperma es obtenida de acuerdo con la invención por el análisis de las propiedades ópticas de la muestra, las cuales varían durante el transcurso del tiempo debido a la motilidad del esperma. Esta es un efecto, la amplitud de la señal promedio en las porciones -relevantes de la forma de la onda, como será descrito con mayor detalle posteriormente. En un cuarto aspecto de la invención, se proporciona un método de determinación de la velocidad promedio (AV (por sus siglas en inglés) ) de las células del esperma, que comprende: (i) obtener un Indice de Motilidad del Esperma (SMI) de las células del esperma como se definió en la Patente US No. 4,176, 953; (ii) obtener la MSC; y (iii) calcular AV utilizando una expresión algebraica que involucra la relación de SMI/MSC. Se hace referencia aquí a la Patente US No. 4,176, 953 expedida el 4 de diciembre de 1979, y la cual ha sido implementada en varias versiones de Analizadores de la Calidad del Esperma por Medical Electronic Systems, Israel. Esta patente, cuando se aplica al análisis de semen, proporciona un parámetro llamado SMI (Indice de Motilidad del Esperma) . Como se describió en la patente anterior y se probó en numerosos estudios de soporte, el SMI es una función tanto de la concentración de las células móviles (lo que es referido como MSC) como de su velocidad promedio (AV) . Por razones de simplificación, se puede decir que el SMI es una función de MSCxAV, o AV es una función de SMI/MSC. La velocidad promedio de una muestra de esperma puede proporcionar una indicación de la calidad de la motilidad del esperma . Sin importar lo que se estableció anteriormente, el SMI como una función de MSC y AV es más compleja que una multiplicación directa. Después de observación, análisis y medición sobre muestras de semen por centenas, la interrelación correcta (fórmula) entre ellas ha sido desarrollada. En términos generales, la fórmula para extraer la velocidad promedio puede ser definida como: AV=f (SMI/MSC) , la "f" es un polinomio de tercer grado. Trabajando con f (x) = 1/lOOOx3 + l/10x2 + 0.89x, se proporcionó un factor de correlación de r = 0.82. Se debe señalar que la mayoría de protocolos del análisis de semen requieren datos sobre el % de esperma que tiene motilidad progresiva en lugar de su velocidad promedio. La motilidad progresiva está definida como la de aquellos espermas que tienen una velocidad promedio de 5 micrones/segundo o mayor. Este parámetro también puede ser extraído fácilmente de la velocidad promedio si una dispersión normal de las velocidades es supuesta alrededor del promedio. Aún en los casos en donde la dispersión de la velocidad no es normal, el error en el cálculo del % del esperma móvil progresivamente no es afectado significativamente. Además, cuando son definidas velocidades mínimas diferentes como de movilidad progresiva, este umbral variable es introducido fácilmente en el cálculo, por lo cual se proporciona una flexibilidad extra en la provisión de este parámetro. Esto es importante cuando se trabaja en diferentes medios de dilución, temperaturas ambientales o de hecho diferentes especies en mediciones de examen. En un quinto aspecto de la invención, se proporciona un sistema para analizar la viabilidad del esperma, que comprende: (i) medios para medir TSC; (ii) medios para medir MSC; y (iii) un sistema de visualización de video. El sistema de la invención combina la medición de los dos parámetros principales del esperma TSC y MSC, con la visualización tradicional del esperma, haciendo posible asi la adquisición del tercer parámetro - la morfología del esperma. En una modalidad preferida, TSC y/o MSC son determinados de acuerdo con los métodos de la invención. En otra modalidad preferida, el sistema comprende además un dispositivo de muestreo de la invención. Se debe enfatizar que existe una diferencia básica entre el sistema de visualización de video utilizado en el sistema de la invención y otros sistemas de visualización del esperma (tales como CASA) . Los otros sistemas requieren imágenes de calidad extremadamente elevada a causa de que la totalidad de sus resultados son construidos durante el procesamiento de la imagen. En la presente invención, por otra parte, la visualización es utilizada solamente como una herramienta complementaria para observar casos atipicos o sospechosos, para agregar confianza a los resultados procesados, para identificar patologías específicas y para hacer posible la evaluación manual de la morfología del esperma, cuando se requiera. Para satisfacer estas tareas, el sistema de visualización de video utilizado en la invención está diseñado como un subsistema económico, compacto, el cual aunque es de uso limitado como un elemento autónomo, satisface de manera precisa un papel complementario en el sistema de la invención. Una ventaja importante adicional del sistema de visualización cuando se compara con los procedimientos microscópicos, es que la transferencia por medio de una pipeta, la preparación de portaobjetos, las diluciones y el llenado de los hemocitómetros es innecesario . El uso, junto con el sistema de visualización de video, del dispositivo de la invención, el cual se desempeña como una cámara de prueba completa, elimina todo lo anterior. Estas características, permiten y hacen posible en efecto el uso del sistema de la invención en cualquier medio ambiente clínico pequeño o aún en la oficina. El sistema de visualización de video le permite a uno obtener información suplementaria con respecto a la muestra probada: 1. Medición de concentraciones de esperma muy bajas La medición de TSC a concentraciones muy bajas (abajo de 5 millones de espermas/ml) está limitada inherentemente en su exactitud. Esto se debe al hecho de que la absorción de la luz por los factores diferentes de las células del esperma, puede llegar a ser relativamente significativa a estos niveles bajos. La absorción de la luz se puede deber a la variabilidad del plasma seminal o a la presencia de células diferentes del esperma. Estas últimas incluyen WBCs (células blancas de la sangre que indican infecciones) y otras células inmaduras o no espermáticas de varias fuentes, etc. Puesto que de acuerdo con la invención TSC es medido por absorción óptica, sin visualización podría existir una posibilidad de ambigüedad en intervalos muy bajos debido a las consideraciones mencionadas anteriormente. Cuando TSC es considerado importante en los intervalos bajos, la visualización hace posible la diferenciación entre las diferentes células que contribuyen a la absorción de la luz. Puesto que MSC es medida independientemente de la absorción de la luz, el % de motilidad (MSC/TSC) puede ser calculado utilizando el parámetro de TSC determinado visualmente . 2. Identificación de las células extrañas en el semen El sistema es útil en la identificación de la presencia de otras células- las cuales pueden tener un efecto sobre la calidad del semen y/o para ayudar a diagnosticar la enfermedad del paciente. Por ejemplo, los leucocitos indican infección, las células inmaduras indican un problema en la espermatogénesis, la aglutinación se puede deber a varias causas, etc. 3. Evaluación manual de la morfología del esperma Aunque el sistema de la invención evalúa automáticamente el % de esperma con las morfologías normales, no se hace así de acuerdo con un criterio dado (por ejemplo el criterio de WHO) . Tristemente este criterio no es aceptado universalmente . Tal criterio aceptado universalmente todavía no existe, y son frecuentemente un factor de aplicación. Por ejemplo, el criterio de morfología para aplicaciones de IVF e ICSI son normalmente más estrictos que en los casos normales . Otros estándares internacionales (tales como un criterio estricto o el criterio de Krueger) también son aplicados ampliamente. La visualización permite que el médico especialista en fertilidad seleccione su propio criterio así como identificar los defectos específicos presentes (deformidad de la cabeza, problema de la cola, etc. ) . 4. Validación de la vasectomia y diagnóstico de Azoospermia
Para validar totalmente el resultado de la vasectomia o para obtener un diagnóstico conclusivo de azoospermia, es necesario determinar que no existió absolutamente esperma en el semen bajo evaluación. Esto generalmente no es posible con la tecnología de absorción de la luz, a causa de que las concentraciones que van a ser medidas pueden ser muy bajas. En este caso, la visualización manual es necesaria para explorar cuidadosamente campos de observación grandes en la búsqueda de células del esperma individuales. El sistema de visualización del esperma utilizado en el sistema de la invención está adaptado específicamente para resolver óptimamente estas aplicaciones .
. Copia impresa El sistema de visualización de video hace posible el "congelamiento" de una vista seleccionada dada (o algunas vistas) la cual puede entonces ser impresa y anexada al Reporte del Análisis del Semen. Esto es de gran valor para consultas y validación de la eficacia del tratamiento. Un subproducto de la opción de congelamiento es la observación de la muestra de semen bajo condiciones estáticas. Esto facilita ampliamente el análisis y el conteo. En las evaluaciones microscópicas, esto solamente puede hacerse por desmovilización (exterminio) del esperma previo a la observación. Aún entonces, todo el esperma muerto finalizará en una capa, una condición la cual complica normalmente el análisis debido a la elevada concentración y superposición del esperma en dicha capa. Breve Descripción de las figuras Para entender la invención y para ver como puede ser llevada a cabo en la práctica, las modalidades preferidas serán descritas ahora, por medio de ejemplos no limitativos solamente, con referencia a los dibujos que se anexan, en los cuales : la figura 1 es un diagrama de bloques que ilustra una modalidad del método de medición de TSC de acuerdo con la invención; la figura 2 es una vista superior en perspectiva de una modalidad de un dispositivo de muestreo de acuerdo con la invención; la figura 3 es una vista en sección lateral parcial del dispositivo de la figura 2 ; la figura 4 es una vista en sección de la válvula de separación girada 90° desde la vista de la figura 3; la figura 5 es una ilustración esquemática de un sistema para el análisis del semen de acuerdo con una modalidad de la invención; la figura 6 es un diagrama de flujo que ilustra un algoritmo para el cálculo del MSC; la figura 7 es un diagrama de flujo que ilustra un algoritmo para el cálculo de la velocidad promedio; la figura 8 ilustra una señal analógica típica del esperma móvil como una función del tiempo; la figura 9 es una curva de correlación del MSC con una señal analógica promedio; y la figura 10 es un diagrama de bloques que ilustra una modalidad de un sistema de visualización de video de acuerdo con la invención. Descripción Detallada de la Invención E emplo 1 Como se estableció anteriormente, la medición óptica automática de TSC en las muestras de semen humano como lo opuesto a la muestras de animal ha sido dificultada en el pasado debido a la baja concentración de las células del esperma. Esto, junto con el ruido óptico y electrónico del fondo, elevado, debido por ejemplo a la variabilidad del plasma seminal, ha prevenido la aplicación de los métodos utilizados rutinariamente en el análisis de fertilidad veterinaria. El método de la presente invención llega a superar estos obstáculos combinando las siguientes características : (i) la muestra es colocada en un recipiente transparente entre una fuente de luz pulsada sincrónicamente y un fotodetector habilitado sincrónicamente. El uso de una fuente de luz pulsada sincrónicamente y el fotodetector hace posible la distinción de las células del esperma a concentraciones bajas sobre los niveles de ruido electrónico. (ii) la medición de la absorbancia óptica de la muestra en el intervalo de 800-1000 nm. Se ha encontrado que midiendo la absorbancia en la región del infrarrojo cercano proporciona las condiciones óptimas para obtener la absorción fuerte por las células del- esperma y la absorción baja por el plasma seminal. Preferentemente, el intervalo medido es 850-950 nm. Más preferentemente, el intervalo es de 880-900 nm. Usando el método de la invención, la TSC de una muestra puede ser determinada como una función de la absorbancia. Aunque el método de la invención es utilizado preferentemente con las muestras del semen humano o el esperma humano, también puede ser utilizado con el semen del animal y el esperma del animal, preferentemente después de una dilución apropiada. Un ejemplo de un sistema óptico que utiliza una modalidad del método de la invención es ilustrado en la figura 1. El sistema, indicado generalmente por el número 2, comprende una fuente de luz 4, un fotodetector 6 y un sµjetador de la muestra 8 interpuesto entre los mismos. Una fuente de luz preferida puede ser un diodo emisor de luz (LED) pulsado sincrónicamente, de conmutación rápida, el cual emite la luz en la región del infrarrojo cercano. La fuente de luz puede ser controlada por un controlador 10 de la intensidad de la luz el cual a su vez es regulado por un modulador 12. El fotodetector es capaz de detectar sincrónicamente la luz pulsada. El fotodetector transmite las señales analógicas medidas a un desmodulador 14, el cual también es regulado por el modulador 12, y desde allí hasta la salida 16 de la señal en la forma digital. El ruta del rayo de luz a través de la muestra preferentemente es vertical. La longitud de la ruta del rayo de luz a través de la muestra está generalmente entre 5 y 15 mm, preferentemente 10 mm. El recipiente de la muestra debe ser totalmente transparente a las ondas de la luz en la región del infrarrojo cercano de entre 800 y 1000 nm. El material de plástico a partir del cual el sujetador de la muestra está hecho debe ser totalmente no tóxico para las células del esperma. Un material preferido es el poliestireno PG-79. El sujetador de la muestra debe ser diseñado preferentemente para prevenir totalmente la penetración y formación de burbujas de aire en la muestra, las cuales interfieren con la medición óptica. Usando el método de la invención, se ha logrado un descenso en los niveles de detección de TSC de aproximadamente 2 millones de células/ml. Este nivel ya indica una patología extrema del semen.
Ejemplo 2 La figura 2 ilustra una modalidad de un dispositivo de muestreo 20 de acuerdo con la invención, para su uso en la medición del semen. El dispositivo comprende una sección de observación óptica anterior 22, una sección aspirante posterior 24 y una sección de exclusión de aire intermedia 26. La sección de observación óptica 22 comprende una cámara de medición delgada 28 y una cámara de medición gruesa 30. La cámara delgada es utilizada para medir MSC y/o para visualización, mientras que la cámara gruesa es utilizada para medir TSC. De esta manera, los parámetros múltiples pueden ser medidos simultáneamente utilizando el mismo dispositivo de muestreo y etapa de muestreo. La sección de aspiración 24 comprende un cilindro
32 y un émbolo 34 insertado deslizantemente en el mismo. Estas partes son correspondientes entre si y funcionan como en una jeringa estándar. Esta sección sirve para la aspiración de la muestra de semen en las cámaras de medición. La sección de exclusión del aire 26 comprende una válvula de separación 36 para la separación de las cámaras de medición desde el volumen de cilindro después del llenado. El aspirador, la cámara de medición delgada, la cámara de medición gruesa y la sección de exclusión del aire están todos en comunicación de fluido.
Un adaptador 38 en la forma de un carril rectangular se extiende a lo largo de un lado del dispositivo 20 y sirve para el deslizamiento correcto y la alineación del dispositivo durante la inserción en un instrumento óptico por el cual la muestra es evaluada. También proporciona el soporte y estabilidad mecánica requerida para las mediciones electro-ópticas . Las partes del dispositivo pueden ser observadas más claramente en la figura 3. La cámara de medición delgada 38 es una cavidad interna que tiene una pared transparente paralela superior 40 y una inferior 42 a través de las cuales puede pasar el rayo de luz óptica. La distancia entre las paredes está en el intervalo de 100-500 micrones, preferentemente 250-350 micrones", más preferentemente de manera aproximada 300 micrones. En este último caso, el volumen del liquido en la cámara es de aproximadamente 25 µ?. El extremo anterior 44 de la cámara tiene una abertura a través de la cual la muestra puede ser extraída hacia el dispositivo. En la modalidad ilustrada, la cámara es de aproximadamente 4 mm de ancho . La cámara de medición delgada sirve para la evaluación de la motilidad del esperma y puede ser colocada entre una fuente de luz, por ejemplo opuesta a la pared inferior 42 y un fotodetector por ejemplo opuesto a la pared superior 40. Se entenderá que la fuente de luz y el fotodetector también pueden estar colocados sobre los lados opuestos de la cámara. Un rayo de luz es transmitido a través de la cámara que contiene una muestra de semen. El detector sobre el otro lado de la cámara registra las variaciones de la densidad óptica provocadas por las células del esperma en movimiento. Las variaciones de la densidad óptica son traducidas en una señal eléctrica por el fotodetector la cual es dirigida entonces a los circuitos electrónicos para que sea filtrada, digitalizada y procesada para indicar la MSC. La cámara de medición delgada también puede ser utilizada con un sistema de visualización de video, como se explicará de manera adicional posteriormente . La cámara de medición delgada 30 tiene una pared transparente superior 46 y una inferior 48 a través de las cuales puede pasar un rayo de luz óptica. La distancia entre las paredes está en el intervalo de 0.5-3 cm, preferentemente 0.8-1.2 cm, más preferentemente de aproximadamente 1 cm. El volumen aproximado retenido por el compartimiento delgado en este último caso podría ser de aproximadamente 0.5 mi . Esta cámara sirve para mediciones de absorción electro-óptica de la concentración del esperma. Un rayo de luz, el cual puede ser el mismo o diferente de aquel de la cámara delgada 28, es transmitido a través de las paredes superior e inferior de la cámara y detectado por un fotodetector. El volumen de la cámara debe ser llenado completamente con una muestra de esperma para evitar las inexactitudes debido a las burbujas de aire. La atenuación del rayo de luz cuando el mismo pasa a través de la cámara es proporcional a la concentración del esperma. La intensidad del rayo de luz es medida después de pasar a través de la cámara y traducida en- unidades de TSC por medios electrónicos. El orden de las cámaras en el dispositivo de muestreo puede ser intercambiado. El cilindro 32 está en comunicación de fluido con las dos cámaras de medición 28 y 30, de modo que por la extracción del émbolo 34, el fluido es extraído hacia las cámaras. Este método de aspiración permite que volúmenes de la muestra grandes sean aspirados en el dispositivo. Para prevenir que permanezcan burbujas de aire en las cámaras de medición, una válvula de separación 46 está interpuesta entre el cilindro y las cámaras de medición, y está en comunicación de fluido con las mismas. La válvula es mostrada con detalle en la figura 4 y comprende un pistón 50 retenido deslizantemente en un alojamiento 52 de la válvula. Un orificio de conexión 54 que conecta entre la cámara de medición 30 y el cilindro 32 pasa a través del pistón 50. Cuando la válvula está en la posición superior, existe una conexión entre las cámaras de medición y el cilindro aspirante. Oprimiendo la válvula se interrumpe esta conexión y se asegura que no permanezca aire en las cámaras de medición en donde las muestras son medidas y ninguna fuga ocurrirá aún cuando exista una variación de la temperatura. Esta técnica es equivalente al desplazamiento positivo puesto que el aire es excluido de los volúmenes de fluido medidos (excepto en el extremo anterior 44) . Este diseño hace posible el trabajo con las muestras virtualmente de todas las viscosidades, mientras que al mismo tiempo se previene la fuga y la penetración de burbujas de aire en los volúmenes del espécimen que van a ser analizados. Aunque los medios para la exclusión del aire desde las cámaras de medición han sido ejemplificados por una válvula de separación, también se pueden utilizar otros medios, tales como una pipeta de desplazamiento positivo. Todas las partes del dispositivo pueden ser fabricadas de cualquier material el cual no sea tóxico para las células medidas. Preferentemente, el material es relativamente barato, tal como materiales de plástico, de modo que el dispositivo pueda ser desechable. Un ejemplo de un polímero que puede ser utilizado para producir el dispositivo es poliestireno PG79. La válvula de separación, el cilindro y el pistón se pueden hacer de polipropileno . El compartimiento de medición delgado es por mucho la parte más sensible a las substancias tóxicas del dispositivo debido a la relación muy elevada del área con respecto al volumen del líquido seminal en esta sección.
Para aspirar una muestra en el dispositivo 20, la punta 44 del compartimiento de medición delgado 28 es sumergida a una profundidad de aproximadamente 5 mm en la muestra del semen, el cual es aspirado entonces en el dispositivo una vez que se ha pasado la válvula de separación 36. Solo aproximadamente- 0.6 ce son requeridos para un llenado completo del dispositivo. La válvula de separación es empujada entonces descendentemente, y el dispositivo puede ser insertado en un aparato de medición óptica. E emplo 3 Como se mencionó anteriormente, la determinación de MSC de acuerdo con la invención requiere la generación de una señal de voltaje que sea proporcional con respecto a MSC. La figura 5 muestra una modalidad de un sistema para el análisis del semen capaz de generar tal señal. Un capilar óptico 100 que tiene una sección transversal rectangular es utilizado para retener una muestra de semen 102. El capilar 100 es iluminado con un rayo de luz incidente 105 producido por una fuente de luz 110. El capilar 100 tiene una ruta óptica de 300 µ?a a través de la cual pasa el rayo de luz 105. Después de pasar a través del capilar, el rayo de luz dispersada 106 es colimado por una abertura redonda 108 que tiene un diámetro de 70 \im. El rayo de luz colimada 107 choca sobre un fotodetector 115. El fotodetector 115 produce una señal de voltaje analógica 120 proporcional a la intensidad del rayo de luz 107. La señal analógica varia en el tiempo debido a la motilidad del esperma en la muestra del semen 102, como se muestra por ejemplo en la figura 8. La señal analógica 120 se hace entrar a un convertidor analógico a digital 125 que muestrea la señal analógica 120 a una velocidad por ejemplo de- 8000 Hz y genera una señal de salida digital 128. La señal de salida digital puede ser almacenada en una memoria 130. El movimiento del esperma en la muestra 102 conduce a una modulación en la intensidad del rayo de luz 107, la cual a su vez afecta a la señal analógica 120 y a la señal digital 128. Un procesador 135 está configurado para llevar a cabo un análisis de los datos almacenados en la memoria 130 para producir un análisis de la muestra de semen 102. Los resultados del análisis pueden ser exhibidos sobre un dispositivo de pantalla tal como una pantalla CRT 140 de una computadora personal 145, o sobre una pantalla de LCD interna 148 del dispositivo de medición. La figura 6 muestra un diagrama de flujo para una modalidad de un algoritmo para el cálculo del MSC como se lleva a cabo por ejemplo por el procesador 135 de la figura 5, de acuerdo con la invención. En la etapa 200, la señal digital 128 de la figura 5 es filtrada digitalmente para remover las frecuencias elevada y baja que no son relevantes para la frecuencia dominante de la señal, la cual es determinada por las características de motilidad de la muestra de semen 102. Esto se hace para optimizar la relación de la señal con respecto al ruido. El componente de DC (por sus siglas en inglés) de la señal 128 también es removido. Para las muestras de esperma humano, por ejemplo, el intervalo de frecuencia relevante óptima se encontró que va a estar entre 5 y 30 Hz. En la etapa 205, las muestras digitales que tienen un valor absoluto abajo de un primer umbral predeterminado, el cual puede ser determinado empíricamente, son excluidas. En la etapa 210 el mismo valor de umbral es restado de todas las muestras restantes . En la etapa 215, un procedimiento de selección de la forma de onda es llevado a cabo para desechar todas las formas de onda debidas a partículas aberrantes tales como de células no relevantes, etc. Una modalidad preferida de la selección de la forma de onda con el esperma humano es eliminar todas las formas de onda que no satisfagan los siguientes criterios: Altura mínima - 10 milivoltios. Ancho mínimo - 37.5 milisegundos . Ancho máximo - 500 milisegundos. Tiempo de elevación/caída mínimo - 2.5 milisegundos. La definición (y detección) correcta del principio y el fin de las formas de onda asociadas con el esperma son definidas como aquellas en donde ocurren cambios significativos de la dirección de la forma de onda. La diferencia de tiempo entre dos de tales puntos define el ancho del tiempo de una onda dada. La manera de selección puede ser entendida por medio de un ejemplo con referencia a la figura 8 (no dibujada a escala) , la cual muestra la amplitud de la señal analógica (120 en la figura 5) como una función del tiempo. El umbral 302 es determinado empíricamente para proporcionar una linealidad óptima entre la señal de salida y MSC medida microscópicamente. Las formas de onda que son utilizadas para el cálculo de MSC son etiquetadas como 304, 305, 306 y 307. las otras formas de onda tienen que haber sido rechazadas por varias razones: 308 a causa de que su cresta es menor que el umbral; 310 a causa de que es demasiado ancha; y 312 a causa de que es demasiado estrecha. En la etapa 220 de la figura 6 el valor absoluto de todas las muestras seleccionadas es calculado, y en la etapa 225, la a promedio de los valores absolutos es calculada. En la etapa 230, la MSC de la muestra 102 es calculada con base en la a promedio. Por ejemplo, se encontró que la dependencia de MSC sobre a puede ser descrita por una ecuación lineal de la forma : MSC = oca en donde ce es una constante derivada empíricamente. En una modalidad preferida, la dependencia de MSC sobre a puede ser descrita por una ecuación cuadrática de la forma: MSC = Aa2 + Ba Con referencia a la figura 9, una muestra de esperma humana especifica fue analizada de acuerdo con la invención. Se encontró que la dependencia de MSC sobre a podría ser descrita por la siguiente expresión algebraica: MSC = 0.0047a2 + 0.869a (I) Una buena correlación lineal se encontró que existe para los valores pequeños de a. Usando la fórmula (I) , el factor de correlación (r) para el esperma fresco sobre el intervalo total fue > 0.98. El análisis de las muestras de semen tratadas con una viscosidad variable también fue efectuado usando muestras descongeladas, esperma lavado, muestras diluidas (tanto en Citrato de Sodio al 3% como .Amortiguador de Yema de Prueba) así como con las muestras que contienen hasta 20% de glicerol que tiene una viscosidad elevada artificialmente. Se encontró que la viscosidad variable de la muestra (y por lo tanto la velocidad del esperma) , no afectaron significativamente la correlación entre MSC y la señal promedio ("r" en todo caso permaneció arriba de 0.96). Usando técnicas de enriquecimiento centrífugo, una gama muy amplia de concentraciones de esperma humano móvil fueron medidas (hasta 250 M/ml) . No se encontró ninguna saturación significativa. La no linealidad ligera en los intervalos más elevados es corregida fácilmente por una corrección polinomial de segundo grado simple - dada anteriormente . El análisis del semen de bovino también fue llevado a cabo y los factores de correlación entre el MSC de bovino y las señales promediadas idénticamente (la misma metodología que para los seres humanos) proporcionó resultados excelentes de manera semejante. Se va a señalar sin embargo, que el semen de bovino tiene que ser diluido previo a las mediciones. Esto se debe a que su MSC es típicamente de un orden de magnitud arriba de aquel de un ser humano . Ejemplo 4 Como es explicó anteriormente, la velocidad promedio es una función de SMI y MSC. Con referencia a la figura 1, el SMI es calculado en la etapa 235. Esto se puede hacer, por ejemplo, como se describe en la Patente U.S. No. 4,176,953, o utilizando un analizador de SQA. En la etapa 240 la MSC es calculada por cualquier método conocido. En una modalidad preferida, la MSC es calculada por el algoritmo de la invención (véase el Ejemplo 3 anterior) . En la etapa 245 la velocidad promedio AV es calculada utilizando una expresión algebraica que involucra la relación SMI/MSC. En una modalidad AV es calculada utilizando la expresión algebraica:
AV = O .001 [SMI/MSC] 3 + 0.01 [ SMI/MSC] 2 + 0.89 [SMI/MSC] En la etapa 250 los resultados son exhibidos sobre el dispositivo de pantalla 145 ó 148 (Figura 5) . Ejemplo 5 Una modalidad de un subsistema de visualización de video (WS (por sus siglas en inglés) ) el cual puede ser utilizado con el sistema de análisis de la invención es ilustrado en la figura 10. Una muestra de semen 300 es colocada ante un iluminador contrastado en la fase, difuso 305. La muestra puede ser mantenida en un portaobjetos o media tapa de laboratorio, estándar, en un dispositivo de muestreo de acuerdo con la invención. La luz desde el iluminador 305 pasa a través de la muestra 300 y a través de un sistema de lentes dobles 310 que se pueden cambiar, preferentemente con amplificaciones de 20 y 40. La luz amplificada es transportada entonces a una cámara de video de CCD 315 en miniatura. La imagen resultante puede ser exhibida sobre una pantalla de observación interna 320 integrada o sobre un medio de exhibición externo 325 tal como PCs, pantallas, dispositivos de impresión, etc. En una modalidad preferida, el WS es construido alrededor del dispositivo de muestreo de la invención, y particularmente en el compartimiento de medición delgado. El objeto de esta característica es que ninguna preparación adicional será necesaria para incorporar esta función al procedimiento de prueba normal. Simplemente se toma el dispositivo lleno con el semen sobre el cual es efectuada la prueba automática y se inserta - como tal, en la abertura de observación. Sin embargo, el WS no está limitado al uso con el dispositivo de muestreo de la invención, y puede ser utilizado con portaobjetos o medias tapas de laboratorio estándares . El extremo frontal del VSS es semejante a aquel del microscopio. Dos objetivos de una lente son seleccionables para optimizar la amplificación y el campo de observación, de acuerdo con la aplicación (x20 o x40) . Sin embargo, en lugar de los lentes oculares del microscopio, la imagen del objetivo es transportada a una cámara de video de CCD en miniatura. El tamaño del CCD (diagonal) es de 6 mm. La pantalla de observación es una LCD de 100 mm. Esto proporciona una amplificación de video de aproximadamente 1 . Esto proporciona en efecto una amplificación total potencial de 340 ó 680. Aunque los factores de amplificación de solamente 200 y 400 son requeridas, este ajuste es seleccionado de modo que la amplificación anterior podría ser alcanzada en una construcción mucho más pequeña. Esto es deseable por ejemplo para una unidad de escritorio compacta y fuerte (reduciendo la distancia de la imagen especificada se reduce la amplificación a aquella que es requerida) . Los lentes y su ajuste de amplificación pueden ser seleccionados de modo que una "distancia de trabajo" (desde ¦ el objeto hasta los lentes) se pueda hacer variar para hacer posible la exploración de principio a fin de la profundidad total del compartimiento de medición delgado (por ejemplo 300 micrones) . Esto es lo opuesto a la observación microscópica normal la cual no requiere- tal exploración, a causa de que el objeto es encerrado normalmente en un portaobjetos el cual es justo de 20 micrones de profundidad y la profundidad total puede ser observada sin exploración o reenfoque. Como se mencionó anteriormente, un factor de amplificación total de 200 ó 400 puede ser seleccionado. Una amplificación de 400 será la elección cuando sea necesario identificar células no espermáticas (células blancas de la sangre, células redondas, etc.), asi como para investigar y evaluar varias patologías morfológicas de las células de esperma (aglutinaciones, células inmaduras, defectos en la cabeza o cola del esperma, etc.). Una amplificación de 200 será preferible para el conteo de las células, sin importar si las mismas son esperma u otras. La amplificación inferior proporciona un campo de observación más grande (4 veces más grande) y por esto proporciona estadísticas de conteo mejoradas. La posibilidad de congelar las imágenes mejora ampliamente ambas aplicaciones . Para facilitar los conteos de las células y adquirir un resultado verdaderamente cuantitativo utilizando el WS, en una modalidad preferida una rejilla calibrada puede ser proyectada directamente sobre la pantalla de observación de LCD. La rejilla comprende cuadrados de 2 cm los cuales son equivalentes a un tamaño de pre-amplificación de 0.1 ium en el compartimiento de medición lleno del semen (factor de amplificación de 200) . Este método evita la tarea muy difícil de proyectar de manera precisa una rejilla diminuta sobre el propio compartimiento de medición. Esta última solución costosa es incorporada en la Cámara de Conteo de Mackler asi como otros hemacitómetros - evitando su uso como materiales desechables. En la presente invención esto es innecesario y el WS permite que la rejilla sea una parte de la pantalla de observación. El WS puede ser útil en las siguientes aplicaciones: (a) La medición de concentraciones de esperma muy bajas . (b) La identificación de células extrañas en el semen (diferentes de las células de esperma) . (c) El análisis morfológico manual de acuerdo con cualquier criterio seleccionado. (d) Validación eficaz de la vasectomía. (e) Diagnóstico de Azoospermia. (f) Activación de la comparación por puntos de los resultados computarizados con el análisis visual.
(g) Proporcionar una copia impresa de las
"fotografías instantáneas" de las imágenes inmovilizadas de varias capas de semen. La inmovilización es lograda por el congelamiento electrónico de las imágenes . Se hace constar que con relación a este fecha el mejor método conocido por- la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.