CN111855657B - 一种基于能量梯度的***活力评价方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于能量梯度的***活力评价方法,基于随机化二值互补掩模策略,生成二值互补掩模板和多个用于生成单个光斑的光栅相位图,合成得到单个用于生成点阵光学陷阱的全息图;将所得全息图加载至空间光调制器上,对出射光场进行相位调控,得到具有能量梯度的光学陷阱阵列;根据所得具有能量梯度的光学陷阱阵列,对微流体通道中的一批***进行捕获,观测并追踪每个被捕获***在各能量梯度光学陷阱中的逃脱过程,从而完成基于能量梯度的***活力评价。本发明能够定量、快速、简易测量***运动活力。
Description
技术领域
本发明涉及检测体外***质量、体外辅助生殖领域和人工授精技术,特别涉及一种基于能量梯度的***活力评价方法,在大批量***活力检测中应用。
背景技术
在养殖产业或辅助生殖等领域,筛选出高质量的***是提高人工授精效率的关键。***质量的评估依赖于诸多生物标记物,包括***比容、***密度、渗透浓度、***pH值、***化学组分、酶活力、ATP浓度、运动活力、形态和超微结构、受精能力等。而***运动活力由于易于评估而常被作为***质量衡量的重要参数。***运动活力的评价分为主观法、半定量法和定量计算机辅助法。其中,主观法是根据视野内运动***的百分比,将***运动活力分为5个等级:1)0级,即无运动状态;2)1级,即多达25%的***在移动;3)2级,即多达50%的***在移动;4)3级,即多达75%的***在移动;5)4级,即超过75%的***在移动。由此可见,主观法依赖于经验丰富的评价者,无法得到统计结果,而且测量并不可靠。为了增加***运动活力测量的准确性,可以通过两个或多个独立观察者对***运动能力进行半定量分析,具体而言,记录的***运动录像在具有网格的屏幕上以低速播放,从而测量初始运动***的百分比,然而此法极为耗时。定量计算机辅助法则是由计算机辅助***分析***(Computer-Aided Sperm Analysis,CASA)组成,通过计算机对***图片可视化和数字化,并处理和分析***图像,该方式尽管具有很高的重复性,然而设备复杂,且价格不菲。因此,有必要发展一种定量、快速、简易的方法来测量***运动活力。
发明内容
本发明的技术解决问题:克服现有技术的不足,提供一种基于能量梯度的***活力评价方法,通过生成具有能量梯度的多个光学陷阱阵列来对大批量***的运动活力进行准确、快速、简易的定量表征,从而克服传统表征方式的不准确、耗时、复杂等缺陷,并且摆脱对经验丰富的专业人员的需求,降低***活力表征的操作要求和费用。
本发明的技术解决方案:一种基于能量梯度的***活力评价方法,如图1所示,实现步骤为:
第一步,基于随机化二值互补掩模策略,使用计算机生成二值互补掩模板和多个用于生成单个光斑的光栅相位图,合成得到单个用于生成点阵光学陷阱的全息图,即合成相位。
第二步,根据第一步所得合成相位,将其加载至图4所示的空间光调制器上,对出射光场进行相位调控,得到具有N个能量梯度的光学陷阱阵列。
第三步,基于第二步所得具有N个能量梯度的光学陷阱阵列,对微流体通道中的一批***进行捕获,观测并追踪每个被捕获***在各能量梯度光学陷阱中的逃脱过程,从而完成基于能量梯度的***活力评价。
所述第一步,具体实现过程为:基于随机化二值互补掩模策略,即根据N个陷阱的能量比r1:r2:…:rN,通过归一化计算得N-1个阈值th1,th2,…,thN-1,再将计算机生成的初始矩阵M与所有阈值(th1,th2,…,thN-1)比较,获得N个二值互补掩模板R1,R2,…,RN,例如,当M中某位置的元素值属于[0,th1]时,R1中相应位置的元素值设置为1,而其余位置的值被设置为0;当M中某位置的元素值属于[th1,th2]时,R2中相应位置的元素值设置为1,而其余位置的值被设置为0;当M中某位置的元素值属于[thN-1,1]时,RN中相应位置的元素值设置为1,而其余位置的值被设置为0;基于此方式获得N个二值互补掩模板。最后将多个用于生成单个点状光学陷阱的光栅相位P1,P2,…,PN与二值互补掩模板R1,R2,…,RN对应相乘并求和,得到合成相位P。
所述第二步,具体实现过程为:打开激光光源,其出射的柱状光束被准直扩束后照射至空间光调制器上,然后将第一步生成的合成相位P加载至空间光调制器上,出射光场相位由于空间光调制器的相位调控作用而被改变,调节物镜轴向位置并将焦点聚焦至微流体通道下表面处,则在焦平面能够产生具有N个能量梯度的光学陷阱阵列。
所述第三步,具体实现过程为:在微流体通道入口端注入***溶液,由于光学陷阱的吸引作用,活力最弱的***则能被各能量梯度的光学陷阱捕获,而活力最大的***则只能被光强最强的光学陷阱捕获;而且可以在***溶液注射后,开始在不同阶段以不同的恒定速度注射培养液,以期加快每个被能量梯度光学陷阱所捕获***的逃脱过程。通过视频成像观测和追踪大批量被捕获***的逃脱情况,完成***活力的评估过程。
本发明相较于现有技术的优点:光镊技术赋予了研究者微纳操控的本领,能够以非接触的方式对研究对象进行捕获、操控和定量探测。同时作为灵敏的力传感探针,光镊却少有见于***活力的表征。本发明提出一种通过生成的具有能量梯度的光学陷阱来评估***运动活力的方法,能够快速准确地确定***的运动活力,由于结合了微流体的恒速流动来加快评估过程和定量评估***活力,其优点在于:1)测量准确,且重复性高,理论能达到100%;2)既能定性,也能定量测量***活力;3)降低对操作人员的专业和经验要求;4)操作简便,且检测费用可以做到相当低廉。
附图说明
图1为本发明一种基于能量梯度的***活力评价方法的实现流程图;
图2为本发明实施能量梯度光学陷阱对***活力进行评价的具体实施案例图;
图3为获取合成相位用于生成具有能量梯度光学陷阱的原理图;
图4为生成能量梯度光学陷阱的光路示意图。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明进行详细说明。
如图2所示,本发明方法实现步骤为:
第一步,基于随机化二值互补掩模策略,如图3所示,生成二值互补掩模板R1,R2,R3,R4和四个用于生成单个光斑的光栅相位图P1,P2,P3,P4,其中不同空间频率的光栅相位P1,P2,P3,P4能在相机视场中四个不同的指定位置生成点状光斑;将二值互补掩模板R1,R2,R3,R4与光栅相位图P1,P2,P3,P4对应相乘后求和,最终得到单个用于生成具有能量梯度的光学陷阱阵列的合成相位P。
具体实施步骤如下:
1)根据空间光调制器或相位板的分辨率,生成大小为m×n的随机化初始矩阵M,且M中元素服从[0,1]之间的均匀分布;
3)如图3所示,比较随机化初始矩阵M与上一步获得的各阈值thi,可以确定N个二值互补掩模板Ri,维度与随机化初始矩阵M相同,且Ri之间无交集,其并集的结果为全一矩阵(元素值全为1的矩阵)。例如,当随机化初始矩阵M中某位置的元素值属于[0,th1]时,R1对应位置的元素值被设定为1,而其他位置的元素值被设定为0;当随机化初始矩阵M中某位置的元素值属于[th1,th2]时,R2对应位置的元素值被设定为1,而其他位置的元素值被设定为0;当随机化初始矩阵M中某位置的元素值属于[th2,th3]时,R3对应位置的元素值被设定为1,而其他位置的元素值被设定为0;当随机化初始矩阵M中某位置的元素值属于[th3,1]时,R4对应位置的元素值被设定为1,而其他位置的元素值被设定为0;
1)生成N个用于在特定位置产生光学陷阱的光栅相位Pi;
图3中,随机化初始矩阵M由计算机产生,其元素服从[0,1]上的均匀分布;阈值thi是通过用户设定的能量比r1,…,rN通过归一化操作计算所得,既i=1,2,…,N-1;光栅相位Pi用于在指定位置生成单个光学陷阱;加载至空间光调制器上的合成相位P由上述二值互补掩模板Ri和光栅相位Pi合成得到,既N=4。
第二步,根据第一步所得合成相位P,将其加载至图4所示的空间光调制器上,对出射光场进行相位调控,得到如图2中所示的四个具有能量梯度的光学陷阱阵列,其能量之比等于第一步中对应于光栅相位Pi的二值互补掩模板Ri的有效像素数的平方之比(有效像素是指二值互补掩模板Ri中元素值等于1的像素)。
第三步,基于第二步所得具有能量梯度的四个光学陷阱阵列,对微流体通道中的一批***进行捕获,观测并追踪每个被捕获***在各能量梯度光学陷阱中的逃脱过程,从而完成基于能量梯度的***活力评价,由于加载的合成相位P能够在指定位置生成光学陷阱阵列,故光学陷阱在相机视场中的位置也是确定的,当使用相机记录其视场中单个***的捕获和逃脱过程时,可通过粒子追踪算法,如质心法,获取单个***在视场中的位置,通过比对各光学陷阱的位置与每个***的位置,可以获取单个***在光学陷阱中的停留时间,若单个***在各能量梯度的光学陷阱处均有停留,表明单个***能够被光学陷阱捕获。具体地,若单个***能够被图2中四个能量梯度的光学陷阱捕获,标记该***活力等级为1;若单个***能够被图2中能量梯度光学陷阱2-4捕获,标记该***活力等级为2;若单个***能够被图2中能量梯度光学陷阱3-4捕获,标记该***活力等级为3;若单个***只能被最强能量的光学陷阱4捕获,则标记该镜子活力等级为4;基于此用于定性表征视场中每个***活力。另外,通过外部注射培养液的恒速流动,确定视场中每个***逃脱的速度阈值,以此速度阈值作为这些***活力表征的定量依据,若单个***在设定的速度最小值(10μm/s)速度下能够从光学陷阱中逃脱,以此速度作为***活力的评估指标,而若单个***在设定的速度最大值(100μm/s)下才能从陷阱中逃脱,以此速度作为***活力的评估指标,同时设定速度间隔为10μm/s来定量估计10-100μm/s速度范围内的***逃脱阈值,从而完成基于能量梯度的***活力评价。
为实现利用能量梯度光学陷阱对大批量***运动活力的表征,本发明介绍能量梯度陷阱生成方法,原理如图3所示,四个不同空间频率的光栅相位P1、P2、P3、P4与二值互补掩模板R1、R2、R3、R4相乘并求和,得到合成相位P,将其加载至空间光调制器上后,在物镜焦平面将会生成图3示例的四个具有能量梯度的光学陷阱,而基于同样的原理可以推广至更多具有能量梯度的光学陷阱。
为实验上产生具有能量梯度的多个光学陷阱,可以基于全息光镊的基本构造,如图4所示,将捕获激光准直扩束后,照射至空间光调制器(SLM)上,并加载所求的合成相位N=4,用于在物镜焦平面生成四个具有能量梯度的光学陷阱,且单个光陷阱的位置由相应的光栅相位Pi的空间频率确定,而陷阱之间的能量比则满足r1:r2:…:rN的比例关系,也就是二值互补掩模R1、R2、R3、R4的有效像素数的平方之比。由于不同运动活力的***与不同能量梯度的光学陷阱相互作用结果有差异,比如运动活力较弱的***既能够被较低能量的光学陷阱捕获,又能够被较高能量的陷阱捕获;而运动活力较强的***则只能被高能量的陷阱俘获。则在设计好由弱至强的光学陷阱阵列后(图4中,陷阱能量从上至下逐渐增强,水平方向陷阱能量一致),通过图4中微流体通道入口注入定量的***样品,利用相机记录***被阵列陷阱的捕获与逃脱情况,根据单个***被强弱陷阱的捕获结果来将***分为若干等级,比如图4中将***分为4个等级,即等级1、等级2、等级3、等级4,对应***活力由最弱增至最强;具体而言,运动活力最弱的***能够被等级1(最弱)的光学陷阱捕获,而运动活力最强的***只能被等级4(最强)的光学陷阱捕获。因而,这种具有梯度能量的阵列光学陷阱能够快速地划分***运动活力等级。另外,可通过微流体通道注入适当流速的流体,冲击被捕获的***,当流速在不断提高过程中,由于活力较小的***首先逃脱,因此也可以更加快速的确定***的活力等级。
实验光路示意图如图4所示,其中被准直扩束后的激光光束经空间光调制器(其上加载合成相位P)的相位调控作用后,由二向色镜反射至物镜后孔径,用于在物镜焦平面生成具有能量梯度的光学陷阱阵列;而照明光源用于照明微流体通道,便于实验观察和记录,透过微流体通道的照明光源被物镜收集后,透射过二向色镜,然后由反射镜反射至套筒透镜,将***样品成像至相机上;套筒透镜和物镜相互匹配以达到所需的成像放大倍率。
提供以上实施例仅仅是为了描述本发明的目的,而并非要限制本发明的范围。本发明的范围由所附权利要求限定。不脱离本发明的精神和原理而做出的各种等同替换和修改,均应涵盖在本发明的范围之内。
Claims (4)
1.一种基于能量梯度的***活力评价方法,其特征在于实现步骤为:
第一步,基于随机化二值互补掩模策略,生成二值互补掩模板和多个用于生成单个光斑的光栅相位图,合成得到单个用于生成点阵光学陷阱的全息图,即合成相位;
第二步,将第一步所得合成相位加载至空间光调制器上,对出射光场进行相位调控,得到具有N个能量梯度的光学陷阱阵列;
第三步,根据第二步所得具有N个能量梯度的光学陷阱阵列,对微流体通道中的一批***进行捕获;具体实现如下:
采用相机记录微流体通道中的一批***的捕获和逃脱过程,再通过粒子追踪算法,获取其中每个***在相机视场中的位置,比对N个能量梯度光学陷阱的位置与每个***的位置,获取每个***在光学陷阱中的停留时间,若视场中每个***在设定的N个能量梯度光学陷阱处均有停留,表明相机视场中这一批***能够被光学陷阱捕获,若其中单个***能够被各能量梯度的光学陷阱捕获,则评估***活力最弱,标记该***活力等级为1,若单个***只能被最强能量的光学陷阱捕获,则标记该***活力等级为N,从而定性表征视场中每个***活力,其中N取值原则上依据相机视场中***数量和空间光调制器的分辨率来设定;另外,通过外部注射培养液的恒速流动,确定相机视场中每个***逃脱的速度阈值,以此速度阈值作为这些***活力表征的定量依据,若单个***在设定的速度最小值v1下能够从光学陷阱中逃脱,则以此速度作为***活力的评估指标;而若单个***在设定的速度最大值vX下才能从陷阱中逃脱,以此速度作为***活力的评估指标;当速度值范围为v1至vX,确定这一批***逃脱的速度阈值,并以此阈值作为***活力评估指标,从而完成基于能量梯度的***活力评价。
3.根据权利要求1所述的基于能量梯度的***活力评价方法,其特征在于:所述第二步,具体实现过程为:打开激光光源,其出射的柱状激光光束被准直扩束后照射至空间光调制器上,然后将第一步生成的合成相位P加载至空间光调制器上,出射光场相位由于空间光调制器的相位调控作用而被改变,调节物镜轴向位置并将物镜焦点聚焦至微流体通道下表面处,则在物镜焦平面能够产生具有能量梯度的光学陷阱阵列。
4.根据权利要求1所述的基于能量梯度的***活力评价方法,其特征在于:所述第三步中,所述粒子追踪算法采用质心法获取视场中每个***的质心位置。
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