MXPA03006342A - Procesos para una produccion incrementada de pantotenato. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere a metodos mejorados para la produccion de pantoato Y pantotenato utilizando microorganismos que tienen actividades modificadas de enzima biosintetica de pantotenato. En particular, la invencion presenta metodos para reducir la formacion de subproductos e incrementar los rendimientos y la pureza del producto deseado. Se presentan tambien microorganismos recombinantes y condiciones para su cultivo. Se presentan tambien composiciones producidas por tales microorganismos.

Description

i PROCESOS PARA UNA PRODUCCIÓN INCREMENTADA DE PANTOTENATO Solicitudes Relacionadas La presente invención reclama el beneficio de la solicitud de patente provisional previamente presentada No. de Serie 60/262, 995, presentada el dia 19 de enero de 2001 (pendiente) . La presente invención se relaciona también con la solicitud de patente norteamericana No. de serie 09/667,569, presentada el dia 21 de septiembre de 2000 (pendiente) , que es una continuación en parte de la Solicitud de Patente norteamericana No. de ser£¾ 07/400,494, presentada el dia 21 de septiembre de 1999 (abandonada) . La Solicitud de Patente norteamericana No. de serie 09/667,569, reclama también el beneficio de la solicitud de patente provisional previamente presentada No. de serie 60/210,072, presentada el dia 7 de junio de 2000, Solicitud de Patente provisional No. de serie 60/221,836, presentada el dia 28 de julio de 2000, y Solicitud de Patente provisional No. de serie 60/227,860, presentada el dia 24 de agosto de 2000. El contenido entero de cada una de las solicitudes antes mencionadas se incorpora aquí por referencia. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El pantotenato, conocido también como ácido pantoténico o vitamina B5, es un miembro del complejo B de vitaminas y es un requerimiento nutricional para los mamíferos, incluyendo ganado y seres humanos (por ejemplo, a partir de fuentes de alimentos, como complemento vitamínico soluble en agua o bien como aditivo alimenticio) . En las células, el pantotenato es utilizado primariamente para la biosíntesis de la coenzima A (CoA) y proteína portadora de acilo (ACP) . Estas coenzimas funcionan en el metabolismo de las porciones acilo que forman tioésteres con el grupo sulfhidrilo de la porción r-fosfopanteteína de estas moléculas. Estas coenzimas son esenciales en todas las células, participando en más de 100 reacciones intermedias en el metabolismo celular. El medio convencional de sintetizar e_S^*- pantotenato (particularmente el isómero D bioactivo) es a través de la síntesis química a partir de elementos químicos iniciales, un proceso que es impedido por el costo excesivo del sustrato así como el requerimiento de resolución óptica de intermedios racémicos. Por consiguiente, los investigadores se han enfocado recientemente a sistemas bacterianos o microbianos que producen enzimas útiles en los procesos de biosíntesis del pantotenato (puesto que las bacterias mismas son capaces de sintetizar el_. pantotenato) . En particular, procesos de bxoconversión han sido evaluados como un medio para favorecer la producción del isómero preferido de ácido pantoténico. Además, métodos de síntesis microbiana directa han sido examinados recientemente como un medio para facilitar la producción de D-pantotenato . Existen todavía, sin embargo, una necesidad significativa de procesos mejorados para la producción de procesos mejorados para la producción de pantotenato, especialmente de procesos microbianos optimizados para producir rendimientos más altos de producto deseado. COMPENDIO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a procesos mejorados (por ejemplo, síntesis microbianas) para la producción de pantotenato. En particular, los presentes inventores han descubierto que la desregulación de la vía biosintética de pantotenato y/o .la desr.egulación..de la vía isoleucina-valina (ilv) en microorganismos, además de producir títulos significativamente incrementados de pantoato y/o pantotenato, resulta en la síntesis de un producto alternativo, específicamente ácido [R] -3- (2-hidroxi-3-metil-butirilamino) -propiónico o bien ácido 3- (2-hidroxi-3-metil-butirilamino) -propiónico ("HMBPA") , que se conoce aquí de manera intercambiable como "2- (i?) -hidroxiisovalerato de ß-alanina", ¦"2-hidroxiisovalerato de ß-alanina", "a-hidroxiisovalerato de ß-alanilo" y/o antotenato" . La vía que lleva a H BPA (conocida a continuación como la vía biosintética de HMBPA") incluye ciertas enzimas convencionalmente asociadas con la biosíntesis de pantotenato y/o isoleucina-valina (ilv) que, cuando están sobre-expresadas, pueden participar adicionalmente en la vía biosintética de HMBPA. En particular, la vía incluye la conversión de ce-quetoisovalerato en [R] -2-hidroxiisovalerato (a-HIV) , catalizada por una actividad reductasa (actividad PanEl, PanE2, y/o IlvC) , seguido por- condensación de a-HIV con ß-alanina, catalizada por actividad PanC. Puesto que la vía biosintética HMBPA alternativa compite para precursores claves de la biosintesis del pantotenato, específicamente a-quetoisovalerato (a-KIV) y ß-alanina, y compite también por enzimas convencionaluiente asociadas con la biosintesis de pantotenato, es deseable disminuir o eliminar la biosintesis de HMBPA con el objeto de iiasrementar . efectivamente la biosintesis de pantotenato. Por consiguiente, en un aspecto de la presente invención presenta un proceso para la producción de una composición de pantotenato libre de HMBPA que incluye el cultivo de un microorganismo que tiene una vía biosintética . de pantotenato desregulada bajo condiciones tales que se produzca una composición de pantotenato libre de HMBPA. En otro aspecto, la invención presenta un proceso para la producción de una composición de pantotenato libre de HMBPA que- incluye el cultivo de un microorganismo que tiene una vía biosintética de pantotenato desregulada y una vía biosintética de isoleucina-valina (ilv) desregulada, dicho microorganismo tiene una actividad PanB regulada de tal manera que se produzca una composición de pantotenato libre de HMBPA. En otro aspecto de la invención se presenta un proceso para la producción de una composición de pantotenato libre de HMBPA que incluye el cultivo de un microorganismo que tiene una vía biosintética de pantotenato desregulada y una via biosintética de isoleucina-valina desregulada [ilv) , el microorganismo teniendo una actividad PanE regulada de tal manera que se produzca una composición de pantotenato libre de HMBPA. En otro aspecto la invención presenta un proceso para la producción de una composición de pantotenato libre de HMBPA que incluye el cultivo de un microorganismo que tiene una via hd sintética - de pantotenato desregulada y una via biosintética de isoleucina-valina desregulada (ilv) , el microorganismo teniendo una actividad IlvC regulada de tal manera que se produzca una composición de pantotenato libre de HMBPA. En otro aspecto, la invención presenta un proceso para la producción de una composición de pantotenato libre de HMBPA que incluye el cultivo de un microorganismo que tiene una via biosintética de pantotenato desregulada y una via biosintética de isoleucina-valina desregulada (ilv) , dicho microorganismo tiene actividades PanB y PanE reguladas de tal manera que se produzca una composición de pantotenato libre de HMBPA. En otro aspecto, la invención presenta un proceso para la producción de una composición de pantotenato libre de HMBPA que incluye el cultivo de un microorganismo que tiene una via biosintética de pantotenato desregulada y una via biosintética de isoleucina-valina ' desregulada (ilv) , dicho microorganismo tiene actividades PanB e IlvC reguladas de tal manera que se produzca una composición de pantotenato libre de HMBPA. Composiciones producidas de conformidad con los métodos descritos arriba son también presentadas como microorganismos utilizados en dichas metodologías. Se presentan también procesos para la producción de unas composiciones selectivamente mixtas pantotenato: HMBPA. Otras características y ventajas de la invención serán aparentes a partir de la siguiente descripción detallada y de las reivindicaciones..^ BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1 es una representación esquemática de las vías biosintéticas de pantotenato y de isoleucina-valina (ilv) las enzimas biosintéticas de pantotenato son mostradas en negritas y sus genes correspondiente indicados en cursivas. Las enzimas biosintéticas de isoleucina-valina (ilv) son presentadas en cursivas en negritas y sus genes correspondientes se presentan en cursiva. La figura 2 es una representación esquemática de la vía biosintética que lleva la formación de ácido [R]-3-(2- hidroxi-3-metil-butirilamino) -propiónico ("HMBPA") en B. subtilis. La figura 3 es una representación esquemática de la estructura de ácido [R] -3- (2-hidroxi-3-metil-butirilamino) --propiónico ("HMBPA") .

La figura 4 es un cromatograma de HPLC de una muestra de un medio para una fermentación de 41 L de ??824. La figura 5 es un espectro de masa que muestra la masa monoisotópica relativa de ácido 3- (2-hidroxi-3-metil-butirilamino) -propiónico . La figura 6 muestra un lineamiento de los aminoácidos C-terminales a partir de proteínas PanB conocidas o sospechadas . ¦La figura 7 es una representación esquemática de la construcción, del plásmido p¾N624. - J La figura 8 es una representación esquemática de la construcción del plásmido pAN620. La figura 9 es una representación esquemática de la construcción del plásmido pAN636. La figura 10 e.s una representación esquemática de la construcción del plásmido pAN637 que permite la selección de copias individuales o copias múltiples utilizando cloranfenicol . DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención se basa, por lo menos en parte, en el descubrimiento de una vía biosintética alternativa en microorganismos recombinantes que utiliza ciertas enzimas biosintéticas de pantotenato y/o isoleucina-valina (ilv) y precursores para elaborar un subproducto o producto colateral llamado ácido [R] -3- (2-hidroxi-3-metil-butirilamino) -propiónico ("HMBPA") . En particular, se ha descubierto que bacterias que han sido manipuladas para que tengan vías biosintéticas de pantotenato desreguladas y/o vias biosintéticas de isoleucina-valina (ilv) desreguladas son capaces de generar HMBPA a partir de o-quetoisovalerato (a-KIV) , un producto clave de la vía biosintética de isoleucina-valina (ilv) y precursor de la via biosintética de pantotenato. La producción de HMBPA en bacterias utiliza por lo menos las enzimas biosintéticas de pantotenato quetopantoat.ojTR.T ductasa ..(el producto de gel PanE) , el producto de gen PanE2 y/o una acetohidroxisomeroreductasa (el producto de gen ilvC) y los resultados de la condensación de ácido [R] -2-hidroxiisovalérico ( -HIV) , formado por reducción de a-KIV, y ß-alanina, esta última reacción es catalizada por la enzima biosintética de pantotenato pantotenato sintetasa (el producto de gen PanC) . Los sustratos ct-KIV y ß-alanina pueden ser utilizados tanto para la producción de pantotenato como para la producción de HMBPA, ß-alanina proporcionándose, por ejemplo, por alimentación y/o actividad aspartato-a-decarboxilato incrementada (el producto de gen PanD) . Con el objeto de disminuir o eliminar la competencia para los precursores de la biosintesis de pantotenato y/o enzimas biosintéticas, es deseable regular selectivamente ciertas enzimas de tal manera que la producción se aleje de HMBPA y se dirija hacia pantoato-panto'tenato . De preferencia, microorganismos que tienen una via biosintética de pantotenato desregulada y/o una via biosintética de isoleucina-valina (ilv) desregulada son manipulados adicionalmente de tal manera que PanB y/PanE sean regulados 5 selectivamente. La regulación selectiva de PanB y/o PanE incluye la optimización de los niveles de estas enzimas de tal manera que la producción fluya hacia pantoato/pantotenato . En particular, la presente invención presenta métodos para gnz. ¦ . 10.. producir composiciones que tienen proporciones incrementadas . entre pantotenato y HMBPA, de preferencia, composiciones de pantotenato libres de HMBPA. Como se emplea -aquí, la expresión "composición de pantotenato libre de HMBPA" describe una composición que incluye pantotenato libre de HMBPA y/o sustancialmente libre de HMBPA de tal manera que dicha composición incluya cantidades insignificantes de HMBPA (es decir, si HMBPA está presente, su presencia se encuentra a un nivel suficientemente bajo o a una concentración relativa suficientemente baja con relación al nivel o concentración de pantotenato de tal manera que la composición pueda considerarse como libre de HMBPA para propósitos tecnológicos, científicos y/o industriales) . De preferencia, una composición de pantotenato libre de HMBPA incluye pantotenato y, si HMBPA está presente, su presencia se encuentra en una proporción de 10:100 (es decir, 10% de HMBPA versus 90% de pantotenato, por ejemplo, de conformidad con lo determinado por comparación de las áreas de pico cuando una muestra de producto es analizada por HPLC) o menos. Con mayor preferencia, una composición de pantotenato libre de HMBPA incluye pantotenato y, si HMBPA está presente, está presente en una proporción de 9:100 (es decir 9% de HMBPA versus 91% de pantotenato) o menos. Con preferencia aún mayor, una composición de pantotenato libre de HMBPA incluye pantotenato y, si HMBPA está presente, su presencia se encuentra en proporción de .,8:100 (es decir, 8% de HMBPA versus 92% de pantotenato) o menos, 7:100 (es decir 7% de HMBPA versus 93% de . pantotenato) o menos, 6:100 (es decir, 6% de HMBPA versus 94% de pantotenato) o menos o bien 5:100 (es decir, de HMBPA versus 95% de pantotenaco) o menos. Con preferencia aún mayor una composición, de pantotenato libre de HMBPA incluye pantotenato y, si HMBPA está presente, está presente en una proporción e 0.5:100 (es decir, 0.5% de HMBPA versus 99.5% de pantotenato) o menos, 0.2:100 (es decir, 0.2% de HMBPA versus 99.8% de pantotenato) o menos o bien 0.1:100 (es decir, 0.1% de HMBPA versus 99.9% de pantotenato) o menos. Valores y rangos incluidos y/o intermedio de los valores presentados aqui se contemplan también dentro del alcance de la presente invención. En una modalidad, la invención presenta un proceso para la producción de un pantotenato libre de HMBPA que incluye el cultivo de un microorganismo que tiene una via biosintética de pantotenato desregulada bajo condiciones tales que se produzca una composición de pantotenato libre de HMBPA. El término vía biosintética de pantotenato" incluye la via biosintética que incluye las enzimas biosintéticas de pantotenato (por ejemplo, polipéptidos codificados por genes de codificación de -enzima biosintética) , compuestos (por ejemplo, sustratos, productos intermedios o productos), cofactores y similares utilizados en la formación o síntesis de pantotenato. El término ía biosintétab&a de...pantotenato" incluye la vía biosintética que lleva a la síntesis de pantotenato en microorganismos (por ejemplo, individuo) así como la vía biosintética que lleva a la síntesis de pantotenato in vxtro. Como se emplea aquí, un microorganismo ¾que tiene una vía biosintética de pantotenato desregulada) incluye un microorganismo que tiene por lo menos una enzima biosintética de pantotenato desregulada (por ejemplo, sobre-expresada) (ambos términos de conformidad con lo definido aquí) de tal manera que se incremente la producción de pantotenato (por ejemplo, en comparación con la producción de pantotenato en dicho nucleoorganismo antes de la desregulación de dicha enzima biosintética o bien en comparación con un microorganismo de tipo silvestres) . El término "pantotenato" incluye la forma de ácido libre de pantotenato, que se conoce también como ""ácido pantoténico" así como cualquier sal del mismo (por ejemplo, derivada por reemplazo del hidrógeno ácido del pantotenato o del ácido pantoténico con un catión, por ejemplo, calcio, sodio, potasio, amonio) , que se conoce también como una "sal de "pantotenato". El término "pantotenato" incluye también derivados alcohólicos de pantotenato. Sales de pantotenato preferidas son pantotenato de calcio o pantotenato de sodio. Un derivado alcohólico preferido es pantotenol. Sales de pantotenato y/o alcoholes , de . la presente invención incluyen sales y/o al-j¡©-aoles preparados a través de métodos convencionales a partir de los ácidos libres descritos aquí. En otra modalidad, una_ sal de pantotenato es sintetizada directamente por un microorganismo de la presente invención. Una sal de pantotenato de' la presente invención puede también ser convertida en una forma de ácido libre de pantotenato o ácido pantoténico por metodología convencional. De preferencia, un microorganismo "que tiene una vía bíosintética de pantotenato desregulada" incluye un microorganismo que tiene por lo menos una enzima bíosintética de pantotenato desregulada (por ejemplo, sobre- expresada) de tal manera que la producción de pantotenato sea 1 g/L o mayor. Con mayor preferencia, un microorganismo "que tiene una vía bíosintética de pantotenato desregulada" incluye un microorganismo que tiene por lo menos una enzima bíosintética de pantotenato desregulada (por ejemplo, sobre-expresada) de tal manera que la producción de pantotenato sea de 2 g/L o más. El término "enzima biosintética de pantotenato" incluye cualquier enzima utilizada en la formación de un compuesto (por ejemplo, el producto intermedio o producto) de la via biosintética de pantotenato. Por ejemplo, la síntesis de pantotenato a partir de a-quetoisovalerato (a-KIV) procede a través del producto intermedio, quetopantoato . La formación de quetopantoato es catalizada por el enzima biosintética de pantotenato panB o bien quetopsrrr.oato . hidroximetiltransferasa (el producto del gen panB) .' La formación de pantoato es catalizada por la enzima biosintética de pantotenato PanEl o bien quetopantoato reductasa (el producto de gen panEl) . La síntesis de ß-alanina a partir del aspartato es catalizada por la enzima biosintética de pantotenato PanD o bien aspartato-a-decarboxilasa (el producto de gen panD) . La formación de pantotenato a partir de pantoato y ß- l niña (por ejemplo, condensación) es catalizada por la enzima biosintética de pantotenato PanC o bien pantotenato sintetasa (el producto de gen PanC. Las enzimas biosintéticas de pantotenato pueden también efectuar una función alternativa como enzimas en la vía biosintética de HMBPA descrita aquí. Por consiguiente, en una modalidad, la invención presenta un proceso para la producción de una composición de pantotenato libre de HMBPA que incluye el cultivo de un microorganismo que tiene por lo menos una enzima biosintética de pantotenato desregulada (por ejemplo, desregulada de tal manera que la producción de pantotenato sea incrementada) , dicha enzima se selecciona, por ejemplo, dentro del grupo que consiste PanB (o bien quetopantoato hidroximetiltransferasa) , PanC (o bien pantotenato sintetasa, PanD (o bien aspartato-a-decarboxilasa) , PanEl (o bien quetopantoato reductasa) . En otra modalidad, la invención presenta un proceso para la producción de una composición de pantotenato libre de HMBPA que incluye e cultivo de un microorganismo, .agaje tiene por lo menos dos enzimas biosintéticas de pantotenato desregulada, dichas enzimas, seleccionándose, por ejemplo, dentro del grupo que consiste de PanB (quetopantoato hidroximetiltransferasa) , PanC (o bien pantotenato sintetasa) , PanD (o bien aspartato-a-decarboxilasa, y PanEl (o bien quetopantoato reductasa. En otra modalidad, la invención presenta un proceso para la producción de una composición de pantotenato libre de HMBPA que incluye e cultivo de un microorganismo que tiene por lo menos tres enzimas biosintéticas de pantotenato desreguladas, dichas enzimas seleccionándose, por ejemplo, dentro del grupo que consiste de PanB (o bien quetopantoato hidroximetiltransferasa) , PanC (o bien pantotenato sintetasa) , PanD (o bien aspartato-a-decarboxilasa) , y PanEl (quetopantoato reductasa) . En otra modalidad, la invención presenta un proceso para la producción de una composición de pantotenato libre de HMBPA que incluye el cultivo de un microorganismo que tiene por lo menos cuatro enzimas biosintéticas de pantotenato desreguladas, por ejemplo, un microorganismo que tiene PanB (o bien quetopantoato hidroximetiltransferasa) , PanC (o bien pantotenato sintetasa) , PanD o bien aspartato-a-decarboxilasa) , y PanEl (o bien quetopantoato reductasa) desreguladas. En otro aspecto, la invención presenta un proceso para la producción de un pan¾(¾:enato libre de HMBPA que incluye el cultivo de un microorganismo que tiene una vía biosintética de pantotenato des -regulada bajo condiciones tales que se produzca una composición de pantotenato libre de HMBPA, el microorganismo tiene ademas una via biosintética de isoleucina-valina desregulada. El término "via biosintética" de isoleucina-valina incluye la via biosintética que involucra enzimas biosintéticas de isoleucina-valina (por ejemplo, polipéptidos codificados por genes que codifican la enzima biosintética), compuestos (por ejemplo, sustratos, productos intermedios o productos), cofactores y similares utilizados en la formación o síntesis de conversión de piruvato en valina o isoleucina. El término "via biosintética de isoleucina-valina" incluye la vía biosintética que lleva a la síntesis de valina o isoleucina en microorganismos (por ejemplo, in vivo) así como la vía biosintética que lleva' a la síntesis de valina o isoleucina in vitro. Como se emplea aquí, el término un microorganismo ""que tiene una vía de isoleucina-valina (ilv) desregulada" incluye un microorganismo que tiene por lo menos una enzima biosintética de isoleucina{ alina (ilv) desregulada (por ejemplo, sobre-expresada) (ambos términos de conformidad con lo definido aquí) de tal manera que se incremente la producción de isoleucina y/o valina y/o precursor de valina, cx~ ketoisovalerato (OÍ-KIV) (en comparación con la producción de isoleucina y/o valina y/o a-KIV en^dicho microorganismo antes de la desregulación de dicha enzima biosintética o bien en comparación con un microorganismo de tipo silvestre) . La Figura 1 incluye una representación esquemática de la vía biosintética de isoleucina-valina. Las enzimas biosintéticas de isoleucina-valina son representadas en cursivas en negritas y sus genes correspondientes son indicados en cursivas. El término "enzima biosintética de isoleucina-valina^incluye cualquier enzima utilizada en la formación de un compuesto (por ejemplo, intermedio o producto) de la vía biosintética de isoleucina-valina. De conformidad con la Figura 1, la síntesis de valina a partir de piruvato procede a través de los productos intermedios, acetolactabq>£ dihidroxiisovalerato ( , ß-DHIV) y a-ketoisovalerato (ot-KIV) . La formación de acetolactato a partir de piruvato es catalizado por la enzima biosintética de isoleucina-valina ? i acetohidroxiácido sintetasa (los productos del gen ilvBM o bien alternativamente, el producto de gen alsS) . La formación de , ß-DHIV a partir de acetolactato es catalizado por la enzima biosintética de isoceleucina-valina acetohidroxiácido isomeroreductasa (el producto del gen ilvBN. La síntesis de - IV a partir de a-ß-DHIV es catalizada por la enzima biosintética de isoleucina-valina dihidroxiácido deshidratasa (el producto del gen ilvD) . Además, la valina y la isoleucina pueden estar inter-convertidas con sus compuestos a-keto respectivos _· por aminoácido transaminasas de cadena ramificada. Las enzimas biosintéticas de isoleucina-valina pueden también efectuar una función alternativa como enzimas en la vía biosintética de HMBPA descrita aquí. Por consiguiente, en una modalidad, la invención presenta un proceso para la producción de una composición de pantot.enato libre de HMBPA que incluye el cultivo de un microorganismo que tiene por lo menos una enzima biosintética de isoleucina-valina (ilv) desregulada (por ejemplo, desregulado de tal manera que se incremente la producción de valina .y/o isoleucina y/o a- IV) . Dicha enzima seleccionándose, por ejemplo, dentro del grupo que consiste de IlvBN, AlsS (o bien acetohidroxiácido sintetasa) , IlvC (o bien acetohidroxiácido isomeroreductasa) e IlvD (o bien dihidroxiácido deshidratasa) . En otra modalidad, la invención presenta un proceso para producción de una composición de pantotenato libre de HMBPA que incluye el cultivo de un microorganismo que tiene por lo menos dos enzimas biosintéticas de isoleucina-valina (ilv) desreguladas, dicha enzima seleccionándose, por ejemplo, dentro del grupo que consiste de IlvBN, AlsS (o bien acetohidroxiácido sintetasa) , IIvC (o bien acetohidroxiácido isomeroreductasa) e IIvD (o bien dihidroxiácido deshidratasa) . En otra modalidad, la invención presenta un proceso para la producción de una composición de pantotenato libre de ????? que incluye el cultivo de un microorganismo que ti^ne. .por , lo menos tres enzimas biosintéticas de isoleucina-valina (ilv) desreguladas, por ejemplo, dicho microorganismo que tiene IlvBN o AlsS (o bien acetohidroxiácido sintetasa) , IlvC (o bien acetohidroxiácido isomeroreductasa) e IlvD (6 bien dihidroxiácido deshidratasa) desregulada. Como se mencionó aguí,, se ha descubierto que enzimas de la vía biosintética de pantotenato y/o vía de isoleucina-valina (ilv) tienen una actividad alternativa en síntesis de ácido [R] -3- (2-hidroxi-3-metJ-l-butirilamino) -propiónico ("HMBPA") o bien la vía biosintética de ácido [R] -3- (2-hidroxi-3-metil-butirilamino) -propiónico ("HMBPA") . El término "vía biosintética de ácido [R]-3- {2-hidroxi-3-metil-butirilamino) -propiónico ("HMBPA") " incluye la vía biosintética alternativa que incluye enzimas biosintéticas y compuestos (por ejemplo, sustratos y similares) tradicionalmente asociados con la vi biosintética de pantotenato y/o la vía biosintética de isoleucina-valina (ilv) utilizada en la formación o síntesis de HMBPA. El término "vía biosintética de HMBPA" incluye la vía biosintética que lleva a la síntesis de HMBPA en microorganismos (por ejemplo, in vivo) así como la vía biosintética que lleva a al síntesis de HMBPA in vltro. El término "enzima biosintética de HMBPA" incluye cualquier enzima utilizada en la formación de un compuesto (por ejemplo, producto intermedio o producto) de la vía biosintética de HMBPA- Por ejemplo, la síntesis de ácido 2- & hidroxiisovalérico ( -HIV) a partir de -ketoisovalerato (cx-KIV) es catalizada por el producto de gen panEl o panE2 - (PanEl se conoce alternativamente aquí como quetopantoato reductasa) y/o es catalizada por el producto de gen ilvC (se conoce alternativamente aquí como acetohidroxiácido isomeroreductasa) . La formación de HMBPA a partid de alanina y a-HIV es catalizada por el producto de gen panC (se conoce alternativamente aquí como pantotenato sintetasa) . El término "ácido [R]-3- (2-hidroxi-3-metil-butirilamino) -propiónico ("HMBPA") incluye la forma de ácido libre de HMBPA, que se conoce también como [R]-3- (2-hidroxi-3-metil-butirilamino) -propionato" así como cualquier sal del mismo (por ejemplo, derivado por medio del reemplazo del hidrógeno ácido de 3- (2-hidroxi-3-metil-butirilamino) -propiónico o bien 3- (2-hidrüxi-3-metil— utirilamino) -propionato con un catión, por ejemplo, calcio, sodio, potasio, amonio), que se conoce también como "sal de ácido 3- (2-hidroxi-3-metil-butirilamino) -propiónico" o bien "sal de HMBPA" . Sales de HMBPA preferidas son HMBPA de calcio o HMBPA de sodio. Sales de HMBPA de la presente invención incluyen sales preparadas a través de métodos convencionales a partir de los ácidos libres descritos aquí. Una sal de HMBPA de la presente invención puede también ser convertida en una forma de ácido libre de ácido 3- (2-hidroxi-3-metil-butirilamino) -propiónico o bien 3- (2- ,¾ioxi-3,-metil-butirilamino) -propionato a través de una metodología convencional . Con base por. lo menos en parte del descubrimiento que la sobre-expresión o desregulación de la vía biosintética de pantotenato y/o vía de isoleucina-valina ( Jv) pueden resultar en una producción alternativa de HMBPA (en comparación con la producción de pantotenato) , la presente invención presenta procesos para la producción de pantotenato libre de HMBPA que incluyen el cultivo de microorganismos que no solamente tienen la vía biosintética de pantotenato y¿o la vía de isoleucina-valina (ilv) desreguladas, sino que tienen además ciertas enzimas selectivamente reguladas de tal manera que se favorezca la producción de composiciones de pantotenato libres de HMBPA. De conformidad con lo definido aquí, el término "selectivamente regulada" incluye la selección para regulación o enfoque de una enzima particular o de enzimas particulares para la vía biosintética de pantotenato o la vía de isoleucina-valina (llv) conocida por participar tanto en la sintesis tanto de pantotenato como en la síntesis de HMBPA de una manera que favorece la producción de pantotenato con relación a la producción de HMBPA. Enzimas preferidas seleccionadas o enfocadas para regulación incluyen PanEl, PanE2, PanB y/o IlvC- En una modalidad, PanEl es regulada selectivamente. Por ejemplo, los presentes inventores han descubierto que la sobre-expresión de PanEl puede catalizar la formación de . precursores de HMBPA, por consiguiente la regulación selectiva de la cantidad o actividad (por ejemplo, para disminuir ligeramente los niveles o actividad de PanEl) puede desplazar la formación de producción de HMBPA hacia la producción de pantotenato (es decir, favorecer la producción de pantotenato en comparación con la producción de HMBPA) . Además, se ha descubierto que PanE2 favorece la producción de HMBPA. Por consiguiente, otra modalidad, presenta la deleción o regulación de panE2. De la misma manera, los presentes inventores han descubierto que un incremento de « la actividad PanB puede desplazar la formación desde la vía biosintética de HMBPA alternativa hacia la vía biosintética de pantotenato, por lo que la regulación selectiva de la cantidad o actividad de PanB puede favorecer la producción de pantotenato en comparación con la I producción de HMBPA. En una modalidad, la actividad PanB es incrementada mediante la sobreexpresión o desregulación del gen panB. En otra modalidad, la actividad PanB es incrementada por la expresión de copias múltiples del gen panB. La actividad PanB puede ser incrementada por medio de la disminución de la inhibición de retroalimentacion de PanB. En particular, se ha descubierto que la actividad PanB puede ser incrementada mediante la regulación (por ejemplo, regulación selectiva) de pantotenato quinasa, una enzima ^ria e en. la formación de Coenzima A (CoA) a partirá3-. pantotenato (véase, por ejemplo, Solicitud de Patente -Norteamericana No. de Serie No. 09/09/667,569). La regulación de la pantotenato quinasa (por ejemplo, la disminución de la actividad o nivel de pantotenato quinasa) redujo la producción de CoA, reduciendo a su vez la inhibición de retroalimentacion de PanB asi como favoreciendo la acumulación de pantotenato. En una modalidad, la actividad pantotenato quinasa es disminuida (y la actividad PanB es a su vez incrementada) mediante la deleción de CoaA y la regulación de descendente de la actividad de CoaX (CoaA y CoaX pueden catalizar el primer paso de biosintesis de CoA en ciertos microorganismos) . En otra modalidad, la actividad pantotenato quinasa es disminuida (y la actividad PanB es a su vez incrementada) mediante la deleción de CoaX y la regulación descendente de CoaA. En otra modalidad, la actividad pantotenato quinasa es disminuida (y la actividad PanB es a su vez incrementada) mediante la regulación descendente de las actividades CoaA y CoaX. En oro aspecto de la presente invención presenta procesos para la producción de pantotenato libre de HMBPA que incluyen el cultivo de microorganismos bajo condiciones de cultivo seleccionadas para favorecer la producción de pantotenato en comparación con la producción de HMBPA. En particular, se ha descubierto que condiciones que incluyen, pero no se limitan a esto, glucosa de estado de eguilifcasio reducida, oxigeno disuelto de estado de equilibrio incrementado y/o exceso de serina favorecen la producción de pantotenato en comparación con la producción de HMBPA. El término "glucosa de estado de equilibrio reducida" incluye los niveles de glucosa de estado de equilibrio menores o inferiores a los habitualmente utilizados para cultivar el microorganismo en cuestión. Por ejemplo, el cultivo de microorganismos Bacillus descritos en los ejemplos de la presente invención es efectuado rutinariamente en presencia de aproximadamente 0.2-1,0 g/L de glucosa de estado de equilibrio. Por consiguiente, los niveles reducidos de glucosa de estado de equilibrio incluyen de preferencia niveles inferiores a 0.2 g/L de glucosa de estado de equilibrio. I1 término "oxígeno disuelto de . estado de equilibrio incrementado" incluye los niveles de oxígeno disuelto de estado de equilibrio incrementados o mayores que los habitualmente utilizados para cultivar el microorganismo en cuestión y, por ejemplo, se correlaciona inversamente con niveles reducidos de glucosa de estado de equilibrio . Por ejemplo, el cultivo de los microorganismos Bacillus descrito en los ejemplos de la presente invención se efectúa habitualmente en presencia de aproximadamente 10-30% de oxigeno disuelto . Por consiguiente, el oxigeno disuelto de estado de equilibrio incrementado puede incluir niveles mayores que 30% de oxigeno disuelto, de preferencia hasta 95% de oxigeno, d-fesaielto- El término ""exceso de serina" incluye niveles de serina incrementados o mayores que los habitualmente utilizados para cultivar el microorganismo en cuestión. Por ejemplo, el cultivo de los microorganismos Bacillus descrito en los ejemplos de la presente invención se efectúa de manera rutinaria en presencia de aproximadamente 0-2.5 g/L de serina. Por consiguiente, niveles de serina en exceso pueden incluir niveles mayores que 2.5 g/L de serina, de preferencia entre aproximadamente 2.5 y 20 g/L de serina. En otra modalidad, la producción de HMBPA es favorecida por el incremento de precursores y/o productos intermedios de via biosintética de pantotenato y/o isoleucina-valina (ilv) de conformidad con lo definido aqui (por ejemplo, el cultivo de microorganismos en presencia de exceso de ß-alanina, valina y/o x-KIV) o bien, alternativamente, el cultivo de microorganismos capaces de producir niveles significativos de ß-alanina en ausencia de una alimentación ?f -alanina (es decir, microorganismos independientes de ß-alanina de conformidad con la Solicitud de Patente Norteamericana No 09/09/667,569) . 5 Varios aspectos de la invención se describen en detalles adicionales en las sub-secciones siguientes: I. Enfoque de Genes que Codifican Varias Enzimas Biosintéticas de Pantotenato y/o isoleucina-Valina (ilv) y/o HMBPA «5. · . 10. En una modalidad, la presente invención se dirige a.enfocar o modificar varias enzimas biosintéticas de las vías ', biosintéticas de pantotenato y/o isoleucina-valina -(ilv) y/o HMBPA. En particular, la invención presenta la modificación de varias actividades enzimáticas asociadas con dichas vías 15 mediante la modificación o la alteración de los genes que codifican dichas enzimas biosintéticas. El término "gen", como se emplea a uí, incluye una molécula de ácido nucleico (por ejemplo, una molécula de ADN o segmento de la ^ misma) que, en un. organismo, puede ser separada de otro gen o de otros genes, por ADN intergénico (es decir, ADN de espaciador o de intervención que flanquea naturalmente el gen y/o separa genes en el ADN cromosómico del organismo) . Alternativamente, un gen puede empalmar ligeramente otro gen (por ejemplo, el extremo 3' de un primer gen empalma el extremo 5' de un segundo gen) , los genes que se empalman están separados de los demás genes por ADN intergénico. Un gen puede dirigir la síntesis de una enzima u otra molécula de proteina (por ejemplo, puede comprender secuencias codificadoras, por ejemplo, un cuadro de lectura abierto contiguo (ORF) que codifica la proteina) o bien puede en si ser funcional en el organismo. Un gen en un organismo puede agruparse en un operón, de conformidad con lo definido aquí, dicho operón siendo separado de otros genes y/u operones por ADN intergénico. Un "gen aislado", como se emplea aquí, incluye un gen esencialmente libre de secuencias que flanquean naturalmente el gen en el ADN cromosómico del organismo a partir del cual el gen es derivado (es decir, libre de secuencias codificadoras adyacentes que codifican una. segunda proteina o proteina distinta, secuencias estructurales adyacentes o similares) e incluye opcionalmente secuencias reguladoras 5' y 3' , por ejemplo, secuencias de promotor y/o secuencias de terminador. En una modalidad, un gen asilado incluye secuencias predominantemente codificadoras para una proteina (por ejemplo, secuencias que codifican proteínas Bacillus) . En otra modalidad, un gen aislado incluye secuencias codificadoras para una proteina (por ejemplo, para una proteina de Bacillus) y secuencias reguladoras 5' y/o 3' a partir del ADN cromosómico del organismo a partir del cual el gen es derivado (por ejemplo, secuencias reguladoras de Bacillus 5 y/o 3' adyacentes) . De preferencia, un gen aislado contiene menos que aproximadamente 10 kb, 5 kb 2 kb, 1 kb, 0-5 kb, 0.2 kb, 0.1 kb, 50 bp, 25 bp o bien 10 bp de secuencias de nucleótidos que flanquean naturalmente el gen en el ADN cromosómico del organismo a partir del cual el gen es derivado. El término "operón" incluye por lo menos dos genes adyacentes u ORF's, opcionalmente empalmándose en secuencia ya sea en extremo 5' o en el extremo 3' de por lo menos un gen u ORF. El término "operón" incluye una unidad coordinada de expresión de gen que contiene un ipaoiiiotor y posiblemente un elemento de regulación asociado .con uno o varios genes adyacentes u ORFs (por ejemplo-, genes estructurales que codifican enzimas, por ejemplo, enzimas biosintéticas) . La expresión de los genes (por ejemplo, genes estructurales) puede ser regulada de manera coordinada, por ejemplo, por proteínas de regulación que se unen al elemento regulador o bien por anti-terminación de transcripción. Los genes de un operón (por ejemplo, genes estructurales) pueden ser transcritos para proporcionar un üBNm. sm le que codifica todas las proteínas. Un "gen que tiene una mutación" o "gen mutante" como se emplea aquí, incluye un gen que tiene una secuencia de nucleótidos que incluye por lo menos una alteración (por ejemplo, sustitución, inserción, deleción) de tal manera que el polipéptido o la proteína codificada por dicho mutante presente una actividad diferente del polipéptido o proteina codificado por la molécula de ácido nucleico de tipo silvestre o gen. En una modalidad, un gen que tiene una mutación o gen mutante codifica un polipéptido o una proteina que tiene actividad incrementada en comparación con el polipéptido o proteina codificada por el gen de tipo silvestre, por ejemplo, cuando se ensaya en condiciones similares (por ejemplo, ensayado en microorganismos cultivados a la misma temperatura) . Como se emplea aquí, una "actividad incrementada" o una "actividad enzimática incrementada" es una actividad que es por lo menos 5% mayor que la actividad del polipéptido o proteína - codificado por molécula o gen de ácido nucleico de tipo silvestre, de preferencia' por lo menos 5-10% mayor, con mayor preferencia, por lo menos 10-25% mayor o con preferencia aún mayor, por lo menos 25-50%, 50-75% ó 75-100% mayor que la del polipéptido o proteína codificada por el gen o molécula de ácido nucleico de tipo silvestre. Rangos intermedios entre los valores mencionados arriba, por ejemplo, 75-85%, 85-90%, 90-95%, están también abarcados dentro del marco de la presente invención. Como se emplea aqui, una '"actividad incrementada" o una "actividad enzimática incrementada" puede también incluir una actividad que es por lo menos un 1.25 veces mayor que la actividad del polipéptido ó proteína codificada por el gen de tipo silvestre, de preferencia por lo menos 1.5 veces mayor, con mayor preferencia por lo menos 2 veces mayor y con preferencia aún mayor por lo menos 3 veces, 4 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces, 50 veces, 100 veces mayor que la actividad del polipéptido o proteina codificada por el gen de tipo silvestre. En otra modalidad, un gen que tiene una mutación o gen mútante codifica un polipéptido o proteina que tiene una actividad reducida en comparación con el polipéptido o proteina codificada por el gen de tipo silvestre, ' por ejemplo, cuando se eás-aya en condiciones similares (por ejemplo, ensayado en microorganismos cultivados en la misma temperatura) . Un gen imitante puede también codificar ningún polipéptido o tener un nivel reducido de producción del polipéptido de tipo silvestre- Como se emplea aquí, una "actividad reducida" o "actividad enzimática reducida" es una actividad que es por lo menos 5% menor a la actividad del polipéptido o proteina codificada por el gen o molécula de ácido nucleico de tipo silvestre, de preferencia por lo menos 5-10% menor, de preferencia por lo menos 10-25% menor y con preferencia aún mayor por lo menos 25-50%, 50-75% ó 75-100% menor que la actividad del polipéptido o proteina codificada por el gen o molécula de ácido nucleico de tipo silvestre. Rangos intermedios de los valores mencionados arriba, por ejemplo, 75-85%, 85-90%, 90-95%, se contemplan también como abarcados dentro del marco de la presente invención. Como se emplea aqui, una ^actividad reducida" o "actividad enzimática reducida" puede también incluir una actividad que ha sido borrada o ^noqueada" (por ejemplo, una actividad aproximadamente 100% menor que la actividad del polipéptido o proteina codificada por el gen o molécula de ácido nucleico de tipo silvestre) . Una actividad puede ser determinada de conformidad con cualquier ensayo bien aceptado para medir la actividad de una proteina particular de interés. La actividad puede ser medida o ensayada directamente, . ?t ejemplo,. la medición de una actividad de una proteina asilada o purificada a partir de una célula o microorganismo. Alternativamente, una actividad puede ser medida o ensayada dentro de una célula o microorganismo o bien en un medio ektracelular. Por ejemplo, el ensayo para un gen mutante (es decir, dicho mutante que codifica una actividad enzimática reducida) puede lograrse mediante la expresión del gen mutante en un microorganismo, por ejemplo, un microorganismo mutante en el cual la enzima es sensible a la temperatura, v ensayar el gen mutante para determinar la capacidad de complementar un mutante sensible a temperatura (Ts) para actividad enzimática. Un gen mutante que codifica una "actividad enzimática incrementada"' puede ser un gen que complementa el mutante Ts más efectivamente por lo ejemplo que un gen de tipo silvestre correspondiente. Un gen mutante que codifica una "actividad enzimática reducida" es un gen que complementa el mutante Ts de manera menos efectiva, por ejemplo que, un gen de tipo silvestre correspondiente . Se observará por parte del experto en la materia que aún una sustitución simple en una secuencia génica o de ácido nucleico (por ejemplo, una sustitución de base que codifica un cambio de aminoácido en la secuencia de aminoácido correspondiente) puede afectar dramáticamente la actividad de un polipéptido o proteina codificada en comparación con el polipéptido. o proteina de tipo silvestre correspondiente. Un .·:'&. gen mutante (por ejemplo, que codifica un polipéptido o proteina mutante) , de conformidad con lo definido aquí, es fácilmente distinguible de un gen o ácido nucleico que codifica una proteina homologa en la medida en que un gen mutante codifica una proteina o polipéptido que tiene una actividad alterada, opcionalmente observable como un fenotipo distinto diferente en un microorganismo que expresa dicho gen mutante o produce en dicha proteina mutante o polipéptido mutante (es decir, un microorganismo mutante) en comparación con un microorganismo correspondiente que expresa el gen de tipo silvestre. En contraste, un homólogo de proteina puede tener una actividad idéntica o sustancialmente similar, opcionalmente fenotípicamente no discernible cuando se produce en un microorganismo, en comparación con un microorganismo correspondiente que expresa el gen de tipo silvestre. Por consiguiente, no es por ejemplo, el grado de identidad de secuencia entre las moléculas de ácido nucleico, genes, proteina o polipéptidos que sirve para distinguir entre homólogos y imitantes, sino que es la actividad de la proteína o polipéptido codificado que distingue entre homólogos y murantes: los homólogos tienen, por ejemplo, una identidad de secuencia baja (por ejemplo, identidad de secuencia del 30-50%) y sin embargo, tienen actividades funcionales sustancialmente equivalentes, " y los imitantes comparten por esj-emplo una identidad de secuencia del 99% y sin embargo, tienen actividades funcionales dramáticamente diferentes o alteradas. La persona con conocimientos en la materia observará también que moléculas de ácido nucleico, genes, proteína o polipéptidos para su uso en la presente invención pueden ser derivados de cualquier microorganismo que tiene una vía biosintética de HMBPA, una vía biosintética de llv o una vía biosintética de pantotenato. Tales moléculas de ácido nucleico, genes, proteína o polipéptidos pueden ser identificados por la persona con conocimientos en la materia empleando técnicas conocidas tales como tamizado por homología, comparación se secuencias y similares, y pueden ser modificados por la persona con conocimientos en la materia de tal manera que la expresión o producción de estas moléculas de ácido nucleico, genes, proteína o polipéptidos ocurra en un microorganismo recombinante (por ejemplo, mediante la utilización de promotores apropiados, sitios de unión ribosomales, vectores de expresión o integración, modificación de la secuencia de los genes de tal manera que 5 se incremente la transcripción (tomando en cuenta el uso de codón preferido), etc., de conformidad con técnicas descritas aquí y las técnicas conocidas en la técnica) . En una modalidad, los genes de la presente invención se derivan de un organismo microorganismo Gram positivo (por -3Ü.Q ejemplo, un microorganismo que conserva el colorante. b¿sJ.co, por ejemplo, violeta cristal, debido a la presencia de. una pared Gram positiva que rodea el microorganismo) . El término "derivado de" (por ejemplo, "derivado de" un microorganismo Gram positivo) se refiere a un gen naturalmente encontrado en el microorganismo (por ejemplo, se encuentra naturalmente en un microorganismo Gram positivo) . En una modalidad preferida, los genes de la presente invención son derivados de un microorganismo que pertenece a un género seleccionado dentro de]., grupo que consiste de Bacillus, Corynebacterium (por ejemplo, Corynebacterium glutamicum) , Lactobacillusr Lactococci y Streptomyces. En una modalidad más preferida, los genes de la presente invención se derivan de un microorganismo del genero Bacillus. En otra modalidad preferida, los genes de la presente invención son derivados de un microorganismo seleccionado dentro del grupo que consiste de Bacillus subtillsr Bacillus lentimoxbusr Bacillus lentus, Bacillus finasr Bacillus lentus, Bacillus firmus, Bacillus pantothenticus, Bacillus amylollqaefaciens, Bacillus cerues, Bacillus cixculans, Bacillus coagulans, Bacillus 5 licheníformitsf Bacillus megateriumr Bacillus pumilus, Bacillus thuringiensisr Bacillus halodurans, y otras especies de Bacillus de grupo 1, por ejemplo, de conformidad con lo caracterizado por el tipo 16S ARNr. En otra modalidad, preferida, el gen es derivado de un Bacillus brevis o lCk=s. bacillus stearothermoliphus. En otra modalidad preferida, ••2S5¾; ¦ . ¦ genes de la presente invención son derivados de un microorganismo seleccionado dentro del grupo que consiste de Bacillus lichenformis, Bacillus amylolíquefaciensr Bacillus subtilis, y Bacillus pumilus. En una modalidad particularmente preferida, el gen es derivados de Bacillus subtilis fpor ejemplo, es derivado de Bacillus subtilis) . El término "derivado de Bacillus subtilis" o bien "derivado de Bacillus subtilis" o bien derivados de nBacillus subtilis" incluyen un gen naturalmente encontrado en el microorganismo Bacillus subtilis. Dentro del alcance de la presente invención se encuentran genes derivados de Bacillus (por ejemplo, genes derivados de B. subtilis), por ejemplo, genes coaX, genes serA, genes glyA, genes coaA, genes pan y/o genes ilv de Bacillus o B. subtilis. 25 En otra modalidad, los genes de la presente invención son derivados de un microorganismo Gram negativo (excluye colorante básico) . En una modalidad preferida, los genes de la presente invención son derivados de un microorganismo que pertenece a un género seleccionado dentro del grupo que consiste de Salmonella (por ejemplo, Salmonella typhimurium) r Escherichiar Klebsiella, Serratia y Proteus. En una modalidad preferida, los genes de la presente invención son derivados de un microorganismo del género Escherichia. En una modalidad todavía más preferida, los genes de la presente invención son derivados de Escherichia coli. En.¿j=fcra modalidad, los genes de la presente invención son derivados de Saccharomyces (por ejemplo Saccharomyces cerevisiae) . - II. Moléculas de ácido nucleicos recombinantes y vectores La presente invención presenta además moléculas de ácido nucleicos recombinantes (por ejemplo, moléculas de ADN recombinantes) que incluyen genes descritos aquí (por ejemplo, genes aislados) . De preferencia, genes de Bacillus, con mayor preferencia genes de Bacillus subtilis, con preferencia aún mayor genes biosintéticos de pantotenato de Bacillus subtilis y/o genes biosintéticos de isoleucina-valina (ilv) y/o genes biosintéticos de HMBPA. El término "molécula de ácido nucleico recombinante" incluye una molécula de ácido nucleico (por ejemplo, una molécula de ADN, que ha sido alterada o modificada o manipulada de tal manera que difiera en cuanto a secuencia de nucleótidos de una molécula de ácido nucleico nativa o natural a partir de la cuál se derivó la molécula de ácido nucleico recombinante (por ejemplo, por adición, deleción, o sustitución de uno o varios nucleótidos) . De preferencia, una molécula de ácido nucleico recombinante (por ejemplo, una molécula de ADN recombinante) incluye un gen aislado de la presente invención enlazada de manera operativa a secuencias regulatorias . La expresión "secuencia enlazado operativamente a secuencia (s) regulatoria (s) " significa que la secuencia de nucleótidos del gen de interés está unida a la(s) secuencia (s) ragwlatoria (s.) de una manera que permite la expresión (por ejemplo, expresión incrementada, realzada, constitutiva, basal, atenuada, disminuida o reprimida) del gen, de preferencia la expresión de -un producto génico codificado por el gen (por ejemplo, cuando la molécula de ácido nucleico recombinante está incluida en un vector recombinante, de conformidad con lo definido aqui, y es introducido en un microorganismo) . El término "secuencia regulatoria" incluye secuencias de ácido nucleico que afectan (por ejemplo, modulan o regulan) la expresión de otras secuencias de ácido nucleico (es decir, genes) . En una modalidad, una secuencia regulatoria está incluida en una molécula de ácido nucleico recombinante e una posición similar o idéntica y/o en una orientación similar o idéntica con relación a un gen particular de interés como se observa para la secuencia regulatoria y "gen de interés como ! aparece en la naturaleza, por ejemplo, en una posición y/u orientación nativa. Por ejemplo, un gen de interés puede estar incluido en una molécula de ácido nucleico recombinante enlazada operativamente a una secuencia regulatoria que acompaña o es adyacente al gen de interés en el organismo natural (por ejemplo, enlazado operativamente a secuencias regulatorias "nativas" (por e emplo, al promotor "nativo") . Alternativamente, un gen de interés puede estar incluido en una molécula de ácido nucleico recombinante enlazada operativamente a una secuencia regulatoria que acompaña o es adyacente a otro gen (por, ejemplo, un gen diferente) en el organismo natural. Alternativamente, un gen de interés puede estar incluido en una molécula de ácido nucleico recombinante enlazado operativamente a una secuencia regulatoria de otro organismo. Por ejemplo, secuencias regulatorias de otros microbios (por ejemplo, otras secuencias regulatorias bacterianas, secuencias regulatorias de bacteriófagos y similares) pueden estar operativamente unidas a un gen de interés particular. En una modalidad, una secuencia regulatoria es una secuencia que no ocurre naturalmente o no nativa (por ejemplo, una secuencia que ha sido modificada, sometida a mutación, sustituida, derivada, con deleciones incluyendo secuencias que son químicamente sintetizadas) . Secuencias regulatorias preferidas incluyen promotores, realzadores, señales de terminación, señales de antiterminación y otros elementos de control de expresión (por ejemplo, secuencias a las cuales se unen represores o inductores y/o sitios de unión para proteínas regulatorias de transcripción y/o traducción, por ejemplo, en el ARNm transcrito) . Tales secuencias regulatorias son descritas, por ejemplo en Sambrook, J. Fritish, E.F. y Maniatis,^ T. Molecular Cloning: ? Laboratory Manual [Clonación Molecular: Un Manual de Laboratorio] r segunda edición. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold, S samg Ha bor, - NY, 1989. Secuencias regulatorias incluyen las secuencias que dirigen la expresión constitutiva de una secuencia de nucleótidos en un microorganismo (por ejemplo, promotores constitutivos y promotores fuertes) , las que" dirigen la expresión inducible de una secuencia de .nucleótidos en un microorganismo (por ejemplo, promotores inducidos, por ejemplo, promotores inducibles de xilosa) y los que acumulan o retienen la expresión de una secuencia de nucleótidos en un microorganismo (por ej.emplo, señales de atenuación o secuencias de represor) . También dentro del marco de la presente invención se encuentra la regulación de la expresión de un de interés mediante la remoción o la deleción de secuencias regulatorias.- Por ejemplo secuencias involucradas en la regulación negativa de transcripción pueden ser removidas de tal manera que se mejore la expresión de un gen de interés . En una modalidad, una molécula de ácido nucleico recombinante de la presente invención incluye una secuencia de ácido nucleico o gen que codifica por lo menos un producto génico bacteriano (por ejemplo, una enzima biosintética del pantotenato, una enzima biosintética de isoleucina-valina y/o una enzima biosintética de HMBPA) enlazados operativamente a un promotor o secuencia de promotor. Promotores preferidos de la presente invención incluyen promotores de Bacillus y/o promotores des¾bacterió.fago (por ejemplo, bacteriófago que infecta Bacillus) . En una modalidad, un promotor es un promotor Bacillus, de preferencia un promotor Bacillus fuerte (por ejemplo, un promotor asociado con un gen de control químico en Bacillus o un promotor asociado con un gen de vía glicolítica en Bacillus) . En otra modalidad, un promotor es un promotor de bacteriófago. En una modalidad preferida, el promotor proviene del bacteriófago SP01. En una modalidad particularmente preferida, un promotor se selecciona dentro del grupo que consiste de P15f P2s ó Pvegr ue tiene por ejemplo las siguientes secuencias_respectivas : GCTATOACGACAGCTATGGTTCACTGTCCACCAACCAAAACTGTGCTCAGT ACCGCCAATATTTCTCCCTTGAGGGGTACAÁAGAGGTGTCCCTAGAAGAGAT CCACGCTGTGTAAAAAlTTTACAAAAAGGTATTGACriTCCCTACAGGGTGT GTAATAATTTAATTACAGGCGGGGGCAACCCCGCCTGT(SEQIDNO:l)3 GCCTACCTAGCTTCCAAGAAAGATATCCTAACAGCACAAGAGCGGAAAGAT GT nGTl'ClACATCCAGAACAACCTCTGCTAAAATTCCTGAAAAATTTTGCA AAAAGTTGTTGACTTiATCTACAAGGTGTGGTATAATAATCrrAACAACAGC AGGACGC (SEQIDNO:2), y ! i GAGGAATCATAGAATTTTGTCAAAATAATTITATTGACAACGTCTTATTAAC GTTGATATAATTTAAATTTTATTTGACAAAAATGGGCl'CGTGTTGTACAATA . AATGTAGTGAGGTGGATGCAATG (SEQ IDNO:3).

Promotores preferidos adicionales incluyen tef (el promotor de factor de elongación de traducción (TEF) y pyc (el promotor de piruvato carboxilasa (PYC) ) , que promueven un alto nivel de expresión en Bacillus (por ejemplo Bacillus subtilis) . Promotores preferidos adicionales, por ejemplo, ¦para su uso en microorganismos Gram positivos incluyen, sin limitarse a estos ejemplos, promoto.i?e'e amy y SP02.. Promotores preferidos adicionales, por ejemplo, para su uso en microorganismos Gram negativos incluyen, sin limitarse a estos ejemplos, eos, tacr txpr tetr txp-tetr lppr lacf lpp- lacr lacIQ, T7, T5, T3,' gal, tre, arar SP6, ?-PR, o bien ?- PL. En otra modalidad, una molécula de ácido nucleico recombinante de la presente invención incluye una secuencia de terminados o secuencias de terminador (por ejemplo, secuencias de terminador de transcripción) . El término "secuencias de terminador incluye secuencias regulatorias que sirven para terminar la transcripción de AR m. Secuencias de terminador (o bien terminadores de transcripción en tándem) puede servir además para estabilizar el ARNm (por ejemplo, mediante la adición de estructura a ARNm) , por ejemplo, contra nucleasas.

En otra modalidad, una molécula de ácido nucleico recombinante de la presente invención incluye secuencias que permiten la detección del vector que contiene dichas secuencias (es decir, marcadores detectables y/o seleccionadas) , por ejemplo, genes que codifican secuencias de resistencia a los antibióticos o bien que superan mutaciones auxotrópicas, por ejemplo, trpC, marcadores farmacológicos, marcadores fluorescentes, y/o marcadores calorimétricos (por ejemplo, lacZ/ß) . En otra modalidad, una molécula de J£¾cido nucleico, recombinante de la presente invención incluye un sitio de unión de ribosoma artificial (RBS) o una secuencia que es transcrita en un RBS artificial. El término "sitio de unión de ribosoma artificial (RBS)" incluye un sitio dentro de una molécula de AR m (por ejemplo, codificada dentro de ADN) al cuál se une un ribosoma (por ejemplo, para iniciar la traducción) que difiere de un RBS nativa (por ejemplo, un RBS encontrado en un gen que ocurre naturalmente) en por lo menos un nucleótido. RBSs artificiales preferidos incluyen aproximadamente 5-6, 7-8, 9-10, 11-12, 13-14, 15-16, 17-18, 19-20, 21-22, 23-24, 25-26, 27-28, 29-30 o más nucleótidos de los cuales aproximadamente 1-2, 3-4, 5-6, 7-8, 9-10, 11-12, 13-15 o más difieren del RBS nativo (por ejemplo, el RBS nativo de un gen de interés, por ejemplo, el panB RBS nativo TAAACATGAGGAGGAGAAAACATG (SEQ ID NO: 4) o bien el panD RBS nativo ATTCGAGAAATGGAGAGAATATAATATG (SEQ ID NO: 5) ) . De preferencia, nucleótidos que difieren son sustituidos de tal manera que sean idénticos a uno o varios nucleótidos de un RBS ideal cuando se alinean óptimamente para propósitos de comparación. RBSs ideales incluyen, sin limitarse a estos ejemplos, AGAAAGGAGGTGA (SEQ ID NO: 6), TTAAGAAAGGAGGTGANNNNATG (SEQ ID NO: 7), TTAGAAAGGAGGTGANNNNNATG (SEQ ID NO: 8), AGAAAGGAGGTGANNNNNNNATG (SEQ ID NO: 9) , y AGAAAGGAGGTGANNNNNNATG (SEQ im NO: - 10) - . RBSs artificiales pueden ser utilizados para reemplazar los RBSs nativos o que ocurren naturalmente asociados' con un gen particular. RBSs artificiales incrementar de preferencia la producción de un gen particular. RBSs artificiales preferidos (por ejemplo, RBSs para incrementar la producción de panB, por ejemplo, pan B. subtílis, incluyen CCCTCTAGAAGGAGGAGAAAACATG (SEQ ID NO: 11) y CCCTCTAGAGGAGGAGAAAACATG (SEQ ID NO: 12) . RBSs artificiales preferidos (por ejemplo, RBSs para incrementar la producción de panD, por ejemplo, de pan de B. subtil s) incluyen TTAGAAAGGAGGATTTAAATA G (SEQ ID NO: 13), TTAGAAAGGAGGTTTAATTAATG (SEQ ID NO: 14) , TTAGAAAGGAGGTGATT?????G (SEQ ID NO: 15), TTAGAAAGGAGGTGTTTAAAATG (SEQ ID NO: 16) , ATTCGAGAAAGGAGGTGAATATAATATG (SEQ ID NO: 17), ATTCGAGAAAGGAGGTGAATAATAATG (SEQ ID NO : 18), y ATTCGTAGAAAGGAGGTGAAFTA ATG (SEQ ID NO: 19) . La presente invención se refiere además a vectores (por ejemplo, vectores recombinantes) que incluyen moléculas de ácido nucleico (por ejemplo, genes de moléculas de ácido nucleico recombinantes que comprenden tales genes) de conformidad con lo descrito aquí . El término "vector recombinante" incluye un vector (por ejemplo, plásmido, fago, fásmido, virus, cósmido u otro vector de ácido nucleico purificado) que ha sido alterado, modificado o manipulado de tal majaera .que .contenga más secuencias de ácido nucleico, menos secuencias · de ácido nucleico o secuencias de ácido nucleico diferentes de las secuencias de ácido nucleico incluidas en la molécula de ácido nucleico, nativa o natural a partir de la cuál se derivó el vector recombinante. De preferencia, el vector recombinante incluye un gen que codifica una enzima biosintética o una molécula de ácido nucleico recombinante que incluye dicho gen, unido operativamente a secuencias regulatorias, por ejemplo, secuencias promotoras, secuencias de terminador, y/o sitios de unión de ribosoma artificiales (RBSs), de conformidad con lo definido aquí. En otra modalidad, un vector recombinante de la presente invención incluye secuencias que incrementan la replicacion en bacterias (por ejemplo, secuencias que incrementan la replicacion) . En una modalidad, secuencias que incrementan la replicacion funcionan en E. coli. En otra modalidad, secuencias que incrementan la replicación son derivadas de pBR322. En otra modalidad, un vector recombinante de la presente invención incluye secuencias de resistencia a los antibióticos. El término "secuencias de resistencia a loa antibióticos" incluye secuencias que promueven o confieren resistencia a los antibióticos en el organismo huésped (por ejemplo Bacillus) . En una modalidad, las secuencias de resistencia a los antibióticos se seleccionan dentro del grupo que consiste . ¿scte secuencias cat (resistencia al cloranfenicol) , secuencias tet (resistencia a la tetracliclina) , secuencias erm (resistencia a la eritromicina) , secuencias neocursivas (resistencia a la neomicina) , secuencias kan (resistencia a la canamicina) y secuencias spec (resistencia a la espectinomicina) - Vectores recombinantes de la presente invención pueden incluir además secuencias de recombinación homologas (por ejemplo, secuencias diseñadas para permitir la recombinación del gen de interés en el cromosoma del organismo huésped) . Por ejemplo, secuencias bpr, vprr ó amyE pueden utilizarse como blancos de homología para recombinación en el cromosoma huésped. Se observara adicionalmente por parte de la persona experta en la materia que el diseño de un vector puede ser adecuado según factores tales como la elección de microorganismo a manipular genéticamente, ¦ el nivel de expresión del producto génico deseado, y similares. IV. Microorganismos reco binantes La presente invención se refiere además a microorganismos, es decir, microorganismos recombinantes, que incluyen vectores o genes (por ejemplo, genes de tipo silvestre y/o genes sometidos a mutaciones) de conformidad con lo descrito aquí. Como se emplea aquí, el término "microorganismo recombinante" incluye un microorganismo (por ejemplo, bacteria, célula de levadura, célula fungal, etc.) que han sido genéticamente .aÉÉY.erado, modificado o manipulado (manipulado genéticamente) . ^-n. de tal manera que presente un genotipo y/o fenotipo alterado, modificado o diferente (por ejemplo, cuando la modificación, genética afecta la codificación secuencias de ácido nucleico de microorganismos) en comparación con el microorganismo que ocurre naturalmente a partir del cuál se deriva. En una modalidad, un microorganismo recombinante de la presente invención es un organismo Graiu positivo (por ejemplo, un microorganismo que conserva un colorante básico, por ejemplo, violeta cristal, debido a la presencia de una pared Gram positiva que rodea el microorganismo. En una modalidad preferida, el microorganismo recombinante es un microorganismo que pertenece a un género seleccionado dentro del grupo que consiste de Bacillusr Corynebacteriumr Lactobacillusr Lactococci y Streptomyces. En una modalidad más preferida, el microorganismo recombinante es del género Bacillus. En otra modalidad preferida, el microorganismo recombinante se selecciona dentro del grupo que consiste de Bacillus subtilis, Bacillus lentimorbus, Bacillus lentus, Bacillus fir us, Bacillus pantothenticusr Bacillus amyloliquefacieriSf Bacillus cereus, Bacillus círculans, Bacillus coagulansr Bacillus lícheniformisr Bacillus megaterium, Bacillus pumilusr Bacillus thuringiensis, Bacillus haloduranSf y otras especies de Bacillus de grupo 1, por ejemplo, de conformidad con lo caracterizado por el tipo 16S ARNr. Esotra .modalidad preferida, el microorganismo recombinante .. es Bacillus brevis, o Bacillus stearothermophilus. En otra modalidad preferida, el microorganismo recombinante se selecciona dentro del grupo que consiste de Bacillus lícheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus subtilisr y Bacillus pumilus. En otra modalidad, el microorganismo recombinante es un organismo Gram negativo (incluye colorante básico) . En una modalidad preferida, el microorganismo recombinante es un microorganismo que pertenece a un género seleccionado dentro del grupo que consiste de Salmonella, Escherichia colir Klebsiella, Serratia, y Proteus. En una modalidad más preferida, el microorganismo recombinante es del género Escherichia. En una modalidad todavía más preferida, el microorganismo recombinante es Escherichia coli. En otra modalidad, el microorganismo recombinante es ' Saccharomyces (por ejemplo, S. cerevisiae) . Un microorganismo "recombinante" preferido de la presente invención es un microorganismo que tiene una enzima o vía de biosintesis de pantotenato desregulada, una enzima o vía biosintética de isoleucina-valina (ilv) desregulada y/o una enzima o vía biosintética de HMBPA modificada. El término "desregulado" o "desregulación" incluye la alteración o modificación de por lo menos un gen en un microorganismo que codifica una ' enzima en una vía biosintética, de . tal manera .que el nivel o actividad de la via biosintéF¾.:a en el., microorganismo se ha alterado o modificado. De preferencia, por lo menos un gen que codifica una enzima -en una via biosintética es alterado o modificado de tal manera que el producto génico sea realzado o incrementado. La expresión "via desregulada" puede incluir también una via biosintética en la cual más que un gen que codifica una enzima en una via biosintética es alterado o modificado de tal manera que el nivel o actividad de más que una enzima biosintética se ha alterado o modificado. La capacidad "desregular" una via (por ejemplo, desregular simultáneamente más que un gen en una via biosintética dada) en un microorganismo en algunos casos surge del fenómeno particular de microorganismos en los cuales más que una enzima (por ejemplo, dos o tres enzimas biosintéticas) están codificadas por genes que ocurren adyacentes entre ellos en una pieza contigua de material genético que se conoce como "operón" (definido aquí) . Debido a la regulación coordinada de genes incluidos en un operón, la alteración o modificación del elemento promotor y/o regulador simple puede resultar en una alteración o modificación de la expresión de cada producto génico codificado por el operón. La alteración o modificación del elemento regulador puede incluir, sin limitarse a estos ejemplos, la remoción del elemento (los elementos) promotor (es) " y/o regulador (es) endógeno (s), la adición de pxairstores . fuertes, promotores inducibles o promotores múltiples o la remoción de secuencias reguladoras de tal manera que la expresión de los productos génicos sea modificada, la modificación de la ubicación cromosómica del operón, la alteración de las secuencias de ácido nucleico adyacentes al operón o dentro del operón como por ejemplo un sito de enlace de ribosoma, el incremento de número de copias del operón, la modificación de proteínas (por ejemplo, proteínas reguladoras, supresores, realzadores, activadores de transcripción y similares) que participan en la transcripción del operón y/o la traducción de los productos génicos del operón, o bien cualquier otro medio convencional para desregular la expresión de genes rutinarios en la técnica (incluyendo, sin limitarse a este ejemplo, el uso de moléculas de ácido nucleico de antisentido, por ejemplo, para bloquear la expresión de proteínas represoras) . La desregulación puede también incluir la alteración de la región codificadora de uno o varios genes para proporcionar por ejemplo, una enzima que es resistente a retroalimentación o tiene una actividad especifica mayor o menor. En otra modalidad preferida, un microorganismo recombinante es diseñado o manipulado de tal manera que por lo menos una enzima biosintética de pantotenato, por lo menos una enzima biosintética de isoleucina-valina, y/o por lo menos una enzima biosintética de HMBPA es sobre-expresada. El término "sobre-expresada" o "sobre-expresión" iae uye .,1a. expresión del producto génico (por ejemplo, una enzima biosintética) en un nivel mayor que el nivel expresado antes de la manipulación de microorganismo o en un microorganismo comparable que no ha sido manipulado. En una modalidad, el microorganismo puede ser genéticamente diseñado o manipulado para expresar un nivel de producto génico mayor que el expresado en un microorganismo comparable que no ha sido manipulado . La. manipulación genética puede incluir, pero sin limitarse a estos ejemplos, la alteración o modificación de secuencias reguladoras o sitios asociados con la expresión de un gen en particular (por ejemplo, por adición de promotores fuertes, promotores inducibles o promotores múltiples o bien por remoción de secuencias reguladoras de tal manera que al expresión sea constitutiva) , la modificación de la ubicación i I cromosómica de un gen particular, la alteración de secuencias de ácido nucleico adyacentes a un gen particular como por ejemplo un sitio de enlace de ribosoma, el incremento del número de copias de un gen particular, la modificación de proteínas (por ejemplo, proteínas reguladoras, supresores, realzadores, activadores de transcripción y similares) que participan en la transcripción de un gen particular y/o la traducción de un producto génico particular, o bien cualquier otro medio convencional para desregular la expresión de un - gen · particular rutinario en la técnica (incluyendo-·. &.~? sin limitarse a este ejemplo, el uso de moléculas de- ácido nucleico de antisentido, por ejemplo, para bloquear la expresión de proteínas de represor) . La manipulación genética puede también la deleción de un gen, por ejemplo, para bloquear una vía o para remover un represor. En otra modalidad, el microorganismo puede ser física o ambientalmente manipulado para sobre-expresar un nivel de producto génico mayor que el nivel expresado antes de la manipulación de microorganismo o en un microorganismo comparable que no ha sido manipulado. Por ejemplo, un microorganismo puede ser tratado o cultivado en presencia de. un agente conocido o sospechado de incrementar la transcripción de un gen particular y/o la traducción de un producto génico particular de tal manera que se mejore o incremente la transcripción y/o la traducción.

Alternativamente, un microorganismo puede ser cultivado a una temperatura seleccionada para incrementar la transcripción de un gen particular y/o la traducción de un producto génico particular de tal manera que se mejore o incremente la transcripción y/o traducción. V". Cultivo y Fermentación de Microorganismos Recomblnantes El término "cultivo" incluye el mantenimiento y/o crecimiento de un microorganismo vivo de la presente invención (por e emplo, el mantenimiento y/o crecimiento de un cultivo o cepa) . En una modalidad, un^microorganismo de la presente invención es cultivado en medio liquido. En otra modalidad, un microorganismo de la presente invención es cultivado en medio sólido o medio seitii-sólido . En una modalidad preferida, un microorganismo de la invención es cultivado en medio (por ejemplo, un medio estéril, liquido) que comprende nutrientes esenciales o benéficos para el mantenimiento y/o el crecimiento del microorganismo (por ejemplo, fuentes de carbono o sustancia de carbono, por ejemplo carbohidrato, hidrocarburos, aceites, grasas, ácidos grasos, ácidos orgánicos, y alcoholes; fuentes de nitrógeno, por ejemplo, peptona, extractos de levadura", extractos de carne, extractos de malta, urea, sulfato de amonio, cloruro de amonio, nitrato de amonio y fosfato de amonio; fuentes de fósforo, por ejemplo, ácido fosfórico, sales de sodio y potasio del mismo; elementos a nivel de trazas por ejemplo, sales de magnesio, hierro, manganeso, calcio, cobre, zinc, boro, molibdeno, y/o cobalto; asi como factores de crecimiento tales como aminoácidos, vitaminas, promotores del crecimiento y similares) . De preferencia, microorganismos de la presente invención son cultivados bajo un pH controlado. El término ¾pH controlado" incluye cualquier pH que resulte en la producción del producto deseado (por ejemplo, pantoato y/o pantotenato) . En una modalidad, microorganismos son cultivados a un pH de aproximadamente 7. En otra modalidad, miraSG&rganisitios son cultivados a un pH comprendido entre 6.0 y 8.5. El pH deseado puede ser mantenido a través de cualquier número de métodos conocidos por parte de los expertos en la materia. Se prefiere también que los microorganismos de la presente invención sean cultivados bajo aereación controlada. El término "aereación controlada" incluye una aereación suficiente (por ejemplo, oxigeno) para resultar en la producción del producto deseado (por ejemplo, pantoato y/o pantotenato) . En una modalidad, la aereación es controlada por la regulación de los niveles de oxigeno en el cultivo, por ejemplo, mediante la regulación de la cantidad de oxigeno disuelto en el medio de cultivo. De preferencia, la aereación del cultivo es controlada por la agitación del cultivo. La agitación puede proporcionarse a través de un impulsor o equipo de agitación mecánica similar, mediante el hecho de voltear o agitar el recipiente de cultivo (por ejemplo, tubo o frasco) o bien a través de varios equipos de bombeo. La aereación puede ser controlada adicionalmente por el pasaje de aire estéril u oxígeno a través del medio (por ejemplo, a través de la mezcla de fermentación) . Asimismo, de preferencia, microorganismos de la presente invención son cultivados sin exceso de formación de espuma (por ejemplo, a través de adición de agentes anti-espuma) . Además, microorganismos de la presente invención pueden ser cultivados bajo telE^eraturas : ..controladas, El término "temperatura controlada" incluye cualquier temperatura que resulte en la producción del producto deseado (por ejemplo, pantoato y/o pantotenato) . En una modalidad, las temperaturas controladas incluyen temperaturas entre 15°C y 95°C. En otra modalidad, las temperaturas controladas incluyen temperaturas comprendidas entre 15°C y 70°C. Las temperaturas preferidas están comprendidas entre 20°C y 55°C, con mayor preferencia entre 30°C y 50°C. Microorganismos pueden ser culti ados (por ejemplo, mantenidos y/o desarrollados) en medio líquido y de preferencia son cultivados, ya sea de manera continua o intermitente, por métodos de cultivo convencionales tales como cultivo tradicional, cultivo en probeta, cultivo con agitación (por ejemplo, cultivo con agitación rotatoria, cultivo en frasco agitado, etc.), cultivo rotatorio con aereación, o fermentación. En un modalidad preferida, los microorganismos cultivados en frascos agitados. En una modalidad más preferida, los microorganismos son cultivados en un fermentador (por ejemplo, un proceso de fermentación) . Los procesos de fermentación de la presente invención incluye, sin limitarse a estos ejemplos, procesos de lote, lote alimentado y continuos o métodos de fermentación. La expresión "proceso de lote" o "fermentación de lote" se refieren a un sistema en donde la composición del medio, nutrientes aditivos suplementarios -y. similares se establece al principio de la fermentación y no presenta alteración durante la fermentación, sin embargo, intentos pueden efectuarse para controlar factores tales como pH y concentración de oxigeno para evitar una acidificación excesiva del medio y/o la muerte de los microorganismos. La expresión fragmentación en ^proceso de lote alimentado" o "lote alimentado" se refiere a una fermentación en lote a excepción que uno o varios sustratos o suplementos se agregan (por ejemplo, se agregan en incrementos o bien de manera continua) conforme avanza la fermentación. La expresión "proceso continuo" o "fermentación continua" se refiere a un sistema en el cual un medio de fermentación definido es agregado continuamente a un fermentador y una cantidad igual de medio utilizado o "acondicionado" es removida simultáneamente, de preferencia para recuperar el producto deseado (por ejemplo, pantoato y/o pantotenato) . Varios procesos de se tipo han sido desarrollados y son bien conocidos en la técnica. La expresión "cultivo bajo condiciones tales que un compuesto deseado sea producido" incluye el mantenimiento y/o crecimiento de microorganismos en condiciones (por ejemplo, temperatura, presión, pH, duración, -etc.) apropiados suficientes para obtener la producción del compuesto deseado o para obtener rendimientos deseados del' compuesto particular ¦ cjEte. se está produciendo. Por ejemplo, el cultivo es continuo durante un tiempo suficiente para producir la cantidad deseada de un compuesto (por ejemplo, pantoato y/o pantotenato) . De preferencia, el cultivo es continuo durante un tiempo suficiente para alcanzar sustancialmente una producción adecuado del compuesto (por ejemplo, un tiempo suficiente para alcanzar una concentración adecuada de pantoato y/o pantotenato o bien una proporción adecuada de pantoato y/o pantotenato: HMBPA) . En una modalidad, el cultivo prosigue durante aproximadamente 12 a 24 horas. FJ¾ otra modalidad, cultivo prosigue durante aproximadamente 24 a 36 horas, 36 a 48 horas, 48 a 72 horas, 72 a 96 horas, 96 a 120 horas, 120 a 144 horas, o más de 144 horas. En otra modalidad, se cultivan microorganismos en condiciones tales que por lo menos aproximadamente 5 a 10 g/L de compuesto se producen en aproximadamente 36 horas, por lo menos aproximadamente 10 a 20 g/L de compuesto se producen en aproximadamente 48 horas, y por menos aproximadamente 20 a 30 g/L de compuesto se producen en aproximadamente 72 horas. En otra modalidad, microorganismos son cultivados bajo condiciones tales que por lo menos aproximadamente 5 a 20 g/L de compuesto se producen en aproximadamente 36 horas, por lo menos aproximadamente 20 a 30 g/L de compuesto se producen en aproximadamente 48 horas, o bien por lo menos aproximadamente 30 a 50 g/L de compuesto se producen en aproximadamente 72 horas. En otra masdalidad, microorganismos son cultivados bajo condiciones tales que se logra una proporción HMPBA:HMBPA+pantotenato de 0.1:100 o menos (es decir, 0.1% de HMBPA versus 99.9% de pantotenato, por ejemplo, de conformidad con lo determinado por comparáción de las áreas de picos cuando una muestra de producto es analizado por HPLC) , de preferencia, tal 'que se alcance una proporción de 0.2:100 o menos (0.2% de HMBPA versus 99.8% de pantotenato), con mayor preferencia tal que se logra una proporción de 0.5:100 o menos (0.5% de H BPA versus 99.5% de pantotenato) . En otra modalidad, microorganismos son cultivados bajo condiciones tales que se logra una proporción HMPBA:HMBPA+pantotenado de 1:100 o menos (es decir, 1% de HMBPA versus 99% de pantotenato, por ejemplo, de conformidad con lo determinado por comparación de las áreas picos cuando una muestra de producto es analizada por HPLC) , de preferencia tal que una proporción de 2:100 o menos se logre (2% de HMBPA versus 98% de pantotenato) , con mayor preferencia de tal manera que se logre una proporción de 3:100 o menos (3% de HMBPA versus 97% de pantotenato), con mayor preferencia por lo menos 4:100 o menos (4% de HMBPA versus 96% de pantotenato), 5:100 o menos (5% de HMBPA versus 95% de pantotenato), 6:100 o menos (6% de HMBPA versus 94% de pantotenato, 7:100 o menos (7% de HMBPA versus 93% de pantotenato), 8:100 o menos (8% de HMBPA versus 92% de pantotenato), 9:100 o menos (9% de HMBPA versus . ¾ · de . pantotenato), o bien 10:100 o menos (10% de HMBPA versus 90% de pantotenato) . La metodología de la presente invención puede incluir además un paso de recuperar un compuesto deseado (por ejemplo, pantoato y/o pantotenato) . El término "recuperar" un compuesto deseado incluye la extracción, cosecha, asilamiento o purificación del compuesto a partir del medio de cultivo. La recuperación del compuesto puede efectuarse de conformidad con cualquier metodología convencional de aislamiento o purificación conocida en la técnica incluyendo, sin limitarse a estos ejemplos, tratamiento con una resina convencional (por ejemplo, una resina de intercambio de aniones o cationes, resina de adsorción no iónica, etc.)/ tratamiento con un adsorbente convencional (por ejemplo, carbón activado, ácido silícico, gel de sílice, celulosa, alúmina, etc.), alteración de H, extracción con solvente (por ejemplo, con un solvente convencional como por ejemplo alcohol, acetato de etilo, hexano y similares) , diálisis, . filtración, concentración, cristalización, recristalización, , ajuste de pH, liofilización y similares. Por ejemplo, un compuesto puede ser recuperado de un medio de cultivo removiendo primero los microorganismos del cultivo. Los medios son después pasados a través de una resina de intercambio de cationes o bien sobre una resina de intercambio de cationes y despuéé^a través -de una resina de intercambio de aniones o sobre una resina de intercambio de aniones para remover aniones inorgánicos y ácidos orgánicos que tienen acideces más fuertes que el compuesto de interés. El compuesto resultante puede ser subsecuentemente convertido en una sal (por ejemplo, una sal de calcio) de conformidad con lo descrito aquí . De preferencia, un compuesto deseado de la presente invención es "extraído", "aislado", o "purificado" de tal manera que la preparación resultante esté sustancialmente libre de otros componentes de medio (por ejemplo, libre de componentes de medio y/o subproductos de fermentación) . La expresión "sustancialmente libre de otros componentes de medio" incluye preparaciones del compuesto deseado en donde el compuesto es separado de los componentes de medio o subproductos de fermentación del cultivo a partir del cual se produce. En una modalidad, la preparación tiene más que aproximadamente 80% (en peso seco) del compuesto deseado (por ejemplo, menos que aproximadamente 20% de otros componentes de medio o subproductos de fermentación) , con mayor preferencia más que aproximadamente 90% del compuesto deseado (por ejemplo, menos que aproximadamente 10% de otros componentes de medio o subproductos de fermentación) , con preferencia aún mayor más que aproximadamente 95% del compuesto deseado (por ejemplo, menos que aproximadamente 5% de otros componentes de medio o subproductos de fermentación) , y con preferencia especial más que aproximadamente 98-99% de compuesto desasado (por ej.emplo, menos que aproximadamente 1.2% de otros componentes de medio o subproductos de fermentación) . Cuando el compuesto deseado ha sido derivado en una sal, el compuesto es de preferencia además libre de contaminantes químicos asociados con la formación de la sal. Cuando el compuesto deseado ha sido derivado en un alcohol, el compuesto es de preferencia adicionalmente libre de contaminantes químicos asociados con la formación del alcohol. En una modalidad alternativa, el compuesto deseado no es purificado a partir del microorganismo, por ejemplo, cuando el microorganismo es biológicamente no peligroso (por ejemplo, seguro) . Por ejemplo, el cultivo entero (o bien sobrenadante de cultivo) puede ser utilizado como una fuente de producto (por ejemplo, producto crudo) . En una modalidad, el cultivo (o bien sobrenadante de cultivo) es utilizado sin modificación. En otra modalidad, el cultivo (o bien sobrenadante de cultivo) es concentrado. En otra modalidad el cultivo (o bien sobrenadante de cultivo) es secado o liofilizado. De preferencia, un método de producción de la presente invención resulta en la producción del compuesto deseado en un rendimiento significativamente alto. La expresión "rendimiento significativamente alto" incluye un nivel de producción o rendimiento que es suficientemente elevsste" o arriba de lo que es usual para métodos de producción comparables, por ejemplo, que es elevado a un nivel suficiente para producción comercial del producto deseado (por ejemplo, la producción del producto a un costo comercialmente factible) . En una modalidad, la invención presenta un método de producción que incluye el cultivo de un microorganismo recombinante bajo condiciones tales que el producto deseado (por ejemplo, pantoato y/o pantotenato) es producido a un nivel mayor que 2 g/L. En otra modalidad, la invención presenta un método de producción que incluye el cultivo de un microorganismo recombinante bajo condiciones tales que el producto deseado (por ejemplo, pantoato y/o pantotenato) es producido a un nivel mayor que 10 g/L. En otra modalidad, la invención presenta un método de producción que incluye 'el cultivo de un microorganismo recombinante bajo condiciones tales que el producto deseado (por ejemplo, pantoato y/o pantotenato) es producido a un nivel mayor que 20 g/L. En una modalidad, la invención presenta un método de producción que incluye el cultivo de un microorganismo recombinante bajo condiciones tales que el producto deseado (por ejemplo, pantoato y/o pantotenato) es producido a un nivel mayor que 30 g/L. En otra modalidad, la invención presenta un método de producción que incluye el cultivo de un microorganismo recombinante bajo condiciones tales que el producto deseado (por ejemplo-, pantoato y/o pantotenato) es producido a un nivel mayor que 40, g/L. En otra modalidad, la invención presenta un método de producción que incluye el cultivo de un microorganismo recombinante bajo condiciones tales que el producto deseado (por ejemplo, pantoato y/o pantotenato) es producido a un nivel mayor que 50 g/L. En otra modalidad, la invención presenta un método de producción que incluye el cultivo de un microorganismo recombinante bajo condiciones tales que el producto deseado (por ejemplo, pantoato y/o pantotenato) es producido a un nivel mayor que 60 g/L. La invención incluye además un método de producción para producir el compuesto deseado que incluye el cultivo *de un microorganismo recombínate bajo condiciones tales que se produce un nivel suficientemente elevado de compuesto . dentro de un periodo comercialmente deseable de tiempo- Según la enzima biosintética o la combinación de enzimas biosintéticas manipuladas, puede ser deseable o necesario proporcionar (por ejemplo, alimentar) a microorganismos de la presente invención por lo menos un precursor biosintético de tal manera que el compuesto deseado o los compuestos deseados sean producidos. El término "precursor biosintético" o "precursor" incluye un agente o compuesto que, cuando se proporciona al medio de cultivo de un microorganismo, cuando se pone en contacto con el medio de cultivo de un microorganismo, o bien cuando está incluido en el medio de cultivo de un microorganismo, sirve- para incrementar o realzar la biosintesis del producto deseado. En una modalidad, el precursor biosintético o precursor es aspartato. En otra modalidad, el precursor biosintético o precursor es ß-alanina. La cantidad de aspartato o ß-alanina que se agrega es de preferencia una cantidad que resulta en una concentración en el medio de cultivo suficiente para incrementar la productividad del microorganismo (por ejemplo, un concentración suficiente para realzar la producción de pantoato y/o pantotenato) . Precursores biosintéticos de la presente invención pueden ser agregado en forma de una solución concentrada o suspensión (por ejemplo, en un solvente adecuado como por ejemplo agua o amortiguador) o bien en forma de un sólido (por ejemplo, en forma de un polvo) . Además, precursores biosintéticos de la presente invención pueden ser agregados en forma de una alícuota única, o bien de manera continua o intermitente durante un período dado de tiempo. El término "exceso de -alanina" incluye niveles de ß-alanina incrementados o mayores que los habitualmente utilizados para el cultivo del microorganismo en cuestión. Por ejemplo, el cultivo de los microorganismos Bacillus descritos en los Ejemplos de la presente invención se efectúan de manera rutinaria en presencia de aproximadamente 0-0.01 g/L de ß-alanina. Por consiguiente, niveles en exceso de '-^a^lani a pueden incluir niveles de aproximadamente 0.01-1, de preferencia aproximadamente 1-20 g/L. En · otra modalidad, el precursor biosintético es valina. En otra modalidad, el precursor biosinfcético es -quetoisovalerato . De preferencia, valina o cx-quetoisovalerato se agrega en una cantidad que resulta en una concentración en el medio suficiente para producción del producto deseado (por ejemplo, pantoato y/o pantotenato) El término "exceso d© -KIV" incluye niveles de cx-KIV incrementados o mayores que los niveles rutinariamente utilizados para --- cultivar el microorganismo en cuestión. Por ejemplo, el cultivo de microorganismos Bacillus descritos en los Ejemplos de la presente invención se efectúa de manera rutinaria en presencia de aproximadamente 0-0.1 g/L de a-KIV. Por consiguiente, niveles de cx-KIV en exceso pueden incluir niveles de aproximadamente 0.01-1, de preferencia de aproximadamente 1-20 g/L de -KIV. El término "exceso de valina" incluye niveles de valina incrementados o mayores que los rutinariamente utilizados para cultivar el microorganismo en cuestión. Por ejemplo, el cultivo de los microorganismos Baclllus descritos en los Ejemplos de la presente invención se efectúan de manera rutinaria en presencia de aproximadamente 0-0.5 g/L de valina. Por consiguiente, niveles de valina en exceso pueden incluir niveles de aproximadamente 0.5-5 g/L,. de preferencia de aproximadamente 5-20 g/L de valieai. Precursores biosintéticos se conocen también aquí como "sustratos biosintéticos suplementarios". Otro aspecto de la . presente invención incluye procesos de biotransformación que presentan los microorganismos recombinantes descritos aquí. El término "proceso de biotransfcrmación", se conoce también aqui como "procesos de bioconversión", incluye procesos biológicos que resultan en la producción (por ejemplo, transformación o conversión) de sustratos apropiados y/o compuestos intermedios apropiados en un producto deseado (por ejemplo, pantoato y/o pantotenato) . El (los) microorganismo (s) y/o enzimas que se utilizan en las reacciones de biotransformación están en una forma que permite que ellos desempeñen su función contemplada (por ejemplo, producción de un compuesto deseado) .. Los microorganismos pueden ser células enteras, o bien pueden ser solamente las partes de las células que se requieren para obtener el resultado final deseado. Los microorganismos pueden estar suspendidos (por ejemplo, en una solución apropiada como por ejemplo soluciones amortiguadas o medios amortiguados), enjuagados (por ejemplo, enjuagados sin medio del cultivo de microorganismo), secados en acetona, inmovilizados (por ejemplo, con gel de poliacrilamida o k-carragenano o bien en soportes sintéticos, por ejemplo, perlas, matrices y similares), fijados, reticulados o permeabilizados (por ejemplo, tener membranas permeabilizadas y/o paredes permeabilizadas de tal manera que compuestos-,.jpyr ejemplo, sustratos, productos intermedios o productos puedan atravesar fácilmente dicha membrana o pared) . . . VJ. Procesos para la Producción de Composiciones Selectivamente Mezcladas de Pantotenato y HMBPA La presente invención presenta además procesos y microorganismos para la producción de composiciones selectivamente mezcladas de pantotenato y HMBPA. Como se define aquí, la expresión "composición selectivamente mezclada"' incluye una composición producida de una manera tal que la proporción entre pantotenato y HMBPA es una caracteristica controlada, es decir, se selecciona la proporción entre pantotenato y HMBPA. La selección puede ocurrir mediante manipulación del microorganismo que produce la composición (es decir, la cepa de producción) de tal manera que se favorezca la producción de un componente sobre el otro . En un aspecto, la invención presenta un proceso para la producción de una composición selectivamente mezclada de pantotenato: HMBPA que incluye el cultivo del microorganismo que tiene una vía biosintética de pantotenato desregulada bajo condiciones tales que se produzca una composición selectivamente mezclada de pantotenato :HMBPA. En una modalidad, el microorganismo es cultivado bajo condiciones que favorecen la producción de pantotenato. En otra modalidad, · -e¾ microorganismo es cultivado bajo condiciones que favorecen la producción de HMBPA. En otra modalidad, el microorganismo es cultivado bajo condiciones de glucosa de estado de equilibrio controlado que favorecen la producción de pantotenato . En otra modalidad, el microorganismo es cultivado bajo condiciones de glucosa de estado de equilibrio controlado que favorece la producción de HMBPA. En otra modalidad, el microorganismo es cultivado bajo condiciones de oxigeno disuelto de estado de equilibrio controlado que favorecen la producción de pantotenato. En otra modalidad, el microorganismo es cultivado bajo condiciones de oxigeno disuelto de estado de equilibrio controlado que favorecen la producción de HMBPA. En otra modalidad, el microorganismo es cultivado bajo condiciones de niveles controlados de serina que favorecen la producción de pantotenato. En una modalidad, la composición comprende pantotenato y HMBPA en una proporción de 75 moles de pantotenato por 25 moles de HMBPA o más . En otra modalidad, la composición comprende pantotenato y HMBPA en una proporción de 90 moles de pantotenato a 100 moles de HMBPA o más. En otra modalidad, la composición 5 comprende pantotenato y HMBPA en una proporción de 75 moles de HMBPA por 25 moles de pantotenato o más. En otra modalidad, la composición comprende pantotenato y HMBPA en una proporción de 90 moles de HMBPA por 10 moles de pantotenato o más. Valores y rangos incluidos y/o intermedios .10...de los valores presentados aquí están también..Ktentro. del,. alcance de la presente invención. _ : Esta invención se ilustra adicionalmente a través de los ejemplos siguientes que no deben considerarse como limitativos. Los contenidos de todas las referencias, 15 patentes y solicitudes de patente publicadas en esta, solicitud se incorporan aqui por referencia. EJEMPLOS Ejemplo I: Descubrimiento y caracterización de la vía biosintética de ácido [R] -3- (2- idroxi-3-metil-butirilamino) - 20 propiónico (HMBPA) En el desarrollo de cepas de Bacillus para la producción de pantotenato, se efectúan varias manipulaciones genéticas a genes y enzimas involucrados en la via biosintética de pantotenato y la via de isoleucina-valina (ilv) (Figura 1) de conformidad con lo descrito en la patente norteamericana No. de serie 09/400,494 y en la solicitud . de patente norteamericana No. de serie 09/667,569. Por ejemplo, cepas que tienen un operón de panBCD desregulado y/o que tienen un panEl desregulado presentan una producción incrementada de pantotenato (cuando se cultiva en presencia de ß-alanina y a- quetoisovalerato (cx-KIV) ) . Cepas desreguladas adicionalmente para ilvBNC e ilvD presentan una producción incrementada de pantotenato en presencia de solamente ß-alanina. Además, es posible lograr una independencia de ß-alanina mediante una · desregulación, .adicional de panD. Una cepa ejemplar es PA824, un protótrofo de triptófano, resistente a Spec y Tet, desregulada para panBCD en el locus de panBCD, desregulada para panEl en el locus de panEl (dos genes en el genoma de B. subtilis son homólogos a panE, panEl y panE2, de E. coli, el primero codifica la quetopantoato reductasa mayor involucrada en la producción de pantotenato mientras que panE2 no contribuye a la síntesis de pantotenato (Solicitud de patente norteamericana No. de serie 09/400,494), desregulada para ilvD en el locus de IlvD, que sobreexpresa un cassett de ilvBNC en el locus de amyE, y que sobreexpresa panD en el locus bpr. Bajo las condiciones de fermentación siguientes, PA824 proporciona rutinariamente aproximadamente 20-30 g/L de pantotenato. La producción de pantotenato por PA824 en este ejemplo se logra en recipientes de termentador de 14 L. La composición del lote y la composición del medio de alimentación se presentan a continuación. Lote Material g/L (final) 1 Extracto de levadura 10 2 Glutamato de Na 5 3 (NH4)2S04 8 4 KH2PO4 5 Agregado después de esterilización y enfriamiento . ... 1 Glucosa 2.5 2 CaCl2 0.1 3 MgCl2 1 4 Citrato de Sodio 1 5 FeS04»7 H0 0.01 5 SM-1000X ' 1 mL El volumen final del medio del lote es 6 L. La solución de elemento a nivel de trazas SM-1000X tiene la composición siguiente: 0.15 g H20, 2.5 g de H3BO3, 0.7 g de CoCl2«6 H20, 0.25 g de CuS04«5 H20, 1.6 g de MnCl2«4 H20, 0.3 g de ZnS04»7 H20 se disuelven en agua (volumen final 1 L) . El medio del lote fue inoculado con 60 mi de cultivo de PA824 en frasco agitado (CD = 10 en medio SVY: caldo de infusión de becerro de Difco 25 g, extracto de Levadura Difco 5 g, Glutamato de sodio 5 g, (NH4)2S04 2.7 g en 740 mi de H20, autoclave; agregue 200 mi de K2HPO4 1 M (pH 7) estéril y 60 mi de solución de glucosa al 50% estéril (volumen final 1 L) ) . La fermentación fue efectuada a una temperatura de 43°C con un régimen de flujo de aire de 12 L/minuto como un lote 5 alimentado limitado en glucosa. La glucosa en lote inicial (2.5 g/L) fue consumida durante el crecimiento exponencial. Posteriormente las concentraciones de glucosa fueron mantenidas entre 0.2-1 g/L por alimentación continua de solución de ALIMENTACIÓN de la siguiente manera, -?? . ALIMENTACIÓN . -i. Material g/L (final) " - - 1 Glucosa 550 2 CaCl2 0.1 3 SM-1000X 3 mL 15 La bomba de régimen de alimentación variable fue controlada por computadora y relacionada a la concentración de glucosa en el tanque mediante un algoritmo. En este ejemplo, la alimentación total fue de 6 L. Durante la fermentación, el pH fue ajustado a 7.2. El control 20 fue logrado por mediciones de pH acopladas a un control por computadora. El valor de pH fue mantenido mediante la alimentación ya sea de una solución de NH3 al 25% o bien de una solución de H3PO4 al 20%. NH3 actúa simultáneamente como una fuente de N para la fermentación. La concentración de 25 oxigeno disuelto [p02] fue ajustada' a 30% mediante la regulación del régimen de agitación y aereación. La formación de espuma fue controlada mediante la adición de aceite de silicona. Después de la suspensión de la adición de la solución de alimentación, en este ejemplo después de 48 horas, la fermentación prosiguió hasta que el valor [p02_ alcanzara 95%. Después se detuvo la fermentación matando el microorganismo a través de esterilización durante 30 minutos. La esterilización exitosa fue comprobada mediante la colocación en placa de una muestra del caldo de fermentación en placas de agar. El titulo de .pjaantotenato. en el caldo de fermentación fue de 21.7 g/L después de esterilización y remoción de las células por centrifugación (de conformidad con lo determinado por análisis HPLC) . Para análisis HPLC, la muestra de caldo de fermentación fue diluida con agua estéril (1:40). Se inyectaron 5 µ? de. esta dilución en una columna de HPLC (Aqua C18, 5 um, 150 x £.0 mu, PhenomenexTM) . La temperatura de la columna fue mantenida a 40°C. La fase móvil A fue 14.8 mM H3P03, fase móvil B 100% acetonitrilo. El régimen de flujo fue constante a 0.5 mL/minuto. Se aplicó un gradiente: Inicio: 2% fase móvil B 0-3 minutos incremento lineal a 3% de fase móvil B 3-3.5 minutos incremento lineal a 20% de fase móvil B La detección fue efectuada a través de un detector de UV (210 nm) . El tiempo de experimento fue de 7 minutos con un tiempo posterior de 3 minutos adicionales. El tiempo de retención para el acid pantoténico es de 3.9 minutos. El cromatograma de HPLC para la muestra mencionada arriba se proporciona en la Figura 4. Identificación de un compuesto relacionado con el pico con tiempo de retención de 4.7 minutos Además de producir cantidades significativas de pantotenato, se descubrió un segundo compuesto eluido con un tiempo de retención aproximadamente de 4.7 minutos en este sistema. El segundo producto prominente formado en la . fermesrLacióru fue ácido 3- (2-hidroxi-3-metil-butirilamino) -propiónic.o (HMBPA) (conocido también aqui como "2- (R) -hidroxiisovalerato de ß-alanina", "2-hidroxiisovalerato de ß-alanina", ™ -alanil-oí-hidroxiisovalerato" y/o "fancotenato") . Se identificó a través de su espectro de masa (Figura 5; masa monoisotópica relativa: 189) y por XH- - y ±JC-NMR después de purificación cromatográfica por cromatografía instantánea en fase reversa (fase móvil: 10 mM KH2PO4, con contenidos crecientes de acetonitrilo (1-50%)) (datos no ilustrados). El compuesto fue considerado como teniendo la configuración R en el átomo de carbono asimétrico por analogía con [R] -pantotenato . Con el objeto de verificar la identidad del compuesto. Se llevó a cabo una síntesis deliberada de 2-hidroxiisovalerato de ß-alanina racémico de la siguiente manera. Se disolvieron ß-alanina (2.73 g/ 30 mmol) y metóxido de sodio (5.67 g de una solución al 30% en metanol/31.5 inmoles) en metanol (40 mL) . 2-hidroxiisovalerato de metilo (éster metílico de ácido 2-hidroxi~3-metilbutírico) (3.96 g / 30 inmoles) se agregó y se sometió a reflujo durante 18 horas. Se removió después el metanol por rotavap y el metanol fue reemplazado por terc-butanol (50 mL) . Se agregó terc-butóxido de potasio (50 mg) y se sometió a reflujo durante 26 horas. El solvente fue removido en vacío, el residuo disuelto en agua (50 mL) y pasado a través de una resina de intercambio de iones fuertemente acida (forma HierLewatite™.. S 100 Gl; 100 mL) . Se utilizó más agua para enjuagar el intercambiador de iones. Los eluatos acuosos son combinados y el agua es removida en vacío. El residuo es sometido a cromatografía instantánea (gel de sílice; ácido acético al 2% en acetato de etilo como eluyente) y las fracciones de producto son evaporadas para proporcionar un residuo sólido. El residuo fue recristalizado a partir de acetato de etilo/tolueno (10 mL/20 mL, respectivamente) y se obtuvo HMBPA (2-hidroxiisovalerato de -alanina) analíticamente puro, que mostró una masa isotópica relativa de 190 (189 + H+) en el espectrómetro de masa y las mismas resonancias """H- MR que el producto obtenido a partir de la fermentación. La vía biosintética resultante en la producción de HMBPA se presenta en la Figura 2. La estructura química de ácido [R] - 3- (2-hidroxi-3-metil-butirilamino) -propiónico (HMBPA) se muestra en la Figura 3. Como se muestra en la Figura 2, HMBPA es el producto de condensación de ácido [R] -ot-hidroxiisovalerico (a-HIV) y ß-alanina, catalizado por la enzima PanC. -HIV es generado por reducción de; -KIV, una reacción catalizada por las -queto reductasas PanE (por ejemplo, PanEl y/o PanE2) y/o IlvC. Con base en la estructura química y en la vía biosintética que lleva a la producción de HMBPA, los presentes inventores han formulado el modelo siguiente ' para describir la interacción entre las vías prevxsnsente conocidas de pantotenato e isoleucina-valina (ilv) y.' la vía biosintética de HMBPA recientemente caracterizada. Por lo menos en un aspecto, el modelo establece que existen por lo menos dos vías en microorganismos que compiten por cx-KIV, el sustrato para la enzima biosintética PanB, específicamente, la vía biosintética de pantotenato y la vía biosintética de HMBPA. (Una tercera vía y una cuarta vía que compiten para a -KIV son las vías que resultan de la producción de valina o leucina a partir de OÍ-KIV, véase, por ejemplo, Figura 1) . Por lo mencs la vía biosintética de pantotenato y la vía biosintética de HMBPA producen adicionalmente sustratos competitivos para la enzima PanC, específicamente OÍ -HIV y pantoato. La producción de HMBPA tiene efectos significativos sobre la producción de pantotenato. De manera más importante, la vía de HMBPA compite con la vía de pantotenato para precursoresa ( -KIV y ß-alanina) y para algunas de las enzimas (PanC, PanD, PanEl, y/o IlvC) . Además, puesto que la estructura de HMBPA es similar ' a la estructura de pantotenato, puede tener la propiedad indeseable de regular negativamente uno o varios pasos en la vía de pantotenato. El modelo predice que la producción de pantotenato puede ser mejorada u optimizada a través de cualquier medio que favorezca el uso de sustratos ( -KIV y ß-alanina) y/o enzimas (PanC, PanD, PanEl y/o IlvC) en los procesos biosintéticos de pantotenato en comparación con procesos biosintéticos de .HMBPA. Un enfoque preferido para optimizar la producción de pantoato y/o pantotenato mientras se minimiza la producción de HMBPA es incrementar la actividad de PanB en las células puesto que esto disminuirá la disponibilidad dea -KIV para la síntesis de a-HIV mientras que promueve la síntesis de quetopantoato y pantoato. Métodos para incrementar la actividad incluyen la sobreexpresión del gen panB, el incremento del número de copias del gen, el incremento de la actividad específica de la enzima y/o la liberación de la inhibición de la enzima por mutación o disminución de los niveles de coenzima A. Niveles de pantoato más elevados a su vez incrementan la síntesis de pantotenato y disminuyen la síntesis de HMBPA porque supera a a-HIV en su competencia por PanC. Otro enfoque para optimizar la síntesis de pantotenato es optimizar el nivel de panEl . Se demuestra dé aquí que el incremento de la producción de PanEl incrementa la síntesis de HMBPA a costas de pantotenato. Por consiguiente, la realización de una disminución moderada del nivel de expresión de panEl en PA824 o PA668 (es decir, una regulación precisa del nivel de expresión de panEl) resultará en una disminución de la síntesis de HMBPA y un incremento de la síntesis de pantotenato. Además, como se muestra en el Ejemplo II, una deleción de panE2 disminuye significativamente la síntesis de HMBPA. Otros enfoques para incrementar la síntesis de pantoato y/o pantotenato versus la síntesis de HMBPA incluyen la optimización de los niveles de producción -KIV en las células y/o en el aislamiento de una proteína de PanC modificada con preferencia incrementada por pantoato como sustrato . Los siguientes ejemplos proporcionan soporte experimental para el modelo descrito aquí y ejemplifican adicionalmente procesos para incrementar la producción de pantoato y/o pantotenato (con relación a los niveles de HMBPA) con base en el modelo. EJEMPLOS II-VIII: Para los Ejemplos II-VI, la cuantificación de pantotenato y/o HMBPA fue efectuada de la siguiente manera. Alícuotas de medio de- fermentación fueron diluidas 1:100 y alícuotas de cultivos en' probetas fueron diluidas 1:10 en agua o acetonitrilo al 5% antes de su inyección a una columna de HPLC Phenomenex Aqua™ 5 µ C18 HPLC (250 x 4.6 mm, 125 A) . Las fases móviles fueron A — acetonitrilo al 5%, 50 mM amortiguador de fosfato monosódico ajustado a pH 2.5 con ácido fosfórico; y B = 95% acetonitrilo, 5% H20. Los gradientes lineales fueron los siguientes. Minutos Solvente A Solvente B 0 100% 0% 16 " 100% 0% 1?, 0% 100% 20 0% 100% 21 " 100% 0% Parámetros adicionales y aparato fueron los siguientes: régimen de flujo- = 1.0 ml/minuto; volumen de inyección = 20 µ?; Detector = Hewlett Packard 1090 serie DAD detector UV 3014, Señal A = 197 nm, ref. = 450 nm, revisión de Firmware E; calentador de columna = temperatura de horno 40°C; Hardware = Hewlett Packard Kayak™ XA; y Software = Hewlett Packard Chemstation Plus™ revisión A.06.03 [509] . HMBPA se eluye a aproximadamente 13 minutos en este sistema. Ejemplo II: Disminución de la síntesis de HMBPA mediante la deleción de PanE2 de las cepas de producción de Pantotenato De conformidad con lo descrito en el Ejemplo I,· la producción de HMBPA fue observada primero en microorganismos que sobreexpresan panEl lo que indica que la quetopantoato reductasa puede catalizar no solamente la reducción de quetopantoato a pantoato sino también la reducción de -quetoisovalerato a 2-hidroxiisovalerato. Como se mencionó previamente, dos genes en el genoma de B. subtilis son homólogos al gen panE de E. coli que codifica quetopantoato reductasa y han sido nombrados panEl y panE2. En Bacillus, se ha demostrado que el gen panEl codifica la quetopantoato reductasa mayor involucrada en la producción de pantotenato, mientras que panE2 no contribuye a la síntesis de pantotenato. Además, la. sobreexpresión de panE2 a partir de un cassett P26panE2 en pA 238 (SEQ ID NO: 25) lleva a una reducción del título de pantotenato (por ejemplo, Solicitud de patente norteamericana No. de serie 09/400,494) . Dada la homología entre los productos de gen panE2 y panEl y el hecho que la sobreexpresión de panE2 desplazó la producción lejos de pantoato/pantotenato, se probó si panE2 presentaba una contribución de manera significativa a la producción de HMBPA. Se planteó de manera hipotética que el producto de gen panE2 es una enzima capaz de reducir OÍ-KIV a a-HIV, pero que no puede reducir significativamente quetopantoato a pantoato. Para probar la hipótesis, panE2 fue sometida a deleción a partir de la cepa de producción de pantotenato PA824 (descrita en el Ejemplo I) por transformación con un cassett úpanE2::cat a partir de ADN cromosómico de la cepa PA248 {úpanE2 : : cat) (de conformidad con' lo presentado en SEQ ID NO: ! 24, para construcción, véase Solicitud de patente norteamericana No. de serie 09/400,494) para proporcionar la cepa PA919. Tres aislados de PA91 fueron comparados con PA824 para la producción de pantotenato y HMBPA en cultivos en probetas cultivados en SVY más ß-alanina. Tabla 1. Producción de pantotenato y HMBPA por derivados de ??824 y PA880 cultivados a una temperatura de 43°C en cultivos en tubos de ensayo durante 48 horas de SVY glucosa + ß-alanina 5 Cepa rasgo nuevo origen PA824 - PA880 AcoaX PA824 PA894 AcoaX, coaA (S151L) , cat PA880 PA911-5 PzepanB@vpr, ¿S.coaX PA880 PA911-8 PZ6panB@panB, AcoaX PA919-1 ApanE2: zcat PA824 PA919-2 w PA919-3 w Tabla 1. (Continuación) Cepa OD6oo [pan] g/1 [HMBPA] g/1 PA82 13.9 4.3 0.64 PA880 16.4 5.1 0.48 PA89 14.9 4.9 0.47 PA911-5 13.4 5.3 0.40 PA911-8 13.8 6.1 0.45 PA919-1 13.2 4.2 0.15 PA919-2 14.8 3.8 0.13 PA919-3 18.0 5.5 0.14 De conformidad con lo indicado por los datos presentados en la Tabla 1, los tres aislados de PA919 produjeron aproximadamente cuatro veces menos HMBPA que PA824, lo que demuestra que el producto de gen panE2 contribuyó a la producción de HMBPA y demuestra que la producción de HMBPA puede ser por lo menos fácilmente eliminada mediante la simple - deleción de panE2, sin sacrificar la producción dee! pantotenato . Ejemplo III. Producción de HMBPA y producción de Pantotenato son inversamente correlacionadas Cepas derivadas de PA36 (el linaje de RL-1 equivalente de PA377, descrito er. la Solicitud de patente norteamericana No. de serie 09/667,569)' que presentan una deleción del cassett P26panBCD y que contienen un cassett P26panC*D amplificado en el locus vpr en cualquiera del cassett P26panB de tipo silvestre (PA666) o _cassett P26ñpanB (PA664) amplificado en el locus bpr fueron construidas de la siguiente manera. Un alineamiento de los aminoácidos C-terminales de proteínas PanB conocidas o sospechadas se muestra en la Figura 6. Tres regiones conocidas como 1, 2 y 3 fueron identificadas las cuales tienen residuos de aminoácidos conservados o semi- conservados que son indicados por flechas en la parte superior de la figura. La proteina PanB de B. subtilis (RBS02239) es subrayada. Dos de las proteínas PanB (RCY14036 y CAB56202.1) no tienen la región 3 mientras que la segunda proteína PanB tampoco tiene la región 2 y tiene residuos de aminoácidos no conservados que ocupan la región 1. Variantes de PanB de B. subtilis fueron creadas las cuales no tenían las regiones 1, 2 y 3. Las variantes deseadas fueron creadas diseñando cebadores de reacción en cadena de polimerasa 3' para amplificar el gen panB de B. subtilis de tal manera que la región 3, las regixme.3 2 y, 3, o las tres regiones estuvieran faltando en el producto final. Los productos de reacción en cadena dé polimerasa fueron generados y clonados en vector de expresión de E. coli pASK-1BA3, creando los plásmidos pAN446r pA 447 y pAN448, respectivamente. Los plásmidos fueron después transformados en las cepa SJ2 de E. coli que contiene la mutación panB6 para probar la complementación. Solamente pAN446, que no tiene la región 3, pudo complementar. Esto indica que la región 3 no es esencial para la actividad PanB de B. subtilis pero que la región 2 se requiere para actividad o estabilidad. El siguiente paso en este análisis fue transferir el gen panB desde pA 446 a un vector de expresión de B. subtilis y después introducirlo en una cepa apropiada para probar la actividad de la proteína PanB codificada en B. subtilis. Para este propósito, una cepa que presenta una deleción del operón P26panBCD fue creada primero- Esto se logró a través de la inserción, en un principio, de un gen cat entre el sitio BseRI localizado justo corriente arriba de RBS de panB y el sitio Bg/II localizado en panD, creando el plásmido pAN624, SEQ ID NO: 20 (Figura 7) . La mutación por deleción-sustitución resultante {ñpanBCD: :cat624) que remueve la totalidad de panB y panC, fue cruzada en PA354 por transformación, con selección para resistencia al cloranfenicol en placas complementadas con . L iriM pantotenato. Uno de los transformantes fue guardado y nombrado PA644. El ADN cromosómico aislado a partir de PA644 fue analizado por reacción en cadena de polimerasa y se mostró que contenia la mutación por deleción-sustitución. Como se esperaba, PA644 requiere de pantotenato pera crecer, pero conserva los genes ilv manipulados (P26 lvSWC PzeilvD) asi como el gen V2epanEl originalmente presente en PA354. Asi, tiene todas las enzimas involucradas en la síntesis de pantotenato sobre-producidas, excepto PanB. El gen que contiene la deleción de panB más corta fue insertado en un vector de expresión de B. subtilis pOTP61 (descrito en la Solicitud de patente norteamericana No. de serie 09/667,569), creando el plásmido pAN627. Al mismo tiempo, un gen de control de panB de tipo silvestre fue insertado en pOTP61, creando el plásmido pAN630. Los fragmentos Wotl de cada plásmido, sin secuencias de vector de E. coli, fueron ligados y transformados en PA644, con selección para resistencia a la tetraciclina . Un transformante de cada transformación fue guardado y transformado adicionalmente con ADN cromosómico a partir de PA628 con selección para Pan†. PA628 contiene un plásmido de expresión de P26panC*D de copias múltiples (pA 620) integrado en el locus vpr. Con el objeto de determinar los efectos de la mutación de gen panB directamente sobre la producción de pantotenato, el plásmido.=¾,A 620. SEQ .ID. NO: 21, que es ilustrado en la Figura 8, proporciona las dos enzimas restantes requeridas para la síntesis de pantotenato (PanC y PanD) . Cuatro transformantes para cada transformación fueron aislados, cultivados en medio SVY que contiene 10 g/L de aspartato durante 48 horas, y después ensayados para la producción de pantotenato. Los transformantes con el gen panB removidos 3' fueron nombrados PA664 y los que contenían el gen de tipo silvestre fueron llamados PA666. Los datos mostraron que el gen panB con deleción 3' en PA664 codifica una proteína PanB con actividad muy reducida. Para probar la producción de HMBPA, cultivos en tubos de ensayo de PA365, PA666 y PA664 fueron efectuados en medio SVY + aspartato con y sin adición de a -KIV o pantoato durante 48 horas y después ensayados para HMBPA y pantotenato de conformidad con lo previamente descrito. )la 2. Efecto de la actividad PanB y adición de precursores xre la producción de HMBPA y pantotenato, datos de cultivo 48 horas en tubos de ensayo, medio SVY + aspartato (10 ¦ Cepa Operón pan Plásmido Plásmido pan C*D Pan B PA365 P26panBCD Ninguno Ninguno PA666 ApanBCD: :cat pAN620 pAN630 PA664 ApanBCD: :cat pAN620 pAN627 Tabla 2 (Continuación) Cepa sin adiciones +0C-KIV [pan] Pico* [pan] . Pico de (g/L) HMBPA (g/L) HMBPA PA365 3.0 0.71 3.2 1.28 PA666 3.7 0.55 3.3 1.70 PA66 0.3 0.6 1.76 Tabla 2 (Continuación) Cepa tPantoato (5 g/L) [pan] Pico de (g/L) HMBPA PA365 4.8 0.38 PA666 5.2 0.26 PA664 2.5 0.74 *pico de HMBPA = área de pico x 10 Los datos presentados en la Tabla 2 demuestran que, en ausencia de suplementos, ??666 produjo la menor cantidad de HMBPA mientras que PA664 produjo la mayor cantidad, lo que indica una correlación inversa entre la actividad PanB y la producción de HMBPA. Esto es consistente con el modelo que predice que las dos vías compiten por OÍ-KIV, el sustrato para PanB, y producen sustratos competitivos para PanC; se podía también esperar que la disminución de la actividad PanB incrementara la disponibilidad de cx-KIV para la síntesis de o¡-HIV y una disminució .. correspondiente de la cantidad de pantoato sintetizado. Cuando -KIV se agrega al medio, las tres cepas produjeron una cantidad significativamente mayor de HMBPA. Este resultado implica que cc-KIV es un precursor de HMBPA, de conformidad con lo descrito en la figura 2, y tiene un exceso de a-KIV favorece la producción de HMBPA. Este resultado sugiere también que la síntesis de HMBPA se debe por lo menos parcialmente a un efecto de sobreflujo de exceso de producción de a-KIV. Cuando se agrega pantoato al medio, la producción de HMBPA fue^reducida en aproximadamente 50% en las tres cepas. A la inversa, las cepas produjeron cada una significativamente más pantotenato. Este resultado es también consistente con el modelo en el sentido que las dos vías producen sustratos que cdapiten por PanC (a-KIV y pantoato) . Conjuntamente, los resultados antes mencionados indican adicionalmente que el incremento de la síntesis de pantoato debería ser benéfico para promover la producción de pantotenato así como para reducir los niveles de HMBPA. Además, factores que disminuyen la síntesis de pantoato afectan negativamente la síntesis de pantotenato. Ejemplo IV. Efecto del incremento de panB y/o regulación de PanEl sobre la producción de pantotenato PA668 es un derivado de PA824 que contiene copias adicionales de P26 panB amplificadas en el locus vpr o en el locus panB. PA668 fue construido utilizando el vector de expresión de panB (pAN636, seq id no: 22) láf^ ue permite la selección de múltiples copias utilizando cloranfenicol (figura 9) . El fragmento de restricción Notl de pA 636, que no tiene la secuencia de vector E. coli, fue ligada y después utilizado para transformar PA824 con selección en placas que contienen 5 g/ml de cloranfenicol . Transformantes resistentes a 30 g/ml de cloranfenicol fueron aislados y tamizados para producción de pantotenato en cultivos en tubo de ensayo de 48 horas. Los aislados mostrados producen menos HMBPA que PA824 (a la inversa producen aproximadamente 10 por ciento más pantotenato que PA824) . Una segunda cepa, llamado PA669, fue construida la cuál es PA824 con copias adicionales de P26 panEl amplificadas en el locus vpr o locus panEl. La cepa PA669 fue construido mediante la transformación de PA824 con el fragmento notJ autoligado de plásmido pAN637, seq id no: 23 (figura 10) con selección para resistencia al i cloranfenicol. Dos aislados de PA669 fueron seleccionados para estudios adicionales; ??669-5 produce menos PanEl que ??669-7 de conformidad con lo determinado por análisis de SDS-PAGE de los extractos totales de células efectuados a partir de las dos cepas. Cultivos en tubos de ensayo de las cepas PA824, PA668-2, PA668-24, y de dos aislados de PA669 (PA669-5 y PA669-7) fueron efectuados en tres medios diferentes (SVY, SVY + aspartato, y SYV + aspartato + pantoato) 'durante 48 horas y después - e¾s¾-yados para pantotenato, HMBPA, y ß-alanina (Tabla 3) . Tabla 3. .Efecto de copias adicionales de panB y panEl sobre la producción de pantotenato y HMBPA por PA824, datos de cultivo en tubos de ensayo de 48 horas, medio SYV. Cepa Sin adiciones Plásmido Plásmido [pan] [ß-ala] panB panE (g/L) (g/L) PA824 Ninguna Ninguna 1.8 0.05 PA668-2 pAN636 Ninguna 1.5 <0.04 PA688-24 pAN636 Ninguna 1.8 0.05 PA669-5 Ninguna pAN637 1.8 0.04 PA669-7 Ninguna pAN637 1.8 O.OS (Continuación de la tabla 3) Cepa Sin +aspartato (lOg/L) adiciones HMBPA [pan] [ß-ala] HMBPA * (g/L) (g/L) PA82 <0.1 4.7 2.5 0.53 PA668-2 <0.1 5.0 1.6 <0.10 PA668-24 <0.1 4.9 2.8 0.34 PA669-5 <0.1 4.2 3.1 0.74 PA669-7 <0.1 3.7 3.2 1.41 (continuación de la tabla 3) Cepa +aspartato (10 g/L) [pan] [ß-ala] HMBPA (g/L) . (g/L) PA824 5.6 2.5 <0.10 PA668-2 4.9 1.2 <0.10 PA668-24 6.1 .2.6 <0.10 PA669-5 5.8 2.6 0.30 PA669-7 5.2 2.5 0.75 * HMBPA = área de pico X 10"3 Ninguna de las produjo cantidades detectables de HMBPA en medio SVY. Todas las cepas produjeron cantidades aproximadamente equivalentes de pantotenato y cantidades bajas de ß-alanina lo que indica que la ß-alanina es limitante tanto para la síntesis de pantotenato como para la síntesis de HMBPA en estos cultivos y que ß-alanina es un precursor de ambos compuestos. Cuando se cultivaron en medio SVY + aspartato, los dos aislados de PA669 produjeron más HMBPA que PA824, mientras que ambos aislados de PA668 produjeron menos HMBPA que PA824. Vale la pena observar que la cepa que produce la mayor cantidad de pAnEl (PA669-7) produjo la mayor cantidad de HMBPA (y la menor cantidad de pantotenato) . Esto sugiere que niveles altos de PanEl favorecen la producción de HMBPA a costas de una síntesis menor de pantotenato. Es también interesante observar que PA668-24 produjo más HMBPA que PA668-2, aún cuando un análisis SDS-PAGE de extractos provenientes de los dos cepas-mostraron que producen niveles aproximadamente equivalentes de PanB. El análisis SDS-PAGE mostró también que PA668-24 produce mucho más IlvC que PA668-2. Con base en estos datos, se propone que IlvC influencia la síntesis de HMBPA mediante el incremento de los niveles de estado de equilibrio de a-KIV y/o mediante la catalización de la formación de oc-HIV a partir de a-KIV, explicando de esta forma el desplazamiento observado hacia la producción de HMBPA. El conjunto final de datos en la tabla 3 muestra que la adición de pantoato al medio de crecimiento disminuyó la producción de HMBPA por parte de todas las cepas que habían previamente producido niveles detectables, por ejemplo, por desplazamiento de la síntesis hacia pantotenato. Esto apoya adicionalmente el modelo en el sentido que a-HIV y pantoato son sustratos en competencia por PanC.

Ejemplo V: Incremento de la síntesis de pantotenato por reducción de pantotenato quinasa en cepas de producción Una estrategia para incrementar la producción de pantotenato es reducir la cantidad de actividad pantotenato quinasa en las cepas de producción. La pantotenato quinasa es la primera enzima en la vía del pantotenato a la co-enzima A. Se planteó de manera hipotética que una actividad pantotenato quinasa menor provocaría niveles de estado de equilibrio menores de la coenzima A, lo que provocaría a su vez una actividad de enzima Parí&: mayor .y títulos más altos- de pantotenato. De conformidad , con lo descrito en la solicitud de patente norteamericana No. 09/667,569, dos genes no enlazados han sido identificados en B. subtilis los cuales codifican ambos pantotenato quinasa, 1) , coaA, que es homólogo del gen de pantotenato quinasa de E. coli esencial, y 2) coaX, que representa una clase novedosa de genes bacterianos ' de pantotenato quinasa. Ya sea coaA o bien coaX, puede ser removido de una cepa de B. subtilis de tipo silvestre sin ningún efecto aparente sobre el crecimiento en medios rico o medio mínimo. Sin embargo, no es posible generar cepas que tienen una deleción de ambos genes, lo que sugiere que uno u otro es necesario para la viabilidad. Por consiguiente, se construyo una cepa que trene un coaX removido y después se sometió coaA, a mutación para reducir la actividad específica de la enzima coaA. Aún cuando el fenotipo de las cepas AcoaX, con coaA mutados son sutiles, los datos son consistentes con la hipótesis de la actividad de PanB puede ser incrementada mediante la restricción de la actividad pantotenato guinasa. Esto a su vez disminuye la producción de HMBPA y incrementa la producción de pantotenato . Instalación de AcoaX y alelos de coaA con mutaciones en PA824 La deleción de coaX a partir de ??824 fue lograda en una sola etapa mediante la transformación de PA824 para resistencia a .la canamicina con ADN cromosómico de PA876 (PY19-?sS oaX:-;kan)-·, según lo descrito en la solicitud de patente norteamericana No. 09/667/569, para proporcionar PA880. La deleción coaX en PA880 y PA876 fue derivada finalmente del plásmido pAN336 * (SEQ ID NO: 26, véase solicitud de patente norteamericana No. de serie 09/667,569). Después, se introdujeron una versión de un gen coaX de tipo silvestre y dos alelos mutados de coaA de la siguiente manera. El control y dos alelos sometidos a mutaciones fueron introducidos primero en el cromosoma de la cepa PY79 de tipo silvestre utilizando la transformación para resistencia al cloranfenicol por plásmidos, y después se utilizó el ADN cromosómico a partir de estas cepas intermedias para transformar PA880 para resistencia al cloranfenicol . Los plásmidos utilizados para integrar el control y los alelos mutantes fueron pAN294 (SEQ ID NO: 27, véase solicitud de patente norteamericana' No. de serie 09/667/569), pAN343, y pAN344. pAN343 es casi idéntico a pAN294, excepto que contiene un cambio de base de T a C en el número de base 3228 de pi¾ 294. De manera similar, pAN344 tiene un cambio de CC a TA en los números de base 3217 y 3218 de pAN294. Los tres plásmidos tienen un gen de resistencia al cloranfenicol (cat) que sustituye el gen sustituible de función desconocida, yqjT, que se encuentran justo corriente debajo de coaA. Las cepas intermedias derivadas de PY79 por cruzamientos dobles de pA 294 (coaA de tipo silvestre, , -_y jT:.:cat) , pAN343 {coaA Y155H, yqjT:.-cat), y pAN344 {coaAZi S151 , yqjT: . cat) , se conocen como PA886, PA887 y PA888, respectivamente. Después, PA880 fue transformado ' para resistencia al cloranfenicol con el ADN cromosómico del PA886, PA887, o PA888, para proporcionar las cepas PA892 {coaA de tipo silvestres, cat), PA893 {coaA Y155H, cat) y PA894 {coaA S151L, cat), respectivamente. Ocho candidatos para PA893 fueron eestudiados para la adquisición de la mutación de ?155? por reacción en cadena de polimerasa del gen coaA y digestión con NlalII, y los ocho candidatos resultaron correctos. Nueva cepa, incluyendo PA880, fueron ensayados para la producción de pantotenato a 43° en cultivos en tubo de ensayo estándares- efectuados en medio SVY más 5 g/1 de ß-alanina (véase tabla 4) . Tabla 4." Producción de pantotenato y fantotenato por derivados de PA824 que presentan una deleción de coaX y mutación de coaAr cultivados a una temperatura de 43°C en cultivos en tubos de ensayo de 48 horas con SVY glucosa + ß-alaniña Cepa coaA coaX OD6oo [pan] [HMBPA] g/i g/i PA824 wt wt 11.1 4.4 0.77 PA824 wt wt 11.4 4.1 0.70 PA880 t ? 11.6 5.5 0.33 PA880 wt ? 12.7 ¿ 5.1 . . 0.33 PA892-1 wt, cat ? 11.7 4.5 0.26 PA892-2 wt, cat ? 13.4., 4.5 0.26 PA8 2-3 wt, cat ? 12.9 4.8 0.25 PA893-1 ?155?, cat ? x0.7 4.3 0.24 PA893-2 Y155H, cat ? . 12.0 4.5 0.25 PA893-3 Y155H, cat ? 11.9 4.7 0.23 PA893-4 Y155H, cat ? 12.8 4.3 0.20 PA893-5 Y155H, cat ? 11.6 4.7 0.28 PA893-8 Y155H, cat ? 10.0 4.7 0.25 PA894-1 S151L?, cat ? 11.6 4.6 0.29 PA894-2 S151L?, cat ? 15.6 4.5 0.27 PA894-3 S151L?, cat ? 12.3 5.0 0.31 PA894-4 S151L?, cat ? 12.2 5.0 0.27 PA894-5 S151L?, cat ? 11.8 4.5 0.26 PA89 -6 S151L?, cat ? 11.2 4.7 0.27 PA894-7 S151L?, cat ? 13.1 4.7 0.26 PA894-8 S151L?, cat ? 13.2 4.8 0.32 En un medio que contiene ß-alanina, PA894 (S151L) , pero no PA893 (Y155H) proporcionó, en promedio, niveles ligeramente 5 más altos de pantotenato que PA892 (la cepa isogénica con coañ de tipo silvestre) . PA880 proporcionó una cantidad significativamente mayor de pantotenato (5.5 y 5.1 g/1) que su origen isogénico, PA824 (4.4 y 4.1 g/1), y niveles ligeramente mayores de pantotenato que PA894 (promedio •10· aproximadamente 4.7 g/1). Es posible que la insercásn AyqjT . presente en PA892, PA893 y PA894 (pero no PA880) tenga un efecto que contrarreste cualquier incremento que pueda resultar de los alelos de coaA mutados. A pesar del rango angosto de títulos de pantotenato a partir 15 de las nuevas cepas, se observó un patrón significati amente mayor para la producción de HMBPA. En todas las cepas en donde se presentó una deleción de coaX, título de HMBPA fue de dos a tres veces menor que para PA824. Esto es consistente con el principio en el sentido que la producción de HMBPA 20 resulta en parte de una limitación de la actividad PanB. Por consiguiente, el ÁcoaX lleva a una actividad de panB incrementada. Ejemplos VI: Incremento de la síntesis de pantotenato por incremento combinado en panB y reducción de pantotenato quinasa en las cepas de producción PA668, que contiene un cassette de expresión de PanB adicional el cuál es diseñado para ser amplificado por cloranfenicol (véase ejemplo IV), produce más pantotenato y menos HMBPA que su predecesor, PA824. Puesto que la deleción de coaX a partir de PA824 reduce también la producción de HMBPA e incrementa moderadamente la producción de pantotenato (PA880) , una cepa que combina las dos modificaciones fue construida y probada para la producción de pantotenato. El plásmido PAN636 (figura 9) fue digerido con Notl, ligado en circuios, y utilizado para traSs-formar PA880 para resistencia al cloranfenicol para proporcionar la cepa PA911. Varios aislados de PA911 fueron probados por reacción en cadena de polimerasa para determinar si el plásmido estaba integrado en vpr como se contemplaba, o bien en panB, en donde puede también integrarse. Se encontraron ambos tipos. Un aislado de cada tipo de PA911, PA911-5 y PA911-8 fue amplificado en tetraciclina (cassette panD) y cloranfenicol (cassette panB) y probado para la producción de pantotenato en cultivos en tubos de ensayo en medio SVY más ß-alanina (véase tabla 1) . Ambos aislados produjeron más pantotenato, y ligeramente menos HMBPA que su origen PA880. Además, de manera consistente con los aislados de PA668, PA911-8, que tiene el cassette panB integrado en panB, produjo el nivel más alto de pantotenato . Ejemplo VII: Incremento de la producción de pantotenato por incremento de la disponibilidad de serina Se planteó de manera hipotética que la proporción entre la producción de pantotenato y de HMBPA pudiera también ser controlada por la regulación de la disponibilidad de serina en los cultivos de microorganismos. En particular, se propuso que el incremento de la disponibilidad de serina pudiera incrementar la producción de pantotenato en comparación con la producción de HMBPA, mientras que una disminución de la disponibilidad de serina pudiera disminuir la producción de pantotenato en comparacióii3 ¾on la producción de HMBPA. Este método se basa en el entendimiento que el sustrato de PanB, metilentetrahidrofolato, se deriva de serina. Asi, la regulación de los niveles de serina pudiera regular efectivamente ios' niveles de sustrato "de PanB. Para comprobar esta hipótesis, se cultivo PA824 en cultivos en tubos de ensayos de SVY glucosa más 5 g/L de ß-alanina y + 5 g/L de serina durante 48 horas a una temperatura de 43° C. Tabla 5: Producción de pantotenato y HMBPA por PA824 con y sin adición de serina Serina agregada OD60o [pan] g/L [HMBPA] g/1 a 5 g/L 16.3 4.9 0.84 14.0 4.5 0.80 + 13.1 6.4 0.56 + 12.9 6.0 0.62 Como se demostró a través de los datos presentados en la tabla 5, la adición de serina incrementa el nivel de producción de pantotenato mientras disminuye a la inversa la producción de HMBPA. Como alternativa a la alimentación de serina, otro método para incrementar los niveles de serina y de metilentetrahidrofolato con el objeto de regular los niveles de producción de pantotenato es incrementar la síntesis o la actividad 3-fosfoglicerato deshidrogenasa o de serina hidroximetiltransferasa (los productos de gen serA y gJ,yA, respectivamente) , incrementado de esta forma la biosíntesis de serina y metilentetrahidrofolato en microorganismos apropiadamente manipulados. Ejemplo VIII; Producción de pantotenato con cepas ??668-2? y PA668-24 en termentadores de 10 litros con medio basado en harina de soya Las cepas PA668-2A y PA668-24 fueron cultivadas cada una dos veces en fermentadores de 10 litros. El medio fue PFM-155 y la composición es la siguiente. Lote Material g/L (final) 1 Amberex 10003 5 2 Cargill 200/20 (harina de soya) 40 3 Glutamato de Na 5 4 (NH4)2S04 8 5 MgS04*7¾0 1 6 MAZU DF204C 1 7 H20 hasta 4 L Agregado después de esterilización y enfriamiento 1 KH2P0 10 2 ??2??04·3?20 20 3 ¾0 hasta 400 mi 1 Glucosa al 80% 20 2 CaCl2«2H20 0.1 1 Citrato. de Sodio 1 2 FeS0»7H20 0.01 3 SM-1000X 1 X ALIMENTACIÓN MATERIAL g/L (final) 1 ' Glucosa al 80% 800 2 CaCl2«2H20 0.8 3 H20 hasta 3500 mi Agregado después de esterilización y enfriamiento 1 Citrato de Sodio 2.0 2 FeS0«7H20 0.02 3 SM-1000X 2 X 4 Glutamato de Na 5.0 5 ¾0 hasta 500 mi La producción de pantotenato por PA668-2A fue de 45 g/1 y 51 g/L a las 36 horas, de manera similar a las fermentaciones rutinarias de PA824 en el mismo medio. Después de 36 horas, cuando la producción de pantotenato empieza rutinariamente a bajar con PA82 , ambas fermentaciones de PA668-2A siguieron 5 produciendo para proporcionar 63 g/1 de pantotenato a las 48 horas. De manera más significativa, la producción de HMBPA a las 48 horas fue reducida a 3-5 g/L, y fue inferior a 5% del pantotenato durante la mayoría de la fermentación anterior . Beneficios para la síntesis de pantotenato son evidentes a __¾£(>. .partir de los niveles incrementados de panB en la cepa ~£&£68..

La cepa PA668-24 produjo pantotenato a un régimen aún.. más rápido con las dos fermentaciones alcanzando un promedio de 58 g/L después de 36 horas. Equivalentes 15 Las personas con conocimientos en la materia reconocerán o bien podrán determinar utilizando experimentos de rutina muchos equivalente a las modalidades de la invención descritas aquí. Tales equivalentes se encuentran dentro del marco de las reivindicaciones siguientes.

LISTADO DE SECUENCIAS <110> BASF A TIENGESELLSCHAFT <120> PROCESOS PARA UNA PRODUCCION INCREMENTADA DE PANTOTENATO <130> BGI-148PC <140> <141> <160> 21 <170> Patentln Ver. 2.0 <210> 1 <211> 194 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: secuencia promot <220> <221> -35_señal <222> (136) .. (141) <220> <221> -10_señal <222> (159) .. (154) <400> 1 gctattgacg acagctatgg ttcactgtcc accaaccaaa actgtgctca gtaccgccaa 60 tatttctccc ttgaggggta caaagaggtg tccctagaag agatccacgc tgtgtaaaaa 120 ttttacaaaa aggtattgac tttccctaca gggtgtgtaa taatttaatt acaggcgggg 180 gcaaccccgc ctgt 194 <210> 2 <211> 163 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: secuencia promotor <220> <221> -35_señal <222> (113) .. (118) <220> <221> -10_señal <222> (136) .. (141) <400> 2 gcctacctag cttccaagaa agatatccta acagcacaag agcggaaaga tgttttgttc 60 tacatccaga acaacctctg ctaaaattcc tgaaaaattt tgcaaaaagt tgttgacttt 120 atctacaagg tgtggtataa taatcttaac aacagcagga cgc 163 <210> 3 <211> 127 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: secuencia promot <220> <221> -35_señal <222> (34) .. (39) <220> <221> -10_señal <222> (58) .. (63) <220> <221> ~35__señal <222> (75) .. (80) <220> <221> -10_señal <222> (98) .. (103) <400> 3 gaggaatcat agaattttgt caaaataatt ttattgacaa cgtcttatta acgttgatat 60 aatttaaatt ttatttgaca aaaatgggct cgtgttgtac aataaatgta gtgaggtgga 120 tgcaatg 127 <210> 4 <211> 24 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: sitio de unión del ribosoma <400> 4 taaacatgag gaggagaaaa catg · 24 <210> 5 <211> 28 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: sitio de unión del ribosoma <400> 5 attcgagaaa tggagagaat ataatatg 28 <210> 6 <211> 13 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: sitio de unión del ribosoma <400> 6 agaaaggagg tga 13 <210> 7 <211> 23 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: sitio de unión del ribosoma <220> <223> Todas las apariciones de n = cualquier nucleótido <400> 7 ttaagaaagg aggtgannnn atg 23 <210> 8 <211> 23 <212> ADN · <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: sitio de unión del ribosoma <220> <223> Todas las apariciones de n = cualquier nucleótido <400> 8 ttagaaagga ggtgannnnn atg 23 <210> 9 <211> 23 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: sitio de unión del ribosoma <¿220> <223> Todas las apariciones de n = cualquier nucleótido <400> 9 agaaaggagg tgannnnnnn atg 23 <210> 10 <211> 22 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: sitio de unión del ribosoma <220> <223> Todas las apariciones de n = cualquier nucleótido <400> 10 agaaaggagg tgannnnnna tg 22 <210> 11 <211> 25 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: sitio de unión del ribosoma <400> 11 ccctctagaa ggaggagaaa acatg 25 <210> 12 <211> 24 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: sitio de unión del ribosoma <400> 12 ccctctagag gaggagaaaa catg 24 <210> 13 <211> 23 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: sitio de unión del ribosoma <400> 13 ttagaaagga ggatttaaat atg 23 <210> 14 <211> 23 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: sitio de unión del ribosoma <400> 14 ttagaaagga ggtttaatta atg 23 <210> 15 <211> 23 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: sitio de unión del ribosoma <400> 15 ttagaaagga ggtgatttaa atg · 23 <210> 16 <211> 23 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: sitio de unión del ribosoma <400> 16 ttagaaagga ggtgtttaaa atg 23 <210> 17 <211> 28 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: sitio de unión del ribosoma <400> 17 attcgagaaa ggaggtgaat ataatatg 28 <210> 18 <211> 27 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: sitio de unión del ribosoma <400> 18 attcgagaaa ggaggtgaat aataatg 27 <210> 19 <211> 28 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: sitio de unión del ribosoma <400> 19 attcgtagaa aggaggtgaa ttaatatg 28 <210> 20 <211> 6886 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223>. Descripción de la Secuencia Artificial: vector <220> <223> pAN624 <400> 20 aagaaaccaa ttgtccatat tgcatcagac attgccgtca ctgcgtcttt tactggctct 60 tctcgctaac caaaccggta accccgctta ttaaaagcat tctgtaacaa agcgggacca 120 aagccatgac aaaaacgcgt aacaaaagtg tctataatca cggcagaaaa gtccacattg 180 attatttgca cggcgtcaca ctttgctatg ccatagcatt tttatccata agattagcgg 240 atcctacctg acgcttttta tcgcaactct ctactgtttc tccatacccg tttttttggg 300 ctaacaggag gaattaacca tggatccgag ctcgacagta tcaagcactt cacaatctgg 360 gagctgaaag cccgccttat gtagctcata cttgacaaat ccaaggtcaa aatggatatt 420 gtgggcgaca aaataagcgc cgtcaagcaa ttggaatact tcttcagcaa ctgcttcaaa 480 tggctgttca ttctcgacca tttgattaga gattccagta agctgctcaa taaaagcagg 540 gattgattta tttggattaa tgtattttga aaaccgctca gtaatttgtc cattttcgat 600 tacaaccgct gcgatttgta tgattttatc gcctttcttc ggcgaattcc ctgttgtctc 660 tacatctata acaacgaacc gttgcttatt cattaaaatg gacacctcaa ttcttgcata 720 cgacaaaagt gtaacacgtt ttgtacggaa atggagcggc aaaaccgttt tactctcaaa 780 atcttaaaag aaaacccccg ataaaggggg cttttcttct acaaaattgt acgggctggt 840 tcgttcccca gcatttgttc aattttgttt tgatcattca gaacagccac tttcggctca 900 tggcttgccg cttcttgatc agacatcatt ttgtaggaaa taataatgac cttatctcct 960 tcctgcacaa ggcgtgcggc tgcaccgttt aagcatatga cgccgcttcc ccgtttacca 1020 ggaataatat acgtttcaag acgtgctcca ttattattat tcacaatttg tactttttca 1080 ttaggaagca ttcccacagc atcaatgaga tcctctagag tcgacctgca ggcatgcaag 1140 cttccgtcga cgctctccct tatgcgactc ctgcattagg aagcagccca gtagtaggtt 1200 gaggccgttg agcaccgccg ccgcaaggaa tggtgcatgc aaggagatgg cgcccaacag 1260 tcccccggcc acggggcctg ccaccatacc cacgccgaaa caagcgctca tgagcccgaa 1320 gtggcgagcc cgatcttccc catcggtgat gtcggcgata taggcgccag caaccgcacc 1380 tgtggcgccg gtgatgccgg ccacgatgcg tccggcgtag aggatcaatc ttcatccatt 1440 ccaaggtaaa tcccccttcg ccgtttctgt taccattata caccttttga accttaacgt 1500 aaacgttaag ttttaaaaaa caataaaaaa gacgagcagc atacagcacc cgtctttcac 1560 tttcctgttt aagctaaact tcccgccact gacagagact ctttttgaag gctttcagaa 1620 agcactcgat acgcgatctg gagctgtaat ataaaaacct tcttcaacta acggggcagg 1680 ttagtgacat tagaaaaccg actgtaaaaa gtacagtcgg cattatctca tattataaaa 1740 gccagtcatt aggcctatct gacaattcct gaatagagtt cataaacaat cctgcatgat 1800 aaccatcaca aacagaatga tgtacctgta aagatagcgg taaatatatt gaattacctt 1860 tattaatgaa ttttcctgct gtaataatgg gtagaaggta attactatta ttattgatat 1920 ttaagttaaa cccagtaaat gaagtccatg gaataataga aagagaaaaa gcattttcag 1980 gtataggtgt tttgggaaac aatttccccg aaccattata tttctctaca tcagaaaggt 2040 ataaatcata aaactctttg aagtcattct ttacaggagt ccaaatacca gagaatgttt 2100 tagatacacc atcaaaaatt gtataaagtg gctctaactt atcccaataa cctaactctc 2160 cgtcgctatt gtaaccagtt ctaaaagctg tatttgagtt tatcaccctt gtcactaaga 2220 aaataaatgc agggtaaaat ttatatcctt cttgttttat gtttcggtat aaaacactaa 2280 tatcaatttc tgtggttata ctaaaagtcg tttgttggtt caaataatga ttaaatatct 2340 cttttctctt ccaattgtct aaatcaattt tattaaagtt catttgatat gcctcctaaa 2400 tttttatcta aagtgaattt aggaggctta cttgtctgct ttcttcatta gaatcaatcc 2460 ttttttaaaa gtcaatatta ctgtaacata aatatatatt ttaaaaatat cccactttat 2520 ccaattttcg tttgttgaac taatgggtgc tttagttgaa gaataaagac cacattaaaa 2580 aatgtggtct tttgtgtttt tttaaaggat ttgagcgtag cgaaaaatcc ttttctttct 2640 tatcttgata ataagggtaa ctattgcatg ataagctgtc aaacatgaga attcccgttt 2700 tcttctgcaa gccaaaaaac cttccgttac aacgagaagg attcttcact ttctaaagtt 2760 cggcgagttt catccctctg tcccagtcct tttttggatc aaggcagact gctgcaatgt 2820 ctatctattt taataatagg tgcagttcgc aggcgatact gcccaatgga agtataccaa 2880 aatcaacggg cttgtaccaa cacattagcc caattcgata tcggcagaat agattttttt 2940 aatgccttcg ttcgtttcta aaagcagaac gccttcatca tctataccta acgccttacc 3000 gtaaaaggtt ccgtttaacg ttctggctct catattagtg ccaataccga gcgcatagct 3060 ttcccataaa agcttaatcg gcgtaaatcc gtgcgtcata taatcccggt accgtttctc 3120 aaagcatagt aaaatatgct ggatgacgcc ggcccgatca attttttccc cagcagcttg 3180 gctgaggctt gtcgcgatgt ccttcaattc atctggaaaa tcattaggct gctggttaaa 3240 cggtctccag cttggctgtt ttggcggatg agagaagatt ttcagcctga tacagattaa 3300 atcagaacgc agaagcggtc tgataaaaca gaatttgcct ggcggcagta gcgcggtggt 3360 cccacctgac cccatgccga actcagaagt gaaacgccgt agcgccgatg gtagtgtggg 3420 gtctccccat gcgagagtag ggaactgcca ggcatcaaat aaaacgaaag gctcagtcga 3480 aagactgggc ctttcgtttt atctgttgtt tgtcggtgaa cgctctcctg agtaggacaa 3540 atccgccggg agcggatttg aacgttgcga agcaacggcc cggagggtgg cgggcaggac 3600 gcccgccata aactgccagg catcaaatta agcagaaggc catcctgacg gatggccttt 3660 ttgcgtttct acaaactctt tttgtttatt tttctaaata cattcaaata gtatccgct 3720 catgagacaa taaccctgat aaatgcttca ataatattga aaaaggaaga gtatgagtat 3780 tcaacatttc cgtgtcgccc ttattccctt ttttgcggca ttttgccttc ctgtttttgc 3840 tcacccagaa acgctggtga aagtaaaaga tgctgaagat cagttgggtg cacgagtggg 3900 ttacatcgaa ctggatctca acagcggtaa .gatccttgag agttttcgcc ccgaagaacg 3960 ttttccaatg atgagcactt ttaaagttct gctatgtggc gcggtattat cccgtgttga 4020 cgccgggcaa gagcaactcg gtcgccgcat ..acactattct :cagaatgact tggttgagta 4080 ctcaccagtc acagaaaagc atcttacgga -tggcatgaca rgtaagagaat rtatgcagtgc 4140 tgccataacc 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tctgtagcac cgcctacata cctcgctctg ctaatcctgt taccagtggc 5040 tgctgccagt ggcgataagt cgtgtcttac cgggttggac tcaagacgat agttaccgga 5100 taaggcgcag cggtcgggct gaacgggggg ttcgtgcaca cagcccagct tggagcgaac 5160 gacctacacc gaactgagat acctacagcg tgagctatga gaaagcgcca cgcttcccga 5220 agggagaaag gcggacaggt atccggtaag cggcagggtc ggaacaggag agcgcacgag 5280 ggagcttcca gggggaaacg cctggtatct ttatagtcct gtcgggtttc gccacctctg 5340 acttgagcgt cgatttttgt gatgctcgtc aggggggcgg agcctatgga aaaacgccag 5400 caacgcggcc tttttacggt tcctggcctt ttgctggcct tttgctcaca tgttctttcc 5460 tgcgttatcc cctgattctg tggataaccg tattaccgcc tttgagtgag ctgataccgc 5520 tcgccgcagc cgaacgaccg agcgcagcga gtcagtgagc gaggaagcgg aagagcgcct 5'580 gatgcggtat tttctcctta cgcatctgtg cggtatttca caccgcatat ggtgcactct 5640 cagtacaatc tgctctgatg ccgcatagtt aagccagtat acactccgct atcgctacgt 5700 gactgggtca tggctgcgcc ccgacacccg ccaacacccg ctgacgcgcc ctgacgggct 5760 tgtctgctcc cggcatccgc ttacagacaa gctgtgaccg tctccgggag ctgcatgtgt 5820 cagaggtttt caccgtcatc accgaaacgc gcgaggcagc agatcaattc gcgcgcgaag 5880 gcgaagcggc atgcataatg tgcctgtcaa atggacgaag cagggattct gcaaacccta 5940 tgctactccg tcaagccgtc aattgtctga ttcgttacca attatgacaa cttgacggct 6000 acatcattca ctttttcttc acaaccggca cggaactcgc tcgggctggc cccggtgcat 6060 tttttaaata cccgcgagaa atagagttga tcgtcaaaac caacattgcg accgacggtg 6120 gcgataggca tccgggtggt gctcaaaagc agcttcgcct ggctgatacg ttggtcctcg 6180 cgccagctta agacgctaat ccctaactgc tggcggaaaa gatgtgacag acgcgacggc 6240 gacaagcaaa catgctgtgc gacgctggcg atatcaaaat tgctgtctgc caggtgatcg 6300 ctgatgtact gacaagcctc gcgtacccga ttatccatcg gtggatggag cgactcgtta 6360 atcgcttcca tgcgccgcag taacaattgc tcaagcagat ttatcgccag cagctccgaa 6420 tagcgccctt ccccttgccc ggcgttaatg atttgcccaa acaggtcgct gaaatgcggc 6480 tggtgcgctt catccgggcg aaagaacccc gtattggcaa atattgacgg ' ccagttaagc 6540 cattcatgcc agtaggcgcg cggacgaaag taaacccact ggtgatacca ttcgcgagcc 6600 tccggatgac gaccgtagtg atgaatctct cctggcggga acagcaaaat atcacccggt 6660 cggcaaacaa attctcgtcc ctgatttttc accaccccct gaccgcgaat ggtgagattg 6720 agaatataac ctttcattcc cagcggtcgg tcgataaaaa aatcgagata accgttggcc 6780 tcaatcggcg ttaaacccgc caccagatgg gcattaaacg agtatcccgg cagcagggga 6840 tcattttgcg cttcagccat acttttcata ctcccgccat tcagag 6886 <210> 21 <211> 7140 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: vector <220> <223> pAN620 <400> 21 tcggcggccg cttcgtcgac cgaaacagca gttataaggc atgaagctgt ccggtttttg 60 caaaagtggc tgtgactgta aaaagaaatc gaaaaagacc gttttgtgtg aaaacggtct 120 ttttgtttcc ttttaaccaa ctgccataac tcgaggccta cctagcttcc aagaaagata 180 tcctaacagc acaagagcgg aaagatgttt tgttctacat ccagaacaac ctctgctaaa 240 attcctgaaa aattttgcaa aaagttgttg actttatcta caaggtgtgg tataataatc 300 ttaacaacag caggacgctc tagattagaa aggaggattt aaatatgaga cagattactg 360 atatttcaca gctgaaagaa gccataaaac aataccattc agagggcaag' tcaatcggat 420 ttgttccgac gatggggttt ctgcatgagg ggcatttaac cttagcagac aaagcaagac 480 aagaaaacga cgccgttatt atgagtattt ttgtgaatcc tgcacaattc ggccctaatg 540 aagattttga agcatatccg cgcgatattg agcgggatgc agctcttgca gaaaacgccg 600 gagtcgatat tctttttacg ccagatgctc atgatatgta tcccggtgaa aagaatgtca 660 cgattcatgt agaaagacgc acagacgtgt tatgcgggcg ctcaagagaa ggacattttg 720 acggggtcgc gatcgtactg acgaagcttt tcaatctagt caagccgact cgtgcctatt 780 tcggtttaaa agatgcgcag caggtagctg ttgttgatgg gttaatcagc gacttcttca 840 tggatattga attggttcct gtcgatacgg tcagagagga agacggctta gccaaaagct 900 ctcgcaatgt atacttaaca gctgaggaaa gaaaagaagc gcctaagctg tatcgggccc 960 ttcaaacaag tgcggaactt gtccaagccg gtgaaagaga tcctcaagcg gtgataaaag 1020 ctgcaaaaga tatcattgaa acgactagcg gaaccataga ctatgtagag ctttattcct 1080 atccggaact cgagcctgtg aatgaaattg ctggaaagat gattctcgct gttgcagttg 1140 ctttttcaaa agcgcgttta atagataata tcattattga tattcgtaga aaggaggtga 1200 attaatatgt atcgtacgat gatgagcggc aaacttcaca gggcaactgt tacggaagca 1260 aacctgaact atgtgggaag cattacaatt gatgaagatc tcattgatgc tgtgggaatg 1320 cttcctaatg aaaaagtaca aattgtgaat aataataatg gagcacgtct tgaaacgtat 1380 attattcctg gtaaacgggg aagcggcgtc atatgcttaa acggtgcagc cgcacgcctt 1440 gtgcaggaag gagataaggt cattattatt tcctacaaaa tgatgtctga tcaagaagcg 1500 gcaagccatg agccgaaagt ggctgttctg aatgatcaaa acaaaattga acaaatgctg 1560 gggaacgaac cagcccgtac aattttgtaa aggatcctgt tttggcggat gagagaagat 1620 tttcagcctg atacagatta aatcagaacg cagaagcggt ctgataaaac agaatttgcc 1680 tggcggcagt agcgcggtgg tcccacctga ccccatgccg aactcagaag tgaaacgccg 1740 tagcgccgat ggtagtgtgg ggtctcccca tgcgagagta gggaactgcc aggcatcaaa 1800 taaaacgaaa ggctcagtcg aaagactggg cctttcgttt tatctgttgt ttgtcggtga 1860 acgctctcct gagtaggaca aatccgccgg gagcggattt gaacgttgcg aagcaacggc 1920 ccggagggtg gcgggcagga cgcccgccat aaactgccag gcatcaaatt aagcagaagg 1980 ccatcctgac ggatggcctt "ittgcgtttc tacaaactct tggtaccgag acgatcgtcc 2040 tctttgttgt agcccatcac ttttgctgaa gagtaggagc cgaaagtgac ggcgtattca 2100 ttgagcggca gctgagtcgc accgacagaa atcgcttctc ttgatgtgcc cggcgatccg 2160' actgtccagc cgttcggtcc gctgttgccg tttgaggtaa 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ctcccgtatc gtagttatct 4740 acacgacggg gagtcaggca actatggatg aacgaaatag acagatcgct gagataggtg 4800 cctcactgat ' taagcattgg taactgtcag accaagttta ctcatatata ctttagattg 4860 atttaaaact tcatttttaa tttaaaagga tctaggtgaa gatccttttt gataatctca 4920 tgaccaaaat cccttaacgt gagttttcgt tccactgagc gtcagacccc gtagaaaaga 4980 tcaaaggatc ttcttgagat cctttttttc tgcgcgtaat ctgctgcttg caaacaaaaa 5040 aaccaccgct accagcggtg gtttgtttgc cggatcaaga gctaccaact ctttttccga 5100 aggtaactgg cttcagcaga gcgcagatac caaatactgt ccttctagtg tagccgtagt 5160 taggccacca cttcaagaac tctgtagcac cgcctacata cctcgctctg ctaatcctgt 5220 taccagtggc tgctgccagt ggcgataagt cgtgtcttac cgggttggac tcaagacgat 5280 agttaccgga taaggcgcag cggtcgggct gaacgggggg ttcgtgcaca cagcccagct 5340 tggagcgaac gacctacacc gaactgagat acctacagcg tgagctatga gaaagcgcca 5400 cgcttcccga agggagaaag gcggacaggt atccggtaag cggcagggtc ggaacaggag 5460 agcgcacgag ggagcttcca gggggaaacg cctggtatct ttatagtcct gtcgggtttc 5520 gccacctctg acttgagcgt cgatttttgt gatgctcgtc 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<220> <223> pAN636 <400> 22 tcggcggccg cttcgtcgac cgaaacagca gttataaggc atgaagctgt ccggtttttg 60 caaaagtggc tgtgactgta aaaagaaatc gaaaaagacc gttttgtgtg aaaacggtct 120 ttttgtttcc ttttaaccaa ctgccataac tcgaggccta cctagcttcc aagaaagata 180 tcctaacagc acaagagcgg aaagatgttt tgttctacat ccagaacaac ctctgctaaa 240 attcctgaaa aattttgcaa aaagttgttg actttatcta caaggtgtgg tataataatc 300 ttaacaacag caggacgctc tagaaggagg agaaaacatg aaaacaaaac tggattttct 360 aaaaatgaag gagtctgaag aaccgattgt catgctgacc gcttatgatt atccggcagc 420 taaacttgct gaacaagcgg gagttgacat gattttagtc ggtgattcac ttggaatggt 480 cgtcctcggc cttgattcaa ctgtcggtgt gacagttgcg gacatgatcc atcatacaaa 540 agccgttaaa aggggtgcgc cgaatacctt tattgtgaca gatatgccgt ttatgtctta 600 tcacctgtct aaggaagata cgctgaaaaa tgcagcggct atcgttcagg aaagcggagc 660 tgacgcactg aagcttgagg gcggagaagg cgtgtttgaa tccattcgcg cattgacgct 720 tggaggcatt ccagtagtca gtcacttagg tttgacaccg cagtcagtcg gcgtactggg 780 cggctataaa gtacagggca aagacgaaca aagcgccaaa aaattaatag aagacagtat 840 aaaatgcgaa gaagcaggag ctatgatgct tgtgctggaa tgtgtgccgg cagaactcac 900 agccaaaatt gccgagacgc taagcatacc ggtcattgga atcggggctg gtgtgaaagc 960 ggacggacaa gttctcgttt atcatgatat tatcggccac ggtgttgaga gaacacctaa 1020 atttgtaaag. caatatacgc gcattgatga aaccatcgaa acagcaatca gcggatatgt 1080 tcaggatgta agacatcgtg ctttccctga acaaaagcat tcctttcaaa tgaaccagac 1140 agtgcttgac ggcttgtacg ggggaaaata agggggggat cctgttttgg cggatgagag 1200 aagattttca gcctgataca gattaaatca gaacgcagaa gcggtctgat aaaacagaat 1260 ttgcctggcg gcagtagcgc ggtggtccca cctgacccca tgccgaactc agaagtgaaa 1320 cgccgtagcg ccgatggtag tgtggggtct ccccatgcga gagtagggaa ctgccaggca 1380 tcaaataaaa cgaaaggctc agtcgaaaga ctgggccttt cgttttatct gttgtttgtc 1440 ggtgaacgct ctcctgagta ggacaaatcc gccgggagcg gatttgaacg ttgcgaagca 1500 acggcccgga gggtggcggg caggacgccc gccataaact gccaggcatc aaattaagca 1560 gaaggccatc ctgacggatg gcctttttgc gtttctacaa actcttggta ccgagacgat 1620 cgtcctcttt gttgtagccc atcacttttg ctgaagagta ggagccgaaa gtgacggcgt 1680 attcattgag cggcagctga gtcgcaccga cagaaatcgc ttctcttgat gtgcccggcg 1740 atccgactgt ccagccgttc ggtccgctgt tgccgtttga ggtaacagcg acaacgcctt 1800 ctgacatggc ccagtcaagc gctgtgcttg tcgcccagtc cgggttgttt aaagagtttc 1860 cgagagacag gttcatcaca tctgccccgt cctgcactgc acgttccacg cccgcgatga 1920 cgttttccgt tgtgccgctt ccgccaggcc ctaacacacg ataagcaaga agtgtggcat 1980 caggcgctac gcctttaatc gttccgtttg cagccacagt tccggctacg tgtgtgccat 2040 ggtcagttgc ctcgcccctc ggatcgccgg ttggtgtttc ttttggatcg taatcattgt 2100 ccacaaaatc gtatccttta tattgtccaa agtttttctt cagatctggg tgatt'gtatt 2160 caaccccagt gtcaataatc gccaccttga tgccttttcc tgtgtagcct aaatcccatg 2220 catcgtttgc tccgatataa ggcgcactgt catccatttg cggagatacg gcgtcttcgg 2280 agattgtggg gaattctcat gtttgacagc ttatcatgca atagttaccc ttattatcaa 2340 gataagaaag aaaaggattt ttcgctacgc tcaaatcctt taaaaaaaca caaaagacca 2400 cattttttaa tgtggtcttt attcttcaac taaagcaccc attagttcaa caaacgaaaa 2460 ttggataaag -tgggatattt :-ttaaaatata ±atttatgtt -acagtaatat 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atggggaagg ccatccagcc 6720 tcgcg 6725 <210> 23 <211> 6806 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: vector <220> <223> pAN637 <400> 23 tcggcggccg cttcgtcgac cgaaacagca gttataaggc atgaagctgt ccggtttttg 60 caaaagtggc tgtgactgta aaaagaaatc gaaaaagacc gttttgtgtg aaaacggtct 120 ttttgtttcc ttttaaccaa ctgccataac tcgaggccta cctagcttcc aagaaagata 180 tcctaacagc acaagagcgg aaagatgttt tgttctacat ccagaacaac ctctgctaaa 240 attcctgaaa aattttgcaa aaagttgttg actttatcta caaggtgtgg tataataatc 300 ttaacaacag caggacgctc tagacaattg agatcttaag aaaggaggtg ttaattaatg 360 aagattggaa tcattggcgg aggctccgtt ggtcttttat gcgcctatta tttgtcactt 420 tatcacgacg tgactgttgt gacgaggcgg caagaacagg ctgcggccat tcagtctgaa 480 ggaatccggc tttataaagg cggggaggaa ttcagggctg attgcagtgc ggacacgagt 540 atcaattcgg actttgacct gcttgtcgtg acagtgaagc agcatcagct tcaatcfcgtt 600 ttttcgtcgc ttgaacgaat cgggaagacg aatatattat ttttgcaaaa cggcatgggg 660 catatccacg acctaaaaga ctggcacgtt ggccattcca tttatgttgg aatcgttgag 720 cacggagctg taagaaaatc ggatacagct gttgatcata caggcctagg tgcgataaaa 780 tggagcgcgt tcgacgatgc tgaaccagac cggctgaaca tcttgtttca gcataaccat 840 tcggattttc cgatttatta tgagacggat tggtaccgtc tgctgacggg caagctgatt 900 gtaaatgcgt gtattaatcc tttaactgcg ttattgcaag tgaaaaatgg agaactgctg 960 acaacgccag cttatctggc ttttatgaag ctggtatttc aggaggcatg ccgcatttta 1020 aaacttgaaa atgaagaaaa ggcttgggag cgggttcagg ccgtttgtgg gcaaacgaaa 1080 gagaatcgtt catcaatgct ggttgacgtc attggaggcc ggcagacgga agctgacgcc 1140 attatcggat acttattgaa ggaagcaagt cttcaaggtc ttgatgccgt ccacctagag 1200 tttttatatg gcagcatcaa agcattggag cgaaatacca acaaagtggt ttactaagga 1260 tcctgttttg gcggatgaga gaagattttc agcctgatac agattaaatc agaacgcaga 1320 agcggtctga taaaacagaa tttgcctggc ggcagtagcg cggtggtccc acctgacccc 1380 atgccgaact cagaagtgaa acgccgtagc gccgatggta gtgtggggtc tccccatgcg 1440 agagtaggga actgccaggc atcaaataaa acgaaaggct cagtcgaaag actgggcctt 1500 tcgttttatc tgttgtttgt cggtgaacgc tctcctgagt aggacaaatc 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gattgctgta tctgaagaag aggcaaaagc tgtggaagga ttgaatgatt 2820 atctatctgt tgaagaagtg gagacgatct atattccgct tgttcgcttg cttcatttac 2880 atgtcaagtc tgcggctgaa cgcaataagc atgtcaatgt ttttttgaag cacccacatt 2940 cagccaaaat tccgtttatt atcgg.cattg ccggcagtgt cgcagtcgga aaaagcacga 3000 cggcgcggat cttgcagaag ctgctttcgc gtttgcctga ccgtccaaaa gtgagcctta 3060 tcacgacaga tggtttttta tttcctactg ccgagctgaa aaagaaaaat atgatgtcaa 3120 gaaaaggatt tcctgaaagc tatgatgtaa aggcgctgct cgaatttttg aatgacttaa 3180 aatcaggaaa ggacagcgta aaggccccgg tgtattccca tctaacctat gaccgcgagg 3240 aaggtgtgtt cgaggttgta gaacaggcgg atattgtgat tattgaaggc attaatgttc 3300 ttcagtcgcc caccttggag gatgaccggg aaaacccgcg tatttttgtt tccgatttct 3360 ttgatttttc gatttatgtg gatgcggagg aaagccggat tttcacttgg tatttagagc 3420 gttttcgcct gcttcgggaa acagcttttc aaaatcctga ttcatatttt cataaattta 3480 aagacttgtc cgatcaggag gctgacgaga tggcagcctc gatttgggag agtgtcaacc 3540 ggccgaattt atatgaaaat attttgccaa ctaaattcag gtcagatctc attttgcgta 3600 agggagacgg gcataaggtc gaggaagtgt tggtaaggag ggtatgaaat gtgctgcagc 3660 tcgagcaata gttaccctta ttatcaagat aagaaagaaa aggatttttc gctacgctca 3720 aatcctttaa aaaaacacaa aagaccacat tttttaatgt ggtctttatt cttcaactaa 3780 agcacccatt agttcaacaa acgaaaattg gataaagtgg gatattttta aaatatatat 3840 ttatgttaca gtaatattga cttttaaaaa aggattgatt ctaatgaaga aagcagacaa 3900 gtaagcctcc taaattcact ttagataaaa atttaggagg catatcaaat gaactttaat 3960 aaaattgatt tagacaattg gaagagaaaa gagatattta atcattattt gaaccaacaa 4020 acgactttta gtataaccac agaaattgat attagtgttt tataccgaaa cataaaacaa 4080 gaaggatata aattttaccc tgcatttatt ttcttagtga caagggtgat aaactcaaat 4140 acagctttta gaactggtta caatagcgac ggagagttag gttattggga taagttagag 4200 ccactttata caatttttga tggtgtatct aaaacattct ctggtatttg gactcctgta 4260 aagaatgact tcaaagagtt ttatgattta tacctttctg atgtagagaa atataatggt 4320 tcggggaaat tgtttcccaa aacacctata cctgaaaatg ctttttctct ttctattatt 4380 ccatggactt catttactgg gtttaactta aatatcaata ataatagtaa ttaccttcta 4440 cccattatta cagcaggaaa attcattaat aaaggtaatt caatatattt accgctatct 4500 ttacaggtac atcattctgt ttgtgatggt tatcatgcag gattgtttat gaactctatt 4560 caggaattgt cagataggcc taatgactgg cttttataat atgagataat gccgactgta 4620 ctttttacag tcggttttct aatgtcacta acctgccccg ttagttgaag aaggttttta 4680 tattacagct gtcgactcgt gatcttcgga caggctgttc agctttttct caatgcgatc 4740 cagctgcgct tttcggtttt tcgcatactt gaagcctgta acagccgcaa agacgacagc 4800 ggcaaatata ataaatacaa acagctgaaa catcacatca cctatattca tgttcttcac 4860 ctcatgtttg cgggagagat tcattctctt ccgtttttta tttaaagcgg cttttccaga 4920 cgggaacggt gttttgtggt ctccattttc atttgccgat aggcgaacgc taaaaatggc 4980 aggccgagca gggtaatgcc gctcaggaca gaaaaaatat aaatcggccg gccagcgcca 5040 aacaggtcta tacatatccc cccgacccaa gggccgatga cgtttccgag ctgtggaaaa 5100 ccgattgccc cgaaataagt gccttttaat cctggttttg caatctggtc tacatacaaa 5160 tccatcatag agaataaaag cacttcgccg attgtaaatg tgatgacaat catcacaatt 5220 gatggaacac cgtgtgatac ggtgaaaatg gccatgctga tgctaaccat cacattaccg 5280 agcatcagag aacaaagcgg cgaaaaccgt tttgcaaaat ggacaatggg aaattgcgtc 5340 gccaacacaa cgattgcgtt taatgtcagc atcagcccat acagcttcgt tccattgccg 5400 atcaaggggt tctgcgccat atactgaggg aatgtggaac tgaattgtga gtagccgaag 5460 gtgcatagcg taatgccgac caaagcaatg gtaaaaagat aatccttttg cgtgaccata 5520 aacgcttccc gcacgctcat atttcgggac tgggctggtg ctgataagga tggatgtttt 5580 ttaaattgga gggcaagcac aattccgtat agtccgtaaa tgactgcagg caccaaaaag 5640 ggcgtagtcg attgcgatga gccgaaatat aggccaagca caggtccgaa gacaacgccg 5700 atattaatag ccgcatagcg taaattaaaa actagcagtc tcgttttttc ttctgtcata 5760 tcagacaaca aggcctttga agcgggctca aacagtgatt tgcaaagacc gtttaatgcg 5820 tttactacaa aaaacaccca gagattagat gctgccgcaa agcctgcaaa taccagcatc 5880 catccgaaaa tcgatacaag catcatgttt tttctgccga atttatctga gatatatccg 5940 ccgtaaaagc ttgcgaggat gccgactgat gagctcgcgg cgatgaccag ccctgcatag 6000 gaagctgatg cgccttggac ggctgtcaaa taaatcgcta aaaaaggaat gctcatcgat 6060 gttgccattc tgccgaaaat ggttccgatt ataattgtac gcgttggatg catagcttga 6120 gtattctata gtgtcaccta aatagcttgg cgtaatcatg gtcatagctg tttcctgtgt 6180 gaaattgtta tccgctcaca attccacaca acatacgagc cggaagcata aagtgtaaag 6240 cctggggtgc ctaatgagtg agctaactca cattaattgc gttgcgctca ctgcccgctt 6300 tccagtcggg aaacctgtcg tgccagctgc attaatgaat cggccaacgc gcggggagag 6360 gcggtttgcg tattgggcgc tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg 6420 ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact caaaggcggt aatacggtta tccacagaat 6480 caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag .caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta 6540 aaaaggccgc gttgctggcg tttttcgata ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa 6600 atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac caggcgtttc 6660 cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt 6720 ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc tttctcatag ctcacgctgt aggtatctca 6780 gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg 6840 accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat 6900 cgccactggc agcagccact ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta 6960 cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg gctacactag aaggacagta tttggtatct 7020 gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac 7080 aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa 7140 aaggatctca agaagatcct ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa 7200 actcacgtta agggattttg gtcatgagat tatcaaaaag gatcttcacc tagatccttt 7260 taaattaaaa atgaagtttt aaatcaatct aaagtatata tgagtaaact tggtctgaca 7320 gttaccaatg cttaatcagt gaggcaccta tctcagcgat ctgtctattt cgttcatcca 7380 tagttgcctg actccccgtc gtgtagataa ctacgatacg ggagggctta ccatctggcc 7440 ccagtgctgc aatgataccg cgagacccac gctcaccggc tccagattta tcagcaataa 7500 accagccagc cggaagggcc gagcgcagaa gtggtcctgc aactttatcc gcctccatcc 7560 agtctattaa ttgttgccgg gaagctagag taagtagttc gccagttaat agtttgcgca 7620 acgttgttgg cattgctaca ggcatcgtgg tgtcacgctc gtcgtttggt atggcttcat 7680 tcagctccgg ttcccaacga tcaaggcgag ttacatgatc ccccatgttg tgcaaaaaag 7740 cggttagctc cttcggtcct ccgatcgttg tcagaagtaa gttggccgca gtgttatcac 7800 tcatggttat ggcagcactg cataattctc ttactgtcat gccatccgta agatgctttt 7860 ctgtgactgg tgagtactca accaagtcat tctgagaata ccgcgcccgg cgaccgagtt 7920 gctcttgccc ggcgtcaata cgggataata gtgtatgaca tagcagaact ttaaaagtgc 7980 tcatcattgg aaaacgttct ~tcggggcgaa aactctcaag gatcttaccg ctgttgagat 8040 ccagttcgat gtaacccact cgtgcaccca actgatcttc agcatctttt actttcacca 8100 gcgtttctgg gtgagcaaaa acaggaaggc aaaatgccgc aaaaaaggga ataagggcga 8160 cacggaaatg ttgaatactc atactcttcc tttttcaata ttattgaagc atttatcagg 8220 gttattgtct catgagcgga tacatatttg aatgtattta gaaaaataaa caaatagggg 8280 ttccgcgcac atttccccga aaagtgccac ctgtatgcgg tgtgaaatac cgcacagatg 8340 cgtaaggaga aaataccgca tcaggcgaaa ttgtaaacgt taatattttg ttaaaattcg 8400 cgttaaatat ttgttaaatc agctcatttt ttaaccaata ggccgaaatc ggcaaaatcc 8460 cttataaatc aaaagaatag accgagatag ggttgagtgt tgttccagtt tggaacaaga 8520 gtccactatt aaagaacgtg gactccaacg tcaaagggcg aaaaaccgtc tatcagggcg 8580 atggcccact acgtgaacca tcacccaaat caagtttttt gcggtcgagg tgccgtaaag 8640 ctctaaatcg gaaccctaaa gggagccccc gatttagagc ttgacgggga aagccggcga 8700 acgtggcgag aaaggaaggg aagaaagcga aaggagcggg cgctagggcg ctggcaagtg 8760 tagcggtcac gctgcgcgta accaccacac ccgccgcgct taa 8803

Claims (55)

1. R E I V I N D I C A C I O N E S 1. ün proceso para la producción de una composición de pantotenato libre de HMBPA, que comprende el cultivo de un microorganismo que tiene una via biosintética de pantotenato desregulada bajo condiciones tales que se produzca una composición de pantotenato libre de HMBPA.
2. 2. El proceso de conformidad con la reivindicación 1, en donde dicho microorganismo tiene por lo menos dos enzimas biosintéticas de pantotenato desreguladas.
3. 3. El proceso de conformidad con la reivindicación 1, en donde dicho microorganismo tiene por lo menos tres enzimas biosintéticas de pantotenato desreguladas.
4. 4. El proceso de conformidad con la reivindicación 1, en donde dicho microorganismo tiene por lo menos cuatro enzimas biosintéticas de pantotenato desreguladas .
5. 5. El proceso de conformidad con la reivindicación 4, en donde dicho microorganismo tiene una quetopantoato hidroximetiltransferasa desregulada, una quetopantoato reductasa desregulada, una pantotenato sintetasa desregulada y una aspartato-a-decarboxilasa desregulad .
6. 6. El proceso de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde dicho microorganismo tiene además una via biosintética de isoleucina-valina (iJv) desregulada. ;
7. 7. El proceso de conformidad con la reivindicación 6, en donde dicho microorganismo tiene por lo menos dos enzimas biosintéticas de isoleucina-valina (ilv) desreguladas.
8. 8. El proceso de conformidad con la reivindicación 6, en donde dicho microorganismo tiene por lo menos tres enzimas biosintéticas de isoleucina-valina {ilv) desreguladas.
9. 9. El proceso de conformidad con la reivindicación 8, en donde dicho microorganismo tiene una acetohidroxiácido sintetasa desregulada, una acetohidroxiácido isomeroreductasa desregulada, y una dihidroxiácido deshidratasa desregulada.
10. 10. Un proceso para la producción de una composición de pantotenato libre de HMBPA, que comprende el cultivo de un microorganismo que tiene una vía biosintética de pantotenato desregulada y una via biosintética de isoleucina-valina (ilv) desregulada, dicho microorganismo tiene una actividad PanB regulada de tal manera que se produzca una composición de pantotenato libre de HMBPA.
11. 11. Un proceso para la producción de una composición de pantotenato libre de HMBPA, que comprende el cultivo de un microorganismo que tiene una via biosintética de pantotenato desregulada y una via biosintética de isoleucina-valina (iJv) desregulada, dicho microorganismo tiene una actividad PanEl regulada de tal manera que se produzca una composición de pantotenato libre de HMBPA.
12. 12. Un proceso para la producción de una composición de pantotenato libre de HMBPA, que comprende el cultivo de un microorganismo que tiene una via biosintética de pantotenato desregulada y una via biosintética de isoleucina-valina (ilv) desregulada, dicho microorganismo tiene una actividad PanE2 regulada de tal manera que se produzca una composición de pantotenato libre de HMBPA.
13. 13. Un proceso para la producción de una composición de pantotenato libre de HMBPA, que comprende el cultivo de un microorganismo que tiene una via biosintética de pantotenato desregulada y una via biosintética de isoleucina-valina (ilv) desregulada, dicho microorganismo tiene una actividad IlvC regulada de tal manera que se produzca una composición de pantotenato libre de HMBPA.
14. 14. Un proceso para la producción de una composición de pantotenato libre de HMBPA que comprende el cultivo de un microorganismo que tiene una via biosintética de pantotenato desregulada* y una via biosintética de isoleucina-valina (ilv) desregulada, dicho microorganismo tiene actividades PanB y PanEl reguladas de tal manera que se produzca una composición de pantotenato libre de HMBPA.
15. 15. Un proceso para la producción de una composición de pantotenato libre de HMBPA que ': comprende el cultivo de un microorganismo que tiene una via biosintética de pantotenato desregulada y una via biosintética de isoleucina-valina (ilv) desregulada, dicho microorganismo tiene actividades PanB y PanE2 reguladas de tal manera que se produzca una composición de pantotenato libre de HMBPA.
16. 16. Un proceso para la producción de' una composición de pantotenato libre de HMBPA que comprende el cultivo de un microorganismo que tiene una via biosintética de pantotenato desregulada y una via biosintética de isoleucina-valina (ilv) desregulada, dicho microorganismo tiene actividades IlvC reguladas de tal manera que se produzca una composición de pantotenato libre de HMBPA.
17. 17. El proceso de cualesquiera de las reivindicaciones 10, 14, 15 y 16, en donde la actividad panB es incrementada por sobre-expresión de panB.
18. 18. El proceso de cualesquiera de las reivindicaciones 10, 14, 15 y 16, en donde la actividad PanB es incrementada por expresión de copias múltiples del gen panB.
19. 19. El proceso de cualesquiera de ' las reivindicaciones 10, 14, 15 y 16, en donde la actividad PanB es incrementada por disminución de la inhibición de retroalimentación de PanB.
20. 20. El proceso de cualesquiera de las reivindicaciones 10, 14, 15 y 16, en donde la actividad PanB es incrementada por la regulación de la actividad pantotenato qiiinasa .
21. 21. El proceso de conformidad con la reivindicación 20, en donde la actividad pantotenato quinasa es disminuida.
22. 22. El proceso de conformidad con la reivindicación 21, con deleción de CoaA y regulación descendente de CoaX.
23. 23. El proceso de conformidad con la reivindicación 21, con deleción de CoaX y regulación descendente de CoaA.
24. 24. El proceso de conformidad con la reivindicación 21, en donde CoaX y CoA son regulados de manera descendente .
25. 25. El proceso de conformidad con las reivindicaciones 10, 14 ó 15, en donde la actividad PanE es disminuida por deleción del gen panE2.
26. 26. El proceso de conformidad con. las reivindicaciones 10, 14 o 15, en donde la actividad PanE es disminuida por la regulación de la expresión del gen panE.
27. 27. El proceso de conformidad con - la reivindicación 13 o de conformidad con la reivindicación 15, en donde la actividad IlvC es disminuida por la regulación de la expresión del gen ilvC.
28. 28. El proceso de cualesquiera de las reivindicaciones antes mencionada en donde dicho microorganismo es cultivado bajo condiciones de glucosa de estado de equilibrio reducido.
29. 29. El proceso de cualesquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho microorganismo es cultivado bajo condiciones de oxigeno disuelto de estado de equilibrio incrementado.
30. 30. El proceso de cualesquiera de las reivindicaciones antes mencionadas, en donde dicho microorganismo es cultivado bajo condiciones de exceso de serina .
31. 31. El proceso de cualesquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho microorganismo tiene la vía biosintética de pantotenato desregulada de tal manera que la producción de pantotenato sea independiente de la alimentación de ß-alanina.
32. 32. El proceso de cualesquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho microorganismo sobre-expresa el gen panD de tal manera que la producción de pantotenato sea independiente de la alimentación de ß-alanina.
33. 33. El proceso de cualesquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el microorganismo pertenece al género Bacíllus
34. 34. El proceso de cualesquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el microorganismo es Bacillus subtilis.
35. 35. Un producto sintetizado de conformidad con el proceso de cualesquiera de las reivindicaciones anteriores.
36. 36. Una composición de pantotenato libre de HMBPA sintetizada de conformidad con el proceso de cualesquiera de las reivindicaciones anteriores.
37. 37. Una composición sintetizada por un microorganismo que tiene una via biosintética de pantotenato desregulada, en donde dicha composición comprende pantotenato y es esencialmente libre de HMBPA.
38. 38. Un microorganismo recombinante para la producción de composiciones de pantotenato libres de HMBPA, dicho microorganismo tiene una via biosintética de pantotenato desregulada, una via de isoleucina-valina desregulada (ilv) y tiene PanB o PanEl selectivamente regulado.
39. 39. Un microorganismo recombinante para la producción de composiciones de pantotenato libres de HMBPA, dicho microorganismo tiene una vía biosintética de pantotenato desregulada, una vía de isoleucina-valina desregulada (ilv), y tiene PanB y PanEl selectivamente reguladas.
40. 40. Un microorganismo recombinante para la producción de composiciones de pantotenato libres de HMBPA, dicho microorganismo tiene una vía biosintética de pantotenato \ desregulada, una vía de isoleucina-valina desregulada (ilv) y tiene panB o PanE2 selectivamente reguladas . ;
41. 41. Un microorganismo recombinante para la producción de composiciones de pantotenato libres de HMBPA, dicho microorganismo tiene una via biosintétic'a de pantotenato desregulada, una via de isoleucina-valina (ilv) desregulada, y tiene panB y PanE2 selectivamente reguladas.
42. 42. Un microorganismo recombinante para la producción de composiciones de pantotenato libres de HMBPA, dicho microorganismo tiene una via biosintética de pantotenato desregulada, una via de isoleucina-valina (iJv) desregulada, y tiene deleción de panEl, deleción de panE2 y sobre-expresión de IlvC.
43. 43. El microorganismo de cualesquiera de las reivindicaciones 38-42 que pertenece al género Bacillus .
44. 44. El microorganismo de cualesquiera de las reivindicaciones 38-42, que es Bacillus subtilis .
45. 45. Un proceso para la producción de una composición de pantotenato : HMBPA selectivamente mezclada, que comprende el cultivo de un microorganismo que tiene una via biosintética de pantotenato desregulada bajo condiciones tales que se produzca una composición selectivamente mezclada de pantotenato : HMBPA.
46. 46. El proceso de conformidad con la reivindicación 45, en donde el microorganismo es cultivo bajo condiciones que favorecen la producción de pantotenato.
47. 47. El proceso de conformidad con la reivindicación 45, en donde el microorganismo es cultivado bajo condiciones que favorecen la producción de HMBPA.
48. 48. El proceso de conformidad con la reivindicación 45 o 46, en donde el microorganismo es cultivado bajo condiciones de glucosa de estado de equilibrio controlado que favorecen la producción de pantotenato.
49. 49. El proceso de conformidad con la reivindicación 45 o de conformidad con la reivindicación 47, en donde el microorganismo es cultivado bajo condiciones de glucosa de estado de equilibrio controlado que favorecen la producción de HMBPA.
50. 50. El proceso de conformidad con la reivindicación 45 o 46, en donde el microorganismo es cultivado bajo condiciones de oxigeno disuelto de estado de equilibrio controlado que favorecen la producción de pantotenato .
51. 51. El proceso de conformidad con. la reivindicación 45 o 47, en donde el microorganismo se cultiva bajo condiciones de oxigeno disuelto de estado de equilibrio controlado que favorece la producción de HMBPA.
52. 52. El proceso de conformidad con la reivindicación 45 o 46, en donde el microorganismo es cultivado bajo condiciones de niveles controlados de serina que favorecen la producción de pantotenato. :
53. 53. El proceso de conformidad con la reivindicación 45 o 46, en donde el microorganismo tiene modificaciones que favorecen la producción de pantotenato.
54. 54. El proceso de conformidad con la reivindicación 45 o 47, en donde el microorganismo tiene modificaciones que favorecen la producción de HMBPA.
55. 55. Un producto producido a través del proceso de cualesquiera de las reivindicaciones 45-54.