CN112226451A - 枯草芽孢杆菌表达***及其生产α-L-AFs的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种枯草芽孢杆菌表达***及其生产α‑L‑AFs的方法。通过在枯草芽孢杆菌基因组的aprE位点***木糖诱导的T7 RNA聚合酶表达***，建立所述枯草芽孢杆菌表达***。利用枯草芽孢杆菌表达***生产α‑L‑***呋喃糖苷酶的方法为：合成序列如SEQ ID NO:2所示的质粒pMK4‑T7，在质粒pMK4‑T7中***α‑L‑***呋喃糖苷酶的编码基因，得到表达质粒pMK4‑T7‑arbf；将表达质粒pMK4‑T7‑arbf转化至权利要求1所述的枯草芽孢杆菌表达***得到枯草芽孢杆菌T7‑arbf；所述枯草芽孢杆菌T7‑arbf进行发酵培养分泌生产α‑L‑***呋喃糖苷酶。本发明能够以廉价的麸皮为诱导物高效表达蛋白；在发酵实验中，α‑L‑***呋喃糖苷酶的最高酶活可以达到194.8±4.1U/mL。

Description

枯草芽孢杆菌表达***及其生产α-L-AFs的方法

技术领域

本发明属于枯草芽孢杆菌表达***构建技术领域，具体涉及一种枯草芽孢杆菌表达***及其生产α-L-***呋喃糖苷酶的方法。

背景技术

作为GRAS(Generally Recognised As Safe)菌种，枯草芽孢杆菌作为底盘细胞被广泛应用于生物工程中，尤其可以用于表达生产食品相关的酶类。尽管如此，枯草芽孢杆菌中的启动子工具仍然有限。应用最广泛的启动子是P43。近年来陆续报道了几种新型启动子，但它们的效率仍比不上T7表达***中的T7启动子。T7启动子最早被用于大肠杆菌中，在T7 RNA聚合酶的作用下，能够非常高效地起始转录其下游的DNA序列。近年来有文献报道T7表达***可以在芽孢杆菌中发挥作用，但在枯草芽孢杆菌ATCC 6051a中还未见报道。枯草芽孢杆菌ATCC 6051a又称A164菌株，与实验室研究使用的枯草芽孢杆菌模式菌168及其衍生菌种相比，其分泌表达异源蛋白的效果更好，在含有蛋白胨的培养基中生长更快，具有更好的工业应用的潜力。

α-L-***呋喃糖苷酶(EC 3.2.1.55；α-L-arabinofuranosidases；α-L-AFs)可以特异性地作用于α-L-***呋喃糖苷、***木聚糖或***半乳聚糖，可以水解(1,3)和/或(1,5)-位键，修剪含有α-L-***糖基的侧链。α-L-AFs可应用于多种工业加工过程，如利用生物质生产糖或医药化合物、改善饮料风味、面包储存、动物饲料处理以及纸浆脱木素等。根据序列相似性和进化关系α-L-AFs可分为5个糖基水解酶家族(glycosylhydrolases families,GHs)，即GH3、GH43、GH51、GH54和GH62等。一些α-L-AFs在大肠杆菌、黑曲霉或毕赤酵母中已被鉴定和过表达，但尚未报道α-L-AFs在枯草芽孢杆菌中的分泌表达。

发明内容

本发明的目的是，提供一种枯草芽孢杆菌表达***及其生产α-L-***呋喃糖苷酶的方法。

本发明为实现上述目的所采用的技术方案如下：

本发明提供一种枯草芽孢杆菌表达***，通过在枯草芽孢杆菌基因组的aprE位点***木糖诱导的T7 RNA聚合酶表达***，建立所述枯草芽孢杆菌表达***。

作为优选实施方案，所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌164S，其通过在枯草芽孢杆菌ATCC 6051a的nprE位点整合一份拷贝的comk得到。

作为优选实施方案，所述T7 RNA聚合酶表达***的DNA序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明还提供所述枯草芽孢杆菌表达***在生物转化或表达酶蛋白中的应用。具体地，本发明提供了所述的枯草芽孢杆菌表达***在生产α-L-***呋喃糖苷酶中的应用。

本发明还提供所述枯草芽孢杆菌表达***生产α-L-***呋喃糖苷酶的方法，包括如下步骤：

步骤1，合成序列如SEQ ID NO:2所示的质粒pMK4-T7，在质粒pMK4-T7中***α-L-***呋喃糖苷酶的编码基因，得到表达质粒pMK4-T7-arbf；

步骤2，将表达质粒pMK4-T7-arbf转化至权利要求1所述的枯草芽孢杆菌表达***得到枯草芽孢杆菌T7-arbf；

步骤3，所述枯草芽孢杆菌T7-arbf进行发酵培养分泌生产α-L-***呋喃糖苷酶。

作为优选实施方案，所述步骤1中质粒pMK4-T7-arbf的DNA序列如SEQ ID NO:3所示。

作为优选实施方案，所述步骤1中α-L-***呋喃糖苷酶的氨基酸序列如SEQ IDNO:4所示。

作为优选实施方案，所述步骤3中枯草芽孢杆菌T7-arbf在木糖、木聚糖或麸皮诱导下，在LB培养基中进行发酵培养。

作为优选实施方案，所述枯草芽孢杆菌T7-arbf发酵培养的培养基为：LB培养基+3％(m/V)麸皮。

与现有的技术相比，本发明的有益效果为：

1，本发明的T7表达***不同于其它在芽孢杆菌应用的***，本发明利用GFP以及高效率的合成启动子P43作为对照，对基于T7启动子的外源蛋白的重组生产进行了验证。

2，本发明设计的T7表达***由于独特的基因组整合位点，宿主细胞的高转化效率，以及T7 RNA聚合酶的高表达效率，使其可以在枯草芽孢杆菌中高效地表达外源蛋白；能够以廉价的麸皮为诱导物高效表达蛋白，在发酵实验中，α-L-***呋喃糖苷酶的最高酶活可以达到194.8±4.1U/mL。

3，本发明的枯草芽孢杆菌表达***在蛋白表达、生物转化等方面具有良好的应用前景。

附图说明

图1为本发明重组枯草芽孢杆菌164T7P构建示意图。

图2为本发明质粒pMK4-T7的示意图。

图3为本发明实施例2木糖诱导的T7表达***和P43表达***分别表达GFP的结果数据示意图。

图4为本发明质粒pMK4-T7-arbf的示意图。

图5为本发明实施例3枯草芽孢杆菌T7-arbf表达的重组Arbf酶活随温度变化的曲线图。

图6为本发明实施例3枯草芽孢杆菌T7-arbf表达的重组Arbf酶活随pH变化的曲线图。

图7为本发明木糖与麸皮分别作为诱导物获得重组Arbf的表达结果比较图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案进行详细说明。实施例中未注明具体条件的操作，按照常规条件或制造商建议的条件进行。以下采用的试剂和生物材料如未特别说明，均为商业化产品。

以下各实施例中使用的生物材料来源如下：

枯草芽孢杆菌164S来自实验室保藏菌种，为枯草芽孢杆菌ATCC6051a(也称A164)的衍生菌：在枯草芽孢杆菌A164的nprE位点整合了一份拷贝的comk。枯草芽孢杆菌ATCC6051a为美国模式培养物收藏库(American type culture collection)的模式菌株，6051a为其收藏号，可从美国ATCC保藏中心购买获得。

大肠杆菌BL21(DE3)购自生工生物工程(上海)股份有限公司。pMK4-P43-gfp的构建方法来自文献“一种芽孢杆菌中性蛋白酶启动子的克隆和验证”(DOI：10.13386/j.issn1002-0306.2016.13.030)。pMK4-T7为合成质粒(序列如SEQ ID NO:2所示)，将T7启动子、多克隆位点以及T7终止子***pMK4的Pst I和Nde I位点。DNA合成及测序注释工作在生工生物工程(上海)股份有限公司完成。pMD19T为生工生物工程有限公司的克隆质粒。

实施例中使用的2×Phanta Master Mix(货号P511-01)、

II OneStep Cloning Kit(货号C115-01)购自南京诺唯赞生物科技有限公司；SDS-PAGE凝胶试剂盒购自生工生物工程(上海)股份有限公司，限制性内切酶购自TaKaRa；红霉素(货号E808819)、氯霉素(货号C804169)和D-木糖(货号D856756)购自上海麦克林生化科技有限公司，4-硝基苯基-α-L-呋喃***糖苷(pNPA，4-nitrophenylα-L-arabinofuranoside，货号6892-58-6)购自北京凯森莱医药科技有限公司。

实施例1：重组枯草芽孢杆菌164T7P的构建

枯草芽孢杆菌164T7P是在枯草芽孢杆菌164S的aprE位点整合T7RNA聚合酶表达序列。枯草芽孢杆菌164S的aprE位点是比较理想的整合位点，这是因为该基因表达碱性蛋白酶，对其进行替代整合可以减少宿主细胞对外源蛋白的降解。本发明将完整的含有T7 RNA聚合酶过表达序列(如SEQ ID NO:1所示)整合到此位点，同时敲除了该基因，然后通过消除红霉素抗性基因后得到164T7P，图1为重组枯草芽孢杆菌164T7P的构建示意图。枯草芽孢杆菌164T7P的具体构建方法如下：

(1)整合质粒pMD19T-T7P的构建

首先扩增T7 RNA聚合酶编码基因片段(T7RNAP)，使用引物对为F77-F(5’-atgaacacgattaacatcgctaagaacgac-3’)(如SEQ ID NO:5所示)/F77-R(5’-catgctgcagaaaagaagcaggtatggaggaacctgcttctttttactattacgcgaacg cgaagtccgactc-3’)(如SEQ IDNO:6所示)，使用模板为大肠杆菌BL21(DE3)基因组。然后扩增木糖启动子PxylA，使用引物对为Fxy-F(5’-atcgctgcagctaacttataggggtaacacttaaaaaagaatc-3’)(如SEQ ID NO:7所示)/Fxy-R(5’-gtcgttcttagcgatgttaatcgtgttcatattatggcctcctttggatcccatttc-3’)(如SEQ ID NO:8所示)，使用模板为枯草芽孢杆菌6051a的基因组DNA。

使用2×Phanta Master Mix扩增上述2个DNA片段(T7RNAP和PxylA)，PCR方法采用2×Phanta Master Mix的说明书方法。扩增的PCR产物使用Dpn I做消模板处理后，采用AxyPrep PCR清洁试剂盒进行DNA的清洁回收，最后所清洁的DNA片段通过Nanodrop测定浓度。

使用融合PCR的方法连接上述两个片段，融合PCR的方法如下：

第一步，PCR反应配置体系为10μL 2×Phanta Master Mix，2个片段各200ng，添加ddH₂O至体系为20μL。进行第一轮PCR反应，PCR反应条件为预变性95℃5min，然后变性95℃15S，退火60℃15S，延伸72℃3min，循环数10。

第二步，PCR反应配置体系为25μL 2×Phanta Master Mix，2.5μL引物Fxy-F(10μM)，2.5μL引物F77-R(10μM)，1μL第一轮PCR反应产物，19μL ddH₂O。PCR反应条件为预变性95℃5min，然后变性95℃15S，退火55℃15S，延伸72℃3min，循环数30。

经凝胶电泳检测，第二步PCR扩增出了2个片段融合产物，采用AxyPrep PCR清洁试剂盒进行DNA的清洁回收，通过Nanodrop测定浓度。采用

II One StepCloning Kit做连接构建，将PCR融合产物连接到pMD19T的XmaI和Kpn I位点，构建方法为试剂盒说明书方法。所构建的质粒经生工测序鉴定验证后，命名为pMD19T-T7P。

(2)pMD19T-T7P的转化及消抗

使用限制酶ApaL I处理质粒pMD19T-T7P使之线性化，然后将线性化的pMD19T-T7P转化到枯草芽孢杆菌164S，均匀涂布于含有10μg/mL红霉素的抗性平板，放置于37℃恒温箱过夜培养，对于所长出的单菌落，通过菌落PCR鉴定，阳性转化子即为转化成功的菌种。通过转化子中所带的Cre/lox***以及传代的方法进行消抗，所长出的转化子同时***到10μg/mL氯霉素抗性平板和10μg/mL红霉素抗性平板上，在两种抗性平板上均不能生长，且通过菌落PCR鉴定敲除红霉素抗性基因ermC的重组菌，为构建的枯草芽孢杆菌164T7P。

实施例2T7表达***表达GFP

(1)质粒pMK4-T7-gfp与枯草芽孢杆菌T7-GFP的构建

人工合成质粒pMK4-T7，参见图2，为质粒pMK4-T7的示意图。以限制内切酶BamH I和EcoR I酶切合成的质粒pMK4-T7，使其线性化，然后采用AxyPrep PCR清洁试剂盒进行DNA的清洁回收；同时扩增gfp，扩增gfp使用引物对为gfp-F(5’-gtttaactttaagaaaggaggatataccatgagtaaaggcgaagaacttttcac-3’)(如SEQ ID NO:9所示)/gfp-R(5’-gcttcctttcgggctttgttagcaggaattcttatttgtatagttcatccatgcc-3’)(如SEQ ID NO:10所示)，使用模板为质粒pMK4-P43-gfp，扩增产物通过限制内切酶Dpn I做消模板处理后采用AxyPrep PCR清洁试剂盒进行DNA的清洁回收；然后使用一种基于融合PCR的克隆技术构建质粒pMK4-T7-gfp，具体操作如下：

PCR反应体系：gfp片段200ng，线性化质粒pMK4-T7 500ng，2×Phanta MasterMix25μL，添加ddH₂O至反应体系为50μL。PCR反应条件为预变性95℃5min，然后变性95℃15S，退火55℃15S，延伸72℃4min，循环数30。

最后取10μLPCR反应产物转化枯草芽孢杆菌164T7P，孵育后均匀涂布于含有10μg/mL氯霉素的抗性平板，放置于37℃恒温箱过夜培养，对于所长出的单菌落，通过菌落PCR鉴定，阳性转化子即为转化成功的菌种，随机挑取单克隆提取质粒，交由生工生物公司测序，鉴定完全正确的质粒即为质粒pMK4-T7-gfp，所对应的重组菌命名为枯草芽孢杆菌T7-GFP。

(2)枯草芽孢杆菌P43-GFP的构建

取10μL质粒pMK4-P43-gfp转化枯草芽孢杆菌164T7P，孵育后均匀涂布于含有10μg/mL氯霉素的抗性平板，放置于37℃恒温箱过夜培养，对于所长出的单菌落，通过菌落PCR鉴定，阳性转化子即为转化成功的菌种，命名为枯草芽孢杆菌P43-GFP。

(3)枯草芽孢杆菌发酵表达GFP的测定

除非特殊说明，以下培养基中均含有10μg/mL氯霉素。使用枯草芽孢杆菌T7-GFP和P43-GFP做摇瓶发酵实验：首先挑取单克隆到装有3mL LB培养基(配方为10g/L蛋白胨，10g/LNaCl，5g/L酵母粉)的试管中，200rpm，37℃在恒温摇床过夜培养；然后取300μL的培养物转接到装有30mL LB培养基的250mL摇瓶中，200rpm，37℃在恒温摇床培养；待生长～4h或OD₆₀₀到1左右，向培养基中添加终浓度为1％(m/V)的木糖诱导；每隔12h取一次样，使用酶标仪测定OD₆₀₀和荧光强度。

实验结果见附图3，为木糖诱导的T7表达***和P43表达***分别表达GFP的数据比较图。图3结果表明：T7表达***在枯草芽孢杆菌中比启动子P43的效率要高10倍以上，具有很大的应用潜力。

实施例3以木糖为诱导物表达α-L-***呋喃糖苷酶

(1)质粒pMK4-T7-arbf与枯草芽孢杆菌T7-Arbf的构建

arbf编码一种细菌型的耐温，其序列是利用利用生物信息学工具通过序列比对分析获得的，氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，然后通过基因合成获取。在基因外源表达之前，对该序列是否具有的功能并不十分确定。通过全基因组测序及注释，找到了其中的基因arbf，推测其能。

以化学合成的编码α-L-***呋喃糖苷酶的DNA为模板，进行了线性DNA的PCR扩增，所f使用引物分别为arbf-F(5’-taattttgtttaactttaagaaaggaggatataccatgactgtacacaaagcgaagatg-3’)(如SEQ ID NO:11所示)/arbf-R，以及arbf-R(5’-gccaactcagcttcctttcgggctttgttagcaggaattcttattgtttcttcattctgatcacattcc-3’)(如SEQ ID NO:12所示)，扩增产物通过限制内切酶Dpn I做消模板处理后采用AxyPrep PCR清洁试剂盒进行DNA的清洁回收。再线性化质粒pMK4-T7与基因arbf的DNA片段，通过融合PCR的克隆技术构建质粒pMK4-T7-arbf，具体操作与实施例2中的方法相同。参见图4，为质粒pMK4-T7-arbf的示意图。

取10μL质粒pMK4-T7-arbf转化枯草芽孢杆菌164T7P，孵育后均匀涂布于含有10μg/mL氯霉素的抗性平板，放置于37℃恒温箱过夜培养，对于所长出的单菌落，通过菌落PCR鉴定，阳性转化子即为转化成功的菌种，命名为枯草芽孢杆菌T7-Arbf。

(2)枯草芽孢杆菌T7-Arbf的发酵实验

除非特殊说明，以下培养基中均含有10μg/mL氯霉素。使用枯草芽孢杆菌T7-Arbf做摇瓶发酵实验：首先挑取单克隆到装有3mL LB培养基的试管中，200rpm，37℃在恒温摇床过夜培养；然后取300μL的培养物转接到装有30mL LB培养基的250mL摇瓶中，200rpm，37℃在恒温摇床培养；待生长～4h或OD₆₀₀到1左右，向培养基中添加终浓度为1％(m/V)的木糖诱导；每隔12h取一次样，测定OD₆₀₀及α-L-***呋喃糖苷酶的活性及表征。

α-L-***呋喃糖苷酶活性的测定方法：α-L-***呋喃糖苷酶每水解一分子pNPA(4-nitrophenylα-L-arabinofuranoside)产生一分子对硝基苯酚(4-nitrophenol)，每分钟水解底物产生1μmol对硝基苯酚所需的酶量定义为1个活力单位。通过测定产物的生成计算酶活。首先取50μl的pNPA溶液，加入100μl经稀释的酶液，40℃水浴孵育5min；然后加入150μl的10％Na₂CO₃溶液终止反应，410nm处测定吸光值(注：酶的稀释倍数以控制最终测定OD₄₁₀在0.2～0.8之间为准)。测定重组Arbf酶的温度和pH曲线，所采用的的温度区间为25～65℃，pH区间为3.5～9.0。同时测定重组Arbf酶学特征参数。

发酵结果显示：重组Arbf酶可以分泌到细胞外，参见图5和图6，分别为表达的重组Arbf酶活随温度以及pH变化的曲线图。根据图5和图6可知：其最适温度为45℃，最适pH为6.5。重组Arbf酶的Km值为1.4±0.1mM，kcat为139.4s^-1。在木糖的诱导下，在LB培养基中，枯草芽孢杆菌T7-Arbf发酵表达的重组α-L-***呋喃糖苷酶，其最高酶活性为141.4±4.8U/mL。

实施例4以麸皮为诱导物表达α-L-***呋喃糖苷酶

麸皮为小麦加工的副产物，富含***木聚糖。通过实验发现：枯草芽孢杆菌可以通过本身的XynA和XynC，水解出麸皮中的木糖残基。本部分与实施例3发酵方法的区别仅在于把诱导物木糖替换成廉价的麸皮，其他方法步骤均相同。具体发酵方法如下：

除非特殊说明，以下培养基中均含有10μg/mL氯霉素。使用枯草芽孢杆菌T7-Arbf做摇瓶发酵实验：首先挑取单克隆到装有3mL LB培养基的试管中，200rpm，37℃在恒温摇床过夜培养；然后取300μL的培养物转接到装有30mL LB+3％麸皮(m/V)培养基的250mL摇瓶中，200rpm，37℃在恒温摇床培养每隔12h取一次样，测定OD₆₀₀及α-L-***呋喃糖苷酶的活性及表征。

参见图7，为木糖与麸皮分别作为诱导物获得重组Arbf的表达结果比较图。木糖作为诱导物时，在LB培养基中，枯草芽孢杆菌T7-Arbf发酵表达的Arbf酶，其最高酶活为141.4±4.8U/mL。麸皮作为诱导物时，发酵表达的Arbf酶最高酶活为194.8±4.1U/mL，是用木糖作为诱导物的1.4倍。

上述仅为本发明的部分优选实施例，本发明并不仅限于实施例的内容。对于本领域中的技术人员来说，在本发明技术方案的构思范围内可以有各种变化和更改，所作的任何变化和更改，均在本发明保护范围之内。

序列表

<110> 中国科学院上海高等研究院

<120> 枯草芽孢杆菌表达***及其生产α-L-AFs的方法

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 6647

<212> DNA

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 1

caaatgcgct gaatgcctat gttacaggaa ttggggccaa taaacggatt gtattgtggg 60

atacgacgct gaacaaactt gacgattcag aaattctgtt tattatgggc cacgaaatgg 120

gccattatgt catgaagcac gtttacatcg gtctggctgg ctatttgctc gtgtcgctcg 180

ccggatttta tgtcattgat aagctttaca agcggacggt tcgcctaacc cgcagcatgt 240

ttcatttaga agggcggcat gatcttgcgg cacttccgct gttattgctt ttgttttctg 300

ttttgagctt tgcggttacg cctttttcta atgctgtctc gcgttatcag gagaataagg 360

ctgaccagta tgggatcgag ttgacagaga acagagaagc cgctgttaaa acgtttcagg 420

atttggccgt gacggggctg agccaggttg atcctccggt gcttgtgaag attttcagag 480

gcagccatcc gtcgatcatg gaacggattc aacatgcgga gaaagaagag aatgcgccgg 540

aacatcagga tgctgacaaa taaaaagaag caggtatgga ggaacctgct tctttttact 600

attattgtgc agctgcttgc ctgcactgca gggatccaag cttgcggccg ctaccgttcg 660

tatagcatac attatacgaa gttatttaaa ccgtgtgctc tacgaccaaa actataaaac 720

ctttaagaac tttctttttt tacaagaaaa aagaaattag ataaatctct catatctttt 780

attcaataat cgcatccgat tgcagtataa atttaacgat cactcatcat gttcatattt 840

atcagagctc gtgctataat tatactaatt ttataaggag gaaaaaatat gggcattttt 900

agtatttttg taatcagcac agttcattat caaccaaaca aaaaataagt ggttataatg 960

aatcgttaat aagcaaaatt catataacca aattaaggag ggaaataatg aacgagaaaa 1020

atataaaaca cagtcaaaac tttattactt caaaacataa tatagataaa ataatgacaa 1080

atataagatt aaatgaacat gataatatct ttgaaatcgg ctcaggaaaa ggccatttta 1140

cccttgaatt agtaaagagg tgtaatttcg taactgccat tgaaatagac cataaattat 1200

gcaaaactac agaaaataaa cttgttgatc acgataattt ccaagtttta aacaaggata 1260

tattgcagtt taaatttcct aaaaaccaat cctataaaat atatggtaat ataccttata 1320

acataagtac ggatataata cgcaaaattg tttttgatag tatagctaat gagatttatt 1380

taatcgtgga atacgggttt gctaaaagat tattaaatac aaaacgctca ttggcattac 1440

ttttaatggc agaagttgat atttctatat taagtatggt tccaagagaa tattttcatc 1500

ctaaacctaa agtgaatagc tcacttatca gattaagtag aaaaaaatca agaatatcac 1560

acaaagataa acaaaagtat aattatttcg ttatgaaatg ggttaacaaa gaatacaaga 1620

aaatatttac aaaaaatcaa tttaacaatt ccttaaaaca tgcaggaatt gacgatttaa 1680

acaatattag ctttgaacaa ttcttatctc ttttcaatag ctataaatta tttaataagt 1740

aagttaaggg atgcataaac tgcatccctt aacttgtttt tcgtgtgcct attttttgtg 1800

aattgattat cgatcttttg cgccatggat aacttcgtat agcatacatt atacgaacgg 1860

tacatatgcc cgggctaact tataggggta acacttaaaa aagaatcaat aacgatagaa 1920

accgctccta aagcaggtgc attttttcct aacgaagaag gcaatagttc acatttattg 1980

tctaaatgag aatggactct agaagaaact tcgtttttaa tcgtatttaa aacaatggga 2040

tgagattcaa ttatatgatt tctcaagata acagcttcta tatcaaatgt attaaggata 2100

ttggttaatc caattccgat ataaaagcca aagttttgaa gtgcatttaa catttctaca 2160

tcatttttat ttgcgcgttc cacaatctct tttcgagaaa tattcttttc ttctttagag 2220

agcgaagcca gtaacgcttt ttcagaagca tataattccc aacagcctcg atttccacag 2280

ctgcatttgg gtccattaaa atctatcgtc atatgaccca tttccccaga aaaaccctga 2340

acacctttat acaattcgtt gttaataaca agtccagttc caattccgat attaatactg 2400

atgtaaacga tgttttcata gttttttgtc ataccaaata ctttttcacc gtatgctcct 2460

gcattagctt cattttcaac aaaaaccgga acattaaact cactctcaat taaaaactgc 2520

aaatctttga tattccaatt taagttaggc atgaaaataa tttgctgatg acgatctaca 2580

aggcctggaa cacaaattcc tattccgact agaccataag gggactcagg catatgggtt 2640

acaaaaccat gaataagtgc aaataaaatc tcttttactt cactagcgga agaactagac 2700

aagtcagaag tcttctcgag aataatattt ccttctaagt cggttagaat tccgttaaga 2760

tagtcgactc ctatatcaat accaatcgag tagcctgcat tcttattaaa aacaagcatt 2820

acaggtcttc tgccgcctct agattgccct gccccaattt caaaaataaa atctttttca 2880

agcagtgtat ttacttgaga ggagacagta gacttgttta atcctgtaat ctcagagaga 2940

gttgccctgg agacagggga gttcttcaaa atttcatcta atattaattt ttgattcatt 3000

ttttttacta aagcttgatc tgcaatttga ataataacca ctcctttgtt tatccaccga 3060

actaagttgg tgttttttga agcttgaatt agatatttaa aagtatcata tctaatatta 3120

taactaaatt ttctaaaaaa aacattgaaa taaacattta ttttgtatat gatgagataa 3180

agttagttta ttggataaac aaactaactc aattaagata gttgatggat aaacttgttc 3240

acttaaatca aagggggaaa tgacaaatgg tccaaactag tgatatctaa aaatcaaagg 3300

gggaaatggg atccaaagga ggccataata tgaacacgat taacatcgct aagaacgact 3360

tctctgacat cgaactggct gctatcccgt tcaacactct ggctgaccat tacggtgagc 3420

gtttagctcg cgaacagttg gcccttgagc atgagtctta cgagatgggt gaagcacgct 3480

tccgcaagat gtttgagcgt caacttaaag ctggtgaggt tgcggataac gctgccgcca 3540

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cataccaata acttaagggt aactagcctc gccggcaata gttaccctta ttatcaagat 5340

aagaaagaaa aggatttttc gctacgctca aatcctttaa aaaaacacaa aagaccacat 5400

tttttaatgt ggtcttttat tcttcaacta aagcacccat tagttcaaca aacgaaaatt 5460

ggataaagtg ggatattttt aaaatatata tttatgttac agtaatattg acttttaaaa 5520

aaggattgat tctaatgaag aaagcagaca agtaagcctc ctaaattcac tttagataaa 5580

aatttaggag gcatatcaaa tgaactttaa taaaattgat ttagacaatt ggaagagaaa 5640

agagatattt aatcattatt tgaaccaaca aacgactttt agtataacca cagaaattga 5700

tattagtgtt ttataccgaa acataaaaca agaaggatat aaattttacc ctgcatttat 5760

tttcttagtg acaagggtga taaactcaaa tacagctttt agaactggtt acaatagcga 5820

cggagagtta ggttattggg ataagttaga gccactttat acaatttttg atggtgtatc 5880

taaaacattc tctggtattt ggactcctgt aaagaatgac ttcaaagagt tttatgattt 5940

atacctttct gatgtagaga aatataatgg ttcggggaaa ttgtttccca aaacacctat 6000

acctgaaaat gctttttctc tttctattat tccatggact tcatttactg ggtttaactt 6060

aaatatcaat aataatagta attaccttct acccattatt acagcaggaa aattcattaa 6120

taaaggtaat tcaatatatt taccgctatc tttacaggta catcattctg tttgtgatgg 6180

ttatcatgca ggattgttta tgaactctat tcaggaattg tcagataggc ctaatgactg 6240

gcttttataa tatgagataa tgccgactgt actttttaca gtcggttttc taatgtcact 6300

aacctgcccc gttagttgaa gaaggttttt atattacagc tccagatcta ggtgaagatc 6360

ctttttgata atctcatgac caaaatccct taacgtgagt tttcgttcca ctgagcgtca 6420

gaccccgtag aaaagatcaa aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg cgtaatctgc 6480

tgcttgcaaa caaaaaaacc accgctacca gcggtggttt gtttgccgga tcaagagcta 6540

ccaactcttt ttccgaaggt aactggcttc agcagagcgc agataccaaa tactgttctt 6600

ctagtgtagc cgtagttagg ccaccacttc aagaactctg tagcaccgcc tacatacctc 6660

gctctgctaa tcctgttacc agtggctgct gccagtggcg ataagtcgtg tcttaccggg 6720

ttggactcaa gacgatagtt accggataag gcgcagcggt cgggctgaac ggggggttcg 6780

tgcacacagc ccagcttgga gcgaacgacc tacaccgaac tgagatacct acagcgtgag 6840

ctatgagaaa gcgccacgct tcccgaaggg agaaaggcgg acaggtatcc ggtaagcggc 6900

agggtcggaa caggagagcg cacgagggag cttccagggg gaaacgcctg gtatctttat 6960

agtcctgtcg ggtttcgcca cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg ctcgtcaggg 7020

gggcggagcc tatggaaaaa cgccagcaac gcggcctttt tacggttcct ggccttttgc 7080

tggccttttg ctcacatgtt ctttcctgcg ttatcccctg attctgtgga taaccgtatt 7140

accgcctttg agtgagctga taccgctcgc cgcagccgaa cgaccgagcg cagcgagtca 7200

gtgagcgagg aagcggaaga 7220

<210> 4

<211> 502

<212> PRT

<213> 地衣芽孢杆菌 (Bacillus licheniformis)

<400> 4

Met Thr Val His Lys Ala Lys Met Thr Ile Asp Lys Glu Tyr Lys Val

1 5 10 15

Ala Glu Ile Asp Lys Arg Ile Tyr Gly Ser Phe Ile Glu His Leu Gly

20 25 30

Arg Ala Val Tyr Glu Gly Ile Tyr Glu Pro Asp His Pro Glu Ala Asp

35 40 45

Glu Ser Gly Phe Arg Lys Asp Val Ile Lys Leu Val Arg Glu Leu Lys

50 55 60

Val Pro Phe Ile Arg Tyr Pro Gly Gly Asn Phe Val Ser Gly Tyr Asn

65 70 75 80

Trp Glu Asp Gly Val Gly Pro Val Glu Gln Arg Pro Thr Arg Leu Asp

85 90 95

Leu Ala Trp Ala Thr Thr Glu Pro Asn Leu Ile Gly Thr Asn Glu Phe

100 105 110

Met Asp Trp Ala Lys Leu Val Gly Ala Glu Val Asn Met Ala Val Asn

115 120 125

Leu Gly Thr Arg Gly Ile Asp Ala Ala Arg Asn Leu Val Glu Tyr Cys

130 135 140

Asn His Pro Ser Gly Ser Tyr Tyr Ser Asp Leu Arg Lys Ser His Gly

145 150 155 160

Tyr Lys Glu Pro His Lys Ile Lys Thr Trp Cys Leu Gly Asn Glu Met

165 170 175

Asp Gly Pro Trp Gln Ile Gly His Lys Thr Ala Ala Glu Tyr Gly Arg

180 185 190

Leu Ala Ala Glu Ala Ala Lys Val Met Lys Trp Thr Asp Pro Ser Ile

195 200 205

Glu Leu Val Ala Cys Gly Ser Ser Gly Ser Gly Met Pro Thr Phe Ile

210 215 220

Asp Trp Glu Thr Thr Val Leu Asp His Thr Tyr Glu His Val Glu Tyr

225 230 235 240

Ile Ser Leu His Ser Tyr Tyr Gly Asn Arg Asp Asn Asp Leu Pro Asn

245 250 255

Tyr Leu Ala Arg Ser Leu Asp Met Asp His Phe Ile Lys Thr Val Ile

260 265 270

Ser Val Cys Asp Tyr Met Lys Ala Lys Lys Lys Ser Lys Lys Thr Ile

275 280 285

His Leu Ser Tyr Asp Glu Trp Asn Val Trp Tyr His Ser Asn Glu Lys

290 295 300

Asp Lys Glu Ala Glu Arg Trp Ala Lys Ala Pro His Leu Leu Glu Asp

305 310 315 320

Ile Tyr Asn Phe Glu Asp Ala Leu Leu Val Gly Cys Met Leu Ile Thr

325 330 335

Met Leu Lys His Ala Asp Arg Val Lys Ile Ala Cys Leu Ala Gln Leu

340 345 350

Val Asn Val Ile Ala Pro Ile Met Thr Asp Lys Gly Gly Glu Ala Trp

355 360 365

Arg Gln Thr Ile Phe Tyr Pro Phe Met His Ala Ser Val Tyr Gly Arg

370 375 380

Gly Thr Val Leu Gln Thr Ala Val Ser Ser Pro Lys Tyr Asp Ala Lys

385 390 395 400

Asp Phe Thr Asp Val Pro Tyr Leu Glu Ser Val Ser Val Phe Asn Glu

405 410 415

Glu Ala Glu Glu Leu Thr Val Phe Ala Val Asn Arg Ala Thr Asp Ala

420 425 430

Gly Leu Glu Met Glu Ala Asp Met Arg Ser Phe Glu Gly Tyr Ser Val

435 440 445

Ser Glu His Ile Val Leu Glu His Glu Asp His Lys Ala Thr Asn Glu

450 455 460

Lys Asp Arg Asn Asn Val Val Pro His Ser Gly Gly Asp Ala Lys Val

465 470 475 480

Cys Asp Gly Arg Leu Thr Ala His Leu Pro Lys Leu Ser Trp Asn Val

485 490 495

Ile Arg Met Lys Lys Gln

500

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atgaacacga ttaacatcgc taagaacgac 30

<210> 6

<211> 73

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

catgctgcag aaaagaagca ggtatggagg aacctgcttc tttttactat tacgcgaacg 60

cgaagtccga ctc 73

<210> 7

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

atcgctgcag ctaacttata ggggtaacac ttaaaaaaga atc 43

<210> 8

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gtcgttctta gcgatgttaa tcgtgttcat attatggcct cctttggatc ccatttc 57

<210> 9

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gtttaacttt aagaaaggag gatataccat gagtaaaggc gaagaacttt tcac 54

<210> 10

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gcttcctttc gggctttgtt agcaggaatt cttatttgta tagttcatcc atgcc 55

<210> 11

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

taattttgtt taactttaag aaaggaggat ataccatgac tgtacacaaa gcgaagatg 59

<210> 12

<211> 69

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gccaactcag cttcctttcg ggctttgtta gcaggaattc ttattgtttc ttcattctga 60

tcacattcc 69

Claims (10)

1.一种枯草芽孢杆菌表达***，其特征在于：通过在枯草芽孢杆菌基因组的aprE位点***木糖诱导的T7 RNA聚合酶表达***，建立所述枯草芽孢杆菌表达***。

2.如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌表达***，其特征在于：所述枯草芽孢杆菌为来源于工业枯草芽孢杆菌ATCC 6051a的突变菌株164S，通过在6051a的nprE位点整合一份拷贝的comk表达框得到。

3.如权利要求1所述的工业生产菌株枯草芽孢杆菌164的表达***，其特征在于：所述T7 RNA聚合酶表达***的DNA序列如SEQ ID NO:1所示。

4.权利要求1-3任一项所述枯草芽孢杆菌表达***在生物转化或表达酶蛋白中的应用。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于：所述酶蛋白为α-L-***呋喃糖苷酶。

6.一种枯草芽孢杆菌表达***生产α-L-***呋喃糖苷酶的方法，包括如下步骤：

步骤1，合成序列如SEQ ID NO:2所示的质粒pMK4-T7，在质粒pMK4-T7中***α-L-***呋喃糖苷酶的编码基因，得到表达质粒pMK4-T7-arbf；

步骤2，将表达质粒pMK4-T7-arbf转化至权利要求1所述的枯草芽孢杆菌表达***得到枯草芽孢杆菌T7-arbf；

步骤3，所述枯草芽孢杆菌T7-arbf进行发酵培养分泌生产α-L-***呋喃糖苷酶。

7.如权利要求6所述的枯草芽孢杆菌表达***生产α-L-***呋喃糖苷酶的方法，其特征在于：所述步骤1中质粒pMK4-T7-arbf的DNA序列如SEQ ID NO:3所示。

8.如权利要求6所述的枯草芽孢杆菌表达***生产α-L-***呋喃糖苷酶的方法，其特征在于：所述步骤1中α-L-***呋喃糖苷酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。

9.如权利要求6所述的枯草芽孢杆菌表达***生产α-L-***呋喃糖苷酶的方法，其特征在于：所述步骤3中枯草芽孢杆菌T7-arbf在木糖、木聚糖或麸皮诱导下，在LB培养基中进行发酵培养。

10.如权利要求6所述的枯草芽孢杆菌表达***生产α-L-***呋喃糖苷酶的方法，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌T7-arbf发酵培养的培养基为：LB培养基+3％(m/V)麸皮。

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