HU230549B1 - Javított eljárások pantotenát előállítására - Google Patents
Javított eljárások pantotenát előállítására Download PDFInfo
- Publication number
- HU230549B1 HU230549B1 HU0302798A HUP0302798A HU230549B1 HU 230549 B1 HU230549 B1 HU 230549B1 HU 0302798 A HU0302798 A HU 0302798A HU P0302798 A HUP0302798 A HU P0302798A HU 230549 B1 HU230549 B1 HU 230549B1
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- pantothenate
- hmbpa
- gene
- microorganism
- production
- Prior art date
Links
- GHOKWGTUZJEAQD-ZETCQYMHSA-N (D)-(+)-Pantothenic acid Chemical compound OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(O)=O GHOKWGTUZJEAQD-ZETCQYMHSA-N 0.000 title claims description 255
- 235000019161 pantothenic acid Nutrition 0.000 title claims description 249
- 239000011713 pantothenic acid Substances 0.000 title claims description 249
- 229940014662 pantothenate Drugs 0.000 title claims description 245
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 43
- 230000008569 process Effects 0.000 title claims description 26
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title description 113
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 173
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 104
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 104
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 86
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 81
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 claims description 50
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 43
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 36
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 19
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims description 15
- -1 pantothenate compound Chemical class 0.000 claims description 12
- 108010021592 Pantothenate kinase Proteins 0.000 claims description 11
- 102100024122 Pantothenate kinase 1 Human genes 0.000 claims description 10
- 229940009098 aspartate Drugs 0.000 claims description 9
- 230000009467 reduction Effects 0.000 claims description 7
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 3
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 claims description 2
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 claims description 2
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 claims description 2
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 claims description 2
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 claims 1
- 241000238370 Sepia Species 0.000 claims 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 claims 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 claims 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 220
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 103
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 description 82
- 239000000047 product Substances 0.000 description 67
- 230000001851 biosynthetic effect Effects 0.000 description 61
- UCMIRNVEIXFBKS-UHFFFAOYSA-N beta-alanine Chemical compound NCCC(O)=O UCMIRNVEIXFBKS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 55
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 44
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 44
- OTOIIPJYVQJATP-BYPYZUCNSA-M (R)-pantoate Chemical compound OCC(C)(C)[C@@H](O)C([O-])=O OTOIIPJYVQJATP-BYPYZUCNSA-M 0.000 description 37
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 37
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 35
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 35
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 34
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 34
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 34
- 230000002074 deregulated effect Effects 0.000 description 33
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 30
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 30
- 229940000635 beta-alanine Drugs 0.000 description 27
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 27
- HNZZAEBYPPNVOF-DHYYHALDSA-N (2s)-2-amino-3-methylbutanoic acid;(2s,3s)-2-amino-3-methylpentanoic acid Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O.CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O HNZZAEBYPPNVOF-DHYYHALDSA-N 0.000 description 26
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 26
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 24
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 22
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 22
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 22
- 101150081585 panB gene Proteins 0.000 description 21
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 21
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 20
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 20
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 20
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 19
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 19
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 18
- XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N Propionic acid Substances CCC(O)=O XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 16
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 15
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 15
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 15
- 101100028493 Haloferax volcanii (strain ATCC 29605 / DSM 3757 / JCM 8879 / NBRC 14742 / NCIMB 2012 / VKM B-1768 / DS2) pan2 gene Proteins 0.000 description 14
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 14
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 14
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 13
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 13
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 12
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 12
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 11
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 11
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 11
- 101150051152 coaX gene Proteins 0.000 description 11
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 11
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 11
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 11
- QHKABHOOEWYVLI-UHFFFAOYSA-N 3-methyl-2-oxobutanoic acid Chemical compound CC(C)C(=O)C(O)=O QHKABHOOEWYVLI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 10
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 10
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 9
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 8
- 230000003831 deregulation Effects 0.000 description 8
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 8
- RGJOEKWQDUBAIZ-IBOSZNHHSA-N CoASH Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCS)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 RGJOEKWQDUBAIZ-IBOSZNHHSA-N 0.000 description 7
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 7
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 7
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 7
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 7
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 7
- 101150048956 coaA gene Proteins 0.000 description 7
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 7
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 7
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 108010070495 2-dehydropantoate 2-reductase Proteins 0.000 description 6
- PKVVTUWHANFMQC-UHFFFAOYSA-N 2-dehydropantoic acid Chemical compound OCC(C)(C)C(=O)C(O)=O PKVVTUWHANFMQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 6
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 6
- 101150109763 coaW gene Proteins 0.000 description 6
- RGJOEKWQDUBAIZ-UHFFFAOYSA-N coenzime A Natural products OC1C(OP(O)(O)=O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)C(O)C(=O)NCCC(=O)NCCS)OC1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 RGJOEKWQDUBAIZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000005516 coenzyme A Substances 0.000 description 6
- 229940093530 coenzyme a Drugs 0.000 description 6
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 6
- KDTSHFARGAKYJN-UHFFFAOYSA-N dephosphocoenzyme A Natural products OC1C(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)C(O)C(=O)NCCC(=O)NCCS)OC1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 KDTSHFARGAKYJN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 6
- 239000012092 media component Substances 0.000 description 6
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 6
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 6
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 6
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 6
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 6
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 5
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Natural products CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 201000001718 Roberts syndrome Diseases 0.000 description 5
- 208000012474 Roberts-SC phocomelia syndrome Diseases 0.000 description 5
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 5
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 5
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 5
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 5
- 238000005001 rutherford backscattering spectroscopy Methods 0.000 description 5
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 5
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 5
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 5
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 5
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 5
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 4
- GHOKWGTUZJEAQD-UHFFFAOYSA-N Chick antidermatitis factor Natural products OCC(C)(C)C(O)C(=O)NCCC(O)=O GHOKWGTUZJEAQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 4
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 4
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 4
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 4
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 4
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 4
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 4
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 4
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 101150076071 panD gene Proteins 0.000 description 4
- 101150028586 panE gene Proteins 0.000 description 4
- 229940055726 pantothenic acid Drugs 0.000 description 4
- 235000019260 propionic acid Nutrition 0.000 description 4
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 4
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 3
- 101100323086 Escherichia coli (strain K12) alx gene Proteins 0.000 description 3
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M Pyruvate Chemical compound CC(=O)C([O-])=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 3
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 239000000981 basic dye Substances 0.000 description 3
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 230000036983 biotransformation Effects 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 3
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 3
- 235000019788 craving Nutrition 0.000 description 3
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 3
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 108091006104 gene-regulatory proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000034356 gene-regulatory proteins Human genes 0.000 description 3
- 101150043028 ilvD gene Proteins 0.000 description 3
- 101150105723 ilvD1 gene Proteins 0.000 description 3
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- IUVKMZGDUIUOCP-BTNSXGMBSA-N quinbolone Chemical compound O([C@H]1CC[C@H]2[C@H]3[C@@H]([C@]4(C=CC(=O)C=C4CC3)C)CC[C@@]21C)C1=CCCC1 IUVKMZGDUIUOCP-BTNSXGMBSA-N 0.000 description 3
- 238000010992 reflux Methods 0.000 description 3
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 3
- 101150028074 2 gene Proteins 0.000 description 2
- WTLNOANVTIKPEE-UHFFFAOYSA-N 2-acetyloxypropanoic acid Chemical compound OC(=O)C(C)OC(C)=O WTLNOANVTIKPEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GWYFCOCPABKNJV-UHFFFAOYSA-M 3-Methylbutanoic acid Natural products CC(C)CC([O-])=O GWYFCOCPABKNJV-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- DARDVQMPKFOPRT-UHFFFAOYSA-N 3-[(2-hydroxy-3-methylbutanoyl)amino]propanoic acid Chemical compound CC(C)C(O)C(=O)NCCC(O)=O DARDVQMPKFOPRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QYNUQALWYRSVHF-ABLWVSNPSA-N 5,10-methylenetetrahydrofolic acid Chemical compound C1N2C=3C(=O)NC(N)=NC=3NCC2CN1C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 QYNUQALWYRSVHF-ABLWVSNPSA-N 0.000 description 2
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 2
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N Erythromycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](C)C(=O)O[C@@H]([C@@]([C@H](O)[C@@H](C)C(=O)[C@H](C)C[C@@](C)(O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@H](C[C@@H](C)O2)N(C)C)O)[C@H]1C)(C)O)CC)[C@H]1C[C@@](C)(OC)[C@@H](O)[C@H](C)O1 ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N 0.000 description 2
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010000200 Ketol-acid reductoisomerase Proteins 0.000 description 2
- 101100242684 Mesorhizobium japonicum (strain LMG 29417 / CECT 9101 / MAFF 303099) panD1 gene Proteins 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 2
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 2
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-M Propionate Chemical compound CCC([O-])=O XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108010053763 Pyruvate Carboxylase Proteins 0.000 description 2
- 102100039895 Pyruvate carboxylase, mitochondrial Human genes 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- WQDUMFSSJAZKTM-UHFFFAOYSA-N Sodium methoxide Chemical compound [Na+].[O-]C WQDUMFSSJAZKTM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DKGAVHZHDRPRBM-UHFFFAOYSA-N Tert-Butanol Chemical group CC(C)(C)O DKGAVHZHDRPRBM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 2
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 description 2
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 2
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 2
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 2
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 238000010923 batch production Methods 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 2
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 2
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 2
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 238000003818 flash chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 2
- 229940049906 glutamate Drugs 0.000 description 2
- 210000005255 gram-positive cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- GWYFCOCPABKNJV-UHFFFAOYSA-N isovaleric acid Chemical compound CC(C)CC(O)=O GWYFCOCPABKNJV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 2
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 238000010979 pH adjustment Methods 0.000 description 2
- 101150019254 panC gene Proteins 0.000 description 2
- 108020003551 pantothenate synthetase Proteins 0.000 description 2
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 2
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 2
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 2
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 2
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 2
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 2
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 2
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 2
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- XJYXOMKIPWYNND-VKZKZBKNSA-N (2r)-3-formyl-2,4-dihydroxy-3-methylbutanoic acid Chemical compound OCC(C)(C=O)[C@@H](O)C(O)=O XJYXOMKIPWYNND-VKZKZBKNSA-N 0.000 description 1
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001644 13C nuclear magnetic resonance spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 108010036575 3-methyl-2-oxobutanoate hydroxymethyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 108010000700 Acetolactate synthase Proteins 0.000 description 1
- 241000352333 Amegilla alpha Species 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 240000003291 Armoracia rusticana Species 0.000 description 1
- 235000011330 Armoracia rusticana Nutrition 0.000 description 1
- 238000012935 Averaging Methods 0.000 description 1
- 241000304886 Bacilli Species 0.000 description 1
- 241000193755 Bacillus cereus Species 0.000 description 1
- 241000193422 Bacillus lentus Species 0.000 description 1
- 241000194110 Bacillus sp. (in: Bacteria) Species 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 101100489022 Bacillus subtilis (strain 168) yqgT gene Proteins 0.000 description 1
- 241000193388 Bacillus thuringiensis Species 0.000 description 1
- 241000702194 Bacillus virus SPO1 Species 0.000 description 1
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 108010088278 Branched-chain-amino-acid transaminase Proteins 0.000 description 1
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 1
- 241000282988 Capreolus Species 0.000 description 1
- 244000223760 Cinnamomum zeylanicum Species 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical class [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SNPLKNRPJHDVJA-ZETCQYMHSA-N D-panthenol Chemical group OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCCO SNPLKNRPJHDVJA-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 1
- 101150082674 E2 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150062179 II gene Proteins 0.000 description 1
- 108010042653 IgA receptor Proteins 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZOKXTWBITQBERF-UHFFFAOYSA-N Molybdenum Chemical compound [Mo] ZOKXTWBITQBERF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- JOCBASBOOFNAJA-UHFFFAOYSA-N N-tris(hydroxymethyl)methyl-2-aminoethanesulfonic acid Chemical compound OCC(CO)(CO)NCCS(O)(=O)=O JOCBASBOOFNAJA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 102100034014 Prolyl 3-hydroxylase 3 Human genes 0.000 description 1
- 241000635201 Pumilus Species 0.000 description 1
- 108020005115 Pyruvate Kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000013009 Pyruvate Kinase Human genes 0.000 description 1
- 101710094523 Replication enhancer Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 description 1
- 241000607720 Serratia Species 0.000 description 1
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- VEUACKUBDLVUAC-UHFFFAOYSA-N [Na].[Ca] Chemical compound [Na].[Ca] VEUACKUBDLVUAC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 description 1
- 101150037395 alsS gene Proteins 0.000 description 1
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 1
- 239000003957 anion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 150000001449 anionic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 239000002518 antifoaming agent Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010002447 aspartate-alpha-decarboxylase Proteins 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 230000003190 augmentative effect Effects 0.000 description 1
- 229940097012 bacillus thuringiensis Drugs 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 230000037429 base substitution Effects 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 235000013405 beer Nutrition 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000023732 binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 239000008366 buffered solution Substances 0.000 description 1
- FAPWYRCQGJNNSJ-UBKPKTQASA-L calcium D-pantothenic acid Chemical compound [Ca+2].OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC([O-])=O.OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC([O-])=O FAPWYRCQGJNNSJ-UBKPKTQASA-L 0.000 description 1
- 229960002079 calcium pantothenate Drugs 0.000 description 1
- 159000000007 calcium salts Chemical class 0.000 description 1
- 150000001721 carbon Chemical group 0.000 description 1
- JJWKPURADFRFRB-UHFFFAOYSA-N carbonyl sulfide Chemical compound O=C=S JJWKPURADFRFRB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 125000001309 chloro group Chemical group Cl* 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 235000017803 cinnamon Nutrition 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000010941 cobalt Substances 0.000 description 1
- 229910017052 cobalt Inorganic materials 0.000 description 1
- GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N cobalt atom Chemical compound [Co] GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 239000007859 condensation product Substances 0.000 description 1
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 238000010924 continuous production Methods 0.000 description 1
- 239000010949 copper Chemical class 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 1
- 230000009849 deactivation Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 238000009795 derivation Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 235000015872 dietary supplement Nutrition 0.000 description 1
- PXEDJBXQKAGXNJ-QTNFYWBSSA-L disodium L-glutamate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C(=O)[C@@H](N)CCC([O-])=O PXEDJBXQKAGXNJ-QTNFYWBSSA-L 0.000 description 1
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 229960003276 erythromycin Drugs 0.000 description 1
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000003925 fat Substances 0.000 description 1
- 235000019197 fats Nutrition 0.000 description 1
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 1
- 238000005187 foaming Methods 0.000 description 1
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 description 1
- 238000012224 gene deletion Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 101150097303 glyA gene Proteins 0.000 description 1
- 101150079604 glyA1 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 235000012907 honey Nutrition 0.000 description 1
- 235000003642 hunger Nutrition 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-UHFFFAOYSA-N hydron Chemical compound [H+] GPRLSGONYQIRFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001261 hydroxy acids Chemical class 0.000 description 1
- 101150033780 ilvB gene Proteins 0.000 description 1
- 101150090497 ilvC gene Proteins 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 229910001412 inorganic anion Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 239000013067 intermediate product Substances 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 108010056929 lyticase Proteins 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- WPBNNNQJVZRUHP-UHFFFAOYSA-L manganese(2+);methyl n-[[2-(methoxycarbonylcarbamothioylamino)phenyl]carbamothioyl]carbamate;n-[2-(sulfidocarbothioylamino)ethyl]carbamodithioate Chemical compound [Mn+2].[S-]C(=S)NCCNC([S-])=S.COC(=O)NC(=S)NC1=CC=CC=C1NC(=S)NC(=O)OC WPBNNNQJVZRUHP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- FEIWNULTQYHCDN-UHFFFAOYSA-N mbba Chemical compound C1=CC(CCCC)=CC=C1N=CC1=CC=C(OC)C=C1 FEIWNULTQYHCDN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019988 mead Nutrition 0.000 description 1
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- YSGBMDFJWFIEDF-UHFFFAOYSA-N methyl 2-hydroxy-3-methylbutanoate Chemical compound COC(=O)C(O)C(C)C YSGBMDFJWFIEDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013048 microbiological method Methods 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 239000011733 molybdenum Substances 0.000 description 1
- 229910052750 molybdenum Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000016768 molybdenum Nutrition 0.000 description 1
- 235000013923 monosodium glutamate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000403 monosodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019799 monosodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 150000002891 organic anions Chemical class 0.000 description 1
- 238000006213 oxygenation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001139 pH measurement Methods 0.000 description 1
- 230000020477 pH reduction Effects 0.000 description 1
- 101150039315 panB1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150103470 panB2 gene Proteins 0.000 description 1
- 235000020957 pantothenol Nutrition 0.000 description 1
- 239000011619 pantothenol Substances 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 101150042813 pcaA gene Proteins 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229920000728 polyester Polymers 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 159000000001 potassium salts Chemical class 0.000 description 1
- LPNYRYFBWFDTMA-UHFFFAOYSA-N potassium tert-butoxide Chemical compound [K+].CC(C)(C)[O-] LPNYRYFBWFDTMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940002612 prodrug Drugs 0.000 description 1
- 239000000651 prodrug Substances 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 230000001902 propagating effect Effects 0.000 description 1
- 230000004952 protein activity Effects 0.000 description 1
- 238000005086 pumping Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 238000012807 shake-flask culturing Methods 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229920002545 silicone oil Polymers 0.000 description 1
- GQTHJBOWLPZUOI-FJXQXJEOSA-M sodium D-pantothenate Chemical compound [Na+].OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC([O-])=O GQTHJBOWLPZUOI-FJXQXJEOSA-M 0.000 description 1
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229940073490 sodium glutamate Drugs 0.000 description 1
- 229940068459 sodium pantothenate Drugs 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 238000000638 solvent extraction Methods 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N spectinomycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](NC)[C@@H](O)[C@H]([C@@H]([C@H]1O1)O)NC)[C@]2(O)[C@H]1O[C@H](C)CC2=O UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N 0.000 description 1
- 229960000268 spectinomycin Drugs 0.000 description 1
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 1
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 1
- 230000037351 starvation Effects 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 108091006106 transcriptional activators Proteins 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 210000003934 vacuole Anatomy 0.000 description 1
- NQPDZGIKBAWPEJ-UHFFFAOYSA-M valerate Chemical compound CCCCC([O-])=O NQPDZGIKBAWPEJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229940070710 valerate Drugs 0.000 description 1
- 125000002987 valine group Chemical group [H]N([H])C([H])(C(*)=O)C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 235000014101 wine Nutrition 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1022—Transferases (2.) transferring aldehyde or ketonic groups (2.2)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/02—Amides, e.g. chloramphenicol or polyamides; Imides or polyimides; Urethanes, i.e. compounds comprising N-C=O structural element or polyurethanes
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Description
A pantotenát (különösen a bioaktív
D izomer) szintézis h tömeg vegyszerek kémiai szintézisével olyan el~ gátat szab egyrészt, a szubssirat túl nagy költa racém köztes termié kék optikai felbontásának szúkseuessége< E mikrobiális rendszerek után kutatnak, amelyek, a. pantötenát. bioszintézisben felhasználható enzimeket termelnek (illetve maguk a baktériumok képesek pantotenát szintetizálására). Különösen konverziós eljárásuk értékelhetők kedvező termelési módként ré sZes i t e11 í zömerjélnék η1őá1111 á Sában <
rabba vi közvetlen mikeebiolőgiai ssí n t éz i s módszere it, min
Azonban, még mindig nagy szükség van javított pantotenát zár-
meló eljárásokra, főleg olyan mikrobiológiai eljárásokra? ame~ Ivek a kívánt termék magasabb hozama érdekében optimalizáltak.
A találmány tárgyát javított eljárások (például mikrobiológiai szintéziseki képezik pantotenát előállítására. Felfedeztük, hogy a. pantotenát bioszintézis ütvonal és/vagy az isoleucin-valin (iiv) útvonal szabályozásának megszüntetése mikroorganizmusokban a jelentősen megnövekedett pantoát és/vagy pantotenát titexen túl egy változó terméket, nevezetesen [Rj-3-í. (2~hidxoxi“ -3-metil-hutiriI) -amino] -propionsavat vagy 3- ((z-hidrőxi-Smvetil-butiril)-amino]-propionsavat [3- (2“hydroxy-3-methy1-butyrylamino)~ propionic add ~ „HMBPA) - egymással felcserélhetvén itt még ,,β- a 1 aft i n - 2 - (R) - h 1 d r ο x i - i z e va 1 e r á t, „ β - a 1 a n i n - 2 - h i d r ox 1 - i z o v a le tát, „β-alanil-a-hidroxi-izovalerát és/vagy „fantotenát névvel illetve - eredményez. A HMRPA-hoz vezető anyagcsere útvonal {itt „HMBPA bioszintézis útvonal) felölel bizonyos, hagyományosan a pantotenát és/vagy izóleucin-valin. (22v) biaszintézishez kapcsolódó enzimeket, amelyek túlzott kifejeződés esetén még a HMSPA biosdntézis útvonalba is képesek bekapcsolódni> A. bioszintézis útvonal főleg a rednktáz aktivitással (például PanEl, PanB2 és/vagy IlvC aktivitásukkal} katalizált a-ketö-izovalerát [R]-2~hidroxi-1 zovaleráttá i a- HÍV) tör ténő átala kulás t fög la1j a magába, amelyet PanC aktivitás által katalizált α-HIV és β-alanin kondenzáció követ. Mivel az alternatív HMBPA bioszintézis útvonal verseng a pantotenát hioszintézis kulcs prekurzorálért, nevezetesen az g-keto-izövalerátért (a-KlV) és $~alaninért és verseng a hagyományoson a pantotenát bioszintézishez kapcsolódó enzimekért is, a pantotenát biosxintézis hatékony növelése érdekében kivána7?.C74/BZ .4®.
2*
tos ΗΜΒΡΑ Mos Matézis visssas soritása vagy megszüntetése.
Ennek megfelelően a találmány tárgyát egy szempont szerint HMEPA-mentés pantotenát készítmény ©löállítására irányuló eljárás képezi, amely tartalmazza deregulált pantotenát bíoszíntézis útvonallal rendelkező mikroorganizmus tenyésztését olyan körülmények között; hogy HMBPA-mentes pantotenát termelődik, Egy másik szempont szerint a találmány tárgyát HMBPA-mentas pantotenát készítmény előállítására irányuló eljárás képezi, amely tartalmazza deregulált pantotenát bioszintézis útvonallal és deregúláit izoleucin-vaiin (ilv) Moszintézís útvonallal rendelkező mikroorganizmus tenyésztését, nevezett mikroorganizmus oly módon szabályozott PanB aktivitással rendelkezik, hogy HMBPA-mentes pantotenát termelődik. Egy további szempont szerint a találmány tárgyát HMBM-méntes pantotenát készítmény előállítására irányuló eljárás képezif amely tartalmazza deregulált pantotenát bioszintézis útvonallal és deregulált izoleucin-valin (ily) bioszintézis útvonallal rendelkező mikroorganizmus tenyésztését, a mikroorganizmus oly módon szabályozott PanE aktivitással rendelkezi kf hogy HMBPA-meptes pantotenát termelődik, Egy további szempont szerint a találmány tárgyát HMBPA-mentes pantotenát készítmény előállítására irányuló eljárás képezi, amely tartalmazza deregulált pantötenát bioszintéiis útvonallal és deregulált izoleuoin-valin (ilv) biószintézis útvonallal rendelkező mikroorganizmus tenyésztését., a mikroorganizmus oly módon szabályozott IlvC aktivitással rendelkezik, hogy HHBPA-mentes pantotenát termelődik. Egy további szempont szerint a találmány tárgyát HMBPA-meutes pantotenát készítmény előállítására irányuló Mjá4
rás képezi, amely tartalmazza deregulált pantotenát bioszintézis útvonallal és deregulált izoleuoin·valín (ilv) bioszintézis útvonallal rendel kezű mikroorganizmus tenyésztését, nevezett mikro organizmos oly módon szabályozott PanB és PanE aktivitásokkal rendelkezik, hogy HMBPA-mentes pantotenát termelődik. Egy további szempont szerint a találmány tárgyát HMBPA-mentes pantotenát készítmény előállítására irányuló eljárás képezi, amely tartalmazza deregulált pantotenát bioszintézis útvonallal és deregulált ízoleucin-valin (í.2v) bíoszintézis útvonallal rendelkező mikroorganizmus tenyésztését, nevezett mikroox'ganizmus oly módon szabályozott PanB és IlvC aktivitásokkal rendelkezik, hogy HMBPA-ment.es pantotenát termelődik. A fent leírt, eljárásokkal előállított készítmények és nevezett eljárásokban alkalmazott mikroOrganizmusok is a találmány tárgyát képezik. Szintén, a találmány oltalmi körébe tartoznak szelektíven kevert pantotenát. ; HMBPA készítmények előállítására irányuló eljárások.
A találmány egyéb előnyei nyilvánvalóvá válnak az itt következő részletes leírásból és a szabadalmi igénypontokból.
Az ábrák rövid leírása
1. ábra: a pantotenát és izoleucin-valin (ilv) biosz.intézis útvonalak vázlatos ábrázolása. A pantotenát .bioszintézis enzimjeit vastagon jelöljük, a nekik megfelelő géneket dőlt betűkkel. Az izoleucin-valin (ilv) bioszintézis enzimjeit vastag dőlt betűkkel jelöljük á nekik megfelelő géneket dőlt betűkkel.
2. ábra(l-hidroxi-S-met.íl-bútirilamíno) -propionsav („HMBPA) kialakulásához vezető bioszintézis útvonal vázlata B. ssubtil is-ben.
3» ábra: f.Rj-3- (2-hidrox:i3-metíl-butírilamino) -propionsav („HMBPA) szerkezetének vázlatos ábrázolása.
4. ábra: BA824 14 literes fermentációjából vett minta HFbC kromatogramj a.
5. ábra: 3-(2-hidroxi-3-meti1-butirilamino)-propionsav relatív monoizotópos tömegét mutató tömegspektrum.
6. ábra: ismert vagy gyanított PanB fehérjék C~te.rminálls aminosavjainak sorbaállítása.
7. ábra: a pAW24 plazmád szerkezetének vázlatos bemutatása.
8. ábra: a pAN620 plazmád szerkezetének vázlatos bemutatása.
9. ábra: a pAN636 plazmád szerkezetének vázlatos bemutatása.
10. ábra: a klőramfenikoát felhasználó egyedi vagy többszö- rös másolatok szelekcióját lehetővé tevő pAN837 plazmád szürkezetérek váz1atos bemutatása.
A találmány alapja - legalább részben - olyan alternatív bioszíntézis útvonal rekombináns mákroorganizmusökban/ amely bizonyos pantotenát és/vagy izoleuein-valin (íiv) bioszintetikus enzimeket és prekurzorokat használ fel ^B)-3” [ (F-hidroxl-B-'metil-butiról)-amino}-propionsav („IMM··.) együttes termék, vágy melléktermék előállításához. Főleg a deregulált pantotenát bioszintézisre és/vagy izaleucin-valin (álv) bíoszintézisre genetikailag átalakított baktériumok képesek, a-keto-izovalerátból (a-KIV) HMBFA előállítására, amely az izbleucin-valin ti,ívj bioazintézis útvonal kulcs terme ke és a pantotenát bio szín tézis útvonal, prekurzora, HMBFA termeléshez a baktériumok felhasználják a pántot énét bioszintetikus enzimek közül legalább a ketopantoát redüktázt (a panE gén termékét), a panE2 gén termékét és/vagy az
77.ö7«/gE «**· ♦♦ χβ **♦ « Λ * ♦ * ·* κ « φ ♦ » ♦ »* >♦ » * » Λ ♦ Φ < *»»«
Χ« Φ> ·» ♦«♦ aceto-hidroxi-izomeroreduktázt (az ilvC gén. termékét) és az aKIV redukciójával keletkező [Rj-z-hídroKi-izovalerát (α-HIV) és β-alanin kondenzációját eredményezik, amely utóbbi reakciót a pantotenát szintetáz (a panC gén terméke) pantotenát bioszintetikus enzim katalizálja. Az α-KIV és β-alanin szubsztrátok a pantotenát termelésben és a HMBPA termelésben egyaránt felhasználásra kerülhetnek, β-alanin például biztosítja és/vagy növeli az aezpaxtát-a-dekarboxiláz aktivitást (a panD gén termékét) .
A pantotenát bioszintésis prekurzoraiért és/vagy bioszintetikus enzimjeiért való versengés csökkentése vagy megszüntetése érdekében kívánatos bizonyos enzimek szelektív szabályozása oly módon, hogy a termelést HMBPA-tól pantoát/pantotenát irányába toljuk el... A deregulált pantotenát bioszintézis útvonallal és/vagy deregulált izoleucin-valin (ílv) bioszintézis útvonallal rendelkező mikroorganizmusokat előnyösen tovább manipuláljuk oly módon, hogy PanB-t és/vagy PanE-t szelektíven szabályozzuk, PánB és/vagy PanE szelektív szabályozásába beletartozik ezen enzimek szintjeinek oly módon történő optimalizálása., hogy a termelés pantoát/pantotenát irányába tolódjon el.
A találmány tárgyát főleg megnövelt pantotenát : HMBRA aránnyal rendelkező készítmények, előnyösen HMBPA-mentes készítmények előállítási módszerei képezik. Az itt leírtak szerint a „HMBPA-mentes pantotenát készítmény olyan pantotenát tartalmú készítményre utal, amely nem tartalmaz HKBPA-t és/vagy lényegében nem tartsimaz HMBPA-t úgy, hogy neve matt készítmény jelentéktelen mennyiségű HMBPA-t tartalmaz (azaz ha HMBPA jelen, van, akkor a pantotenát szintjéhez vagy koncentrációjához képest e.le7 7.07»:/ se ♦ Φ' X ·> φ X ♦ φ ♦ « φ * ·!» <* « φ
Φ > * Φ «: χ * * χφφ.Φ * * * χ φ Φ ♦ ♦ ♦ gendden alacsony szinten vagy koncentrációban van jelen oly módon, hogy a késtítmény technológiai, túdömányos és/vagy ipari célokra HMBPA-mentesnek tekinthető). HMBPA-mentes pantptenát készítmény előnyösen pantotenátot tartalmaz és ha H.M.BPA jelen van, akkor 10:100 arányban (azaz 90% pantotenáttal szerben 10% HMBPA, például egy termékminta HPLC analízisekor a csúcsok alatti területek Összehasonlításával meghatározva) vagy kisebb arányban. Előnyösebben, HMBPA-mentes pantotenát készítmény pantotenátot tartalmaz és ha HMBPA jelen van, akkor 9:100 arányban (azaz 91% pantotenáttal szemben 9% HMBPA) vagy kisebb arányban. Még előnyösebben, HMBPA-mentes pantotenát készítmény pantotenátot tartalmaz és ha HMBPA je'en van, akkor 8:1.00 arányban (azaz 92% pantötenáttal s z emberi 8 % HM B PA) vagy kisebb a rá n yb a n, '7:100 a r án yb a n (a z a .93% pantötenáttal szemben
7%
HMBPA) vagy kisebb arányban.
6:100 aránybaπ
94% pantotenáttal szemben 6% HMBPA) vagy kisebb arányban vagy 5:
100 arányban (azaz 95% pantotenáttál szemben 5% HMBPA) vagy kisebb arányban. Még előnyösebben, HMBPA-mentes pantotenát készítmény pantbtéhátot tartalmaz és ha HMBPA jelen van, akkor 0,5:100 arányban (azaz 99,5% pantotenáttal szemben 0,5% HMSPA) vagy kisebb arányban, 0,2:100 arányban (azaz 99,0% pantotenáttal arányban vagy 0,1
9% pantotenáttal szemben 0,1%
HM8PA) vagy kisebb a rányban
A z itt: b emu t a tett értékek értékek és tartományok szintén a találmány oltalmi körébe tartoznak
A találmány tárgyát egy megvalósítási formában HMBPA-mentes pantotenát előá11í tására szolgá16 eljárás képezi, ame1y tarta17?.07<:/gE jf:
+* ΦΧΦ * < χ * * * X *·
Φ Á * * * * X * Φ * y X Φ * X * *«Μ» ♦ Λ *« Ο« ΧΦν .mássa dexeguiált pánt öten át. bioszintézis útvonallal rendelkező mikroorganizmus tenyésztését olyan körülmények között, hogy ΗΜΒΡΆ-mentes pántokénál termelődjön. A „pántokénál bioszintézis útvonal kifejezés magába foglalja a pántokénál kialakulásában vagy szintézisében felhasználásra kerülő pántokénál bioszintetikus enzimeket (például bioszintetikus enzimeket kóaoló gének által kódolt polipeptideket), vegyületeket (például szubszfcrákokat t Intermediereket vagy termékeket), kofaklorokat. és hasonlókat felölelő bioszintézis útvonalat.. A „pantótánát biosz Intéz is útvonal* kifejezés ugyanúgy magába foglalja mikroorganizmusckhan a pantotenát szintéziséhez (például in vivő) vezető biószintézís útvonalat, mint a pántokénál in vitro szintéziséhez vezető bioszintézis útvonalat.
Az itt leírtak szerint a „deregulált pahtot.enát bíoszintézis útvonallal rendelkező mikroorganizmus olyan mikroorganizmusra Utálj, amelynek legalább egy pantotenát bioszintetikus enzimje oly módon deregulált (például túlzottan kifejezett) (mindkét kifejezést definiáljuk itt), hogy pántokénál termelődése fokozódik (nevezett mikroorganizmus pántokénál termelését összehasonlítva például nevezett bioszintetikus enzim deregulációja előtti pántokénál termelésével vagy vad típusú mikrdorgaH.izm.us pántokénál, termelésével). A „pantotenát kifejezés a pantotenát szabad savas formáját jelenti, utalunk rá a „pantoténsav kifejezéssel is ugyanúgy, mint bármelyik sójával {amely a pantotenát vagy pantoténsav savas hidrögénjének kationnal, például kalciummal, nátriummá.!, kailommal, amméníurnái történő önerejéből származik), „pantotenát sóként is említve. A „pantotenát* kifejezés félölé•naw ♦**♦ *χ XX ** * ♦ ♦ * * » ♦ χ X * V ♦ ♦ X *X X * * x « ♦ ♦ x ♦ * β**♦ ♦ * X» *♦ , X li a pantotenát alkohol származékait is. Előnyben részesített pantotenát sók a kalcium-pantotenát és a nátrium-pantotenát. Előnyben részesített alkohol származék a pantotenol, A találmány szerinti pantotenát sok és/vagy alkoholok közé tartoznak az itt leírt szabad savakból hagyományos módszerekkel élőálütött sók és/vagy alkoholok. Egy másik megvalósítási formában a pantotenát sót közvetlenül egy találmány szerinti mikroorganizmussal szintet izáltatjuk. A találmány szerinti pantotenát só ehhez hasonlóan hagyományos módszerekkel átalakítható a pantotenát szabad savas formájává vagy pantoténsavvá. A „deregulált pantotenát bioszintézis útvonallal rendelkező mikroorganizmus előnyösen olyan mikroorganizmust jelent, amelynek legalább egy pantotenát bioszíntetikús énzímjé deregulált (például túlzottan kifejeződik) oly módon, hogy a pantotenát termelés 1 g/1 vagy ennél -nagyobb. Még előnyösebben,, a „deregulált pantotenát bíoszintézis útvonallal rendelkező mikroorganizmus olyan mikroorganizmust jelent, amelynek legalább egy pantotenát bioszintetikus enzimje deragu.lált (például túlzottan kifejeződik) oly módon, hogy a pantotenát termelés 2 g/1 vagy ennél nagyobb,
A „pantotenát bioszintetikus enzim kifejezés felölel bármely enzimet, amely felhasználásra kerül a pantotenát bioszíntézis útvonal egy vegyúletérek (például, köztes terméknek) a kialakulásában. Például pantoát szintézise a-keto-izovalezátböl (a-KIV) egy köztes terméken, ketopantoáton keresztül valósul meg. Ketopantoát kialakulását a pantotenát bioszintetikus enzim PanB vagy keto-pantoát hldroxi-metil-transzferál (a p<snB gén terméke) katalizálja. Pantoát képződését a pantotenát bioszintetikus enzim PanEl » X * * Φ * X * vagy ket-gpantoát reduktáz (a panEl gén terméke) katalizálja alanin szintézisét aszpartátból a pantotenát bioszintetikus enzim
PanD vagy aszpartát-a-dekarboxiláz (a panb gén terméke) kata.1.1· zálja. Pantotenát képződését pantoátból és β-a.laninból (például kondenzációval) & pantotenát bioszintetikus enzim PanC vagy pantotenát. szintetáz (a panC gén terméke) katalizálja, Pantotenát bioszintetikus enzimek alternatív szerepet is játszhatnak a HMBPA bíoszintézís útvonal enzimjeiként, az itt leírtak szerint
Ennek megfelelően, a találmány tárgyát egy megvalósítási formában olyan HMBPA-mentes pantotenát készítmény előállítására ranyuló eljárás képezi, amely tartalmazza legalább egy deregu· bioszintetikus enzimmel (például oly módon fokozódik a pantotenát termelés) mikroorganizmus tenyésztését, ahol nevezett enzimet (vagy ketopantoát hidroxilmetil-transzferázt)?
Panö-t (vagy és PanEl-t
HM B PA » me n t e s (vagy ketopantoát reduktázt) tartalmazó csoportból
A találmány tárgyát egy másik megvalósításban olyan pantotenát készítmény előállítására irányuló eljáramely tartalmazza legalább két deregulált pantotenát enzimme1 rende1kaz ő mik r ο o rganizmus tenyésztését, enzimet a PanB-t (vagy ketopantoát hidroxilmet.iltranszferázt),
-t (vagy pántot áriát ás z p a r t á t-a-dekarbox i 1 á z t) és B án E l-1 tázt) tartalmazó csoportból választjuk. A találmány tárgyát egy ik megvalósításban olyan HMBPA-méntes pantotenát készítmény előállítására irányuló eljárás képezi, arnély tartalmazza lég alább három deregulált pantotenát bioszintetikus enzimmel ren-* delkező mikroorganizmus tenyésztését, ahol nevezett enzimet a PanS-t (vagy ketopantoát hidroxilmetil-transzferázt) , PanC-^t (vagy pantotenát szintetázt) f PanD-t (vagy aszpartát-a-dekarbo~ xilázt) és. PanEl~t '(vagy ketopantoát redúktázt) tartalmasé oso~ portból választjuk, A találmány tárgyát egy másik megvalósítás' bán olyan HMBPA-mentes pantotenát készítmény előállítására irányuló eljárás képezi, amely tartalmazza legalább négy deregulált pantotenát bioszintetikus enzimmé! rendelkezi mikroorganizmus tenyésztését, ahol nevezett enzimet a PanB-t (vagy ketopantoát hidroxilmetíl-transzfes'ázt j f PanC-t (vagy pantotenát szintetázt) , PanD-t (vagy aszpartát-a-dekarboxilázt) és PanEl-t (vagy ketopantoát redúktázt) tartalmazó csoportból választjuk.
A találmány tárgyát egy másik szempont; szerint BWPA-mentes pantotenát készítmény előállítására irányuló eljárás képezi, amely tartalmazza deregulált pantotenát bioszintézis útvonallal rendelkező mikroorganizmus tenyésztését olyan körülgiények között, hogy HMBPA-mentes pantotenát termelődik és a mikroorganizmus ezenkívül deregulált. izoleucin-valin bioszintézis útvonallal rendelkezik. Az „izoleucin-valin bioszintézis útvonal kifejezés magába foglalja azokat a bioszintézis útvonalon felhasználásra kerülő izoleucin-valin bioszintetikus enzimeket (például .bioszintetikus enzimeket kódoló gének által kódolt polipepti.de két) , vegyületeket (például szubsztrátokat, intermediereket vagy termékeket), kofaktotokat és hasőnlókat^ amelyek a piruvát valinná vagy izoleucínná történő átalakulásában vesznek részt. Az „ízoleucin-valin bioszíntézis útvonal kifejezésbe egyaránt .beletartozik, az . δ76/β£ ‘ϊ á bioszintézis útvonal, amely valin vagy izoleucin szintéziséhez vezet mikroorganizmusokban (például. ín vivő) és a valin vagy izoleucin in vítro szintéziséhez vezető bioszintetikus útvonal.
Az itt leírtak szerint a „deregulált izoieucin-valin (ilvj bioszintézis útvonallal rendelkező mikroorganizmus olyan mikroorganizmusra utal, amelynek legalább egy izoleucin-valin (ílv) bioszintetikus enzimje oly módon deregulált (például túlzottan kifejezett) (mindkét kifejezést definiáljuk itt), hogy izoleucin és/vagy valin és/vagy a valin prekurzor a-keto-izovalerát (ctKlVj termelődése fokozódik (nevezett mikroorganizmus izoleucin és/vagy valin és/vagy α-KIV termelését összehasonlítva például nevezett bioszintetikus enzim deregulációja előtti vagy a vad típusú mikroorganizmus termelésével) Az 1. ábra vázlatosan ábrázd ja az izoleucin-valíri (ilv) bioszintézis útvonalat, Az izoleucin-valin bioszintetikus enzimeket vastag dőlt betűkkel és a nekik megfelelő géneket dőlt betűkkel tüntettük fel. Az „izoleucin-val '..n bioszintetikus enzim kifejezés felölel bármely enzimet, amely felhasználásra kerül az izoleucin-valin bioszintézis útvonal egy vegyül elének (például köztes terméknek.) a kialakulásában. Az .1.. ábra szerint valin szintézise piruvátból az aoetolaktát f a,β-dihidroxi-izovalerát (α,β-DHIV) és a-keto-i.zo·» valerát (α-KIV) köztes termékeken keresztül történik. Az acetolaktát kialakulását piruvátból az acetohidroxisav szinretáz (az ílvBN gén terméke vagy másik lehetőségként az alsS gén terméke) izoleucin-valin bioszintetikus enzim katalizálja, a,β-DHIV képződését acetolaktátból az acetohidroxisav izomeroreduktáz (az íivC gén terméke) izoieucin-valin bioszintetikus enzim: katali77.Ö76/BZ
X * * * ♦ * V♦ * ΐ· > ♦ ♦ . ♦v
Φ ♦ ♦ * * x X w*♦*
XX »♦ **:♦ salja. a-KIV szintézisét α,β-DHIV-ból a dihidroxisav dehidratáz (az. í.IvD gén terméke) izoieucin-valin bioszintetikus enzim Kata zál ja,
Továbbá valin és izoleucin saját a-keto-vegyületükkei egymásba alakíthatók elágazó láncú aminosav transzárninázok se gitségével. Az izoleucín-valin bioszintetikus enzírnek a.1.térna11 v szerepet is játszhatnak a KMBPA bioszintézis útvonal enzimjei ként, az itt leírtak szerint.
Ennek megfelelően, a találmány tárgyát egy me gva1ósi tás 1 formában olyan HMBPA-mentes pantotenát készítmény előállítására irányuló eljárás képezi, amely tartalmazza legalább egy derégulált izoleucin-valín (ilv) bioszintetikus enzimmel (például oly módon de regu iá11, hogy fokozódik a valin és/vagy izoleucia és/vagy ct-KIV termelés) rendelkező mikroorganizmus tenyésztését, ahol nevezett (aoetohidroxisav izomeroreduktázt) és T.lvD-t (dihidroxisav dehidratázt) tartalmazó csoportból választjuk. Egy másik megvalósítás bán a találmány tárgyát olyan
HMB-PA^mentes pántot agát késáitmény előállítására irányuló eljárás képezi, amely tartalmazza legalább két deregulált izoleucin-valin (l.lv; bioszintetikus enzimmel rendelkező mikroorganizmus tenyésztését, ahol nevezett enzimet az llvB'N-t, AlsS-t (acetohidroxísav szintetázt), IlvC-t (acetohidro xisav izomex'oreduktázt) és IlvD-t (dihidroxisav dehidratázt) taralmazó csoportból választjuk, Egy másik megvalósításban a ta mány tárgyát olyan HMBPA-mentes pantotenát készítmény előállttá sára irányuló eljárás képezi, amely tartalmazza legalább három deregulált izoleucin-valin (ÜV) bioszintetikus enzimmel rendel keze mikroorganizmus tenyésztését^· ahol nevezett enzimet
X 4
IlvBN-t, AlsS-t (aeeco-hidroxisav szintetázt), IlvC-t (acétohidroMÍsav izomeroreduktázt) és TlvD-t (dihidroxiéáv deMdrátázt) tartalmazó csoportból választjuk.*
Az itt említettek szerint a pantotenát bioszintézis útvonal és/vagy az izoleuoin-valin (l.Iv) biószintézis útvonal enzimjeiről bebizonyosodott, hogy alternatív aktivitásuk létezik az [BJ-3- [ (2-hidroxi-.3-metil-butiril) -amino] -propionsav vagy 3- ((2-hidroxi-3-metil-butiril) -amino]-propionsav („HMBPA) bioszintézis útvonalon, Az (2-hidroxi-3-metil-bu.t.iril) -amino]-propionsav („HMBPA) bioszintézis útvonal kifejezés olyan alternatív bioszlntézis útvonalra utal, amely magába foglalja a pantotenát biószintézis: útvonalhoz és/vagy izoleúcin-valin (./..ív) biószintézis útvonalhoz hagyományosan kapcsolódó, HMBPA kialakulásában vagy szintézisében felhasználásra kerülő bioszintetikus enzimeket és vegyületeket (például szubsztrátokat és hasonlókat). A „HMBPA bioszintézis útvonal kifejezésbe ugyanúgy beletartozik a mikroorganizmusokban HMBPA szintéziséhez (például in vivő) vezető bioszintézis útvonal, mint a HMBP.A in vftro szintéziséhez veze t ö b i os z int é z1s ú t vonal,
A ,,ΗΜΒΡΑ bioszintetikus enzim kifejezés felölel bármely enzimet, amely felhasználásra kerül a HMBPA biószintézis útvénál egy vegyületének (például köztes terméknek) a kialakulásában. Például a 2“hidroxi~.izovaleriánsav (α-HIV) szintézisét a-keto-izovalerátbói (a-KIVj a panEl és panE2 géntermékek (PanEl-re keto-pantoát reduktázként is utalunk itt) és/vagy az IlvC gén terméke (amelyre acétohídroxisav izömeroreduktázkéht ís utalunk itt) katalizálják. HMBPA kialakulását β-alaninból és a-HlV-ból a pa.nG gén terméké ?7,Ö?S/3S ο
♦ ** *4♦ λ ♦ » ·* *♦ X ο « * * * ** *♦ tété %.♦ ο ’Τ (amelyre pantotenát szintetázként is utalunk itt) katalizálja.
Az ,4R}3~ [ (2“h.idroxi3-metil-butiril) -ami no] -propionsav („ikíBPA) kifejezés egyaránt jelenti a HMBPA szabad savas formáját, amelyet ,,[R]-3- [ (2-hidroxi~3-metil-butiril) -amino] -propionátként is említünk és annak bármilyen sóját (amely a 3-[ (2-hidroxi-3-met.il-butiril) -amino] -propionsav vagy 3-( (2-MdxóXi-3-metil-butiril) -amino)-propionát savas hidrogénjének például kalciummal r nátriummal, káliummal, ammóniámmal történő cseréjéből származik}, amelyre mint a ,,3~ ((2-hidroxi-3-metil-butiril)-amino] -propionsav sója' vagy ,,ΗΜΒΡΑ sója utalunk. Előnyben részesített HMBPA sók a kalcium-HMBPA vagy a nátrium-HMBPA. A találmány szerinti WBPA sók közé tartoznak az itt leírt szabad savakból hagyományos módszerekkel, előállított sók. A találmány szerinti HMB.PA só ehhez hasonlóan hagyományos módszerekkel átalakítható a 3-[(z-hidroxí-S-metil-butiril;-amino]-propionsav vagy 3-[(2-hidroxi-3-metil-butiril)-amino]-propionát szabad sav formájává.
Legalább részben arra a felfedezésre alapozva, hogy a pantotenát bioszintézis útvonal és/vagy izoleucín-valin (ily) bioszintézis útvonal túlzott kifejeződése vagy deregulációja - a kívánt pantotenát termelődéshez viszonyítva - HMBPA alternatív termelődéséhez vezethet, a találmány tárgyát olyan mikroorganizmus tenyésztését magába foglaló HMBPA-mentes pantotenát előállítására irányuló eljárás képezi, Amelyben nem csak a pantotenát bioszintézis útvonal és/vagy izoleuein-valin (i.lv) biöSzihtézis útvonal deregulált, de bizonyos további enzimek szelektíven szabályozottak oly módon, hogy HMBPA-mentas pantotenát termelődik, A.z itt leírtak szerint a- „sxelektíwh szabályozott kifejezés n.oWBz azt jelenti, hogy olyan enzimet vagy enzimeket választunk ki szabályozásra vagy juttatunk célba a pantotenát bioszintézis útvonalról és/vagy izoleucin-valln dívj bioszintézis útvonalról, amelyekről ismert, hogy oly módon vesznek részt mind a panrotenát, mind a HMBPA szintézisben, hogy a pantotenát termelődés kedvezményezett a HHBPA termelődéssel szemben. A szabályozáshoz történő kiválasztásra vagy célba juttatásra előnyben részesített enzimek közé tartoznak a PanEl, PanE2, FanB és/vagy Xlvd, £gy megvalósítási formában PanEl szelektívén szabályozott, Kiderítettük, hogy például PanEl túlzott kifejeződése katalizálhatja HMBPA prekurzor képződését, ezért az enzim mennyiségének vagy aktivitásának szelektív szabályozása (például PanEl szintjének vagy aktivitásának némi csökkentése} a termelést HMBPA-tól a pántotanát képződés irányába tolhatja el (azaz a pantotenát termelés kedvezményezett a HMBPA termeléssel szemben). Továbbá rájöttünk, hogy PanE2 a HMBPA termelésnek kedvez. Ennek megtel© lően egy másik megvalósításban- a találmány tárgyát pan£2 gén deléciója vagy szabályozása képezi.
Ehhez hasonlóan fólfedeztük, hogy növekvő Panö aktivitás a termelődést az alternatív HMBPA bioszintézis útvonaltól a pantotenát bioszintézis útvonal irányába tolhatja el, tehát PanB mennyiségének vagy aktivitásának szelektív szabályozása a pantotehát termelődésnek kedvezhet HMBPA termelődéssel szemben, Egy megvalósítási formában PanB aktivitását a panB gén túlzott kifejezésével vagy deregulációjával növeljük. Egy másik megvalósítási formában PanB aktivitását a panB gén többszörös másolatának kifejezésével növeljük, PanB aktivitása fokozható PanB feedback
V7.ÖWM inhibiciójának csökkentésével. Különösen azt sikerült kideríteni, hogy FanB aktivitása megnövelhető a pantotenátből koenzim A-t (CoA-t) képző pantotenát kináz kulcs enzim szabályozása (azaz szelektív szabályozása) révén (US 09/09/667,569 sorozatszámú szabadalmi bejelentés). Pantotenát kináz szabályozása (például a pantotenát kináz aktivitásának vagy szintjének csökkentésével) csökkentette a CoA termelést, PanB feedback inhibiciójának csökkentés® pedig ugyanúgy kedvezett a pantotenát felhalmozódásnak. Egy megvalósítási formában a pantotenát kináz aktivitást csökkentjük (és PanB aktivitását viszont növeljük) CoaA deléciójával és CoaX aktivitás visszafogásával (CoaA és CoaX egyaránt képes katalizálni a CoA bioszintézis első lépését. bivonyos mikroorganizmusokban). Egy másik megvalósítási formában a pantotenát kináz aktivitást csökkentjük· (és PanB aktivitását viszont növeljük) CoaX deléciójával és CoaA aktivitás visszafogásával. Egy még további megyalóáításí formában a pantotenát kináz aktivitást csökkentjük (és PanB aktivitását viszont növeljük) CoaA és CoaX aktivitásának visszafogásával.
A találmány tárgyát még· további szempont szerint ΗΜΕΡΑ mentes pantotenát. előállítására szolgáló eljárás képezi, amely tartalmazza mikroorganizmus tenyésztését olyan körülmények között, amely HMBPA termelődésével szemben pantötenát termelődésének kedvez. Megállapítottuk, hogy - korlátozást nem jelentve - csökkentett stéady state (állandósult) glükóz szinttel, megnövelt steady state oldott oxigén szinttel és/vagy szétin fölösleggel jellemezhető körülmények a HMBPA térmelődés-sel szemben a pantotenát termelődésnek kedveznek. A „csökkentett steady staté glü77.δ7β/Β£ kóz szint olyan steady state glükóz szinteket jelent/ amely kevesebb vagy alacsonyabb a szóban forgó mikroorganizmus tenyésztéséhez szokásosan alkalmazott glükóz szintnél, Például a példákban leirt fíacillus mik.roorganizmusok tenyésztése szokásosan körülbelül 0,2-1,0 g/1 steady state glükóz szinten történik. A csökkentett steady state glükóz szintnek megfelelő koncentráció kevesebb/ mint 0,2 g/1 steady state glükóz. A „megnövelt steady state oldott oxigén szint kifejezés alatt a szóban forgó mikroorganizmus tenyésztésénél szokásosan alkalmazott steady state oldott oxigén szinthez képest megnövelt vagy magasabb oldott oxigén szintet értünk, és ez például fordítottan arányos a csökkentett steady state glükóz szinttel. Például a példákban leírt, a Bacillus mikroorganizmus tenyésztése szokásosan 10-30% oldott oxigén- szint mellett történik. Ennek megfelelően a megnövelt steady state oldott oxigén szint 30%-nál magasabb oldott, oxigén szintet, előnyösen akár 95% oldott oxigén szintet jelent. A „szerin fölösleg kifejezés olyan szer in mennyiségre utal, .amely a szóban forgó mikroorganizmus tenyésztésénél szokásosan alkalmazott szerin szinthez képest megnövelt vagy nagyobb szerin mennyiség. Például a példákban leirt a &9CÍJ..Zus mikroorganizmus tenyésztése szuxúsosan körülbelül 0-2,5 g/1 szerin jelenlétében történik. Ennek megfelelően a szerin fölösleg 2,5 g/l-nél nagyobb mennyiségű szerint, előnyösen körülbelül 2,5-20 g/1 szerint jelent.
Egy még további megvalósítási formában a HMBPA termelésnek teremttok kedvező körülményeket a pantotenat és/vagy izoleucin-val.ín Ulv) bioszintézis útvonal itt definiált prekurzorainak és/vagy köztes termékeinek toveléséval (például mikröörganízm.uso19 kát β-alanin, valin és/vagy a-KIV fölöslegének j eleniétében nyesztve) vagy másik lehetőségként β-alanin betáp 1á 1 á s n é 1 kü 1 lentős mennyiségű β-alanint termelni képes az US 09/09/667,569 sorozatszámú szabadalmi <
:<· *
-'*,V mi kroorgani zmus (azaz bejelentésben leírtak szerinti β-alanintól független mikroorganizmus) tenyésztésével.
A találmány különböző vonatkozásait a továbbiakban a következő alfejezetekben részletezzük.
X. Különböző és/vagy isgoleucin-velin (Ür) éa/v&gy WBPA MósMntetikus enzimeket kódoló gének célba
A találmány tárgyát egy megvalósítási formában a pantotenát és/vagy i zο1eucin-va1 in tílvj és/vagy HMBB bioszintézis útvona lak különböző bioszintetikus enzimjeinek óéiba juttatása vagy módosítása képezi. A találmány tárgyát különösen nevezett útvoHalakhoz kapcsolódó különböző enzimes aktivitások módosítása vagy nevezett bioszintetikus enzimeket kódoló gének megváltottaAz itt leírtak szerint a „gén kifejezés olyan nukleinsav molekulát jelent (például ONS molekulát vagy annak szegmensét)r amery egy szervezetben gének közötti DHS-se.l (azaz a q ént a szervezet kromoszómáiis DNS-áben természetes körülmények és/vagy egymástól. elválasztó közbenső vagy t é r kő a: i ) elválasztható más géntől vagy más génektől. Más)
R lehe cse kélv mértékben átfedhet egy má sík génnel (például az első gén 3’-vége átfed a második gén 5'-végével) egymá ssa1 át fedő gének más génektől vá laszthatók el. Ά gén közvetlenül szintetizálhat enzimet vagy '?7(öZg/Sg rv
Ο egyéb fehérje molekulát (például tartalmazhat kódoló szekvenciákat, például Összefüggő nyílt leolvasási keretet (épen teading frame = ŐRE), amely fehérjét kódol) vagy önmaga játszhat szerepet á szervezetben. Egy szervezetben a gének csoportosulhatnak az itt leírtak szerint egy operonon, nevezett öperont más génektől és/vagy operonoktól a gének közötti DNS választja el. Az itt leírtak szerint „izolált gén olyan génre utal, amely lényegében mentes azoktól a szekvenciáktól, amelyek, természeté© körülmények között szegélyezik a gént annak a szervezetnek a kromoszómáiis DNS-ében ahonnan a gén származik (azaz mentes második vagy elkülönülő fehérjét kódoló szomszédos kódoló szekvenciáktól, szomszédos strukrúrális szekvenciáktól és hasonlóktól) és adott esetben tartalmaz 5* és 3' szabályozó szekvenciákat, például promóter szekvenciákat és/vagy terminátor szekvenciákat. Egy megvalósítási formában az izolált gén túlnyomórészt fehérjét kódoló szekvenciákat tartalmaz (például Bacillus fehérjéket kódoló szekvenciákat). Egy másik megv&lósitási formában az izolált gén tartalmaz fehérjét kódoló szekvenciákat (például Aacillns fehérjét kódoló szekvenciákat) és szomszédos 5? és/vagy 3f szabályozó szekvenciákat annak a szervezetnek a kromoszómá.lis DNS-ébol, amelyből a gén származik (például szomszédos fő és/vagy 3' fíacillus szabályozó szekvenciákat). Az izolált gén előnyösen kevesebb, mint körülbelül 10 kb, 5 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb, 0,2 kb, 0,1 kb, 50 bp, 25 bp vagy 10 bp olyan nükléótid-szekvenciát tartalmaz, amely természeted körülmények között szegélyezi a gént annak a szervézetnek a kromöszómális DNS-ében, amelyből a gén származik.
Az „operon legalább két egymással szomszédos gént vagy QRF-t
77. <5? g,· j>£ foglal magába, adott esetben egymást átlapolva legalább az egyikgén vagy ORF 5’ vagy 3' végi szekvenciájánál. Az „operon kifejezés a génkifejeződés egy koordinált egysége, amely promótert és esetleg szabályozó elemet tartalmaz egy vagy több szomszédos génhez vagy ORF-hez kapcsolva (például bioszintetikus enzimeket kódold struktúrgének). A gének (például struktúrgének) kifejeződése lehet koordináltan szabályozott, például szabályozó fehérjék szabályozó elemekhez történő kötődése vagy transzkripció anti-terminációja révén. Egy operon génjei (példáéi struktúrgéöek) átírhatók az összes fehérjét kódoló egyszálú mRNS-be.
„Mutációt szenvedett gén’''' vagy „mutáns gén kifejezések az itt leírtak szerint olyan nukleotíd-szekvenciával rendelkező génre utalnak, amelyben legalább egy módosítás (például szubsztitúció, ínszerció, deléció) van és nevezett mutáns által kódolt polípeptid vagy fehérje a vad típusú nukleínsav molekula vagy gén által kódolt polípeptid vagy fehérje aktivitásától eltérő aktivitást mutat. Egy megvalósítási formában a mutáns gén által kódolt polípeptid vagy fehérje megnövekedett aktivitást mutat a vad típusú gén által kódolt polípeptiddel vagy fehérjével összehasonlítva, a meghatározást hasönló körülmények között végezve (például ugyanazon a hőmérsékleten tenyésztett mikroorganizmusokban vizsgálva). A „megnövekedett aktivitás vagy „megnövekadett enzimaktivitás azt jelenti, h<.,gy az aktivitás legalább 5%kái nagyobb, mint a vad típusú núkleinsav molekula vagy gén áltál kódolt polípeptid vagy fehérje aktivitása, előnyösen legalább 5-1Q%-kal, alőnyösábben legalább 10-25%-kal, még elonyö?7.v?6/sb:
* * ♦ * X ♦
Φ «* **
V * ** »♦ *.* sebben legalább 25-50%-kal, 50-75%-kál vagy 75-100%-kal nagyobb, mint a vad típusú nukleinsav molekula vagy gén által kódolt eső tartományok, például 75-85%/ 85-90%, 90-95% szintén a találmány oltalmi körébe tartoznak. A „mégnöveködett aktivitás vagy „megnóvekedett enzimaktivitás azt is jelentheti, hogy az aktivitás legalább 1,25-szöröse a vad típusú gén által kódolt pol.i.po.pt id vagy fehérje aktivitásának, előnyösen legalább roea, 5ö-szerese, 100-szorosa a vad típusú gén által kódolt po Λ ipeptid vagy fehérje aktivitásának.
Egy másik megvalósítási formában a mutáns gén po peptid vagy fehérje csökkent aktivitást mutat:
típusú gén által kódolt polipeptiddel vagy fehérjével összehasonlítva, a meghatározást hasonló körülmények között·, végezve (például ugyan azon a hőmérsékleten tenyésztett mikroorganizmusokban vizsgálva),
Az is előfordulhat, hogy a mutáns gén nem kódol polípeptídét vagy a vad típusú polipeptid. csökkentett szintjét termeli.. A „csökkent
| aktivitás vat | j'y „SS ÖkÍ | cent enz ima k r. i vitás | azt jelenti, hogy az |
| a k t i v i t á s 1 egt | dább 51* | -kai kisebb, mint a | vad típusú nukleinsav |
| molekula vagy | gén álta | .1 kódolt polipeptid ? | vagy fehérje aktivitá- |
| s a, a .1 dny Ö s e n | legalább | > 5-10%-kai,· előnyöse | 'bben legalább 10-25%- |
| kai, még előnyösebben | 1aga1ább 25-50 %- ka1, | , 50-75%-kai vagy 7 5- | |
| 10 0 % -ka1 kis eb | b, mint | a vad típusú nuklein | .sav molekula vagy gén |
| által kódólt y | >olipepti | d vagy fehérje aktivj | Ltása. A fent megadott |
| értékek közé | esd tar | t omán yo k, péIdán1 7' | )-85%:, 85-90%, 90-95% |
77.07«/SS φφ** < W X» # * φ♦
Λ * Φ*
ΦΦX» φ * Φ X φ φ φφ szintén a találmány oltalmi körébe tartoznak. Az itt leírtak szerint a „csökkent aktivitás vagy „csőkként anzimakt.ivitás jelenthet deletált vagy „knock ont aktivitást is (például körülbelül 100%-kai kisebb aktivitást, mint a vad típusé nukleinsav molekula vagy gén. által kódolt polipeptid vagy fehérje aktivitása} <
Az aktivitás a szóban forgó fehérjére jól bevált, bármely aktivitás méréssel meghatározható. Az aktivitás mérhető közvetlenül, példán! sejtből vagy mikroorganizmusból, izolált vagy tisztított fehérje aktivitásának mérésével. Másik lehetőségként az aktivitás mérhető vagy meghatározható a sejten vagy mikroor•ganizmuson belül, vagy extracelluláris közegben. Például mutáns gén (azaz nevezett mutáns által kódolt csökkent enzimaktivitás) meghatározása elvégezhető a m.nt.áns gén mikroorganizmusban törté nő kifejezésével például olyan mutáns mikroorganizmusban, amelyben az enzim hőérzékeny - és a mutáns gén vizsgálatával, va jön képes-e komplementéIni a hőérzékeny (temperatnre sensifivé
Ts) mutáns enzimaktivitását. „Megnövekedőtt euzímaktívítást kó doló mutáns gén lehet az, amelyik a Ts mutánst hatékonyabban komplementéÍja, mint például a megfelelő vad típusú gén, „Csökkent enzimaktivitást kódoló mutáns gén lehet az, amelyik a Ts mutánst, kevésbé hatékonyan komplement al j a, mint például a megfelelő vad típusú gén.
A szakember képes megítélni, hogy akár egy egyedi szubszti túció a nukleinsavban vagy génben {például a megfelelő aminosav szekvenciában aminosav cserét kódoló bázis szubsztitúció) drámaian befolyásolhatja kódolt polipeptid vagy fehérje aktivitását összevetve a vad típusú po 1.1 pepiiddel vagy fehérjével. Az itt de finiáltak szerinti mutáns gén (például mutáns pólipeptidet vagy fehérjét kódoló) könnyen megkülönböztethető homológ fehérjét kódoló nukieinsavtól vagy géntől, mivel a mutáns gén megváltozott aktivitással rendelkező fehérjét vagy pólipeptidet kódol, amely adott esetben eltérő tehetipánként figyelhető meg abban a mikroorganizmusban, amely kifejezi a nevezett mutáns gént vagy termeli a nevezett mutáns fehérjét vagy pólipeptidet (azaz a mutáns mikroorganizmusban) összevetve a vad típusú gént kifejező mikroorganizmussal. Ennek ellenére a homológ fehérje rendelkezhet azonos vagy lényegében hasonló aktivitással, adott esetben fenotipusosan nem észrevehető, ha mikroorganizmusban termelődik, Összevetve a vad típusú gént kifejező mikroorganizmussal. Ennek megfelelően nem a szekvencia azonosság mértéke a döntő nukleinsav molekulák* gének, fehérjék vagy pólipeptidek esetében a homológok és mutánsok megkülönböztetésénél, hanem inkább a kódolt fehérje vagy polipeptid aktivitása az, amely megkülönbözteti egymástól a homológokat és mutánsokat: például kevés szekvencia azonosságot (például 30-50% szekvencia azonosságot) mutató homológoknak lehet lényegében ekvivalens funkcionális aktivitásuk, míg például 99%-os szekvencia azonosságot mutató mutánsok rendelkezhetnek drámaian eltérő vagy megváltozott funkcionális aktivitással.
á szakember számára az is nyilvánvaló, hogy a találmányban felhasználásra kerülő nukleinsav molekulák, gének, fehérjék vagy pölipeptidek s-zárma zhatnak bármilyen, HmBPA bíoszintézis útvonallal., ilv bioszintézis útvonallal vagy pantotenát. bioszintézis útvonallal rendelkező mikroorganizmusból. Ilyen nukleinsav molekulákét, géneket, fehérjéket vagy polipsptideket a szakember is* í ; t ·» “ mert technikák - úgymint homolőgia söreenalés, szekvencia összehasonlítás és hasonlók - felhasználásával képes azonosítani, A szakember képes módosítani is ezekét oly módon, hogy e nukleinsav molekulák, gének, fehérjék vagy polipeptídek rekombináns mikrcorganizmusban kifejeződjenek vagy termelődjenek (például megfelelő promóterek, riboszóma kötő-helyek, expresszié® vagy integrációs vektorok felhasználásával, a gének szekvenciájának oly módon történő módosításával, hegy fokozódjon a tranázkrlpció (figyelembe véve a preferálható kódon használatot), az itt leírt és a szakmában ismert technikák segítségével).
Égy megvalósítási formában a találmány szerinti gének Grampozitív mikröcrgáhizmusból származnak (azaz olyan mikreorganizmusból, amely megtartja a bázikua színezékét, például kristályibolyát a mikroorganizmust körülvevő Gram-pczitív sejtfalnak köszönhetően) . A „származás (például Gram-pozitív mikroorganizmusból „származó) olyan génre utal., amely természetes körülmények között megtalálható a mikroorganizmusban (például természetes körülmények között megtalálható Gram-pozxtív mikroorganizmusban), Előnyben részesített megvalósításban a találmány szerinti gének á Buciilusz Cö,ryneha éteri um (Cö,ryaebacÉ:e.rÍOT glufcamícum) , Lact^>ac.l.llus, Lactococc-us és Streptomyces nemzetségeket tartaImazó csőpor tbó1 választo11 mikrοorg a n i zmusokbó1 s zá urna znak. Még inkább előnyben részesített megvalósifásban a találmány szerinti gének a. Bacillus nemzetségbe tartozó mikrcorganizmusból szármáznák. Egy másik előnyben részesített megvalósításban a találmány szerinti gének a nacilJus subtllisz Baóillus lentimor.öus, Bacillus lentúS/ Bací.llus fAíKs. Bac.illuz pantothertícus,
77.WS2
Baoillus arnyloiiguefaciéns,, Bacillus cereu-s, BacíIIms clrcuJansz Baoillus ccagülans, SádiAs líobénifarmisz ÉáoiHus megateriu.m, Bacíllus pumXlus, BacXllus thürXngiensís, Baoillus feálodürans és egyéb, 1> csoportba tartozó, például 16S r.RNS típussal jellemezhető Bacillus fajok. Egy másik előnyben részesített megvalósítási formában a gén Baoú.Zlus brovXs-bő.1 vagy Bácíiiua stasrothermcphXlus-ból származik. Egy másik előnyben részesített megválósitási formában a találmány szerinti gének a BacXXius lioheniforrnia/ Baoiliw arnylöliguefácíéns, Baeilius subtHXs és Baoíl2us pumiius fájókat tartalmazó csoportból választott mikroorganizmusból származnak. Különösen előnyben részesített megvalósítási formában a gén Bacilius subáiXia-ből származik (azaz Baoillus subtiiís-származék). A ,,ΰαο.ϊίius subtiiis-ből származó vagy ^Bacílius subtiilá-származék kifejezések olyan génre utalnak, amely természetes körülmények között megtalálható a Saciilus subtiifs mikroorganizmusban. A találmány oltalmi körébe tartoznak BeáiHas-származék gének (például B. sübtilis-származék gének) , például BaciXIus vagy B. subtilis coaX gének, seré gének, glyA gének, ocaA gének, pan gének és/vagy iiv gének.
Egy másik megvalósítási formában a találmány szs-.nií gének Sram^negatív mikroorganizmusokból (bázikus színezéket kizáró mikroorganizmusokból) származnak. Előnyben részesített megvalósítási formában a találmány szerinti gének a Salxnonella (például Salmonella typhimurium), Escherichia, Kiebsieila, Eerratia és Áro fétis nemzetségeket tartalmazó csoportból választott mikroorganizmusokból származnak. Még inkább előnyben részesített megvalósítási formában a találmány szerinti gének az Escherichía nem77. 07<s/Í5£
*χ ♦ » ♦ ♦ *
X > Φ*
Λ X *
ΦΦ
X:
etségbe tartozó mikroorganizmusból .származnak. Még eim él is inkább előnyben részesített megvalósítási formában szerinti gének Sscharicnia colí-ból számainak·. Egy a találmány másik megvalósitási formában találmány szerinti gének a da noha romycw
XX. Rekombináns nuMéinsav molekulák és vektorok
A találmány további, tárgyát képezik olyan rekoitoináns mikisins av moIe ku1ák (például rekombináns DNS molekulák) t amelyek tartalmazzák az itt leírt géneket, (például izolált géneket) , előnyösen i/adlius géneket, még előnyösebben Sadllus suótilis géneket, még ennél is előnyösebben .Sadllus subdlis pantotenát tikos nana intetikus génekét géneket és/vagy é s / va g y i z ο 1 mucin- v a 11 n (11 v) bi. o s z .1 n t a HM3PA bioszintetikus géneket. A „rekombinukleinsav molekula kífeiezés olv modon. megváltoztatott, módosított vagy genetikailag átalakított u u k 1 e i. n s a v mo 1 e k u Iá r a (például DNS molekulára) utal, amelynek n u k 1 e o t i d - s z e k v e n c i á j a (például egy vágy több nukleotid addiciój ával, delécióiával vagy szubsztitúciójával} a natív vagy dúló azon nukleínsav molekulától, amelyből a rekombínáns nuklsinsav molekula származik. A rekombínáns nukleinsav molekula (példáül rekombináns DNS molekula) előnyösen szabályozó szekvendákkal működőképesen összekapcsolt találmány szerinti izolált gént tartalmaz. A „szabályozó szekvenciákkal működőképesen őszbekapcsold kifejezés azt jelenti, hogy a szóban forgó gén nukleotid-szekvenciája oly módon kapcsolódik szabályozó szökvénólával vagy szekvenciákkal, hogy lehetővé válik a gén kifejeződése (például fokozott, megnövekedőtt, konstitutív, minimális,
77.076/BE
legyengített, csökkent vagy kifejeződése), előnyösen a gén által kódolt termék kifejeződése (például ha a rekombináns nukleinsav molekula az itt. .leírtak szerint rekombináns vektorban van és azt. bevezetjük egy mikroorganizmusba} ,
A „szabályozó szekvencia kifejezés olyan nukleinsav-szekvenoíát jelent, amely más nukleinsav-szekvenciák (például gének} kifejeződését befolyásolja (például módosítja vagy szabályozza). Egy megvalósítási formában a szabályozó szekvencia hasonló vagy azonos pozícióban és/vagy orientációban helyezkedik el a rekombináris nukleinsav molekulában, mint a szóban forgó gén, megfigyelve a szabályozó szekvenciát és a szobán forgó gént, elhelyezkedésük (például natív pozícióban és/vagy orientációban) természetesnek tűnik. Például a szóban forgó gént a rekombináns nukleinsav molekula tartalmazhatja működőképesen Összekapcsolva olyan szabályozó szekvenciával, amely a természetes szervezetben a szóban forgó génhez tartozik vagy szomszédos azzal (például működőképesen hozzákapcsolva natív szabályozó szekvenciákhoz, például natív promóterhes). Másik lehetőségként, a szóban forgó gént a rekombináns^ nukleinsav molekula tartalmazhatja működőképesen összekapcsolva olyan szabályozó szekvenciával, amely a természetes szervezetben egy másik (például eltérő) génhez tartóz) k vagy szomszédos azzal. Másik lehetőségként, a szóban forgó gént a rekombináns nukleinsav molekula tartalmazhatja működőképesen összekapcsolva egy másik szervezetből származó szabályozó szekvenciával. Például más mikrobákból származó szabályozó szekvenciák (például más bakteriális szabályozó szekvenciák, bakteriofág szabályozó szekvenciák és hasonlók) kapcsolódhatnak műkő-
dőképesen a szóban forgó génhez.
Egy megvalósítási formában a szabályozó szekvencia nem-natív vagy a természetben nem előforduló szekvencia (például módos!
tott, mutáns, szubsztituált, származtatott, deistáit szekvencia.
véne ákat), Előnyben részeközé tartoznak proraóterex, fokozók ienhaneers), termínácíós szignálok, anti-terminációs szignálok és egyéb expressziós kontroll elemek (például olyan szekvenciák, amelyekhez represszorok vagy inducerek kapcsolódnak és/vagy transzkripciós és/vagy transzlációs szabályozó fehérjék kötő he ivei, például az átirt mRNS-ben) . ilyen szabályozó szekvenciákat például Sambrook és munkatársai ÍSambrook, J,, and
Maniatis, T., híolecular Cloning: A Laboratory
Manual,
2nd ed,, tartóz^ nak mikroorganizmusban nukleotid-szekvencia konsti utiv prömóterek és erős konstitutív promóterek) , azok a szekvenciák, nu ki eotid-szekve n c i a indu ká 1 ha t ó irányítják, (például. indukálható promóterek, például xilóz indukáIható nromóterek) és azok a szekvenciák, amelyek mikroorga.nizmusban nukleot i d-szekvencia kifej eződését gyengíti k (attónustej attenuáoiós szignálok, vagy fepreszvéneiét. eltávolításával vagy deléeiójával. Például a transzkripció negatív szabályozásában részt vevő szekvenciák eltávolítása30 val a szóban forgó gén kifejeződése fokozható.
Egy megvalósítási formában a találmány szerinti rekombináns nukleinsav molekula legalább egy bakteriális génterméket (például pantotenát bioszintetikus enzimet, izoleucin-valin bioszintetikus enzimet és/vagy HMBPA bioszintetikus enzimet) kódoló nuk~ leinsav-szekvenciát vagy gént tartalmaz működőképesen hozzákapcsolva promóterhez Vagy promóter szekvenciához« Előnyben részesitett találmány szerinti promóterek közé tartoznak Baoillos prcmóterek és/vagy bakteriofág promöterek (például Bádiiitís fajokat fertőzni képes bakteriofág prömótere). Egy megvalósítási formában a promóter
Bacdllus promóter, előnyösen erőé Badliüá promóter (például a
Bacillus biokémiai hcusekeepíng génjéhez kapcsolódó pr omó tér vagy a Sácúlius glikelitikus útvonalának génjéhez kapcsolódó promóter) . Egy másik még valósítási formában a promóter bakteriofág promóter. Előnyben részesített megvalósítási formában a promóter az SP01 bakteriofág prumótere,. Ólö.nősen előnyben részesített megvalósítási formában a promótert a /
1¼ vagy Ρνΐί,~ promóterekst tartalmazó csoportból választjuk, melyeknek szekvenciája remire a következő:
<TTTAATTACAGGCGGGGGCAACCCCGCCTGT (1. számú szekvencia),
ben részesített promótó.kék közé tartoznak a te.f (a transzlációs eloiHjációs faktor (TEF) promóter) és pyc (a píruvát karboxiláz (PVC) promoter), amelyek elősegítik a magas színtű kifejeződést Bácillus-ban (például Sacíllus snbt.1i.is-ben) . További előnyben részesített ~ korlátozást azonban nem jelentő — promóterek Grampozitív baktériumokban történő felhasználáshoz az amy és SPO.2 proHióterek. További előnyben részesitett - korlátozást azonban nem jelentő - promóterak például Gram-negatfv mikroorganizmusok· bah történő alkalmazáshoz a cos, tac, t.rp, tét/ trp-tet, ίρρ, lacz Ipp-lac, lacIG, Τ'Λ T5, T3, gal, trc, ars, SPű, λ-PR vagy λ-PL.
Egy másik megvalósítási formában a találmány szerinti rekombináns nukleinsav molekula terminátor szekvenciát vagy tét~ minátör szekvenciákat (például transzkripciós terminátor szekvenciákat) tartalmaz, A „terminátor szekvencia* kifejezés olyan szabályozó szekvenciát jelöl, amely mRNS transzkripciójának lezárását (termináoióját) szolgálja, Terminátor szekvenciák (vagy tandem transzkripciós terminátorck) szolgálhatják még a mRWS: stabilizálását (például mRNS-hez struktúra hozzáadásával), például nukleázokkal szeriben.
Egy másik megvalósítási formában a találmány szerinti rekombináns nukleinsav molekula olyan szekvenciákat tartalmaz, amelyek lehetővé teszik nevezett szekvenciákat (azaz kimutatható és/vacíy szelekciós markereket) tartalmazó vektor kimutatását, például antibiotikum rezisztenciát kódoló géneket vagy auxotróf m07szar
«. » » ' χ *· * »
* ♦ * «♦ * *
mutációkat kompiómentélni képes géneket, például tzpC-t, drog markereket, fluoreszcens markereket és/vagy kolorimet.ríás markereket (például lacE/p-'galaktoaidázt). Egy még további megvalósítási .formában a találmány szexmnti rekombináns nukleinsav molekula mesterséges riboszóma-kötő helyet (ribosome binding site ~ RBS) vagy mesterséges RBS-be átíródó szekvenciát tartalmaz. A „mesterséges riboszóma-kötő hely (RBS) kifejezés olyan helyet jelöl egy mRNS (például DNS~en kódolt) molekulán belül, amelyhez riboszöma kötődik {például a transzláció elindítására) és amely legalább égy nukleotidban eltér a natív RBS-tól (például terme
Előnyben részesí11-12, 13-15 vagy több eltér natív RBS-től (például a szobán forgó gén natív RBS-étől, például a natív panB RS.S~t.01,. melynek vagy a natív panb RSS-től, melynek szekvenciája: ATTCGAGAAATG
GAGAGAATATAATATG (5. számú szekvencia)) , Az eltérő nukleotidok előnyösen oly módon szubsztituáltak, hogy azonosak legyenek egy ideális RB3 egy vagy több nukleotidjával optimális Összehasonlító sorbaállifásnál.
Ideális RBS-ek közé tartóznak korlátozást > z* > Ík szekvencia), szekvencia), (9 ékvénela)
r.rV&E
AGAAAGGAGGTGANNNNNNATG (10. számú szekvencia) . Mesterséges RBS-ek felhasználhatók az egyes génekhez kapcsolódó/ természetben előforduló vagy natív RBS-ek helyettesítésére. Előnyben részesített mesterséges RBS-ek (például panB, különösen 8. aubtdfis panB transzlációját növeld BBS-ekj közé tartozik: CCCTCTAGAAGGAGGAGAAAACATG (11. számú szekvencia) és CGCTCTAGAGGAGGAGAAAACATG (12. számú szekvencia). Előnyben részesített mesterséges RBS-ek (például pánt), különösen B. subtilís pa.aD transzlációját növelő RBS-ek) közé tartózik: TTAGAAAGGAGGATTTAAATATG (13. számú szekvencia), TTAGAAAGGAGGTTTAATTAATG (14. s zámú szekvenc1a), TTAGAAAGGAGGTGATHAAATG (15. számú szekvencia) , TTAGAAAGGAGGTGTTTAAAATG (16. számú szekvencia), ATTCGAGAAAGGAGGTGAATATAATATG (17. számú szekvencia), ATTCGAGAAAGGAGG1OAATAATAATG (18. számú szekvencia) és ATTCGTAGAAAGGAGGTGAATTAATATG (19. számú szekvencia) .
A találmány tárgyát képezik továbbá nukleinsav molekulákat (például géneket vagy nevezett géneket tartalmazó rekömbináns núkleinsav molekulákat) tartalmazó vektorok (például rekombináns vektorok) az itt leírtak szerint. A „rekombináns vektor kifejezés olyan vektorra (például plazmid, fág, fazmíd, vírus, kozmád vagy egyéb tisztított nukleinsav vektorra) utal, amely oly .módon megváltoztatott, módosított vagy genetikailag átalakított, hogy több, kevesebb vagy eltérd nukleinsav-szekvenciával rendelkezik, mint az a natív vagy természetben előforduló nukleinsav molekula, amelyből a rekombináns vektor származik. A rekombináns vektor előnyösen bioszintetikus enzimet kódoló gént vagy nevezett gént hordozó rekombináns nukleinsav molekulát, tartalmaz működőképesén hozzákapcsolva szabályozó szekvenciákhöz, például promóter szekvenciákhoz, termínátor székvenciákhoz és/vagy mesterséges r·*beszórna-kötő helyekhez (RES-ekhez) az itt leírtak szerint. Egy másik magvalósitási formában a találmány szerinti rekömbi-náns vektor tartalmaz olyan szekvenciákat, amelyek fokozzák a repít kádót baktériumokban (például reputációt fokozó szekvenciákat) > Egy megvalósítási formában a replikádét fokozó szekvenciák £. coli-ban működőképesek. Egy másik megvalósítási formában a replikádét fokozó szekvenciák pBR322 plazmádból származnak.
Egy még további megvalódtási formában a találmány szerinti rekombináns vektor antib1o11kum xezisztencia szekvenciákat tartalmaz. Az .„antibiotikum rezisztenda szekvencia olyan szekvenciát jelöl, amely elősegíti vagy átadja az adott antibíötikummal szembeni érzéketlensége (rezisztenciát) a gazdaszervezetnek(például Buciilus-nak) . Egy megvalósítási formában az antibiotikum rezisztencia szekvenciákat a következőket tartalmazó csoportból választjuk: oat (kióramfenikol rezisztencia) szekvencia, tét (tetracíklin rezisztencia) szekvencia, erm (eritromicin rezisztencia) szekvencia, neo (neomicín rezisztencia) szekvencia, kan (kanamicin rezisztencia) szekvencia és spec (spectinomicin rezisztencia) szekvencia. A találmány szerinti rekombínáns vektorok tartalmazhatnak továbbá homológ rekombinációs szekvenciákat (például a szóban forgó génnek a gazdaszervezet kromoszómájába történő rekombinációja lehetővé tételére). Például bpr, vpr vagy amyE özekvéndák alkalmazhatók, mint homólógia célpontok a gazdaszervezet kromoszómájába történő rekombinációhoz. A. szakom77.Ö7Ö/W •’d Rt .
·.:·’./· ·~· bér számára nyilvánvaló, hogy a vektor- megtervezése olyan faktorok függvénye, mint a genetikailag módosítandó mikroorganizmus kiválasztása, a kívánt géntermék kifejeződési szintjének megválasztása és hasonlók.
XV. Rekombináns mikroorganizmusok
A találmány tárgyát képezik továbbá az itt leirt vektorokat vagy géneket (például vad típusú vagy mutáns géneket) tartalmazó mikroorganizmusók, azaz rekombináns mikröörganizmusok. Az itt leírtak szerint a „rekombináns mikroorganizmus kifejezés olyan genetikailag megváltoztatött, módosított vagy manipulált (például genetikailag átalakított) mikroorganizmust (például baktériumot, élesztőt, gombát, sík.) jelent, amely ahhoz a természetben előforduló mikroorganizmushoz képest, amelyikből származik, megváltozott, módosított vagy eltérő genotípust és/vagy fenotipust mutat (például ha a genetikai módosítás érinti a mikroorganizmus kódoló nukleinsav-szekvencíáit).
Egy megvalósítási formában a találmány szerinti rekömbináns mikroorganizmus Gxam-pozitív szervezet (azaz olyan mikroorganizmus, amely megtartja a bázikue színezéket, például kristályibolyát a mikroorganizmust körülvevő Gram-pozitív sejtfalnak köszönhetően). Előnyben részesített megvalósításban a találmány szerinti rekömbínáns mikroorganizmus a Bacillus, Coryaabacteríum, lactobaoillps, laotőcoccus és Sfreptomyces nemzetségeket tartalmazó csoportból választott mikroorganizmus. Még inkább előnyben részesített megvalósításban a találmány szerinti rekömbináns mikroorganizmus a Sacillus nemzetségbe tartozó mikroorganizmus. Egy másik előnyben részesített megvalósításban a talál
7. Ö7 is/BE mány szerinti rekombináns mikroorganizmust a naoillus subtiliso Sacillus xentimorbüs, EaoilUís lentus, Bacilius firmus, Baunillus pantothentícna, Bac.í.Zlus amyloliguefaciens, Sacillus cereus, Baci 1..?.us circulárs, Bacilius' coagulans, Sádllus J.ichenifbrmi&', Baeillus zuegaterium, Bacrllus pumilus, Bacillus thuringiensis, SacJJhm Jialodurans és egyéb, 1. csoportba tartozó, például 168 rRNS típussal jellemezhető Baci.llüs fajokat tartalmazó csoportból választjuk. Egy másik előnyben, részesített megvalósítási formában a rekombináns .mikroorganizmus Baclllus brevis vagy BaoZUus sfearothermopbílus. Egy másik előnyben részesített megvalósítási formában a találmány szerinti rekombináns mikroorganizmus a Bacílius J.;i oh sní bozxmi s, Bacfllus <3mylvl.iquefscíefí$s Bacíllus subtilig és Saóillus pumiius fajokat tartalmazó csoportból választott mikroorganizmus.
Egy másik megvalósítási formában a találmány szerinti rekombináns mikroorganizmus Gram-negativ mikroorganizmus (bázikus színezéket kizáró mikroorganizmusokból), Előnyben részesített megvalósítási formában a találmány szerinti rekömbináns mikroorganizmus a SalmoneHa, Bsclvm ?eb; a, Klebslelia, Serratia és Btoteus nemzetségeket tartalmazó csoportbál választott mikroorganizmus. Még inkább előnyben részesített megvalósítási formában a találmány szerinti rekombináns mikroorganizmus az Escherlcbia nemzetségbe tartozó mikroorganizmus. Még ennél is inkább előnyben részesített megvalósítási formában a találmány szerinti rekombináns mikrocrganizm.us Escheriobíg coli. Egy másik megvalósítási formában a találmány szerinti rekombináns mikroorganizmus 8acGúaromyee.s (például o, cereviszae)....
77.CW8®
A találmány szerinti „rekombináns mikroorganizmus dereguIáit pantotenát bíoszintézis útvonallal, vagy enzimmai, dereguIáit izoleucin-valin (ílv) bioszintézis útvonallal vágy enzimmel és/vagy módosított HMBPA bioszintézis útvonallal vagy enzimmel rendelkező mikroorganizmus, A „deregulált vagy „dereguláció kifejezés egy mikroorcsanizmus legalább egy - bioszintetikus enzimet kódoló - génjének oly módon történő megváltoztatását vagy módosítását jelenti, hogy a bioszintetikus enzim szintje vagy aktivitása a mikroorganizmusban megváltozik vagy módosul. Előnyösen legalább egy - bioszintetikus enzimet kódoló - gén változik meg vagy modósul oly módon, hogy a géntermék fokozódik vagy megnő. A „deregulált bioszintézis útvonal kifejezés olyan bioszintézis útvonalat is jelenthet, amelyben egynél több ~ bioszintetikus enzimet kódoló - gén változik meg vagy módosul oly módon, hogy egynél több bioszintetikus enzim szintje vagy aktivitása változik meg vagy módosul. Egy bioszintézis útvonal „deregulá™ fásának 'például adott bioszintézis útvonalon egynél több gén egyidejű deregulációjának) képessége egy mikroorganizmusban néhány esetben az adott mikroorganizmus iónoménjóból ered, amenynyiberi egynél több enzimet (például két vagy három bioszintetikus enzimet) a genetikai anyag egy összefüggő darabján egymással szomszédosán elhelyezkedő gének - melyeket „operon-nak nevezünk (korábban definiáltuk) - kódolnak. Egy pperonban foglalt gének egymással összehangolt szabályozásának köszönhetően az egyedüli pror.öi er és/vagy szabályozó elem megváltoztatása vagy módosítása az operon által kódolt minden egyes géntermék megváltozott vagy módosult kifejeződését eredményezheti. A szabályozó elem megvál77.074 7SB ♦6♦* ♦
** toztatá-sa vagy módosítása - korlátozás nélkül - jelentheti az endogén promóter és/vagy szabályozó elem(ek) eltávolítását, erős promóterek, indukálható promóterek vagy összetett promóterek hozzáadását vagy szabályozó szekvenciák oly módon történő eltávolítását, hogy a géntermék kifejeződése megváltozzon, az operán kromoszómái is elhelyezkedésének módosítását, az operonnal szomszédos vagy az operonon belüli nukleínsav-szekvencíák, úgymint ribosgóma-kötő hely megváltoztatását, az operon példányszámának növelését, az operon transzkripciójában és/vagy az operon géntermékeinek transzlációjában részt vevő' fehérjék (például szabályozó fehérjék, szupresszorok, fokozók, transzkripciós aktivátorok és hasonlók} módosítását vagy gének kifejeződésének bármilyen, a szakmában rutinszerűen alkalmazott egyéb hagyományos eszközzel történő deregulációját (beleértve - korlátozást azonban nem jelentve - antiszenz nukleinsav molekulák felhasználását, például repxesszor fehérjék kifejeződésének blokkolására) .. A dereguláció magába foglalhatja egy vagy több gén kódoló régiójának megváltoztatását is, például feedback rezisztens, vagy nagyobb vagy alacsonyabb specifikus aktivitású enzim kinyerése érdekében.
Egy másik előnyben részesített megvalósításban a rekombináns mikroorganizmust úgy tervezzük meg és alakítjuk ki, hogy legalább egy pantotenát bioszintetikus enzim, legalább egy ízoleucin-valin bioszintetikus enzim és/vagy legalább egy HMBPA. bioszintetikus enzim túlzottan kifejeződjön. A „túlzott kifejeződés azt jelenti, hogy a géntermék (például bioszintetikus enzim) magasabb szinten fejeződik ki, mint a mikroorganizmus genetikai átalakítása előtt vagy egy olyan összehasonlítható mikro77.Ö7S/SS
4444 44 ** ;
*í ♦ * * ♦ * χ * * * 4 * * X .4 4 4 *»/%- « organizmusban, amelyet nem manipuláltunk. Egy megvalósítási formában a mikroorganizmus lehet genetikailag oly módon tervezett vagy átalakított, hogy a génterméket túlzottan kifejezze, magasabb szinten, mint ahogyan egy nem manipulált összehasonlítható mikroorganizmusban kifejeződik.
Genetikai átalakítás - korlátozást nem jelentve - magába foglalhatja, az adott gén kifejeződésével összefüggő szabályozó szekvenciák vagy helyek megváltoztatását vagy módosítását (például erős promóterek, indukálható promóterek vagy összetett promóterek hozzáadásával vagy szabályozó szekvenciák oly módon történő eltávolításával, hogy a kifejeződés konstitutív legyen), az adott gén kromoszómáira elhelyezkedésének módosítását, az adott génnel szomszédos nukleinsav-szekvenoiák, úgymint fihöszóma-kötő hely megváltoztatását, az adott gén példányazárnának növelését, az adott gén transzkripciójában és/vagy az adott gén termékeinek transzlációjában részt vevő fehérjék (például szabályozó fehérjék, szupresszorok, fokozók, transzkripciós aktivátorok és hasonlók) módosítását vagy egy adott gén kifejeződésének bármilyen, a szakmában rutinszerűen -alkalmazott egyéb hagyományos eszközzél történő deregulációját (beleértve - korlátozást azonban nem jelentve - autiszenz nukleinsav molekulák íelhasználásat, például rspresszor fehérjék kifejszedésének blokkolására) < Genetikai módosításba beletartozhat gén deléciója is, például bioszintézis útvonal blokkolása vagy represszor eltávolítása céljából.
Egy másik megvalósítási formában a mikroórganízmüs .lehat fizikailag vagy környezetileg manipulált, hogy a géntermékét túlzottan kifejezze, magasabb szinten, mint ahogyan egy nem manipu* * 4 ♦ <
>44 ♦
Iáit összehasonlítható mikroorganizmusban kifejeződik. Például a mikroorganizmus kezelhető az adott gén. transzkripcióját és/vagy az adott gén termékének transzlációját tudottén vagy sejthetően növelő vegyszerrel, vagy tenyészthető annak jelenlétében oly módon, hogy a transzkripció és/vagy transzláció fokozódik vagy növekszik. Másik lehetőségként a mikroorganizmus tenyészthető az adott gén transzkripciójának és/vagy az adott gén terméke transzlációjának növelésére kiválasztott hőmérsékleten oly módon, hogy a transzkripció és/vagy transzláció fokozódik vagy növekszik.
V. Rekombináns mikroorganizmusok tenyésztése és fermentálása
A „tenyésztés' kifejezés a találmány szerinti élő mikroorga nizmus fenntartását és/vagy szaporítását (például egy kultúra vagy törzs fenntartását és/vagy szaporítását) jelenti. Egy megvalósítási formában a találmány szerinti mikroorganizmust folyékony tápközegben tenyésztjük. Egy másik megvalósítási formában a találmány szerinti mikroorganizmust szilárd tápk.özegben vagy félig szilárd tápközegben tenyésztjük. Előnyben részesített magva lósításban a találmány szerinti mikroorganizmust a mikroorganizmu s fe nnt a rt ásáh oz és/vag y s a apó r ításáho z né1kü1ö zhe t et1en vagy kedvező hatású tápanyagokat (például szénforrást vagy széntartalmú szubsztrátot·, úgymint például szénhidrátot, szénhidrc-géne ket, olajokat, zsírokat, zsírsavakat, szerves savakat és alkoho lókat; nitrogén forrást, úgymint például peptont, élesztők!vonatot, húskivcnatot, malátakivonatot, karbamidot, ammóuium-szulfá tot, ammóníum-klóridot, ammónium-nxtrátét és ammóniúm-foszfátot; foszfor forrást, úgymint például foszforsavat, ennek nátrium és kálium sóját; nyomelemeket, úgymint magnéziumot, vasat, mangánt,
77.07S/SZ kalciumot, rezet, cinxct, bort, molibdént és/vagy kobaltot tártálmázd sókat ugyanúgy, mint növekedési faktorokat, úgymint arainosavakat, vitaminokat növekedést fokosokat és hasonlókat) tartalmazó tápközegben (például steril, folyékony tápközegben) tenyésztjük.
A találmány szerinti mikroorganizmusokat előnyösen ellenőrzött pH mellett tenyésztjük. Az „ellenőrzött pH olyan pH értéket jelent, amely a kívánt termék (például pantoát -és/vagy pantötenát) termelődését eredményezi. Egy megvalósítási formában a mikroorganizmust körülbelül 7 pH értéken tenyésztjük.. Egy másik megvalósítási formában a mikroorganizmust 6,0 és 8,5 pH közötti értéken tenyésztjük. A kívánt pH érték a szakmában ismert számos módszer bármelyikével fenntartható.
Előnyben részesített megvalósítási formában a találmány szerinti mikroorganizmusokat ellenőrzött levegőztetés mellett tenyésztjük. Az „ellenőrzött levegőztetés a kívánt termék (például pantoát és/vagy pantotenát) előállításához elegendő mértékű levegőztetést (azaz oxigén ellátást) jelent. Egy megvalósítási formában a levegőztetést a tenyészetben az oxigén színt szabályozásával kontrolláljuk, például a tápközeg oldott oxigén tartalmának szabályozásával. A levegőztetés kontrollját a tápközegben előnyösen a tenyészet keverésével biztosítjuk. A keverés megoldható propellerrel vagy hasonló mechanikai keverő berendezéssel, a tenyésztő edény (például kémcső vagy lombik) forgatásával vagy rázásával vagy különböző pumpáló berendezéssel. A levegőztetés biztosítható továbbá steril levegő vagy oxigén átáramoltatásával a tápközegen (például a fermentáciőa keveréken keresztül), A találmány szerinti mikroorganizmusokat előnyöséé fölösleges habzás nélkül {például habzásgátlö adagolása mellett.) tenyésztjük.
A találmány szerinti mikroorganizmusokat továbbá ellenőrzött hőmérsékleten tenyésztjük. Az „ellenőrzött hőmérséklet/ a kívánt termék (például pantoát és/vagy pantotenát) előállítását eredményező bármilyen hőmérsékletet felölel. Egy megvalósítási formában az ellenőrzött hőmérséklet tartománya 15 °C és 95 °C közötti. Egy másik megvalósítási formában az ellenőrzött hőmérséklet 15 °C és 70 °C között van. Előnyben részesített hőmérsékletek a 20 °C és 55 °C közötti, még előnyösebben a 30 °C és 50 0C közötti hőmérsékletek«
Mikroorganizmusok tenyészthetők (például fenntarthatók és/'vagy szaporíthatok) folyékony tápközegekben, és előnyösen vagy folyamatösáh vagy szakaszosan tenyésztjük azokat hagyományos tenyésztési eljárásokkal, úgymint állandó tenyészetben, kémcső kültúrábáh, rálátott kultúrában (például körkörösen rálátott kultúrában, rázatott lo.mbi.kos tenyészetben, stb.) levegőztetett pörgetett kultúrában vagy fermentációban. Előnyben részesített megvalósításban a mikroorganizmusokat rázatott lomb!kokban tenyésztjük. Még előnyösebb megvalósífásban a mikroorganizmusokat. fermentorban (például fermentációs eljárássá!) tenyésztjük. A találmány szerinti fermentációs eljárások közé tartoznak - korlátozást azonban nem jelentenek - a batch, fed-batch és folytonos fermentációs eljárások vagy módszerek. A „batch eljárás·' vagy „batch fermentáció’ elnevezés olyan rendszerre utal, amelynél a tápközeg összetevőit, tápanyagokat, tápanyag kiegészítőket és hasonlókat a fermentáció kezdetekor állítjuk össze és nem eszközölünk változtatást a fermentáció során, kivéve az olyan faktorokat, mint a pH vagy oxigén koncentráció, amelyek kont77.Ö7S/BS rolljára szükség van a tápközeg elsavasodásának és/vagy a mikroorganizmusok pusztulásának elkerülése érdekében. A „fed-batch eljárás vagy „fed-batch fermentáció elnevezés szakaszos fermentációra utal, azzal a kivétellel, hogy egy vagy több szabszfcrátot vagy kiegészítőt a fermentációs folyamat előrehaladtával adagolunk (például növekvő adagokban vagy folyamatosan). A „folytonos eljárás vagy „folytonos fermentáció elnevezés olyan rendszerre utal, amelynél definiált fermentációs tápközeget adagolunk folyamatosan a fermentorba és egyidejűleg ugyanolyan mennyiségű, használt vagy „kondicionált tápközeget távolitünk el a ferméntorből, előnyösen a kívánt termék (például pantoát és/vagy pantotenát) kinyerésével. Ilyen eljárások különböző változatait fejlesztették ki és ezek jól ismertek a szakmában.
A „tenyésztés olyan körülmények között, hog'* u kívánt vagyaiét termelődjön kifejezés magába foglalja a mikroorganizmus fenntartását és/vagy szaporítását a kívánt vegyület termeléséhe® vagy az adott termék kívánt hozamának eléréséhes megfelelő vagy elégséges körülmények között. Például a tenyésztést a vegyület (például pantoát vagy pantotenát) kívánt mennyiségének termelődéséhez elegendő ideig folytatjuk. A tenyésztést előnyösen annyi ideig folytatjuk, amennyi elegendő a vegyület megfelelő feldúsulásához (például elegendő ideig ahhoz, hogy elérjük a pantoát és/vagy pantotenát megfelelő termelődését vagy a pantoát és/vagy pantotenát ? HMBPA megfelelő .arányát). Sgy megvalósítási formában a tenyésztést körülbelül 12-24 órán keresztül végezzük. Egy másik megvalósítási formában a tenyésztést körülbelül 24-36 órán át, 36-43 érán át, 48-72 órán át, 72-96 órán át, 96-120 órán át,
77.Ö76/BK
X*’* , *· .
120-144 arán át vagy még tovább folytatjuk.
Egy további megváló sítási formában a mikroorganizmusokat olyan körülmények között tenyésztjük, hogy körülbelül 36 óra alatt legalább körülbelül S~ 10 g/1 termék, körülbelül 48 óra alatt legalább körülbelül 10-20 g/1 termék és körülbelül 72 -óra alatt legalább körülbelül '2.0-30 g/1 termék képződjön. Egy még további megvalósítási formában a mikröötgánizmüsokat olyan körülmények között tenyésztjük, hogy körülbelül 36 óra alatt legalább körülbelül 5-20 g/1 termék, kö rülbelül 48 óra alatt legalább körülbelül 20-30 g/1 termék és körülbelül 72 óra alatt legalább körülbelül 30-50 g/1 vagy 60 g/1 termák képződjön. Egy másik megvalósításban á mikröorganízmásokat olyan körülmények között tenyésztjük, hogy a HMBFA :
HMBPA + pantötenát arány 0/1:100 vagy kisebb (azaz 0,1% HMSPA
99,9% pantötenáttal szemben, például a termékminta BBuC analízisénél kapott csúcsok alatti területek összehasonlitásából megha tározva) , előnyösen ez az arány 0,2:100 vágy kisebb (0,2% HMBPÁ
99,8% pantctenáttal szemben), ez az arány még előnyösebben
0,5·; 1.00 vagy kisebb (0/5% HMBEA 99,5% pantotenáttal szemben),.
Még további megvalósításban a mikroorganizmusokat olyan körülmények között tenyésztjük, hogy a HMBPA ; HMBPA * pantotenát arány 1:100 vagy kisebb (azaz 1% HMBPA 99% pantotenáttal szemben, például a termékminta KPLC analízisénél kapott csúcsok alatti területek Összehasonlításából meghatározva), előnyösen ez az arány 2:100 vagy kisebb (2% HMBPA 93% pantotenáttal szemben), ez az arány még előnyösebben 3:100 vagy kisebb (3% HMBBA 97% pantctenáttal szemben), még előnyösebben legalább 4:100 vagy kisebb (4%
HMBPA 96% pantctenáttal szemben), 5:100 vagy kisebb (5% HMSPA
77. ÖW&E
95% pantotenáttal szemben):, 6:100 vagy kisebb (6% HMBPA 94% pantotenáttal szemben), 7:100 vagy kisebb (7% HMBPA 93% pantctenáttal szemben), 8:100 vagy kisebb (8% HMBPA 92% pantotenáttal szemben), 9:100 vagy kisebb (9% HMBPA 91% pantotenáttal szemben) vagy 10:100 vagy kisebb (10% HMBPA 90% pantotenáttal szemben).
A találmány szerinti eljárás tartalmazhatja továbbá a kívánt termék (például pantoát vagy pantotenát) kinyerésének lépését. A kívánt termék ,,kinyerése* magába foglalja a vegyület extrakcióiát, izolálását vagy tisztítását a tenyésztéshez használt tápközegből. A vegyület kinyerése történhet bármely, a szakmában ismert hagyományos izolálási vagy tisztítási módszer szerint, beleértve - korlátozást azonban nem jelentve - hagyományóé gyantával (például anion- vagy kátioncserélő, nem-ionos adszorpcióé gyantával) való kezelést, hagyományos adszorbenssel (például aktivált faszénnel, kovasavval, szilikagéllel, cellulózzal, alumíniummal, stb.) történő kezelést, pH változtatást, oldószeres extrakciót (például szokásos oldószerrel, úgymint alkohollal, etilacetáttal, hexánnal és hasonlókkal), dialízist, szűrést, betöményitést, kristályosítást, újra kristályosítást, pH beállítást, liofilezést és hasonlókat. Például a vegyület kinyerhető a tápközegből először a mikroorganizmus tápközegből való eltávolításával. A tápközeget ezután kationok eltávolítása céljából átvezetjük egy katlgncsarélő gyantán és azután egy anioncserélő gyantán a, szóban forgó vegyületnél erősebb aciditásu szerves és szervetlen anionok eltávolítása céljából. Az eredményül kapott vegyület ezután az itt leírtak szerint sóvá (például kalcium sóvá) alakitható.
Ρ 0 3 0 2 ? 9 8 ®s
A találmány szerinti kívánt vegyületet előnyösen oly módon „extraháljuk, „izoláljuk vagy „tisztítjuk, hogy az eredményül kapott preparátum lényegében mentes az egyéb tápközeg komponensektől (például tápközeg Összetevőktől és/vagy fermentációs melléktermékektől mentes). Az „egyéb tápközeg komponensektől mentes megjelölés a kívánt vegyület olyan preparátumaira utal, amelyekben a vegyületet elválasztottuk annak a tenyészetnek a tápközeg összetevőitől vagy fermentációs melléktermékeitől, amelyben az termelődött. Elgy megvalósítási formában a preparátum (száraz tömegre vonatkoztatva) több, mint körülbelül 80%-ban a kívánt vegyületet tartalmazza (például kevesebb, mint körülbelül 20%-bán tartalmaz egyéb tápközeg összetevőt vagy fermehtácíós mellékterméket), előnyösebben több, mint körülbelül 90%-ban tartalmazza a kívánt vegyületet (például kevesebb, mint körülbelül 20%-ban tartalmaz egyéb tápközeg összetevőt vagy fermentációs mellékterméket), még előnyösebben több, mint körülbelül 95%-ban tartalmazza a kívánt vegyule et (például kevesebb, mint körülbelül 5%-ban tartalmaz egyéb tápközeg Összetevőt vagy fermentációs mellékterméket) és legelőnyösebben több, mint körülbelül 98-99%ban a kívánt vegyületet tartalmazza (például kevesebb, mint körülbelül l~2%~ban tartalmaz egyéb tápközeg összetevőt vagy fermentációs mellékterméket)> Amennyiben a kívánt vegyületet sóvá alakítjuk, a vegyület előnyösén mentes továbbá a sóvá, alakítással kapcsolatos kémiai szennyezőktől. Ha a kívánt vegyületét alkohollá alakítjuk, a vegyület előnyösen mentes továbbá az alkohollá alakítással kapcsolatos kémiai szennyezőktől.
Alternatív megvalósítási formában a kívánt vegyületet nem
77. ixm/ss
Se tisztítjuk meg a mikröórganizmustólí ha a mikroorganizmus biológiailag nem veszélyes {azaz ártalmatlan), Például a teljes tenyészet (vagy tenyészet felülúszó} felhasználható termék forrásként (például nyers termékként). Egy megvalósításban a tenyészetet (vagy tenyészet felülúszót) módosítás nélkül felhasználjuk. Egy másik «megvalósításban a tenyészetet (vagy tenyészet felülúszót) szárítjuk vagy liofilizáljuk.
A találmány szerinti, termék-előállítási módszer a kívánt vegyülatet előnyösen jelentőben magas hozammal állítja elő. A „jelentősen magas hozam olyan termelési szintet vagy hozamot jelent , amely az összevethető előállítási módszereknél szokásoshoz képest elegendően magas vagy magasabb, például a kívánt termék kereskedelmi előállításához (például a termék megfelelő költséggel történő kereskedelmi előállításához) elegendő szintre emelt. A találmány tárgyát egy megvalósítási formában olyan előállítási eljárás képezi, amelyben rekombináns mikroorganizmust a kívánt termék (például pantoát és/vagy pantotenát) termelésének 2 g/1 nél magasabb szintjét eredményező körülményék között tenyésztünk, A találmány tárgyát egy másik megvalósítási formában olyan előállítási eljárás képezi, amelyben rekombináns mikroorganizmust a. kívánt termék (például pantoát és/vagy pantotenát) termelésének 10 g/l-nél magasabb szintjét eredményező körülmények között tenyésztünk. A találmány tárgyát egy másik megvalósítási formában olyan előállítási eljárás képezi, amelyben rekombínáns mikroorganizmust, a kívánt termék (például pantoát és/vagy pantotenát) termelésének 20 g/l~nél magasabb szintjét eredményező körülmények között tenyésztünk, A találmány tárgyát még to48 #*»♦ << ν* * * ♦ * >· « < X · * ♦ ♦ ♦ · *« X ♦
’.? *.,♦ ·.,- ·„* ”Γ vább.i megvalósítási formában olyan előállítási eljárás képezi, amelyben rekomblnáns mikroorganizmust a kívánt termék (például pantoát és/vagy pantotenát) termelésének 30 g/l-nél magasabb szintjét eredményező körülmények között tenyésztünk. A találmány tárgyát még további megvalósítási formában olyan előállítási eljáx'ás képezi, amelyben rekombináns mikroorganizmust a kívánt termék (például pánt oá t és /vagy pantotenát) termelésének 40 g/lnél magasabb szintjét eredményező körülmények között tényésztünk. A találmány tárgyát még további megvalósítási formában olyan előállítási eljárás képezi, amelyben rekombi.náns mikroorganizmust a kívánt termék (például pantoát és/vagy pantotenát.) termelésének Sö g/l-néí magasabb .szintjét eredményező körűimé^ nyék között tenyésztünk. A találmány tárgyát még további megvalósítási formában olyan előállítási eljárás képezi, amelyben rekcmbináns mikroorganizmust a kívánt termék (például pantoát és/vagy pantotenát) termelésének 60 g/l-nél magasabb szintjét eredményező körülmények között tenyésztünk. A találmány további tárgyát képezi a kívánt termék előállítására szolgáló eljárás, amelyben rskombináns mikroorganizmust olyan körülmények között tenyésztünk, hogy kereskedelmileg kívánatos időtartam alatt a vegyület elegendően magas szinten képződjön.
A manipulált bioszintetikus enzimtől vagy bioszintetikus enzimek kombinációjától függően kívánatos vagy szükséges lehet a találmány szerinti mikroorganizmus számára legalább egy bioszintetikus prekurzor biztosítása (például tápanyagként adagolva), hogy a kívánt vegyület vagy vegyületek termelődj ének , A „bioszintetikus prekurzor* vagy „prekurzor* olyan vegyszert vagy ve77. ö-jszsz ♦*
♦ ♦ * gyületet jelunt, amely a mikröótganirmussal érintkeztétvá vagy a mikrocrganíxmus tápközegéhe adagolva a kívánt termék biöszintézísének fokozását vagy növelését szolgálja. Egy magvalósítási formában a bioszintetikus prekurzor vagy prekurzor aszpartáti. Egy másik mégyalósitási formában a bioszintetikus prekurzor vagy prekurzor β-alanía. Az aszpartátot vagy β-alanlnt előnyösen olyan mennyiségben adagoljuk, amely a mikroorganizmus produktivitásának fokozásához elegendő koncentrációt (például pantoát és/vagy pantotenát termelődésének fokozásához elegendő konc,éntrációt) eredményez a tápközegben. Ά találmány szerinti bioszintetikus prekurzorok adagolhatok koncentrált oldat vagy szuszpenzio formájában (például alkalmas oldószerben, úgymint vízben vagy puffőrben) vagy szilárd formában (például por alakban). A találmány szerinti bioszintetikus prekurzórok adagolhatok továbbá egy adagban, folyamatosan vagy egy adott időperiódus alatt szakaszosan. A „β-alanin fölösleg kifejezés olyan β-alanin szintre utal, amely a szóban, forgó -niikroorganizmus tenyésztéséhez szokásosan alkalmazott mennyiségnél nagyobb vagy megnövelt. Például a példákban leírt Bacíllus mikroorganizmusok tenyésztése szokásosan 0-0,01 g/1 β-alánin jelenlétében történik. Ennek megfelelően a β-alanih fölösleg körülbelül 0,01-1 g/1. szintet, előnyösén körülbelül 1-20 g/1 szintet jelenthet.
Egy további megvalósít ás í főm árun a bioszintetikus prekurzor valín. Egy még további megvalósítási formában a bioszintetikus prekurzor a-keto-izóvalerát. A valint vagy az a-kato-izöválerátot előnyösen olyan mennyiségben adagoljuk, amely a tápközegben elegendő koncentrációt eredményez ahhoz, hogy a ki77.övezsz ♦*Á* ÍX » * v « ♦ « « * *
S X « v » . *x > V %«»·.. «..♦ -¾ *‘r várit termék (például pantoát éa/vagy pantotenát) termelődjön. Az „α-KIV fölösleg a szóban forgó mikroQrg^nxzmus tenyésztéséhez szokásosan felhasznált rx-KIV szinthez képest megnövelt vagy magasabb α-KIV szintet, jelent. Például az itt következő példákban leírt Sacíllus mikroorganizmus tenyésztése szokásosan körülbelül 0-0,01 g/1 α-KIV jelenlétében történik. Ennék megfelelően az a-KIV fölösleg körülbelül. 0,01-1 g/1, előnyösen körülbelül 1-20 g/1 α-KIV szinteket jelent. A „valin fölösleg a szóban forgó mikrocrganizmus tenyésztéséhez szokásosan felhasznált Valin szinthez képest megnövelt vagy magasabb valin szintet jelent. Például az itt következő példákban leírt Bacíllus mikroorganizmus tenyésztése szokásosan körülbelül 0-0,5 g/1 valin jelenlétében történik. Ennek megfelelően a valin fölösleg körülbelül 0,5-5 g/1, előnyösen körülbelül 5-20 g/1 valin koncentrációkat jelent, A bioszintetikus prekurzorokra, mint „kiegészítő bioszintetikus szubsztrátókra is utalunk itt.
A találmány tárgyát egy másik vonatkozásban az itt leírt rekombináns mikroorganizmusokat alkalmazó biotranszformációs eljárások képezik. A „biotranszformációs eljárás kifejezés - amely helyett itt a „biokonverziós eljárás kifejezést is használjuk olyan biológiai eljárásokat (például transzformációt vagy konverziót) jelöl, amelyek megfelelő szubsztrátckból és/vagy köztes termékekből a kívánt termék (például pantoát és/vagy pantotenát) termelődését eredményezik. A biutranszformáció®: reakciókban felhasznált mikroorganizsaus (ok) és/vagy enzimek olyan formában vannak, amely lehetővé teszi ezeknek a kitűzött feladat (funkció) elvégzését (például a kívánt termék előállítását). A mlkroorga7?,ÖW&S
* φ
*< ♦* * « φ φ φ * *» nizmusok lehetnek, egész sejtek vagy; lehetnek a sejtnek csupán, azon részei, amelyek a kívánt eredmény eléréséhez szükségesek. A tiikroorganizmusok rendelkezésre állhatnak s-zuszpendálva (például megfeleld oldatban, úgymint pufferolt oldatokban vagy tápközegekben) , leöblítve (például a mikr-oörganizaius tenyésztő tápközegétől öblítéssel megszabadítva), acetonnal megstárítva, rögzítve (például poliakrílaraid gélen vagy k-karragenumóh vagy szintetikus hordozón, úgymint például gyöngyökön, mátrixokon és hasonlókon), fixálva, keresztkötéssel kapcsolva vagy pérmeábilizálva (például félig áteresztő membránja és/vagy sejtfala van, ezért vegyületek, úgymint például sznbsZtrátok, köztes termékek vagy termékek sokkal könnyebben tudnak áthaladni nevezétt membránon vagy sejtfalon).
Bantötonát és HMBEA ázelektíwn kevert készitményeinsk előA találmány további tárgyát képezik pantotenát és HMBPA szelaktiven kevert készítményeinek előállítására szolgáló eljárások és mikroorganizmusok. Az itt leírtak szerint a „szelektíven kevert készítmény kifejezés oly módon előállított készítményre utal, amelyben a pantotenát : HMBPA arány ellenőrzött sajátság, azaz a pantotenát ; ΉΜΒΡΑ arány megválásztott> Az arány megválasztása történhet a készítményt termelő mikroorganizmus (azaz a termelő törzs) manipulálása révén oly siódon, hogy az, egyik komponens termelődés® meghaladja a másikét.
A találmány tárgyát egy vonatkozásban szelektíven kevert pantotenát : HMBPA készítmény előállítására írányulő eljárás képezi, amely tartalmazza deregulált pantotenát bioszintézis útvonallal rendelkező mikroorganizmus tenyésztését olyan körülmények
77.β7ί>/ΒΖ
között, hogy szelektíven kevert pantotenát : ΗΜΕΡΑ készítmény termelődjön, Egy megvalósítási formában a mikroorganizmust olyan körülmények között tenyésztjük, amely a pantotenát termelődést segíti elő. Egy másik magvalósítási formában a mikroorganizmust Olyan körülmények között tenyésztjük, amely a HMBBA -terme lödé ét segíti elő. Egy másik megvalósítási formában a mikroorganizmust olyan kontrollált steady state glükóz szint mellett tenyésztjük, amely a pantotenát termelődést segíti elő. Egy másik megvalósítási formában a mikroorganizmust olyan kontrollált steady state glükóz szint mellett tenyésztjük, amely a ΗΜΕΡΑ termelődést segíti elő. Egy még további megvalósítási formában a mikroorganizmust olyan kontrollált steady state oldott oxigén szintnél tenyésztjük, amely a pantotenát termelődést segíti elő. Egy még további megvalósítási formában a mikroorganizmust olyan kontrollált steady state oldott oxigén szintnél tenyésztjük, amely a HMBPA termelődést segíti elő, Egy még további megvalósítási formában a mikroorganizmust olyan kontrollált steady state szerin szint mellett tenyésztjük, amely a pantotenát termelődést segíti elő. Egy megvalósítási formában a készítmény pantotenátot és HMBPA-t 75 mól pantotenát ; 25: mól HMBBA arányban vagy ennél nagyobb arányban tartalmaz. Egy másik megvalósítási formában a készítmény pánt otená tót és ΗΜΕΡΑ-1 90 mól pantotenát : 10 mól MBP'A arányban vagy ennél nagyobb arányban tartalmaz:. Egy másik megvalósitási formában a készítmény pantotenátot és HMBEA-t 75 rnől HMBPA : 25 mól pantotenát arányban vagy ennél nagyobb arányban tartalmaz. Egy még további megvalósítási formában a készítmény pantotenátöt és HMBPA-t 90 mól HMBPA ; 10 mól pantotenát
77,ö7fe/BE *»»» «» «« «
». « . ·» »» « .* φ »* » λ,
η. - ·«,· vd -ή* arányban vagy ennél, nagyobb arányban tartalmaz. Az .itt bemutatott értékek közé eső értékek és tartományok szintén a találmány oltalmi körébe tartoznak,
A. találmányt az alábbi példákkal szemléltetjük, amelyek azonban nem jelentik a találmány oltalmi körének korlátozását.. Az Itt hivatkozott referenciák, szabadalmak és szabadalmi, bejelentések tartalmát teljes egészében beépítettük referenciaként.
FéldUüe
I. példa:
Az [R]-3- [ (2-hidroxi~3-meti.l-butiril) -ami no] -propionsav (HMSPA) hiö&Mntézia útvonal feltárása és jellemzése .Raclilus törzsek pantotenát termeléshez történő kifejlesztése során genetikai manipulációkat végeztünk a pantotenát bioszintézis útvonal és az izoieucin-valin (12v) bioszintézis útvonal génjein és enzimjein (1. ábra) a 09/400,494 és 09/667,569 soi'ozatszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentésekben leírtak alapján. Például deregulált panBCD opsronnal és/vagy deregulált psnEl génnel rendelkező törzsek -> β-alanin és a-keto-izovalerát (a-KIV) jelenlétében tenyésztve - fokozott pantotenát termelést mutatnák. A továbbá deregulált ilvB&C és llvD géneket hordozd törzsek csak β-alanin jelenlétében is fokozott pantotenát termelést mutatnak. További panD deregulációval :0-alaai.ntól független termelés érhető el.
A PA824 kísérleti, törzs triptofán prototróf, dpec és Tét rezísztens, a panBOD fókuszon deregulált panECD-t, a panEl lótuszon deregulált panEl-t (két gén Á. subtílis genomjában, amelyek homológók az n. coll panB, pánEl és panbí génjeivel, az előbbi
7'j. r? s / sá kódolja a pantotenát képződésben részt vevő fő kstopantoát reiduktázt, ugyanakkor panE2 nem érintett á pantotenát szintézisben az 09/400,494 sorözatszámü amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés szerint), az í.ivb lókuszon deregulált ilvD-t tartalmaz, túlzottan kifejezi az .ilvBNC kazettát az amyE Lókuszon és túlzottan kifejezi a panD gént a bpr fókuszon.
A következő fermentációs körülmények, között PA824 gyakorlatilag körülbelül 28~3ö g/1 pantotenátot termel. A pantotenát termelést a PA824 törzzsel ebben a példában 14 literes fermentosokban végezzük. A b-atc'n fermentációs tápközeg összetétele és az utólag hozzáadott komponensek, a következők:
Batch
| Anyag | g/1 (végső koncentráció) | |
| 1 . | Élesztőkivonat | 10 |
| 2. | Na-gintárnát | 5 |
| 3, | (NhuzSO, | 8 |
| 4. | KH.aPO..s | d |
| 5. | K2KPO4 | 7,6 |
Sterilezés és visszahütés után adagolva
| 1 . | Glükóz | 2,5 |
| ’> <*.· A | Cadz | o.- i |
| 3. | MgCla | 1 |
| 4 . | N á t r i um- e i t. r á t | 1 |
| 5. | FeSCg x 7H5O | 0, 01 |
| 6. | 8M-1000X | 1 ml |
77.S76/SZ
*-ί . » ι> » ,
A batch tápközeg végső térfogata 6 liter. Az SM-löOüX jelű nyomelem oldat összetétele a következő: 0,15 g NajMoCú x 2H2Gf 2,5 g H3BO3, 0,7 g CoCl2 x 6H2O, 0.,25 g CüSO4 x 5H2ö, 1, 6 g MnCls x 4H2>0, 0.3 g EnÓCü x 7H2O vízben feloldva (1 liter végső térfogat) ..
A batch tápközeget a PA324 törzs - SVY tápközegben: 25 g borjúhús infúziós leves (Difco), 5 g élesztőkivonat (Difco), 5 g nátrium-glutamát·, 2,7 g (NK4HSÖ4 740: ml vízben, autoklávozva; hozzáadva 200 ml steril 1 M K2HPCü~ot (pH 7) és 60 ml steril 50%~ os glükóz oldatot, (végső térfogat 1 liter) - rázatott lombikos tenyészetének (00 ::: 10) 60 ml-ével oltottuk be. A fermentációt °C-on, 12 1/perc levegőztetés mellett glükóz limitált fed batch technikával végeztük. A kezdeti glükóz mennyiség (2,5 g/L) az exponenciális növekedés fázisában elfogyott. Ezután a. glükóz koncentrációját 0,2-1 g/1 közötti értéken tartottuk a következő oldat folyamatos adagolásával;
Rátáplálás
| Anyag | g/1 (végső koncmitráció) | |
| 1·. | Glükóz | 550 |
| 2. | CaCl? | 0,1 |
| 3. | SM-1000X | 3 ml |
A változtatható sebességű rátáplálást számítógép vezérelte, a tartályban levő glükóz koncentrációhoz kapcsolódva, egy a Igeritmus segítségével, Ebben a példában a teljes rátáplálás 6 liter volt.
A fermentáció során a pH~t 7,2 értéken tartottuk. A kontroll pH méréssel összekötött számitógépes vezérléssel történt. A meg77.CÓS/3F;
>♦* felelő pH értéket vagy 25%-os NHs-val vagy 204-os HjPO.s oldattal egyidejűleg á fermentáció N-forrásaként Is szolgál. Az oldott oxigén koncentrációt fpOg] 30%-ra a keverés és a levegőztetés sebességének szabályozásával. A haba szilikonolajat adagoltunk. A rátáplálás befejezése után, ebben a példában 48 óra után a fermentációt addig folytattűk, amíg a [pCE] el nem érte a 95%-at. Ezután a fermentációt leállítottuk, mikroorganizmusokat 30 perces steri.lezéssei előlsteriiezést a fermentációs tápkőregből ága-r lemézekre történő szélesztéssel bizonyítottuk. Sterilezés és a sejt e k cen trifugálá s sa1 való eltávolítása után a férmentlében a p a n t o t e n á t i, i t e r 21,7 g./1 volt (HPLC analízissel meghatározva)
A HPLC analízishez a formánt léből vett mintát steril víz z e1 ás oldatnak 5 μΐ-ét injektáltuk oszlopra (Aqua Cl 8, 'S hőmérsékletét 40 ^C-on tartottuk. A mokgo A fázis 14,8 mM
100% acetonitril volt
Az áramlási sebességet f5 m1/perc á11andó érté ken neárís növekedés
3% rne zgó B fázisra növekedés
20% mozgó B fázisra
A detektálást W detektorral (210 nm-en) végeztük, A futtatási további 3 perccel megtoldva, A pantoténsav re perc
A fent említett minta HPLC kromatogram ját a 4. ábrán mutatjuk be.
§7
Χ*Φ» ΦΦ «X *< Φ * X Χ· Φ· Φ X ' Φ φ > Φ Φ Λ «« Φ * Φ X X Φ Φ Φ X Φ ΦΦ*Α φφ XX φ< χΧ <
A jelentős mennyiségű pantotenát. képződésen kívül egy második vegyűletet is találtunk, amely körülbelül 4,7 perces retenciős idővel eluált ebben a rendszerben. A fermentáció során keletkezett második jelentős terítéket 3- [ (2-hidroxi-3~metil~butíril) aminol-propionsavnak azonosítottuk (HMBPA), amelyre itt „β-alanin-2-(R) -hidroxi-izovalerát, f4)-alanin-2-hidroxi“izova.l©rát'y, ,,β~alan.il-α-hidroxi-izovalerát és/vagy „faritotenát névvel is hivatkozunk. Ezt a vegyűletet reverz fázisú flash kromatográfiás (mozgó fázis 10 mM KH2Kh, növekvő mennyiségű acetonitrillel (1-50%), adatot nem mutatunk) tisztítást követően tömegspektruma (5. ábra; relatív monoizotópos tömeg 18 9) és és nC~NMR alapján azonos·· lőttük. A vegyületrói .feltételeztük, hogy az aszimmetrikus szénatomnál az (R]-pantotenáttal analóg módon R konfigurációjú.
A vegyület azonosságának igazolására racém. p-alanín--2-hidroxi-izovalerát óvatos szintézisét végeztük el a következők szerint: β-alanint (2,73 g /30 mmól) és nátrium-metoxidot (30%-os metanolős oldatból 5,67 g /31,5 mmól) oldottunk fel metanolban (40 ml). Metil-(2-hidröxi-izovaierát)-ot (f-hidroxi-S-metll-vajsav-met 11-észtert) (3,96 g /30 mmól) adtunk hozzá és 18 órán keresztül visszafölyató hűtő alatt forraltuk. Ezután a metanolt vákuumbepárlóban (rotavap) eltávolítottuk és tere-butanollal (50 ml) pótoltuk. Kálium-terc-butoxidot (50 mg) adtunk hozzá és 26 órán keresztül refluxáltattuk. Az oldószert vákuumban eltávolítót tűk, a .maradéköt vízben (50 ml) feloldottuk és erősen savas ioncserélő gyantán (H’ forma Lewatitew S 100 Gl; 10Φ ml) vezettük keresztül. Még további vizet használtunk az ioncserélő öblítéséhez. A vizes eluátumokát kombináltuk és a vizet vákuumban eltávolítottuk. A maradékot flash kromatográfiának (szílikagél; 2% ecetsav etil-acetátban eluensként) vetettük alá és a tormák frakciókat bepároltűk, hogy szilárd maradékot kapjunk. A maradékot étilaeetát/toluöl (10 ml/20 ml) ©legyéből újra kristályosítottuk és analitíkailag tisztá HMBPA-t (p-alanin-2hidroxi-izovalerátot) kaptunk, amely tömegspektrométriával 190 (189 í hA relatív monöizotőpos tömeget mutatott és ugyanazt a XH-NHR rezonanciát, mint a fermentációból kapott termék.
A -HMBFA termelődést eredményező biószintézis útvonalat a 2. ábrán mutatjuk be. Az [R|-3- ((P-hidroKÍ-ő-metil-butiril) * ami no) •-propionsav (HMBPA) kémiai szerkezetét a 3. ábrán tüntetjük fel. Ahogyan az a 2. ábrán látható, HMHPA az [PJ-a-hidroxi-izóvaleriánsav (α-HIVj és β-alanin kondenzációs terméke, amely kondenzációt a PanC enzim katalizálja. a-HIV az e-KIV redukciójával jön létre, amely reakciót az g-keto-reduktáz enzimek, PanE (például Pa.nÉ'1 és/vagy PánE2) és/vagy IlvC katalizálják.
A HMBRA kémiai szerkezetére és a HMBPA-hoz vezető bioszíntézis útvonalra alapozva a következő modellt alakítottuk ki a korábban már ismert pántot enat és izoleucín-va'l i n (ilvj bioszintézis útvonal és az újonnan feltárt HMBPA bioszintézis útvonal közötti kölcsönhatás leírására. Legalább egy vonatkozásában a modell azt állítja, hogy mikroorganizmusokban legalább két olyan bioszintézis útvonal létezik, amely a PanB bioszintetikus enzim szubsztrátjóért * ú-KlV-ért - verseng, nevezetesen a pantotenát bicszintézis útvonal és a ΗΜΒΡΆ bíoszintézis útvonal. (A harmadik és negyedik a-KIV-ért versengő bioszintézís útvonal az, amelyik a-OV-bői vallat vagy leocint állít elő, lásd az 1. ábrát.) •mmwsis κ·.
* legalább a pantotenát bíoszintézis útvonal és a HMBPA bíoszinté zis útvonal előállít továbbá a PanC enzimért versengő szubsztrá tokat, nevezetesen a-HIV-et és pantoátot. HMBPA termelődése je lentősen befolyásolja a pantotenát képződést. A legfontosabb, hogy a HMBPA bioszintézis útvonal az α-KIV és β-alanin prekur sorokért és néhány enzimért (PanC, PanD, PanEl és/vagy IlvC) verseng a pantotenát bioszintézis útvonallal. Ezenkívül, mivel
HMBPA szerkezete hasonló a pantotenátéhoz, lehet olyan nemkivá natos sajátsága, hogy a pantotenát bioszintézis útvonalon egy vagy több lépést negatívan szabályoz. A modell azt valószínűsí.ti, hogy a pantotenát vágy optimalizálható, termelés bármely olyan eszközzel javítható amely előnyben részesíti a-KI.V és β-alauin néhány enzim (PanC, PanD, PanEl és/vagy
IlvC) pantotenát bíoszintézis folyamataiban történő felhasználó ^szintetikus folyamatokkal szembenx
Egy előnyben részesítek;, megközelítés pantoát és/vagy panto tenát termelés maximalizálására, miközben a HMBPA termelődés mlnimálísra csökken, a PanB enzim aktivitásának növelése a
| zis számára. | ugyanakkor elősegít. |
| zisét. Az a | k t i v írás növ e 1é s én e k |
| gén túlzott | kifejezése, a gén pé |
| s oe v. r f ko * | akti v i t á sának növelés |
i ketopantoát és pantoát mód s z e re1 kö z é t a rt o z1 k szinté a panB e és/vagy az enzim inhIbiéiójának megkönnyítése mutációval vagy a CoA szintek csökkentésével.
Nagyobb pantoát szintek viszont növelik a pantotenát szintézist és csökkentik a HMBPA szintézist α-HIV-nek a PanC-ért folyó ver sengésből való kivonásává1.
eo
Χ· 4« «4<
x ♦ ♦ * 4 ♦« 4 χ * 44 4 *4 4* * 4 ♦ 4 4 4 * X 4*X4
4> 44 *4 4X4
Egy másik megközelítés a pantotenát szintézis maximén zálására a panÉl kifejeződés szintjének optimalizálása. Itt bemutatjuk, hogy PánEl termelésének növekedése a pantotenát termelődés rovására növeli HNBPA szintézisét. Ennek megfelelően a panEl kifejeződésének mérsékelt csökkentése (azaz a panBl kifejeződés szintjének pontos szabályozása) PA824 vagy PA668 törzsekben a HMBPA szintézis csökkenését és a pantotenát szintézis növekedését eredményezi. Továbbá a II. példában bemutatottak szerint panE)2 deléciója jelentősen csökkenti a HMBPA szintézist.
A pantoát és/vagy pantotenát szintézis HMBPA szintézissel szembeni növelésére más megközelítések tartalmazzak ct-KlV termelődésl szintjeinek optimalizálását a sejtekben és/vagy pantoátra mint szubsztrátra megnövekedett preferenciá jú, módosított PanC fehérje izolálását.
A következő példák az itt leírt modellre nyújtanak kísérleti alátámasztást és továbbá kísérletileg mutatnak be pantoát és/vagy pantotenát képződését (a HMBBA szintékhez képest) fokozó, a modellen alapuló kísérleteket.
XI-VIIX. példák:
A II-VI.. példákban a pantotenát és/vagy HMÖPA mennyiségét a következők szerint határoztuk meg. A farmentié kis részleteit 1:100 arányban és kémcső tenyészetek kis részleteit 1:10 arányban hígítottuk vízzel vagy O-os acetonitrillel a HPLC oszlopra (Phenomenex™ Aqua 5 pm, C18, 250 x 4,50 mm, 125 A) történő injektálást megelőzően. A mozgó fázisok a következők voltak: A == őt acetonitril, 50 mM mononátrium-foszfát puffer, pH 2,5-re állítva foszforsavval; és B - aoetonitril, 5% víz,
*»♦* ♦ *
* ♦ »♦
* ♦ > Μ « <
A lineáris gradiensek a következők voltak:
| A fázis | B fáMa | |
| 0 | 100% | 0% |
| 16 | 100% | 0% |
| 17 | 0% | 100% |
| 20 | 0% | 100% |
| 21 | 100% | 0% |
További paraméterek és berendezések: áramlási sebessség 1,0 ml /perc; injektálási térfogat «= 20 μΐ; detektor ~ Hewlett Packard 1090 sorozat DAD UV detector-3014, Signal A ~ 197 nm, rét. - 430 nm, Firmware rév:sión E; Oszlop melegítő berendezés hőmérséklete 40 'ÖC; Hardware Hewlett Paekard Kayakm XA; és Software *> Hewlett Packard Chemstation Pina™ fnmily ravision A.0Ő.03[509]í
HHBPA körülbelül 13 percnél eluál ebben a rendszerben.
XX. példa:
Csökkenő WBBA oibtééis Patnk2 deléoxójávaX jsantotmnát termelő törrámából
Az I. példában leírtak szerint HMBP.A termelést először olyan mikroorganizmusökban figyeltünk meg, amelyek túlzottan kifejezik panEl-et jelezve, hogy a ketopantoát reduktáz nemcsak a keto-pantoát -> pantoát redukciót képes katalizálni, hanem a-kato-izovalerát 2~hidroxi··izovaleráttá történő redukcióját is. A korábban említettek szerint, Baoillüs suMilis genomjában két gén homológ az £< coli kétopanteát reduktátf. kódoló panE génjével és ezek elnevezése panEl és panE2. Bacíllas törzsben kimutattuk, hogy a paaEl gén kódolja a pantotenát képződésben részt vevő fő ?7.Ö?<5/8£
»>**
* * ♦ <
ketopantöát reduktázt, míg panE2 nem játszik szerepet a pantöténát szintézisben. Továbbá panE2 túlzott kiféjezése a pAN238 £dpanE2 kezet tájából (25. számú szekvencia) a pantotenát títer csökkenéséhez vezet (lásd a 09/400,494 sorozata zámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentést). Adott a pahEl és panE2 génterméke közötti homológia és az a tény, hogy panB2 túlzott kifejezése a termelést a pantoát/pantotenát szintézistől eltolja, ezért megvizsgáltuk, vajon pa.nE2 jelentős mértékben érintett-e a HMBRA termelésben. Azt feltételeztük, hogy a pa«E2 gén terméke olyan enzim, amely képes α-KXV —» d-HIV .redukciójára, viszont nem képes jelentős mértékben redukálni a ketopantoátot pantoáttá.
A hipotézis tesztelésére panE2~t beleteltek a PA824 pantotenát termelő törzsből (leírása -az I. példában) a 9A248 törzs Mp&nEd.;cat) kromoszómáiig DNS-éből származó 4panE2; ;cat kazettával (24. számú szekvencia, összeálllítást lásd a 09/400,494 sorozatszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentésben) történő transzformálásával, így kaptuk a PA919 törzset. PA919 három izoláturnát hasonlítottuk Össze PA824 törzzsel pan~ totenat és HMBPA termelés szempontjából kémcső tenyészetekben, β-alanínnal kiegészített SVY tápközegben szaporítva.
* « ♦ * x κ * Λ φ *
X 4 ** ♦« *♦ φ« *X *3 3
X ♦ φ
Φ φ φ » Λ Φ φ * φ
X* Φ
***» *φ **-<
♦ * * * φ *« ♦ * X * * * *» * * X Φ Φ X * ♦ *ΦΦΦ
ΦΦ #4 φ.« χφφ
Az 1. táblázatban bemutatott adatok jelzik, hogy a három PA919 izolátum mindegyiké körülbelül negyed annyi HMBPA-t termelt, mint a PA824 törzs, szemléltetve, hogy a pan£2 géntermék részt vesz a HMBPA képződésben és a HMBPA termelődés legalább részben megszüntethető egyszerűen a psnE2 gén deléoiójával a pantotenát termelés feláldozása nélkül.
xii , példa?
A MMSPA termelés és a ^nntotonát termelés fordított korrelációt mutat
PA365-ből (a 09/667,569 sorozatszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentésben leírt PA377 törzs RL-1 oldalági ekvivalenséből'; származó, a F^panBCP kazettára deletált és IbíipanOD kazettát a vpr fókuszon megsokszorozva tartalmazó, és a vad típusú kazettát (PA666), vagy a jygzIpanB kazettát (PA664) a bpr lókuszon megsokszorozva tartalmazó törzsekét állítottunk össze a következők szerint. Iámért vagy feltételezett PanB fehérjék C~terminális aminosavjainak összehasonlító sorba állítását mutatja a 6. ábra. Háröm régiót, 1<, 2. és 3. jelűt azonosítattunk, amelyek konzervatív vagy félig könzetvativ aminosav maradékokat tartalmaznak, ezeket nyilakkal jelöljük az ábra tétjén. A B. sobtilis PanB fehérjéjét (RBS02239) aláhúztuk. Két PanB fehérjéből (RCY14O36 és CAB56202.1) hiányzik a 3. régió, míg az. utóbbi PanB fehérjéből a 2. régió is hiányzik és az
1. régiót nem-konzervárív aminosav maradékok foglalják el.
Olyan B. subtilís PanB változatokat hoztunk létre, amelyekből hiányzik az 1., 2. és 3. régió. A kívánt változatokat 3' POR primerek megtervezésével néztük létre a B. sübtil.ís panB gén oly módon történő megsokszorozására, hogy a 3. régió, a 2. és 3. re77,075/SS «**♦ # « * Φ ♦ < X Φ * V * ♦ χ · ♦ *φ « ♦ ·*,.♦ %ρ Η”-β ‘Μ· gió vagy mindhárom régió hiányozzon a végső termékből. A FCR termékeket elkészítettük és pASK~lSA3 E, coll expressziós vektorba klónoztuk, létrehozva a pAN446, pAWH? és pÁM448 plazmidókat. A plazmidökat azután komplementáció teszteléséhez panB6 mutációt tartalmazó JS, coli SJ2 törzsbe transz formáltuk. A csupán a 3. régiót nem tartalmazó pAN446 volt képes a komplementálásra. Ez azt jelzi, hogy a 3. régió nélkülözhető suhtilis PanB aktivitásához, ugyanakkor a 2. régióra szükség van az enzim aktivitásához vagy stabilitásához.
A következő lépés ebben az analízisben a panB gén transzferje pAN446-ból S. suhtilis expresszíós vektorba és azután ennek bevezetése olyan törzsbe, amely alkalmas a kódolt PanB fehérje aktivitásának tesztelésére B. subtll.?.s--ben. Ennek elvégzéséhez először olyan törzset állítottunk elő, amelyben a P^panBCD operon deletált. Ezt ügy hajtottuk végre, hogy először cet gént inszertáltunk a panB RBS-töl upstream elhelyezkedő BseRI hely és a panB génben elhelyezkedő Bgll hely közé, létrehozva a pAN624 plazmidot (20. számú szekvencia; 7. ábra). Az eredményül kapott, mind panB-t, mind panC-t eltávolító deléciós-szubsztitüciós mutációt (JpanBCD;íoatéSá) transzformációval BA354-be kereszteztük, klőramfenikol rezisztenciára történő szelekcióval 1 m!4 pantotenáttal kiegészített .lemezeken. A transzformánsok egyikét megőriztük és FA644 jelöléssel láttuk el< i?A644-bdl izolált kromoszómális DMS-t BCR-rel analizáltunk és kimutattuk a deléciósszubsztitüciós mutációt. A vártnak megfelelően, PA64 4 növekedéséhez pantotenátot igényel, de ugyanúgy megtartja a manipulált ilv géneket (E^iivBNC, P^ilvD), mint a PA3S4-ben eredetileg jelen levő PíjpanEl gént. Ilyenformán tehát rendélkezik a pantoát szintézisben részt vevő összes enzimmel - túlzottan kifejezve kivé'?7.ΰ76/ΒΖ ♦ *** ·>« ♦ « *♦ * * Γ * * Λ · * « * ♦ * * ♦ ♦· * * ♦·*♦’ *^· **!* ve PanB~t, A legrövidebb panB deléciót tartalmazó gént a pOTPől B. puhtilís expresszié® vektorba (leírása a 09/667,669 sorozatszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentésben) inszertáltuk, létrehozva a pAN627 plazmidot. Ugyanekkor vad típusú pa.nB kontroll gént inszertáltunk pOTP61-be, létrehozva a pANádQ plazmidot. Minden egyes plazmid NotI fragmentumát, amelyek E. coli vektor szekvenciákat nem tartalmaztak, ligáltuk és transzfermáltuk PA644-be, szelekcióval tetraciklin rezisztenciára.
Minden transzformációból egy transz.formánst megőriztünk és tovább transzfcrmáltuk PA628-ból származó kromoszómáiig MS-sel, szelekcióval Pan-ra. PA628 a Bs^panC*!) expressziós plazmid (pÁN620) több példányát tartalmazza a Vpr fókuszra beépülve. A panB gén mutációjának közvetlenül a pantotenát termelődésre kifejtett hatása meghatározásához a pAN620 plazmid (21. számú szekvencia; ábra) nyújtja a pantotenát szintézishez szükséges megmaradó két enzimet (PanC-t és PanD-t). Minden transzformácicból négy transzformánst izoláltunk, szaporítottuk 10 g/1 aszpartátot tartalmazó SVY tápközegben 48 órán keresztül, azután meghatároztuk a termelődött pantotenátot. A 3-' deietált panB-t hordozó transz formánsokat PA664 jelzéssel és a vad típusú géneket tartalmazókat PA666 jelzéssel láttuk el. Az adatok azt mutatták, hogy PA664-ben a 3? deletált panB gén nagyiértékben lecsökkent aktivitással rendelkező PanB fehérjét kódol. HMBPA termelés vizsgálatához PA365, PA666 és PA664 kémcső tenyészeteit szaporítottuk aszparcáttal kiegészített SW tápközegben, α-KIV vagy pantoát jelenlétében és anélkül, 4 8 órán keresztül és azután a korábban leírtak szerint meghatároztuk a termelődött HMBPA-t és pantoténátöt.
??.07í5/8E 'fí '0 •s:
Öl •<y íg xj '03 p ö « <Ö n.
φ N ‘Ό tö
Ή «ί «>?.z ®t~i r<v,VXJ ö’íö
M-U
ÖU nί'ύ
Míi,
UN
-Xw φΠ5
Cm+ tn><
«!>>
ύ 'Cx :-S-H :“iÍÖ >-P
--·re· cΌ
-Vré:
íUΦ íí<4«·
ÍŰΦ
CMN • ·'(D
U>·,
ÍÖΟ
SS<7 '05-jX
H XIΌ 'fötn íj<j
S;
<-Φ ex·-i4
A 2. táblázatban olvasható adatok azt mutatják, hogy a kiegészítek nélküli tápközegben PA666 termelte a legkevesebb HMBPA-t, míg PA664 a legtöbbet jelezve, hogy fordított korreláció áll fenn a PanB aktivitás és HMBPA termelés között. Ez egybevág azzal a modellel, amelynek feltételezése szerint a két bioszintézis útvonal verseng α-KIV-ért, a PanB szubsztrátjáért és versengő (kompétitív) szubsztrátokat termel PanC-nak; PanB aktivitását csökkentve a-KlV-nek az α-HXV szintézis számára fokozott hozzáférhetőségére és ennek megfelelően a szintetizálódott pantoát mennyiségének csökkenésére számítottunk. A tápközcghoz a-K.XV hozzáadásakor mind a három törzs jelentősen több HMBPA-t termelt. Ez az eredmény megefősítí azt, hogy d-KXV a HMBPA prekurzora - ahogyan azt a 2, ábrán szemléltetjük - és d-KIV fölöslege elősegíti ΗΜΒΡ.Α képződését. Ez az eredmény azt is sugallja, hogy ΗΜΕΡΑ szintézise legalább részben α-KIV fölösleg képződés levezetésének („biztonsági túlfolyóját*) köszönhető, Amikor pantoátot adtunk a tápközeghez HMBPA termelődése durván 50%-kal csökkent mind a három törzsben, viszont mindhárom törzs jelentősen több pantotenátot termelt. Ez az eredmény is egybevág azzal a modellel, mely szerint, a két bioszintézis útvonal PanC egymással versengő szubsztrát jait (α-HIV és pantoát.) állítja elő, összesítve, a fenti eredmények azt is jelzik, hogy megnövelt pantoát szintézis ugyanúgy kedvező lehat a pantotenát termelés elősegítésében, mint a HMBPA szintek csökkentése. Továbbá a pantoát szintézist csökkentő faktorok negatívan befolyásolják a pantotenát szintézist.
7W6/8E
J· X « χ V Λ • ··* >,* W *.«
XV. példa:
Megnövelt FanB és/vagy sxabályo^gtt FanEl hatása a pantötanáfe termelésre
PA668 a PA824 olyan származéka, amely P^panB extra példányait tartalmazza megsokszorozva a vpr vagy panE lókuszon. PA668 törzset a panB ©xpressziós vektor (pAN636, 22, számú szekvencia) felhasználásával állítottuk össze, amely lehetővé teszi többszörös példányok szelekcióját klóramfénikol alkalmazásával (9. ábra) . A pAN636 NotI restrikciós fragmentumát, amelyből hiányoznak az E. coli vektor szekvenciák, ligáítük és azután felhasználtuk klóramfenikol szelekcióval PA824 transzformálására 5 pg/ml klóramfenikolt tartalmazó lemezeken. 30 gg/ml klóramfenikolra rezisztans transzf órmánsokat izolál tünk és screenaltünk pantotenát termelésre 48 órás kémcső tenyészetekben. A bemutatott izolátumok kevesebb HMBPA-t termelnek, mint PA824. (őzzel szemben körülbelül 10%-kal több pantotenátot termelnek, mint PA824) , Egy második törzset PA669 jelüt készítettünk. PA824-ből származtatva, amely PjéPanEl extra példányait tartalmazza megsokszorozva a vpr vagy panEl fókuszon. A PA669 törzs összeállításához a PA824 törzset a pAN637 plazmid önállóan ligáit Hotl fragmentumával(23. számú szekvencia, 10. ábra), klóramfenikol rezisztencia szelekcióval transzformáltuk. PA669 két izölátumát választottuk ki tnyábbi vizsgálathoz; ΡΆ669-5 kevesebb PanEl-t termel, mint PA669-7 a két törzsből készült teljes sejtkivonatok SDS-PAGE analízise alapján.
PA824, PA668-2, PA668-24 és a két PA669 izolátum (PA669-5 és PA669-7) kémcső tenyészeteit szaporítottuk három különböző tápközegben {.SVy, SVY i aszpartát és SV¥ φ aszpartát r pantoátj 48 órán keresztül, azután meghatároztuk a pantotenát, HMBPA és βalanin .mennyiségéket (3. táblázat) .
'?7<07<5/W
X*0> O 4X x\e x * *· ♦ ♦ < * « ♦ ♦ ♦ * v ♦Φ X * * ♦ * X ♦ ·* *♦ ** «- X*<
A törzsek egyike sem termelt kimutatható mennyiségű HMBPA-t SW tápközegben. Minden törzs közelítőleg azonos mennyiségű pantptenátot és kis mennyiségű β-alanint termelt jelezve, hogy β-alanin mind a pantotenát, mind a HMBPA szintézist limitálja ezekben a tenyészetekben és β-alanin mindkét vegyületnek prekursora. SW + aszpartát tápközegben szaporítva a két PA669 izolátűm több HMBPA-t termelt, mint PA824, ugyanakkor mindkét PA688 izolátum kevesebb HMBPA-t termelt, mint PÁS24. Említésre érdemes, hogy a legtöbb PanEl~t termelő törzs CPA869-7) termelte a legtöbb HMBPA-t (és a legkevesebb pantotenátot). Ez azt sugallja, hogy PanEl magas szintje az alacsony pantotenát szintézis árán segíti elő á HMBPA termelődését. Az is érdekes, hogy PA6GB24 több HMBPA-t termelt, mint PA668-2, jóllehet a két törzs kivonataiból végzett SD8-PAGE analízis azt mutatta, hogy ez a két törzs nagyjából Ekvivalens mennyiségű PanB-t termelt. Az SDSFAGE analízis azt is megmutatta, hogy PA66B-24 jóval több IlvC-t térrnel, mint PA868-2. Ezekre az adatokra alapozva feltételszhehogy IlvC a~KIV steady state szintjeinek növelésével és/vagy α-KIV α-HIV képződésének katalizálásával befolyásolja a HMBPA szintézist, ezáltal felelős a megfigyelt, HMBPA képződés irányába történt eltolódásért,
A 3. táblázatban az adóitok utolsó csoportja azt mutatja, hogy panroát hozzáadása a tápközeghez minden olyan törzsnél csökkentette a .HMBPA képződést - például a szintézis pantötenát irányába történő eltolásával - amelyek korábban kimutatható szinten termélték ezt a vegyületet. Ez még: tovább alátámasztja azt a modellt, amely szerint α-HlV és pantoát PanC kpmpetitív szubsztrátjal.
77.Ö7S/SZ
Pantotenát nöwlésa termelő törzseikben
Egy lehetséges stratégia a pantotenát termelés növelésére a pantotenát kináz aktivrzaa csökkentése termelő törzsekben. Bántatená kináz az első enzim a pantotenát —> CoA bioszintézis útvonaLón. Azt feltételeztük, hogy kisebb pantotenát kinéz aktivitás alacsonyabb steady state CoA szintekhez vezethet, amely viszont nagyobb PanB enzimaktivitáshoz és magasabb pantotenát literekhez vezethet. A 09/667,569 sorozatszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentésben leírtak szerint két egymással nem kap sahtilis-ben, amélyek közül mind1) coaA, amely homológ az osszon·· pantotenát kináx riálís pantotenát kináz gének új osztályát reprezentálja hálható vad típusú B, aubtilie törzsből anélkül, hogy .bármilyen nyilvánvaló hatása lenne a sza~ gazdag vagy minimál táptalajon. Olyan törzset azonban nem lehet létrehozni.
amelyben mindkét gén deletált jelezve, hogy szükséges az életképességhez. Ezért létrehoztunk egy törzset deietált coaX-szel és azután zim specifikus aktivitását csökkentő mutációnak vetettük alá. Bár
C>y a mutáns ooaA-val rendelkező, AooaX törzsek kényesek, az adatok egy bevá g na k a a hipotézissel, hogy PanB aktivitás növelhető a pantötenát kinéz aktivitás visszaszorításával, Ez viszont csőkkent! a HMBPA termelést és növeli a pantotenát képződést.
ÁceatX és mutáns coaA alléink xnstálláöiój^ MB24~be coaX deléciöját PA824~ből egy lépésben végestük PA824 kana micin reziaztenssé transzformálásával, amelyet a 09/667,569 se« « * V rókát számú- amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentésben leírt, P.A876-bó.l származó krómószárnális DNS (PY79őcoaX::kan) segítségével, végeztünk, hogy megkapjuk PA880~at. A coaX deléció™ ját PA880-ban és FA876-ban közvetlenül a pAN336 plazmidból származtattuk (26. számú szekvencia, 09/667,569 sorozatszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés). Ezt követően vad típusú coaA gén kontroll változatát és ooaA két mutáns allélját vezettük be a következők szerint. A kontroli és a két mutáns alléit először a PY79 vad típusú törzs kromoszómájába vázettük be plazmidokkal klóramfenikól rezisztencia kialakítására szolgáló transzformáció alkalmazásával, és azután ezekből az átmeneti törzsekből származó kromoszómalis DNS-t használtunk fal PA830 klóramfeníköl rezisztenciára transzformálására. A kontroll és mutáns allélek beépítéséré felhasznált plazmidck a pAN294 (27. számú szekvencia, 09/667,569 sorozatszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés), pAN343 és pAN344. A pAK343 majdnem azonos a pAN294 plazmáddal, azzal az eltéréssel, hogy a pAN294 3228. bázisánál T -·> C bázis cserét tartalmaz. Ehhez hasonlóan pAN344 CC -> TA cserét tartalmaz a pAN294 3217, és 3218, bázisainál, Mindhárom plazmid tartalmaz klőramfenikbl rezisztencia gént (cet), helyettesítve a mindjárt ooaA mellett downstream elhelyezkedő ygjT ismeretlen funkciójú, nélkülözhető gént. A PY79-ből ρΑΝ294 (vad típusú ooaA, yqgT::cat), pAN343 (cöáA2 Y155H, ygjT::uat) és OAN344 (coaA2 S151L, ygjT: :cet) dupla crossöver-jóval származtatott átmeneti törzsek nevei rendre PA886, PA887 és ΡΑ888» A következőkben PABBO-at transzformáltuk klóramfenikol rezisztenciára PA886, PA887 vagy PA8S8 törzsekből származó kromoszómálís DNS-sel, így kaptuk rendre a PA892 (vad típusú coaA, cat), PA893 (cöaA Y.1.55H, cet) és PA894 (totó SlőlL,
77.07S/SZ »♦ y* ' *
X « « cat). törzseket. Nyolc PA893 jelöltet választottunk ki az Í155H mutáció megszerzésének vízsgálatárá a pcaA gén PCR-ével és NlaTIT emésztéssel és mind a nyele helyes volt.
Néhány jelöltet minden egyes új törzs esetében, beleértve PA880-at, megvizsgáltunk pantotenát termelésre 43 °C~or: standard kémcső tenyészetben, 5 g/1 β-alaninnal kiegészített SVY tápközegben szaporítva (lásd a 4« táblázatot).
4. táblázat: Fantotemét <azjtoé®nát «tetet élt coeX éa mutáns coaA 43 4S órá-s kémeső tenyesne éhen, SVY glüJeőx é /?-alaxnte tépköxogbem ez^pöríéva
.07 É /0.0.
β-áianint tartalmazó tápközegben BA8.94 (SlblL) átlagosan kissé magasabb pantotenát szintet eredményezett, mint PA8B2 (a vad típusú coaA-val rendelkező izogén törzs), PA893 (Y155H) viszont nem. PA880 jelentősen több pantotenátot termelt (5,5 és 5,1 g/1), mint Izoqén felmenője PA824 (4,4 és 4,1 q/1) és kissé nagyobb pantotenát szinteket, mint PA894 (átlagosan körülbelül 4,7 g/1). Lehet, hogy a PA892, PA893 és PA894 törzsekben (de
PA880™ban nem) jelen levő Ayg-jTncat inszéróiénak olyan hatása van, amely ellensúlyoz bármely olyan előnyt, amelyet a mutáns coaA allélek eredményezhetnének.
Az új törzsek pantotenát titerelnek keskeny koncentráció tartományai ellenére, erősen szignifikáns mintázatot figyeltünk meg a HMBPA képződésben. Az összes coaX deletált törzsnél, a HMBPA titer fele, harmada volt a PA824 törzs literének. Ez egybevág azzal az elmélettel, hogy HMBPA képződését részben a PanB aktivitás limitálása eredményezi. Ennek megfelelően AcoaX megnövekedett PanB aktivitáshoz vezet.
Pantotenát szintézis nővnláaa FanB aktivitás növelésének és pantotenát kinéz aktivitás csökkentésének kombinációjával terme1Ő törzsekben
Kloramfenikollal történő megsokszorozásra tervezett extra PanB expressziós kazettát tartalmazó PA668 (lásd a IV. példában) több pantotenátot és kevesebb KMBPA-t termel, mint elődje PA824, Mivel a coáX delécíója PA824-ből szintén csökkenti a H'MBPA képződést és mérsékelten javítja a pantotenát termelést (PA880), a két módosítást kombináló törzset hoztunk létre és vizsgáltuk
W.076/BE
pantotenát termelését. pAN636 plazmidot (9. ábra) emésztettük NotX-gyei, körré 1igáituk és felhasználtuk FA880 transzförmálásáré klőramfenikol rezisztencia kialakítására és megkaptuk a PA911 törzset, PA911 néhány izolátumát teszteltük PCR-rel annak meghatározására, vajon szándékaink szerint vpr-nél épült-e be a plazmid vagy panB-nél, ahol szintén képes integrálódni. Mindkét típusra találtunk izolátumot. PARII mindkét típusára agy izeiétumor, PA911-5 és PA911-9 jelűeket megsokszoroztuk tétraoiklinén (panD kazetta) és klór&mfenikolon (panB kazetta) és megvizsgáltuk pantotenát termelésüket Kémcső tenyészetben β-alaninnal kiegészített SV¥ tápközegben szaporítva (lásd az 1. táblázatot). Mindkét izolátum több pantutenátot és kissé kevesebb HMBPA-t termelt, mint a PA880 szülői törzs. Továbbá, a PAS68 izolátümokkal megegyezőén, a panB kazettát a panB génbe beépülve tartalmazó PA911-8 termelte a legtöbb pantotenátot.
Mntoténát termelés nöwiéae a&eriá hozzáférhetőségének növelésével
Feltételeztük, hogy a pantotenát : HMBPA képződési arány a mikroorganizmus tenyészetbén á szerín hozzáférhetőségének szabályozásával is kontrollálható. Főképpen azt tételeztük fel, hogy szerin hozzáférhetőségének növelése: növelheti a pantotenát termelést á HMBPA termeléshez viszonyítva, míg szerin hozzáférhetőségónek csökkenése csökkenti a pantotenát termelést a HMBBA termeléshez képest. Eá az elmélet azon az ismereten alapul, hogy a PanB szubsztrátja, metilén-tetrahidrofolát, sserínböl származik.. Ilyenformán tehát szerin szintek szabályózásának hatékonyan kell 77.07S/HE.
szabályoznia a PanB szubsztrát szinteket. Ennek a hipotézisnek a vizsgálatára ΈΑΒ24 törzset szaporítottunk kémcső tenyészetben SVY glükóz 1 5 g/1 β-alanin és ± 5 g/1 szexin tápközegben 48 órán keresztül 43 °C~on.
5. táblázat: PA824 pantotenát és HMÖPA termelése szerin hozzáadásával és anélkül
| Sserin adagolás 5 g/1 | OÖsöö | [pan] g/1 | [HMHPA] g/1 |
| 16, 3 | 4,9 | 0,84 | |
| 14,0 | 4,5 | 0,80 | |
| 4 | 13,1 | 6,4 | 0, 56 |
| 4 | 12, 9 | 6, 0 | 0, 62 |
Az 5. táblázatban bemutatott adatok szerint szerln hozzáadása növeli a pantotenát képződés szintjét, ugyanakkor csökkenti a HMBPA termelést. A szerin rátáplálás alternatívája egy másik módazer a szerin és mstilén-tetrahidrofolát szintjeinek növelésére a pantotenát termelés szabályozása érdekében, a 3-foszfögliGerát dehidrogenáz vagy a szerin hidroximétll transzferáz (serA és glyA géhtefmékék; szintézisének vagy aktivitásának növelése, ezáltal fokozva a szerin és metilén-tetrahidrofolát bioszintézisét a génét lkailag megfelelően átalakított mikroorganizmusban.
VXXI. példa;
ΒΑβ68~·2Α ás PA668-24 törzsek pantotenát 10 literes
A PA668-2A és PA668-24 törzseket egyenként 2-2 alkalommal 10 literéé f érment örökben szaporítottuk. A tápközeg PFM-155 volt és az Összetétele a kövétkezők szerint:
f
Bateh
| Anyag | g/1 (végső kodd^^xé) | |
| 1. | Amberex 1003 | 5 |
| 2. | Cargill 200/20 (ezójaliszt) | 40 |
| 3. | Na-glutamát | 5 |
| 4. | (WdsSCh | 8 |
| .....>.............: | MgSO« x VHjQ | 1 |
| 6 * | MA3U DF2Ö4C | : 1 |
| 7. | H2O | feltöltve 4 literre |
Sterileződ ás visszahütés után adagolva
| 1. | KHjPCb | 10 |
| 2. | K2.HPG4 x 3H?O | í 20 |
| 3. | h2o | feltöltve 400 ml~re |
| 1. | 80% glükóz | 20 |
| 2. | CaCl2 x 2H2O | 0,1 |
| 1. | N á t r i um- c i t r át. | 1 |
| 2. | FeSCg x 7H2O | 0,01 |
| 3. | SM-1000X | 1 X |
Rá táplálás
| Anyag | g/1 (végső kaneentráció) | |
| 1. | 80í glükóz | 800 |
| 2. | CaClj x 2-H.aQ | 0,8 |
| 3. | h2o | feltöltve 3500 :ml-re |
77.QWB£ t t
Sterilezés és visszahütés után adagolva
| 1. | N á t r i um ~ c i t r á t | 2,0 |
| 2. | PeSO4 m W> | 0,02 |
| 3. | SM-1000X | 2 X |
| 4. | Na-glutamát | 5,0 |
| 5. | HjO | feltöltve 500 ml-re |
A PA668-2A törzs pantotenát termelése 45 g/1 és 51 g/1 volt 36 óra után, hasonlóan rutin PA824 fermentációkhoz ugyanebben a tápközegben. 36 óra elteltével, amikor a pantotenát termelés a PA824 törzzsel rutinszerűén elkezd lassulni, mindkét PA668~2A. fermentációban folytatódott a termelődés 63 g/1 pantotenát szint eléréséig 48 óra után. Még jelentősebb, hogy a HKBPA termelődés 48 óránál 3-5 g/l-re esett vissza és a pantotenát mennyiségnek kevesebb, mint 5%-a volt a legtöbb korábbi fermentáció alatt. A pantotenát szintézisre gyakorolt jótékony hatás egyértelmű a ΡΆ668 törzs megnövekedett PanB szintjeiből. A PA668-24 törzs mécs nagyobb sebességgel termelt pantotenátot mindkét fermentációban, átlagosan 58 g/l-t 36 óra alatt.
A szakember csupán rutin kísérletek alkalmazásával képes az itt leirt találmány specifikus megvalósítási formáival egyenértékű változatok elkészítésére. Az ilyen egyenértékű változatok szintén a találmány és az itt kővetkező szabadalmi igénypontok oltalmi körébe tartoznak.
Claims (3)
- SZABADALMI IGÉNYPONTOK '1. Eljárás pantotenát kompózíclŐ előállítására. ahol az [Rl-3-(2-hidroxi-3-met' i 1 - b u t1 ril á m i η o) - pro p i o ns a vn a k vág y a 3 - (2 - h i d rox i - 3 - meri l - b u ti ri l a m i η o) - p röpte n savnak (HMBPA) az említett kompozícióban a pantotenáfh.oz viszonyított, aránya netn mu;\obb. nőm 1,10 es amely eliátas a; alább? lépeseket íaríaunmrza:a) Böcüíns· su.&rfh\? sejteket transzformálunk a 2'4. szekvencia szerinti vagy a 26, szekvencia szerinti DNS kazettákkal; ésb) s iiDh.;o?n?Mí sepiA ko”a kcaias'uut a csökkentett Páni 2 ködök pdn-wen.r kináz aktivitásból vagy csökkentik CoaX-kódolt pantotenát kináz aktivitással rendelkező kloramfertikol-rezis-tens rekombináns sejteket; és cs a sejteket kb. 12 órán át tcnws/jük
- 2, Az I. igénypont-szerinti eljárás, amelynél további lépésként pantotenát vegyüietet.-a tenyésztő közegből izoláljuk.
- 3. Az I, vagy 2. igénypont szerinti eljárás, ahol az említett mikroorganizmus továbbá emelkedett aktivitással rendelkezik legalább egy, az alábbi csoportból választott enzimmel szemben: ketopantotenát. hidroximetibtranszferál pantoteöát s zi nte t á z é s a-szpart á t - a 1 fa - d e k a r b o x i I á z.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US26299501P | 2001-01-19 | 2001-01-19 | |
| US60/262,995 | 2001-01-19 | ||
| PCT/US2002/001842 WO2002057474A2 (en) | 2001-01-19 | 2002-01-19 | Processes for enhanced production of pantothenate |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HUP0302798A2 HUP0302798A2 (hu) | 2003-11-28 |
| HUP0302798A3 HUP0302798A3 (en) | 2011-05-30 |
| HU230549B1 true HU230549B1 (hu) | 2016-11-28 |
Family
ID=22999939
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU0302798A HU230549B1 (hu) | 2001-01-19 | 2002-01-19 | Javított eljárások pantotenát előállítására |
Country Status (18)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US7220561B2 (hu) |
| EP (1) | EP1370670A2 (hu) |
| JP (1) | JP4217070B2 (hu) |
| KR (1) | KR20040004496A (hu) |
| CN (1) | CN100543143C (hu) |
| AU (1) | AU2002247012A1 (hu) |
| BR (1) | BR0206587A (hu) |
| CA (1) | CA2434483A1 (hu) |
| CZ (1) | CZ20031978A3 (hu) |
| EE (1) | EE200300343A (hu) |
| HU (1) | HU230549B1 (hu) |
| IL (1) | IL156613A0 (hu) |
| MX (1) | MXPA03006342A (hu) |
| NO (1) | NO20033267L (hu) |
| PL (1) | PL373006A1 (hu) |
| RU (1) | RU2003125653A (hu) |
| SK (1) | SK9022003A3 (hu) |
| WO (1) | WO2002057474A2 (hu) |
Families Citing this family (22)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8232081B2 (en) * | 1999-09-21 | 2012-07-31 | Basf Se | Methods and microorganisms for production of panto-compounds |
| WO2002057476A2 (en) * | 2001-01-19 | 2002-07-25 | Basf Aktiengesellschaft | Methods and microorganisms for the production of 3-(2-hydroxy-3-methyl-butyrylamino)-propionic acid (hmbpa) |
| MXPA03006343A (es) * | 2001-01-19 | 2003-10-06 | Basf Ag | Microorganismos y procesos para produccion mejorada de pantotenato. |
| DE10108223A1 (de) | 2001-02-21 | 2002-10-10 | Basf Ag | Verfahren zur Herstellung von D-Pantothensäure und/oder deren Salze als Zusatz zu Tierfuttermitteln |
| CA2491145A1 (en) | 2002-07-03 | 2004-01-15 | Basf Aktiengesellschaft | Microorganisms and processes for enhanced production of pantothenate |
| HUP0500383A2 (hu) * | 2002-07-03 | 2005-08-29 | Basf Ag | Mikroorganizmusok és eljárások pantotenát fokozott termelésére |
| JP4713469B2 (ja) * | 2003-06-18 | 2011-06-29 | ディーエスエム アイピー アセッツ ビー．ブイ． | 胞子形成できない微生物を用いたパントテネート（Ｐａｎｔｏｔｈｅｎａｔｅ）の製造 |
| DE10344200A1 (de) * | 2003-09-22 | 2005-05-04 | Basf Ag | Verfahren zur Herstellung eines D-Pantothensäure und/oder deren Salze enthaltendes Tierfuttersupplement |
| DE112007001179T5 (de) | 2006-05-16 | 2009-04-02 | Dsm Ip Assets B.V. | Verfahren zur Herstellung von Panthenol |
| EP2157174A1 (en) | 2008-08-12 | 2010-02-24 | DSM IP Assets B.V. | Increased production of pantothenate (vitamin B5) |
| HUE039900T2 (hu) | 2010-03-22 | 2019-02-28 | Stemina Biomarker Discovery Inc | Gyógyszerek humán fejlõdésre gyakorolt toxicitásának elõrejelzése humán õssejtszerû sejtek és metabolomika alkalmazásával |
| EP2580341A4 (en) * | 2010-06-11 | 2014-04-23 | Univ California | SYNTHETIC STRIPS FOR BIOFUEL SYNTHESIS |
| WO2012175575A2 (en) | 2011-06-21 | 2012-12-27 | Dsm Ip Assets B.V. | Increased vitamin b5 production |
| WO2012175574A1 (en) | 2011-06-21 | 2012-12-27 | Dsm Ip Assets B.V. | Increased pantothenate (vitamin b5) production |
| KR102266177B1 (ko) | 2013-07-23 | 2021-06-17 | 피티티 글로벌 케미컬 퍼블릭 컴퍼니 리미티드 | 당 이입을 위해 촉진 확산을 이용한 석신산 및 기타 화학물질의 제조방법 |
| CN103980150B (zh) * | 2014-04-12 | 2016-08-17 | 烟台恒迪克能源科技有限公司 | 一种脂肪醇醚烷酰基氨基酸钠的合成方法 |
| CN109868254B (zh) * | 2019-03-14 | 2021-02-19 | 浙江工业大学 | 一种高产泛酸的基因工程菌、构建方法及应用 |
| WO2022072490A1 (en) * | 2020-10-02 | 2022-04-07 | Codexis, Inc. | Engineered pantothenate kinase variant enzymes |
| WO2022219173A1 (en) | 2021-04-15 | 2022-10-20 | Dsm Ip Assets B.V. | Production of panthenol |
| EP4108654A1 (en) | 2021-06-23 | 2022-12-28 | DSM IP Assets B.V. | Production of panthenol |
| WO2024110278A1 (en) | 2022-11-21 | 2024-05-30 | Dsm Ip Assets B.V. | Production of panthenol |
| EP4378923A1 (en) | 2022-12-01 | 2024-06-05 | DSM IP Assets B.V. | Production of panthenol |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP3710497B2 (ja) * | 1992-09-25 | 2005-10-26 | ビーエーエスエフ アクチェンゲゼルシャフト | Ｄ−パント酸、ｄ−パントテン酸およびそれらの塩の製造法 |
| DE19846499A1 (de) * | 1998-10-09 | 2000-04-20 | Degussa | Verfahren zur Herstellung von Pantothensäure durch Verstärkung von für Ketopantoat-Reduktase kodierenden Nukleotidsequenzen |
| DE19855312A1 (de) * | 1998-12-01 | 2000-06-08 | Degussa | Verfahren zur fermentativen Herstellung von D-Pantothensäure unter Verwendung coryneformer Bakterien |
| DE19855314A1 (de) * | 1998-12-01 | 2000-06-08 | Degussa | Verfahren zur fermentiven Herstellung von D-Pantothensäure unter Verwendung von Stämmen der Familie Enterobacteriaceae |
| SK5222002A3 (en) * | 1999-09-21 | 2003-03-04 | Basf Ag | Methods and microorganisms for production of panto-compounds |
| JP2001089706A (ja) | 1999-09-21 | 2001-04-03 | Toto Ltd | 光触媒性親水性コート剤 |
| MXPA03006343A (es) | 2001-01-19 | 2003-10-06 | Basf Ag | Microorganismos y procesos para produccion mejorada de pantotenato. |
| DE10106460A1 (de) * | 2001-02-13 | 2002-08-14 | Degussa | Verfahren zur fermentativen Herstellung von D-Pantothensäure und/oder deren Salzen |
-
2002
- 2002-01-19 CN CNB028038584A patent/CN100543143C/zh not_active Expired - Fee Related
- 2002-01-19 CA CA002434483A patent/CA2434483A1/en not_active Abandoned
- 2002-01-19 AU AU2002247012A patent/AU2002247012A1/en not_active Abandoned
- 2002-01-19 SK SK902-2003A patent/SK9022003A3/sk unknown
- 2002-01-19 EE EEP200300343A patent/EE200300343A/xx unknown
- 2002-01-19 IL IL15661302A patent/IL156613A0/xx unknown
- 2002-01-19 EP EP02714764A patent/EP1370670A2/en not_active Withdrawn
- 2002-01-19 PL PL02373006A patent/PL373006A1/xx not_active Application Discontinuation
- 2002-01-19 WO PCT/US2002/001842 patent/WO2002057474A2/en not_active Application Discontinuation
- 2002-01-19 BR BR0206587-8A patent/BR0206587A/pt active Search and Examination
- 2002-01-19 US US10/466,717 patent/US7220561B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-01-19 KR KR20037009571A patent/KR20040004496A/ko not_active Application Discontinuation
- 2002-01-19 JP JP2002558526A patent/JP4217070B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2002-01-19 CZ CZ20031978A patent/CZ20031978A3/cs unknown
- 2002-01-19 HU HU0302798A patent/HU230549B1/hu not_active IP Right Cessation
- 2002-01-19 MX MXPA03006342A patent/MXPA03006342A/es unknown
- 2002-01-19 RU RU2003125653/13A patent/RU2003125653A/ru not_active Application Discontinuation
-
2003
- 2003-07-18 NO NO20033267A patent/NO20033267L/no not_active Application Discontinuation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA2434483A1 (en) | 2002-07-25 |
| JP2005501509A (ja) | 2005-01-20 |
| US7220561B2 (en) | 2007-05-22 |
| KR20040004496A (ko) | 2004-01-13 |
| WO2002057474A2 (en) | 2002-07-25 |
| RU2003125653A (ru) | 2005-03-10 |
| IL156613A0 (en) | 2004-01-04 |
| BR0206587A (pt) | 2005-12-13 |
| SK9022003A3 (en) | 2003-12-02 |
| PL373006A1 (en) | 2005-08-08 |
| CN1496405A (zh) | 2004-05-12 |
| EE200300343A (et) | 2003-10-15 |
| US20040086982A1 (en) | 2004-05-06 |
| HUP0302798A3 (en) | 2011-05-30 |
| NO20033267L (no) | 2003-09-19 |
| MXPA03006342A (es) | 2004-12-03 |
| CN100543143C (zh) | 2009-09-23 |
| WO2002057474A3 (en) | 2003-10-02 |
| JP4217070B2 (ja) | 2009-01-28 |
| NO20033267D0 (no) | 2003-07-18 |
| EP1370670A2 (en) | 2003-12-17 |
| CZ20031978A3 (en) | 2004-06-16 |
| HUP0302798A2 (hu) | 2003-11-28 |
| AU2002247012A1 (en) | 2002-07-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| HU230549B1 (hu) | Javított eljárások pantotenát előállítására | |
| EP1390519B1 (en) | Microorganisms and processes for enhanced production of pantothenate | |
| CN100485028C (zh) | 生产氨基酸的细菌及制备l-氨基酸的方法 | |
| KR20050100389A (ko) | 박테리아 및 상기 박테리아에 의한 화학적 화합물 제조방법 | |
| KR20000047829A (ko) | 미생물에서 ｐａｎＤ 유전자를 증폭시켜 Ｄ-판토텐산을제조하는 발효 방법 | |
| JP2003527828A (ja) | パント−化合物を産生するための方法および微生物 | |
| US7291489B2 (en) | Microorganisms and processes for enhanced production of pantothenate | |
| KR20140111421A (ko) | L-발린 생산능이 향상된 균주 및 이를 이용한 l-발린 생산방법 | |
| KR20010051233A (ko) | 측쇄 아미노산의 배출을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열,이의 분리 방법 및 이의 용도 | |
| SK163999A3 (en) | Method for the fermentative production of d-pantothenic acid using enterobacteriaceae strains | |
| US7105302B2 (en) | Nucleotide sequences coding for the pknB gene | |
| EP1520030B1 (en) | Microorganisms and processes for enhanced production of pantothenate | |
| KR20040014489A (ko) | 코리네형 박테리아를 이용한 발효에 의한 ｌ-아미노산의생산 방법 | |
| ES2378985T3 (es) | Bacterias productoras de L-treonina y un procedimiento para preparar L-treonina | |
| US7226763B2 (en) | Process for preparing L-amino acids with corynebacteria with enhanced nucleotide sequences coding for pknD | |
| US20020048795A1 (en) | Nucleotide sequences coding for the ccsB gene | |
| WO2021048353A1 (en) | Coryneform bacteria with a heterologous threonine transporter and their use in the production of l-threonine | |
| JP2005503758A (ja) | ３−（２−ヒドロキシ−３−メチル−ブチリルアミノ）−プロピオン酸（ｈｍｂｐａ）の製造方法及び微生物 | |
| WO2002022828A1 (en) | Isolation and sequencing of the pknb gene of c. glutamicum | |
| EP1317545A2 (en) | Nucleotide sequences coding for the pknd gene | |
| CZ427799A3 (cs) | Fermentativní způsob výroby D-pantothenové kyseliny využívající kmenů bakterií z čeledi Enterobacteriacae |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FH91 | Appointment of a representative |
Free format text: FORMER REPRESENTATIVE(S): BELICZAY LASZLO, S.B.G. & K. SZABADALMI UEGYVIVOEI IRODA, HU Representative=s name: S.B.G & K. SZABADALMI UEGYVIVOEI IRODA, HU |
|
| FH92 | Termination of representative |
Representative=s name: BELICZAY LASZLO, S.B.G. & K. SZABADALMI UEGYVI, HU |
|
| MM4A | Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees |