MXPA02007305A - Composiciones antiboticas de azalida. - Google Patents

Abstract

Se describen composiciones antibioticas que comprenden una mezcla en equilibrio de isomeros de azalida, agua y uno o mas acidos, y metodos para preparar estas composiciones. Las composiciones antibioticas pueden estabilizarse de modo ventajoso mediante la adicion de uno o mas codisolventes miscibles en agua. En una realizacion preferida, dicho uno o mas codisolventes es el propilenglicol.

Description

COMPOSICIONES ANTIBIOTICAS DE A2ALIDA ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN 5 La invención trata de composiciones farmacéuticas que comprenden una mezcla en equilibrio de isómeros de un compuesto antibiótico de azalida, y de métodos para prepararlas. Esta invención además trata de formas estabilizadas de las composiciones anteriormente mencionadas, y de métodos para estabilizarlas. Esta invención además trata 10 de métodos para tratar un mamífero que comprende administrar a un mamífero que necesite este tratamiento una composición farmacéutica de la invención. Se ha informado con anterioridad acerca de agentes antióbicos macrólidos que resultan activos frente a una amplia variedad de infecciones 15 bacterianas y protozoarias en mamíferos, peces y pájaros (véase, por ejemplo, las publicaciones de patentes internacionales WO 98/56802 y WO 99/12552). Estos compuestos en general presentan un anillo de lactona macrocíclico de 12 a 22 átomos de carbono, al cual están unidos uno o más restos de azúcar. Los antibióticos macrólidos actúan sobre la subunidad 20 ribosómica de 50S para inhibir la síntesis proteica en microorganismos. Los ejemplos de antibióticos macrólidos incluyen lincomicina, azitromicina, que es un derivado de la eritromicina A, y otros compuestos de azalida. El desarrollo de composiciones farmacéuticas que contienen compuestos de azalida como principio activo ha presentado problemas importantes. Algunas azalidas son capaces de isomerizarse en disolución. Por consiguiente, la producción de una composición antibiótica reproducible que comprenda un solo isómero o una proporción fija de isómeros ha resultado difícil. En segundo lugar, una composición que contenga una cantidad fija de un isómero de azalida concreto puede cambiar con el tiempo. En tercer lugar, el anillo de lactona y los azúcares de las azalidas pueden ser hidrolizados con facilidad incluso en medios con un Ph ligeramente ácido o básico, disminuyendo la potencia farmacológica y la caducidad de una composición antibiótica. Por consiguiente, un objeto de la presente invención es proporcionar composiciones antibióticas y métodos para prepararlas, que solucionen los problemas anteriormente mencionados. No debe entenderse que las citas de las referencias bibliográficas en la presente indiquen que dichas referencias correspondan a la técnica anterior de la presente invención. ** . *& .. ** ásm *& **.. ¿ j ?«*.*s* ¿ . *.., , ..« „ -*-.^...-..***. .., *.*„.<* .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN En una primera realización, la presente invención trata de una composición que comprende: (a) el compuesto de fórmula I (0 y el compuesto de fórmula II: (ii) en una proporción desde aproximadamente 90% ± 4% a aproximadamente 10% ± 4%, respectivamente; (b) agua; y (c) uno o más ácidos presentes a una concentración total desde aproximadamente 0.2 mmol a aproximadamente 1.0 mmol por ml de la composición. La presente invención trata de un método para obtener una composición que comprende: (a) el compuesto de fórmula I y el compuesto de fórmula II en una proporción desde aproximadamente 90% ± 4% a aproximadamente 10% ± 4%, respectivamente; (b) agua; y (c) uno o más ácidos presentes a una concentración total desde aproximadamente 0.2 mmol a aproximadamente 1.0 mmol por ml de la composición, que comprende la etapa de calentar hasta una temperatura desde aproximadamente 50°C a aproximadamente 90°C una mezcla que comprende: (a) el compuesto de fórmula (I), (b) agua y (c) uno o más ácidos en una cantidad total que varia desde aproximadamente 0.2 mmol a aproximadamente 1.0 mmol por ml de la mezcla. En una realización preferida, el pH de la mezcla varia desde aproximadamente 5.0 a aproximadamente 8.0, y más preferiblemente desde aproximadamente 5.0 a aproximadamente 6.0. La invención trata de un método para tratar una infección bacteriana o protozoaria en un mamífero, que comprende administrar a un mamífero que necesite este tratamiento una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición que comprende: (a) el compuesto de fórmula I y el compuesto de fórmula II en una proporción desde aproximadamente 90% ± 4% a aproximadamente 10% ± 4%, respectivamente; (b) agua; y (c) uno o más ácidos presentes a una concentración total desde aproximadamente 0.2 mmol a aproximadamente 1.0 mmol por ml de la composición. En una realización preferida, el pH de la mezcla varia desde aproximadamente 5.0 a aproximadamente 8.0, y más preferiblemente desde aproximadamente 5.0 a aproximadamente 6.0. En otra realización preferida, la infección bacteriana o protozoaria se selecciona del grupo formado por enfermedad respiratoria bovina, enfermedad respiratoria porcina, neumonía, coccidiosis, anaplasmosis y queratinitas infecciosa. La presente invención trata de una composición que comprende: (a) una mezcla que comprende: (i) el compuesto de fórmula (I) y el compuesto de fórmula (II) en una proporción desde aproximadamente 90% ± 4% a aproximadamente 10% ± 4%, respectivamente; (ii) agua; y (iii) uno o más ácidos presentes a una concentración total desde aproximadamente 0.2 mmol a aproximadamente 1.0 mmol por ml de la mezcla; y (b) uno o más codisolventes miscibles en agua presentes en una cantidad total desde aproximadamente 250 a aproximadamente 750 mg por ml de la composición. La presente invención trata de un método para obtener una composición que comprende: (a) una mezcla que comprende: (i) el compuesto de fórmula (I) y el compuesto de fórmula (II) en una proporción desde aproximadamente 90% ± 4% a aproximadamente 10% ± 4%, respectivamente; (ii) agua; y (iii) uno o más ácidos presentes a una concentración total desde aproximadamente 0.2 mmol a aproximadamente 1.0 mmol por ml de la mezcla; y (b) uno o más codisolventes miscibles en agua presentes en una cantidad total desde aproximadamente 250 a aproximadamente 750 mg por ml de la composición, que comprende la etapa de añadir a la mezcla uno o más codisolventes miscibles en agua en una cantidad total desde aproximadamente 250 a aproximadamente 750 mg por ml de la composición. La presente invención trata de un método para obtener una composición que comprende (a) una primera mezcla que comprende: (i) el compuesto de fórmula (I) y el compuesto de fórmula (II) en una proporción desde aproximadamente 90% ± 4% a aproximadamente 10% ± 4%, respectivamente; (ii) agua; y (iii) uno o más ácidos presentes a una concentración total desde aproximadamente 0.2 mmol a aproximadamente 1.0 mmol por ml de la mezcla; y (b) uno o más codisolventes miscibles en agua presentes en una cantidad total desde aproximadamente 250 a aproximadamente 750 mg por ml de la composición, que comprende la etapa de calentar hasta una temperatura desde aproximadamente 50°C a aproximadamente 90°C una mezcla que comprende el compuesto de fórmula (I), agua, uno o más ácidos en una cantidad que varia desde aproximadamente 0.2 mmol a aproximadamente 1.0 mmol por ml de la mezcla, y uno o más codisolventes miscibles en agua se añaden antes, durante o después de la etapa de calentamiento, en una cantidad desde aproximadamente 250 a aproximadamente 750 mg por ml de la composición. La presente invención trata de un método para conservar la integridad estructural del compuesto de fórmula I o del compuesto de fórmula tn-u? l i ^ ?^m?^aa^m? máiaj ? ^ ^^^^^^^^^^Ü^¡M II, que comprende la etapa de formar una composición mediante la adición de uno o más codisolventes miscibles en agua a una mezcla que comprende: (a) el compuesto de fórmula I y el compuesto de fórmula II; (b) 5 agua; y (c) uno o más ácidos presentes en una cantidad total desde aproximadamente 0.2 mmol a aproximadamente 1.0 mmol por ml de la mezcla, y la cantidad de codisolvente miscible en agua añadida es desde aproximadamente 250 a aproximadamente 750 por ml de la composición. La presente invención trata de un método para tratar una infección bacteriana o protozoaria en un mamífero, que comprende administrar a un mamífero que necesite dicho tratamiento una cantidad eficaz de una composición que comprende: (a) una mezcla que comprende: (i) el compuesto de fórmula (I) y el compuesto de fórmula (II) en una proporción desde aproximadamente 90% ± 4% a aproximadamente 10% ± 4%, respectivamente; (ii) agua; y (iii) uno o más ácidos presentes a una concentración total desde aproximadamente 0.2 mmol a aproximadamente 1.0 mmol por ml de la mezcla; y (b) uno o más codisolventes miscibles en agua presentes en una cantidad total desde aproximadamente 250 a aproximadamente 750 mg por ml de la composición En una realización de las composiciones de la invención, dichos uno o más ácidos se seleccionan del grupo formado por ácido acético, ácido bencensulfónico, ácido cítrico, ácido bromhidrico, ácido clorhídrico, ácido D- y L- láctico, ácido metanosulfónico, ácido fosfórico, ácido succinico, ácido sulfúrico, ácido D- y L-tartárico, ácido p-toluensulfónico, ácido adipico, ácido aspártico, ácido canforsulfónico, ácido 1.2-etanodisulfónico, ácido lauriisulfúrico, ácico glucoheptónico, ácido glucónico, ácido 3-hidroxi-2-naftoico, ácido 1-hidroxi-2-naftoico, ácido 2-hidroxietanosulfónico, ácido málico, ácido múcico, ácido nítrico, ácido naftalensulfónico, ácido palmitico, ácido D- glucárico, ácido esteárico, ácido maleico, ácido malónico, ácido fumárico, ácido benzoico, ácido cólico, ácido etanosulfónico, ácido glucurónico, ácido glutámico, ácido hipúrico, ácido lactobiónico, ácido lisinico, ácido mandélico, ácido napadisilico, ácido nicotinico, ácido poligalacturónico, ácido salicilico, ácido sulfosalicilico, ácido triptofánico y sus mezclas. En una realización preferida, dicho uno o más ácidos es el ácido cítrico. En otra realización preferida, dichos uno o más ácidos son el ácido cítrico y el ácido clorhídrico. En una realización más preferida, el ácido cítrico está presente en una cantidad desde aproximadamente 0.02 mmol a aproximadamente 0,3 mmol por ml de la composición, y el ácido clorhídrico está presente en una cantidad suficiente para lograr un pH de la composición desde aproximadamente 5 a aproximadamente 6. En una realización de las composiciones de la invención, dichos uno o más codisolventes miscibles en agua se seleccionan del grupo formado por etanol, isopropanol, dietilenglicol monometil éter, dietilenglicol butil éter, dietilenglicol monoetil éter, dietilenglicol dibutil éter, polietilenglicol-300, polietilenglicol-400, propilenglicol, glicerina, 2-pirrolidona, N-metil-2-pirrolidona, glicerol formal, sulfóxido de dimetilo, sebecato de dibutilo, adkaaaJMriiih Éta riMli_ik polisorbato 80 y sus mezclas. En una realización, dicho uno o más codisolvente miscible en agua es el propilenglicol. En una realización preferida, el propilenglicol está presente en una cantidad desde aproximadamente 450 a aproximadamente 550 mg por ml de la composición. En una realización de las composiciones de la invención, la composición además comprende uno o más antioxidantes presentes en una cantidad desde aproximadamente 0.01 mg a aproximadamente 10 mg por ml de la composición. En una realización preferida, dicho uno o más antioxidante se selecciona del grupo formado por bisulfito de sodio, sulfito de sodio, metabisulfito de sodio, tiosulfato de sodio, formaldehido sulfoxilato de sodio, ácido L-ascórbico, ácido eritórbico, acetilcisteina, cisteina, monotioglicerol, ácido tioglicólico, ácido tioláctico, tiourea, ditiotreitol, ditioeritreitol, glutatión, palmitato de ascorbilo, hidroxianisol butilado, hidroxitolueno butilado, ácido nordihidroguaiarético, galato de propilo, a-tocoferol y sus mezclas. En una realización más preferida, dicho uno o más antioxidante es el monotioglicerol. En una realización especialmente preferida, el monotioglicerol está presente en una cantidad desde aproximadamente 4 mg/ml a aproximadamente 7 mg/ml de la composición. En una realización de las composiciones de la invención, la concentración de la primera mezcla (del compuesto I y el compuesto II) en la composición varia desde aproximadamente 50 mg/ml a aproximadamente 200 mg/ml. En una realización preferida, la concentración de la primera IMMMIWI^dUÉllüi mezcla en la composición varia desde aproximadamente 90 mg/ml a aproximadamente 110 mg/ml. En una realización especialmente preferida de ia composición de esta invención, el ácido cítrico está presente en una cantidad desde aproximadamente 0.02 mmol a aproximadamente 0.3 mmol por ml de la composición, y el ácido clorhídrico está presente en una cantidad suficiente para lograr un pH de la composición de aproximadamente 5 a aproximadamente 6; el propilenglicol está presente en una cantidad desde aproximadamente 450 a aproximadamente 550 mg por ml de la composición; y el monotioglicerol está presente en una cantidad desde aproximadamente 4 mg/ml a aproximadamente 6 mg/ml de la composición. Esta invención también trata de un compuesto de fórmula: o su sal farmacéuticamente aceptable; en la cual R1 es OH o -MkA?aáddUÉMM^^^i.^lt^^Uta y en la cual R2 es H o CH3. La presente invención puede comprenderse más a fondo haciendo referencia a la descripción detallada y los ejemplos ilustrativos, los cuales se pretende que ejemplifiquen las realizaciones no limitantes de la invención.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Isómero II Isómero I - La presente invención trata de composiciones farmacéuticas que comprenden el isómero I y el isómero II (de forma conjunta se denominan los "isómeros de azalida"), en una proporción desde aproximadamente 90% ± 4% a aproximadamente 10% ± 4%. El nombre químico del isómero I es (2R,3S,4R,5R,8R,10R,11R,12S,13S,14R)-13-((2,6- didesoxi-3-O-metil-3-O-metil-4-C-((propilamino)-metil)-a-L-ribohexo- piranosil)oxi-2-etil-2,3,10-trihidroxi-3,5,8,10,12,14-hexametil-11-((3,4,6- tridesoxi-3-(dimetilamino)-ß-D- xilohexopiranosil)oxi)-1-oxa-6- azaciclopentadecan-15-ona. El nombre químico del isómero II es (3R, 6R, 8R, 9R, 10S, 11S, 12R)-11-((2,6-didesoxi-3-C-metil-3-O-metil-4-C-((propilamino)-metil)-a-L-ribohexopiranosil)oxi)-2-((1 R,2R)-1 ,2-dihidroxi-1-metilbuti -d-hidroxi-S.?.d.lO.^-pentametil-g-ÍÍS^.e-tridesoxi-S-ídimetilamino)-ß-D-xilohexopiranosil)oxi)-1-oxa-4-azaciclotridecan-13-ona. El isómero I puede formarse a partir de una reacción de translactonización del isómero II. De forma similar, el isómero II puede formarse a partir de una reacción de translactonización del isómero I. Los métodos para obtener el isómero I se describen en la publicación internacional n° WO 98/56802, que se incorpora en la presente como referencia. Los métodos para obtener el isómero II se describen en el ejemplo 1 que aparece a continuación. Los isómeros de azalida son agentes antibióticos activos. Sin querer limitarse por ninguna teoría, la invención está basada en parte en el sorprendente descubrimiento de los solicitantes de que una composición que comprende el isómero I y el isómero II en una proporción desde aproximadamente 90% ± 4% a aproximadamente 10% ± 4%, puede obtenerse con rapidez utilizando los métodos descritos en la presente, independientemente de la proporción de partida de los isómeros de azalida. Por consiguiente, la expresión "mezcla en equilibrio de los isómeros", tal como se utiliza en la presente, hace referencia a una mezcla del isómero I y el isómero II en una proporción desde aproximadamente 90% ± 4% a aproximadamente 10% ± 4%, respectivamente. Una composición antibiótica que comprende una mezcla en equilibrio de isómeros puede por tanto producirse, y proporciona un patrón para ensayo o para el uso del consumidor. Por tanto, resulta muy deseable una composición que comprenda la mezcla en equilibrio de los isómeros. La presente invención además trata de un método para .preparar una composición que comprende una mezcla en equilibrio de los isómeros. En una realización, la mezcla en equilibrio de los isómeros se obtiene a partir de una disolución del isómero I sustancialmente puro. La expresión "sustancialmente .puro", tal como se utiliza en la presente, a menos que se indique lo contrario, significa que tiene una pureza de al menos 97%. En otra realización, la mezcla en equilibrio de los isómeros se obtiene a partir de una disolución que comprende una mezcla del isómero I y el isómero II. En general, una mezcla en equilibrio de los isómeros se genera calentando una disolución en agua del isómero I, preferiblemente el isómero I sustancialmente puro, o una mezcla del isómero I y el isómero II, en presencia de uno o más ácidos. En una realización preferida, una disolución en agua del isómero I y uno o más ácidos se calienta hasta una temperatura desde aproximadamente 50°C a aproximadamente 90°C, preferiblemente desde aproximadamente 60°C a aproximadamente 80°C, durante aproximadamente 0.5 a aproximadamente 24 horas, preferiblemente desde aproximadamente 1 a aproximadamente 10 horas, a un pH desde aproximadamente 5.0 a aproximadamente 8.0, preferiblemente desde aproximadamente 6.0 a aproximadamente 8.0. Más preferiblemente, una disolución del isómero I y del isómero II se calienta hasta una temperatura desde aproximadamente 65°C a aproximadamente 75°C durante aproximadamente 1 a aproximadamente 8 horas, a un pH desde aproximadamente 6.5 a aproximadamente 7.5 en presencia de uno o más ácidos. La concentración del isómero I o de la mezcla del isómero I y el isómero II que va a ser equilibrada, puede variar desde aproximadamente 50 mg/l a aproximadamente 500 mg/ml, más preferiblemente desde aproximadamente 100 mg/ml a aproximadamente 300 mg/ml, y lo más preferible desde aproximadamente 225 mg/ml a aproximadamente 275 mg/l de la disolución. Los ácidos adecuados que resultan útiles para obtener la mezcla en equilibrio de los isómeros incluyen, pero no se limitan al ácido acético, ácido bencensulfónico, ácido cítrico, ácido bromhidrico, ácido clorhídrico, ácido D- y L- láctico, ácido metanosulfónico, ácido fosfórico, ácido succinico, ácido sulfúrico, ácido D- y L-tartárico, ácido p-toluensulfónico, ácido adipico, ácido aspártico, ácidocanforsulfónico, ácido 1 ,2-etanodisulfónico, ácido laurilsulfúrico, ácico glucoheptónico, ácido glucónico, ácido 3-hidroxi-2-naftoico, ácido 1-hidroxi-2-naftoico, ácido 2-hidroxietanosulfónico, ácido málico, ácido múcico, ácido nítrico, ácido naftalensulfónico, ácido palmitico, ácido D-glucárico, ácido esteárico, ácido maleico, ácido malónico, ácido fumárico, ácido benzoico, ácido cólico, ácido etanosulfónico, ácido glucurónico, ácido glutámico, ácido hipúrico, ácido lactobiónieo, ácido lisínico, ácido mandélico, ácido napadisílico, ácido nicotinico, ácido poligalacturónico, ácido salicílico, ácido sulfosalicilico, ácido triptofánico y sus mezclas. Preferiblemente, el o los MMHMMÍM^^MMiiÜlIk ácidos son el ácido cítrico y clorhídrico. Cuando se encuentra presente, el ácido cítrico está a una concentración desde aproximadamente 0.02 mmol a aproximadamente 0.3 mmol por ml de la disolución. En una realización, se utiliza una concentración de ácido desde aproximadamente 0.2 mmol a aproximadamente 1.0 mmol por ml de disolución. Sin querer limitarse por ninguna teoría, los solicitantes creen que la sal formada por la adición de un ácido a una disolución del isómero I ejerce un efecto tamponante, porque los isómeros de azalida en si mismos actúan como una base. Los expertos en la técnica comprenderán que la cantidad de ácido requerida para un pH deseado variará según el ácido utilizado, y que con el fin de mantener un pH dentro de un intervalo deseado, puede añadirse otro ácido y/o una base a la disolución del ácido y el isómero I, o a la mezcla del isómero I y el isómero II. Las bases adecuadas incluyen, pero no se limitan a los hidróxidos y carbonates de metales alcalinos, los bicarbonatos de metales alcalinos, y los hidróxidos y carbonates de metales alcalino-térreos. Se prefiere el hidróxido de sodio y el hidróxido de potasio. Los ácidos y bases descritos anteriormente se utilizan de modo conveniente en forma de sus disoluciones acuosas. Las composiciones que comprenden la mezcla en equilibrio de isómeros (las "composiciones equilibradas" resultan útiles para tratar una infección bacteriana o protozoaria en un mamífero. Las composiciones equilibradas también resultan útiles como intermedios en la formación de composiciones estabilizadas y equilibradas.

•HM iÉMiAaÉUUMÉMiMlál La presente invención además trata de composiciones estabilizadas y equilibradas, y de métodos para estabilizarlas, que comprenden diluir las composiciones equilibradas con uno o más disolventes orgánicos ("codisolventes") miscibles en agua. El codisolvente no debe afectar significativamente la proporción del isómero I y el isómero II en las composiciones equilibradas, y de hecho, conserva su integridad estructural. La expresión "conservar la integridad estructural" del isómero I o del isómero II, tal como se utiliza en la presente, incluye pero no se limita a disminuir su velocidad de hidrólisis hasta, por ejemplo, la azalida de descladinosa, y disminuir su velocidad de formación de subproductos, por ejemplo, de un producto de inserción de acetaldehído y de formaldehído, definidos a continuación. Sin querer limitarse por ninguna teoría, los solicitantes creen que la dilución con el codisolvente mejora la estabilidad de los isómeros de azalida. Además, en virtud de la presencia del codisolvente, cualquier dolor sufrido tras la inyección de las composiciones estabilizadas y equilibradas puede ser menor que el sufrido tras la inyección de una composición equilibrada y no estabilizada. Los codisolventes útiles para estabilizar las composiciones equilibradas incluyen, pero no se limitan a alcoholes como etanol e isopropanol; éteres glicólicos como dietilenglicol monometil éter, dietilenglicol butil éter, dietilenglicol monoetil éter y dietilenglicol dibutil éter; polietilenglicoles como olietilenglicol-300 y polietilenglicol-400; glicoles como propilenglicol ("PG") y glicerina; pirrolidonas como 2-pirrolidona y N-metil-2-pirrolidona; glicerol formal; sulfóxido de dimetilo; sebecato de dibutilo; esteres de polioxietilensorbitán, como polisorbato 80; y sus mezclas. Preferiblemente, los codisolventes útiles para estabilizar las composiciones equilibradas en disoluciones inyectables incluyen, pero no se limitan a etanol, polietilenglicoles como polietilenglicol-300 y polietilenglicol-400, glicoles como propilenglicol y glicerina, pirrolidonas como 2-pirrolidona y N-metil-2-pirrolidona, glicerol formal, sulfóxido de dimetilo, esteres de polioxietilensorbitán como polisorbato 80, y sus mezclas, más preferiblemente glicerol formal, N-metil-2-pirrolidona y propilenglicol, y lo más preferible propilenglicol. En una realización, se utiliza un codisolvente en una cantidad desde aproximadamente 250 a aproximadamente 750 mg por ml de las composiciones farmacéuticas para estabilizarlas. En una realización preferida, se utiliza desde aproximadamente 400 a aproximadamente 600 mg del codisolvente por mil de las composiciones farmacéuticas. En una realización más preferida, se utiliza desde aproximadamente 450 a aproximadamente 550 mg de codisolvente por ml de las composiciones farmacéuticas. En una realización, se añaden uno o más codisolventes al isómero I, o a una mezcla del isómero. I y el isómero II, antes del equilibrio. En este caso, la mezcla resultante se calienta hasta alcanzar una temperatura desde aproximadamente 50°C y aproximadamente 90°C, preferiblemente desde aproximadamente 60°C a aproximadamente 80°C, durante aproximadamente 0.5 a aproximadamente 24 horas, preferiblemente desde aproximadamente 1 a aproximadamente 10 horas, a un pH desde ?¿a? *i , Z±> lt*á : aproximadamente 5.0 a aproximadamente 8.0, preferiblemente a un pH desde aproximadamente 6.0 a aproximadamente 8.0. En una realización preferida, el equilibrio de los isómeros de azalida se lleva a cabo en ausencia del codisolvente, que se añade a las composiciones equilibradas después de que se hayan enfriado hasta aproximadamente la temperatura ambiente. Después de la adición del codisolvente, el pH de la disolución resultante puede volver a ajustarse para mejorar aún más la estabilidad de la composición. El pH se ajusta mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica, como por ejemplo mediante la adición de una cantidad del ácido o base descrita con anterioridad, por ejemplo como una disolución madre al 10% (p/p), y se mide el pH de la disolución resultante utilizando, por ejemplo, un pH-metro. En una realización, el pH de la disolución resultante, si es necesario, se ajusta desde aproximadamente 4.5 a aproximadamente 7.5, preferiblemente desde aproximadamente 5.0 a aproximadamente 6.0, y lo más preferible desde aproximadamente 5.2 a aproximadamente 5.6. La presente invención además trata de composiciones farmacéuticas que comprenden una mezcla en equilibrio de isómeros, agua, uno o más ácidos, y uno o más codisolventes miscibles en agua. La cantidad de isómeros de azalida en las composiciones farmacéuticas varia desde aproximadamente 50 mg de isómeros de azalida por ml de composición farmacéutica, a aproximadamente 200 mg de isómeros de azalida por ml de composición farmacéutica. Preferiblemente, las composiciones farmacéuticas .¿^¿¿b^ÉAüfi comprenden desde aproximadamente 75 mg a aproximadamente 150 mg, más preferiblemente desde aproximadamente 90 a aproximadamente 110 mg de isómeros de azalida por ml de la composición farmacéutica. Las composiciones farmacéuticas además pueden comprender uno o más antioxidantes. Los antioxidantes disminuyen ia velocidad o previenen la rotura oxidativa de las composiciones farmacéuticas. Los antioxidantes adecuados incluyen, pero no están limitados a bisulfito de sodio, sulfito de sodio, metabisulfito de sodio, tiosulfato de sodio, formaldehído sulfoxilato de sodio, ácido L-ascórbico, ácido eritórbico, acetilcisteina, cisteína, monotioglicerol ("MTG"), ácido tioglicólico, ácido tioláctico, tiourea, ditiotreitol, ditioeritreitol, glutatión, palmitato de ascorbilo, hidroxianisol butilado, hidroxitoleno butilado, ácido norhidroguaiarético, galato de propilo, a-tocoferol y sus mezclas. Los expertos en la técnica sabrán que la cantidad de antioxidante variará según el antioxidante utilizado. En una realización preferida, el antioxidante, cuando se encuentra presente, se encontrará en una cantidad desde aproximadamente 0.01 mg a aproximadamente 10 mg por ml de la composición farmacéutica. En una realización más preferida, el antioxidante es monotioglicerol y se encuentra presente en una cantidad desde aproximadamente 1 mg a aproximadamente 8 mg por ml de la composición farmacéutica. En una realización más preferida, el antioxidante es monotioglicerol, y se encuentra presente en una cantidad desde aproximadamente 4 mg a aproximadamente 6 mg por ml de la ^ttt^^t lmá? m?li m^ a^^l É??á mmmmmmlmmmmlÉ composición farmacéutica. Las composiciones farmacéuticas opcionalmente comprenden uno o más conservantes. Los conservantes resultan útiles para disminuir la velocidad o prevenir la proliferación de microorganismos, en particular cuando las composiciones farmacéuticas están expuestas al aire. Los conservantes útiles son: eficaces frente a un amplio espectro de microorganismos; física, química y microbiológicamente estables durante la vida útil de las composiciones farmacéuticas; no . tóxicos; solubles de modo adecuado; compatibles con los otros componentes de la composición; y aceptables con respecto al sabor y al olor. Los conservantes adecuados incluyen, pero no se limitan a cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio, ácido benzoico, alcohol bencílico, metilparabeno, etilparabeno, propilparabeno, butilparabeno, benzoato de sodio, fenol y sus mezclas. En una realización preferida, el o los conservantes se seleccionan de un grupo formado por alcohol bencílico, metilparabeno, propilparabeno, una combinación de metilparabeno/propilparabeno, y fenol. Cuando están presentes, el o los conservantes se encuentran en una cantidad desde aproximadamente 0.01 a aproximadamente 10 mg por ml de las composiciones farmacéuticas. Preferiblemente, el o los conservantes es el fenol, y se encuentra presente en una cantidad desde 2.0 a aproximadamente 5.0 mg por ml, más preferiblemente desde aproximadamente 2.0 a aproximadamente 3.0 mg por ml de las composiciones farmacéuticas. Un experto en la técnica sabrá que la cantidad de conservante utilizado en las .M^^^^^MÍMUMÍ. presentes composiciones dependerá del conservante elegido, y que algunos conservantes pueden utilizarse a concentraciones menores, incluso menores que aproximadamente 0.01 mg por ml de las composiciones farmacéuticas. En una realización preferida, las composiciones farmacéuticas de la invención tienen un pH desde aproximadamente 50 a aproximadamente 7.0, y comprenden: (1 ) una mezcla en equilibrio de los isómeros presentes en una cantidad desde aproximadamente 50 mg a aproximadamente 200 mg por ml de la composición farmacéutica; (2) ácido cítrico presente en una concentración desde aproximadamente 0.02 mmol a aproximadamente 0.3 mmol por ml de la composición farmacéutica, y opcionalmente una cantidad de ácido clorhídrico eficaz para lograr el intervalo de pH; (3) propilenglicol, presente en una cantidad desde aproximadamente 250 a aproximadamente 750 mg por ml de la composición farmacéutica; (4) monotioglicerol, presente en una cantidad desde aproximadamente 1 mg a aproximadamente 15 mg por ml de la composición farmacéutica; y (5) agua, presente en una cantidad desde aproximadamente 100 a aproximadamente 750 mg por ml de la composición farmacéutica. En una realización más preferida, las composiciones farmacéuticas de la invención tienen un pH desde aproximadamente 5.0 a aproximadamente 6.0, y comprenden: (1) un mezcla en equilibrio de isómeros presentes en una cantidad desde aproximadamente 75 mg a - •*-" - «->--*"»g"^ - aproximadamente 150 mg por ml de la composición farmacéutica; (2) ácido cítrico presente en una cantidad desde aproximadamente 0.05 mmol a aproximadamente 0.15 mmol por ml de la composición farmacéutica, y opcionalmente una cantidad de ácido clorhídrico eficaz para lograr el intervalo de pH; (3) propilenglicol, presente en una cantidad desde aproximadamente 400 a aproximadamente 600 mg por ml de la composición farmacéutica; (4) monotioglicerol, presente en una cantidad desde aproximadamente 1 mg a aproximadamente 8 mg por ml de la composición farmacéutica; y (5) agua, presente en una cantidad desde aproximadamente 250 a aproximadamente 550 mg por ml de la composición farmacéutica. En la realización más preferida, las composiciones farmacéuticas de la invención tienen un pH desde aproximadamente 5.2 a aproximadamente 5.6, y comprenden: (1) un mezcla en equilibrio de isómeros presentes en una cantidad desde aproximadamente 90 mg a aproximadamente 110 mg por ml de la composición farmacéutica; (2) ácido cítrico presente en una cantidad desde aproximadamente 0.075 mmol a aproximadamente 0.125 mmol por ml de la composición farmacéutica, y una cantidad de ácido clorhídrico eficaz para lograr el intervalo de pH; (3) propilenglicol, presente en una cantidad desde aproximadamente 450 a aproximadamente 550 mg por ml de la composición farmacéutica; (4) monotioglicerol, presente en una cantidad desde aproximadamente 4 mg a aproximadamente 6 mg por ml de la composición farmacéutica; y (5) agua, presente en una cantidad desde aproximadamente 300 a aproximadamente 500 mg por ml de la composición farmacéutica. Las composiciones farmacéuticas pueden prepararse como sigue. Los reactivos se añaden en un recipiente con una camisa de acero inoxidable o de fibra de vidrio, con un recubrimiento opcional de nitrógeno. Se añade agua para inyección al recipiente de reacción, y se comienza la agitación. Cada componente adicional se añade mientras la mezcla se agita continuamente. Se añade ácido en una concentración desde aproximadamente 0.02 mmol a aproximadamente 0.5 mmol por ml de agua, y se deja disolver. Se añade opcionalmente una disolución acuosa de un ácido, por ejemplo una disolución acuosa de ácido clorhídrico al 10% (p/p), para ajustar el pH al intervalo deseado, y la disolución se mezcla. En este momento, se añade a la mezcla de agua y ácido el isómero I, o una mezcla del isómero I y el isómero II, lentamente y en pequeñas cantidades para evitar la formación de grumos. Se deja que se disuelvan el isómero I, o la mezcla del isómero I y el isómero II, y se mide el pH de la disolución resultante. En una realización, la concentración del isómero I o de la mezcla del isómero I y el isómero II es desde aproximadamente 50 mg a aproximadamente 500 mg por ml, preferiblemente desde aproximadamente 100 a aproximadamente 300 mg por ml, y lo más preferible desde aproximadamente 225 a aproximadamente 275 mg por ml de la disolución resultante. La disolución entonces se calienta hasta alcanzar una temperatura de aproximadamente 70°C ± 10°C, y se mantiene a esta temperatura hasta que se obtiene una ¡ f ^ mezcla en equilibrio de isómeros. Los métodos para determinar que se ha obtenido una mezcla en equilibrio de isómeros incluyen la. cromatografía en gel, la cromatografía en capa fina, y la cromatografía liquida de alta resolución. En general, utilizando las condiciones descritas en la presente, se obtiene una mezcla en equilibrio de isómeros en aproximadamente 1 a aproximadamente 8 horas. Cuando se obtiene la mezcla en equilibrio de los isómeros, la 5 disolución resultante se enfría hasta aproximadamente 25°C ± 10°C. Esta disolución puede utilizarse como composición farmacéutica. Preferiblemente, se añade el codisolvente en una cantidad desde aproximadamente 250 a aproximadamente 750 mg por ml de la composición farmacéutica. Se añade opcionalmente un antioxidante en una cantidad desde aproximadamente 0.01 mg a aproximadamente 10 mg por ml de la composición farmacéutica. Si se encuentra presente, el conservante se añade en una cantidad desde aproximadamente 0.01 mg a aproximadamente 10 mg por ml de la composición farmacéutica. Si se encuentra presente, el conservante se añade en una cantidad desde aproximadamente 0.01 a aproximadamente 10 mg por ml de la composición farmacéutica, y el pH se ajusta desde aproximadamente 5.0 a aproximadamente 8.0, preferiblemente desde aproximadamente 5.0 a aproximadamente 6.0, mediante la adición de un ácido y/o una base, por ejemplo, como una disolución acuosa al 10% (p/p) o en forma sólida. La mezcla resultante se diluye hasta un volumen deseado. En una realización, la concentración final de la mezcla en equilibrio de los isómeros es desde aproximadamente 50 mg a aproximadamente 200 mg, preferiblemente desde aproximadamente 75 mg a aproximadamente 150 mg, y lo más preferible desde aproximadamente 90 mg a aproximadamente 110 mg por ml de la composición farmacéutica resultante. Las composiciones resultantes preferiblemente se esterilizan, por ejemplo, haciendo pasar las composiciones a través de un prefiltro, por ejemplo un filtro de 5-10 mieras, y después a través de un filtro esterilizante final de 0.2 mieras que ha sido previamente esterilizado. El filtro esterilizante se esteriliza mediante un autoclave con calor húmedo, durante 60 minutos a 121 °C, y se ensaya su integridad utilizando un método de presión antes de la esterilización y después de la filtración del producto. La disolución estéril se añade a recipientes adecuados, por ejemplo viales de vidrio, que se esteriliza y despirogenan a 250°C durante 240 minutos en un túnel de calor seco. El espacio superior del recipiente se limpia con un chorro de un gas inerte, por ejemplo argón o preferiblemente nitrógeno. Los recipientes se cierran con tapones que se despirogenan mediante lavado, y se esterilizan mediante un autoclave con calor húmedo, durante 60 minutos a 121°C. Los recipientes entonces se sellan. Los expertos en la técnica sabrán que pueden utilizarse pequeñas modificaciones de lo expuesto para preparar composiciones estériles. La presente invención además trata de métodos para tratar un mamífero, que comprenden administrar a un mamífero que necesite este tratamiento una cantidad farmacéuticamente eficaz de una composición .**..* ... . -^ "»» farmacéutica de la invención. Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden utilizarse para tratar infecciones por bacterias gram-positivas, bacterias gram-negativas, protozoos y micoplasmas, incluyendo pero sin limitarse a Actinobacillus pleuropneumonia, Pasteurella multocida, Pasteurella haemolytlca, H. parasuis, B. bronchiseptica, S. choleraesuis, S. pilo, Moraxella bovis, H. somnus, M. bovis, Eimeria zuernii, Eimería bovis, A. margínale, M. hyopneumoniae, Lawsonia intracellularis, y especies de Straphylococcus, Salmonella, Chlamydia, Coccidia, Cryptosporidla, E. col i, Haemophilus, ' Neospora y Streptococcus. La expresión "tratamiento", tal como se utiliza en la presente, a menos que se indique lo contrario, incluye el tratamiento o la prevención de una infección bacteriana o una infección protozoaria, como se indica en el método de la presente invención. Tal como se utiliza en la presente, a menos que se indique lo contrario, las expresiones "infección(es) bacteriana(s)" e "infección(es) protozoaria(s)" incluyen infecciones bacterianas e infecciones protozoarias que se producen en mamíferos, peces y aves, así como los trastornos relacionados con las infecciones bacterianas y protozoarias que pueden tratarse o prevenirse mediante la administración de antibióticos como los compuestos de la presente invención. Estas infecciones bacterianas e infecciones protozoarias, y los trastornos relacionados con dichas infecciones, incluyen los siguientes: neumonía, otitis media, sinusitis, bronquitis, tonsilitis y mastoiditis relacionadas con una infección por Streptococcus ^^^^^^^¿¡^^¡^j pneumoniae, Haemophilus influenzae, Moraxella catarrhalis, Staphylococcus aureus o Peptostreptococcus spp.; faringitis, fiebre reumática y glomerulonefritis relacionadas con una infección por Streptococcus pyogenes, estreptococos del grupo C y G, Clostridium diptheriae o Actinobacillus haemolytlcum; infecciones del tracto respiratorio relacionadas con una infección por Mycoplasma pneumon-iae, Legionella pneumophila, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus Influenzae o Chlamydia pneumonlae; infecciones de la piel y los tejidos blandos sin complicaciones, abscesos y osteomielitis, y fiebre puerperal relacionada con una infección por Staphylococcus aureus, estafilococos positivos frente a la coagulasa (es decir, S. epidemidis, S. hemolyticus, etc.), Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae, estreptococos de los grupos C-F (estreptococos de colonias minúsculas), estreptococos viridans, Corynehacterium minutissimun, Clostridium spp., o Bartonella henselae; infecciones del tracto urinario agudas sin complicaciones relacionadas con una infección por Staphylococcus saprophyticus o Enterococcus spp.; uretritris y cervicitis; y enfermedades de transmisión sexual relacionadas con una infección por Chiamydia trachomatis, Haemophilus ducreyi, Treponema pallidum, Ureaplasma urealyticum o Neisseria gonorrheae; enfermedades de toxinas relacionadas con una infección por S. aureus (intoxicación alimentaria y síndrome del choque tóxico), o estreptococos de los grupos A, B y C; úlceras relacionadas con una infección por Helicobacter pylori; síndromes febriles sistémicos relacionados con »«*. .. « - ? é~*.*?».*,* una infección por Borrelia recurrentis; enfermedad de Lyme relacionada con una infección por Borrelia burgdorferi; conjuntivitis, queratitis y dacrocistitis relacionadas con una infección por Chiamydla trachomatis, Neisseria gonorrheae, S. aureus, S. pneumoniae, S. pyogenes, H. influenzae o Listeria spp.; enfermedad del complejo de Mycobacterium avium diseminado (MAC) relacionada con una infección por Mycobacterium avium o Mycobacterium intracellulare; gastroenteritis relacionada con una infección por Campylobacter jejuni; protozoos intestinales relacionados con una infección por Cryptosporidium spp.; infección odontogénica relacionada con una infección por estreptococos viridans; tos persistente relacionada con una infección por Bordetella pertussis: gangrena gaseosa relacionada con una infección por Clostridium perfringens o Bacteroides spp.; y aterosclerosis relacionada con una infección por Helicobacter pylon o Chiamydia pneumoniae. Las infecciones bacterianas y las infecciones protozoarias, y los trastornos relacionados con estas infecciones, que pueden ser tratados o prevenidos en animales, incluyen los siguientes: enfermedad respiratoria bovina relacionada con una infección por P. haem., P. multocida, Mycoplasma bovis o Bordetella spp.; enfermedad entérica de la vaca relacionada con una infección por E. coli o protozoos (es decir, coccidios, criptosporidios, etc.); mastitis de la vaca lechera relacionada con una infección por Staph. aureus, Strep. uberis, Strep. agalactiae, Strep. dysgalactiae, Klebsiella spp., Corynebacterium o Enterococcus spp.; enfermedad respiratoria porcina relacionada con una infección por A. pleuro, * *-"-^*-~* - --* • - -¿»-*n -i- P. multocida o Mycoplasma spp.; enfermedad entérica porcina relacionada con una infección por E. coli, Lawsonia intracellularis, Salmonella o Serpulina hyodyisinteriae; uñero de la vaca relacionado con una infección por Fusobacterium spp.; metritis de la vaca relacionada con una infección por E. coli; verrugas pilosas de la vaca relacionadas con una infección por Fusobacteríum necrophorum o Bacteroides nodosus: ojo rosa de la vaca relacionado con una infección por Moraxella bocis; aborto prematuro de la vaca relacionado con una infección por protozoos (es decir, neosporium); infección del tracto urinario en perros y gatos relacionada con una infección por E. coli; infecciones de la piel y los tejidos blandos en perros y gatos relacionadas con una infección por Staph. epidermidis, Staph. intermedius, estafilococos negativos frente a la coagulasa o P. multocida; e infecciones dentales o bucales en perros y gatos relacionadas con una infección por Alcaligenes spp., Bacteroides spp., Clostridium spp., Enterobacter spp., Eubacterlum, Peptostreptococcus, Porphyromonas o Prevotella. Otras infecciones bacterianas e infecciones protozoarias, y los trastornos relacionados con estas infecciones, que pueden tratarse o prevenirse según el método de la presente invención aparecen en J.P. Sanford et al., "The Sanford Guide to Antimicrobial Therapy", 26a edición (Antimicrobial Therapy, Inc., 1996). La actividad antibacteriana y antiprotozoaria de los compuestos de la presente invención contra patógenos bacterianos y protozoarios se demuestra por la capacidad de los compuestos para inhibir el crecimiento de ? *. **.** . amllU M* cepas concretas de patógenos humanos o animales.

Ensayo I El ensayo I, descrito a continuación, emplea una metodología y unos criterios de interpretación convencionales, y está diseñado para suministrar una guía para establecer modificaciones químicas que puedan conducir a compuestos que eviten unos mecanismos concretos de resistencia a macrólidos. En el ensayo I, se juntan un grupo de cepas bacterianas para que incluyan una diversidad de especies patógenas diana, ..incluyendo mecanismos representativos de resistencia a macrólidos que han sido caracterizados. El uso de este grupo permite determinar la relación entre estructura química/actividad con respecto a la potencia farmacológica, el espectro de actividad y los elementos estructurales o modificaciones que pueden resultar necesarios para eliminar los mecanismos de resistencia. Los patógenos bacterianos que forman el grupo de investigación aparecen en el cuadro a continuación. En muchos casos, resultan disponibles la cepa parental susceptible a los macrólidos y la cepa resistente a los macrólidos derivada de ella, para suministrar una evaluación más precisa de la capacidad de los compuestos para evitar el mecanismo de resistencia. Las cepas que contienen el gen con la denominación ermA/ermB/ermC son resistentes a los antibióticos de macrólidos, de lincosamidas y de estreptogramina B debido a modificaciones (metilación) de moléculas de rRNA 23S por una Erm- - - - - -* - -*^ - * «- *-<-<*•> <*—»-. ..«"*- • - *—™fibtwi? metilasa, con lo cual en general se evita la unión de las tres clases estructurales. Se han descrito dos tipos de eflujo de macrólidos: msrA codifica un componente de un sistema de eflujo en estafilococos, que evita la entrada de macrólidos y estreptograminas, mientras que mefA/E codifica una proteína transmembrana que parece que efluye sólo macrólidos. La inactivación de los antibióticos de macrólidos puede producirse y mediarse por una fosforilación en el 2N-hidroxilo (mph), o mediante rotura de la lactona macrocíclica (esterasa). Las cepas pueden caracterizarse utilizando la tecnología de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) convencional y/o mediante la secuenciación del determinante de la resistencia. El uso de la tecnología de la PCR en esta solicitud se describe en J. Sutcliffe et al., "Detection Of Erythromycin-Resistant Determinants By PCR", Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 40(11 ), 2562-2566 (1996). El ensayo se lleva a cabo en placas de microvaloración y se interpreta según Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests -Sixth Edition; Approved Standard, publicado por las directrices de The National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS); se utiliza la concentración mínima inhibitoria (CMI) para comparar cepas. La mezcla en equilibrio de los isómeros de azalida se disuelve inicialmente en sulfóxido de dimetilo (DMSO) como una disolución madre 40 mg/ml.

??«^ * * ? -* «•' El ensayo II se utiliza para comprobar la actividad contra Pasteurella multocida, y el ensayo lll se utiliza para comprobar la actividad . . ^A..,t **já contra Pasteurella haemolytica.

Ensayo II Este ensayo está basado en el método de dilución en líquido en formato de micrólitro. Un única colonia de P. multocida (cepa 59A067) se inocula en 5 ml de caldo de infusión de cerebro-corazón (BHI). La mezcla en equilibrio de isómeros de azalida se prepara solubilizando 1 mg de la mezcla en 125 µl de sulfóxido de dimetilo (DMSO). Se preparan diluciones de la mezcla en equilibrio de los isómeros de azalida utilizando caldo BHI no inoculado. Las concentraciones de la mezcla en equilibrio de los isómeros de azalida utilizadas varían desde 200 µg/ml a 0.098 µg/ml mediante diluciones en serie en dos veces. El BHI inoculado con P. multocida se diluye con caldo BHI no inoculado para preparar una suspensión de 104 células por 200 µl. Las suspensiones de células-BHI se mezclan con las respectivas diluciones en serie de la mezcla en equilibrio de los isómeros de azalida, y se incuban a 37°C durante 18 horas. La concentración mínima inhibitoria (MIC) es igual a la concentración de la mezcla que muestra una inhibición de 100% del crecimiento de P. multocida, según se determina mediante la comparación con un control no inoculado. ^j^¡ Ensayo lll Este ensayo se basa en el método de dilución en agar utilizando un replicador Steers. Se inoculan en cultivo BHI de dos a cinco colonias aisladas de una placa de agar, y se incuban durante la noche a 37°C con agitación (200 rpm). A la mañana siguiente, se inoculan 300 µl de precultivo de P. haemoytica totalmente desarrollado en 3 ml de caldo BHI fresco, y se incuba a 37°C con agitación (200 rpm) . Se disuelven las cantidades apropiadas de la mezcla en equilibrio de los isómeros de azalida en etanol, y se prepara una serie de diluciones en serie en dos veces. Se mezclan 2 ml de la respectiva dilución en serie con 18 ml del agar BHI fundido y se solidifica. Cuando el cultivo de P. multocida inoculado alcanza una densidad estándar McFarland de 0.5, se inoculan aproximadamente 5 µl del cultivo de P. multocida en las placas de agar BHI que contienen las diversas concentraciones de la mezcla en equilibrio de los isómeros de azalida, utilizando un replicador Steers, y se incuba durante 18 horas a 37°C. Las concentraciones iniciales de la mezcla varían desde 100-200 µg/ml. La CMI es igual a la concentración de la mezcla que muestra una inhibición de 100% del crecimiento de P. haemolytica, según se determina mediante la comparación con un control no inoculado. Más preferiblemente, el ensayo de microdilución se lleva a cabo utilizando un cultivo Mueller-Hinton de cationes ajustados, según las directrices de NCCLS M31-A, volumen 19, n° 11 , "Performance standards for antimicrobial disk and dilution susceptibility tests for bacteria isolated from animáis", junio 1999 (ISBN 1-56238-377-9), que se incorpora en la presente como referencia. Este ensayo puede utilizarse para determinar la CMI de un compuesto frente a P. haemolytica y P. multocida. Por ejemplo, la mezcla en equilibrio de los isómeros se ensayó según este ensayo homologado, frente a P. haemolytica (ATCC 14003), y se descubrió que presentaba una CMI de 1 µg/ml. Cuando la mezcla en equilibrio de los isómeros se ensaya según este ensayo homologado frente a P. multocida (ATCC 43137), se descubrió que la CMI era 1 µg/ml.

Ensayo IV La actividad in vivo de las composiciones farmacéuticas de la presente invención puede determinarse mediante estudios convencionales de protección en animales muy conocidos por los expertos en la técnica, que normalmente se llevan a cabo en ratones. A su llegada, los ratones se asignan a jaulas (10 por jaula) y se deja que se aclimaten durante un mínimo de 48 horas antes de utilizarlos. Los animales se inoculan con 0.5 ml de una suspensión bacteriana (P. multocida cepa 59A006) 3 x 103 CFU/ml por vía intraperitoneal. Cada experimento se lleva a cabo con al menos 3 grupos control no medicados, incluyendo uno infectado con una dosis de exposición X0.1 y dos infectados con una dosis de exposición X1 ; también puede utilizarse un grupo de datos de exposición X10. En general, todos los ratones en un estudio concreto pueden exponerse en 30-90 minutos, en especial si se utiliza una jeringa de repetición (como una . falLi *í *i. *MÍem ~3 jeringa ComwallR) para administrar la exposición. Treinta minutos después de haber comenzado la exposición, se administra el primer tratamiento con la composición farmacéutica. Puede que resulte necesario que una segunda persona comience con la dosificación de la composición farmacéutica si todos los animales no han sido expuestos al final de los 30 minutos. Las vías de administración son dosis subcutáneas u orales. Las dosis subcutáneas se administran en la piel suelta de la parte posterior del cuello, mientras que las dosis orales se administran mediante una aguja de alimentación. En ambos casos, se utiliza un volumen de 0.2 ml por ratón. Las composiciones se administran 30 minutos, 4 horas y 24 horas después de la exposición. En cada ensayo se incluye una composición control de eficacia conocida, administrada por la misma vía. Los animales son observados a diario, y se registra el numero de supervivientes en cada grupo. El control del modelo de P. multocida continúa durante 96 horas (cuatro días) después de la exposición. La DP50 es una dosis calculada en la cual la composición farmacéutica ensayada protege a 50% de un grupo de ratones de la mortalidad debida a la infección bacteriana, que seria letal en ausencia de tratamiento. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención muestran una actividad antibacteriana en uno de los ensayos descritos anteriormente, en concreto en el ensayo IV. Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden utilizarse para tratar humanos, ganado vacuno, *-*, , ..^¿?. *mJ .. ., - at.«-fa caballos, ovejas, cerdos, conejos, gatos, perros y otros mamíferos que necesiten dicho tratamiento. En concreto, las composiciones farmacéuticas de la invención pueden utilizarse para tratar, entre otras, la enfermedad respiratoria bovina, la enfermedad respiratoria porcina, la neumonía, la pasteurelosis, la coccidiosis, la anaplasmosis y la queratinitis infecciosa. Las composiciones farmacéuticas pueden administrarse mediante la vía oral, intramuscular, intravenosa, subcutánea, intraocular, parenteral, tópica, intravaginal o rectal. Para la administración al ganado vacuno, los cerdos u otros animales domésticos, las composiciones farmacéuticas pueden administrarse en el pienso, o por vía oral mediante una composición empapante. Preferiblemente, las composiciones farmacéuticas se inyectan por vía intramuscular, intravenosa o subcutánea. En una realización preferida, las composiciones farmacéuticas se administran en dosificaciones que varían desde aproximadamente 0.5 mg de la mezcla en equilibrio de los isómeros por kg de peso corporal diarios (mg/kg/día) a aproximadamente 20 mg/kg/día. En una realización más preferida, las composiciones farmacéuticas se administran en dosificaciones que varían desde aproximadamente 1 mg/kg/día a aproximadamente 10 mg/kg/día. En una realización aún más preferida, las composiciones farmacéuticas se administran en dosificaciones que varían desde aproximadamente 1.25 mg/kg/día a aproximadamente 5.0 mg/kg/día. Las composiciones farmacéuticas pueden administrarse hasta varias veces diarias, durante aproximadamente 1 a aproximadamente 15 días, preferiblemente durante aproximadamente 1 a aproximadamente 5 días, y fe afijft » U-* 'fftf'r-"'"— - repetirse cuando resulte apropiado. Los expertos en la técnica comprenderán con facilidad que pueden producirse variaciones en la dosificación dependiendo de la especie, peso y trastorno del sujeto que se está tratando, su respuesta individual a las composiciones farmacéuticas, y la vía concreta de administración elegida. En algunos casos, pueden resultar terapéuticamente eficaces unos niveles de dosificación por debajo del limite inferior de los intervalos mencionados con anterioridad, mientras que en otros casos pueden emplearse dosis aún mayores sin provocar ningún efecto secundario perjudicial, con la condición de que estas dosis mayores primero se subdividan en varias dosis pequeñas para su administración a lo largo del día. Los siguientes ejemplos ilustran -más a fondo las composiciones y los métodos de la presente invención. Debe entenderse que la presente invención no está limitada a los detalles específicos de los ejemplos que aparecen a continuación.

EJEMPLO 1 Síntesis del isómero II. A un matraz Erlenmeyer de 2 I se le añadió desmetilazitromicina (190.5 g, 259.2 .mmol), cloruro de metileno (572 ml) y sulfato de magnesio (38 g). La mezcla se agitó durante 10 minutos, -y después se filtró en un matraz de fondo redondo de 5 I. Se añadió más cloruro de metileno (2285 ml), y la disolución se enfrió hasta-0-5°C. Entonces se añadió CBZ-CI (CBZ = cloroformiato de bencilo) (58.4 ml) durante 10 minutos. La -reacción .se agitó a aproximadamente 0°C durante 6 horas, y después a temperatura ambiente durante la noche. Un -análisis HPLC indicó la presencia de material de partida residual, de forma que la reacción se volvió a enfriar hasta aproximadamente 0°C y se añadió más CBZ-CI (19,5 ml) de una sola vez. La reacción se agitó durante 5.5 horas a 0°C, y después durante 2.5 horas a la temperatura ambiente. Una TLC indicó que la reacción se había completado. La reacción se extinguió con bicarbonato de sodio acuoso saturado (953 ml) y las fases se separaron. La fase orgánica se secó sobre sulfato de magnesio, después se filtró y se concentró para producir el compuesto de fórmula (lll): (lll) a un matraz de fondo redondo de 5 I que contenía el compuesto de fórmula (lll) (225.3 g) en cloruro de metileno (901 ml) y DMSO (450 ml) a -65°C, se le añadió anhídrido trifluoroacético (82.4 ml). La temperatura se mantuvo a -60°C a lo largo de la adición, que finalizó en 9 minutos. La reacción se agitó r. i i *.. ,¿^ ^A. desde -65°C a -70°C durante 20 minutos. La reacción se extinguió con trietilamina (145 ml) y después se agitó desde -60°C a -65°C durante 20 minutos. A la mezcla de reacción se le añadió agua (1127 ml) durante 3 minutos, en cuyo momento la temperatura aumentó hasta -2°C. La mezcla de reacción se agitó durante 10 minutos y se dejó que las fases se separaran. La fase orgánica se lavó con agua (675 ml), y después con cloruro de sodio acuoso saturado (675 ml). La fase orgánica se secó sobre sulfato de magnesio, después se filtró y los disolventes orgánicos se eliminaron mediante destilación. Se añadió MTBE y se destiló para eliminar todas las trazas de cloruro de metileno y DMSO. Se añadió más MTBE hasta un volumen total de 3380 ml. Se añadió ácido dibenzoil-D-tartárico monohidratado (87.8 g) en MTBE (1126 ml) para formar una suspensión espesa. La mezcla se calentó hasta reflujo y se agitó durante la noche. Después de enfriar hasta la temperatura ambiente, los sólidos se recogieron en un embudo Buchner y se enjuagaron con MTBE. Los sólidos se secaron en una estufa de secado a 40°C para producir 258.3 g de la sal de tartrato de dibenzoilo del compuesto de fórmula (IV): .*?& Á (IV) a un matraz de fondo redondo de 3 I se le añadió cloruro de metileno (800 ml) y la sal de tartrato dé dibenzoilo del compuesto de fórmula (IV) (188 g) . Se añadió agua (400 ml) y carbonato de potasio (45.5 g), y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 5 minutos. La fase orgánica se separó, después se lavó con agua (250 ml) y se secó sobre sulfato de magnesio. El agente secante se eliminó mediante filtración, y la disolución resultante se evaporó bajo una corriente de nitrógeno hasta un volumen final de 623 ml, para producir una cetona de base libre. A un matraz de fondo redondo de 5 1 se le añadió THF (623 ml) y bromuro de- trimetilsulfonio (74.7 g). La suspensión resultante se enfrió hasta -10°C y se añadió terc-butóxido de potasio (54.4 g). La mezcla de reacción se agitó durante 10 minutos a -10°C, y después se enfrió hasta -70°C durante 5 minutos. Se añadió una disolución de la cetona de base libre durante 11 minutos, manteniendo la temperatura entre -60°C y -65°C. Una HPLC indicó que la reacción se había completado después de 90 minutos. La reacción se extinguió a -60°C utilizando una disolución de cloruro de amonio (315 g) en agua (1800 ml). La temperatura aumentó hasta -5°C durante la extinción. La mezcla de reacción se calentó hasta 5-10°C y las fases se separaron. La fase orgánica se secó sobre sulfato de sodio, después se filtró y se concentró para producir el compuesto de fórmula (V) (117.4 g) como una espuma de color amarillo. Una HPLC indicó una pureza de 61.4% mediante el área de los picos.

(V) A una disolución del compuesto de fórmula (V) (275 g, 312 mmol) en metanol seco (2.75 I), se le añadió yoduro de potasio (518 g, 3.12 mol) y n-propilamina (250 ml, 3.04 mol). La mezcla se agitó durante la noche a 45°C. Una TLC indicó que la reacción se había completado. La reacción se concentró en un evaporador rotatorio, y el residuo se repartió entre agua (2.5 I) y cloruro de metileno (2.5 I). El pH de la fase acuosa se ajustó a 6.7 utilizando HCl acuoso 3 N. La extracción se repitió otra vez más. Las fases acuosas reunidas se mezclaron con cloruro de metileno fresco (1.5 I) y **A? ti lct* ÍM. i ^¿ ¡r'Jfff¡ >Ji el pH de la fase acuosa se ajustó a 8.5 utilizando carbonato de potasio sólido. Las fases se separaron y la fase acuosa se reextrajo dos veces con más cloruro de metileno. Las fases orgánicas reunidas se secaron sobre sulfato de sodio y después se filtraron. El filtrado se concentró en un evaporador rotatorio para producir una espuma de color beige (230 g). La purificación de la espuma se llevó a cabo en una columna de gel de sílice cargada con suspensión, utilizando hexanos-dietilamina 19/3 (v/v) como la fase móvil. De esta manera, 125 g del producto bruto produjeron 72 g del isómero I como una espuma blanca y amorfa. El isómero I se disolvió en acetonitrilo (0.5 I) a temperatura ambiente. Entonces se añadió agua desionizada (1 I), lo cual provocó la precipitación. Luego se añadió más acetonitrilo (0.5 I) para producir una disolución homogénea que se agitó a temperatura ambiente durante 30 horas. Un análisis HPLC indicó la formación de un nuevo componente, que comprendía aproximadamente 20% del área de los picos total. El disolvente orgánico se eliminó en un evaporador rotatorio. Se añadió carbonato de potasio (30 g) al residuo acuoso, seguido de cloruro de metileno (0.3 1 ). La mezcla se agitó y se eliminó la fase orgánica inferior. También se llevaron a cabo dos extracciones más (2 x 0.3 1 ). Las fases orgánicas reunidas se secaron sobre sulfato de sodio, después se filtraron y la disolución resultante se concentró hasta una espuma seca (aproximadamente 10 g). La mezcla resultante del isómero I y el isómero II se disolvió en una mezcla de cloruro de metileno y hexanos-dietilamina 19/3 (v/v), y se colocó en una columna de gel de sílice cargada con suspensión, y después se eluyó con el sistema 19/3. El eluyente se cambió a hexanos-dietilamina 19/6 en la fracción 56. Las fracciones 9-17 se reunieron y se concentraron hasta una espuma seca, que contenía sólo material de partida sin reaccionar. Las fracciones 52-72 se reunieron y se concentraron, y contentan el isómero II (pureza de 79% mediante HPLC).

EJEMPLO 2 El cuadro 1 a continuación muestra el efecto del pH, la temperatura, el tipo de ácido y la concentración del isómero I sobre la velocidad de reacción de equilibrio, y sobre los niveles de impurezas principales después del equilibrio. Los experimentos repetidos (que no aparecen) demostraron la reproducibilidad de los resultados. La velocidad de equilibrio de los isómeros I y II (desde aproximadamente 90% ± 4% a aproximadamente 10% ± 4%, respectivamente) resultó coherente en todos los experimentos. El análisis de los datos indicó que el pH y la temperatura producen un efecto significativo en el tiempo necesario para el equilibrio. Sin querer limitarse por ninguna teoría, unas temperaturas de equilibrio menores o unos valores de pH menores en general dan como resultado unos tiempos de equilibrio sustancialmente mayores. El tiempo de equilibrio también puede depender, entre otros, de la concentración del material de partida, y del tipo y concentración del ácido utilizado. El isómero I a una concentración de hasta aproximadamente 300 mg por ml de la composición, se calentó hasta alcanzar una temperatura desde aproximadamente 40°C a aproximadamente 80°C en presencia de uno o más ácidos a una concentración desde aproximadamente 0.2 mmol a aproximadamente 1.0 mmol por ml de la mezcla, y con una cantidad suficiente de ácido clorhídrico para lograr un pH desde aproximadamente 6.5 a aproximadamente 7.5 durante hasta aproximadamente 20 horas, para producir una mezcla en equilibrio de isómeros que es aproximadamente 95%- 98% pura. Los parámetros cinéticos de equilibrio y los niveles de impurezas para el equilibrio de los isómeros I y II de azalida se determinaron como función del pH, la temperatura de equilibrio, el tipo de ácido y la concentración del isómero I, y aparecen listados en el cuadro 1. Para identificar las impurezas pueden utilizarse métodos conocidos, incluyendo la cromatografía liquida de alta resolución ("HPLC"), la espectroscopia de resonancia magnética nuclear ("RMN"), la cromatografía de gases ("CG"), la "espectrometría de masas ("MS"), la espectrometría de masas/cromatografía liquida ("LC/MS"), CG/MS y la cromatografía en capa fina ("TLC") . "DS" hace referencia al isómero I antes del equilibrio, y se incluye para la comparación. Se preparen y ensayaron unas mezclas en equilibrio de los isómeros como sigue. Se prepararon 40 ml de disolución en cada uno de los experimentos 1A-11A, y cada disolución se dividió en partes alícuotas de 1 ml JBSAS antes de calentar, con el fin de controlar con mayor facilidad el equilibrio en diferentes momentos. Se prepararon 20 ml de disolución en cada uno de los experimentos 12B-24B, y cada disolución se dividió en partes alícuotas de 0.7 ml antes de calentar. Se prepararon 100 ml de disolución en cada uno de los experimentos 25C-28C, se prepararon 200 ml de disolución en cada uno de los experimentos 29C-30C, y el equilibrio se controló mediante partes alícuotas de 0.5 ml recogidas de las disoluciones. Se prepararon 60 ml de disolución en cada uno de los experimentos 31 D-33D y 35D-41 D, se prepararon 170 ml de disolución en el experimento 34D, y el equilibrio se controló a partir de partes alícuotas de 0.5 ml recogidas de las disoluciones. Se prepararon de 7.200 ml a 54.000 ml de disolución en cada uno de los experimentos 42E-46E, y el equilibrio se controló recogiendo partes alícuotas de 2 ml a 5 ml de las disoluciones. Se prepararon de 35 ml a 50 ml de disolución en cada uno de los experimentos 47F-50G, y cada disolución se dividió en partes alícuotas de 1 ml antes de calentar. Se añadió agua al recipiente adecuado, seguida del tipo y cantidad de ácido listado en la columna 4 de el cuadro 1. La expresión "es" que precede al tipo de ácido hace referencia a una cantidad de ácido suficiente para obtener el pH listado en la columna 2. Cuando se utiliza ácido cítrico o tartárico 0.1 M, también se añadió ácido clorhídrico en cantidad suficiente para obtener el pH listado en la columna 2. Cuando se indica una concentración de ácido en la columna 4 (por ejemplo "cítrico 0.1 M"), esta es la concentración de ácido en una disolución que tiene una mezcla equilibrada del isómero I y el isómero II presente en una concentración de 100 mg/ml. La mezcla de agua y ácido se agitó hasta que todo el ácido se disolvió (aproximadamente 5 minutos o menos para los volúmenes más pequeños, y aproximadamente 20 minutos para los volúmenes mayores). El isómero I se añadió lentamente y en pequeñas porciones para evitar la formación de grumos, y la mezcla resultante se agitó vigorosamente hasta que se disolvió (menos de 30 minutos para los volúmenes más pequeños, y aproximadamente 60-120 minutos para los volúmenes mayores). Después de la disolución del isómero I, se midió el pH de la disolución resultante. Si el pH era menor que el pH listado en la columna 2, se aumentó el pH hasta el listado en la columna 2 con hidróxido de sodio al 2%. Si el pH era mayor que el pH listado en la columna 2, se disminuyó con el (los) ácido(s) apropiado(s). Para cada experimento, la disolución se calentó a la temperatura indicada en la columna 3 hasta que se obtiene una mezcla en equilibrio de los isómeros, según se determina mediante uno de los ensayos HPLC descritos a continuación. En algunos experimentos, las mezclas se calentaron durante un periodo de tiempo mayor que el necesario para el equilibrio (porcentajes mayores que 100% en la columna 8) para determinar los efectos de un calentamiento prolongado sobre el grado de impurezas. Para controlar el equilibrio de los isómeros de azalida, las partes alícuotas de la mezcla de reacción se ensayaron mediante HPLC en diversos momentos durante el equilibrio. En la mayoría de los experimentos de equilibrio mostrados en el cuadro 1 , las partes alícuotas se diluyeron con tampón de fosfato de potasio 40 mM (pH 6.0) hasta una concentración de •i i aproximadamente 0.5 mg de isómeros de azalida por ml de volumen de muestra total, y se sometieron a una cromatografía utilizando una columna de 250 x 4.0 mm, Asahipak ODP-50, 50 µm (acetonitrilo al 40%/metanol al 35%/fosfato de potasio 40 mM al 25%; pH 8.5, fase móvil; caudal 0.7 ml/min; temperatura ambiente) en un cromatógrafo liquido HP 1090 equipado con un detector de absorbancia programable Applied Biosystems 783A. Los picos se detectaron mediante el control de la absorción ultravioleta a 210 nm. Para el resto de los experimentos de equilibrio que aparecen en el cuadro 1 (experimentos 31 D-46E), las partes alícuotas se diluyeron con acetonitrilo al 20%/metanol al 50%/fosfato de potasio 50 mM al 30% (pH 5.5) hasta una concentración de 1.0 mg de isómeros de azalida por ml del volumen de muestra total, y se sometieron a una cromatografía utilizando una columna de 50 x 2.0 mm, YMC Pro-Pack C?8, 3 µm (acetonitrilo al 20%/metanol al 50%/fosfato de potasio 50 mM al 30%; pH 7.0, fase móvil; caudal 0.5 ml/min; temperatura ambiente) en un cromatógrafo liquido HP 1090 con detector de UV interno. Los picos se detectaron mediante el control de la absorción ultravioleta a 210 nm. Se determinaron las cantidades relativas del isómero I y del isómero II calculando la proporción de sus áreas pico relativas del cromatograma. En las condiciones de HPLC anteriores, el isómero I presenta un tiempo de retención de aproximadamente 13-23 minutos, y el isómero II presenta un tiempo de retención relativo ("TRR") de aproximadamente 0.8 a 0.9. "TRR" significa un tiempo de retención relativo al del isómero I bajo las condiciones de HPLC descritas con anterioridad.

La pureza de las muestras equilibradas en el cuadro 1 se determinó utilizando HPLC según uno de tres procedimientos. En los experimentos 1A-24B, 48F y 50G, las partes alícuotas se diluyeron con tampón de fosfato de potasio 25 mM (pH 5.5) hasta una concentración de 1.25 mg de isómeros de azalida por ml de volumen de muestra total, y se ensayaron utilizando una columna de 250 x 4.6 mm, Eclipse XDB-C8, 5 µm (acetonitrilo al 22%/metanol al 58%/fosfato de potasio 25 mM al 20%; pH 8.0, fase móvil; caudal 0.6 ml/min; temperatura ambiente) en un módulo de separación Waters Alliance 2690 con un detector amperométrico BAS CC-5/LC-4C. Los picos se detectaron de modo electroquímico con un electrodo a +0.70 V, un segundo electrodo a +0.88 V, y un intervalo de 0.5 µA. En los experimentos 25C-41 D, las partes alícuotas se diluyeron con ácido cítrico 50 mM (pH 5.5) hasta una concentración de 0.25 mg de isómeros de azalida por ml de volumen de muestra total, y se ensayaron utilizando una columna de 150 x 4.6 mm, YMC Pro-Pack Cíe, 3 µm (metanol al 70%/fosfato 50 mM al 30%; pH 7.0, fase móvil; caudal 1 ml/min; temperatura ambiente) en el sistema Waters Alliance. Los picos se detectaron de modo electroquímico con sólo un detector a +0.90 V. En los experimentos 42E-43E, las partes alícuotas se diluyeron con ácido cítrico 50 mM (pH 5.5) hasta una concentración de 0.25 mg de isómeros de azalida por ml de volumen de muestra total, y se ensayaron utilizando una columna de 150 x 4.6 mm, YMC Pro-Pack Cíe, 3 µm (metanol al 70%/fosfato 50 mM al 30%; pH 7.0, fase móvil; caudal 1 ml/min; temperatura ambiente) en un cromatógrafo liquido HP 1090 con un detector amperométrico BAS CC-5/LC-4C. Los picos se detectaron de modo electroquímico con un sólo electrodo a +0.90 V. El porcentaje de la mezcla en equilibrio de isómeros (columna 9) e impurezas (columna 10) con relación a la muestra ensayada se determinó utilizando las áreas bajo los picos en los cromatogramas. Algunas de las impurezas detectadas fueron: una azalida de descladinosa (su TRR era aproximadamente 0.26 en una columna Eclipse XDB-Cß), un producto de inserción de acetaldehido (su TRR era aproximadamente 1.75 en una columna Eclipse XDB-C8) y un producto de inserción de formaldehído (su TRR era aproximadamente 1.6 en una columna Eclipse XDB-Cß). La azalida de descladinosa tiene la estructura; el producto de inserción de acetaldehído tiene la estructura: * ^mtl. el producto de inserción de formaldehído tiene la estructura: la azalida de descladinosa, el producto de inserción de acetaldehído, el producto de inserción de formaldehído y sus sales farmacéuticamente aceptables poseen propiedades antibióticas, y resultan útiles como agentes antibióticos. Los experimentos de los grupos A y B (identificados por la letra que sigue al número de experimento) en el cuadro 1 se llevaron a cabo para determinar los efectos del pH, la temperatura, el tipo de ácido, la concentración del ácido y la concentración del isómero I sobre el equilibrio. . ¿fein Los experimentos del grupo C en el cuadro 1 ilustran los efectos del pH y la temperatura sobre el equilibrio. Los experimentos del grupo D en el cuadro 1 ilustran los efectos del pH, la temperatura y la concentración del ácido sobre el equilibrio. Los experimentos del grupo E en el cuadro 1 ilustran un método preferido de equilibrio, es decir, a un pH de aproximadamente 7.0, una temperatura de equilibrio de aproximadamente 70°C y una concentración de isómero I de aproximadamente 250 mg/ml. Los experimentos del grupo F ensayan los efectos de distintos ácidos y temperaturas de equilibrio, y el experimento G se llevó a cabo en presencia de un codisolvente de propilenglicol al 50%. Los resultados de estos experimentos indican que, incluso bajo una diversidad de condiciones, el equilibrio de los isómeros de azalida da un resultado coherente de formación de aproximadamente 90% ± 4% del isómero I y de aproximadamente 10% ± 4% del isómero II. Parece que la temperatura de equilibrio y el pH ejercen el mayor efecto sobre la velocidad de equilibrio, conduciendo en general unas temperaturas mayores a unas velocidades mayores, incluso con concentraciones mayores del isómero I. Sin embargo, en la mayoría de los casos, unos tiempos de equilibrio mayores dieron como resultado una mayor concentración de impurezas, y por tanto, las condiciones de equilibrio óptimas son las que conducen a unas velocidades de equilibrio relativamente elevadas, es decir, que forman una mezcla en equilibrio de isómeros en 1-3 horas. »a *- í ^ ^jf feáa O a < O »&• » : Oí * h % Á k EJEMPLO 3 En el cuadro 2 que aparece a continuación se muestra la estabilidad de las composiciones equilibradas, almacenadas a 50°C durante 12 semanas, y estabilizadas con codisolvente. Los resultados indican que las composiciones que no contienen codisolvente son significativamente menos estables que las composiciones que contienen codisolvente, en una cantidad desde aproximadamente 250 a aproximadamente 500 mg por ml de la composición (experimentos 1A-11B). Las composiciones que tienen un pH de aproximadamente 5.4 y que contienen propilenglicol ("PG") en una cantidad desde aproximadamente 450 a aproximadamente 550 mg por ml de la composición son las más estables. Otros codisolventes pueden utilizarse para estabilizar las composiciones (experimentos 1 E-2E); sin embargo, se prefiere el propilenglicol. Tal como aparece en el cuadro 2, la estabilidad depende del pH, y también puede depender del tipo y la cantidad de ácido utilizado, y de la concentración de la mezcla equilibrada de isómeros. Estas composiciones se preparan como sigue. Después de calentar hasta la temperatura deseada (columna 2) y permitir que la mezcla de agua, ácido e isómero I se equilibre durante el tiempo que aparece en la columna 3, se dejó que las mezclas en equilibrio de los isómeros alcanzasen la temperatura ambiente. Cuando las mezclas alcanzaron la temperatura ambiente, se añadió la cantidad apropiada del codisolvente deseado (columna 6). El porcentaje de codisolvente que aparece en la i columna 6 es un porcentaje de peso en peso (por ejemplo, PG 50% es 500 mg de propilenglicol por ml de composición farmacéutica). Si se utiliza un antioxidante o un conservante, se añaden las cantidades apropiadas (columnas 8 y 9). Se midió el pH de la disolución y se ajustó al valor de la 5 columna 5 añadiendo uno o más ácidos y/o hidróxido de sodio al 10% p/p. Los volúmenes de las disoluciones resultantes entonces se ajustaron añadiendo agua. Las composiciones se filtraron a través de un filtro esterilizante de 0.2 mieras. Los viales se llenaron en una campana de flujo laminar, y el espacio superior del vial se limpió con un chorro de una mezcla del gas apropiada 10 (columna 10) antes de sellar. El equilibrio y la pureza se controló utilizando HPLC como se ha descrito antes en el ejemplo 2. Se determinó la estabilidad de las composiciones estabilizadas y equilibradas selladas en viales de vidrio después del almacenamiento durante 12 semanas a 50°C. Se controlaron los efectos de la concentración de la mezcla en equilibrio de los isómeros, el pH, 15 la cantidad y tipo de codisolvente, el tipo y la concentración del ácido, la exposición al aire, la presencia de conservantes y la presencia de antioxidantes. Los resultados aparecen en el cuadro 2. Los experimentos 1A-3A se llevaron a cabo para controlar el efecto de la concentración de la mezcla en equilibrio sobre la estabilidad. Los 20 experimentos 2A, 6A y 7A se llevaron a cabo para controlar el efecto del pH sobre la estabilidad. Los experimentos 2A, 4A y 5A muestran el efecto de la cantidad de codisolvente sobre la estabilidad, y los experimentos 3A y 8A muestran el efecto de utilizar sólo ácido cítrico, en oposición a las mezclas de ácido cítrico y fosfórico, para obtener un pH ácido. Los experimentos 1 B-11 B muestran los efectos del pH y del codisolvente propilenglicol ("PG") sobre la estabilidad. Los experimentos 1 C y 2C muestran el efecto de utilizar sólo ácido tartárico, en oposición a una mezcla de ácido tartárico y clorhídrico, para obtener un pH ácido. Los experimentos 9B-11 B y 3C muestran los efectos de un conservante sobre la estabilidad de la mezcla, y los experimentos 9B-11B, 4C y 5C muestran los efectos de un antioxidante sobre la estabilidad de la mezcla. Los experimentos 6C y 7C muestran los efectos de utilizar una mezcla de ácido tartárico y clorhídrico, o una mezcla de ácido cítrico y clorhídrico, sobre la estabilidad. Los experimentos 1 D-12D muestran los efectos de diferentes cantidades del antioxidante monotioglicerol ("MTG") y de diferentes grados de exposición al oxigeno sobre la estabilidad. Los experimentos 4D-6D y 13D-18D demuestran los efectos del pH de la composición y de la concentración de ácido sobre la estabilidad. Los resultados de estos experimentos indican que después de un almacenamiento durante 12 semanas a 50°C, las composiciones equilibradas que contenían al menos propilenglicol al 50% y que tienen un pH que varia desde aproximadamente 5.2 a aproximadamente 5.5 mantienen más de 93% de la concentración inicial de la mezcla en equilibrio de los isómeros. El mayor nivel de impurezas se encontró en una composición que no tenia codisolvente (experimento 4A) . Por consiguiente, la presencia del codisolvente, de forma sorprendente e inesperada, limita la cantidad de impurezas. Se descubrió un alto nivel de impurezas después de 12 semanas en las composiciones que presentaban menos de 40% de codisolvente y un pH menor que 5.0. La concentración de ácido también afecta la estabilidad de las composiciones farmacéuticas. Las composiciones con concentraciones relativamente bajas de ácido (aproximadamente 20 mM) y un pH de aproximadamente 5.4 muestran la mayor estabilidad después del almacenaje. Sin embargo, unas concentraciones bajas de ácido dan como resultado una baja potencia del tampón, lo cual conduce a un pH fluctuante y puede dar como resultado un grado de impurezas relativamente elevado bajo otras condiciones de tiempo o temperatura.

CUADRO 2 si Oí *J*a?t*ASt*L£*i ,t^ * ^ *,i ¡ : ' •'•-- •- iM"-' • - -.^^-A - ^.iM*.?aár.?**j,i d) co EJEMPLO 4 Se prepararon 52 litros de una composición farmacéutica inyectable que contenia 100 mg de la mezcla en equilibrio de los isómeros 5 por ml de la composición como sigue. Se añadieron 16.584 kg de agua para inyección (calidad USP) burbujeada con nitrógeno (calidad NF) a un recipiente de mezcla de acero inoxidable, y se comenzó la agitación. También se utilizó nitrógeno como capa cobertera para reducir la exposición al oxigeno de la disolución en el recipiente de mezcla durante la preparación. 10 Se añadió al agua aproximadamente 1 kg de ácido cítrico anhidro (calidad USP) y la mezcla resultante se agitó hasta que se disolvió el ácido. Posteriormente se añadieron a la mezcla 1.511 kg de una disolución de ácido clorhídrico al 10% (p/p) (calidad NF) en agua (calidad USP). Se añadieron lentamente a la mezcla en agitación 5.357 kg de una mezcla que contenía 15 aproximadamente 97% del isómero I y el isómero II (en una proporción de aproximadamente 99:1 ) y. 3% de una o más impurezas, y se dejaron disolver. Se ajustó el pH de la disolución resultante a 7.0 ± 0.5 mediante la adición de 0.224 kg de una disolución de ácido clorhídrico al 10% (p/p) en agua. Se logró el equilibrio de los isómeros I y II calentando la disolución 20 hasta 70°C ± 10°C durante 105 minutos. Cuando finalizó el equilibrio, según se determinó utilizando HPLC, se dejó que la disolución se enfriase hasta 25°C ± 10°C, y se añadieron 26.008 kg de propilenglicol (calidad USP) a la mezcla en agitación. Después de que el propilenglicol se mezclase &^****L*^*& . ¿«t- ... *..^.^..*. * ».... ""*-"' completamente, se añadieron 0.26 kg de monotioglicerol (calidad NF) a la disolución, y el pH se volvió a ajustar a 5.4 ± 0.3 mediante la adición de 2.349 kg de ácido clorhídrico al 10% (p/p) en agua. El volumen final se ajustó a 52.015 litros mediante la adición de 1.843 kg de agua. La 5 composición resultante contenía 100 mg de la mezcla en equilibrio de los isómeros por ml de la composición, 500 mg por ml de propilenglicol, ácido cítrico a una concentración de 0.1 M, y monotioglicerol a una concentración de 5 mg/ml de la composición. La composición se filtró a través de un prefiltro de 6 mieras, y 10 después a través de un filtro esterilizante final de 0.2 mieras, que se esterilizó mediante un autoclave con calor húmedo durante 60 minutos a 121 °C y se ensayó su integridad utilizando un método de presión antes de la esterilización y después de la filtración. Se esterilizaron viales de vidrio de suero de tipo I incoloros de 20 ml (Wheaton Science Products, Miliville, 15 Nueva Jersey) y se despirogenaron en un túnel de calor seco a 250°C durante 240 minutos. Se despirogenaron tapones siliconizados de clorobutilo gris de 20 mm 4432/50 (The West Company, Lionville, PA) mediante lavado y se esterilizaron mediante un autoclave con calor húmedo durante 60 minutos a 121 °C. Cada uno de los viales 2.525 se llenó bajo 20 condiciones estériles con 20 ml de la composición resultante más un relleno superior de 0.6 ml (20.6 ml/vial son 2.06 g/unidad de potencia del vial de la composición farmacéutica a 100 mg/ml de la mezcla en equilibrio de los isómeros basada en una potencia del lote de sustancia fármaco real de 97.1%), los espacios superiores del vial se limpiaron con un chorro de nitrógeno, y los viales se cerraron con los tapones y se sellaron (tapones para sellar de aluminio de 20 mm, producto n° 5120-1125, The West Company, Lionville, PA). Las realizaciones concretas descritas en los ejemplos no deben limitar el alcance de la presente invención. Se pretende que estos ejemplos ilustren unos cuantos aspectos de la invención. Cualquier realización que sea funcionalmente equivalente está dentro del alcance de esta invención. En efecto, los expertos en la técnica sabrán comprender diversas modificaciones de la invención, además de las mostradas y descritas en la presente, y se pretenden que se incluyan en las reivindicaciones adjuntas. Todas las referencias bibliográficas descritas en la presente se incorporan en la presente como referencia en su totalidad.

Claims (22)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Una composición que comprende: (a) el compuesto de fórmula (0 y el compuesto de fórmula II:

(II)

* M, ». * >-.» -J.A ***** UÁ * É-T8*"*' en una proporción desde aproximadamente 90% ± 4% a aproximadamente 10% ± 4%, respectivamente; (b) agua; y (c) uno o más ácidos presentes a una concentración total desde aproximadamente 0.2 mmol a aproximadamente 1.0 mmol por 10 ml de la composición. 2.- Un método para obtener la composición de la reivindicación 1 , que comprende la etapa de calentar hasta una temperatura desde aproximadamente 50°C a aproximadamente 90°C una mezcla que comprende: (a) el compuesto de fórmula (I), (b) agua; y (c) uno o más ácidos presentes en una cantidad que varia desde aproximadamente 0.2 mmol a aproximadamente 1.0 mmol por ml de la mezcla; y el pH de la mezcla varia desde aproximadamente 5.0 a aproximadamente 8.0. 3.- El uso de una composición de la reivindicación 1 , para la elaboración de un medicamento para tratar una infección bacteriana o protozoaria en un mamífero.

4.- El uso como se reclama en la reivindicación 3, en donde la infección bacteriana o protozoaria se selecciona del grupo formado por enfermedad respiratoria bovina, enfermedad respiratoria porcina, neumonía, coccidiosis, anaplasmosis y queratinitis infecciosa.

5.- Una composición que comprende: (a) una primera mezcla de: (i) el compuesto de fórmula (I): ( y el compuesto de fórmula (II): (II) en una proporción desde aproximadamente 90% ± 4% a aproximadamente 10% + 4%, respectivamente; (ii) agua; y (iii) uno o más ácidos presentes a una concentración total desde aproximadamente 0.2 mmol a aproximadamente 1.0 mmol por ml de la primera mezcla; y (b) uno o más codisolventes miscibles en agua presentes en una cantidad desde aproximadamente 250 a aproximadamente 750 mg por ml de la composición.

6.- La composición de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada además porque dichos uno o más ácidos se seleccionan del grupo formado por ácido acético, ácido bencensulfónico, ácido cítrico, ácido bromhidrico, ácido clorhídrico, ácido D- y L-láctico, ácido metanosulfónico, ácido fosfórico, ácido succinico, ácido sulfúrico, ácido- D- y L-tartárico, ácido p-toluensulfónico, ácido adipico, ácido aspártico, ácido canforsulfónico, ácido 1 ,2-etanodisulfónico, ácido lauriisulfúrico, ácico glucoheptónico, ácido glucónico, ácido 3-hidroxi-2-naftoico, ácido 1-hidroxi-2-naftoico, ácido 2-hidroxietanosulfónico, ácido málico, ácido múcico, ácido nítrico, ácido naftalensulfónico, ácido palmítico, ácido D-glucárico, ácido esteárico, ácido maleico, ácido malónico, ácido fumárico, ácido benzoico, ácido cólico, ácido etanosulfónico, ácido glucurónico, ácido glutámico, ácido hipúrico, ácido lactobiónico, ácido lisinico, ácido mandélico, ácido napadisilico, ácido nicotinico, ácido poligalacturónico, ácido salicilico, ácido sulfosalicílico, ácido triptofánico y sus mezclas.

7.- La composición de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada además porque dicho uno o más ácidos es el ácido cítrico.

8.- La composición de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada además porque el ácido cítrico está presente en una cantidad desde aproximadamente 0.02 mmol a aproximadamente 0.3 mmol por ml de la composición.

9.- La composición de conformidad con la reivindicación 6, en el cual dichos uno o más ácidos son el ácido cítrico y el ácido clorhídrico.

10.- La composición de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada además porque el ácido cítrico está presente en una cantidad desde aproximadamente 0.02 mmol a aproximadamente 0.3 mmol por ml de la composición, y el ácido clorhídrico está presente en una cantidad suficiente para lograr un pH de la composición desde aproximadamente 5 a aproximadamente 6.

11.- La composición de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada además porque dichos uno o más codisolventes miscibles en agua se seleccionan del grupo formado por etanol, ¡sopropanol, dietilenglicol monometil éter, dietilenglicol butil éter, dietilenglicol monoetil éter, dietilenglicol dibutil éter, polietilenglicol-300, polietilenglicol-400, propilenglicol, glicerina, 2-pirrolidona, N-metil-2-pirrolidona, glicerol formal, sulfóxido de dimetilo, sebecato de dibutilo, polisorbato 80 y sus mezclas.

12.- La composición de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizada además porque dicho uno o más codisolventes miscibles en agua es el propilenglicol.

13.- La composición de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada además porque el propilenglicol está presente en una cantidad desde aproximadamente 450 a aproximadamente 550 mg por ml de la composición.

14.- La composición de conformidad con la reivindicación 5, que además comprende uno o más antioxidantes presentes en una cantidad desde aproximadamente 0.01 mg a aproximadamente 10 mg por ml de la composición.

15.- La composición de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada además porque dichos uno o más antioxidantes se seleccionan del grupo formado por bisulfito de sodio, sulfito de sodio, metabisulfito 5 de sodio, tiosulfato de sodio, formaldehído sulfoxilato de sodio, ácido L- ascórbico, ácido eritórbico, acetilcisteina, cisteina, monotioglicerol, ácido tioglicólico, ácido tioláctico, tiourea, ditiotreitol, ditioeritreitol, glutatión, palmitato de ascorbilo, hidroxianisol butilado, hidroxitolueno butilado, ácido nordihidroguaiarético, galato de propilo, a-tocoferol y sus 10 mezclas.

16.- La composición de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada además porque dicho uno o más antioxidantes es el monotioglicerol.

17.- La composición de conformidad con la reivindicación 16, 15 caracterizada además porque el monotioglicerol está presente en una cantidad desde aproximadamente 4 mg/ml a aproximadamente 6 mg/ml de la composición.

18.- La composición de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada además porque la concentración de la primera mezcla en la 20 composición varía desde aproximadamente 50 mg/ml a aproximadamente 200 mg/ml.

19.- La composición de conformidad con la reivindicación 18, caracterizada además porque la concentración de la primera mezcla en la U ÍM?tmiÉ M mmmmmmmm n i,r > Élh h T "f Ti ll I.Tfr fU í ' ? f r M It - li fj .ftlf - 1, T ~> '" iSHÜtóét . composición varia desde aproximadamente 90 mg/ml a aproximadamente 110 mg/ml.

20.- La composición de conformidad con la reivindicación 19, caracterizada además porque el ácido cítrico está presente en una 5 cantidad desde aproximadamente 0.02 mmol a aproximadamente 0.3 mmol por ml de la composición, y el ácido clorhídrico está presente en una cantidad suficiente para lograr un pH de la composición desde aproximadamente 5 a aproximadamente 6; el propilenglicol está presente en una cantidad desde aproximadamente 450 a aproximadamente 550 mg por ml de la 10 composición; y el monotioglicerol está presente en una cantidad desde aproximadamente 4 mg/ml a aproximadamente 6 mg/ml de la composición.

21.- Un método para obtener la composición de la reivindicación 5, que comprende la etapa de calentar hasta una temperatura desde aproximadamente 50°C a aproximadamente 90°C una mezcla que 15 comprende: (a) el compuesto de fórmula (I); (b) agua; y (c) uno o más ácidos en una cantidad que varia desde aproximadamente 0.2 mmol a aproximadamente 1.0 mmol por ml de ia mezcla; y uno o más codisolventes miscibles en agua se añaden antes, durante o después de la etapa de calentamiento, en una cantidad desde aproximadamente 250 a 20 aproximadamente 750 mg por ml de la composición.

22.- Un compuesto de fórmula: f¡^^a^^ _t?l ?l if -'E'"í**^-^Aatfc-'- '" -" *- -' - *"--J •"" -"""•" - -»-*"— --«*>•«<«'**>** -?± < o su sal farmacéuticamente aceptable; caracterizada además porque R1 es OH o y caracterizada además porque R2 es H o CH3.