MXPA02000843A - Variantes de subtilisina proteasa que tienen supresiones de aminoacidos y sustituciones en regiones de epitope definidas. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere a variantes de proteasa similar a subtilisina que tienen inmunogenicidad disminuida en relacion con sus correspondientes proteasas del tipo silvestre; la presente invencion se refiere ademas a tales variantes que tienen adicionalmente una o mas sustituciones de aminoacidos en una o mas regiones de epitope o que tienen adicionalmente una o mas sustituciones estabilizadoras; la invencion se refiere ademas a genes mutantes que codifican tales variantes y a composiciones de limpieza y para el cuidado personal que comprenden tales variantes.

Description

VARIANTES DE SUBTILISINA PROTEASA QUE TIENEN SUPRESIONES DE AMINOÁCIDOS Y SUSTITUCIONES EN REGIONES DE EPITOPE DEFINIDAS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a subtilisina proteasas genéticamente manipuladas que son útiles en composiciones tales como, por ejemplo, composiciones para el cuidado personal, composiciones de lavandería, composiciones de limpieza para superficies duras y composiciones de limpieza para trabajos ligeros.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las enzimas constituyen la clase más grande de proteínas presentes en la naturaleza. Una clase de enzima incluye proteasas que catalizan la hidrólisis de otras proteínas. Se ha explotado esta facultad de hidrolizar proteínas, incorporando proteasas presentes en la naturaleza y genéticamente manipuladas, particularmente aquéllas pertinentes a aplicaciones de lavandería. En las técnicas de la limpieza, las más extensamente utilizadas de estas proteasas son las serina proteasas. La mayoría de estas serina proteasas es producida por organismos bactéricos, mientras que algunas son producidas por otros organismos, tales como hongos. Véase Siezen, Roland J. Et al., "Homology Modelling and Protein Engineering Strategy of Subtilases, the Family of Subtilisin-Like Serine Proteases", Proteinn Engineering, Vol. 4, No. 7, pág. 719-737 (1991 ). Desafortunadamente, no se optimiza frecuentemente la eficacia de las proteasas del tipo silvestre en su medio ambiente natural para el medio ambiente artificial de una composición de limpieza. Específicamente, nos se optimizan necesariamente las características de las proteasas tales como, por ejemplo, estabilidad térmica, estabilidad del pH, estabilidad oxidativa y especificidad de substrato, para su utilización fuera del medio ambiente natural de la enzima. Se han empleado varios procedimientos para alterar la secuencia de aminoácidos del tipo silvestre de las serina proteasas con la finalidad de incrementar la eficacia de la proteasa en el medio ambiente no natural del lavado del cuerpo. Estos procedimientos incluyen el rediseño genético de la proteasas para realzar la estabilidad térmica y mejorar la estabilidad de oxidación en condiciones completamente diversas. Sin embargo, puesto que tales proteasas modificadas son ajenos a los mamíferos, son antígenos potenciales. Como antígenos, estas proteasas causan una respuesta inmunogénica y/o alergénica (descrita colectivamente en la presente como respuesta inmunogénica) en los mamíferos. Además, mientras que la ingeniería genética ha sido prominente en la búsqueda continua de proteasas más altamente efectivas para su uso en aplicaciones de lavandería, no se ha utilizado proteasas comercialmente en - '**-* *--*- composiciones para el cuidado personal y detergentes para trabajos ligeros. Una razón principal de la ausencia de proteasas manipuladas en productos tales como, por ejemplo, jabones, geles, lavado del cuerpo y champúes, se debe al problema de la sensibilización humana que da lugar a respuestas ¡nmunológicas inconvenientes. Sería por lo tanto grandemente ventajoso proveer una composición para el cuidado personal o un detergente para trabajos ligeros que provea las propiedades de limpieza de proteasas manipuladas con la provocación reducida al mínimo de una respuesta inmunológica. Un procedimiento hacia el alivio de la actividad ¡nmunológica de una proteasa es mediante el rediseño de uno o más epítopes de la proteasa. Los epítopes son aquellas regiones de aminoácidos de un antígeno que producen una respuesta ¡nmunológica mediante la unión de anticuerpos o la presentación de antígenos procesados a células T a través de una proteína compleja de histocompatibilidad importante (MHC). Los cambios de los epítopes pueden afectar su eficiencia como antígeno. Véase Walsh, B.J. y M.E.H. Howden, "A Method for Detection of IgE Binding Sequences of Allergens Based on a Modification of Epitope Mapping", Journal of Immunological Methods, Vol. 121 , págs. 275-280 (1989). Los presentes inventores han descubierto que aquella serína proteasas comúnmente conocidas como subtilisinas, incluyendo subtilisina BPN', tienen regiones prominentes de epítopes en las posiciones de aminoácidos 103-126 y 220-246, así como en las posiciones de aminoácidos -" i , .« í 70-84 correspondientes a subtilisina BPN'. Los presentes inventores han rediseñado aquí genéticamente tales subtilísinas para aliviar las propiedades inmunogénicas atribuidas a esta región de epítope. Al hacerlo, los presentes inventores han descubierto subtilisinas que producen una respuesta inmunológica disminuida y aún así mantienen su actividad como proteasa limpiadora eficiente. Según ello, las presentes proteasas son adecuadas para su uso en varios tipos de composiciones incluyendo, pero limitándose a las mismas, composiciones de lavandería, vajillas, superficies duras, el cuidado de la piel, el cuidado del cabello, el cuidado de la belleza, lentes de contacto y orales.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a variantes de serina proteasas que tienen inmunogenícidad en relación con sus correspondientes proteasas del tipo silvestre. Más particularmente, la presente invención se refiere a variantes de serina protesas que tienen una secuencia modificada de aminoácidos de una secuencia modificada de aminoácidos del tipo silvestre, la secuencia del tipo silvestre que comprende una primera región de epítope correspondientes a las posiciones 103-126 de subtilisina BPN', una segunda región de epítope correspondientes a las posiciones 220-246 de subtilisina BPN' y una tercera región de epítope correspondientes a las posiciones 70-84 de subtilisina BPN', en que la secuencia modificada de aminoácidos comprende una supresión de una o más posiciones en una o más regiones de epítope. La presente invención se refiere además a tales variantes que tienen adicionalmente una o más sustituciones en una o más regiones de epítope o que tienen una o más sustituciones de estabilización. La invención se refiere además a genes mutantes que codifican tales variantes y a composiciones de limpieza y para el cuidado personal que comprenden tales variantes.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Se describen a continuación en la presente los componentes esenciales de la presente invención. Todos los porcentajes y las relaciones están calculados en peso, a no ser que se indique de otra manera. Todos los porcentajes están calculados con base en la composición total, a no ser que se indique de otra manera. Todos los niveles de componente o composición están en referencia con el nivel activo de ese componente o composición y están exentos de impurezas, por ejemplo solventes residuales o productos secundarias, que están presentes en fuentes comercialmente obtenibles. Se incorporan en la presente por referencia en su totalidad todos los documentos referidos en la presente, incluyendo todas las patentes, solicitudes de patente y publicaciones impresas. i -i . x t. <4 Como se usan en la presente, se usarán abreviaturas para describir aminoácidos. El cuadro I provee una lista de abreviaturas usadas en la presente: CUADRO 1 Definiciones Como se usa en la presente, el término "mutación" se refiere a una alteración en una secuencia de genes y/o una secuencia de aminoácidos producida por aquellas secuencias secuencias de genes. Las mutaciones incluyen supresiones, sustituciones y adiciones de residuos de aminoácidos a la secuencia de proteínas del tipo silvestre. Como se usa en la presente, el término "tipo silvestre" se refiere a una proteína, en la presente específicamente una proteasa, producida por organismos no mutados. Como se usa en la presente, el término "variante" significa una proteína, en la presente específicamente una proteasa, que tiene una secuencia de aminoácidos que difiere de la de la proteasa del tipo silvestre. Como se hace referencia en la presente, mientras las variantes de la presente invención no están limitadas a las de subtilisina BPN', toda la numeración de aminoácidos está con referencia a la secuencia de aminoácidos para subtilisina BPN' que está representa por SEQ ID NO:1. La secuencia de aminoácidos para subtilisina BPN' está descrita más extensamente por Wells et al., Nucleic Acids Research, Vol. II, 7911-7925 (1983), incorporado en la presente por referencia.

Variantes de la presente invención Los presentes inventores han descubierto tres regiones de epítope en serina proteasas las cuales corresponden a las posiciones 103-126 (a las cuales se hace referencia en la presente como la primera región de epítope), 220-246 (a las cuales se hace referencia en la presente como la segunda región de epítope) y 70-84 (a las cuales se hace referencia en la presente como la tercera región de epítope) de subtilisina BPN'. Los presentes -t-t_ ¿xx rt j. M inventores han descubierto además que una o más supresiones y/o sustituciones de aminoácidos en una o más regiones de epítope proveen variantes que producen una respuesta alergénica y/o inmune disminuida en relación con la correspondiente serina proteasa del tipo silvestre. Como se usa en la presente, se puede designar una variante haciendo referencia a las posiciones suprimidas que caracterizan la variante. Por ejemplo, se puede designar como D 104 una variante de serina proteasa que tiene una supresión de la posición 104 correspondiente a subtilisina BPN'. Como ejemplo adicional, se puede designar, como 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 112, 113, 114, 116, 117, 118, 119, 123 y 125 una variante de serina proteasa que tiene supresiones en cada una de las posiciones D 104-110, 112-114, 116-119, 123-125 correspondientes a la subtilisina BPN',. Similarmente, se pueden indicar las sustituciones proveyendo el residuo de aminoácidos del tipo silvestre, seguido por el número de posición, seguido por el residuo sustituido de aminoácidos que se ha de sustituir. En donde el residuo sustituido de aminoácidos puede ser cualquier aminoácido natural, se provee el símbolo "*". Las sustituciones múltiples que comprenden una variante están separadas por el símbolo "+". Para ¡lustrar, se designa una sustitución de alanina por asparagina en la posición 109, ya sea con Asn109Ala o N109A. Se designa una variante que comprende tanto supresiones como sustituciones, combinando las designaciones mencionadas anteriormente. Por ejemplo, un ejemplo de variante que tiene una sustitución en ambas posiciones 109 y 122, así como supresiones en la posición 104, se designa como D 104, N109A + I122A ó D 104, Asn 109Ala + lie 122Ala. Las variantes de la presente invención son variantes de proteasas similares a subtilisina. Como se usa en la presente, el término 5 "proteasa similar a subtilisina" significa una proteasa que tiene por lo menos 50%, y preferiblemente 80%, de identidad de secuencia de aminoácidos con las secuencias de subtilisina BPN'. Las proteasas similares a subtilisina son producidas, por ejemplo, por los microorganismos Bacillus alcalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus amylosaccharicus, Bacillus licheniformis, 10 Bacillus lentus, y Bacillus subtilis. Se puede encontrar una discusión relacionada con serina proteasas similares a subtilisina y sus homologías en Siezen et al., "Homology Modelling and Protein Engineering Strategy of Subtilases, the Family of Subtilisin-Like Serine Proteases", Protein Engineering, Vol. 4, No. Pags. 719-737 (1991 ). 15 Las variantes de la presente invención son variantes de serina proteasas que tienen una secuencia modificada de aminoácidos de una secuencia del tipo silvestre de aminoácidos, comprendiendo la secuencia del tipo silvestre una primera región de epítope, una segunda región de epítope y una tercera región de epítope, en que la secuencia modificada de 20 aminoácidos comprende una supresión de una o más posiciones en una o más regiones de epítope en que: (a) cuando ocurre una supresión en la primera región de epítope, la supresión es de una o más de las posiciones 103, 104, 105, 106, 107, 108, ?mé¡Ü&BM¡Íb*¿?tÁ___ 109, 1 10, 1 1 1 , 1 12, 1 13, 114, 1 15, 116, 1 17, 1 18, 119, 120, 121 , 122, 123, 124, 125 y 126 correspondientes a subtilisina BPN'; (b) cuando ocurre una supresión en la segunda región de epítope, la supresión es de una o más de las posiciones 220, 221 , 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231 , 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241 , 242, 243, 244, 245 y 246 correspondientes a subtilisina BPN'; y (c) cuando ocurre una supresión en la tercera región de epítope, la supresión es de una o más de las posiciones 70, 71 , 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81 , 82, 83 y 84 correspondientes a subtilisina BPN'. Preferiblemente, si ocurre una supresión en la primera región de epítope, la supresión es de una o más de las posiciones 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 112, 113, 114, 116, 117, 118, 119, 123, 124, 125 y 126 correspondientes a subtilisina BPN'. En una modalidad particularmente preferida, la supresión es por lo menos de la posición 114 correspondiente a la subtilisina BPN'. Preferiblemente, si ocurre una supresión en la segunda región de epítope, la supresión es de una o más de las posiciones 220, 221 , 222, 223, 224, 225, 227, 228, 229, 230, 231 , 232, 233, 239, 240, 242, 243, 244, 245 y 246 correspondientes a subtilisina BPN'. Preferiblemente, si ocurre una supresión en la tercera región de epítope, la supresión es de una o más de las posiciones 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81 y 82 correspondientes a subtilisina BPN'. Más preferiblemente, la supresión es de una o más de las posiciones 70, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81 y ..».* - ..1 1 : 82 correspondientes a subtilisina BPN'. Más preferiblemente aún, la supresión es de una o más de las posiciones 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81 y 82 correspondientes a subtilisina BPN'. Muy preferiblemente, la supresión es de una o más de las posiciones 78 y 79. Las variantes preferidas de la presente invención incluyen aquellas que comprenden D 70, 75-82; D 75-82; D 70, 78, 79; D 70; D 75; D 76; D 78; D 79; D 81 o D 82. Las variantes más preferidas ¡ncluyen aquellas que comprenden D 70, 75-82, D 75-82; D 70, 78, 79; D 70; D 78; o D 79. En una modalidad más preferida de la presente invención, las presentes variantes tienen una secuencia modificada de aminoácidos de una secuencia del tipo silvestre de aminoácidos, comprendiendo la secuencia del tipo silvestre una primera región de epítope y una segunda región de epítope, en que la secuencia modificada de aminoácidos comprende una supresión de una o más posiciones en una o más regiones de epítope en que: (a) cuando ocurre una supresión en la primera región de epítope, la supresión es de una o más de las posiciones 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 112, 113, 114, 116, 117, 118, 119, 123 y 125 correspondientes a subtilisina BPN'; (b) cuando ocurre una supresión en la segunda región de epítope, la supresión es de una o más de las posiciones 220, 221 , 222, 223, 224, 225, 227, 228, 229, 230, 231 , 232, 233, 239, 240, 242, 243, 244, 245 y 246 correspondientes a subtilisina BPN'. .. ^^¡aa-L t^ En otra modalidad preferida, las presentes variantes tienen una secuencia modificada de aminoácidos de una secuencia del tipo silvestre de aminoácidos, comprendiendo la secuencia del tipo silvestre una primera región de epítope y una segunda región de epítope, en que la secuencia modificada de aminoácidos comprende una supresión de dos o más posiciones en una o más regiones de epítope en que: (a) cuando ocurre una supresión en la primera región de epítope, la supresión es de una o más de las posiciones 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111 , 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121 , 122, 123, 124, 125 y 126 correspondientes a subtilisína BPN', preferiblemente las posiciones 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 112, 113, 114, 116, 117, 118, 119, 123 y 125 correspondientes a subtilisina BPN'; y (b) cuando ocurre una supresión en la segunda región de epítope, la supresión es de una o más de las posiciones 220, 221 , 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231 , 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241 , 242, 243, 244, 245 y 246 correspondientes a subtilisina BPN', preferiblemente las posiciones 220, 221 , 222, 223, 224, 225, 227, 228, 229, 230, 231 , 232, 233, 239, 240, 242, 243, 244, 245 y 246 correspondientes a subtilisina BPN'. En una modalidad más preferida aún de la presente invención, variantes de la presente invención son variantes de serina proteasas que tienen una secuencia modificada de aminoácidos de una secuencia del tipo silvestre de aminoácidos, comprendiendo la secuencia del tipo silvestre una primera región de epítope, una segunda región de epítope y una tercera región de epítope, en que la secuencia modificada de aminoácidos comprende una supresión de una o más posiciones en dos o más regiones de epítope en que: (a) cuando ocurre una supresión en la primera región de epítope, la supresión es de una o más de las posiciones 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 1 11 , 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121 , 122, 123, 124, 125 y 126 correspondientes a subtilisina BPN', preferiblemente las posiciones 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 112, 113, 114, 116, 117, 118, 119, 123 y 125 correspondientes a subtilisina BPN'; (b) cuando ocurre una supresión en la segunda región de epítope, la supresión es de una o más de las posiciones 220, 221 , 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231 , 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241 , 242, 243, 244, 245 y 246 correspondientes a subtilisina BPN', preferiblemente las posiciones 220, 221 , 222, 223, 224, 225, 227, 228, 229, 230, 231 , 232, 233, 239, 240, 242, 243, 244, 245 y 246 correspondientes a subtilisina BPN'.; y (c) cuando ocurre una supresión en la tercera región de epítope, la supresión es de una o más de las posiciones 70, 71 , 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81 , 82, 83 y 84 correspondientes a subtilisina BPN', preferiblemente las posiciones 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81 y 82 correspondientes a subtilisina BPN' y muy preferiblemente las posiciones 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81 y 82 correspondientes a subtilisina BPN'.

En esta modalidad, la frase "supresión de una o más posiciones en dos o más de las regiones de epítope" significa que hay una supresión de una o más posiciones en una región de epítope como se define en la presente, una supresión de una o más posiciones en otra región de epítope como se define en la presente y una supresión opcional de una o más posiciones en la región restante de epítopes como se define en la presente. Las variantes de la presente invención pueden comprender también, además de una o más supresiones, una sustitución de una o más de las posiciones 70, 71 , 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81 , 82, 83, 84, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111 , 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121 , 122, 123, 124, 126, 220, 221 , 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231 , 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241 , 242, 243, 244, 245 y 246 correspondientes a subtilisina BPN'. Se prefieren para su sustitución entre estas posiciones una o más de 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81 y 82 correspondientes a subtilisina BPN'; más preferiblemente, una o más de 70, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81 y 82 correspondientes a subtilisina BPN'; más preferiblemente aún, una o más de 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81 y 82 correspondientes a subtilisina BPN'; y muy preferiblemente, una o más de 78 y 79. Desde luego, si se ha hecho una supresión en cualquier posición dada, no se puede hacer una sustitución en esa posición. Se hacen sustituciones en una o más de estas posiciones precedentes, reemplazando el residuo del tipo silvestre de aminoácidos con otro residuo natural de aminoácidos, tal como uno dado en el cuadro I. í i- .. i Se pueden hacer una o más mutaciones adicionales ("sustituciones estabilizadoras") en cualquier posición de la serina proteasa a fin de estabilizar, por ejemplo, la proteasa en seguida de la mutación de la región de epítope o de realzar la actividad proteolítíca de la variante. Muchas de tales mutaciones estabilizadoras son bien conocidas en la técnica. Se exponen algunos ejemplos de tales mutaciones estabilizadoras, por ejemplo, en WO 95/10591 , Baeck et al., publicado el 20 de abril 1995; patente de E. U. A. No. 4,914,031 , Zukowski et al., expedida el 3 de abril de 1990; patente de E. U. A. No. 5,470,733, Brvan et al., expedida el 28 de noviembre de 1995; patente de E. U. A. No. 5,567,601 , Brvan et al., expedida el 22 de octubre de 1996; WO 89/07642, patente de E. U. A. No. 5,707,848, Brvan et al., expedida el 13 de enero de 1998; Van Eekelen et al., publicada el 24 de agosto de 1989; WO 87/04461 , Stabinskv et al., publicada el 30 de julio de 1987; patente de E. U. A. 4,760,025, Estell et al., expedida el 26 de julio de 1988; WO 92/11348, Branner et al., publicada el 9 de julio de 1992; EP 0,405,901 , Casteleiin et al., publicada el 2 de enero de 1991 ; WO 91/00345, Branner et al., publicada el 10 de enero de 1991 ; y WO 94/10020 Brode et al., publicada el 23 de marzo de 1995. Las mutaciones estabilízadoras preferidas incluyen una o más de: II07V; K213R; Y217K; N218S; G169A; M50F; Q19E; P5A; S9A; I31 L; E156S; G169A; N212G; S188P; T254A; S3C + Q206C; y Q271 E. Las mutaciones estabilizadoras más preferidas incluyen una o más de P5A, S9A; I31 L; E156S; G169A; N212G; S188P; T254A; S3C + Q206C; Q271 E; Y217K. Las mutaciones estabilizadoras más preferidas incluyen Y217L e Y217K.

Método de elaboración Se preparan las variantes mutando las secuencias de nucleótidos que codifican una serina proteasa, dando por resultado así variantes que tienen secuencias modificadas de aminoácidos. Tales métodos son bien conocidos en la técnica; se expone uno de tales métodos a continuación: Se transforma un fagémido (pSS-5) que contiene el gen del tipo silvestre de subtilisina BPN' (Mitchison, C. Y J. A. Wells, "Protein Engineering of Disulfide Bonds in Subtilisin BPN", Biochemistry, Vol. 28, pp. 4807-4815 (1989) a Escherechia coli dut-ung cepa CJ236 y se produce una plantilla de ADN de cadena sencilla que contiene uracilo, usando el fago auxiliar VCSM13 (Kunkekl et al., "Rapid and Efficient Site-Specific Mutagenesis Without Phenotypic Selection", Methods in Enzimology, Vol 154, págs. 367-382 (1987) según modificaron Yuckenberq et al., "Site Directed Mutaqenesis- A Practical Approach, McPherson, M. J. ed., págs. 27-48 (1991 ). Se usa la mutagénesis iniciadora dirigida en su sitio modificada del método de Zoller and Smith (Zoller, M. J., and M. Smith, "Oliqonucleotide-Directed Mutagenesis Using M13-Derived Vectors: An Efficient and General Procedure for the Production of Point Mutations in any Fragment of DNA", Nucleic Acids Research, Vol. 10 pp. 6487-6500 (1982), para producir todos los mutantes (esencialmente como presenta Yuckenberq et al., anteriormente). Se hacen oligonucleótidos usando un sintetizador de ADN 380B (Applied Biosystems Inc.). se transforman los productos de reacción de la mutagénesis a Escherichia coli cepa MM294 (American Type Culture Collection E. Coli 33625). . Se confirman todas las mutaciones por secuenciación de ADN y se transforma el ADN aislado a la expresión de Bacillus subtilis cepa PG632 (Saunders et al.. "Optimization of the Signal-Sequence Cleavage Site for Secretion from Bacillus subtilis of a 34-amino acid Fragment of Human Parathyroid Hormone", Gene, Vol. 102, pp. 277-282 (1991 ) y Yanq et al., "Cloning of the Neutral Protease Gene of Bacillus subtilis and the Use of the Cloned Gene to Créate an in w ro-Derived Deletion Mutatíon", Journal of Bacteriology, Vol. 160 págs. 15-21 (1984). Se determina la valoración preliminar de la actividad de la variante mediante la facultad de las células PG632 con plásmidos mutantes para hidrolizar caseína. La fermentación es como sigue. Se cultivan células Bacillus subtilis (PG632) que contienen la variante de interés, a la fase logarítmica media en un litro de caldo de LB que contienen 10 g/l de glucosa y se inoculan a un fermentador Biostat C (Braun Biotech, Inc., Allentown, PA) en un volumen total de 9 litros. El medio de fermentación contiene extracto de levadura, hidrosilato de caseína, soluble - almidón parcialmente hidrolizado (Maltrin M-250), antiespumante, reguladores de pH y minerales de indicio (véase "Biology of Bacilli: Applications to Industry", Doi, R. H. Y M. McGloughlin, eds. (1992)). Se mantiene el caldo a un pH constante de 7.5 durante el proceso de fermentación. Se añade canamicina (50 µg/ml) para la selección de antibiótico del plásmido mutagenizado. Se cultivan las células durante 18 horas a 37°C a un A6oo de aproximadamente 60 y se cosecha el producto. Se lleva el caldo de fermentación a través de los siguientes pasos para obtener una variante pura. Se libra el caldo de las células de Bacillus subtilis por flujo tangencial con respecto a una membrana de 0.I6 µm. Se concentra luego el caldo libre de células por ultrafiltración con una membrana cortada con peso molecular de 8000. Se ajusta el pH a 5.5 con regulador de pH de MES concentrado (ácido 2-(N-morfolino)etansulfónico). Se purifica adicionalmente la variante por cromatografía de intercambio catiónico con S-sefarosa y elución con gradientes de NaCI (véase (Scopes R. K., "Protein Purification Principies and Practice", Springer-Verlag, New York (1984)). Se usa un ensayo de pNA (DelMAr et al.. Analytical Biochemistry, Vol. 99 págs. 316-320 (1979)), para determinar la concentración de variantes activas para fracciones recogidas durante la elución de gradiente. Este ensayo mide la velocidad a la cuál se libera p-nitroanilina conforme a la variante hidrolisa el substrato sintético soluble, succinil-alanina-alanina-prolina-fenilalanina-p-nitroanilina (sAAPF-p-NA). Se mide la velocidad de producción de color amarillo procedente de la reacción de hidrólisis, en 410 nm en un espectrofotómetro y es proporcional a la concentración de enzimas activas. Además, se usan mediciones de absorbencia a 280 nm, para determinar la concentración de proteína total. La relación de enzima activa/proteína total da la pureza de variante y se usa para identificar fracciones que se han de combinar para la solución madre. Para evitar la autolisis de la variante durante el almacenamiento, se añade un peso igual de propilenglicol a las fracciones combinadas obtenidas de la columna de cromatografía. Enseguida de la terminación del procedimiento de purificación, se verifica la pureza de la solución madre de la variante con SDS-PAGE (electroforesis de gel de dodecilsulfato-poliacrilamida de sodio) y se determina la concentración de enzima absoluta mediante un método de titulación usando inhibidor de tripsina del tipo ll-T: clara de huevo de pavo (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri). En preparación para su uso se eluye la solución madre de enzima mediante una columna de exclusión de tamaño Sephadex-G25 (Pharmacia, Piscataway, New Jersey) para separar el propilenglicol e intercambiar el regulador de pH. Se intercambia el regulador de pH de MES en la solución madre de enzima por regulador de pH tris a 0.1 M (tris(-hidroximetil-aminometano) que contiene CaCI2 y se ajusta el pH a 8.6 con HCl. Se llevan a cabo todos los experimentos a un pH de 8.6 en un regulador de pH tris termostatizado a 25°C.

J- t?. I .t t Métodos analíticos Se pueden someter a prueba las presentes variantes en cuanto a actividad enzimática y a respuesta inmune y/o alergénica, usando los siguientes métodos, ambos conocidos por un experto en la técnica. Alternativamente, se pueden usar otros métodos bien conocidos en la técnica.

Actividad de variante Se puede ensayar la actividad de proteasa de una variante de la presente invención mediante métodos bien conocidos en la técnica. Se exponen a continuación en la presentes dos de tales métodos: Método de actividad en escamas de piel Usando cinta Scotch #3750G, se desprenden escamas de piel humana de las piernas de un individuo hasta que la cinta queda sustancialmente opaca con las escamas. Se corta luego la cinta en cuadros de 2.54 cm por 2.54 cm y se guarda. En un plato de Petri de 10 mm por 35 mm, se añade 2 ml de 0.75 mg/ml de una enzima de control (por ejemplo, subtilisina BPN') o la variante que se ha de someter a prueba en regulador de pH a 5.5 de KH2PO4 a 0.01 M. A esta solución se le añade 1 ml de solución a pH de 8.6 de laurato de sodio al 2.5%. Se mezcla la solución suavemente sobre un agitador de plataforma. Se impregna el cuadro de cinta previamente preparado en la solución (con el lado de las escamas hacia arriba) durante diez minutos continuando la mezcladura suave. Se enjuaga luego suavemente el cuadro de cinta en agua de la llave durante quince minutos. Se introduce con pipeta Stevenel Blue Stain (3 ml, comercialmente obtenible de Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) a un plato de Petri limpio. Se mete el cuadro de cinta enjuagado a la solución colorante durante tres minutos (lado de escamas hacia arriba) con mezcladura suave. Se quita el cuadro de cinta de la solución colorante y se lava consecutivamente en dos vasijas de pico de 300 ml de agua destilada, durante quince segundos por enjuague. Se deja secar con aire el cuadro de cinta. Se compara visualmente o usando un cromatómetro la intensidad de color entre el cuadro de cinta obtenido de la enzima de control y el cuadro de cinta obtenido de la variante. En relación con el cuadro de cinta de cinta de control, un cuadro de cinta de variante que muestra menos intensidad de color es indicativo de una variante que tiene actividad más alta.

Método de actividad de colágeno teñido Combínense 50 ml de regulador de pH tris a 0.1 M (tris- .hidroximetil-aminometano) que contiene CaCI2 a 0.01 M para dar un pH de 8.6 y 0.5 g de Azocoll (colágeno impregnado de azocolorante, comercialmente obtenido de Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Incúbese esta mezcla a 25°C, mientras se mezcla suavemente con un agitador de plataforma. Fíltrense 2 ml de la mezcla a través de un filtro de jeringa de 0.2 mieras y léase la absorbencia de la mezcla a 520 nm a cero en un espectrofotómetro. Añádase 1 ppm de una enzima de control (por ejemplo, subtilisina BPN') o la variante que se ha de someter a prueba a los 48 ml restantes de mezcla de tris/Azocoll. Fíltrense 2 ml de solución que contiene control/variante a través de un filtro de jeringa de 0.2 mieras cada dos minutos durante un total de diez minutos. Para cada muestra filtrada, léase la absorbencia inmediatamente a 520 nm. Grafíquense los resultados con respecto al tiempo. Las pendientes del control y el conjugado de prueba son indicativos de las actividades relativas de las muestras. Una pendiente más alta es indicativa de una actividad más alta. Se puede expresar la actividad (pendiente) de la variante de prueba como porcentaje de la actividad (pendiente) de control.

Prueba intranasal en ratones en cuanto a inmunoqenicidad Se puede determinar el potencial inmunogénico de las variantes des serina proteasa de la presente invención, usando métodos conocidos en la técnica o mediante la prueba intranasal en ratones en cuanto a inmunogenicidad que se presenta aquí a continuación. Esta prueba es similar a los ensayos descritos en Robinson et al., "Specific Antibody Responses to Subtilisin Carlsberg (Alcalase) in Mice: Development of an Intranasal Exposure Model", Fundamental and Applied Toxicology, Vol. 34, págs. 15-24 (1996) and Robinson et al., "Use of the Mouse Intranasal Test (MINT) to Determine the Allergenic Potency of Detergent Enzymes: Comparison to the Guinea Pig Intratracheal (GPIT) Test", Toxicological Science, Vol. 43, págs. 39-46 (1998), pudiéndose utilizar ambos ensayos en lugar de la prueba expuesta a continuación el presente.

Se utilizan en la prueba hembras de ratones BDF1 (Charles River Laboratories, Portage, Ml) que pesaban de aproximadamente 18 a aproximadamente 20 gramos. Se ponen en cuarentena los ratones una semana antes de dosificar. Se alojan los ratones en jaulas con camas de astillas de madera en espacios controlados en cuanto a humedad (30-70%), temperatura (19.4-25°C) y ciclos de 12 horas de luz y oscuridad. Se alimentan los ratones con alimento Purina® para ratones (Purina Mills, Richmond, IN) y agua a voluntad. Se dosifica el antígeno potencial que se ha de someter a prueba (ya sea subtilisina BPN' como control positivo o como variante de la presente invención), a un grupo de cinco ratones. Antes de dosificar, se anestesia cada ratón con una inyección intraperitoneal (i.p.) de una mezcla de Ketaset (88.8 mg/kg) y Rompun 6.67 mg/kg). Se mantiene cada animal anestesiado en la palma de la mano, abajo de nuevo y se dosifican intranasalmente con 5 ml de proteasa en solución reguladora de pH (KH2PO a 0.01 M, pH de 5.5). Aunque cada grupo recibe la misma dosificación, se someten a prueba varias dosificaciones. Se ponen las soluciones de dosificación suavemente sobre la parte exterior de cada ventana de la nariz y las inhala el ratón. Se repite la dosificación en los días 3, 10, 17 y 24. Se recogen muestras de suero en el día 29. Se mide el anticuerpo lgG1 específico para la enzima mediante un método ELISA de captura de antígenos. Se pueden comparar las inmunogenicidades de la variante con las de subtilisina BPN', usando valores regulares de ED50.

Composiciones de la presente invención Se pueden usar las variantes de la presente en cualquier aplicación que sea adecuada para la respectiva proteasa del tipo silvestre. Uno de tales ejemplos incluye composiciones de limpieza. A causa de las propiedades deseables de alergenicidad y/o inmunogenicidad reducidas de las presentes variantes, se pueden usar además las variantes en aplicaciones que se han beneficiado mínimamente con el uso de proteasas. Algunos ejemplos de tales aplicaciones incluyen aquellas en las cuales la variante se pone necesariamente en contacto estrecho con la piel humana, por ejemplo con el uso de composiciones para el cuidado personal.

Composiciones de limpieza Se pueden utilizar la variantes en composiciones de limpieza incluyendo, pero no limitándose a las mismas, composiciones de lavandería, composiciones de limpieza para trabajos ligeros, incluyendo composiciones de limpieza de vajillas, y composiciones detergentes para el lavado automático de vajillas. Las composiciones de limpieza de la presente comprenden una cantidad efectiva de una o más variantes de la presente invención y un portador para composición de limpieza. Como se usa en la presente, "cantidad efectiva de variante", o similar, se refiere a la cantidad de variante necesaria para lograr la actividad proteolítica necesaria en la composición específica para limpieza. Tales cantidades efectivas son determinadas fácilmente por un experto en la técnica y se basa en muchos factores, tales como la variante particular usada, la aplicación de limpieza, la composición específica de la composición para limpieza y según se desee una composición líquida o seca (por ejemplo, granular, en barras) y similares. Preferiblemente, las composiciones de limpieza comprenden de aproximadamente 0.0001 % a aproximadamente 10%, más preferiblemente de aproximadamente 0.001 % a aproximadamente 1 % y muy preferiblemente de aproximadamente 0.01 % a aproximadamente 0.1 % de una o más variantes de la presente invención. Se discutirán a continuación con mayor detalle varios ejemplos de varias composiciones en que se pueden emplear las variantes. Además de las presentes variantes, las presentes composiciones de limpieza comprenden también un portador de composición para limpieza que comprende uno o más materiales de composición para limpieza, compatible con la variante. El término "material de composición para limpieza", como se usa en la presente, significa cualquier material seleccionado para el tipo particular de composición para limpieza deseada y la forma del producto (por ejemplo, líquida, granulo, barra, pulverizador, banderilla, pasta, gel), materiales que son también compatibles con la variante usada en la composición. Se hace diestramente la selección específica de los materiales de composición para limpieza, considerando el material que se ha de limpiar, la forma deseada de la composición para la condición de limpieza durante su uso. El término "compatible", como se usa en la presente, significa que los materiales de composición para limpieza no reducen la actividad proteolítica de la variante a tal grado que la variante no es tan efectiva como se desea durante situaciones normales de uso. Se ejemplifican posteriormente en la presente con detalle los materiales de composición de limpieza. Se pueden usar las variantes de la presente invención en una variedad de composiciones detergentes en que se desea alta espumación y buena actividad de limpieza. Así, se pueden usar las variantes con varios ingredientes convencionales para proveer limpiadores completamente formulados para superficies duras, composiciones pare el lavado de vajillas, composiciones del lavado de tela y similares. Tales composiciones pueden estar en forma de líquidos, granulos, barras y similares. Se pueden formular tales composiciones como detergentes "concentrados" que contienen tanto como aproximadamente 30% a aproximadamente 60% en peso de pesos tensioactivos. Las composiciones de limpieza de la presente pueden contener opcional, y preferiblemente, varios agentes tensioactivos (por ejemplo, aniónicos, no iónicos o zwitteriónicos). Tales agentes tensioactivos están presentes típicamente a niveles de aproximadamente 5% a aproximadamente 35% de las composiciones. Algunos ejemplos no limitantes de agentes tensioactivos útiles en la presente incluyen los alquilbencensulfatos convencionales y alquilsulfatos primarios y aleatorios de C11-C18, los alquilsulfatos secundario (2,3) de las fórmulas CH3(CH2)x(CHOSO3)-M+)CH3 y CH3(CH2)y(CHOSO3)" M+)CH2CH3) en que x e (y+1 ) son números enteros por lo menos de aproximadamente 7, preferiblemente por lo menos de aproximadamente 9, y M es un catión solubilizador en agua, especialmente sodio, los alquilalcoxisulfatos de Cío-C-iß (especialmente etoxisulfatos de EO 1-5), alquilalcoxicarboxilatos de C10-C18 (especialmente etoxicarboxilatos de EO 1-5), los alquilpoliglicósidos de C10-C-18 y sus correspondientes poliglicósidos sulfatados, esteres de ácidos grasos a-sulfonatados de C-|2-C?8, alquil- y alquilfenolalcoxilatos (especialmente etoxilatos y etoxi/propoxi mixto), betaínas y sulfobetaínas ("sultaínas") de C12-Ci8, óxidos de amina de C-io-C-is y similares. Se prefieren en la presente alquilalcoxisulfatos (AES) y alquilalcoxicarboxilatos (AEC). Se prefiere también el uso de tales agentes tensioactivos en combinación con los agentes tensioactivos de óxido de amina y/o betaína o sultaína, dependiendo de los deseos del formulador. Se listan en textos regulares otros agentes tensioactivos convencionales. Los agentes tensioactivos paticularmente útiles incluyen las N-metilglucamidas de C10-C18 expuestas en la patente de E.U.A. No. 5,194, 639, Connor et al., expedida el 16 de marzo de 1993. Se puede incluir una extensa variedad de otros ingredientes útiles en composiciones detergentes de limpieza en las composiciones de la presente incluyendo, por ejemplo, otros ingredientes activos, portadores, hidrótopos, materiales auxiliares de procesamiento, colorantes o pigmentos, y solventes para formulaciones líquidas. Si se desea un incremento adicional de espumación, se pueden incorporar a las composiciones intensificadores de espuma, tales como alcolamidas de do-C-is, típicamente a niveles de aproximadamente 1 % a aproximadamente 10%. Las amidas de monoetanol y dietanol ilustran una clase típica de tales ¡ntensificadores de espuma. Es ventajoso también el uso de tales intensificadores de espuma con agentes tensioactivos adjuntos de alta espumación, tales como los óxidos de amina, las betaínas y las sultaínas indicadas anteriormente. Si se desea, se pueden añadir sales solubles de magnesio, tales como MgCl2, MgSO y similares, a niveles típicamente de aproximadamente 0.1 % a aproximadamente 2%, parra proveer espumación adicional. Las composiciones detergentes líquidas de la presente pueden contener agua y otros solventes como portadores. Son adecuados los alcoholes primarios y secundarios de bajo peso molecular, ejemplificados por metanol, etanol, propanol e /so-propanol. Se prefieren los alcoholes monohídricos para solubilizar agentes tensioactivos, pero se pueden usar también polioles, tales como los que contienen de aproximadamente 2 a aproximadamente 6 átomos de carbono y de aproximadamente 2 a aproximadamente 6 grupos hidroxi (por ejemplo, 1 ,3-propanodiol, etilenglicol, glicerina y 1 ,2-propanodiol). Las composiciones pueden contener de aproximadamente 5% a aproximadamente 90%, tucamente de aproximadamente 10% a aproximadamente 50% de tales portadores. Se formularán preferiblemente las composiciones detergentes de la presente de tal manera que, durante su uso en operaciones acuosas de limpieza, el agua de lavado tenga un pH entre aproximadamente 6.8 y '.! . , aproximadamente 1.1. Se formulan típicamente a esta escala los productos terminados. Los procedimientos para controlar el pH a los niveles de uso recomendados incluyen, por ejemplo, el uso de reguladores de pH, álcalis y ácidos. Tales procedimientos son bien conocidos por los expertos en la técnica. Cuando se formulan las composiciones de limpieza para superficies duras y composiciones de limpiezas de tela de la presente invención, el formulador quizás desee emplear varios mejoradores de detergencia a niveles de aproximadamente 5% a aproximadamente 50% en peso. Los mejoradores de detergencia típicos ¡ncluyen las zeolitas de 1-10 mieras, policarboxilatos tales como citrato y oxidisuccinatos, silicatos estratificados, fosfatos y similares. Otros mejoradores de detergencia convencionales aparecen listados en formularios regulares. De igual manera, el formulador quizas desee emplear varias enzimas adicionales, tales como celulasas, lipasas, amilasas y proteasas en tales composiciones, típicamente a niveles de aproximadamente 0.001 % a aproximadamente 1 % en peso. Varias enzimas detersivas y para el cuidado de telas son bien conoOcidas en la técnica de detergentes para lavandería. Se pueden usar en tales composiciones varios compuestos blanqueadores, tales como los percarbonatos, perboratos y similares, típicamente a niveles de aproximadamente 1 % a aproximadamente 15% en peso. Si se desea, tales composiciones pueden contener activadores de blanqueo, tales como tetraacetiletilendiamina, sulfonato de - i . nonanoiloxibenceno y similares, que son también conocidos en la técnica. Los niveles de uso varían típicamente de aproximadamente 1 % a aproximadamente 10% en peso. Se pueden usar también en tales composiciones a gentes de liberación de suciedad, especialmente del tipo de oligoéster aniónico, agentes de quelación, especialmente los aminosfosfonatos y los etilendiamin-disuccinatos, agentes de eliminación de suciedad de arcilla, especialmente tetraetilenpentamina etoxilada, agentes de dispersión, especialmente poliacrilatos y poliaspartatos, abrillantadores, especialmente abrillantadores aniónicos, supresores de espuma, especialmente siliconas y alcoholes secundarios, suavizantes de tela, especialmente arcillas de esmectita y similares, a niveles que varían de aproximadamente 1 % a aproximadamente 35% en peso. Los formularios regulares y las patentes publicadas contienen múltiples descripciones detalladas de tales materiales convencionales. Se pueden usar también estabilizadores de enzimas en las composiciones de limpieza. Tales estabilizadores de enzimas incluyen propilenglicol (preferiblemente de aproximadamente 1 % a aproximadamente 10%), formiato de sodio (preferiblemente de aproximadamente 0.1 % a aproximadamente 1 %) y formiato de calcio (preferiblemente de aproximadamente 0.1 % a aproximadamente 1 %). Las presentes variantes son útiles en composiciones de limpieza para superficies duras. Como se usa en la presente, "composición para limpieza de superficies duras" se refiere a composiciones detergentes líquidas y granulares para limpiar superficies duras, tales como pisos, paredes, azulejo de baño y similares. Las composiciones de limpieza para superficies duras de la presente invención comprenden una cantidad efectiva de una o más variantes de la presente invención, preferiblemente de aproximadamente 0.001 % a aproximadamente 10%, más preferiblemente de aproximadamente 0.01 % a aproximadamente 5%, más preferiblemente aún de aproximadamente 0.05% a aproximadamente 1 % en peso de variante de la composición. Además de comprender una o más de las variantes, tales composiciones de limpieza para superficies duras comprenden típicamente un agente tensioactivo y un mejorador de detergencia secuestrante soluble en agua. En ciertos productos especializados, tales como limpiadores de ventanas por aspersión, sin embargo, se usan algunas veces los agentes tensioactivos, ya que pueden producir un residuo membranoso y/o veteado sobre la superficie de vidrio. El componente tensioactívo, cuando está presente, puede constituir tan poco como 0.1 % de las composiciones de la presente, pero típicamente las composiciones contendrán de aproximadamente 0.25% a aproximadamente 10%, mas preferiblemente de aproximadamente 1 % a aproximadamente 5% de agente tensioactivo. Típicamente, las composiciones contendrán de aproximadamente 0.5% a aproximadamente 50% de un mejorador de detergencia, preferiblemente de aproximadamente 1 % a aproximadamente 10%.

Preferiblemente, el pH debe estar en el intervalo de aproximadamente 7 a aproximadamente 12. Se pueden usar agentes convencionales de ajuste de pH, tales como hidróxido de sodio, carbonato de sodio o ácido clorhídrico, si es necesario el ajuste. Se pueden incluir solventes en las composiciones. Los solventes útiles incluyen, pero no se limitan a los mismos, éteres de glicol, tales como éter dietilenglicolmonohexilico, éter dietilenglicolmonobutílico, éter etilenglicol-monobutílíco, éter etilenglicolmonohexílico, éter propilenglicolmonobutílico, éter dipropilenglicolmonobutílico, y dioles tales como 2,2,4-trimetil-1 ,3-pentanodiol y 2-etil-1 ,3-hexanodiol. Cuando se usan, tales solventes están presentes típicamente a niveles de aproximadamente 0.5% a aproximadamente 15%, más preferiblemente de aproximadamente 3% a aproximadamente 11 %. Adicíonalmente, se pueden usar en las presentes composiciones solventes altamente volátiles, tales como /so-propanol o etanol, para facilitar la evaporación más rápida de la composición de las superficies cuando no se enjuaga la superficie después de la aplicación con "intensidad completa" de la composición a la superficie. Cuando se usan, los solventes volátiles están presentes típicamente a niveles de aproximadamente 2% a aproximadamente 12% en las composiciones. Se ilustran las composiciones de limpieza para superficies duras de la presente invención con los siguientes ejemplos. ,_,íík; EJEMPLOS 1-6 Composiciones líquidas de limpieza para superficies duras Todas las fórmulas están ajustadas al pH de 7. En otra modalidad de la presente invención, las composiciones del lavado de vajillas comprenden una o más variantes de la presente invención. Como se usa en la presente, "composición para el lavado de vajillas" se refiere a todas las formas de composiciones de limpiar vajillas incluyendo, pero no limitándose a las mismas, formas granulares y líquidas. Se ilustran las composiciones del lavado de vajillas de la presente invención con los siguientes ejemplos.

EJEMPLOS 7-10 Detergente líquido para vajillas Todas las fórmulas están ajustadas al pH de 7. Se ilustran las composiciones líquidas para limpieza de tela de la presente invención con los siguientes ejemplos.

EJEMPLOS 11-13 Composiciones líquidas de limpieza para telas Composiciones del cuidado personal Las presentes variantes son particularmente adecuadas para su uso en composiciones del cuidado personal tales como, por ejemplo, acondicionadores del cabello que se dejan puestos y se enjuagan, champúes, composiciones de la acné que se dejan puestas y se enjuagan, geles para ducha, limpiadores faciales espumantes y no espumantes, cosméticos, lociones y agentes hidratantes para manos, cara y cuerpo, agentes hidratantes facíales que se dejan puestos, paños cosméticos y de limpiar, composiciones del cuidado oral y composiciones del cuidado para lentes de contacto. Las presentes composiciones del cuidado personal comprenden una o más variantes de la presente invención y un portador para el cuidado personal. Para ilustrar, las presentes variantes son adecuadas para su inclusión en las composiciones descritas en las siguientes referencias: Patente de E. U. A. No. 5,641 ,479, Linares et al., expedida el 24 de junio de 1997 (limpiadores de la piel); Patente de E. U. A. No. 5,599,549, Wivell et al., expedida el 4 de febrero de 1997 (limpiadores de la piel); Patente de E. U. A. No. 5,585,104, Ha et al., expedida el 17 de diciembre de 1996; Patente de E. U. A. No. 5,540,852, Kefauver et al., expedida el 30 de julio de 1996, (limpiadores de la piel); Patente de E. U. A. No. 5,510,050, Dunbar et al.. expedida el 23 de de abril de 1996 (limpiadores de la piel); Patente de E. U. A. No. 5,612,324, Guano Lin et al., expedida el 18 de marzo de 1997 (preparaciones contra el acné); Patente de E. U. A. No. 5,587,176, Warren et aj\, expedida el 24 de diciembre de 1996 (preparaciones contra el acné); Patente de E. U. A. No. 5,549,888, Venkateswaran, expedida el 27 de agosto de 1996 (preparaciones contra el acné); Patente de E. U. A. No. 5,470,884, Corless et al., expedida el 28 de noviembre de 1995 (preparaciones contra el acné); Patente de E. U. A. No. 5,650,384, Gordon et al., expedida el 22 de julio de 1997 (gel para regadera); Patente de E. U. A. No. 5,607,678, Moore et al., expedida el 4 de marzo de 1997 (gel para regadera); Patente de E. U. A. No. 5,624,666, Coffindaffer et al., expedida el 29 de abril de 1997 (acondicionadores y/o champúes para el cabello); Patente de E. U. A. No. 5,618,524 Bolich et al., expedida el 8 de abril de 1997 (acondicionadores y/o champúes para el cabello); Patente de E. U. A. No. 5,612,301 , Inman, expedida el 18 de marzo de 1997 (acondicionadores y/o champúes para el cabello); Patente de E. U. A. No. 5,573,709, Wells, expedida el 12 de noviembre de 1996 (acondicionadores y/o champúes para el cabello); Patente de E. U. A. No. 5,482,703, Pinos, expedida el 9 de enero de 1996 (acondicionadores y/o champúes para el cabello); Patente de E. U. A. No. Re. 34,584, Grote et al., expedida el 12 de abril de 1994 (acondicionadores y/o champúes para el cabello); Patente de E. U. A. No. 5,641 ,493, Date et al.. expedida el 24 de junio de 1997 (cosméticos); Patente de E. U. A. No. 5,605,894, Blank et al., expedida el 25 de febrero de 1997 (cosméticos); Patente de E. U. A. No. 5,585,090, Yoshioka et al., expedida el 17 de diciembre de 1996 (cosméticos); Patente de E. U. A. No. 4,939,179, Chenev et al., expedida el 3 de julio de 1990 (lociones para manos, cara y/o cuerpo); Patente de E. U. A. No. 5,607,980, McAtee et al., expedida el 4 de marzo de 1997 (lociones para manos, cara y/o cuerpo); Patente de E. U. A. No. 4,045,364, Ritcher et al., expedida el 30 de agosto de 1977 (paños cosméticos y de limpiar); solicitud de patente europea EP 0 619 074, Touchet et al.. publicada el 12 de octubre de 1994 (paños cosméticos y de limpiar); patente de E. U. A. No. 4,975,217, Brown-Skrobot et al., expedida el 4 de diciembre de 1990 (paños cosméticos y de limpiar); patente de E. U. A. No. 5,096,700, Seibel, expedida el 17 de marzo de 1992 (composiciones de limpieza oral); patente de E. U. A. No. 5,028,414, Sampathkumar, expedida el 2 de julio de 1991 , (composiciones de limpieza oral); patente de E. U. A. No. 5,028,415, Benedict et al., expedida el 2 de julio de 1991 (composiciones de limpieza oral); patente de E. U. A. No. 5,028,415, Benedict et al., expedida el 2 de julio de 1991 (composiciones de limpieza oral); patente de E. U. A. No. 4,863,627, Davies et al.. 5 de septiembre de 1989 (soluciones de limpieza para lentes de contacto); patente de E. U. A. No. Re. 32,672, Huth et al., reexpedida el 24 de mayo de 1988 (soluciones de limpieza para lentes de contacto); y patente de E. U. A. No. 4,609,493, Schafer, expedida el 2 de septiembre de 1986 (soluciones de limpieza para lentes de contacto). Para ilustrar más las composiciones de limpieza oral de la presente invención se incluye una cantidad farmacéuticamente aceptable de una o más variantes de la presente invención, en composiciones útiles para eliminar manchas proteínicas de dientes o dentaduras postizas. Como se usa en la presente, "composiciones de limpieza oral" se refiere a dentífricos, AA ..A.J k pastas para dientes, geles para dientes, polvos para dientes, enjuagues bucales, pulverizadores para la boca, geles para la boca, gomas de mascar, grageas, sacos aromatizados, tabletas, biogeles, pastas para profilaxis, soluciones para tratamiento dental y similares. Preferiblemente, las 5 composiciones de limpieza oral comprenden de aproximadamente 0.0001 % a aproximadamente 20% de una o más variantes de la presente invención, más preferiblemente de aproximadamente 0.001 % a aproximadamente 10%, más preferiblemente aún de aproximadamente 0.01 % a aproximadamente 5%, en peso de la composición, y un portador farmacéuticamente aceptable. Como se 10 usa en la presente, "farmacéuticamente aceptable" significa que los fármacos, medicamentos o ingredientes inertes que describe el término son adecuados para su uso en contacto con los tejidos de seres humanos y animales inferiores sin toxicidad, incompatibilidad, inestabilidad, irritación, respuesta alérgica y similares, indebidos en proporción con una relación razonable de 15 beneficio/riesgo. Típicamente, los componentes del portador para limpieza oral farmacéuticamente de los componentes para limpieza oral de las composiciones de limpieza oral comprenderán generalmente de aproximadamente 50% a aproximadamente 99.99%, preferiblemente de 20 aproximadamente 65% a aproximadamente 99.99%, más preferiblemente de aproximadamente 65% a aproximadamente 99%, en peso de la composición. Los componentes del portador farmacéuticamente aceptable y los componentes opcionales que se pueden incluir en las composiciones de x3 t_?t_?__i-?,, ?:- ** limpieza oral son bien conocidos por los expertos en la técnica. Se expone una extensa variedad de tipos de composición, componentes de portador y composiciones, útiles en las composiciones de limpieza oral, en las referencias citadas anteriormente en la presente. 5 En otra modalidad de la presente invención, las composiciones de limpieza de dentaduras para limpiar dentaduras fuera de la cavidad oral comprenden una o más variantes de la presente invención. Tales composiciones de limpieza de dentaduras comprenden una cantidad efectiva de una o más de las variantes, preferiblemente de aproximadamente 0.0001 % 10 a aproximadamente 50% de una o más de las variantes, más preferiblemente de aproximadamente 0.001 % a aproximadamente 35%, más preferiblemente aún de aproximadamente 0.01 % a aproximadamente 20%, en peso de la composición, y un portador para limpieza de dentaduras varios formatos de composiciones de limpieza de dentaduras, tales como tabletas efervescentes 15 y similares (véase, por ejemplo, la patente de E.U.A. No. 5,055,305, Young) y son generalmente apropiados para su incorporación de una o más de las variantes para eliminar manchas proteínícas de las dentaduras. En otra modalidad de la presente invención, las composiciones de limpieza para lentes de contacto comprenden una o más variantes de la 20 presente invención. Tales composiciones de limpieza para lentes de contacto comprenden una cantidad efectiva de una o más de las variantes, preferiblemente de aproximadamente 0.01 % a aproximadamente 50% de una o más de las variantes, más preferiblemente de aproximadamente 0.01 % a aproximadamente 20%, más preferiblemente aún de aproximadamente 1 % a aproximadamente 5%, en peso de la composición, y un portador de limpieza para lentes de contacto. Varios formatos de composiciones de limpieza para lentes de contacto, tales como tabletas, líquidos y similares, son bien conocidos en la técnica y son generalmente apropiados para la incorporación de una o más variantes de la presente invención para eliminar manchas proteínicas de los lentes de contacto. Se ilustra la modalidad de la composición de limpieza para lentes de contacto de la presente invención con los ejemplos 14-17.

EJEMPLOS 14-17 Solución de limpieza para lentes de contacto Los ejemplos 18-21 ilustran el uso de las presentes variantes en los productos de jabonadura para el cuerpo: EJEMPLOS 18-21 Productos para el lavado del cuerpo Los ejemplos 22-25 ilustran el uso de las presentes variantes en productos de lavado facial: EJEMPLOS 22-25 Productos para el lavado de la cara Los ejemplos 26-27 ilustran el uso de las presentes variantes en composiciones hidratantes de la piel que se dejan puestas: EJEMPLOS 26-27 Composición hidratante para dejar sobre la piel El ejemplo 28 ilustra el uso de las presentes variantes en composiciones de paños de limpiar: EJEMPLO 28 Composición para paño de limpieza Se impregna la composición anterior sobre una hoja absorbente tejida, constituida de celulosa y/o poliéster a aproximadamente 250%, en peso de la hoja absorbente.

LISTADO DE SECUENCIAS <1 10> The Procter & Gamble Company <120> VARIANTES DE SUBTISILINA PROTEASA QUE TIENEN SUPRESIONES DE AMINOÁCIDOS Y SUSTITUCIONES EN REGIONES DE EPITOPE DEFINIDAS <130> Deletionsubsminor <140> PCT/US00/ <141 > 2000-07-1 1 <160> 1 <170> Patentln Ver 2 0 <210> 1 <211 > 275 <212> PRT <213> Bacillus amyloliquefaaens <400> 1 Ala Gln Ser Val Pro Tyr Gly Val Ser Gln He Lys Ala Pro Ala Leu 1 5 10 15 His Ser Gln Gly Tyr Thr Gly Ser Asn Val Lys Val Ala Val He Asp 20 25 30 Ser Gly lie Asp Ser Ser His Pro Asp Leu Lys Val Ala Gly Gly Ala 35 40 45 Ser Met Val Pro Ser Glu Thr Asn Pro Phe Gln Asp Asn Ser His 50 55 60 Gly Thr His Val Ala Gly Thr Val Ala Ala Leu Asn Asn Ser lie Gly 65 70 75 80 Val Leu Gly Val Ala Pro Ser Ala Ser Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu 85 90 95 Gly Ala Asp Gly Ser Gly Gln Tyr Ser Trp He lie Asn Gly He Glu 100 105 110 Trp Ala He Ala Asn Asn Met Asp Val lie Asn Met Ser Leu Gly Gly 1 15 120 125 Pro Ser Gly Ser Ala Ala Leu Lys Ala Ala Val Asp Lys Ala Val Ala 130 135 140 Ser Gly Val Val Val Val Ala Ala Ala Gly Asn Glu Gly Thr Ser Gly 145 150 155 160 Ser Ser Ser Thr Val Gly Tyr Pro Gly Lys Tyr Pro Ser Val He Ala 165 170 175 Val Gly Ala Val Asp Ser Ser Asn Gln Arg Ala Ser Phe Ser Ser Val 180 185 190 Gly Pro Glu Leu Asp Val Met Ala Pro Gly Val Ser He Gln Ser Thr 195 200 205 Leu Pro Gly Asn Lys Tyr Gly Ala Tyr Asn Gly Thr Ser Met Ala Ser 210 215 220 Pro His Val Ala Gly Ala Ala Ala Leu He Leu Ser Lys His Pro Asn 225 230 235 240 Trp Thr Asn Thr Gln Val Arg Ser Ser Leu Glu Asn Thr Thr Thr Lys 245 250 255 Leu Gly Asp Ser Phe Tyr Tyr Gly Lys Gly Leu lie Asn Val Gln Ala 260 265 270 Ala Ala Gln 275

Claims (10)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Una variante de proteasa similar a subtilisina, caracterizada porque dicha variante tiene una secuencia modificada de aminoácidos de una secuencia del tipo silvestre de aminoácidos, comprendiendo la secuencia del tipo silvestre una primera región de epítope y una segunda región de epítope, en que la secuencia modificada de aminoácidos comprende una supresión de una o más posiciones en una o más regiones de epítope en que: (a) cuando ocurre una supresión en la primera región de epítope, la supresión es de una o más de las posiciones 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 112, 113, 114, 116, 117, 118, 119, 123 y 125 correspondientes a subtilisina BPN'; y (b) cuando ocurre una supresión en la segunda región de epítope, la supresión es de una o más de las posiciones 220, 221 , 222, 223, 224, 225, 227, 228, 229, 230, 231 , 232, 233, 239, 240, 242, 243, 244, 245 y 246 correspondientes a subtilisina BPN'.

2.- Una variante de proteasa similar a subtilisina, caracterizada porque dicha variante tiene una secuencia modificada de aminoácidos de una secuencia del tipo silvestre de aminoácidos, comprendiendo la secuencia del tipo silvestre una primera región de epítope y una segunda región de epítope, en que la secuencia modificada de aminoácidos comprende una supresión de dos o más posiciones en una o más regiones de epítope en que: (a) cuando ocurre una supresión en la primera región de epítope, la supresión es de una o más de las posiciones 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111 , 112, 113, 114, 1 15, 116, 117, 118, 1 19, 120, 121 , 122, 123, 124, 125 y 126 correspondientes a subtilisina BPN'; y (b) cuando ocurre una supresión en la segunda región de epítope, la supresión es de una o más de las posiciones 220, 221 , 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231 , 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241 , 242, 243, 244, 245 y 246 correspondientes a subtilisina BPN'.

3.- Una variante de conformidad con cualquiera de las dos reivindicaciones, caracterizada además porque comprende también una sustitución en una o más de las posiciones 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111 , 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121 , 122, 123, 124, 126, 220, 221 , 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231 , 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241 , 242, 243, 244, 245 y 246 correspondientes a subtilisina BPN'.

4.- Una variante similar a subtilisina caracterizada porque dicha variante tiene una secuencia modificada de aminoácidos de una secuencia del tipo silvestre de aminoácidos, comprendiendo la secuencia del tipo silvestre una primera región de epítope, una segunda región de epítope y una tercera región de epítope, en que la secuencia modificada de aminoácidos comprende una supresión de una o más posiciones en dos o más regiones de epítope en que: (a) cuando ocurre una supresión en la primera región de epítope, la supresión es de una o más de las posiciones 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111 , 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121 , 122, 123, 124, 125 y 126 correspondientes a subtilisina BPN'; (b) cuando ocurre una supresión en la segunda región de epítope, la supresión es de una o más de las posiciones 220, 221 , 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231 , 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241 , 242, 243, 244, 245 y 246 correspondientes a subtilisina BPN'; y (c) cuando ocurre una supresión en la tercera región de epítope, la supresión es de una o más de las posiciones 70, 71 , 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81 , 82, 83 y 84 correspondientes a subtilisina BPN'.

5.- Una variante de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada además porque se selecciona la serina proteasa del grupo que consiste en subtilísina BPN', subtilisina Carlsberg, subtilisina DY, subtilisina 309, proteinasa K y termitasa, y porque dicha variante comprende también una o más mutaciones estabilízadoras.

6.- Una variante de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada además porque la supresión ocurre en la tercera región de epítope, la supresión es de una o más de de las posiciones 70, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81 y 82 correspondientes a subtilisina BPN'.

7.- Una variante de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada además porque comprende también una sustitución en una o más de las posiciones 70, 71 , 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81 , 82, 83 y 84, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111 , 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121 , 122, 123, 124, 126, 220, 221 , 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231 , 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241 , 242, 243, 244, 245 y 246 correspondientes a subtilisina BPN'.

8.- Una composición de limpieza que comprende una variante de conformidad con la reivindicación 1 y un portador para composición de limpieza.

9.- Una composición para el cuidado personal caracterizada porque dicha composición comprende un portador para el cuidado personal y una variante de serina proteasa que tiene una secuencia modificada de aminoácidos de una secuencia del tipo silvestre de aminoácidos, comprendiendo la secuencia del tipo silvestre una primera región de epítope, una segunda región de epítope y una tercera región de epítope, en que la secuencia modificada de aminoácidos comprende una supresión de una o más posiciones en una o más regiones de epítope en que: (a) cuando ocurre una supresión en la primera región de epítope, la supresión es de una o más de las posiciones 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 112, 113, 114, 115, 1 16, 117, 118, 119, 120, 121 , 122, 123, 124 y 125 correspondientes a subtilisína BPN'; (b) cuando ocurre una supresión en la segunda región de epítope, la supresión es de una o más de las posiciones 220, 221 , 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231 , 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241 , 242, 243, 244, 245 y 246 correspondientes a subtilisina BPN'; y (c) cuando ocurre una supresión en la tercera región de epítope, la supresión es de una o más de las posiciones 70, 71 , 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81 , 82, 83 y 84 correspondientes a subtilisina BPN'. i. i..» .

10.- Una composición para el cuidado personal que comprende una variante de conformidad con la reivindicación 1 y un portador para el cuidado personal. 11 ,- Una composición para el cuidado personal que comprende una variante de conformidad con la reivindicación 4 y un portador para composición de limpieza. 12.- Una composición para el cuidado personal que comprende una variante de conformidad con la reivindicación 4 y un portador para el cuidado personal. °y *<(3 RESUMEN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a variantes de proteasa similar a subtilisina que tienen inmunogenicidad disminuida en relación con sus 5 correspondientes proteasas del tipo silvestre; la presente invención se refiere además a tales variantes que tienen adicionalmente una o más sustituciones de aminoácidos en una o más regiones de epítope o que tienen adicionalmente una o más sustituciones estabilizadoras; la invención se refiere además a genes mutantes que codifican tales variantes y a 10 composiciones de limpieza y para el cuidado personal que comprenden tales variantes. GC/jtc P01/2132F E'íSS