CZ2002220A3 - Varianty subtilisinové proteasy s delecemi a substitucemi aminokyselin v definovaných epitopových regionech - Google Patents

Varianty subtilisinové proteasy s delecemi a substitucemi aminokyselin v definovaných epitopových regionech Download PDF

Info

Publication number
CZ2002220A3
CZ2002220A3 CZ2002220A CZ2002220A CZ2002220A3 CZ 2002220 A3 CZ2002220 A3 CZ 2002220A3 CZ 2002220 A CZ2002220 A CZ 2002220A CZ 2002220 A CZ2002220 A CZ 2002220A CZ 2002220 A3 CZ2002220 A3 CZ 2002220A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
deletion
positions
amino acid
epitope region
subtilisin
Prior art date
Application number
CZ2002220A
Other languages
English (en)
Inventor
Donn Nelton Rubingh
Elizabeth Ellen Sikorski
Original Assignee
The Procter & Gamble Company
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by The Procter & Gamble Company filed Critical The Procter & Gamble Company
Publication of CZ2002220A3 publication Critical patent/CZ2002220A3/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
    • C12N9/54—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea bacteria being Bacillus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
    • C11D3/00—Other compounding ingredients of detergent compositions covered in group C11D1/00
    • C11D3/16—Organic compounds
    • C11D3/38—Products with no well-defined composition, e.g. natural products
    • C11D3/386—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Detergent Compositions (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Cosmetics (AREA)

Description

Varianty subtilisinové proteasy s delecemi a substitucemi v definovaných epitop&htíeh/ regionech.
aminokyselin
Oblast techniky
Vynález se týká geneticky zkonstruovanými subtilisinovými protesami, které jsou užitečné v prostředcích, jako jsou například prostředky k osobní ochraně, prací prostředky, prostředky k čištění tvrdých povrchů a lehkých čistících prostředků.
Dosavadní stav techniky
Enzymy tvoří největší část v přírodě se vyskytujících proteinů. Jedna třída enzymů zahrnuje proteasy, které katalyzují hydrolýzu jiných proteinů. Tato schopnost hydrolyzovat proteiny byla využita při zavedení přírodních a geneticky zkonstruovaných proteas do čistících prostředků, zvláště pracích prostředků.
V oborech zabývajících se čistícími prostředky se nejčastěji používají serinové proteasy. Většina těchto šeřinových proteas se vyrábí pomocí bakteriálních organismů, některé z nich se vyrábí pomocí jiných organismů, jako jsou houby. Viz. Siezen, Rola J. et al., „Homology Modelling a Protein Engineering Stratégy of Subtilases, the Family of Subtilisin-Fike Serine Proteases“, Protein Engineering, vol. 4, č. 7, str. 719 až 737 (1991). Bohužel účinnost nekultivováných proteas v jejich přirozeném prostředí není často optimalizována na umělé prostředí čistícího prostředku. Specifické charakteristiky proteas, jako jsou například termální stabilita, pH stabilita, oxidační stabilita a substrátová specificita, nejsou nezbytně optimalizovány k použití mimo přirozené prostředí enzymu.
Bylo použito několik přístupů ke změně pořadí sekvence aminokyselin v nekultivovaných serinových proteasách s cílem zvýšit účinnost proteas za zvýšení termální stability a zlepšení oxidační stability za zcela odlišných podmínek.
Avšak protože takto modifikované proteasy jsou vůči savcům cizí, jsou potenciálními antigeny. Jako antigeny způsobují tyto proteasy imunogenní anebo alergenní reakce (zde jsou souhrnně popsány jako imunnogenní reakce) u savců.
Zatímco genetické inženýrství bylo v popředí pokračujícího výzkumu efektivnějších proteas k použití v pracích prostředcích, geneticky zkonstruované proteasy nebyly komerčně využity v prostředcích k osobní ochraně a lehkých detergentech. Prvním důvodem pro absenci • 9
9*99 • 9999 9 9
9 9 9 9 9 9
9 9 9 9 9 9
99 99
zkonstruovaných proteas v produktech, jako jsou mýdla, gely, tělové šampony a šampony, spočívá v problému spojeným s citlivostí lidí, která vede k nežádoucím imunologickým reakcím. Měl by tedy být vysoce prospěšný při zajištění prostředku k osobní ochraně nebo lehkého detergentu, který má čistící vlastnosti zkonstruovaných proteas s minimalizovaným vyvoláváním imunologické odezvy.
Jedním z přístupů ke zmírnění imunologické aktivity proteasy je přestavba jednoho či více epitopů proteasy.
Epitopy jsou obasti aminokyselin na povrchu antigenu, které vyvolávají imunologickou odezvu vazbou protilátek nebo vložením zúčastněných antigenů T buněk pomocí majoritního histokompatibilního proteinového komplexu (MHC). Změny v epitopech ovlivní jejich antigenní účinnost. Viz. Walsh, B.J. a M.E.H. Howden, „A Method for the Detection of IgE Binding Sequences of Allergens Based on a Modification of Epitope Mapping“, Journal of Immunological Methods, vol. 121, str. 275 až 280 (1989).
Ve vynálezu bylo objeveno, že tyto serinové proteasy obecně známé jako subtilisiny, mezi něž patří i subtilisin BPN', mají přední epitopální regiony v aminokyselinových pozicích 103 až 126 a 220 až 246, stejně jako aminokyselinové pozice 70 až 84 odpovídající subtilisinu BPN'. Ve vynálezu byly takové subtilisiny geneticky přestavěny, aby se zmímilly imunnogenní vlastnosti připisované tomuto epitopálnímu regionu. Přitom byly objeveny subtilisiny, které vyvolávají sníženou imunologicou odezvu, které však ještě mají aktivitu účinných čistících proteas. Proto jsou vynalezené proteasy vhodné k použití v několika typech prostředků, které zahrnují, ale nejsou tímto nijak omezeny, prací prostředky, prostředky na nádobí, tvrdé povrchy, k ochraně kůže, ochraně vlasů, kosmetické prostředky, prostředky k ústní ochraně a prostředky na čištění kontaktních čoček.
Podstata vynálezu
Vynález se týká různých variant serinových proteas, které mají sníženou imunogenicitu vzhledem k jejich odpovídajícím nekultivovaným proteasam. Obzvláště se vynález týká variant serinových proteas, které mají sekvenci aminokyselin modifikovanou z nekultivované sekvence aminokyselin, přičemž takováto nekul ti vo váná sekvence obsahuje první epitopální region odpovídající pozicím 103 až 126 subtilisinu BPN', druhý epitopální region odpovídající pozicím 220 až 246 subtilisinu BPN'a třetí epitopální region odpovídající pozicím 70 až 84 subtilisinu BRN', kde modifikovaná aminokyselinová sekvence zahrnuje odstranění jedné nebo více pozic v jednom nebo více epitopálních regionech. Vynález se dále ·· ·* » 9 ·
Β · · ·· *« ···· týká takových variant, které dále mají jednu nebo více aminokyselin substituovaných v jednom nebo více epitopálních regionech nebo dále mají jednu nebo více stabilizačních substitucí. Vynález se dále týká mutovaných genů kódujících takové varianty a čistících prostředků a prostředků k osobní ochraně, které tyto varianty obsahují.
Přesný popis vynálezu
Níže jsou popsány základní složky vynálezu. Jsou zahrnuty, avšak nejsou tímto nijak omezeny, i popisy různých volitelných a výhodných složek užitečných v provedeních vynálezu.
Vynález zahrnuje, skládá se nebo se v podstatě sestává z jakýchkoli požadovaných nebo volitelných složek anebo omezení zde popsaných.
Všechna procenta a poměry jsou hmotnostní, pokud není uvedeno jinak. Všechna procenta jsou vypočtena vzhledem k hmotnosti celého prostředku, pokud není uvedeno jinak.
Všechny hladiny složek nebo prostředků jsou srovnány s aktivními hladinami takových složek nebo prostředků a nejsou v nich započteny nečistoty, například zbytky rozpouštědel nebo vedlejších produktů, které mohou být přítomny v komerčně dostupných zdrojích.
Všechny dokumenty , na které je zde odkázáno, zahrnují všechny patenty, patentové přihlášky a vytištěné publikace a jsou zde zahrnuty odkazem.
Zkratky zde použité popisují aminokyseliny. V tabulce I je výpis těchto použitých zkratek :
Aminokyselina TřÍDÍsmenná zkratka Jednopísmenná zkratka
Alanin Ala A
Arginin Arg R
Asnaragin Asn N
Asnartová kvselina Asn D
Cystein Cvs C
Glutamin Gin 0
Glutamová kvselina Glu E
Glvcin Glv G
Histidin His H
Isoleucin De I
Leucin Leu L
Lvsin Lvs K
Methionin Met M
Fenvlalanin Phe F
Prolin Pro P
Serin Ser S
Threonin Thr Τ
·· ···· ♦ · ·· • · · • · ··· • · · · * · · · ·· ·· • · ♦ • · ♦ • ♦ · • » · · ·· ·· ·♦ ·· • · · ·
9 ·
9 9
9 9
9999
Aminokvselina Třínísmenná zkratka Jednopísmenná zkratka
Trvntofan Trn W
Tvrosin Tvr Y
Valin Val V
Výraz „mutace“ zde použitý označuje změnu v genové sekvenci anebo sekvenci aminokyselin produkovaných touto genovou sekvencí. Mutace zahrnují delece, substituce a adice zbytků aminokyselin na nekultivované proteinové sekvence.
Výraz „nekultivovaný“ zde použitý označuje protein, zde specificky proteasa, produkovanou nemutovanýmy organismy.
Výraz „varianta“ použitý v přihlášce označuje protein, zde specificky proteasa, který má sekvenci aminokyselin odlišnou od sekvence v nekultivovaných proteasách.
Jak je zde zmíněno, zatímco varianty vynálezu nejsou omezeny vzhledem k variantám subtilisinu BPN', všechno číslování aminokyselin je provedeno dle sekvence aminokyselin v subtilisinu BPN', který je reprezentován SEQ ID NO:1. Sekvence aminokyselin subtilisinu BPN'je dále popsána v Wells et al., Nucleic Acids Research, vol. II, 7911 - 7925 (1983), zahrnuto zde odkazem.
Varianty vynálezu
Ve vynálezu byly objeveny tři epitopální regiony v serinových proteasách, které odpovídají pozicím 103 až 126 (zde označen jako první epitopální region), 220 až 246 (zde označen jako druhý epitopální region) a 70 až 84 (zde označen jako třetí epitopální region) subtilisinu BPN'. Ve vynálezu bylo dále objeveno, že jedna nebo více delecí aminokyselin anebo substitucí v jednom nebo více epitopálních regionech poskytují varianty, které vyvolávají snížení alergické anebo imunní odezvy vzhledem k odpovídající nekultivované serinové protease.
Variantu lze ve vynálezu ustanovit podle odstraněných aminokyselinových pozic, které charakterizují variantu. Například varianta serinové proteasy, která má odstraněnu pozici 104, která odpovídá subtilisinu BPN', je ustanovena jako D 104. Dalším příkladem je varianta serinové proteasy, která má odstraněny pozice 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 112, 113, 114, 116, 117, 118, 119, 123 a 125, které odpovídají subtilisinu BPN', a kterou lze ustanovit jako D 104-110, 112-114, 116-119, 123, 125. Podobně substituce lze označit ustanovením nekul ti vo váného aminokyselinového zbytku, kterým substituujeme, následně číslem pozice, dále aminokyselinovým zbytkem, kterým substituujeme. V případě, že aminokyselinový ·>· · »« I» ·· • 9 9 • ·<·♦·» • 9 9 9 • 9 9 9
99
9 ·
C · «
9 9
9 9 9
99
99
9 9 9
9 9 · 9
9 9
9999 zbytek, který substituujeme, je jakákoli přírodní aminokyselina, je ustanoven symbol Varianta s několikanásobnou substitucí je oddělena symbolem Pro ilustraci, substituce alaninu za asparagin v pozici 109 je ustanovena buď jako AsnlO9Ala nebo N109A. Varianta, která obsahuje delece i substituce, je ustanovena kombinací shora zmíněných ustanovení. Například varianta, která má substituci obou pozic , 109 a 122, stejně jako deleci v pozici 104 je ustanovena jako D 104, N109A + I122A nebo D104, AsnlO9Ala + Ilel22Ala.
Vynalezené varianty jsou varianty proteas podobných subtilisinu. Výraz „proteasa podobná subtilisinu“ zde označuje proteasu, která má nejméně 50 %, výhodně 80 % sekvence aminokyselin shodné se sekvencí subtilisinu BPN'. Nekultivované proteasy podobné subtilisinu produkují například mikroorganismy Bacillus alcalophillus, Bacillus amyloliquef aciens, Bacillus amylosaccharicus, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus a Bacillus subtilis. Diskusi, která se týká protes podobných subtilisinu a jejích homologů, lze nalézt v Siezen et al., „Homology Modelling a Protein Engineering Stratégy of Subtilases, the Family of Subtilisin-Like Serine Protease“, Protein Engineering, vol. 4, č. 7, str. 719 až 737 (1991).
Vynalezené varianty jsou varianty seronivých proteas, které mají modifikovanou sekvenci aminokyselin z původní nekultivované aminokyselinové sekvence, nekultivovaná sekvence obsahuje první epitopální region, druhý epitopální region a třetí epitopální region, kde modifikovaná sekvence aminokyselin obsahuje deleci jedné nebo více pozic v jednom nebo více epitopálních regionech, kde :
(a) pokud se delece vyskytuje v prvním epitopálním regionu, jedná se o deleci jedné nebo více pozic 103,104,105, 106, 107,108, 109,110, 111, 112, 113,114, 115,116,117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125 a 126, které odpovídají subtilisinu BPN';
(b) pokud se delece vyskytuje v druhém epitopálním regionu, jedná se o deleci jedné nebo více pozic 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 244, 245 a 246, které odpovídají subtilisinu BPN'; a (c) pokud se vyskytuje delece v třetím epitopálním regionu, jedná se o deleci jedné nebo více pozic 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83 a 84, které odpovídají subtilisinu BPN'.
Pokud se delece vyskytuje v prvním epitopálním regionu, jedná se výhodně o deleci jedné nebo více pozic 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 112, 113, 114, 116, 117, 118, 119, 123 a 125, které odpovídají subtilisinu BPN'. Při zvláště výhodném provedení je delece přinejmenším v pozici 114 odpovídající subtilisinu BPN'.
···» ·* ·· • · • ··« • · · • ♦ · ·· • · · • · · • · · · • · · · ·« ·· ·· • · # · • · · • · · • · · ·· ····
Pokud se delece vyskytuje v druhém epitopálním regionu, jedná se výhodně o deleci jedné nebo více pozic 220, 221,222, 223, 224, 225, 227, 228, 229, 230, 231,232, 233, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245 a 246, které odpovídají subtilisinu BPN'.
Pokud se delece vyskytuje v třetím epitopálním regionu, jedná se výhodně o deleci jedné nebo více pozic 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81 a 82, které odpovídají subtilisinu BPN'. Výhodněji se jedná o deleci jedné nebo více pozic 70, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81 a 82, které odpovídají subtilisinu BPN'. Ještě výhodněji se jedná o deleci jedné nebo více pozic 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81 a 82, které odpovídají subtilisinu BPN'. Nejvýhodněji se jedná o deleci jedné nebo obou pozic 78 a 79. Výhodné vynalezené varianty zahrnují ty, které obsahují D 70, 75-82; D 75-82; D 70, 78, 79; D 70; D 75; D 76; D 78; D 79; D 81 nebo D 82. Výhodnější varianty zahrnují ty, které obsahují D 70, 75-82; D 75-82; D 70, 78, 79; D 70; D 78 nebo D
79.
Ve výhodnějším provedení vynálezu mají varianty modifikované aminokyselinové sekvence z původní nekultivované sekvence aminokyselin, nekultivovaná sekvence obsahuje první epitopální region a druhý epitopální region, kde modifikovaná sekvence aminokyselin obsahuje deleci jedné nebo více pozic v jednom či vice epitopálních regionech, kde (a) pokud se delece vyskytuje v prvním epitopálním regionu, jedná se o deleci jedné nebo více pozic 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 112, 113, 114, 116, 117, 118, 119, 123 a 125, které odpovídají subtilisinu BPN';
(b) pokud se delece vyskytuje v druhém epitopálním regionu, jedná se o deleci jedné nebo více pozic 220, 221, 222, 223, 224, 225, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 239, 240, 242,
243, 244,245 a 246, které odpovídají subtilisinu BPN'.
V jiném výhodném provedení vynálezu mají varianty modifikované aminokyselinové sekvence z původní nekultivované sekvence aminokyselin, nekultivovaná sekvence obsahuje první epitopální region a druhý epitopální region, kde modifikovaná sekvence aminokyselin obsahuje deleci jedné nebo více pozic v jednom či vice epitopálních regionech, kde (a) pokud se delece vyskytuje v prvním epitopálním regionu, jedná se o deleci jedné nebo více pozic 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 112, 113, 115, 114, 116, 117, 118, 119,
120, 121, 122, 123, 124, 125 a 126, které odpovídají subtilisinu BPN';
(b) pokud se delece vyskytuje v druhém epitopálním regionu, jedná se o deleci jedné nebo více pozic 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235,
236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245 a 246, které odpovídají subtilisinu BPN', výhodně pozice 220, 221, 222, 223, 224, 225, 227,228, 229, 230, 231, 232,233,239, 240, 241, 242, 243, 244,245 a 246, které odpovídají subtilisinu BPN'.
• · • · · · « · • · · · • · · · · · · ····· · · · · · · ······· ····· ' ··········· ·· ·· e· ·· ·· ····
V více výhodnějším provedení vynálezu mají varianty modifikovanou sekvenci aminokyselin z původní nekultivované aminokyselinové sekvence, nekultivovaná sekvence obsahuje první epitopální region, druhý epitopální region a třetí epitopální region, kde modifikovaná sekvence aminokyselin obsahuje deleci jedné nebo více pozic ve dvou nebo více epitopálních regionech, kde :
(a) pokud se delece vyskytuje v prvním epitopálním regionu, jedná se o deleci jedné nebo více pozic 103,104,105, 106, 107, 108, 109,110,111, 112,113, 114, 115,116, 117, 118,
119, 120, 121, 122, 123, 124, 125 a 126, které odpovídají subtilisinu BPN'; výhodně pozice 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 112, 113, 114, 116, 117, 118, 119, 123 a 125, které odpovídají subtilisinu BPN';
(b) pokud se delece vyskytuje v druhém epitopálním regionu, jedná se o deleci jedné nebo více pozic 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235,
236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 244, 245 a 246, které odpovídají subtilisinu BPN', výhodně pozice 220, 221, 222, 223, 224, 225, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233,239, 240,
242, 244, 245 a 246, které odpovídají subtilisinu BPN'; a (c) pokud se vyskytuje delece v třetím epitopálním regionu, jedná se o deleci jedné nebo více pozic 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83 a 84, které odpovídají subtilisinu BPN', výhodně pozice 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81 a 82, které odpovídají subtilisinu BPN', výhodněji pozice 70, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81 a 82, které odpovídají subtilisinu BPN', a nejvýhodněji pozice 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81 a 82, které odpovídají subtilisinu BPN'.
V tomto provedení fráze „delece jedné nebo více pozic ve dvou nebo více epitopálních regionech“ znamená, že v jednom epitopálním regionu definovaném v přihlášce je delece jedné nebo více pozic, v jiném epitopálním regionu definovaném v přihlášce je delece jedné nebo více pozic a ve zbývajícím epitopálním regionu definovaném v přihlášce je volitelná delece jedné nebo více pozic.
Vynalezené varianty mohou případně spolu s jednou nebo více delecemi dále obsahovat substituci jedné nebo více pozic 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 103,
104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122,
123, 124, 125,126,220, 221, 222, 223, 224, 225, 226,227,228, 229, 230,231,232, 233,234,
235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 244, 245 a 246, které odpovídají subtilisinu BPN'.
Mezi těmito pozicemi je výhodná substituce jedné nebo více pozic 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79,
80, 81 a 82, které odpovídají subtilisinu BPN'; výhodněji jedné nebo více pozic 70, 75, 76,
77, 78, 79, 80, 81 a 82, které odpovídají subtilisinu BPN', ještě výhodněji jedné nebo více • · • · • · · pozic 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81 a 82, které odpovídají subtilisinu BPN', a nej výhodněji jedné nebo obou pozic 78 a 79. Samozřejmě pokud je v kterékoli pozici provedena delece, nelze v téže pozici provést substituci. Substituce v jedné nebo více těchto předcházejícíh pozic se provádí nahrazením nekultivováného aminokyselinového zbytku jiným přírodním aminokyselinovým zbytkem, jak je uvedeno v tabulce I.
Jednu nebo více přídavných substitučních mutací („stabilizační substituce“) lze provést v kterékoli pozici serinové proteasy, aby se například restabilizovala proteasa po mutaci epitopálního regionu nebo aby se zvýšila proteolytická aktivita dané varianty. Mnoho takových stabilizačních mutací je v oboru známo. Příklady takových stabilizačních mutací jsou popsány například v WO 95/10 591, Baeck et al., publikováno 20. dubna 1995; U.S. pat. č. 4 914 031, Zukowski et al., vydáno 3. dubna 1990; U.S. pat. č. 5 470 733, Bryan et_al., vydáno 28. listopadu 1995; U.S. pat. č. 5 567 601, Bryan et al., vydáno 22. října 1996; WO 89/07 642, U.S. pat. č. 5 707 848, Bryan et al., vydáno 13. ledna 1998; Van Eekelen et al., publikováno 24. srpna 1989; WO 87/04 461, Stabinsky et al., publikováno 30. července 1987; U.S. pat. č. 4 760 025, Estell et al., vydáno 26. července 1988; WO 92/11 348, Branner et al., publikováno 9. července 1992; EP 0 405 901, Casteleiin et al., publikováno 2. ledna 1991; WO 91/00 345, Branner et al., publikováno 10. ledna 1991 a WO 94/10 020, Brode et al., publikováno 23. března 1995.
Výhodné stabilizační mutace zahrnují jednu nebo více z následujících: II07V;
K213R; Y217L; Y217K; N218S; G169A; M50F; Q19E; P5A; S9A; BIL; E156S; G169A; N212G; S188P; T254A; S3C + Q206C; a Q271E. Výhodnější stabilizační mutace zahrnují jednu nebo více z následujících: P5A; S9A;
I31L; E156S; G169A; N212G; S188P; T254A; S3C + Q206C; Q271E; Y217L; a Y217K. Nejvýhodnější mutace zahrnují Y217L a Y217K.
Způsob přípravy
Varianty se připravují mutací nukleotidové sekvence, která kóduje nekultivované serinové proteasy, což vede k variantám, které mají modifikovanou sekvence aminokyselin. Takové způsoby jsou v oboru dobře známy; jeden z těchto způsobuje popsán níže :
Fagemid (pSS-5) obsahující nekultivovaný gen subtilisinu BPN' (Mitchison, C. a J.A.
Wells, Protein Engineenng of Disulfide Bonds in Subtilisin BPN', Biochemistry, vol. 28, str. 4 807 až 4815, 1989) je přenesen do kmene CJ236 Escherichia coli DUT- UNG- a jedno vláknový templát DNA s uracilem se vytvoří použitím pomocného fágu VCSM13 • · · · ··· · · · · · · · t · ··· · · · ·· · η ♦······ · · · · · y ··········· ·· ·· ·· ·· · · ···· (Kunkel et al., „Rapid and Efficient Site-Specific Mutagenesis Withiut Phenotypic Selection“, Methods in Enzymology, vol. 154, str. 367 až 382, 1987) a je modifikován podle Yuckenberg et al., „Site-Directed in vitro Mutagenesis Using Uracil-Containing DNA and Phagemid Vectors“, Directed Mutagenesis - A Practical Approach, McPherson, M.J., editor, str. 27 až 48 (1991). Úvodní místně řízená mutagenese modifikovaná podle metody Zollera a Smitha (Zoller, M.J. a M.Smith, „Oligonucleotide - Directed Mutagenesis Using M13 - Derived Vectors: An Efficient and General Proceduře for the Production of Point Mutations in any Fragment of DNA“, Nucieic Acid Research, vol. 10, str. 6487 až 6500, 1982) byla použita k přípravě všech mutantů (v podstatě podle již zmíněné práce Yuckenberga et al.).
Oligonukleotidy se vyrábí použitím 380B DNA syntetizátoru (Applied Biosystems lne.).
Reakční produkty mutagenese se přemístí do kmene MM294 Escherichia coli (American Type Culture Collection E. coli 33 625). Všechny mutace se potvrdí sekvencováním DNA a isolovaná DNA se umístí do kmene PG632 Bacillus subtilis (Sauners et ak, „Optimization of the Signal-Sequence Cleavage Site for Secretion from Bacillus subtilis of a 34-amino acid Fragment of Human Parathyroid Hormone“, Gene, vol. 102, str. 277 až 282,1991; and Yang et al., „Cloning of the Neutrál protease Gene of Bacillus subtilis and the Use of the Cloned Gene to Create an in vitro-T)eňveá Deletion Mutation“, Journal of Bacteriology, vol. 160, str.
až 21, 1984). Předběžné posouzení aktivity varianty je určeno schopností PG632 buněk přenesených plasmidy mutantů hydrolyzovat kasein.
Fermentace probíhá podle následujícího popisu. Buňky Bacillus subtilis (PG632), které obsahují zkoumanou variantu, rostou v MID-LOG fázi v litrovém LB bujónu, který obsahuje 10 g/1 glukosy, a poté je naočkován na fermentor Biostat C (Braun Biotech, lne., Allentown,
PA) v celkovém objemu 9 litrů. Fermentační médium obsahuje kvasnicový extrakt, kaseinový hydrolyzát, rozpustný, částečně hydrolyzovaný škrob (Maltrin M-250), ANTIFOAM, pufry a stopové minerály (viz. „Biology of Bacilli: Applications of Industry“, Doi, R.H. and M. McGloughlin, eds. 1992). V bujónu je během fermentace udržováno pH 7,5. Kanamycin (50 pg/l) se přidá k antibiotické selekci mutovaného plasmidu. Buňky rostou 18 hodin při 37°C na Aeoo 60 a produkt je sklizen.
Fermentační bujón je zpracován podle následujících kroků tak, aby se získala čistá varianta. Bujón je vyčištěn od buněk Bacillus subtilis tangenciálním tokem přes 0,16 pm membránu.
Bujón zbavený buněk je poté koncentrován ultrafiltrací přes přerušovanou membránu s molekulovou hmotností 8000. Koncentrovaným MES pufrem (2-(N-morfolin)ethansulfonová kyselina) se upraví pH na 5,5 . Varianta je dále čištěn • · • · · ·
iontoměničovou chromatografii s S-sefarosou a vymýváním s gradienty NaCl. (viz. Scopes, R.K., „Protein Purification principles and Practice“, Springer-Verlag, New York, 1984).
K určení koncentrace aktivních variant ve frakcích odebraných při gradientovém vymývání se používá kvantitativní rozbor /4NA (UdelMar et al., Analytical Biochemistry, vol. 99, str. 316 až 320, 1979). Tento rozbor měří množství p-nitroanilinu, který se uvolňuje, když varianta hydrolyzuje rozpustný syntetický substrát, sukcinyl-alanin-alanin-prolin-fenylalaninp-nitroanilin (sAAPF-pNA). Množství žluté látky uvolněné z hydrolytické reakce se měří při 410 nm na spektrometru a odpovídá koncentraci aktivního enzymu. Dále se používají měření absorbance při 280 nm k určení celkové koncentrace proteinu. Poměr množství aktivního enzymu a celkového množství proteinu udává čistotu varianty a používá se k určení frakcí, které se slijí dohromady jako zásobní roztok.
Proto, aby se předešlo autolýze varianty během skladování, přidá se ke slitým frakcím získaným z chromatografické kolony propylenglykol ekvivalentní hmotnosti. Po dokončení čistící procedury se čistota zásobního roztoku varianty určí pomocí SDS-PAGE (elektroforesa v polyakrylamidovém gelu modifikovaném dodecylsulfátem sodným) a celková koncentrace enzymu se určí metodou titrace aktivních míst použitím trypsinového inhibitoru typu II-T : krůtí vaječný bílek (Sigma Chemical Co., St.Louis, Missouri).
Při přípravě k použití je zásobní roztok enzymu promyt přes Sephadex-G25 (Pharmacia, Piscataway, New Jersey) ve vylučovací koloně a odstraní se tak propylenglykol a změní pufr. MES pufr v zásobním roztoku enzymu se vymění za 0,1 M tzv. trispufr (tris(hydroxymethyl)aminomethan), který obsahuje 0,01 M CaCl2 a mápH upravené chlorovodíkovou kyselinou na 8,6. Všechny experimenty se provádí při pH 8,6 v trispufru při teplotě 25°C.
Analytické metody
Vynalezené varianty lze testovat na enzymatickou aktivitu a imunní anebo alergenickou odezvu použitím následujících metod, obě jsou osobě z oboru dobře známé. Lze také použít i jiné metody v oboru dobře známé.
Aktivita varianty
Proteasová aktivita vynalezené varianty se kvantitativně určí metodami dobře známými v oboru. Dvě takové metody jsou níže popsány :
• · · · «· • · · · · • · · · · · · · • · · » · · · • · · · · 9 9
9 9 · · 9 Λ 9
9 9
9 9 · • *
Metoda určení aktivity při odlupování kůže
S použitím pásku Scotch® #3750G se odeberou z nohou subjektu lidské kožní šupiny, opakovaně, až je pásek v podstatě neprůhledný. Pásek je poté rozřezán na čtverečky o straně 2,5 cm a ty jsou ponechány stranou. Na petriho misku o průměru 10 mm až 35 mm se dají 2 ml roztoku kontrolního enzymu (například subtilisinu BPN') nebo testované varianty o koncentraci 0,75 mg/ml v 0,01 Μ KH2PO4 pufru o pH 5,5. K tomuto roztoku se přidá 1 ml 2,5% laurátu sodného o pH 8,6. Roztok se jemně míchá v plošné třepačce. Předem připravený čtvereček pásku se namočí v roztoku (stranou s šupinami nahoru) na deset minut za stálého jemného míchání. Čtvereček pásku se poté jemně oplachuje ve vodě z kohoutku po dobu 15 sekund. Na čistou petriho misku je odpipetován Stevenelovo modré barvivo (3 ml, komerčně dostupný u Sigma Chemical Co., St,Louis, MO). Omytý čtvereček je dán do barviva (stranou s šupinami nahoru) na tři minuty za jemného míchání. Čtvereček se z barviva odstraní a opláchne se ve dvou kádinkách s 300 ml destilované vody, každé opláchnutí trvá 15 sekund. Čtvereček se ponechá sušit na vzduchu. Intenzita barvy mezi čtverečkem získaným z kontrolního enzymu a čtverečkem s variantou se srovnají vizuálně nebo chromometrem. Vzhledem ke čtverečku z kontrolního enzymu je čtvereček s variantou méně intenzivně barevný, což ukazuje na vyšší aktivitu varianty.
Metoda měření aktivity s použitím barevného kolagenu ml 0,1 M roztoku trispufru (tris-hydroxymethyl-aminomethan) obsahujícího 0,01 M CaCL k získání pH 8,6 se smíchá s 0,5 g azocollu (kolagen impregnovaný azobarvivem, komerčně dostupný u Sigma Chemical Co., St,Louis, MO). Tato směs se inkubuje při 25°C za jemného míchání v plošné třepačce. 2 ml směsi se filtrují přes syringový filtr (0,2 MICRON) a odečte se absorbance směsi při 520 nm k vynulování spektrofotometru. K zbývajícím 48 ml směsi trispufru a azacollu se přidá 1 ppm kontrolního enzymu (například subtilisinu BPN') nebo testované varianty. 2 ml roztoku obsahujícího kontrolní enzym nebo variantu se přefiltruje přes syringový filtr (0,2 MIKRON) každé dvě minuty v celkovém čase deset minut. Pro každý filtrovaný vzorek se odečte okamžitě absorbance při 520 nm. Výsledky se zanesou do grafu proti času. Směrnice kontrolního a testovaného konjugátu ukazují relativní aktivity vzorků. Vyšší směrnice znamená vyšší aktivitu. Aktivitu testované varianty (směrnice) lze vyjádřit jako procento aktivity kontrolního vzorku (směrnice).
•0 ·· ·· ···· 0· ·· 000 0· 0 0 0 0 0 0000· 0· 0 0· * 0 00 000 0 000 0 0 «0 00 00 ·0 0· 0000
Intranasální test imunogenicity na myších
Imunogenní potenciál vynalezených variant serinové proteasy lze určit použitím metod známých v oboru nebo intranasálním testem imunogenicity na myších tak, jak je popsán níže. Tento test je podobný kvantitativním rozborům popsaným v Robinson et al., „Specific Antibody responses to Subtilisin Cerlsberg (Alcalase) in Mice: Development of an Intranasal Exposure Model“, Fundamental and Applied Toxicology, vol. 34, str. 15 až 24 (1996) a Robinson et al., „Use of the Mouše Intranasal Test (MINT) to Determine the Allergenic Potency of Detergent Enzymes: Comparison to the Guinea Pig Intratracheal (GPIT) Test“, Toxicological Science, vol. 43, str. 39 až 46 (1998), oba z těchto kvantitativních rozborů lze využít namísto testu popsaném níže.
V testu se použijí myší samičky BDF1 (Charles River Laboratories, Portage, MI) vážící od do 20 gramů. Myši jsou před podáním dávky dány do karantény. Myši se umístí v klecích s podestýlkou z dřevěných pilin v místnostech s kontrolovanou vlhkostí (30 - 70 %), teplotou (19-25 °C) a dvanáctihodinovými cykly světla a tmy. Myši se krmí myším žrádlem zn. Purina® (Purina Mills, Richmond, IN) a vodou ad libitum.
Testovaný potenciální antigen (buď subtilisin BPN' jako positivní kontrola nebo vynalezené varianta) se dávkuje skupině pěti myší. Před podáním dávky je každá myš zanestetizována intraperitoneální (i.p.) injekcí směsi Ketasetu (88,8 mg/kg) a Rompunu (6,67 mg/kg). Zanestetizované zvíře se drží skloněné v dlani a intranasálně se mu podá dávka 5 ml proteasy v roztoku pufru (0,01 Μ KH2PO4, pH 5,5). I když každá skupina dostává tytéž dávky, lze testovat dávky různé. Dávkovači roztoky jsou jemně umístěny na vnější straně myší nozdry. Dávkování se opakuje 3., 10., 17. a 24. den .
Vzorky séra jsou shromážděny v 29. dnu. Specifická enzymová protilátka IgGl v myším séru se měří metodou ELISA, při níž se zachycují antigeny. Imunogenicity varianty lze srovnat s imunogenicitami subtilisinu BPN'za použití standardních ED5o objemů.
Vynalezené prostředky
Vynalezené varianty lze použít v jakékoli aplikaci vhodné pro příslušnou nekultivovanou proteasu. Jeden takový příklad zahrnuje čistící prostředky. Vynalezené varianty lze díky jejich požadovaným sníženým alergenním anebo imunogenním vlastnostem použít v aplikacích, které byly minimálně prospěšné z hlediska použití proteas. Příklady takových aplikací • · • 9 · · · · ·· ·· • · 9 9 *
9 · • · 9 9 9 zahrnují ty, v nichž dochází k nevyhnutelnému přímému kontaktu s lidskou kůží, jako jsou prostředky k osobní ochraně.
Čistící prostředky
Varianty lze použít v čistícím prostředcích, které zahrnují, ale nejsou tímto nijak omezeny, prací prostředky, prostředky k čištění tvrdých povrchů, lehké čistící prostředky zahrnující prostředky na nádobí, a detergentní prostředky pro myčky na nádobí.
Čistící prostředky zde zahrnují účinné množství jednoho nebo více vynalezených variant a nosiče pro čistící prostředky.
Výraz „účinné množství varianty“, nebo výraz podobný označují v přihlášce množství varianty nezbytné k dosažení proteolytické aktivity potřebné ve specifickém čistícím prostředku. Taková účinná množství jsou pro průměrného odborníka v oboru snadno zjistitelná a jsou závislá na mnoha faktorech, jako je konkrétní použitá varianta, druh čištění, specifický prostředek v čistícím prostředku a zda má být prostředek kapalný nebo pevný, suchý (např. ve formě granulí, kostek) a podobně. Výhodně obsahuje čistící prostředek 0,0001 % až 10 %, výhodněji 0,001 % až 1 % a nejvýhodněji 0,01 % až 0,1 % jedné či více vynalezených variant. Několik příkladů různých čistících prostředků, v nichž jsou použity varianty, je popsáno detailně níže.
Vedle vynalezených variant obsahuje vynalezený čistící prostředek nosič pro čistící prostředky, který obsahuje jeden nebo více materiálů pro čistící prostředky, které jsou kompatibilní s variantou. Výraz „materiál pro čistící prostředky“ v přihlášce znamená jakýkoli materiál vybraný pro daný konkrétní typ čistícího prostředku a formu produktu (např. kapalinu, granuli, kostku, spray, tyčinku, pastu, gel), přičemž materiály jsou také kompatibilní s variantou použitou v prostředku. Specifický výběr materiálů pro čistící prostředky se snadno provede podle materiálu, který se má čistit, podle požadované formy čistícího prostředku a podmínek během čištění. Výraz „kompatibilní“ v přihlášce použitý znamená, že materiály pro čistící prostředky nesnižují proteolytickou aktivitu varianty natolik, že by neměla požadovanou účinnost při běžných čistících situacích. Detailně jsou specifické materiály pro čistící prostředky uvedeny níže.
Vynalezené varianty lze použít v široké paletě detergentních prostředků, u nichž se vyžaduje vysoká pěnivost a dobrá proteolytická aktivita. Varianty lze tudíž použít s různými konvenčními přísadami a poskytnout tak plně formulované čističe tvrdých povrchů, prostředky pro myčky na nádobí, prostředky na praní tkanin a podobně. Takové prostředky • · · · · · · · · · · · · · «·· · · · » ·· ♦ • · · · · · · ♦ · · · «· ·· «· ·· ·· ···· jsou ve formě kapalin, granulí, kostek a podobně. Takové prostředky lze formulovat jako „koncentrované“ prostředky, které obsahují 30 % až 60 % surfaktantů, procenta jsou hmotnostní.
Čistící prostředky v přihlášce případně a výhodně obsahují různé surfaktanty (např. aniontové, kationtové a zwitterionické surfaktanty). Takové surfaktanty jsou obsaženy obvykle v množství 5 % až 35 %, vztaženo na hmotnost prostředků.
Příklady surfaktantů, které ale nejsou tímto nijak omezeny, zde zahrnují obvyklé Cn až Cig alkylbenzensulfonáty a primární a větvené alkylsulfáty, Cio až Cig sekundární 2-alkylsulfáty nebo 3-alkylsulfátyobecného vzorce CH3(CH2)X(CHOSO3'M+)CH3 a
CH3(CH2)y(CHOSO3’M+)CH2CH3, kde x a (y+1) jsou celá čísla a to nejméně 7, výhodně nejméně 9, a M je kation, který udílí rozpustnost ve vodě, zvláště sodný kation, Cjo až Cig alkylalkoxysulfáty (zvláště pak EO 1-5 ethoxysulfáty), Cjo až Cjg alkylalkoxykarboxyláty (zvláště EO 1-5 ethoxykarboxyláty), Cjo až Cig alkylpolyglykosidy ajejich odpovídající sulfatované polyglykosidy, Ci2 až Cig sulfonované estery mastných kyselin, Ci2 až Cig alkyl a alkylfenolalkoxyláty (zvláště ethoxyláty a alkoholáty se směsí ethoxy a propoxyskupin), Ci2 až Cjg betainy a sulfobetainy („sultainy“), C]2 až Cig aminoxidy a podobně. V přihlášce jsou výhodné alkylalkoxysulfáty (AES) a alkylalkoxykarboxyláty (AEC). Použití těchto surfaktantů v kombinaci s aminoxidem anebo betainem nebo sultainovým surfaktantem je také výhodné a to v závislosti na požadavcích formulace. Další užitečné konvenční surfaktanty jsou popsány v standardních textech. Zvláště užitečné surfaktanty zahrnují Cio až Cig N-methylglukamidy popsané v U.S. pat. č. 5 194 639, Connor et al., vydáno 16. března 1993.
Široká škála dalších přísad užitečných v detergentních čistících prostředcích, které lze použít ve vynalezených prostředcích, zahrnuje například další aktivní přísady, nosiče, hydrotropy, ošetřovací pomůcky, barviva nebo pigmenty a rozpouštědla pro kapalné prostředky. Pokud je potřeba přídavná pěnivá přísada, lze do prostředků přidat pěnivé látky jako jsou Cio až Ci6 alkolamidy, typicky v množství 1 % až 10 %. Cio až Cumonoethanol a diethanolamidy jsou typickými třídami takových pěnivých látek. Použití těchto pěnivých látek s vysoce pěnivými přídavnými surfaktanty jako jsou aminoxidy, betainy a sultainy, které jsou výše popsány, je také výhodné. Do prostředků se přidávají, pokud je tak požadováno, rozpustné hořečnaté soli jako MgCl2, MgSC>4 a podobně v typických množstvích 0,1 % až 2 % a zvýší se tak pěnivost.
V přihlášce použité kapalné detergentní prostředky obsahují jako nosiče vodu a jiná rozpouštědla. Vhodné jsou nízkomolekulámí primární nebo sekundární alkoholy jako •· ·· ·· ···· ·· « · · · · · « ····· · · · · ·
ÍÍÍJ*J5*J*Í· • · · · ·· · · · * například methanol, ethanol, propanol a wo-propanol. Pro rozpustnost surfaktantů jsou výhodné monohydroxyalkoholy, ale polyoly, které obsahují 2 až 6 atomů uhlíku a 2 až 6 hydroxylových skupin (např. 1,3-propandiol, ethylenglykol, glycerin a 1,2-propandiol), lze také použít. Prostředky obsahují 5 % až 90 %, typicky 10 % až 50 % takových nosičů.
Detergentní prostředky použité v přihlášce jsou výhodně takové, že během použití při vodných čistících operacích bude mít čistící voda pH mezi 6,8 až 11. Konečné produkty jsou typicky formulovány v tomto rozmezí. Techniky pro kontrolu pH, které se má pohybovat v doporučeném rozmezí, zahrnují například použití pufrů, alkálií a kyselin. Pro odborníka v oboru jsou tyto techniky dobře známy.
Při formulování vynalezených prostředků na čištění tvrdých povrchů a prostředků na čistění tkanin lze využít různých stavebních látek v množstvích 5 % až 50 % hmotnostních. Typické stavební látky zahrnují zeolity o velikosti 1 až 10 mikronů, polykarboxyláty jako citráty a oxydisukcináty, vrstvené silikáty, fosfáty a podobně. Další konvenční stavební látky jsou popsány v standardních předpisech.
V těchto prostředcích lze využít i různé přídavné enzymy jako jsou celulasy, lipasy, amylasy a proteasy, typicky v množstvích od 0,001 % do 1 % hmot. Různé čistící enzymy a enzymy k ochraně tkanin jsou v oboru pracích prostředků dobře známy.
Ve vynalezených prostředcích se používají různé bělící prostředky, jako jsou perkarbonáty, perboráty a podobně, typicky v množstvích 1 % až 15 % hmot. Pokud je potřeba, obsahují vynalezené prostředky také bělící aktivátory jako jsou tetraacetylethylendiamin, nonanoyloxybenzensulfonát a podobně, které jsou v oboru dobře známé. Používají se typicky v rozmezí 1 % až 10 % hmot.
Ve vynalezených prostředcích se používají také uvolňovače hlíny, zvláště pak uvolňovače aniontového oligosterového typu, chelatační činidla, zvláště aminofosfáty a ethylendiamindisukcináty, činidla odstraňující jíl, zvláště ethoxylovaný tetraethylenpentamin, dispersní činidla, zvláště polyakryláty a polyaspartáty, činidla dodávající jas, činidla potlačující tvorbu mydlin, zvláště silikony a sekundární alkoholy, změkčovadla tkanin, zvláště smektické jíly a podobně, Výše uvedené přísady se používají ve vynalezených prostředcích v množství 1 % až 35 % hmot. Standardní předpisy a publikované patenty obsahují rozsáhlé a detailní popisy takových konvenčních materiálů.
V čistících prostředcích lze použít i enzymové stabilizátory. Takové enzymové stabilizátory zahrnují propylenglykol (výhodně 1 % až 10 %), formiát sodný (výhodně 0,1 % až 1 %) a formiát vápenatý (výhodně 0,1 % až 1 %).
4 4 4 · · 4 4 4 « • 4 · · 4 ·· 9 9 9 9
Α 4444444 44444 * V 4444 4444 444
44 44 44 44 4444
Vynalezené varianty jsou užitečné v prostředcích k čištění tvrdých povrchů. Výraz „prostředek k čištění tvrdých povrchů“ v přihlášce označuje kapalný a granulovaný detergentní prostředek k čištění tvrdých povrchů jako jsou podlahy, zdi, koupelnové kachle a podobně. Vynalezené prostředky k čištění tvrdých povrchů obsahují účinné množství jednoho nebo více vynalezených variant, výhodně 0,001 % až 10 %, výhodněji 0,01 % až 5 %, ještě výhodněji 0,05 % až 1 % hmot. varianty v prostředku. Vedle jedné nebo více variant obsahují takové prostředky k čištění tvrdých povrchů typicky také surfaktant a ve vodě rozpustnou izolující stavební látku. V určitých speciálních produktech jako jsou spreje na čištění oken se však surfaktanty někdy nepoužívají, protože zanechávají filmy anebo pruhy na povrchu skla.
Pokud je surfaktant použit, je obsažen v množství třeba jen 0,1 % vynalezeného prostředku, ale typicky je obsah 0,25 % až 10 %, výhodně 1 % až 5 % surfaktantu.
Prostředky typicky obsahují 0,5 % až 50 % detergentní stavební látky, výhodně je to 1 % až 10%.
Výhodně by se pH mělo pohybovat v rozmezí 7 až 12. Pokud je nezbytná úprava pH, lze použít konvenční činidla k úpravě pH jako jsou hydroxid sodný, uhličitan sodný nebo chlorovodíková kyselina.
Prostředky mohou obsahovat také rozpouštědla. Užitečná rozpouštědla zahrnují, ale nejsou tímto nijak omezena, glykolethery, jako jsou diethylenglykolmonohexylether, diethylenglykolmonobutylether, dipropylenglykolmonobutylether, a dioly, jako jsou 2,2,4trimethyl-l,3-pentandiol a 2-ethyl-l,3-hexandiol. Pokud jsou rozpouštědla použita, pak typicky v množství 0,5 % až 15 %, výhodně 3 % až 11 %.
K usnadnění rychlejšího odpařování prostředku z povrchu, který není omyt po aplikaci prostředku na povrch „v plné síle“, se používají ve vynalezených prostředcích dále vysoce těkavé rozpouštědla jako jsou iso-propano] a ethanol. Pokud jsou použity těkavé rozpouštědla, pak typicky v množství 2 % až 12 % v prostředcích.
Příklady provedení vynálezu
Vynalezené prostředky k čištění tvrdých povrchů jsou ilustrovány na následujících příkladech.
·· ·· • · · · ·
9 9 9
9 9 9 9 · '9 9
Příklady 1 až 6 : Prostředky k čištění tvrdých povrchů
Př. 1 Př.2 Př.3 Př.4 Př.5 Př.6
Varianta D 108 0,05 % 0,50 % 0,02 % 0,03 % 0,30 % 0,05 %
EDTA - - 2,90 % 2,90 % - -
Citrát sodný - - - - 2,90 % 2,90 %
C12 alkylbenzensulfonát sodný 1,95% 1,95% 1,95%
C12 alkylsulfát sodný - 2,20 % - 2,20 % - 2,20 %
C12 ethoxyalkylsulfát sodný - 2,20 % - 2,20 % - 2,20 %
C]2 alkyldimethylaminoxid - 0,50 % - 0,50 % - 0,50 %
Kumensulfonát sodný 1,30% - 1,30% - 1,30% -
Hexylkarbitol 6,30 % 6,30 % 6,30 % 6,30 % 6,30 % 6,30 %
Voda 90,4 % 88,3 % 87,53 % 85,87 % 87,25 % 85,85 %
Všechna složení mají pH upraveno na 7.
V jiném provedení vynálezu obsahují prostředky k mytí nádobí jednu nebo více vynalezených variant. Výraz „prostředek k mytí nádobí“ v přihlášce označuje všechny formy prostředků k čištění nádobí, které zahrnují, ale nejsou tímto nijak omezeny, granulované a kapalné formy. Vynalezené prostředky k mytí nádobí jsou ilustrovány na následujících příkladech.
Příklady 7 až 10 : Kapalný detergent na nádobí
Př.7 Př.8 Př.9 Př. 10
Varianta D 223 0,05 % 0,50 % 0,02 % 0,40 %
C12 - C14 alkyl-N-methylglukamid 0,90 % 0,90 % 0,90 % 0,90 %
C12 ethoxyalkyl-1-sulfát 12,0 % 12,0% 12,0% 12,0 %
2-Methylundekanová kyselina 4,50 % 4,50 % 4,50 % 4,50 %
C12 ethoxyalkyl-2-carboxylát 4,50 % 4,50 % 4,50 % 4,50 %
C12 alkohol-4-ethoxylát 3,00 % 3,00 % 3,00 % 3,00 %
Ci2 alkylaminoxid 3,00 % 3,00 % 3,00 % 3,00%
Kumensulfonát sodný 2,00 % 2,00 % 2,00 % 2,00 %
Ethanol 4,00 % 4,00 % 4,00 % 4,00 %
Mg2+ (jako MgCl2) 0,20 % 0,20 % 0,20 % 0,20 %
Ca2+ (jako CaCl2) 0,40 % 0,40 % 0,40 % 0,40 %
Voda 65,45 % 65 % 65,48 % 65,1 %
4 ·4 4 4
444 44 4 4 4 4 4
44444 >4 4 44 4
44 444 4 4 4 4 4 4
Všechna složení mají pH upraveno na 7.
Vynalezené kapalné prostředky k čištění tkanin jsou ilustrovány na následujících příkladech.
Příklady 11 až 13 : Kapalné prostředky k čištění tkanin
Př. 11 Př. 12 Př. 13
Varianta Dl07, Y217K 0,05 % 0,03 % 0,30 %
C12 - Cm alkylsulfát sodný 20,0 % 20,0 % 20,0 %
2-Butyloktanová kyselina 5,0 % 5,0% 5,0 %
Citrát sodný 1,0% 1,0% 1,0%
C i2-alkohol-3 -ethoxylát 13,0% 13,0% 13,0%
Monoethanolamin 2,50 % 2,50 % 2,50 %
Voda/propylenglykol/ethanol (100:1:1) 58,45 % 58,47 % 58,20 %
Prostředky k osobní ochraně
Vynalezené varianty zvláště vyhovují použití v prostředcích k osobní ochraně, jako jsou například fixní a splachovací vlasové kondicionéry, šampóny, fixní a splachovací prostředky proti akné, obličejová mléka a kondicionéry, sprchové gely, mýdla, krémová a nekrémová obličejová čistidla, kosmetické přípravky, pleťové vody a hydratační krémy na ruce, tvář a tělo, fixní obličejové hydratační krémy, kosmetické a čistící tampony, prostředky k ochraně dutiny ústní a k ochraně kontaktních čoček. Vynalezené prostředky k osobní ochraně obsahují jeden nebo více vynalezených variant a nosič.
Pro ilustraci je třeba uvést, že vynalezené varianty je vhodné zahrnout do prostředků popsaných v následujících dokumentech : U.S. pat. č. 5 641 479; Linares et al„ vydáno 24. července 1997 (čističe kůže); U.S. pat. č. 5 599 549; Wivell et al., vydáno 4. února 1997 (čističe kůže); U.S. pat. č. 5 585 104; Ha et al., vydáno 17. prosince 1996 (čističe kůže); U.S. pat. č. 5 540 852; Kefauver et al., vydáno 30. července 1996 (čističe kůže); U.S. pat. č. 5,510,050; Dunbar et al., vydáno 23. dubna 1996 (čističe kůže); U.S. pat. č. 5 612 324; Guang Lin et al., vydáno 18. března 1997 (přípravky proti akné); U.S. pat. č. 5 587 176; Warren et al., vydáno 24. prosince 1996 (přípravky proti akné); U.S. pat. č. 5 549 888; Venkateswaran, vydáno 27. srpna 1996 (přípravky proti akné); U.S. pat. č. 5 470 884; Corless et al., vydáno
4· ··*· ·· ·· • · · · • · * • · 9
4499
28. listopadu 1995 (přípravky proti akné); U.S. pat. č. 5 650 384; Gordon et al., vydáno 22. července 1997 (sprchové gely); U.S. pat. č. 5 607 678; Moore et al., vydáno 4. března 1997 (sprchové gely); U.S. pat. č. 5 624 666; Coffindaffer et al., vydáno 29. dubna, 1997 (vlasové kondicionéry anebo šampóny); U.S. pat. č. 5 618 524; Bolich et al., vydáno 8. dubna 1997 (vlasové kondicionéry anebo šampóny); U.S. pat. č. 5 612 301; Inman, vydáno 18. března 1997 (vlasové kondicionéry anebo šampóny); U.S. pat. č. 5 573 709; Wells, vydáno 12. listopadu 1996 (vlasové kondicionéry anebo šampóny); U.S. pat. č. 5 482 703; Pings, vydáno 9. ledna 1996 (vlasové kondicionéry anebo šampóny); U.S. pat. č. Re. 34 584; Grote et al., znovu vydáno 12.dubna 1994 (vlasové kondicionéry anebo šampóny); U.S. pat. č. 5 641 493, Pate et al., vydáno 24.července 1997 (kosmetické přípravky); U.S. pat. č. 5 605 894, Blank et al., vydáno 25. února 1997 (kosmetické přípravky); U.S. pat. č. 5 585 090, Yoshioka et al., vydáno 17. prosince 1996 (kosmetické přípravky); U.S. pat. č. 4 939 179, Chenev et al., vydáno 3. července 1990 (pleťové vody na ruce, tvář a tělo); U.S. pat. č. 5 607 980, McAtee et al., vydáno 4. března 1997 (pleťové vody na ruce, tvář a tělo); U.S. pat. č. 4 045 364, Richter et al., vydáno 30. srpna 1977 (kosmetické a čistící tampony); European Patent Application, EP O 619 074, Touchet et al., publikováno 12. října 1994 (kosmetické a čistící tampony); U.S. Pat. č. 4 975 217, Brown-Skrobot et al., vydáno 4. prosince 1990 (kosmetické a čisticí tampony); U.S. pat. č. 5 096 700, Seibel, vydáno 17. března 1992 (prostředky k čištění dutiny ústní); U.S. pat. č.5 028 414, Sampathkumar, vydáno 2. července 1991 (prostředky k čištění dutiny ústní); U.S. pat. č.5 028 415, Benedict et al., vydáno 2. července 2, 1991 (prostředky k čištění dutiny ústní); U.S. pat. č. 5 028 415, Benedict et al., vydáno 2. července 1991 (prostředky k čištění dutiny ústní); U.S. pat. č. 4 863 627, Davies et al., 5.září 1989 (roztoky na čištění kontaktních čoček); U.S. pat. č. 36 672, Huth et al., znovu vydáno 24. března 1988 (roztoky na čištění kontaktních čoček) a U.S. pat. č. 4 609 493, Schafer, vydáno 2.září 1986 (roztoky na čištění kontaktních čoček).
K dalšímu popisu vynalezených prostředků k čištění dutiny ústní, v prostředcích užitečných při odstraňování bílkovinných skvrn ze zubů nebo umělých chrupů jsou zahrnuty jedna nebo více farmaceuticky přijatelné vynalezené varianty Výraz „prostředky k čištění dutiny ústní“ označuje prostředky na čištění zubů, zubní pasty, zubní gely, zubní prášky, ústní vody, ústní spreje, ústní gely, žvýkací gumy, pastilky, váčky, tablety, biogely, profylaktické pasty, roztoky k ošetření zubů a podobně. Prostředky k čištění dutiny ústní výhodně obsahují 0,0001 % až 20 % jedné nebo více vynalezených variant, výhodněji 0,001 % až 10 %, ještě výhodněji 0,01 % až 5 %, vztaženo na hmotnost prostředku, a farmaceuticky přijatelný nosič. Výraz „farmaceuticky přijatelný nosič“ zde znamená, že drogy, léky nebo inertní přísady, ···· • · ·♦ • * · <· · ··· • · · • · · «· ♦· • * ·
• · · • »
9 9 ··
99
9 9 9
9 9
9 9
9 9
9999 které výraz popisuje, jsou vhodné k použití v kontaktu s lidskými tkáněmi a tkáněmi nižších živočichů bez přílišné toxicity, inkompatibility, nestability, dráždění, alergické odezvy a podobně, a to souměřitelně s rozumným poměrem mezi prospěchem a rizikem.
Farmaceuticky přijatelné nosiče účinných složek v prostředcích k čištění dutiny ústní budou obsaženy obecně v množství 50 % až 99,99 %, výhodně 65 % až 99,99 %, výhodněji 65 % až 99 % hmotnosti prostředku.
Farmaceuticky přijatelné nosiče a volitelné složky, které lze do vynalezených prostředků k čištění dutiny ústní zahrnout, jsou odborníkům v oboru velmi dobře známy. V pracích zde citovaných je popsána široká škála typů prostředků, nosičů a volitelných složek.
V dalším provedení vynálezu obsahují prostředky k čištění umělého chrupu mimo dutinu ústní jednu nebo více vynalezených variant. Takové prostředky k čištění umělého chrupu obsahují účinné množství jedné nebo více variant v množství výhodně 0,0001 % až 50 %, výhodněji 0,001 % až 35 %, ještě výhodněji 0,01 % až 20 %, vztaženo na hmotnost prostředku, a nosiče pro prostředky k čištění umělého chrupu. Různé formy prostředků k čištění umělého chrupu jako jsou šumivé tablety a podobně, jsou v oboru dobře známé (viz. např. U.S. pat. č. 5 055 305, Young) a jsou obecně vhodné k začlenění jednoho nebo více variant odstraňujících bílkovinné skvrny na umělých chrupech.
V dalším provedení vynálezu obsahují jeden nebo více vynalezených variant prostředky k čištění kontaktních čoček. Takové prostředky k čištění kontaktních čoček obsahují účinné množství jedné nebo více variant, výhodně 0,01 % až 50 %, výhodněji 0,01 % až 20 %, ještě výhodněji 1 % až 5 %, vztaženo na hmotnost prostředku, a nosiče pro prostředky k čištění kontaktních čoček. Různé formy prostředků k čištění kontaktních čoček, jako jsou tablety, kapaliny a podobně, jsou v oboru velmi dobře známé a obecně jsou vhodné k začlenění jedné nebo více vynalezených variant, které odstraňují bílkovinné skvrny z kontaktních čoček.
Provedení vynálezu v případě prostředku na čištění kontaktních čoček ilustrují příklady 14 až 17.
Příklady 14 - 17 : Roztok na čištění kontaktních čoček
Př.14 Př. 15 Př. 16 Př. 17
Varianta D 78, 103 0,01 % 0,5 % 0,1 % 2,0 %
Glukosa 50,0 % 50,0 % 50,0 % 50,0 %
Neiontový surfaktant (po lyoxy ethylen 2,0 % 2,0 % 2,0 % 2,0 %
Př.14 Př. 15 Př. 16 Př. 17
Př.14 Př. 15 Př. 16 Př. 17
Aniontový surfaktant (polyoxyethylen -alkylfenylethersulfát sodný) 1,0% 1,0% 1,0% 1,0%
Chlorid sodný 1,0% 1,0% 1,0% 1,0%
Borax 0,30 % 0,30 % 0,30 % 0,30 %
Voda 45,69 % 45,20 % 45,60 % 43,70 %
Příklady 18 až 21 ilustrují použití vynalezených variant v produktech na mytí těla : Příklady 18-21: Produkty na mytí těla
Př. 18 Př. 19 Př.20 Př.21
Voda 62,62 % 65,72 % 57,72 % 60,72 %
Disodná sůl EDTA 0,2 % 0,2 % 0,2 % 0,2 %
Glycerin 3,0 % 3,0 % 3,0 % 3,0 %
Polyquatemium 10 0,4 % 0,4 % 0,4 % 0,4 %
Laurethsulfáte sodný 12,0% 12,0% 12,0 % 12,0 %
Cocamid MEA 2,8 % 2,8 % 2,8 % 2,8 %
Laurafoacetát sodný 6,0 % 6,0 % 6,0 % 6,0 %
Myristová kyselina 1,6% 1,6% 1,6% 1,6%
Heptahydrát sulfátu hořečnatého 0,3 % 0,3 % 0,3 % 0,3 %
Trihydroxystearin 0,5 % 0,5 % 0,5 % 0,5 %
PEG-6 triglyceridy kaprylové / kaprové kyseliny 3,0 % - -
Polyestery sacharosy a cottonové mastné kyseliny 3,0 %
Polyestery sacharosy a behenové mastné kyseliny 3,0 % 4,0 %
Petrolátum - 4,0 % 8,0 % -
Minerální olej - - - 6,0 %
DMDM hydantoin 0,08 % 0,08 % 0,08 % 0,08 %
Varianta D78, 105, 223 0,1 % 2,0 % 2,0 % 5,0 %
Kyselina citrónová 1,40% 1,40% 1,40% 1,40%
• » · • · ··· • · · ··
9 99 99 9999
Příklady 22 až 25 ilustrují použití vynalezených variant v produktech na mytí tváře :
Příklady 22-25 : produkty na mytí tváře
Př.22 Př.23 Př.24 Př.25
Voda 66,52 % 65,17% 68,47 % 68,72 %
Disodná sůl EDTA 0,1 % 0,1 % 0,2 % 0,2 %
Kyselina citrónová - - 1,4% 1,4%
Laureth-3-sulfát sodný 3,0 % 3,5 % - -
Laureth-4-karboxylát sodný 3,0 % 3,5 % - -
Laureth-12 1,0% 1,2% - -
Polyquatemium 10 - - 0,4 % 0,4 %
Polyquatemium 25 0,3 % 0,3 % - -
Glycerin 3,0 % 3,0 % 3,0 % 3,0 %
Lauroamfoacetát sodný - - 6,0 % 6,0 %
Laurová kyselina 6,0 % 6,0 % 3,0 % 3,0 %
Myristová kyselina - - 3,0 % 3,0 %
Magnesium sulphate heptahydrate 2,3 % 2,0 % 2,0 % 2,0 %
Triethanolamin 4,0 % 4,0 % 4,0 % 4,0 %
Trihydroxystearin 0,5 % 0,5 % 0,5 % 0,5 %
Polyestery sacharosy a behenové kyseliny 2,0 % 2,0 %
Polyestery sacharosy a cottonové kyseliny 3,0 % 2,0 %
PEG-6 triglyceridy kaprylové / kaprové kyseliny - - - 2,0 %
Petrolatum - - 4,0 % -
Minerální olej - - - 2,0 %
Cocamidopropylbetain 2,0 % 3,0 % 1,8% 1,8%
Lauryldimethylaminoxid 1,0% 1,2% 1,2% 1,2%
Dexanthenol 1,0% 0,25 % 0,25 % -
DMDM hydantoin 0,08 % 0,08 % 0,08 % 0,08 %
Varianta D 73 - 82, 103, Y217K 1,0% 2,0 % 0,5 % 0,5 %
Vůně 0,2 % 0,2 % 0,2 % 0,2 %
ΦΦ φφ • φ φ « · φ · φ ·· φφφφ
Φφ ·» • · · · • · φ • φφφ · ♦ * φ φφφ • Φ φφ ·Φ «· ·· φφφφ
Příklady 26 až 27 ilustrují použití vynalezených variant ve fixních prostředcích zvlhčujících kůži:
Příklady 26-27 : Fixní prostředek na zvlhčování kůže
Př.26 Př.27
Glycerin 5,0 % -
Stearová kyselina 3,0 % -
Cn-13 isoparafin 2,0 % -
Glykolstearát 1,5% -
Propylenglykol - 3,0 %
Minerální olej 1,0% 10,0%
Sezamový olej - 7,0 %
Petrolátum - 1,8 %
Triethanolamin 0,7 % -
Cetylacetát 0,65 % -
Glycerylstearát 0,48 % 2,0 %
TEA stearát - 2,5 %
Cetylalkohol 0,47 % -
Lanolinalkohol - 1,8%
DEA - cetylfosfát 0,25 % -
Methylparaben 0,2 % 0,2 %
Propylparaben 0,12 % 0,1 %
Karbomer 934 0,11 % -
Disodná sůl EDTA 0,1 % -
Varianta D 246 0,1 % 0,5 %
Voda 84,32 % 71,1 %
• · • * <·* • · · • · · ·· ·♦ ♦ ·»·>· • a ·» • · · · • · · • · · • · · • « ···«
Příklad 28 ilustrující použití vynalezených variant v prostředcích pro čistící tampóny : Příklad 28 : Prostředek pro čistící tampóny
Propylenglykol 1,0%
Ammoniumlaurylsulfát 0,6 %
Jantarová kyselina 4,0 %
Sukcinát sodný 3,2 %
Triclosan® 0,15 %
Varianta 1122 A 0,05 %
Voda 91,0%
Výše popsaný prostředek je impregnován do tkané absorbující vrstvy skládající se z celulosy anebo polyesteru z 25 %, vztaženo na hmotnost absorbující vrstvy.
Průmyslová využitelnost
Vynalezené varianty jsou použitelné při výrobě například prostředky k osobní ochraně, prací prostředky, prostředky k čištění tvrdých povrchů a lehkých čistících prostředků.
• 9« »9 99 • · Λ 9 » 9 ·
9 9 9 9 4
9 9 · 9 9 · • 9 9 9 9 99
1Λ 9« 9 * 9 99·
Popis sekvence <l 10> The Procter & Gambie Company <l20> VARIANTY SUBTILISINOVÝCH PROTEAS S DELECEMIA SUBSTITUCEMI
AMINOKYSELIN V DEFINOVANÝCH EPITOPÁLNÍCH REGIONECH <l40> PCT/USOO/ <l4l> 2000-07-11 <l60> l <l 70> Patent ve verzi 2.0 <2l0> l <211> 275 <2l2> PRT <213> Bacillus amyloliquefaciens <400> l
Ala Gin Ser Val Pro Tyr Gly Val Ser Gin Ile Lys Ala Pro Ala Leu l 5 10 15
His Ser Gin Gly Tyr Thr Gly Ser Asn Val Lys Val Ala Val Ile Asp
25 30
Ser Gly Ile Asp Ser Ser His Pro Asp Leu Lys Val Ala Gly Gly Ala
40 45
Ser Met Val Pro Ser Glu Thr Asn Pro Phe Gin Asp Asn Asn Ser His
55 60
Gly Thr His Val Ala Gly Thr Val Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly 65 70 75 80
Val Leu Gly Val Ala Pro Ser Ala Ser Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu
90 95
Gly Ala Asp Gly Ser Gly Gin Tyr Ser Trp Ile Ile Asn Gly Ile Glu
100 105 HO
125
Trp Ala Ile Ala Asn Asn Met Asp Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly ll5 120
4*. ···· ·· • · · » * · » · · · • · ··· es· « · · • · · 44« » 9 4 4 9 9
4 4 4 9 4 4 4 9 4 4 »4 44 49 94 »· 4499
Pro Ser Gly Ser Ala Ala Leu Lys Ala Ala Val Asp Lys Ala Val Ala
130 135 140
Ser Gly Val Val Val Val Ala Ala Ala Gly Asn Glu Gly Thr Ser Gly 145 150 155 160
Ser Ser Ser Thr Val Gly Tyr Pro Gly Lys Tyr Pro Ser Val Ile Ala
165 170 175
Val Gly Ala Val Asp Ser Ser Asn Gin Arg Ala Ser Phe Ser Ser Val
180 185 190
Gly Pro Glu Leu Asp Val Met Ala Pro Gly Val Ser Ile Gin Ser Thr
195 200 205
Leu Pro Gly Asn Lys Tyr Gly Ala Tyr Asn Gly Thr Ser Met Ala Ser
210 215 220
Pro His Val Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ile Leu Ser Lys His Pro Asn
225 230 235 240
Trp Thr Asn Thr Gin Val Arg Ser Ser Leu Glu Asn Thr Thr Thr Lys
245 250 255
Leu- Gly Asp Ser Phe Tyr Tyr Gly Lys Gly Leu Ile Asn Val Gin Ala
260 265 270
Ala Ala Gin

Claims (12)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Varianta proteasy podobné subtilisinu vyznačující se tím , že má modifikovanou aminokyselinovou sekvenci z původní nekultivované sekvence aminokyselin, přičemž tato nekulíivováná sekvence obsahuje první epitopální region a druhý epitopální region, kde modifikovaná sekvence aminokyselin obsahuje deleci jedné nebo více pozic v jednom či více epitopálních regionech, kde,
    a) pokud se delece vyskytuje v prvním epitopálním regionu, jedná se o deleci jedné nebo více pozic 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 112,113, 114, 116,117,118, 119,123 a 125, které odpovídají subtilisinu BPN'; a
    b) pokud se delece vyskytuje v druhém epitopálním regionu, jedná se o deleci jedné nebo více pozic 220, 221, 222, 223, 224, 225, 227, 228, 229, 230, 231,232, 233, 239, 240, 242, 243, 244, 245 a 246, které odpovídají subtilisinu BPN'.
  2. 2. Varianta proteasy podobné subtilisinu vyznačující se tím , žerná modifikovanou aminokyselinovou sekvenci z původní nekultivované sekvence aminokyselin, přičemž tato nekul ti vo váná sekvence obsahuje první epitopální region a druhý epitopální region, kde modifikovaná sekvence aminokyselin obsahuje deleci jedné nebo více pozic v jednom či více epitopálních regionech, kde,
    a) pokud se delece vyskytuje v prvním epitopálním regionu, jedná se o deleci jedné nebo více pozic 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 112, 113, 114, 116, 117, 118, 119, 120, 12, 122, 123, 124, 125 a 126, které odpovídají subtilisinu BPN'; a
    b) pokud se delece vyskytuje v druhém epitopálním regionu, jedná se o deleci jedné nebo více pozic 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233,234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245 a 246, které odpovídají subtilisinu BPN'.
  3. 3. Varianta podle kteréhokoli z předcházejících nároků vyznačující se tím , že dále obsahuje substituci jedné nebo více pozic 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 112, 113, 114, 116, 117, 118, 119, 120, 12, 122, 123, 124, 125,126, 220, 221,222, 223,224, 225,226, 227,228, 229,230, 231,232, 233,234, 235,236, 237,238, 239,240,241,242,243, 244, 245 a 246, které odpovídají subtilisinu BPN'.
  4. 4. Varianta proteasy podobné subtilisinu vyznačující se tím , žerná modifikovanou aminokyselinovou sekvenci z původní nekultivované sekvence aminokyselin, přičemž tato nekultivo váná sekvence obsahuje první epitopální region, druhý epitopální region a třetí epitopální region, kde modifikovaná sekvence aminokyselin obsahuje deleci dvou nebo více pozic v jednom či více epitopálních regionech, kde,
    a) pokud se delece vyskytuje v prvním epitopálním regionu, jedná se o deleci jedné nebo více pozic 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 115, 114, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125 a 126, které odpovídají subtilisinu BPN';
    b) pokud se delece vyskytuje v druhém epitopálním regionu, jedná se o deleci jedné nebo více pozic 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, . 236, 237,238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245 a 246, které odpovídají subtilisinu BPN';
    c) pokud se delece vyskytuje v třetím epitopálním regionu, jedná se o deleci jedné nebo více pozic 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83 a 84, které odpovídají subtilisinu BPN'.
  5. 5. Varianta podle nároku 4vyznačující se tím , že serínová proteasa je vybrána ze skupiny obsahující subtilisin BPN', subtilisin Carlsberg, subtilisin DY, subtilisin 309, proteinasu K a termitasu a dále obsahuje jednu nebo více stabilizačních mutací.
  6. 6. Varianta podle nároku 5vyznačující se tím , že pokud se delece vyskytuje ve třetím epitopálním regionu, jedná se o deleci jedné nebo více pozic 70, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81 a 82, které odpovídají subtilisinu BPN'.
  7. 7. Varianta podle nároku 4vyznačující se tím , že dále obsahuje substituci jedné nebo více pozic 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84,103, 104,105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 115, 114, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238,239,240,241,242,243,244,245 a 246, které odpovídají subtilisinu BPN'.
    l
  8. 8. Čistící prostředek vyznačující se tím , že obsahuje variantu podle nároku 1 a nosič pro čistící prostředek.
  9. 9. Prostředek k osobní ochraně vyznačující se tím , že obsahuje nosič pro prostředky k osobní ochraně a variantu serinové proteasy, která má modifikovanou aminokyselinovou sekvenci z původní nekultivované sekvence aminokyselin, přičemž tato nekultivovaná sekvence obsahuje první epitopální region, druhý epitopální region a třetí epitopální region, • ·
    99 9 9
    9 · kde modifikovaná sekvence aminokyselin obsahuje deleci dvou nebo více pozic v jednom či více epitopálních regionech, kde,
    a) pokud se delece vyskytuje v prvním epitopálním regionu, jedná se o deleci jedné nebo více pozic 103, 104,105,106, 107,108,109, 110,112,113, 115,114,116,117, 118,119, 120, 121, 122, 123, 124, 125 a 126, které odpovídají subtilisinu BPN'; a
    b) pokud se delece vyskytuje v druhém epitopálním regionu, jedná se o deleci jedné nebo více pozic 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231,232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245 a 246, které odpovídají subtilisinu BPN'; a
    c) pokud se delece vyskytuje v třetím epitopálním regionu, jedná se o deleci jedné nebo více pozic 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83 a 84, které odpovídají subtilisinu BPN'.
  10. 10. Prostředek k osobní ochraně vyznačující se tím , že obsahuje variantu podle nároku 1 a nosič pro prostředky k osobní ochraně.
  11. 11. Čistící prostředek vyznačující se tím , že obsahuje variantu podle nároku 4 a nosič pro čistící prostředky.
  12. 12. Prostředek k osobní ochraně vyznačující se tím , že obsahuje variantu podle nároku 4 a nosič pro prostředky k osobní ochraně.
CZ2002220A 1999-07-22 2000-07-11 Varianty subtilisinové proteasy s delecemi a substitucemi aminokyselin v definovaných epitopových regionech CZ2002220A3 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US14499199P 1999-07-22 1999-07-22

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ2002220A3 true CZ2002220A3 (cs) 2002-05-15

Family

ID=22511101

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ2002220A CZ2002220A3 (cs) 1999-07-22 2000-07-11 Varianty subtilisinové proteasy s delecemi a substitucemi aminokyselin v definovaných epitopových regionech

Country Status (11)

Country Link
US (1) US6586224B1 (cs)
EP (1) EP1206526A2 (cs)
JP (1) JP2003505067A (cs)
KR (1) KR20020021397A (cs)
CN (1) CN1373802A (cs)
AU (1) AU5928100A (cs)
BR (1) BR0012693A (cs)
CA (1) CA2379712A1 (cs)
CZ (1) CZ2002220A3 (cs)
MX (1) MXPA02000843A (cs)
WO (1) WO2001007575A2 (cs)

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK200101090A (da) * 2001-07-12 2001-08-16 Novozymes As Subtilase variants
EP1461072A4 (en) * 2001-12-31 2005-02-09 Genencor Int PROTEASES PRODUCING MODIFIED IMMUNOLOGICAL RESPONSE AND METHODS OF PRODUCTION AND USE
DE10360805A1 (de) 2003-12-23 2005-07-28 Henkel Kgaa Neue Alkalische Protease und Wasch- und Reinigungsmittel, enthaltend diese neue Alkalische Protease
WO2006063587A1 (en) * 2004-12-14 2006-06-22 Novozymes A/S Testing the activity of an enzyme using absorbance
DE102007003143A1 (de) 2007-01-16 2008-07-17 Henkel Kgaa Neue Alkalische Protease aus Bacillus gibsonii und Wasch- und Reinigungsmittel enthaltend diese neue Alkalische Protease
DE102007032111B4 (de) 2007-07-09 2017-07-20 Henkel Ag & Co. Kgaa Neue Proteasen und Wasch- und Reinigungsmittel enthaltend diese Proteasen
DE102007036756A1 (de) 2007-08-03 2009-02-05 Henkel Ag & Co. Kgaa Neue Proteasen und Wasch- und Reinigungsmittel, enthaltend diese neuen Proteasen
DE102007051092A1 (de) 2007-10-24 2009-04-30 Henkel Ag & Co. Kgaa Subtilisin aus Becillus pumilus und Wasch- und Reinigungsmittel enthaltend dieses neue Subtilisin
EP2650354A3 (en) * 2008-11-11 2014-02-12 The Procter and Gamble Company Bacillus subtilisin comprising one or more combinable mutations
KR101930962B1 (ko) 2010-01-25 2018-12-19 알러간, 인코포레이티드 단일-사슬 단백질의 그의 이-사슬 형태로의 세포내 전환 방법
EP3013950B1 (en) 2013-06-27 2018-08-08 Novozymes A/S Subtilase variants and polynucleotides encoding same
CN109481336B (zh) * 2018-12-19 2021-10-26 广州立白企业集团有限公司 口腔护理组合物及其应用
ES2811080B2 (es) * 2019-09-10 2021-12-21 The Spb Global Corp S L Composicion y metodo para eliminacion de alergenos alimentarios en superficies

Family Cites Families (80)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BE795238A (fr) 1972-02-09 1973-08-09 Schering Ag Derives d'insuline reticules de maniere intramoleculaire, leur procede de preparation et leur utilisation
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
DE2631656C2 (de) 1976-07-14 1983-02-10 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim Verwendung eines Hydroxysuccinimidoester-Derivats zur Bindung von biologisch aktiven Proteinen aneinander und/oder an flüssige oder feste Trägerstoffe
DE2926808A1 (de) 1978-07-04 1980-01-17 Novo Industri As Proteaseprodukt mit verringerter allergener wirkung, herstellungsverfahren und waschmittel
US4556554A (en) 1981-06-01 1985-12-03 Germaine Monteil Cosmetiques Corp. Immobilized enzymes
US4760025A (en) 1984-05-29 1988-07-26 Genencor, Inc. Modified enzymes and methods for making same
NZ208612A (en) 1983-06-24 1991-09-25 Genentech Inc Method of producing "procaryotic carbonyl hydrolases" containing predetermined, site specific mutations
US5371190A (en) * 1984-05-29 1994-12-06 Genencor International, Inc. Substrate assisted catalysis
US5371008A (en) * 1984-05-29 1994-12-06 Genencor International, Inc. Substrate assisted catalysis
US4732863A (en) 1984-12-31 1988-03-22 University Of New Mexico PEG-modified antibody with reduced affinity for cell surface Fc receptors
US4844897A (en) 1985-09-13 1989-07-04 Hiroshi Maeda Anti-tumor protease preparations
WO1987004461A1 (en) * 1986-01-15 1987-07-30 Amgen THERMALLY STABLE AND pH STABLE SUBTILISIN ANALOGS AND METHOD FOR PRODUCTION THEREOF
EP0260299A4 (en) 1986-02-12 1988-11-24 Genex Corp MUTAGENESIS AND SCREENING PROCESS AND PRODUCT OBTAINED.
US4980288A (en) 1986-02-12 1990-12-25 Genex Corporation Subtilisin with increased thermal stability
US4908773A (en) 1987-04-06 1990-03-13 Genex Corporation Computer designed stabilized proteins and method for producing same
ES2068181T3 (es) 1986-04-30 1995-04-16 Genencor Int Mutantes de la carbonil hidrolasa no humana, secuencias de adn y vectores que codifican las mismas y huespedes transformados con dichos vectores.
NZ221627A (en) 1986-09-09 1993-04-28 Genencor Inc Preparation of enzymes, modifications, catalytic triads to alter ratios or transesterification/hydrolysis ratios
DE3877300T2 (de) 1987-04-02 1993-06-03 Genentech Inc Substratunterstuetzte katalyse.
US4853871A (en) 1987-04-06 1989-08-01 Genex Corporation Computer-based method for designing stablized proteins
JP3155984B2 (ja) 1987-04-06 2001-04-16 ノヴォザイムズ・アクティーゼルスカブ タンパク質の安定化のための金属イオン結合部位における静電的相互作用の操作
US4914031A (en) * 1987-04-10 1990-04-03 Amgen, Inc. Subtilisin analogs
US5543302A (en) 1988-05-27 1996-08-06 Solvay Enzymes, Inc. Proteases of altered stability to autolytic degradation
JPH02219571A (ja) 1989-02-20 1990-09-03 Kanebo Ltd 修飾プロテアーゼ及びその製造法
US5324844A (en) 1989-04-19 1994-06-28 Enzon, Inc. Active carbonates of polyalkylene oxides for modification of polypeptides
US5122614A (en) 1989-04-19 1992-06-16 Enzon, Inc. Active carbonates of polyalkylene oxides for modification of polypeptides
KR100188532B1 (ko) 1989-05-17 1999-06-01 스티븐 엠. 오드리 돌연변이 섭티리신 및 그를 함유하는 조성물
EP0405901B1 (en) 1989-06-26 2004-09-01 Unilever Plc Enzymatic detergent compositions
US5658871A (en) 1989-07-07 1997-08-19 Lever Brothers Company, Division Of Conopco, Inc. Microbial lipase muteins and detergent compositions comprising same
DK97190D0 (da) 1990-04-19 1990-04-19 Novo Nordisk As Oxidationsstabile detergentenzymer
US5230891A (en) 1990-08-20 1993-07-27 Kanebo Limited Modified protease, method of producing the same and cosmetic products containing the modified protease
US5133968A (en) 1990-08-20 1992-07-28 Kanebo, Ltd. Modified protease, method of producing the same and cosmetic products containing the modified protease
US5766898A (en) 1990-12-05 1998-06-16 Novo Nordisk A/S Proteins with changed epitopes and methods for the production thereof
JP3355186B2 (ja) * 1990-12-05 2002-12-09 ノボザイムス アクティーゼルスカブ 改変したエピトープを有するタンパク質及びその製造のための方法
ES2090481T3 (es) 1991-05-01 1996-10-16 Unilever Nv Composiciones detergentes que contienen enzimas estabilizadas.
US5414135A (en) 1991-12-30 1995-05-09 Sterling Winthrop Inc. Vinyl sulfone coupling of polyoxyalkylenes to proteins
IT1260468B (it) 1992-01-29 1996-04-09 Metodo per mantenere l'attivita' di enzimi proteolitici modificati con polietilenglicole
GB9207280D0 (en) 1992-04-02 1992-05-13 Unilever Plc Skin care method and composition
GB9207288D0 (en) 1992-04-02 1992-05-13 Unilever Plc Cosmetic composition
AU678768B2 (en) 1992-06-05 1997-06-12 Scripps Research Institute, The D-enzyme compositions and methods of their use
AU5006993A (en) 1992-08-21 1994-03-15 Enzon, Inc. Novel attachment of polyalkylene oxides to bio-effecting substances
CA2101361A1 (en) 1992-08-27 1994-02-28 Robert A. Snow Low diol polyalkylene oxide biologically active proteinaceous substances
US5567601A (en) * 1993-06-01 1996-10-22 University Of Maryland Subtilisin mutants lacking a primary calcium binding site
US5470733A (en) * 1993-06-01 1995-11-28 University Of Maryland Calcium free subtilisin mutants
US6436690B1 (en) 1993-09-15 2002-08-20 The Procter & Gamble Company BPN′ variants having decreased adsorption and increased hydrolysis wherein one or more loop regions are substituted
ATE343636T1 (de) 1993-09-15 2006-11-15 Procter & Gamble Subtilisin bpn'-varianten mit verminderter adsorption und erhöhter hydrolyse
MA23346A1 (fr) 1993-10-14 1995-04-01 Genencor Int Variantes de la subtilisine
US6187579B1 (en) 1993-10-28 2001-02-13 Carlsberg A/S Customized proteases
US5446090A (en) 1993-11-12 1995-08-29 Shearwater Polymers, Inc. Isolatable, water soluble, and hydrolytically stable active sulfones of poly(ethylene glycol) and related polymers for modification of surfaces and molecules
ZA952220B (en) 1994-05-02 1995-12-14 Procter & Gamble Bpn' variants having decreased adsorption and increased hydrolysis wherein one or more loop regions are substituted
US5629384A (en) 1994-05-17 1997-05-13 Consiglio Nazionale Delle Ricerche Polymers of N-acryloylmorpholine activated at one end and conjugates with bioactive materials and surfaces
JPH10509324A (ja) 1994-11-24 1998-09-14 ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ 抑制されたアレルゲン性を有するポリペプチドの製造のための方法
WO1996017929A1 (en) 1994-12-07 1996-06-13 Novo Nordisk A/S Polypeptide with reduced allergenicity
ATE257844T1 (de) 1995-03-10 2004-01-15 Nakamura Toshikazu Menschlicher wachstumsfaktor (hgf), verändert durch polyethylenglykol
WO1996040791A1 (en) 1995-06-07 1996-12-19 Novo Nordisk A/S Modification of polypeptides
WO1996040792A1 (en) 1995-06-07 1996-12-19 Novo Nordisk A/S Modification of polypeptides
DE19530816A1 (de) 1995-08-23 1997-02-27 Cognis Bio Umwelt Verwendung von mutierter Subtilisin-Protease in kosmetischen Produkten
AU4690796A (en) 1995-12-29 1997-07-28 Procter & Gamble Company, The Detergent compositions comprising immobilized enzymes
BR9510680A (pt) 1995-12-29 1999-03-30 Procter & Gamble Composições detergentes compreendendo enzimas imobilizadas
JP2000506119A (ja) 1996-02-15 2000-05-23 ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ ポリペプチドのコンジュゲーション
US6946280B1 (en) 1996-03-29 2005-09-20 Genencor International, Inc. Enzyme multimer and process of producing same
DK0942962T3 (da) 1996-11-26 2007-05-07 Genencor Int Kemisk modificerede enzymer
EP0954572A1 (en) 1997-01-10 1999-11-10 Novo Nordisk A/S Enzyme coupled with polymeric molecules for skin care
JP2001511162A (ja) 1997-02-06 2001-08-07 ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ 付加され、そして／又は除去された付着基を有するポリペプチド−ポリマー結合体
ES2296336T3 (es) 1997-06-25 2008-04-16 Novozymes A/S Polipeptido modificado.
US5972339A (en) 1997-11-13 1999-10-26 The General Hospital Corporation Method of eliciting anti-HIV-1 helper T cell responses
GB9727262D0 (en) 1997-12-24 1998-02-25 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
KR20010040397A (ko) 1998-01-23 2001-05-15 마가렛 에이.혼 개질된 효소 및 펩티드 합성에 이들을 사용하는 용도
EP1056842A2 (en) 1998-02-11 2000-12-06 Maxygen, Inc. Genetic vaccine vector engineering
KR100585408B1 (ko) 1998-02-12 2006-06-01 와이어쓰 홀딩스 코포레이션 인터루킨-12로 제형된 폐렴구균 및 수막구균 백신
CA2321961A1 (en) 1998-02-24 1999-08-26 Dovetail Technologies Inc. Novel disulfides and thiol compounds
US5985264A (en) 1998-03-05 1999-11-16 The Medical College Of Ohio IL-12 Stimulation of Neonatal immunity
NZ506650A (en) 1998-03-05 2003-11-28 Ohio Med College Enhancement of immunity by intranasal inoculation of IL- 12
US6328967B1 (en) 1998-03-12 2001-12-11 Allergenics, Inc. Delivery system to modulate immune response
US6495136B1 (en) 1998-03-26 2002-12-17 The Procter & Gamble Company Proteases having modified amino acid sequences conjugated to addition moieties
JP2002507426A (ja) * 1998-03-26 2002-03-12 ザ、プロクター、エンド、ギャンブル、カンパニー アミノ酸置換を有するセリンプロテアーゼ変異体
EP1082443A1 (en) * 1998-03-26 2001-03-14 The Procter & Gamble Company Serine protease variants having amino acid deletions and substitutions
US6835550B1 (en) * 1998-04-15 2004-12-28 Genencor International, Inc. Mutant proteins having lower allergenic response in humans and methods for constructing, identifying and producing such proteins
JP4392778B2 (ja) 1998-06-24 2010-01-06 ジェネンコア インターナショナル インコーポレーテッド 新規なセルラーゼを産生する放線菌、その放線菌が産生するセルラーゼ、およびそのセルラーゼを作成する方法。
ATE433485T1 (de) 1998-11-10 2009-06-15 Univ Toronto Chemisch modifizierte mutante serinhydrolasen
JP2002533087A (ja) 1998-12-21 2002-10-08 ジェネンカー インターナショナル，インコーポレイティド 複数荷電変種を有する化学修飾酵素

Also Published As

Publication number Publication date
US6586224B1 (en) 2003-07-01
KR20020021397A (ko) 2002-03-20
CN1373802A (zh) 2002-10-09
EP1206526A2 (en) 2002-05-22
CA2379712A1 (en) 2001-02-01
AU5928100A (en) 2001-02-13
BR0012693A (pt) 2002-04-09
WO2001007575A3 (en) 2002-03-07
JP2003505067A (ja) 2003-02-12
WO2001007575A2 (en) 2001-02-01
MXPA02000843A (es) 2002-07-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US6569663B1 (en) Serine protease variants having amino acid substitutions
JP3642735B2 (ja) プロテアーゼ複合体
US6586223B1 (en) Subtilisin protease variants having amino acid substitutions in defined epitope regions
CZ2002220A3 (cs) Varianty subtilisinové proteasy s delecemi a substitucemi aminokyselin v definovaných epitopových regionech
AU750336B2 (en) Serine protease variants having amino acid deletions and substitutions
EP1276871A2 (en) Enzyme variants having one or more d-amino acid substitutions
US6908757B1 (en) Serine protease variants having amino acid deletions and substitutions
CZ20003397A3 (cs) Varianta serinové proteázy; prostředek pro osobní hygienu, čistící prostředek, mutovaný gen
MXPA00009442A (en) Serine protease variants having amino acid deletions and substitutions
CZ20003394A3 (cs) Varianta serinové proteázy, mutovaný gen, prostředek pro osobní hygienu
MXPA00009434A (en) Serine protease variants having amino acid substitutions
CZ2002210A3 (cs) Proteasa podobající se subtilisinu obsahující intramolekulární zesí»ování a její pouľití
MXPA00009385A (en) Protease conjugates