MXPA02000763A - Activacion terapeutica catalizada por enzima. - Google Patents

Activacion terapeutica catalizada por enzima.

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Abstract

Esta invencion proporciona compuestos de sustrato novedosos que selectivamente inhiben la proliferacion de celulas patologicas, por ejemplo, celulas patologicas que endogenamente sobreexpresan una enzima objetivo que confiere resistencia a agentes biologicos y quimioterapeuticos. La enzima actua en un compuesto de sustrato para 1) convertirse a una toxina celular y/o 2) liberar un subproducto toxico. En una modalidad, la actividad de la enzima objetivo ha sido enormemente mejorada en una celula objetivo como un resultado de la perdida de funcion supresora de tumor y/o seleccion resulta a partir de la exposicion previa a la quimioterapia. En otra modalidad, la celula patologica contiene una enzima objetivo que es un producto de expresion de un agente infeccioso en la celula. Ademas proporcionado por esta invencion existe un metodo para tratar un sujeto suministrando al sujeto un profarmaco como se describe en la presente. Los profarmacos de esta invencion pueden usarse solos o en combinacion con otros agentes quimioterapeuticos o terapias anti- cancer alternativas tales como radiacion.

Description

ACTIVACIÓN TERAPÉUTICA CATALIZADA POR ENZIMA DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Esta solicitud reclama la prioridad bajo 35 U.S.C. § 119 (e) a las siguientes solicitudes provisionales Norteamericanas Nos. de Serie: 60/145,356; 60/145,437; y 60/191,315, presentadas el 22 de julio, 1999; 23 de julio, 1999 y 21 de marzo del 2000, respectivamente, los contenidos de las cuales se incorporan en la presente para referencia dentro de la presente descripción. La presente invención se relaciona al campo del descubrimiento de fármaco y especialmente, al diseño de profármacos que son sustratos para enzimas intracelulares endógenas que se sobreexpresan en células patológicas. Durante todo y dentro de esta descripción, varias publicaciones se relacionan por primer autor y fecha, número de patente o número de publicación. La mención bibliográfica completa para cada referencia puede encontrarse dentro de la especificación o al final de esta solicitud, inmediatamente precediendo las reivindicaciones. Las descripciones de estas publicaciones se incorporan en la presente para referencia dentro de esta descripción para describir más completamente el estado de la técnica a la cual esta invención pertenece. El cáncer es una de las enfermedades humanas más comúnmente fatal alrededor del mundo. El tratamiento con fármacos anticáncer es una opción de importancia firmemente jmj incrementada, especialmente para malignidades sistémicas o para cánceres metastáticos que han pasado el estado de curabilidad quirúrgica. Desafortunadamente, el subconjunto de tipos de cáncer humano que son favorables para tratamiento curativo hoy, es aún bastante pequeño (Haskell, C.M. (1995)) resultando en aproximadamente 600,000 muertes por año. Véase, Cáncer Facts & Figures, 1999 American Cáncer Society. El progreso en el desarrollo de fármacos que pueden curar cáncer humano es lento, con éxitos limitados a unas pocas malignidades hematológicas y menos tipos de tumor sólido (Dorr and Van Hoff (1994) ) . El progreso en descubrir terapias que se basan en el mecanismo de enfermedad ofrece oportunidades para éxitos futuros. (Cobleigh, M.A. et al. (1999); y Roth, J. A. et al. (1999)). La heterogeneidad de tumores malignos con respecto a su genética, biología y bioquímica así como también la resistencia principal o inducida por tratamiento para mitigar la terapia contra tratamiento curativo. Además, muchos fármacos anticáncer exhiben únicamente un bajo grado de selectividad, provocando con frecuencia severos o aún efectos secundarios tóxicos que amenazan la vida, evitando de esta manera la aplicación de dosis suficientemente altas para exterminar todas las células cancerosas. La búsqueda para agentes anti-neoplásticos con selectividad mejorada para células malignas, patológicas resistentes al tratamiento, « * i- pertenece por consiguiente a una tarea central para el desarrollo de fármacos. Las células de cáncer se caracterizan por crecimiento incontrolado, desdiferenciación e inestabilidad genética. La inestabilidad se expresa a sí misma como el número de cromosomas aberrante, eliminaciones de cromosoma, redisposiciones, pérdida o duplicación más allá del número diploide normal. (Wilson, J.D. et al. (1991)). Esta inestabilidad genómica puede provocarse por varios factores. uno de los mejores caracterizados es la plasticidad genómica mejorada la cual ocurre hasta la pérdida de la función del gen supresor de tumor (por ejemplo, Almasan, A. et al. (1995a) y Almasan, A. et al. (1995b)). La plasticidad genómica se presta por sí misma a la adaptabilidad de las células tumorales para su ambiente cambiante, y pueden permitirse para la más frecuente mutación, amplificación de genes, y la formación de elementos extracromosomales (Smith, K.A. et al. (1995) y Wilson, J.D. et al. (1991)). Estas características suministradas para mecanismos resultan en mayor malignidad agresiva puesto que permite a los tumores resistencia rápidamente desarrollada a mecanismos de defensa huéspedes naturales, terapias biológicas (véase, ilson, J.D. et al. (1991) y Shepard, H.M. et al. (1988)), así como también a agentes quimioterapéuticos (véase, Almasan, A. et al. (1995a); y Almasan, A. et al. (1995b)). yy^^^yJJ Además, la utilidad clínica de un agente quimioterapéutico puede limitarse severamente por el surgimiento de resistencia a células malignas a aquel fármaco. Un número de mecanismos celulares se implican probablemente en la resistencia a fármaco, por ejemplo, metabolismo alterado de los fármacos, impermeabilidad de la célula al compuesto activo o eliminación del fármaco acelerada de la célula, especificidad alterada de una enzima inhibida, producción incrementada de una molécula objetivo, reparación incrementada de lesiones citotóxicas, o la desviación de una reacción inhibida por trayectorias bioquímicas alternativas. En algunos casos, la resistencia a un fármaco puede conferir resistencia a otros fármacos bioquímicamente distintos. Un mecanismo alternativo de resistencia a agentes quimioterapéuticos de cáncer ocurre a través de la pérdida funcional de genes supresores de tumor. Los mejores caracterizados de estos son p53, RB y pl6. (Funk, J.O. 1999; y Teh, B.T. (1999)). La pérdida de función de estos productos de gen conduce a una expresión deprimida de enzimas comúnmente llevada a cabo por fármacos anti-cáncer (por ejemplo, 5-fluorouridilo ("5FU") /timidilato sintasa y metotrexato/dihidrofolato reductasa). (Lee, V. et al. (1997); Lenz, H.J. et al. (1998); y Fan, J. and Bertino, J. (1987)).
La amplificación de ciertos genes se implica en la resistencia a productos biológicos y quimioterapia. La íil j.4 , *.. ,? <A, í amplificación del gen que codifica dihidrofolato reductasa se relaciona a la resistencia a metotrexato, mientras que la sobreexpresión/amplificación del gen que codifica timidilato sintasa se relaciona a la resistencia al tratamiento con 5- fluoropirimidinas. (Smith, K.A. et al. (1995)). La Tabla 1 resume algunas enzimas prominentes en resistencid a productos biológicos y quimioterapia. Tabla 1 Enzimas Sobreexpresadas en Resistencia a Quimioterapia de Cáncer .. * La escasa selectividad de agentes anticáncer ha sido reconocida durante un largo tiempo e intentos para mejorar la selectividad y permitir mayores dosis para administrarse han sido numerosas. Un enfoque ha sido el desarrollo de profármacos. Los profármacos son compuestos que son toxicológicamente benignos, pero los cuales pueden convertirse in vivo a productos terapéuticamente activos. En algunos casos, la activación ocurre a través de la acción de una enzima no endógena suministrada a la célula objetivo por el anticuerpo ("ADEPT" o terapia de profármaco de enzima dependiente de anticuerpo (Patente Norteamericana No. 4,975,278)) o eligiendo objetivos de gen ("GDEPT" o gen dependiente de terapia de profármaco de enzima (Melton, R.G. and Sher ood, R.E. (1996)). Estas tecnologías tienen varias limitaciones con respecto a su capacidad para evacuar la sangre y penetrar tumores. Véase, Connors, T.A. and Knox, R.J. (1995) . Un número de análogos de nucleótido y nucleósido han sido desarrollados y probados como agentes anti-tumorales y anti-virales. Por ejemplo, 5-fluroacilo (5FU) y 5- fluorodesoxiuridina (5FUdR) han sido ampliamente utilizados como agentes quimioterapéuticos basados en su capacidad para convertir intracelularmente a inhibidores de la enzima de timidilato sintasa (TS) . Como con muchos otros agentes quimioterapéuticos inhibidores de enzima, la terapia de cáncer que utiliza 5FU frecuentemente conduce a la selección para células de tumor resistentes al fármaco agresivo las cuales son reacios al tratamiento adicional con este fármaco. (Aschele, C. et al. (1994); Mader, R.M. et al. (1998); Lonn, U. et al. (1996); Paradiso, A. et al. (2000); y Edler, D. et al. (2000) ) . Se ha rendido particular atención también a análogos nucleósido halogenados tales como (E)-5-(2-bromovinil) -2' -desoxiuridina (BVdU). Estos tipos de compuestos se desarrollaron originalmente como agentes antivirales basados en la observación que requieren fosforilación a la forma de nucleótido de monofosfato para sacar respuestas citotóxicas y esta fosforilación se consumó de preferencia por virus herpes de enzimas de timidina cinasa (TK) . BVdU y compuestos relacionados han mostrado consistentemente toxicidad limitada a células de mamífero normales, mientras que han sido efectivos para eliminar células infectadas viralmente. (DeClerq, E. et al. (1997)). A lo largo de la extensa prueba de análogos nucleósido tales como BVDU como antivirales y agentes anti-cáncer, han sido consistentemente reportados por tener mínima toxicidad en células normales y de cáncer. fastas observaciones han sido sustentadas por resultados demuestran la fosforilación preferencial de tales compuestos por enzimas de timidina cinasa virales, que explican la baja toxicidad de estos compuestos para células mamíferas. Así, BVdU y análogos nucleósido relacionados que no han sido desarrollados como agentes terapéuticos anti-cáncer (De Clerq, E. et al. (1997) ) . Esta invención proporciona compuestos novedosos que inhiben selectivamente la proliferación de células patológicas, por ejemplo, células patológicas que sobreexpresan endógenamente una enzima objetivo que confiere resistencia a agentes biológicos y quimioterapéuticos. La enzima actúa en un compuesto profármaco de esta invención para 1) convertirse a una toxina celular y/o 2) liberar un subproducto tóxico. En otro aspecto de esta invención, el producto de una reacción inicial con una enzima de resistencia, es activado de manera subsecuente y completamente por una enzima celular común tal como una acilasa, fosfatasa u otra enzima "gobernante" (Voet, et al. (1995) ) o constituyente celular común (por ejemplo, agua) para liberar el subproducto tóxico del profármaco. En una modalidad, la actividad de la enzima objetivo ha sido en gran medida mejorada en una célula objetivo como un resultado de la pérdida de la función y/o selección supresora del tumor resultando de la exposición previa a la quimioterapia. En otra modalidad, la célula patológica contiene una enzima objetivo que es un producto de expresión de un agente infeccioso en la célula. El producto de expresión puede conferir resistencia antibiótica. Otro aspecto de esta invención incluye ensayos para tamizar para nuevos profármacos que pueden activarse por enzimas objetivo. Los equipos para realizar tales ensayos que contienen los reactivos e instrucciones necesarias para completar el ensayo y analizar los resultados se proporcionan también por esta invención. Adicionalmente proporcionado por esta invención existe un método para tratar un sujeto suministrando al sujeto un profármaco como se describió en la presente. Los profármacos de esta invención pueden utilizarse solos o en combinación con otros agentes quimioterapéuticos o terapias anti-cáncer alternativas tales como radiación. Un aspecto adicional de esta invención es la preparación de un medicamento para usar en el tratamiento de un sujeto que sufre de una patología caracterizada por células que expresan una enzima objetivo. Aún un aspecto adicional de esta invención es un método para identificar el agente terapéutico óptimo para un sujeto, aislando células que expresan una enzima objetivo y poniendo en contacto las células con al menos uno de los ,,.,-, profármacos de esta invención, y luego identificando cuál de uno o más profármacos inhiben la proliferación o eliminan |Í#S células, por lo que identifican el agente terapéutico óptimo para el sujeto. Los profármacos de esta invención tienen la siguiente estructura: o tautómeros de los mismos; en donde R12 o R13 pueden ser el mismo o diferentes y se seleccionan del grupo que consiste de oxo, OH o NHNH?; en donde si a es 0 ó 1, a condición de que si a es 0 y R13 es oxo, entonces existe un doble enlace entre la posición 3 y 4 y R12 es NHNH2 o si a es 0 y R12 es oxo, entonces existe un doble enlace entre la posición 2 y 3 y R13 es NHNH2; o si a es 1, entonces R12 y R13 son ambos oxo; en donde R1 es un sustituyente que tiene la fórmula : en donde R y R3 son independientemente un grupo hidrocarbilo insaturado o saturado; en donde n es 0 o un número entero de 1 a 10 y m es 0 ó 1; y en donde R4 se selecciona del grupo que consiste de F, Cl, Br, I, CN, S03H, C02H, C02CH2CH3, C02CH3, SI(CH3)3/ CHO, N02, CF3, CC13, CH=C(R15)2 o un sustituyente que tiene la estructura: ^ §..&. í & ¡^^t ^ y en donde Xa y Xb son independientemente los mismos o diferentes y se seleccionan del grupo que consiste de Cl, Br, I y un grupo saliente potente; en donde Ya, Yb o Yc son independientemente los mismos o diferentes y son H o F; en donde Z, Za y Zb son independientemente los mismos o diferentes y son 0 o S; y en donde Rx4 es H o F, a condición de que si R14 es F, entonces a es 1 y R12 y R13 son ambos oxo; y en donde Q se selecciona del grupo que consiste de un azúcar, un carbocíclico, y un compuesto acíclico, o un derivado de fosfato enmascarado o derivado de fosforamidato del mismo. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Los conceptos descritos en la presente se exhiben gráficamente en la Figura ÍA y IB utilizando el ejemplo de la enzima de timidilato sintasa y el compuesto NBlOll™. La Figura ÍA muestra cómo niveles elevados de TS en células tumorales pueden conducir a generación preferencial de toxina. La Figura IB muestra la conversión de NBlOll™ a BVdUMP, e interacción subsecuente con TS para generar toxina de nucleótido. Las Figuras 2A y 2B son gráficas de flujo que ilustran un tamiz de rendimiento elevado de esta invención. La Figura 3A muestra niveles de TS relativos en varios tejidos humanos. La Figura 3B muestra una comparación de niveles de ARNm TS promedio entre tejidos normal y de tumor de colon humano. La Figura 4 muestra el esquema sintético para los nucleósidos de furo [2, 3-d] pirimidinona de esta invención. El protocolo sintético se describió en detalle, infra . La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique de otra forma, técnicas convencionales de biología molecular, microbiología, biología celular, química orgánica, química médica y ADN recombinante, los cuales están dentro del alcance de la técnica. Véase, por ejemplo, Sambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd edition (1989); CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, F.M. Ausubel et al. eds., (1987); las series METHODS IN ENZYMOLOGY, Academic Press, Inc.; PCR 2: A PRACTICAL APPROACH, MJ. MacPherson et al., eds. (1995); Spector, D.L. et al. (1998) CELLS: A LABORATORY MANUAL, Vols I a III, Cold Spring Harbor Press, and ANIMAL CELL CULTURE, R.I. Freshney, ed. (1987) . Como se utiliza en la especificación y reivindicaciones, la forma singular "un", "una" y "el, la" incluyen referencias plurales a menos que el contexto claramente lo estipule de otra forma. Por ejemplo, el término "una célula" incluye una pluralidad de células, incluyendo mezclas de las mismas.
Como se usa en la presente, el término "que comprende" se pretende para significar que las composiciones y métodos incluyen los elementos vueltos a citar, pero no excluye otros. "Consiste esencialmente de" cuando se usa para definir composiciones y métodos, significará que excluye otros elementos de cualquier significancia esencial a la combinación. Así, una composición que consiste esencialmente de los elementos como se definieron en la presente no excluirían contaminantes en traza del método de aislamiento y purificación y portadores farmacéuticamente aceptables, tales como solución salina de amortiguador de fosfato, conservadores, y similares. "Que consiste de" significará que excluye más de los elementos de traza de otros ingredientes y etapas del método sustancial para administrar las composiciones de esta invención. Las modalidades definidas para cada uno de estos términos de transición están dentro del alcance de esta invención. El término "sobreexpresión" significará al menos 2 veces, preferiblemente 3 veces, y de mayor preferencia 4 veces y de mayor preferencia 5 veces o mayor expresión sobre los niveles normales o niveles medidos de las células normales o no patológicas. Una "composición" se pretende para significar una combinación del agente activo y otro compuesto o composición, inerte (por ejemplo, un agente detectable o marcable) o activo, tal como un adyuvante. Una "composición farmacéutica" se pretende para incluir la combinación de un agente activo con un portador, inerte o activo, haciendo la composición adecuada para uso de diagnóstico o terapéutico in vi tro, in vivo o ex vivo. Como se usa en la presente, el término "portador farmacéuticamente aceptable" abarca cualquiera de los portadores farmacéuticos estándares, tales como solución salina amortiguada por fosfato, agua, y emulsiones, tales como una emulsión de aceite/agua o agua/aceite, y varios tipos de agentes humectantes. Las composiciones también pueden incluir estabilizadores y conservadores. Por ejemplo de portadores, estabilizadores, y adyuvantes, véase Martin REMINGTON'S PHARM. SCI., 15th Ed. (Mack Publ. Co . , Easton (1975)). Una "cantidad efectiva" es una cantidad suficiente para efectuar resultados benéficos o deseados. Una cantidad efectiva puede administrarse en una o más administraciones, aplicaciones o dosis. Células "objetivo" o "patológicas" incluyen células hiperproliferativas que son desdiferenciadas, inmortalizadas, neoplásicas, malignas, metastáticas o transformadas. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a células de cáncer tales como células de sarcoma, células de leucemia, células de carcinoma, o células de adenocarcinoma. Los cánceres especificados incluyen, pero no se limitan a células de cáncer de seno, células de hepatoma, células de cáncer de hígado, células de carcinoma pancreático, células de carcinoma del esófago, células de cáncer de vejiga, células de cáncer gastrointestinal, células de cáncer de ovario, células de cáncer de la piel, células de cáncer de próstata, y células de cáncer gástrico. Las células objetivo o patológicas sobreexpresan una enzima intracelular que se relaciona a cualquiera de una pérdida de la función del producto de gen supresor de tumor, resistencia al fármaco o inestabilidad genética. Alternativamente, la resistencia a un fármaco puede conferir resistencia a otros fármacos bioquímicamente distintos. Diferentes terapias de la técnica anterior se dirigen para crear inhibidores más potentes de enzimas endógenas, intracelulares, esta invención explota la actividad más alta de la enzima asociada con las células enfermas resistentes a terapia y tejidos contra células normales y tejidos y no depende de inhibir la enzima. El término "enzima objetivo" se usa en la presente para definir enzimas que tienen una o más de las características observadas anteriormente. Los productos del gen activados o sobreexpresados y relacionados a la resistencia del fármaco incluyen, pero no se limitan a timidilato sintasa (TS) (Lónn, U. et al. (1996); Kobayashi, H. et al. (1995); y Jackman, A.L. et al. (1995b)), dihidrofolato reductasa (Banerjee, D. et al. (1995) y Bertino, J.R. et al. (1996)), tirosina cinasas (TNF-a, Hudziak, R.M. et al. (1988)) y resistencia a multifármaco (Stühlinger, M. et al. (1994)); Akdas, A. et al. (1996); y (Tannock, I.F. (1996)); y proteínas asociadas a la resistencia a multifármaco dependiente de ATP (Simón, S.M. and Schindler, M. (1994) ) y, en algunas enfermedades que incluyen cáncer de colon y próstata, topoisomerasa I (Husain et al (1994) ) . La amplificación de dihidrofolato reductasa (DHFR) se relaciona con la resistencia a metotrexato mientras que la amplificación del gen que codifica timidilato sintasa se relaciona a la resistencia al tratamiento del tumor con 5-fluoropirimidina. La amplificación de los genes asociados con resistencia al fármaco puede detectarse y verificarse por una reacción de cadena de polimerasa modificada (PCR) como se describió en Kashini-Sabet, et al. (1988), Patente Norteamericana No. 5,085,983, o el método descrito en la presente. La resistencia al fármaco adquirida puede verificarse por la detección de anormalidades citogenéticas, tales como regiones de inmunotransferencia de cromosoma homogéneas y cromosomas dobles mínimos ambos de los cuales se asocian con la amplificación del gen. Ensayos alternativos incluyen ensayos de actividad de enzima directa o indirecta y cada uno de los cuales se asocian con la amplificación del gen (por ejemplo, Carreras y Santi (1995)); otras metodologías (por ejemplo, reacción de cadena de polimerasa, Houze, T.A. et al. (1997) o inmunohistoquímica (Johnson, P.G. et al. (1997) ) . La enzima glutation-S-transferasa ha sido mostrada para elevarse ocasionalmente en algunos tumores humanos (Morgan, A.S. et al. (1998)), pero no obstante se excluye de la "enzima objetivo" como se usó en la presente porque es un elemento de una familia de gen que codifica enzimas con especificidades traslapantes. En resumen, los profármacos de la invención objeto son distinguibles a partir de la terapéutica convencional sobre la base de que las enzimas objetivo de esta invención son comúnmente sobreexpresadas, sobreacumuladas o activadas en células patológicas contra células normales. Los principios más importantes que distinguen la invención actual de otros enfoques son: (1) Esta invención describe la síntesis de sustratos para enzimas como timidilato sintasa. La enzima sobreexpresada convertirá profármacos a toxina, de preferencia en células enfermas. Los enfoques previos se han calculado generalmente en inhibidores de estas enzimas. Los inhibidores conducen a expresión amplificada de la enzima, y resistencia subsecuente al tratamiento (véase, por ejemplo, Lónn, U. et al. (1996); Paradiso, A. et al. (2000); y Edler, D. (2000) ) . (2) El enfoque actual es también distinguible de otro enfoque de "profármaco de sustrato", por ejemplo, las enzimas de glutation-S-transferasa (véase, por ejemplo, Morgan, A.S. et al. (1998)). Las enzimas de la familia GST se expresan a niveles elevados en respuesta al agravio tóxico a la célula. La familia GST de enzimas tiene especificidades de sustrato traslapantes, las cuales son difíciles para diseñar un reactivo de sustrato con únicamente una sola especie de enzima con expresión elevada en una célula de cáncer (Morgan, A.S. et al. (1998)). Debido a las enzimas objetivo de la invención actual (por ejemplo, timidilato sintasa, dihidrofolato reductasa y timidina cinasa) son únicas con respecto a su estructura y especificidad de sustrato, es fácil diseñar los sustratos únicos. Varios ejemplos de sustratos de timidilato sintasa se proporcionan infra. (3) En algunos casos el gen que codifica la enzima objetivo (por ejemplo, timidilato sintasa) puede haber experimentado mutación para dar resistencia a los inhibidores, (Barbour, K.W. et al. (1992) y Dicken, A.P. et al. (1993)) pero todavía será capaz de llevar a cabo la reacción con fármacos de sustrato sin inhibidor. (4) Una ventaja de este enfoque es que la pérdida de función supresora de tumor es crítica para desarrollo de malignidad. La mayoría de las células tumorales han perdido una de las funciones supresoras de tumor p53, RB o pl6.
(Funk, J.O. (1999); Banerjee, D. (1998); y Th, B.T. et al. (1999)). Tal pérdida resulta en expresión incrementada de enzimas de resistencia (por ejemplo, timidilato sintasa) , independiente de exposición previa a quimioterapia. Los profármacos descritos en la presente serán útiles en tratar etapas tempranas de malignidad, así como enfermedad previamente tratada con quimioterapia. Los sustratos para enzimas como GST incluyen muchos compuestos no relacionados a quimioterapia. ( halen and Boyer (1998)). Los conceptos descritos anteriormente se exponen gráficamente en la Figura ÍA y IB utilizando el ejemplo de la enzima de timidilato sintasa y el compuesto NBlOll™. En una modalidad alternativa, la célula objetivo se define por su resistencia a un fármaco o compuesto no relacionado a cáncer. En este caso, la célula se infecta con un microorganismo que confiere resistencia a un antibiótico, por ejemplo, beta-lactamasa. Los organismos incluyen bacterias, levaduras y parásitos, tales como tripanosomas . La Tabla 2 proporciona una lista de enzimas seleccionadas para este enfoque en una enfermedad infecciosa. •-.>«*! Los profármacos de esta invención se seleccionan del grupo que consiste de isómeros L y D de los compuestos que tienen la estructura: L o p. o ?L en donde: R" es una porción de la fórmula: con la condición de que en el compuesto I, n pueda ser 0. R2 es una porción de conducto de electrón divalente seleccionada del grupo que consiste de un grupo hidrocarbilo insaturado; un grupo hidrocarbilo aromático que comprende uno o más grupos hidrocarbilo insaturados; y, un grupo heteroaromático que comprende uno o más grupos hidrocarbilo insaturados; R3 se selecciona del grupo que consiste de: >—CH2 CHR — |—C(R?)a R5 puede ser el mismo o diferente y es independientemente un grupo alquilo lineal o ramificado que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, o un grupo cicloalquilo que tiene de 3 a 10 átomos de carbono, o un halógeno (por ejemplo, F, Cl, Br, I) ; o el grupo: o el grupo: en donde n es 0 o un número entero de 1 a 10 y m es 0 ó 1; en donde R4 puede ser un sustituyente seleccionado del grupo que consiste de _*.*..** ** -Z— CF,— CHF— CH, — C— OH -Z— CF2 — CH2 — CH2 — N02 en donde R y R1 son alquilos inferiores y RL° es H o CH. y cada sustituyente X es independientemente el mismo o diferente del otro y es -Cl, -Br, -I, u otro grupo saliente potente, con la condición de que cuando R' sea -H, y m sea cero, entonces R4 no sea un halógeno o cuando m sea cero y n sea cero, entonces R4 no sea un halógeno; en donde cada sustituyente Y es independientemente el mismo o diferente del otro y es independientemente -H o -F y cada sustituyente Z es independientemente el mismo o diferente del otro y es -O- o -S-. En un aspecto, m es 0 y R2 es un grupo hidrocarbilo aromático seleccionado del grupo que consiste de: En un aspecto alternativo, m es 0 y R~ es un grupo heteroaromático seleccionado del grupo que consiste de: en donde J se selecciona del grupo que consiste de -O-, -S-, -Se-, -NH-, y -NRALQ- y en donde RALQ es un alquilo lineal o ramificado que tiene 1 a 10 átomos de carbono o un grupo cicloalquilo que tiene 3 a 10 átomos de carbono.' En un aspecto específico, R1 se selecciona del grupo que consiste de: Q es uno seleccionado del grupo que consiste de un azúcar, un compuesto carbocílico, un acíclico y derivados de fosfato o fosforamidato enmascarados del mismo. La derivación de fosfato o fosforamidato enmascarada se une a Q en la posición 5' del compuesto, mostrado en mayor detalle posteriormente. Por ejemplo, Q es una porción seleccionada 10 del grupo que consiste de: en donde cada RD es independientemente el mismo o diferente del otro y se selecciona del grupo que consiste de -H-, -OH, -OC(=0)CH3, F, y otro grupo hidroxilo protegido; y ?H??á?íÍ&? ÍSa? ,4, l. ,i -? . -Í ..*M :. , .» - - .1 t.yiat R es hidrógeno, un grupo fosfato, un grupo fosfodiéster, o un grupo fosforamidato unido a Q en la posición 5' . Se deberá entender que, aunque no se establece explícitamente que cualquiera de los profármacos de esta invención pueden estar en cualquier forma enantiomérica, diastereiomérica, o estereoisomérica, incluyendo, forma D, forma L, forma a-anomérica, y forma ß-anomérica. En una modalidad, R4 es, o contiene una entidad química seleccionada del grupo que consiste de -Br, -I, -0-alquilo, -O-arilo, O-heteroarilo, -S-alquilo, -S-arilo, -S-heteroarilo, -CN, -OCN, -SCN, -NH2, -NH-alquilo, -N (alquilo) 2 -NHCHO, -NHOH, -NHO-alquilo, NH2C0NH0-, NHNH2, -N3 y un derivado de cis-platina, tal como: En una modalidad, Q es: en donde R7 es como se describió anteriormente, o más específicamente, una estructura tal como: o un compuesto que tiene la estructura: en donde R es un sustituyente aromático. En una modalidad alternativa, R7 es un grupo fosforamidato derivado de un aminoácido, incluyendo, por ejemplo, los veinte aminoácidos que ocurren naturalmente. En una modalidad, R7 es un grupo fosforamidato derivado de alanina. En una modalidad, R7 es o contiene un grupo que tiene la estructura: :* -m El grupo anterior, y métodos para su preparación, se describen en McGuigan, et al. (1993), y McGuigan, et al. (1996) . Esta invención también proporciona un isómero L o D del compuesto que tiene la estructura: o tautómeros del mismo, en donde R1 es un sustituyente que tiene la fórmula : en donde R2 y R3 son el mismo o diferente y son independientemente un grupo hidrocarbilo insaturado o saturado; en donde R4 se selecciona del grupo que consiste de F, Cl, Br, I, CN, SO3H, C02H, C02CHjCH3, SI(CH3)3 CHO, N02, CF,, CCI3, C(R )^; en donde R5 se selecciona del grupo que consiste de F, Cl, Br, e I; en donde n es 0 o un número entero de 1 a 10 y m es 0 ó 1; y Q es como se definió anteriormente . En un aspecto, m es 0 y R2 se selecciona del grupo que consiste de: O O -CHfi I CI -CHjS I CI -CHaO C- en donde R5 es independientemente el mismo o diferente y se selecciona del grupo que consiste de un grupo alquilo lineal o ramificado que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, un grupo cicloalquilo que tiene de 3 a 10 átomos de carbono, CN y un halógeno. En otro aspecto, R" y R3 tomados juntos es un alquenilo o alquinilo y se selecciona del grupo que consiste de: En otro aspecto, m es 0 y R~ es un grupo hidrocarbilo aromático seleccionado del grupo que consiste de: En un aspecto adicional, m es 0 y R es un grupo heteroaromático seleccionado del grupo que consiste de: en donde J se selecciona del grupo que consiste de -O-, -S-, -Se-, -NH-, y -NRALQ- y en donde RA0 es un alquilo lineal o ramificado que tiene 1 a 10 átomos de carbono o un grupo cicloalquilo que tiene 3 a 10 átomos de carbono. Para esta modalidad, R7 es como se describió anteriormente . En una modalidad específica, R7 es: El grupo anterior, y métodos para su preparación, se describen en Abraham, et al. (1996). En una modalidad, R7 es un grupo fosfato o es, o contiene un grupo que tiene una estructura seleccionada del grupo que consiste de: El primero de los dos grupos anteriores, y métodos para su preparación, se describen en Freed, et al. (1989), Sastry, et al., (1992); Farquhar, et al. (1994), y Farquhar, et al. (1995). El segundo de los dos grupos anteriores, y métodos para su preparación, se describen en Valette, et al. (1996); y Benzaria, et al. (1996). En una modalidad, R7 es, o contiene un grupo que tiene una estructura seleccionada del grupo que consiste de: en donde R es un sustituyente aromático el primero de los dos grupos anteriores, y métodos para su preparación, se describen en Meier, et al. (1997). El segundo de los dos grupos anteriores, y métodos para su preparación, se describen en Hostetler, et al. (1997); y Hostetler, et al., Solicitud de Patente Internacional publicada No. WO 96/40088 (1996) . En una modalidad, R7 forma un grupo cíclico dentro de Q. Una de tal modalidad, y un método para su preparación se muestra posteriormente (en donde DMTr es 4,4'-dimetoxitritilo, Boc es t-butiloxicarbonilo, DCC es 1,3-diciclohexilcarbodiimida, y 4-DMAP es 4-dimetilaminopiridina) : En una modalidad, el compuesto puede estar en una forma de sal, o en una forma protegida o de profármaco, o en una combinación del mismo, por ejemplo, como una sal, un éter, o un éster. En una modalidad separada, las estructuras anteriores se modifican además para poseer tiofosfodiaziridina en lugar de grupos fosfodiaziridina, ^ ^^L^ utilizando los métodos descritos posteriormente. La síntesis de los derivados de pipmidina 5-sustituidos observados anteriormente puede lograrse por métodos que son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, el tratamiento de 5-cloromercuri-2' -desoxiuridina con compuesto haloalquilo, haloacetatos o haloalquenos en la presencia de Li2PdCl resulta en la formación, a través de un intermediario de organopaladio, del derivado 5-alquilo, 5-acetilo o 5-alqueno, respectivamente. Wataya, et al. (1979) y Bergstrom, et al. (1981). Otro ejemplo de modificación C5 de nucleósidos de pirimidina y nucleótidos es la formación de derivados de C5-trans-estirilo por tratamiento de nucleótido desprotegido con acetato mercúrico seguido por la adición de estireno o estirenos sustituidos en el anillo en la presencia de Li2PdCl4. Bigge, et al. (1980). Los trifosfatos de pirimidin desoxiribonucleósido se derivaron con mercurio en la posición 5 del anillo de pirimidina por tratamiento con acetato mercúrico en amortiguador de acetato a 50° durante 3 horas. Dale, et al. (1973) . Tal tratamiento también se esperaría que fuera efectivo para la modificación de monofosfatos; alternativamente, un trifosfato modificado podría convertirse enzimáticamente a un monofosfato modificado, por ejemplo, por tratamiento controlado con fosfatasa alcalina seguida por purificación de monofosfato. Otras porciones, orgánicas o no orgánicas, con propiedades moleculares similares a mercurio, pero con propiedades farmacológicas preferidas podrían sustituirse. Para métodos generales para síntesis de pirimidinas sustituidas, véase por ejemplo, Patentes Norteamericanas Nos. 4,247,544; 4,267,171; y 4,948,882; y Bergstrom, et al. (1981). Los métodos anteriores podrían también aplicarse a la síntesis de los derivados de nucleósidos de pirimidina 5-sustituidos y nucleótidos que contienen azúcares diferentes de ribosa o 2' -desoxiribosa, por ejemplo 2' -3' -didesoxiribosa, arabinosa, furanosa, lixosa, pentosa, hexosa, heptosa, y piranosa. Un ejemplo de un sustituyente en la posición 5 es el grupo halovinilo, por ejemplo, E-5- (2-bromovinil) -2' -desoxiuridilato. Barr, P.J. et al. (1983) . Alternativamente, 5-bromodesoxiuridina, 5-yododesoxiuridina, y sus derivados de monofosfato están comercialmente disponibles de Glen Research, Sterling, VA (USA), Sigma-Aldrich Corporation, St. Louis, MO(USA), Moravek Biochemicals, Inc., Brea, CA (USA), ICN, Costa Mesa, CA (USA) y New England Nuclear, Boston, MA (USA) . La 5-bromodesoxiuridina y 5-yododesoxiuridina comercialmente disponibles pueden convertirse a sus monofosfatos ya sea química o enzimáticamente, aunque la acción de una enzima cinasa utilizando reactivos comercialmente disponibles de Glen Research, Sterling, VA (USA) e ICN, Costa Mesa, CA (USA) . Estos derivados de halógeno pueden combinarse con otros sustituyentes para crear antimetabolitos novedosos y más potentes. Las estructuras en la posición 5 de uracilo se refieren como las uniones porque se conectan al grupo saliente propuesto (toxophore) al heterociclo. Hasta la activación del heterociclo por la reacción con el residuo Cys en el sitio activo de una enzima humana, TS, por ejemplo, una carga negativa se conduce de la posición 6 de uracilo en la unión. Este mecanismo ha sido descrito para las versiones 5'-monofosforiladas de (E) -5- (bromovinil) -2' -desoxiuridina (BVdU) por Barr, P.J. et al. (1983) y de (E) -5- (3, 3, 3-trifluoro-1-propenil) -2' -desoxiuridina (TFPe-dUrd) por Wataya, et al. (1979), Santi (1980); y Bergstrom, et al. (1984) . El "separador" de unión entre la toxina y dNMP debe estar insaturado a fin de que pueda conducir la carga negativa labilizando la toxina suministrada por el ataque de TS-Cys-sulfihidrilo. De las muchas funcionalidades orgánicas insaturadas disponibles para este propósito, las unidades vinilo, alilo y propargilo son simples, pequeñas y fácilmente accesibles en forma sintética. Las unidades vinilo y alilo tienen la ventaja que pueden prepararse en cualquiera de las dos formas isoméricas geométricas no interconvertibles. Así, pueden utilizarse como "sondas" de acomodación de profármaco para el sitio activo de enzima. Por otro lado, la unidad de propargilo tiene la ventaja de ser simétrica cilindricamente, a fin de que de la toxina de enzima catalizada liberada de este tipo de unión no dependa de su orientación con respecto al anillo de uracilo dUMP, como es el caso con las moléculas de vinilo y alilo. Dos enfoques distintos han sido tomados para diseñar algunos de los profármacos basados en nucleótido de esta invención. Uno se basa en la estructura del monofosfato de BVdU y caracteriza un grupo saliente/toxina directamente unido a los términos de un sustituyente de (poli) vinilo a C5 de dUMP. Este es el enfoque de unión de vinilo. El otro se basa en la estructura de TFPe-dUMP y es similar al primero, pero tiene una unidad de metileno que separa el grupo saliente/toxina y la unidad insaturada y así contiene una unidad alilo o propargilo. Este es el enfoque de unión de alilo . El mecanismo de activación de una versión de propargilo del enfoque de unión de alilo tiene un precedente en la interacción de 5' -monofosfato de 5-etinil-2'-desoxiuridina (EdUMP) y 5' -monofofato de 5- (3-hidroxi-l-propinil) -2' -desoxiuridina (HOPdUMP) con TS (Barr, et al. (1981); Barr and Robins 1983). EdUMP es un inhibidor potente de TS (Ki = 0.1 TM) , y probablemente forma una especie basada en aleño en el sitio activo. HOPdUMP (Ki = 3.0 TM) muestra cinéticas de inhibición inusuales, que podrían deberse a la formación de una especie basada en cumuleno en el sitio activo. Los 5, 6-dihidrofuracilos 5-alquilidenados similares en la estructura al intermediario común en los mecanismos de enfoque de unión de vinilo y alilo han sido sintetizados recientemente (Anglada et al. (1996). Estos se muestran por ser altamente electrofílieos. Su fácil reacción con etanol para generar 5- (etoximetil) uracilo es un precedente para la adición de agua que regenera catalíticamente TS competente. Aún más recientemente, la existencia del intermediario de metileno C5 elusivo largo producido por TS se demostró por estudios de atrapado (Barret, et al. (1998)). Modalidades particulares incluyen los compuestos que tienen las estructuras L o D mostradas posteriormente. Los compuestos se identifican por estructura y una designación numérica.
NB10I4 NBIC07 — — — SlMßj . NB1018 NB1Q22 _»__ — -H NB1019 NB1Q23 •H NB102S NB1026 •C?r — NB102 Modalidades preferidas se muestran posteriormente. Un compuesto que tiene la estructura: en donde Xd y Xe son independientemente los mismos o diferentes y se seleccionan del grupo que consiste de Cl, Br, I y CN o los análogos del nucleósido del mismo. En un aspecto más preferido, Xd es Cl o Br y Xe es H. Un compuesto que tiene la estructura: en donde Xf y Xg son independientemente los mismos o diferentes y se seleccionan del grupo que consiste de Cl, Br, I, y CN o los análogos del nucleósido del mismo. En una uno Cl mula: en donde cada X se selecciona del grupo que consiste de Cl, Br, I, y CN; o los análogos nucleósido del mismo. En una modalidad preferida, X es Cl o Br y en una modalidad más preferida, X es Br. Un compuesto que tiene la estructura: en donde Rd es un alquilo de cadena lineal o ramificada inferior, o los análogos nucleósido del mismo.
Un compuesto que tiene la estructura: en donde R y R9 y alquilos de cadena lineal o ramificada inferiores y R10 es H o CH3 o los análogos nucleósido del mismo. Un compuesto que tiene la estructura: en donde R ,10 es H o CH3; o el análogo de nucleósido del mismo, Un compuesto que tiene la estructura: Un compuesto que tiene la estructura: o el análogo de nucleósido del mismo. Un compuesto como se describe en la presente, en donde el compuesto tiene la estructura: En un aspecto, R' = H. En otro aspecto, R7 es un sustituyente que tiene la estructura: Un compuesto como se describe en la presente, en donde el compuesto tiene la estructura: en donde R7 = H o R7 es un sustituyente que tiene la estructura Un compuesto que tiene la estructura: Un compuesto que tiene la estructura: en donde cada X se selecciona del grupo que consiste de C02Et, Cl, y Br; o el análogo de nucleósido del mismo. Un compuesto que tiene la estructura: o el análogo de nucleósido del mismo. Un compuesto que tiene la estructura: 1 1 o el análogo de nucleósido del mismo. Los profármacos pueden combinarse con un portador, tal como un portador farmacéuticamente aceptable, para uso in vitro e in vivo. 5 Esta invención también proporciona un ensayo de tamización rápido y simple que permitiría identificación inicial de compuestos novedosos con por lo menos algunas de las características deseadas (véase Figura 2A y 2B) . El ensayo requiere por lo menos dos tipos de células, la primera 10 siendo una célula control en la cual la enzima objetivo no se expresa o se expresa a un nivel bajo, por ejemplo, una célula normal. El segundo tipo de célula es la célula probada en la cual la enzima objetivo se expresa a un nivel detectable, por ejemplo, un nivel elevado. Esta célula puede ser una línea de 15 célula tumoral que se selecciona para niveles mejorados de enzimas objetivo. Alternativamente, una célula genéticamente modificada para expresar diferencialmente la enzima o enzimas objetivo (que contiene las especies apropiadas de enzima objetivo) pueden utilizarse. La transfección de células yy?¿^^a¿ huéspedes con polinucleótidos que codifican la enzima objetivo es ya sea pasajera o permanente utilizando procedimientos bien conocidos en la técnica y descritos en Chen, L. et al. (1996); Hudziak, R.M. et al. (1988); o Cárter, P. et al. (1992), y en la sección experimental siguiente. Las células pueden ser procarióticas (bacterias tales como E. coli ) o eucarióticas. Las células pueden ser células de mamífero o no mamífero, por ejemplo, células de ratón, células de rata, células de humano, hongos (por ejemplo, levaduras), o parásitos (por ejemplo, Pneumocistis o Leishmania) que provocan enfermedades. Vectores adecuados para inserción del ADNc están comercialmente disponibles de Stratagene, La Jolla, CA y otros vendedores. La cantidad de expresión puede regularse por el número de copias del cásete de expresión introducido dentro de la célula o variando el uso promotor. El nivel de expresión de la enzima en cada línea celular transfectada puede verificarse por ensayo de inmunotransferencia y enzima en lisatos celulares, utilizando anticuerpos monoclonales o policlonales previamente elevados contra la enzima para inmuno-detección. (Chen, L. et al. (1996)). Los ensayos enzimáticos para detectar la cantidad de enzima expresada también pueden realizarse como se reseña por Carreras, C.W. and Santi, D.V. (1995), o el método descrito en la sección experimental siguiente. ¡_^^^^^^¡¡^ En un aspecto adicional, más de una especie de enzima puede ser utilizada para transducir separadamete células huéspedes separadas, a fin de que el efecto del fármaco candidato en una enzima objetivo pueda compararse simultáneamente a su efecto en otra enzima o una enzima correspondiente de otras especies. En otra modalidad, una tercera célula objetivo se usa como un control porque ésta recibe una cantidad efectiva de un compuesto profármaco de esta invención. Esta modalidad es particularmente útil para tamizar para nuevos agentes que son activados por timidilato sintasa. En aún otro aspecto, por lo menos un sistema de célula probada adicional se establece a la prueba del potencial sinergístico de la prueba terapéutica en combinación con otra terapia o agente conocido. Para los propósitos de esta invención, el fármaco candidato exitoso bloqueará el crecimiento o eliminación del tipo celular de prueba, pero deja el tipo de célula control ileso. Los ensayos de crecimiento pueden realizarse por métodos estándares como se describe por Miller (1992) ; Sugarman, B.J. et al. (1985) y Spector, D.L. et al. (1998), o utilizando los métodos descritos en la sección experimental siguiente. Se entenderá por aquellos expertos en la técnica que el tamiz puede aplicarse ampliamente para el ... i, descubrimiento de antibióticos. Por ejemplo, la timidilato sintasa de levadura podría sustituirse por aquella de las formas humana o E. coli de la enzima. Esto permitiría el descubrimiento de antibióticos antifúngicos específicos que apunten a levadura relacionada a patógenos. Además, otras enzimas pueden someterse a este tratamiento. Por ejemplo, los profármacos que apunten específicamente a la actividad de dihidrofolato reductasa de agentes infecciosos, como Pneumocystis carnii , podrían seleccionarse. Estos agentes serán seleccionados para especificidad por la enzima objetivo, y pueden mostrarse sin activar la enzima del huésped natural empleando el ensayo de tamización descrito en la presente. Las construcciones celulares control contendrán la enzima humana normal correspondiente, para mostrar la falta de toxicidad cuando solamente la enzima humana normal está presente. Las Figuras 2A y 2B muestran cómo uno puede conducir por lo menos una modalidad de este aspecto de la invención. Un gen extraño, por ejemplo, un gen humano que codifica TS, se insertó en la célula huésped de manera que el TS humano se expresa. La "célula control" no expresa la enzima objetivo. En algunas modalidades, esto puede ser necesario para suplementar los medios de cultivo con el producto de proteína de la enzima objetivo. El profármaco candidato puede agregarse ^ ^A Ít - ^^? f directamente al medio de cultivo celular y la célula objetivo o el medio de cultivo se ensayó entonces para la cantidad de liberación marcada del profármaco candidato si el profármaco contiene una marca detectable. Alternativamente, la incorporación celular puede mejorarse empacando el profármaco dentro de los liposomas utilizando el método descrito en Lasic, D.D. (1996) o combinados con citofectinas como se describió en Lewis, J.G. et al. (1996). Una modalidad alternativa para un profármaco que tiene ventaja de sobreexpresión TS en células tumorales es un fosforamidato de desoxiuridina, u otras modificaciones (citadas en la presente) conjugadas con un radionuclido terapéutico. Un ejemplo de un radionuclido terapéutico es renio 188. El isótopo puede sintetizarse esencialmente como se describió por Callahan, et al. (1989). Alternativamente, puede obtenerse comercialmente, por ejemplo de Mallicrodt Medical BV, The Netherlands. El radionuclido terapéutico puede conjugarse con desoxiuridina, o desoxiuridina 5'-fosforamidato, u otro derivado, por métodos estándares por ejemplo, como se describió por Lin, W.Y. et al. (1997). El fosforamidato de desoxiuridina que contiene radionuclido se tomará de preferencia en el ADN de células tumorales que sobreexpresan la timidilato sintasa y provocan su muerte a través de la emisión concentrada de radiación beta y gamma. Los radionuclidos alternativos incluyen renio-186, y otros.
(Troutner, D.A. (1987)). Los compuestos son útiles para predecir si un sujeto será tratado adecuadamente por un profármaco de esta invención suministrando a una muestra que contiene la célula a ser tratada un profármaco y ensayando para muerte celular o inhibición de la proliferación celular. Los solicitantes proporcionan equipos para determinar si una célula patológica o un paciente será tratado adecuadamente por esta terapia proporcionando por lo menos un profármaco de esta invención e instrucciones para uso. Esta invención también proporciona un método para inhibir la proliferación de una célula patológica u objetivo in vi tro o in vi vo suministrando a la célula una cantidad efectiva de un profármaco de esta invención. Cuando se practica in vivo, el método es útil para tratar una patología caracterizada por células objetivo en un sujeto suministrando al sujeto una cantidad efectiva de un profármaco de esta invención. Cuando la célula objetivo es célula objetivo es resistente a un fármaco quimioterapéutico, el método puede modificarse adicionalmente poniendo en contacto o administrando a la célula o paciente una cantidad efectiva del fármaco al cual la célula tienen resistencia desarrollada. Debido a que los profármacos de esta invención pueden tener resistencia inversa a la terapia anterior, ÍJ-JJ-,.1 subsecuente al tratamiento exitoso con un profármaco de esta invención, la administración de la terapia previa pueden nuevamente inhibir el desarrollo o metástasis de tumores. Ejemplos en donde esto puede ocurrir incluyen, pero no se limitan a cuando la célula objetivo expresa una enzima que se amplifica como un resultado de selección in vivo por quimioterapia o cuando la enzima objetivo es una enzima intracelular endógena que se sobreexpresa en la célula objetivo. Un ejemplo de tal enzima es timidilato sintasa la cual ha sido mostrada para ser sobreexpresada como un resultado de quimioterapia anterior y confiere un fármaco resistente al fenotipo en la célula al fármaco anterior. Los profármacos de esta invención pueden también combinarse con otras terapias conocidas para mejorar o sinergizar los efectos terapéuticos de cualquiera o ambas terapias anteriores o el efecto terapéutico del profármaco. Tales terapias anteriores incluyen, pero no se limitan a quimioterapia de cáncer, terapia de radiación y cirugía. Cuando se suministra a un animal, el método también es útil para confirmar además la eficacia del profármaco. Como un ejemplo de un modelo animal, grupos de ratones desnudos (Balb/c NCR nu/nu hembras, Simonsen, Gilroy, CA) son cada uno inoculados subcutáneamente con células de cáncer u objetivo hiperproliferativas de aproximadamente 10° a aproximadamente 10s, como se define en la presente. Cuando el i j tumor se estabiliza, el profármaco se administra, por ejemplo, por rutas intraperitoneal o intravenosa. Las mediciones de tumor para determinar la reducción del tamaño de tumor se hace en dos dimensiones utilizando calibradores de venier dos veces en una semana. Otros modelos animales también pueden emplearse como apropiados. (Lovejoy et al. (1997); Clarke, R. (1996); y Pegram. M. D. et al. (1997)). La administración in vivo puede efectuarse en una dosis, continua o intermitentemente a través de todo el curso del tratamiento. Los métodos para determinar los mayores medios efectivos y dosis de administración son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica y variarán con la composición usada para terapia, el propósito de la terapia, la célula objetivo siendo tratada, y el sujeto siendo tratado. Las administraciones solas o múltiples pueden llevarse a cabo con el nivel de dosis y el paciente siendo seleccionado por el médico tratante. Las formulaciones y métodos de dosis adecuados de administrar los agentes pueden encontrarse posteriormente. El profármaco, combinaciones de fármacos, o composición que contiene cualquiera de los dos puede utilizare en la fabricación para medicamentos para el tratamiento de humanos y otros animales por administración de acuerdo con procedimientos convencionales, tales como un ingrediente activo en composiciones farmacéuticas.
|^^^^ —• ""•* **»"- '-' * Las composiciones farmacéuticas pueden administrarse oral, intranasal, parenteralmente o por terapia de inhalación, y pueden tomar la forma de tabletas, pastillas, granulos, cápsulas, pildoras, ámpulas, supositorios o forma de aerosol. Pueden también tomar la forma de suspensiones, soluciones y emulsiones del ingrediente activo en diluyentes acuoso o no acuosos, jarabes, granulados o polvos. Además de un compuesto de la presente invención, las composiciones farmacéuticas pueden contener también otros compuestos farmacéuticamente activos o una pluralidad de compuestos de la invención. Más particularmente, un compuesto de la fórmula de la presente invención también mencionado en la presente como el ingrediente activo, puede administrarse para terapia por cualquier ruta adecuada incluyendo oral, rectal, nasal, típica (incluyendo transdérmica, aerosol, bucal y sublingual) , vaginal, parental (incluyendo subcutánea, intramuscular, intravenosa e intradérmica) y pulmonar. También se apreciará que la ruta preferida variará con la condición y edad del receptor, y la enfermedad siendo tratada. En general, una dosis adecuada para cada uno de los compuestos nombrados anteriormente, está en el rango de aproximadamente 1 a aproximadamente 100 mg por kilogramo de peso corporal del receptor por día, preferiblemente en el . &&&•- ^ **»*.-rango de aproximadamente 1 a aproximadamente 50 mg por kilogramo de peso corporal por día y de mayor preferencia en el rango de aproximadamente 1 a aproximadamente 25 mg por kilogramo de peso corporal por día. A menos que se indique de otra manera, todos los pesos del ingrediente activo se calculan como el compuesto paterno de la fórmula de la presente invención para sales o esteres del mismo, los pesos podrían incrementarse proporcionalmente. La dosis deseada se presenta preferiblemente como dos, tres, cuatro, cinco, seis o más sub-dosis administradas en intervalos apropiados a través de todo el día. Estas sub-dosis pueden administrarse en formas de unidad de dosis, por ejemplo, conteniendo aproximadamente 1 a aproximadamente 100 mg, preferiblemente aproximadamente 1 a aproximadamente 25 mg, y de mayor preferencia aproximadamente 5 a aproximadamente 25 mg del ingrediente activo por forma de unidad de dosis. Se apreciará que las dosis apropiadas de los compuestos y composiciones de la invención pueden depender del tipo y severidad y etapa de la enfermedad y pueden variar de paciente a paciente. Determinando la dosis óptima generalmente implicará el balanceo del nivel de beneficio terapéutico contra cualquier riesgo o efectos secundarios nocivos de los tratamientos de la presente invención. De manera ideal, el profármaco debe administrarse para lograr concentraciones pico del compuesto activo a sitios de enfermedad. Esto puede lograrse, por ejemplo, por inyección intravenosa del profármaco, opcionalmente en solución salina, o administrada oralmente, por ejemplo, como una tableta, cápsula o jarabe que contiene el ingrediente activo. Los niveles sanguíneos deseables del profármaco pueden mantenerse por una infusión continua para proporcionar una cantidad terapéutica del ingrediente activo dentro del tejido de la enfermedad. El uso de combinaciones operativas se contempla para proporcionar combinaciones terapéuticas que requieren una dosis total inferior de cada agente antiviral componente que puede requerirse cuando cada compuesto terapéutico individual o fármaco se utiliza solo, por lo que reduce efectos adversos. Mientras que es posible para el ingrediente profármaco ser administrado solo, es preferible presentarlo como una formulación farmacéutica que comprende por lo menos un ingrediente activo, como se definió anteriormente, junto con uno o más portadores farmacéuticamente aceptables para eso y opcionalmente otros agentes terapéuticos. Cada portador debe ser "aceptable" en el sentido de ser compatible con los otros ingredientes de la formulación y no dañinos al paciente. Las formulaciones de la presente invención adecuada para administración oral pueden presentarse como unidades discretas tales como cápsulas, obleas o tabletas, cada una «Ai i conteniendo una cantidad predeterminada del ingrediente activo; como un polvo o granulos; como una solución o suspensión en un líquido acuoso o no acuoso; o como una emulsión líquida aceite en agua o una emulsión líquida agua en aceite. El ingrediente activo puede también presentar un bolo, remedio o pasta. Una tableta puede hacerse por compresión o moldeando, opcionalmente con uno o más ingredientes adicionales. Las tabletas comprimidas pueden prepararse comprimiendo en una máquina adecuada el ingrediente activo en una forma de flujo libre tal como un polvo o granulos, opcionalmente mezclados con un aglutinante (por ejemplo, povidona, gelatina, hidroxipropilmetilcelulosa) , lubricante, diluyente inerte, conservador, desintegrante (por ejemplo, glicolato de almidón de sodio, povidona reticulada, carboximetilcelulosa de sodio reticulada) agente de superficie activo o dispersante. Las tabletas moldeadas pueden hacerse moldeando en una máquina adecuada una mezcla del compuesto en polvo humectado con un diluyente líquido inerte. Las tabletas pueden opcionalmente recubrirse o clasificarse y pueden formularse para proporcionar liberación lenta o controlada del ingrediente activo en la presente utilizando, por ejemplo, hidroxipropilmetilcelulosa en proporciones que varían para proporcionar el perfil de liberación deseado. Las tabletas pueden opcionalmente proporcionarse con un recubrimiento entérico, para proporcionar liberación en partes del intestino diferentes del estómago. Las formulaciones adecuadas para administración local en la boca incluyen obleas que comprenden el ingrediente activo en una base saborizada, usualmente sacarosa y acacia o tragacanto; pastillas que comprenden el ingrediente activo en un base inerte tal como gelatina y glicerina, o sacarosa y acacia; y enjuagues bucales que comprenden el ingrediente activo en un portador líquido adecuado . Las composiciones farmacéuticas para administración local de acuerdo con la presente invención pueden formularse como un ungüento, crema, suspensión, loción, polvo, solución, pasta, gel, rocío, aerosol o aceite. Alternativamente, una formulación puede comprender un parche o una venda tal como un vendaje o enyesado adhesivo impregnado con ingredientes activos y opcionalmente uno o más excipientes o diluyentes. Para enfermedades del ojo u otros tejidos externos, por ejemplo, boca y piel, las formulaciones se aplican preferiblemente como un ungüento tópico o crema que contiene el ingrediente activo en una cantidad de, por ejemplo, aproximadamente 0.075 a aproximadamente 20% p/p, de preferencia de aproximadamente 0.2 a aproximadamente 25% p/p y de mayor preferencia aproximadamente 0.5 a aproximadamente 10 a p/p. Cuando se formula en un ungüento, el profármaco puede emplearse con ya sea una base de ungüento parafínica o miscible en agua. Alternativamente, los ingredientes del profármaco pueden formularse en una crema con una base de crema aceite en agua. Si se desea, la fase acuosa de la base de crema puede incluir, por ejemplo, por lo menos aproximadamente 30% p/p de un alcohol polihídrico, es decir, un alcohol que tiene dos o más grupos hidroxilo tales como propilenglicol, butan-1,3-diol, manitol, sorbitol, glicerol y polietilenglicol y mezclas de los mismos. Las formulaciones locales pueden incluir deseablemente un compuesto que mejora absorción o penetración del ingrediente de profármaco a través de la piel u otras áreas afectadas. Ejemplos de tales mejoradores de penetración dérmica incluyen sulfóxido de dimetilo y análogos relacionados . La fase oleosa de las emulsiones de esta invención puede estar constituida de ingredientes conocidos en una manera conocida. Mientras que esta fase puede comprender solamente un emulsificador (de otra manera conocido como un emulgente) , comprende deseablemente una mezcla de al menos un emülsificador con una grasa o un aceite o con una grasa y un aceite. Preferiblemente, un emulsificador hidrofílico se incluye junto con un emulsificador lipofílico que actúa como un estabilizador. Es también preferido incluir un aceite y ,.-. «.. _. una grasa. Juntos, el o los emulsificadores con o sin el o los estabilizadores realizan la así llamada cera emulsificadora, y la cera junto con el aceite y/o grasa realizan la así llamada base de ungüento emulsificador que forma la fase dispersada de aceite de las formulaciones de crema. Emulgentes y estabilizadores de emulsión adecuados para uso en la formulación de la presente invención incluyen Tween 60, Span 80, alcohol cetoestearílico, alcohol miristílico, monoestearato de glicerilo y lauriisulfato de sodio . La elección de aceites o grasas adecuados para la formulación se basa en lograr las propiedades cosméticas deseadas, ya que la solubilidad del compuesto activo en más aceite probablemente para ser usados en formulaciones de emulsión farmacéutica es muy baja. Así, la crema debe ser preferiblemente un producto no grasoso, no teñido y lavable con consistencia adecuada para evitar la filtración de tubos u otros recipientes. La cadena lineal o ramificada, alquilésteres mono- o dibásicos tales como di-isoadipato, estearato de isocetilo, diéster de propilenglicol o ácidos grasos de coco, miristato de isopropilo, oleato de decilo, palmitato de isopropilo, estearato de butilo, palmitato de 2-etilhexilo o una mezcla de esteres de cadena ramificada conocidos como Crodamol CAP pueden utilizarse, los últimos • A. Ü<t tres siendo esteres preferidos. Estos pueden utilizarse solos o en combinación dependiendo de las propiedades requeridas. Alternativamente, los lípidos de punto de fusión elevados, tales como parafina suave blanca y/o parafina líquida u otros aceites minerales pueden utilizarse. Las formulaciones adecuadas para administración local al ojo también incluyen gotas para ojos en donde el ingrediente activo se disuelve o suspende en un portador adecuado, especialmente un solvente acuoso para el ingrediente profármaco. El ingrediente profármaco se presenta preferiblemente en tal formulación en una concentración de aproximadamente 0.5 a aproximadamente 20%, en forma ventajosa aproximadamente 0.5 a aproximadamente 10% en forma particular aproximadamente 1.5% p/p. Las formulaciones para administración rectal pueden presentarse como un supositorio con una base adecuada que comprende por ejemplo, manteca de cacao o un salicilato. Las formulaciones adecuadas para administración vaginal pueden presentarse como supositorios, tampones, cremas, geles, pastas, espumas o formulaciones en rocío que contienen en adición al ingrediente profármaco, tales portadores son como se conocen en la técnica por ser apropiados . Las formulaciones adecuadas para administración nasal, en donde el portador es un sólido, incluyen un polvo 4*i burdo que tiene un tamaño de partícula, por ejemplo, en el rango de aproximadamente 20 a aproximadamente 500 mieras que se administran en la forma en la cual se toma al inhalar, es decir, por inhalación rápida a través del pasaje nasal de un recipiente del polvo mantenido cerrado hasta la nariz. Las formulaciones adecuadas en donde el portador es un líquido para administración como, por ejemplo, rocío nasal, gotas nasales, o por administración de aerosol por nebulizador, incluyen soluciones acuosas u oleosas del ingrediente profármaco. Las formulaciones adecuadas para administración parenteral incluyen soluciones de inyección estéril isotónica acuosas y no acuosas las cuales pueden contener antioxidantes, amortiguadores, bacteriostatos y solutos los cuales suministran la formulación isotónica con la sangre del receptor pretendido; y suspensiones estériles acuosas y no acuosas las cuales pueden incluir agentes de suspensión y agentes espesantes, y liposomas u otros sistemas microparticulados los cuales se diseñan para apuntrar el compuesto a los componentes sanguíneos o uno o más órganos. Las formulaciones pueden presentarse en recipientes sellados de unidad de dosis o multidosis, por ejemplo, ámpulas y frascos, y pueden almacenarse en una condición de secado por congelamiento (liofilizada) que requiere únicamente la adición del portador líquido estéril, por ejemplo, agua para inyecciones, inmediatamente antes del uso. Las soluciones y suspensiones de inyección extemporáneas pueden prepararse de polvos estériles, granulos y tabletas del género previamente descrito. Se debe entender que además de los ingredientes particularmente mencionados anteriormente, las formulaciones de esta invención pueden incluir otros agentes convencionales en la técnica que tienen consideración al tipo de formulación en cuestión, por ejemplo, aquellos adecuados de administración oral puede incluir tales agentes adicionales como agentes edulcorantes, espesantes y saborizantes. Los profármacos y composiciones de la fórmula de la presente invención pueden también presentarse para el uso en la forma de formulaciones veterinarias las cuales pueden prepararse por métodos que son convencionales en la técnica. Los siguientes ejemplos se pretenden para ilustrar, pero no limitan la invención. Materiales y Métodos Síntesis de los Compuestos ECTA del Nucleósido La síntesis de los nucleósidos de pirimidina 5-sustituida observados anteriormente pueden lograrse por métodos que son bien conocidos en la técnica y descritos anteriormente de manera breve. En una modalidad, la presente invención implica cuatro clases de compuestos. Cada clase se define por la estructura de la base de uricilo, o base de uricilo modificada presente. Estas clases son compuestos ECTA en donde: 1) la base es una derivado de furano-pirimidinona de uracilo; 2) la base es 6-fluoro uracilo; 3) la base es derivado de uracilo sustituido con 4-hidrazona; 4) la base es uracilo. La base de uracilo o uracilo modificado se usa para sintetizar compuestos sustituidos con grupos salientes tóxicos en la posición 5, unida por una unión conductora de electrón en la posición 5, e incluye una porción separadora apropiada entre el conducto de electrón y el grupo saliente tóxico. Los compuestos ECTA pueden ser no fosforilados, 5'-monofosfato, 5' -fosfodiéster, o desoxiuridinas 5' -protegidas ("enmascarados") o derivados comparables de porciones de carbohidrato alternativas, como se describen posteriormente. Los derivados de monofosfato de desoxiuridina 5-sustituidas son aquellas en las cuales la porción de fosfato ha sido bloqueada a través de la unión de grupos de protección químicos adecuados. La protección de los derivados de monofosfato de desoxiuridina 5-sustituida pueden mejorar laq solubilidad, facilitar la penetración celular, facilitar el pasaje a través de la barrera de sangre-cerebro, y evitar la acción de fosfatasas celulares o extracelulares, lo cual puede de otra manera resultar en la pérdida del grupo de fosfato. En otra modalidad, los derivados de uracilo 5-sustituidos o uridina se administran a células que contienen í. i *i j actividad de cmasa de nucleósido, en donde el derivado de uracilo/updina 5-sust?tu?do se convierte a un derivado de monofosfato de uridina 5-sustitu?do. Los derivados de uridina pueden también modificarse para incrementar su solubilidad, penetración celular, y/o capacidad para cruzar la barrera de sangre-cerebro . La acción de la timidilato sintasa hasta los derivados de monofosfato de uridina 5-sustituidos pueden liberar el sustituyente unido en la posición 5 ("grupo saliente") del anillo de pirimidina. El sustituyente liberado es luego capaz, ya sea inherentemente o siguiendo la reacción con otro componente celular, de actuar como una toxina o un inhibidor de proliferación celular. Síntesis; de los compuestos ECTA con uniones de propargilo La síntesis de las 2' -desoxiuridinas equipadas con alcohol propargílico y alílico está directamente. Muchos de estos y sus derivados cercanos se reportan en la literatura, y algunos incluso se han estudiado junto con TS. Por ejemplo, 5-alquinil-dUMPs incluyendo el 5- (3-metoxi-l-propinilo) y 5- (3-hidroxi-l-propinilo) onas que han sido examinados como inhibidores TS (Bar, y Robins (1981) ) y algunos de estos han mostrado para incorporarse en el ADN de las células de cáncer deficientes de TS (Balzarini, J. et al. (1985)). Tanto 5-mercuri- (Ruth, J. L. et al. (1978)) como 5-yodouridinas (Robins, M.J. et al. (1981)) fácilmente se *? condensan con alquenos y alquinos en la presencia de un catalizador de paladio para producir uridinas equipadas con uniones C5. La ruta posterior es la más frecuentemente empleada (Robins, M. J. et al. (1982)), Asakura, J. et al. (1988) y (1990)). Las condensaciones de rendimiento elevadas de 5-yodo-2' -desoxiuridinas protegidas con propargiléter de t-butildimetilsililo (Graham, et al. (1998); De Clercq, et al. (1983), metil propargil éter (Tolstikov, et al. (1997)) y aún su alcohol propargílico (Chaudhuri, et al. (1995) y Goodwin, et al. (1993)) han sido logrados. El sustituyente 3-hidroxi-1-propinilo introducido por la reacción posterior puede también accesarse por reducción DIBAL-H de un grupo metacrilato (Cho, Y. M. et al. (1994)), por sí mismo elevándose de la misma reacción Heck usada en la síntesis de BVdU. Estas reacciones catalizadas con paladio son tan versátiles que pueden utilizarse para condensar ataduras basadas en propargilo muy largas y elaboradamente funcionalizadas para 5-yodo-2' -desoxiuridinas . (Livak, et al. (1992) y Hobbs (1989)). Las ataduras basadas en (Z) -alilo se generan por la hidrogenación parcial de un precursor propargílico sobre catalizador Undiar (Robins, M.J. et al. (1983)) mientras las onas basadas en (E) -alilo son mejor preparadas por acoplamiento Heck de un etileno (E)-tributilestanilado (Crisp, (1989)). Siguiendo estrechamente los procedimientos de literatura, una 2' -desoxiuridma de 3',5'-di-0 protegida equipada con t-butildimetilsilil propargiléter (Graham, et al. (1998), y De Clercq, et al. (1983)) se prepara y una porción de la misma, se convierte al (Z)-alil éter correspondiente (Robins and Barr (1983) ) se reduce. Debido a la remoción mediada por TBAF de un grupo TBDMS genera un oxianión que puede funcionalizar in si tu, estos nucleósidos de unión (Z)-alíticos y propargilo protegidos de TBDMS servirán como precursores convenientes para algunos de los objetivos equipados con toxofore. Para el nucleósido equipado con alcohol (E) -alílico, el derivado de 0-tetrahidropiraniléter conocido se prepara por la literatura de acoplamiento Heck de un etileno (E) -tributilestanilado (Crips (1989) ) .
Utilizando una etapa doble del protocolo de literatura (Phelps et al. (1980) and Hsiao and Bardos (1981)), los alcoholes propargílico y (E) y (Z) -alílico se convierten a sus bis-aziridinil fosforamidatos o tiofosforamidatos correspondientes a fin de que el procesamiento de TS de las versiones de 5' -mononucleótido liberarán un metabolito activo de los fármacos citostáticos TEPA o ThioTEPA (Dirven, et al. (1995)), respectivamente.
Síntesis de furano-pirimidinonas La síntesis de furano-pirimidinonas empezando con síntesis de una 2' -desoxiuridina equipada con alcohol C5 propargílico. Los compuestos de furano-pirimidinona son entonces formados del derivado de O-tetrahidropiraniléter descrito anteriormente. La síntesis prosigue por la reacción del segundo carbón de la unión de propargilo con la unión de oxígeno en la posición C4 del anillo de pirimidina para producir una furano-pirimidinona fluorescente la cual puede fácilmente separarse de la mezcla de reacción. Tales compuestos proporcionan una base adicional para síntesis de compuestos ECTA a través de varias combinaciones de conductos de electrón específicos, separadores y grupos salientes tóxicos .
Los nucleósidos furo [2, 3-d] pirimidinona se prepararon condensando 2' , 3' -di-O-p-tuolilo o 2',3'-di-0-acetil-5-yodo-2' -desoxiuridina con 1- (tetrahidropiraniloxi) -2-propina ("New methods of synthesis of d-a inoethylpyrazoles" Jones, R.G. and Mann, M.J. (1953)) bajo condiciones conocidas para promover la formación de estos compuestos fluorescentes (Robins, M.J. et al. (1983)). La remoción catalizada de base de los grupos de protección de carbohidrato dan el nucleósido bicíclico sustituido de 6-(tetrahidropiran-2-iloximetilo) el cual se somete ya sea a hidrólisis del grupo THP acídico estándar (TFA en CH2C12) o fue 5' -fosforamidado regioselectivamente por el mismo procedimiento utilizado para preparar BVdU-PA y 5FTJdR-PA. Después de la fosforamidación, el grupo THP puede removerse por hidrólisis acídica, como se muestra en la Figura 4. Compuestos ECTA TS basados en furano-pirimidinonas Los grupos salientes R4 tóxicos pueden unirse al alcohol furan-2-metíl?co utilizando métodos similares a aquellos empleados para unir grupos salientes tóxicos al hidroxilo en el compuesto de propargil uridina C5, como se explica con la síntesis de los derivados TEPA y ThioTEPA descritos anteriormente. Una variedad de grupos salientes tóxicos alternativos, aparentes para un experto en la técnica, se conceptualizan. Además, las modificaciones a la longitud y composición del componente de conducto de electrón R2 y de la composición del elemento separador R3 son también concebidas. Los compuestos ECTA TS basados en furano-pirimidinonas pueden también consistir de porciones "Q" variadamente modificadas. Muchas 2 ' -desoxiuridinas 5-sustituidas no son sustratos para TK humano, pero interesantemente se encontró 5- (4-hidroxi-l-butinil) -2' -desoxiuridina ser una excepción (Barr, P.J. et al. (1981)). Los compuestos ECTA pueden tener un 5' hidroxilo libre, un 5'monofosfato o un grupo 5' fosforamidato unido a los grupos carbohidrato alternativos. Un método novedoso para síntesis de tales compuestos fosforamidato se logra haciendo reaccionar un nucleótido desprotegido de 2-desoxi 3' -hidroxi, 5' -hidroxi con un fosfocloridato en la presencia de un depurador HCL. En una modalidad preferida, el fosfocloridato comprende un sustituyente fosforoso el cual se deriva de un aminoácido tal como alanina. Por ejemplo, el fosfocloridato . í*Zi* í £ puede ser fosforocloridato de fenil-L-metoxialanina. Compuestos basados en C5 Fluoro uridina y C4 hidozona La adición de tiol neutral a la pirimidina de doble unión C5-C6 prosigue como una reacción exotérmica (3-9 kcal por mol; véase reseña por Les, A. et al. (1998) en la reacción de TS normal con dUMP. Los sustituyentes alternativos al hidrógeno reactivo de TS en la posición 6 que pueden facilitar la formación de la unión de sulfidrilo con la enzima a través de la cisteína de TS humana activa (homologa con cys-198 de L. casei) , incluye flúor. Tales sustituyentes en otras posiciones en el anillo pirimidina pueden también facilitar la reacción entre el sustrato y TS . Por ejemplo, una sustitución 4-hidrazona en el uracilo (como se describe por Les, A. et al. (1998) facilita la formación del tiol con TS. Es importante que el intermediario de (TS) nucleótido-tiol resultante redispuesto en tal manera como para liberar el nucleótido alterado el cual puede lograrse de manera pasiva a través de hidrólisis.
La introducción de flúor en la posición C6 no ha sido previamente reportada, pero puede sintetizarse por las siguientes descripciones sintéticas de Krajewskas and Shugar (1982), quienes describen la síntesis de un número de uracilo 6 sustituidos y análogos de uridina. Las sustituciones que facilitan la química en la posición C4 de la base de pirimidina son bien conocidas por aquellos expertos en la técnica. Ejemplos de las descripciones de literatura incluyen Wallis et al. (1999); Negishi, et al. (1996), Barbato et al. (1991), Barbato, et al. (1989) y Holy et al. (1999). Estas técnicas sintéticas también permiten combinaciones de sustituciones, por ejemplo en las posiciones C4 y C5 del anillo de pirimidina (Pluta, et al. 1999) o las posiciones C2 y C4 del anillo de pirimidina (Zeid, et al. (1999) ) .
En otra modalidad de la invención, los compuestos ECTA se sintetizan por adición de conductos de electrón alternativos, porciones separadoras y grupos salientes tóxicos a ya sea la base de fluoro-uridina C6 o la pirimidina modificada de hidrazona C4. Los métodos descritos anteriormente para síntesis de los compuestos de ECTA basados en 2, desoxiuridina, pueden nuevamente emplearse para síntesis de tales moléculas. Síntesis de Nucleósido Fenil Metoxialaninil Fosforamidatos El uso de fosforamidatos como profármacos de fosfato para nucleótidos se reportó primero por McGuigan, C. et al. (1993) y McGuigan, C. et al. (1994). Estos autores mostraron que los derivados de fosforamidatos de derivados de 2' , 3' -didesoxinucleósidos antivirales tales como d4T retienen sus actividades antivirales en células deficientes de timidina-cinasa. Estudios adicionales muestran que el grupo de fosforamidato se hidrolizó al grupo fosfato dentro de las células (McGuigan, C. et al. (1996); Balzarini, J. et al. (1996); y Saboulard, et al. (1999)). Los fosfaramidatos se sintetizaron haciendo reaccionar 2 ' , 3' -didesoxinucleósidos con fosforocloridato de fenil metoxialaninilo (PMPC) . Ya que únicamente un grupo hidroxilo está presente, estas reacciones usualmente prosiguen suavemente. En los compuestos en donde más de un grupo hidroxilo está presente, el nucleósido protegido apropiadamente podría requerirse. Ya que el grupo 5' -OH de 2' -desoxinucleósidos es mucho menos impedido que el grupo 3' -OH, la fosforamidación selectiva con PMPC es posible bajo condiciones controladas cuidadosamente. Ambos BVdU y 5FUdR condensados con PMPC en la presencia de N- metilimidazol en CH2C12 anhidro para dar los fosforamidatos correspondientes. En ambos casos, el producto deseado se separó fácilmente del material de partida utilizando cromatografía en columna en gel de sílice. El esquema sintético se resumió posteriormente.
Los siguientes ejemplos se pretenden para ilustrar, pero no limitan la invención. Ejemplos 1 y 2 Síntesis de los compuestos ECTA con uniones de propargilo Utilizando el procedimiento sintético general descrito supra, el 3- [2-desoxiuridin-5-il] -prop-2-iniléster del ácido bis-aziridin-1-il-fosfinico se sintetizó y se analizó por 1H NMR para producir el siguiente resultado; """H NMR ((CD3)2S0) se complicó debido al ruido. Características salientes: d 8.28 (d, 1, H6) , 6.10 (seudo-t, 1, Hl' ) , 5.26 (m, intercambios con D20, 1, 3' -OH), 5.13 (m, intercambios con D20, 1, 5' -OH), 4.81 (q o dd, 2, propargil-CH2) , 4.24 (m, 1, H3', 3.57 (m, 2, 5'-CH2), 2.15-2.0 (m, 8, aziridin-CH2) . 3- [2-desoxiuridin-5-il] -prop-2-iniléster del ácido --.i i » bis-aziridin-1-il-fosfinotioico también se sintetizó y se analizó por ?R NMR para producir el siguiente resultado: H NMR ((CD3);SO) complicado debido al ruido. Características salientes: d 8.29 (d, 1, H6) , 6.10 (seudo-t, 1, Hl' ) , 5.22 (m, intercambios con D?0, 1, 3' -OH), 5.10 (m, intercambios con D20, 1.5' -OH), 4.88 (q o dd, 2, propargil-CH2) , 4.31 (m, 1, H3'), 3.52 (m, 2, 5'-CH2), 2.15-2.0 (m, 8, aziridin-CH2) . Ejemplos 3 a 8 Sintesis de furano-pirimidinonas Se prepararon los siguientes compuestos utilizando el procedimiento sintético general descrito supra. Ejemplo 3 3- (2-Desoxi-ß-D-ribofuranosil) -6- (tetrahidropiran- 2-iloximetil)furo[2,3-d]pirimidin-2-(3H) -ona. XH NMR ((CD3)2SO) d 8.80 (s, 1, H4 ) , 6.74 (s, 1, H5) , 6.16 (seudo, 1, Hl'], 5.27 (d, sustituido con D20, 1, 3' -OH), 5.12 (t, sustituido con D20, 1, 5' -OH), 4.72 (m, 1, THP-H2), 4.56 (q, 2, CH20THP) , 3.92 (m, 1, H4' ) , 3.64 (m, 2, 5'-CH2), 2.40 (m, 1, H2'a), 2.03 (m, 1, H2'b), 1.68 y 1.50 (m, 8, THP) . Espectro de masa de baja resolución (DCI-NH3) derivado en bis-TMS, m/z 323 (B+TMS+H+) , 511 (MH+) , 583 (M+TMS+) . Ejemplo 4 3- (2-Desoxi-ß-D-ribofuranosil) -6-(hidroximetil)furo[2,3-d]pirimidin-2(3H)-ona. XH NMR ((CD3)2SO) d 12.0 (s amplio, 1, OH), 8.24 (s, 1, H4), 6.53 (s, 1, H5) , 5.51 (seudo-t, 1, Hl' ) , 4.42 (m, 2, CH2OH) . Espectro de masa de baja resolución (DCI-NH3) , m/z 167 (B+2H+) , 184 (B+NH4+) . Ejemplo 5 Fenilmetoxi-L-alanilfosforamidato de l-[6- (Tetrahidropiran-2-iloximetil) uro[2,3-d]pirimidin-2 (3H) -on-3-il]-2-desoxi-ß-D-ribofuranos-5-ilo. XH NMR ((CD3)2SO) se complicó debido a la presencia de diastereómeros. Características salientes: d 8.62 y 8.59 (cada s, cada 1, H4) , 7.4-7.1 (m, 5, PHO), 6.61 y 6.60 (cada s, cada 1, H5) , 6.25 (m, 1, Hl'), 4.56 (q, 2, propargil-CH2) , 3.56 y 3.54 (cada s, cada 3, C02Me), 2.0 (m, 1, H2'b), 1.22 (m, 3, alaninil-a-Me). Espectro de masa de baja resolución (DCI-NH3) , m/z 167 (B+2H+) , 184 (B+H++NH4+-THP) . Ejemplo 6 Fenilmetoxi-L-alanilfos oramidato de l-[6-(Hidroximetil) furo [2 ,3-d]pirimidin-2 (3H) -on-3-il] -2-desoxi-ß-D-ribofuranos-5-ilo ?E NMR (CDCI3) se complicó debido a la presencia de diastereómeros. Características salientes: d 8.5 (s, 1, H4), 7.4-7.1 (m, 5, PhO), 6.36 y 6.30 (cada s, cada 1, H5) , 6.23 (m, 1, Hl' ) , 3.67 y 3.65 (cada s, cada 3, C02Me) , 2.69 (m, 1, H2'a), 2.10 (m, 1, H2'b), 1.35 ( , 3, alaninil-a-Me) . Espectro de masa de baja resolución (DCI-NH3) , m/z 525 (MH+) , 595 (MNH4+) .
Ejemplo 7 El 4-nitrofeniléter derivado de 5- (3-hidrox?-l-propinil) -2' -desoxiuridina se preparó de acuerdo a la síntesis de éter estándar como se muestra posteriormente.
Ejemplo 8 5- [3- (4-Nitrofenoxi) -1-propinil] -2' -desoxiuridina. Se trató una solución de 5- (3-hidroxi-l-propinil) -2' -desoxiuridina pre-secada Robins, M.J. et al., (1983) (565 mg, 2 mmoles) en 40 mL de THF anhidro bajo argón con 4-nitrofenol (696 mg, 5 mmoles), trifenilfosfina (787 mg, 3 mmoles), y azodicarboxilato de diisopropilo (590 L, 3 mmoles) y la mezcla de reacción se calentó a 60°C hasta que la solución se aclaró, y luego 1 h más. La mezcla se permitió enfriar a 23°C y luego se evaporó en Si02 y se purificó por cromatografía utilizando Me0H/CH2Cl2 como eluyente para producir 107 mg (13%) del producto etéreo deseado: pf 112-118°C. XH NMR ((CD3)2SO) d 11.65 (s, sustituido con D20, 1, NH, 8.29 (s, 1, H6), 8.24 (d, J= 9.3 Hz, 2, m-ArH) , 7.23 (d, J= 9.3 Hz, 2, o-ArH) , 6.09 (seudo-t, 1, Hl' ) , 5.17 (s, 2, propargil-CH:), 4.22 (m, 1, H3'), 3.80 (m, 1, H4' ) , 3.59 (m, 2, 5'-CH2), 2.13 (seudo-t, 2, 2'-CH). Espectro de masa de baja resolución (DCI-NH3) en material per-trimetilsilatado, m/z 547 [M(TMS)2H+], 565 [M(IMS)2NH4+], 620 [M(TMS)3H+]. Ejemplo 9 5- (4-Carbetoxi-l,3-butandienil) -2' -desoxiuridina (a) 5- (Carbometoxivinil) -2' -desoxiuridin-3' ,5' -bis (tetrahidro-2H-piran-2-il) éter (I) Una lechada de 5- (carbometoxivinil) -2' -desoxiuridina (3.0 g, 9.6 mmoles), 3, 4-dihidro-2ff-pirano (22 L, 21.3 mmoles) y p-toluensulfonato de piridinio (PPTS, 0.242 g, 0.96 mmoles) en dimetilformamida (DMF, 5 mL) se agitó a 50°C durante 18 horas. La solución resultante se concentró al vacío (temperatura de baño 45°C) para dar un aceite amarillo pálido, espeso. El aceite se disolvió en EtOAc y el sólido se filtró. La solución se concentró nuevamente. El aceite obtenido se purificó por cromatografía en columna en gel de sílice utilizando 50-75% de EtOAc/hexano como eluyente para dar 3.81 g (85%) del producto puro como un aceite incoloro. (b) 5- (3-Hidroxiprop-l-enil) -2' -desoxiuridin-3' ,5' -bis (tetrahidro-2H-piran-2-il) éter (II) Se enfrió una solución de (I) (3.5 g, 7.27 mmoles) en CH2C12 (14 mL) a -78°C en un baño de hielo seco/acetona. Se agregó en gotas durante 2 horas hidruro de diisobutilamonio (DIBAL-H) en tolueno (1.0 M, 24 mL, 24.0 mmoles) mientras que la temperatura se mantuvo a -78°C. La solución se agitó a -78°C durante 2 horas adicionales y se agregó en gotas MeOH (2.5 mL) para destruir cualquier exceso de DIBAL-H. La mezcla de reacción se canuló dentro de una mezcla de 30% de solución de ácido cítrico (50 mL) , hielo (25 g) y EtOAc (30 mL) durante aproximadamente 20 minutos. Las fases se separaron y la fase acuosa se extrajo con EtOAc (2 x 25 mL) . La fase orgánica combinada se lavó con NaHC03 saturado (20 mL) y salmuera (20 mL) , se secó sobre MgSÜ4 y se concentró para dar 3.288 g (100%) del aceite incoloro. (c) 5- (3-Oxoprop-l-enil) -2' -desoxiuridin-3' ,5' -bis (tetrahidro-2H-piran-2-il)éter (III) A una solución del producto sin purificar (II) obtenido del anterior (1.988 g, 4.4 mmoles) en CH2C12 (9 mL) se agregó dicromato de piridinio sólido (PDC; 1.82 g, 4.8 mmoles) con enfriamiento de agua. La suspensión se agitó mientras que el ácido acético (0.4 mL) se agregó en gotas. El baño de agua se removió y la reacción se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. El producto sin purificar se filtró a través de una almohadilla de florisilo (2 x 2.5 cm) y el florisilo se lavó con 35 mL de EtOAc. La solución café obtenida se filtró a través de otra columna de florisilo (3.5 cm de diámetro x .¿.J 2.5 cm de altura) . El filtrado se concentró para dar 1.273 (64% de rendimiento) de aceite café muy ligero. (d) 5- (4-Carbetoxi-l,3-butandienil) -2' -desoxiuridin-3' ,5' -bis (tetrahidro-2H-piran-2-il)éter (IV) Se agregó (carbetoximetilen) trifenilfosforano (0.32 mg, 0.92 mmoles) a una solución del aldehido sin purificar (III) (0.344 g, 0.77 mmoles) . La solución se oscureció y se tornó color hierro. Después de 1 hora, (III) se consumió completamente como se juzgó por la cromatografía de capa delgada. El solvente se evaporó y el producto sin purificar se purificó por cromatografía en columna en gel de sílice utilizando 35-45% de EtOAc/hexano como eluyente. El producto puro (0.310 g, 78% de rendimiento) se obtuvo como aceite incoloro. (e) 5-(4-Carbetoxi-l,3-butandienil)-2' -desoxiuridina (V) Se disolvió 5- (4-carbetoxi-l, 3-butandienil) -2' -desoxiuridin-3' , 5' -bis ( tetrahidro-2H-piran-2-il ) éter (IV) (0.637 g, 1.22 mmoles) en MeOH (1.5 mL) y se agregó PPTS (0.49 g, 0.16 mmoles). La solución se agitó a 50°C durante 7.5 horas y se dejó a temperatura ambiente durante la noche. Se formó un precipitado blanco. La mezcla de reacción se enfrió a 0°C y se filtró para dar (V) puro como un sólido blanco (0.188 g) . El filtrado se concentró y se llevó a cromatografía en gel de sílice utilizando 50-100% de EtOAc/hexano como eluyente para dar un producto adicional de 0.180 g. El rendimiento total del producto fue 0.368 g (86°.). XH NMR (DMSO d6) : 1-22 (3H, t, J = 7 Hz) , 2.17 (2H, br t, J = 5.5 Hz), 3.55-3.75 (2H, m) , 3.81 (1H, m) , 4.12 (2H, q, J = 7 Hz), 4.25-428 (1H, m) , 5.19 (1H, t, J 4.8 Hz), 5.27 (1H, d, J = 4.1 Hz), 5.98 (1H, d, J = 14.5 Hz) , 6.14 (1H, t, J = 6.3 Hz), 6.75 (1H, d, J = 14.5 Hz) , 7.18-7.30 (2H, m) , 8.30 (1H, s) , 11.56 (1H, s) . Ejemplo 10 5- (4-Carbometoxi-1,3-butandienil) -2' -desoxiuridina (Va) Se desaereó una solución de trietilamina (3.9 mL, 28.2 mmoles) en dioxano (12 mL) burbujeando nitrógeno durante 15 minutos. Se agregaron acetato de paladio (0.60 g, 0.26 mmoles) y trifenilfosfina (0.183 g, 0.70 mmoles) y la solución se calentó a 70°C durante 20 minutos para dar una solución café oscuro. Se agregó 5-yodo-3' -desoxiuridina (5.0 g, 14.1 mmoles) y 2, 4-pentadienoato de metilo (2.5 g, 22.3 mmoles) y la mezcla se calentó bajo reflujo durante 15 horas. El solvente y los componentes volátiles se evaporaron al vacío y el residuo se dividió entre agua (15 mL) y EtOAc (15 mL) . Las fases se separaron y la fase acuosa se extrajo dos veces con EtOAc (10 mL cada una) . La fase orgánica combinada se lavó con salmuera y se concentró. El residuo se disolvió en MeOH (15 mL) y se permitió enfriar a temperatura ambiente. El sólido formado se recolectó por filtración, se lavó con una cantidad pequeña de MeOH y se secó al vacío para dar 0.38 g del polvo café. XH NMR (DMSO-de): 2.17 (2H, t, J = 6.4 Hz) , 3.55-3.70 (2H, m) , 3.66 (3H, s) , 3.82 (1H, q, J = 3.6 Hz) , 4.27 (1H, m) , 5.18 (1H, t, J = 4.9 Hz) , 5.26 (1H, d, J = 4.5 Hz) , 5.99 (1H, d, J = 14.4 Hz) , 6.14 (1H, d, J = 6.4 Hz) , 6.74 (1H, d, J = 14.8 Hz), 7.20-7.35 (2H, ) , 8.30 (1H, s) , 11.56 (1H, s) . El filtrado anterior se concentró y se llevó a cromatografía en gel de sílice utilizando 60-100% de EtOAc/hexanos como eluyente para dar otros 0.70 g del producto como una espuma café. El rendimiento combinado fue 1.08 g (22.6%) . Ejemplo 11 5- (4-Carboxi-l , 3-butandienil) -2' -desoxiuridina (VI) Método I Se disolvió 5- (4-Carbetoxi-l, 3-butandienil) -2' -desoxiuridina (V, del Ejemplo 1) (0.449 g, 1.28 mmoles) en NaOH 2N (3 mL) y se agitó a 25°C. Después de 20 minutos, se formó un precipitado y el TLC mostró que el material de partida se consumió completamente. La mezcla se enfrió a 0°C y se acidificó a pH 1 con HCl 2N. El sólido blanquecino resultante se extrajo por filtración, se lavó con agua y se secó in vacuo para dar 0.225 g (54%) del producto.
LH NMR (DMSD-d„) : 2.12-2.19 (2H, m) , 3.50-3.70 (2H, m) , 3.75-3.85 ( lE, ) , 4.24-4.29 (1H, m) , 5.19 (1H, t, J = 4.8 Hz), 5.27 (1H, d, J = 4.2 Hz) , 5.80-5.95 (1H, m) , 6.14 (1H, t, J = 6.4 Hz), 6.60-6.75 (1H, m) , 7.15-7.25 (2H, m) , 8.26 (1H, s), 11.56 (1H, s), 12.16 (1H, s amplio). El filtrado y los lavados se combinaron y se evaporaron hasta sequedad. El sólido amarillo pegajoso resultante se disolvió en MeOH a partir del cual se formó un precipitado blanco. El sólido se extrajo por filtración para dar 0.200 g adicionales del producto. Método II El compuesto del título puede también prepararse de 5- (4-carbometoxi-l, 3-butandienil) -2' -desoxiuridina (Va) (preparada de acuerdo al método en el Ejemplo 2) en rendimiento comparable como se mencionó anteriormente. Ejemplo 12 5- (4 -Br omo -liS, 3E-butandi enil) -2' -desoxiuridina (Vlla) y 5- (4-Bromo-lE,3Z-butandienil) -2' -desoxiuridina (Vllb) Se agregó KHC0 (0.185 g, 1.84 mmoles) a una solución de 5- (4-carboxi-l, 3-butandienil) -2' -desoxiuridina (VI) (0.200 g, 0.62 mmoles) en DMF (1 mL) y la mezcla se agitó durante 20 minutos a 25°C. Se agregó en gotas una solución de N-bromosuccinimida (0.117 g, 0.65 mmoles) en DMF (0.3 mL) . La evolución de gas suave (C02) ocurrió a través de toda la adición. La suspensión café resultante se agitó durante 2 horas a 25°C en cuyo tiempo el TLC mostró que (VI) se consumió completamente. Se agregó agua (10 mL) a la suspensión y la solución resultante se extrajo con EtOAc (2 x 15 mL) . El extracto se secó sobre MgS04 y el solvente se evaporó in vacuo para dar un sólido amarillo (178 mg, 80% de rendimiento) que consistió de una mezcla de dos isómeros como se muestra por 1H NMR. El producto sin purificar se separó por HLPC semi-preparativa (columna de fase inversa C18) utilizando 20% de acetonitrilo en agua como la fase móvil para dar los siguientes isómeros: 5- (5-Bromo-lE,3Z-butandienil) -2' -desoxiuridina: tiempo de retención 10.5 minutos; LH NMR: (DMSO-d5) : 2.11-2.18 (2H, m) , 3.50-3.70 (2H, ) , 3.80 (1H, q distorsionado, J = 3.5 Hz), 4.25 (1H, s amplio), 5.08 (1H, s amplio), 5.25 (1H, s amplio), 6.15 (1H, t, J = 6.5 Hz) , 6.40 (1H, d, J = 7 Hz), 6.53 (1H, d, J = 15.6 Hz) , 6.83 (1H, dd, J = 7, 10Hz), 7.39 (1H, dd, J = 10, 15.6 Hz) . 5- (4-Bromo-l-S,3E-butandienil) -2' -desoxiuridina: tiempo de reacción 15.1 minutos; LH NMR (DMSO-d6) : 2.12-2.16 (2H, m) , 3.50-3.70 (2H, m) , 3.80 (1H, q, J = 3.2 Hz) , 4.26 (1H, m) , 5.13 (1H, s amplio), 5.25 (1H, s amplio), 6.14 (1H, t, J - 6.5 Hz), 6.36 (1H, d, J = 15.6 Hz) , 6.67 (1H, d, J = 13.1 Hz), 6.84 (1H, dd, J = 11, 13.1 Hz), 7.04 (1H, dd, J = ilti.l.ti 11, 15.6 Hz) . Ejemplo 13 Utilizando los procedimientos mencionados en el Ejemplo 11, Método II, los siguientes compuestos pueden obtenerse en una forma similar: 5- (4-cloro-l, 3-butandienil) -2' -desoxiuridina (utilizando N-clorosuccinimida en lugar de N-bromosuccinimida en la Etapa B) ; 5- (4-yodo-l, 3-butandienil) -2' -desoxiuridina (utilizando yodo en yoduro de sodio en lugar de N-bromosuccinimida) . Ejemplo 14 Fosforamidato de 5- (2-Bromovinil) -2' -Desoxiuridina Fenil N- Metoxi-L-alaninilo Fosforocloridato de Fenil N-Metoxi-L-alaninilo El clorhidrato del metiléster de L-alanina (245.8 g; 1.76 mmoles) se colocó en un matraz de fondo redondo de tres cuellos de 12 litros (equipado con un agitador mecánico y termómetro) seguido por 4.0 L de diclorometano. La mezcla se agitó durante 15 minutos a temperatura ambiente. Se agregó fosfodicloridato de fenilo (370.0 g; 1.76 moles) a la mezcla y la agitación continuó durante 15 minutos a temperatura ambiente. El matraz se colocó en el baño con hielo seco y la agitación se continuó durante 20 minutos hasta formarse una suspensión uniforme. Se agregó en gotas (~90 minutos) tri-n-butilamina recién destilada (626.5 g; 3.38 moles) con agitación vigorosa .'^t.tii a la mezcla de reacción a fin de que la temperatura en lugar del matraz se mantuvo a ~0°C. El baño se removió y la agitación se continuó durante 6 horas a temperatura ambiente. La solución se concentró a ~2.84 litros evaporando varias porciones de la mezcla en un evaporador giratorio y la mezcla se selló bajo argón y se almacenó a -20°C. El producto fue 85% puro por NMR fosforoso para dar una concentración estimada de fosfocloridato de fenil etoxialaninilo de ~0.5 M. Ejemplo 15 Fosforamidato de 5- (2-Bromovinil) -2' -Desoxiuridina Fenil N- Metoxi-i-alaninilo (NBlOll) La reacción se realizó bajo atmósfera de argón. 5-(2-bromovinil) -2' -desoxiuridina (BVdU) (204 g; 612 mmoles) se colocó en un matraz de fondo redondo de 3 litros de tres cuellos equipado con agitador mecánico. El matraz se colocó en un baño de agua helada y 1600 mL (~800 L) del reactivo de fosfocloridato de fenilmetoxialaninilo se agregaron utilizando un embudo de adición durante 15 minutos con agitación vigorosa de la mezcla de reacción, seguida por la adición de 100 mL de N-metilimidazol durante 5 minutos utilizando una jeringa. Después de 5 minutos la mezcla se volvió clara y después de 10 minutos el baño de agua helada se removió para permitir a la mezcla calentarse hasta temperatura ambiente mientras la agitación continuaba. La reacción se verificó por HPLC de fase inversa y se completó en 3 horas. La reacción se extinguió por la adición de 100 L de metanol y la mezcla se evaporó a un aceite, se volvió a disolver en 6 mL de diclorometano y se pasó a través de 800 g de gel de sílice. La porción mayor de BVdU-PA mencionada en la presente como NBlOll, se pasó a través de la columna durante la carga y finalmente la elución de NBlOll se completó pasando 5 litros de 5% de metanol en diclorometano. Todas las fracciones que contienen NBlOll se combinaron y se evaporaron en un aceite, el residuo se disolvió en 4 litros de acetato de etilo y la mezcla se extrajo con agua (2 x 2 litros) . La capa orgánica se secó con sulfato de sodio, se filtró, y se lavó con acetato de etilo (3 x 300 mL) . El filtrado combinado y los lavados se evaporaron para producir una espuma blanca ligeramente coloreada; peso total ~540 g: El producto sin purificar se purificó por dos cromatografías de gel de sílice utilizando 0-5% de MeOH en CH2CI2 y 10% de MeOH en CH2C12, respectivamente, como eluyente. El rendimiento del producto (>98% puro) fue 64 g. Ejemplo 16 Utilizando los métodos descritos en el Ejemplo 15, se prepararon los fosforamidatos de fenil N-metoxi-L-alanilo de los siguientes nucleósidos: 1. 5- (4, 4-dibromo-l, 3-butandienil) -2' -desoxiuridina, 2. 5- (2-clorovinil) -2' -desoxiuridina, 3. 5-trifluorometil-2' -desoxiuridina, 4. 5- (4-carbetoxi-l, 3-butandienil) -2' -desoxiuridina, 5. 5- (4-carbometoxi-l,3-butandienil) -2' -desoxiuridina, 6. 5- (4-bromo-l£, 3£-butandienil) -2' -desoxiuridina, 7. 5- (4-bromo-l.E, 3Z-butandienil) -2' -desoxiuridina, 8. 5- (trimetilsililetinil) -2' -desoxiuridina, 9. 5- (etinil) -2' -desoxiuridina, 10. 5- (1-decinil) -2' -desoxiuridina, 11. 3- (2' -desoxi-/?-D-ribofuranosil) -2, 3-dihidrofuro- [2, 3-d]pirimidin-2-ona 12. 3-(2'-desoxi-?-D-ribofuranosil)-6-octil-2,3-dihidrofuro [2, 3-d]pirimidin-2-ona. Derivados Las sales, esteres y éteres de los compuestos anteriores descritos en la presente están también dentro del alcance de esta invención. Las sales de los profármacos de la presente invención pueden derivarse de ácidos y bases inorgánicas u orgánicas. Ejemplos de ácidos incluyen ácidos clorhídrico, bromhídrico, sulfúrico, nítrico, perclórico, fumárico, maleico, fosfórico, glicólico, láctico, salicílico, succínico, toluen-p-sulfónico, tartárico, acético, cítrico, metansulfónico, etansulfónico, fórmico, benzoico, malónico, naftalen-2-sulfónico y bencensulfónico. Otros ácidos, tales como oxálico, aunque no son farmacéuticamente aceptables, pueden emplearse en la preparación de sales útiles como intermediarios para obtener los compuestos de la invención y s * c sus sales de adición de ácido farmacéuticamente aceptables. Ejemplos de bases incluyen metal álcali (por ejemplo, sodio) hidróxidos, metal alcalinotérreo (por ejemplo, magnesio) , hidróxidos, amoniaco, y compuestos de la fórmula NW4T, en donde W es alquilo de C?-4. Ejemplos de sales incluyen: acetato, adipato, alginato, aspartato, benzoato, bencensulfonato, bisulfato, butirato, citrato, canforato, canforsulfonato, ciclopentanpropionato, digluconato, dodeciisulfato, etansulfonato, fumarato, flucoheptanoato, glicerofosfato, hemisulfato, heptanoato, hexanoato, clorhidrato, bromhidrato, yodhidrato, 2-hidroxietansulfonato, lactato, maleato, metansulfonato, 2-naftalensulfonato, nicotina, oxalato, palmoato, pectinato, persulfato, fenilpropionato, picrato, pivatalato, propionato, succinato, tartrato, tiocianato, tosilato, y undecanoato. Otros ejemplos de sales incluyen aniones de los compuestos de la presente invención combinados con un catión adecuado tal como Nat, NH4T, NW<T (en donde W es un grupo alquilo de C?-4) . Para uso terapéutico, las sales de los compuestos de la presente invención serán farmacéuticamente aceptables. Sin embargo, las sales de ácidos y bases que no son farmacéuticamente aceptables pueden también encontrar uso, por ejemplo, en la preparación o purificación de un compuesto farmacéuticamente aceptable. ! «».>tfHh>^-p>t„ ,.,r __ ------- Los esteres de los profármacos o compuestos identificados por el método de esta invención incluyen esteres del ácido carboxílico (es decir, -0-C(=0)R) obtenidos por esterificación o los grupos 2'-, 3'- y/o 5' -hidroxi, en los cuales R se selecciona de (1) alquilo de cadena lineal o ramificada (por ejemplo, n-propilo, t-butilo, o n-butilo) , alcoxialquilo (por ejemplo, metoximetilo) , aralquilo (por ejemplo, bencilo) , ariloxialquilo (por ejemplo, fenoximetilo), aralquilo (por ejemplo, bencilo), ariloxialquilo (por ejemplo, fenoximetilo) , arilo (por ejemplo, fenilo opcionalmente sustituido por, por ejemplo, halógeno, alquilo de C?-4 o alcoxi de C?-4 o amino) ; (2) esteres de sulfonato, tales como alquilsulfonilo (por ejemplo, metansulfonilo) o aralquilsulfonilo; (3) esteres de aminoácido (por ejemplo, L-valilo o L-isoleucilo) ; (4) esteres de fosfonato y (5) esteres mono-, di- o trifosfato. Los esteres de fosfato pueden esterificarse además por, por ejemplo, un alcohol de C?-2o o reactivo derivado de los mismos, o por un glicerol de 2, 3-di- (Cß-2 ) acilo. En tales esteres, a menos de que se especifique de otra forma, cualquier porción alquilo presente contiene ventajosamente de 1 a 18 átomos de carbono, particularmente de 1 a 6 átomos de carbono, más particularmente de 1 a 4 átomos de carbono. Cualquier porción de cicloalquilo presente en tales esteres ventajosamente contiene de 3 a 6 átomos de carbono. Cualquier ¿y¡^ porción de arilo presente en tales esteres ventajosamente comprende un grupo fenilo. Ejemplos de derivados de profármaco de lixo-furanosilo de la presente invención incluyen, por ejemplo, aquellos con grupos hidroxilo protegido químicamente (por ejemplo, grupos O-acetilo) , tales como 2' -O-acetil-lixo-furanosilo; 3' -O-acetil-lixo- furasonilo; 5' -O-acetil-lixo-furanosilo; 2' , 3' -di-O-acetil- lixo-furanosilo y 2' , 3' , 5' -tri-O-acetil-lixo-furasonilo . Los éteres de los compuestos de la presente invención incluyen éteres de metilo, etilo, propilo, butilo, isobutilo, y sec-butilo. En una modalidad preferida, el sustrato puede no ser químicamente relacionado a las pirimidinas o folatos, pero en lugar de sintetizarse con base en los parámetros conocidos del diseño de fármaco racional. Véase Dunn, W.J. et al. (1996) . Los ensayos químicos para productos, por ejemplo, en donde un producto de reacción es un anti-metabolito de los derivados de bromovinilo de dUMP, se describen en los Ejemplos proporcionados posteriormente o por Barr, P.J. et al. (1983) . Ensayos para Cantidad de Nucleósido y Monofosfato en Células Este ensayo se realizó con el compuesto NB 1011. Sin embargo, se entiende por aquellos con experiencia en la técnica que el siguiente método es fácilmente modificado para aplicación o uso con los profármacos de esta invención. Las líneas celulares MCF7 (línea celular de cáncer de seno) ; MCF7TDX (línea celular de cáncer de seno resistente a Tomudex) y H630R10 (línea celular de cáncer de colon resistente a 5-FU de Dr. S. Copur, Yale University, véase Copur, S. et al. (1995)) en un medio RPMl suplementado con 10% de FCS y antibióticos se colocaron en placas en 100 mm de discos Petri en la cantidad de 750,000 células por disco y se incubaron durante toda la noche a 37 °C. Se agregaron 100 µM deBVdU a cada disco y las células continuaron creciendo durante 2 días a 37°C. Después de eso, el medio se aspiró y las células se lavaron dos veces con solución salina amortiguada de fosfato (PBS) . Entonces se agregó 1 L de PBS por disco y los discos se colocaron en un congelador a -80°C. Las células se interrumpieron a través de procedimiento de enfriamiento/descongelamiento, repetido dos veces. Los desechos celulares en la suspensión resultante se centrifugaron (13,000 rpm, 10 minutos) y el sobrenadante se desproteinizó pasando a través de un Centrifugal Filter Device (Centrifree, 30,000 cortes, Amicon) por centrifugación a 5,000 rpm durante 30 minutos en un centrifugo Sorvall Super T21 (Rotor SL-50-T, 1,912 g) a 20°C. El pasaje se concentró al volumen de 100 µL, e inyectó en una columna de HPLC (Adsorbosphere HS, C18, 5 um, 4.6 mm x 150 mm, Alltech) . Las muestras se analizaron utilizando gradiente de acetonitrilo .--..-. ..1-en agua conteniendo ácido trifluoroacético. Los picos se detectaron a 300 nm, el máximo de absorción de los derivados de BVdU y las cantidades de los compuestos se expresaron como área pico a 300 nm. La identificación de los compuestos se hizo en comparación con sus tiempos de retención y espectros con aquellos de estándares auténticos. Ensayo de Proliferación Celular AlamarBlue Este ensayo se realizó con el compuesto NBlOll y los profármacos de esta invención. Las células exponencialmente desarrolladas se transfirieron a placas de cultivo de tejido de fondo plano de 384 pozos. Todos los tipos celulares se colocaron en placas a una densidad de 500 células por pozo en 25 µL de un medio completo (RPMl 1640 + 10% de suero bovino fetal + antibióticos/antimicóticos) . Después de 24 horas (día 0), 25 µL del medio completo conteniendo los compuestos durante el rango de dosis de 10""3 a 10"10 M se agregaron en triplicado. El tiempo de exposición del fármaco fue 120 horas (día 5) , después de lo cual la inhibición de crecimiento se analizó. 5 µL del indicador redox, alamarBlue, se agregó a cada pozo (10% de v/v) . Después de 4 horas de incubación a 37°C, se verificó la fluorescencia a 535 nm de excitación y 595 nm de emisión. Ensayo de Inhibición de Proliferación Celular de Cristal Violeta Este ensayo se realizó con el compuesto NBlOll y j-Hnf f-v; los profármacos de esta invención. La capacidad de los compuestos de prueba para bloquear la proliferación de células se determinó por el procedimiento del cristal violeta. (Sugarman, B.J. et al. (1985); y Antelman, D. et al. (1995) ) . Los compuestos se disolvieron en sulfóxido de dimetilo a una concentración de 1 M. Se diluyeron adicionalmente como es necesario en un medio de cultivo celular DMEM, y subsecuentemente en los primeros pozos de la placa microtituladora de 96 pozos. Cada concentración se probó en triplicado en la línea celular objetivo. Las concentraciones del compuesto de 1 uM a 3000 µM se probaron. Las células se incubaron con el compuesto durante 72 horas, las placas se lavaron, y las células se fijaron con metanol y se tiñeron con cristal violeta como se describió en Sugarman, B.J. et al. (1985); y Antelman, D. et al. (1995). Análisis de Western Blot de Niveles TK y TS en Líneas Celulares Los experimentos de western blot se realizaron utilizando epitelio de colon normal humano del tipo celular CCDldco (obtenido de ATCC, Manassas, VA) , línea celular de adenocarcinoma de colon H630R10 resistente a 5-FU (obtenido de Dr. S. Copur, Yale University, véase Copur, S. et al. (1995) , y líneas celulares de cáncer de seno transfectadas de HER2 (Pegram, M.D. et al. (1997)). Las células se usaron en amortiguador RIPA (50 mM de Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM de NaCl, 0.5% de Tritón X-100, 0.1% de SDS y 0.5% de ácido desoxicólico, sal sódica e inhibidores de proteasa) . Las concentraciones de proteína se determinaron utilizando equipo 5 de ensayo de proteína BCA-200 (obtenido de Pierce, Rockford, IL) . 10 µg de proteínas de cada línea celular se resolvieron por 12% de SDS-PAGE. Las proteínas separadas se transfirieron en membrana PVDF (obtenida de Amersham, England) , seguida por inmunotransferencia con anticuerpo principal monoclonal de 10 timidilato de sintasa humana y anticuerpo monoclonal anti- butulina (fabricado por NeoMarkers, Fremont, CA) . La peroxidasa de rábano enlazada con Ig de anti-ratón de oveja se utilizó como anticuerpo secundario (Amersham) . El equipo plus ECL (Amersham) se utilizó para la detección de 15 inmunoreactividad. Las bandas que corresponden a timidilato sintasa se cuantificaron y normalizaron a aquella de tubulina por análisis de imagen (Molecular Dynamics Storm) . Análisis RT-PCR de ARNm TS en Líneas Celulares El nivel de expresión de las copias de timidilato 20 sintasa humana en líneas celulares diferentes se cuantificó utilizando RT-PCR. Los cebadores de oligonucleótido para amplificación del timidilato sintasa humana y B-actina se diseñaron como sigue: cebador de sentido de timidilato sintasa (SEC DE IDE?T. ?O.: 1) 5' -GGGCAGATCCAACACATCC-3' (que 25 corresponde a las bases 208-226 de la secuencia de AD?c de íá ?imitttit,nr- ..il-. -i.-t .,...,- .., , - . ( Li timidilato sintasa, Genbank No. de Acceso X02308), cebador antisentido (SEC. DE IDENT. NO.: 2) 5' -GGTCAACTCCCTGTCCTGAA- 3' (que corresponde a las bases 564-583) , cebador de sentido ß-actina (SEC. DE IDENT. NO.: 3) 5' -GCCAACACAGTGCTGTCTG-3' (que corresponde a las bases 2643-2661 de la secuencia de gen ß-actina, Genbank No. de Acceso M10277) y cebador antisentido (SEC. DE IDENT. NO.: 4) 5' -CTCCTGCTTGCTGATCCAC-3' (que corresponde a las bases 2937-2955) . Los ARN totales se aislaron de las células utilizando equipo mini Rneasy (obtenido de Qiagen, Valencia, CA) . Para verificar para posible contaminación de ADN, los cebadores para amplificación de ß-actina se diseñaron para extender la unión de exon4/intron5/exon5. Las plantillas de ADN genómico conducen a un fragmento de 313 pb de ß-actina, y la plantilla de ADNc genera un producto de 210 pb. Las reacciones de transcripción inversa se realizaron, utilizando sistema de preamplificación SuperScript (Gibco/BRL, Gaithersburg, MD) . Se aplicó 3 µg de ARN total en un volumen de 20 µl de amortiguador para conducir la reacción de transcripción inversa, seguida por protocolo del fabricante. Las reacciones de PCR se realizaron en un volumen de 48 µl, conteniendo 3 µl de mezcla de AD?c de reacción de transcripción inversa, 3 mM de MgCl2, 50 mM de KCl, 20 mM de Tris-Cl, pH 8.4, 0.2 mM de cada d?TP, 0.4 TM de cebadores de '^^^^ f t . -i - _. sentido y antisentido de timidilato sintasa y 3 unidades de polimerasa de ADN Taq (obtenida de Promega, Madison, Wl) . Las mezclas de reacción se incubaron a 94°C durante 3 minutos, seguidas por 10 ciclos de 1 minuto de incubación a 94°C, 1 5 minuto de incubación a 58°C y luego 1 minuto de incubación a 72°C. Después de 10 ciclos, los cebadores de ß-actina humanos se agregaron en 2 µl para lograr una concentración final de 0.2 µM, llevando el volumen de reacción final a 50 µl . La reacción de PCR se continuó a un total de 28 ciclos, seguido 10 por una incubación de 7 minutos a 72°C. Se determinaron 5 µL de los productos PCR por electroforesis en 2% de gel de agarosa, seguido por inmunotransferencia con teñido de gel de ácido nucleico SYBR Gold (obtenido de Molecular Probes, Eugene, Oreg.) Las bandas 15 de ADN que corresponden a la timidilato sintasa se cuantificaron y normalizaron a aquellas de la ß-actina por Molecular Dynamics Storm. Análisis de Northern Blot Se obtuvieron northern blots de Invitrogen 20 (Carisbad, CA) y se hibridizaron a una sonda de ADNc TS clonada. Las señales de hibridización normalizadas contra la proteína ribosomal S9 como una transcripción de gobierno. Se consideró un tumor para sobreexpresar ARNm TS si la señal normalizada se mejoró por lo menos 2 veces cuando se comparó 25 con el control de tejido normal.
Clonación, Expresión y Purificación de Timidilato Sintasa Humana Para la expresión de E. coli la TS ORF humana completa se subclonó dentro del vector de expresión promotor T7 pET28a (Novagen, Inc.). El vector de plásmido resultante que codifica la síntesis de la TS humana como una proteína de fusión recombinante con seis histidinas seguidas por un sitio de desdoblamiento de trombina. Esta proteína de fusión agrega un total de 20 aminoácidos extras a los términos amino de TS humano. Para producir la proteina recombinante, el vector de expresión TS humano se introdujo en la cepa E. coli BL21 (DE3) , una cepa con el gen de polimerasa ARN T7 insertado dentro del cromosoma bajo el control del operador lac. La proteína de fusión TS-poli-His humana se purificó utilizando un metal para quelar la resina de afinidad (Novagen, Inc.). La purificación de la proteína se siguió por electroforesis en 10% de geles de poliacrilamida SDS. Las concentraciones de proteína se determinaron utilizando el ensayo de proteína Pierce BCA. Aproximadamente 10 mg de la proteína de fusión TS humana se recuperó de un cultivo de 500 ml de E. coli . Cuando se visualizó con inmunotransferencia de plata únicamente la banda que corresponde al TS humano fue aparente. La identidad de la banda TS humana se confirmó realizando un Western blot con el anticuerpo monoclonal anti-TS TS106 (NeoMarkers) .
Ensayo de Actividad de Enzima de Timidilato Sintasa (TS) La actividad de TS se midió utilizando el ensayo espectrofotométrico de Wahba, et al. (1961). En este ensayo, la actividad de TS se verificó midiendo el incremento en absorbencia a 340 mm que ocurre cuando el co-factor 5,10 de metilen tetrahidrofolato se oxidizó a dihidrofolato como dUTP se convirtió a dTTP. La enzima preparada por este método tiene una actividad específica de 0.5-0.65 unidades/mg de proteína. Una unidad se define como la producción de un micromol de dTMP por minuto. Este valor es similar a aquel reportado por Pedersen-Lane, J. et al. (1997). Determinación de Productos Intracelulares del Metabolismo de Profármaco de TS Es importante determinar los productos intracelulares del metabolismo de profármaco de TS para sustanciar el mecanismo propuesto de activación y acción y para definir agentes que son candidatos terapéuticos. Una vista aceptable de metabolismo intracelular de amidatos de arilfosfodiéster implica conversión enzimática dentro de un ácido carboxílico, redisposición intramolecular del amidato de fosfomonoéster dentro de un nucleósido de 5'-monofosforilo . Véase, Valette et al. (1996). Sin embargo, este mecanismo es improbable para describir el procesamiento intracelular de todos los pronucleótidos basados en fosforamidato. Por ejemplo, un mecanismo diferente se propuso para el procesamiento de amidato de aril fosfomonoéster, implicando la conversión directa simple del fosforamidato a las especies de monofosfato por hidrolatos de fosforamidato. Véase, Mclntee et al. (1997) y Fries et al. (1995). A pesar del mecanismo para desenmascarar el nucleósido de monofosfato, este ensayo detectará productos de conversión de TS del monofosfato intracelular a los compuestos citotóxicos dentro de la célula. Las células se incubaron con una cantidad de compuestos de profármaco que inducen 50% de inhibición de crecimiento de líneas celulares que expresan TS elevada (en el ensayo 72H, supra) . Ambas células expresadoras TS bajas y altas se utilizaron (por ejemplo, CCDldco contra H630R10) . Estudios de curso de tiempo se realizaron en los cuales las células tratadas se procesaron de acuerdo con el método descrito por Mclntee, E.J. et al. (1997) . Las células se usaron con 60% de metanol en agua a -20°C, y el residuo particulado removido por centrifugación. Los sobrenadantes se secaron y se almacenaron a -20°C. Las alícuotas se evaluaron inicialmente por RP-HPLC y luego por LC-MS para documentar la conversión intracelular de la fosforamidita al monofosfato y también asegurar la transformación del monofosfato por timidilato sintasa. Documentación de la Actividad del Sustrato Utilizando Timidilato Sintasa Purificada j - Este ensayo determina las actividades específicas de las preparaciones de enzima de TS futuras, para asegurar la actividad de tales preparaciones durante el tiempo, y para determinar si los compuestos tamizados para la actividad adecuada inactivan la enzima de TS bajo condiciones de reacción in vi tro . Para determinar qué productos de reacción se producen cuando los compuestos de profármaco se incuban juntos con la enzima TS recombinante purificada, las condiciones de reacción similares a aquellas empleadas con el ensayo de actividad TS se utilizan para generar productos de reacción in vi tro . Estos productos de reacción serán entonces analizados por espectrometría de masa GS para identificar las moléculas actuales formadas. Resultados TS se expresa altamente en varias líneas celulares de tumor y tumores principales Los niveles de expresión de timidilato sintasa en un cerebro humano normal, corazón, riñon, bazo, hígado, colon, pulmón, intestino delgado, músculo del abdomen, testículos, ovario, útero, próstata, glándula tiroides, glándula salivaría, glándulas de adrenalina, piel, linfocitos sanguíneos periféricos, médula ósea y de colon humano y tejidos normales humanos equilibrados se determinaron utilizando RT-PCR cuantitativos, como se describió anteriormente. Los cebadores para ß-actina se diseñaron para extender la unión de exon4/intron5/exon5 para verificar la posible contaminación de ADN. Por lo tanto, los resultados reportados en las Figuras 3 se muestran como niveles de ARNm TS relativos. La Figura 3A muestra ARNm TS relativos en los tejidos humanos normales múltiples. La Figura 3B es una comparación del promedio de ARNm TS entre tejidos de colon humanos normales y de tumor. Los niveles de proteína de timidilato sintasa (TS) en varias líneas celulares de tejido normales y de tumor se determinaron siguiendo procedimientos descritos anteriormente. Los niveles de proteína se midieron por análisis Western blot; los resultados se muestran posteriormente . Tabla 3 Nivel de proteína TS en tipos celulares humanos normales y de tumor Cepas de Célula Descripción Nivel TS1 NHOST Hueso, osteoblasto 51 NPRSC Próstata, estroma 98 CCD18co Epitelio de colon, fibroblasto 100 WI38 Pulmón, embriónico 150 DET551 Piel, como fibloblasto, embriónico 177 MRC9 Pulmón, como fibloblasto, embriónico 211 NHDF Piel, fibroblsto 224 NHLF Pulmón, fibroblasto 236 Promedio 156±24" 1. Timidilato Sintasa (TS) - los niveles de TS se determinaron utilizando análisis Western blot, los niveles de expresión cuantificados se expresaron como valores relativos a aquellos de la cepa celular CCD 18co. 2. Error estándar Células de Tumor (> 4X TS) Lineas celulares Descripción Nivel1 TS H630/TDX Colon, carcinoma , resistente a TDX2 671 HCTC { +) Colon, carcinoma, TS incrementada 1276 MCF7/TDX Seno, adenocarcinoma , resistente a TDX2 1980 H630R10 Colon, carcinoma, resistente a 5-FU3 2305 Promedio 1558±3544 1. Timidilato Sintasa (TS ) - los niveles de TS se determinaron utilizando análisis Western blot, los niveles de expresión cuantificados se expresaron como valores relativos a aquellos de la cepa celular CCDldco . 2. Tomudex 3. 5-Fluorouracilo 4. Error estándar Las cantidades de BVdUMP y BVdU Medidas en Células Las cantidades de BVdUMP o BVdU presentes en líneas celulares de lisatos MCF7, MCF7TDX, y H630R10 cada una tratada con BVdU, se expresan como un área de un pico HPLC correspondiente a 300 nm. Observe que los coeficientes de extinción de estos compuestos a 300 nm son los mismos, por lo que la comparación de las áreas pico permiten comparación directa de las cantidades formadas. La Tabla 4, en lo siguiente, muestra el nivel de BVdUMP y BVdU medido dentro de las células después de 2 días de tratamiento. Las células se incubaron en medios completos con 100 µm de BVdU. Los lisatos se prepararon y los niveles de BVdUMP y BVdU se determinaron. Tabla4.
La tabla muestra que BVdU puede penetrar todos los tres tipos celulares, pero aparece como BVdUMP más prominentemente en líneas celulares MCF7 y MCF7TDX. La conversión pequeña ocurre en la línea celular H630R10. En un experimento separado, los lisatos celulares MCF7TDX y H630R10 se utilizaron para catalizar fosforilación BVdU en un sistema libre celular con ATP agregado como un método donador de fosfato. Esto confirmó la mayor relación elevada de esta reacción en el lisato celular MCF7TDX cuando se comparó para el lisato celular H630R10. Los lisatos de tumor preparados como se describen (Look, K.Y. et al. (1997) pueden prepararse y utilizarse en este ensayo con BVdU (u otro nucleósido candidato) para determinar si un paciente dado es un candidato para nucleósido contra terapia de fosforamidato . Estos resultados muestran que en células MCF7TDX BVdU puede ser fosforilado para producir el monofosfato correspondiente, un sustrato para reacción TS subsecuente mientras que en las células H630R10 tal fosforilación sigue significativamente más lenta que en MCF7TDX. Es importante mencionar que MCF7TDX es una línea celular de tumor de seno. Se ha reportado que en las células de tumor de seno una TK con propiedades diferentes de la TK humana de otro tejido se encontró. (Madec, A. et al. (1988)). Esta TK puede ser responsable para fosforilación BVdU. Basado en los resultados presentados anteriormente se espera que los nucleósidos, tales como BVdU; puedan ser especialmente útiles para el tratamiento de ciertos tipos de cáncer, incluyendo cáncer de seno, en donde BVdU puede fosforilarse . Además, el procedimiento experimental descrito anteriormente, permite la determinación in vi tro de viabilidad de utilizar BVdU u otros nucleósidos para un tipo de cáncer dado utilizando el siguiente enfoque. Si una muestra de tejido está disponible las células pueden tratarse in vi tro con BVdU y posible formación de BVdUMP pueden verificarse. La formación de BVdUMP registrar el tipo de tumor podría considerarse como un candidato para tratamiento de nucleósido exitoso como opuesto a los derivados de fosforamidato. Tabla 5 Ensayo de Citotoxicidad de Alamar Blue de Células Normales y de Tumor Tabla 6 La numeración en las Tablas 5 y 6 se refieren a las estructuras, mostradas infra. Los resultados de la prueba que utilizan el ensayo alamarBlue se muestran en la Tabla 5, y los resultados de cristal violeta basados en ensayos se muestran en la Tabla 6. MCF7-TDX se deriva de las células de tumor de seno MCF7 a través de la selección en el cultivo celular en la presencia de Tomudex, un inhibidor directo de TS. Tal selección con frecuencia resulta en niveles intracelulares elevados de TS (Freemantle, S.J. et al. (1995)). Similarmente, H630R10 es una línea celular epitelial de cáncer de colon resistente a 5FU (fluoropirimidina) derivada de células de cáncer de colon ¿ ¿ H630. Véase, Copur, S. et al. (1995). HT1080, #12, es una línea celular de tumor de fibrosarcoma que expresa altos niveles de TS a través de un transgen introducido en células de tumor HT1080. Las líneas celulares normales utilizadas en estos ensayos incluyen CCDldco (epitelio de colon normal) y Det551 (piel normal) . Los datos en ambas Tablas 5 y 6 indican que la mayoría de los compuestos son activos como fosforamidatos y nucleósidos. Una excepción es NB1026™ la cual tiene poca actividad detectable como un fosforamidato, pero es activa como un nucleósido (NB1025™) . Este resultado indica que NB1026™ puede no activarse similar a NBlOll™. Los resultados de citotoxicidad con los nucleósidos, especialmente BVdU, NB1020™ (CIVdU) y NB1024™, son sorprendentes ya que la literatura enseña que los compuestos 5-sustituidos como BVdU no son eficientemente monofosforilados por células humanas a menos que expresen timidina cinasa viral. Véase, Balzarini, J. et al. (1985) y De Clerq, E. et al. (1997) . Estos autores han propuesto que una vez fosforilado por la TK codificada por virus herpes, el derivado de nucleótido 5-sustituido puede unirse a la enzima TS e inactivarla. Los resultados en las Tablas 4-6 demuestran, por primera vez, que por lo menos algunas células tumorales pueden tener una actividad de timidina cinasa inusual capaz de fosforilar moléculas de uridina 5-sustituidas similares a BVdU, y los otros nucleósidos mostrados en la presente. Alternativamente, algunas células tumorales pueden tener una cantidad inusualmente elevada, o forman la enzima TK normal (Suki, S. et al. (1995); y Romain, S. et al. (1995)), conduciendo a una baja, pero suficiente activación de nucleósidos a sus monofosfatos correspondientes. El compuesto NB1024™ como se probó anteriormente consiste de una mezcla de dos isómeros, 5- (4-Bromo-l£, 3£-butadienil) -2' -desoxiuridina (Vlla), (Isómero 2), y 5-(4-Bromo-l£,3Z-butadienil) -2' -desoxiuridina (VIIb) ; (Isómero 1). Estos dos compuestos se separaron por HPLC semi-preparativa (columna de fase inversa C18) utilizando 20% de acetonitrilo en agua como la fase móvil como se describió anteriormente (Ejemplo 12) . La capacidad de cada compuesto aislado para bloquear la proliferación celular fue determinada entonces por el procedimiento de cristal violeta. Los resultados se muestran en la Tabla 7. Los dos isómeros exponen actividades marcadamente diferentes con el isómero Z, mostrando significativamente mayor crecimiento inhibiendo actividad en comparación con el isómero E. Tabla7.ActividadCitotóxicadeIsómeros NB1024 Las primeras dos líneas celulares, TS HT1080 #12 y MCF7TDX expresan altos niveles de TS, mientras que los otros dos, CCDldco y Det551, son células normales. Mientras que la invención ha sido descrita en detalle y con referencia a modalidades específicas de la misma, será aparente para un experto en la técnica que varios cambios y modificaciones pueden hacerse en la presente sin apartarse del espíritu y alcance de la misma. REFERENCIAS Literatura Abraham et al. (1996) J. Med. Chem. 39: 4569-4575 Akdas, A. et al. (1996) Eur. Urol. 29(4) :483-486 Almasan, A. et al. (1995a) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 92:5436-5440 Almasan, A. et al. (1995b) Cáncer Metasta ses Rev. 14:59-73 Antelman, D. et aL (1995) Oncogene 10:697 Asakura, J. et al. (1988) Tetrahedron Lett. 29:2855-2858 Asakura, J. et al. (1990) J. Org. Chem. 55:4928-4933 Aschele, C. et al. (1999) . J. Chern. Oncol . 17(6) :1760-1770 Balzarini, J. et al. (1985) Methods Find. Exp. Clin. Pharmacol. 7:19-28 Balzarim, J. et al. (1996) Proc Nati. Acad. Sci . USA 93:7295-7299 Banerjee, D. et al. (1995) Acta Biochem Pol . 42:457 Banerjee, D. et al. (1998) Cáncer Res. 58:4292-4296 Barbour, K. W. et al. (1992) Molec Pharmacol . 42:242-248 Barbato, et al. (1989) Nucleosides Nucleotides 8(4): 515-528 l ¿>.a Barr y Robins (1981) J. Med. Chem. 24(12) : 1385-1388 Barr, P.J. et al. (1983) Biochemistry 22:1696-1703 Barrett, J.E. (1998) J. Ap. Chem. Soc. 120:449-450 Benzaria et al. (1996) J. Med. CHem. 39: 4958 Bergstrom, D.E. et al. ((1981) & (1984) J. Med. Chem. 27:279-284 Bertino, J.R. et al. (1996) Stem Cells 14:5 Bigge, et al (1980) J. Amer. Chem. Soc. 102:2033-2038 Callahan, A.P. et al. (1989) Comm. Nucí. Med. 20:3-6 Carreras and Santi (1995) Annu. Rev. Biochem. 64:721-762 Cárter, P. et al. (1992) Proc Nati. Acad. Sci. USA 89:4285-4289 Chadhuri, N.C. et al. (1995) J. Am. CHem. Soc. 117:10434-10442 Chen L. et al. (1996) Cáncer Res. 56:1331-1340 Cho, Y.M. et at. (1994) Tetrahedron Lett. 25:1149-1152 Clarke, R (1996) Breast Cáncer Res. Treat. 39:1-6 Cobleigh, M.A et al. (1999) .J. Clin. Oncol . 17 (9) :2639-2648 Connors, T.A and Knox, R.J. (1995) Stem Cells 13:501-511 Copur, S. et al. (1995) Biochem. Pharm. 49(10) : 1419-1426 Crisp, G.T. (1989) Synth. Commun. 19:2117-2123 Cruickshank. K.A. et at. (1988) Tetrahedron Lett. 29:5221-5224 Dale, et al. (1973) Proc Nati. Acad. Sci. USA 70:2238-2242 DeClercq, E. et al. (1983) J. Med Chem. 26:661-666 DeClereq, E. et at. (1997) Ctin. Micro. Review 10(4) :674-693 Dicken, A P. et al (1993) Proc. Nati . Acad. Sci . USA 90:11797-11801 Dirven, H.A et at. (1995) Cáncer Res. 55:1701-1706 Dorr, R.T. and Von Hoff; D.D., eds. (1994) "Cáncer Chemotherapy Handbook" 2nd ed. (Appleton y Lange), pp. 768-773 Dyer, RL. et at. (1991) Nucí. Acids CHern. 4:79-83 Edler, D. et al. (2000) Clin. Cáncer Res. 6(2):488-492 5 Fan, J. and Bertino, J. (1987) Oncogene 14:1191-1200 Farquhar et al. (1994) J. Med. Chem. 37:3902-3909 Farquhar, J. et at. (1995) J. Med Chem.38: 488-495 Freed, et at. (1989) Biochem. Pharmacol. 38:3193-3198 Freemantle, S.J. et at. (1995) Br. J. Cáncer 71:925-930 10 Fries, K.M., et al. (1995) J. Med. Chem. 38:2672-2680 Funk, J.O. (1999) Anticancer Res. 19 (6A) .-4772-4780 Goodwin, J.T. et al. (1993) Tetrahedron Lett. 34:5549-5552 Gottesman, M.M. et al. (1995) Annu. Rev. Genet. 29:607 Graham,D. et al. (1998) J. Chem. Soc Perkin Trans. 1:1131-1138 15 Haskell, C.M ed., (1995) Cáncer Treatment 4th Ed., W.B. Saunders Co., Philadelphia, PA Hobbs, F.W. Jr. (1989) J. Org. Chem. 54:3420-3422 Holy, et al. (1999) J. Med. Chem. 42(12) : 2064-2086 Hostetler, et al. (1997) Biochem. Pharmacol 53:1815 20 Houze, T.A (1997) Tumour Biol. 18:53-68 Hsiao and Bardos (1981) J. Med. Chem. 24:887-889 Hudziak, R.M. et al. (1988) Proc. Nati. Acad Sci USA 85:5102 Husain, et al. (1994) Cáncer Res. 54:539 Jackman, A.L. et al. (1995a) Ann. Oncol. 6(9) .871-881 iiifgii^^ i Jackman, A.L. et al. (1995b) Anticancer Drug Des. 10:573 Johnson, P.G. et al. (1997) J. Clin. Oncol . 15:1923-1931 Jones, R.G. and Mann, M.J. (1953) J. Am. Cáncer Soc. 75:4048-4052 Kashani-Sabet et al. (1988) Cáncer Res. 48:5775-5778 Kobayashi, H. et al. (1995) Japan. J. Cáncer Res. 86:1014-1018 Krajewskas y Snugar (1982 Biochem. Pharmacol. 31 (6) : 1097-1102 Lasic, D.D. (1996) Nature 380:561-562 Lee, V. et al. (1997) Mxp. Cell Res. 234:270-276 Lenz, H.J. et al. (1998) Clin. Cáncer Res. 4:1227-1234 Les, A. et al. (1988) Bio. Structure and Dynamics 15(4): 703-715 Lewis, J.G. et al. (1996) Proc. Nati . Acad. Sci . USA 93:3176-3181 Lin, W-Y. et al. (1997) Eur. J. Nud. Med. 24:590-595 Livak, K J. en al. (1992) Nucleic Acids Res. 20:4831-4837 Lonn, U. et al. (1996) Cáncer 77(1) : 107-112 Look, K.Y. et al. (1997) Anticancer Res. 17:2353-2356 Lovejoy, et al. (1997) J. Pathol. 181:130-135 Madec, A. et al. (1988) Bull Cáncer 75:187-194 Mader, R.M. et al. (1998) Gen. Pharmacol . 31(5): 661 666 McGuigan, C. (1993) J. Med. CHe . 36:1048-1052 McGuigan, C. (1996) J. Med CHem. 39:1748-1753 McGuigan, C. et al. (1994) FEBS Lett. 351:11-14 Mclatee, EJ. (1997) J. Med Chem. 40: 3323-3331 Melton, R.G. and Sherwood, R.E. (1996) J. Nati. Cáncer Inst. 88: 153-165 Meier, et al . (1997) Bicorg. Med. Chem. Lett. 7 : 1577 Meier, et al. (1997) Bioorg. Med Chem. Lett . 7:99 Meier, et al., (1997) International Antiviral News. 5:183 Miller, J.H., "A Short course in bacterial genetics: A laboratory manual and handbook for E. coli and related bacteria" Cold Spring Harbor Press (1992) Morgan, A.S. et al. (1998) Cáncer Res. 58:2568-2575 Negishi, et al. (1996) Nuc. Acids Symp. Ser: 35:137-138 Paradiso, A. at al. (2000) Br. J. Cáncer 82 (3) :560-567 Pederson-Lane, J. (1997) Protein Expression d Purification 10:256-262 Pegram, M.D. et al. (1997) Oncogene 15:537-547 Phelps, M.E. et at. (1980) J. Med. Chem. 23:1229-1232 Pluta, et at. (1999) Boíl . Chim. Farm. 138(1): 30-33 Robins, M.J. et at. (1981) Tetrahedron Lett. 22:421-424 Robins, M.J. et at. (1982) Gar¡. J. Chem. 60:554-557 Robins, M.J. et al. (1983) J. Org. Chem. 48:1854-1862 Ro ain, S. et al. (1995) Inti. J. Cáncer 61 (1) : 7-12 Roth, J.A. et al. (1999) Oncology 13(10 Supp. 5):148-154 Ruth, J.L. et al. (1978) J. Org. Chem 43:2870-2876 Saboulard, L. et al. (1999) Mol. Pharm. 56:693-704 Santi, D.V. (1980) J. Med. Chem. 23:103-111 Sastry, et al., (1992) Mol . Pharmacol 41:441-445 Schaechter,M. et al., eds. (1993) Mechanisms of Microbial Disease, 2nd Ed, Williams and Wilkins Shepard H.M. et al. (1988) J. Clin. Im unol. 8:353-395 Simón, S.M. and Schindler, M (1994) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91:3497 Smith, K.A. et al. (1995) Philos. Trans. R Soc. Lon. B. Biol. Sci. 347:49-56 Spector, D.L. et aL (1998) Cells, A Loboratory Manual, Vols I to III, Cold Spring Harbor Press Stühlinger, M. et al. (1994) J. Steroid Biochem. 49:39 Sugarman, B.J. et al. (1985) Science 230:943-945 Suki, S. et al. (1995) Leukemia Lymphoma 18(1-2) :87-92 Tannock, I.F. (1996) . J. Clin. Oncol . 14(12) : 3156-3174 Teh, B.T. (1999) Anticancer Res. 19(6A) : 4715-4728 Tolstikov, V.V. et al. (1997) Nucleosides Nucleotides 16:215-225 Troutner, D.N (1987) Nucí. Med Biol . 14:171-176 Valette, et al. (1996) J. Med. Chem 39:1981 Voet, et al. (1995) Biochemistry 2nd Ed., John Wiley & Sons, Inc. Wahba, A J. et al. (1961) J. Biol . Chem. 236(3) :Cll Wallis, et al. (1999) Fármaco 54 (1-2) : 83-89 Wataya, Y. (1979) J. Med Chem. 22:339-340 Wettergren, Y. et al. (1994) Mol . Genet. 20:267-285 Whalen and Boyer (1998) Semin. Liver Dis. 18(4) : 345-358 Wilson J.D., et at; (eds.) "Harrison' s Principies of Internal Medicine" 12* ed., McGraw-Hill, Inc., pp. 21-76 (1991) Yen Y. et al. (1994) Cáncer Res. 54:3686-3691 Zeid, et al. (1999) Nucleosides Nucleotides 18(1): 95-111

Claims (52)

  1. REIVINDICACIONES 1. Un compuesto que tiene la estructura: o tautómeros del mismo; en donde R12 o R13 pueden ser los mismos o diferentes y se seleccionan del grupo que consiste de oxo, OH o NHNH2; en donde si a es 0 ó 1, a condición de que si a es 0 y R13 es oxo, entonces existe un doble enlace entre la posición 3 y 4 y R12 es NHNH? o si a es 0 y R12 es oxo, entonces existe un doble enlace entre la posición 2 y 3 y R13 es NHNH2; o si a es 1, entonces R12 y R13 son oxo; en donde R1 es un sustituyente que tiene la fórmula: en donde R2 y R3 son independientemente un grupo hidrocarbilo insaturado o saturado; en donde n es 0 o un número entero de 1 a 10 y m es 0 ó 1; y en donde R4 se selecciona del grupo que consiste de F, Cl, Br, I, CN, S03H, C02H, CO2CH2CH3, CO2CH3, SI(CH3)3, CHO, N02, CF3, CCI3, CH=C(R15)2 o un sustituyente que tiene la estructura: 0 Z-—CF2 CH2 C—OH
  2. ; —^Z—CF2--CH2--CH2---N02 en donde X2 y b son independientemente los mismos o diferentes y se seleccionan del grupo que consiste de Cl, Br, I, y un grupo saliente potente; en donde Ya, Yb o Yc son independientemente los mismos o diferentes y son H o F; en donde Z, Za y Zb son independientemente los mismos o diferentes y se seleccionan del grupo que consiste de O y S; y en donde R14 es H o F, a condición de que si R14 es F, entonces a es 1 y R12 y R13 son oxo; y en donde Q se selecciona del grupo que consiste de un azúcar, un compuesto carbocíclico, y un acíclico, o un derivado de fosfato enmascarado o derivado de fosforamidato del mismo. 2. El compuesto de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque Q se selecciona del grupo que consiste de sustituyentes que tienen la estructura: en donde Ra y Rb son independientemente los mismos o diferentes y se seleccionan del grupo que consiste de Br, Cl, F, I, H, OH, OC(=0)CH3, y un grupo hidroxilo protegido; y en donde R7 se une a Q en la posición 5' de Q y se selecciona del grupo que consiste de hidrógeno, un grupo fosfato, un grupo fosfodiéster o un grupo fosforamidato; y en donde el compuesto puede estar en cualquier forma enantiomérica, diastereisomérica, o estereoisomérica, incluyendo la forma D, forma L, forma a-anomérica y forma ß-anomérica.
  3. 3. El compuesto de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque Q es: 4* V
  4. 4. El compuesto de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque m es 0 y R se seleccionan del grupo que consiste de:
  5. CHjO C- -CH¿0 S C- -CHjS- S - "-"-*-tt->-^í — • - .,....,» .AJ. . .*, -. en donde R5 es independientemente el mismo o diferente y se selecciona del grupo que consiste de un grupo alquilo lineal o ramificado que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, un grupo cicloalquilo que tiene de 3 a 10 átomos de carbono, CN y un halógeno. 5. El compuesto de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque R2 y R3 tomados juntos es un alquenilo o alquinilo y se selecciona del grupo que consiste de: 10
  6. 6. El compuesto de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque m es 0 y R~ es un grupo hidrocarbilo aromático seleccionado del grupo que consiste de:
  7. 7. El compuesto de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque m es 0 y R~ es un grupo heteroaromático seleccionado del grupo que consiste de: en donde J se selecciona del grupo que consiste de -O-, -S-, -Se-, -NH-, y NRALQ- y en donde RAQ es un alquilo lineal o ramificado que tiene de 1 a 10 átomos de carbono o un grupo cicloalquilo que tiene de 3 a 10 átomos de carbono.
  8. 8. El compuesto de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque R7 es: ... k
  9. 9. El compuesto de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque R es:
  10. 10. El compuesto de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque R7 se selecciona del grupo que consiste de:
  11. 11. El compuesto de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque R7 se selecciona del grupo que consiste de: _! «• - t-V? ñ^tíii k o un compuesto que tiene la estructura: en donde K? es un sustituyente aromático.
  12. 12. El compuesto de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque R4 se selecciona del grupo que consiste de:
  13. 13. Un compuesto que tiene la estructura: -.^?aÉat-liá^^^^É»e-á8a-ia¿,J, á, » j .. . -_-t-ji i. en donde X y Xe son independientemente los mismos o diferentes y se seleccionan del grupo que consiste de Cl, Br, I y CN; o los análogos nucleósidos del mismo.
  14. 14. El compuesto de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque Xd es Cl o Br y Xe es H.
  15. 15. Un compuesto que tiene la estructura: en donde Xf y Xg son independientemente los mismos o diferentes y se seleccionan del grupo que consiste de Cl, Br, I y CN; o los análogos nucleósidos del mismo.
  16. 16. El compuesto de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque Xf y Xg son los mismos y son cada uno Cl o Br.
  17. 17. Un compuesto que tiene la estructura de la fórmula: en donde cada X se selecciona del grupo que consiste de Cl, Br, I y CN; o los análogos nucleósidos del mismo.
  18. 18. El compuesto de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque X es Cl o Br.
  19. 19. El compuesto de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque X es Br.
  20. 20. Un compuesto que tiene la estructura: en donde R8 es un alquilo de cadena lineal o ramificada inferior; o los análogos nucleósidos del mismo.
  21. 21. Un compuesto que tiene la estructura: en donde R8 y R9 son alquilos de cadena lineal o ramificada inferiores y R10 es H o CH; o los análogos nucleósidos del mismo.
  22. 22. Un compuesto que tiene la estructura: en donde R ,10 es H o CH3; o el análogo nucleósido del mismo.
  23. 23. Un compuesto que tiene la estructura: •fi. -tfflriffyfcf'i
  24. 24. Un compuesto que tiene la estructura: o el análogo nucleósido del mismo.
  25. 25. El compuesto de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el compuesto tiene la estructura: iÜ
  26. 26. El compuesto de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque R7 = H.
  27. 27. El compuesto de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque R7 es un sustituyente 5 que tiene la estructura:
  28. 28. El compuesto de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el compuesto tiene la estructura:
  29. 29. El compuesto de conformidad con la 10 reivindicación 28, caracterizado porque R7 = H.
  30. 30. El compuesto de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque R7 es un sustituyente que tiene la estructura 15 ^^^^"^lümttÉ n i - , ' 1 k^ái,*...*^....,-^.^* .,_ m |
  31. 31. Un compuesto que tiene la estructura;
  32. 32. Un compuesto que tiene la estructura; caracterizado porque X se selecciona del grupo que consiste de CO?Et, Cl, y Br; 5 o el análogo nucleósido del mismo. t?ítAiJt? .. ..'.a.1.» i.
  33. 33. Un compuesto que tiene la estructura: o el análogo nucleósido del mismo.
  34. 34. Un compuesto que tiene la estructura: o el análogo nucleósido del mismo.
  35. 35. La composición caracterizada porque comprende los compuestos de conformidad con las reivindicaciones 1 a 34, y un portador.
  36. 36. La composición de conformidad con la reivindicación 35, caracterizada porque el portador es un portador farmacéuticamente aceptable.
  37. 37. Un método para tamizar un agente terapéutico, caracterizado porque comprende: (a) poner en contacto una muestra que contiene una célula objetivo con cualquiera de los compuestos de las reivindicaciones 13 a 34; (b) poner en contacto una muestra separada de la célula objetivo con un agente terapéutico potencial; y (c) comparar las muestras para la inhibición de proliferación celular o eliminación celular.
  38. 38. El método de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado porque la célula objetivo se caracteriza como resistente a un fármaco quimioterapéutico.
  39. 39. El método de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado porque la célula objetivo se caracteriza como expresando una enzima objetivo que se amplifica como un resultado de selección in vivo por quimioterapia.
  40. 40. El método de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado porque la enzima objetivo es una enzima intracelular endógena que se sobreexpresa en la célula objetivo.
  41. 41. El uso de cualquiera de los compuestos de conformidad con las reivindicaciones 13 a 34, para la preparación de un medicamento para tratar o inhibir la proliferación de una célula patológica.
  42. 42. Un método para inhibir la proliferación de una célula patológica, que comprende poner en contacto la célula IAJL. ^¡^^^^^ "*•""' —' *~" »:*>**. * con una cantidad efectiva de cualquiera de los compuestos de conformidad con las reivindicaciones 13 a 34.
  43. 43. El método de conformidad con la reivindicación 42, caracterizado porque la célula patológica es resistente a un fármaco quimioterapéutico.
  44. 44. El método de conformidad con la reivindicación 42, caracterizado porque la célula patológica expresa una enzima objetivo que se amplifica como un resultado de selección in vivo por quimioterapia.
  45. 45. El método de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado porque la enzima objetivo es una enzima intracelular endógeno que se sobreexpresa en la célula objetivo.
  46. 46. El método de conformidad con la reivindicación 45, caracterizado porque la enzima es timidilato sintasa.
  47. 47. Un método para tratar una patología caracterizada porque la proliferación de las células objetivo en un sujeto comprende administrar al sujeto cualquiera de los compuestos de conformidad con las reivindicaciones 13 a 44.
  48. 48. El método de conformidad con la reivindicación 47, caracterizado porque la célula objetivo es resistente a un fármaco quimioterapéutico.
  49. 49. El método de conformidad con la reivindicación 47, caracterizado porque la célula objetivo expresa una enzima que se amplifica como un resultado de selección in vi vo por quimioterapia.
  50. 50. El método de conformidad con la reivindicación 49, caracterizado porque la enzima objetivo es una enzima 5 intracelular endógena que se sobreexpresa en la célula objetivo.
  51. 51. El método de conformidad con la reivindicación 50, caracterizado porque la enzima es timidilato sintasa.
  52. 52. El método de conformidad con la reivindicación 10 48, caracterizado además porque comprende poner en contacto la célula con la quimioterapia anterior después que la resistencia a la quimioterapia anterior ha sido revertida.
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Families Citing this family (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9708611D0 (en) * 1997-04-28 1997-06-18 Univ Cardiff Chemical compounds
US6703374B1 (en) 1997-10-30 2004-03-09 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Nucleosides for imaging and treatment applications
US7462605B2 (en) 1998-01-23 2008-12-09 Celmed Oncology (Usa), Inc. Phosphoramidate compounds and methods of use
DK1045897T3 (da) * 1998-01-23 2002-05-13 Newbiotics Inc Enzymatisk katalyserede, terapeutiske midler
WO2001007088A2 (en) * 1999-07-22 2001-02-01 Newbiotics, Inc. Methods for treating therapy-resistant tumors
US6683061B1 (en) * 1999-07-22 2004-01-27 Newbiotics, Inc. Enzyme catalyzed therapeutic activation
GB0009486D0 (en) 2000-04-17 2000-06-07 Univ Cardiff Chemical compounds
WO2002007780A2 (en) * 2000-07-20 2002-01-31 Newbiotics, Inc. Methods for identifying therapeutic targets
WO2002056832A2 (en) 2001-01-19 2002-07-25 Newbiotics, Inc. Methods to treat autoimmune and inflammatory conditions
JP4109123B2 (ja) 2001-05-09 2008-07-02 セルメド オンコロジー （ユーエスエイ）， インコーポレイテッド ペプチドデホルミラーゼ活性化プロドラッグ
WO2004043400A2 (en) 2002-11-14 2004-05-27 Celmed Oncology (Usa), Inc. Peptide deformylase activated prodrugs
WO2004111192A2 (en) 2003-05-29 2004-12-23 The Scripps Research Institute Targeted delivery to legumain-expressing cells
GB0317009D0 (en) 2003-07-21 2003-08-27 Univ Cardiff Chemical compounds
US8399428B2 (en) 2004-12-09 2013-03-19 Regents Of The University Of Minnesota Nucleosides with antiviral and anticancer activity
GB0609178D0 (en) 2006-05-09 2006-06-21 Univ Cardiff Novel compounds
US7964580B2 (en) 2007-03-30 2011-06-21 Pharmasset, Inc. Nucleoside phosphoramidate prodrugs
DE102008030091B4 (de) * 2008-06-25 2011-03-03 Resprotect Gmbh Uracilderivate und deren Verwendung
WO2012117246A1 (en) 2011-03-01 2012-09-07 Nucana Biomed Limited Phosphoramidate derivatives of 5 - fluoro - 2 ' - deoxyuridine for use in the treatment of cancer
SG10201602044WA (en) 2011-09-16 2016-04-28 Gilead Pharmassett Llc Methods For Treating HCV
EA201490836A1 (ru) 2011-10-21 2014-11-28 Эббви Инк. Комбинационное лечение (например, с abt-072 или abt-333) с помощью daa для применения при лечении hcv
US8466159B2 (en) 2011-10-21 2013-06-18 Abbvie Inc. Methods for treating HCV
GB2515941A (en) 2011-10-21 2015-01-07 Abbvie Inc Methods for treating HCV comprising at least two direct acting antiviral agent, ribavirin but not interferon
US8492386B2 (en) 2011-10-21 2013-07-23 Abbvie Inc. Methods for treating HCV
CA2852867C (en) 2013-01-31 2016-12-06 Gilead Pharmasset Llc Combination formulation of two antiviral compounds
MX2016002185A (es) 2013-08-27 2016-06-06 Gilead Pharmasset Llc Formulacion combinada de dos compuestos antivirales.
RS60968B1 (sr) 2014-06-25 2020-11-30 NuCana plc Prolekovi gemcitabina
MX2020004054A (es) 2014-06-25 2021-11-30 NuCana plc Formulacion que comprende un profarmaco de gemcitabina.
CN108431016A (zh) * 2015-11-16 2018-08-21 艾可瑞恩治疗公司 核酸前体药物
CN109689063A (zh) 2016-04-28 2019-04-26 埃默里大学 含有炔烃的核苷酸和核苷治疗组合物及其相关用途
CN108148098B (zh) * 2018-02-08 2020-10-27 南通大学 靶向癌细胞高水平ros的吉西他滨-芳香氮芥缀合物及其制备方法和医药用途

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU9016998A (en) * 1997-08-08 1999-03-01 Newbiotics, Inc. Methods and compositions for overcoming resistance to biologic and chemotherapy
AU758426B2 (en) * 1997-10-30 2003-03-20 Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The Nucleosides for imaging and treatment applications
DK1045897T3 (da) * 1998-01-23 2002-05-13 Newbiotics Inc Enzymatisk katalyserede, terapeutiske midler

Also Published As

Publication number Publication date
CN1390227A (zh) 2003-01-08
CA2379988A1 (en) 2001-02-01
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WO2001007454A1 (en) 2001-02-01
ATE429438T1 (de) 2009-05-15
IL147750A0 (en) 2002-08-14
DE60042073D1 (de) 2009-06-04

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