KR20020092896A - 효소 촉매된 치료요법 활성화 - Google Patents

효소 촉매된 치료요법 활성화 Download PDF

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밍 파이 찬
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Abstract

본 발명은 예를들면, 생물학 그리고 화학요법제에 대한 내성을 주는 표적 효소를 내인적으로 과발현하는 병적 세포의 증식을 선택적으로 억제하는 신규한 기질 화합물을 제공한다. 그 효소는 기질 화합물에 작용하여 1)그것을 세포 독소로 전환시키며, 또는2)독소 부산물을 방출시킨다. 한 구체예에서, 표적 효소의 활성이 선행 화학요법에의 노출로 부터 기인하는 종양 억제 작용 및/또는 선택의 상실의 결과로서 표적 세포내에서 크게 강화되었다. 다른 구체예에서, 병적 세포는 세포내에서 감염성 제제의 발현 생성물인 표적 효소를 함유한다. 본 발명에 의해 본원에 기술된 프로드러그를 환자에 전달하여 환자를 치료하는 방법을 더욱 제공한다. 본 발명의 프로드러그는 단독으로 또는 다른 화학요법 또는 방사선과 같은 항암치료와 조합하여 사용될 수 있다.

Description

효소 촉매된 치료요법 활성화{ENZYME CATALYZED THERAPEUTIC ACTIVATION}
본 명세서 전체를 통하여, 다양한 공보가 우선 저자 및 일자, 특허 번호 또는 공보 번호에 의해 참조된다. 각 참고자료에 대한 완전한 서지사항은 명세서 내에서, 또는 청구항 바로 전 본 출원의 마지막에서 알 수 있다. 이 공보들의 명세서는 본 발명이 속하는 기술단계를 더욱 충분히 설명하기 위해 본원에 참고자료로서 포함된다.
암은 가장 흔한 전세계적인 인간 불치병 중의 하나이다. 항암제를 사용한 치료는, 특히 외과적으로 치료가능한 상태를 지난 전신성 악성종양 또는 정이성 암에 있어 중요성이 꾸준히 증가하는 선택사항이다. 불행히도, 오늘날 치유력이 있는 치료를 받을 수 있는 인간 암 종류는 아직도 다소 적으며(Haskell, C. M.(1995)), 매년 약 600,000명이 사망하고 있다. Cancer Facts & Figures, 1999American Cancer Society 참조. 인간의 암을 치유할 수 있는 약물 개발의 진행은 느리고, 소수의 혈액 악성종양 및 더 소수의 고형 종양 타입에 한정되어 성공한다(Dorr 및 Van Hoff(1994)). 질환 메카니즘을 토대로 한 치료요법 발견에서의 진전으로 미래의 성공을 위한 기회를 제공한다(Cobleigh, M.A.등(1999); 그리고 Roth, J.A.등(1999)).
악성 종양의 유전학, 생물학 그리고 생화학적인 이질성은 물론 치료 요법에 대한 주요한 또는 치료-유도 내성은 치유력있는 치료를 경감시킨다. 더우기, 많은 항암제는 낮은 정도의 선택성을 보이며, 종종 심각한 또는 생명을 위협하는 부작용을 일으키므로, 모든 암세포를 죽일 만큼 충분히 많은 복용량을 투여하는 것을 막는다. 그러므로 악성 치료-내성 병적 세포에 대해 개선된 선택성을 갖는 항-종양제를 찾는 것이 약물 발전을 위한 핵심 과제이다.
암세포는 통제할 수 없는 성장, 역분화 그리고 유전적 불안정성으로 특성화되어진다. 그 불안정성으로 인해 염색체 수이상, 염색체 결손, 재배열, 상실 또는 보통의 이배체 수를 넘는 복제를 발현한다(Wilson, J.D.등(1991)). 이 유전적 불안전성은 몇 가지 요소로 인해 발생될 수 있다. 가장 특징적인 것은 종양 억제 유전자 작용 상실을 일으키는 강화된 유전적 형성성이다(예를들면, Almasan, A. 등(1995a) 그리고 Almasan, A. 등(1995b)). 유전적 형성성으로 인해 종양 세포가 변화하는 환경에 대한 적응성을 주며, 더욱 잦은 돌연변이, 유전자 증폭, 염색체외 요소의 형성을 허용하게 할 것이다(Smith, K. A.등(1995) 그리고 Wilson, J. D.등(1991)). 이러한 특성들은 종양이 선천적인 숙주 방어 메카니즘, 생물학적 치료요법(Wilson, J. D.등(1991) 그리고 Shepard, H.M.등(1998))은 물론이고 화학요법(Almasan, A. 등(1995a) 그리고 Almasan, A. 등(1995b))에 대한 내성을 빠르게 발전시키게 하므로 더욱 공격적인 악성종양으로 이르게하는 메카니즘을 제공한다.
게다가, 화학요법제의 의학적 유용성이 그 약물에 대한 내성을 갖는 악성 종양 세포의 출현으로 인해 심각하게 한정될 것이다. 약물 내성에는 예를들면, 변경된 약물 대사, 활성 화합물에 대한 세포의 불투과성 또는 세포로 부터의 약물 제거 촉진, 억제된 효소의 변경된 특이성, 표적 분자의 생성 증가, 세포독성 병소의 회복 증가, 또는 다른 생화학적 경로에 의한 억제 반응의 우회와 같은 많은 수의 세포 메카니즘을 포함한다. 몇몇의 경우에 있어 어떤 약물에 대한 내성은 생화학적으로 구별되는 다른 약물에 대한 내성을 줄 수 있다. 암 화학요법에 대한 다른 내성의 메카니즘은 종양 억제 유전자의 작용 상실을 통해 일어난다. 이들 중 가장 특징적인 것은 p53, RB 그리고 p16이다(Funk, J.O. 1999; 그리고 Teh, B.T.(1999)). 이들 유전자 생성물의 작용의 상실로 인해 일반적으로 항암 약물(예를들면, 5-플루오로우리딜("5FU")/티미딜레이트 신타아제 그리고 메토트렉세이트/디히드로폴레이트 환원효소)에 의해 보통 표적되는 효소의 발현을 감소시킨다(Lee, V. 등(1997);Lenz, H.J.등(1998); 그리고 Fan, J. 그리고 Bertino, J.(1987)). 생물학적 그리고 화학요법에 대한 내성에는 어떤 유전자의 증폭을 포함한다. 디히드로폴레이트 환원효소를 코드화하는 유전자 증폭은 메토트레세이트에 대한 내성에 관계되며, 티미딜레이트 신타아제를 코드화하는 유전자 과발현/증폭은 5-플로로피리미딘으로의 치료에 대한 내성에 관계된다(Smith, K.A.등(1995)). 표 1은 생물학적 그리고 화학요법에 대한 내성에 있어서 현저한 몇몇 효소를 요약한다.
항암제의 낮은 선택성은 오랫동안 인식되어 왔으며, 선택성을 개선시키고 더많은 복용량의 투여를 허용하게 하려는 많은 시도가 있었다. 한가지 접근법은 프로드러그의 개발이었다. 프로드러그는 독성학적으로는 양호하지만 생체내에서 치료요법적으로 활성 생성물로 전환될 수 있는 화합물이다. 몇몇의 경우에 있어서, 활성화는 항체("ADEPT" 또는 항체-의존 효소 프로드러그 치료요법(미국 특허 제 4,975,278 호))또는 유전자 표적("GDEPT" 또는 유전자 의존 효소 프로드러그 치료요법(Melton, R.G. 그리고 Sherwood, R.G.(1996))에 의해 표적 세포로 전달된 비-내인성 효소의 활동을 통해 일어난다. 이들 기술들은 혈액을 내보내고 종양에 침투할 수 있는 능력에 심각한 한계를 갖는다. Connors, T. A. 및 Knox, R. J.(1995)참조.
수많은 뉴클레오티드와 뉴클레오시드 유사체가 항-종양제와 항-바이러스제로서 개발되고 시험되어 왔다. 예를들면 5-플루오로우라실 (5FU)과 5-플루오로데옥시우리딘 (5FUdR)이 세포내에서 티미딜레이트 신타아제(TS)의 억제제로 바뀌는 그들의 능력에 기초하여 화학요법제로 광범위하게 사용되어 왔다. 많은 다른 효소 억제 화학요법제와 마찬가지로, 5FU를 사용하는 암치료는 종종 이 약물로 더이상의 치료가 어려운 공격성 약물 내성 종양 세포에 대한 선택으로 이른다(Aschele, C. et al. (1994);Mader, R. M. et al. (1998); Lonn, U. et al. (1996); Paradis, A. et al. (2000); 및 Edler, D. et al. (2000)).
(E)-5-(2-브로모비닐)-2'-데옥시우리딘 (BVdU)과 같은 할로겐화된 뉴클레오시드 유사체에 또한 특별한 관심이 있어왔다. 이러한 타입의 화합물들은 본래 세포독성 반응을 유도하기 위해 모노포스페이트 뉴클레오티드 형태로의 인산화를 필요로 하였으며, 이 인산화는 바람직하게는 포진 바이러스 티미딘 키나아제 (TK)효소에 의해 수행된다는 관찰에 기초하여 항-바이러스제로서 개발되었다. BVdU와 관련 화합물들은 보통의 포유류 세포에는 한정된 독성을 일관적으로 보이는 한편 바이러스 감염 세포를 죽이는데 효과적이다(DeClerq, E. et al. (1997)).
항-바이러스제와 항-암제로서 BVDU와 같은 뉴클레오시드 유사체의 광범위한 시험을 통해, 그것들은 정상 세포와 암세포에 대해 최소한의 독성을 갖는다고 일관적으로 보고되어 왔다. 이러한 관찰들은 포유류 세포에 대한 이러한 화합물들의 낮은 독성을 설명하는 바이러스 티미딘 키나아제 효소에 의해 그러한 화합물들의 우선적 인산화를 증명하는 결과에 의해 지지되어 왔다. 그러므로, BVdU와 관련 뉴클레오시드 유사체들은 항-암 치료요법제로 개발되지 않아 왔다 (De Clerq, E. et al. (1997)).
본 출원은 35 U.S.C §119(e) 하에 각각 1999년 7월 22일 및 2000년 3월 21일에 제출된 다음의 미국 선출원 U.S. 일련 번호: 60/145,356 및 60/191,315에 대한 우선권을 주장하며, 이것들의 내용은 본 명세서에 참고자료로서 포함된다.
본 발명은 약물 개발의 분야, 구체적으로 병적 세포에서 과발현되는 내인성 세포내 효소에 대한 기질인 프로드러그의 디자인에 관한 것이다.
본원에서 기술된 개념을 도 1A와 1B에서 티미딜레이트 신타아제와 화합물 NB101TM의 예를 사용하여 도식한다. 도 1A는 종양 세포내에서 얼마나 높은 수준의 TS가 우선적인 독소 발생으로 이를수 있는가를 보여준다. 도 1B는 NB1011TM가 BVdUMP로 전환과 그후의 뉴클레오티드 독소를 발생시키기 위한 TS와의 상호작용을 보여준다.
도 2A와 2B는 본 발명의 고 산출 스크린을 예시하는 흐름도이다.
도 3A는 다양한 인간 조직(tissue)에서의 상대적인 TS 수준을 보여준다. 도 3B는 정상의 세포와 인간 결장 종양 조직간의 평균 TS mRNA 수준의 비교를 보여준다.
도 4는 본 발명의 푸로[2,3-d]피리미디논 뉴클레오시드의 합성 반응도를 보여준다. 합성 프로토콜은 아래에 상세히 설명된다.
본 발명은 예를들면, 생물학적 그리고 화학치료요법제에 대한 내성을 주는 표적 효소를 내인적으로 과발현하는 병적 세포의 증식을 선택적으로 억제하는 신규한 화합물을 제공한다. 그 효소는 본 발명의 프로드러그 화합물에 작용하여 1) 그것을 세포 독소로 전환시키며/또는 2) 독성 부산물을 방출시킨다. 본 발명의 또 다른 양태에서, 내성 효소와의 개시반응의 생성물은 그후 아실레이스, 포스파타에제 또는 다른 "하우스키핑" 효소(Voet, et al. (1995))와 같은 통상의 세포 효소나 보통의 세포 구성성분(예:물)에 의해 충분히 활성화되어 프로드러그로 부터 독성 부산물을 방출한다.
한가지 구체예에서, 표적 효소의 활성이 선행 화학치료요법에의 노출로 부터 기인하는 종양 억제 작용 및/또는 선택의 상실의 결과로서 표적 세포에서 대단히 강화되어 왔다. 또 다른 구체예에서, 병적 세포는 세포내 감염성 제제의 발현생성물인 표적 효소를 함유한다. 그 발현 생성물은 항생 내성을 줄 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 표적 효소에 의해 활성화될 수 있는 새로운 프로드러그를 스크린하는 시험을 포함한다. 그러한 시험을 수행하기 위해 시약을 함유하는 키트와 시험을 완결하고 결과를 분석하는데 필요한 지침이 또한 본 발명에 의해 제공된다.
본 발명에 의해 더욱 제공되는 것은 본원에 기술된 프로드러그를 환자에게전달함에 의해 환자를 치료하는 방법이다. 본 발명의 프로드러그는 단독으로 또는 다른 화학요법이나 방사선과 같은 다른 항-암치료요법과 조합하여 사용될 수 있다.
본 발명의 다른 양태는 표적 효소를 발현하는 세포에 의해 특성화되어지는 병으로부터 고통받는 환자의 치료에 사용을 위한 약제의 제조이다.
본 발명의 다른 양태는 표적 효소를 발현하는 세포를 고립시키고, 본 발명의 프로드러그 중의 적어도 하나와 세포를 접촉시켜 환자를 위한 최적의 치료요법을 확인하고, 그후 적어도 하나 또는 그 이상의 프로그러그가 증식을 억제하거나 그 세포를 죽이는 것을 확인하여, 그 환자를 위한 최적의 치료요법을 확인하는 것이다.
본 발명의 프로드러그는 다음 구조:
를 갖거나 또는 그들의 호변이성질체이다.
여기에서 R12또는 R13은 같거나 다를수 있으며, 옥소, OH 또는 NHNH2로 구성되는 군으로 부터 선택되며;
a가 0 또는 1이라면,
a가 0이고 R13이 옥소일때는 3과 4 사이의 위치에 이중결합이 존재하고 R12는NHNH2이며, 또는
a가 0이고 R12이 옥소이라면 2와 3사이의 위치에 이중결합이 존재하고 R13은 NHNH2이며; 또는
a가 1이면, R12와 R13은 모두 옥소이도;
R1은 다음의 화학식을 갖는 치환체이며:
여기에서 R2와 R3는 독립적으로 불포화 또는 포화 히드로카르빌기이며;
여기에서 n은 0 또는 1 내지 10의 정수이며, m은 0 또는 1이고; 그리고
여기에서 R4는 F, Cl, Br, I, CN, S03H, CO2H, CO2CH2CH3, C02CH3, SI(CH3)3, CHO, NO2, CF3, CCl3, CH=C(R15)2또는 다음의 구조를 갖는 치환체로 구성되는 군으로부터 선택되고:
여기에서 Xa와 Xb는 독립적으로 같거나 다르며, Cl, Br, I 그리고 효능있는 이탈기로 구성되는 군으로 부터 선택되고;
여기에서 Ya, Yb또는 Yc는 독립적으로 같거나 다르며, H 또는 F이고;
여기에서 Z, Za그리고 Zb는 독립적으로 같거나 다르며, O 또는 S이다;그리고
여기에서 Rl4는 H 또는 F이며, R14가 F라면, a는 1이며, Rl2와 R13은 모두 옥소이며;그리고
여기에서 Q는 당, 카르보시클릭 그리고 아실 화합물로 구성되는 군으로 부터 선택되며, 또는 그들의 차폐된 포스페이트 유도체 또는 포스포라미데이트 유도체이다.
발명의 실시하는 방식
다르게 기술되지 않는다면, 본 발명의 실행에는 다른 지시가 없다면, 본 분야의 범위내에 있는 분자 생물학, 미생물학, 세포 생물학, 유기화학, 의화학 그리고 재조합 DNA에 관한 종래의 기술을 사용할 것이다. 예를들면, Sambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2ndedition (1989); CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, F. M. Ausubel et al. eds., (1987); METHODS IN ENZYMOLOGY 시리즈, Academic Press, Inc.; PCR 2: A PRACTICAL APPROACH, M. J. MacPherson et al., eds. (1995); Spector, D. L. et al. (1998) CELLS: A LABORATORY MANUAL, Vols I 내지 III, Cold Spring Harbor Press; 및 ANIMAL CELL CULTURE, R. I. Freshney, ed. (1987) 참조.
명세서와 청구범위에서 사용된, 단수형 "a", "an" 그리고 "the"는 문맥에서 다르게 나타내지 않는다면 다수의 의미를 가진다. 예를들면, "a cell"이라는 용어는 그것의 혼합물을 포함하는 다수의 세포를 포함한다.
본원에서 사용된, "포함하는"이라는 용어는 그 조성물과 방법이 다른 것들을배제하지 않고, 언급된 요소를 포함한다는 것을 의미한다. 조성물 및 방법을 정의하고자 사용된 경우에 " 로 필수적으로 구성하는"이라는 용어는, 조합에 있어 필수적으로 중요성을 갖는 다른 성분들을 배제하는 것을 의미할 것이다. 그러므로, 본원에서 정의된 필수적으로 요소를 구성하는 조성물은 포스페이트 완충 식염수, 보존제 등과 같은 분리 및 정제방법 및 제제약학적으로 허용가능한 담체로 부터의 미량 오염물질을 배제할 것이다. "로 구성된"는 다른 성분의 미량 원소 및 본 발명의 조성물을 투여하는 실질적인 방법 단계 이상을 배제하는 것을 의미할 것이다. 각각의 이러한 전환 과정으로 한정된 구체예는 본 발명의 범위내이다.
"과발현"은 정상 수준 또는 정상의 또는 비-병적 세포로 부터 측정되는 수준을 넘는 적어도 2배, 바람직하게는 3배, 더욱 바람직하게는 4배, 가장 바람직하게는 5배 또는 그 이상의 발현을 의미할 것이다.
"조성물"은 활성제와 불활성(예를들면, 검출가능한 약물 또는 표지) 또는 애듀번트와 같은 활성인 활성제 및 다른 화합물 또는 조성물의 조합을 포함하도록 의도된다.
"제제약학적인 조성물"은 활성제와 시험관내, 생체내 또는 생체외에서 진단적 또는 치료적 사용에 적합한 조성물을 만드는 불활성 또는 활성인 담체의 조합을 포함하도록 의도된다.
본원에서 사용될 때, "제제약학적으로 허용가능한 담체"는 포스페이트 완충 식염수 용액, 물, 및 오일/물 또는 물/오일 에멀젼과 같은 에멀젼, 및 다양한 형태의 습윤제와 같은 어떤 표준의 제제약학적 담체를 포함한다. 조성물은 또한 안정제 및 보존제를 포함할 수 있다. 담체, 안정제 및 애쥬번트의 예는 Martin REMINGTON'S PHARM SCI., 15th Ed. (Mack Publ. Co., Easton (1975))참조.
"유효량"은 이롭거나 바람직한 결과에 영향을 주기에 충분한 양이다. 유효량은 하나 이상의 투여, 사용 또는 투여량으로 투여될 수 있다.
"표적 세포" 또는 "병적 세포"는 역분화된, 불멸화된, 형성성, 악성, 전이된 또는 전환된 초증식성 세포를 포함한다. 예로는 육종 세포, 백혈병 세포, 암종 세포 또는 선암종세포를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 특이성 암은 유방암 세포, 간암(hepatoma) 세포, 간암(liver cancer) 세포, 췌장암종 세포, 식도암종 세포, 방광암 세포, 위장암 세포, 전립선암 세포 그리고 위암 세포를 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
표적세포 또는 병적 세포는 종양 억제 유전자 생성 기능의 상실, 약물 내성 또는 유전적 불안전성에 관련된 내인성 효소를 과발현한다. 또는 달리, 한 약물에 대한 내성은 다른 생물학적으로 별개인 약물에 대한 내성을 줄 수 있다. 좀더 효능있는 내인성의 세포내 효소의 억제제를 만드는 종래의 기술과는 달리, 본 발명은 정상의 세포와 조직에 대한 치료요법-내성 발병 세포와 조직과 관련된 높은 효소 활성을 개발하며, 효소를 억제하는 것에 의존하지 않는다. 본원에서 "표적 효소"라는 용어는 상기의 특성을 하나 또는 그 이상 갖는 효소를 정의하기 위해 사용된다.
활성화된 또는 과발현된 그리고 약물 내성과 연관된 유전자 생성물은 티미딜레이트 신타아제(TS)(Lonn, U. et al. (1996); Kobayashi, H. et al. (1995); 그리고 Jackman, A. L. et al. (1995b)), 디히드로폴레이트 환원효소 (Banerjee, D. et al. (1995) 그리고 Bertino, J. R. et al. (1996)), 티로신키나아제 (TNF-a, Hudziak, R. M. et al. (1988)) 그리고 멀티드러그 내성 (Stuhlinger, M. et al. (1994)); Akdas, A. et al. (1996); 그리고 (Tannock, I. F. (1996)); 과 ATP-의존 멀티드러그 내성 관련 단백질(Simon, S. M. 및 Schindler, M. (1994))을 포함하며, 몇몇 질병에서는 결장과 전립선암, 토포아이소머라아제 I (Husain et al. (1994))을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
디히드로폴레이트 환원효소(DHFR)의 증폭은 메토트렉세이트에 대한 내성과 관련되고, 티미딜레이트 신타아제를 코드화하는 유전자의 증폭은 5-플루오로피리미딘을 사용한 종양 치료에 대한 내성과 관련된다. 약물 내성에 관련된 유전자의 증폭은 Kashini-Sabet, et al. (1988), 미국 특허 번호 5,085,983 또는 본원에 기술된 방법에 설명된 바와 같은 변형 중합효소 사슬 반응(PCR)에 의해 검출 및 모니터될 수 있다. 후천성 약물 내성은 세포 유전학적 비정상성, 예컨데 상동 염색체 염색 영역 및 이중 미소 염색체의 검출에 의해 모니터될 수 있으며, 2개 모두 유전자 증폭에 관련된다. 다른 분석법은 직접적 또는 간접적 효소 활성 분석법을 포함하며, 2개 모두 유전자 증폭(예를들어, Carreras 및 Santi (1995)) 및 다른 방법론(예를들어, 중합효소 사슬 반응, Houze, T. A. et al. (1997) 또는 면역조직화학(Johnson, P. G. et al. (1997)에 관련된다.
글루타티온-S-전달효소가 인간 종양에서 때때로 사용되어왔지만(Morgan, A. S. et al. (1998)), 그럼에도 중복특이성으로 효소를 코드화하는 유전자 부류의 일종이므로 본원의 "표적 효소"로 부터 배제된다.
요컨데, 본 발명의 프로드러그는 본발명의 표적 효소가 정상 세포에 비해 병적 세포에서 통상 과발현되고, 과축적되거나 활성화된다는 것에 기초하여 종래의 치료요법과는 구별가능하다. 본 발명이 다른 접근법들로 부터 구별되는 가장 중요한 원리는 다음과 같다:
(1) 본 발명은 티미딜레이트 신타아제와 같은 효소를 위한 기질의 합성을 기술한다. 과발현된 효소는 우선적으로 발병 세포에서 프로드러그를 독소로 전환시킬 것이다. 종래의 접근방법들은 이들 효소의 억제제에 주로 의존하여 왔다. 억제제들은 효소의 확대된 발현과 그후 치료에 대한 내성으로 이끈다. (예를들면, Lonn, U. et al. (1996); Paradis, A. et al. (2000); 및 Edler, D. (2000)참조).
(2)본 접근법은 또한 다른 "기질 프로드러그" 접근법, 예를들면 글루타티온-S-전이효소와도 구별된다(예를들면, Morgan, A. S. et al. (1998)참조). GST 부류의 효소들은 세포에 대한 독성 발작에 반응하여 증가된 수준으로 발현된다. 효소의 GST 부류는 중복 기질 특이성을 갖는데, 그것이 암세포에서 상승된 발현을 갖는 단일종 효소와만 반응성을 갖는 기질을 디자인하기 어렵게 만든다(Morgan, A. S. et al. (1998)). 본 발명의 표적 효소(예를들면, 티미딜레이트 신타아제, 디히드로폴레이트 환원효소와 티미딘 키나아제)는 그 구조와 기질 특이성에 있어 유일하므로, 유일한 기질을 디자인하기가 수월하다. 티미딜레이트 신타아제를 위한 기질의 몇가지 예가 아래에 제공된다.
(3)몇가지 경우에서, 표적 효소(예를들며, 티미딜레이트 신타아제)를 코드화하는 유전자 변이를 겪어 억제제에 대한 내성을 줄 수 있을 것이다(Barbour, K. W. et al. (1992) 그리고 Dicken, A. P. et al. (1993)). 그러나 여전히 비-억제제 기질 프로드러그와의 반응을 수행할 수 있을 것이다.
(4)이 접근법의 장점은 종양 억제 작용의 상실이 악성종양의 발달에 결정적이라는 것이다. 대다수의 종양 세포는 p53, RB 또는 pl6 종양 억제 작용중의 하나를 잃는다(Funk, J. O. (1999); Banerjee, D. (1998); 및 Teh, B. T. et al. (1999)). 그러한 상실은 이전의 화학요법에의 노출에 관계없이 내성 효소(예를들면, 티미딜레이트 신타아제)의 증가된 발현으로 이른다. 본원에 기술된 프로드러그는 악성종양의 초기 단계의 치료는 물론 이전에 화학요법으로 치료된 질병에도 유용할 것이다. GST와 같은 효소를 위한 기질은 화학요법에 무관한 많은 화합물을 포함한다(Whalen 및 Boyer (1998)).
위에서 기술된 개념은 도 1A 와 1B에 티미딜레이트 신타아제와 화합물 NB1011TM의 예를 사용하여 도식적으로 보여준다.
다른 구체예에서, 표적 세포는 암에 무관한 약물이나 화합물에 대한 그것의 내성으로 정의된다. 이 경우, 세포는 항생제 예를들면 베타-락타마아제에 내성을 주는 미생물로 감염된다. 유기체는 박테리아, 이스트 그리고 트리파노소마와 같은 기생충을 포함한다. 표 2는 감염성 질병에서 이러한 접근법에 의해 표적되는 효소를 나열한다.
본 발명의 프로드러그는 다음의 구조를 갖는 화합물의 L과 D이성질체로 구성되는 군으로 부터 선택된다:
여기에서:
R1은 다음의 화학식의 부분이다:
화학물I일 경우, n이 0일 수 있다.
R2는 불포화 히드로카르빌기;하나 또는 그 이상의 불포화 히드로카르빌기를 포함하는 방향족 히드로 카르빌기;그리고, 하나 또는 그 이상의 불포화 히드로카르빌기를 포함하는 헤테로방향족기로 구성되는 군으로 부터 선택되는 2가 전자 콘딧 부분이다;
R3은 다음으로 구성되는 군으로 부터 선택된다:
R5는 같거나 다를 수 있으며, 독립적으로 직쇄 또는 분지쇄의 탄소수 1 내지 10의 알킬, 또는 탄소수 3 내지 10의 시클로알킬기, 또는 할로겐(예를들면, F, Cl, Br, I); 또는 다음의 기:
또는 다음의 기이다:
여기에서 n은 0 또는 1 내지 10의 정수이며, m은 0 또는 1이다;
여기에서 R4는 다음으로 구성되는 군으로 부터 선택되는 치환체일 수 있다:
여기에서 R8과 R9는 저급 알킬이며, Rl0은 H 또는 CH3이며, 각각의 X 치환체는 독립적으로 같거나 다르며, -Cl, -Br, -I 또는 다른 효능있는 이탈기이며, R7이 -H이며, m 이 0일때, R4는 할로겐이 아니며, 또는 m이 0이고 n이 0일때, R4는 할로겐이 아니다;
여기에서 각각의 Y치환체는 독립적으로 같거나 다르며, 독립적으로 -H 또는 -F이며, 각각의 Z 치환체는 독립적으로 같거나 다르며 -O- 또는 -S-이다.
한가지 양태에서, m은 0이며 R2는 다음으로 구성되는 군으로 부터 선택되는 방향족 히드로카르빌기이다:
다른 양태에서, m은 0이며 R2는 다음으로 구성되는 군으로 부터 선택되는 헤테로방향족기이다:
여기에서 J는 -O-, -S-, -Se-, -NH-, 그리고 NRALK- 으로 구성되는 군으로 부터 선택되며, 여기에서 RALK는 직쇄 또는 분지쇄의 탄소수 1 내지 10의 알킬 또는 탄소수 3 내지 10의 시클로알킬기이다.
한가지 구체적인 양태에서, R4는 다음으로 구성되는 군으로 부터 선택된다:
Q는 당, 카르보시클릭, 아실 화합물 및 차폐된 포스페이트 또는 그들의 포스포아미데이트 유도체로 구성되는 군으로 부터 선택된다. 차폐된 포스페이트 또는 포스포아미데이트 유도체는 아래에 더욱 구체적으로 보이는 화합물의 5' 위치에서 Q 에 부착된다. 예를들면 Q는 다음으로 구성되는 군으로 부터 선택되는 부분이다:
여기에서 각각의 R6는 독립적으로 같거나 다르며, -H ,-OH, -OC(=O)CH3, F, 그리고 다른 보호 히드록실기로 부터 선택된다; 그리고,
R7은 5' 위치에서 Q에 부착된 H, 포스페이트기, 포스포디에스테르기 또는 포스포라미데이트기이다.
비록 명확하게 언급하지 않았더라도 본 발명의 프로드러그는 D-형태, L-형태, a-아노머 형태, 그리고 p-아노머 형태를 포함하는 거울상이성질체, 부분입체이성질체 또는 입체이성질체 형태내에 있을 수 있다는 것을 이해해야한다.
한 구체예에서, R4는 -Br, -I, -O-알킬, -O-아릴, -S-알킬, -S-아릴, -S-헤테로아릴, -CN, -OCN, -SCN, -NH2, -NH-알킬, -N(알킬)2, -NHCHO, -NHOH, -NHO-알킬, NH2CONHO-, NHNH2, -N3그리고 다음과 같은 시스-플라틴 유도체로 구성되는 군으로 부터 선택되는 화학적 구성요소이거나 함유한다:
한 구체예에서, Q는
이며, 여기에서 R7은 위에서 기술된 것과 같고, 또는 더욱 구체적으로는, 다음과 같은 구조:
이거나 다음의 구조를 갖는 화합물이다:
여기에서 Rd는 방향족 치환체이다.
다른 구체예에서, R7은 예를들면 20개의 자연 발생 아미노산을 포함하는 아미노산으로 부터 유도되는 포스포라미데이트기이다. 한 구체예에서, R7은 알라닌으로 부터 유도되는 포스포라미데이트기이다. 한 구체예에서, R7은 다음의 구조를 갖는 기이거나 함유한다:
위의 기와 그 제조 방법이 McGuigan, et al. (1993) 그리고 McGuigan, et al. (1996)에 기술되어 있다.
본 발명은 또한 다음 구조:
를 갖는 화합물의 L- 또는 D-이성질체 또는 그들의 호변이성질체를 제공한다.
여기에서, Rl은 다음
의 화학식을 갖는 치환체이다:
여기에서 R2와 R3는 같거나 다르며 독립적으로 불포화 또는 포화 히드로카르빌기이다; 여기에서 R4는 F, Cl, Br, I, CN, S03H, CO2H, C02CH2CH3, SI(CH3)`, CHO,NO2, CF3, CCl3, C(R5)2으로 구성되는 군으로부터 선택된다;여기에서 R5는 F, Cl, Br 그리고 I로 구성되는 군으로부터 선택된다; 여기에서 n은 0 또는 1 내지 10의 정수이며, m은 0 또는 1이다; 그리고 Q는 위에서 정의된 것과 같다.
한가지 양태에서, m은 0이며, R2는 다음:
으로 구성되는 군으로 부터 선택된다.
여기에서 R5는 독립적으로 같거나 다르며, 직쇄 또는 분지쇄의 탄소수 1 내지 10의 알킬기, 탄소수 3 내지 10의 시클로알킬기, CN 그리고 할로겐으로 구성되는 군으로부터 선택된다.
또 다른 양태에서, R2와 R3는 함께 알케닐 또는 알키닐이며, 다음:
으로 구성되는 군으로 부터 선택된다
또 다른 양태에서, m은 0이며, R2는 다음:
으로 구성되는 군으로부터 선택되는 방향족 히드로카르빌기이다:
또 다른 양태에서, m은 0이며, R2는 다음:
으로 구성되는 군으로 부터 선택되는 헤테로방향족기이다.
여기에서 J는 -O-, -S-, -Se-, -NH- 그리고 NRALK-로 구성되는 군으로 부터선택되며, 여기에서 RALK은 직쇄 또는 분지쇄의 탄소수 1 내지 10의 알킬 또는 탄소수 3 내지 10의 시클로알킬기이다.
이들 구체예에 대해서, R7은 위에서 기술된 것과 같다.
구체적인 구체예에서, R7은 다음:
과 같다.
위의 기와 그것의 제조 방법은 Abraham, et al. (1996)에 기술되어 있다.
한가지 구체예에서, R7은 포스페이트기이며, 또는 다음:
으로 구성되는 군으로 부터 선택되는 구조를 갖는 기이거나 함유한다.
위의 2개의 기중 첫번째 기와 그것의 제조 방법은 Freed, et al. (1989); Sastry, et al., (1992); Farquhar, et al. (1994), 그리고 Farquhar, et al.에 기술되어 있다. 위의 2개의 기중 두번째 기와 그것의 제조 방법은 Valette, et al.(1996); 및 Benzaria, et al. (1996)에 기술되어 있다.
한 구체예에서, R7은 다음:
으로 구성되는 군으로 부터 선택되는 구조를 갖는 기이거나 함유한다.
여기에서 R은 방향족 치환체이며, 위의 2개의 기중 첫번째 기와 그것의 제조방법은 Meier, et al. (1997). 에 기술되어 있다. 위의 2개의 기중 두번째 기와 그것의 제조 방법은Hostetler, et al. (1997); 그리고 Hostetler, et al., 공개된 국제 특허 출원 WO 96/40088 (1996)에 기술되어 있다.
한 구체예에서, R7은 Q내에 고리기를 형성한다. 한가지 그러한 구체예와 그것의 제조 방법이 아래에 보여진다(여기에서 DMTr은 4,4'-디메톡시트리틸, Boc는 t-부틸옥시카르보닐이며, DCC는 1,3-디시클로헥실카르보디이미드이며, 그리고 4-DMAP는 4-디메틸아미노피리딘이다):
한 구체예에서, 그 화합물은 염형태, 또는 보호 또는 프로드러그, 또는 그들의 조합일 수 있다. 예를들면, 염으로는 에테르 또는 에스테르.
별도의 구체예에서, 위의 구조는 하기 방법을 사용하여 포스포디아지리딘기 대신 티오포스포디아지리딘을 갖도록 더욱 변형된다.
위의 5-치환 피리미딘 유도체의 합성은 당업계에 자명한 방법으로 수행될 수 있다. 예를들면, Li2PdCl4의 존재하에서 할로알킬 화합물, 할로아세테이트 또는 할로알켄을 갖는 5-클로로머큐리-2'-데옥시우리딘의 처리는 유기팔라듐 중간체를 통해, 개별적으로 5-알킬, 5-아세틸 또는 5-알켄 유도체의 형성으로 이른다. Wataya, et al.(1979) 그리고 Bergstrom, et al. (1981). 피리딘 뉴클레오시드와 뉴클레오티드의 C5-변형의 또 다른 예는 Li2PdCl4의 존재하에서 머큐리 아세테이트로 비보호 뉴클레오티드를 처리한후 스티렌 또는 고리-치환 스티렌의 첨가에 의한 C5-트랜스-스티릴 유도체의 형성이다. Bigge, et al. (1980).
피리미딘 데옥시리보뉴클레오시드 트리포스페이트를 피리미딘 고리의 5번 위치에 있는 머큐리로 50℃에서 3시간동안 아세테이트 완충제내의 머큐리 아세테이트와 함께 처리하여 유도하였다. Dale, et al. (1973). 그러한 처리는 또한 모노포스페이트의 변형에 효과적이라 기대될 수 있다; 다르게는, 변형된 트리포스페이트는 예를들면 알칼리성 포스페이트와 조절된 처리후 모노포스페이트의 정제에 의해 변형된 모노포스페이트로 효소적으로 전환될 수 있다. 수은과 유사한 분자적 특성을 갖지만 바람직한 제제약학적 특성을 갖는 유기 또는 비유기의 다른 부분들은 치환될 수 있다. 치환 피리미딘의 합성을 위한 일반적인 방법은 미국 특허 4,247,544; 4,267,171; 그리고 4,948,882; 그리고 Bergstrom, et al. (1981)참조. 위의 방법들은 리보오스나 2'-데옥시리보오스(예2'-3'-디데옥시로보오스, 아라비노스, 푸라노스, 릭소스, 펜토스, 헥소스, 헵토스 그리고 피라노스)보다는 당을 함유하는 5-치환 피리미딘 뉴클레오시드와 뉴클레오티드의 유도체의 합성에 적용가능할 것이다. 5-위치 치환체의 예는 할로비닐기이다. 예: E-5- (2-브로모비닐)-2'-데옥시우리딜레이트. Barr, P. J. et al. (1983).
다르게는, 5-브로모데옥시우리딘, 5-요오도데옥시우리딘, 그리고 그들의 모노포스페이트 유도체들이 Glen Research, Sterling,VA (USA), Sigma-Aldrich Corporation, St. Louis, MO (USA), Moravek Biochemicals, Inc., Brea, CA (USA), ICN, Costa Mesa, CA (USA) 그리고 New Engl및 Nuclear, Boston, MA (USA).로 부터 상업적으로 사용가능하다. 상업적으로 사용가능한 5-브로모데옥시우리딘과 5-요오도데옥시우리딘은 Glen Research, Sterling, VA (USA) 그리고 ICN, Costa Mesa, CA(USA)로 부터 상업적으로 사용가능한 시약을 사용하여 키나아제 효소의 활성을 통해 화학적 또는 효소적으로 모노포스페이트로 전환될 수 있다. 이러한 할로겐 유도체들은 신규하고 더욱 효능있는 항대사물질을 만들기 위해 다른 치환체들과 결합될 수 있다.
우라실의 5번 위치에서의 구조는 제안된 이탈기(톡소포어)를 헤테로고리에 연결하기 때문에 테더로 언급된다. 인간 효소, 예를들면, TS, 의 활성 부위에서의 Cys 잔기와의 반응에 의한 헤테로고리의 활성으로, 음전하가 우라실의 6번 위치로 부터 테더로 도입된다. 이 메카니즘은 Barr, P. J. et al. (1983)에 의해 (E)-5-(브로모비닐)-2'-데옥시우리딘 (BVdU), Wataya, et al. (1979), Santi (1980); 그리고 Bergstrom, et al. (1984)에 의해 (E)-5- (3,3,3-트리플루오로-l-프로페닐)-2'-데옥시우리딘 (TFPe-dUrd)의 5'-모노포스포릴화된 버젼으로 기술되었다.
독소와 dNMP사이의 테더 " 스페이서"는 TS-Cys-술프히드릴 공격에 의해 제공된 독소-불안정화 음전하를 유도할수 있도록 불포화되어야 한다. 이목적을 위해 사용가능한 많은 불포화 유기 작용기들중에, 비닐, 알릴, 그리고 프로파르길 단위는 단순하며, 작고, 쉽게 합성가능하다. 비닐과 알릴 단위는 두개의 비-상호전환가능한 기하학적 이성질체 형태에서 제조될수 있다는 장점을 갖는다. 그러므로, 효소 활성 부위에 의한 프로드러그 적응의 "탐침"으로 사용될 수 있다. 반면, 프로파르길 단위는 원통형으로 대칭인 장점이 있으므로, 이러한 타입의 테더로 부터의 효소-촉매화된 독소방출은 비닐과 알릴 분자의 경우와 같은, dUMP의 우라실 고리에 대한 배향에 의존하지 않는다.
본 발명의 뉴클레오티드기재 프로드러그를 디자인하는데에 두개의 다른 접근법이 적용되어 왔다. 하나는 BVdU 모노포스페이트의 구조와 dUMP의 C5에서의 (폴리)비닐 치환체의 말단에 이탈기/독소가 직접 부착된 특색에 기초한다. 이것이 비닐 테더 접근방법이다. 다른것은 TFPe-dUMP의 구조에 기초하며, 첫 번째 것에 유사하지만 이탈기/독소와 불포화 단위를 분리시키는 메틸렌단위를 가지며, 따라서 알릴이나 프로파르길 단위를 함유한다. 이것이 알릴 테더 접근법이다.
알릴 테더 접근법의 프로파르길 버젼의 활성 메카니즘은 5-에티닐-2'-데옥시우리딘 5'-모노포스페이트(EdUMP)와 5-(3-히드록시-l-프로피닐)-2' 데옥시우리딘 5'-모노포스페이트(HOPdUMP)의 TS와의 상호작용에서 선행한다(Barr, et al. (1981); Barr 및 Robins 1983). EdUMP는 TS (Ki = 0.1 TM)의 효능있는 억제제이고, 아마도 활성 부위에서 알렌-기재 종을 형성한다. HOPdUMP (Ki = 3.0 TM)는 통상적이지 않은 억제 운동을 보여주는데, 그것은 활성 부위에서 큐물렌-기재 종을 형성하기 때문일 것이다.
비닐과 알릴 테더 접근법 메카니즘에 공통인 중간체와 구조에 있어서 유사한 5-알킬리덴화된 5,6-디히드로우라실이 최근에 합성되었다(Anglada et al. 1996). 이것들은 매우 전자친화성을 보였다. 그것들이 에탄올과 쉽게 반응하여 5-(에톡시메틸)우라실을 발생시키는 것이 촉매적으로 유능한 TS를 발생시키는 물첨가에 선행한다. 더욱더 최근에는, TS에 의해 생성된 장기간 잡히지 않는 C5 메틸렌 중간체의 존재를 트래핑 연구로 증명하였다(Barrett, et al. (1998)).
구체적인 구체예는 아래의 L 또는 D구조를 갖는 화합물을 포함한다. 구조와수치적인 칭호로 화합물들을 확인한다.
바람직한 구체예가 아래에 보여진다:
다음 구조:
를 갖는 화합물 또는 그들의 뉴클레오시드 유사체.
여기에서, Xd와 Xe는 독립적으로 같거나 다르며, Cl, Br, I 그리고 CN으로 구성되는 군으로 부터 선택된다. 좀더 바람직한 양태에서, Xd는 Cl 또는 Br이며, Xe는 H이다.
다음 구조:
를 갖는 화합물 또는 그들의 뉴클레오시드 유사체.
여기에서, Xf와 Xg는 독립적으로 같거나 다르며, Cl, Br, I 그리고 CN으로 구성되는 군으로 부터 선택된다. 바람직한 구체예에서, Xf와 Xg는 같으며 각각 Cl 또는 Br이다.
다음 구조:
를 갖는 화합물 또는 그들의 뉴클레오시드 유사체.
여기에서, X는 Cl, Br, I 그리고 CN으로 구성되는 군으로 부터 선택된다; 좀더 바람직한 구체예에서 X는 Cl 또는 Br이며 좀더 바람직한 구체예에서, X는 Br이다.
다음 구조:
를 갖는 화합물 또는 그들의 뉴클레오시드 유사체.
여기에서, R8은 저급 직쇄 또는 분지쇄 알킬이다.
다음 구조:
를 갖는 화합물 또는 그들의 뉴클레오시드 유사체.
여기에서, R8과 R9은 저급 직쇄 또는 분지쇄 알킬이며, R10은 H 또는 CH3이다.
다음 구조:
를 갖는 화합물 또는 그들의 뉴클레오시드 유사체.
여기에서, R10은 H 또는 CH3이다.
다음 구조를 갖는 화합물:
다음 구조를 갖는 화합물:
또는 그들의 뉴클레오사이드 유사체.
본원에서 기술된 화합물, 여기에서 그 화합물은 다음의 구조를 갖는다:
한가지 양태에서, R7=H이다. 또 다른 양태에서, R7은 다음 구조를 갖는 치환체이다:
본원에서 기술된 화합물, 여기에서 그 화합물은 다음의 구조를 갖는다:
여기에서, R7=H이거나 R7은 다음 구조를 갖는 치환체이다:
다음 구조를 갖는 화합물:
다음 구조:
를 갖는 화합물 또는 그들의 뉴클레오시드 유사체.
여기에서, 각각의 X는 CO2Et, Cl 그리고 Br로 구성되는 군으로 부터 선택된다.
다음 구조:
를 갖는 화합물 또는 그들의 뉴클레오시드 유사체.
다음 구조:
를 갖는 화합물 또는 그들의 뉴클레오시드 유사체.
프로드러그는 시험관내와 생체내에서의 사용을 위해 제제약학적으로 허용가능한 담체와 같은 담체와 조합될 수 있다.
본 발명은 적어도 약간의 바람직한 특성을 갖는 신규 화합물의 최초 인식을 가능케 하는 빠르고 간단한 스크린 시험을 또한 제공한다(도 2A와 2B참조). 그 시험은 적어도 2개의 세포 타입을 필요로한다. 첫번째는 표적 효소가 발현되지 않거나 적은 수준으로 발현되는 대조세포이며(예, 정상세포), 두번째 세포 타입은 표적 효소가 검출가능한 수준, 예를들면 높은 수준으로 발현된 시험세포이다. 이 세포는 표적 효소의 높아진 수준에 대해 선택된 종양 세포계일 수 있다. 다르게는 표적 효소 또는 효소들(적당한 종의 표적 효소 함유)을 다르게 발현하기 위해 유전적으로 변형된 세포가 사용될 수 있다. 당업계에 널리 알려지고 Chen, L. 등(1996);Hudziak, R.M.등(1998); 또는 Carter,P.등(1992)에 기술된 과정과 아래의 실험 섹션을 사용하여, 표적 효소를 코드화하는 폴리뉴클레오티드를 갖는 숙주 세포의 감염은 일시적이거나 영구적이다. 세포는 원핵세포(E.coli와 같은 박테리아) 또는 진핵세포일 수 있다. 세포는 포유류 또는 비-포유류 세포일 수 있다. 예를들면, 마우스 세포, 래트 세포, 인간 세포, 균류(예, 이스트) 또는 병을 일으키는 기생 생물(예, Pneumocystis 또는 Leishmania).
cDNA의 삽입에 적당한 벡터는 Stratagene, La Jolla, CA 그리고 다른 판매처로 부터 상업적으로 사용가능하다. 발현 양은 세포내로 도입되는 발현 카세트의 복제 수에 의해 또는 프로모터 사용을 변화시킴에 의해 조절할 수 있다. 각각의 감염된 세포계에서 효소의 발현 수준은 면역-검출을 위해 효소에 대해 미리 배양된 단일클론항체나 다중클론항체를 효소에 사용하여, 세포여액에서 면역블로트법과 효소시험에 의해 감시될 수 있다.(Chen, L.등(1996)). 발현된 효소의 양을 검출하기 위한 효소적 시험은 또한 Carreras, C.W.그리고 Santi,D.V(1995)에 의해 개관된 것이나 아래의 실험 섹션에 기술된 방법 처럼 수행될 수 있다.
또 다른 양태에서, 한가지 종 이상의 효소를 별도의 숙주 세포를 별도로 형질도입하는데 사용할 수 있어서 표적 효소에서의 후보 약물의 효과가 다른 효소나 또 다른 종으로부터의 대응하는 효소에서의 그것의 효과와 동시에 비교될 수 있다.
또다른 구체예에서는, 본 발명의 프로드러그 화합물의 효과적인 양을 수용하기 때문에 세번째 표적 세포가 대조군으로서 사용된다. 이 구체예는 티미딜레이트 신타아제에 의해 활성화된 새로운 약제를 선별하는데 특히 유용하다. 게다가 또다른 관점에서는, 공지된 치료 요법 또는 약제과 공동으로 시험 치료상의 상조적 가능성을 시험하기 위해 최소한 하나의 추가적인 시험 세포 시스템이 구성된다.
본 발명의 목적을 위해서, 성공적인 후보 약제가 시험 세포 타입의 성장을 막거나 죽이겠지만, 대조군 세포 타입은 상하지 않은 채로 남겨둔다. 성장 분석는 Miller(1992); Sugarman, B. J. 외. (1985) 및 Spector, D. L. 외. (1998)에 의해 기술된 바와 같이 표준적인 방법에 의해 또는 하기의 실시예 부분에서 기술된 방법을 사용하여 수행될 수 있다.
항생 물질의 발견을 위해 스크리닝이 폭넓게 응용될 수 있다는 것이 당업자들에 의해 이해될 것이다. 예를 들어, 호모균으로부터의 티미딜레이트 신타아제는 인간의 그것 또는 효소의 E.coli 형태를 대신할 수 있다. 이는 병원체와 관련된 효모균을 표적으로 하는 특정한 항진균성 항생물질을 발견하게 할 것이다. 게다가, 다른 효소가 이러한 치료를 받을 수 있다. 예를 들어, Pneumocystis carnii와 같이, 특히 전염성 약제의 디히드로폴레이트 환원효소 활성을 표적으로 하는 프로드러그가 선택될 수도 있다. 이러한 약제는 표적 효소를 위한 특이성을 위해 선택될 것이고, 여기서 기술된 스크리닝 분석를 사용함으로써 자연 숙주의 효소를 활성화하지 않게 나타날 수 있다. 오직 정상 인간 효소만 존재할 때 독성의 부족을 나타내기 위하여, 대조군 세포 구성은 대응하는 정상 인간 효소를 함유할 것이다.
도 2A 와 2B는 한가지가 어떻게 본 발명의 이러한 관점의 최소한 한가지 구체예를 이끄는지를 보여준다. 이질적 유전자, 예를 들면, 인간 유전자 코드화 TS, 는 인간 TS가 발현되도록 숙주 세포에 삽입된다. "대조군 세포"는 표적 효소를 발현하지 않는다. 일부 구체예에서는 표적 효소의 단백질 생성물로 배양 배지를 보충하는것이 필요할 것이다.
후보 프로드러그는 직접적으로 세포 배양 배지에 첨가될 수 있고, 만약 프로드러그가 검출가능한 라벨을 함유한다면, 표적 세포 또는 배양 배지는 그후 후보 프로드러그로부터 유리된 라벨의 양으로 분석된다. 대체예로서, Lasic, D. D. (1996) 에 기술된 방법을 사용하거나 Lewis, J. G. 외. (1996)에 기술된 바와 같이 시토펙틴과 결합하여 프로드러그를 리포솜안으로 패키징함으로써 세포 흡수가 강화될 수 있다.
종양 세포에서 TS 과도발현을 이용하는 프로드러그의 대체 구체예는 데옥시우리딘 포스포라미데이트, 또는 치료 방사성 핵종과 결합된 다른 변형들(여기서 인용된) 이다. 치료 방사성 핵종의 예는 레늄 188이다. Callahan, 외. (1989)에 의해 기술된 바와 같이 핵종은 본질적으로 합성될 수 있다. 대체예로서, 그것은 상업적으로 예를 들어, Mallicrodt Medical BV, The Netherl및s로부터 얻을 수 있다. 치료 방사성 핵종은 표준 방법에 의해, 예를 들어 Lin, W. Y. 외. (1997)에 의해 기술된 바와 같이, 데옥시우리딘 또는 데옥시우리딘 5'-포스포라미데이트 또는 다른 유도체와 결합될 수 있다. 데옥시우리딘 포스포라미데이트를 함유하는 방사성 핵종은 우선적으로 티미딜레이트 신타아제를 과도 발현하는 종양 세포의 DNA안으로 채워질 것이고 농축된 베타 및 감마 방사의 방출을 통해 그들의 죽음을 초래한다.대체 방사성 핵종에는 레늄-186 및 다른 것들을 포함한다.(Troutner, D. A. (1987))
그 화합물은 치료되는 세포를 함유하는 샘플에 프로드러그를 전달하고, 세포 죽음 또는 세포 증식의 억제를 분석함으로써, 실험 재료가 본 발명의 프로드러그에 의해 적절하게 치료될 것인지를 예측하는데 유용하다. 출원인은 본 발명의 최소한 한가지의 프로드러그와 사용을 위한 지침을 제공함으로써 병적 세포 또는 환자가 적절하게 이 치료 요법에 의해 치료될 것인지를 결정하기 위한 장치를 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명의 효과적인 양의 프로드러그를 세포에 전달함으로써, 시험관내 또는 생체내에 있는 병적 세포 또는 표적 세포의 증식을 억제하는 방법을 제공한다. 생체내에서 실행될때는, 본 발명의 효과적인 양의 프로드러그를 실험 재료에 전달함으로써, 이 방법이 실험 재료에서 표적 세포에 의해 특징지어진 병리를 치료하는데 유용하다.
표적 세포가 화학 치료 요법 약제에 저항성이 있을 때는, 세포가 내성을 기른 약제의 효과적인 양을 세포나 환자를 접촉하거나 투여함으로써 그 방법이 좀더 변형될 수 있다. 본 발명의 프로드러그가 이전의 치료 요법에 대한 내성을 역전시킬 수 있기 때문에, 본 발명의 프로드러그로 하는 성공적인 치료에 이어서, 기존 치료 요법의 투약이 다시 종양의 성장이나 전이를 억제할 수 있다. 이것이 발생하는 예는, 표적 세포가 화학 치료 요법에 의해 생체내에서 선택의 결과로서 확대되는 효소를 발현할 때 또는 표적 효소가 표적 세포에서 과도 발현되는 내인성의 세포내 효소일 때를 포함하지만, 이것으로 제한되지 않는다. 그러한 효소의 예는 이전의 화학 치료 요법의 결과로서 과도 발현되는 것으로 나타난 티미딜레이트 신타아제이고, 세포에 이전 약제 저항성 표현형을 준다.
본 발명의 프로드러그는 또한 다른 공지의 치료 요법과 결합되어, 이전 치료 요법이나 로드러그의 치료 효과 중의 하나 또는 양자 모두의 치료 효과를 강화하거나 공동 작용할 수 있다. 그러한 이전 치료 요법은 암 화학치료 요법, 방사선 치료 요법 및 수술을 포함하지만, 이것으로 제한되지는 않는다.
동물로 전달될때는, 프로드러그의 효능을 좀더 확인하는데 이 방법 또한 유용하다. 동물 모델의 예로서, 여기에서 정의된 대로, 나체 마우스 (Balb/c NCR nu/nu 암컷, Simonsen, Gilroy, CA) 의 그룹에 약 105내지 약 109의 이상증식 세포, 암세포 또는 표적 세포를 각각 피하 접종한다. 종양이 형성될때, 예를 들어, 복강내 또는 정맥내 경로에 의해 프로드러그가 투여된다. 종양 크기의 감소를 결정하는 종양 측정은 일주일에 두 번, 버니어 캘리퍼스를 사용하여 2차원적으로 행해진다. 다른 동물 모델 또한 적절하게 사용될 수도 있다. (Lovejoy 외. (1997); Clarke, R.(1996); 및 Pegram, M. D. 외. (1997)).
생체내에서의 투여는 한번 복용량에서, 치료 과정 전체에 걸쳐 연속적으로 또는 간헐적으로 영향받을 수 있다. 가장 효과적인 수단과 투약의 적량을 결정하는 방법은 당업자들에게 잘 알려져있고, 이는 치료 요법에 사용되는 조성, 치료 요법의 목적, 치료되는 표적 세포 및 치료되는 실험 재료에 따라 변할 것이다. 하나 또는 다수의 투여는 치료하는 의사에 의해 선택되는 복용량 수준 및 패턴으로 수행될수 있다. 적절한 복용량 제조 및 약제 투여 방법은 하기에서 발견될 수 있다.
프로드러그, 약제들의 배합, 또는 둘 중 어느 하나를 함유하는 조성물은 약학 조성물에서의 활성 성분과 같이,종래의 절차에 따라 투약을 함으로써 인간 및 다른 동물들의 치료를 위한 약물의 제조에 사용될 수 있다.
약학 조성물은 경구적으로, 비강내로, 비경구적으로 또는 흡입제 치료 요법으로 투여할 수 있고 정제,마름모꼴 정제,미립, 캡슐,환약, 앰플,좌약 또는 에어로졸 형태를 갖는다. 그들은 또한 수성 또는 비수성 희석액, 시럽, 과립 또는 분말로 활성 성분의 현탁액, 용액 및 에멀젼 형태를 갖는다. 본 발명의 화합물에 더하여, 약학 조성물은 또한 다른 제약학적으로 활성인 화합물 또는 발명의 다수의 화합물을 함유할 수 있다.
보다 자세하게는, 여기에서 또한 활성 성분으로서 언급되는 본 발명의 처방법의 화합물은 경구, 직장, 비강, 국소성(피부에 적용, 에어로졸, 구강, 혀밑) 질, 비경구(피하,근육내,정맥내,피내) 및 폐를 포함하는 어떠한 적절한 경로를 통해 치료를 위해 투여된다. 또한 바람직한 경로는 환자의 상태 및 나이, 그리고 치료되는 질병에 따라 변할 것으로 이해된다.
일반적으로, 위에서 언급한 화합물 각각의 적절한 복용량은 하루에 환자의 kg 몸무게당 약 1 내지 약 100mg의 범위이고,바람직하게는 하루에 환자의 kg 몸무게당 약 1 내지 약 50mg의 범위에, 그리고 가장 바람직하게는 하루에 환자의 kg 몸무게당 약 1 내지 약 25mg의 범위에 있다. 달리 표시되지 않으면, 활성 성분의 모든 중량이 그들의 염 또는 에스테르에 대해서 본 발명의 처방법의 모 화합물로서계산되고, 중량이 균형잡혀 증가될 것이다. 원하는 복용량은 바람직하게 적절한 간격으로 하루동안 투여되는 2,3,4,5,6 또는 그 이상의 부(sub)-복용량으로 표시된다. 이러한 부-복용량은 예를 들어, 단위 복용량 형태당 약 1내지 100mg, 바람직하게는 약 1내지 약 25mg, 가장 바람직하게는 약 5 내지 25mg의 활성 성분을 함유하는 단위 복용량 형태로 투여될 것이다. 발명의 화합물 및 조성물의 적절한 복용량은 질병의 타입,가혹도,단계에 의존하고 환자에 따라 변할 수 있다는 것이 이해될 것이다. 최적의 투약은 일반적으로 본 발명의 치료의 어떠한 위험 또는 해로운 부작용에 대해 치료 이익의 수준을 균형잡는 것을 포함할 것이다.
이상적으로, 프로드러그는 질병의 사이트에서 활성 화합물의 최고점 농도를 달성하도록 투여되어야 한다. 이는 예를 들어, 프로드러그의 내정맥 주사에 의해, 선택적으로 소금물로, 또는 경구적으로 예를 들어, 활성 성분을 함유하는 정제,캡슐 또는 시럽으로 투여되어 달성될 것이다. 프로드러그의 바람직한 혈액 수준은 질병 조직내에 활성 성분의 치료 양을 제공하기 위해 연속적인 주입에 의해 유지될 것이다. 효과적인 배합의 사용은 각각 개개의 치료 화합물 또는 약제가 단독으로 사용될 때 필요한 것보다 더 낮은 각각의 성분 항바이러스 약제의 총 복용량을 필요로하는, 따라서 부작용을 줄이는 치료 배합을 제공하기위해 심사숙고된다.
프로드러그 성분이 단독으로 투여되는 것이 가능하지만, 위에서 정의된 것처럼, 그것에 대한 또는 그 이상의 제약학적으로 허용가능한 담체 및 선택적으로 다른 치료 약제과 함께, 최소한 한가지 활성 성분으로 구성되는 치료 조제물로서 제공되는 것이 바람직하다.
경구 투약에 적합한 본 발명의 조제물은 각각이 소정양의 활성 성분을 함유하는 캡슐, 교갑 또는 정제와 같은 분리된 단위로서; 분말 또는 과립으로서; 수성 또는 비수성 액체로 용액 또는 현탁액으로서; 또는 오일-인-워터 액체 에멀젼 또는 워터-인-오일 에멀젼으로서 나타낼 수 있다.
정제는 선택적으로 하나 또는 그 이상의 부수적인 성분과 함께 압축 또는 성형하여 제조한다. 압축된 정제는 적절한 기계에서 선택적으로 결합제(예를 들어, 포비돈,젤라틴,히드록시프로필메틸 셀룰로스), 윤활제, 불활성 희석제, 방부제, 붕괴제(예를 들어, 나트륨 분말 글리콜레이트, 가교결합된 포비돈, 가교결합된 나트륨 카르복시메틸 셀룰로스), 표면 활성제 또는 분산제와 함께, 분말 또는 과립과 같은 자유 유동 형태의 활성 성분을 압축함으로써 제조한다. 성형된 정제는 적절한 기계에서 불활성 액체 희석제로 젖은 분발 화합물의 혼합물을 성형함으로써 제조된다. 정제는 선택적으로 코팅되거나 새김눈을 낼 수 있고, 예를 들어, 원하는 방출의 프로파일을 제공하기 위해 변화하는 비율로 히드록시 프로필메틸 셀룰로스를 사용하여, 그 안에서 활성 성분의 낮은 방출 또는 제어된 방출을 하도록 제조될 수 있다. 정제는 위 외에 장의 부분에서 방출을 제공하도록 선택적으로 장 코팅이 제공될 수 있다.
입안에서의 국소성 투여에 적합한 조제물은 맛이 가미된 주약, 보통 자당 및 아카시아 또는 트래거캔스로 활성 성분을 함유하는 마름모꼴 정제(lozenge); 젤라틴 및 클리세린과 같은 불활성 주약으로 활성 성분을 함유하는 향기나는 알약(pastille); 적절한 액체 담체로 활성 성분을 함유하는 구강청정제를 포함한다.
본 발명에 따르는 국소성 투여용 약학 조성물은 연고, 크림, 현탁액,로션,분말,용액, 페이스트,겔, 스프레이, 에어로졸 또는 오일로서 제조될 것이다. 대체예로서, 조제물은 붕대 또는 활성 성분이 주입된 접착 고약 드레싱과 같은 패치 또는 드레싱을 포함한다.
눈 또는 다른 외부 조직, 예들 들어 입과 피부의 질병을 위해서, 조제물은 바람직하게 예를 들어, 약 0.075 내지 약 20% w/w, 바람직하게는 약 0.2 내지 약 25% w/w 그리고 가장 바람직하게는 약 0.5 내지 약 10% w/w의 양으로 활성 성분을 함유하는 국소성 연고 또는 크림으로 도포된다. 연고로 제조될 때, 프로드러그는 파라핀 또는 물과 혼합가능한 연고 베이스 중 어느 하나와 함께 사용될 수 있다. 대체예로서, 프로드러그 성분은 오일-인-워터 크림 베이스와 함께 크림으로 제조되기도 한다.
원한다면, 크림 베이스의 수성 상은 예를 들어, 최소한 약 30% w/w의 폴리히드릭 알코올, 즉, 프로필렌 글리콜, 부탄-1,3-디올, 마니톨, 소르비톨, 글리세롤 및 폴리에틸렌 글리콜 및 그들의 혼합물과 같은 히드록시기를 둘 또는 그 이상 갖는 알코올을 포함한다. 국소성 조제물은 바람직하게 피부 또는 다른 영향받는 지역을 통해 프로드러그 성분의 흡수 또는 침투를 높이는 화합물을 포함할 수도 있다. 그러한 피부 침투 강화제의 예는 디메틸술폭시드 및 관련된 유사물을 포함한다.
본 발명의 에멀젼의 유성 상은 공지된 방법으로 공지된 성분으로부터 구성된다. 이 상은 단지 에멀젼제 (그렇지않으면 공지된 배출기능촉진제(emulgent)) 하나만으로 구성되지만, 그것은 지방 또는 오일과, 또는 지방과 오일 모두와 최소한 하나의 에멀젼제와의 혼합물로 구성되는 것이 바람직하다. 바람직하게는, 친수성 에멀젼제가 안정제로서 작용하는 친유성 에멀젼제와 함께 포함된다. 또한 오일과 지방 모두를 포함하는 것도 바람직하다. 동시에, 안정제와 함께 또는 안정제 없이 에멀젼제는 소위 에멀젼화 왁스를 구성하고, 오일 및/또는 지방과 함께 왁스는 크림 조제물의 유성 분산 상을 형성하는 소위 에멀젼화 연고 베이스를 구성한다.
본 발명의 제조에 사용되기에 적합한 배출기능촉진제 및 에멀젼 안정제는 Tween 60, Span 80, 세토스테아릴 알코올, 미리스틸 알코올, 글리세릴 모노스테아레이트 및 나트륨 라우릴 술폰산염을 포함한다.
조제를 위한 적절한 오일 및 지방의 선택은 원하는 화장용 특성을 달성하는데 기반을 둔다. 제약학적 에멀젼 제조에 사용되기에 적당한 대부분 오일에서의 활성 화합물의 용해도은 매우 낮다. 따라서 크림은 바람직하게 튜브나 다른 용기로부터 새지 않도록 적당한 농도를 갖으며 기름기가 없고, 염색되지 않고, 세척가능한 제품이어야 한다. 디-이소아디페이트, 이소세틸 스테아레이트, 코코넛 지방산의 프로필렌 글리콜 디에스테르, 이소프로필 미리스테이트, 데실 올레에이트, 이소프로필 팔미테이트, 부틸 스테아레이트, 2-에틸헥실 팔미테이트와 같은 직쇄 또는 분지쇄, 모노 또는 2염기 알킬 에스테르 또는 Crodamol CAP로 알려진 분지쇄 에스테르와 같은 혼합이 사용될 수 있으며, 마지막 세개가 바람직한 에스테르이다. 이들은 요구되는 특성에 의존하여 단독으로 또는 조합하여 사용된다. 대체예로서는, 백색 연 파라핀 및/또는 액체 파라핀 또는 다른 미네랄 오일과 같은 고융점 액체가사용될 수 있다.
눈에 대한 국소성 투약에 적합한 조제물은 또한 적절한 담체, 특히 프로드러그 성분을 위한 수성 용매에 활성 성분이 용해 또는 현탁된 점안제를 포함한다. 프로드러그 성분은 바람직하게 약 0.5 내지 약 20%,유리하게는 약 0.5 내지 약 10%, 특히 약 1.5% w/w의 농도로 그러한 조제에 존재한다.
직장 투약을 위한 조제물은 예를 들어 코코아 버터 또는 살리실산염으로 구성되는 적절한 베이스와 함께 좌약으로 제공된다.
질 투약에 적합한 조제물은 프로드러그 성분에 더하여, 당업자들에게 적절하다고 공지된 담체 등을 함유하는 좌약, 탐폰, 크림, 겔, 페이스트, 포말 또는 스프레이 조제물로서 제공된다.
담체가 고체인, 비강 투약에 적절한 조제물은 예를 들어, 코로 들이쉬는 방식으로, 즉, 코 가까이 잡은 분말 용기로부터 비강을 통한 빠른 흡입에 의해 투여되는 약 20 내지 약 500 마이크론의 범위의 입자크기를 갖는 조립 분말을 포함한다. 예를 들면, 비강 스프레이, 점비제, 또는 연무기에 의한 에어로졸 투약에 의한 이러한 투약을 위해 담체가 액체인 적절한 조제물은 프로드러그 성분의 수성 또는 유성 용액을 포함한다.
비경구 투여에 적합한 조제물은 항산화제, 완충제, 세균 발육 저지제 및 계획된 수용자의 혈액에 등장성 조제물을 주는 용질을 함유하는 수성 또는 비수성 등장성 무균 주사 용액; 부유제 및 농화제를 함유하는 수성 및 비수성 무균 현탁액; 그리고 혈액 성분 또는 하나 또는 그이상의 기관에 화합물을 표적하도록 설계된 리포솜 또는 다른 마이크로미립자 시스템을 포함한다. 조제물은 예를 들어 앰플 및 유리병 같은, 단위-복용량 또는 멀티-복용량 밀폐된 용기로 제공되고, 사용하기 전에 즉시, 예를 들어 주사용 용액과 같은 무균 액체 담체의 첨가만을 필요로하는 냉동 건조된 상태로 저장된다.즉시 주사 용액 및 현탁액은 이전에 설명한 종류의 무균 분말,과립 및 정제로부터 제조된다.
특별히 위에서 언급한 성분에 더하여, 본 발명의 조제물은 문제가 되는 조제물의 타입을 고려하여, 당업계에서 종래의 다른 약제를 포함할 수도 있다는 것, 예를 들어 경구 투약에 적합한 것들은 감미제, 농축제(비후제) 및 향미료와 같은 다른 약제를 포함할 수 있다는 것이 이해되어야 한다.
본 발명의 처방법의 프로드러그 및 조성물은 또한 당업계의 종래의 방법에 의해 제조되는 수의학 조제물의 형태로 사용되기 위해서도 제공된다.
하기의 예는 예증을 위한 것이지만, 발명을 제한하지는 않는다.
재료 및 방법
뉴클레오시드 ECTA 화합물의 합성
위에서 명기된 5-치환된 피리미딘 뉴클레오시드의 합성은 당업계에서 잘 알려져있으며 간단히 위에서 설명된 방법에 의해 수행될 수 있다.
한가지 구체예에서는, 본 발명은 4가지 부류의 화합물을 포함한다.
각각의 부류는 우리실 염기, 또는 변형된 우리실 염기 존재의 구조에 의해 정의된다.
이들 부류는: (1)염기가 우라실의 푸라노-피리미디논 유도체 (2)염기가 6-플루오로우라실; (3)염기가 4-히드라존 치환된 우라실의 유도체;(4)염기가 우라실인 ECTA 화합물이다. 우라실 또는 변형된 우라실 유도된 염기는 화합물 5 위치에서 중독성 이탈기로 치환되고, 이 5 위치에서 전자 콘딧 테더(tether)가 부착되고, 전자 콘딧과 중독성 이탈기 사이에 적절한 스페이서 부분을 포함하는 화합물을 합성하는데 사용된다. ECTA 화합물은 하기에 기술된 바와 같이, 비인산화된 5' 모노포스페이트, 5' 포스포디에스테르 또는 5' 보호된("차폐된") 데옥시우리딘 또는 다른 카르보히드레이트 부분의 유사한 유도체가 될 수 있다. 보호된 5-치환된 데옥시우리딘 모노포스페이트 유도체는 그 안에서 포스페이트 부분이 적절한 화학적 보호기의 부착을 통해 폐색된 것이다. 5-치환된 데옥시우리딘 모노포스페이트 유도체는 용해도를 개선하고, 세포 침투력을 촉진하고, 혈액-뇌 장벽을 통한 통과를 용이하게 하고, 포스페이트 기의 손실을 초래할 수 있는 세포 또는 세포외 포스페타아즈의 활동을 막을 수 있다. 또다른 구체예에서는, 5-치환된 우라실 또는 우리딘 유도체는 그안에서 5-치환된 우라실/우리딘 유도체가 5-치환된 우리딘 모노포스페이트 유도체로 전환되는 뉴클레오시드 키나제 활성을 함유하는 세포로 투여된다. 우리딘 유도체는 또한 그들의 용해도, 세포 침투력, 및/또는 혈액-뇌 장벽을 통과하는 능력을 증가하도록 변형된다.
5-치환된 우리딘 모노포스페이트 유도체에 대한 티미딜레이트 신타아제의 작용은 5-위치("이탈기")에 부착된 치환분을 유리할 수 있다. 유리된 치환분은 그 후 고유의 또는 다른 세포 성분과의 다음 반응 중의 어느 하나, 독소 또는 세포 증식의 반응 억제제로서 작용할 수 있다.
프로파르길 테더과 ECTA 화합물의 합성
프로파르길 및 알릴 알코올-장착된 2'-데옥시우리딘의 합성은 곧바로 진행한다. 이들의 여럿 그리고 그들의 가까운 유도체는 문헌에 보고되고, 일부는 TS와 관련하여 연구되었다. 예를 들어, 5-(3-메톡시-1-프로피닐) 및 5-(3-히드록시-1-프로피닐)을 포함하는 5-알키닐-dUMPs 그것은 TS 반응 억제제로서 검토되었고 (Barr, 및 Robins (1981)) 이들중 일부는 TS -결핍 암 세포의 DNA안으로 포함된다는 것이 나타났다(Balzarini, J. 외. (1985)).
5 -머튜리-(Ruth, J. L. 외. (1978)) 및 5 -요오도우리딘(Robins, M. J. etal. (1981)) 모두는 팔라듐 촉매의 존재하에서 빠르게 알켄 및 알킨과 응축한다. 후자의 경로가 보다 자주 사용된다(Robins, M. J. 외. (1982)), Asakura, J. 외. (1988) 및 (1990)). 보호된 5-요오도-2'-데옥시우리딘과 t-부티이디메틸실일 프로파르길 에테르(Graham, 외. (1998); De Clercq, 외. (1983), 메틸 프로파르길 에테르(Tolstikov, 외. (1997)) 및 프로파르길 알코올 자체(Chaudhuri, 외. (1995) 및 Goodwin, 외. (1993))와의 높은 수득율 응축이 달성되었다. 후자의 반응에 의해 사용된 3-히드록시-1-프로파닐 치환분은 또한 BVdU의 합성에 사용된 동일한 Heck 반응으로부터 생긴 그 자체인, 메타크릴레이트 기 (Cho, Y. M. 외. (1994))의 DIBAL-H 환원에 의해 접근될 수 있다. 이들 팔라듐-촉매 반응은 또한 매우 변하기 쉬워서 그들은 오랫동안 응축할 수 있고 프로파르길-기재 테더를 5-요오도-2'-데옥시우리딘으로 정교하게 기능화할 수 있다 (Livak, 외. (1992) 및 Hobbs (1989)). (E)알릴-기재 테더는 (E)-트리부틸스테닐레이트된 에틸렌(Crisp, (1989))의 Heck연결에 의해 가장 잘 제조되는 반면, (Z)-알릴-기재 테더는 Undiar 촉매(Robins, M. J. 외. (1983)) 위에 프로파르길 선구물질의 부분적인 수소 첨가에 의해 생성된다.
엄밀히 문헌 절차를 따라, 부틸디메틸실일 프로파르길 에테르-장착된 3', 5'-디-O-보호된 2'-데옥시우리딘(Graham, 외. (1998), 및 DeClercq, 외. (1983)) 은 제조되고, 대응하는 (Z)알릴 에테르(Robins 및 Barr (1983))로 전환된 그것의 일부는 환원된다. TBAF-중개에 의한 TBDMS 의 제거는 산소음이온을 생성하고 그 상태로 기능화될 수 있다. 이들 TBDMS-보호된 프로파르길- 및 (Z)-알리틱-테더된 뉴클레오시드는 독성단-장착된 표적의 일부에 편리한 선구물질로서 작용할 것이다. (E)-알릴 알코올 장착된 뉴클레오시드에 대해서, 공지된 O-테트라히드로피라닐 에테르 유도체는 (E)-트리부틸스테닐레이티드 에틸렌(Crisp (1989))의 문헌 Heck 연결에 의해 제조된다.
두 단계 문헌 프로토콜 (Phelps 외. (1980) 및 Hsiao 및 Bardos (1981))을 사용하여, 프로파르길 및 (E) 및 (Z)-알릴 알코올이 그들의 대응하는 비스-아지리디닐 포스포라미데이트 또는 티오포스포라미데이트로 전환되어, 5'-모노뉴클레오티드 버전의 TS 프로세스가 세포 증식 억제제 TEPA 또는 ThioTEPA 의 활성 대사물을유리시킬 것이다.
프라노-피리미디논의 합성
프라노-피리미디논의 합성은 C5 프로파르길-알콜-장착된 2'-데옥시우리딘의 합성으로 시작된다. 프라노-피리미디논 화합물은 그후 위에서 설명된 O-테트라히드로피라닐 에테르 유도체로부터 형성된다. 합성은 프로파르길 결합의 두 번째 탄소와 피리미딘 고리의 C4 위치에 부착된 산소와의 반응에 의해 진행되어, 반응 혼합으로부터 쉽게 분리될 수 있는 형광성 푸라노 피리미디논을 얻는다. 그러한 화합물은 특정한 전자 콘딧, 스페이서 및 중독성 이탈기의 다양한 결합을 통해 ECTA 화합물의 합성을 위한 추가적인 근거를 제공한다.
프로[2,3-d]피리미디논 뉴클레오시드는 이들 형광성 화합물 (Robins, M. J.외. (1983))의 형성을 촉진하기 위해 공지된 조건 하에서, 2', 3'-디-O-p-톨루오일 또는 2', 3'-디-O-아세틸-5-요오도-2'데옥시우리딘과 1- (테트라히드로피라닐옥시)2-프로핀 ("New methods of synthesis of 8-aminoethylpyrazoles" Jones, R. G. 및 Mann, M. J. (1953)) 을 응축함으로써 제조된다. 카르보히드레이트 보호기의 염기-촉매된 제거는 표준 산성 THP 기 가수분해(TFA in CH2CI2)되거나 또는 BVdU-PA 및 5FUdR-PA을 제조하는 데 사용되는 동일한 절차에 의해 유치선택적으로 포스포라미데이트된 6-(테트라히드로피란-2-일옥시메틸)-치환된 이중고리 뉴클레오시드를 제공한다. 도 4에서 나타낸 바와 같이, 포스포라미데이션 후에, THP기는 산성 가수분해에 의해 제거될 수 있다.
푸라노-피리미디논 기재 TS ECTA 화합물
상기된 TEPA 및 ThioTEPA 유도체의 합성과 함께 설명된 바와 같이, C5 프로파르길 우리딘 화합물에서 중독성 이탈기를 히드록시기에 부착할때 사용된 것과 비슷한 방법을 사용하여, 중독성 R4 이탈기가 푸란-2-메틸 알콜에 부착될 수 있다. 당업자들에게 명백한 다양한 다른 중독성 이탈기가 계획된다. 게다가, R2 전자 콘딧 성분의 길이 및 조성에 대한 변형과 R3 스페이서 성분의 조성의 변형 또한 계획된다.
푸라노-피리미디논 기재 TS ECTA 화합물은 또한 다양하게 변형된 "Q" 부분으로 구성된다. 많은 5-치환된 2'-데옥시우리딘은 인간 TK에 대한 기질이 아니지만, 흥미롭게 5-(4-히드록시-l-부틴일)-2'-데옥시우리딘은 예외로 발견되었다(Barr, P. J. 외. (1981)). ECTA 화합물은 자유 5'히드록시, 5' 모노포스페이트 또는 다른 카르보히드레이트 기에 부착된 5'포스포라미데이트 기를 가질 수 있다. 그러한 포스포라미데이트 화합물의 합성을 위한 신규 방법이 HCl 스캐빈져의 존재하에서 2-데옥시 3'-히드록시, 5'-히드록시 비보호된 뉴클레오티드와 포스포클로리데이트와의 반응에 의해 달성된다. 바람직한 구체예에서, 포스포클로리데이트는 알라닌과 같은 아미노 산으로부터 유도된 인 치환분으로 구성된다. 예를 들어, 포스포클로리데이트는 페닐-L-메톡시알라닌 포스포클로리데이트가 될 수 있다.
C6 플루오로 우리딘 및 C4 히도존 기재 화합물
피리미딘 C5-C6 이중 결합에 대한 중성 티올 첨가는 dUMP와의 정상 TS반응에서 발열 반응 (몰당 3-9 kcal; Les, A. 외. (1998)에 의한 리뷰 참조.)으로서 진행된다. 활성의 인간 TS 시스테인 (시스-198 of L. casei과 동족)을 거쳐 효소와 술피드릴 결합의 형성을 촉진할 수 있는 6 위치에서의 TS 활성 수소에 대한 다른 치환분은 플루오르를 포함한다. 피리미딘 고리에서 다른 위치에서의 그러한 치환분은 또한 기질과 TS 사이의 반응을 촉진할 수 있다. 예를 들어, 우라실에서 4-히드라존 치환은 (Les,A.외(1998)에 의해 기술된 바와 같이)TS를 갖는 티올의 형성을 촉진한다. 생성되는 뉴클레오티드-티올(TS) 중간물질은 가수분해를 거쳐 수동적으로 달성될 수 있는 변화된 뉴클레오티드를 유리시키도록 하는 방식으로 재배열하는것이 중요하다.
C6 위치에서 플루오르의 도입은 이전에는 보고되지 않았지만, 다수의 6 치환된 우라실 및 우리딘 유사물의 합성을 설명한 Krajewskas 및 Shugar (1982) 의 다음의 합성 명세서에 의해 합성될 수 있다.
피리미딘 염기의 C4 위치에서의 화학 촉진 치환은 당업자들에 의해 잘 알려져있다. 문헌 명세서의 예에는 Wallis 외. (1999); Negishi, 외. (1996), Barbato 외. (1991), Barbato, 외. (1989) 및 Holy 외. (1999)가 있다. 이들의 합성 기술은 또한 예를 들어 피리미딘 고리의 C4 및 C5 위치에서(Pluta, 외.1999) 또는 피리미딘 고리의 C2 및 C4 위치에서 치환의 조합을 가능하게 한다.
발명의 또다른 구체예에서는, ECTA 화합물은 C6 플루오로-우리딘 염기 또는 C4 히드라존 변형된 피리미딘 중 어느 한쪽에 다른 전자 콘딧, 스페이서 부분 및 중독성 이탈기를 첨가함으로써 합성된다. 2, 데옥시우리딘 기재 ECTA 화합물의 합성을 위해 위에서 설명된 방법은 그러한 분자의 합성을 위해 다시 사용될 수 있다.
뉴클레오시드 페닐 메톡시알라니닐 포스포라미데이트의 합성
뉴클레오티드를 위한 포스페이트 프로드러그로서의 포스포라미데이트의 사용은 McGuigan, C. 외(1993) 및 McGuigan,C. 외(1994)에 의해 처음으로 보고되었다. 이들 저자들은 d4T와 같은 항바이러스성 2'3'-디데옥시뉴클레오시드 유도체의 포스포라미데이트 유도체가 티미딘-키나아제 결핍 세포에서 그들의 항바이러스성 활성을 유지하는것을 보여주었다. 또다른 연구에서는 포스포라미데이트 기가 세포내에서 포스페이트 기로 가수분해되는 것을 보여주었다.(McGuigan, C. 외(1996);Balzarini,J.외(1996); 및 Saboulard,외(1999)). 포스포라미데이트는 2'3'-디데옥시뉴클레오시드와 페닐 메톡시알라닌일 포스포로클로리데이트(PMPC)와의 반응에 의해 합성되었다.
오직 하나의 히드록시기가 존재하기 때문에, 이들 반응은 일반적으로 순조롭게 진행된다. 하나 이상의 히드록시기가 존재하는 화합물에서는, 적절하게 보호된 뉴클레오시드가 필요하다. 2'-데옥시뉴클레오시드의 5'-OH 기가 3'-OH 기보다 방해를 훨씬 적게 받기 때문에, 주의해서 조절한 조건하에서 선택적인 PMPC와의 포스포라미데이션이 가능하다. BVdU 및 5FUdR 모두 무수물 CH2Cl2에서 N-메틸이미다졸의 존재하에서 PMPC로 응축되어 대응하는 포스포라미데이트를 만든다. 두 가지 경우에, 원하는 생성물은 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피를 사용하여 초기 재료로부터손쉽게 분리될 수 있다. 합성 도식은 하기로 요약된다.
다음의 예는 예증을 위한 것이며, 본 발명을 제한하지는 않는다.
실시예 1 및 2
프로파르길 테더로 ECTA 화합물 합성
상기에 기술된 일반적인 합성 과정을 사용하여,비스-아지리딘-1-일-포스핀산 3-[2-데옥시우리딘-5-일]-프로프-2-인일 에스테르가 합성되고1H NMR에 의해 분석하여 하기의 결과를 얻었다.1H NMR((CD3)2SO)는 노이즈로 인해 복잡하다. 두드러진 특징: δ8.28 (d, 1, H6), 6.10 (가(pseudo)-t, 1, Hl'), 5.26 (m, D20,1,3'-OH와 교환), 5.13 (m, D2O, 1,5'-OH와 교환), 4.81 (q 또는 dd, 2, 프로파르길-CH2), 4.24 (m, 1, H3'), 3.57 (m, 2,5'-CH2), 2.15-2.0 (m, 8, 아지리딘-CH2).
비스-아지리딘-1-일-포스피노피오 산 3-[2-데옥시우리딘-5-일]-프로프-2-인일 에스테르가 또한 합성되었고1H NMR 에 의해 분석되어 하기의 결과를 얻었다.:1HNMR ((CD3)2SO)는 노이즈로 인해 복잡하다. 두드러진 특징: δ8.29 (d, 1, H6), 6.10 (가-t, 1, H1'), 5.22 (m, D20,1,3'-OH와 교환), 5.10 (m, D2O, 1,5'-OH와 교환), 4.88 (q 또는 dd, 2, 프로파르길-CH2), 4.31 (m, 1, H3'), 3.52 (m, 2,5'-CH2), 2.15-2.0 (m, 8, 아지리딘-CH2).
실시예 3 내지 8
푸라노-피리미디논의 합성
상기에 기술한 일반적인 합성 과정을 사용하여, 하기의 화합물을 제조하였다.
실시예 3
3- (2-데옥시-β-D-리보푸라노실)-6- (테트라히드로피란n-2-일옥시메틸) 푸로 [2,3d]피리미딘-2 (3H)-원.1H NMR ((CD3)2SO) δ 8.80 (s, 1, H4), 6.74 (s, 1, H5), 6.16 (가-t, 1, H1'), 5.27 (d, D20,1,3'-OH와 교환), 5.12 (t, D2O, 1,5'-OH와 교환), 4.72 (m, 1, THP-H2), 4.56 (q, 2, CH20THP), 3.92 (m, 1, H4'), 3.64 (m, 2,5'-CH2), 2.40 (m, 1, H2'a), 2.03 (m, 1, H2'b), 1.68 및 1.50 (m, 8, THP). 비스-TMS 유도체에서 저해상도 질량 스펙트럼 (DCI-NH3), m/z 323 (B+TMS+H+), 511 (MH+), 583 (M+TMS+).
실시예 4
3- (2-데옥시-β-D-리보푸라노실)-6- (히드록시메틸) 푸로 [2,3-d]피리미딘2(3H)-원.1H NMR ((CD3)2SO) δ12.0 (bs, 1, OH), 8.24 (s, 1, H4), 6.53 (s, 1, H5), 5.51 (가-t, 1, H1'), 4.42 (m, 2, CH20H). 저해상도 질량 스펙트럼 (DCINH3), m/z 167 (B+2H+), 184 (B+NH4+).
실시예 5
1- [6- (테트라히드로피란-2-일옥시메틸) 푸로[2,3-d]피리미딘-2(3H)-온-3-일]- 2-데옥시-β-D-리보푸라노스-5-일 페닐 메톡시-L-알라니닐포스포라미데이트. 1H NMR ((CD3)2SO)은 부분 입체 이성질체의 존재로 인해 복잡하다. 두드러진 특징: δ 8.62 및 8.59 (각각 s, 각각 1, H4), 7.4-7.1 (m, 5, PhO), 6.61 및 6.60 (각각 s, 각각 1, H5), 6.25 (m, 1, H1'), 4.56 (q, 2, 프로파르길-CH2), 3.56 및 3.54 (각각 s, 각각 3,C02Me), 2.0 (m, 1, H2'b), 1.22 (m, 3, 알라니닐-α-Me). 저해상도 질량 스펙트럼 (DCI-NH3), m/z 167 (B+2H+), 184 (B+H++NH4+-THP).
실시예 6
1-[6-(히드록시메틸)푸로[2,3-d]피리미딘-2(3H)-온-3-일]-2-데옥시-β-D-리보푸라노스-5-일 페닐 메톡시-L-알라니닐포스포라미데이트.1H NMR (CDC13)은 부분 입체 이성질체의 존재로 인해 복잡하다. 두드러진 특징: 8 8.5 (s, 1, H4), 7.4-7.1 (m, 5, PhO), 6.36 및 6.30 (각각 s, 각각 1, H5), 6.23 (m, 1, H1'), 3.67 및 3.65 (각각 s, 각각 3, CO2Me), 2.69 (m, 1, H2'a), 2.10 (m, 1, H2'b), 1.35 (m, 3, 알라니닐-α-Me). 저해상도 질량 스펙트럼 (DCI-NH3), m/z 525 (MH+), 595 (MNH4+).
실시예 7
5- (3-히드록시-1-프로피닐)-2'-데옥시우리딘의 4-니트로페닐 에테르 유도체가 하기에 나타난 바와 같이 표준 에테르 합성에 따라 제조되었다.
실시예 8
5-[3-(니트로페녹시)-1-프로피닐]-2'-데옥시우리딘. 40ml 무수물 THF내에 미리 건조된 5-(3-히드록시-1-프로피닐)-2'-데옥시우리딘 Robins,M.J.외,(1983)(565mg, 2mmol)의 용액은 아르곤 하에서, 4-니트로페놀(696mg,5mmol), 트리페닐포스핀(787mg,3mmol) 및 디이소프로필 아조디카르복실레이트(590L,3mmol)로 처리되었고, 반응 혼합물은 용액이 맑아질때까지 60℃에서 가열하였고 그후 1시간 더 가열하였다. 혼합물을 23 ℃로 냉각하고 그후 SiO2위에서 증발시키고 용리제로 MeOH/CH2Cl2를 사용하는 크로마토그래피에 의해 정제하여 원하는 에테르 생성물 107mg(13%)을 얻었다.:녹는점 112-118℃.1H NMR ( (CD3)2SO) δ 11.65 (s, D2O, 1, NH와 교환), 8.29 (s, 1, H6), 8.24 (d, J= 9.3Hz, 2, m-ArH), 7.23 (d, I= 9.3 Hz, 2, o-ArH), 6.09 (가-t, 1, H1'), 5.17 (s, 2, 프로파르길-CH2), 4.22 (m, 1, H3'), 3.80 (m, 1, H4'), 3.59 (m, 2,5'-CH2), 2.13 (가-t, 2,2'-CH2). per-트리메틸실리에이트된 재료 위에서 저해상도 질량스펙트럼(DCI-NH3), m/z 547 [M(TMS)2H+], 565[M (TMS) 2NH4 +], 620[M (TMS)3H+].
실시예 9
5-(4-카르베톡시-1,3-부타디에닐)-2'-데옥시우리딘
(a)5-(카르보메톡시비닐)-2'-데옥시우리딘-3'5'-비스(테트라히드로-2H-피란-2-일)에테르(I)
디메틸포름아미드(DMF,5ml)내의 5-(카르보메톡시비닐)-2'-데옥시우리딘(3.0g, 9.6mmol), 3,4-디히드로-2H-피란(22mL,22.3mmol) 및 피리디늄 p-톨루엔술폰산염(PPTS,0.242g,0.96mmol)의 슬러리를 50℃에서 18시간 동안 교반하였다. 생성된 용액을 진공에서(욕 온도 45℃) 농축하여 농후하고 엷은 황색의 오일을 얻었다. 오일을 EtOAc에서 용해시키고 고체를 여과시켰다. 고체를 다시 농축하였다. 얻어진 오일을 용리제로서 50-75% EtOAc/헥산을 사용하는 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피로 정제하여 무색의 오일로서 3.81g(85%)의 순수한 생성물을 얻었다.
(b)5-(3-히드록시프로프-1-에닐)-2'-데옥시우리딘-3'5'-비스(테트라히드로-2H-피란-2-일)에테르(II)
CH2Cl2(14ml)내의 (I)(3.5g, 7.27 mmol)의 용액을 드라이 아이스/아세톤 욕에서 -78℃로 냉각하였다. 온도를 -78℃로 유지하면서 톨루엔(1.0M,24 mL, 24.0mmol)에서 디이소부틸알루미늄 수소화물(DIBAL-H)을 2시간 이상 적가하였다. -78℃에서 용액을 추가로 2시간 동안 교반하고 MeOH(2.5mL)를 적가하여 어떠한 과도한 DIBAL-H를 소실시켰다. 반응 혼합물은 30% 시트르산 용액(50ml), 얼음(25g) 및 EtOAc(30mL)의 혼합물로 약 20분 넘게 캐뉼러삽입하였다. 상을 분리하였고 수성상은 EtOAc(2 x 25mL)로 추출하였다. 결합된 유기 상은 포화 NaHCO3(20mL) 및 소금물(20mL)로 세척하고, MgSO4로 건조하고 농축하여 3.288g(100%)의 무색 오일을 얻었다.
(c)5-(3-옥소프로프-1-에닐)-2'-데옥시우리딘-3'5'-비스(테트라히드로-2H-피란-2-일)에테르(III)
CH2Cl2(9ml)내의 상기로부터 얻은 미정제된 (II)의 용액를 수냉각하면서 고체 피리디늄 디크로메이트(PDC; 1.82g, 4.8 mmol)을 첨가하였다. 아세트산 (0.4mL)을 적가하면서 현탁액은 교반하였다. 수 욕를 제거하고 반응은 실온에서 1시간동안 교반하였다. 정제되지 않은 생성물은 플로리실(2x2.5cm) 패드를 통해 여과하고 플로리실을 35mL의 EtOAc로 세척하였다. 얻어진 갈색 용액은 또다른 플로리실의 칼럼 (3.5cm 직경x2.5cm 높이)을 통해 여과하였다. 여액을 농축하여 매우 밝은 갈색의 오일 1.273g(64% 수율)을 얻었다.
(d)5-(4-카르베톡시-1,3-부타디에닐)-2'-데옥시우리딘-3',5'-비스(테트라히드로-2H-피란-2-일)에테르(IV)
(카르복시메틸렌)트리페닐포스포레인(0.32mg, 0.92mmol)을 정제되지 않은 알데히드(III)(0.344g, 0.77mmol) 용액에 첨가하였다. 용액은 어두워지고 녹빛으로변하였다. 1시간 후, (III)은 얇은 층 크로마토그래피에 의해 완전히 소비된것으로 판단되었다. 용매는 증발시키고 정제되지 않은 생성물은 용리제로서 35-45% EtOAc/헥산을 사용하여 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피로 정제하였다. 순수한 생성물(0.310g, 78% 수율)이 무색의 오일로 얻어졌다.
(e)5-(4-카르복시-1,3-부타디에닐)-2'-데옥시우리딘(V)
5-(4-카르복시-1,3-부타디에닐)-2'-데옥시우리딘-3',5'-비스(테트라히드로-2H-피란-2-일)에테르(IV)(0.637g,1.22mmol)을 MeOH(1.5mL)에 용해시키고 PPTS(0.049g,0.16mmol)을 첨가하였다. 용액은 50℃에서 7.5시간동안 교반하고 밤새 실온에 방치하였다. 백색 침전물이 생성되었다. 반응 혼합물은 0℃로 냉각하였고 백색 고체(0.188g)으로 순수한(V)를 얻었다. 여액을 농축하고, 용리제로서 50-100% EtOAc/헥산을 사용하는 실리카 겔 크로마토그래피하여, 또다른 0.180g 생성물을 얻었다. 생성물의 총 수율은 0.368g(86%)였다.
1H NMR (DMSO-d6): 1.22 (3H, t, J = 7 Hz), 2.17 (2H, br t= 5.5 Hz), 3.55 3.75 (2H, m), 3.81 (1H, m), 4.12 (2H, q, J = 7 Hz), 4.25-4.28 (1H, m), 5.19 (1H, t, J = 4.8 Hz), 5.27 (1H, d, J = 4. 1 Hz), 5.98 (1H, d, J = 14. 5 Hz), 6.14 (1H, t, J = 6. 3 Hz), 6.75 (1H, d, J = 14.5 Hz), 7.18-7.30 (2H, m), 8.30 (1H, s), 11.56 (1H, s).
실시예 10
5-(4-카르보메톡시-1,3-부타디에닐)-2'-데옥시우리딘(Va)
디옥산(12mL)내의 트리에틸아민(3.9mL,28.2 mmoL)의 용액을 15분동안 거품이 이는 질소를 통과시킴으로써 탈기하였다. 팔라듐 아세테이트(0.60g,0.26mmol) 및 트리페닐포스핀(0.183g,0.70mmol)을 첨가하고 용액을 70℃에서 20분동안 가열하여 암갈색 용액을 얻었다. 5-요오도-3'-데옥시우리딘(5.0g,14.1mmol) 및 메틸 2,4-펜타디에노에이트(2.5g,22.3mmol)을 첨가하고 혼합물을 15시간동안 환류하면서 가열하였다. 진공에서 용매 및 휘발 성분을 증발시키고 잔기는 물(15mL)과 EtOAc(15mL) 사이에서 분획되였다. 상을 분리하고 수성 상을 EtOAc (10mL 각각)으로 2회 추출하였다. 조합된 유기 상을 소금물로 세척하고 농축하였다. 잔기는 MeOH(15mL)에 용해시키고 실온으로 냉각하였다. 형성된 고체는 여과하여 수집하고, 소량의 MeOH로 세척하고 진공에서 건조시켜 0.38g 갈색 분말을 얻었다.
1H NMR (DMSO-d6): 2.17 (2H, t, J = 6.4 Hz), 3.55-3.70 (2H, m), 3.66 (3H, s),3.82 (1H, q, J = 3. 6 Hz), 4.27 (1H, m), 5.18 (1H, t, J = 4. 9 Hz), 5.26 (1H, d, J = 4. 5 Hz), 5.99 (1H, d, J = 14.4 Hz), 6.14 (1H, d, J = 6. 4 Hz), 6.74 (1H, d, J = 14.8 Hz), 7.20-7.35 (2H, m), 8.30 (1H, s), 11.56 (1H, s).
상기로부터의 여액은 농축하고 용리제로서 60-100% EtOAc/헥산을 사용하여 실리카 겔 크로마토그래피하여 갈색 포말로 또다른 0.70g의 생성물을 얻었다. 합계 수율은 1.08g(22.6%)였다.
실시예 11
5-(4-카르복시-1,3-부타디에닐)-2'-데옥시우리딘(VI)
방법 I
5-(4-카르복시-1,3-부타디에닐)-2'-데옥시우리딘(실시예1로부터의V)(0.449g,1.28mmol)을 2N NaOH(3mL)에 용해시키고 25℃에서 교반하였다. 20분 후에, 침전물이 형성되었고 TLC는 초기 물질이 완전히 소모되었음을 나타내었다. 혼합물은 0℃로 냉각하고 2N HCl을 이용하여 pH 1로 산성화하였다. 생성된 탈-백색 고체는 여과해내고, 물로 세척하고 진공에서 건조시켜 0.225g(54%)생성물을 얻었다.
1H NMR (DMSO-d6): 2.12-2.19 (2H, m), 3.50-3.70 (2H, m), 3.75-3.85 (1H, m),(1H, m), 5.19 (1H, t, J = 4. 8 Hz), 5.27 (1H, d, J = 4. 2 Hz), 5.80-5.95 (1H, m), 6.14 (1H, t, J = 6.4 Hz), 6.60-6.75 (1H, m), 7.15-7.25 (2H, m), 8.26 (1H, s), 11.56 (1H, s), 12.16 (1H, br s).
여액 및 세척물을 결합시키고 증발시켜 건조하였다. 백색 침전물이 형성된 것으로부터, 생성된 점착성 황색 고체는 MeOH에 용해하였다. 고체는 여과해내고 추가로 0.200g의 생성물을 얻었다.
방법II
표제 화합물은 또한 위에서 언급한 것과 비슷한 수율로 5-(4-카르보메톡시-1,3-부타디에닐)-2'데옥시우리딘(Va)(실시예 2에서의 방법에 따라 제조됨)으로부터 제조될 수 있다.
실시예 12
5-(4-브로모-1E,3E-부타디에닐)-2'-데옥시우리딘(VIIa) 및
5-(4-브로모-1E,3Z-부타디에닐)-2'-데옥시우리딘(VIIb)
DMF(1mL)내의 5-(4-카르복시-1,3-부타디에닐)-2'-데옥시우리딘(VI) (0.200g,0.62mmol)의 용액에 KHCO3(0.185g,1.84mmol)을 첨가하고 혼합물을 25℃에서 20분동안 교반하였다. DMF(0.3mL)내의 N-브로모숙시니미드(0.117g, 0.65mmol) 용액을 적가하였다. 첨가하는 동안 내내 잔잔한 가스 방출(CO2)이 일어났다. 생성된 갈색 현탁액은 25℃에서 TLC가 (VI)가 완전히 소모됨을 나타낸 시간인 2시간동안 교반하였다. 현탁액에 물(10mL)을 첨가하고 결과의 용액은 EtOAc(2 x 15mL)로 추출되었다. 추출물은 MgSO4에서 건조하였고 용매는 진공에서 증발시켜1H NMR에 의해 나타난 바와 같이 두개의 이성질체의 혼합물로 이루어진 황색 고체(178mg,80% 수율)을 얻었다. 정제되지 않은 생성물은 이동 상으로서 물에서 20% 아세토니트릴을 사용하는 반-예비 HPLC(역 상 C18 칼럼)에 의해 분리시켜 하기의 이성질체를 얻었다.
5-(4-브로모-1E,3Z-부타디에닐)-2'-데옥시우리딘: 유지 시간 10.5 분;
1H NMR: (DMSO-d6): 2.11-2.18 (2H, m), 3.50-3.70 (2H, m), 3.80 (1H, 왜곡된 q, J = 3.5 Hz), 4.25 (1H, br s), 5.08 (1H, br s), 5.25 (1H, br s), 6.15 (1H, t, J = 6.5 Hz), 6.40 (lH, d, J=7Hz), 6.53 (lH, d, J=15. 6Hz), 6.83 (lH, dd, J=7, 10Hz), 7.39 (1H, dd, J =10,15.6 Hz).
5-(4-브로모-1E,3E-부타디에닐)-2'-데옥시우리딘: 유지 시간 15.1 분;
1H NMR (DMSO-d6): 2.12-2.16 (2H, m), 3.50-3.70 (2H, m), 3.80 (1H, q, J = 3.2 Hz), 4.26 (1H, m), 5.13 (1H, br s), 5.25 (1H, br s), 6.14 (1H, t, J = 6. 5 Hz), 6.36 (1H, d, J = 15.6 Hz), 6.67 (1H, d, J = 13.1 Hz), 6.84 (1H, dd, J = 11,13.1 Hz), 7.04 (1H, dd, J = 11, 15.6 Hz).
실시예 13
실시예 11의 방법 II에서 언급된 절차를 사용하여, 유사한 형태로 하기의 화합물을 얻을 수 있다.:5-(4-클로로-1,3-부타디에닐)-2'-데옥시우리딘(단계 B에서 N-브로모숙시니미드 대신에 N-클로로숙시니미드를 사용); 5-(4-요오도-1,3-부타디에닐)-2'-데옥시우리딘(N-브로모숙시니미드 대신에 요오드화 나트륨으로 요오드를 사용)
실시예 14
5-(2-브로모비닐)-2'-데옥시우리딘 페닐
N-메톡시-L-알라닐 포스포라미데이트
페닐 N-메톡시-L-알라닐 포스포로클로리데이트
L-알라닌 메틸 에스테르 히드로클로라이드(245.8g;1.76mol)을 12L 3구 둥근 바닥 플라스크(기계적 교반기 및 온도계가 구비됨)에 넣고 이어서 디클로로메탄 4.0L를 넣었다. 혼합물을 실온에서 15분동안 교반하였다. 페닐 포스포디클로리데이트(370.0g;1.76mol)을 혼합물에 첨가하고 실온에서 15분간 교반을 계속하였다. 플라스크를 드라이 아이스와 함께 욕에 넣고 균일한 현탁액이 형성될때까지 20분간 교반을 계속한다.
새로 증류된 트리-엔-부틸아민(626.5g;3.38mol)을 격렬하게 교반하면서 반응 혼합물에 적가(~90min)하여 플라스크 내부의 온도가 ~0℃로 유지되도록 하였다. 욕을 제거하고 실온에서 6시간동안 교반을 계속하였다. 회전식 증발기에서 혼합물의 일부를 증발시킴으로써 용액을 ~2.84L로 농축하고 혼합물을 아르곤하에서 밀폐하고 -20℃에 저장하였다. 생성물은 인 NMR에 의해 순도 85%였으며 대략의 농도가 ~0.5M인 페닐메톡시알라닌일 포스포클로리데이트을 얻었다.
실시예 15
5-(2-브로모비닐)-2'-데옥시우리딘 페닐 N-메톡시-L-알라닌일
프스포라미데이트(NB1011)
아르곤 분위기하에서 반응이 수행되었다. 5-(2-브로모비닐)-2'-데옥시우리딘(BVdU)을 기계적 교반기가 구비된 3구 3L 둥근 바닥 플라스크에 넣는다. 플라스크를 얼음물 욕에 넣고, 반응 혼합물의 격렬한 교반과 함께 첨가 깔때기를 사용하여 15분 이상 페닐메톡시알라닌일 포스포클로리데이트 시약 1600mL(~800mmol)을 첨가하였다. 이어서 시린지를 사용하여 5분 이상 100mL의 N-메틸이미다졸을 첨가하였다. 5분 후에 혼합물이 투명해지고 10분 후에는 얼음물 욕을 제거하여 교반을 계속하면서 혼합물을 실온까지 데운다. 반응은 역상 HPLC에 의해 모니터되고 3시간 후에 종결된다. 100mL의 메탄올을 첨가함으로써 반응을 억제시키고 혼합물을 오일로 증발시키고 6L의 디클로로메탄에 재용해시키고 실리카 겔 800g에 통과시켰다. 여기서 NB1011로 언급되는 BVdU-PA의 주요 부분은 로딩시 칼럼을 통해 통과시키고 최종적으로 NB1011의 용출은 디클로로메탄에서 5% 메탄올의 5L을 통과시킴으로써 종결되었다. NB1011을 함유하는 모든 부분은 결합되고 오일로 증발되고, 잔기는 에틸 아세테이트 4L에 용해되고, 물(2 x 2L)로 혼합물을 추출하였다. 유기 층은 황산 나트륨으로 건조되고, 여과되고, 에틸 아세테이트(3 x 300mL)로 세척하였다. 결합된 여액 및 세척물은 증발시켜 옅은 백색 포말을 생성했다. 총 중량~540g:
정제되지 않은 생성물은 CH2Cl2에서의 0-5% MeOH 및 CH2Cl2에서의 10% MeOH를 각각 용리제로 사용하는 두 개의 실리카 겔 크로마토그래피로 정제하였다.
실시예 16
실시예 15에서 기술한 방법을 사용하여, 하기의 뉴클레오시드의 페닐 N-메톡시-L-알라닐 포스포라미데이트를 제조하였다.
1. 5- (4,4-디브로모-1,3-부타디에닐)-2'-데옥시우리딘,
2. 5- (2-클로로비닐)-2'-데옥시우리딘,
3. 5-트리플루오로메틸-2'-데옥시우리딘,
4. 5- (4-카르베톡시-1,3-부타디에닐)-2'-데옥시우리딘,
5. 5- (4-카르보메톡시-1,3-부타디에닐)-2'-데옥시우리딘,
6. 5- (4-브로모-lE, 3E-부타디에닐)-2'-데옥시우리딘,
7. 5- (4-브로모-lE, 3Z-부타디에닐)-2'-데옥시우리딘,
8. 5- (트리메틸실레티닐)-2'-데옥시우리딘,
9. 5- (에티닐)-2'-데옥시우리딘,
10. 5- (1-데시닐)-2'-데옥시우리딘,
11. 3- (2'-데옥시- D-리보푸라노실)-2, 3-디히드로푸로 [2,3-d] 피리미딘-2-하나
12. 3- (2'-데옥시- D-리보푸라노실)-6-옥틸-2, 3-디히드로푸로 [2,3 d] 피리미딘-2-하나.
유도체
여기서 개시된 상기 화합물의 염, 에스테르 및 에테르 또한 본 발명의 범주에 속한다. 본 발명의 프로드러그의 염은 무기 또는 유기 산 및 염기로부터 유도된다. 산의 예로는 염산, 브롬화수소산, 질산, 과염소산, 푸마르산, 말레산, 인산, 글리콜산, 젖산, 살리실산, 숙신산, 톨루엔-p-술폰산, 주석산, 아세트산, 구연산, 메탄술폰산, 에탄술폰산, 포름산, 벤조산, 말론산, 나프탈렌-2-술폰산 및 벤젠술폰산을 포함한다. 옥살산과 같은 다른 산들은 그 자체로는 제약학적으로 허용가능하지 않지만, 발명의 화합물과 제약학적으로 허용가능한 산 첨가 염을 얻는데 있어서 중간물질로서 염의 제조에서 유용하게 사용될 수 있다. 염기의 예로는 알칼리 금속(예를 들어 나트륨) 수산화물, 알칼리 토금속(예를 들어 마그네슘) 수산화물, 암모니아 및 화학식 NW4 +의 화합물(여기서 W는 C1-4알킬)을 포함한다.
염의 예로는 다음 : 아세테이트, 아디페이트, 알기네이트, 아스파르테이트, 벤조에이트, 벤젠술포네이트, 비술페이트, 부티레이트, 시트레이트, 캄포레이트,팜포술포네이트, 시클로펜타네프로피오네이트, 디글루코네이트, 도데실술페이트, 에탄술포네이트, 푸마레이트, 플루코헵타노에이트, 글리세로포스페이트, 헤미술페이트, 헵타오에이트, 헥사노에이트, 히드로클로라이드, 히드로브로마이드, 히드로요오디드, 2-히드록시에탄술포네이트, 락테이트, 말레에이트, 메탄술페이트, 2-나프탈렌술포네이트, 니코티네이트, 옥살레이트, 팔모에이트, 펙티네이트, 퍼술페이트, 페닐프로프리오네이트, 피크레이트, 피발레이트, 프로피오네이트, 숙시네이트,타르트레이트, 티오시아네이트, 토실레이트 및 운데카노에이트을 포함한다. 염의 그밖의 예에는 Na+, NH4 +및 NW4 +와 같은 적절한 양이온과 혼합된 본 발명의 화합물의 음이온을 포함한다. (여기서 W는 C1-4알킬기이다.)
치료의 용도로, 본 발명의 화합물의 염은 제약학적으로 허용가능하다. 그러나, 제약학적으로 허용가능하지 않은 산과 염기의 염 또한 예를 들어 제약학적으로 허용가능한 화합물의 제조 또는 정제에서 사용되는 것을 찾을 수 있다.
본 발명의 방법에 의해 증명된 프로드러그 또는 화합물의 에스테르는 2'-,3'- 및/또는 5'-히드록시기의 에스테르화에 의해 얻어진 카르복실산 에스테르(즉, -O-C(=O)R)를 포함한다. 여기서 R은 (1) 직쇄 또는 분지쇄 알킬(예를 들어,n-프로필,t-부틸, 또는 n-부틸), 알콕시알킬(예를 들어, 메톡시메틸), 아랄킬(예를 들어,벤질), 아릴옥시알킬(예를 들어,페녹시메틸), 아릴(예를 들어, 선택적으로 예를 들어, 할로겐, C1-4알킬 또는 C1-4알콕시 또는 아미노에 의해 대체되는 페닐);(2)알킬술포닐(예를 들어, 메탄술포닐)과 같은 술포네이트 에스테르 또는 아랄킬술포닐; (3)아미노 산 에스테르(예를 들어, L-발일 또는 L-이소류실; (4)포스포네이트 에스테르 및 (5)모노-,디-또는 트리포스페이트 에스테르로부터 선택된다.
포스페이트 에스테르는 예를 들어, C1-20알코올 또는 그들의 반응적 유도체, 또는 2,3-디-(C6-24)아실 글리세롤에 의해 좀더 에스테르화될 수 있다. 그러한 에스테르에서는, 다르게 명기되지 않으면, 존재하는 어떠한 알킬 부분이 1 내지 18, 자세하게는 1 내지 6, 보다 자세하게는 1내지 4의 탄소 원자를 유리하게 함유한다. 그러한 에스테르에 존재하는 어떤 알킬 부분은 유리하게 3 내지 6 탄소 원자를 함유한다. 그러한 에스테르에 존재하는 어떤 알킬 부분은 유리하게 페닐기를 구성한다. 본 발명의 릭소-푸라노실 프로드러그 유도체의 예는 예를 들어, 2'-O-아세틸-릭소-푸라노실;3'-O-아세틸-릭소-푸라노실;5'-O-아세틸-릭소-푸라노실;2',3'-디-O-아세틸-릭소-푸라노실 및 2',3',5'-트리-O-아세틸-릭소-푸라노실과 같이, 화학적으로 보호된 히드록시기(예를 들면, O-아세틸기)를 갖는 것들을 포함한다.
본 발명의 화합물의 에테르는 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 이소부틸 및 sec-부틸 에테르를 포함한다.
또다른 구체예에서는, 기질이 화학적으로 피리미딘 또는 엽산염과 관련이 없겠지만, 오히려 합리적인 약물 디자인의 공지된 제한 범위/파라미터에 기반하여 합성된다. Dunn, W.J. 외(1996) 참조.
예를 들어, 반응 생성물이 dUMP의 브로모비닐-유도체대사길항 물질인 생성물의 화학적 분석은 하기에 규정된 실시예에서 또는 Barr,P.J. 외(1983)에 의해 설명된다.
세포에서 뉴클레오시드 및 모노포스페이트의 양에 대한 분석
이 분석는 화합물 NB 1011로 수행되었다. 그러나, 하기의 방법이 본 발명의 프로드러그와 함께 응용 또는 사용을 위해 쉽게 수정된다는 것이 당업자들에게 이해되었다.
세포계 MCF7(유방암 세포계); 10% FCS로 보충된 RPMI 배지에서의 MCF7TDX( Tomudex 내성 유방암 세포계) 및 H63OR10(Dr.S.Copur, 예일대학으로부터 얻어진 5-FU 내성 결장암 세포계, Copur, S. 외(1995) 참조) 및 항생 물질을 접시당 750,000 세포의 양으로 100mm Petri 접시에 플레이트하고 밤새 37℃에서 배양하였다. 각각의 접시에 BVdU의 100μM을 첨가하고 세포를 2일간 37℃에서 계속하여 성장시켰다. 그 후, 배지를 흡인시키고 세포를 포스페이트 완충된 소금물로 2회 세척하였다. 그 후 접시당 PBS의 1mL을 첨가하고 접시를 -80℃ 냉동장치에 두었다. 세포는 2회 반복된 냉동/해동 과정을 통해 붕괴되었다. 생성된 현탁액의 세포 잔해를 돌리고( spun down)(13,000 rpm, 10분) 상청액은 5,000rpm으로 30분 동안 20℃에서 Sorvall Super T21 원심분리기(Rotor SL-50-T, 1,912g)로 원심분리법에 의해 원심 여과기(Centrifree, 30,000 컷-오프, Amicon)를 통해 통과시킴으로써 탈단백시켰다. 통과물은 100μl의 부피로 농축되고 HPLC 칼럼(Adsorbosphere HS,C18, 5μm, 4.6mm x 150 mm, Alltech)위로 주입되었다. 샘플은 트리플루오로아세트산을 함유하는 물에서 아세토니트릴 구배를 사용하여 분석하였다. BVdU-유도체의 흡수의 최대인 최고점은 300nm에서 검출되었고, 화합물의 양은 300nm에서 최고점 영역으로서표시되었다. 유지 시간 및 스펙트럼을 인증된 표준의 값과 비교함으로써 화합물을 확인하였다.
AlamarBlue 세포 증식 분석
이 분석는 화합물 NB 1011 및 본 발명의 프로드러그로 수행되었다. 지수적으로 생장하는 세포는 384-웰 평판 조직 배양 플레이트로 옮겨졌다. 모든 세포 종류를 웰 당 500 세포의 밀도로 완전 배지(RPMI 1640 + 10% 태아 소과 동물 혈청 + 항생물질/항진균제) 25μL에 옮겼다. 24 시간 후에(0일), 1회 분량 범위 인 10-3내지 10-10에 걸쳐 화합물을 함유하는 25μL 의 완전 배지를 3배로 첨가하였다. 약제 노출 시간은 생장 억제를 평가한 후, 120 시간(5일)이었다. 산화 환원 반응 지시약 5μL ,alamarBlue 가 각각의 웰에 첨가되었다.(10%v/v) 37℃에서 4시간 배양 후에, 535nm 여기 및 595 nm 방사에서 형광성이 관찰되었다.
크리스탈 바이올렛 세포 증식 억제 분석
이 분석는 화합물 NB 1011 및 본 발명의 프로드러그로 수행되었다. 세포의 증식을 막는 시험 화합물의 능력은 크리스탈 바이올렛 과정에 의해 결정되었다.(Sugarman, B.J.외 (1985); 및 Antelman,D.외(1995)).
화합물은 1M의 농도로 디메틸 술폭시드에 용해시켰다. 또한 DMEM 세포 배양 배지로 필요한 만큼 희석하고, 이어서 96-웰 마이크로틸터 판의 첫번째 웰로 희석하였다. 각각의 농도는 표적 세포계 위에서 3회 시험되었다. 1μM 부터 3000μM 까지의 화합물 농도가 시험되었다. Sugarman,B.J.외(1985); 및 Antelman,D.외(1995)에 기술된 바와 같이 세포는 72시간동안 화합물과 함께 배양하였고, 판들을 세척하고, 메탄올로 세포를 고정하고 크리스탈 바이올렛으로 착색하였다.
세포계에서 TK 및 TS 수준의 웨스턴 블롯 분석
웨스턴 블롯 실험은 인간 정상 결장 상피 세포 타입 CCD18co(ATCC,Manassas,VA로부터 얻음), 5-FU에 저항력있는 결장 선암 세포계 H630R10(Dr.S.Copur, 예일대학으로부터 얻음, Copur,S.외 (1995) 참조), 및 HER2-세포로 감염시킨 유방암 세포계(Pegram,M.D.외(1997))를 사용하여 수행되었다. 세포는 RIPA 완충제(50 mM Tris-HCl, pH 7.5,150 mM NaCl, 0.5% Triton X-100,0.1% SDS 및 0.5% 데옥시콜 산, 나트륨 염 및 프로테아제 반응 억제제)에 용균하였다. 단백질 농도는 BCA-200 단백질 분석 장비 (Pierce, Rockford, IL로부터 얻음)를 사용하여 결정되었다. 각각의 세포계로부터 10μg의 단백질을 12% SDS-PAGE에 의해 분해하였다. 분리된 단백질은 PVDF 막 (Amersham, 잉글랜드으로부터 얻음)로 옮기고, 이어서 인간 티미딜레이트 신타아제 단일클론성 제1 항체 및 항-튜뷸린 단일클론성 항체 (NeoMarkers, Fremont, CA에서 제조)로 면역블롯을 하였다. 안티-마우스 Ig 에 연결된 양고추냉이 페록시다아제가 제2 항체로 사용되었다(Amersham). ECL 플러스 장비가 면역반응의 검출에 사용되었다(Amersham). 티미딜레이트 신타아제에 대응하는 밴드가 정량되고 이미지 분석(Molecular Dynamics Storm)에 의해 튜뷸린의 밴드로 표준화되었다.
세포계에서의 TS mRNA의 RT-PCR 분석
다른 세포계에서 인간 티미딜레이트 신타아제 전사의 발현 수준은 RT-PCR을사용하여 정량되었다. 인간 티미딜레이트 신타아제 및 B-액틴의 확대를 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머가 하기와 같이 설계되었다. 티미딜레이트 신타아제 센스 프라이머(SEQ ID NO: 1) 5'-GGGCAGATCCAACACATCC-3' ( 티미딜레이트 신타아제 cDNA 서열의 베이스 208-226에 대응, Genbank Accession No. X02308), 안티센스 프라이머 (SEQ ID NO: 2) 5'GGTCAACTCCCTGTCCTGAA-3' (베이스 564-583에 대응), β-액틴 센스 프라이머(SEQ ID NO: 3) 5'-GCCAACACAGTGCTGTCTG-3' (β-액틴 유전자 서열 베이스 2643-2661 에 대응, Genbank Accession No. M10277) 및 안티센스 프라이머 (SEQ ID NO: 4) 5'-CTCCTGCTTGCTGATCCAC-3' (베이스 2937-2955에 대응).
Rneasy 미니 키트 (Qiagen, Valencia, CA로부터 얻음)를 사용하여 전체 RNA를 세포로부터 분리하였다. 가능한 DNA 합성/오염을 측정하기 위해서, β-액틴의 확대를 위한 프라이머가 엑손4/인트론5/엑손5 접합을 연결하도록 설계되었다. 게놈 DNA 주형은 β-액틴 조각이 되고, cDNA 주형은 210 bp 생성물을 생성하였다.
SuperScript 전치 증폭 시스템 (Gibco/BRL, Gaithersburg, MD)을 사용하여, 역 전사 반응을 수행하였다. 3μg 전체 RNA는 20μl 부피 완충제에 적용하여 제조업체의 규약에 따르는 역전사 반응을 이끌었다.
PCR 반응은 역전사 반응으로부터의 cDNA 혼합물 3μl을 함유하는 48μl 부피,3 mM MgCl2,50 mM KC1,20 mM Tris-CI, 각각의 dNTP pH 8.4,0.2 mM , 0.4 TM of 티미딜레이트 신타아제 센스 및 안티센스 프라이머 및 Taq DNA 폴리머라아제의 3 단위(Promega, Madison, WI로부터 얻음)에서 수행되었다. 반응 혼합물은 3분동안 94℃에서 배양하고, 이어서 94℃에서 1분 배양, 58℃에서 1분 배양, 그후 72℃에서1분 배양을 10회 행하였다. 10회 반복 후, 0.2μl의 최종 농도를 달성하기 위해 인간 β-액틴 프라이머 2μl를 첨가하여, 최종 반응 부피는 50μl이 되었다. PCR 반응은 총 28 회 계속하였고, 이어서 72 ℃에서 7분간 배양하였다.
PCR 생성물의 5μl는 2% 아가로우스 겔에서 전기 영동에 의해 분해하였고, 이어서 SYBR Gold 핵산 겔 염색액(Molecular Probes, Eugene, Oreg.으로부터 얻음)으로 착색하였다. 티미딜레이트 신타아제에 대응하는 DNA 밴드를 정량하고 Molecular Dynamics Storm에 의해 β-액틴의 밴드로 표준화하였다.
노던 블롯 분석
노던 블롯은 Invitrogen (Carlsbad, CA)로부터 얻었으며 클론된 TS cDNA 탐침으로 혼성화하였다. 혼성화 신호는 표준화된 vs.하우스키핑 전사로서 리보솜 단백질 S9이다. 표준화된 신호가 정상 조직 대조군에 비교했을 때 최소한 2배 강화되면 , 종양은 TS mRNA를 과발현한 것으로 간주하였다.
인간 티미딜레이트 신타아제의 클로닝, 발현 및 정제
E. coli에서의 발현을 위해 완전 인간 TS ORF을 T7 프로모터 발현 벡터 pET28a (Novagen, Inc.)로 하위 클론하였다. 생성되는 플라스미드 벡터는 인간 TS 의 합성을 트롬빈 분열 사이트가 이어지는 6 히스티딘을 갖는 제조합형 융합 단백질로서 코드화한다. 이러한 융합 단백질은 인간 TS의 아미노 말단에 총 20 여분의 아미노산을 첨가한다. 재조합형 단백질을 생산하기 위하여, 인간 TS 발현 벡터는 라크 오퍼레이터의 제어하에서 염색체 안으로 삽입된 T7 RNA 폴리머라아제 유전자를 갖는 스트레인인, E. coli 스트레인 BL21 (DE3)안으로 도입된다.
인간 TS-폴리-His 융합 단백질은 금속 킬레이트 유연 수지(Novagen, Inc.)를 사용하여 정제되었다. 단백질 정제 후에 10% SDS 폴리아실아미드 겔에서 전기 영동을 하였다. 단백질 농도는 Pierce BCA 단백질 분석을 사용하여 결정하였다. 약 10 mg의 인간 TS 융합 단백질을 E. coli의 500 ml 배양으로부터 찾아내었다. 오직 인간 TS 에 대응하는 밴드만이 은빛 염색으로 분명하게 나타났다. 인간 TS 밴드의 확인은 항-TS 단일클론성 항체 TS106으로 웨스턴 블롯을 수행함으로써 확인할 수 있다.
티미딜레이트 신타아제(TS) 효소 활성 분석
TS 활성은 Wahba, 외(1961)의 분광 광도 분석을 사용하여 측정한다. 이 분석에서는, dUTP가 dTTP로 변환되면서 공동인자 5,10 메틸렌 테트라히드로폴트가 디히드로폴레이트로 산화될때 발생하는 340 nm에서 흡수성의 증가를 측정함으로써 TS 활성을 체크한다. 이 방법으로 제조한 효소는 0.5-0.65 단위/mg 단백질의 특유한 활성을 갖는다. 1 단위는 분당 dTTP의 1 마이크로몰의 생산으로 정의된다. 이 값은 Pedersen Lane, J. 외. (1997)에 의해 보고된 값과 유사하다.
TS 프로드러그 대사의 세포내 생성물의 결정
활성의 제안된 메카니즘 및 작용을 실증하고 치료법이 될만한 약제를 정의하기 위하여, TS 프로드러그 대사의 세포내 생성물을 결정하는 것이 중요하다. 아릴 포스포디에스테르 아미데이트의 세포내 대사의 한가지 허용가능한 관점은 카르복실산으로의 효소 전환, 5'-모노프스포릴 뉴클레오시드로의 포스포디에스테르 아미데이트의 세포내의 재배열을 포함한다. Valette외(1996) 참조. 그러나, 이러한 메카니즘이 모든 포스포라미데이트-기재 프로뉴클레오티드의 세포내의 진행 과정을 설명하지는 않는다. 예를 들어, 아릴 포스포모노에스테르 아미데이트 진행 과정에는 다른 메카니즘이 제안되는데, 이는 포스포라미데이트 히드로레이트에 의해 포스포라미데이트가 모노포스페이트 종으로의 간단한 직접적인 전환을 포함한다. McIntee 외. (1997) 및 Fries 외. (1995) 참조. 뉴클레오시드 모노포스페이트를 드러내는 메카니즘과 상관없이, 이 분석은 세포 내에서 세포내의 모노포스페이트가 세포 독성 화합물로 바뀌는 TS 전환의 생성물을 검출한다.
세포는 높은 TS 발현 세포계(위에서의 72H 분석)의 50% 성장 억제를 유도하는 프로드러그 화합물의 한가지 양으로 배양된다. 낮은 그리고 높은 TS 발현체 세포 둘다 사용된다.(예를 들어,CCD18co vs. H630R1) 시간 과정 연구는 처리된 세포가 McIntee, E. J. 외. (1997)에 의해 기술된 방법에 따라 처리함으로써 수행되었다. 세포는 -20℃에서 60% 메탄올로 물에서 용균되고, 원심 분리에 의해 특정 잔기가 제거된다. 상청액은 건조되고 -20℃에서 저장된다. 일정부분(분취량)은 처음에는 RP-HPLC에 의해 평가되고, 그후 LCMS에 의해 포스포라미데이트의 모노포스페이트으로의 세포내 전환을 상세히 기록하고, 또한 티미딜레이트 신타아제에 의해 모노포스페이트의 변환을 확보한다.
정제된 티미딜레이트 신타아제를 이용한 기질 활성의 조사
시간을 뛰어넘어 제조의 활성을 보장하고, 적절한 활성을 위해 스크리닝된 화합물이 시험관내 반응 조건하에서 TS 효소를 정말로 비활성화하는지를 결정하기 위해, 이 분석은 앞으로의 TS 효소 제조의 특정한 활성을 결정한다.
프로드러그 화합물이 정제된 제조합형 TS 효소와 함께 배양될 때 어떠한 반응 생성물이 생산되는지를 결정하기 위해서, TS 활성 분석에 적용된 것과 유사한 반응 조건을 사용하여 시험관 내에서 반응 생성물을 생성한다. 이들 반응 생성물은 그후 GC-질량 분광법으로 분석하여 실제 형성된 분자를 확인하였다.
결과
몇 가지 종양 세포계 및 초기 종양에서 TS 가 높게 발현된다
위에서 설명한 바와 같이, 정상 인간의 뇌,심장,신장,비장,간,결장,폐,소장, 위 근육,고환,난소,자궁,전립선, 갑상선, 타액선, 부신, 피부, 말초 혈액 림프구, 골수에서 및 인간 결장으로부터의 티미딜레이트 신타아제 발현 수준과 매치된(matched) 인간 정상 조직을 정성적 RT-PCR를 사용하여 결정하였다. β-액틴을 위한 프라이머가 엑손4/인트론5/엑손5 접합을 확장하여 가능한 DNA 오염을 체크하도록 설계되었다. 따라서 도 3에 보고된 결과를 상대 TS mRNA 수준로 나타낸다. 도 3A는 다수의 정상 인간 조직에서의 상대 TS mRNA를 나타낸다. 도 3B는 정상 및 종양 인간 결장 조직 사이에서 평균 TS mRNA를 비교한 것이다.
다양하게 배양된 정상 및 종양 세포계에서의 티미딜레이트 신타아제(TS) 단백질 수준은 위에서 기술한 과정을 따라 결정된다. 단백질 수준은 웨스턴 블롯 분석에 의해 측정된다. 결과는 하기에 나타낸다.
1.티미딜레이트 신타아제(TS)- TS 수준은 웨스턴 블롯 분석을 사용하여 결정된다. 정량된 발현 수준은 세포 스트레인 CCD 18co의 수준에 비례하는 값으로서 표현된다.
2.표준 에러
1.티미딜레이트 신타아제(TS)- TS 수준은 웨스턴 블롯 분석을 사용하여 결정된다. 정량된 발현 수준은 세포 스트레인 CCD 18co의 수준과 비례하는 값으로서 표현된다.
2.Tomudex
3.5-플루오로우라실
4.표준 에러
세포에서 측정된 BVdUMP 및 BVdU의 양
각각 BVdU로 처리된 용해질(lysate) 세포계 MCF7, MCF7TDX, 및 H630R10 에 존재하는 BVdUMP 또는 BVdU의 양은 300nm에서 HPLC 최고점에 해당하는 영역으로 표시된다. 이들 화합물의 300nm에서의 흡광 계수가 같으므로, 최고점 영역의 비료가 생성된 양의 직접적인 비교가 된다는 사실을 유념하라.
하기의 표 4는 2일 치료 후에 세포내에서 측정된 BVdUMP 및 BVdU 수준을 나타낸다. 세포는 100 μm BVdU 와 함께 완전 배지에서 배양되었다. 용해질이 제조되고 BVdUMP 및 BVdU 수준이 결정되었다.
표는 BVdU가 모든 세가지 세포 타입을 침투할 수 있다는 것을 나타내지만, MCF7 및 MCF7TDX 세포계에서 BVdUMP가 가장 현저하게 나타난다. H630R10 세포계에서는 전환이 거의 발생하지 않는다.
별도의 실험에서는, 포스페이트 공여 방법으로 첨가된 ATP를 갖는 무세포 시스템에서 BVdU 인산화을 촉매화하는데 MCF7TDX 및 H630R10 세포 용해질이 사용되었다. 이는 H630R10 세포 용해질과 비교할때 MCF7TDX 세포 용해질에서 이 반응의 속도가 훨씬 크다는 것을 확인한다. 기술된 대로 (Look, K. Y. 외. (1997)) 제조된 종양 용해질이 BVdU(또는 다른 후보 뉴클레오시드)와 함께 이 분석에서 제조되고이용되어, 주어진 환자가 뉴클레오시드에 대한 포스포라미데이트 치료 요법에 대한 후보인지 여부를 결정할 수 있다.
이들 결과는 MCF7TDX 세포에서 BVdU 가 포스포릴레이트(인산화)되어 해당하는 모노포스페이트, H630R10 세포에서 그러한 인산화가 MCF7TDX 에서보다 훨씬 더 느리게 진행되는 다음의 TS 반응을 위한 기질을 얻을 수 있다는 것을 보여준다. MCF7TDX 가 유방 종양 세포계라고 언급하는 것이 중요하다. 유방 종양 세포에서 다른 조직으로부터의 인간 TK와 다른 특징을 갖는 TK가 발견된다고 보고 되었다. 이 TK는 BVdU 인산화의 원인이 될 것이다. 위에서 나타낸 결과에 근거하여 BVdU와 같은 뉴클레오시드는 특히, 유방암을 포함하여, BVdU가 인산화될 수 있는 특정 타입의 암의 치료에 유용할 것으로 예상된다. 더욱이, 상기에 기술된 실험 과정은 다음의 접근을 사용하여 주어진 암 타입을 위해 BVdU 또는 다른 뉴클레오시드의 사용의 가능성을 시험관내에서 결정하게 해준다. 만약 조직 샘플이 이용가능하다면, 세포가 BVdUMP로 시험관내에서 치료될 것이며, 가능한 BVdUMP의 형성을 체크할 수 있다. BVdUMP 형성이 등록되었다면, 종양 타입이 포스포라미데이트 유도체에 반대되는 것으로 성공적인 뉴클레오시드 치료를 위한 후보로서 고려되어야 한다.
표 5 및 6에서의 번호는 뒤에 나타낸, 구조를 언급한다. alamarBlue 분석을사용한 시험 결과를 표 5에 나타내고, 크리스탈 바이올렛에 기초한 분석 결과는 표 6에 나타낸다. MCF7-TDX는 TS의 직접적인 억제제인 Tomudex의 존재하에서 세포 배양에서 선택을 거쳐 MCF7 유방 종양 세포로부터 유도되었다. 이러한 선택은 종종 높은 세포내 수준의 TS를 초래한다. ((Freemantle, S. J. 외. (1995)) 유사하게, H630R10 은 결장암 저항성의 H630 결장암 세포로부터 유도된 상피성 세포계 5FU (플루오로피리미딘) 이다. Copur, S. 외. (1995) 참조. HT1080,#12는 HT1080 종양 세포에 도입된 트랜스유전자를 거쳐 높은 수준의 TS를 발현하는 섬유육종 종양 세포계이다. 이들 분석에 사용된 정상 세포계는 CCD18co (정상 결장 상피) 및 Det551 (정상 피부)를 포함한다.
표 5 및 6 양자의 데이타는 포스포라미데이트 및 뉴클레오시드로서 가장 활성인 화합물을 나타낸다. 한가지 예외는 포스포라미데이트로서의 활성은 거의 검출되지 않지만, 뉴클레오시드(NB 1025w)로서는 활성 NB 1026TM이다. 이러한 결과는 Nib1026가 NB1011와 유사하게 활성화되지 않는다는 것을 나타낸다. 문헌은 BVdU와 같이 5-치환된 화합물이 바이러스성 티미딘 키나아제를 발현하지 않으면, 인간 세포에 의해 효과적으로 모노포스포릴레이트되지 않음을 교시하므로, 뉴클레오시드, 특히 BVdU, NB 1020TM (ClVdU) 및 NB1024TM의 세포 독성 결과는 놀랍다. Balzarini, J. 외. (1985) 및 De Clerq, E. 외. (1997) 참조. 이들 저자들은 포진바이러스-코드화된 TK에 의해 일단 포스포릴레이트된 5-치환된 뉴클레오티드 유도체가 TS 효소와 결합하고 그것과 상호작용할 수 있음을 제안하였다. 표 4-6 에서의 결과는 처음으로, 최소한 일부 종양 세포가 BVdU와 유사하게 5-치환된 우리딘 분자를 포스포릴레이트할 수 있는 이상(unusual) 티미딘 키나아제 활성을 가질 수 있다는 것을 보여주고, 그안에 다른 뉴클레오시드를 나타낸다.
대체예로서, 어떤 종양 세포는 특이하게 높은 양을 갖거나, 또는 정상 TK 효소를 생성하여(Suki, S. 외. (1995); 및 Romain, S. 외. (1995)), 낮지만, 그들에 대응하는 모노포스페이트에 대한 뉴클레오시드의 충분한 활성을 이끌어낸다.
위에서 시험한 바와 같이 화합물 Nib1024은 2개의 이성질체의혼합물로 구성된다. 5- (4-브로모-lE, 3E-부타디에닐)-2'-데옥시우리딘 (VIIa), (이성질체 2), 및 5- (4-브로모- lE, 3Z-부타디에닐)-2'-데옥시우리딘 (VIIb), (이성질체 1). 이들 두 화합물은 상기된 바와 같이(실시예 12) 이동 상으로서 물에서 20% 아세토니트릴을 사용하여 반-예비 HPLC (역상 C18 칼럼) 에 의해 분리되었다. 각각의 분리된 화합물이 세포 분아 증식을 막는 능력은 그후 크리스탈 바이올렛 과정에 의해 결정되었다. 결과는 표 7에 나타낸다. 2가지 이성질체는 E 이성질체와 비교하여 상당히 더 큰 성장방해 활성을 보이는 Z 이성질체와 현저하게 다른 활성을 보인다.
첫번째 두 세포계, TS HT1080 #12 및 MCF7TDX는 높은 수준의 TS를 발현하는 반면, 다른 두개,CCDISco 및 Det551는 정상 세포들이다.
본 발명이 자세하게 그리고 그것의 특정한 구체예에 관련되어 설명되었지만, 발명의 정신과 범위를 벗어나지 않으면, 그 안에 다양한 변형과 수정이 있을 수 있다는 것이 당업자들에게는 명백할 것이다.
참고문헌

Claims (52)

  1. 다음 구조:
    를 갖는 화합물 또는 그들의 호변이성질체.
    (여기에서 R12또는 R13은 같거나 다를수 있으며, 옥소, OH 또는 NHNH2로 구성되는 군으로 부터 선택되며;
    a가 0 또는 1이라면,
    a가 0이고 R13이 옥소일때는 3과 4 사이의 위치에 이중결합이 존재하고 R12는 NHNH2이며, 또는
    a가 0이고 R12이 옥소이라면 2와 3사이의 위치에 이중결합이 존재하고 R13은 NHNH2이며; 또는
    a가 1이면, R12와 R13은 모두 옥소이고;
    R1은 다음의 화학식을 갖는 치환체이며:
    여기에서 R2와 R3는 독립적으로 불포화 또는 포화 히드로카르빌기이며;
    여기에서 n은 0 또는 1 내지 10의 정수이며, m은 0 또는 1이고; 그리고
    여기에서 R4는 F, Cl, Br, I, CN, S03H, CO2H, CO2CH2CH3, C02CH3, SI(CH3)3, CHO, NO2, CF3, CCl3, CH=C(R15)2또는 다음의 구조를 갖는 치환체로 구성되는 군으로부터 선택되고:
    여기에서 Xa와 Xb는 독립적으로 같거나 다르며, Cl, Br, I 그리고 효능있는 이탈기로 구성되는 군으로 부터 선택되고;
    여기에서 Ya, Yb또는 Yc는 독립적으로 같거나 다르며, H 또는 F이고;
    여기에서 Z, Za그리고 Zb는 독립적으로 같거나 다르며, O 또는 S로 구성되는군으로 부터 선택되며; 그리고
    여기에서 Rl4는 H 또는 F이며, R14가 F라면, a는 1이며, Rl2와 R13은 모두 옥소이며;그리고
    여기에서 Q는 당, 카르보시클릭 그리고 아실 화합물로 구성되는 군으로 부터 선택되며, 또는 그들의 차폐된 포스페이트 유도체 또는 포스포라미데이트 유도체이다.)
  2. 제 1 항에 있어서, Q가 다음 구조:
    를 갖는 치환체의 군으로 부터 선택되는 것을 특징으로 하는 화합물.
    (여기에서 각각의 Ra그리고 Rb는 독립적으로 같거나 다르며, Br, Cl, F, I, H, OH, OC(=O)CH3 그리고 보호 히드록실기로 구성되는 군으로 부터 선택되며; 그리고,
    R7은 Q의 5'위치에서 Q에 부착되며, H, 포스페이트기, 포스포디에스테르기 또는 포스포라미데이트기로 구성되는 군으로 부터 선택되며; 그리고
    여기에서, 화합물은 D-형태, L-형태, a-아노머 형태 그리고 p-아노머 형태를 포함하는 거울상이성질체, 부분입체이성질체 또는 입체이성질체 형태로 있을 수 있다.)
  3. 제 2 항에 있어서, Q가
    인 것을 특징으로 하는 화합물.
  4. 제 1 항에 있어서, m이 0이며, R2가
    으로 구성되는 군으로 부터 선택되는 것을 특징으로 하는 화합물.
    (여기에서 R5는 독립적으로 같거나 다르며, 직쇄 또는 분지쇄의 탄소수 1 내지 10의 알킬기, 탄소수 3 내지 10의 시클로알킬기, CN 그리고 할로겐으로 구성되는 군으로부터 선택된다)
  5. 제 1 항에 있어서, R2와 R3가 함께 알케닐 또는 알키닐이며,
    으로 구성되는 군으로 부터 선택되는 것을 특징으로 하는 화합물.
  6. 제 1 항에 있어서, m이 0이며, R2가
    으로 구성되는 군으로부터 선택되는 방향족 히드로카르빌기인 것을 특징으로하는 화합물.
  7. 제 1 항에 있어서, m이 0이며, R2가
    으로 구성되는 군으로 부터 선택되는 헤테로방향족기인 것을 특징으로 하는 화합물.
    (여기에서 J는 -O-, -S-, -Se-, -NH- 그리고 NRALK-로 구성되는 군으로 부터 선택되며, 여기에서 RALK은 직쇄 또는 분지쇄의 탄소수 1 내지 10의 알킬 또는 탄소수 3 내지 10의 시클로알킬기이다)
  8. 제 2 항에 있어서, R7이
    인 것을 특징으로 하는 화합물.
  9. 제 2 항에 있어서, R7이
    인 것을 특징으로 하는 화합물.
  10. 제 2 항에 있어서, R7이
    으로 구성되는 군으로 부터 선택되는 것을 특징으로 하는 화합물.
  11. 제 2 항에 있어서, R7이
    또는
    의 구조를 갖는 화합물로 구성되는 군으로 부터 선택되는 것을 특징으로 하는 화합물.
    (여기에서 Rd는 방향족 치환체이다)
  12. 제 1 항에 있어서, R4가
    로 구성되는 군으로 부터 선택되는 것을 특징으로 하는 화합물.
  13. 다음 구조:
    를 갖는 화합물 또는 그들의 뉴클레오시드 유사체.
    (여기에서, Xd그리고 Xe는 독립적으로 같거나 다르며, Cl, Br, I 그리고 CN으로 구성되는 군으로 부터 선택된다)
  14. 제 13 항에 있어서, Xd가 Cl 또는 Br이며, Xe가 H인 것을 특징으로 하는 화합물.
  15. 다음 구조:
    를 갖는 화합물 또는 그들의 뉴클레오시드 유사체.
    (여기에서, Xf그리고 Xg는 독립적으로 같거나 다르며, Cl, Br, I 그리고 CN으로 구성되는 군으로 부터 선택된다)
  16. 제 15 항에 있어서, Xf와 Xg가 같으며, 각각 Cl 또는 Br인 것을 특징으로 하는 화합물.
  17. 다음 구조:
    를 갖는 화합물 또는 그들의 뉴클레오시드 유사체.
    (여기에서, X는 Cl, Br, I 그리고 CN으로 구성되는 군으로 부터 선택된다)
  18. 제 17 항에 있어서, X가 Cl 또는 Br인 것을 특징으로 하는 화합물.
  19. 제 18 항에 있어서, X가 Br인 것을 특징으로 하는 화합물.
  20. 다음 구조:
    를 갖는 화합물 또는 그들의 뉴클레오시드 유사체.
    (여기에서, R8은 저급 직쇄 또는 분지쇄 알킬이다)
  21. 다음 구조:
    를 갖는 화합물 또는 그들의 뉴클레오시드 유사체.
    (여기에서, R8그리고 R9은 저급 직쇄 또는 분지쇄 알킬이며, R10은 H 또는 CH3이다)
  22. 다음 구조:
    를 갖는 화합물 또는 그들의 뉴클레오시드 유사체.
    (여기에서, R10은 H 또는 CH3이다)
  23. 다음 구조:
    를 갖는 화합물.
  24. 다음 구조:
    를 갖는 화합물 또는 그들의 뉴클레오시드 유사체.
  25. 제 1 항에 있어서, 화합물이 다음 구조:
    를 갖는 것을 특징으로 하는 화합물.
  26. 제 25 항에 있어서, R7이 H인 것을 특징으로 하는 화합물.
  27. 제 25 항에 있어서, R7이
    의 구조를 갖는 치환체인 것을 특징으로 하는 화합물.
  28. 제 1 항에 있어서, 화합물이 다음 구조:
    를 갖는 것을 특징으로 하는 화합물.
  29. 제 28 항에 있어서, R7이 H인 것을 특징으로 하는 화합물.
  30. 제 28 항에 있어서, R7이
    의 구조를 갖는 치환체인 것을 특징으로 하는 화합물.
  31. 다음 구조:
    를 갖는 화합물.
  32. 다음 구조:
    를 갖는 화합물 또는 그들의 뉴클레오시드 유사체.
    (여기에서, X는 CO2Et, Cl, 그리고 Br로 구성되는 군으로 부터 선택된다)
  33. 다음 구조:
    를 갖는 화합물 또는 그들의 뉴클레오시드 유사체.
  34. 다음 구조:
    를 갖는 화합물 또는 그들의 뉴클레오시드 유사체.
  35. 제 1 항 내지 제 34 항의 화합물과 담체를 포함하는 조성물.
  36. 제 35 항에 있어서, 담체가 제제약학적으로 허용가능한 담체인 것을 특징으로 하는 조성물.
  37. (a)표적 세포를 함유하는 샘플을 제 13 항 내지 제 34 항의 화합물 중 어느 하나와 접촉시키는 단계;
    (b)별개의 표적 세포의 샘플을 효능있는 치료제와 접촉시키는 단계; 그리고
    (c)세포 증식 억제 또는 세포를 죽이는 것에 대해 샘플들을 비교하는 단계,
    을 포함하는 것을 특징으로 하는 치료제 스크리닝 방법.
  38. 제 37 항에 있어서, 표적 세포가 화학치료 약물에 내성인 것을 특징으로 하는 방법.
  39. 제 37 항에 있어서, 표적 세포가 화학요법에 의해 생체내 선택의 결과로서 증폭된 표적 효소를 발현하는 것을 특징으로 하는 방법.
  40. 제 37 항에 있어서, 표적 효소가 표적 세포에서 과발현되는 내인성 세포내 효소인 것을 특징으로 하는 방법.
  41. 병적 세포의 증식을 치료 또는 억제를 위한 약제의 제조에 제 13 항 내지 제 34 항의 화합물중 어느 하나의 사용.
  42. 세포를 제 13 항 내지 제 34 항의 화합물중 어느 하나의 유효양과 접촉시키는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 병적 세포 증식 억제 방법.
  43. 제 42 항에 있어서, 병적 세포가 화학치료 약물에 내성인 것을 특징으로 하는 방법.
  44. 제 42 항에 있어서, 병적 세포가 화학요법에 의해 생체내 선택의 결과로서 증폭되는 표적 효소를 발현하는 것을 특징으로 하는 방법.
  45. 제 44 항에 있어서, 표적 효소가 표적 세포에서 과발현되는 내인성 세포내 효소인 것을 특징으로 하는 방법.
  46. 제 45 항에 있어서, 효소가 티미딜레이트 신타아제인 것을 특징으로 하는 방법.
  47. 제 13 항 내지 제 44 항의 화합물중 어느 하나를 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 표적 세포의 증식을 특징으로 하는 병 치료 방법.
  48. 제 47 항에 있어서, 표적 세포가 화학요법 약물에 내성인 것을 특징으로 하는 방법.
  49. 제 47 항에 있어서, 표적 세포가 화학요법에 의해 생체내 선택의 결과로서 증폭되는 효소를 과발현하는 것을 특징으로 하는 방법.
  50. 제 49 항에 있어서, 표적 효소가 표적 세포에서 과발현되는 내인성 세포내 효소인 것을 특징으로 하는 방법.
  51. 제 50 항에 있어서, 효소가 티미딜레이트 신타아제인것을 특징으로 하는 방법.
  52. 제 48 항에 있어서, 선행 화학요법에 대한 내성이 역전된 후에, 세포를 선행 화학요법에 접촉시키는것을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
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Families Citing this family (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9708611D0 (en) * 1997-04-28 1997-06-18 Univ Cardiff Chemical compounds
US6703374B1 (en) 1997-10-30 2004-03-09 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Nucleosides for imaging and treatment applications
CN1192102C (zh) * 1998-01-23 2005-03-09 新生物生物公司 酶催化的治疗剂
US7462605B2 (en) 1998-01-23 2008-12-09 Celmed Oncology (Usa), Inc. Phosphoramidate compounds and methods of use
JP2003525866A (ja) * 1999-07-22 2003-09-02 ニューバイオティックス インコーポレイテッド 治療抵抗性腫瘍を処置するための方法
US6683061B1 (en) * 1999-07-22 2004-01-27 Newbiotics, Inc. Enzyme catalyzed therapeutic activation
GB0009486D0 (en) 2000-04-17 2000-06-07 Univ Cardiff Chemical compounds
WO2002007780A2 (en) * 2000-07-20 2002-01-31 Newbiotics, Inc. Methods for identifying therapeutic targets
US7138388B2 (en) 2001-01-19 2006-11-21 Celmed Oncology (Usa), Inc. Methods to treat autoimmune and inflammatory conditions
WO2002089739A2 (en) 2001-05-09 2002-11-14 Newbiotics, Inc. Peptide deformylase activated prodrugs
EP1585751A4 (en) 2002-11-14 2008-08-13 Celmed Oncology Usa Inc PEPTIDE DEFORMYLASE-ACTIVATED PRODRUGS
CA2536357A1 (en) 2003-05-29 2004-12-23 The Scripps Research Institute Targeted delivery to legumain-expressing cells
GB0317009D0 (en) 2003-07-21 2003-08-27 Univ Cardiff Chemical compounds
US8399428B2 (en) * 2004-12-09 2013-03-19 Regents Of The University Of Minnesota Nucleosides with antiviral and anticancer activity
GB0609178D0 (en) 2006-05-09 2006-06-21 Univ Cardiff Novel compounds
US7964580B2 (en) 2007-03-30 2011-06-21 Pharmasset, Inc. Nucleoside phosphoramidate prodrugs
DE102008030091B4 (de) 2008-06-25 2011-03-03 Resprotect Gmbh Uracilderivate und deren Verwendung
SG192841A1 (en) 2011-03-01 2013-09-30 Nucana Biomed Ltd Phosphoramidate derivatives of 5 - fluoro - 2 ' - deoxyuridine for use in the treatment of cancer
MD4589C1 (ro) 2011-09-16 2019-03-31 Gilead Pharmasset Llc Compoziţie farmaceutică cu conţinut de sofosbuvir şi utilizarea acesteia în tratamentul hepatitei virale C
US8492386B2 (en) 2011-10-21 2013-07-23 Abbvie Inc. Methods for treating HCV
GB2515942A (en) 2011-10-21 2015-01-07 Abbvie Inc Combination treatment (e.g. with ABT-072 or ABT-333) of DAAs for use in treating HCV
US8853176B2 (en) 2011-10-21 2014-10-07 Abbvie Inc. Methods for treating HCV
US8466159B2 (en) 2011-10-21 2013-06-18 Abbvie Inc. Methods for treating HCV
NZ625087A (en) 2013-01-31 2017-05-26 Gilead Pharmasset Llc Combination formulation of two antiviral compounds
ES2900570T3 (es) 2013-08-27 2022-03-17 Gilead Pharmasset Llc Formulación de combinación de dos compuestos antivirales
TWI695718B (zh) 2014-06-25 2020-06-11 英商努卡那公眾有限公司 前藥
TWI674097B (zh) 2014-06-25 2019-10-11 英商努卡那公眾有限公司 磷酸酯衍生物之調配物
BR112018009946A8 (pt) * 2015-11-16 2019-02-26 Ichorion Therapeutics Inc pró-fármacos de ácido nucleico
WO2017189978A1 (en) 2016-04-28 2017-11-02 Emory University Alkyne containing nucleotide and nucleoside therapeutic compositions and uses related thereto
CN108148098B (zh) * 2018-02-08 2020-10-27 南通大学 靶向癌细胞高水平ros的吉西他滨-芳香氮芥缀合物及其制备方法和医药用途

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU9016998A (en) * 1997-08-08 1999-03-01 Newbiotics, Inc. Methods and compositions for overcoming resistance to biologic and chemotherapy
AU758426B2 (en) * 1997-10-30 2003-03-20 Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The Nucleosides for imaging and treatment applications
CN1192102C (zh) * 1998-01-23 2005-03-09 新生物生物公司 酶催化的治疗剂

Also Published As

Publication number Publication date
JP2003505466A (ja) 2003-02-12
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