CN1390227A - 酶催化的治疗活化 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了新型底物化合物,它们选择性地抑制病理细胞的增殖,所述病理细胞例如是内源性地超量表达赋予生物作用剂和化疗剂抗性的靶酶。所述酶作用于底物化合物从而:1)将它转化为细胞毒素和/或2)释放毒性副产物。在一个实施方案中,靶细胞中靶酶的活性大为增强了,是由于肿瘤抑制因子作用的丧失和/或因以前接触化疗而引起的选择性丧失的缘故。在另一个实施方案中,病理细胞包含靶酶,该靶酶是细胞中的感染剂的表达产物。本发明进一步提供了一种治疗受治疗者的方法,该方法通过对受治疗者送递本文描述的前体药物。本发明的前体药物可单独用或者与其它化疗药物或备选的抗癌疗法(例如,放射)结合。

Description

酶催化的治疗活化
                   相关申请的相互参照
本申请按照35 U.S.C.§119(e)要求享有下列美国临时申请的优先权：分别于1999年7月22日；1999年7月23日和2000年3月21日提交的U.S.系列号：60/145,356；60/145,437和60/191,315，将它们的内容并入本文作参考。
                      技术领域
本发明涉及药物发现领域，具体地说，涉及前体药物的设计，所述前体药物是在病理细胞中超量表达的内源性胞内酶的底物。
                     发明背景
在本申请中，各份出版物都注明第一作者和日期，专利号或公布号。各参考文献的文献目录出处可见于本说明中或本申请末尾(就在权利要求书的前面)。这些出版物的公开内容都并入本文作参考从而更详细地描述本发明涉及的领域状况。
癌症是一种全世界最常见的致命的疾病。用抗癌药物的治疗是一种日益重要的选择，尤其对于手术已不能治愈的***性恶性肿瘤或转移癌。遗憾的是，现在能治愈的人癌种类的亚型仍相当少(Haskell，C.M.(1995))，导致每年约600,000人死亡。参见，Cancer Facts&Figures，1999 American Cancer Society。能治愈人癌的药物的开发进展缓慢，成功限于少数几种血液恶性肿瘤和更少的几种实体瘤(Dorr和Van Hoff(1994))。寻找基于疾病机制的疗法的进展为未来的成功提供机会(Cobleigh，M.A.等(1999)；以及Roth，J.A.等(1999))。
恶性肿瘤的异质性相对于它们的遗传学、生物学和生物化学以及原发的或治疗引起的对治疗的抗性减轻治愈性治疗作用。此外，很多抗癌药物只表现低程度的选择性，常常引起严重的或甚至危及生命的毒性副作用，于是阻止高到足以杀伤全部癌细胞的剂量的应用。因此，探寻具有改良的对治疗抗性病理、恶性细胞的选择性的抗肿瘤剂仍然是药物开发的中心任务。
癌细胞的特征在于：不可控制的生长、去分化和遗传不稳定性。不稳定性表达自身为异常的染色体数，染色体缺失、重排、损失或正常二倍体数以外的复制(Wilson，J.D.等(1991))。这种基因组不稳定性可能由几个因素引起。最特性化的一个是增强的基因组可塑性，它是在失去肿瘤抑制基因功能时出现的(例如，Almasan，A.等(1995a)和Almasan，A.等(1995b))。基因组可塑性有助于肿瘤细胞对改变的环境的适应性，从而允许更频繁的突变，基因的扩增，以及染色体外因子的形成(Smith，K.A.等(1995)和Wilson，J.D.等(1991))。这些特征提供导致更具进攻性的恶性肿瘤的机制，因为它能使肿瘤迅速产生对自然宿主防御机制、生物治疗的抗性(参见Wilson，J.D.等(1991)和Shepard，H.M.等(1988))，以及对化疗的抗性(参见Almasan，A.等(1995a)和Almasan，A.等(1995b))。
此外，化疗剂的临床适用性可能严重受抗药物的恶性细胞出现的限制。一些细胞机制可能涉及抗药性，例如，改变药物的代谢，细胞对活性化合物的不渗透性或加速从细胞消除药物，改变抑制酶的特异性，增大靶分子的生产，增强细胞毒性损伤的修复，或者通过可选的生化途径设置抑制反应的旁路。在某些情况下，对一种药物的抗性可能赋予对其它生化上不同的药物的抗性。对癌化疗的抗性的备选机制经由肿瘤抑制基因的功能损失而出现。这些中最佳特性化的是p53、RB和p16(Funk，J.O.1999；以及Teh，B.T.(1999))。这些基因产品的功能损失导致通常被抗癌药物靶向的酶(例如，5-氟尿苷酰(“5FU”)/胸苷酸合酶和氨甲蝶呤/二氢叶酸还原酶)的表达抑制(Lee，V.等(1997)；Lenz，H.J.等(1998)；以及Fan，J.和Bertino，J.(1987))。某些基因的扩增涉及对生物治疗和化疗的抗性。编码二氢叶酸还原酶的基因的扩增涉及对氨甲蝶呤的抗性，而编码胸苷酸合酶的基因的超量表达/扩增则涉及对5-氟嘧啶治疗的抗性(Smith，K.A.等(1995))。表1归纳了抗生物治疗和化疗的重要的酶。
                              表1
                 在癌化疗抗性中超量表达的酶
    酶 生物治疗或化疗                  参考(实例)
    胸苷酸合酶 基于尿嘧啶基于叶酸基于喹唑啉 L_nn，U.等(1 996)Kobayashi，H.等(1995)Jackman，A.L.等(1995a)
    二氢叶酸还原酶 基于叶酸的 Banerjee，D.等(1995)Bertino，J.R.等(1996)
    酪氨酸激酶 TNF-α多抗药性 Hudziak，R.M.等(1988)Stühlinger，M.等(1994)
    MDR-相关的蛋白质(ABCP-gp蛋白质) 多抗药性 Simon，S.M.和Schindler，M(1994)Gottesman，M.M.等(1995)
    CAD* RALLA** Smith，K.A.等(1995)Dorr，R.T.和Von Hoff，D.D编辑(1994)
    拓扑异构酶I(Colon&ProstateCancers) 喜树碱 Husain等(1994)
    核糖核苷酸还原酶 羟基脲 Wettergren，Y.等(1994)Yen，Y.等(1994)
*CAD＝氨甲酰-P合酶，天冬氨酸转氨甲酰酶，二氢乳清酸酶**PALA＝N-(磷酸乙酰)-L-天冬氨酸
很久以前，人们就认识到抗癌剂的差选择性，进行了很多尝试以改善选择性和允许施用更大的剂量。一种方法是前体药物的开发。前体药物是毒理上良性的但在体内可被转化为治疗活性产物的化合物。在某些情况下，通过被抗体送递到靶细胞的非内源性酶的作用(“ADEPT”或抗体依赖性酶前体药物疗法(美国专利No.4,975,278))或基因导向的作用(“GDEPT”或基因依赖性酶前体药物疗法(Melton，R.G.和Sherwood，R.E.(1996))发生活化。这些技术就它们退出血液和渗入肿瘤的能力来说具有严格的限制。参见，Connors，T.A.和Knox，R.J.(1995)。
作为抗肿瘤剂和抗病毒剂开发和测试了一些核苷酸和核苷类似物。例如，5-氟尿嘧啶(5FU)和5-氟脱氧尿苷(5FUdR)已被广泛用作化疗剂，基于它们的在胞内被转化为胸苷酸合酶(TS)的抑制剂的能力。至于很多其它的酶抑制性化疗剂，应用5FU的癌疗法通常导致攻击性抗药肿瘤细胞(它们难于用这种药进一步治疗)的选择。(Aschele，C.等(1994)；Mader，R.M.等(1998)；L_nn，U.等(1996)；Paradiso，A.等(2000)；以及Edler，D.等(2000))。
已经特别关注卤化核苷类似物，例如，(E)-5-(2-溴乙烯基)-2′-脱氧尿苷(BVdU)。这些类别的化合物原来是作为抗病毒剂开发的，基于这一观察结果，即，它们需要磷酸化成一磷酸核苷酸的形式以便激发出细胞毒性响应，而这种磷酸化作用优选通过疱疹病毒胸苷激酶(TK)来完成。BVdU和相关化合物一致显示对正常哺乳动物细胞有限的毒性，而它们在杀伤病毒感染的细胞方面都有效(DeClerq，E等(1997))。
在核苷类似物(例如，作为抗病毒剂和抗癌剂的BVDU)的广泛测试中，一致报导它们对正常细胞和癌细胞具有最小毒性。阐明这些化合物通过病毒胸苷激酶优先磷酸化的结果支持了这些观察结果，它解释了这些化合物对哺乳动物细胞的低毒性。所以，还没有作为抗癌治疗剂开发BVdU和相关的核苷类似物(DeClerq，E等(1997))。
                        发明公开
本发明提供了新型化合物，它们选择性地抑制病理细胞的增殖，所述病理细胞例如是内源性地超量表达一种赋予对生物作用剂和化疗剂抗性的靶酶。所述酶作用于本发明的前体药物化合物从而：1)将它转化为细胞毒素和/或2)释放毒性副产物。在本发明另一方面，与抗性酶初始反应的产物接着被常规细胞酶(例如，酰基转移酶、磷酸酶或其它“管家”酶)(Voet等(1995))或常规细胞成分(例如，水)充分活化而从前体药物释放毒性副产物。
在一个实施方案中，靶细胞中靶酶的活性大为增强了，是由于肿瘤抑制因子作用的丧失和/或因以前接触化疗而引起的选择性丧失的缘故。在另一个实施方案中，病理细胞包含靶酶(它是细胞中的感染剂的表达产物)。该表达产物能赋予抗生素抗性。
本发明另一方面包括筛选可被靶酶活化的新前体药物的检测。本发明还提供了进行这样的检测的试剂盒，它们盛有完成检测和分析结果所需的试剂和说明书。
本发明进一步提供了一种通过对受治疗者送递本文描述的前体药物而治疗受治疗者的方法。本发明的前体药物可单独用或者与其它化疗药物或备选的抗癌疗法(例如，放射)结合。
本发明又一方面是药剂的制备，所述药剂被用于治疗患有以表达靶酶的细胞为特征的病理的受治疗者。
本发明又一方面是一种鉴定患者的最适疗法的方法，即，通过分离表达靶酶的细胞，将该细胞与至少一种本发明的前体药物接触，然后鉴别哪一种或多种前体药物抑制增殖或杀伤所述细胞，于是鉴定受治疗者的最适疗法。
本发明的前体药物具有如下结构：或其互变异构体；其中，R12或R13可以相同或不同并且选自下组：氧代，OH或NHNH2；其中，如果a是0或1，假定：如果a是0，而且R13是氧代，那么，在位置3和4之间存在一个双键，并且R12是NHNH2；或者
如果a是0，而且R12是氧代，那么，在位置2和3之间存在一个双键，并且R13是NHNH2；或者
如果a是1，那么，R12和R13都是氧代；
其中，R1是具有下式的取代基：
Figure A0081207300211
其中，R2和R3独自是不饱和的或饱和的烃基；
其中，n是0或1～10的整数，而m则是0或1；以及
其中，R4选自下组：F，Cl，Br，I，CN，SO3H，CO2H，CO2CH2CH3，CO2CH3，SI(CH3)3，CHO，NO2，CF3，CCl3，
CH＝C(R15)2或具有如下结构的取代基：
Figure A0081207300212
Figure A0081207300221
其中，Xa和Xb独自相同或不同并且选自下组：Cl，Br，I，以及有效的离去基；
其中，Ya、Yb或Yc独自相同或不同，它们是H或F；
其中，Z、Za和Zb独自相同或不同，它们是O或S；以及
其中，R14是H或F，假定，如果R14是F，那么，a是1，而且R12和R13都是氧代；以及
其中，Q选自下组物质：糖，碳环，以及无环的化合物，或者掩蔽的磷酸酯衍生物或其氨基磷酸酯衍生物。
                    对图的简要描述
在图1A和1B中应用胸苷酸合酶和化合物NB1011TM的实例图示了本文描述的概念。图1A中示出了肿瘤细胞中如何更高水平的TS可导致优先产生毒素。图1B中示出了NB1011TM至BVdUMP的转化，接着与TS相互作用而产生核苷酸毒素。
图2A和2B是阐释本发明的高流通量筛选的流程图。
图3A示出了各种人组织中的相对TS水平。图3B示出了正常组织和人结肠肿瘤组织之间平均TS mRNA水平的比较。
图4示出了本发明的呋喃并[2，3-d]嘧啶酮核苷的合成示意图。下文详细描述了合成方案。
                   实施本发明的方式
除非另外说明，本发明的实施将应用常规分子生物学、微生物学、细胞生物学、有机化学、药物化学和重组DNA的技术，这些技术属于本领域技术范围。参见例如，Sambrook等，分子克隆：实验指南(MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL)，第2版(1989)；分子生物学中的现有方案(CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY)，F.M.Ausubel等编辑，(1987)；酶学中的方法(METHODS IN ENZYMOLOGY)系列，Academic Press，Inc.；PCR 2：一种实际方法(A PRACTICALAPPROACH)，M.J.MacPherson等编辑(1995)；Spector，D.L.等(1998)细胞：实验指南(CELLS：A LABORATORY MANUAL)，Vols I～III，ColdSpring Harbor Press；以及动物细胞培养(ANIMAL CELL CULTURE)，R.I.Freshney编辑(1987)。
本说明书和权利要求书中应用的单数形式的“一个”和“该”包括复数参考物(除非文中另外清楚地叙述)。例如，术语“一个细胞”包括很多细胞，包括它们的混合物。
本文应用的术语“包括”旨在表示组合物和方法包括引用的因素，但不排除其它因素。当用于定义组合物和方法时，“基本上由...构成”应当表示排除任何对组合有重要意义的其它因素。所以，一种基本上包括本文定义的因素的组合物并不排除分离和纯化方法中得到的痕量污染物和药物上可接受的载体，例如，磷酸盐缓冲盐水、防腐剂等。“由...构成”应当表示排除比痕量成分更多的其它组分和施用本发明组合物的基本方法步骤。由这些过渡术语的每一个定义的实施方案应属于本发明的范围。
术语“超量表达”应当表示是常规水平或者从正常细胞或非病理细胞测定的水平的至少2倍、优选3倍、更优选4倍和最优选5倍或更多的表达。
“组合物”旨在表示活性剂和其它惰性(例如，可检测的作用剂或标记)的或活泼的化合物或成分(例如，辅助剂)的组合。
“药物组合物”旨在包括活性剂与惰性或活泼的载体的组合，使组合物适合体外、体内或离体的诊断或治疗应用。
本文应用的术语“药物上可接受的载体”包括任何标准药物载体(例如，磷酸盐缓冲盐水溶液)，水，乳液(例如，油/水或水/油乳液)，以及各种湿润剂。所述组合物还可包含稳定剂和防腐剂。载体、稳定剂和辅助剂的实例可参见：Martin REMINGTON′S PHARM.SCI.，第15版(Mack Publ Co.，Easton(1975))。
“有效量”是足以达到有益的或所需的结果的量。有效量可在一次或多次施药、敷用或剂量中施用。
“靶”细胞或“病理”细胞包括去分化的、无限增殖化的、肿瘤性转化的、恶性的、转移的或转化的过度增殖细胞。实例包括但不限于：癌细胞，例如，肉瘤细胞、白血病细胞、癌细胞或腺癌细胞。具体的癌包括但不限于：乳腺癌细胞、肝细胞癌细胞、肝癌细胞、胰腺癌细胞、食管癌细胞、膀胱癌细胞、胃肠道癌细胞、卵巢癌细胞、皮肤癌细胞、***癌细胞和胃癌细胞。
靶细胞或病理细胞超量表达这样的胞内酶，即，涉及肿瘤抑制基因产物功能的丧失、抗药性或遗传不稳定性中的任一项。对一种药物的抗性也可赋予对其它生化性质不同的药物的抗性。与旨在产生更多有效的内源性胞内酶的抑制剂的现有技术疗法不同，本发明利用与治疗抗性疾病细胞和组织(与正常细胞和组织相比)相关的更高酶活性并且不依赖于抑制所述酶。术语“靶酶”被用于本文而定义具有一个或多个上述特征的酶。
活化的或超量表达的和涉及抗药性的基因产物包括但不限于：胸苷酸合酶(TS)(L_nn，U等(1996)；Kobayashi，H.等(1995)；以及Jackman，A.L.等(1995b))，二氢叶酸还原酶(Banerjee，D.等(1995)和Bertino，J.R.等(1996))，酪氨酸激酶(TNF-α，Hudziak，R.M.等(1988))以及多抗药性(Stülinger，M.等(1994))；Akdas，A.等(1996)；和(Tannock，I.F.(1996))；以及ATP-依赖性多抗药性相关的蛋白质(Simon，S.M.和Schindler，M.(1994))，并且在某些情况下包括结肠癌和***癌，拓扑异构酶I(Husain等(1994))。
二氢叶酸还原酶(DHFR)的扩增涉及对氨甲蝶呤的抗性，而编码胸苷酸合酶的基因的扩增则涉及对用5-氟嘧啶***的抗性。与抗药性相关的基因的扩增可通过修饰的聚合酶链反应(PCR)[如Kashini-Sabet等(1988)，美国专利5,085,983中所述]或者通过本文描述的方法来检测和监控。后天的抗药性可通过细胞遗传异常(例如，均匀染色体染色区和双微体染色体，它们都与基因扩增相关)的检测来监控。备选的测定法包括：直接的或间接的酶活性测定，它们的每一种都与基因扩增相关(例如，Carreras和Santi(1995))；其它方法(例如，聚合酶链反应，Houze，T.A.等(1997)或者免疫组织化学(Johnson，P.G.等(1997))。
已证实在某些人肿瘤中，酶谷胱甘肽-S-转移酶偶尔升高(Morgan，A.S.等(1998))，但还是不包括于本文应用的“靶酶”中，因为它是编码具有重叠特异性的酶的基因家族中的一员。
总之，本发明的前体药物基于如下事实而区别于常规治疗剂，即，本发明的靶酶通常在病理细胞(与正常细胞相比)中被超量表达、过度积聚或活化。区别本发明与其它方法的最重要原则是：
(1)本发明描述了关于酶(例如胸苷酸合酶)的底物的合成。超量表达的酶会将前体药物转化为毒素(优先在疾病细胞中)。以前的方法大多数依赖于这些酶的抑制剂。抑制剂导致酶的扩增表达，随后造成对治疗的抗性(参见例如，L_nn，U等(1996)；Paradiso，A.等(2000)；以及Edler，D.(2000))。
(2)现有方法还与其它“底物-前体药物”方法有别，例如，谷胱甘肽-S-转移酶(参见例如，Morgan，A.S.等(1998))。GST家族的酶以升高的水平响应对细胞的毒性损伤被表达。GST家族的酶具有重叠的底物特异性，这使得难于设计仅仅与在癌细胞中增量表达的一种酶反应的底物(Morgan，A.S.等(1998))。由于本发明的靶酶(例如，胸苷酸合酶、二氢叶酸还原酶和胸苷激酶)相对于它的结构和底物特异性来说是独特的，所以，容易设计独特的底物。下文提出了关于胸苷酸合酶的底物的数个实例。
(3)在某些情况下，编码靶酶(例如，胸苷酸合酶)的基因可能已经历了突变而给出对抑制剂的抗性(Barbour，K.W.等(1992)和Dicken，A.P.等(1993))但仍能与非抑制剂底物前体药物进行反应。
(4)这种方法的一个优点是，肿瘤抑制剂功能的丧失对于恶性肿瘤的恶化至关重要。大部分肿瘤细胞已失去了p53、RB或p16肿瘤抑制剂功能之一(Funk，J.O.(1999)；Banerjee，D.(1998)；以及Teh，B.T.等(1999))。这种损失导致抗性酶(例如，胸苷酸合酶)的表达增大，与以前接触化疗无关。本文描述的前体药物将适用于治疗早期恶性肿瘤，以及以前用化疗治疗的疾病。象GST这样的酶的底物包括很多与化疗无关的化合物(Whalen和Boyer(1998))。
在图1A和1B中应用胸苷酸合酶和化合物NB1011TM的实例图示了上文描述的概念。
在一个备选实施方案中，靶细胞通过它对与癌无关的药物或化合物的抗性而定义。在此情况下，用微生物感染的细胞赋予抗生素(例如，β-内酰胺酶)抗性。生物包括细菌、酵母和寄生虫(例如，锥虫)。表2列出了通过这种方法在传染病中靶向的酶。
                              表2在传染病中超量表达的酶，而且它们有助于抗药性
酶 提供对下列物质的增大的抗性：
β-内酰胺酶 青霉素和其它含β-内酰胺的抗生素
氨基糖苷酶、或氨基糖苷修饰酶 氨基糖苷抗生素(例如，链霉素、庆大霉素)
氯霉素转乙酰酶 氯霉素
二氢叶酸还原酶 三甲氧苄二氨嘧啶
参考文献：微生物疾病的机制(Mechanisms of Microbial Disease)，第2版，M.Schaechter，G.Medloff，B.I.Eisenstein，编辑TSSatterfield。Publ.Williams and Wilkins，p.973(1993)。
本发明的前体药物选自具有如下结构的化合物的L和D异构体：其中：
R1是下式的结构部分：
但须在化合物I中，n可以是0。
R2是选自下组的二价电子通道(conduit)部分：不饱和烃基；包括一个或多个不饱和烃基的芳烃基；以及包括一个或多个不饱和烃基的杂芳基；
R3选自下组基：
Figure A0081207300281
R5可以相同或不同，并且独自是：具有1～10个碳原子的直链烷基或支链烷基，或者具有3～10个碳原子的环烷基，或者卤素(例如，F，Cl，Br，I)；
或者基：
Figure A0081207300282
或者基：
Figure A0081207300283
其中，n是0或1～10的整数，而m则是0或1；其中，R4可以是选自下组的取代基：
Figure A0081207300291
Figure A0081207300301
其中，R8和R9都是低级烷基，而R10则是H或CH3，而且每个X取代基独自是相同或彼此不同的，它是-Cl，-Br，-I，或其它有效的离去基，但须，当R7是-H，而且m是0时，那么，R4不是卤素；或者当m是0而且n是0时，那么，R4不是卤素；
其中，每个Y取代基独自相同或彼此不同，它独自是-H或-F，而且每个Z取代基独自相同或彼此不同，它是-O-或-S-。
在一方面，m是0，而R2则是选自下组的芳烃基：在一备选方面，m是0，而R2则是选自下组的杂芳基：
其中，J选自下组：-O-，-S-，-Se-，-NH-，和-NRALK，而且其中，RALK是具有1～10个碳原子的直链或支链烷基或具有3～10个碳原子的环烷基。
在一特定方面，R4选自下组：
Q选自下组物质：糖，碳环，无环化合物及其掩蔽的磷酸酯或氨基磷酸酯衍生物。所述掩蔽的磷酸酯或氨基磷酸酯衍生物在化合物的5′位与Q连接(下文更详细示出)。例如，Q是选自下组的结构部分：
其中，每个R6独自是相同或彼此不同的，选自下组：-H，-OH，-OC(＝O)CH3，F，和其它被保护的羟基；以及
R7是氢，磷酸酯基，磷酸二酯基，或在5′位与Q连接的氨基磷酸酯基。
应懂得，虽然没有明确说明，但本发明的任何前体药物可以呈任意对映的、非对映的或立体异构的形式，包括D型、L型、α-端基异构形式和β-端基异构形式。
在一个实施方案中，R4是或包含选自下组的化学实体：-Br，-I，-O-烷基，-O-芳基，-O-杂芳基，-S-烷基，-S-芳基，-S-杂芳基，-CN，-OCN，-SCN，-NH2，-NH-烷基，-N(烷基)2，-NHCHO，-NHOH，-NHO-烷基，NH2CONHO-，NHNH2，-N3，以及顺式铂氨的衍生物，例如：在一个实施方案中，Q是：
Figure A0081207300322
其中，R7如上所述，或者更具体地是例如下式的结构：或是具有如下结构的化合物：
Figure A0081207300332
其中，Rd是芳族取代基。
在一个备选的实施方案中，R7是得自氨基酸(包括例如，二十种天然氨基酸)的氨基磷酸酯基。在一个实施方案中，R7是得自丙氨酸的氨基磷酸酯基。在一个实施方案中，R7是或含如下结构的基：
上述基及其制备方法被描述于McGuigan等(1993)和McGuigan等(1996)中。
本发明还提供了具有如下结构的化合物的L-或D-异构体：
Figure A0081207300341
或其互变异构体，其中，R1是具有下式的取代基：
Figure A0081207300342
其中，R2和R3相同或不同，独自是不饱和的或饱和的烃基；其中，R4选自下组：F，Cl，Br，I，CN，SO3H，CO2H，CO2CH2CH3，SI(CH3)3，CHO，NO2，CF3，CCl3，C(R5)2；其中，R5选自下组：F，Cl，Br，和I；其中，n是0或1～10的整数，而m则是0或1；并且Q如上述定义。
在一方面，m是0，而R2则选自下组：
Figure A0081207300343
其中，R5独自相同或不同并且选自下组：具有1～10个碳原子的直链烷基或支链烷基，具有3～10个碳原子的环烷基，CN和卤素。
在另一方面，R2和R3一起构成一个烯基或炔基，它选自下组基：在另一方面，m是0，而R2则是选自下组的芳烃基：
Figure A0081207300353
在又一方面，m是0，而R2则是选自下组的杂芳基：
其中，J选自下组：-O-，-S-，-Se-，-NH-，和-NRALK，而且其中，RALK是具有1～10个碳原子的直链或支链烷基或者具有3～10个碳原子的环烷基。
就这些实施方案来说，R7如上述定义。
在一个特定的实施方案中，R7是：
上述基及其制备方法被描述于Abraham等(1996)。
在一个实施方案中，R7是磷酸酯基或者是或包含具有选自下组的结构的基：
上述两个基的第一个及其制备方法被描述于Freed等(1989)；Sastry等(1992)；Farquhar等(1994)和Farquhar等(1995)。上述两个基的第二个及其制备方法被描述于Valette等(1996)；以及Benzaria等(1996)。
在一个实施方案中，R7是或包含具有选自下组的结构的基：
Figure A0081207300371
其中，R是芳族取代基，上述两个基的第一个及其制备方法被描述于Meier等(1997)。上述两个基的第二个及其制备方法被描述于Hostetler等(1997)；以及Hostetler等公布的国际专利申请No.WO96/40088(1996)。
在一个实施方案中，R7在Q内形成一个环状基。下文示出了一个这样的实施方案及其制备方法(其中，DMTr是4，4′-二甲氧基三苯甲基，Boc是叔-丁氧基羰基，DCC是1，3-二环己基碳二亚胺，而4-DMAP则是4-二甲氨基吡啶)：
在一个实施方案中，所述化合物可呈盐形式，或者呈被保护的或前体药物形式，或其组合，例如，作为盐、醚或酯。
在又一个实施方案中，应用下述方法将如上结构进一步改性使它具有硫代磷酸二吖丙啶基而不是磷酸二吖丙啶基。
上述5-取代的嘧啶衍生物的合成可通过本领域熟知的方法进行。例如，用卤代烷基化合物、卤代醋酸酯或卤代烯在Li2PdCl4存在下处理5-氯汞基-2′-脱氧尿苷，导致分别形成(通过有机钯中间体)5-烷基、5-乙酰基或5-烯衍生物。Wataya等(1979)和Bergstrom等(1981)。嘧啶核苷和核苷酸的C5-改性的另一个实例是C5-反式苯乙烯基衍生物的形成，即，通过用醋酸汞处理未保护的核苷酸，接着，在Li2PdCl4存在下添加苯乙烯或环取代的苯乙烯。Bigge等(1980)。
用汞使嘧啶脱氧核糖核苷三磷酸在嘧啶环的5位衍生化，即，通过在50℃下用醋酸汞在醋酸盐缓冲液中处理3小时。Dale等(1973)。这样的处理还应当有望对一磷酸酯的改性有效；也可用酶法将改性的三磷酸酯转化为改性的一磷酸酯，例如，通过用碱性磷酸酶控制处理，接着纯化一磷酸酯。可取代分子性能与汞相似、但具有优选的药理性能的其它部分(有机的或无机的)。至于合成取代嘧啶的一般方法，参见例如，美国专利Nos.4,247,544；4,267,171；和4,948,882；以及Bergstrom等(1981)。上述方法应当也适合5-取代的嘧啶核苷和核苷酸的衍生物的合成，所述衍生物含除核糖或2′-脱氧核糖以外的糖，例如，2′，3′-二脱氧核糖、***糖、呋喃糖、来苏糖、戊糖、己糖、庚糖和吡喃糖。5-位取代基的一个实例是卤代乙烯基，例如，E-5-(2-溴乙烯基)-2′-脱氧尿苷酸。Barr，P.J.等(1983)。
备选地，5-溴脱氧尿苷、5-碘脱氧尿苷和它们的一磷酸酯衍生物可从下列公司商购：Glen Research，Sterling，VA(USA)，Sigma-Aldrich Corpoation，St.Louis，MO(USA)，MoravekBiochemicals，Inc.，Brea，CA(USA)，ICN，Costa Mesa，CA(USA)和NewEngland Nuclear，Boston，MA(USA)。可商购的5-溴脱氧尿苷和5-碘脱氧尿苷可通过化学法或酶法转化为它们的一磷酸酯，即，应用可从Glen Research，Sterling，VA(USA)和ICN，Costa Mesa，CA(USA)商购的试剂、通过激酶的作用转化。可将这些卤素衍生物与其它取代基结合而产生新的和更有效的抗代谢物。
尿嘧啶的5位的结构被称为“链(tethers)”，因为它们将拟用的离去基(毒性基团)与杂环连接。在通过与人enz，TS的活性位点上的Cys残基反应使杂环活化时，例如，将一个负电荷从尿嘧啶的6位传导入链。已描述了关于(E)-5-(溴乙烯基)-2′-脱氧尿苷(BVdU)(Barr，P.J.等(1983))和(E)-5-(3，3，3-三氟-1-丙烯基)-2′-脱氧尿苷(TFPe-dUrd)[Wataya等(1979)；Santi(1980)；以及Bergstrom等(1984)]的5′-一磷酸化形式的机制。
毒素和dNMP之间的链“间隔基”必须是不饱和的，于是，它可传导由TS-Cys-巯基攻击提供的毒素-活化负电荷。在适用于该效用的很多不饱和有机官能团中，乙烯基、烯丙基和炔丙基单元是简单的、小的和容易合成获得。乙烯基和烯丙基单元具有的优点是，可呈两种不可互变的几何异构体形式之一制备它们。所以，它们可用作由酶活性位点调节的前体药物的“探针”。另一方面，炔丙基单元具有呈圆柱形对称这一优点，所以，enz催化的从这类链的毒素释放不依赖于它相对于dUMP的尿嘧啶环的取向(乙烯基和烯丙基分子的情况通常是这样的)。
已采用两种不同的方法来设计某些基于核苷酸的本发明的前体药物。一种基于BVdU一磷酸酯的结构，它的特征是直接连接在dUMP的C5上的聚乙烯基取代基末端的离去基/毒素。这是乙烯基链法。另一种基于TFPe-dUMP的结构并与第一种相似，但具有一个将离去基/毒素与不饱和单元隔离的亚甲基单元，所以，它包含一个烯丙基或炔丙基单元。这是烯丙基链法。
烯丙基链法的炔丙基形式的活化机制在5-乙炔基-2′-脱氧尿苷5′-一磷酸酯(EdUMP)和5-(3-羟基-1-丙炔基)-2′-脱氧尿苷5′-一磷酸酯(HOPdUMP)这二者与TS的相互作用中具有一个先决条件[Barr等(1981)；Barr和Robins 1983]。EdUMP是TS(Ki＝0.1TM)的有效抑制剂，可能在活性位点形成基于丙二烯的物质。HOPdUMP(Ki＝3.0 TM)显示不一般的抑制动力学，这可能是由于在活性位点形成基于累积多烯的物质的缘故。
近期合成了结构与乙烯基链法和烯丙基链法机制的常见中间体相似的5-亚烷基化5，6-二氢尿嘧啶(Anglada等，1996)。这些被证实是高度亲电的。它们的容易与乙醇反应而生成5-(乙氧基甲基)尿嘧啶是添加水而再生有催化能力的TS的先决条件。甚至最近，通过捕集研究证实了由TS产生的难以理解的长C5亚甲基中间体的存在(Barrett等(1998))。
特定的实施方案包括具有如下所示L或D结构的化合物。通过结构和数字标记来鉴别这些化合物。
Figure A0081207300401
Figure A0081207300403
         NB1012                        -
Figure A0081207300404
                NB1013                       NB1020-CF3                       NB1014                       NB1027
Figure A0081207300411
NB1016                         NB1021
Figure A0081207300412
       NB1017                         NB1024R               Y＝
Figure A0081207300413
              Y＝H
Figure A0081207300414
     NB1018                        NB1022         NB1019                        N81023       -                           NB102-H                          NB1025                        N81026-C8H17                      -                           NB102优选的实施方案如下所示：一种具有下列结构的化合物：其中，Xd和Xe独自相同或不同并且选自下组：Cl，Br，I，和CN或其核苷类似物。在一更优选的方面，Xd是Cl或Br，而Xe则是H。
一种具有下列结构的化合物：
Figure A0081207300421
其中，Xf和Xg独自相同或不同并且选自下组：Cl，Br，I，和CN或其核苷类似物。在一优选的实施方案中，Xf和Xg相同，各自是Cl或Br。
一种具有下式结构的化合物：
其中，每个X选自下组：Cl，Br，I，和CN；
或其核苷类似物。在一优选的实施方案中，X是Cl或Br，而在一更优选的实施方案中，X是Br。
一种具有下列结构的化合物：其中，R8是低级直链或支链烷基，或其核苷类似物。一种具有下列结构的化合物：
Figure A0081207300432
其中，R8和R9是低级直链或支链烷基，而R10是H或CH3或其核苷类似物。
一种具有下列结构的化合物：其中，R10是H或CH3；或其核苷类似物。一种具有下列结构的化合物：
Figure A0081207300442
一种具有下列结构的化合物：
Figure A0081207300443
或其核苷类似物。一种本文描述的化合物，其中，该化合物具有如下结构：
Figure A0081207300451
在一方面，R7＝H。在另一方面，R7是具有如下结构的取代基：
Figure A0081207300452
一种本文描述的化合物，其中，该化合物具有如下结构：其中，R7＝H或者R7是具有如下结构的取代基：一种具有如下结构的化合物：
Figure A0081207300461
一种具有下列结构的化合物：其中，每个X选自下组：CO2Et，Cl，和Br；或其核苷类似物。一种具有下列结构的化合物：或其核苷类似物。
一种具有下列结构的化合物：或其核苷类似物。
所述前体药物可与载体(例如，药物上可接受的载体)组合而供体外或体内应用。
本发明还提供了迅速而简便的筛查检测，它将能初步鉴定具有至少一些所需特性的新型化合物(见图2A和2B)。检测需要至少两类细胞，第一类是对比细胞，其中，靶酶不被表达或者被低水平表达，例如正常细胞。第二类细胞是测试细胞，其中，靶酶以可检测水平(例如，高水平)被表达。这类细胞可以是因提高的靶酶水平而被选择的肿瘤细胞系。也可应用被遗传修饰而差异表达靶酶或酶(含合适的靶酶物种)的细胞。应用本领域熟知的和描述于Chen，L.等(1996)；Hudziak，R.M.等(1988)；或Carter，P.等(1992)和下文的试验部分中的方法，用编码靶酶的多核苷酸转染宿主细胞是瞬时的或长久的。所述细胞可以是原核的(细菌，例如大肠埃希氏菌(E.coli))细胞或真核细胞。所述细胞可以是哺乳动物细胞或非哺乳动物细胞，例如，小鼠细胞，大鼠细胞，人细胞，引起疾病的真菌(例如，酵母)或寄生物(例如，肺囊虫属(Pneumocystis)或利什曼原虫属(Leishmania))。
适合***cDNA的载体是从Stratagene，La Jolla，CA和其他供应商商购的。可通过导入细胞的表达盒的拷贝数或者通过改变启动子使用率来调节表达量。每个转染的细胞系中酶的表达水平可通过免疫印迹和溶胞产物中的酶测定(应用以前针对免疫检测的酶而激发的单克隆或多克隆抗体)来监测(Chen，L.等(1996))。还可按Carreras，C.W.和Santi，D.V.(1995)综述的或者如下试验部分中描述的方法进行酶法检测而测定表达的酶量。
在进一步的方面，可应用多于一种酶来独立转导单独的宿主细胞，于是，可同时比较候选药物对靶酶的效果与它对其它酶或来自另一物种的相应酶的效果。
在另一个实施方案中，应用第三种靶细胞作对比，因为它接受有效量的本发明前体药物化合物。该实施方案特别适用于筛查通过胸苷酸合酶活化的新作用剂。在又一方面，建立至少一个另外的试验细胞体系来测试试验治疗剂与已知疗法或作用剂组合的协同潜力。
对本发明来说，成功的候选药物将阻止生长或杀伤试验型细胞，但不伤害对比细胞类型。可通过Miller(1992)；Sugarman，B.J.等(1985)和Spector，D.L.等(1998)描述的标准方法，或者应用如下试验部分中描述的方法来进行生长检测。
本领域技术人员应懂得，可应用广泛的筛查而寻找抗生素。例如，来自酵母的胸苷酸合酶可代替人的或酶的大肠埃希氏菌形式。这应当能发现靶向酵母相关的病原体的特定抗真菌抗生素。此外，其它酶也可受这种处理。例如，可选定特异性地靶向传染剂[例如，卡氏肺囊虫(Pneumocystis carnii)]的二氢叶酸还原酶活性的前体药物。将选定对靶酶特异性的这些作用剂，它们可通过应用本文描述的筛查检测证实不活化天然宿主的酶。对比细胞构建物应包含相应的正常人酶，以便在只存在正常人酶时显示毒性的缺乏。
图2A和2B示出了我们如何能进行本发明这个方面的至少一个实施方案。将一种外源基因(例如，编码TS的人基因)***宿主细胞，以致表达人TS。“对比细胞”不表达靶酶。在一些实施方案中，可能有必要用靶酶的蛋白质产物补充培养基。
可将候选的前体药物直接加入细胞培养基中，然后对靶细胞或培养基检测从候选的前体药物释放的标记量(如果前体药物包含可检测的标记)。也可通过应用Lasic，D.D.(1996)描述的方法或者与Lewis，J.G.等(1996)描述的细胞转染剂结合而将前体药物包装入脂质体来增强细胞摄取。
一个利用在肿瘤细胞中TS超量表达的前体药物的备选实施方案是脱氧尿苷氨基磷酸酯，或者与治疗放射性核素缀合的其它修饰(本文引述的)。治疗放射性核素的一个实例是铼188。该同位素可基本上按Callahan等(1989)描述的那样合成。它也可商购，例如，得自Mallicrodt Medical BV(荷兰)。可通过例如由Lin，W.Y.等(1997)描述的方法将所述治疗放射性核素与脱氧尿苷或脱氧尿苷5′-氨基磷酸酯或其它衍生物缀合。含放射性核素的脱氧尿苷氨基磷酸酯将优先被吸收入超量表达胸苷酸合酶的肿瘤细胞的DNA，并且通过β和γ辐射的集中放射而引起它们的死亡。备选的放射性核素包括铼-186和其它元素(Troutner，D.A.(1987))。
所述化合物适用于预测一名受治疗者将是否适合通过本发明的前体药物治疗，即，将前体药物送递到包含需要处理的细胞的样品，检测细胞死亡或细胞增殖的抑制。申请人提供了试剂盒供测定病理细胞或患者将是否适合通过这种疗法治疗(通过提供至少一种本发明的前体药物和使用说明)。
本发明还提供了一种抑制体外或体内的病理细胞或靶细胞增殖的方法，即，通过送递有效量本发明的前体药物至所述细胞。当在体内实施时，所述方法适用于通过对受治疗者送递有效量本发明的前体药物而治疗受治疗者以靶细胞为特征的病理状况。
当所述靶细胞是抗化疗药物的靶细胞时，可进一步修饰所述方法，即，通过接触或者对细胞或患者施用有效量的药物(细胞已形成对它的抗性)。由于本发明的前体药物能逆转对以前的疗法的抗性，随后用本发明的前体药物成功治疗，所以，施用以前的疗法又能抑制肿瘤的生长或转移。可能出现这种情况的实例包括但不限于：当靶细胞表达一种由于通过化疗在体内选择而扩增的酶时，或者当靶酶是在靶细胞中超量表达的内源性胞内酶时。这种酶的一个实例是胸苷酸合酶，已证实它由于以前的化疗而被超量表达并且使细胞上具有抗以前的药物的抗药性表型。
本发明的前体药物还可与其它已知疗法结合以增强或协同任一个以前的疗法或两个以前的疗法或前体药物的疗效。这类以前疗法包括但不限于：癌化疗、放射治疗和手术。
当对动物送递时，所述方法还适用于进一步证实前体药物的效果。作为动物模型的一个实例，用约105～约109超增殖性癌细胞或本文定义的靶细胞皮下接种几组裸鼠(Balb/c NCR nu/nu雌性，Simonsen，Gilroy，CA)。当形成肿瘤后，就施用前体药物(例如，通过腹膜内或静脉内途径)。每周两次用游标卡尺进行肿瘤测量以测定肿瘤二维尺寸的减小。适当的话还可用其它动物模型[Lovejoy等(1997)；Clarke，R.(1996)；以及Pegram，M.D.等(1997)]。
在治疗期间，可连续地或断续地进行单剂量体内施药。测定最有效的施药途径和剂量的方法是本领域技术人员熟知的并且将随下列因素而变：用于治疗的组合物、治疗目的、受处理的靶细胞和受治疗的受治疗者。可进行一次或多次施药，剂量水平和模式由治疗医师选择。从下文可见合适的剂量配方和施用治疗剂的方法。
前体药物、药物的组合或者含二者之一的组合物可被用于生产通过常规施药方法治疗人和其它动物的药剂(例如，药物组合物中的活性组分)。
所述药物组合物可通过经口、鼻内、肠胃外或者通过吸入疗法施药，可呈片剂、锭剂、颗粒、胶囊、丸剂、安瓿、栓剂或气溶胶形式。它们还可呈活性组分在水性或非水稀释剂中的悬浮液、溶液和乳液，糖浆，粒化物或粉末的形式。除了本发明的化合物以外，药物组合物还可包含其它药物活性化合物或本发明的多种化合物。
更具体地说，可通过下列任何合适的途径为了治疗而施用本发明结构式的化合物(本文也称为活性组分)，包括经口，经直肠，经鼻，局部(包括经皮、气溶胶、口腔和舌下)，经***，肠胃外(包括皮下、肌内、静脉内和皮内)和肺内。还应懂得，优选的途径将随接受者的病况和年龄，以及受治疗的疾病而定。
通常，对于上述名称的化合物的每一种来说，合适的剂量在每天每千克接受者的体重约1～约100mg范围内，优选在每天每千克体重约1～约50mg范围内，最优选在每天每千克体重约1～约25mg范围内。除非另外说明，所有活性组分的重量都以本发明的结构式的母体化合物计算的，对于其盐或酯，重量应当按比例增大。优选在每天以适当间隔作为两个、三个、四个、五个、六个或多个子剂量施用所要求的剂量。这些子剂量可呈单元剂型施用，例如，每单元剂型含约1～约100mg、优选约1～大于约25mg、最优选约5～大于约25mg活性组分。应懂得，本发明的化合物和组合物的适当剂量可取决于疾病的类别和严重性和病期，并且因不同的患者而变。确定最适剂量通常将涉及针对本发明的治疗的任何危险或有害副作用而平衡治疗有益的水平。
较理想的是，应当施用前体药物而在疾病部位实现活性化合物的峰值浓度。这可通过下述方法实现，例如，通过静脉内注射前体药物(任选于盐水中)，或者经口施药，例如，作为含活性组分的片剂、胶囊或糖浆。可通过连续输注来保持所要求的前体药物血液水平，从而在疾病组织内提供活性组分的治疗量。考虑了使用有效的组合而提供这样的治疗组合，即，要求每种组分抗病毒剂的总剂量比各种治疗化合物或药物单独使用时需要的总剂量更低，于是减小不利影响。
虽然可以单独施用前体药物组分，但优选将它作为药物制剂提供，该制剂包含至少一种上文定义的活性组分，以及一种或多种药物上可接受的载体并且任选包含其它治疗剂。各种载体在与制剂的其它组分相容的意义上必须是“可接受的”并且不伤害患者。
适合口服的本发明的制剂可作为下列形式提供，即，离散的单元(例如，胶囊、扁囊剂或片剂)，每单元含预定量的活性组分；作为粉末或颗粒；作为在水性或非水液体中的溶液或悬浮液；或者作为水包油乳液或油包水乳液。所述活性组分还可呈大丸剂、药糖剂或糊剂提供。
片剂可通过压榨或模压(任选与一种或多种辅助成分)制备。压制片剂可这样制备，即，在合适的机器中对呈自由流动形式的活性组分(例如，粉末或颗粒)进行压制，所述活性组分任选混有下列组分：粘合剂(例如，聚乙烯吡咯烷酮、明胶、羟丙基甲基纤维素)，润滑剂，惰性稀释剂，防腐剂，崩解剂(例如，羟基乙酸淀粉钠、交联聚乙烯吡咯烷酮、交联羧甲基纤维素钠)，表面活性剂或者分散剂。模压片剂可通过在合适的机器中将惰性液体稀释剂增湿的粉状化合物的混合物模压而制备。片剂可任选被包覆或压痕，还可被配制成提供缓慢或控制释放其中的活性组分(应用例如不同比率的羟丙基甲基纤维素以提供希望的释放分布)。可任选用肠溶包衣包覆片剂从而在肠道部分而不是胃中释放。
适合在口腔内局部施药的制剂包括：锭剂，它包含处于调味基料(通常是蔗糖和***胶或黄蓍胶)中的活性组分；软锭剂，它包含处于惰性基料(例如，明胶和甘油，或者蔗糖和***胶)中的活性组分；以及漱口剂，它包含处于合适的液态载体中的活性组分。
本发明的用于局部施药的药物组合物可作为软膏、乳膏、悬浮剂、洗剂、粉末、溶液、糊剂、凝胶、喷雾剂、气溶胶或油配制。制剂还可包括膜片或敷料(例如，浸渍了活性组分和任选一种或多种赋形剂或稀释剂的绷带或膏药)。
至于眼或其它外部组织(例如，口和皮肤)的疾病，优选以局部软膏或乳膏施用所述制剂，所包含的活性组分量例如是约0.075～约20％w/w，优选约0.2～约25％w/w，最优选约0.5～约10％w/w。当配制成软膏时，所述前体药物可与石蜡或水混溶性软膏基料一起施用。也可用水包油乳膏基料将前体药物组分配成乳膏。
如果需要的话，乳膏基料的水相可包含例如，至少约30％w/w多元醇，即，具有两个或多个羟基的醇，例如，丙二醇、1，3-丁二醇、甘露糖醇、山梨糖醇、甘油和聚乙二醇及其混合物。可能希望局部制剂包含一种这样的化合物，即，它增强前体药物组分透过皮肤或其它受感染区的吸收或渗透。这样的皮肤渗透增强剂的实例包括二甲亚砜和相关的类似物。
本发明的乳液的油相可按已知方式由已知组分构成。虽然该相可能仅仅包含乳化剂(或者称为“emulgent”(乳化剂))。但希望它包含至少一种乳化剂与脂肪或油或者与脂肪和油二者的混合物。优选的是，包括亲水性乳化剂与亲脂性乳化剂(它起稳定剂作用)。还优选既包含油又包含脂肪。同时，含有或不含稳定剂的乳化剂构成所谓的乳化蜡，而这种蜡与油和/或脂肪一起构成所谓的乳化软膏基料，它形成乳膏制剂的油性分散相。
适用于本发明的制剂的乳化剂和乳液稳定剂包括：吐温60、司盘80、十六醇十八醇混合物、肉豆蔻醇、一硬脂酸甘油酯和十二烷基硫酸钠。
对制剂来说，合适的油或脂肪的选择基于达到所需的美容特性，因为活性化合物在可能用于药物乳剂中的大部分油中的溶解度很低。所以，乳膏应当优选是不油滑的、不污染的和可洗掉的制品，它具有合适的稠度以免从管或其它容器内渗出。可应用直链或支链的、单烷基酯或二元烷基酯，例如，二异己二酸酯，硬脂酸异十六醇酯，椰子脂肪酸的丙二醇二酯，肉豆蔻酸异丙酯，油酸癸酯，棕榈酸异丙酯，硬脂酸丁酯，2-乙基己基棕榈酸酯或者被称为“Crodamol CAP”的支链酯混合物，优选的酯是最后那三种。这些酯可根据所需的性能而单独用或组合用。还可应用高熔点脂质(例如，白色软石蜡和/或液体石蜡)或者其它矿物油。
适合对眼局部施药的制剂还包括滴眼剂，其中，活性组分被溶于或悬浮于合适的载体(特别是前体药物组分的水性溶剂)。这种制剂中前体药物组分优选以约0.5～约20％w/w、有利的是约0.5约～10％w/w、特别是约1.5％w/w的浓度存在。
供直肠施药的制剂可作为栓剂提供，它包含合适的基料，该基料包括例如，可可脂或水杨酸盐。
适合***施药的制剂可作为栓剂、塞子、乳膏、凝胶、糊剂、泡沫或喷射制剂提供，除前体药物组分之外，它还包含本领域技术人员已知的合适的载体。
适合经鼻施药的制剂(其中，载体是固体)包含粗粉末，它的粒径例如在约20～约500微米范围内，将它按嗅的方式施药，即，通过鼻通道从靠近鼻的盛粉末容器迅速吸入。用于作为例如喷鼻剂、滴鼻剂施药或者利用喷雾器通过气溶胶施药的合适的制剂(其中，载体是液体)包括前体药物组分的水性或油性溶液。
适合肠胃外施药的制剂包括水性和非水的等渗无菌注射液，它可包含抗氧化剂，缓冲剂，抑菌剂和溶质(溶质使制剂与预期的接受者的血液是等渗的)；以及水性和非水的无菌悬浮液，它们可包含悬浮剂和增稠剂，以及脂质体或其它微粒体系(设计它们而将化合物导向血液成分或者一个或多个器官)。制剂可呈单元剂量或多剂量密封容器(例如，安瓿和小瓶)提供，可在冻干条件下贮存，只需就在使用前添加无菌液态载体(例如注射用水)。可从以前描述类型的无菌粉末、颗粒和片制备临时注射溶液和悬浮液。
应懂得，除了上文特别提及的组分之外，本发明的制剂还可包含本领域常见的关于所述制剂的其它作用剂，例如，适合口服的那些可包含这类另外的作用剂，例如，增甜剂、增稠剂和调味剂。
本发明的结构式的前体药物和组合物还可呈兽医制剂形式提供，它可通过本领域常规方法制备。
如下实施例旨在阐述但不是限制本发明。
原料和方法核苷ECTA化合物的合成
上述5-取代的嘧啶核苷的合成可通过本领域熟知的、上文简要描述的方法进行。
在一个实施方案中，本发明涉及四类化合物。每一类由给出的尿嘧啶碱(uricil base)或改性的尿嘧啶碱(modified uricil base)的结构定义。这些类是ECTA化合物，其中，1)所述碱是尿嘧啶的呋喃桥嘧啶酮衍生物；2)所述碱是6-氟尿嘧啶；3)所述碱是4-腙取代的尿嘧啶衍生物；4)所述碱是尿嘧啶。尿嘧啶或改性尿嘧啶衍生的碱被用于合成在5位被毒性离去基取代的化合物(在该5位通过“电子通道链”(electron conduit tether)连接，包括在电子通道和毒性离去基之间合适的间隔基)。ECTA化合物可以是未磷酸化的，5′一磷酸酯，5′磷酸二酯或者5′被保护的(“掩蔽的”)脱氧尿苷或可比的备选碳水化合物部分的衍生物(如下所述)。被保护的5-取代脱氧尿苷一磷酸酯衍生物是这样的化合物：其中，磷酸酯部分通过连接合适的化学保护基而被封阻了。5-取代脱氧尿苷一磷酸酯衍生物的保护可改善溶解性，有利于细胞渗透，有利于穿过血-脑屏障，并且防止细胞的或胞外的磷酸酶的作用(否则它会导致磷酸酯基的失去)。在另一个实施方案中，5-取代尿嘧啶或尿苷衍生物被施用到含核苷激酶活性的细胞，其中，5-取代尿嘧啶/尿苷衍生物被转化为5-取代尿苷一磷酸酯衍生物。尿苷衍生物还可被改性以增大它们的溶解性，细胞渗透性，和/或穿过血-脑屏障的能力。
胸苷酸合酶对5-取代尿苷一磷酸酯衍生物的作用能释放连接到嘧啶环的5位(“离去基”)的取代基。释放的取代基就能(固有地或者在与其它细胞成分反应后)起毒素或细胞增殖的抑制剂的作用。用炔丙基链(propargvl tethers)合成ECTA化合物
炔丙醇和烯丙醇装备的2′-脱氧尿苷的合成简单易懂。文献中报导了很多这些和其它密切相关的衍生物，甚至将一些与TS联系研究。例如，研究了5-炔基-dUMPs[包括5-(3-甲氧基-1-丙炔基)和5-(3-羟基-1-丙炔基)]作为TS抑制剂(Barr，和Robins(1981))，已证实它们中的一些结合入TS-缺乏癌细胞的DNA(Balzarini，J.等(1985))。
5-汞尿苷(Ruth，J.L.等(1978))和5-碘尿苷(Robins，M.J.等(1981))都容易与烯烃和炔烃在钯催化剂存在下缩合而给出C5链接的尿苷。后一条途径更常用[Robins，M.J.等(1982)，Asakura，J.等(1988)和(1990)]。已实现了被保护的5-碘-2′-脱氧尿苷与叔丁基二甲基甲硅烷基炔丙基醚[Graham等(1998)；De Clercq等(1983)]、甲基炔丙基醚[Tolstikov等(1997)]和甚至炔丙醇自身[Chaudhuri等(1995)和Goodwin等(1993)]的高产率缩合。还可通过甲基丙烯酸酯基的DIBAL-H还原(它自身是从用于BVdU的合成的相同Heck反应产生的)得到通过后一个反应引入的3-羟基-1-丙炔基取代基(Cho，Y.M.等(1994))。这些钯催化的反应如此通用以致它们可被用于使基于很长的、复杂的官能化炔丙基的链与5-碘-2′-脱氧尿苷缩合[Livak等(1992)和Hobbs(1989)]。基于(Z)-烯丙基的链是通过炔丙基母体在Undiar催化剂上的部分氢化而产生的[Robins，M.J.等(1983)]，而基于(E)-烯丙基的链则最好通过(E)-三丁基甲锡烷基化乙烯的Heck偶合来制备(Crisp(1989))。
严密地按文献方法，制备了叔丁基二甲基甲硅烷基炔丙基醚装备的3′，5′-二-O-保护的2′-脱氧尿苷[Graham等(1998)，以及De Clercq等(1983)]，并且将它的一部分[已转化为相应的(Z)-烯丙基醚(Robins和Barr(1983))]还原。由于TBAF-介导的TBDMS基的除去产生氧阴离子(它可被就地官能化)，所以，这些TBDMS-保护的炔丙基-和(Z)-烯丙基链接的核苷将作为某些毒性基团装备的靶的方便母体。至于(E)-烯丙醇装备的核苷，已知的0-四氢吡喃基醚衍生物是通过文献报导的(E)-三丁基甲锡烷基化乙烯的Heck偶合来制备(Crisp(1989))。
应用两步文献方案[Phelps等(1980)以及Hsiao和Bardos(1981)]，将炔丙基醇以及(E)-和(Z)-烯丙基醇转化成它们相应的二氮丙啶基氨基磷酸酯或硫代氨基磷酸酯，以致5′-一核苷酸形式的TS处理将分别释放细胞抑制药TEPA或ThioTEPA的活性代谢物(Dirven等(1995))。
Figure A0081207300571
呋喃桥嘧啶酮的合成
呋喃桥嘧啶酮的合成始于C5炔丙醇装备的2′-脱氧尿苷的合成。然后从上述0-四氢吡喃基醚衍生物形成呋喃桥嘧啶酮化合物。合成是这样继续进行的，即，通过炔丙基键的第二个碳原子与连接在嘧啶环C4位的氧反应而生成荧光呋喃桥嘧啶酮，可轻易将它从反应混合物分离。这样的化合物为通过特定的电子通道、间隔基和毒性离去基的各种组合合成ECTA化合物提供了又一基础。
呋喃并[2，3-d]嘧啶酮核苷是通过2′，3′-二-O-对-甲苯甲酰或2′，3′-二-O-乙酰-5-碘-2′-脱氧尿苷与1-(四氢吡喃氧基)-2-丙炔在已知促进这些荧光化合物生成的条件[Robins，M.J.等(1983)]下缩合而制备的[“合成δ-氨乙基吡唑的新方法”，Jones，R.G.和Mann，M.J.(1953)]。碱催化的碳水化合物保护基的除去给出6-(四氢吡喃-2-基氧基甲基)-取代的双环核苷，它或者经历标准酸化THP基水解(TFA于CH2Cl2中)或者被区域选择性地5′-氨基磷酸化(通过用于制备BVdU-PA和5FUdR-PA的相同操作)。氨基磷酸化后，THP基可通过酸解除去(如图4中所示)。基于呋喃桥嘧啶酮的TS ECTA化合物
可利用与将毒性离去基连接到C5炔丙基尿苷化合物的羟基上的那些方法相似方法(如上文关于TEPA和硫代TEPA衍生物的合成解释的那样)将毒性R4离去基连接到呋喃2-甲醇上。展望了本领域技术人员明白的各种备选的毒性离去基。此外，还展望了对R2电子通道组分的长度和成分以及对R3间隔单元的成分的修饰。
基于呋喃桥嘧啶酮的TS ECTA化合物还可包含各种修饰的“Q”部分。很多5-取代的2′-脱氧尿苷不是人TK的底物，但有趣的是，发现5-(4-羟基-1-丁炔基)-2′-脱氧尿苷例外(Barr，P.J.等(1981))。ECTA化合物可具有连接到备选的碳水化合物基上的游离5′羟基、5′一磷酸酯基或5′氨基磷酸酯基。一种合成这样的氨基磷酸酯化合物的新方法是这样进行的，即，将2-脱氧3′-羟基，5′-羟基未保护的核苷酸与氯化二氧磷基(phosphochloridate)在HCl清除剂存在下反应。在一个优选的实施方案中，所述氯化二氧磷基包括磷取代基，它得自例如丙氨酸这样的氨基酸。例如，所述氯化二氧磷基可以是苯基-L-甲氧基丙氨酸氯化偶磷(phosphorochloridate)。基于C6氟尿苷和C4腙(hydozone)的化合物
在与dUMP的正常TS反应中往嘧啶C5-C6双键添加中性硫羟是按放热反应进行的(3～9kcal/mol；参见Les，A.等(1998)的综述)。6位TS活性氢的备选取代基能促进与酶形成巯基(sulfydryl)键，它经过活性人TS半胱氨酸(与L.casei的cys-198同源的)，所述取代基包括氟。所述嘧啶环其它位置上的这类取代基也能促进底物与TS之间的反应。例如，尿嘧啶上的4-腙取代(如Les，A.等(1998)所描述的)促进与TS的硫羟的形成。重要的是，生成的核苷酸-硫羟(TS)中间体以释放改变的核苷酸的方式重排(它可通过水解而被动地进行)。
Figure A0081207300591
以前从未报导在C6位引入氟，不过它可按Krajewskas和Shugar(1982)的合成描述来合成，它描述了一些6取代的尿嘧啶和尿苷类似物的合成。
化学促进在嘧啶碱的C4位取代是本领域技术人员熟知的。文献描述的实例包括：Wallis等(1999)；Negishi等(1996)，Barbato等(1991)，Barbato等(1989)和Holy等(1999)。这些合成方法还能实现取代的组合，例如，在嘧啶环的C4和C5位(Pluta等(1999))或者在嘧啶环的C2和C4位(Zeid等(1999))。
在本发明另一个实施方案中，ECTA化合物是通过往C6氟尿苷碱或C4腙改性的嘧啶添加备选的电子通道、间隔基部分和毒性离去基而合成的。上述关于合成基于2，脱氧尿苷的ECTA化合物的方法又可用于这类分子的合成。核苷苯基甲氧基丙氨酰氨基磷酸酯的合成
McGuigan，C.等(1993)和McGuigan，C.等(1994)最先报导了氨基磷酸酯作为核苷酸的磷酸酯前体药物的应用。这些作者证实了，抗病毒的2′，3′-二脱氧核苷衍生物的氨基磷酸酯衍生物(例如d4T)在胸苷激酶缺乏的细胞中保持它们的抗病毒活性。进一步的研究证实了，氨基磷酸酯基在细胞内被水解成磷酸酯基[McGuigan，C.等(1996)；Balzarini，J.等(1996)；以及Saboulard等(1999)]。氨基磷酸酯是通过2′，3′-二脱氧核苷与苯基甲氧基丙氨酰氯化偶磷(PMPC)反应而合成的。
由于只存在一个羟基，所以，这些反应通常平稳地进行。在存在多于一个羟基的化合物中，可能需要被适当保护的核苷。由于2′-脱氧核苷的5′-OH基比3′-OH基的位阻作用小得多，所以，PMPC的选择性氨基磷酸化可能在小心控制的条件下进行。BVdU和5FUdR都与PMPC在N-甲基咪唑的存在下在无水CH2Cl2中缩合而给出相应的氨基磷酸酯。在两种情况下，轻易应用柱色谱法在硅胶上分离所需的产物与原料。将合成示意图归纳如下。
如下实施例旨在阐述而不是限制本发明。
                      实施例1和2
            具有炔丙基链的ECTA化合物的合成
应用上述一般合成操作，合成了二-吖丙啶-1-基-次膦酸3-[2-脱氧尿苷-5-基]-丙-2-炔基酯，通过1H NMR分析而获得如下结果：1HNMR((CD3)2SO)因噪音而变得复杂。特征：
                 δ 8.28(d，1，H6)，6.10(假-t，1，H1′)，5.26(m，同D2O互换，1，3′-OH)，5.13(m，同D2O互换，1，5′-OH)，4.81(q或dd，2，炔丙基-CH2)，4.24(m，1，H3′)，3.57(m，2，5′-CH2)，2.15-2.0(m，8，氮丙啶-CH2)。
还合成了二-吖丙啶-1-基-膦基硫代酸(phosphinothioicacid)3-[2-脱氧尿苷-5-基]-丙-2-炔基酯，通过1H NMR分析而获得如下结果：1H NMR((CD3)2SO)因噪音而变得复杂。特征：δ8.29(d，1，H6)，6.10(假-t，1，H1′)，5.22(m，同D2O互换，1，3′-OH)，5.10(m，同D2O互换，
1，5′-OH)，4.88(q或dd，2，炔丙基-CH2)，4.31(m，1，H3′)，3.52(m，2，5′-CH2)，2.15-2.0(m，8，氮丙啶-CH2).
                          实施例3～8
                      呋喃桥嘧啶酮的合成
应用上述一般合成操作，合成了下列化合物。
                            实施例3
3-(2-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-6-(四氢吡喃-2-基氧基甲基)呋喃并[2，3-d]嘧啶-2(3H)-酮。
                 1H NMR((CD3)2SO)δ8.80(s，1，H4)，6.74(s，1，H5)，6.16(假-t，1，H1′)，5.27(d，同D2O互换，1，3′-OH)，5.12(t，同D2O互换，
1，5′-OH)，4.72(m，1，THP-H2)，4.56(q，2，CH2OTHP)，3.92(m，1，H4′)，3.64(m，2，5′-CH2)，2.40(m，1，H2′a)，2.03(m，1，H2′b)，1.68和1.50(m，8，THP).
二-TMS衍生物的低分辨质谱(DCI-NH3)，m/z 323(B+TMS+H+)，511(MH+)，583(M+TMS+).
                     实施例4
3-(2-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-6-(羟甲基)呋喃并[2，3-d]嘧啶-2(3H)-酮。
       1H NMR((CD3)2SO)δ12.0(bs，1，OH)，8.24(s，1，H4)，6.53(s，1，H5)，5.51(假-t，1，H1′)，4.42(m，2，CH2OH). 低分辨质谱-(DCI-NH3)，m/z 167(B+2H+)，184(B+NH4+).
                        实施例5
1-[6-(四氢吡喃-2-基氧基甲基)呋喃并[2，3-d]嘧啶-2(3H)-酮-3-基]-2-脱氧-β-D-呋喃核糖-5-基苯基甲氧基-L-丙氨酰氨基磷酸酯。1H NMR((CD3)2SO)因非对映体的存在而变得复杂。特征：δ8.62和8.59(各个s，各个1，H4)，7.4-7.1(m，5，PhO)，6.61和6.60 (各个s，各个1，H5)，6.25(m，1，H1′)，4.56(q，2，炔丙基-CH2)，3.56和3.54(各个s，各个3，CO2Me)，2.0(m，1，H2′b)，1.22(m，3，丙氨酰-α-Me).低分辨质谱(DCI-NH3)，m/z 167(B+2H+)，184(B+H++NH4+-THP).
                         实施例6
1-[6-(羟甲基)呋喃并[2，3-d]嘧啶-2(3H)-酮-3-基]-2-脱氧-β-D-呋喃核糖-5-基苯基甲氧基-L-丙氨酰氨基磷酸酯。1H NMR(CDCl3)因非对映体的存在而变得复杂。特征：δ8.5(s，1，H4)，7.4-7.1(m，5，PhO)，6.36和6.30(各个s，各个1，H5)，6.23(m，1，H1′)，3.67和3.65(各个s，各个3，CO2Me)，2.69(m，1，H2′a)，2.10(m，1，H2b)，1.35(m，3，丙氨酰-α-Me).低分辨质谱(DCI-NH3)，m/z 525(MH+)，595(MNH4 +).
                         实施例7
按如下所示的标准醚合成法制备了5-(3-羟基-1-丙炔基)-2′-脱氧尿苷的4-硝基苯基醚衍生物。
Figure A0081207300631
                    实施例8
5-[3-(4-硝基苯氧基)-1-丙炔基]-2′-脱氧尿苷。在氩气氛中，用4-硝基苯酚(696mg，5mmol)、三苯膦(787mg，3mmol)和偶氮二羧酸二异丙酯(590L，3mmol)处理预先干燥的5-(3-羟基-1-丙炔基)-2′-脱氧尿苷(Robins，M.J.等(1983))(565mg，2mmol)于40mL无水THF中的溶液，将反应混合物加热到60℃直至溶液清亮，再继续加热1h。使混合物冷却到23℃，然后将它蒸发到SiO2上，通过色谱法纯化(应用MeOH/CH2Cl2作为洗脱剂)给出107mg(13％)所需的醚产品：
                      mp 112-118℃.1H NMR((CD3)2SO)δ11.65(s，同D2O互换，1，NH)，8.29(s，1，H6)，8.24(d，J＝9.3Hz，2，m-ArH)，7.23(d，J＝9.3Hz，2，o-ArH)，6.09(假-t，1，H1′)，5.17(s，2，炔丙基-CH2)，4.22(m，1，H3′)，3.80(m，1，H4′)，3.59(m，2，5′-CH2)，2.13(假-t，2，2′-CH2).per-三甲基甲硅烷基化物质的低分辨质谱(DCI-NH3)，m/z547[M(TMS)2H+]，565[M(TMS)2NH4 +]，620[M(TMS)3H+].
                         实施例9
         5-(4-乙酯基-1，3-丁二烯基)-2′-脱氧尿苷
(a)5-(甲酯基乙烯基)-2′-脱氧尿苷-3′，5′-二(四氢-2H-吡喃-2-基)醚(I)
在50℃下搅拌5-(甲酯基乙烯基)-2′-脱氧尿苷(3.0g，9.6mmol)、3，4-二氢-2H-吡喃(22mL，21.3mmol)和对-甲苯磺酸吡啶噁(PPTS，0.242g，0.96mmol)于二甲基甲酰胺(DMF，5mL)中的浆状液达18h。真空浓缩(浴液温度45℃)形成的溶液而给出稠密的淡黄色油。将该油溶于EtOAc，滤出固体。再次浓缩溶液。通过柱色谱法(应用50～75％EtOAc/己烷作为洗脱剂)在硅胶上纯化获得的油，给出3.81g(85％)无色油状纯产品。
(b)5-(3-羟基丙-1-烯基)-2′-脱氧尿苷-3′，5′-二(四氢-2H-吡喃-2-基)醚(II)
将(I)(3.5g，7.27mmol)于CH2Cl2(14mL)中的溶液在干冰/丙酮浴中冷却到-78℃。在2h中滴加二异丁基氢化铝(DIBAL-H)的甲苯(1.0M，24mL，24.0mmol)溶液，而将温度保持在-78℃。在-78℃下将溶液又搅拌2h，滴加MeOH(2.5mL)而破坏任何过量的DIBAL-H。在约20min内将反应混合物用插管通入30％柠檬酸溶液(50mL)、冰(25g)和EtOAc(30mL)的混合物中。进行相分离，用EtOAc(2×25mL)萃取水相，用饱和NaHCO3(20mL)和盐水(20mL)洗涤合并的有机相，在MgSO4上干燥，浓缩而给出3.288g(100％)无色油。
(c)5-(3-氧代丙-1-烯基)-2′-脱氧尿苷-3′，5′-二(四氢-2H-吡喃-2-基)醚(III)
在水冷却下，往上述获得的粗(II)(1.988g，4.4mmol)的CH2Cl2(9mL)溶液中添加固体重铬酸吡啶噁(PDC，1.82g，4.8mmol)。搅拌该悬浮液，同时滴加醋酸(0.4mL)。撤去水浴，在室温下将反应混合物搅拌1h。通过硅酸镁载体片(2×2.5cm)过滤粗产品，用35mL EtOAc洗涤硅酸镁载体。将获得的棕色溶液滤过另一个硅酸镁载体柱(3.5cm直径×2.5cm高)。浓缩滤液而给出1.273g(64％产率)很亮的棕色油。
(d)5-(4-乙酯基-1，3-丁二烯基)-2′-脱氧尿苷-3′，5′-二(四氢-2H-吡喃-2-基)醚(IV)
将(乙酯基亚甲基)三苯基正膦(0.32mg，0.92mmol)加到粗醛(III)(0.344g，0.77mmol)的溶液中。溶液变暗，变成铁锈色。1h后，通过薄层色谱法判断(III)被完全消耗了。蒸发溶剂，通过柱色谱法(用35～45％EtOAc/己烷作为洗脱剂)在硅胶上纯化粗产品。获得无色油状纯产品(0.310g，78％产率)。
(e)5-(4-乙酯基-1，3-丁二烯基)-2L脱氧尿苷(V)
将5-(4-乙酯基-1，3-丁二烯基)-2′-脱氧尿苷-3′，5′-二(四氢-2H-吡喃-2-基)醚(IV)(0.637g，1.22mmol)溶于MeOH(1.5mL)，添加PPTS(0.049g，0.16mmol)。在50℃下将溶液搅拌7.5h，在室温下放置一夜。生成白色沉淀。将反应混合物冷却到0℃，过滤而给出纯的(V)白色固体(0.188g)。浓缩滤液，在硅胶上进行色谱处理(用50～100％EtOAc/己烷作为洗脱剂)又给出0.180g产品。产品的总产量是0.368g(86％)。
1H NMR(DMSO-d6)：1.22(3H，t，J＝7Hz)，2.17(2H，br t，J＝5.5Hz)，3.55-3.75(2H，m)，3.81(1H，m)，4.12(2H，q，J＝7Hz)，4.25-4.28(1H，m)，5.19(1H，t，J＝4.8Hz)，5.27(1H，d，J＝4.1Hz)，5.98(1H，d，J＝14.5Hz)，6.14(1H，t，J＝6.3Hz)，6.75(1H，d，J＝14.5Hz)，7.18-7.30(2H，m)，8.30(1H，s)，11.56(1H，s)．
                          实施例10
    5-(4-甲酯基-1，3-丁二烯基)-2′-脱氧尿苷(Va)通过鼓泡通入氮气15min将三乙胺(3.9mL，28.2mmo1)于二 烷(12mL)中的溶液脱气。添加醋酸钯(0.60g，0.26mmol)和三苯膦(0.183g，0.70mmol)，在70℃下将溶液加热20min而给出深棕色溶液。添加5-碘-3′-脱氧尿苷(5.0g，14.1mmol)和2，4-戊二烯酸甲酯(2.5g，22.3mmol)，将混合物回流加热15h。真空蒸发溶剂和挥发性组分，将残余物在水(15mL)和EtOAc(15mL)之间分配。进行相分离，用EtOAc萃取水相两次(每次10mL)。用盐水洗涤合并的有机相并浓缩。将残余物溶于MeOH(15mL)，使它冷却到室温。通过过滤收集形成的固体，用少量MeOH洗涤，真空干燥而给出0.38g棕色粉末。
1H NMR(DMSO-d6)：2.17(2H，t，J=6.4Hz)，3.55-3.70(2H，m)，3.66(3H，s)，3.82(1H，q，J＝3.6Hz)，4.27(1H，m)，5.18(1H，t，J＝4.9Hz)，5.26(1H，d，J＝4.5Hz)，5.99(1H，d，J＝14.4Hz)，6.14(1H，d，J＝6.4Hz)，6.74(1H，d，J＝14.8Hz)，7.20-7.35(2H，m)，8.30(1H，s)，11.56(1H，s).
浓缩上述滤液，在硅胶上进行色谱处理(用60～100％EtOAc/己烷作为洗脱剂)，又给出0.70g产品(棕色泡沫)。合并的产量是1.08g(22.6％)。
                        实施例11
    5-(4-羧基-1，3-丁二烯基)-2′-脱氧尿苷(VI)
                          方法I
将5-(4-乙酯基-1，3-丁二烯基)-2′-脱氧尿苷(V，来自实施例1)(0.449g，1.28mmol)溶于2N NaOH(3mL)，在25℃下搅拌。20min后，形成沉淀，TLC表明原料完全被消耗。将混合物冷却到0℃，用2N HCl酸化到pH1。滤出生成的米色固体，用水洗涤，真空干燥，给出0.225g(54％)产品。
1H NMR(DMSO-d6)：2.12-2.19(2H，m)，3.50-3.70(2H，m)，3.75-3.85(1H，m)，4.24-4.29(1H，m)，5.19(1H，t，J＝4.8Hz)，5.27(1H，d，J＝4.2Hz)，5.80-5.95(1H，m)，6.14(1H，t，J＝6.4Hz)，6.60-6.75(1H，m)，7.15-7.25(2H，m)，8.26(1H，s)，11.56(1H，s)，12.16(1H，br s).
合并滤液和洗涤液，蒸发至干。将生成的粘性黄色固体溶于MeOH，形成白色沉淀。滤出固体而给出另外的0.200g产品。
                      方法II
还可从5-(4-甲酯基-1，3-丁二烯基)-2′-脱氧尿苷(Va)(按实施例2中的方法制备的)以与上述可比的产率制备标题化合物。
                      实施例12
      5-(4-溴-1E，3E-丁二烯基)-2′-脱氧尿苷(VIIa)和
      5-(4-溴-1E，3Z-丁二烯基)-2′-脱氧尿苷(VIIb)
往5-(4-羧基-1，3-丁二烯基)-2′-脱氧尿苷(VI)(0.200g，0.62mmol)于DMF(1mL)的溶液中添加KHCO3(0.185g，1.84mmol)，在25℃下将混合物搅拌20min。滴加N-溴丁二酰亚胺(0.117g，0.65mmol)于DMF(0.3mL)中的溶液。在添加过程中平稳地析出气体(CO2)。在25℃下将形成的棕色悬浮液搅拌2h，此时TLC显示(VI)被完全消耗。往悬浮液中添加水(10mL)，用EtOAc萃取(2×15mL)形成的溶液。将萃取液在MgSO4上干燥，真空蒸发溶剂而给出黄色固体(178mg，80％产率)，1H NMR表明，它包含两种异构体的混合物。通过半制备HPLC(反相C18柱)分离(应用20％乙腈水溶液作为流动相)粗产品，给出下列异构体：
5-(4-溴-1E，3Z-丁二烯基)-2′-脱氧尿苷：保留时间10.5分钟；1H NMR；(DMSO-d6)：2.11-2.18(2H，m)，3.50-3.70(2H，m)，3.80(1H，distorted q，J＝3.5Hz)，4.25(1H，brs)，5.08(1H，br s)，5.25(1H，br s)，6.15(1H，t，J＝6.5Hz)，6.40(1H，d，J＝7Hz)，6.53(1H，d，J＝15.6Hz)，6.83(1H，dd，J＝7，10Hz)，7.39(1H，dd，J＝10，15.6Hz).
5-(4-溴-1E，3E-丁二烯基)-2′-脱氧尿苷：保留时间15.1分钟；1H NMR(DMSO-d6)：2.12-2.16(2H，m)，3.50-3.70(2H，m)，3.80(1H，q，J＝3.2Hz)，4.26(1H，m)，5.13(1H，br s)，5.25(1H，br s)，6.14(1H，t，J＝6.5Hz)，6.36(1H，d，J＝15.6Hz)，6.67(1H，d，J＝13.1Hz)，6.84(1H，dd，J＝11，13.1Hz)，7.04(1H，dd，J＝11，15.6Hz).
                      实施例13
应用实施例11中提及的方法(方法II)，可以相似方式获得如下化合物：5-(4-氯-1，3-丁二烯基)-2′-脱氧尿苷(应用N-氯丁二酰亚胺代替步骤B中的N-溴丁二酰亚胺)；5-(4-碘-1，3-丁二烯基)-2′-脱氧尿苷(应用碘化钠中的碘代替N-溴丁二酰亚胺)。
                      实施例14
            5-(2-溴乙烯基)-2′-脱氧尿苷苯基
             N-甲氧基-L-丙氨酰氨基磷酸酯
苯基N-甲氧基-L-丙氨酰氯化偶磷
将L-丙氨酸甲酯氢氯化物(245.8g；1.76mol)置于12L三颈圆底烧瓶(装有机械搅拌器和温度计)中，接着添加4.0L二氯甲烷。在室温下将混合物搅拌15分钟。往混合物中添加二氯磷酸苯酯(phenylphosphodichloridate)(370.0g；1.76mol)，在室温下继续搅拌15分钟。将烧瓶置于干冰浴中，继续搅拌20分钟直至形成均匀的悬浮液。
在强烈搅拌下将新鲜蒸馏的三正丁胺(626.5g；3.38mol)滴加(～90min)到反应混合物中，以致烧瓶内的温度保持在～0℃。撤去浴液，在室温下继续搅拌6小时。通过旋转式蒸发器蒸发几部分混合物而将溶液浓缩到～2.84L，在氩气氛中密封混合物并在-20℃贮存。通过磷NMR分析产品纯度是85％，估测苯基甲氧基丙氨酰二氧磷基氯化物的浓度为～0.5M。
                         实施例15
5-(2-溴乙烯基)-2′-脱氧尿苷苯基N-甲氧基-L-丙氨酰氨基磷酸酯(NB1011)
在氩气氛中进行反应。将5-(2-溴乙烯基)-2′-脱氧尿苷(BVdU)(204g；612mmol)置于装有机械搅拌器的3L三颈圆底烧瓶中。将烧瓶置于冰水浴中，应用加液漏斗在15min内添加1600mL(～800mmol)苯基甲氧基丙氨酰二氧磷基氯化物试剂，强烈搅拌反应混合物，接着，在5分钟内用注射器添加100mL N-甲基咪唑。5分钟后，混合物变清亮，10分钟后，撤去冰水浴，使混合物暖至室温(同时继续搅拌)。通过反相HPLC监测反应，在3小时中反应完全。通过添加100mL甲醇猝灭反应，将混合物蒸发成油，重溶于6L二氯甲烷，通过800g硅胶。在装柱过程中使BVdU-PA的主要部分(在本文被称为“NB1011”)通过柱，最后流过5L5％甲醇的二氯甲烷溶液完全洗脱NB1011。合并含NB1011的全部级分，蒸发成油，将残余物溶于4L醋酸乙酯，用水(2×2L)萃取混合物。用硫酸钠干燥有机层，过滤，用醋酸乙酯(3×300mL)洗涤。蒸发合并的滤液和洗涤液而产生浅白色泡沫；总重量：～540g：
通过两次硅胶色谱法(分别应用0～5％MeOH的CH2Cl2溶液和10％MeOH的CH2Cl2溶液作为洗脱液)纯化粗产品。产品(＞98％纯度)的产量是64g。
                      实施例16
应用实施例15中描述的方法，制备了下列核苷的苯基N-甲氧基-L-丙氨酰氨基磷酸酯：
1. 5-(4，4-二溴-1，3-丁二烯基)-2′-脱氧尿苷，
2. 5-(2-氯乙烯基)-2′-脱氧尿苷，
3. 5-三氟甲基-2′-脱氧尿苷，
4. 5-(4-乙酯基-1，3-丁二烯基)-2′-脱氧尿苷，
5. 5-(4-甲酯基-1，3-丁二烯基)-2′-脱氧尿苷，
6. 5-(4-溴-1E，3E-丁二烯基)-2′-脱氧尿苷，
7. 5-(4-溴-1E，3Z-丁二烯基)-2′-脱氧尿苷，
8. 5-(三甲基甲硅烷基乙炔基)-2′-脱氧尿苷，
9. 5-(乙炔基)-2′-脱氧尿苷，
10. 5-(1-癸炔基)-2′-脱氧尿苷，
11. 3-(2′-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-2，3-二氢呋喃并[2，3-d]嘧啶-2-酮，
12. 3-(2′-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-6-辛基-2，3-二氢呋喃并[2，3-d]嘧啶-2-酮。衍生物
本文公开的上述化合物的盐、酯和醚都在本发明的范围内。本发明的前体药物的盐可得自无机或有机酸和碱。酸的实例包括：盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、高氯酸、富马酸、马来酸、磷酸、乙醇酸、乳酸、水杨酸、琥珀酸、对甲苯磺酸、酒石酸、醋酸、柠檬酸、甲磺酸、乙磺酸、甲酸、苯甲酸、丙二酸、萘-2-磺酸和苯磺酸。其它酸(例如草酸)虽然本身不是药物上可接受的，但也可用于制备适用作获得本发明的化合物及其药物上可接受的酸加合盐的中间体的盐。碱的实例包括：碱金属(例如钠)氢氧化物、碱土金属(例如镁)氢氧化物、氨和式NW4 +的化合物(其中，W是C1-4烷基)。
盐的实例包括：醋酸盐、己二酸盐、藻酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、硫酸氢盐、丁酸盐、柠檬酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、环戊烷丙酸盐、digluconate、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、富马酸盐、flucoheptanoate、甘油磷酸盐、半硫酸盐(hemisulfate)、庚酸盐、己酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、2-羟基乙磺酸盐、乳酸盐、马来酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、草酸盐、双羟萘酸盐(palmoate)、果胶酸盐(pectinate)、过硫酸盐、phenylproprioate、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、甲苯磺酸盐和十一酸盐。盐的其它实例包括本发明化合物的阴离子与合适的阳离子[例如，Na+、NH4 +和NW4 +(其中，W是C1-4烷基)]化合生成的盐。
就治疗用途来说，本发明化合物的盐将是药物上可接受的。然而，药物上不可接受的酸和碱的盐也可用于，例如，制备或纯化药物上可接受的化合物。
通过本发明方法鉴别的前体药物或化合物的酯包括：通过2′-，3′-，和/或5′-羟基的酯化获得的羧酸酯(即，-O-C(＝O)R)，其中，R选自(1)直链或支链烷基(例如，正丙基、叔丁基或正丁基)，烷氧基烷基(例如，甲氧基甲基)，芳烷基(例如，苄基)，芳氧基烷基(例如，苯氧基甲基)，芳基(例如，苯基，任选被例如卤素、C1-4烷基或C1-4烷氧基或氨基取代)；(2)磺酸酯，例如，烷基磺酰(例如，甲磺酰)或芳烷基磺酰；(3)氨基酸酯(例如，L-缬氨酰或L-异亮氨酰)；(4)膦酸酯以及(5)一磷酸酯，二磷酸酯或三磷酸酯。磷酸酯可被例如C1-20醇或其活性衍生物或者被2，3-二(C6-24)酰基甘油进一步酯化。在这样的酯中，除非另外说明，存在的任何烷基部分有利地含1～18个碳原子，优选1～6个碳原子，更优选1～4个碳原子。在这样的酯中存在的任何环烷基部分有利地含3～6个碳原子。在这样的酯中存在的任何芳基部分有利地包括苯基。本发明的来苏-呋喃糖基(lyxo-furanosyl)前体药物衍生物的实例包括例如，具有被化学保护的羟基(例如，具有O-乙酰基)的那些，例如，2′-O-乙酰基-来苏-呋喃糖基；3′-O-乙酰基-来苏-呋喃糖基；5′-O-乙酰基-来苏-呋喃糖基；2′，3′-二-O-乙酰基-来苏-呋喃糖基和2′，3′，5′-三-O-乙酰基-来苏-呋喃糖基。
本发明的化合物的醚包括：甲基醚、乙基醚、丙基醚、丁基醚、异丁基醚和仲丁基醚。
在进一步的实施方案中，所述底物可能不与嘧啶或叶酸酯化学相关，而是基于合理药物设计的已知参数合成的。参见Dunn，W.J.等(1996)。
下文提供的实施例中或者由Barr，P.J.等(1983)描述了对产品(例如，当反应产物是dUMP的溴乙烯基衍生物的抗代谢物时)的化学检测。对细胞中的核苷和一磷酸的量的检测
该检测是用化合物NB1011进行的。然而，本领域技术人员应懂得，容易修改下述方法而用于本发明的前体药物。
将处于补加了10％FCS和抗生素的RPMI培养基中的细胞系MCF7(乳腺癌细胞系)；MCF7TDX(Tomudex抗性乳腺癌细胞系)和H630R10(5-FU抗性结肠癌细胞系，得自Dr.S.Copur，YaleUniversity，参见Copur，S.等(1995))以每个皿750,000个细胞的量铺板于100mm培养皿中，在37℃下培养一夜。往每个培养皿中添加100μM BVdU，使细胞在37℃下继续生长2天。此后，吸出培养基，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)将细胞洗涤两次。然后，在每个培养皿中添加1ml PBS，将培养皿置于-80℃冷冻机中。通过冷冻/融化操作(重复两次)使细胞破裂。旋转(13,000rpm，10分钟)使形成的悬浮液中的细胞渣沉降，使上清液流过离心过滤装置(Centrifugal FilterDevice)(Centrifree，30,000截止，Amicon)通过在20℃的SorvallSuper T21离心机(Rotor SL-50-T，1,912g)上以5,000rpm离心30分钟而脱除蛋白质。将流过的液体浓缩至100μl的体积，注射到HPLC柱(Adsorbosphere HS，C18，5μm，4.6mm×150mm，Alltech)上。应用乙腈于水中的梯度(含三氟乙酸)分析样品。检测300nm处的峰(BVdU衍生物的最大吸收值)，以300nm处的峰面积表达化合物的量。化合物的鉴定是通过将它们的保留时间和谱与真实标准物的比较而进行的。AlamarBlue细胞增殖检测
该检测是用化合物NB1011和本发明的前体药物进行的。将指数生长的细胞转移到384孔平底组织培养板上。将所有类型的细胞以每孔500个细胞的密度铺板于25μL完全培养基(RPMI 1640+10％胎牛血清+抗生素/抗真菌剂)中。24小时(0天)后，一式三份添加25μL含10-3～10-10M剂量范围的所述化合物的完全培养基。药物接触时间是120小时(5天)，此后，检测生长抑制。往每孔添加5μL氧化还原指示剂(alamarBlue)(10％v/v)。在37℃下培养4小时后，监测荧光(535nm激发和595nm发射处)。结晶紫细胞增殖抑制检测
该检测是用化合物NB1011和本发明的前体药物进行的。通过结晶紫方法[Sugarman，B.J.等(1985)；以及Antelman，D.等(1995)]测定了试验化合物阻止细胞增殖的能力。
将化合物溶于二甲亚砜至1M的浓度。必要的话，用DMEM细胞培养基进一步稀释它们，接着，置于96孔微量滴定板的第一批孔中。对靶细胞系一式三份测试每个浓度。测试了1μM～3000μM的化合物浓度。将细胞与化合物保温72小时，洗涤所述板，用甲醇固定细胞，用结晶紫按Sugarman，B.J.等(1985)；以及Antelman，D.等(1995)的方法染色。细胞系中TK和TS水平的蛋白质印迹分析
应用人正常结肠上皮细胞类型CCD18co(得自ATCC，Manassas，VA)，抗5-FU的结肠腺癌细胞系H630R10(得自Dr.S.Copur，YaleUniversity，参见Copur，S.等(1995))，以及HER2-转染的乳腺癌细胞系(Pegram，M.D.等(1997))进行了蛋白质印迹试验。将细胞溶于RIPA缓冲液(50mM Tris-HCl，pH7.5，150mM NaCl，0.5％TritonX-100，0.1％SDS以及0.5％脱氧胆酸、钠盐和蛋白酶抑制剂)。通过应用BCA-200蛋白质分析盒(得自Pierce，Rockford，IL)测定蛋白质浓度。用12％SDS-PAGE溶解10μg各细胞系的蛋白质。将分离的蛋白质转移到PVDF膜(得自Amersham，England)上，接着，用人胸苷酸合酶单克隆初级抗体和抗微管蛋白单克隆抗体(由NeoMarkers，Fremont，CA生产的)进行免疫印迹分析。将辣根过氧化物酶联绵羊抗小鼠Ig用作次级抗体(Amersham)。利用ECL加试剂盒(Amersham)检测免疫反应性。定量分析相应于胸苷酸合酶的带，通过图象分析(Molecular Dynamics Storm)正常化成微管蛋白的带。细胞系中TS mRNA的RT-PCR分析
应用RT-PCR定量分析了不同细胞系中人胸苷酸合酶转录物的表达水平。设计了用于扩增人胸苷酸合酶和B-肌动蛋白的寡核苷酸引物如下：胸苷酸合酶有义引物(序列号：1)5′-GGGCAGATCCAACACATCC-3′(相应于胸苷酸合酶cDNA序列的碱基208～226，基因库登记号：X02308)，反义引物(序列号：2)5′-GGTCAACTCCCTGTCCTGAA-3′(相应于碱基564～583)，β-肌动蛋白有义引物(序列号：3)5′-GCCAACACAGTGCTGTCTG-3′(相应于β-肌动蛋白基因序列的碱基2643～2661，基因库登记号：M10277)和反义引物(序列号：4)5′-CTCCTGCTTGCTGATCCAC-3′(相应于碱基2937～2955)。
应用Rneasy微型试剂盒(得自Qiagen，Valencia，CA)从细胞分离总的RNAs。为了监测可能的DNA污染，设计了扩增β-肌动蛋白的引物以跨越外显子4/内含子5/外显子5连接。基因组DNA模板产生313bpβ-肌动蛋白片段，而cDNA模板则产生210bp产物。
用SuperScript前置放大***(Gibco/BRL，Gaithersburg，MD)进行了逆转录反应。用3μg总的RNA(于20μl缓冲液的体积内)按生产商的方案进行逆转录反应。
PCR反应是在含下列物质的48μl体积内进行的：3μl来自逆转录反应的cDNA混合物，3mM MgCl2，50mM KCl，20mM Tris-Cl(pH8.4)，各0.2mM dNTP、0.4TM胸苷酸合酶有义和反义引物，以及3单位TaqDNA聚合酶(得自Promega，Madison，WI)。在94℃下将反应混合物保温3min，接着，循环10次在94℃下1min保温、在58℃下1min保温、然后在72℃下1min保温。循环10次后，添加处于2μl中的人β-肌动蛋白引物以达到0.2μM的最终浓度，使最终反应体积为50μl。继续进行PCR反应至总计28次循环，接着在72℃下进行7min保温。
通过电泳将5μl PCR产物溶于2％琼脂糖凝胶，接着，用SYBR Gold核酸凝胶染色剂(得自Molecular Probes，Eugene，Oreg.)染色。定量分析相应于胸苷酸合酶的DNA带，通过Molecular Dynamics Storm正常化成β-肌动蛋白的带。RNA印迹分析
RNA印迹得自Invitrogen(Carlsbad，CA)，将它与克隆化TS cDNA探针杂交。将杂交信号对作为管家转录物的核糖体蛋白质S9正常化。乳膏正常化信号与正常组织对比物相比增强至少2倍，就认为肿瘤超量表达TS mRNA。人胸苷酸合酶的克隆、表达和纯化
为了在大肠埃希氏菌中表达，将完全人TS ORF亚克隆入T7启动子表达载体pET28a(Novagen，Inc.)。生成的质粒载体编码作为含六个组氨酸接着是凝血酶切割位点的重组融合蛋白的人TS的合成。该融合蛋白为人TS的氨基端添加共20个额外的氨基酸。为了生产重组蛋白质，将人TS表达载体导入大肠埃希氏菌株BL21(DE3)(一种在乳糖操纵基因的控制下在染色体中***T7 RNA聚合酶基因的菌株)。
应用金属螯合亲合树脂(Novagen，Inc.)纯化人TS-poly-His融合蛋白。蛋白质纯化之后是在10％SDS聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳。应用Pierce BCA蛋白质检测法测定蛋白质浓度。从500ml大肠埃希氏菌培养物回收约10mg人TS融合蛋白。当用银染色法观察时，只有相应于人TS的带是明显的。通过用抗TS单克隆抗体TS106(NeoMarkers)进行蛋白质印迹而证实人TS带的鉴定。胸苷酸合酶(TS)活性检测
应用Wahba等(1961)的分光光度分析测定TS活性。在此分析中，通过测定340nm处的吸光度增大(随着dUTP转化为dTTP，当辅因子5，10亚甲四氢叶酸被氧化成二氢叶酸时产生该现象)而监测TS活性。通过这种方法制备的酶具有0.5～0.65个单位/mg蛋白质的比活。一个单位被定义为每分钟生产一微摩尔dTMP。该值与Pedersen-Lane，J.等(1997)报导的相似。TS前体药物代谢的胞内产物的测定
重要的是测定TS前体药物代谢的胞内产物以便核实提出的活化和作用机制并确定属于候选治疗剂的作用剂。一个关于芳基磷酸二酯酰胺化物的胞内代谢的可接受观点涉及，酶促转化为羧酸，磷酸一酯酰胺化物至5′-单磷酰核苷的分子内重排。参见，Valette等(1996)。然而，这个机制不大可能描述所有基于氨基磷酸酯的前核苷酸的胞内加工。例如，提出了一个关于芳基磷酸一酯酰胺化物加工的不同机制，一个涉及通过氨基磷酸酯水解物(hydrolate)将氨基磷酸酯简单直接转化为一磷酸酯物质，参见McIntee等(1997)和Fries等(1995)。不管未掩蔽核苷一磷酸酯的机制如何，该检测法将测定细胞内的胞内一磷酸酯至细胞毒性化合物的TS转化的产物。
将细胞与一定量引起高TS表达细胞系(在72H检测中，上文)的50％生长抑制的前体药物化合物一起保温。应用了低TS表达细胞和高TS表达细胞(例如，CCD18co与H630R10)。进行时程研究，其中，按McIntee，E.J.等(1997)描述的方法加工处理过的细胞。用60％甲醇水溶液在-20℃下溶解细胞，通过离心除去粒状的残余物。将上清液干燥，在-20℃下贮存。先后通过RP-HPLC和LC-MS估测等分样以确定氨基磷酸酯至一磷酸酯的胞内转化，还保证通过胸苷酸合酶转化一磷酸酯。利用纯化的胸苷酸合酶确证底物活性
该检测测定了未来TS酶制剂的比活以保障这类制剂随时间的活性，从而确定屏蔽合适的活性的化合物是否在体外反应条件下灭活TS酶。
为了确定当将前体药物化合物与纯化的重组TS酶一起保温时产生了什么反应产物，应用了与TS活性检测中所用的相似条件而在体外产生反应产物。然后通过GC-质谱分析这些反应产物以鉴定生成的实际分子。
                            结果 在数个肿瘤细胞系和初级肿瘤中高度表达TS
应用上述定性RT-PCR测定了在正常人脑、心脏、肾、脾、肝、结肠、肺、小肠、胃肌肉、睾丸、卵巢、子宫、***、甲状腺、唾腺、肾上腺、皮肤、外周血淋巴细胞、骨髓和人结肠和配对的人正常组织中的胸苷酸合酶表达水平。设计了β-肌动蛋白的引物以跨越外显子4/内含子5/外显子5连接而监测可能的DNA污染。因此，以相对TS mRNA水平示出图3中报告的结果。图3A示出了多种正常人组织中的相对TS mRNA水平。图3B是正常人结肠组织和肿瘤人结肠组织之间的平均TS mRNA的比较。
按上述方法测定了各种培养的正常细胞系和肿瘤细胞系中的胸苷酸合酶(TS)蛋白质水平。通过蛋白质印迹分析测定了蛋白质水平；结果如下所示。
                        表3
        人正常细胞和肿瘤细胞中的TS蛋白质水平细胞株            描述                      TS水平1NHOST             骨，成骨细胞               51NPRSC             ***，基质               98CCD18co           结肠上皮，成纤维细胞       100WI38              肺，胚性的                 150DET551            皮肤，成纤维样的，胚性的   177MRC9              肺，成纤维样的，胚性的     211NHDF              皮肤，成纤维细胞           224NHLF              肺，成纤维细胞             236平均                                         156±2421.胸苷酸合酶(TS)-TS水平是通过应用蛋白质印迹分析测定的，量化的表达水平以相对于细胞株CCD18co的值表示。2.标准误差
                            肿瘤细胞(≥4X TS)细胞株               描述                         TS水平1H630/TDX             结肠，癌，TDX2抗性            671HCTC(+)              结肠，癌，增大的TS             1276MCF7/TDX             乳腺，腺癌，TDX2抗性          1980H630R10              结肠，癌，5-FU3抗性           2305平均                                                1558±35421.胸苷酸合酶(TS)-TS水平是通过应用蛋白质印迹分析测定的，量化的表达水平以相对于细胞株CCD18co的值表示。2.Tomudex3. 5-氟尿嘧啶4.标准误差在细胞中测定的BVdUMP和BVdU的量
用BVdU处理的每个细胞系MCF7、MCF7TDX和H630R10的溶胞产物中存在的BVdUMP或BVdU的量都以相应的300nm处HPLC峰的面积表示。注意，这些化合物在300nm处的消光系数都相同，所以，峰面积的比较能直接比较形成的量。
下表4示出了2天处理后测定的细胞内BVdUMP和BVdU的水平。将细胞在含100μm BVdU的完全培养基中培养。制备了溶胞产物，测定BVdUMP和BVdU的水平。
                          表4
 细胞系     BVdUMP     BVdU     BVdUMP/(BVdUMP+BVdU)×100
 MCF7     63.7     90.8     44.2
 MCF7TDX     10.9     39.0     21.2
 H630R10     ＜1     26.3     ＜4
上表表明，BVdU能渗透全部三种细胞，但似乎BVdUMP在MCF7和MCF7TDX细胞系中最突出。在H630R10细胞系中出现小的转化。
在一个单独的试验中，用MCF7TDX和H630R10细胞溶胞产物催化无细胞体系(添加了作为磷酸盐供体法的ATP)中的BVdU磷酸化。这证实了MCF7TDX细胞溶胞产物中此反应高得多的速率(和H630R10细胞溶胞产物相比)。可制备如(Look，K.Y.等(1997))所述那样制备的肿瘤溶胞产物，并在此检测中用来与BVdU(或其它备选的核苷)确定给定的患者是否是核苷与氨基磷酸酯疗法的候选者。
这些结果表明，在MCF7TDX细胞中，BVdU可被磷酸化而产生相应的一磷酸酯(后续TS反应的底物)，而在H630R10细胞中，这样的磷酸化显然比MCF7TDX中的更慢。值得一提的是，MCF7TDX是乳腺肿瘤细胞系。已有报导：在乳腺肿瘤细胞中，发现了具有与人其它组织的TK不同特性的TK(Madec，A.等(1997))。该TK可能导致BVdU磷酸化。基于上述结果，预计核苷(例如，BVdU)可能特别适用于治疗某些类别的癌(包括乳腺癌)，其中，BVdU可被磷酸化。此外，上述试验方法能使应用如下方法体外确定对给定类别的癌施用BVdU或其它核苷的可行性。如果可获得组织样品，就可用BVdU在体外处理细胞，于是，就可监测BVdUMP的可能形成。如果记录了BVdUMP的形成，必定将这类肿瘤看作适合成功的核苷处理(与氨基磷酸酯衍生物相比)。
                         表5
    对正常细胞和肿瘤细胞的Alamar Blue细胞毒性检测
  MCF7TDX  IC50(μM)H630R10    HT1080     平均肿瘤          IC50(μM)CCd18co Det551     平均正常
 NB1011     2     82     182     88.7     414     398     406
 BVDU     0.02     201     719     306.7     1000     ND     1000
 NB1012     127     82     -     104.5     ND     110     110
 NB1013     26     92     ND     59.0     ND     570     570
 NB1020     0.48     326     1000     442.2     1000     ND     1000
 NB1014     396     287     ND     341.5     ND     239     239
 NB1016     877     337     ND     607.0     ND     338     338
 NB1021     637     141     1000     592.7     1000     ND     1000
 NB1017     55     52     ND     53.5     ND     137     137
 NB1024     4     14     258     92.0     1000     ND     1000
 NB1018     115     164     ND     139.5     ND     412     412
 NB1022     8     0.03     3     3.7     9     ND     9
 NB1019     251     95     ND     173.0     ND     ND     -
 NB1023     5     0.11     2     2.4     11     ND     11
 NB1026     1000     1000     1000     1000.0     1000     ND     1000
 NB1025     49     192     454     231.7     378     ND     378
                                    表6
                    对正常细胞和肿瘤细胞的结晶紫检测
        IC50(uM)H630R10   HT1080#12     平均肿瘤        IC50(μM)CCD18co     Det551     平均正常
    NB1011     130     1.2     65.6     408     356     382
    BVDU     405     7     206.0     1000     625     812.5
    NB1017     111     17     64.0     206     253     229.5
    NB1024     92     3.3     47.7     784     460     622
    NB1018     248     20     134.0     254     431     342.5
    NB1022     3.8     0.3     2.1     0.7     3.6     2.15
    NB1019     220     24     122.0     162     824     493
    NB1023     2.7     0.2     1.5     0.9     3.3     2.1
表5和6中的编号表示下文所示的结构。应用alamarBlue检测的测试结果示于表5中，而来自基于结晶紫的检测的结果则示于表6中。MCF7-TDX来自MCF7乳腺肿瘤细胞，是经过在Tomudex(TS的直接抑制剂)存在下在细胞培养物中选择的。这样的选择通常导致TS的高胞内水平(Freemantle，S.J.等(1995))。同样，H630R10是来自H630结肠癌细胞的5FU(氟代嘧啶)抗性结肠癌上皮细胞系。参见，Copur，S.等(1995)。HT1080，#12是纤维肉瘤肿瘤细胞系，它经过诱导入HT1080肿瘤细胞中的转基因表达高TS水平。用于这些检测中的正常细胞系包括CCD18co(正常结肠上皮)和Det551(正常皮肤)。
表5和6中的数据表明，大多数化合物作为氨基磷酸酯和核苷是活泼的。一个例外是NB1026TM，它作为氨基磷酸酯具有很小的可检测活性，不过作为核苷(NB1025TM)是活泼的。该结果表明，NB1026TM可能不像NB1011TM那样被活化。关于核苷(特别是BVdU、NB1020TM(ClVdU)和NB1024TM)的细胞毒性结果令人意外，因为文献启示了，5-取代的化合物(例如，BVdU)不被人细胞有效地一磷酸化，除非它们表达病毒胸苷激酶。参见，Balzarini，J.等(1985)和De Clerq，E.等(1997)。这些作者提出了，一旦被疱疹病毒编码的TK磷酸化，5-取代的核苷酸衍生物就能结合到TS酶上并将它灭活。表4～6的结果首次阐明了，至少一些肿瘤细胞可能具有异常的胸苷激酶活性，即，能磷酸化与BVdU相似的5-取代的尿苷分子，以及本文示出的其它核苷。某些肿瘤细胞也可能具有异常高的量，或者形成正常TK酶(Suki，S.等(1995)；以及Romain，S.等(1995))，导致将核苷低而充分活化成它们相应的一磷酸酯。
上述测试的化合物NB1024TM包含两种异构体的混合物，即，5-(4-溴-1E，3E-丁二烯基)-2′-脱氧尿苷(VIIa)(异构体2)，以及5-(4-溴-1E，3Z-丁二烯基)-2′-脱氧尿苷(VIIb)(异构体1)。这两种化合物是通过半制备HPLC(反相C18柱)应用20％乙腈水溶液作为流动相如前述那样(实施例12)分离的。然后，通过结晶紫法测定每一种分离的化合物阻止细胞增殖的能力。结果示于表7中。这两种异构体显示与Z异构体显著不同的活性，表明与E异构体相比明显更大的生长抑制活性。
                表7.NB1024异构体的细胞毒性活性
TS HT1080#12   MCF7TDX    CCD18co   Det551
 NB1011     4.3     4.2     461     263
 BVdU     ND     ＜0.8     ＞1000     ＞1000
 NB1024混合物     10.7     6.4     ＞300     ＞300
 NB1024异构体1     10.1     9.8     ＞300     ＞300
 NB1024异构体2     ＞300     ＞300     ＞300     ＞300
前两种细胞系(TS HT1080#12和MCF7TDX)表达高水平的TS，而其它两种(CCD18co和Det551)则是正常细胞。
虽然参照其特定的实施方案详细描述了本发明，但本领域技术人员应懂得，可对其进行各种改变和修饰而不偏离它的精神和范围。
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Claims (52)

1.一种具有如下结构的化合物：或其互变异构体；其中，R12或R13可以相同或不同并且选自下组：氧代，OH或NHNH2；
其中，如果a是0或1，假定：如果a是0，而且R13是氧代，那
么，在位置3和4之间存在一个双键，并且R12是NHNH2；或者
如果a是0，而且R12是氧代，那么，在位置2和3之间存在一个
双键，并且R13是NHNH2；或者
如果a是1，那么，R12和R13都是氧代；其中，R1是具有下式的取代基：其中，R2和R3独自是不饱和的或饱和的烃基；其中，n是0或1～10的整数，而m则是0或1；以及其中，R4选自下组：F，Cl，Br，I，CN，SO3H，CO2H，CO2CH2CH3，CO2CH3，SI(CH3)3，CHO，NO2，CF3，CCl3，CH＝C(R15)2或具有如下结构的取代基：
其中，Xa和Xb独自相同或不同并且选自下组：Cl，Br，I，以及有效的离去基；
其中，Ya、Yb或Yc独自相同或不同，它们是H或F；
其中，Z、Za和Zb独自相同或不同，它们选自O和S；以及
其中，R14是H或F，假定，如果R14是F，那么，a是1，而且R12和R13都是氧代；以及
其中，Q选自下组物质：糖，碳环，以及无环的化合物，或者掩蔽的磷酸酯衍生物或其氨基磷酸酯衍生物。
2.权利要求1的化合物，其中，Q是选自具有如下结构的取代基：其中，Ra和Rb独自相同或不同并且选自下组：Br，Cl，F，I，H，OH，
  OC(＝O)CH3，和被保护的羟基；以及其中，R7在Q的5′位与Q连接，并且选自下组：氢，磷酸酯基，磷酸
  二酯基或氨基磷酸酯基；而且其中，所述化合物可以呈任意对映的、非对映的或立体异构的形
  式，包括D型、L型、α端基异构形式和β端基异构形式。
3.权利要求2的化合物，其中，Q是：
Figure A0081207300042
4.权利要求1的化合物，其中，m是0，而R2则选自下组基：
Figure A0081207300051
其中，R5独自相同或不同并且选自下组：具有1～10个碳原子的直链
烷基或支链烷基，具有3～10个碳原子的环烷基，CN和卤素。
5.权利要求1的化合物，其中，R2和R3一起构成一个烯基或炔基，它选自下组：
Figure A0081207300061
6.权利要求1的化合物，其中，m是0，而R2则是选自下组的芳烃基：
Figure A0081207300062
7.权利要求1的化合物，其中，m是0，而R2则是选自下组的杂芳基：
Figure A0081207300063
其中，J选自下组：-O-，-S-，-Se-，-NH-，和-NRALK-，
而且其中，RALK是具有1～10个碳原子的直链或支链烷基或者具有3～10个碳原子的环烷基。
8.权利要求2的化合物，其中，R7是：
Figure A0081207300064
9.权利要求2的化合物，其中，R7是：
Figure A0081207300071
10.权利要求2的化合物，其中，R7选自下组：
Figure A0081207300072
11.权利要求2的化合物，其中，R7选自下组：
或者具有如下结构的化合物：其中，Rd是芳族取代基。
12.权利要求1的化合物，其中，R4选自下组：
13.一种具有如下结构的化合物：
Figure A0081207300083
其中，Xd和Xe独自相同或不同并且选自下组：Cl，Br，I，和CN；或其核苷类似物。
14.权利要求13的化合物，其中，Xd是Cl或Br，而Xe则是H。
15.一种具有如下结构的化合物：其中，Xf和Xg独自相同或不同并且选自下组：Cl，Br，I，和CN；或其核苷类似物。
16.权利要求15的化合物，其中，Xf和Xg相同，各自是Cl或Br。
17.一种具有下式结构的化合物：
Figure A0081207300092
其中，每个X选自下组：Cl，Br，I，和CN；或其核苷类似物。
18.权利要求17的化合物，其中，X是Cl或Br。
19.权利要求18的化合物，其中，X是Br。
20.一种具有如下结构的化合物：
Figure A0081207300101
其中，R8是低级直链或支链烷基；或其核苷类似物。
21.一种具有如下结构的化合物：其中，R8和R9都是低级直链或支链烷基，而R10是H或CH3；或其核苷类似物。
22.一种具有如下结构的化合物：
Figure A0081207300103
其中，R10是H或CH3；或其核苷类似物。
23.一种具有如下结构的化合物：
Figure A0081207300111
24.一种具有如下结构的化合物：或其核苷类似物。
25.权利要求1的化合物，其中，该化合物具有如下结构：
Figure A0081207300113
26.权利要求25的化合物，其中，R7＝H。
27.权利要求25的化合物，其中，R7是具有如下结构的取代基：
Figure A0081207300121
28.权利要求1的化合物，其中，该化合物具有如下结构：
29.权利要求28的化合物，其中，R7＝H。
30.权利要求28的化合物，其中，R7是具有如下结构的取代基：
31.一种具有如下结构的化合物：
32.一种具有如下结构的化合物：
Figure A0081207300131
其中，X选自下组：CO2Et，Cl，和Br；或其核苷类似物。
33.一种具有如下结构的化合物：
Figure A0081207300132
或其核苷类似物。
34.一种具有如下结构的化合物：
或其核苷类似物。
35.一种组合物，它包含权利要求1～34的化合物，以及一种载体。
36.权利要求35的组合物，其中，所述载体是药物上可接受的载体。
37.一种筛查治疗剂的方法，它包括：
(a)将含靶细胞的样品与权利要求13～34的任意化合物接触；
(b)将靶细胞的单独样品与可能的治疗剂接触；和
(c)比较样品对细胞增殖或细胞杀伤的抑制作用。
38.权利要求37的方法，其中，所述靶细胞的特征在于对化疗药物的抗性。
39.权利要求37的方法，其中，所述靶细胞的特征在于表达一种作为通过化疗而体内选择的结果而被扩增的靶酶。
40.权利要求37的方法，其中，所述靶酶是在靶细胞中被超量表达的内源性胞内酶。
41.权利要求13～34的任意化合物在制备用于治疗或抑制病理细胞增殖的药剂中的应用。
42.一种抑制病理细胞增殖的方法，它包括，将所述细胞与有效量权利要求13～34的任意化合物接触。
43.权利要求42的方法，其中，所述病理细胞抗化疗药物。
44.权利要求42的方法，其中，所述病理细胞表达一种作为通过化疗而体内选择的结果而被扩增的靶酶。
45.权利要求44的方法，其中，所述靶酶是在靶细胞中被超量表达的内源性胞内酶。
46.权利要求45的方法，其中，所述酶是胸苷酸合酶。
47.一种治疗以受治疗者的靶细胞增殖为特征的病理的方法，它包括，对受治疗者施用权利要求13～44的任意化合物。
48.权利要求47的方法，其中，所述靶细胞抗化疗药物。
49.权利要求47的方法，其中，所述靶细胞表达一种作为通过化疗而体内选择的结果而被扩增的酶。
50.权利要求49的方法，其中，所述靶酶是在靶细胞中被超量表达的内源性胞内酶。
51.权利要求50的方法，其中，所述酶是胸苷酸合酶。
52.权利要求48的方法，它进一步包括，在逆转了对以前的化疗的抗性后，将所述细胞与以前的化疗接触。
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