CN108148098B - 靶向癌细胞高水平ros的吉西他滨-芳香氮芥缀合物及其制备方法和医药用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种靶向癌细胞高水平ROS的吉西他滨‑氮芥缀合物及其药学上可接受的盐，具有通式I所示结构：

Description

靶向癌细胞高水平ROS的吉西他滨-芳香氮芥缀合物及其制备 方法和医药用途
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种靶向癌细胞高水平ROS的吉西他滨-氮芥缀合物及其药学上可接受的盐，它们的制备方法，含有这些衍生物的药用组合物以及它们的医药用途，特别是在制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术
吉西他滨(gemcitabine,dFdC)是1996年美国FDA批准的新的抗代谢类抗癌药物。dFdC 是一种细胞周期特异性抗肿瘤药，在细胞内dFdC历经一系列的磷酸化，扮演一个竞争脱氧胞苷三磷酸底物，其通过竞争嵌入DNA双链,引起DNA双链错误识别，从而发挥其独特的细胞毒作用，抑制肿瘤细胞生长，促使细胞凋亡(Jordheim LP,Durantel D,Zoulim F,etal. at Rev Drug Discov,2013,12:447-464)。虽然dFdC已在临床使用，但其极性较大，跨膜能力较差，从而导致体内生物利用度降低，半衰期较短；同时其N4位氨基易被脱氨酶降解失活 (Moysan E,Basttiat G,Benoit JP.Mol Pharm,2013,10:430-444)。因此在dFdC的N4位氨基进行亲脂性修饰有助于提高dFdC脂溶性和跨膜能力，也降低N4位氨基被脱氨酶降解，改善药物体内生物利用度。
Figure GDA0002639734350000011
在临床上长期使用的芳香氮芥药物，如苯丁酸氮芥(chlorambucil)，苯达莫司汀(bendamustine，Treanda)，主要引起DNA单链和双联通过烷化作用交联而影响DNA的功能。其中Cephalon公司的苯达莫司汀被美国FDA于2008年3月21日批准，用于慢性淋巴细胞性白血病。有临床研究表明，芳香氮芥药物苯达莫司汀或苯丁酸氮芥与吉西他滨联合用药，可明显促进药物治疗耐受性，协同抑制恶性肿瘤的生长，延长癌症患者的生存期，并可提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，用于治疗复发/难治性多发性骨髓瘤和淋巴瘤(Santoro A,Mazza R,Pulsoni A,et al.J Clin Oncol.2016,4(27):3293-9；Quaglino P,Maule M,Prince HM,et al.Ann Oncol.2017,28(10):2517-2525)，但是此类药物联合用药缺乏选择性，对正常组织的毒性也很大，单个药物本身的生物利用度不高，这些问题仍然有待于进一步改进。
肿瘤微环境中活性氧簇(ROS，包括O2 -，HO·和H2O2)的水平明显高于正常组织，据文献报道，正常组织的H2O2浓度仅在0.001～0.7μM左右,而肿瘤组织由于过量H2O2的产生和累积，达50～100μM，并可以耐受外部环境中0.1～10mM浓度的H2O2(Stone JR.Arch BiochemBiophys.2004,422,119-124)，同时ROS水平在肿瘤细胞的增殖和转移期间也会出现升高。可基于肿瘤微环境中ROS的高含量，设计相应的靶向性抗肿瘤前药。
基于以上研究，本发明根据前药设计原理和拼合原理，利用芳香氮芥如苯丁酸氮芥、苯达莫司汀的羧基与吉西他滨的N4位氨基进行酰胺化偶联，同时在吉西他滨的5’和/或3’的羟基上引入频那醇苯硼酸酯，利用频那醇苯硼酸酯选择性地被肿瘤细胞高水平的ROS氧化离去，从而释放药物的特点，设计合成了靶向癌细胞高水平ROS的吉西他滨-芳香氮芥缀合物。目前尚未见对此类化合物的任何报道。
发明内容
本发明针对现有技术不足，首次公开了一种靶向癌细胞高水平ROS的吉西他滨-芳香氮芥缀合物及其药学上可接受的盐、其制备方法及其医药用途。
本发明具体技术方案如下：
一种靶向癌细胞高水平ROS的吉西他滨-氮芥缀合物及其药学上可接受的盐，具有通式Ⅰ所示结构：
Figure GDA0002639734350000021
通式Ⅰ中：
R代表
Figure GDA0002639734350000022
R1代表H或者
Figure GDA0002639734350000023
R2代表H或者
Figure GDA0002639734350000024
本发明的一个优选方案，所述缀合物通式Ⅰ的结构中的R、R1、R2选自如下组合：
Figure GDA0002639734350000031
R1＝H，R2＝H；
或者
Figure GDA0002639734350000032
R2＝H；
或者
Figure GDA0002639734350000033
R1＝H，
Figure GDA0002639734350000034
或者
Figure GDA0002639734350000035
或者
Figure GDA0002639734350000036
R1＝H，R2＝H；
或者
Figure GDA0002639734350000037
R2＝H；
或者
Figure GDA0002639734350000038
R1＝H，
Figure GDA0002639734350000039
或者
Figure GDA00026397343500000310
本发明优选化合物编号及其对应的结构如表1所示。
表1通式Ⅰ优选化合物编号及其对应的结构
Figure GDA00026397343500000311
本发明的另一目的在于提供本发明通式Ⅰ所述化合物的制备方法，步骤包括：
(1)化合物3在咪唑的存在下，与叔丁基二甲基氯硅烷反应得到化合物4，
Figure GDA0002639734350000041
(2)在缩合剂1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)和4-二甲氨基吡啶(DMAP) 存在下，化合物4与化合物5缩合反应得到化合物6，
Figure GDA0002639734350000042
其中，R代表
Figure GDA0002639734350000043
(3)化合物6在脱保护试剂的作用下得到化合物Ⅰa，
Figure GDA0002639734350000044
所述脱保护剂优选四丁基氟化铵(TBAF)。
进一步的，上述制备方法步骤(3)之后还可以包括步骤(4)：
(4)在DMAP或N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)存在下，化合物Ⅰa与化合物2a反应得到化合物Ⅰb、Ⅰc和Ⅰd，
Figure GDA0002639734350000051
其中，R代表
Figure GDA0002639734350000052
R’代表
Figure GDA0002639734350000053
所述化合物2a为
Figure GDA0002639734350000054
Ⅰa、Ⅰb、Ⅰc、Ⅰd均属于本发明所述通式Ⅰ化合物。
优选的，化合物2a可采用如下步骤制备而成：对溴苯甲醇在[1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯的催化下，与联硼酸频那醇酯反应得到化合物2，化合物2与N,N’-羰基二咪唑反应得到化合物2a。
Figure GDA0002639734350000055
本发明的另一目的在于提供一种含有效剂量的本发明通式Ⅰ化合物或其医学上可接受的盐及药学上可接受的载体或辅料的药物组合物。
本发明的另一目的是提供本发明通式Ⅰ化合物在制备抗肿瘤药物中的应用，尤其是在制备治疗急性白血病、多发性骨髓瘤、肝癌、肺癌、胃癌及***等抗肿瘤药物中的应用。
本发明化合物可以单独或与一种或一种以上的药学上可接受的载体组合制成制剂以供给药。例如，溶剂、稀释剂等，可以用口服剂型给药，如片剂、胶囊、可分散粉末、颗粒剂等。本发明药物组合物的各种剂型可以按照药学领域中熟知的方法进行制备。这些药用制剂中可以含有与载体组合的例如0.05％～90％重量的活性成分，更常见约15％～60％之间重量的活性成分。本发明化合物剂量可以是0.005～5000mg/kg/天，也可根据疾病严重程度或剂型的不同使用剂量超出此剂量范围。
本发明化合物可以与其他抗肿瘤药物例如烷化剂(如环磷酰胺或顺铂)、抗代谢药(如 5-氟尿嘧啶或羟基脲)、拓扑异构酶抑制剂(如喜树碱)、有丝***抑制剂(如紫杉醇或长春碱)、DNA***剂(如阿霉素)联合应用，另外还可以与放射治疗联合应用。这些其他抗肿瘤药物或放射治疗可以与本发明化合物同时或在不同时间给予。这些联合治疗可以产生协同作用从而有助于改善治疗效果。
本发明优点：
本发明根据前药设计原理和拼合原理，利用苯丁酸氮芥、苯达莫司汀的羧基与吉西他滨的N4位氨基进行酰胺化偶联，同时在吉西他滨的5’和/或3’的羟基上引入频那醇苯硼酸酯，设计合成了靶向癌细胞高水平ROS的吉西他滨-芳香氮芥缀合物。本发明利用频那醇苯硼酸酯被ROS氧化为苯酚和硼酸，化学键断裂释放药物的特点，使本发明所述化合物能够选择性地在含有高浓度ROS肿瘤细胞内释放出吉西他滨-芳香氮芥缀合物，再进一步通过各种酯酶或酰胺酶缓慢释放出吉西他滨和芳香氮芥，发挥协同抗肿瘤作用。本发明对吉西他滨进行的亲脂性修饰不仅有助于提高吉西他滨脂溶性和跨膜能力，不依赖于核苷转运蛋白进入细胞，还能够降低吉西他滨N4位氨基被脱氨酶降解，改善其体内生物利用度，而且可产生芳香氮芥引起DNA的烷化作用，影响DNA的功能，实现多重作用的抗肿瘤效果，降低肿瘤细胞对这类药物的耐药性。
具体实施方式
为了进一步阐明本发明，下面给出一系；列实施例，这些实施例完全是例证性的，它们仅用来对本发明具体描述，不应当理解为对本发明的限制。
实施例1 4-(4-(双(2-氯乙基)氨基)苯基)-N-(1-((2R,4R,5R)-3,3-二氟-4-羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-2-酮-1,2-二氢嘧啶-4-基)-丁酰胺(Ⅰ1)的制备
4-氨基-1-((2R,4R,5R)-3,3-二氟-4-(叔丁基二甲基硅氧基)-5-(叔丁基二甲基硅氧基甲基)四氢呋喃-2-基)-1H-嘧啶-2-酮(化合物4)的制备
将吉西他滨(化合物3,1.0g，3.80mmol)溶于10mL干燥的DMF中，加入TBDMS-Cl(1.15g，7.64mmol)和1.03g咪唑，室温搅拌，经薄层层析检测反应完全后，加入100ml 水，再加等量乙酸乙酯萃取三遍，有机相经无水硫酸钠干燥，减压浓缩得到粗品。粗品通过柱层析纯化(流动相甲醇：二氯甲烷＝1:25-1:15)得到1.64g，收率88％。
Figure GDA0002639734350000061
4-(4-(双(2-氯乙基)氨基)苯基)-N-(1-((2R,4R,5R)-3,3-二氟-4-(叔丁基二甲基硅氧基)-5-(叔丁基二甲基硅氧基甲基)四氢呋喃-2-基)-2-酮-1,2-二氢嘧啶-4-基)-丁酰胺(化合物6a)的制备
将苯丁酸氮芥(化合物5a)(334mg，1.10mmol)、EDCI(384，2.00mmol)、DMAP (34mg，10％)和化合物4(492mg，1.00mmol)溶于10ml无水CH2Cl2中，室温搅拌过夜，反应结束后减压蒸出溶剂，粗品通过柱层析纯化(流动相乙酸乙酯：石油醚＝1:10- 1:4)得到白色固体666mg，收率84％。
4-(4-(双(2-氯乙基)氨基)苯基)-N-(1-((2R,4R,5R)-3,3-二氟-4-羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-2- 酮-1,2-二氢嘧啶-4-基)-丁酰胺(Ⅰ1)的制备
将上一步产物化合物6a(666mg，0.84mmol)溶于无水THF中，向其中加入8.4ml 1M的TBAF四氢呋喃溶液，室温反应3-5h，反应结束后，减压蒸出溶剂，加入100ml水，乙酸乙酯萃取三遍，有机相经无水硫酸钠干燥，减压浓缩得到粗品。粗品通过柱层析纯化(流动相乙酸乙酯：石油醚＝2:1-4:1)得到(Ⅰ1)白色固体410mg，收率89％.ESI-MS(m/z):549 [M+H]+；1H NMR(DMSO-d6,400MHz):δ11.01(s,1H,NH),8.25(d,1H,J＝8.0Hz,C＝CH-N), 7.29(d,1H,J＝8.0Hz,C＝CH-C),7.03(d,4H,J＝8.0Hz,Ar-H),6.66(d,4H,J＝6.0Hz,Ar-H), 6.35(s,1H,OH),6.18(t,1H,J＝8.0Hz,CH),5.33(s,1H,OH),4.02(d,1H,J＝8.0Hz,CH),3.89 (m,1H,CH),3.80(t,2H,J＝8.0Hz,CH2),3.67(m,8H,CH2),2.44(m,4H,CH2),1.79(m,2H, CH2).
实施例2((2R,3R,5R)-5-(4-(4-(4-(双(2-氯乙基)氨基)苯基)丁酰胺基-2-氧代嘧啶-1(2H)-基-4,4- 二氟-3-羟基四氢呋喃-2-基)甲基-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼戊环-2-基)碳酸苄酯(Ⅰ2)、 (2R,3R,5R)-5-(4-(4-(4-(双(2-氯乙基)氨基)苯基)丁酰胺基-2-氧代嘧啶-1(2H)-基)-4,4-二氟-2-(羟甲基)四氢呋喃-3-基)甲基-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼戊环-2-基)碳酸苄酯(Ⅰ3)和 ((2R,3R,5R)-5-(4-(4-(4-(双(2-氯乙基)氨基)苯基)丁酰胺基-2-氧代嘧啶-1(2H)-基)-4,4-二氟-3- ((((4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼戊环-2-基)苄基)氧基)羧基)氧基)四氢呋喃-2-基)甲基-4- (4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼戊环-2-基)苄基)碳酸酯(Ⅰ4)的制备 (4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼戊环-2-基)苯基)甲醇(化合物2)的制备
将对溴苯甲醇(化合物1，1.0g，5.35mmol)溶于10mL干燥的1,4-二氧六环溶液中，加入联硼酸频那醇酯(247mg，5.88mmol)，乙酸钾和pdCl2(dppf)，N2保护条件下，加热至 85℃搅拌反应。经薄层层析检测反应完毕后，减压蒸除溶剂，加入200ml乙酸乙酯，再加等量水萃取三遍，有机相经无水硫酸钠干燥，减压浓缩得到粗品。粗品经柱层析纯化(流动相乙酸乙酯：石油醚＝1:8-1:4)得到淡黄色油状液体181mg，收率90％，ESI-MS(m/z):235 [M+H]+。
4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼戊环-2-基)苄基-1H-咪唑-1-羧酸酯(化合物2a)的制备
将化合物2(660mg，2.82mmol)溶于10ml无水CH2Cl2中，然后加入N,N’-羰基二咪唑(915mg，5.64mmol)，N2保护条件下，室温搅拌1-2h。反应结束后，补加40ml CH2Cl2，以等量的1M HCl溶液洗涤三遍，有机相经无水硫酸钠干燥后，减压浓缩得白色固体787mg，收率85％，ESI-MS(m/z):329[M+H]+。
Figure GDA0002639734350000081
((2R,3R,5R)-5-(4-(4-(4-(双(2-氯乙基)氨基)苯基)丁酰胺基-2-氧代嘧啶-1(2H)-基-4,4-二氟-3-羟基四氢呋喃-2-基)甲基-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼戊环-2-基)碳酸苄酯(Ⅰ2)、 (2R,3R,5R)-5-(4-(4-(4-(双(2-氯乙基)氨基)苯基)丁酰胺基-2-氧代嘧啶-1(2H)-基)-4,4-二氟-2-(羟甲基)四氢呋喃-3-基)甲基-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼戊环-2-基)碳酸苄酯(Ⅰ3)和 ((2R,3R,5R)-5-(4-(4-(4-(双(2-氯乙基)氨基)苯基)丁酰胺基-2-氧代嘧啶-1(2H)-基)-4,4-二氟-3- ((((4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼戊环-2-基)苄基)氧基)羧基)氧基)四氢呋喃-2-基)甲基-4- (4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼戊环-2-基)苄基)碳酸酯(Ⅰ4)制备
将化合物Ⅰ1(274mg,0.50mmol)溶于无水CH2Cl2中，然后依次加入化合物2a(197,0.60mmol)和DMAP(61mg,0.50mmol)，N2保护条件下，加热至40℃搅拌反应。经薄层层析检测反应完毕后，减压蒸除溶剂，粗品经柱层析纯化(流动相甲醇：二氯甲烷＝1:80- 1:50)分离得到淡黄色固体(Ⅰ2、Ⅰ3和Ⅰ4)，收率分别为33％、27％和21％。
其中化合物Ⅰ2谱图数据为：ESI-MS(m/z):809[M+H]+；1H NMR(DMSO-d6,400MHz): δ10.99(s,1H,NH),8.00(d,1H,J＝8.0Hz,C＝CH-N),7.70(d,2H,J＝8.0Hz,Ar-H),7.40(d,2H, J＝8.0Hz,Ar-H),7.27(m,1H,CH),7.03(d,2H,J＝8.0Hz,Ar-H),6.66(d,2H,J＝8.0Hz,Ar-H), 6.52(m,1H,CH),6.22(m,1H,CH),5.20(s,2H,CH2),4.48(m,2H,CH2),4.23(m,1H,CH),4.15 (m,1H,OH),3.69(m,8H,CH2),2.46(t,2H,J＝8.0Hz,CH2),2.42(t,2H,J＝8.0Hz,CH2),1.81 (m,2H,CH2),1.27(m,12H,CH3).化合物Ⅰ3谱图数据为：ESI-MS(m/z):809[M+H]+；1H NMR(DMSO-d6,400MHz):δ10.99(s,1H,NH),8.16(d,1H,J＝8.0Hz,C＝CH-N),7.71(d,2H,J＝8.0Hz,Ar-H),7.42(d,2H,J＝8.0Hz,Ar-H),7.30(m,1H,CH),7.03(d,2H,J＝8.0Hz,Ar-H), 6.67(d,2H,J＝8.0Hz,Ar-H),6.31(m,1H,CH),5.33(m,1H,CH),5.27(m,2H,CH2),4.29(m, 1H,CH),3.95(s,1H,OH),3.80(d,2H,J＝8.0Hz,CH2),3.69(m,8H,CH2),2.42(t,J＝8.0Hz, 2H,CH2),1.80(t,2H,J＝8.0Hz,CH2),1.58(m,2H,CH2),1.28(m,12H,CH3).以及化合物Ⅰ4谱图数据为：1H NMR(DMSO-d6,400MHz):δ11.02(s,1H,NH),8.05(d,1H,J＝8.0Hz,C＝CH- N),7.69(m,4H,Ar-H),7.39(d,4H,J＝8.0Hz,Ar-H),7.29(m,1H,CH),7.03(d,2H,J＝8.0Hz, Ar-H),6.66(d,2H,J＝8.0Hz,Ar-H),6.33(m,1H,CH),5.44(s,1H,CH),5.26(m,1H,CH),5.20 (m,4H,CH2),5.18(m,2H,CH2),4.55(m,4H,CH2),3.69(m,8H,CH2),2.46(t,2H,J＝8.0Hz, CH2),2.42(t,2H,J＝8.0Hz,CH2),1.81(m,2H,CH2),1.27(m,24H,CH2).
实施例3 4-(5-(双(2-氯乙基)氨基)-1-甲基-1H-苯并[d]咪唑-2-基)-N-(1-((2R,4R,5R)-3,3-二氟-4- 羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-2-酮-1,2-二氢嘧啶-4-基)-丁酰胺(Ⅰ5)的制备
4-(5-(双(2-氯乙基)氨基)-1-甲基-1H-苯并[d]咪唑-2-基)-N-(1-((2R,4R,5R)-4-((叔丁基二甲基硅基)氧基)-5-(((叔丁基二甲基硅基)氧基)甲基)-3,3-二氟四氢呋喃-2-基)-2-酮-1,2-二氢嘧啶- 4-基)-丁酰胺(化合物6b)的制备
将盐酸苯达莫司汀(化合物5b)(454mg，1.10mmol)、EDCI(384，2.00mmol)、DMAP(227mg，50％)和化合物4(492mg，1.00mmol)溶于10ml无水CH2Cl2中，40℃加热反应 12h，反应结束后减压蒸出溶剂，粗品通过柱层析纯化(流动相乙酸乙酯：石油醚＝2:1- 4:1)得到淡黄色固体656mg，收率79％。
4-(5-(双(2-氯乙基)氨基)-1-甲基-1H-苯并[d]咪唑-2-基)-N-(1-((2R,4R,5R)-3,3-二氟-4-羟基- 5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-2-酮-1,2-二氢嘧啶-4-基)-丁酰胺(Ⅰ5)的制备
将上一步产物化合物5b(656mg，0.79mmol)溶于无水THF中，向其中加入7.9ml 1M的TBAF四氢呋喃溶液，室温反应3-5h，反应结束后，减压蒸出溶剂，加入100ml水，析出固体，减压抽滤，滤饼经真空干燥箱干燥得到粗品。粗品通过柱层析纯化(流动相甲醇：二氯甲烷＝1:30-1:15)得到(Ⅰ5)淡黄色固体，收率85％，ESI-MS(m/z):603[M+H]+；1H NMR(DMSO-d6,400MHz):δ11.12(s,1H,NH),8.24(d,1H,J＝8.0Hz,C＝CH-N),7.34(d,1H, J＝8.0Hz,Ar-H),7.27(m,1H,OH),6.93(s,1H,Ar-H),6.79(m,1H,OH),6.34(d,1H,J＝8.0Hz, Ar-H),6.18(t,1H,J＝8.0Hz,CH),5.33(m,1H,CH),4.18(m,1H,CH),3.90(m,1H,CH),3.81(m, 2H,CH2),3.81(m,8H,CH2),3.68(s,3H,CH3),2.85(t,2H,J＝8.0Hz,CH2),2.58(t,2H,J＝8.0 Hz,CH2),2.05(m,2H,CH2).
实施例4((2R,3R,5R)-5-(4-(4-(5-(双(2-氯乙基)氨基)-1-甲基-1H-苯并[d]咪唑-2-基)丁酰胺基)- 2-氧代嘧啶-1(2H)-基)-4,4-二氟-3-羟基四氢呋喃-2-基)甲基-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼戊环-2-基)碳酸苄酯(Ⅰ6)、(2R,3R,5R)-5-(4-(4-(5-(双(2-氯乙基)氨基)-1-甲基-1H-苯并[d]咪唑-2- 基)丁酰胺基)-2-氧代嘧啶-1(2H)-基)-4,4-二氟-2-(羟甲基)四氢呋喃-3-基-4-(4,4,5,5-四甲基- 1,3,2-二氧硼戊环-2-基)碳酸苄酯(Ⅰ7)和((2R,3R,5R)-5-(4-(4-(4-(双(2-氯乙基)氨基-1-甲基-1H- 苯并[d]咪唑-2基)丁酰胺基-2-氧代嘧啶-1(2H)-基)-4,4-二氟-3-((((4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼戊环-2-基)苄基)氧基)羧基)氧基)四氢呋喃-2-基)甲基-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼戊环-2- 基)苄基)碳酸酯(Ⅰ8)的制备
参照实施例2中化合物(Ⅰ2、Ⅰ3和Ⅰ4)的制备方法，由(Ⅰ5)替代方法中的(Ⅰ1)，与化合物2a反应制得淡黄色固体(Ⅰ6、Ⅰ7和Ⅰ8)，收率分别为22％、19％和21％。
化合物Ⅰ6谱图数据为：ESI-MS(m/z):863[M+H]+.1H NMR(DMSO-d6,400MHz):δ11.15(s,1H,NH),8.16(d,1H,J＝8.0Hz,CH),7.71(d,2H,J＝8.0Hz,Ar-H),7.42(d,2H,J＝8.0 Hz,Ar-H),7.33(d,1H,J＝8.0Hz,Ar-H),7.29(d,1H,J＝8.0Hz,Ar-H),6.94(s,1H,Ar-H),6.79(m, 1H,CH),6.32(t,1H,J＝8.0Hz,CHCF2),5.33(m,1H,CH),5.28(s,2H,CH2),4.30(m,1H,CH), 3.81(m,2H,CH2),3.71(m,8H,CH2),3.67(s,3H,CH3),2.85(t,2H,J＝8.0Hz,CH2),2.59(d,2H,J ＝8.0Hz,CH2),2.05(m,2H,CH2),1.30(s,12H,CH3).化合物Ⅰ7谱图数据为：ESI-MS(m/z): 863[M+H]+；1H NMR(DMSO-d6,400MHz):δ11.11(s,1H,NH),8.16(d,1H,J＝8.0Hz,CH), 7.71(d,2H,J＝8.0Hz,Ar-H),7.42(d,2H,J＝8.0Hz,Ar-H),7.30-7.33(m,2H,CH),6.95(s,1H, Ar-H),6.78(m,1H,CH),6.31(m,1H,CH),5.33(m,1H,CH),5.27(m,2H,CH2),4.29(m,1H, CH),3.80(m,2H,CH2),3.67-3.70(m,11H,CH2,NCH3),2.85(t,2H,J＝8.0Hz,CH2),2.57(t,J＝ 8.0Hz,2H,CH2),1.98(m,2H,CH2),1.29(m,12H,CH3).以及化合物Ⅰ7谱图数据为：1H NMR (DMSO-d6,400MHz):δ11.08(s,1H,NH),8.15(d,1H,J＝8.0Hz,CH),7.69(m,4H,Ar-H),7.41 (d,4H,J＝8.0Hz,Ar-H),7.30(m,2H,CH),6.96(m,1H,Ar-H),6.33(m,1H,CH),5.34(s,1H, CH),5.20-5.26(m,2H,CH2),4.55(m,4H,CH2),3.71(m,8H,CH2),3.67(s,3H,CH3),2.86(t,2H, J＝8.0Hz,CH2),2.55(t,2H,J＝8.0Hz,CH2),2.03(m,2H,CH2),1.29(m,24H,CH2).
实施例5四甲基氮唑蓝比色法(MTT)体外抗肿瘤试验
按常规采用MTT评价了本发明化合物对6种人癌细胞株的抗增殖活性。MTT法已广泛用于大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感测定等，选择dFdC作为阳性对照药，Dipyridamole(Dipy)作为核苷转运蛋白抑制剂。
人癌细胞株：***细胞Hela、胃癌细胞HGC27、肝癌细胞HepG2、肺癌细胞A549、急性白血病细胞HL60、多发性骨髓瘤细胞H929。
人正常细胞株：正常肝细胞LO2。
实验方法如下：取处于指数生长期状态良好的细胞一瓶，加入0.25％胰蛋白酶消化，使贴壁细胞脱落，制成每毫升含2×104～4×104个细胞的悬液。取细胞悬液接种于96孔板上，每孔180μL，置恒温CO2培养箱中培养24小时。换液，加入Dipyridamole、羧酸酯酶和受试化合物Ⅰ1-Ⅰ8(化合物用DMSO溶解后用PBS稀释，受试化合物浓度为2.5×10-5 mol/L)，每孔20μL，培养72小时。将MTT加入96孔板中，每孔20μL，培养箱中反应4 小时。吸去上清液，加入DMSO，每孔150μL，平板摇床上振摇5分钟。用酶联免疫检测仪在波长为570nm处测定每孔的吸收度，计算细胞抑制率。实验结果如表2所示。
细胞抑制率＝(阴性对照组OD值–受试物组OD值)/阴性对照组OD值×100％。
本发明通式Ⅰ化合物在羧酸酯酶作用下，经过一系列肿瘤细胞抗增殖活性测试，药理实验结果表明(见表2)，本发明通式Ⅰ化合物对人肿瘤细胞的增殖具有较强程度的抑制作用，均显著比对照药Chlorambucil和bendamustine强2-3倍，其中大部分本发明化合物的细胞活性与阳性药dFdC相近或更强，大部分本发明化合物的细胞活性也同样相近于dFdC分别与 Chlorambucil或bendamustine联合用药的活性。然而，本发明化合物Ⅰ1-Ⅰ8在相同浓度下对人正常肝细胞LO2的细胞毒明显低于肿瘤细胞，也显著低于阳性药dFdC以及与Chlorambucil 或bendamustine联合用药对人正常肝细胞LO2的细胞毒性，说明本发明化合物不仅对肿瘤细胞具有显著的抗肿瘤活性，而且对正常细胞毒性较低，具有一定的肿瘤细胞选择性，值得进一步地深入研究。
此外，由于核苷类药物吉西他滨水溶性高，不易透过细胞膜，通常依赖于核苷转运蛋白载体进入细胞内，然而在耐药的肿瘤细胞膜上，核苷转运蛋白数量减少，且发生突变，故阻碍了药物进入细胞膜。在本实验中我们采用Dipyridamole(Dipy)作为核苷转运蛋白抑制剂，观察对吉西他滨及其缀合物的细胞活性影响。从实验结果发现，当dFdC联合了Dipy同时给药，活性显著下降，而本发明化合物与Dipy同时给药，他们仍然具有较强的抗肿瘤活性，由此说明本发明化合物引入了脂溶性的芳香氮芥片段，脂溶性得到明显提高，不依赖于核苷转运蛋白载体跨膜进入细胞，发挥多重抗肿瘤作用。
表2本发明化合物对部分肿瘤细胞增殖的抑制率％(25μM)
Figure GDA0002639734350000111
Figure GDA0002639734350000121
ND:未检测.
实施例6流式细胞仪检测细胞凋亡率
选择胃癌细胞株HGC27，并且处于对数生长期状态，加入消化液(0.125％胰蛋白酶+0.01％EDTA)消化，计数2～2.5×105个/ml，制成细胞悬液，接种于培养板，置恒温CO2培养箱中培养24小时。换用2％血清的DMEM培养基培养，加入羧酸酯酶和不同浓度受试药物化合物Ⅰ1-8，继续培养72小时。收集细胞，贴壁细胞用不含EDTA的胰酶消化收集，1000 r/min离心5min，用冷的PBS洗涤细胞二次(1000rpm离心5min)，计数后，加约1×105个细胞于试管中离心，去上清。悬浮细胞于500μL的Binding Buffer。加入5μL Annexin V-FITC混匀后，加入5μL Propidium Iodide，混匀,避光反应5～15min。在1小时内，进行流式细胞仪的观察和检测。激发波长Ex＝488nm；发射波长Em＝530nm。每组3管。未经药物处理的细胞为阴性对照。凋亡细胞为AnnexinV+和AnnexinV+PI+，而PI+的细胞为坏死细胞,非染细胞为未损伤细胞。计算200细胞中的凋亡细胞为测试指标。实际凋亡率＝药物凋亡率/阴性对照组的凋亡率。
采用流式细胞仪进行检测细胞凋亡率，选择活性化合物Ⅰ1-8为代表，结果发现在25μmol/L对HGC27细胞具有显著促进肿瘤细胞凋亡，凋亡率可达到72-91％，且大部分发明化合物强于同浓度下的吉西他滨凋亡作用(25μmol/L凋亡率为77％)。
上述实验结果为本发明通式Ⅰ化合物中优选化合物Ⅰ1-Ⅰ8药理实验结果，对本发明符合通式Ⅰ结构的其他化合物的药理药效亦有指导意义，由于本发明通式Ⅰ化合物具有和吉西他滨或芳香氮芥相似的化学结构和空间结构，因而具有相同或相似的药理药效作用，经过上述优选化合物Ⅰ1-Ⅰ8药理实验的验证，说明通式Ⅰ化合物均具有不同程度的抗肿瘤活性。

Claims (8)

1.一种靶向癌细胞高水平ROS的吉西他滨-氮芥缀合物及其药学上可接受的盐，其特征在于具有通式Ⅰ所示结构：
Figure FDA0002639734340000011
通式Ⅰ中：
R代表
Figure FDA0002639734340000012
或者
Figure FDA0002639734340000013
R1代表H或者
Figure FDA0002639734340000014
R2代表H或者
Figure FDA0002639734340000015
2.根据权利要求1所述的靶向癌细胞高水平ROS的吉西他滨-氮芥缀合物，其特征在于所述缀合物通式Ⅰ的结构中的R、R1、R2选自如下组合：
Figure FDA0002639734340000016
R1＝H，R2＝H；
或者
Figure FDA0002639734340000017
R2＝H；
或者
Figure FDA0002639734340000018
R1＝H，
Figure FDA0002639734340000019
或者
Figure FDA00026397343400000110
或者
Figure FDA00026397343400000111
R1＝H，R2＝H；
或者
Figure FDA00026397343400000112
R2＝H；
或者
Figure FDA00026397343400000113
R1＝H，
Figure FDA00026397343400000114
或者
Figure FDA00026397343400000115
3.一种权利要求1或2所述的靶向癌细胞高水平ROS的吉西他滨-氮芥缀合物的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)化合物3在咪唑的存在下，与叔丁基二甲基氯硅烷反应得到化合物4，
Figure FDA0002639734340000021
(2)在缩合剂1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和4-二甲氨基吡啶存在下，化合物4与化合物5缩合反应得到化合物6，
Figure FDA0002639734340000022
其中，R代表
Figure FDA0002639734340000023
或者
Figure FDA0002639734340000024
(3)化合物6在脱保护试剂的作用下得到化合物Ⅰa，
Figure FDA0002639734340000025
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于步骤(3)之后还包括步骤(4)：
(4)在DMAP或N,N-二异丙基乙胺存在下，化合物Ⅰa与化合物2a反应得到化合物Ⅰb、Ⅰc和Ⅰd，
Figure FDA0002639734340000031
其中，R代表
Figure FDA0002639734340000032
或者
Figure FDA0002639734340000033
R’代表
Figure FDA0002639734340000034
所述化合物2a为
Figure FDA0002639734340000035
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于所述化合物2a采用如下步骤制备而成：对溴苯甲醇在[1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯的催化下，与联硼酸频那醇酯反应得到化合物2，化合物2与N,N’-羰基二咪唑反应得到化合物2a，
Figure FDA0002639734340000036
6.一种药物组合物，其特征在于包括治疗上有效剂量的如权利要求1或2所述的通式Ⅰ化合物或其药学上可接受的盐及可接受的载体或辅料。
7.如权利要求1或2所述的靶向癌细胞高水平ROS的吉西他滨-氮芥缀合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述肿瘤为急性白血病、多发性骨髓瘤、肝癌、肺癌、胃癌或***。
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