MXPA01006457A - Plantas transgenicas que comprenden un gen condicionalmente letal. . - Google Patents

Plantas transgenicas que comprenden un gen condicionalmente letal. .

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Abstract

Se ensenan construcciones geneticas, vectores de transformacion y metodos para la produccion de plantas transgenicas, las cuales pueden ser selectivamente removidas de un sitio de crecimiento a traves de la aplicacion de un agente quimico o tension fisiologica. La invencion enlaza un gen objetivo para el rasgo de interes comercial a un gen condicionalmente letal, el cual puede ser selectivamente expresado para ocasionar la muerte de la planta. A traves del uso de las construcciones geneticas, vectores de transformacion y metodos de la presente invencion, se pueden evitar la invasion de ambientes y contaminacion de producciones comerciales no disenadas por ingenieria a traves de plantas transgenicas. Tambien se ensenan metodos para la transforma de la especia de Brassica.

Description

PLANTAS TRASNGENICAS QUE COMPREDEN UN GEN CONDIC1ONALMENTE LETAL CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a plantas transgénicas y, en particular, a plantas transgénicas adecuadas para liberación de campo ambientalmente sensible y construcciones genéticas y vectores para la producción de las mismas. La presente invención también se refiere a construcciones genéticas novedosas para la selección e identificación convenientes de plantas transgénicas y a la progenie derivada de las mismas. La presente invención además se refiere a vectores y métodos de transformación novedosos para la producción de especies transgénicas de Brassica.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Plantas transgénicas Se sabe que los rasgos nuevos y alterados (los así llamados "rasgos novedosos") pueden ser impartidos a especies de cosecha a través de tecnología de ADN recombinante. Con el fin de derivar estas cosechas con rasgos novedosos, se requiere de un método para insertar ADN recombinante en el genoma de la cosecha. Este método, comúnmente denominado como transformación, técnicamente está haciendo retos y requiere de un esfuerzo significante para desarrollar los protocolos para el cultivo, la misma transformación y regeneración de plantas enteras. En algunas especies, la transformación se ha vuelto de rutina, aunque en otras especies, la transformación permanece difícil y es consumidora de tiempo. Sin embargo, algunas variedades de cosechas que fueron genéticamente diseñadas por ingeniería para expresar rasgos novedosos han sido liberadas a la cadena de producción comercial y otras están experimentado ensayos de campo en la preparación para liberación comercial. Muchas de estas variedades de cosecha transgénica tienen rasgos novedosos que proporcionan fenotipos alterados. Estos fenotipos incluyen composiciones mejoradas, resistencia mejorada a plagas, enfermedad o tensiones ambientales, y tolerancia a herbicidas. Dicha tolerancia proporciona nuevos medios para controlar hierbas malas y nuevas oportunidades de producción para los granjeros. Muchos rasgos actuales novedosos en el comercio que afectan características agronómicas son colectivamente denominados rasgos de "entrada", es decir, aquellos rasgos que se relacionan con la economía de la producción. Por ejemplo, la tolerancia a herbicidas es un rasgo de entrada ya que permite que los granjeros tengan más opciones para controlar la maleza o hierba mala; típicamente los costos del control de hierba mala pueden ser reducidos a través de estas tolerancias novedosas a herbicidas De esta manera, la economía de la producción o "entrada" requerida para el desarrollo de la cosecha se ve favorablemente alterada. Otros rasgos, tales como resistencia a insectos pueden reducir los costos de granjeros a través de aplicaciones de insecticida químicos reducidas. Además de los rasgos de entrada, existen los rasgos de "salida" que alteran la composición o calidad de la planta cosechada. Dichos rasgos impactan los productos finales o "producciones o resultados" de una cosecha y pueden incluir una composición alterada de aceite o harina, un contenido reducido anti-nutricional y cosechas con características de procesamiento alteradas. Se ha hecho un esfuerzo considerable hacia el desarrollo de cosechas con rasgos de salida que proporcionan nuevos productos, y un valor económico y utilidad elevada. Algunos rasgos son clasificados como rasgos de "salida" de alto valor. Dichos rasgos residen en plantas de cosecha utilizadas para "agricultura molecular" para producir proteínas novedosas con aplicaciones comerciales o farmacéuticas. La agricultura molecular mantiene una considerable promesa para la producción económica de grandes volúmenes de proteínas comercialmente útiles y valiosas. El uso de plantas de cosecha para producir en masas proteínas ofrece muchas ventajas sobre la tecnología de fermentación, que incluyen: facilidad de producción; estabilidad del producto cuando se sintetiza en órganos de almacenamiento de plantas, tales como tubérculos o semillas; y la posibilidad de recuperar co-productos valiosos tales como harina, aceite o almidón, de las plantas.
Las proteínas contempladas para la producción en masa por la agricultura molecular incluyen enzimas industriales; por ejemplo, aquellas derivadas de fuente microbianas tales como proteasas, enzimas modificadoras de almidón o carbohidrato (por ejemplo, alfa-amilasa, glucosa-oxidasa, celulasas, hemicelulasas, xilanasas, mañanazas o pectinasas). Además, la producción de enzimas tales como ligninasas o peroxidasas, las cuales son particularmente valiosas en la industria de pulpa y papel, ha sido sugerida dentro de varias especies de cosechas. Otros ejemplos de enzimas comercial o industrialmente importantes, las cuales pueden ser producidas utilizando agricultura molecular, son fosfatasas, óxidoreductasas y fitasas. El número de enzimas industrialmente valiosas es grande y las plantas ofrecen un vehículo conveniente para la producción en masa de esas proteínas a costos anticipados como competitivos con la fermentación. Además, la agricultura molecular se está contemplando para utilizarse en la producción y suministro de vacunas, anticuerpos (Hein, M.B. y Hiatt, A.C.; EUA 5,202,422), hormonas de péptido (Vandekerc hove, J. S., EUA 5,487,991), factores sanguíneos y similares. Se ha postulado que plantas comestibles que han sido diseñadas por ingeniería para producir agentes terapéuticos seleccionados, pueden proporcionar un medio para el suministro de fármaco, el cual es de costo efectivo y particularmente adecuado para administración de agentes terapéuticos en países rurales o subdesarrollados. El material de planta conteniendo los agentes terapéuticos puede ser cultivado e incorporado en la dieta (Lam, D. M., y Arntzen, C.J. EUA 5,484,719). En resumen, los rasgos novedosos de entrada y de salida contemplados para las plantas de cosecha son muy amplios en alcance y pueden conducir al desarrollo de numerosos productos y procesos nuevos. Por consiguiente, los medios confiables para producir plantas con rasgos novedosos incorporan las plantas transgénicas iniciales a la crianza y variedad de programas de desarrollo son herramientas importantes para el suministro de estos productos al comercio. Un problema de la producción de plantas transgénicas es que al descubrir un evento transgénico en una célula de planta, es necesario un esfuerzo considerable para recuperar plantas fértiles, morfológicamente normales, para usarse en esquemas de crianza subsecuentes. De esta manera, los métodos que permiten la simple identificación de plantas que han recibido el transgen es un objeto primario para la comercialización. La selección o identificación de plantas transgénicas a través de métodos confiables que no requieran de ensayos bioquímicos o colorimétricos, son particularmente convenientes. Un método que permite flexibilidad, puede ser adicionalmente valioso, tal como un esquema que puede ser usado en cualquier punto en el desarrollo de una variedad transgénica. Un método muy preferido puede permitir la selección en cultivo, identificación de crianza y actividades de introgresión, así como identificación y discriminación a nivel de campo.
Preocupaciones asociadas con la liberación de campo de plantas transqénicas Se ha sugerido que la liberación de cosechas genéticamente modificadas pueden conducir a daño ambiental debido a su expresión de potencial genético que ordinariamente no puede ser obtenido a través de selección natural o a través de recombinación sexual. Además, se ha sugerido que las plantas transgénicas liberadas pueden invadir ecosistemas naturales, ya sea través de la extensión de las mismas plantas o a través de la hibridación con receptores silvestres. Estas misiones han sido extensamente debatidas y la experimentación ha sido iniciada para probar la supervivencia continua de plantas transgénicas y transferencia de rasgos de especies de cosecha a receptores silvestres, (por ejemplo, University of California, Risk assessment in agricultural biology: proceedings of an international conference, 1991, Casper, R., & Landsman, J., 1992; The bio-safety results of filed test of genetically modified plants and microorganisms. Proceedings of the 2nd International Symposium on The Biosafety Results of Field Tests of Genetically Modified Plants and Microorganisms, 1992, Goslar, Germany, Dale, P. et al., 1992, the field reléase of transgenic plants, The British Crop Protection Council. Brighton Crop Protection Conference: Pests and Diseases, Vols. I, II y lll; Proceedings of Field Tests of Genetically Modified Plants and Microorganisms, 1994, Monterey, California, Jones, D.D., 1994). El consenso de los estudios y resultados experimentales logrados hasta la fecha apoya el punto de que el grado de potencial extendió transgenes a receptores silvestres depende altamente de las especies y condiciones ambientales. El cruce con parientes probablemente no es con algunas especies y probable para otras (Raybould & Grey, J., Applied Ecology, 30: 199-219, 1993). El grado al cual cualquier planta transformada puede ser invasiva de otros habitáis y, por lo tanto, el riesgo ambiental, también depende de la misma especie de la planta. Muchas cosechas están altamente especializadas y adaptadas a prácticas de cultivo no competitivas y, de esta manera, generalmente no se consideran como un riesgo ambiental serio (Dale y otros., Plant Breeding 111:1 -22, 1993; Fishlock, D., The PROSAMO Report, publicado por Laboratory Goverment Chemist, Queens Road, Teddington, Middlesex, UK TW11 OLY). Sin embargo, generalmente se está de acuerdo en que probablemente existen algunos riesgos de que ciertas plantas de cosecha, plantas ornamentales o plantas cultivadas para propósitos farmacológicos naturales puedan volverse plagas de maleza ya que muchas de las especies de maleza que actualmente afectan la producción agrícola en un momento fueron introducidas de otro ambiente, frecuentemente por razones ornamentales, culinarias o médicas (Séller, K.H., Biotechnology 7: 1134-1339, 1989).
Aunque los años de estudios requerirán el entendimiento completo del impacto potencial de plantas transgénicas en el ambiente, un problema de término cercano potencialmente más serio se refiere a la contaminación de producción agrícola con rasgos novedosos de plantas transgénicas. Tanto los efectos de Xenia (efecto directo de polen cruzado en la composición de las semillas) como voluntarios o semillas que permanecen en el campo pueden contaminar la producción agrícola subsecuente. Aunque tales eventos no han sido un problema principal en el pasado, la contaminación inadvertida de cosechas destinadas para el consumo general con variedades visualmente indistinguibles desarrolladas para otros propósitos, por ejemplo, cosechas que contiene una proteína farmacéuticamente activa, se ha convertido en una emisión de preocupación particular. Por consiguiente, la habilidad para discriminar cosechas transgénicas en una forma simple y confiable, es de gran valor. Actualmente, se han empleado el aislamiento físico combinado con filas de límite que funcionan como trampas de polen para contener plantas con rasgos transgénicos bajo estudio y desarrollo (por ejemplo, Agricultura and Agri-Food Canadá, Regulatory Directive 94-08; Assessment Criteria for Determining Environmental Safety Plants with Novel Traits, Regulatory Directive 94-09; the Biological of Brassica napus L. (Canola/Rapessed), Regulatory Directive 95-014; Field Testing Plants With Novel Traits in Canadá). Sin embargo, con el aumento de la producción comercial de plantas transgénicas, el potencial para contaminación dentro de una instalación se incrementa dramáticamente. Esta contaminación potencial se ha convertido en una preocupación principal para la industria de aceite de colsa, y se ha convertido un punto importante para otras cosechas principales (por ejemplo, maíz), ya que números más grandes de diferentes genotipos recombinantes llegan al mercado. La contaminación de producción de cosechas comerciales con rasgos de otros cultivos que afectan la calidad y el funcionamiento, es un problema potencialmente serio. Sin embargo, debido a la posible contaminación de productos alimenticios, un problema potencialmente más serio es el uso de cañóla (u otras cosechas) como un vehículo de producción para proteínas heterólogas de valor comercial o medicinal. Aunque los estándares de producción establecidos anteriormente pueden ser implementados para conservar la identidad de líneas transgénicas individuales y reducir la contaminación no pretendida, el flujo de genes hacia otros cultivos finalmente puede ocurrir. Las emisiones con relación a la ocurrencia y extensión de genes que no imparten una morfología distinta o un rasgo fácilmente identificable (tal como tolerancia a herbicidas) aún no se ha resuelto. Aunque se han utilizado muchas técnicas para introducir genes en plantas, las construcciones genéticas en la técnica anterior no incluyen aspectos que sean útiles para identificar y seleccionar células de plantas transgénicas en cultivo o para controlar la persistencia o extensión potencial de los transgenes Por consiguiente, las construcciones léticas que operan dentro de un mecanismo que permite la discri., ación de plantas transgénicas de plantas no transgénicas o discriminación entre plantas transgénicas que llevan dife.- tes rasgos, podría resolver el problema de contaminación. Ur ecanismo que no tiene efecto en las plantas no transgénicas, aú oermite que plantas que contienen un transgen específico que rá eliminada a medida que son identificadas, también podrían nroporcionar una solución. Además, un mecanismo que selectivamente remueve plantas de cosechas que tiene transgenes específicos de otras cosechas comerciales que no tienen aquellos transgenes, también pueden ser valiosos Métodos para transformación de plantas En general, actualmente se utilizan ampliamente dos métodos para introducir ADN a células de plantas. El primero implica el uso de Agrobacterium, o bacterias terrestres similares, para transferir ADN. Los tejidos de plantas objetivo o células son co-cultivados con una cepa de Agrobacterium adecuada que inyecta ADN de plásmido a células de planta (Schilperoot, R.A. y otros, EUA 4,940,838; Schilperoot. R.A. y Hoekema, A., EUA 5,464,763) Subsecuentemente, la células de plantas individualmente transformadas son regeneradas a plantas enteras. El sistema de transformación de Agrobacterium se basa históricamente en el uso del vector bacteriano natural que es el agente causante de enfermedad de agalla de corona. La enfermedad de agalla de corona representa los resultados de una forma natural de transformación de plantas. Los plásmidos de inducción de tumor (Ti) de existencia natural de Agrobacteria comprende: Las secuencias de ADN necesarias para la transferencia de ADN a células de plantas; las secuencias de ADN necesarias para la integración de ADN extraño al ADN de planta huésped, denominados los fragmentos de límite; y genes, denominados oncogenes, que dan como resultado la formación de substancias reguladoras de crecimiento de plantas que ocasionan la formación de agallas en el sitio de infección. Los plásmidos Ti típicamente también codifican para genes que dan como resultado la formación de ciertos tipos de aminoácidos inusuales (opinas) que pueden ser metabolizados a través de Agrobacteria, pero no a través de las células de la planta. El sistema natural, la porción de plásmido Ti, la cual es transferida al huésped de planta receptor (ADN -T) usualmente contiene todos estos genes y secuencias de ADN. Los oncogenes de las cepas de Agrobacterium tumorigénicas han sido extensamente estudiados. En general, existen dos tipos de oncogenes del plásmido de Agrobacterium: el oncogén tmr y los oncogenes tms. El oncogén tmr (también conocido como el gen ipt) codifica una enzima que sintetiza 5'-monofosfato de isopentil-adenosina, el cual es una hormona de planta de citoquinina que induce la formación de brotes en un huésped adecuado. Los oncogenes denominados como tms (comprendiendo el oncogén tmsl y el oncogén tms2) codifican enzimas responsables para la sobreproducción de auxina en huéspedes adecuados, conduciendo la producción de raíces. Cuando se combinan, los genes tms y tmr usualmente conducen a la producción de agallas de corona en huéspedes adecuados. Las plantes que contienen los oncogenes Ti son fenotípicamente anormales, teniendo tumores de agalla de corona u hojas rizadas o torcidas debido al desequilibrio del crecimiento hormonal. Estas plantas anormales no son adecuadas para aplicaciones comerciales. Aunque estas plantas pueden ser fácilmente identificadas después de la transformación, no forman plantas morfológicamente normales. Por consiguiente, el plásmido Agrobacterium Ti ha sido identificado en una variedad de formas, y típicamente a través de la remoción de los oncogenes, para ser una herramienta para la introducción de ADN en células de plantas. En general, los métodos de transformación de Agrobacterium que han sido utilizados hasta la fecha han utilizado plásmidos Ti en donde los genes que dan como resultado la formación de citoquininas y auxinas en los genes para la síntesis de opima han sido removidos. Dichos plásmidos generalmente son denominados como estando "desarmados". Por consiguiente, un plásmido Ti "armado" generalmente se consideran que contiene un oncogén. El plásmido Ti para usarse en la transformación de plantas, además ha sido diseñado por ingeniería para contener sitios de restricción, para la introducción conveniente de genes extraños entre o adyacentes a uno o más de los fragmentos de límite, y genes para la identificación y selección de células transformadas, tales como genes resistencia a antibióticos o genes de ß-glucoronidasa-sintasa (GUS). Los genes de replicación por lo general son introducidos al plásmido Ti para permitir la replicación del plásmido en huéspedes que no son Agrobacterial. Los genes vir (virulencia) que son requeridos para la movilización del ADN y transferencia del plásmido a células bacterianas por lo general son retenidos en un plásmido separado o en un sitio del plásmido Ti distinto de aquel que contiene el ADN, el cual va a ser transferido y, como tales, no son transferidos a células de plantas receptoras. La segunda tecnología amplia empleada para generar plantas transformadas implica el uso de microproyectiles activados. Estos métodos han sido empleados para transformar tanto monocotiledóneas como dicotiledóneas que son recalcitrantes a métodos de Agrobacterium. Una variedad de diferentes microproyectiles y métodos de bombardeo han sido descritos en, por ejemplo, Sanford y otros, EUA 4,945,050; McCabe, y otros, EUA 5,149,655; Fitzpatrick-McElligott y otros, EUA 5,466,587; y Coffee y otros, EUA 5,302,523, EUA 5,464,765. El ADN introducido utilizando microproyectiles activados comprende aspectos funcionales similares para la expresión en células de plantas, equivalente a aquellos introducidos a través de sistemas de Agrobacterium, por ejemplo, el vector utilizado generalmente comprende sitios diseñados por la ingeniería para la inserción de gen extraño y genes necesarios para la identificación o selección de transformantes. Otros métodos que han sido utilizados para obtener plantas transformadas incluyen: microinyección directamente en los núcleos de célula (Crossway y otros, EUA 4,743,548); y consumo de ADN directo a través de protoplastos (Paszkowskí y otros EUA 5,231,019, EUA 5,453,367). Aunque el aspecto general de transformación de plantas está bien entendido, la aplicación práctica de procesos de transformación de plantas por lo general está limitada por la respuesta genotípica de células de plantas para la transformación y condiciones de cultivo. No es usual solamente que uno o dos genotipos estrechos dentro de una especie sean manejables para la transformación. Por consiguiente, no es simple, o en algunos casos posible, transformar eficientemente todos los genotipos dentro de una especie de cosecha. A pesar de los numerosos intentos para alterar protocolos de cultivo y de transformación, algunos genotipos de plantas son recalcitrantes a la transformación a través de técnicas que son eficientes dentro de otros genotipos. De esta manera, en muchos casos, un genotipo especifico que es manejable a la transformación primero es utilizado, después el evento transgénico es cruzado, o "introgresado" al germoplasma que es recalcitrante al mismo método de transformación. Aunque este método puede permitir la introducción final de un transgen a una línea que no puede ser transformada sin esfuerzo indebido, el proceso lleva tiempo y esfuerzo ya que uno tiene que seleccionar el transgen en cada cruce sexual. De esta manera, un método que permite una rápida discriminación de plantas en donde el transgen ha sido introducido ya sea por transformación o introgresión, enormemente podría facilitar la producción de plantas transgénicas. En particular, un ensayo visual no destructivo puede permitir la rápida clasificación de números grandes de líneas de crianza y poblaciones de segregación. Este proceso de clasificación, si se aplica en la etapa de siembra o aún en la etapa del desarrollo de, la semilla (por ejemplo, rescate del embrión), puede encontrar utilidad dentro de programas de producción de variedad comercial permitiendo la selección de líneas en una etapa temprana, eliminando así la necesidad de desarrollar plantas hasta la madurez, ahorrando así tiempo y recursos de terreno. Dicho método también puede ser usado para eliminar un número importante de líneas nulas de la cultivación y permitir una crianza aerodinámica y proceso de introgresión. En particular, dicho método podría ser útil para la producción de plantas de Brassica llevando transgenes para rasgos de entrada o de salida, incluyendo rasgos de salida de alto valor.
Transformación de brassica La transformación de miembros de la familia de Cruciferae a través de Agrobacterium y otros métodos ha sido reportada. Sin embargo, muchos de los receptores que se relacionan específicamente con la transformación de Brassica han detallado la dificultad en obtener de manera rutinaria especies de Brassica transformadas a través de transformación mediada por Agrobacterium. Muchos de los reportes han mostrado éxito con una o dos variedades particulares, pero no hay ninguna enseñanza de métodos detallados que generalmente sean aplicables a todas las especies dentro del género de Brassica. Aunque muchas manipulaciones de condiciones de cultivo pueden ser empleadas, algunas variedades han probado ser extremadamente difíciles para transformar a través de los métodos previamente reportados. De esta manera, el esfuerzo importante es expandido para la introducción de transgenes en estos genotipos a través de cruce e introgresión. Cualquier mejora y descubrimiento que permite la generación confiable de plantas transgénicas a partir de estos genotipos o que permita un medio más eficiente para la introgresión, estos rasgos podrían ser una mejora importante en la técnica. Muchos de los estudios de transformación de Brassica iniciales fueron realizados son un solo genotipo, B. napus cv Westar (Radke y otros, Theor. Appl. Genet. 75_:685-694, 1988; Moloney y otros, Plant Cell Reports 8:238-242, 1989; Moloney y otros, 1989, EUA 5,188,958; Moloney y otros, 1989, EUA 5,463,174). Westar fue una selección conveniente, ya que respondió al cultivo de tejido y protocolos de transformación descritos en las referencias citadas anteriormente y permitió el descubrimiento de plantas transgénicas. Westar permanece siendo el genotipo de selección para experimentos de transformación; sin embargo, las propiedades agronómicas de la variedad se consideran pobres en comparación con cultivos recientes. Por lo tanto, permanece un hueco en la tecnología de transformación confiable genotipos comerciales de la semilla oleaginosa de Brassica napus. Además, muchos estudios de transformación de Brassica conducidos utilizando los métodos descritos, o variaciones de los mismos, han producido resultados que son altamente variables y dependen de la respuesta innata de los materiales de plantas específicos para el protocolo de transformación. Como un ejemplo, las frecuencias de transformación que han sido logradas para Brassica napus son algunas veces variables y muy bajas (Fry y otros, Plant Cell Reports _6:321-325, 1987; Mehra-Palta y otros, ln_ Proc 8th Int. Rapeseed Congress, Saskatoon, Saskatchewan, 1991; Swanson y Erickson, Theor. Appl. Genet. 7_8:831-835, 1989). También las frecuencias variables y por lo general de baja transformación han sido observadas con otras especies de Brassica, tales como B. olerácea (Christie y Earle, ln_ Proc 5o Crucifier Genetics Workshop, Davis, pp 46-47, 1989; Metz y otros, Plant Cell Reports 15:287-292, 1995; Eimert y Siegemund, Plant Molec. Biol.19:485-490, 1992; DeBlock y otros, Plant Physiol. 91:694-701 , 1989; Berthomieu y Jouanin, Plant Cell Reports 11:334-338; Toriyama y otros, Theor. Appl. Genet. 8_l:769-776, 1991); B. rapa (Radke y otros, Plant Cell Reports 1J_:499-505, 1992); B júncea (Barfield y Púa, Plant Cell Reports 1_0:308-314, 1991); Deepak y otros, Plant Cell Reports 12:462-467, 1993; Púa y Lee, Planta 196:69-76, 1995); B. nigra carinata (Narasimhulu y otros, Plant Cell Reports 11:359-362, 1992; Babic, M.Sc. Thesis, Univ of Saskatchewan, 1994). Las muchas especies de Brassica, variedades y cultivos representan un grupo muy diverso con morfologías y características fisiológicas radicalmente diferentes. Muchas especies de Brassica de interés comercial no responden bien o para nada a los métodos previamente descritos. En particular, la especie de semilla oleaginosa de Brassica napus con composiciones de ácido graso inusuales parecen ser recalcitrantes a los esfuerzos de la transformación convencionales. Un genotipo, tipificado por la variedad AG019 como se describe en la patente de E.U.A. 5,965,755 es un genotipo con un alto contenido de ácido oleico, y un bajo de contenido de ácido linoléico que insensible a métodos de transformación convencionales, por ejemplo, aquellos descritos por Moloney (ibid). La variedad AG019 y variedades derivadas de la misma tiene composiciones de ácido grado maleosas que proporcionan aceite con estabilidad oxidante mejorada y valor nutricional. El cruce con una especie de Brassica napus de perfil de aceite convencional, por ejemplo, un Westar transformado, como un medio para introducir un transgen, ocasiona la pérdida en el perfil del aceite y requiere de grandes esfuerzos de crianza para reconstruir el perfil de aceite deseado. En la mayoría de los casos. es incierto que esto pueda ser obtenido De esta manera, se requiere un método de transformación, el cual sea útil para la transformación de Brassica recalcitrante, particularmente especie de semilla oleaginosa de Brassica napus con perfiles de aceite alterados, más particularmente transformación de la especie AG019 de Brassica y progenie derivada de la misma. Por consiguiente, los métodos para transformar genotipos recalcitrantes de Brassica serán valiosos. Además, los métodos para identificar células de plantas transformadas, y plantas y progenie derivadas de las mismas también serán valiosas, particularmente si los métodos son simples, no destructivos por naturaleza y permiten la identificación visual de las plantas o células que contienen el transgen de interés. Si dichos métodos además proporciona discriminación a nivel de campo, entonces es aconsejable una amplia variedad de aplicaciones. Se han desarrollado métodos que dirigen estas necesidades a cierto grado. Están disponibles genes marcadores visuales tales como ß-glucuronidasa o GUS, pero requieren de un ensayo bioquímico p histoquímico. Los genes que responden a químicos aplicados son tipificados por los así llamados genes "condicionalmente letales". Sin embargo, estos típicamente conducen a un fenotipo letal, por lo tanto no son útiles para rastrear transgenes en un proceso de crianza. Por consiguiente, es un objeto de la presente invención proporcionar un gen condicionalmente letal que sea útil en un programa de crianza, así como otros objetos comercialmente importantes.
Genes condicionalmente letales Se conocen rasgos y genes condicionalmente letales que imparten estos rasgos. Muchos genes condicionalmente letales conducen a un fenotipo letal y muerte de planta. Sin embargo, se pueden utilizar algunos genes condicionalmente letales en una forma que necesariamente no conducirá a muerte celular. Un ejemplo de dicho gen condicionalmente letal es el oncogén 2 tms del plásmido de Ti de Agrobacterium. Este oncogén codifica para la enzima indolacetimada hidrolasa (lAMH) que, en combinación con el oncogén 1 de Agrobacterium que codifica para indolacetimada sintasa (IAMS) forma parte de la trayectoria de síntesis del ácido indolacético (IAA) típica de este tipo de bacteria. La formación de ácido indolacético a través de plantas se presenta a través de una trayectoria diferente de aquella del Agrobacterium . Por lo tanto, la expresión de lAMH (oncogén 2) en plantas no da como resultado la formación de ácido indolacético, ya que el substrato para la enzima indolacetamida no está presente en células de plantas. Sin embargo, la aplicación de indolacetamida a plantas que expresan el gen AMH da como resultado la rápida acumulación de IAA. Aunque el ácido indolacético, IAA, es un regulador de crecimiento de planta de auxina de existencia natural, los altos niveles no controlados de IAA rápidamente desordena el metabolismo celular dando como resultado senectud y muerte de células La enzima lAMH es capaz de hidrolizar otras substancias relacionadas con indolamida incluyendo naftalenacetamida dando como resultado la producción del ácido naftalenacético (NAA) regulador de crecimiento de plantas sintético. El uso de un gen condicionalmente letal, tal como el oncogén lAMH, para plantas de maíz rogueado se describe en la patente de E.U.A. 5,180,873 (Jorgensen) expedida en enero de 1994. Jorgensen enseña la transformación de plantas para que contengan un gen condicionalmente letal. Las plantas son subsecuentemente sometidas a análisis de enlace, después se seleccionan para enlace estrecho en entre el gen letal y un sitio objetivo, el cual sea ya preexistente o introducido a través de técnicas de crianza tradicionales. La patente de E.U.A. 5,426,041 de Fabijanski y otros emitida en junio de 1995, enseña un método para la producción de semilla híbrida utilizando IAMS en combinación con lAMH. Ninguna patente enseña un método para utilizar el oncogén 2 en un medio no letal o para la selección durante y después de la transformación. Ninguna patente enseña un método para utilizar el oncogén 2 para la remoción selectiva de especies relacionadas habiendo adquirido el material genético transformado. De esta manera, un gen condicionalmente letal dentro de una construcción genética también conteniendo un rasgo novedoso, ofrece un medio conveniente para controlar la diseminación del rasgo novedoso. Sin embargo, que el gen letal no proporciona un medio no destructivo para identificar o seleccionar células de plantas transformadas, específicamente células de Brassica, los genes condicionalmente letales tradicionales no resuelven el problema de la presente de seleccionar, identificar y rastrear plantas transgénicas y progenie derivado de las mismas. Por consiguiente, otro objeto de la presente invención es modificar y utilizar un gen condicionalmente letal, previamente identificado para rastrear transgenes durante la crianza y proceso de comercialización, así como bajo condiciones de campo.
COMPENDIO DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona métodos y construcciones genéticas para la producción de plantas transgénicas que pueden ser identificadas visual y no destructivamente. La presente invención además proporciona plantas transgénicas que pueden ser removidas con seguridad y específicamente de un sitio de crecimiento a través de la aplicación de un químico benigno que es convertido a un agente fitotóxico en presencia de ia construcción genética expresada. Los métodos, construcciones genéticas y plantas de la presente invención son particularmente adecuadas para aquellas aplicaciones relacionadas con rasgos de entrada o salida o la producción heteróloga de proteínas. La presente invención proporciona una construcción genética que comprende un gen condicionalmente letal operablemente asociado con un promotor funcional en una célula de planta. El gen es utilizado para seleccionar, identificar o selectivamente aniquilar una planta que expresa dicho gen. La presente invención también proporciona una construcción genética comprendiendo dos genes adaptados para la expresión en una célula de plana. Un gen es un gen condicionalmente letal. Cualquiera o ambos genes están operablemente asociados con un promotor funcional en una célula de planta. La construcción genética comprende un gen condicionalmente letal expresado para aniquilar la planta en respuesta a una formulación química aplicada. Por lo tanto, de acuerdo con un amplio aspecto de la presente invención, se proporciona una construcción genética que comprende: a) un gen condicionalmente letal adaptado para la expresión en una célula de planta, y b) un gen de rasgo novedoso que codifica para una proteína, péptido o ARN antisentido; el gen de rasgo novedoso siendo adaptado para la expresión en una célula de planta y, cuando se expresa, producir un fenotipo deseado.
De acuerdo con otro amplio aspecto de la presente invención, se proporciona una método para producir una planta recombinante que pueda s,er identificada, comprendiendo: a) transformar una célula de planta con una construcción genética incluyendo un gen de rasgo novedoso y un gen condicionalmente letal, el gen de rasgo novedoso y el gen condicionalmente letal siendo adaptados para la expresión independiente en la planta; y b) regenerar la célula de planta a una planta entera. De acuerdo con otro amplio aspecto de la presente invención, se proporciona un método para la identificación visual de una planta o progenie de la misma conteniendo un transgen condicionalmente letal, que comprende: a) tratar la planta o población de plantas con una formulación comprendiendo un químico benigno que es un substrato del producto del gen condicionalmente letal (el químico benigno siendo aplicado a un nivel que, después de la conversión a una fitotoxina por el producto del gen condicionalmente letal, da como resultado un nivel subletal de la fitotoxina); b) identificar visualmente plantas que manifiestan el fenotipo subletal; y c) seleccionar las plantas identificadas y permitir su recuperación a plantas normales. La presente invención también proporciona un método para la identificación visual de una semilla de germinación o embrión de planta, que comprende el oncogén 2 como un transgen, comprendiendo: a) cultivar o semilla o embrión en un medio que contenga una indolamida o un derivado relacionado opcionalmente conteniendo un inhibidor de transporte de auxina; y b) identificar visualmente la semilla germinada o embrión que manifiesta el fenotipo. La presente invención también proporciona un método para seleccionar una semilla de germinación o embrión de planta que comprende el oncogén 2 como un transgen, comprendiendo: a) cultivar la semilla o embrión en un medio conteniendo una indolamida o un derivado relacionado, opcionalmente conteniendo un inhibidor de transporte de auxina; b) identificar visualmente la semilla germinada o embrión que manifiesta el fenotipo; y c) transferir la semilla identificada o embrión a un medio sin indolamida o el inhibidor de transporte de auxina; obteniendo así la semilla de germinación o embrión de planta comprendiendo el oncogén 2 como un transgen. De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona un método para seleccionar células de la planta Brassica transgénicas durante la transformación, que comprende: la transformación de una célula de planta de Brassica con una construcción genética comprendiendo un oncogén y opcionalmente, un en que codifica un rasgo novedoso; exponer dichas células de planta a un derivado de auxina benigno de una hormona de planta capaz de ser accionada por dicho oncogén en un paso en el proceso de cultivo; cultivar las células y utilizar la conversión del derivado benigno en una hormona de planta activa como un medio para identificar dichas células de planta transformadas, las cuales manifiestan el fenotipo asociado con la hormona activa; y recupera células de plantas transformadas. La invención también proporciona un método para transformar Brassica napus, que comprende la inclusión de ácido naftalenacético en el medio en el paso de formación de callo y recuperación. La invención es bien adecuada para la producción de plantas de cosecha, tales como especies/variedades de Brassica, para aplicaciones agrícolas e industriales a gran escala. El método encuentra utilidad para el rastreo e identificación de transgenes durante el proceso de crianza. El método también encuentra utilidad para la producción de variedades de plantas comerciales, que comprende rasgos novedosos en donde la contaminación de otras producciones comerciales de la misma especie, a través de la polinización de cruce o semilla de voluntario, debe ser evitada. Además, la invención proporciona protección ambiental proporcionando un método para remover selectivamente de cualquier planta ambiental que tengan transgenes. La presente invención específicamente proporciona un método para producir plantas de cosecha o forrajeras, las cuales expresan proteínas heterólogas. El método de la invención puede ser utilizado para eliminar substancialmente la contaminación de expresores de proteína heterólogos de otras producciones comerciales. Además, la presente invención proporciona métodos para transformar especies y variedades de Brassica, e incluyendo aquellas encontradas previamente como recalcitrantes o transformables solamente a eficiencias muy bajas. Esto incluye las variedades comercialmente importantes con un alto contenido oleico y un bajo contenido linoléico, particularmente AG019 y la progenie derivada de Ja misma.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS En las Figuras, "C.R." se refiere a "región de codificación"; "TER." se refiere a "región de terminación"; "PROM." se refiere a "promotor", y "PR" se refiere a "iniciador". La Figura 1 ilustra la construcción del vector de transformación de planta pJH121 comprendiendo el oncogén 2 de Agrobacterium condicionalmente letal en el vector pHS723. Además del oncogén, el vector contiene un gen de codificación para la proteína de fusión de resistencia a canamicina beta-glucoronidasa para la selección de células de planta. La Figura 2 ilustra la construcción del vector de transformación de planta pJH122 comprendiendo el oncogén 2 de Agrobacterium condicionalmente letal en el vector pRD400. Además del oncogén, el vector contiene el gen de resistencia a canamicina para la selección de células de planta. La Figura 3 la derivación del vector de transformación de planta pJH123 comprendiendo el oncogén 2 de Agrobacterium condicionalmente letal enlazado a un gen heterólogo, el cual es una región de codificación de oleosina de semilla de Arabidopsis fusionada en marco a la secuencia de codificación GUS. La región de codificación de oleosina de semilla proporciona una localización especifica de la proteína de fusión para cuerpos de semilla oleaginosa. El gen heterólogo está bajo el control del promotor de oleosina de semilla. La Figura 4 ilustra la construcción de vector de transformación de planta pJH125, comprendiendo el oncogén 2 de Agrobacterium condicionalmente letal bajo el control del promotor 35S, en el vector pRD400. Además del oncogén, el vector contiene el gen de resistencia a canamicina para la selección de células de planta. La Figura 5 ilustra la derivación del vector de transformación de planta pJH126, comprendiendo el oncogén 2 de Agrobacterium condicionalmente letal, bajo el control del promotor 35S, enlazado a un gen heterólgo, el cual es una región de codificación de oleosina de semilla de Arabidopsis fusionada en marco a la secuencia de codificación GUS. La región de codificación de oleosina de semilla proporciona localización especifica de la proteína de fusión en cuerpos de semilla oleaginosa. El gen heterólogo está bajo el control del promotor de oleosina de semilla. La Figura 6 ilustra la construcción del vector de transformación de planta pJH130 comprendiendo el oncogén 2 de Agrobacterium condicionalmente letal, bajo el control del promotor 35S, en el vector pHS723. Además del oncogén, el vector contiene un gen que codifica la proteína de fusión de beta-glucoronidasa-de resistencia a canamicina para la selección de células de planta.
DESCRICPCION DE LAS MODALIDADES ESPECIFICAS La invención proporciona construcciones genéticas para producir plantas transgénicas que pueden ser fácilmente identificadas en forma visual. Dichas construcciones genéticas también proporcionan plantas recombinantes que pueden ser removidas fácilmente de cualquier ubicación de crecimiento a través de la aplicación de una formulación química que afecta solamente a aquellas plantas transgénicas. Las construcciones genéticas también proporcionan un método novedoso de selección que puede ser usado durante el proceso de transformación. De acuerdo con una modalidad preferida, la construcción genética contiene un gen condicionalmente letal y un segundo gen que codifica para un rasgo deseado. Cualquiera o ambos genes pueden ser modificados de manera que puedan ser expresados en una célula de planta. Es deseable que la construcción genética esté así construida de manera que las secuencias de ADN que comprenden las regiones de regulación transcripcionales y de traducción y el ADN que codifica tanto los genes objetivo como condicionalmente letales sean enlazadas a través de sitios de clonación múltiples para permitir la substitución conveniente de secuencias de ADN objetivo y/o condicionalmente letales, alternativas o adicionales. La construcción genética de la presente invención puede ser introducida a un vector para la transformación de plantas. El vector comprende el gen condicionalmente letal adaptado para la expresión selectiva en plantas enlazadas al gen objetivo también adaptado para expresión en plantas. El vector puede comprender las secuencias genéticas requeridas, por ejemplo, para replicación, transformación y selección en plantas, como es conocido. Por ejemplo, el vector puede incluir los límites de ADN-T derechos y opcionalmente los izquierdos, en donde el vector va a ser utilizado en un sistema de transformación mediado por Agrobacterium o un gen resistente a canamicína (NPTII) para la selección de transformantes.
La construcción genética puede ser introducida a células de planta para formar células recombinantes a través de cualquier método adecuado, tal como, por ejemplo, métodos mediados por Agrobacterium, de electroporación, o de pistola de partículas. Las células de planta pueden ser regeneradas a plantas enteras a través de cualquier método adecuado. Las plantas recombinantes pueden ser usadas en la crianza de plantas o directamente en producción agrícola. El segundo gen de la construcción codifica una proteína deseada, péptido o ARN antisentido. El gen puede ser, por ejemplo, parte o todo un gen de existencia natural de cualquier fuente (es decir un gen heterólogo) forma alterada de un gen de existencia natural, una secuencia sintética de ADN o una combinación de secuencias de existencia natural y sintéticas. Uno o más intrones pueden estar presentes dentro de la secuencia de codificación del producto objetivo. Este segundo gen es capaz de ser transcrito o expresado como un producto de traducción en un sistema de plantas; por ejemplo, teniendo regiones de iniciación y terminación apropiadas de transcripción y traducción. La expresión de este segundo gen puede ser regulada a través de, por ejemplo, un promotor especifico en tejido o nativo alterado o alterado, constitutivo, capaz de inducción, o regulado en forma de desarrollo, que pueden ser igual a o diferente del promotor que regula la expresión del fenotipo condicionalmente letal. La selección del promotor para el gen variará dependiendo de efecto o resultado deseado que va a ser obtenido. En aplicaciones de agricultura molecular, la expresión especifica de semilla del segundo gen es particularmente útil. De esta manera, el segundo gen en estos sistemas preferiblemente incluye regiones de regulación transcripcionales y de traducción capaces de expresión en el desarrollo de semillas de planta, y más específicamente, en el embrión de semilla u otro tejido de semilla capaz de almacenamiento de triglicéridos. Dichas regiones reguladoras pueden incluir, por ejemplo, el promotor oleosina (Plant y otros, Plant Molecular Biology 25:193-205, 1994). Preferiblemente, el segundo gen comprende: (i) regiones reguladoras de transcripción y traducción funcionales en plantas, incluyendo regiones de iniciación y terminación; (ii) una región que codifica un péptido o proteína quimérica. Esta región de codificación preferiblemente comprende, (a) una región que codifica por lo menos para una porción de una proteína especifica en cuerpo oleoso suficiente para proporcionar activación o división del producto quimérico a un cuerpo oleoso y, (b) la región de codificación para la proteína o rasgo deseado. La región de cuerpo oleoso del gen quimérico puede incluir un promotor especifico de cuerpo oleoso. Es péptido o proteína quimérica también pueden comprenden una secuencia de péptido que enlaza la proteína especifica de cuerpo oleoso a la proteína deseada y que puede ser separada específicamente a través de medios químicos o enzimáticos (Moloney, PCT/CA92/00161 ). La presente invención proporciona un método para preparar una planta transgénica, la cual puede ser selectivamente removida de un ambiente en desarrollo. Se proporciona una construcción genética, la cual incluye un gen condicionalmente letal y un segundo gen que codifica para un rasgo deseado. Una célula de planta es transformada con la construcción genética y regenerada a una planta entera. La preparación de la construcción genética, transformación y regeneración se realizan utilizando cualesquiera procedimientos adecuados. Específicamente, la presente invención proporciona la producción de plantas conteniendo un transgen, que comprende un rasgo de entrada o de salida o cualquier rasgo deseado, con la característica novedosa agregada de que dichas plantas transgénicas y su progenie pueden ser removidas específicamente de un sitio de crecimiento, cuando se desee. La invención utiliza una construcción genética, la cual incluye: (a) un gen de rasgo novedoso al cual está enlazado, (b) un gen que codifica para un producto el cual es capaz de convertir una substancia benigna a una substancia que ocasiona el cambio fenotípico o muerte de toda la planta. Los genes identificados en (b) son denominados aquí como genes condicionalmente letales. De acuerdo con otra modalidad, la construcción genética comprende un gen condicional letal operablemente asociado con un promotor funcional en una célula de planta. En este caso, el gen letal condicional es utilizado para seleccionar, identificar o selectivamente aniquilar una planta que lo expresa Los genes condicionalmente letales pueden ser obtenidos a partir de cualquier fuente, tal como, por ejemplo, sistemas de plantas, bacterianos, virales o de animales, y puede ser de tipo silvestre, alternado o sintético. Estos genes están adaptados para la transcripción y traducción en un sistema de plantas e incluyen, por ejemplo, cualquier secuencia de iniciación y detención de transcripción y traducción. El gen condicionalmente letal puede ser regulado para iniciar la muerte de su célula, por ejemplo, en respuesta a la aplicación de una substancia química o en respuesta a la aplicación de una tensión fisiológica, tal como choque de calor y/o frío. En una modalidad, se utiliza un gen condicionalmente letal, el cual es activado para ocasionar la muerte de célula a través de la aplicación de una substancia que se sabe que no tiene efectos adversos sobre el ambiente de desarrollo. Muchos genes condicionalmente letales son conocidos en la técnica. Los genes condicionalmente letales típicamente tienen dos mecanismo de acción. El fenotipo letal es condicional ya sea en presencia de una substancia no tóxica o la inducción de la actividad de gen. En el primer caso, un gen expresa un producto capaz de actuar sobre una substancia no tóxica, que usualmente se aplica en forma externa, haciendo que se vuelva tóxica y capaz de aniquilar una célula de plantas. En este caso, el fenotipo condicionalmente letal depende de la presencia de la substancia no tóxica. En ausencia de la substancia no tóxica, el fenotipo letal no es expresado, en presencia de la substancia, se observa el fenotipo letal. En el segundo caso, un gen condicionalmente letal codifica un producto que es directamente tóxico a una célula de planta. Sin embargo la expresión del gen de toxina es regulada a través de un promotor, de manera que la expresión de la toxina puede ser reprimida cuando se desee y permitir que la planta crezca. En este caso el fenotipo letal es observado cuando el promotor es inducido para expresión. No se requiere de ninguna aplicación de una substancia externa. Además de los genes descritos más adelante, un experto en la técnica fácilmente puede analizar un gen candidato para letalidad en plantas. Además, el gen puede ser analizado para ver si este puede ser usado como tal o si se requiere de un promotor regulable, posiblemente heterólogo para inducir un fenotipo letal condicional. Ejemplos de genes condicionalmente letales útiles en la presente invención y aplicaciones para agricultura molecular son, pero no se limitan a: un oncogén, tal como el oncogén 4 que codifica la enzima, isopentiltransferasa, la cual ocasiona la sobreproducción de citosina, teniendo un promotor químicamente inducible tal como, por ejemplo, el promotor del gen glutationa-S-transferasa II que es capaz de inducción a través de N, N-dialil-2,2-dicloroacetamida y compuestos relacionados (WO9301294; Albertsen, M.C. y otros, EUA 5,478,369); o un oncogén bajo el control de un promotor capaz de inducción frío, tal como, por ejemplo, los genes inducidos a baja temperatura de Arabidopsis (Baker y otros, Plant Molecular Biology 2_4:701-713, 1994; Lang y Pulva, Plant Molecular Biology 20.: 951-962, 1992; Nordin y otros, Plant Molecular Biology 2J_: 641-653, 1993) o Brassica (White y otros, Plant Physiology 106: 917-928, 1994). Otros genes condicionalmente letales útiles son aquellos que convierten una substancia no tóxica a una substancia tóxica, por ejemplo, los genes para: la enzima metoxinina-deshidrogenasa que convierte ácido 2-amino-4-metoxibutanóico (metoxinina) a metoxivinil glicina tóxica (Margraff, R. y otros, Experimentia 36.: 846, 1980); la enzima, rizobitoxina-sintasa que convierte metoxinina no tóxica a ácido 2-amino-4-[2-amino-3-hidroxipropil]-trans-3-butanoico tóxico (rizobitoxina) (Owens. L. D. y otros, Weed Science 2J_: 63-66, 1973); y la enzima, fosfonato monoéster hidrolasa capaz de hidrolizar derivados no tóxicos del glicofosfato herbicida al compuesto glifosfato fitotóxico (Dotson, S.B. y Kishore, G.M., patente de E.U.A. 5,254,801). Los productos de gen condicionalmente letal los cuales actúan sobre substancias no normalmente encontrada en plantas pueden ser regulados por uno o más de: su promotor nativo, un promotor capaz de inducción o un promotor constitutivo. Los productos de gen condicionalmente letal, los cuales actúan sobre substancias normalmente encontradas en plantas, preferiblemente deben ser regulados a través de promotores capaces de inducción, de manera que solamente serán activos bajo ciertas condiciones, según determinado por la acción del promotor que sea letal a una planta. Muchos promotores capaces de inducción son conocidos como lo son los procedimientos de clasificación para la identificación de promotores adecuados. El promotor útil puede ser activo en todos los tipos de célula o en tipos de célula específicos y/o ser regulados en forma de desarrollo. Muchos diferentes tipos de promotores específicos en célula o tejido y regulados a manera de desarrollo han sido descritos en la literatura (por ejemplo, Rocha-Sosa y otros, EUA 5,436,393; Alien y Londsdale, EUA 5,412,085; Coruzzi y otros, EUA 5,391,725; Conklin y Yamamoto, EUA 5,459,252) y aquellos apropiados para el rasgo de interés comercial pueden ser seleccionados y utilizados en la práctica de la presente invención. Sin embargo, se deben entender que cualquier promotor que proporcione niveles suficientes de expresión para ocasionar la muerte de células en plantas transformadas es adecuado para usarse en la presente invención. Los promotores que proporcionan altos niveles de expresión, ya sea durante períodos extendidos o cuando y donde se requiera, son preferidos. Por consiguiente, en una modalidad especifica del método de la presente, un gen condicionalmente letal es enlazado a un gen que codifica una proteína heteróloga capaz de ser expresada en una célula de planta. Dicho gen condicionalmente letal siendo capaz de expresar un fenotipo letal bajo exposición a una formulación química especifica de tensión. Un gen condicionalmente letal preferido es oncogén 2 del plásmido Ti de Agrobacterium tumefaciens que codifica la enzima indolacetamida hidrolasa (lAMH). Como ejemplo, la secuencia de ADN de la octopina de ADN-T, incluyendo la región de codificación y secuencia promotora del oncogén 2, se describe en la patente de E.U.A. 5, 428,147 de Barker y otros. El substrato para lAMH incluye varias indolamidas y derivados auxina relacionados, incluyendo la nafatalenacetamida (NAM) química sintética. La aplicación de NAM a células de plantas expresando el oncogén 2 ocasiona la producción del agente fitotóxico ácido naftalenacético (NAA). El ADN que codifica el gen condicionalmente letal también comprende un promotor a partir del cual lAMH es expresada en células de plantas en cantidades suficientes para conferir el fenotipo condicionalmente letal. Tal promotor puede ser el promotor nativo del oncogén 2, un promotor constitutivo tal como el promotor de virus de mosaico de coliflor CaMV355, o un promotor especifico de célula o tejido. En una modalidad muy preferida de la presente invención, el oncogén 2 de Agrobacterium es utilizado como parte del vector de transformación de plantas. La presencia del oncogén 2, en el vector de transformación de plantas proporciona muchas ventajas. Estas incluyen: la habilidad la utilizar dosis subletales de indolamidas de auxina y derivados de auxina relacionados para ocasionar un cambio visual en el fenotipo en plantas comprendiendo el vector de transformación; la habilidad de utilizar indolamidas y derivados de auxina relacionadas para la selección de células de planta durante el proceso de transformación; y el uso del oncogén 2 como un componente de métodos de rescate de semilla y embrión que permiten la identificación de plantas transgénicas comprendiendo el vector de transformación. La invención además proporciona plantas o células transformadas con las construcciones o vectores antes mencionados. En una modalidad preferida, la planta o célula es Brassica. Una modalidad particular es Brassica la cual tiene una composición de aceite alterada. Preferiblemente, Brassica es una que tiene un alto contenido de ácido oleico y un bajo contenido de ácido linoléico tal como AG019 o sus puntos relacionados y derivados. En un aspecto de la invención, los genes condicionalmente letales son valiosos para controlar la extensión de genes novedosos, incluyendo aquellos utilizados en agricultura molecular. En una modalidad, una planta transgénica conteniendo un gen condicionalmente letal, tal como el oncogén 2, es removida de un ambiente de crecimiento a través de la aplicación de un agente químico, el cual es convertido a un agente fitotóxico en presencia del producto del gen condicionalmente letal. El agente químico es aplicado a un nivel que da como resultado un nivel letal de la fitotoxina. En una modalidad especifica, el oncogén 2 es utilizado como el gen condicionalmente letal. El producto de gen en este caso es lAMH, la cual convierte una indolamida o un derivado relacionado al NAA de fitotoxina. En una modalidad preferida especifica, la indolamida es NAM. En una modalidad preferida, la presente invención proporciona el gen condicionalmente letal tal como el oncogén 2, como un marcador visual, capaz de clasificación que permite la discriminación de plantas transgénicas de plantas no transgénicas. El método involucra la aplicación de una cantidad de un agente químico, después de ser convertido por el gen condicionalmente letal expresado, da como resultado un nivel subletal de fitotoxina. Las plantas que contienen el transgen condicionalmente letal son identificadas en forma visual como aquellas que manifiestan el fenotipo subletal. La invención además proporciona un método para seleccionar la planta transgénica, ya que las plantas identificadas como transgénicas se recuperan a plantas normales en ausencia del agente químico. Como se describió anteriormente, cuando se utiliza el oncogén 2 como el gen condicionalmente letal, el agente químico es una indolamida o un derivado relacionado, en una modalidad preferida especifica, la indolamida es NAM. El uso de un gen condicionalmente letal tal como el oncogén 2 como un marcador visual, permite que cualquier gen deseado, incluyendo aquellos que codifican una proteína heteróloga o un rasgo de "entrada", o de "salida", pueden ser incorporado a una planta, aun cuando dicha planta sea recalcitrante a la transformación, por ejemplo, ciertas Brassicas tales como A019. El cruce sexual seguido por inspección visual de progenie a una etapa temprana de desarrollo proporciona un medio conveniente, no destructor, no bioquímico para identificar la planta transgénica. Literalmente miles de plantas pueden ser clasificadas a la vez Este método proporciona un medio no costoso y exacto para rastrear la introgresión de rasgos novedosos dentro de una gran población de crianza. No se requiere de ningún ensayo bioquímico, tal como los ensayos GUS o análisis de ácido nucleico tales como PCR. La inclusión de un gen letal condicional, tal como el oncogén 2 en vectores de transformación de plantas que contienen genes que codifican para rasgos de entrada o salida, por lo tanto, permite un a rápida introgresión de dichos rasgos en numerosas variedades de plantas. Se proporciona un procedimiento simple para clasificar plantas transgénicas que expresan el oncogén 2. Las poblaciones de plantas son rociadas con la mezcla formulada de naftalenacetamida. En 24 horas, se observan, en las plantas transgénicas, epinastia y cambios fenotípicos visuales obvios. Las plantas sin el oncogén 2 no se ven afectadas. Se seleccionan plantas que han sido afectadas. Estas se recuperan en 72 horas y continúan creciendo y establecen las semillas. Esta respuesta fenotípica es transmitida a generaciones subsecuentes. La presente invención además proporciona el oncogén 2 como un marcador visual, capaz de clasificación, que permite la selección de semillas germinación o embriones de plantas que expresan el oncogén 2. El método implica cultivar la semilla o embrión en un medio que contiene: (a) una indolamida o un derivador relacionado, y (b) un inhibidor de transporte de auxina; después identificar visualmente al semilla o embrión germinado que manifiesta el fenotipo. La semilla o embrión transgénico identificado es fácilmente recuperado transfiriendo a un medio sin indolamida o el inhibidor de transporte a auxina. La presente invención además proporciona un método para seleccionar una célula de planta transgénica durante la transformación. El procedimiento utiliza un oncogén como parte de una construcción de expresión o vector utilizado para transformar la célula. Una vez que el vector ha penetrado la célula de planta, la célula es expuesta a una fórmula que contiene: (a) un derivado benigno de una hormona de planta que se convierte en una hormona activa en presencia de un producto de expresión de oncogén y, (b) un inhibidor de transporte de auxina. Después de que las células se dejan desarrollar en un macizo, el macizo de célula es identificado visualmente como aquel que manifiesta el fenotipo asociado con la hormona activa. El grupo de células identificadas después se deja recuperar en ausencia del derivado de hormona, y se regenera en una forma usual a una plana entera. Si el oncogén es el oncogén 2 entonces el derivado benigno preferido es una indolamida o un derivado relacionado tal como NAM y el inhibidor preferido es ácido naftilftalámico. La aplicación de un inhibidor de transporte de auxina además de NAM, el cual se convierte a través de lAMH a NAA, enormemente potencia el efecto del NAA. De esta manera, se identifican células de plantas transgénicas que comprenden un rasgo deseado y el oncogén 2, a través de la aplicación de una formulación que incluye: (a) una indolacetamida y compuestos relacionados, y (2) un inhibidor de transporte de auxina. Se pueden utilizar numerosos inhibidores de transporte de auxina (Fitotrofinas): ácido N-(1 -naftil)ftalámico "Naptalam" (NPA); ácido 2,3,5-Triyodobenzoico (TIBA); ácido 9-hidroxifluoren-9-carboxílico (HFCA); Eritrosina, eosina, fluoresceína; Semicarbazonas (SCBs); y etanfon. Típicamente, los inhibidores de transporte de auxina son aplicados a un régimen de entre 10 a 100% del régimen del derivado de auxina aplicado. En algunos casos, se utilizan regímenes de 200-400 % del inhibidor de transporte de auxina con relación al derivado de auxina aplicado. Aunque cualquier planta o célula puede ser utilizada en los métodos de la presente invención, en una modalidad preferida, la planta o célula utilizada es Brassica. Una modalidad particular es Brassica, la cual tiene una composición oleosa alterada. Preferiblemente, la Brassica es una que tiene un alto contenido de ácido oleico y un bajo contenido de ácido linoléico tal como AG019 o sus relativos y derivados.
Transformación de Brassica También se describe un método novedoso para obtener Brassica napus transformada. El método es particularmente útil para ia transformación de cultivos que se ha encontrado que son difíciles de transformar utilizando métodos previos. En particular, se prefieren la variedad AG019 y su progenie.
En esta modalidad particular de la presente invención, el método de la presente para obtener plantas de Brassica napus AG019 transformadas incluye los pasos de: transformación, selección y regeneración. El método puede ser utilizado para transformar plantas de Brassica napus AG019 y su progenie con cualquier material genético deseado. El material es insertado en un vector de transformación adecuado para utilizarse en transformación de Agrobacterium como es conocido. El procedimiento de transformación incluye co-cultivación de células de planta con una cepa adecuada de Agrobacterium tumefaciens. Las cepas, que han sido utilizadas para transformación de Brassica, son numerosas e incluyen, por ejemplo, cepa GV3101/p MP90 (Koenz & Schell, Molecular Gen. Genet. 204:383-396, 1986), cepa LBA4404/pAL4404 (Coms y otros, Plasmid 7:15-29, 1992) y cepa A281/pEHA105 (Hood y otros, Trasngenic Res. 2:208-218, 1983). La Agrobacterium es utilizada para transformar células de Brassica co? una construcción genética seleccionada. Las células de Brassica pueden estar en cualquier forma, por ejemplo, células en cultivo o en callo o células en tejido de planta, sin embargo, se prefieren hipocotiledóneas. Las células que van a ser transformadas son precultivadas. En este tratamiento, las células son colocadas en un medio de regeneración durante 3 días. El medio de regeneración contiene macro y micro nutrientes, vitaminas y reguladores de crecimientos, los cuales inducen la formación de brotes.
Después del tratamiento de precultivo, las células se ponen en contacto con un cultivo de la cepa de Agrobacterium seleccionada. Las células después se colocan sobre un medio de co-cultivación durante un período de tiempo adecuado, preferiblemente alrededor de 3 días y de preferencia a una temperatura de aproximadamente 15°C. Después de la co-cultivación, las células son transformadas a callos y a un medio de recuperación durante 7 días. Después, los explantes son colocados en un medio de selección conteniendo macro y micronutrientes, vitaminas y reguladores de crecimiento, los cuales inducen la formación de brotes. El medio de selección también contiene un bacteriocida, por ejemplo, carbenicilina. Preferiblemente, también contiene un agente de selección. Las células crecen sobre el medio de selección hasta que se desarrollan brotes (transformantes putativos). En el caso de transformación de Brassica napus con perfiles oleosos alterados, la adición de la hormona NAA a este callo y medio de recuperación incrementa enormemente la formación de brotes transgénicos. Para mejorar la regeneración, cualesquiera brotes que se desarrollan son transferidos en una base regular a un medio de selección fresco. Las plántulas son colocadas en un medio de elongación de brote y finalmente un medio de formación de raíz. El método para obtener plantas de Brassica transformadas descritas anteriormente se ha encontrado especialmente útil para variedades de Brassica napus AG019.
Los ejemplos establecidos a continuación son para propósitos de ilustración y de ninguna manera pretenden limitar el alcance de la invención.
EJEMPLO 1 Método De Transformación Novedoso De Brassica El método presentado a continuación permite la transformación conveniente de Brassica napus, particularmente Brassica napus variedad AG019 y su progenie. Para todos los pasos del protocolo de transformación de AG019, se utilizaron las siguientes condiciones de Cultivo de Tejido (TC): 22+1- 1'C durante 16 horas con luz y 8 horas en la obscuridad con una intensidad de luz de 100 microE/m2/s. Se esterilizaron en la superficie semillas durante 10 segundos en 100% de etanol. Después del baño de etanol, las semillas fueron transferidas a 100% de Javex (5.64% p/v de hipoclorito de sodio) + 0.1% de Tween 20 (v/v) durante 10 minutos, seguido por un baño adicional de 10 minutos en 100% de Javex más 0.1% de Tween 20 (v/v). En la esterilización de superficie, las semillas después se lavaron con aproximadamente 800 ml de agua estéril. La semillas esterilizadas en la superficie se colocaron en placas sobre MMOM de resistencia de A (medio orgánico mínimo de Murashige), 1% (p/v) de sacarosa, 0.8% (p/v) de agar a un pH de 5.8. Las semillas esterilizadas en la superficie se incubaron durante 5-7 días bajo las condiciones TC descritas anteriormente. Una colonia individual de Agrobacterium conteniendo la construcción de vector de transformación de planta es transferido al medio mínimo AB (Watson y otros, 1975) durante 48 horas a 28°C, lo cual se da a una densidad de aproximadamente 6 x 108 cfu/ml. Las hipocotiledóneas son cosechadas de semillas germinadas y transferidas al medio de pre-cultivo (MMOM, 3% p/v) de sacarosa, 5.0 mg/L BAP, 0,7% (p/v) de agar, y NAA, 0.1 mg/L, pH 5.8) y se incubó durante 3 días bajo las condiciones de TC descritas anteriormente. Los explantes de hipocotiledóneas después se transfirieron del medio de pre-cultivo al medio mínimo AB conteniendo la cepa de Agrobacterium de interés y se incubó durante por lo menos 2 minutos. Los explantes de hipocotiledóneas después se colocaron en placas sobre el medio de pre-cultivo y se incubaron durante 3 días bajo las condiciones TC descritas anteriormente. Después de la co-cultivación, los explantes de hipocotiledóneas se transfirieron al medio de formación de callo/recuperación (MMOM, 3% (p/v) de sacarosa, 5.0 mg/L BAP, 0.1% mg/L NAA 0.7% (p/v) de agar, pH 7.5 más 300 mg/L Timentina) y se incubó bajo las condiciones de TC descritas anteriormente para eliminar Agrobacterium y permitir la formación de callo y recuperación del explantes de hipocotiledónea. Se debe observar que este paso incluye la adición del NAA de hormona, que enormemente facilita la recuperación de brotes transgénicos. Después de la formación de callo/recuperación, los explantes de hipocotiledónea fueron transferidos al Medio de Inducción de Brotes (MMOM, 3% (p/v) de sacarosa, 4.5 mg/L de BAP, 0.7% (p/v) de agar, pH 5.8 más 300 mg/L de Timentina 5.0 mg/L de nitrato de plata y un agente de selección tal como canamicina, si es apropiado), y se incubó durante aproximadamente 4 semanas bajo las condiciones de TC descritas anteriormente para inducir la formación de brotes. Después de una incubación durante 4 semanas el medio de inducción de brotes, se transfirieron los brotes verdes y callos al medio de elongación de brote en cual contiene MMOM, 3% (p/v) de sacarosa y 0.7% (p/v) de agar más 300 mg/L de Timentina, más una agente de selección a un pH de 5.8. Los brotes verdes y callos se incubaron durante 4 semanas más utilizando las condiciones TC como se describió anteriormente. Los brotes verdes se transfirieron del medio de elongación de brote al medio de formación de raíz (MMOM, 3% (p/v) de sacarosa y 0.7% (p/v) de agar; 0.1 mg/L de NNA, o IBA; pH 7.5) y se incubó durante 4 semanas más o hasta que las raíces se desarrollaron para transferirse al suelo. Después de la formación de la raíz, las plántulas se transfirieron al suelo y crecieron bajo condiciones de invernadero.
EJEMPLO 2 Construcción De Un Vector De Transformación De Planta Novedoso Comprendiendo Un Gen Condicionalmente Letal (Oncogén 2) Se construyeron vectores de transformación de planta novedosos comprendiendo el oncogén 2 de Agrobacterium como un gen condicionalmente letal, como se describe en este ejemplo y ejemplos 3 a 7. Estos vectores permiten que las plantas transformadas con ellos sean selectivamente removidas de una población de plantas no transformadas. Dichos aspectos según conferidos por estos vectores, no se han encontrado en vectores empleados por rutina para producir plantas transgénicas de Brassica. El vector se prepara aislando primero el oncogén 2 condicionalmente letal de la cepa A248 de Agrobacterium tumif aciens a través de PCR e introduciendo sitios de restricción en el extremo 5' y 3' del gen. Una secuencia de codificación de ADN, junto con las secuencias nativas de promotor y terminador del plásmido pT¡A6 se obtuvo (No. de acceso X00409). El ADN total fue extraído de la cepa A248 de Agrobacterium tumifaciens. Un fragmento de PCR de 2.3 Kb extendiéndose desde un sitio Hind lll cerca del extremo 5' del oncogén 1 (IAA-M), a través del promotor bidireccional de longitud completa a través de la región de codificación de oncogén 2 (IAA-H), finalizando con su terminador, fue amplificado a partir del plásmido de Ti, pT¡6. Los iniciadores utilizados, pr8349 y pr7495, fueron diseñados utilizando la secuencia publicada del oncogén 2. (GenBank no. de acceso X00409). Para facilitar la clonación del producto, las extensiones de 5' sobre los iniciadores introdujeron 3 sitios de restricción, Xbal, Pst I y Kpn I, al extremo 5' de un sitio BamHi para el extremo 3' del producto de PCR resultante.
Kpnl Xbal PsTI pr8349 5' -AAAATCTAGACTGCAGGTACCGCACTCGGTGGAGATTTG3 BamHI pr7495 5 -AAAAGCATCCCACAGCGTGTGCCTAAATAGGATTGCT- El ADN total de la cepa A248 de Agrobacterium tumifaciens se utilizó en una reacción de PCR conteniendo 0.1 ug del ADN de plantilla, 5 unidades (1uL) de polimerasa de ADN TaqPlus de Stratagene (San Diego, California) 10 ul de regulador de pH Extend Tag (Stratagene), 0.5 U (0.2 ul) de polimerasa de ADN Pfu (Stratagene), 8 ul de 2.5 mM de dNTPs, 5uM de iniciadores (2.5 ul de cada uno) y 21.2 ul de agua La reacción se inició a 94°C durante 2 minutos, después 35 ciclos de. 94°C durante 30 segundos, 55°C durante 30 segundos, 72°C durante 2 minutos. Después de estos ciclos, la reacción se mantuvo a 72°C durante 7 minutos y el ADN fue aislado. Se obtuvo de un producto de 1.8 Kb , el cual fue verificado a través de análisis de restricción para corresponder al oncogén 2 auténtico. El producto de PCR fue digerido con Xbal y Bam Hl y ligado a los sitios correspondientes del plásmido pHS723 (Hirji, r. Hammerlindl, J.K., Woytowich, A. E., Khachatourian, G.G., Datla, R.S.S., Séller, W.A., Selveraj, G. (1996) Plasmid pHS723 and its derivates: plant transformation vectors that enable efficient selection and progeny analysis. Fourth Canadian Plant Tissue Culture and Genetic Engineering Conference, Saskatoon, Saskatchewan, Canadá) para dar pJH121. El vector resultante fue transferido a la cepa GV3101 ::pMP90 de Agrobacterium y se utilizó en experimentos de co-cultivación para producir plantas transformadas expresando el oncogén 2. El vector también confiere resistencia a canamicina y actividad GUS para la clasificación de transgénicos. La derivación pJH121 se ilustra en la Figura 1.
EJEMPLO 3 CONSTRUCCIÓN DEL VECTOR DE TRANSFORMACIÓN DE PLANTA PJH122 Se construyó como sigue un vector de transformación de planta comprendiendo el oncogén 2 y un marcador de resistencia a canamicina. El plásmido pJH121 fue digerido secuencialmente, primero con Xba I, después con BamHI para dividir la región de codificación del oncogén 2 de 2.3 Kb y terminador impulsado por su promotor de longitud completa nativo. El fragmento fue purificado mediante gel y electroelouído. El vector de transformación de planta binario pRD400 fue similarmente digerido con Xba I y Bam Hl. El vector pRD400 es un plásmido idéntico a pBIN 19 excepto que un par de base individual ha sido cambiado en el gen de fosfotransferasa de neomicina para mejorar la expresión del marcador seleccionable (Datla y otros, Gene 122:383-384. 1992). El cásete de gen electrouído fue ligado a los sitios correspondientes del vector. El plásmido resultante, pJH122, fue transferido a través de apareamiento triparenteral a la cepa GV3101 ::pMP90 de Agrobacterium para la transformación a plantas. La derivación de pJH122 se ilustra en la Figura 2.
EJEMPLO 4 Construcción Del Vector De Transformación De Planta pJH123 Un vector de transformación de planta comprendiendo un gen condicionalmente letal y un gen que codifica una proteína heteróloga capaz de expresión en células de planta, fue construido En este ejemplo, el oncogén 2 condicionalmente letal fue unido a un gen heterólogo que codifica una proteína de fusión. La fusión en este caso es entre el gen de oleosina y el gen de beta-glucuronidasa, bajo el control del promotor de oleosina en el plásmido SBS 2002. El plásmido SBS 2002 es un vector de transformación de planta que contiene un cásete de 3.9 kb consistiendo de un promotor de oleosina de Arabidopsis y una región de codificación, la cual es fusionada a manera de traducción a la región de codificación de beta- glucoronidasa y finaliza en el terminador de sintasa de nopalina. El cásete es esencialmente como aparece en pCGYOBPGUSA, descrito en Rooijen and Moloney (Structural requirements of oleosin domanins for subcellular targeting to the oil body. Planta Physiology 109 (1995): 1353-1361). El plásmido SBS2002 fue digerido con Pst I y los fragmentos se separaron sobre gel de agarosa. El cásete de Oleosin-GUS-NOS ter de 3.8 kb fue electroeluído y ligado a los adaptadores Pst I - Bgl II. Los adaptadores fueron fosforilados sobre el extremo Pst I pero no el extremo Bgl II. El producto resultante después fue fosforilado en los sitio s Bgl II a través de una reacción de sinasa. El vector de transformación de planta, pJH122, como se describió en el ejemplo 3 fue digerido con Bam Hl y desfosforilado. El fragmento de Oleosina-GUS cinado después fue ligado a los sitios Bam Hl del vector en presencia de la enzima Bam Hl. Solamente las ligaciones de Bam/Bgl sobrevivirán cuando se transforman a E. coli. El vector terminado, pJH123, fue transfectado a través de apareamiento triparental a la cepa Gv3101 : :pMP90 de Agrobacterium para transformaciones de planta. El vector confiere en tejido y plantas transformadas, resistencia a canamicina para selección, así como expresión del oncogén 2. Además, el cásete de oleosina-GUS proporciona la expresión de actividad de glucruronidasa activada para los cuerpos oleosos de semillas (van Rooijen y Moloney, 1995). La derivación de pJH123 se ilustra en la Figura 3.
EJEMPLO 5 Construcción Del Vector De Transformación De Planta pJH125 La región que se extiende el codón de inicio de traducción de la región de codificación del oncogén 2 y que finaliza con su terminador, fue amplificada a través de PCR a partir del plásmido de Ti, pT¡A6, el cual se extrajo del ADN total de la cepa A248 de Agrobacterium tumifaciens. Los iniciadores utilizados, pr10109 y pr7495 fueron diseñados utilizando la secuencia publicada del oncogén 2.. (GenBank no. de acceso X00409). Para facilitar la clonación del producto, las extensiones 5' en los iniciadores introdujeron 2 sitios de restricción, Xbal y Ncol, al extremo 5' y un sitio BamHI al extremo 3' del producto de PCR resultante.
Xbal Ncol pr10109 5 -AAAATCTTAGAGTCCATGGTGGCCATTACCTCG- BamHi pr7495 5 -AAAAGGATCCCACAGCGTGTGCCTAAATAFFATTGCT-3 El producto de PCR fue digerido con Xbal y Bam Hl y ligado en los sitios correspondientes del plásmido p35S-l5S-NOS. El plásmido p35S-335S-NOS comprende un fragmento de 600 bp consistiendo del promotor de mosaico de coliflor 35S con secuencia duplicada mejoradora, (Kay, R., Chan, A., Daly, M., y McPherson, J., Duplication of CaMV 35S Promoter sequences creates a strong enhancer for plant genes. Science, 236 (1987) 1299-1302) y el terminador NOS. El fragmento de promotor-terminador está contenido dentro del vector de clonación común pTZ17R y fue obtenido del Dr. Raju Datla (Plant Bioitechnology Institute, National Research Council of Canadá, 110 Gymnasium Road, Saskatoon, Saskatchewan, S7N 0W9) para dar pJH124. El cásete de promotor-oncogén de 2300 bp fue aislado de pJH124 como un fragmento de Hindi y BamHI y se ligó a los sitios, correspondientes del sitio de clonación múltiple del vector de transformación de planta binario (pRD400) para derivar el vector de transformación de planta, pJH125. El vector fue transferido a la cepa GV3101 ::pMP90 de Agrobacterium y se utilizó en la co-cultivación con explantes para producir plantas transformadas expresando el oncogén 2. La derivación de pJH125 se ilustra en la Figura 4.
EJEMPLO 6 Construcción Del Vector De Transformación De Planta pJH126 El cásete de oleosina-GUS de pSBS 2002 fue aislado, enlazado y cinado como se describió para la construcción de pJH123. El vector de transformación de planta pJH126 (consistiendo de pRD400 conteniendo la región de codificación del oncogén 2 y el terminador accionado por el promotor 35S-35S) fue digerido con BamHI y desfosforilado. El fragmento de oleosina-GUS cinado después fue ligado a los sitios desfosforilados de BamHI del vector en presencia de la enzima Ba Hl como se describe para pJH123. El vector terminado, pJH126, fue transferido a través de apareamiento triparental a la cepa GV3101 ::pMP90 de Agrobacterium para transformaciones de plantas. El vector confiere en el tejido y plantas transformadas resistencia a canamicina para selección, así como expresión del oncogén. Además, el cásete de oleosina-Gus proporciona. expresión de actividad de glucoronidasa activada a los cuerpos oleosos de semillas. La derivación de pJH1265 se ilustra en la Figura 5.
EJEMPLO 7 Construcción Del Vector De Transformación De Planta pJH130 El cásete del promotor 35S-35S-oncogén de 2300 bp fue aislado como Hindi a un fragmento BamHI de pJh124 y se clonó a los sitios correspondientes del vector de transformación de planta pHS723 para producir el plásmido pJH130. El vector de estructura de base, pHS723, expresa una proteína de fusión de GUS/NPT, la cual permite la selección de células transformadas, y su progenie con base en resistencia a canamicina y la fácil clasificación de tejido transformado con base en la expresión de la actividad de glucuronidasa. El cásete de oncogén introducido, las células, plantas y su progenie también expresan además el producto de gen del oncogén 2. La derivación de pJH130 se ilustra en la Figura 6.
EJEMPLO 8 Análisis De Plantas Tabaco Transformadas Conteniendo El Vector pJH121 Se recuperaron plantas de tabaco transformadas conteniendo la construcción pJH 121 descrita anteriormente, y se probaron utilizando análisis estándares para determinar la presencia del vector insertado. Se seleccionaron los transformantes confirmados y un número representativo de plantas fue tratado con NAM para demostrar el fenotipo condicionalmente letal como sigue. Se preparó una solución conteniendo 200 ug/mL de NAM con 0.1% de Tween 20. Las plantas fueron rociadas para lavar utilizando un aspersor presurizado. En las plantas que expresan el fenotipo condicionalmente letal, 2 días después de rociar las hojas se cayeron y los márgenes de las hojas se rizaron. En 5 días, las hojas se torcieron y la planta mostró una toxicidad de auxina típica. Las plantas no transformadas no se vieron afectadas por el tratamiento.
La semilla fue recogida de plantas transformadas y germinadas en presencia de NAM para confirmar la expresión de semilla del fenotipo condicionalmente letal.
EJEMPLO 9 Análisis De Plantas De Brassica Napus Transformadas Conteniendo El Vector pJH121 Las plantas transformadas de Brassica napus conteniendo la construcción pJH 121 descrita anteriormente, fueron recuperadas y probadas utilizando análisis estándar para determinar la presencia del vector insertado. Los transformantes confirmados se seleccionaron y un número representativo de plantas en la etapa de 3-4 hojas de crecimiento se trató con NAM para demostrar el fenotipo condicionalmente letal como sigue. Se preparó una solución conteniendo 200 ug/mL de NAM con 0.1% de Tween 20. Las plantas fueron rociadas para limpiar utilizando un aspersor presurizado. En las plantas que expresan el fenotipo condicionalmente letal, las plantas transgénicas permanecieron con el desarrollo impedido 25 días después del rocío, mientras que las variedades no transgénicas crecieron normalmente y crecieron. La semilla fue recogida de plantas transformadas y germinada en presencia de NAM para confirmar la expresión de semilla del fenotipo condicionalmente letal.
EJEMPLO 10 Análisis De Brassica Napus Transformada Conteniendo El Vector PJH125 Las plantas de Brassica napus transformadas conteniendo la construcción pJH125 (oncogén 2 35S) descritas anteriormente se recuperaron y probaron utilizando análisis estándar para determinar la presencia del vector insertado. Se seleccionaron transformantes confirmados y se probó un número representativo de plantas con NAM para demostrar el fenotipo condicionalmente letal como sigue. Se preparó una solución conteniendo 200 ug/mL de NAM con 0.1% de Tween 20. .Las plantas se rociaron para limpiar utilizando un aspersor presurizado. En las plantas que expresan el fenotipo condicionalmente letal, dos días después de rociar la aspersión, las hojas se cayeron y los márgenes de las hojas se rizaron. En 5 días, las hojas se torcieron y la planta mostró una toxicidad de auxina típica. Las plantas no transformadas se vieron no afectadas por el tratamiento.
EJEMPLO 11 Demostración Del Oncogén 2 Como Un Marcador Seleccionable/Clasificable Positivo En Programas De Crianza Se puede utilizar el oncogén 2, cuando se enlaza al transgen de rasgo de interés, como un marcador positivo seleccionable y marcable en transformación, conversión de evento y estrategias de crianza convencionales como un marcador visual simple para rastrear 10 el gen de rasgo de interés. La habilidad para seleccionar visualmente plantas en un evento de conversión (retroceso, introgresión) y programas de crianza convencionales reduce el tiempo y el apoyo analítico (ELISA; PCR; Southern Blot Analysis, etc.) requerido para identificar la progenie que contiene el transgen de interés de cruzas 15 entre el evento transgénico y el genoplasma agronómicamente selecto. Además, la rápida selección visual en un programa de crianza reduce el manejo y de muestra de tejido y el mantenimiento de plantas no transgénicas en una población de segregación que no son de interés en el programa de crianza hasta que los resultados 20 del análisis analítico estén disponibles del laboratorio. En este ejemplo, se plantaron 20 plantas de eventos de transformación JH 2984 y JH 2973. Estas variedades transgénicas fueron segregando 3:1 para el vector de transformación de planta insertado pJH125. Se aplicó NAM a un régimen de 1 mg/mL en la 25 etapa 2-3 de la hoja. 24 horas después de la aplicación de NAM, las JBgMgggggg^^ plantas fueron clasificadas para un fenotipo visual. A partir de la apariencia visual de las hojas torcidas, se seleccionó una muestra aleatoria de 8 plantas como transgénicos putativos, se seleccionaron 4 siendo no transgénicos. Estas plantas fueron sometidas a análisis de PCR para la presencia del vector de transformación. Las 8 plantas transgénicas putativas se confirmó que llevan el vector de transformación a través de PCR, mientras que las 4 de los puntos nulos putativos o plantas no transgénicas mostraron ser no transgénicas a través de análisis de PCR. De esta manera, el uso rápido y confiable del uso del oncogén 2 como un marcador capaz de clasificación parar identificar variedades transgénicas dentro de poblaciones de segregación (por ejemplo, tal como programas de crianza o durante la introgresión) se ve demostrado.
EJEMPLO 12 Uso Del Oncogén 2 Condicionalmente Letal Como Un Marcador Capaz De Clasificación En Germinación De Embrión Y Semilla Se utilizó el oncogén 2 como un marcador seleccionable en la germinación de semilla y rescate de embrión en ensayos in vitro, permitiendo una determinación muy temprana de la presencia del vector de transformación en poblaciones de segregación. Las semillas o embriones de plantas transgénicas conteniendo pJH125, cuando se cultivaron en un medio conteniendo NAM y un inhibidor de transporte de auxina, pueden ser visualmente seleccionados con base en el fenotipo cuando se compara con siembras no transformadas. El ensayo in vitro reduce el tiempo y espacio físico (por ejemplo, número de plantas en cámaras de crecimiento o bajo cultivación) requerido para identificar líneas transgénicas homocigotas y el método de rescate de embrión permite ia selección y recuperación de siembras transformadas, el cual reduce el tiempo del ciclo de generación a generación en un programa de crianza. En este ejemplo, las semillas de JH2973 y Jh2984, representando una población de segregación para el vector de transformación pJH125 fueron germinadas in vitro en presencia de NAM y el ácido naftilftalámico (NPA) y de inhibidor de transporte de auxina. Las siembras transgénicas se seleccionaron con base en el fenotipo que incluye siembras con el desarrollo impedido, cotiledóneas pequeñas, raíces y callos con el desarrollo impedido e hinchados en la unión de raíz/brote. Los segregantes no transformados se desarrollaron en forma normal. Cuando las siembras transgénicas putativas fueron transferidas al medio no selectivo, las plantas se recuperaron y crecieron normalmente. La presencia del vector de transformación en estas plantas fue confirmada como se hizo anteriormente. Es obvio que para Brassica napus el uso de cultivos de microespora para producir embriones derivados de microesporas en combinación con el uso del oncogén 2 como un marcador capaz de selección, proporciona un medio conveniente para derivar líneas transgénicas homocigotas.
EJEMPLO 13 Uso Del Oncogén 2 Como Un Marcardor Seleccionable Durante La Transformación De Brassica napus El protocolo de transformación detallado en el ejemplo 1 puede ser modificado para permitir el uso del oncogén 2 dentro del procedimiento. En particular, el protocolo de transformación descrito en el ejemplo 1 requiere de tratamiento con NAM en las fases precultivo, co-cultivación, formación de cali/recuperación e inducción de raíz, para la recuperación exitosa de variedades transgénicas de AG019 y su progenie. El reemplazo de NAA con NAM, en la formación y callo y recuperación, de un período de 7 días de incubación en aquellos casos en donde el oncogén 2 es incluido en el vector de transformación, proporciona un medio conveniente para promover el crecimiento.de células plantas transgénicas y proporciona un método de selección positivo para la recuperación de Brassica transgénica. El medio se hace con NAM en lugar de NAA y típicamente incluye un inhibidor de transporte de auxina a una relación de 1:2 a 2:1 (NAM: inhibidor de transporte de auxina). Cada patente, solicitud de patente y publicación mencionadas aquí anteriormente se incorporan aquí por referencia individual. Las modificaciones a las modalidades especificas anteriores serán evidentes para aquellos expertos en la técnica, mientras realizan las enseñazas de la invención. Se debe entender que todas estas modificaciones serán cubiertas por las reivindicaciones anexas.
LISTA DE SECUENCIAS <110> National Research Council of Canadá <120> Plantas Transgénicas y Métodos para su Producción <130> 75151-9 <140> <141> <150> US60/113.546 <151> 1998-12-22 <160> 3 <170> Patentln Ver. 2.0 <210> 1 <211> 39 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> iniciador <400> 1 aaaatctaga ctgcaggtac cgcactcggt ggagatttg 39 <210> 2 <211> 37 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> iniciador <400> 2 aaaaggatcc cacagcgtgt gcctaaatag gattgct 37 <210> 3 <211> 32 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> iniciador <220> <223> iniciador <400> 3 aaaatctaga gtccatggtg gccattacct cg 32

Claims (58)

REIVINDICACIONES
1. Una construcción genética que comprende: un primer gen condicionalmente letal adaptado para expresión en una célula de planta; y un segundo gen adaptado para la expresión en una célula de planta, dicho segundo gen, cuando se expresa en una planta, confiriendo un rasgo novedoso en esa planta.
2. La construcción de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el segundo gen es heterólogo a la célula de planta.
3. La construcción de acuerdo con la reivindicación 2, en donde el gen heterólogo codifica para un producto farmacéutico.
4. La construcción de acuerdo con la reivindicación 2, en donde el gen heterólogo codifica para una enzima industrialmente útil.
5. La construcción de acuerdo con la reivindicación 2, en donde le gen heterólogo codifica para renina y/o hirudina.
6. La construcción de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el segundo gen, cuando se expresa, cambia el fenotipo de la planta.
7. La construcción de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el segundo gen codifica para una proteína, péptído o ARN antisentido.
8. La construcción de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el segundo gen codifica para una rasgo de entrada o salida.
9. La construcción de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el gen condicionalmente letal es un oncogén.
10. La construcción de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el gen condicionalmente letal es el oncogén 2 de Agrobacterium tumifaciens.
11. La construcción de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el gen condicionalmente letal se expresa en respuesta a un químico o tensión.
12. La construcción de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el gen condicionalmente letal es letal solamente cuando se aplica una substancia exógena.
13. La construcción de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el gen condicionalmente letal es letal cuando es expresado y no es necesario aplicar ninguna substancia exógena.
14. La construcción de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el gen condicionalmente letal es el oncogén 4, un oncogén bajo del control de un promotor de un gen capaz de inducción a baja temperatura de Arabidopsis, el gen codificando para metoxinina-deshidrogenasa, el gen codificando para rizobitozina-sintasa, o el gen codificando para fosfonato monoéster hidrolasa.
15. La construcción de acuerdo con la reivindicación 12, en donde el gen condicionalmente letal es el gen que codifica para metoxinina-hidrogenasa, el gen que codifica para rizobitoxina-sintasa, o ei gen codifica para fosfonato monoéster hidrolasa.
16. La construcción de acuerdo con la reivindicación 12, en donde el gen condicionalmente letal es el gen que codifica para metoxinina deshidrogenasa o el gen que codifica para rizobitozina- sintasa.
17. La construcción de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el promotor de dicho primer gen condicionalmente letal es capaz de inducción.
18. La construcción de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el promotor de dicho primer gen condicionalmente letal es específico en tejido.
19. La construcción de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el promotor del primer gen condicionalmente letal es constitutivo.
20. Un vector de transformación de planta que comprende la construcción genética de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19.
21. Una planta que comprende una construcción genética de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19.
22. Una planta que comprende la construcción genética de cualquiera de las reivindicaciones 11, 12, 13 y 15.
23. Una planta transformada con el vector de la reivindicación 20.
24. La planta de cualquiera de las reivindicaciones 21 a 23, la cual es Brassica.
25. La planta de Brassica de acuerdo con la reivindicación 24, la cual tiene una composición de aceite alterada.
26. La planta de Brassica de acuerdo con la reivindicación 25, la cual tiene un genotipo con alto contenido de ácido oleico y un bajo de ácido linoléico.
27. La planta de Brassica de acuerdo con la reivindicación 26, la cual es de la variedad AG-019 o sus derivados.
28. Un método para producir una planta transgénica, la cual puede ser removida de un ambiente de crecimiento, que comprende: transformar una célula de planta con la construcción o vector genético de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20; y regenerar la planta de célula a una planta entera.
29. Un método para remover la planta de la reivindicación 22, de un ambiente de crecimiento, que comprende la aplicación de un agente químico, el cual es convertido a un agente fitotóxico a través de un producto de un gen condicionalmente letal, en donde el agente es aplicado a un nivel que, después de la conversión por el producto de gen, da como resultado un nivel subletal del substrato convertido.
30. Un método para la identificación visual de la planta de acuerdo con la reivindicación 22, que comprende: la aplicación de un agente químico que es un substrato del producto del gen condicionalmente letal, en donde el agente es aplicado a un nivel que, después de la conversión por el producto de gen, da como resultado un nivel subletal del substrato convertido; visualmente identificar las plantas que manifiestan el fenotipo subletal.
31. El método de acuerdo con la reivindicación 29, o reivindicación 30, en donde la construcción genética o vector comprende el oncogén 2 como el agente condicionalmente letal, y en donde el agente químico es una indolamida o un derivado relacionado.
32. El método de acuerdo con la reivindicación 31, en donde la indolamida es naftalenacetamida.
33. Un método para seleccionar una planta transgénica de acuerdo con la reivindicación 22, que comprende: la aplicación de un agente químico que es un substrato para el producto del gen condicionalmente letal, en donde el agente es aplicado a un nivel que, después de la conversión por el producto de gen, da como resultado un nivel subletal del substrato convertido; identificar visualmente las plantas que manifiestan el fenotipo subletal; y permitir que las plantas identificadas se recuperen a plantas normales en ausencia del agente químico.
34. Un método de acuerdo con la reivindicación 33, en donde la construcción genética o vector comprende el oncogén 2 como el gen condicionalmente letal, y en donde el agente químico es una indolamida o un derivado relacionado.
35. Ei método de acuerdo con la reivindicación 34, en donde la indolamida es naftalenacetamida.
36. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 29 a 35, en donde la planta es Brassica.
37. El método de acuerdo con la reivindicación 36, en donde la planta Brassica tiene una composición de aceite alterada.
38. El método de acuerdo con la reivindicación 37, en donde la planta de Brassica tiene un alto contenido de ácido oleico y un bajo contenido de ácido linoléico.
39. El método de acuerdo con la reivindicación 38, en donde la planta de Brassica es una variedad de AG-019 o sus derivados.
40. Un método para la identificación visual de una semilla de germinación o embrión de planta, que comprende el oncogén 2 como un transgen, que comprende: cultivar la semilla o embrión en un medio conteniendo una indolamida o un derivado relacionado; y visualmente identificar la semilla o embrión germinado que manifiesta el fenotipo.
41. Un método para seleccionar una semilla o planta de germinación o embrión, comprendiendo el oncogén 2, como un transgen, que comprende: cultivar la semilla o embrión en un medio que contenga una indolamida o un derivado relacionado; visualmente identificar la semilla o embrión germinado que manifiesta el fenotipo; y transferir la semilla o embrión identificado a un medio sin indolamida; obteniendo así la semilla o embrión de planta de germinación comprendiendo el oncogén 2 como un transgen.
42. El método de acuerdo con la reivindicación 40 o 41, en donde el medio del paso (a) contiene un inhibidor de transporte de auxina y el medio del paso (b) no tienen un inhibidor de transporte de auxina.
43. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 40 a 42, en donde el inhibidor es ácido N-(1-naftil)ftalámico; ácido 2,3,5-triyodobenzoico; ácido 9-hidroxifluoren-9-carboxílico; eritrosina; eosina; fluoresceína; semicarbazona; o etanfon.
44. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 40 a 43, en donde la indolamida es naftalenacetamida y el inhibidor es ácido naftilpftalámico.
45. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 40 a 44, en donde la semilla o embrión es Brassica.
46. El método de acuerdo con la reivindicación 45, en donde la semilla o embrión de Brassica tiene una composición de aceite alterada.
47. El método de acuerdo con la reivindicación 46, en donde la semilla o embrión de Brassica tiene un alto contenido de ácido oleico y un bajo contenido de ácido linoléico.
48. El método de acuerdo con la reivindicación 47, en donde la semilla o embrión de Brassica es de la variedad AG-019 o sus derivados.
49. Un método para seleccionar una célula de planta transgénica que comprende: transformar una célula de planta con una construcción o vector genético comprendiendo un oncogén adaptado para expresión en una célula de planta; exponer la célula de planta a una fórmula comprendiendo un derivado de auxina benigno de una hormona de planta, la cual es convertida a una hormona activa a través del producto del oncogén y un inhibidor de transporte de auxina; cultivar la célula para formar un grupo de células; visualmente identificar el grupo de células que manifiesta el fenotipo asociado con la hormona activa; y permitir que el grupo identificado de células se recupere en ausencia del derivado.
50. El método de acuerdo con la reivindicación 49, en donde el oncogén es el oncogén 2.
51. El método de acuerdo con la reivindicación 49, en donde el derivado benigno es naftalenacetamida y el inhibidor es ácido naftilftalámico.
52. El método de acuerdo con cualquiera de ias reivindicaciones 49 a 51, en donde la célula de planta es Brassica.
53. El método de acuerdo con la reivindicación 52, en donde la célula de planta de Brassica tiene una composición de aceite alterada.
54. El método de acuerdo con la reivindicación 53, en donde la célula de planta de Brassica tiene un alto contenido de ácido oleico y un bajo contenido de ácido linoléico.
55. El método de acuerdo con la reivindicación 54, en donde la célula de planta de Brassica es de la variedad AG-019 o sus derivados.
56. Un método para transformar Brassica napus, comprendiendo la inclusión de ácido naftalenacético en el medio en el paso de formación de callo y recuperación, en donde la Brassica napus tiene un perfil de aceite alterado.
57. El método de acuerdo con la reivindicación 56, en donde la Brassica napus es de la variedad AG-019.
58. Un plásmido seleccionado del grupo que consiste de: pJH121, pJH122, pJH123, pJH125, pJH126, y pJH130.
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