JP7453657B2 - 受精を介さず種子植物の胚乳発生を誘導する核酸分子及びベクター、並びに受精を介さず胚乳を発生しうる組換え種子植物及びその作製方法 - Google Patents
受精を介さず種子植物の胚乳発生を誘導する核酸分子及びベクター、並びに受精を介さず胚乳を発生しうる組換え種子植物及びその作製方法 Download PDFInfo
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Description
[1]種子植物のゲノム内に導入して発現させることにより、受精を介さず種子植物の胚乳発生を誘導するための核酸分子であって、胚乳発生誘導機能を有するポリペプチドをコードする塩基配列を含む核酸分子。
[2]胚乳発生誘導機能を有するポリペプチドが、下記式(Ia)又は(Ib)で表されるアミノ酸配列を有するモチーフを含むポリペプチドである、[1]の核酸分子。
[F/V][K/Q][A/Q]KLRKGLWSPEED[E/D]KL[L/Y]N[H/Y]I[I/T]RHG[H/V]GCWSSVPKLAGLQRCGKSCRLRWINYLRPDLKRG[A/S]FSQ[D/Q]EE[D/S]LI[I/V][A/E]LH[A/E][A/I]LGNRWSQIA[S/T][H/R]LPGRTDNEIKNFWNSCLKKKLR[Q/R][K/R]G[I/L]DP[A/T]THKP[I/L]
・・・(Ia)
ERKKGVPWTE[E/D]EH[R/K/L][Q/L/R/S]FL[M/L]GLKKYG[K/R]GDWRNI[A/S][R/K][N/S/Y]FV[T/I/Q][T/S]RTPTQVASHAQKYF[I/L]R[Q/L][V/L/N][N/S/T][G/D]GKDKRR[S/A]SIHDITTVN[I/L]
・・・(Ib)
[3]胚乳発生誘導機能を有するポリペプチドが、配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号17、及び配列番号19からなる群より選択されるアミノ酸配列と80%以上の配列相同性を有するポリペプチドである、[1]又は[2]の核酸分子。
[4]胚乳発生誘導機能を有するポリペプチドをコードする塩基配列が、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18、及び、配列番号20より選択される塩基配列と80%以上の配列同一性を有する、[1]~[3]の核酸分子。
[5]前記核酸分子が更に、転写抑制機能を有するポリペプチドをコードする塩基配列を含み、胚乳発生誘導機能を有するポリペプチドをコードする塩基配列と、転写抑制機能を有するポリペプチドをコードする塩基配列が、インフレームで連結されている、[1]~[4]の核酸分子。
[6]転写抑制機能を有するポリペプチドが、下記式(IIa)、(IIb)、(IIc)、又は、(IId)で表されるアミノ酸配列を有するモチーフを含むポリペプチドである、[5]の核酸分子。
[L/F]DLN[L/F][X]P ・・・(IIa)
[L/V][R/K]LFGVX[M/V/L] ・・・(IIb)
TLXLFP ・・・(IIc)
TLXLFR ・・・(IId)
(但し、上記式(IIa)~(IId)中、Xは任意のアミノ酸残基を表す。)
[7]転写抑制機能を有するポリペプチドが、配列番号21、配列番号23、配列番号25、及び配列番号27からなる群より選択されるアミノ酸配列と80%以上の配列相同性を有するポリペプチドである、[5]又は[6]の核酸分子。
[8]転写抑制機能を有するポリペプチドをコードする塩基配列が、配列番号22、配列番号24、配列番号26、及び配列番号28からなる群より選択される塩基配列と80%以上の配列同一性を有する、[5]~[7]の核酸分子。
[9]前記核酸分子が更に、プロモーター領域の塩基配列を含み、胚乳発生誘導機能を有するポリペプチドをコードする塩基配列が、プロモーター領域の塩基配列と機能的に連結されている、[1]~[8]の核酸分子。
[10]前記核酸分子が更に、ターミネーター領域の塩基配列を含み、胚乳発生誘導機能を有するポリペプチドをコードする塩基配列が、ターミネーター領域の塩基配列と機能的に連結されている、[1]~[9]の核酸分子。
[11][1]~[10]の核酸分子を担持するベクター。
[12]植物ウイルスベクター又はアグロバクテリウムベクターである、[11]のベクター。
[13]受精を介さず胚乳を発生しうる組換種子植物を作製する方法であって、[1]~[10]の核酸分子、又は、[11]若しくは[12]のベクターを、種子植物細胞内に導入して発現させることを含む方法。
[14][1]~[10]の核酸分子、又は、[11]若しくは[12]のベクターが、細胞内に組み込まれている組換え種子植物。
[15][13]の方法により作製される組換え種子植物。
(1-1.概要)
本発明の一側面によれば、種子植物のゲノム内に導入して発現させることにより、受精を介さず種子植物の胚乳発生を誘導するための核酸分子(以下適宜「本発明の核酸分子」とする)が提供される。
本発明の核酸分子は、胚乳発生誘導機能を有するポリペプチド(胚乳発生誘導ポリペプチド)をコードする塩基配列を有する。
・シロイヌナズナAt5g26660ポリペプチドのアミノ酸配列(配列番号3)
・シロイヌナズナAt5g01200ポリペプチドのアミノ酸配列(配列番号5)
・シロイヌナズナAt2g38090ポリペプチドのアミノ酸配列(配列番号7)
・シロイヌナズナAt5g58900ポリペプチドのアミノ酸配列(配列番号9)
・シロイヌナズナAt3g16350ポリペプチドのアミノ酸配列(配列番号11)
・イネOs05g0543600ポリペプチドのアミノ酸配列(配列番号13)
・イネOs01g0142500ポリペプチドのアミノ酸配列(配列番号15)
・イネOs01g0853700ポリペプチドのアミノ酸配列(配列番号17)
・イネOs04g0569100ポリペプチドのアミノ酸配列(配列番号19)
・・・(Ia)
ERKKGVPWTE[E/D]EH[R/K/L][Q/L/R/S]FL[M/L]GLKKYG[K/R]GDWRNI[A/S][R/K][N/S/Y]FV[T/I/Q][T/S]RTPTQVASHAQKYF[I/L]R[Q/L][V/L/N][N/S/T][G/D]GKDKRR[S/A]SIHDITTVN[I/L]
・・・(Ib)
・シロイヌナズナAt5g26660遺伝子の塩基配列(配列番号4)
・シロイヌナズナAt5g01200遺伝子の塩基配列(配列番号6)
・シロイヌナズナAt2g38090遺伝子の塩基配列(配列番号8)
・シロイヌナズナAt5g58900遺伝子の塩基配列(配列番号10)
・シロイヌナズナAt3g16350遺伝子の塩基配列(配列番号12)
・イネOs05g0543600遺伝子の塩基配列(配列番号14)
・イネOs01g0142500遺伝子の塩基配列(配列番号16)
・イネOs01g0853700遺伝子の塩基配列(配列番号18)
・イネOs04g0569100遺伝子の塩基配列(配列番号20)
本発明の核酸分子は、前述の胚乳発生誘導ポリペプチドをコードする塩基配列に加えて、転写抑制機能を有するポリペプチド(転写抑制ポリペプチド)をコードする塩基配列を有することが好ましい。この場合、胚乳発生誘導ポリペプチドをコードする塩基配列と、転写抑制ポリペプチドをコードする塩基配列が、インフレームで連結されていることが好ましい。
・シロイヌナズナAt2g36080遺伝子の転写抑制領域BRDポリペプチドのアミノ酸配列(配列番号23)
・シロイヌナズナWUSCHEL遺伝子の転写抑制領域WUS-boxポリペプチドのアミノ酸配列(配列番号25)
・シロイヌナズナAtMYBL2遺伝子の転写抑制領域L2Rポリペプチドのアミノ酸配列(配列番号27)
[L/V][R/K]LFGVX[M/V/L] ・・・(IIb)
TLXLFP ・・・(IIc)
TLXLFR ・・・(IId)
・At2g36080遺伝子の転写抑制領域BRDの塩基配列(配列番号24)
・WUSCHEL遺伝子の転写抑制領域WUS-boxの塩基配列(配列番号26)
・AtMYBL2遺伝子の転写抑制領域L2Rの塩基配列(配列番号28)
本発明の核酸分子は、プロモーター領域を有することが好ましい。プロモーター領域は、通常は胚乳発生誘導ポリペプチドをコードする塩基配列の5’側に、胚乳発生誘導ポリペプチドと機能的に連結されるように配置されることが好ましい。
・シロイヌナズナAt5g07260遺伝子のプロモーター(配列番号30)。
・シロイヌナズナAt5g26660遺伝子のプロモーター(配列番号31)。
・シロイヌナズナAt5g01200遺伝子のプロモーター(配列番号32)。
・シロイヌナズナAt2g38090遺伝子のプロモーター(配列番号33)。
・シロイヌナズナAt5g58900遺伝子のプロモーター(配列番号34)。
・シロイヌナズナAt3g16350遺伝子のプロモーター(配列番号35)。
・イネ・アクチン遺伝子のプロモーター(配列番号36)。
・トウモロコシ・ユビキチン1遺伝子のプロモーター(配列番号37)
・イネOs05g0543600遺伝子のプロモーター(配列番号38)
・イネOs01g0142500遺伝子のプロモーター(配列番号39)
・イネ・FST遺伝子のプロモーター(配列番号40)。
・イネOs01g0853700遺伝子のプロモーター(配列番号41)
・イネOs04g0569100遺伝子のプロモーター(配列番号42)
本発明の核酸分子は、ターミネーター領域を有することが好ましい。ターミネーター領域は、通常は胚乳発生誘導ポリペプチドをコードする塩基配列の3’側に、胚乳発生誘導ポリペプチドと機能的に連結されるように配置されることが好ましい。
・シロイヌナズナのヒートショックタンパク質遺伝子のターミネーター(配列番号44)。
本発明の核酸分子は、その他の1又は2以上の遺伝子要素を有していてもよい。その他の遺伝子要素の例としては、抗生物質耐性遺伝子、制限酵素配列、相同組換え配列等が挙げられる。
本発明の核酸分子は、前述の胚乳発生誘導ポリペプチドをコードする塩基配列を有すると共に、好ましくは任意選択要素として転写抑制ポリペプチドをコードする塩基配列を有し、更には任意選択要素として、プロモーター領域、ターミネーター領域、及び/又はその他の遺伝子要素を有する。特に、胚乳発生誘導ポリペプチドをコードする塩基配列以外の任意選択要素を有する場合には、通常は転写抑制ポリペプチドをコードする塩基配列が胚乳発生誘導ポリペプチドをコードする塩基配列とインフレームで連結されると共に、胚乳発生誘導ポリペプチドをコードする塩基配列の5’側にプロモーター領域が、胚乳発生誘導ポリペプチドをコードする塩基配列の3’側に転写抑制領域及び/又はターミネーター領域が配置され、それぞれ胚乳発生誘導ポリペプチドをコードする塩基配列と機能的に連結される。これにより、本発明の核酸分子が種子植物の植物細胞に導入され、好ましくはゲノム内に組み込まれた場合に、各遺伝子要素が機能的に連関して作動し、胚乳発生誘導ポリペプチドが自律的に発現される。即ち、本発明の核酸分子は、キメラ遺伝子カセットとして構成されていることが好ましい。
本発明の核酸分子は、通常はこれを植物細胞内に導入してゲノム内に組み込むべく、ベクターに担持した形態で使用される。
本発明の別の側面によれば、受精を介さず胚乳を発生しうる組換種子植物を作製する方法(以下適宜「本発明の方法」とする)が提供される。
なお、以下に記載のプライマー塩基配列の表記のうち、大文字と小文字が混在しているものについては、大文字は増幅対象遺伝子の塩基配列と相補的な領域を意味し、小文字は付加配列を意味する。
実施例1は、At5g07260遺伝子に転写抑制ドメインであるSRDXをコードする遺伝子断片を直結し、これを更にカリフラワーモザイクウイルス(CAMV)35Sプロモーターの下流で作動するように連結したキメラ遺伝子ProCaMV 35S:At5g07260SRDX(キメラ遺伝子A)を有する形質転換用プラスミド(コンストラクトA)を構築し、これをシロイヌナズナ植物体に導入して得られた形質転換植物の形態を観察すると共に、受精胚の養育能力を解析することにより、コンストラクトAのシロイヌナズナにおける自発的胚乳発生促進効果を調べたものである。
(a)プラスミドpBIG2の構築
米国ミシガン州立大学より譲渡された植物形質転換用ベクターpBIG-HYG(Becker, Nucleic Acid Research, (1990), 18(1):203)を制限酵素HindIII及びSstIで切断し、アガロースゲル電気泳動によって分離することで、GUS遺伝子を除いたpBIG-HYGのDNA断片を得た。
5’-CGTCGACGGTACCCCCGGGATCTGTAATTGTAATGTTGTTTGTTGTTTGTTGTTGTTGGTAATTGTG-3’(配列番号46)
シロイヌナズナSUPERMAN遺伝子の転写抑制ドメインであるSRDXの塩基配列の5’末端にGGGを、3’末端にストップコドンをそれぞれ付与した、以下の配列番号47及び48の塩基配列を有する相補的な二本のDNA断片を作製した。
5’-CTTAAGCGAAACCCAAACGGAGTTCTAGATCCAGATCGAGCCC-3’(配列番号48)
シロイヌナズナAt5g07260遺伝子のcDNAを鋳型として、以下の配列番号49の塩基配列を有する5’末端アッパープライマー、及び、以下の配列番号50の塩基配列を有する3’末端ローアープライマーを用いてPCR反応を行うことにより、At5g07260遺伝子の全長配列からストップコドンを除いた部分配列を増幅した。
5’-ACGGTGGACTGGAAGAGCATTTTGGACATT-3’ (配列番号50)
コンストラクトAによるシロイヌナズナ植物体の形質転換は、“Transfomation of Arabidopsis thaliana byvacuum infiltration”(http://www.bch.msu.edu/pamgreen/protocol.htm)に記載の方法に従った。但し、感染させるのにバキュームは用いず、単に浸すだけにした。コンストラクトAを、土壌細菌(Agrobacterium tumefaciens)株GV3101(C58C1Rifr)pMP90(Gmr)(koncz and Schell, Molecular and General Genetics, (1986), 204[3]:383-396)株にエレクトロポレーション法で導入した。導入した菌を250mLのLB培地で二日間培養した。
シロイヌナズナAt5g26660遺伝子のcDNAを鋳型として、以下の配列番号51の塩基配列を有する5’末端アッパープライマー、及び、以下の配列番号52の塩基配列を有する3’末端ローアープライマーを用いて、前記[実施例1](1-1)(b)と同様の条件でPCR反応を行うことにより、At5g26660遺伝子からストップコドンを除いた部分配列を増幅した。
5’-AAGGCTCTGATCAAACACCATGTTATTAAG-3’ (配列番号52)
前記[実施例1](1-2)に記載の手順と同様にして、コンストラクトBによるシロイヌナズナ植物体の形質転換を実施し、首尾よく形質転換された植物体をハイグロマイシン培地による選抜により取得した。こうして得られた、コンストラクトBにより形質転換された植物体を、適宜「形質転換植物体B」と略称する。
シロイヌナズナAt5g01200遺伝子のcDNAを鋳型として、以下の配列番号53の塩基配列を有する5’末端アッパープライマー、及び、以下の配列番号54の塩基配列を有する3’末端ローアープライマーを用いて、前記[実施例1](1-1)(b)と同様の条件でPCR反応を行うことにより、At5g01200遺伝子からストップコドンを除いた部分配列を増幅した。
5’-ACTCCACTGCGGAAACGCATTATAATAGCT-3’ (配列番号54)
前記[実施例1](1-2)に記載の手順と同様にして、コンストラクトCによるシロイヌナズナ植物体の形質転換を実施し、首尾よく形質転換された植物体をハイグロマイシン培地による選抜により取得した。こうして得られた、コンストラクトCにより形質転換された植物体を、適宜「形質転換植物体C」と略称する。
シロイヌナズナAt2g38090遺伝子のcDNAを鋳型として、以下の配列番号55の塩基配列を有する5’末端アッパープライマー、及び、以下の配列番号56の塩基配列を有する3’末端ローアープライマーを用いて、前記[実施例1](1-1)(b)と同様の条件でPCR反応を行うことにより、At2g38090遺伝子からストップコドンを除いた部分配列を増幅した。
5’-CATTTGGAGATACGCATTGTACGATTCGAA-3’ (配列番号56)
前記[実施例1](1-2)に記載の手順と同様にして、コンストラクトDによるシロイヌナズナ植物体の形質転換を実施し、首尾よく形質転換された植物体をハイグロマイシン培地による選抜により取得した。こうして得られた、コンストラクトDにより形質転換された植物体を、適宜「形質転換植物体D」と略称する。
シロイヌナズナAt5g58900遺伝子のcDNAを鋳型として、以下の配列番号57の塩基配列を有する5’末端アッパープライマー、及び、以下の配列番号58の塩基配列を有する3’末端ローアープライマーを用いて、前記[実施例1](1-1)(b)と同様の条件でPCR反応を行うことにより、At5g58900遺伝子からストップコドンを除いた部分配列を増幅した。
5’-TAGTTGAAACATTGTGTTTTGGGCGTCATA-3’ (配列番号58)
前記[実施例1](1-2)に記載の手順と同様にして、コンストラクトEによるシロイヌナズナ植物体の形質転換を実施し、首尾よく形質転換された植物体をハイグロマイシン培地による選抜により取得した。こうして得られた、コンストラクトEにより形質転換された植物体を、適宜「形質転換植物体E」と略称する。
シロイヌナズナAt3g16350遺伝子のcDNAを鋳型として、以下の配列番号59の塩基配列を有する5’末端アッパープライマー、及び、以下の配列番号60の塩基配列を有する3’末端ローアープライマーを用いて、前記[実施例1](1-1)(b)と同様の条件でPCR反応を行うことにより、At3g16350遺伝子からストップコドンを除いた部分配列を増幅した。
5’-GATAGCCTGAATCGCGCTGTTGCCTTTACT-3’ (配列番号60)
前記[実施例1](1-2)に記載の手順と同様にして、コンストラクトFによるシロイヌナズナ植物体の形質転換を実施し、首尾よく形質転換された植物体をハイグロマイシン培地による選抜により取得した。こうして得られた、コンストラクトFにより形質転換された植物体を、適宜「形質転換植物体F」と略称する。
(a)プラスミドp35SRDXの構築
前記の[実施例1](1-1)(a)及び(b)と同様の手順により、プロモーターProCaMV 35S及び転写抑制ドメインSRDXが導入されたプラスミドp35SRDXを構築した。
プラスミドp35SRDXに対して、常法に従い、attL1配列の5’側のHindIIIサイトに変異を導入した。これをHindIII及びSmaIで切断し、マルチクローニングサイトを含むDNA断片を挿入することにより、pSRDX-NOSとした。
5’-GGGGGATCCAGCTCCTCCTCTGTTTTTGGTGAAAACTTTC-3’ (配列番号62)
得られたAt5g01200遺伝子のプロモーター領域(以下適宜「ProAt5g01200」とする)の増幅産物を、常法に従ってHindIII及びBamHIで切断し、アガロールゲル電気泳動で回収した。同様に、上記のプラスミドpSRDX-NOSを、常法に従ってHindIII及びBamHIで切断し、アガロールゲル電気泳動で回収した。得られたプラスミドpSRDX-NOSの切断断片に、前記プロモーターProAt5g01200の切断断片を、常法に従って挿入し、シークエンスを確認することにより、At5g01200遺伝子の5’上流域が順方向に導入されており、且つPCRエラーが入っていないものを選抜した。得られたプラスミドをProAt5g01200-SRDX-NOSベクターと呼ぶ。
シロイヌナズナAt5g01200遺伝子のcDNAを鋳型として、前記[実施例3](1-1)と同様に、配列番号53の塩基配列を有する5’末端アッパープライマー、及び、以下の配列番号54の塩基配列を有する3’末端ローアープライマーを用いてPCR反応を行うことにより、At5g01200遺伝子からストップコドンを除いた部分配列を増幅した。
前記[実施例1](1-2)に記載の手順と同様にして、コンストラクトGによるシロイヌナズナ植物体の形質転換を実施し、首尾よく形質転換された植物体をハイグロマイシン培地による選抜により取得した。こうして得られた、コンストラクトGにより形質転換された植物体を、適宜「形質転換植物体G」と略称する。
形質転換植物体A~Gのつぼみから雄蕊を取り除き(除雄)、未受精のさや及び胚珠の形質を観察した。また、コントロールとして、野生型のシロイヌナズナ植物体の未受精のさや及び胚珠の形質を同様に観察した。形質転換植物体A~Eについて得られた光学顕微鏡写真を図3に、形質転換植物体Gについて得られた光学顕微鏡写真を図4にそれぞれ示す。図3の写真は、野生型植物体及び形質転換植物体A~Eの各々の(a)つぼみの外観、(b)さやの外観、(c)さやの内部、及び(d)胚珠を示す。図4の写真は、形質転換植物体Gの(A)さやの外観(野生型との対比で示す)、(B)さやの内部、並びに(C1)及び(C2)胚珠を示す。図3及び図4の写真から明らかなように、形質転換植物体A~Gの何れにおいても、野生型植物体と比較して、未受精条件下でのさやの伸長と胚珠の肥大が確認された。このことより、キメラ遺伝子A~Gを有するコンストラクトA~Gは、シロイヌナズナにおいて自発的胚珠肥大(未受精下での胚珠肥大)を誘導することが証明された。
形質転換植物体A~C及びGの未受精のさやを分解し、取り出した胚珠をバニリン染色液(バニリン0.2gを6N HCl溶液10mlに懸濁したもの)で染色し、染色後の胚珠を光学顕微鏡を用いて観察した。また、コントロールとして、野生型のシロイヌナズナ植物体の胚珠を同様にバニリン染色し、光学顕微鏡を用いて観察した。得られた野生型植物体並びに形質転換植物体A~C及びGの光学顕微鏡写真を図7に示す。形質転換植物体A~C及びGの何れの未受精胚珠においても、バニリン染色液による赤色の呈色が確認された。
形質転換植物体A及びGのつぼみから雄蕊を取り除き(除雄)、未受精の雌蕊に対してココペリ(kokoperi)変異体(赤色の蛍光マーカーを有する)の花粉を受粉した。
(a)プラスミドpZmUBQ1_SRDX_HSPの構築
Yoshida et al., Front Plant Sci. (2013) 4, 383.に記載のベクターpUBQ1SXGを制限酵素EcoRI及びSacIで切断し、プラスミドpRI201-AN(タカラバイオ株式会社、日本)を制限酵素EcoRI及びSacIで切断して生じるHeat Shock Proteinターミネーターを含むDNA断片を挿入した。これをプラスミドpZmUBQ1_SRDX_HSPとする。このプラスミドはZeamaysUBQ1プロモーター、転写抑制ドメインSRDXをコードする領域、シロイヌナズナHSP18.2遺伝子のターミネーター領域を含んでおり、それらの両端にattL1、attL2 GATEWAY組換えサイトを有する。
イネOs05g0543600遺伝子のcDNAを鋳型として、以下の配列番号63の塩基配列を有する5’末端アッパープライマー、及び、以下の配列番号64の塩基配列を有する3’末端ローアープライマーを用いて、前記[実施例1](1-1)(b)と同様の条件でPCR反応を行うことにより、Os05g0543600遺伝子からストップコドンを除いた部分配列を増幅した。
5’-GAAGTATTCCAAGTTGAAGTCGAATTGAGC-3’ (配列番号64)
コンストラクトHによるイネカルスの形質転換は、“A protocol for Agrobacterium-mediated transformation in rice”(Nishimura et al. 2006, Nature Protocols, 1:2796)に記載の方法に従った。コンストラクトHを、土壌細菌(Agrobacterium tumefaciens)株EHA105(Hood et al., Transgenic Research (1993) 2: 208-218.)株にエレクトロポレーション法で導入した。
イネOs01g0142500遺伝子のcDNAを鋳型として、以下の配列番号65の塩基配列を有する5’末端アッパープライマー、及び、以下の配列番号66の塩基配列を有する3’末端ローアープライマーを用いて、前記[実施例1](1-1)(b)と同様の条件でPCR反応を行うことにより、Os01g0142500遺伝子からストップコドンを除いた部分配列を増幅した。
5’-AAACAATATGCTTCGGCTCGCGGCCAACTG-3’ (配列番号66)
前記[実施例8](8-2)に記載の手順と同様にして、コンストラクトIによるイネ植物体の形質転換を実施し、首尾よく形質転換された植物体をハイグロマイシン培地による選抜により取得した。こうして得られた、コンストラクトIにより形質転換された植物体を、適宜「形質転換植物体I」と略称する。
(a)プラスミドpOsFSTp-SRDX-HSP_Entryの構築
Mitsuda et al., Plant Cell (2007) 19, 270.に記載のベクターpSRDX-NOS_entryを制限酵素EcoRI及びSacIで切断し、プラスミドpRI201-AN(タカラバイオ株式会社、日本)を制限酵素EcoRI及びSacIで切断して生じるHeat Shock Proteinターミネーターを含むDNA断片を挿入した。これをプラスミドpSRDX-HSP_entryとする。イネゲノムを鋳型として、以下の配列番号67の塩基配列を有する5’末端アッパープライマー、及び以下の配列番号68の塩基配列を有する3’末端ローアープライマーを用いてPCR反応を行うことにより、イネFST遺伝子のプロモーター領域を増幅した。
5’-AAATTTGGATCCGCCTGCTATACCTTCCTGATCGAGTTT-3’ (配列番号68)
イネOs01g0853700遺伝子のcDNAを鋳型として、以下の配列番号69の塩基配列を有する5’末端アッパープライマー、及び、以下の配列番号70の塩基配列を有する3’末端ローアープライマーを用いて、前記[実施例1](1-1)(a)と同様の条件でPCR反応を行うことにより、Os01g0853700遺伝子からストップコドンを除いた部分配列を増幅した。
5’-CAAGTGTCCGCATTGCATCTGCAGGAG-3’ (配列番号70)
前記[実施例8](8-2)に記載の手順と同様にして、コンストラクトJによるイネ植物体の形質転換を実施し、首尾よく形質転換された植物体をハイグロマイシン培地による選抜により取得した。こうして得られた、コンストラクトJにより形質転換された植物体を、適宜「形質転換植物体J」と略称する。
イネOs04g0569100SRDX遺伝子のcDNAを鋳型として、以下の配列番号71の塩基配列を有する5’末端アッパープライマー、及び、以下の配列番号72の塩基配列を有する3’末端ローアープライマーを用いて、前記[実施例1](1-1)(b)と同様の条件でPCR反応を行うことにより、Os01g0142500遺伝子からストップコドンを除いた部分配列を増幅した。
5’-CACGTCGCAATGCAGCGCCGTCTTGATCTT-3’ (配列番号72)
前記[実施例8](8-2)に記載の手順と同様にして、コンストラクトKによるイネ植物体の形質転換を実施し、首尾よく形質転換された植物体をハイグロマイシン培地による選抜により取得した。こうして得られた、コンストラクトKにより形質転換された植物体を、適宜「形質転換植物体K」と略称する。
形質転換植物体H、I、J及びKの開花期の花序を温湯(42℃)に7分間浸した後、同日中に開花した花から雄蕊を取り除いた(除雄)。開花が前日までに終了した花と開花前のつぼみは切り落とし、除雄した花において未授精の胚珠の発達を観察した。またコントロールとして、野生型のイネ植物体の花序を同様に除雄し、未授精の胚珠の発達を同様に観察した。また、形質転換植物体H、I、J、及びK、並びに野生型植物体それぞれの除雄しない花序においても、胚珠の発達を同様に観察した。胚珠の発達はステージ0~4に分類した。野生型のイネ植物体の各ステージ、及び、形質転換植物体H、I、J、及びKにおいて除雄しても自発的に肥大したステージ3相当の胚珠外観の代表的な写真を図10A及びBに示す。ステージ0は開花前と同じ大きさの胚珠であるのに対し、ステージ1~4では胚乳肥大が起こっている。図10A及びBのステージ3及び4の右側の写真は胚珠の切断面を示す。ステージ4の胚乳は完全に固形であるのに対し、ステージ3の胚乳は一部~全体が液状である。
Claims (12)
- 受精を介さず胚乳を発生しうる組換種子植物を作製する方法であって、
種子植物のゲノム内に導入して発現させることにより、受精を介さず種子植物の胚乳発生を誘導するための核酸分子であって、胚乳発生誘導機能を有するポリペプチドをコードする塩基配列を含む核酸分子、又は、前記核酸分子を担持するベクターを、種子植物細胞内に導入して発現させることを含む方法。 - 胚乳発生誘導機能を有するポリペプチドが、下記式(Ia)又は(Ib)で表されるアミノ酸配列を有するモチーフを含むポリペプチドである、請求項1に記載の方法。
[F/V][K/Q][A/Q]KLRKGLWSPEED[E/D]KL[L/Y]N[H/Y]I[I/T]RHG[H/V]GCWSSVPKLAGLQRCGKSCRLRWINYLRPDLKRG[A/S]FSQ[D/Q]EE[D/S]LI[I/V][A/E]LH[A/E][A/I]LGNRWSQIA[S/T][H/R]LPGRTDNEIKNFWNSCLKKKLR[Q/R][K/R]G[I/L]DP[A/T]THKP[I/L]
・・・(Ia)
ERKKGVPWTE[E/D]EH[R/K/L][Q/L/R/S]FL[M/L]GLKKYG[K/R]GDWRNI[A/S][R/K][N/S/Y]FV[T/I/Q][T/S]RTPTQVASHAQKYF[I/L]R[Q/L][V/L/N][N/S/T][G/D]GKDKRR[S/A]SIHDITTVN[I/L]
・・・(Ib) - 胚乳発生誘導機能を有するポリペプチドが、配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号17、及び配列番号19からなる群より選択されるアミノ酸配列と90%以上の配列相同性を有するポリペプチドである、請求項1又は2に記載の方法。
- 胚乳発生誘導機能を有するポリペプチドをコードする塩基配列が、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18、及び、配列番号20からなる群より選択される塩基配列と90%以上の配列同一性を有する、請求項1~3の何れか一項に記載の方法。
- 前記核酸分子が更に、転写抑制機能を有するポリペプチドをコードする塩基配列を含み、胚乳発生誘導機能を有するポリペプチドをコードする塩基配列と、転写抑制機能を有するポリペプチドをコードする塩基配列が、インフレームで連結されている、請求項1~4の何れか一項に記載の方法。
- 転写抑制機能を有するポリペプチドが、下記式(IIa)、(IIb)、(IIc)、又は、(IId)で表されるアミノ酸配列を有するモチーフを含むポリペプチドである、請求項5に記載の方法。
[L/F]DLN[L/F][X]P ・・・(IIa)
[L/V][R/K]LFGVX[M/V/L] ・・・(IIb)
TLXLFP ・・・(IIc)
TLXLFR ・・・(IId)
(但し、上記式(IIa)~(IId)中、Xは任意のアミノ酸残基を表す。) - 転写抑制機能を有するポリペプチドが、配列番号21、配列番号23、配列番号25、及び配列番号27からなる群より選択されるアミノ酸配列と90%以上の配列相同性を有するポリペプチドである、請求項5又は6に記載の方法。
- 転写抑制機能を有するポリペプチドをコードする塩基配列が、配列番号22、配列番号24、配列番号26、及び配列番号28からなる群より選択される塩基配列と90%以上の配列同一性を有する、請求項5~7の何れか一項に記載の方法。
- 前記核酸分子が更に、プロモーター領域の塩基配列を含み、胚乳発生誘導機能を有するポリペプチドをコードする塩基配列が、プロモーター領域の塩基配列と機能的に連結されている、請求項1~8の何れか一項に記載の方法。
- 前記核酸分子が更に、ターミネーター領域の塩基配列を含み、胚乳発生誘導機能を有するポリペプチドをコードする塩基配列が、ターミネーター領域の塩基配列と機能的に連結されている、請求項1~9の何れか一項に記載の方法。
- 前記ベクターが、植物ウイルスベクター又はアグロバクテリウムベクターである、請求項1~10の何れか一項に記載の方法。
- 種子植物のゲノム内に導入して発現させることにより、受精を介さず種子植物の胚乳発生を誘導するための核酸分子であって、胚乳発生誘導機能を有するポリペプチドをコードする塩基配列を含む核酸分子、又は、前記核酸分子を担持するベクターが、細胞内に組み込まれている、受精を介さず胚乳を発生しうる組換え種子植物。
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