JP7208614B2 - 形質転換植物及びその作出方法 - Google Patents
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Description
1. 第1のポリヌクレオチド及び該ポリヌクレオチドの発現のための植物由来プロモーターを含む第1のベクターと、該プロモーターのメチル化を誘導する第2のポリヌクレオチドを含む第2のベクターとを植物に導入することを特徴とする、植物の形質転換方法。
2. 第1のベクター及び第2のベクターを同時に、又は別個に導入する、上記1記載の方法。
3. 第1のポリヌクレオチドがカロテノイド生合成遺伝子の発現を抑制するポリヌクレオチドである、上記1又は2記載の方法。
4. 第2のポリヌクレオチドが上記プロモーターの塩基配列と相補的な配列を含み、該プロモーターのメチル化を誘導するものである、上記1~3のいずれか記載の方法。
5. カロテノイド生合成遺伝子の発現を抑制するポリヌクレオチドを発現する第1のベクターと、該ポリヌクレオチドの発現を制御する植物由来プロモーターのメチル化を誘導する第2のベクターとを植物に導入することを含む、白色化が制御された形質転換植物の作出方法。
6. カロテノイド生合成遺伝子の発現を抑制することにより植物の白色化を誘導することを含む、形質転換植物における白色化の制御方法であって、
カロテノイド生合成遺伝子の発現の抑制が、植物由来プロモーターの制御下で発現し、該カロテノイド生合成遺伝子の塩基配列の一部に相補的な配列を有する第1のsiRNAによる抑制であり、
該プロモーターが、該プロモーターの塩基配列の一部に相補的な配列を有する第2のsiRNAの存在下でメチル化され、該第2のsiRNAの不存在下で脱メチル化される、
上記方法。
7. カロテノイド生合成遺伝子の発現を抑制する第1のポリヌクレオチドと、該第1のポリヌクレオチドの発現を制御する植物由来プロモーターとを含む第1のベクターと、該プロモーターのメチル化を誘導する第2のポリヌクレオチドを含む第2のベクターとを植物に導入して白色化が制御された形質転換植物を作出し、
該形質転換植物を栽培して、該第1のポリヌクレオチドの発現が制御され、かつ該第2のポリヌクレオチドを含まない後代植物を選択する
ことを含み、該後代植物が、自殖若しくは交配後に、又は栄養繁殖による栽培により、該プロモーターの脱メチル化により白色化することを特徴とする、形質転換植物の拡散を防止する方法。
8. 緑色組織の白色化が制御された形質転換植物であって、カロテノイド生合成遺伝子の発現を抑制するポリヌクレオチドが、該ポリヌクレオチドの発現を制御する植物由来プロモーターと共に導入された、上記植物。
9. 上記植物由来プロモーターが緑色組織特異的に発現を誘導するプロモーターである、上記8記載の植物。
10. 上記植物由来プロモーターがメチル化されている、上記8又は9記載の植物。
11. 更に上記植物由来プロモーターの配列に相補的な配列を有するRNAをコードするポリヌクレオチドが導入された、上記8~10のいずれか記載の植物。
12. 更に目的のタンパク質をコードする遺伝子が導入された、上記8~11のいずれか記載の植物。
13. 種子繁殖性又は栄養繁殖性である、上記8~12のいずれか記載の植物。
14. 上記1~7のいずれかに記載の方法に使用するための、又は上記8~13のいずれかに記載の植物を作出するための、カロテノイド生合成遺伝子の発現を抑制するポリヌクレオチドと、該ポリヌクレオチドの発現を制御する植物由来プロモーターとを含むベクター。
15. 上記1~7のいずれかに記載の方法に使用するための、又は上記11~13のいずれかに記載の植物を作出するための、上記プロモーターのメチル化を誘導するポリヌクレオチドを含むベクター。
2)特別な遺伝子導入技術を必要とせず、アグロバクテリウム法などの従来の遺伝子組換え技術が使用できる。
3)種子繁殖性と栄養繁殖性のいずれの作物種にも適用可能である。
第1の態様として、本発明は、第1のポリヌクレオチド及び該ポリヌクレオチドの発現のためのプロモーターを含む第1のベクターと、該プロモーターのメチル化を誘導する第2のポリヌクレオチドを含む第2のベクターとを植物に導入することを特徴とする、植物の形質転換方法を提供する。
本発明の方法のために植物に導入される第1のベクターは、第1のポリヌクレオチド及び該ポリヌクレオチドの発現のためのプロモーターを含む。第1のポリヌクレオチドとしては、特に限定するものではないが、例えば植物の緑色組織の白色化の制御のために使用し得るポリヌクレオチドであり得る。そのようなポリヌクレオチドとして、植物に内在するカロテノイド生合成遺伝子の発現を抑制するポリヌクレオチドが挙げられる。
本発明の方法は、上記の第1のベクターと共に、緑色組織特異的に発現を誘導し得る上記プロモーターのメチル化を誘導する第2のポリヌクレオチドを含む第2のベクターを植物に導入することを特徴とする。第1のベクターと第2のベクターとは、それぞれ異なるゲノム領域に組み込まれると想定される(図2B)。
第1のベクター及び第2のベクターは同時に、又は別個に植物に導入することができる。
第2の態様として、本発明は、カロテノイド生合成遺伝子の発現を抑制するポリヌクレオチドを発現する第1のベクターと、該ポリヌクレオチドの発現を制御するプロモーターのメチル化を誘導する第2のベクターとを植物に導入することを含む、白色化が制御された形質転換植物の作出方法に関する。
第3の態様として、本発明は、カロテノイド生合成遺伝子の発現を抑制することにより植物の白色化を誘導することを含む、形質転換植物における白色化の制御方法であって、
カロテノイド生合成遺伝子の発現の抑制が、プロモーターの制御下で発現し、該カロテノイド生合成遺伝子の塩基配列の一部に相補的な配列を有する第1のsiRNAによる抑制であり、
該プロモーターが、該プロモーターの塩基配列の一部に相補的な配列を有する第2のsiRNAの存在下でメチル化され、該第2のsiRNAの不存在下で脱メチル化される、
上記方法を提供する。
第4の態様として、本発明は、カロテノイド生合成遺伝子の発現を抑制する第1のポリヌクレオチドと、該第1のポリヌクレオチドの発現を制御するプロモーターとを含む第1のベクターと、該プロモーターのメチル化を誘導する第2のポリヌクレオチドを含む第2のベクターとを植物に導入して白色化が制御された形質転換植物を作出し、
該形質転換植物を栽培して、該第1のポリヌクレオチドの発現が制御され、かつ該第2のポリヌクレオチドを含まない後代植物を選択する
ことを含み、該後代植物が、自殖若しくは交配後に、又は栄養繁殖による栽培により、該プロモーターの脱メチル化により白色化することを特徴とする、形質転換植物の拡散を防止する方法を提供する。
本発明はまた、緑色組織の白色化が制御された形質転換植物であって、カロテノイド生合成遺伝子の発現を抑制するポリヌクレオチドが、該ポリヌクレオチドの発現を制御する植物由来プロモーターと共に導入された、上記植物を提供する。
本発明は更に、上記の本発明の植物を作出するための、又は上記の本発明の方法に使用するための、カロテノイド生合成遺伝子の発現を抑制するポリヌクレオチドと、該ポリヌクレオチドの発現を制御するプロモーターとを含むベクターを提供する。このベクターは、本明細書において記載する「第1のベクター」に相当する。
タバコ(Nicotiana tabacum, cv. SR-1)のカロテノイド生合成遺伝子(フィトエン不飽和化酵素;NtPDS、XM_016642616 (配列番号1))をターゲットとして、その部分配列の逆向き繰り返し配列(RNAi構造(配列番号2))を、緑色組織特異的に発現を誘導するアサガオ由来クロロフィル生合成関連遺伝子プロモーター(PnZIPp、配列番号3)、及び選択マーカー遺伝子としてのカナマイシン耐性遺伝子と共にベクターpRI910(TaKaRa)に組込み、PnZIPpの制御下でRNAiを発現する第1のベクターを作製した。
実施例1において葉の白色化(致死性形質)を制御することが実証されたPnZIPp領域(配列番号3)を標的(ターゲット)として、その部分配列のRNAi構造(配列番号4)を作製した(サイレンサー)。
実施例1及び2で作製した第1及び第2のベクターを、アグロバクテリウム法により2段階でタバコに接種した。
第1及び第2のベクターが導入された個体では、第2のベクターによってPnZIPpのターゲット配列のメチル化が誘導され、致死性形質の発現抑制が生じていると考えられる。
実施例3で得られた個体におけるターゲット領域(配列番号3の1209~1558番目の350塩基の塩基配列)のメチル化状態を、バイサルファイトシークエンス解析により確認した。
実施例3で得られた、白色化の誘導が抑制され、緑色の葉を持つ個体は、内生NtPDS遺伝子が正常に機能している(致死性形質の発現抑制)と予想されるため、そのような個体(T0世代)を選抜した。
GM作物の自殖後代や拡散した花粉・種子において、メチル化領域の脱メチル化現象により、「致死性形質の発現抑制」の「解除」が起こり、自発的な枯死(葉の白色化)が誘導された(図1右左、図2D、3D)。また、世代を進めない栄養繁殖(クローン増殖)においても、徐々に脱メチル化が進行し葉の白色化が誘導された(図3E)。
Claims (11)
- 第1のポリヌクレオチド及び該ポリヌクレオチドの発現のための植物由来プロモーターを含む第1のベクターと、該プロモーターのメチル化を誘導する第2のポリヌクレオチドを含む第2のベクターとを植物に導入することを特徴とする、植物の形質転換方法であって、第1のポリヌクレオチドが、カロテノイド生合成遺伝子の発現を抑制して植物の白色化及び枯死を誘導するポリヌクレオチドであり、植物由来プロモーターが緑色組織特異的に発現を誘導し得るプロモーターであり、かつ第2のポリヌクレオチドが上記プロモーターの塩基配列と相補的な配列を有するRNAをコードするポリヌクレオチドである、上記方法。
- 第1のベクター及び第2のベクターを同時に、又は別個に導入する、請求項1記載の方法。
- カロテノイド生合成遺伝子の発現を抑制して植物の白色化及び枯死を誘導するポリヌクレオチドを発現する第1のベクターと、該ポリヌクレオチドの発現を制御する植物由来プロモーターのメチル化を誘導する第2のベクターとを植物に導入することを含む、白色化が制御された形質転換植物の作出方法であって、植物由来プロモーターが緑色組織特異的に発現を誘導し得るプロモーターであり、第2のベクターが該植物由来プロモーターの塩基配列と相補的な配列を有するRNAをコードするポリヌクレオチドを含む、上記方法。
- カロテノイド生合成遺伝子の発現を抑制することにより植物の白色化を誘導することを含む、形質転換植物における白色化の制御方法であって、
カロテノイド生合成遺伝子の発現の抑制が、緑色組織特異的に発現を誘導し得る植物由来プロモーターの制御下で発現し、該カロテノイド生合成遺伝子の塩基配列の一部に相補的な配列を有する第1のsiRNAによる抑制であり、
該プロモーターが、該プロモーターの塩基配列の一部に相補的な配列を有する第2のsiRNAの存在下でメチル化され、該第2のsiRNAの不存在下で脱メチル化される、
上記方法。 - カロテノイド生合成遺伝子の発現を抑制して植物の白色化及び枯死を誘導する第1のポリヌクレオチドと、該第1のポリヌクレオチドの発現を制御する植物由来プロモーターとを含む第1のベクターと、該プロモーターのメチル化を誘導する第2のポリヌクレオチドを含む第2のベクターとを植物に導入して白色化が制御された形質転換植物を作出し、
該形質転換植物を栽培して、該第1のポリヌクレオチドの発現が制御され、かつ該第2のポリヌクレオチドを含まない後代植物を選択する
ことを含み、該後代植物が、自殖若しくは交配後に、又は栄養繁殖による栽培により、該プロモーターの脱メチル化により白色化することを特徴とする、形質転換植物の拡散を防止する方法であって、植物由来プロモーターが緑色組織特異的に発現を誘導し得るプロモーターであり、第2のベクターが該植物由来プロモーターの塩基配列と相補的な配列を有するRNAをコードするポリヌクレオチドを含む、上記方法。 - 緑色組織の白色化が制御された形質転換植物であって、カロテノイド生合成遺伝子の発現を抑制して植物の白色化及び枯死を誘導するポリヌクレオチドが、該ポリヌクレオチドの発現を制御する植物由来プロモーターと共に導入されており、植物由来プロモーターが緑色組織特異的に発現を誘導し得るプロモーターであり、更に上記植物由来プロモーターの塩基配列に相補的な配列を有するRNAをコードするポリヌクレオチドが導入された、上記植物。
- 上記植物由来プロモーターがメチル化されている、請求項6記載の植物。
- 更に目的のタンパク質をコードする遺伝子が導入された、請求項6又は7記載の植物。
- 種子繁殖性又は栄養繁殖性である、請求項6~8のいずれか1項記載の植物。
- 請求項1~5のいずれか1項に記載の方法に使用するための、又は請求項6~9のいずれか1項に記載の植物を作出するための、カロテノイド生合成遺伝子の発現を抑制して植物の白色化及び枯死を誘導するポリヌクレオチドと、該ポリヌクレオチドの発現を制御する植物由来プロモーターとを含むベクターであって、植物由来プロモーターが緑色組織特異的に発現を誘導し得るプロモーターである、上記ベクター。
- 請求項1~5のいずれか1項に記載の方法に使用するための、又は請求項6~9のいずれか1項に記載の植物を作出するための、緑色組織特異的に発現を誘導し得る植物由来プロモーターのメチル化を誘導するポリヌクレオチドを含むベクターであって、該ポリヌクレオチドが上記プロモーターの塩基配列と相補的な配列を有するsiRNAを発現するポリヌクレオチドである、上記ベクター。
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