JPS63245668A - 植物の組織培養方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は植物の組織培養に関し、特にカルス細胞を発芽
させて苗条を形成する方法に係る。

〔従来の技術〕

植物の組織培養は、バイオテクノロジーの一分野として
近年注目を浴びている。なかでも、カルス培養はタンク
での大量培養が可能であることから、アンドシアンやシ
コニン等のような植物の二次代謝物の製造に既に応用さ
れている。また、培養したカルス細胞は、細胞壁を溶解
してプロトプラスト細胞として細胞融合に用いることが
できる。

従って、有用な植物新品種を育種する手段としても有用
である。更に、植物の特徴であるトチポテンシ−（分化
全能性）により、カルス細胞を発芽させて生育させれば
、カルスを誘導した元の植物体と全く同じ遺伝子的特徴
をもった完全な植物体、即ちクローン植物を得ることが
できる。従って、カルス培養は優秀な苗を多量に生産す
るための極めて有効な手段である。

上記のような目的で行なわれるため、カルス培養におい
ては発芽および発根を促進すること、並びにカルス細胞
の生育効率を高めることは重要な課題となる。

これらの課題のうち、発芽および発根を促進する方法と
しては、オーキシン類およびサイトカイニン類を培地中
に添加する方法が従来から用いられている。

一方、カルス細胞の生育効率を高めることを目的とした
方法は、従来特に提案されていない。

〔発明が解決しようとする問題点〕

カルス細胞の発芽および発根を促進するために従来用い
られている方法は、一定範囲の植物から誘導されたカル
ス細胞に対しては有効であり、その範囲では成果を挙げ
ている。しかし、どのような植物から誘導されたカルス
に対しても有効な訳ではない。従来の方法が奏効しない
植物は、例えば豆科植物の大豆や枝豆等、アブラナ科植
物のノ１ツカダイコンやアブラナ等である。これら植物
に由来するカルス培養細胞では、オーキシン類やサイト
カイニン類を添加して発根を促がすことはできるが、発
芽は促がされない。しかも、これら植物に由来するカル
ス細胞を発芽させるための適当な手段は従来存在しなか
った。このため、上記植物に由来するカルス細胞からは
、未だ苗条体は得られていない。

また、カルス細胞の生育効率を向」ニさせる適当な方法
がないため、カルス培養を植物の代謝生産物の製造に応
用する場合、製造効率を高めるためにはカルス細胞の増
殖を高めるしかなく、その効果に一定の限度があった。

本発明は上記事情に鑑みてなされたもので、未だ発芽さ
せることに成功していない上記のカルス細胞を発芽させ
ることができ、しかもカルス細胞の生育度をも向上でき
る植物組織の培養方法を提供するものである。

〔問題点を解決するための手段および作用〕本発明によ
る植物の組織培養方法は、植物のカルス細胞をジベレリ
ンを含む植物ホルモンの存在下に、適当な培地で培養す
ることにより発芽させることを特徴とするものである。

本発明の要点は、植物のカルス培養においてジベレリン
を使用する点にある。ジベレリンは、オーキシン類やサ
イトカイニン類と同様に植物の生長調節物質である。ジ
ベレリンは種なしブドウや種なしスイカの生産に従来広
く用いられているが、植物の組織培養に用いた例は少な
く、カルス培養に用いた例については知られていない。

本発明は、このジベレリンをカルス培養に用いることに
よって、従来発芽させることができなかったカルス細胞
の発芽を可能とし、或いはカルス細胞を肥大化して生長
効率を高めることに成功したものである。

従って、本発明はこれら従来の方法で発芽させ得なかっ
たカルス細胞に適用した場合に特に有意義である。しか
し、本願発明の適用範囲はこれら植物由来のカルス細胞
に限定されるものではなく、従来の方法で発芽するカル
ス細胞に適用した場合にも、発芽に要する培養期間を短
縮できる等の効果が得られる。

ジベレリンは、稲のバカナエ病菌によって生産される高
等植物の生長促進物質の総称で、最も良く知られている
のはＡ１−Ａ４の４種類（以下、ＧＡ、〜ＧＡ４という
）である。本発明ではこの何れを用いてもよいが、ＧＡ
３が最も活性が高い。

その使用形態としては、カルス培養の培地中に添加して
もよく、またカルスを誘導する際の培地に添加してカル
ス細胞中に導入しても良い。更に、カルス誘導母体とな
る植物体を培養する際に、培地中に添加する等の方法で
該植物体中に導入してもよい。ジベレリンの使用量は使
用形態、カルスの種類、その他の具体的な条件によって
も異なるが、例えばカルス細胞の培地中に添加する場合
には、０．Ｉ　ＩＩｔｇ〜２０ｍｇ／Ｊ！程度が望まし
い。少な過ぎると効果がなく、多過ぎると長期培養の間
にカルスを急速に劣化させるからである。

本発明においては、ジベレリン以外の他の植物ホルモン
を適宜併用する。併用する植物ホルモンとしては下記に
示したオーキシン類、サイトカイニン類等、カルス培養
に従来使用されているものが挙げられる。ジベレリンの
単独使用で発芽させ得る場合もあるが、植物の種類によ
ってはこれらを併用して初めて発芽する場合がある。

くオーキシン類〉 インドール−３−酢酸（ＩＡＡ）、インドール−３−酪
酸（Ｉ　ＢＡ）　、２．４−ジクロロフェノキシ酢酸（
２，４−Ｄ）　、１−ナフタリン酢酸（ＮＡＡ）くサイ
トカイニン類〉 カイネチン、６−ベンジルアデニン（ＢＡ）、ゼアチン 本発明でカルスを培養するための培地としては、従来使
用されているものをそのまま使用すれすることができる
。例えば、ＭＳ培地（ｕｒａｓｈｌｇｃ−ｋｏｏｇ培地
）、ホワイト培地、ゴートレー培地、ガンボルグ培地、
ＬＳ培地（ｉｎｓｍａｌｅｒ−ｋｏｏｇ培地）等、或い
はこれらをベースとした修正培地が挙げられる。

本発明は、従来の方法で発芽させ得なかったカルス細胞
に適用して特に有意義なことは既述した通りである。本
発明の適用によって初めて発芽が可能となるカルスは、
例えば次の植物から誘導されたものである。

豆科植物 ソラマメ属（ソラマメ等）、大豆属（ダイズ等）、エン
ドウ属（エンドウ等）、ササゲ属（ササゲ等）、アズキ
属（アズキ等） アブラナ科植物 大根属（ハツカダイコン、ダイコン等）、アブラナ属（
アブラナ、ハクサイ、キャベツ、コマツナ、ミズナ等） なお、上記植物からカルスを誘導する方法としては、従
来行なわれている常法によればよい。例えば、イオン交
換水で充分に洗浄した種子、葉、茎、根、その他の組織
を適当な大きさの組織片に切断し、次いで次亜塩素酸ソ
ーダやエタノール等の適当な殺菌剤で殺菌処理する。こ
れを更に滅菌水で洗浄した後、適当な培地で培養するこ
とによりカルスを誘導することができる。または、植物
の種子を常法で滅菌後、無菌発芽培地（通常はサッカロ
ース３％を含む０．８％寒天培地）に無菌接種し、暗所
または明所に放置して得られた無菌苗の胚軸を長さ約５
賭に切断するか、葉部を約３　Ｘ　３　ｍｒｔｒに切断
したものを４〜５サンプル作製し、これを適当な培地で
培養することによってカルスを誘導してもよい。

なお、本発明を適用すべきカルス細胞は、例えば花粉培
養で得られた半数体植物から得られたカルスであっても
よい。また、例えばコルヒチン処理により得られた２倍
体や、３倍体、４倍体等の多数倍体植物から得られたカ
ルスであってもよい。

〔発明の効果〕

本発明によれば、従来は発芽させることができなかった
カルス細胞でも、これを発芽させて苗条を形成すること
ができる。従って、これら植物の優秀な苗を多量に生産
する有効な手段となるのみならず、カルス培養の可能性
を著しく高めるものである。例えば、細胞融合の技術と
組合せることにより、豆科植物の根粒菌による空中窒素
固定能を付与した種々の優秀な新種植物の苗を大量に生
産することも可能となる。

また、本発明の適用によりカルス細胞自体が肥大化され
ることは、カルス培養により植物の代謝生成物を製造す
る場合、製造効率を高めるを力な手段として期待される
。

〔実施例〕

以下に本発明の詳細な説明する。なお、以下の実施例で
用いた培地、培養条件、使用した生長調節物質は次の通
りである。

く培地〉 サッカロース３％及び寒天０．８％を含むＭＳ培地 く培養条件〉 培養温度２５℃、　２０００　ｌｕｘで１６時間照光く
生長調節物質〉 ■　ＮＡＡ　（１−ナフタリン酢酸）　／ＢＡ（６−ベ
ンジルアデニン）／ジベレリン（ＧＡ３　）の組合せ。

培地中に添加。

■　インドール−３−酪酸（ＩＢＡ）／カイネチン（Ｋ
）／ジベレリン（Ｇ３）の組合せ。培地中に添加。

実施例１ 市販されている早生枝豆の無菌発芽幼苗から約５　ｖｔ
ｘの茎片を作成し、これを材料とて常法によリカルスを
誘導した。次いで、このカルスを前記の培養条件下に６
週間培養した。この実施例では、生長調節物質として前
記■の組合せを用いて培養を行なった。

なお、各生長調節物質の濃度を次の範囲で変化させ、計
６４例の培養実験を行なった。

ＮＡＡ：Ｏ〜５Ｂ／ノ範囲で４段階 ＢＡ　　：ｏ、５〜４Ｍ！ｉ／ノの範囲で４段階ＧＡ３
　：　　０〜５１９／Ｉの範囲で４段階上記のカルス培
養の結果、ＧＡ３濃度０の培養例では全く発芽せず、苗
条形成はみられなかった。

これに対し、ＧＡ３を添加した培養例では次の場合に発
芽し、苗条の形成がみられた。

ＮＡＡ濃度：ｏｒｌｌｊ／ノ ＢＡ　　６度：　０．５１１５１／Ｉ ＧＡ３濃度：　１．Ｏｊ２！７／Ｉ！ 次に、培養後のカルスの生重量と、９０℃で２４時間乾
燥した後の乾重量とを調べたところ次の結果が得られた
。まず、ＮＡＡ及びＧＡ３を併用した培養例において、
カルス生重量の増加がみられた。

また、乾重量／生重量の比はＧＡ３無添加の培養例では
略０．ｌであるのに対し、ＧＡ３．添加の培養例では０
．０７〜０．０８と減少した。この結果は、ＧＡ３の存
在によりカルス細胞の肥大化が促進されたことを示して
いる。

更に、培養後のカルス細胞の状態を調べたところ、ＧＡ
３無添加の培養例ではカルスが崩れ易く、ボロボロであ
った。しかし、ＧＡ３の存在下に培養した例では、その
濃度を増すに伴って弾力性をもった柔かいカルスが得ら
れた。

実施例２ 早生枝豆を、２６／Ｉ！のＧＡ３を添加したＭＳ培地を
用いて無菌発芽させた。その上胚軸から常法によりカル
スを誘導した後、該カルスを実施例１と同様にして培養
した。

その結果、ＮＡＡ、ＢＡ、ＧＡ３が夫々次の濃度の場合
にカルスが発芽し、苗条の形成がみられた。

ＮＡＡ濃度：０η／ノ ＢＡ濃度　：　１．０　＠／ノ ＧＡ３濃度＝０．１または５．０［／ｉまた、ＧＡ３の
濃度変化に伴うカルス生重量の変化は、実施例１の場合
に比較して小さかった。

実施例３ 市販されている丸薬小松菜の無菌発芽幼苗から約５題の
茎片を作成し、これを材料として常法によりカルスを誘
導した。次いで、このカルスを前記所定の培養条件下に
６週間培養した。この実施例では、生長調節物質として
前記■の組合せを用いた培養と、前記■の組合せを用い
た培養の両方を行なった。

なお、各生長調節物質の濃度を次の範囲で変化させ、夫
々の組合せについて計９６例、計１４４例の培養実験を
行なった。

く組合せ■〉 ＮＡＡ：　　０〜５１６／）範囲で４段階ＢＡ　　：ｏ
、ｉ〜４η／ノの範囲で６段階ＧＡ３　：　０〜５　Ｂ
／ノの範囲で４段階く組合せ■〉 ＩＢＡ：　　０〜５ｔｊ／ノ範囲で４段階Ｋ　　　：ｏ
、ｔ〜４η／ｌの範囲で６段階Ｇ　Ａ　３　：　０〜１
０６／ノの範囲で６段階上記のカルス培養の結果、ＧＡ
３濃度０の培養例では全く発芽せず、苗条形成はみられ
なかっ、た。

これに対し、ＧＡ３を添加した培養例では次の場合に発
芽し、苗条の形成がみられた。

く組合せ■〉　Ｉ〜■の二側 ＩＩＩＩＩＩ ＮＡＡ濃度（Ｅｌ／））　２　５　５ ＢＡ　　濃度ＣＫＩ／、ｅ）　　４　　１　　２ＧＡ３
濃度（醍／、ｉ？）　　０．Ｌ　　Ｏ，１０，１く組合
せ■〉 ＩＢＡ濃度：５篤／ノ Ｋ　　ｌａ度：　０．５　ａｌｌ！ ＧＡ３濃度：　０．１　＃／１ 次に、実施例１の場合と同様にして、培養後のカルスの
生重量と乾重量とを調べた。その結果、生重量はＧＡ３
の添加により増加がみられた。■の組合せではＧＡ３の
低濃度域での重量増加が大きく、■の組合せではＧＡ３
の濃度が１．０篤／ノ以上のときに増加が大きかった。

また、乾重量／生重量の比については実施例１の場合と
同様、ＧＡ３無添加の培養例では０．０８〜０．１２で
あるのに対し、ＧＡ３添加の培養例では０．０５〜０．
０８と減少した。この結果は、ＧＡ３の存在によりカル
ス細胞の肥大化が促進されたことを示している。

更に、培養後のカルス細胞の状態を調べた結果、ＧＡ３
無添加で培養したカルスは緑色でかなりしまっていたの
に対し、ＧＡ３の存在下に培養したカルスは淡色で明る
く、膨潤した柔かい状態であった。

実施例４ 市販されている白茎千筋京水菜の無菌発芽幼苗から約５
　ｒｎｍの茎片を作成し、これを材料として常法により
カルスを誘導した。次いで、このカルスを前記所定の培
養条件下に６週間培養した。生長調節物質としては前記
■の組合せを用い、各生長調節物質の濃度を次の範囲で
変化させて計３２例の培養実験を行なった。

ＮＡＡ：０．２〜２η／ノ範囲で４段階ＢＡ　　：０．
２〜２ＩＩｇ／ノの範囲で４段階ＧＡ３：０または２１
１９／ノの２段階上記のカルス培養の結果、ＧＡ３濃度
０の培養例では全く発芽せず、苗条形成はみられなかっ
た。

こいれに対し、ＧＡ３を添加した培養例では次の場合に
発芽し、苗条の形成がみられた。

ＮＡＡ濃度：　２．０　Ｍ／、ｌ？ ＢＡ濃度　：　２．０１Ｇ／Ｊ！ Ｇ　Ａ　３　’ｔａ度：　２．０１５１７ノまた、培養
後のカルスの生重量を調べたところ、ＧＡ３の添加によ
るカルスの生重量の増加および乾重量／生重量比の低下
が認められ、この場合にもカルス細胞の肥大化促進の効
果が明らかになった。また、ＧＡ３の存在下で培養した
カルスは、ＧＡ３フリーの培地で培養したカルスに比較
して柔かい膨潤した状態であった。

出願人代理人　弁理士　鈴江武彦 手続補正書 昭和６３年　３月３１日 特許庁長官　　　小　川　邦　夫　殿 １、事件の表示 特願昭６２−７６２３２号 ２、発明の名称 植物の組織培養方法 ３、補正をする者 事件との関係　　特許出願人 妹尾三部 ４、代理人 東京都千代田区霞が関３丁目７番２号　ＵＢＥビル６、
補正の対象　　　明細書 ７、補正の内容 明細書第１７頁第１０行に「状態であった。」とある記
載を、下記の通りに訂正しまず。

記 状態であった。

実施例５ アズキに対するジベレリン投与の効果を調べるために、
次の実験を行なった。アズキの品種としては、大納言（
在来種）を用いた。

■　苗条形成における培養時のＧＡＥ　１度の影響と、
ＧＡＥとオーキシンとの相互作用：無菌発芽時に０．２
ｔｎｙ／ＱのＧＡＥを添加したものと、無添加のＭＳ培
地を用い、得られた茎片を５　ｍｍ程度の長さに切断し
て培養を行なった。培養培地としてはＭＳ培地を基本と
し、ＢＡ（０，４ｍｇ／　Ｑ　）　、ＧＡＥ　　（０〜
７．０　ｍｙ／　Ｑ　＞、オーキシン類ＮＡＡ、　ＰＣ
Ｌ、　２．４−Ｄ　（０，０，２１ｎ９／（！、＞を組
合わせて添加し、ショ糖３％、寒天０．８％を加え、＋
）Ｈ５，８に調整した。培養条件は、温度２５℃、１６
時間照光（３５００１ｕｘ）とした。

その結果、苗条形成はＧＡＥ　　０．１■、／　、＆、
　、オーキシンフリーで最も多く確認された。特に、無
菌発芽時にＧＡ３処理をしたものが良好であった。

オーキシンを添加するとカルス化や発根が促進されてし
まい、苗条形成は有効ではなかった。また、ＧＡＥを添
加すると、従来の方法で行なったものに比べて苗条数お
よび苗条伸長ともに良好であった。

■　苗条形成における茎片部位の違いによる影響とカル
ス化との関係： 培養時に茎片部位が明確になるように置床して苗条形成
を検討し、併せてカルスの重量を測定した。

その結果、茎片部位の違いによる苗条形成については、
無菌発芽時にＧ　Ａ　３処理をし、オーキシンフリーで
培養した試料では胚軸の中央部から根の部位が良好であ
ったが、他の条件では子葉の付は根の部位が良好であっ
た。苗条形成の良好な部位では不定胚のような形状が認
められたが、逆に不良な部位では膨潤したカルス形状が
認められた。

−■　苗条形成における無菌発芽時のＧＡａ添加濃度お
よび照光時間の影９： 無菌発芽時のＧＡ３添加濃度を０〜１．０ＩＲ９／（１
の範囲で変化させ、照光時間を１６時間、２４時間とし
た二つの場合において５０日間培養を行ない、苗条形成
における影響の検討を行なった。

その結果、無菌発芽時のＧＡ３添加濃度は０．１〜０．
５１ｎｇ／Ｒが良好であった。照光時間が与える影響は
、２４時間照光の方が１６時間照光に比べて特に良好で
あった。

■　苗条形成における茎片孔２ｍｍと５ｍｍとの違い： 培養培地をＢＡ　（０，４ｍ９／　Ｑ、）　、ＧＡＥ　
　（０，１■／Ｑ）と固定し、材料の茎片孔を２ｍｍと
　５ｍｍにて培養を行なった。

その結果、苗条形成において、茎片孔は５圓の方が２ｍ
ｍに比べて良好であった。

上記■〜■の実験で得られた苗条を発根培地（ＩＢ八へ
、１　ｉｇ／　ｇ　）に移し、発根させて井上げを行な
ったところ、４１体が再生し且つ結実する結果が得られ
た。

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. （１）植物のカルス細胞をジベレリンを含む植物ホルモ
   ンの存在下に、適当な培地で培養することにより発芽さ
   せることを特徴とするカルス細胞の発芽方法。
2. （２）前記カルス細胞が豆科植物またはアブラナ科植物
   に由来することを特徴とする特許請求の範囲第（１）項
   記載のカルス細胞の発芽方法。
3. （３）前記豆科植物が大豆属、ソラマメ属またはエンド
   ウ属の植物であることを特徴とする特許請求の範囲第（
   ２）項記載のカルス細胞の発芽方法。
4. （４）前記アブラナ科の植物が、アブラナ属またはダイ
   コン属の植物であることを特徴とする特許請求の範囲第
   （２）項記載のカルス細胞の発芽方法。
5. （５）前記ジベレリンを含む植物ホルモンが、ジベレリ
   ン以外にオーキシン類および／またはサイトカイニン類
   を含むことを特徴とする特許請求の範囲第（１）項〜第
   （４）項の何れか１項に記載のカルス細胞の発芽方法。
6. （６）前記ジベレリンを含む植物ホルモンを、前記適当
   な培地に添加することを特徴とする特許請求の範囲第（
   １）項〜第（５）項の何れか１項に記載のカルス細胞の
   発芽方法。
7. （７）前記ジベレリンの添加濃度が、０．１ｍｇ〜２０
   ｍｇ／ｌであることを特徴とする特許請求の範囲第（６
   ）項記載のカルス細胞の発芽方法。