MX2014003301A

MX2014003301A - Composiciones de compuestos de jasmonato y métodos de uso de las mismas.

Info

Publication number: MX2014003301A
Application number: MX2014003301A
Authority: MX
Inventors: Pereira Lopes Jose E Fehr
Original assignee: Nanocare Technologies Inc
Priority date: 2011-09-16
Filing date: 2012-09-17
Publication date: 2014-10-14
Also published as: KR20140090602A; US20180000958A1; EP2755643B1; BR112014006153A2; CN107970213A; US9592305B2; WO2013040556A1; CA2848219A1; KR102023132B1; US10328155B2; JP2017222659A; RU2014114931A; CN104203222A; MX370253B; HK1254825A1; JP2019077702A; KR20190108189A; JP2014526519A; EP2755643A4; US20150140110A1

Abstract

La invención describe compuestos de jasmonato nanotransportados y/o microtransportados y sus composiciones farmacéuticas, así como el uso de los mismos, para tratar o prevenir trastornos relacionados con la angiogénesis o trastornos relacionados con NF-?B; se describen también métodos para elaborar los compuestos nanoportados y/o microportados y sus composiciones.

Description

COMPOSICIONES DE COMPUESTOS DE JASMONATO. Y MÉTODOS DE USO DE LAS MISMAS REFERENCIA RECÍPROCA A LAS SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reclama prioridad a, y el beneficio de, la solicitud provisional de los Estados Unidos Nos.: 61/535,836, presentada en Septiembre 16 de 20 ; 61/555,690, presentada en Noviembre 4 de 2011; 61/603,042, presentada en Febrero 24 de 2012; 61/607,318, presentada en Marzo 6 de 2012; y 61/612,774, presentada en Marzo 19 de 2012; y la solicitud internacional No.: PCT/IB2012/000364, presentada en Febrero 27 de 2012. El contenido entero de cada una de las solicitudes anteriores, se incorpora en su totalidad en la presente como referencia.

CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a composiciones farmacéuticas de compuestos de jasmonato (por ejemplo, compuestos de jasmonato nanoportados o microportados), útiles para el tratamiento y la prevención de varias enfermedades y trastornos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los compuestos de jasmonato o jasmonatos se caracterizan por el anillo de ciclopentanona y se conocen como hormonas del estrés de las plantas producidas por plantas que enfrentan una situación llena de estrés. Ejemplos de jasmonatos incluyen, pero no están limitados a, ácido jasmónico (JA), jasmonato de metilo (MJ) y cis-/trans-jasmona (véase, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos 6,469,061 y WO 2007/066337). Se ha mostrado que el MJ y el JA son efectivos y selectivos contra células tumorales (véase, por ejemplo, Flescher, Anti-Cancer Drugs 2005, 16: 901-916 y US 2002/0173470). Sin embargo, cuando se administran in vivo, los jasmonatos son usualmente metabolizados, por ejemplo, por esterasas, antes de que lleguen a las células cancerosas objetivo, haciéndolos menos atractivos como agentes anti-cáncer.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención provee, en parte, jasmonatos nanoportados o microportados, especialmente, dihidrojasmonato de metilo nanoportado o microportado (MDJ, conocido también como 2-(3-oxo-2-pentilciclopentil)acetato de metilo), para su aplicación en el tratamiento o prevención de varios trastornos, tales como enfermedades inflamatorias y trastornos relacionados con la angiogénesis. La estructura química del MDJ se muestra a continuación: En un aspecto, la presente descripción provee una composición farmacéutica que incluye un solvente farmacéuticamente aceptable y una pluralidad de nanoportadores y/o microportadores que contienen MDJ. Los nanoportadores y/o microportadores se forman de una ciclodextrina o un dendrímero, o un liposoma, o son partículas de nanoemulsión sintéticas (LDEs) que comprenden un núcleo de éster de colesterilo rodeado por una capa exterior de fosfolípidos, los nanoportadores tienen un tamaño que varía de 1 nanómetro (nm) a 1000 nm (por ejemplo, 1-900 nm, 1-800 nm, 1-700 nm, 1-600 nm, 1-500 nm, 1-400 nm, 1-300 nm, 1-200 nm, 1-100 nm, 1-90 nm, 1-80 nm, 1-70 nm, 1-50 nm, 1-30 nm o 1-10 nm); los microportadores tienen un tamaño que varía de 1 miera a 50 mieras (por ejemplo, de 1 miera a aproximadamente 40, 30, 20, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ó 1.5 mieras), y la composición farmacéutica tiene una concentración de MDJ que varía de 1 nM a 1 M (por ejemplo, de 1 nM a 10 nM, 1 nM a 100 nM, 1 nM a 1 µ?, 1 nM a 10 µ?, 1 nM a 100 µ?, 100 µ? a 1 mM, 100 µ? a 10 mM, 100 µ? a 100 mM o 100 mM a 1 M).

La composición farmacéutica puede tener una o más de las siguientes características: La composición farmacéutica tiene una concentración de MDJ que varía de 1 nM a 10-100 µ? (por ejemplo, 1 nM a 10 nM, 10 nM a 100 nM, 100 nM a 1 µ?, 1 µ? a 10 µ? ó 10 µ? a 100 µ?), ó 100 µ? a 1 mM (por ejemplo, 100 µ? a 200 µ?, 300 µ?, 400 µ?, 500 µ?, 600 µ?, 700 µ?, 800 µ? ó hasta 900 µ?), ó 100 µ? a 10 mM (por ejemplo, de 100 µ?, 200 µ?, 300 µ?, 400 µ?, 500 µ?, 600 µ?, 700 µ?, 800 µ?, ó de 900 µ? a 1 mM, 2 mM, 3 mM, 4 mM, 5 mM, 6 mM, 7 mM, 8 mM, 9 mM, ó hasta 10 mM), ó 100 µ? a 100 mM (por ejemplo, de 100 µ?, 200 µ?, 300 µ?, 400 µ?, 500 µ?, 600 µ?, 700 µ?, 800 µ?, 900 µ?, ó de 1 mM a 10 mM, 20 mM, 30 mM, 40 mM, 50 mM, 60 mM, 70 mM, 80 mM, 90 mM, ó hasta 100 mM), ó 10 µ? a 1 mM (por ejemplo, de 10 µ?, 20 µ?, 30 µ?, 40 µ?, 50 µ?, 60 µ?, 70 µ?, 80 µ?, ó de 90 µ? a 0.1 mM, 0.2 mM, 0.3 mM, 0.4 mM, 0.5 mM, 0.6 mM, 0.7 mM, 0.8 mM, 0.9 mM, ó hasta 1 mM), ó 1-100 mM (por ejemplo, 1-10 mM, 1-20 mM, 1-30 mM, 1-40 mM, 1-50 mM, 1-60 mM, 1-70 mM, 1-80 mM ó 1-90 mM), ó 100 mM a 1 M (por ejemplo, de 0.2 M, 0.3 M, 0.4 M, 0.5 M, 0.6 M, 0.7 M, 0.8 M, 0.9 M a 1M).

Los nanoportadores se forman de una ciclodextrina y tienen un tamaño que varía de 3 nm a 100 nm, por ejemplo, 3.5-11 nm, 10-20 nm, 10-30 nm, 10-40 nm, 10-50 nm, 10-60 nm, 10-70 nm, 10-80 nm, 10-90 nm, 20-30 nm, 20-40 nm, 20-50 nm, 20-60 nm, 20-70 nm, 20-80 nm, 20-90 nm, 30-40 nm, 30-50 nm, 30-60 nm, 30-70 nm, 30-80 nm, 30-90 nm, 40-50 nm, 40-60 nm, 40-70 nm, 40-80 nm, 40-90 nm, ó 50-60 nm, 50-70 nm, 50-80 nm, 50-90 nm ó 50-100 nm.

Los nanoportadores son liposomas o LDEs y tienen un tamaño que varía de 30 nm a 500 nm, por ejemplo, 50 nm-110 nm, 30 nm a 50 nm, 30 nm a 100 nm, 30 nm a 150 nm, 30 nm a 200 nm, 30 nm a 250 nm, 30 nm a 300 nm, 30 nm a 350 nm, 30 nm a 400 nm ó 30 nm a 450 nm.

Los microportadores son liposomas o LDEs y tienen un tamaño que varía de aproximadamente 2 pm a 30 pm (por ejemplo, 2-5 pm, 2-10 pm, 2-15 pm, 2-20 µ?t? o 2-25 pm), aproximadamente 5 pm a 20 pm (por ejemplo, 5-7.5 pm, 5-10 pm, 5-12.5 pm, 5-15 pm ó 5-17.5 µ??), ó aproximadamente 10 pm. Además, la concentración del MDJ varía de 10-100 pM a 100 mM (por ejemplo, de 50-100 µ? o de 100 µ?, 200 µ?, 300 µ?, 400 µ?, 500 µ?, 600 µ?, 700 µ?, 800 µ?, ó de 900 µ? a 1 mM, 2 mM, 3 mM, 4 mM, 5 mM, 6 mM, 7 mM, 8 mM, 9 mM o hasta 10 mM 10 mM, 20 mM, 30 mM, 40 mM, 50 mM, 60 mM, 70 mM, 80 mM, 90 mM ó hasta 100 mM) ó 100 mM a 1 M (por ejemplo, de 0.2 M, 0.3 M, 0.4 M, 0.5 M, 0.6 M, 0.7 M, 0.8 M, 0.9 M a 1 M).

Los nanoportadores se forman de un dendrímero y tienen un tamaño que varía de 1 nm a 500 nm (por ejemplo, 2-10 nm, 2-20 nm, 2-50 nm, 2-100 nm, 2-150 nm, 2-200 nm, 2-250 nm, 2-300 nm, 2-350 nm, 2-400 nm, 2-450 nm, 10-100 nm, 10-200 nm, 10-300 nm, 10-400 nm, 10-500 nm, 50-100 nm, 50-200 nm, 50-300 nm, 50-400 nm, 50-500 nm, 100-300 nm, 100-500 nm, 200-500 nm 300-500 nm ó 400-500 nm).

El dendrímero es poliamidoamina (PAMAM).

La concentración de MDJ varía de 1 nM a 10-100 µ? (por ejemplo, 1 nM a 10 nM, 10 nM a 100 nM, 100 nM a 1 µ?, 1 µ? a 10 µ? ó 10 µ? a 100 µ?), 10-100 µ? a 100 mM (por ejemplo, de 50-100 µ? ó de 100 µ?, 200 µ?, 300 µ?, 400 µ?, 500 µ?, 600 µ?, 700 µ?, 800 µ?, ó de 900 µ? a 1 mM, 2 mM, 3 mM, 4 mM, 5 mM, 6 mM, 7 mM, 8 mM, 9 mM ó hasta 10 mM, 10 mM, 20 mM, 30 mM, 40 mM, 50 mM, 60 mM, 70 mM, 80 mM, 90 mM ó hasta 100 mM), o 100 mM a 1M (por ejemplo, de 0.2 M, 0.3 M, 0.4 M, 0.5 M, 0.6 M, 0.7 M, 0.8 M, 0.9 M a 1M). Por ejemplo, la concentración de MDJ es de 100 µ? a 1 mM ó 50 nM a 70 nM.

Los nanoportadores o microportadores contienen además fosfato diácido de 2-aminoetilo (o fosfoetanolamina), 3,7-dimetil-2,6-octadienal (o citral), salicilato de metilo, ácido abscísico, o derivados o análogos de los mismos. El 3,7-Dimetil-2,6-octadienal puede ser un isómero cis o trans.

El solvente farmacéuticamente aceptable es agua, un alcohol, o una mezcla de los mismos.

En otro aspecto, la presente descripción provee de una composición farmacéutica que incluye un solvente farmacéuticamente aceptable y una pluralidad de nanoportadores y/o microportadores que contienen un compuesto de jasmonato. Los nanoportadores y/o microportadores se forman de una ciclodextrina o un dendrímero, o un liposoma, o los nanoportadores y/o microportadores son partículas de nanoemulsión sintéticas (LDEs) que comprenden un núcleo de éster de colesterilo rodeado por una capa de fosfolípidos. Las nanopartículas tienen un tamaño que varía de 1 nm a 1000 nm (por ejemplo, 1-900 nm, 1-800 nm, 1-700 nm, 1-600 nm, 1-500 nm, 1-400 nm, 1-300 nm, 1-200 nm, 1-100 nm, 1-90 nm, 1-80 nm, 1-70 nm, 1-50 nm, 1-30 nm ó 1-10 nm); los microportadores tienen un tamaño que varía de 1 miera a 50 mieras (por ejemplo, de 1 miera a aproximadamente 40, 30, 20, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ó 1.5 mieras), y la composición farmacéutica tiene una concentración del compuesto de jasmonato que varía de 1 nM a 1 M (por ejemplo, de 1 nM a 10 nM, 1 nM a 100 nM, 1 nM a 1 µ?, 1 nM a 10 µ?, 1 nM a 100 µ?, 100 µ? a 1 mM, 100 µ? a 10 mM, 100 µ? a 100 mM ó 100 mM a 1 M).

La composición farmacéutica puede tener una o más de las siguientes características: El compuesto de jasmonato se selecciona del grupo que consiste de ácido jasmónico, ácido 7-iso-jasmónico, ácido 9,10-dihidrojasmónico, ácido 9,10-dihidro-isojasmónico, ácido 2,3-didehidrojasmónico, ácido 3,4-didehidrojasmónico, ácido 3,7-didehidrojasmónico, ácido 4,5-didehidrojasmónico, ácido 4,5-didehidro-7-isojasmónico, ácido cucúrbico, ácido 6-epi-cucúrbico, ácido 6-epi-cucúrbico-lactona, ácido 2-hidroxi-jasmónico, ácido 12-hidroxi-jasmónico-lactona, ácido 11-hidroxi-jasmónico, ácido 8-hidroxi-jasmónico, ácido homo-jasmónico, ácido dihomo-jasmónico, ácido 11-hidroxi-dihomo-jasmónico, ácido 8-hidroxi-dihomo-jasmónico, ácido tuberónico, ácido tuberónico-0-3-glucopiranósido, ácido cucúrbico-0-ß-glucopiranósido, ácido 5,6-didehidro-jasmónico, ácido 6,7-didehidro- jasmónico, ácido 7,8-didehidro-jasmónico, cis-jasmona, dihidrojasmona, y un éster de alquilo inferior de los mismos.

La composición farmacéutica tiene una concentración del compuesto de jasmonato que varía de 1 nM a 1 µ? (por ejemplo, de 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ó 9 nM a 10, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900 ó 950 nM), ó 1 nM a 100 µ? (por ejemplo, 1 nM a 10 nM, 10 nM a 100 nM, 100 nM a 1 µ?, 1 µ? a 10 µ?, ó 10 µ? a 100 µ?), ó 1 nM a 1 mM (por ejemplo, de 50 nM, 100 nM, 200 nM, 500 nM, 1000 nM, 50 µ?, ó de 100 µ? a 200 µ?, 300 µ?, 400 µ?, 500 µ?, 600 µ?, 700 µ?, 800 µ? ó hasta 900 µ?), ó 10 µ? a 100 mM (por ejemplo, de 50 µ? ó de 90 µ? a 0.1 mM, 0.2 mM, 0.3 mM, 0.4 mM, 0.5 mM, 0.6 mM, 0.7 mM, 0.8 mM, 0.9 mM, 1 mM, 10 mM, 20 mM, 40 mM, 50 mM, 60 mM, 70 mM, 80 mM ó hasta 90 mM), ó 100 µ? a 1 mM (por ejemplo, 100 µ? a 200 µ?, 300 µ?, 400 µ?, 500 µ?, 600 µ?, 700 µ?, 800 µ? ó hasta 900 µ?), ó 100 µ? a 10 mM (por ejemplo, de 100 µ?, 200 µ?, 300 µ?, 400 µ?, 500 µ?, 600 µ?, 700 µ?, 800 µ?, ó de 900 µ? a 1 mM, 2 mM, 3 mM, 4 mM, 5 mM, 6 mM, 7 mM, 8 mM, 9 mM ó hasta 10 mM), ó 100 µ? a 100 mM (por ejemplo, de 100 µ?, 200 µ?, 300 µ?, 400 µ?, 500 µ?, 600 µ?, 700 µ?, 800 µ?, 900 µ?, ó de 1 mM a 10 mM, 20 mM, 30 mM, 40 mM, 50 mM, 60 mM, 70 mM, 80 mM, 90 mM ó hasta 100 mM), ó 10 µ? a 1 mM (por ejemplo, de 10 µ?, 20 µ?, 30 µ?, 40 µ?, 50 µ?, 60 µ?, 70 µ?, 80 µ?, ó de 90 µ? a 0.1 mM, 0.2 mM, 0.3 mM, 0.4 mM, 0.5 mM, 0.6 mM, 0.7 mM, 0.8 mM, 0.9 mM ó hasta 1 mM), ó 1-100 mM (por ejemplo, 1-10 mM, 1-20 mM, 1-30 mM, 1-40 mM, 1-50 mM, 1-60 mM, 1-70 mM, 1-80 mM o 1-90 mM), ó 100 mM a 1 M (por ejemplo, de 0.2 M, 0.3 M, 0.4 M, 0.5 M, 0.6 M, 0.7 M, 0.8 M, 0.9 M a 1 M).

Los nanoportadores son LDEs y tienen un tamaño que varía de 30 nm a 500 nm, por ejemplo, 50 nm-1 10 nm, 30 nm a 50 nm, 30 nm a 100 nm, 30 nm a 150 nm, 30 nm a 200 nm, 30 nm a 250 nm, 30 nm a 300 nm, 30 nm a 350 nm, 30 nm a 400 nm ó 30 nm a 450 nm.

Los microportadores son liposomas o LDEs y tienen un tamaño que varía de aproximadamente 2 pm a 30 pm (por ejemplo, 2-5 pm, 2-10 µ?t?, 2-15 pm, 2-20 pm ó 2-25 pm), aproximadamente 5 pm a 20 pm (por ejemplo, 5-7.5 pm, 5-10 pm, 5-12.5 pm, 5-15 pm ó 5-17.5 pm) ó aproximadamente 10 pm. Además, el compuesto de jasmonato es MDJ y la concentración de MDJ varía de 100 mM a 1 M (por ejemplo, de 0.2 M, 0.3 M, 0.4 M, 0.5 M, 0.6 M, 0.7 M, 0.8 M, 0.9 M a 1M).

Los nanoportadores se forman de un dendrímero y tienen un tamaño que varía de 2 nm a 500 nm (por ejemplo, 2-10 nm, 2-20 nm, 2-50 nm, 2-100 nm, 2-150 nm, 2-200 nm, 2-250 nm, 2-300 nm, 2-350 nm, 2-400 nm, 2- 450 nm, 10-100 nm, 10-200 nm, 10-300 nm, 10-400 nm, 10-500 nm, 50-100 nm, 50-200 nm, 50-300 nm, 50-400 nm, 50-500 nm, 100-300 nm, 100-500 nm, 200-500 nm, 300-500 nm ó 400-500 nm).

El dendrímero es poliamidoamina (PAMAM).

El compuesto de jasmonato es MDJ, y la concentración de MDJ varía de 1 nM a 10-100 µ?, 10-100 µ? a 100 mM ó 100 mM a 1 M, por ejemplo, 100 µ? a 1 mM ó 50 nM a 70 nM.

El compuesto de jasmonato es MJ, y la concentración de MJ varía de 1 nM a 1 µ?, 10-100 µ? a 100 mM ó 100 mM a 1 M, por ejemplo, 100 µ? a 1 mM ó 50 nM a 70 nM.

Los nanoportadores o microportadores contienen además fosfato diácido de 2-aminoetilo (o fosfoetanolamina), 3,7-dimetil-2,6-octad¡enal (o citral), salicilato de metilo, ácido abscísico, o derivados o análogos de los mismos. El 3,7-Dimetil-2,6-octadienal puede ser un isómero cis o trans.

El solvente farmacéuticamente aceptable es agua, un alcohol, o una mezcla de los mismos. Cualquiera de los compuestos descritos en la presente puede incluir adicionalmente uno o más compuestos de no jasmonato tales como, por ejemplo, fosfato diácido de 2-aminoetilo (o fosfoetanolamina), 3,7-dimetil-2,6-octadienal (o citral), salicilato de metilo, ácido abscísico, aminoácidos naturales, Ca2+, Zn2+, o derivados o análogos de los mismos.

En otro aspecto más, la presente descripción describe el uso de los compuestos de jasmonato nanoportados y/o microportados o sus composiciones farmacéuticas descritas en la presente para el tratamiento o la prevención de un trastorno relacionado con la angiogénesis, tal como cáncer o un trastorno inflamatorio (por ejemplo, trastorno inflamatorio del intestino, dermatitis aguda, trastorno inflamatorio pélvico o tonsilitis).

En otro aspecto más, la presente descripción describe el uso de los compuestos de jasmonato nanoportados y/o microportados o sus composiciones farmacéuticas descritas en la presente, para el tratamiento o la prevención de un trastorno relacionado con NF- ?, tal como una infección viral, bacteriana o micótica.

Además, la invención describe el uso de los compuestos de jasmonato nanoportados y/o microportados o sus composiciones farmacéuticas descritas en la presente, para inhibir el crecimiento de células cancerosas in vitro o in vivo. Por ejemplo, las líneas de células cancerosas adecuadas para su uso en los métodos de esta invención incluyen: UACC62 -melanoma, MCF7 - resistencia al cáncer, NCIADR - cáncer de mama resistente a fármacos múltiples, 7860 - cáncer de riñón, NC1460 - cáncer de pulmón, PC03 - resistencia al cáncer de próstata, OVCAR03 - cáncer de ovario, HT29 - cáncer de colon, K562 - leucemia, TCP-1003 (panel 3 de cáncer de mama triple negativo), Caco-2— cáncer de colon, un panel de 18 líneas de células de tumor de mama triple negativo que comparten una morfología luminal o de tipo mesénquima; líneas de células de cáncer de mama HCC38 (ATCC®, número: CRL-2314™) y MCF7 (ATCC®, número: HTB-22™); la línea de células de adenocarcinoma de próstata PC-3 (ATCC®, número: CRL-1435™); línea de células de cáncer de próstata VCaP (ATCC®, número: CRL-2876™); línea de células de carcinoma de próstata 22Rv1 (ATCC®, número: CRL-2505™); línea de células de carcinoma de próstata DU 145 (ATCC®, número: HTB-81™); línea de células de carcinoma de próstata LNCaP clon FGC (ATCC®, número: CRL-1740™); línea de células de leucemia MOLT-4 (ATCC®, número: CLR-1582™); línea de células de leucemia (AML) KG-1 (ATCC®, número: CCL-246™); línea de células de leucemia (CML) K-562 (ATCC®, número: CCL-243™); línea de células de leucemia humanas CCRF-CEM (ATCC®, número: CCL-1 19™); línea de células de leucemia CLL Hs 505.T (ATCC®, número: CRL-7306™); línea de células de Jurkat (leucemia; ATCC®, número: TIB-156™); líneas de células Molm (leucemia, por ejemplo, Molm-13, Molm-14, Molm-16, Molm-17 y Molm-18), líneas de células Nomo (leucemia, por ejemplo, NOMO-1), y células mutantes Ras.

Los compuestos de jasmonato nanoportados y/o microportados (por ejemplo, MDJ) o sus composiciones farmacéuticas descritas en la presente, tienen las siguientes ventajas. Muestran actividades anti-cáncer in vitro y/o in vivo en una gama de cánceres tales como cáncer de próstata, cánceres de mama, melanoma, cáncer de colon y leucemia, mientras que muestran poca o ninguna toxicidad hacia las células sanas in vivo. Su mecanismo de acción novedoso puede ser complementario a otras farmacoterapias establecidas para el cáncer de próstata. Por ejemplo, para enfermedades avanzadas, la composición de la invención puede reducir el uso de terapias agresivas que tienen efectos secundarios, y para enfermedades localizadas, la composición de la invención puede prolongar la efectividad de la sensibilidad a la terapia hormonal, y retardar la progresión hacia enfermedades metastásicas.

La presente descripción describe también métodos para la síntesis de los compuestos de jasmonato nanoportados y/o microportados o sus composiciones farmacéuticas descritas en la presente.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Los términos "A-14" y "A14" se usan recíprocamente en las figuras para referirse al complejo de MDJ-nanoportador usado para la medición.

Figura 1A: Cromatograma del MDJ en una LDE; figura 1B: una imagen de microscopía electrónica de barrido de MDJ portado por LDE (un ejemplo de MDJ portado por liposomas); figura 1C: una imagen de microscopía electrónica de barrido de MDJ portado por LDE y aminoácidos.

Figura 2: Expresión de CASPASA-3 intensa y homogéneamente distribuida en un tumor colónico de ratón tratado con MDJ portado por ciclodextrina (i.p.).

Figura 3: Expresión de CASPASA-3 heterogénea, confinada superficialmente al epitelio de carcinoma colónico en ratón tratado con MDJ (i.r.).

Figuras 4A-40: Figura 4A: Vista esquemática de la variación del volumen del tumor, en ratones tratados con MDJ portado por ciclodextrina (GT) y controles (GC). Nótese que todos los animales tratados presentaron una disminución notable en el volumen del tumor. Figuras 4B y 4C: vista macroscópica de tumores representativos al final del experimento. Los tumores de los animales tratados con MDJ portado por ciclodextrina (figura 4B) fueron más pequeños y presentaron una capa externa pálida y dura y un núcleo más blando, en comparación con los tumores control (figura 4C). La histopatología mostró la presencia de áreas de necrosis (N), las cuales eran mucho más grandes en los tumores de los animales tratados con MDJ portado por ciclodextrina (figura 4E) que en los controles (figura 4D). Nótese que los focos de necrosis fueron rodeados por la concentración de pseudoempalizadas neoplásicas hipercromáticas, las cuales se denominan "áreas peri-necróticas" (PN). Las células tumorales control estaban organizadas como cordones de células en red (en líneas bien delimitadas) estrechamente acompañadas por pequeños vasos (flechas negras) (figuras 4F y 4H). Esta organización espacial fue severamente interrumpida en los animales tratados con MDJ portado por ciclodextrina, como se muestra en la figura 4G, con la presencia de fuga de células sanguíneas (flechas blancas) y focos microhemorrágicos (figura 41). Células positivamente inmunoteñidas para CD34 estuvieron presentes en alto número en el estroma de los tumores control (figura 4J), mientras que los tumores GT presentaron una reducción notable y estadísticamente significativa en el número de células teñidas para CD34 (figuras 4K y 4L). La inmunotinción del VEGF mostró una red organizada de vasos en el área frontal de invasión (IF) del tumor en los tumores control (figura 4M). En los tumores GT, el área de IF presentó una disminución notable de la organización espacial y un número más pequeño de células positivas (figura 4N). Los análisis cuantitativos han mostrado una disminución dramática en el número de células positivas para VEGF en las áreas de IF y PN en el grupo GT (figura 40). Prueba de Mann-Whitney (*p<0.01).

Figuras 5A-5D: Variación de la expresión génica en tumores GT y CG. Lista de los primeros genes sobrerregulados y subregulados en tumores para MDJ portado por ciclodextrina en comparación con tumores control, como se encuentra mediante el análisis de las microdisposiciones. Se muestran también los patrones de expresión de genes que mostraron por lo menos una variación doble entre los dos grupos.

Figuras 6A-6D: Vista esquemática de los datos de las microdisposiciones. En la figura 6A, una gráfica de dispersión de la serie de datos muestra la distribución de los genes en ambos grupos, a lo largo de los ejes centrales (eigenvectores). Los genes analizados están distribuidos de acuerdo con la escala mínima hasta la escala máxima, incluyendo sus valores de cambio en número de veces, revelados por ausencia de color. En la figura 6B, los algoritmos de agrupación (medias de K) tales como la agrupación jerárquica, revelaron las entidades más similares fusionadas juntas con base en la similitud de sus perfiles de expresión. Las interacciones de las proteínas que representan el clasificador de genes de las proteínas están presentes en la base de datos de ingenuidad. Estas se representan mediante símbolos coloreados (los símbolos verdes indican proteínas que tienen una inducción más pequeña después del MDJ portado por ciclodextrina, y los símbolos rojos indican proteínas que tienen una mayor inducción). La intensidad de los colores indica la diferencia entre los grupos en la magnitud de la inducción. Las proteínas de conexión se presentan mediante símbolos vacíos. Sólo algunas de las proteínas coloreadas no están directamente o indirectamente enlazadas a través de una proteína de conexión. Algunos de los factores implicados en la angiogénesis en la figura 6C y un panorama general, pueden verse en la figura 6D.

Figuras 7A-7T: Expresión de NFKB, TGFp, HIF-1 y COX-2. Las figuras 7A-7C muestran una reducción notable de ambas subunidades de NFKB (P105 y P50) mediante western-blotting en el grupo GT, cuando se comparan con el grupo GC. Además, el análisis de histoquímica southwestern confirmó que la transcripción de NFKB para el núcleo fue suprimida virtualmente en el grupo GT (figura 7E), cuando se comparó con el grupo GB (figura 7D). La única excepción fue una tinción de NFKB notable y alta en los vasos (figura 7F) sólo en el grupo GT en áreas con daño vascular, vistas en tinción con hematoxilina y eosina (figura 7G). Nota - puesto que el número de vasos era pequeño, esto pudo no haber afectado la cuantificación general de NFKB, mediante el análisis WB. La inmunotinción del TGFp fue mucho más intensa en el grupo GC, principalmente en las áreas PN, delimitadas por flechas negras (figura 7H), cuando se comparó con GT (figura 71), lo cual se confirmó mediante morfometría (figura 7J). Asimismo, la inmunotinción de HIF-1 fue mucho más intensa en el grupo GC, principalmente en las áreas PN (figuras 7K y 7L), cuando se comparó con GT (figuras 7M y 7N), lo cual se confirmó mediante morfometría (figura 70) y análisis western blot (figuras 7P y 7Q). La tinción de COX-2 ha mostrado una concentración mayor de células marcadas en el frente de invasión de los tumores GC, con muchas células organizadas en cordones (figura 7R), que se suprimió en el grupo GT, en el cual se encontró también una desorganización notable del tejido (figura 7S). La morfometría (figura 7T) confirmó la disminución en la expresión de IHC de COX-2 en el grupo GT, salvo el núcleo central de los tumores. Prueba de Mann-Whitney (*p<0.01).

Figuras 8A-8T: Marcadores de células madre (CD133, Oct4 y MT) y marcadores de apoptosis (Túnel y CASPASA-3). Las figuras 8A-8F muestran un patrón similar de tinción de IHC para ambos marcadores de células madre Oct4 y CD133. La inmunotinción fue mucho más intensa en el grupo GC, principalmente en las áreas PN (figuras 8A y 8D/8E, respectivamente), cuando se comparó con GT (figuras 8B y 8F/8G, respectivamente), que se confirmó mediante morfometría (figuras 8C y 8H, respectivamente). La inmunotinción de MT fue mucho más intensa en el grupo GC, principalmente en las áreas del IF (figuras 8I/8J), cuando se comparó con GT (figuras 8L 8M), lo cual se confirmó mediante morfometría (figura 8N). La tinción de MT mostró también una desorganización importante de los cordones de células y los vasos en el grupo GT. La tinción de TUNEL y Caspasa-3 han mostrado mayores niveles de apoptosis en el grupo GT, en las tres áreas que se evaluaron (figuras 8P y 8S, respectivamente), cuando se compararon con el grupo GC (figuras 80 y 8R, respectivamente), lo cual se confirmó mediante análisis morfométrico (figuras 8Q y 8T). Prueba de Mann-Whitney (*p<0.01).

Figura 9: Modelo propuesto para la función de la hipoxia del tumor en el sondeo de la progresión del cáncer, y MDJ portado por ciclodextrina en la desconexión de los sistemas de señalización de tumores.

Figura 10: Efecto del MDJ sobre el crecimiento de las células endoteliales (HUVEC, 2 x 105 células/cavidad) en placas de 96 cavidades en presencia de diluciones en serie de MDJ. Eje principal, símbolos claros: citotoxicidad medida mediante la reducción de MTT. Cada punto representa el promedio de cuatro lecturas realizadas en duplicados independientes, salvo para el control, medido por cuadruplicado. El valor medido para los controles no tratados se muestra mediante la barra de errores correspondiente en la gráfica. Eje secundario, símbolos oscuros: tiempo de dualidad funcional calculado a partir de los cultivos de células. Cada punto representa la media de tres experimentos independientes.

Figura 11 : Efecto del MDJ sobre el crecimiento de células de melanoma de murino (B16-F10, 1 x 104 células/cavidad) en placas de 96 cavidades en presencia de diluciones en serie de MDJ. Eje principal, símbolos claros: citotoxicidad medida mediante la reducción de MTT. Cada punto representa el promedio de cuatro lecturas realizadas en duplicados independientes, salvo para el control, medido por cuadruplicado. El valor medido para los controles no tratados se muestra mediante la barra de errores correspondiente en la gráfica. Eje secundario, símbolos oscuros: tiempo de dualidad funcional calculado a partir de los cultivos de células. Cada punto representa la media de tres experimentos independientes.

Figuras 12A a 12D: Imagen representativa de células endoteliales (figuras 12A y 12B) o de melanoma de murino B16F10 (figuras 12C y 12D) cultivadas hasta confluencia sobre portaobjetos en medio del RPMI en la condición control (figuras 12A y 12C) o después de 60 horas de exposición a MDJ 1mM (figuras 2B y 12D).

Figura 13: Efecto del MDJ sobre el ciclo celular en HUVEC después de 18 horas de exposición in vitro. Las concentraciones usadas en cada prueba se muestran en las gráficas. Se hicieron mediciones del ciclo celular en un equipo BD FACScalibur, después de marcación con yoduro de propidio simple. La tinción con anaranjado de acridina sirvió como control del proceso de apoptosis.

Figura 14: Efecto del MDJ sobre la viabilidad de células endoteliales en la siembra de baja densidad 24 (HUVEC, 1 x 104 células/cavidad), medida mediante la prueba de reducción de MTT en placas de 96 cavidades. Cada punto representa el promedio de ocho lecturas realizadas en cuatro experimentos independientes, y la línea continua representa la medida de los controles no expuestos como comparación. El efecto sobre las mitocondrias se confirmó mediante tinción con itotracker Red y observación microscópica confocal, y puede observarse ya a 4 horas de exposición (véase las figuras 15A a 15F).

Figuras 15A a 15F: Efecto del MDJ sobre la actividad mitocondrial de células endoteliales después de 4 horas de exposición en siembra de baja densidad sobre cubreobjetos de vidrio de 25 mm en placas de 24 cavidades, medida mediante microscopía confocal de fluorescencia Mitotracker Red, aumento de 80x (40x + 2x de zoom digital). Los parámetros de calibración se mantuvieron para todas las medidas. La medida de la brillantez que corresponde a la tinción fluorescente de las mitocondrias se cuantificó con relación al área marcada, sugiriendo que existe un incremento en el número o la actividad mitocondrial en células expuestas a bajas concentraciones de MDJ, también a 24 horas. Las concentraciones iguales a o mayores a 1mM, llevan a una disminución en la intensidad/área de marcación.

Figura 16: Efecto del MDJ sobre la actividad mitocondrial de células endoteliales después de 24 horas de exposición en siembra de baja densidad sobre cubreobjetos de vidrio de 25 mm en placas de 24 cavidades, medido mediante fluorescencia Mitotracker Red en microscopio confocal, aumento de 40x. Los parámetros de calibración se mantuvieron para todas las mediciones, y cada punto es el promedio de seis mediciones independientes.

El MDJ fue bien tolerado por los huevos, cuando se administró en solución en su propia albúmina de huevo.

Figura 17: Estudio in vivo de la toxicidad del MDJ sobre la supervivencia. Los huevos fecundados fueron expuestos al MDJ en dosis de 100, 50, 10 ó 5 pL por huevo (n = 5) en un volumen de 5 mL de albúmina removida del huevo mismo. Los controles fueron expuestos a vehículo sin MDJ. Las concentraciones indicadas en la leyenda se calcularon asumiendo un volumen de 60 mL/huevo.

Figuras 18A a 18C: Efecto de la albúmina a la que se añadió el MDJ sobre la angiogénesis en el modelo de CAM COSES que corresponde al control no expuesto (figura 18C), 1 pL (figura 18B) ó 5 pL (figura 18A) por huevo. La presencia de células de melanoma disminuyó la supervivencia de los huevos. El MDJ recuperó parcialmente esta supervivencia. Los resultados de la CAM en el modelo confirmaron que los cuerpos de melanoma sufren una involución dependiente de la dosis bajo la acción de la sustancia activa.

Figura 19: Estudio in vivo de la toxicidad del MDJ sobre la supervivencia en huevos inoculados con células de melanoma de murino B16F10, 1 x 104 células/cavidad. Los huevos fecundados fueron expuestos al MDJ en dosis de 100, 50, 10, 5 µ? por huevo (n = 5) en un volumen de 5 mi de albúmina removida del huevo mismo. Los controles fueron expuestos a vehículo sin MDJ. Las concentraciones indicadas en la leyenda se calcularon asumiendo un volumen de 60 mL/huevo.

Figuras 20A a 20D: Efecto de la albúmina a la que se administró el MDJ sobre el crecimiento de melanoma en el área de la CAM. Todas las muestras fueron inoculadas con melanoma de murino B16F10, 1 x 104 células/cavidad. Las figuras 20A y 20B, con imagen aumentada 5x. Las figuras 20C y 20D, la misma región representada aumentada 10x. Las figuras 20A y 20C, control no tratado. Las figuras 20B y 20D, tratamiento con una sola dosis de 5 µ? de MDJ. El crecimiento del tumor está estrechamente relacionado con los vasos. El melanoma indujo angiogénesis, y creció cerca de los vasos principales de la CAM.

Figuras 21 A y 21 B: Efecto de la albúmina a la que se añadió el MDJ sobre el crecimiento de melanoma en el área de la CAM. Muestra inoculada con melanoma de murino B16F10, 1 x 104 células/cavidad. Figura 21 A: imagen estereoscópica digitalizada en campo brillante, y Figura 21 B: la misma región, imagen tomada en campo oscuro. Aumento de 10X.

Figura 22: Efecto del MDJ portado por ciclodextrina sobre el crecimiento de células endoteliales (HUVEC, 1 x 104 células/cavidad) o de melanoma de murino (B16F10, 1 x 104 células/cavidad) en placas de cultivo de 96 cavidades. Cada punto representa el promedio de tres lecturas realizadas en duplicados independientes.

Figura 23: Efecto del MDJ portado por ciclodextrina sobre la viabilidad de células endoteliales (HUVEC, 1 x 104 células/cavidad) o de melanoma de murino (B16F10, 1 x 104 células/cavidad) en placas de cultivo de 96 cavidades después de 24 horas de exposición, medido mediante la prueba de MTT. Cada punto representa el promedio de tres lecturas realizadas en duplicados independientes.

Figuras 24A a 24D: Efecto del MDJ portado por ciclodextrina sobre el crecimiento de vasos sanguíneos en el modelo de angiogénesis de la CAM. Figuras 24A y 24B: microfotog rafias tomadas en material fresco sin tinción. Microscopio Jena, iluminación con capacitor paralelo. Aumento de 8x. Figuras 24B y 24D: microfotografías tomadas en material fresco sin tinción, microscopio Jena, iluminación con capacitor paralelo, aumento de 32x. Muestras obtenidas en pruebas independientes. Figuras 24A y 24C: controles no tratados. Figuras 24B y 24D: dosis aplicada a la CAM equivalente a MDJ 1 µ?.

Figura 25: Efecto del MDJ portado por ciclodextrina sobre el crecimiento de los vasos en el modelo de angiogénesis en la CAM inoculada con melanoma de murino B16F10, 1 x 104 células/cavidad en el octavo día de incubación. Microfotografías tomadas en material fresco sin tinción, microscopio Jena, iluminación con capacitor paralelo, aumento de 32x. A: control no tratado. B: muestra tratada con MDJ portado por ciclodextrina aplicado en la CAM en el día 11 de incubación, el equivalente de MDJ 1 µ?.

Figura 26: Efecto del MDJ portado por CD (variando el tamaño de 3 a 30 nm) sobre nueve líneas de células cancerosas: UACC62, MCF7, NCIADR, 7860, NC1460, PC03, OVCAR03, HT29 y K562. El eje X es la concentración de MDJ basada en el volumen total de la muestra; la concentración de MDJ en la nanoemulsión usada fue de 1 milimolar.

Figura 27: Efecto del tamaño de los nanoportadores sobre la actividad de angiogénesis; la concentración del MDJ nanoportado usada siendo de 1 nM a 10-100 micromolar.

Figura 28: Efecto del MDJ portado por liposomas de fosfatidilcolina de soya (liposoma con 50-120 nm en tamaño) sobre nueve líneas de células cancerosas: UACC62, MCF7, NCIADR, 7860, NC1460, PC03, OVCAR03, HT29 y K562. El eje X es la concentración de MDJ basada en el volumen total de la muestra; la concentración del MDJ en la nanoemulsión usada fue de 1 milimolar.

Figura 29: Efecto del complejo de MDJ-nanoportador de liposomas de fosfatidilcolina de soya sobre la actividad mitocondrial de células UACC-62 después de 8 horas de incubación de esas células con el complejo (los tres paneles inferiores), medido mediante microscopía confocal de fluorescencia Mitotracker Red. La concentración del MDJ fue de 10"3 M, y el tamaño del complejo varió de 25 nm a 200 nm.

Figura 30: Efecto del complejo de MDJ-nanoportador de liposomas de fosfatidilcolina de soya sobre la viabilidad de células endoteliales (HUVEC) o de melanoma de murino (B16F10) después de 24 horas de exposición, medido mediante la prueba de MTT.

Figura 31 : Efecto anti-angiogénesis del complejo de nanoportador de MDJ-PAMAM, siendo la concentración de MDJ de 10~3 M en la nanoemulsión. El panel superior mostró claramente la formación de la masa tumoral de melanoma de murino (B16F10) y la formación de una nueva red vascular que provee nutrición para hacer que el tumor crezca mientras, como se muestra en el panel inferior, no se formó ninguna red vascular después del tratamiento con el complejo.

Figura 32: Efecto anti-angiogénesis del complejo de nanoportador de MDJ-LDE sobre células UACC-62, siendo la concentración de MDJ de 10"3 en la muestra.

Figura 33: Efecto anti-angiogénesis del complejo de nanoportador de MDJ-liposoma de fosfatidilcolina de soya sobre células UACC-62, siendo la concentración de MDJ de 10"4 M en la muestra.

Figuras 34A y 34B: Efecto del complejo de microportador de MDJ-LDE activado por macrófagos (10 mieras en tamaño, siendo la concentración de MDJ de 10'3 a 10"1 M) en células de Leucemia. Figura 34A: imagen microscópica de células cancerosas (brillantes) engullidas por macrófagos (opacos); Figura 34B: imagen microscópica de células cancerosas siendo digeridas dentro de un macrófago.

Figura 35: Efecto del MDJ nanoportado sobre la angiogénesis in vivo a bajas dosis, las concentraciones de MDJ siendo de 10 µ? en las dos imágenes superiores, y de 100 nM en las tres imágenes inferiores.

Figura 36: Efecto del MDJ y el MDJ nanoportado sobre la angiogénesis in vivo a una concentración de 30 µ?.

Figura 37: Vías de acción del jasmonato contra células cancerosas (véase Flescher, Cáncer Lett. 2007; 245(1-2): 1-10).

Figuras 38A a 38C: Imágenes de microscopio invertido de la línea de células de Jurkat (leucemia; ATCC®, número: TIB-156™) después de 24 horas de tratamiento con: figura 38A: agua (control); figura 38B: nanopartículas vacías; y figura 38C: nanopartículas que poseen MDJ. En la figura 38C, casi todas las células murieron después de 24 horas de tratamiento.

Figuras 39A a 39C: Imágenes de microscopio invertido de la línea de células de cáncer de próstata VCaP (ATCC®, número: CRL-2876™) después de 24 horas de tratamiento con: figura 39A: agua (control); figura 39B: nanopartículas vacías; y figura 39C: nanopartículas que poseen MDJ. En la figura 39C, casi todas las células murieron después de 24 horas de tratamiento.

Figuras 40A a 40C: Imágenes de microscopio invertido de la línea de células de cáncer de mama HCC38 (ATCC®, número: CRL-2314™) después de 24 horas de tratamiento con: A: agua (control); B: nanopartículas vacías; y C: nanopartículas que poseen MDJ. En la figura 40C, casi todas las células murieron después de 24 horas de tratamiento.

Figuras 41 A a 41 C: Imágenes de microscopio invertido de la línea de células de carcinoma de próstata 22Rv1 (ATCC®, número: CRL-2505™) después de 24 horas de tratamiento con: figura 41 A: agua (control); figura 41 B: nanopartículas vacías; y figura 41 C: nanopartículas que poseen MDJ. En la figura 41 C, 60 a 70% de las células murieron después de 24 horas de tratamiento.

Figuras 42A a 42C: Imágenes de microscopio invertido de macrófagos después de 24 horas de tratamiento con: figura 42A: agua (control); figura 42B: nanopartículas vacías; y figura 42C: nanopartículas que poseen MDJ.

Figura 43: Imágenes que muestran la fragmentación de los vasos cuando se ponen en contacto con A-14 unido con zinc, calcio o aminoácidos. El A-14 unido con zinc demostró el efecto más significativo sobre la fragmentación de los vasos en comparación con el A-14 unido con calcio o aminoácidos. 1 : A-14 con alanina; 2: A-14 con argentina; 0.5: A-14 con zinc; 5: A-14 con calcio y c: control. El portador es liposoma.

Figura 44: Imagen de la izquierda: una cantidad enorme de vasos; se formaron angiogénesis alrededor de las células tumorales. Para crecer, el tumor necesita recibir una gran cantidad de nutrientes y oxígeno. Debido a dicha necesidad, el complejo de vasos se forma dentro/en el tumor después de que el VEGF (factor de crecimiento endotelial vascular) es liberado por el tumor. Imagen de la derecha: después de que es tratado con A-14 conjugado con aminoácidos, la mayor parte del complejo de vasos desapareció. El fenómeno denominado anti-angiogénesis, la destrucción de esos vasos, previene que el tumor reciba los nutrientes y el oxígeno requeridos para su crecimiento. El portador es liposoma.

Figura 45: Imagen que muestra la destrucción de las células endoteliales por A-14 unido a aminoácidos. El portador es liposoma.

Figura 46: Imagen que muestra el efecto anti-angiogénesis alrededor de los vasos en el cáncer de mama por A-14 unido con zinc. El portador es liposoma.

En el cuadro A siguiente, pueden observarse resultados concordantes entre los métodos, de los datos de las microdisposiciones y la qRP-PCR para algunos genes muestreados.

CUADRO A DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Se ha encontrado que los jasmonatos son agentes anti-cáncer potenciales que actúan directamente y selectivamente sobre las mitocondrias de las células cancerosas humanas (véase, por ejemplo, Rotem et al., Cáncer Res 2005; 65: 1984-1993; Costantini et al., JNCI 2000; 90: 1042-1053). Se ha reportado que miembros de los jasmonatos, y algunos de sus derivados sintéticos, exhiben actividad anti-cáncer in vitro e in vivo. Por ejemplo, los jasmonatos incrementaron la duración de vida de ratones que poseen el linfoma EL-4, el MJ es activo en células de linfoma B quimio-resistentes, y datos preliminares han sugerido que el MJ exhibe citotoxicidad por medio de la vía apoptótica (véase, por ejemplo, Flescher, Cáncer Lett. 2007; 245(1-2): 1-10; Fingrut et al., Br J Pharmacol. 2005; 146(6): 800-808; Fingrut ef al., Leukemia, 2002; 16: 608-616). Se han propuesto mecanismos de acción para explicar la actividad anti-cáncer de los jasmonatos (Véase id., y figura 37). Sin embargo, el problema principal que enfrenta a esta nueva familia de agentes anti-cáncer es la dificultad para administrar los compuestos in vivo. Siendo un éster, cuando se administran in vivo, los jasmonatos son usualmente metabolizados, por ejemplo, por esterasas, antes de que lleguen a las células cancerosas objetivo, haciéndolos menos atractivos como agentes anti-cáncer.

La invención provee composiciones farmacéuticas de jasmonatos nanoportados y/o microportados. Se pretende que la composición de la invención sean composiciones "farmacéuticas", significando que son adecuadas para uso farmacéutico. Por consiguiente, el término "composición", como se usa en la presente, indica que abarca composiciones farmacéuticas incluso si no se enuncia expresamente "farmacéuticas". Las composiciones de la invención proveen de preferencia de estabilidad contra la degradación de los jasmonatos antes de que lleguen a las células objetivo in vivo. La invención se basa en parte en el descubrimiento inesperado de que los jasmonatos nanoportados y/o microportados, en particular, el MDJ nanoportado y/o microportado, muestran actividades anti-angiogénesis. La invención se basa también en parte en el descubrimiento inesperado de que el MDJ nanoportado y/o microportado es mucho más efectivo contra las células tumorales que el J nanoportado, por ejemplo, por lo menos 103 más efectivo, con menos toxicidad para las células y vasos sanguíneos normales. La invención se basa también en parte en el descubrimiento inesperado de que los jasmonatos nanoportados y/o microportados, en particular, el MDJ o MJ nanoportado y/o microportado, muestran actividades anti-angiogénesis o actividades angiogénesis basadas en diferentes dosis o concentraciones. Por ejemplo, a una baja concentración de 1 nM a aproximadamente 10-100 µ?, el MDJ nanoportado y/o microportado exhibe efecto angiogénesis, mientras que a una concentración mayor a 100 µ?, el MDJ nanoportado y/o microportado exhibe efecto anti-angiogénesis. Respecto al MJ, a una baja concentración de 1 nM a aproximadamente 1 µ?, el MJ nanoportado y/o microportado exhibe efecto angiogénesis, mientras que a una concentración mayor a1 µ? (por ejemplo, mayor a2 µ? o mayor a5 µ?), el MDJ nanoportado y/o microportado exhibe efecto anti-angiogénesis.

Los descubrimientos inesperados anteriores sugieren que el jasmonato nanoportado/microportado se use como una nueva y prometedora terapia anti-cáncer elegida como objetivo.

Como se usa en la especificación y en las reivindicaciones anexas, las formas singulares "un", "una" y "la" incluyen los referentes plurales, a menos que el contexto indique claramente otra cosa. De esta manera, por ejemplo, la referencia a "un compuesto de jasmonato" puede incluir no sólo un jasmonato individual, sino también una combinación o mezcla de dos o más jasmonatos diferentes que incluyen profármacos, ésteres, sales y metabolitos de los mismos.

Como se usa en la presente, las frases "por ejemplo", "tal como" o "que incluye", se usan para introducir ejemplos que aclaran adicionalmente la materia en cuestión más general. Estos ejemplos se proveen sólo como una ayuda para entender la descripción, y de ninguna manera se pretende que sean limitativos.

En la descripción y el reclamo de la presente invención, la siguiente terminología se usará de acuerdo con las definiciones expuestas a continuación.

Como se usa en la presente, no se pretende que la frase "que contiene", "siendo formado/compuesto de", "que incluye", "que tiene la fórmula" o "que tiene la estructura" sea limitativa, y se usa de la misma manera que el término "que comprende" se usa comúnmente, a menos que el contexto indique claramente otra cosa.

El término "nanoportador", como se usa en la presente, se refiere a un portador o vehículo adecuado para llevar y suministrar un ingrediente activo (por ejemplo, un fármaco) hacia una célula, tejido u órgano objetivo, y el vehículo tiene un tamaño en la escala de aproximadamente 1 nanómetro (nm) a aproximadamente 1000 nm. El término "microportador", como se usa en la presente, se refiere a un portador o vehículo adecuado para llevar y suministrar un ingrediente activo (por ejemplo, un fármaco) hacia una célula, tejido u órgano objetivo, y el vehículo tiene un tamaño en la escala de aproximadamente 1 miera a aproximadamente 100 mieras. En una modalidad, un microportador se forma de un grupo de nanoportadores, por ejemplo, un microportador de LDE formado de un grupo de nanoportadores de LDE. De preferencia, el nanoportador o microportador es un portador farmacéuticamente aceptable.

El término "compuesto nanoportado/microportado", o el término "nanoportador/microportador que contiene un compuesto", como se usa en la presente, se refiere a un complejo de un nanoportador/microportador asociado o acoplado con un compuesto. La asociación o el acoplamiento puede crearse por medio de un enlace químico (por ejemplo, un enlace covalente), un enlace de hidrógeno, una fuerza de van der Waals, una interacción de Coulomb, o similares. En una modalidad, el compuesto es encapsulado en el nanoportador/microportador. En otra modalidad, el compuesto es parcialmente encapsulado en el nanoportador/microportador o en la superficie del nanoportador/microportador (por ejemplo, como parte de la superficie del nanoportador/microportador o fuera, unido aún a la superficie).

El término "emulsión" se refiere a una suspensión de pequeños glóbulos o partículas de un primer líquido (la fase dispersa) dispersos en un segundo líquido (la fase continua), con la cual la primera es normalmente inmiscible.

El término "nanoemulsión", como se usa en la presente, se refiere a una emulsión que tiene las partículas dispersas con un tamaño que varía de aproximadamente 1 nm a aproximadamente 50 µ?t? (por ejemplo, 1 nm-50 µ??, 1 nm-40 µ?t?, 1 nm-30 µ?t?, 1 nm-20 µ?t?, 1 nm-10 µ??, 1-5000 nm, 1-4000 nm, 1-3000 nm, 1-2000 nm, 1-1000 nm, 1-900 nm, 1-800 nm, 1-700 nm, 1-600 nm, 1-500 nm, 1-400 nm, 1-300 nm, 1-200 nm, 1-150 nm, 1-100 nm, 1-90 nm, 1-80 nm, 1-70 nm, 1-60 nm, 1-50 nm, 1-40 nm, 1-30 nm, 1-20 nm, 1-10 nm, 1-5 nm, 50-100 nm, 3-150 nm ó 3-20 nm). Las nanoemulsiones tienden a aparecer claras debido al tamaño pequeño de la fase dispersa.

El término "LDE" se refiere a una partícula de nanoemulsión que asemeja una lipoproteína de baja densidad (LDL) en composición y comportamiento. Por ejemplo, una vez introducidas en el sistema circulatorio, varias proteínas plasmáticas (por ejemplo, apoE) llegan a ser absorbidas sobre la superficie de las partículas de LDE y posteriormente dirigen la LDE hacia células que expresan receptores de LDL (LDLR). La LDE está libre de proteínas, y está compuesta típicamente de un núcleo de éster de colesterilo rodeado por una monocapa de fosfolípidos. Para descripciones más detalladas de LDEs y sus preparaciones, véase, por ejemplo, Ginsburg et al. (1982), J Biol Chem 257: 8216-8227; Maranhao et al. (1993), Lipids 28: 691-696; y Favero et al. (2010), Biol Res 43: 439-444. El término "LDE" se usa en la presente para referirse a un ejemplo de un nanoportador o microportador tipo liposoma que puede usarse de conformidad con la presente invención. La determinación de otros nanoportadores y/o microportadores tipo liposoma adecuados, está dentro del nivel de rutina del experto en la técnica.

El término "éster de colesterilo" se refiere a un éster de colesterol. Por ejemplo, el enlace de éster se forma entre el grupo carboxilato de un ácido graso y el grupo hidroxilo del colesterol. Ejemplos de ésteres de colesterilo incluyen, pero no están limitados a, oleato de colesterilo, nervonato de colesterilo, etc.

El término "fosfolípido" se refiere a una clase de lípidos que son un componente principal de la membrana de todas las células, puesto que pueden formar bicapas lipídicas. La mayoría de los fosfolípidos contienen un diglicérido, un grupo fosfato, y una molécula orgánica simple tal como colina. Una excepción a esta regla es la esfingomielina, la cual se deriva de esfingosina en lugar de glicerol. Ejemplos de fosfolípidos incluyen, pero no están limitados a, glicerofosfolípidos tales como ácido fosfatídico, fosfatidiletanolamina, fosfatidilcolina, fosfatidilserina y fosfoinosítidos (por ejemplo, fosfatidilinositol, fosfato de fosfatidilinositol, bisfosfato de fosfatidilinositol y trifosfato de fosfatidilinositol).

Los compuestos mencionados en presente pueden contener un doble enlace no aromático y uno o más centros asimétricos. De esta manera, pueden ocurrir como racematos y mezclas racémicas, enantiómeros individuales, diastereómeros individuales, mezclas diastereoméricas y formas isoméricas cis o trans. Se contempla la totalidad de dichas formas isoméricas. Por ejemplo, el compuesto de jasmonato descrito en la presente incluye la totalidad de cualquier isómero óptico que se base en el carbono asimétrico y sea ópticamente puro, cualquier mezcla de varios isómeros ópticos, o forma racémica. Ejemplos de estereoisómeros de MDJ incluyen, por ejemplo, jasmonato de (1R,2R)-dihidrometilo, jasmonato de (1R,2S)-dihidrometilo, jasmonato de (1S,2R)-dihidrometilo y jasmonato de (1S,2S)-dihidrometilo. Ejemplos de isómeros de jasmonato de metilo incluyen jasmonato de cis- o trans-(1 R,2R)-metilo, jasmonato de cis- o trans-(1 R,2S)-metilo, jasmonato de cis- o trans-(1S,2R)-metilo y jasmonato de cis- o trans-(1S,2S)-met¡lo.

Se pretende que la presente invención incluya todos los isótopos de átomos que ocurren en los presentes compuestos. Los isótopos incluyen aquellos átomos que tienen el mismo número atómico pero diferentes números de masa. A manera de ejemplo general y sin limitación, los isótopos de hidrógeno incluyen el tritio y el deuterio, y los isótopos de carbono incluyen el C-13 el C-14.

El término "alquilo", como se usa en la presente, se refiere a un grupo hidrocarburo saturado ramificado o no ramificado, típicamente, aunque no necesariamente, que contiene 1 a aproximadamente 24 átomos de carbono, tales como metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, isobutilo, t-butilo, octilo, decilo, y similares, así como grupos cicioalquilo tales como ciclopentilo, ciclohexilo, y similares. En general, aunque no necesariamente, los grupos alquilo en la presente pueden contener 1 a aproximadamente 18 átomos de carbono, y dichos grupos pueden contener 1 a aproximadamente 12 átomos de carbono. El término "alquilo inferior" se refiere a un grupo alquilo de 1 a 6 átomos de carbono, por ejemplo, 1 , 2, 3, 4, 5 ó 6 átomos de carbono.

Composiciones farmacéuticas La presente invención provee también de composiciones farmacéuticas que comprenden un compuesto de jasmonato y por lo menos un excipiente o portador farmacéuticamente aceptable, por ejemplo, un nanoportador/microportador descrito en la presente.

En una modalidad, los nanoportadores usados para la composición de la invención se forman de ciclodextrinas. Las ciclodextrinas (CDs) son oligosacáridos cíclicos formados por unidades de D-L(+)-glucosa enlazadas por cadenas a-1 ,4-C-O-C. Las CDs se producen a partir de almidón por medio de conversión enzimática. Las CDs nativas se definen por el número de unidades de glucosa, por ejemplo, las a-, ß- y ?-CDs consisten de 6, 7 y 8 unidades de glucosa, respectivamente. Más ejemplos de CDs adecuadas para esta invención se describen, por ejemplo, en WO 2010/006392, US 2008/044364 y EP 392608.

En otra modalidad, los nanoportadores/microportadores usados para las composiciones de la invención son LDEs. En particular, la LDE usada para esta invención comprende fosfatidilcolina, ácido oleico, colesterol y trioleína. Pueden usarse también otros portadores tipo liposoma.

En otra modalidad, los nanoportadores usados para la composición de la invención se forman de un dendrímero tal como PAMAM. El cuadro siguiente demuestra el tamaño de un dendrímero PAMAM como una función de generaciones. Más ejemplos de dendrímeros se describen, por ejemplo, en WO 2010/006392.

En otra modalidad más, los nanoportadores/microportadores son liposomas (incluyendo liposomas dirigidos hacia células infectadas con anticuerpos monoclonales para antígenos virales). La formulación de liposoma para el compuesto de la presente invención comprende por lo menos un polímero, aceite, por lo menos un agente tensoactivo y un solvente. Los expertos en la técnica reconocerán que cualquier polímero, aceite, agente tensoactivo y/o solvente adecuado, puede usarse para la formulación de liposomas. La determinación de formulaciones de liposomas adecuadas para su uso en la presente invención está dentro de la aptitud de rutina en la técnica. Ejemplos de polímeros para la formulación de liposomas incluyen, por ejemplo, la policaprolactona, el PHB - polihidroxibutirato, el PMMA -poli(metacrilato de metilo), el quitosán y la ß-ciclodextrina. Ejemplos de aceites usados para la fase oleosa incluyen, por ejemplo, el oleato de isodecilo, el aceite mineral y el aceite EMU. Ejemplos de agentes tensoactivos incluyen, por ejemplo, el monoestearato de sorbitán, la lecitina (tal como lecitina de soya) y el polisorbato 80. La lecitina puede ser cualquier lecitina natural y/o sintética y/o una mezcla de la misma. Los solventes usados para la formulación de liposomas incluyen, pero no están limitados a, acetona, etanol y agua ultra pura. Un ejemplo no limitativo del liposoma usado para la invención es el liposoma formado de soya o fosfatidilcolina de huevo (o lecitina). Estos pueden prepararse de acuerdo con métodos conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo, como se describe en la patente de los Estados Unidos No. 4,522,81 1. De esta manera, la elección de la formulación de liposomas exacta usada será influenciada por el cáncer que está siendo tratado. Ciertas formulaciones de liposomas funcionarán mejor para algunos cánceres que para otros.

En una modalidad, el tamaño de los nanoportadores varía de 1 nm a 1000 nm, por ejemplo, 900-1000 nm, 1 -900 nm, 1-800 nm, 1-700 nm, 1-600 nm, 1-500 nm, 1-400 nm, 1-300 nm, 1 -200 nm, 1-150 nm, 1-100 nm, 1-90 nm, 1-80 nm, 1-70 nm, 1-60 nm, 1-50 nm, 1-40 nm, 1-30 nm, 1 -20 nm, 1-10 nm, 1-5 nm, 2-300 nm, 20-200 nm, 50-150 nm ó 3.5-1 1 nm.

En una modalidad, el tamaño de los microportadores varía de 2 im a 50 pm, por ejemplo, 2-5 µ??, 2-10 µ??, 2-15 pm, 2-20 µ?t?, 2-25 µ??, 2-30 µ??, 2-40 µ??, 2-50 µ??, 5-20 µ?a, 5-10 µ?? ó 7.5-10 µ??.

En una modalidad, el compuesto de jasmonato en la composición farmacéutica se selecciona del grupo que consiste de ácido jasmónico, ácido 7-iso-jasmónico, ácido 9,10-dihidrojasmónico, ácido 9,10-dihidro-isojasmónico, ácido 2,3-didehidrojasmónico, ácido 3,4- didehidrojasmónico, ácido 3,7-didehidrojasmónico, ácido 4,5-didehidrojasmónico, ácido 4,5-didehidro-7-isojasmónico, ácido cucúrbico, ácido 6-epi-cucúrbico, ácido 6-epi-cucúrbico-lactona, ácido 12-hidrox¡-jasmónico, ácido 12-hidroxi-jasmón¡co-lactona, ácido 11-hidroxi-jasmónico, ácido 8-hidroxi-jasmónico, ácido homo-jasmónico, ácido dihomo-jasmónico, ácido 11-hidroxi-dihomo-jasmónico, ácido 8-hidroxi-dihomo-jasmónico, ácido tuberónico, ácido tuberónico-O-p-glucopiranósido, ácido cucúrbico-0-ß-glucopiranósido, ácido 5,6-didehidro-jasmónico, ácido 6,7-didehidro-jasmónico, ácido 7,8-didehidro-jasmónico, cis-jasmona, dihidrojasmona, y un éster de alquilo inferior de los mismos. De preferencia, la composición de la invención incluye dihidrojasmonato de metilo. Otros ejemplos del compuesto de jasmonato adecuados para la invención pueden encontrarse, por ejemplo, en WO 02/080890 y en Gfeller et al. Sci. Signal. 2010, Vol. 3, edición 109, pp. cm3.

En una modalidad, la composición de la invención tiene una concentración de un compuesto de jasmonato (por ejemplo, MDJ) que varía de 1 nM a 100 m , por ejemplo, 1 nM a 99 mM, 1 nM a 90 mM, 1 nM a 80 mM, 1 nM a 70 mM, 1 nM a 60 mM, 1 nM a 50 mM, 1 nM a 40 mM, 1 nM a 30 mM, 1 nM a 20 mM, 1 nM a 10 mM, 1 nM a 5 mM, 1 nM a 1 mM, 1 nM a 900 µ?, 1 nM a 800 µ?, 1 nM a 700 µ?, 1 nM a 600 µ?, 1 nM a 500 µ?, 1 nM a 400 µ?, 1 nM a 300 µ?, 1 nM a 200 µ?, 1 nM a 100 µ?, 1 nM a 90 µ?, 1 nM a 80 µ?, 1 nM a 70 µ?, 1 nM a 60 µ?, 1 nM a 50 µ?, 1 nM a 40 µ?, 1 nM a 30 µ?, 1 nM a 20 µ?, 1 nM a 10 µ?, 1 nM a 5 µ?, 1 nM a 1 µ?, 1 nM a 900 nM, 1 nM a 800 nM, 1 nM a 700 nM, 1 nM a 600 nM, 1 nM a 500 nM, 1 nM a 400 nM, 1 nM a 300 nM, 1 nM a 200 nM, 1 nM a 100 nM, 1 nM a 90 nM, 1 nM a 80 nM, 1 nM a 70 nM, 1 nM a 60 nM, 1 nM a 50 nM, 1 nM a 40 nM, 1 nM a 30 nM, 1 nM a 20 nM, 1 nM a 10 nM, 1 nM a 5 nM, 1 nM a 1 mM, 100 nM a 1 mM, 100 nM a 100 µ?, 1-100 µ?, 10-50 µ?, 20-30 µ?, 100 µ? a 10 mM, 100 µ? a 100 mM, 1-100 mM, 1-100 nM y 59-64 nM.

En una modalidad, la composición de la invención tiene una concentración de un compuesto de jasmonato (por ejemplo, MDJ) que varía de 100 mM a 1 M, por ejemplo, de 0.2 M, 0.3 M, 0.4 M, 0.5 M, 0.6 M, 0.7 M, 0.8 M, 0.9 M a 1M, 100 mM a 1 M, 200 mM a 750 mM, ó aproximadamente 0.8-1 M.

En una modalidad, cuando la composición se usa para el tratamiento de leucemia, la concentración de un compuesto de jasmonato (por ejemplo, MDJ) incluido en la presente varía de 100 µ? a 5 mM, 100 µ? a 4 mM, 100 µ? a 3 mM, 100 µ? a 2 mM, 100 µ? a 1 mM, 100 µ? a 0.5 mM, 0.01 mM a aproximadamente 2 mM, ó aproximadamente 1 mM, 10 µ? a 5 mM, 10 µ? a 4 mM, 10 µ? a 3 mM ó 10 µ? a 2 mM. En otra modalidad, cuando la composición se usa para el tratamiento de un tumor sólido, la concentración de un compuesto de jasmonato (por ejemplo, MDJ) incluido en la presente varía de 1 nM a 1 M (por ejemplo, 1 nM a 0.5 M, 1 nM a 0.1 M, 1 nM a 50 mM, 1 nM a 10 mM, 1 nM a 5 mM, 10 nM a 1 M ó 1 nM a aproximadamente 1 mM, ó 1 µ? a 1 M, ó 1-1000 nM, 1-500 nM, 1-250 nM, aproximadamente 1-100 nM, 1-50 nM, 1-10 nM ó 1-5 nM).

Los nanoportadores o microportadores pueden contener adicionalmente moléculas o iones no de jasmonato además de compuestos de jasmonato. Por ejemplo, fosfato diácido de 2-aminoetilo (o fosfoetanolamina), 3,7-dimetil-2,6-octadienal (o citral), salicilato de metilo, ácido abscísico, aminoácidos neutros, Ca2+, Zn2+, o derivados o análogos de los mismos. El 3,7-Dimetil-2,6-octadienal puede ser un isómero cis o trans. Estas moléculas o iones no de jasmonato pueden estar asociados o acoplados con los compuestos de jasmonato o con los nanoportadores/microportadores. En algunas modalidades, los compuestos no de jasmonato pueden estar contenidos en el mismo nanoportador/microportador que los compuestos de jasmonato. Sin embargo, en otras modalidades, los compuestos no de jasmonato están contenidos en diferentes nanoportadores/microportadores que los compuestos de jasmonato, y estos portadores pueden administrarse concurrentemente. La asociación o el acoplamiento puede crearse por medio de un enlace químico (por ejemplo, un enlace covalente), un enlace de hidrógeno, una fuerza de van der Waals, una interacción de Coulomb, o similares. En una modalidad, el compuesto no de jasmonato es encapsulado en el nanoportador/microportador. En otra modalidad, el compuesto es parcialmente encapsulado en el nanoportador/microportador o en la superficie del nanoportador/microportador (por ejemplo, como parte de la superficie del nanoportador/microportador o fuera unido aún a la superficie).

En una modalidad, el compuesto de jasmonato nanoportado o microportado (por ejemplo, MJ o MDJ) puede ser modificado sintéticamente, por ejemplo, enlazado covalentemente con moléculas de citral y/o fosforiletanolamina. Específicamente, las reacciones pueden llevarse a cabo con cualquiera de los grupos carbonilo del compuesto de jasmonato, por ejemplo, la cetona (E1) en el anillo de ciclopentilo de un compuesto de jasmonato (por ejemplo, MJ o MDJ) o el carbonilo del éster (E2) del compuesto de jasmonato. La reacción entre la cetona (o grupo éster) del jasmonato y el grupo amina (R1) de la fosforiletanolamina puede dar como resultado la formación de una ¡mina o un hemiaminal (o amida). El rendimiento de la reacción entre el jasmonato y el citral puede mejorarse reduciendo primero el grupo aldehido del citral para formar un compuesto de citral reducido ("R2") o hidratando (C-6) el doble enlace para formar R3. Estos pasos preliminares dan como resultado grupos hidroxilo en R2 ó R3, los cuales pueden reaccionar con la cetona (E1) del compuesto de jasmonato para formar un cetal o éster, o pueden reaccionar con el grupo éster (E2) del compuesto de jasmonato para formar un nuevo éster.

La reacción entre estos compuestos, es decir, jasmonato (por ejemplo, MJ o MDJ), fosforiletanolamina, R1, citral, R2 y R3, puede generar productos que incluyen, pero no están limitados a: R1-(E1)MJ; R1-(E2)MJ; R1-(E1)MJ(E2)-R1; R2-(E1)MJ; R2-(E2)MJ; R2-(E1)MJ(E2)-R2; R3-(E1)MJ; R3-(E2)MJ; R3-(E1)MJ(E2)-R3, así como mezclas de ellos tales como R1-(E1)MJ(E2)-R2; R2-(E1)MJ(E2)-R1; R1-(E1)MJ(E2)-R3; R3-(E1)MJ(E2)-R1 ; R2-(E1)MJ(E2)-R3; o R3-(E1)MJ(E2)-R2. En una modalidad, quince moléculas derivadas de jasmonato de metilo se sintetizaron mediante los métodos descritos anteriormente.

Una "composición farmacéutica" es una formulación que contiene un compuesto nanoportado y/o microportado de la presente invención en una forma adecuada para administración a un sujeto. En una modalidad, la composición farmacéutica está en una forma de dosificación global o en una forma de dosificación unitaria. La forma de dosificación unitaria es cualquiera de una variedad de formas que incluyen, por ejemplo, una cápsula, una bolsa IV, una tableta, una bomba individual o un inhalador de aerosol o un vial. La cantidad de ingrediente activo (por ejemplo, una formulación del compuesto nanoportado y/o microportado descrito o sal, hidrato, solvato o isómero del mismo) en una dosis unitaria de la composición, es una cantidad efectiva y se hace variar de acuerdo con el tratamiento particular implicado. El experto en la técnica apreciará que a veces es necesario hacer variaciones de rutina a la dosificación, dependiendo de la edad y la condición del paciente. La dosificación dependerá también de la vía de administración. Se contempla una variedad de vías que incluyen las vías oral, pulmonar, rectal, parenteral, transdérmica, subcutánea, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, por inhalación, bucal, sublingual, intrapleural, intratecal, intranasal, y similares. Las formas de dosificación para la administración tópica o transdérmica de un compuesto de esta invención incluyen polvos, rocíos, ungüentos, pastas, cremas, lociones, geles, soluciones, parches e inhalantes. En una modalidad, el compuesto activo nanoportado y/o microportado se mezcla bajo condiciones estériles con un portador farmacéuticamente aceptable (por ejemplo, nanoportadores/microportadores), y con cualquier conservador, regulador de pH o propelente que se requiera.

Como se usa en la presente, la frase "farmacéuticamente aceptable" se refiere a aquellos compuestos, materiales, composiciones, portadores y/o formas de dosificación que son, dentro del alcance del juicio médico profundo, adecuados para su uso en contacto con los tejidos de seres humanos y animales sin toxicidad excesiva, irritación, respuesta alérgica u otro problema o complicación, en proporción con una relación razonable de beneficio/riesgo.

El término "excipiente o portador o solvente farmacéuticamente aceptable" significa un excipiente, portador o solvente que es útil en la preparación de una composición farmacéutica que es generalmente seguro, no tóxico y ni biológicamente ni de otra manera no deseable, e incluye un excipiente que es aceptable para uso veterinario, así como uso farmacéutico en humanos. Un "excipiente farmacéuticamente aceptable", como se usa en la presente, incluye un excipiente y más de uno de dichos excipientes.

Una composición farmacéutica de la invención se formula para que sea compatible con su vía de administración deseada. Ejemplos de vías de administración incluyen la administración parenteral, por ejemplo, intravenosa, intradérmica, subcutánea, oral (por ejemplo, por inhalación), transdérmica (tópica) y transmucosa. La soluciones o suspensiones usadas para aplicación parenteral, intradérmica o subcutánea pueden incluir los siguientes componentes: un diluyente estéril tal como agua para inyección, solución salina, aceites fijados, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol u otros solventes sintéticos; agentes antibacterianos tales como alcohol bencílico o metilparabenos; antioxidantes tales como ácido ascórbico o bisulfito de sodio; agentes quelantes tales como ácido etilendiaminotetraacético; reguladores de pH tales como acetatos, citratos o fosfatos; y agentes para el ajuste de tonicidad tales como cloruro de sodio o dextrosa. El pH puede ajustarse con ácidos o bases, tales como ácido clorhídrico o hidróxido de sodio. La preparación parenteral puede ser incluida en ampolletas, jeringas desechables o viales de dosis múltiples hechos de vidrio o plástico.

El término "cantidad terapéuticamente efectiva", como se usa en la presente, se refiere a una cantidad de un agente farmacéutico para tratar, mejorar o prevenir una enfermedad o condición identificada, o para exhibir un efecto inhibidor o terapéutico detectable. El efecto puede detectarse mediante cualquier método de prueba conocido en la técnica. La cantidad efectiva precisa para un sujeto dependerá del peso corporal, estatura y salud del sujeto; la naturaleza y el grado de la condición; y la terapéutica o combinación de terapéuticas seleccionadas para administración. Las cantidades terapéuticamente efectivas para una situación dada pueden determinarse mediante experimentación de rutina que esté dentro de la aptitud y juicio del médico clínico. En un aspecto preferido, la enfermedad o condición que se va a tratar es la infección viral.

Para cualquier compuesto (por ejemplo, el compuesto nanoportado y/o microportado descrito en la presente), la cantidad terapéuticamente efectiva puede estimarse inicialmente en pruebas de cultivo de células, por ejemplo, de células neoplásicas, o en modelos animales, usualmente ratas, ratones, conejos, perros o cerdos. El modelo animal puede usarse también para determinar la escala de concentración y la vía de administración apropiadas. Dicha información puede usarse entonces para determinar dosis y vías útiles para administración en humanos. La eficacia terapéutica/profiláctica y la toxicidad pueden determinarse mediante procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos de células o animales experimentales, por ejemplo, por medio de la ED50 (la dosis terapéuticamente efectiva en 50% de la población) y la LD5o (la dosis letal para 50% de la población). La relación de dosis entre los efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico, y puede expresarse como la relación LD50/ED5o. Se prefieren composiciones farmacéuticas que exhiban grandes índices terapéuticos. La dosificación puede variar dentro de esta escala, dependiendo de la forma de dosificación usada, la sensibilidad del paciente, y la vía de administración.

La dosificación y administración se ajustan para proveer niveles suficientes del/los agente(s) activo(s) o para mantener el efecto deseado. Los factores que pueden tomarse en cuenta incluyen la severidad del estado de enfermedad, la salud general del sujeto, la edad, el peso y el género del sujeto, la dieta, la hora y la frecuencia de administración, las combinaciones de fármacos, las sensibilidades de reacción y la tolerancia/respuesta a la terapia. Pueden administrarse composiciones farmacéuticas de acción duradera cada tres a cuatro días, cada semana, o una vez cada dos semanas, dependiendo de la vida media y la velocidad de depuración de la formulación particular.

Las composiciones farmacéuticas que contienen compuestos activos nanoportados y/o microportados de la presente invención pueden fabricarse en una manera que sea generalmente conocida, por ejemplo, por medio de procedimientos de mezclado, disolución, granulación, fabricación de grageas, levigación, emulsificación, encapsulación, entrampado o liofilización convencionales. Las composiciones farmacéuticas pueden formularse en una manera convencional usando uno o más portadores farmacéuticamente aceptables que comprendan excipientes y/o auxiliares que faciliten el procesamiento de los compuestos activos nanoportados y/o microportados en preparaciones que puedan usarse farmacéuticamente. De hecho, la formulación apropiada depende de la vía de administración elegida.

Las composiciones farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones acuosas estériles (en donde son solubles en agua) o dispersiones y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones inyectables estériles o dispersiones. Para la administración intravenosa, los portadores adecuados incluyen solución salina fisiológica, agua bacteriostática, Cremophor EL™ (BASF, Parsippany, N. J.) o solución salina regulada en su pH con fosfato (PBS). En todos los casos, la composición debe ser estéril y debe ser fluida al grado de que exista fácil aplicación por jeringa. Debe ser estable bajo las condiciones de fabricación y almacenamiento, y debe preservarse contra la acción contaminante de microorganismos tales como bacterias y hongos. El portador puede ser un solvente o medio de dispersión que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido, y similares), y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez apropiada puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión, y mediante el uso de agentes tensoactivos. La prevención de la acción de microorganismos puede lograrse mediante varios agentes antibacterianos y antimicóticos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal, y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol o cloruro de sodio en la composición. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede producirse incluyendo en la composición un agente que retarde la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

Pueden prepararse soluciones inyectables estériles incorporando el compuesto activo nanoportado y/o microportado en la cantidad requerida en un solvente apropiado con un ingrediente o una combinación de los ingredientes enumerados anteriormente, según se requiera, seguido de esterilización filtrada. En general, se preparan dispersiones incorporando el compuesto activo nanoportado y/o microportado en un vehículo estéril que contenga un medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos de preparación son secados al vacío y liofilización que dé un polvo del ingrediente activo más algún ingrediente deseado adicional de una solución previamente filtrada estéril del mismo.

Las composiciones orales incluyen generalmente un diluyente inerte o un portador farmacéuticamente aceptable comestible. Pueden ser incluidas en cápsulas de gelatina o comprimidas en tabletas. Para el propósito de administración terapéutica oral, el compuesto activo nanoportado y/o microportado puede incorporarse con excipientes, y puede usarse en la forma de tabletas, trociscos o cápsulas. Pueden prepararse también composiciones orales usando un portador fluido para su uso como un enjuague bucal, en donde el compuesto en el portador fluido se aplica oralmente y se escupe y se expectora o se traga. Pueden incluirse agentes aglutinantes farmacéuticamente compatibles y/o materiales adyuvantes como parte de la composición. Las tabletas, pildoras, cápsulas, trociscos y similares pueden contener cualquiera de los siguientes ingredientes, o compuestos de una naturaleza similar: un aglutinante tal como celulosa microcristalina, goma de tragacanto o gelatina; un excipiente tal como almidón o lactosa, un agente de desintegración tal como ácido algínico, Primogel o almidón de maíz; un lubricante tal como estearato de magnesio o Sterotes; un agente de deslizamiento tal como dióxido de silicio coloidal; un agente edulcorante tal como sacarosa o sacarina; o un agente saborizante tal como menta, salicilato de metilo o saborizante de naranja.

Para la administración por inhalación, los compuestos nanoportados y/o microportados se suministran en la forma de un rocío en aerosol a partir de un contenedor o dispensador sometido a presión, el cual contiene un propelente adecuado, por ejemplo, un gas tal como dióxido de carbono, o un nebulizador.

La administración sistémica puede ser también por medios transmucosos o transdérmicos. Para la administración transmucosa o transdérmica, los penetrantes apropiados para la barrera que se va a permear se usan en la formulación. Dichos penetrantes se conocen generalmente en la técnica e incluyen, por ejemplo, para administración transmucosa, detergentes, sales biliares y derivados de ácido fusídico. La administración transmucosa puede lograrse a través del uso de rocíos nasales o supositorios. Para la administración transdérmica, los compuestos activos nanoportados y/o microportados se formulan en ungüentos, bálsamos, geles o cremas, como es sabido generalmente en la técnica.

Las composiciones farmacéuticas de los compuestos activos nanoportados y/o microportados pueden prepararse con portadores farmacéuticamente aceptables que protegerán al compuesto contra la eliminación rápida del cuerpo, tal como una formulación de liberación controlada, que incluye implantes y sistemas de suministro microencapsulados. Pueden usarse polímeros biodegradables biocompatibles, tales como acetato etilenvinílico, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres y ácido poliláctico. Los métodos para la preparación de dichas formulaciones serán evidentes para los expertos en la técnica. Los materiales pueden obtenerse también comercialmente de Alza Corporation y Nova Pharmaceuticals, Inc.

Es especialmente ventajoso formular composiciones orales o parenterales en forma unitaria de dosificación para facilidad de administración y uniformidad de dosificación. La forma unitaria de dosificación, como se usa en la presente, se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosificaciones unitarias para el sujeto que se va a tratar; cada unidad conteniendo una cantidad predeterminada de compuesto activo nanoportado y/o microportado calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el portador farmacéutico requerido. La especificación para las formas unitarias de dosificación de la invención es determinada por, y depende directamente de, las características únicas del compuesto activo nanoportado y/o microportado y el efecto terapéutico particular que se va a lograr.

Las composiciones farmacéuticas pueden incluirse en un contenedor, empaque o dispensador junto con instrucciones para su administración.

Los compuestos de jasmonato usados para la composición de la presente invención incluyen sus sales. Todas estas formas se contemplan también dentro del alcance de la invención reclamada.

Como se usa en la presente, el término "sales farmacéuticamente aceptables" se refiere a derivados de los compuestos de la presente invención, en donde el compuesto precursor es modificado preparando sales de ácido o base del mismo. Ejemplos de sales farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no están limitados a, sales minerales o de ácidos orgánicos de residuos básicos tales como aminas, sales alcalinas o sales orgánicas de residuos ácidos tales como ácidos carboxílicos, y similares. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las sales no tóxicas convencionales o las sales de amonio cuaternario del compuesto precursor formado, por ejemplo, a partir de ácidos orgánicos o inorgánicos no tóxicos. Por ejemplo, dichas sales no tóxicas convencionales incluyen, pero no están limitadas a, aquellas derivadas de ácidos orgánicos e inorgánicos seleccionados de los ácidos 2-acetoxibenzoico, 2-hidroxietansulfónico, acético, ascórbico, bencensulfónico, benzoico, bicarbónico, carbónico, cítrico, edético, etandisulfónico, 1,2-etansulfónico, fumárico, glucoheptónico, glucónico, glutámico, glicólico, glicolilarsanílico, hexilresorcínico, hidrabámico, bromhídrico, clorhídrico, yodhídrico, hidroximaleico, hidroxinaftoico, isetiónico, láctico, lactobiónico, lauril sulfónico, maleico, málico, mandélico, metansulfónico, napsílico, nítrico, oxálico, pamoico, pantoténico, fenilacético, fosfórico, poligalacturónico, propiónico, salicílico, esteárico, subacético, succínico, sulfámico, sulfanílico, sulfúrico, tánico, tartárico, toluensulfónico, y los aminoácidos de ocurrencia común, por ejemplo, glicina, alanina, fenilalanina, arginina, etc.

Otros ejemplos de sales farmacéuticamente aceptables incluyen ácido hexanoico, ácido ciclopentanpropiónico, ácido pirúvico, ácido malónico, ácido 3-(4-hidroxibenzoil)benzoico, ácido cinámico, ácido 4-clorobencensulfónico, ácido 2-naftalensulfónico, ácido 4-toluensulfónico, ácido alcanforsulfónico, ácido 4-metilbiciclo-[2.2.2]-oct-2-en-1-carboxíl¡co, ácido 3-fenilpropiónico, ácido trimetilacético, ácido butilacético terciario, ácido mucónico, y similares. La presente invención abarca también sales formadas cuando un protón ácido presente en el compuesto precursor es reemplazado por un ión de metal, por ejemplo, un ión de metal alcalino, un ión de metal alcalinotérreo o un ión de aluminio; o se coordina con una base orgánica tal como etanolamina, dietanolamina, trietanolamina, trometamina, N-metilglucamina, dietilamina, dietilaminoetanol, etilendiamina, imidazol, lisina, arginina, morfolina, 2-hidroxietilmorfolina, dibenciletilendiamina, trimetilamina, piperidina, pirrolidina, bencilamina, hidróxido de tetrametilamonio, y similares.

Debe entenderse que todas las referencias a sales farmacéuticamente aceptables incluyen formas de adición de solvente (solvatos) o formas de cristal (polimorfos) como se define en la presente, de la misma sal.

Los compuestos de jasmonato usados en la composición farmacéutica de la presente invención pueden prepararse también como ésteres, por ejemplo, ésteres farmacéuticamente aceptables. Por ejemplo, un grupo de la función ácido carboxílico en un compuesto puede ser convertido hasta su éster correspondiente, por ejemplo, un éster de metilo, etilo u otro éster. Asimismo, un grupo alcohol en un compuesto puede ser convertido hasta su éster correspondiente, por ejemplo, un acetato, propionato u otro éster.

Los compuestos de jasmonato usados en la composición farmacéutica de la presente invención pueden prepararse también como profármacos, por ejemplo, profármacos farmacéuticamente aceptables. Los términos "pro-fármaco" y "profármaco" se usan recíprocamente en la presente, y se refieren a cualquier compuesto que libera un fármaco precursor activo in vivo. Dichos profármacos son conocidos por mejorar numerosas cualidades deseables de las formulaciones farmacéuticas (por ejemplo, solubilidad, biodisponibilidad, fabricación, etc.), y los compuestos nanoportados y/o microportados de la presente invención pueden suministrarse en forma de profármaco. De esta manera, se pretende que la presente invención abarque los profármacos de los compuestos actualmente reclamados, métodos de suministro de los mismos y composiciones que contienen los mismos. Se pretende que el término "profármaco" incluya cualquier portador unido covalentemente que libere un fármaco precursor activo de la presente invención in vivo cuando dicho profármaco se administra a un sujeto. Los profármacos en la presente invención se preparan modificando grupos funcionales presentes en el compuesto de tal manera que las modificaciones son separadas, ya sea en manipulación de rutina o in vivo, hasta el compuesto precursor. Los profármacos incluyen compuestos de la presente invención, en donde un grupo hidroxi, amino, sulfhidrilo, carboxi o carbonilo es unido a cualquier grupo que pueda ser separado in vivo para formar un grupo hidroxilo libre, amino libre, sulfhidrilo libre, carboxi libre o carbonilo libre, respectivamente.

Ejemplos de profármacos incluyen, pero no están limitados a, ésteres (por ejemplo, acetato, dialquilaminoacetatos, formiatos, fosfatos, sulfates y derivados de benzoato) y carbamatos (por ejemplo, N,N-dimetilaminocarbonilo) de grupos funcionales hidroxi, ésteres (por ejemplo, ésteres de etilo, ésteres de morfolinoetanol) de grupos funcionales carboxilo, derivados de N-acilo (por ejemplo, N-acetilo), bases de N-Mannich, bases de Schiff y enaminonas de grupos funcionales amino, oximas, acétales, cetales y ésteres de enol de grupos funcionales cetona y aldehido en compuestos de la invención, y similares. Véase Bundegaard, H., Design of Prodrugs, p. 1-92, Elsevier, New York-Oxford (1985).

Los compuestos de jasmonato usados en la composición farmacéutica de la presente invención pueden ser también sus metabolitos, tales como metabolitos obtenidos de la catálisis ácida y/o básica, por ejemplo, ácido cis-jasmónico, ácido trans-jasmónico, cis-jasmonatos de hidroximetilo, trans-jasmonatos de hidroximetilo, ácidos cis-jasmónicos de hidroxilo, ácidos trans-jasmónicos de hidroxilo, lactonas obtenidas a partir de transesterificación, y similares; metabolitos obtenidos de reacciones oxidativas, por ejemplo, cis-jasmonatos de cetometilo, trans-jasmonatos de cetometilo, cis-jasmonatos de hidroximetilo, trans-jasmonatos de hidroximetilo, dioles obtenidos de reacciones oxidativas, estereoisómeros (por ejemplo, enantiómeros o diastereoisómeros) obtenidos de reacciones oxidativas, epóxidos obtenidos de reacciones oxidativas, y lactonas obtenidas de reacciones oxidativas; productos de deshidratación de jasmonato de metilo, ácido jasmónico y jasmonato de dihidrometilo; y metabolitos formados a través de procesos intracelulares, tales como fosforilación (por ejemplo, por medio de cinasa) o cualquier otra reacción con receptores (tal como el receptor AKR2 y receptores acoplados a proteína G) e interacciones con organelos de la célula. Ejemplos de metabolitos de MDJ incluyen, pero no están limitados a, jasmonato de metilo, cucurbato de metilo, 7-iso-jasmonato de metilo, 2,3-didehidro-MDJ, 3,4-didehidro-MDJ, 3,7-didehidro-MDJ, 4,5-didehidro-MDJ, 12-hidroxi-MDJ, 1-hidroxi-MDJ, 8-hidroxi- DJ, tuberonato de metilo, 12-0-glucosil-MDJ, 11-O-glucosil-MDJ, 12-O-glucosil-MJ, 11-O-glucosil-MJ, 7,8-didehidro-MDJ, cis-jasmona, dihidrojasmona, salicilato de metilo y ácido abscísico.

Además o en forma alternativa, otros compuestos relacionados con el jasmonato pueden usarse en la composición farmacéutica de la presente invención, tales como aquellos formados de compuestos basados en ciclopentanona o ciclopentenona derivados de ácido linolénico (LA). Véase, por ejemplo, Annals ofBotany 100: 681-697, 2007; y Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1997. 48: 355-81.

La composición farmacéutica que incluye los compuestos de jasmonato nanoportados y/o microportados, o sales, ésteres, profármacos o metabolitos farmacéuticamente aceptables de los mismos, se administran por medio de las vías oral, nasal, transdérmica, pulmonar, por inhalación, bucal, sublingual, intraperitoneal, subcutánea, intramuscular, intravenosa, rectal, intrapleural, intratecal y parenteral. En una modalidad, la composición es una composición inyectable. El experto en la técnica reconocerá las ventajas de ciertas vías de administración.

El régimen de dosificación se selecciona de acuerdo con una variedad de factores que incluyen el tipo, la especie, la edad, el peso, el sexo y la condición médica del paciente; la severidad de la condición que se va a tratar; la vía de administración; la función renal y hepática del paciente; y el compuesto particular o sal del mismo usada. El médico o veterinario experto puede fácilmente determinar y prescribir la cantidad efectiva del fármaco que se requiere para prevenir, contrarrestar o detener el progreso de la condición. El régimen de dosificación que puede usarse en los métodos de la invención incluye, pero no está limitado a, diariamente, tres veces por semana (intermitente), dos veces por semana, semanalmente o cada 14 días. En ciertas modalidades, el régimen de dosificación incluye, pero no está limitado a, dosificación mensual o dosificación cada 6 a 8 semanas. En ciertas modalidades, la dosificación varía durante el período de tratamiento. Por ejemplo, una alta concentración de un compuesto de jasmonato (por ejemplo, MDJ) en nanoportadores/microportadores, que varía de 1 mM a 1 M (por ejemplo, 1-1000 mM, 1-900 mM, 1-800 mM, 1-700 mM, 1-600 mM, 1-500 mM, 1-400 mM, 1-300 mM, 1-200 mM, 1-100 mM, 1-50 mM, 1-40 mM, 1-30 mM, 1-20 mM, 1-10 mM, 100 mM a 1 M), puede administrarse en los primeros 3 a 7 días antes de que se administre una concentración menor del compuesto nanoportado/microportado (por ejemplo, de 100 µ? a 5 mM, 100 µ? a 4 mM, 100 µ? a 3 mM, 100 µ? a 2 mM, 100 µ? a 1 mM, 0.01 mM a aproximadamente 2 mM, ó aproximadamente 1 mM, 10 µ? a 5 mM, 10 µ? a 4 mM, 10 µ? a 3 mM ó 10 µ? a 2 mM). En otra modalidad, cuando la composición se usa para el tratamiento de un tumor sólido, la concentración de un compuesto de jasmonato (por ejemplo, MDJ) incluido en la presente varía de 1 nM a 1 M (por ejemplo, 1 nM a 0.5 M, 1 nM a 0.1 M, 1 nM a 50 mM, 1 nM a 10 mM, 1 nM a 5 mM, 10 nM a 1M, ó 1 nM a aproximadamente 1 mM, ó 1 µ? a 1 M, ó 1-1000 nM, 1-500 nM, 1-250 nM, aproximadamente 1-100 nM, 1-50 nM, 1-10 nM ó 1-5 nM) para el tratamiento de cáncer. Este régimen de dosificación puede ser más efectivo en el tratamiento de cierto tipo de cáncer (por ejemplo, leucemia) que los otros. En forma alternativa, puede administrarse una baja dosis seguida primero por una alta dosis de los jasmonatos nanoportados/microportados.

Pueden encontrarse técnicas para la formulación y administración de los compuestos nanoportados y/o microportados descritos de la invención en Remington: the Science and Practice of Pharmacy, decimonovena edición, Mack Publishing Co., Easton, PA (1995). En una modalidad, los compuestos nanoportados y/o microportados descritos en la presente, y las sales, profármacos, metabolitos o ésteres farmacéuticamente aceptables de los mismos, se usan en preparaciones farmacéuticas en combinación con un excipiente, solvente o diluyente farmacéuticamente aceptable. Los excipientes farmacéuticamente aceptables adecuados incluyen llenadores sólidos inertes o diluyentes y soluciones orgánicas o acuosas estériles. Los compuestos nanoportados y/o microportados estarán presentes en dichas composiciones farmacéuticas en cantidades suficientes para proveer la cantidad de dosificación deseada en la escala descrita en la presente.

Métodos para la síntesis de iasmonatos nanoportados o microportados Los compuestos de jasmonato nanoportados o microportados y las composiciones de los mismos descritos en la presente, pueden prepararse con las técnicas conocidas en la materia o los métodos descritos en la presente.

Por ejemplo, cuando se usa ciclodextrina como el nanoportador, los compuestos nanoportados de la invención pueden prepararse mezclando un compuesto de jasmonato de interés con ciclodextrinas en una solución adecuada (por ejemplo, una solución acuosa), de preferencia a temperatura elevada. En modalidades de la presente invención, los nanoportadores o microportadores como se forman contienen aproximadamente 1-100 moles (por ejemplo, 1-90 moles, 1-80 moles, 1-70 moles, 1-60 moles, 1-50 moles, 1- 40 moles, 1-30 moles, 1-20 moles, 1-10 moles ó 1-5 moles) del compuesto de jasmonato por mol de la ciclodextrina. Descripciones más detalladas pueden encontrarse, por ejemplo, en los documentos US 2008/044364, EP392608 y WO2007/145663. Pueden formarse microportadores de ciclodextrina de grupos de nanoportadores de ciclodextrina.

Respecto a otro ejemplo, cuando se usa una LDE (o un liposoma) como nanoportadores o microportadores, los compuestos nanoportados o microportados de la invención pueden prepararse incubando un compuesto de jasmonato de interés en LDEs (o liposomas) preformados en una solución adecuada (por ejemplo, una solución acuosa) a una temperatura abajo de la temperatura ambiente (por ejemplo, aproximadamente 4°C), y dializando entonces la emulsión resultante con un regulador de pH adecuado para obtener el compuesto de jasmonato portado por LDE (o portado por liposomas) deseado. En modalidades de la presente invención, los nanoportadores o microportadores como se forman contienen aproximadamente 1-100 moles (por ejemplo, 1-90 moles, 1-80 moles, 1-70 moles, 1-60 moles, 1-50 moles, 1-40 moles, 1-30 moles, 1-20 moles, 1-10 moles, ó 1-5 moles) del compuesto de jasmonato por mol de LDE (o liposoma).

En una modalidad, se preparan nanoportadores de LDE como sigue. Una mezcla de lípidos que consiste de fosfatidilcolina (por ejemplo, 40 mg), oleato de colesterilo (por ejemplo, 20 mg), trioleína (por ejemplo, 1 mg) y colesterol (por ejemplo, 0.5 mg), se seca primero al vacío por 16 horas a 4°C.

Una emulsión de los lípidos se prepara entonces en Tris-HCI 0.01 M, pH 8.0 mediante irradiación ultrasónica, por ejemplo, usando un equipo Branson, modelo 450A (Ultrasound Arruda, Sao Paulo, Brasil) 125 watts de potencia por 3 horas, bajo una atmósfera de nitrógeno, con temperaturas que varían entre 51 y 55°C. Para obtener la LDE en la escala de diámetro o escala de tamaño deseada para la encapsulación de MDJ, la emulsión se purifica en dos pasos de centrifugación (por ejemplo, ultracentrífuga, Beckman rotor SW-41). En el primer paso, la fracción del tubo superior, que resulta de la centrifugación a 200,000 g por 30 minutos a 4°C, se remueve mediante aspiración (1 mL) y se desecha. En la suspensión restante se añade entonces bromuro de potasio (KBr) para ajusfar la densidad hasta 1.21 g/mL. Después de la segunda centrifugación (200,000 xg por 2 horas a 4°C), la LDE se recuperará en la parte superior del tubo a través de aspiración. El exceso de KBr se remueve mediante diálisis contra dos cambios de 1000 volúmenes de Tris HCI 0.01 M, pH 8. Por último, la emulsión se esteriliza mediante filtración en membrana Millipore con porosidad de 0.22 mm en flujo laminar, y se almacena a 4°C por hasta 30 días. El tamaño de las partículas de LDE en suspensión puede determinarse por medio de dispersión de luz y mediciones de microscopía. El potencial de superficie de las partículas de LDE en suspensión puede medirse en un equipo analizador potencial zeta ZetaPALS (Brookhaven Instruments Corporation) (Lima & Maranhao, 2004).

En una modalidad, la incorporación de un compuesto de jasmonato (por ejemplo, MDJ) en portadores de LDE, se lleva a cabo como sigue. Una solución de MDJ en 50 mL de etanol se añade a una emulsión de LDE de 500 mL (tal como la preparada anteriormente), para obtener una mezcla con una concentración de 3 mg de MDJ por 1 mL. La mezcla se agita a temperatura ambiente por 15 minutos, y entonces se incuba a 4°C por 72 horas. La mezcla incubada se dializa entonces dos veces contra un regulador de pH estéril de 200 mL (por ejemplo, Tris-HCI, 0.01 M). La emulsión dializada puede analizarse entonces usando GC-MS para determinar la cantidad de MDJ encapsulado en, o acoplado con, los portadores de LDE.

En ciertas modalidades, la nanoemulsión de la invención se forma de, además del compuesto de jasmonato, uno o más ingredientes seleccionados de un polímero, tal como un polímero de poli(8-caprolactona) o PCL con un peso molecular promedio de 65,000, citral, fosforiletanolamina, monoestearato de sorbitán (Span®60) y polisorbato 80 (Tween®80). La emulsión puede prepararse por medio de un método similar al descrito por Fessi et al., Drug Des Deliv 4(4): 295-302 (1989). En resumen, se obtiene una emulsión de aceite/agua (O W) mediante la agitación vigorosa del aceite (por ejemplo, 10.0 g), y los compuestos activos (por ejemplo, MDJ) solos o en una mezcla que varía de 0.05 a 0.50 g (constituyentes internos contenidos dentro del portador) en agua (por ejemplo, 400mL) usando un homogeneizador Ultra-Turrax (IKA T10 basic Ultra-turrax®, Ika-Werke, Staufen, Alemania) a, por ejemplo, 15,000rpm por, por ejemplo, 1 minuto. Entonces, una solución orgánica que se prepara, por ejemplo, disolviendo un polímero (por ejemplo, PCL, entre 0.2 y 2.0 g) en acetona (400 mL), se vierte bajo agitación magnética moderada, en la emulsión de O W usando una bomba peristáltica a 10% (PumpPro TPM 600 55 RPM, Waton-Marlow, Wilmington, Reino Unido). Después de 10 minutos de agitación, una solución acuosa preparada, por ejemplo, disolviendo 1.0 g de Tween®80 en agua (200 mL), se vierte también bajo agitación magnética moderada en la fase de emulsión. De nuevo, se usa una bomba peristáltica a, por ejemplo, 10%. Después de que concluye la adición, la mezcla de reacción puede agitarse adicionalmente por, por ejemplo, 10 minutos. En el último paso, el solvente orgánico se remueve y el volumen de la nanoemulsión se concentra hasta, por ejemplo, 500 mL bajo presión reducida (usando, por ejemplo, un rotavapor tal como R-21 , Büchi, Suiza). El segundo paso, es decir, la adición de la solución de polímero a la emulsión, es opcional.

Los métodos que se usan para caracterizar a los compuestos nanoportados y/o microportados incluyen la relación cualitativa de análisis de la estructura teórica (QSAR) aplicada con el software HYPERCHEM usando un procedimiento semi-empírico. En este sentido, QSAR se usa para estimar la estabilidad de los compuestos nanoportados formados de ácido jasmónico o de dihidrojasmonato de metilo y ciclodextrinas (CDs) nativas. En una modalidad, el cálculo se lleva a cabo con el método semi-empírico AM1 usando un gradiente conjugado de Polak-Rabiere con rms de 0.1 kcal (angstroms.mol)"1.

Cualitativamente, la medición de ?? (=Eun¡ón) refleja la más baja de la energía total del sistema cuando ocurre la formación del compuesto nanoportado y/o microportado (es decir, la asociación o el acoplamiento entre los nanoportadores/microportadores y un compuesto de jasmonato).

Por lo tanto, la estabilidad de la reacción representada por Eun¡ón puede estimarse a partir de la diferencia entre la energía del compuesto nanoportado y/o microportado como se forma, y la energía total de los nanoportadores/microportadores y los compuestos.

El cuadro 1 siguiente muestra los resultados del cálculo de Eun¡ón para la asociación entre el ácido jasmónico o el dihidrojasmonato de metilo y las CDs nativas.

CUADR0 1 Resultado de la ?? de estabilización Ácido jasmónico-a-CD -9.63 Ácido jasmónico- -CD -19.64 Ácido jasmónico-y-CD -2.02 Dihidrojasmonato de metilo-a-CD 8.44 Dihidrojasmonato de metilo- -CD -31.35 Dihidrojasmonato de metilo-y-CD -18.23 Como se demuestra en el cuadro 1 , salvo el complejo entre a-CD y el dihidrojasmonato de metilo, todos los demás compuestos nanoportados son estables. Asimismo, la asociación entre el compuesto de jasmonato y ß-CD produce los compuestos nanoportados más estables.

Métodos de tratamiento La presente invención provee métodos para el tratamiento de un trastorno, cuyo curso es influenciado por la angiogénesis anormal (o un "trastorno relacionado con la angiogénesis"). El método incluye administrar a un sujeto que necesita de dicho tratamiento, una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto nanoportado y/o microportado de la presente invención, o una sal, profármaco, metabolito, solvato o estereoisómero farmacéuticamente aceptable del mismo.

Como se usa en la presente, un "sujeto que necesita del mismo", es un sujeto que tiene un trastorno en el cual la angiogénesis anormal desempeña una función, o un sujeto que tiene un riesgo incrementado de que desarrolle dicho trastorno respecto a la población sin restricciones. Un sujeto que necesita del mismo puede tener una condición precancerosa. De preferencia, un sujeto que necesita del mismo tiene cáncer. Un "sujeto" incluye un mamífero. El mamífero puede ser, por ejemplo, cualquier mamífero, por ejemplo, un humano, primate, ave, ratón, rata, ave de corral, perro, gato, vaca, caballo, cabra, camello, oveja o un cerdo. De preferencia, el mamífero es un humano.

Un ejemplo de trastorno relacionado con la angiogénesis es el cáncer. Como se usa en la presente, el término "cáncer" incluye tumores sólidos así como malignidades y/o tumores hematológicos. Ejemplos de cánceres incluyen, pero no están limitados a, carcinoma adrenocortical, cáncer relacionado con SIDA, linfoma relacionado con SIDA, cáncer anal, cáncer anorrectal, cáncer del conducto anal, cáncer del apéndice, astrocitoma cerebelar de la niñez, astrocitoma cerebral de la niñez, carcinoma de células básales, cáncer de piel (no melanoma), cáncer biliar, cáncer extrahepático de conductos biliares, cáncer intrahepático de conductos biliares, cáncer de vejiga, cáncer de vejiga urinaria, cáncer de huesos y articulaciones, osteosarcoma e histiocitoma fibroso maligno, cáncer de cerebro, tumor de cerebro, glioma del tallo cerebral, astrocitoma cerebelar, astrocitoma cerebral/glioma maligno, ependimoma, meduloblastoma, tumores neuroectodérmicos primitivos supratentoriales, glioma hipotalámico y de la vía visual, cáncer de mama, adenomas/carcinoides bronquiales, tumor carcinoide, cáncer gastrointestinal, cáncer del sistema nervioso, linfoma del sistema nervioso, cáncer del sistema nervioso central, linfoma del sistema nervioso central, cáncer cervical, cánceres de la niñez, leucemia linfocítica crónica, leucemia mielógena crónica, trastornos mieloproliferativos crónicos, cáncer de colon, cáncer colorrectal, linfoma cutáneo de células T, neoplasma linfoide, micosis fungoides, síndrome de Sézary, cáncer endometrial, cáncer esofágico, tumor extracraneal de células germinales, tumor extragonadal de células germinales, cáncer extrahepático de conductos biliares, cáncer ocular, melanoma infraocular, retinoblastoma, cáncer de vesícula biliar, cáncer gástrico (estómago), tumor carcinoide gastrointestinal, tumor estromático gastrointestinal (GIST), tumor de células germinales, tumor ovárico de células germinales, tumor trofoblástico gestacional, glioma, cáncer de cabeza y cuello, cáncer hepatocelular (hígado), linfoma de Hodgkin, cáncer hipofaríngeo, melanoma infraocular, cáncer ocular, tumores de las células de los islotes (páncreas endocrino), sarcoma de Kaposi, cáncer de riñón, cáncer renal, cáncer laríngeo, leucemia linfoblástica aguda, leucemia mieloide aguda, leucemia linfocítica crónica, leucemia mielógena crónica, leucemia de células pilosas, cáncer de labio y la cavidad oral, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, cáncer pulmonar de células no pequeñas, cáncer pulmonar de células pequeñas, linfoma relacionado con SIDA, linfoma no de Hodgkin, linfoma primario del sistema nervioso central, macroglobulinemia de Waldenstram, meduloblastoma, melanoma, melanoma intraocular (ojo), carcinoma de células de Merkel, mesotelioma, mesotelioma maligno, cáncer escamoso metastásico de cuello, cáncer de la boca, cáncer de la lengua, síndrome de neoplasia endocrina múltiple, micosis fungoides, síndromes mielodisplásicos, enfermedades mielodisplásicas/mieloproliferativas, leucemia mielógena crónica, leucemia mieloide aguda, mieloma múltiple, trastornos mieloproliferativos crónicos, cáncer nasofaríngeo, neuroblastoma, cáncer oral, cáncer de la cavidad oral, cáncer orofaríngeo, cáncer de ovario, cáncer epitelial ovárico, tumor ovárico de bajo potencial maligno, cáncer pancreático, cáncer de las células de los islotes pancreáticos, cáncer de la cavidad nasal y del seno paranasal, cáncer de paratiroides, cáncer de pene, cáncer faríngeo, feocromocitoma, pineoblastoma y tumores neuroectodérmicos primitivos supratentoriales, tumor de pituitaria, mieloma múltiple/neoplasma de células plasmáticas, blastema pleuropulmonar, cáncer de próstata (carcinoma de próstata o adenocarcinoma de próstata, incluyendo cáncer de próstata resistente a fármacos múltiples), cáncer rectal, cáncer del uréter y la pelvis renal, cáncer de las células de transición, retinoblastoma, rabdomiosarcoma, cáncer de las glándulas salivales, familia de sarcomas de Ewing, sarcoma de Kaposi, sarcoma de tejidos blandos, cáncer uterino, sarcoma uterino, cáncer de piel (no melanoma), cáncer de piel (melanoma), carcinoma de piel de células de Merkel, cáncer del intestino delgado, sarcoma de tejidos blandos, carcinoma escamocelular, cáncer de estómago (gástrico), tumores neuroectodérmicos primitivos supratentoriales, cáncer testicular, cáncer de garganta, timoma, timoma y carcinoma tímico, cáncer de tiroides, cáncer de células de transición de la pelvis renal y el uréter y otros órganos urinarios, tumor trofoblástico gestacional, cáncer uretral, cáncer uterino endometrial, sarcoma uterino, cáncer del cuerpo uterino, cáncer vaginal, cáncer vulvar y tumor de Wilm.

Otros ejemplos de trastornos relacionados con la angiogénesis incluyen enfermedades oculares (por ejemplo, degeneración macular relacionada con la edad o trastornos relacionados con la angiogénesis del segmento posterior del ojo), enfermedades cardiovasculares (por ejemplo, aterosclerosis), inflamación crónica (por ejemplo, artritis reumatoide o enfermedad de Crohn), diabetes (por ejemplo, retinopatía diabética), psoriasis, endometriosis y adiposidad. Véase, por ejemplo, Pharmacological Reviews 52: 237-268, 2001.

La presente invención provee métodos para el tratamiento de un trastorno relacionado con NF-??, tales como una infección por virus, bacterias u hongos. El método incluye administrar a un sujeto que necesita de dicho tratamiento, una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto nanoportado y/o microportado de la presente invención, o una sal, profármaco, metabolito, solvato o estereoisómero farmacéuticamente aceptable del mismo.

Como se usa en la presente, el término "tratamiento" o "tratar" describe el manejo y cuidado de un paciente con el propósito de combatir una enfermedad, condición o trastorno, e incluye la administración de un compuesto nanoportado y/o microportado de la presente invención, o una sal, profármaco, metabolito o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo, para aliviar los síntomas o las complicaciones de una enfermedad, condición o trastorno, o para eliminar la enfermedad, condición o trastorno.

Un compuesto nanoportado y/o microportado de la presente invención, o una sal, profármaco, metabolito o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo, puede usarse también para prevenir una enfermedad, condición o trastorno. Como se usa en la presente, el término "prevención" o "prevenir" describe reducir o eliminar el inicio de los síntomas o complicaciones de la enfermedad, condición o trastorno.

Como se usa en la presente, el término "aliviar" se usa para describir un proceso por el cual la severidad de un signo o síntoma de un trastorno se reduce. De modo importante, un signo o síntoma puede ser aliviado sin que sea eliminado. En una modalidad preferida, la administración de las composiciones farmacéuticas de la invención lleva a la eliminación de un signo o síntoma; sin embargo, no se requiere la eliminación. Se espera que las dosificaciones efectivas disminuyan la severidad de un signo o síntoma. Por ejemplo, un signo o síntoma de un trastorno tal como cáncer, el cual puede ocurrir en sitios múltiples es aliviado, si la severidad del cáncer es disminuida dentro de por lo menos uno de los sitios múltiples.

Todas las patentes, solicitudes de patente y publicaciones mencionadas en la presente, se incorporan de esta manera en su totalidad en la presente como referencia. Sin embargo, en donde una patente, solicitud de patente o publicación que contenga definiciones explícitas se incorpora en la presente como referencia, debe entenderse que esas definiciones explícitas se aplican a la patente, solicitud de patente o publicación incorporada en la cual se encuentran, y no al resto del texto de esta solicitud, en particular las reivindicaciones de esta solicitud.

Se entenderá que mientras que la invención se ha descrito en conjunto con las modalidades específicas preferidas de la misma, se pretende que la descripción anterior, así como los ejemplos siguientes, ilustren y no limiten el alcance de la invención. Los expertos en la técnica entenderán que pueden hacerse varios cambios, y que pueden sustituirse con equivalentes sin que se aparten del alcance de la invención, y además que otros aspectos, ventajas y modificaciones serán evidentes para los expertos en la técnica a la cual la invención pertenece.

Todos los porcentajes y relaciones usados en la presente, a menos que se indique de otra manera, son en peso. Otras características y ventajas de la presente invención son evidentes a partir de los diferentes ejemplos. Los ejemplos provistos ilustran diferentes componentes y metodología útiles para poner en práctica la presente invención. Los ejemplos no limitan la invención reclamada. Con base en la presente descripción, el experto en la técnica puede identificar y usar otros componentes y metodología útiles para poner en práctica la presente invención.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 Síntesis de MDJ portado por LDE Una mezcla de lípidos que consiste de 40 mg de fosfatidilcolina, 20 mg de oleato de colesterol, 1 mg de trioleína y 0.5 mg de colesterol, se secó primero al vacío por 16 horas a 4°C. Una emulsión de los lípidos se preparó entonces en Tris-HCI 0.01 M, pH 8.0 mediante irradiación ultrasónica, usando un equipo Branson, modelo 450A (Ultrasound Arruda, Sao Paulo, Brasil) a 125 watts de potencia por 3 horas, bajo una atmósfera de nitrógeno, con temperaturas que variaban entre 51 y 55°C. Para obtener la LDE en la escala de diámetro o escala de tamaño deseada para la encapsulación de MDJ, la emulsión se purificó en dos pasos de centrifugación (por ejemplo, ultracentrífuga, Beckman rotor SW-41). En el primer paso, la fracción del tubo superior, que resulta de la centrifugación a 200,000 g por 30 minutos a 4°C, se removió mediante aspiración (1 mL) y se desechó. En la suspensión restante se añadió entonces bromuro de potasio (KBr) para ajusfar la densidad hasta 1.21 g/mL. Después de la segunda centrifugación (200,000 xg por 2 horas a 4°C), la LDE se colectó de la fracción superior del tubo a través de aspiración. El exceso de KBr se removió mediante diálisis contra dos cambios de 1000 volúmenes de Tris HCI 0.01 M, pH 8. Por último, la emulsión se esterilizó mediante filtración en membrana Millipore con porosidad de 0.22 mm en flujo laminar, y se almacenó a 4°C por hasta 30 días. Se determinó que el tamaño de las partículas de LDE en suspensión por medio de dispersión de luz y mediciones de microscopía es de 29-400 nm. Se determinó que el potencial de superficie de las partículas de LDE en suspensión en un equipo analizador potencial zeta ZetaPALS (Brookhaven Instruments Corporation) (Lima & Maranhao, 2004) estaría entre -5.43 mV y -7.42 mV, aproximadamente.

Una solución de MDJ en 50 mL de etanol se añadió en 500 mL de la emulsión de LDE preparada anteriormente, para obtener una mezcla con una concentración de 3 mg de MDJ por 1 mL. La mezcla se agitó a temperatura ambiente por 15 minutos, y entonces se incubó a 4°C por 72 horas. La mezcla incubada se dial izó entonces dos veces contra un regulador de pH estéril de 200 mL de Tris-HCI 0.01 M. La emulsión dializada se analizó usando GC-MS para determinar la cantidad de MDJ encapsulado en, o acoplado con, los portadores de LDE. Se determinó que la relación molar de LDE a MDJ está entre 1/10 y 1/5.

EJEMPLO 2 Síntesis de MDJ portado por liposomas de fosfatidilcolina de soya v MDJ portado por polímero MDJ portado por liposomas En un frasco transparente con una tapa, se añadieron cantidades adecuadas del agente tensoactivo no iónico aceite de ricino-polioxietileno-40 hidrogenado (ORPH) (EUMULGIN ® HRE 40) y fosfatidilcolina de soya (FS) (Epikuron ® 200), con una relación molar de 1 :1 de ORPH/FS. Se añadieron entonces oleato de sodio y colesterol con una relación molar de 1 :1 con base en una relación molar de 1 :5 de oleato de sodio/ORPH. La mezcla resultante se filtró a través de una membrana de 0.22 pm. La solución filtrada se añadió en un frasco estéril, entonces se añadió MDJ (96%, adquirido de Sigma-Aldrich) hasta alcanzar una concentración de 10mg por 1 mL de la nanoemulsión resultante (esta cantidad podría variar de 7 mg a 21 mg de MDJ por 1 mL de la nanoemulsión). La nanoemulsión homogeneizada se generó por medio de agitación por acción de remolino alternando con un período de descanso. En particular, la mezcla en el frasco estéril se sónico usando el procesador de líquidos ultrasónico Sonic ® (modelo XL2020TM 220 watts), operado en una manera discontinua, por 20 minutos a temperatura ambiente. Después de la sonicación, la nanoemulsión se centrifugó a 10,000 rpm por 15 minutos para disponer del desecho liberado del sonicador de varilla de titanio. La mezcla resultante se dializó contra un regulador de pH de Tris-HCI, pH 7.2 (fase acuosa). Se determinó que el tamaño de los liposomas de la nanoemulsión es de 50-500 nm. Se determinó también que la relación molar de liposoma a MDJ está entre 1/10 y 1/5.

MDJ portado por polímero/citral fosforiletanolamina Poli(e-caprolactona) con peso molecular promedio de 65,000, monoestearato de sorbitán (Span®60) y polisorbato 80 (Tween®80) se obtuvieron de Sigma-Aldrich (St. Louis, USA). Todos los solventes orgánicos usados eran de grado CLAR adquiridos de J. T. Baker (Ecatepec, México). Se produjo agua ultra pura internamente mediante el sistema Milli-Q (18 ?O) (Millipore Corporation, Bedford, MA, USA). Se obtuvieron nanopartículas que contenían citral (3,7-dimetil-2,6-octadienal), fosforiletanolamina y/o jasmonato de metilo como sigue. Primero, se obtuvo una emulsión de aceite/agua (O/W) mediante agitación vigorosa de aceite (10.0 g) y los compuestos activos, solos o en mezcla, variando de 0.05 a 0.50 g (constituyentes internos) en agua (400 mL) usando un homogeneizador Ultra-Turrax (IKA T10 basic Ultra-turrax®, Ika-Werke, Staufen, Alemania) a 15,000 rpm por 1 minuto. En un segundo paso, una solución orgánica que se preparó disolviendo un polímero (entre 0.2 y 2.0 g) en acetona (400 mL) se vertió bajo agitación magnética moderada, en fase en emulsión, usando una bomba peristáltica a 10% (PumpPro TPM 600 55 RPM, Waton-Marlow, Wilmington, Reino Unido). Después de 10 minutos de agitación, una solución acuosa preparada disolviendo 1.0 g de Tween®80 en agua (200 mL) se vertió también bajo agitación magnética moderada en la emulsión. De nuevo, se usó una bomba peristáltica a 10%. Después de la adición completa, la mezcla de reacción se agitó adicionalmente por 10 minutos. En el último paso, el solvente orgánico se removió y el volumen de la dispersión de nanopartículas se concentró hasta 500 ml_ bajo presión reducida (R-21, Büchi, Suiza). La emulsión de O W obtenida en el primer paso era estable incluso sin el polímero. Varias nanoemulsiones diferentes se prepararon y se analizaron, como es el caso de: - nanoemulsión sin polímeros, conteniendo sólo uno de citral, fosforiletanolamina y un compuesto de jasmonato; - nanoemulsión sin polímeros, conteniendo una mezcla de dos cualquiera de citral, fosforiletanolamina y un compuesto de jasmonato; - nanoemulsión sin polímeros, conteniendo los tres compuestos, es decir, citral, fosforiletanolamina y un compuesto de jasmonato; - nanopartículas poliméricas, conteniendo sólo uno de citral, fosforiletanolamina y un compuesto de jasmonato; - nanopartículas poliméricas, conteniendo una mezcla de dos cualquiera de citral, fosforiletanolamina y un compuesto de jasmonato; y - nanopartículas poliméricas, conteniendo los tres compuestos, es decir, citral, fosforiletanolamina y un compuesto de jasmonato.

Todas las nanoemulsiones mostraron un alto porcentaje de recuperación absoluta (>90%), eficiencia de entrampado (>85%) y estabilidad coloidal para todos los compuestos activos (citral, fosforiletanolamina y el compuesto de jasmonato, tal como MJ o MDJ) aplicados.

EJEMPLO 3 Síntesis de MDJ portado por ciclodextrina Se preparó una nanoemulsión de DJ-ciclodextrina, mezclando una solución acuosa o alcohólica de dihidrojasmonato de metilo (1x10"3 molar a 1x10"2 molar) con una solución de ciclodextrina con cantidad equivalente de ciclodextrina. La mezcla resultante se agitó hasta que se obtuviera una emulsión homogénea.

EJEMPLO 4 Estudio de toxicidad v una evaluación preclínica de MDJ portado por ciclodextrina para el tratamiento de tumores de colon químicamente inducidos en ratones El efecto del MDJ portado por ciclodextrina obtenido en el ejemplo 3 anterior, se estudió en un modelo experimental de cáncer colónico en ratones. Se investigaron la apoptosis y la proliferación celular, los dos eventos más importantes relacionados con el crecimiento tumoral. Se determinaron la apoptosis y los índices de proliferación de tumor de colon, tejidos no cancerosos adyacentes y tejidos colónicos normales. La apoptosis se cuantificó mediante el conteo de los núcleos apoptóticos y la inmunotinción de la CAPSASA-3, mientras que la proliferación se determinó mediante inmunotinción de PCNA.

Material v métodos Los animales se mantuvieron de acuerdo con las normas generales del Committee on Care and Uses of Laboratory Animáis, del National Research Council de los National Institutes of Health (USA). Se alimentó a los ratones con alimento y agua a voluntad, y se mantuvieron sobre una cama de paja de madera dura bajo un ciclo de 12 horas de luz/oscuridad. Se pesó semanalmente a los animales durante los experimentos. Todos los experimentos fueron aprobados por el USP Animal Ethics Committee.

En resumen, se trató a ratones Balb/c mediante instilaciones intra-rectales del carcinógeno N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina (MNNG), dos veces por semana por 2 semanas (XX), y se sacrificó a los mismos 24 semanas después del inicio del tratamiento. Diez días antes del final del experimento, los animales del grupo A (n=10) se trataron con inyecciones diarias i.p. de MDJ portado por ciclodextrina (10 µ? de solución salina con MDJ 1 milimolar) por cada 60 gramos de peso corporal. Los animales del grupo B (n=10) se trataron mediante instilaciones intra-rectales diarias de MDJ portado por ciclodextrina, a la misma dosificación. El grupo C (n=10) se trató con MNNG, y con inyecciones i.p. diarias de MDJ (diluido a 10% en 100 pL de solución salina). Los animales del grupo D se trataron con MNNG y mediante instilaciones intra-rectales diarias de MDJ, a la misma dosificación. El grupo control E se trató con MNNG sola. Los grupos control F y G se trataron con solución salina y MDJ portado por ciclodextrina i.p. e i.r, respectivamente. Los grupos control H e I recibieron solución salina y MDJ, i.p. e i.r, respectivamente. Las dosificaciones del MDJ y el MDJ portado por ciclodextrina se basaron en estudios piloto previos en animales.

Los cólones se colectaron y se procesaron histológicamente para tinción con hematoxilina y eosina para estudiar las características histopatológicas de los tumores químicamente inducidos, y para calificar el índice apoptótico. Se obtuvieron tumor de colon (T), sitio sin tumores adyacente (NT), y mucosa colónica macroscópicamente normal de ratas sin tumores (N) en el mismo grupo de tratamiento. Se llevó a cabo inmunohistoquímica para estudiar la proliferación celular mediante la tinción del antígeno celular proliferante (PCNA), y para analizar la apoptosis celular mediante el conteo de los cuerpos apoptóticos y mediante la tinción de la CAPSASA-3. Los resultados se expresaron como índice de marcación de PCNA (PCNA-Li), índice apoptótico (Al) e índice de marcación de CAPSASA -3 (CASPASA-3-Li). Se monitorearon también los parámetros estándar de química clínica y hematología.

Determinación del índice apoptótico - Se determinó la apoptosis mediante el conteo de núcleos apoptóticos. Se tiñeron secciones con hematoxilina y eosina para evaluar el número de células apoptóticas por sección. Los criterios usados para reconocer a las células apoptóticas fueron: tamaño de la contracción, pérdida de contacto con los tejidos circundantes (a veces formando el halo clásicamente descrito) y condensación nuclear, como se describió previamente (Yu et al., Gut 2002, 51 : 480-484). Se contaron por lo menos 1,000 células en cinco campos al azar, y entonces se calculó el porcentaje de células con características apoptóticas (índice apoptótico o Al). El conteo de los núcleos apoptóticos se comparó con los hallazgos obtenidos mediante la inmunotinción de la CAPSASA-3 en 30 áreas seleccionadas al azar. Se encontró una fuerte correlación entre el conteo de núcleos apoptóticos y los resultados de la CAPSASA-3 (r = 0.83, P<0.001).

Determinación del índice de proliferación - Se evaluó la proliferación mediante tinción con inmunoperoxidasa para el antígeno nuclear de células proliferativas (PCNA) como se describió previamente. En resumen, secciones incluidas en parafina de cada espécimen fueron marcadas con anticuerpo de PCNA, después de la recuperación del antígeno en regulador de pH de citrato. Se obtuvieron controles negativos reemplazando el anticuerpo primario con suero no inmune. Los portaobjetos fueron desarrollados en tetraclorhidrato de 3,3-diaminobencidina (DAB, Dako, Dinamarca) y contrateñidos con hematoxilina de Mayer. El índice de proliferación (Pl) se expresó como un porcentaje de la relación de núcleos positivos para PCNA al total de núcleos contados.

Análisis estadístico - Los resultados se expresaron como media+SE. Se hicieron comparaciones entre los diferentes grupos de tratamiento mediante (análisis de variancia) ANOVA con pruebas de comparación múltiple de Bonferroni. Se consideró a P<0.05 como estadísticamente significativa. Todos los cálculos estadísticos se llevaron a cabo usando el paquete de software estadístico SPSS (versión 11.0, SPSS Inc.).

Resultados Efectos antitumorales del MDJ portado por ciclodextrina Los grupos experimentales C y H (que recibieron MDJ i.p.) se removieron debido a signos tempranos de peritonitis. Todos los ratones tratados con MNNG desarrollaron tumores colónicos, mientras que ninguno de los ratones en los grupos control desarrolló cáncer colónico. No hubo diferencias estadísticamente significativas entre los grupos con respecto al número medio de tumores por ratón (4.6) que desarrollaron cáncer colónico. El índice apoptótico fue generalmente mayor en los tumores colónicos que en sus tejidos colónicos normales y no tumorales adyacentes (P<0.005, ANOVA). El tamaño medio de los tumores, así como Ai, CAPSASA-Li y PCNA-Li en cada grupo de tratamiento, se resume en el cuadro 2 siguiente.

CUADRO 2 Tamaño medio de los tumores colónicos, PCNA-Li. índice apoptótico y CAPSASA-3-Li en los tumores colónicos de diferentes grupos de tratamiento (ANOVA).

** P = 0.03 (grupos A contra B, D y E) - (ANOVA).

P = 0.002 (grupos C contra B, P = 0.002; grupos C contra D, P = 0.004) - (ANOVA).

En resumen, los carcinomas colónicos en los animales tratados con MDJ portado por ciclodextrina presentaron una reducción significativa (43%) en el índice mitótico accesado por la tinción del PCNA cuando se compararon con el grupo E. Además, el MDJ portado por ciclodextrina inyectado intraperitonealmente (i.p.) causó un incremento notable de tres veces en el índice apoptótico (accesado mediante el conteo de los cuerpos apoptóticos y la expresión de la CAPSASA-3). En este grupo, la expresión de la CAPSASA-3 fue intensa y estaba distribuida homogéneamente en los tumores (figura 2). Sin embargo, la administración del MDJ portado por ciclodextrina i.r. y MDJ i.r. estuvo asociada con una reducción leve pero significativa en los marcadores de tumores anteriores, pero el análisis histopatológico mostró que la expresión de la CAPSASA-3 fue confinada superficialmente al epitelio de la mucosa (figura 3).

Otras características histológicas indican un incremento en las defensas inmunes contra los tumores (debido a un incremento notable en el número de linfocitos peri-tumorales, no contados) en los grupos A y B.

Tanto en los animales tratados con MNNG como en los animales que no recibieron el carcinógeno MNNG, el tratamiento con MDJ y MDJ portado por ciclodextrina no estuvo asociado con ningún cambio significativo en la proliferación celular y la apoptosis en la mucosa colónica normal y en la mucosa adyacente a los tumores.

Ausencia de efectos tóxicos del MDJ portado por ciclodextrina A pesar de los fuertes efectos del MDJ portado por ciclodextrina en los tumores y aparte de algún signo de ansiedad conductual, no hubo observación de ningún síntoma de toxicidad para el cerebro, hígado, bazo, riñon, sistema gastrointestinal y médula ósea tanto en el análisis histopatológico como en los parámetros de química clínica y hematología estándar.

El estudio evaluó el uso de la detección morfológica de la actividad de la caspasa-3 como una técnica simple y cuantitativa para medir la apoptosis en las muestras de tejido. La enzima proapoptótica caspasa-3 es activada en un punto de convergencia para las vías de inducción de apoptosis intrínseca y extrínseca (Nakopoulou et al., Pathobiology 2001 , 69: 266-273). Este estudio pretendió caracterizar los cambios apoptóticos y de cinética celular en los tumores colónicos y la mucosa normal de ratones después del tratamiento con MDJ portado por ciclodextrina y MDJ para lograr más discernimiento en los mecanismos que sustentan sus efectos antineoplásicos. Se ha demostrado en este estudio que el tratamiento con MDJ portado por ciclodextrina, pero no MDJ, estuvo asociado con un tamaño medio más pequeño de los tumores colónicos inducidos por la MNNG en ratones. Se encontró que el tratamiento con MDJ portado por ciclodextrina (i.p.) causó una inhibición leve de la proliferación en los tumores colónicos, pero no en sus tejidos normales adyacentes o distantes. Además, se observó que sólo este tratamiento estuvo asociado con una inducción notable de la apoptosis, también sólo en los tumores, pero no en el tejido adyacente normal de la mucosa colónica distante. De modo intrigante, se encontró un índice de proliferación mayor en los tumores de los animales tratados con MDJ, que sugiere que el MDJ puede ser un estímulo irritante para la mucosa, debido posiblemente a un efecto citotóxico sobre las células epiteliales.

En conjunto, el tratamiento con MDJ portado por ciclodextrina dio como resultado una inducción notable de apoptosis e inhibición de la proliferación. En contraste, se encontró que el MDJ no inhibe la proliferación celular e induce un incremento leve de la apoptosis en los tumores colónicos. Estos hallazgos sugieren que los mecanismos que sustentan el efecto antineoplásico del MDJ portado por ciclodextrina pueden estar más relacionados con su capacidad para llegar a todas las partes de un tumor dado que no se encontró en el grupo tratado con MDJ y también en el grupo tratado con MDJ portado por ciclodextrina (i.r.). De modo importante, se ha confirmado que los efectos inhibidores del MDJ portado por ciclodextrina fueron específicos del cáncer en el sentido de que indujeron apoptosis en las células tumorales, mientras que dejaban a las células no tumorales sin afectar.

Los resultados obtenidos en este estudio muestran que el MDJ portado por ciclodextrina inyectado sistémicamente fue capaz de llegar a los tumores colónicos y de reducir el crecimiento de los tumores colónicos químicamente inducidos sin ningún efecto secundario significativo, por lo menos en las condiciones experimentales llevadas a cabo.

EJEMPLO 5 Desconexión del cáncer por el MDJ portado por ciclodextrina El estudio descrito en este ejemplo mostró que el MDJ portado por ciclodextrina obtenido en el ejemplo 3 anterior, indujo contracción notable en los tumores Caco2 de xenoinjerto de humano en ratones NOD-SCID. Además, el MDJ portado por ciclodextrina indujo interrupción vascular, e inhibió la angiogénesis y las células madre de cáncer. El análisis de las microdisposiciones mostró que el MDJ portado por ciclodextrina influyó simultáneamente sobre varias vías de señalización importantes, con inhibición mayor de NFKB, HIF-1 y metalotioneínas. Los resultados fueron validados mediante PCR cuantitativa en tiempo real, western blotting, histoquímica southwestern e inmunohistoquímica.

Se inyectó subcutáneamente a ratones NOD-SCID machos (6 a 8 semanas de vida) con células de cáncer de colon Caco2 de humano (1.5 x 106, en 100 µ?_ de PBS). Una semana después, se dividió aleatoriamente a los ratones en dos grupos. Después de 4 semanas, cuando se establecieron tumores palpables (20-25 mm2), se inyectó intraperitonealmente al grupo GT con 100 pL de MDJ portado por ciclodextrina, una vez al día, por cuatro días, y al grupo control se le administró PBS (grupo GC). Se calculó el volumen del tumor de acuerdo con la siguiente fórmula: longitud2 x ancho/2, y se removieron los tumores en el día 5 después del inicio del tratamiento con MDJ portado por ciclodextrina. El ARN total de los tumores se obtuvo, se cuantificó, y se evaluó la calidad del ARN, como se describió anteriormente. Se llevó a cabo el análisis de la expresión génica con el protocolo de experimentos de las microdisposiciones (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA, que contienen aproximadamente 40,000 sondas) (Rizzatti et al., 2005). Se llevó a cabo la PCR cuantitativa en tiempo real (q-PCR) para los genes objetivo de ciclina D1 , HIF-1 , metalotioneína D3 y VEGFA. El cambio en número de veces se calculó usando el método 2-ACt. Se llevó a cabo análisis Western blot (WB) para HIF-1 a (Novus biologicals) y NFKB p-50 (Santa Cruz Biotechnology, CA). Se usó ß-tubulina (clon KMX-1 1 :3000, Millipore) como control de carga. Se llevó a cabo análisis de histoquímica Southwestern (SW) para la detección in situ de NF-?? en preparaciones de tejido tumoral. Se usaron secciones de hematoxilina y eosina para el análisis histopatológico. Se llevó a cabo inmunohistoquímica (IHC) de PCNA, ciclina D1 ; CAPSASA-3, CD31 , VEGF, CD34, COX-2, TGF , HIF-1 , CD133, Oct4 y MT. Se llevó a cabo también análisis TUNEL. Dos investigadores, sin conocer la identificación de los grupos, evaluaron independientemente las muestras. Se calificaron las células teñidas y la densidad de microvasos. Los datos se analizaron usando el programa estadístico GraphPad Prism 5 (Graph Pad Software Inc., San Diego, California, USA), y el análisis se llevó a cabo mediante la prueba de Mann-Whitney. Se consideró la probabilidad de P<0.05 como estadísticamente significativa.

Además, fue dirigido a verificar si podría influir sobre el microambiente del tumor, la angiogénesis y las células madre de cáncer (CSCs), los cuales están estrechamente relacionados, y actualmente se considera, respectivamente, dirigen el crecimiento del tumor y poseen el principal sistema de resistencia contra el tratamiento convencional del cáncer. Se llevó a cabo análisis estadístico mediante prueba de Mann-Whitney.

El hallazgo más notable del estudio presentado aquí fue un efecto notable de contracción del tumor inducido por el MDJ portado por ciclodextrina, mientras que los tumores de los animales control (GC) presentaron un crecimiento significativo en el período experimental (P<0.01) (figura 4A). Macroscópicamente, en comparación con los tumores control, los tumores de los animales tratados con MDJ portado por ciclodextrina presentaron una capa externa pálida y dura y un núcleo más blando (figuras 4B y 4C), que sugiere que el tratamiento con MDJ portado por ciclodextrina lleva a una reducción en la perfusión de sangre del tumor.

El análisis con hematoxilina y eosina (H&E) de tumores de xenoinjerto mostró vascularidad prominente y una división en cinco tipos de tejido: (1) Núcleo del tumor, con población de células redondas a ovales que parecieron estar poco diferenciadas, hipercromáticas, con un citoplasma basófilo y escaso; (2) focos de necrosis hemorrágica coagulativa; (3) pseudoempalizadas neoplásicas en torno a los focos necróticos, a los que se les denominó "áreas peri-necróticas" (PN); (4) frente invasivo en los límites de los tumores; y (5) elementos estomáticos compuestos usualmente de células en forma de huso, agrupadas en haces y diseminadas en el núcleo del tumor y en la periferia (figura 4J).

El análisis de las microdisposiciones mostró que el MDJ portado por ciclodextrina influyó simultáneamente sobre varias vías de señalización importantes (figuras 6A y 6B). De los 40,000 genes en la disposición, el tratamiento con MDJ portado por ciclodextrina causó sobrerregulación de 2016 genes y subregulación de 1305 genes (2-26.3 veces). Los factores de transcripción maestros fueron alterados, así como los genes novedosos de función aún desconocida. Resumidos en la figura 2, están los genes principales que fueron sobrerregulados o subregulados dos veces o más en los tumores de los animales tratados con MDJ portado por ciclodextrina, en comparación con los no tratados. Cuando se correlacionaron los genes más importantes con expresión alterada y se les clasificó mediante las interacciones de sus productos génicos, usando el sistema de análisis de vías de ingenuidad, emergió una red altamente conectada (figura 6C y 6D). No se encontró discrepancia entre los hallazgos de las microdisposiciones y la qPCR (cuadro A).

De modo interesante, se encontró que varios genes que se sabe están asociados con efectos anti-cáncer, son sobrerregulados en los tumores tratados con MDJ portado por ciclodextrina como es el caso, por ejemplo, del gen PPAR. Por el contrario, se encontró que algunos genes importantes que están asociados con el crecimiento tumoral son subregulados, tales como NFkB, VEGF, AKT, HIF-1 y Hox. Las alteraciones de la expresión génica incluyeron muchas vías enlazadas a la angiogénesis, inflamación, apoptosis, metaloproteasas de matriz, proliferación celular, metabolismo y resistencia a fármacos. La gama entera de cambios en la expresión de los genes tumorales por el MDJ portado por ciclodextrina no puede describirse aquí, pero pueden presentarse rasgos salientes de algunos de los hallazgos más importantes relacionados con los mecanismos implicados en la angiogénesis y la regulación de las células madre de cáncer en conjunto con los datos morfológicos.

Efectos anti-angiogénesis del MDJ portado por ciclodextrina - El grupo tratado con MDJ portado por ciclodextrina presentó áreas de necrosis tumoral hemorrágica, las cuales eran 284% más grandes que las presentadas en el grupo control GC (p<0.01) (figuras 4D y 4E, respectivamente). Además, aparentemente ocurrió necrosis tumoral principalmente desde el centro del tumor, más que desde fuera del tumor sobre la periferia (figura 4E), indicando que no sólo la angiogénesis fue inhibida, sino también que pudo haber ocurrido un fenómeno de interrupción vascular. Por supuesto, el MDJ portado por ciclodextrina deterioró el ensamble de las células endoteliales (EC) en los vasos sanguíneos en lumen y organizados (figuras 4F y 4H), lo cual dio como resultado la formación de crecimiento vascular desordenado, formando lotes de vasos aparentemente disfuncionales con muchos capilares que terminan en un cul de sac (figuras 4G y 41). Estas observaciones están de acuerdo con los hallazgos previos de reducción de la densidad de vasos por el MDJ portado por ciclodextrina en embriones de pollo, y la gemación de nuevos vasos que fueron más permeables y menos organizados que los vasos normales (Braz J Biol. 2010; 70: 443-449).

El SW mostró un incremento impresionante y específico en el número de vasos sanguíneos con tinción específica para NFKB en los tumores GT (485%; p<0.01), que puede representar una mera señalización reactiva al daño celular (figura 7F). Esto es también coherente con la observación de un gran número de microvasos teñidos positivamente para el marcador de apoptosis CAPSASA-3 en el grupo GT. Además, los tumores de los ratones tratados con MDJ portado por ciclodextnna contenían menos microvasos teñidos positivos para VEGF y CD31 que los de los ratones control, consistente con la noción de que el MDJ portado por ciclodextnna puede suprimir la angiogénesis del tumor (figura 4N, 4M y 40).

Además, el grupo GT presentó una reducción significativa en el número de células positivas para CD34, un marcador de células precursoras endoteliales originadas de la médula ósea (figuras 4J, 4K y 4L). Este hallazgo valida la observación de MA de una subregulación de CCRl (receptor CCL9/15), que se relaciona con el reclutamiento CD34(+) de células mieloides inmaduras (¡MCs). Una falta de Ccr1 suprime dramáticamente los brotes de tumores en el hígado de los ratones (Proc Nati Acad Sci U.S.A. 2010; 13063-13068).

Las microdisposiciones mostraron que el tratamiento con MDJ portado por ciclodextnna subreguló la vía de SAT3 y NF-?? que actúa sobre p65/RelA (Fe -2,524) de acuerdo con la sobrerregulación del ARNm IkB (2,599), potenciada por una alta expresión del ARNm TKB1 (NAK) en el núcleo. En conjunto, el análisis por WB y SW validó los resultados de las microdisposiciones, confirmando que los niveles de NFKB fueron reducidos significativamente (figuras 8A a 8T). Se considera a NFKB y Stat3 como factores de transcripción principales que orquestan la relación entre la inflamación y la angiogénesis en la progresión del cáncer, aumentando la expresión del VEGF y otros factores pro-angiogénicos (Curr Mol Med. 2010; 10: 369-373).

Se encontró que el TGFP es subregulado en esta prueba, con una sobrerregulación del TGFBR1 y TGFBR2. La subregulacíón del TGFP en el análisis MA se corroboró mediante qPCR e IHC (figuras 7H, 71 y 7J). La regulación del TGFR puede estar relacionada con los cambios parciales en la regulación del complejo SMAD (activación de SMAD2 y supresión de SMAD3), y la activación de E2F7 y la supresión de E2F6 y E2F4. Esto está asociado con la sobrerregulación de la ciclina-B2 y CDK2AP1 , así como con la subregulacíón de la ciclina-C. El TGF causa la progresión del cáncer a través de la estimulación de la angiogénesis, entre otros mecanismos (Tian et al., Transforming growth factor-f3 and the hallmarks of cáncer. Cell Signa!. 2010).

Se observó una subregulacíón notable del inhibidor de la subunidad del ARNm HIF1a (HIF1AN, FC 3.7 3), así como una subregulacíón (Fe -2.464) del factor 1 inducible por hipoxia (HIF-1), el mediador clave de las vías de señalización de hipoxia. Una subregulacíón de APEX1 (Fe -2.387) se relacionó posiblemente con la menor presencia de HIF1a, y también posiblemente se relacionó con una transcripción disminuida del complejo de metalopeptidasa de matriz como MMP2 (Fe -3.108) y MMP14 (Fe 3.890). La inhibición de HIF1 puede estar relacionada con la expresión indetectable del VEGF del ARNm y la menor inducción de angiogénesis {FEBS J. 2009: 509-518). Se observó que el análisis WB y la IHC (figuras 7K, 7L, 7N, 7M, 70) confirmaron los hallazgos de las microdisposiciones y de la qPCR.

Se encontró un incremento importante en la expresión de PPARa (Fe 7.007), relacionado posiblemente con la presencia indetectable del ARNm STAT5 en el núcleo. Una falta en la expresión de PPAR-gamma del ARNm posiblemente estaba asociada con la ausencia de factores de transcripción tales como c-Fos y c-Jun, y esto pudo ser responsable de la presencia indetectable del ARNm de COX-2 y lo cual está de acuerdo con una disminución aguda de la expresión de COX-2 mediante IHC (figuras 7P, 7Q y 7R). Una activación de PPARa puede estar relacionada con la sobrerregulación de CD36 e ABCA1 , ABCA2 y ABCA 10. Esta vía de señalización sustenta un mecanismo más para la inhibición de la angiogénesis por el MDJ portado por ciclodextrina, debido a que los agonistas de PPARs son mediadores potentes de las respuestas anti-angiogénesis, y los agonistas de PPAR están actualmente en estudio como opciones lógicas en el tratamiento del cáncer (PPAR Res. 2010; 81 : 4609).

De esta manera, la interrupción vascular y los efectos anti-angiogénesis del MDJ portado por ciclodextrina están de acuerdo con la propuesta de que el direccionamiento de vías múltiples es una tendencia en la terapia anti-angiogénesis, debido a el bloqueo de una sola vía puede no ser altamente efectiva y las células tumorales pueden desarrollar resistencia contra los fármacos anti-angiogénesis y/o el uso de otros mecanismos de angiogénesis (CA Cáncer J Clin. 2010; 60: 222-243).

MDJ portado por ciclodextrina y células madre de cáncer - Las células madre de cáncer (CSCs) son la fuente principal del origen tumoral (J Pathol. 1999; 187: 61-81), de la renovación de células y exhiben resistencia incrementada a la inducción de apoptosis por agentes citotóxicos y radioterapia, en comparación con las células más diferenciadas que comprenden la masa de tumores (Curr Med Chem. 2008; 3171-3184). Por lo tanto, se piensa actualmente que los procedimientos terapéuticos dirigidos por las CSCs representan estrategias relevantes para mejorar la terapia clínica del cáncer (Curr Med Chem. 2008; 3171-3 84; J Clin Invest. 2010; 120: 41-50).

Tres marcadores clásicos de células madre tumorales, correlacionadas con baja supervivencia en los pacientes, se usaron en este estudio: CD133, Oct4 y metalotioneína (J Pathol. 2000; 191 : 306-312; Ann Surg Oncol. 2009; 16: 3488-3498; World J. Surg. 2002; 26: 726-731 ; Mutat Res. 2003; 533: 201-209). En tumores control, se ha observado que los tres marcadores de células madre usados se encontraron principalmente en las áreas PN y en el frente de invasión de los tumores (figuras 8A a 8N). Las áreas PN son también en donde la tinción de HIF-1 fue más intensa. Posiblemente, las áreas PN están más propensas a contener un ambiente hipóxico, y la hipoxia activa el HIF-1 alfa para aumentar la actividad de auto- renovación de las células positivas para CD133, dirigiendo su transformación hacia células madre de cáncer e inhibiendo su diferenciación (Oncogene 2009; 45: 3949-3959). De modo interesante, se observó que el MDJ portado por ciclodextrina estuvo asociado con una disminución notable en el número de CSCs; sin embargo, los mecanismos que sustentan este hallazgo quedan por ser dilucidados. Es menos plausible que la necrosis directa de las células debido a las alteraciones vasculares pueda ser un mecanismo principal para ello, debido a que las CSCs son bastante resistentes a las condiciones hipóxicas.

Los tumores control mostraron alto número de células redondas que sobreexpresan metalotioneína (MTOEC) en las áreas peri-necróticas (PN) y MTOEC en forma de huso revestidas con los límites del tumor, organizadas en cordones que se interconectan y están estrechamente correlacionadas con los nuevos vasos sanguíneos (figuras 81, 8J, 8L, 8N y 8M). En el presente estudio, el análisis de las microdisposiciones ha mostrado una disminución en la expresión de MT relacionada con el MDJ portado por ciclodextrina, la cual fue validada mediante qPCR e IHC. Además, el MDJ portado por ciclodextrina inhibió también fuertemente la aparición y la organización espacial de las MTOECs (figuras 81 a 8N). Esto puede influir de modo importante y negativamente sobre la angiogénesis, debido a que la MT tiene funciones reguladoras importantes en el proceso de angiogénesis (J Cereb Blood Flow Metab. 2000; 20: 1174-1189).

Existe un importante intercambio de señalización entre las CSCs y las células endoteliales (Nat Rev Cáncer 2007; 7: 733-736), y en algunos tumores las CSCs residen preferiblemente en zonas específicas adyacentes a los vasos sanguíneos del tumor (nichos de CSCs), o en forma alternativa se originan de áreas poco perfundidas e hipóxicas, a las cuales se han adaptado (Nature 2006; 441 : 1075-1079). Las CSCs mismas pueden producir factores angiogénicos y son por si mismas dependientes de los factores producidos por la vasculatura para mantener la auto-renovación y el crecimiento a largo plazo (Nat Rev Cáncer 2010; 2: 138-146). Por esta razón, se han propuesto recientemente terapias novedosas del cáncer que eligen como objetivo a las CSCs y su microambiente, tomando en cuenta que las CSCs necesitan un nicho hipóxico para protegerlas del estrés oxidativo debido a que las especies de oxígeno reactivas inducen la proliferación mediada por p38-MAPK que lleva al agotamiento de las CSCs (Nat Rev Cáncer 2010; 2: 138-146; Curr. Opin. Hematol. 2008; 522-528). Con base en los hallazgos, puede sugerirse que el MDJ portado por ciclodextrina también puede adaptarse bien a este tipo de terapia, debido a que no sólo estaba asociado con una disminución en el número de CSCs asociadas con los vasos, sino también perturbó la organización espacial de las MTOEC y los nuevos vasos sanguíneos, perturbando el nicho de las CSCs. Se dedujo que no es inconcebible que el fenotipo y el comportamiento biológico de las CSCs pudieran ser invertidos o desactivados por la acción de una molécula de señalización múltiple, tal como el MDJ portado por ciclodextrina.

MDJ portado por ciclodextrina e inducción de apoptosis - Los tumores de ratones tratados con MDJ portado por ciclodextrina contenían muchas más células apoptóticas que los controles, según se muestra mediante los dos marcadores bien conocidos de apoptosis, es decir, las técnicas TUNEL y de CAPSASA-3 (figuras 80 a 8T). Posiblemente este hallazgo está relacionado con la inhibición de NFKB y HIF-1 en estas áreas, debido a que ambos factores son inhibidores potentes de la apoptosis. Esto puede estar relacionado también con la disminución en el número de CSCs en estas regiones. El índice de proliferación, reflejado por la tinción de PCNA, no fue influenciado significativamente por el tratamiento con MDJ portado por ciclodextrina (P=0.14), a pesar de un incremento en la expresión de la CiclinaDL La activación de las vías de supervivencia/anti-apoptóticas es una característica común de las células cancerosas, y está relacionada con la resistencia a los agentes citotóxicos. Las vías de supervivencia implicadas en la respuesta celular a la farmacoterapia son principalmente PI3K/Akt y Ras/MAPK, las cuales median también la señalización activada por los factores de crecimiento y desempeñan una función en la regulación de procesos críticos que incluyen la proliferación celular, el metabolismo, la apoptosis y la angiogénesis. En el presente estudio, el ARNm AKT1 fue subregulado (Fe -2,021) en paralelo con una alta subregulación del complejo de AKT (Fe -2,021 ; ???a, ???ß, RAC, RACa, PKB/AKT). Se relaciona con una subregulación leve del complejo de PI3K (PIK3AP1 -1 ,856; PIK3C3 1 ,549), debido posiblemente a la activación del complejo de GAB (GAB1 1 ,511 y GAB2 1 ,569), que dirige el control tras la activación de p65/RelA. La sobrerregulación de FGFRL1 y FGFR1 , y la supresión de PIK3AP1 y FGF13, estuvieron relacionadas con la activación de FGFR3 y en secuencia de PI4K2A. En conjunto, estas regulaciones están posiblemente relacionadas con una subregulación en el complejo de P13K (PIK3AP1 -1 ,856; PIK3C3 1 ,549), posiblemente por la activación del complejo de GAB (GAB1 1 ,511 y GAB2 1 ,569) y una reducción de la inhibición de la expresión de las caspasas 2 y 9, estimulada principalmente por el complejo de AIFM2 y AIFM3. El Wnt fue subregulado por WIF1 con supresión notable de Wnt5A.

Además, se observó también una subregulación importante del complejo de MAPK, principalmente para MAP2K1 (Fc -3,155), MAPKAPK2 (Fc -2,501), MAPK12 (Fc -2,245), MAP4K3 (Fc -2,153), MAP4K5 (Fc -2,149) y MAPK14 (Fc -2,082). El complejo de ciclina presentó resultados que podrían ser dependientes de la modulación del complejo de NF-??. De esta manera, el complejo de ciclina como D3, A1 y B2 (Fc 3,775; 1 ,528 y 1 ,676) fue sobrerregulado a pesar de la subregulación de la ciclina C (Fc -1727). Al mismo tiempo, los complejos inhibidores fueron activados como p19 INK4D (Fc 1,871) y p15 INK4B (1 ,523) en un balance directo con la activación de las ciclinas. Esto fue acompañado por una disminución de 13c1 XL (Fc -1 ,601) en proporción con el incremento de tBID y BIM así como la sobrerregulación del ARNm BID (Fc 1,505) y finalmente la alta sobrerregulación de la caspasa 9 (2,6343) y la caspasa 2 (1 ,530), a pesar de las puntuaciones sin cambio de la caspasa-3 del ARNm. Puesto que los ratones SCID son ¡nmunodeficientes, la inducción de apoptosis y la supresión del crecimiento tumoral por el MDJ portado por ciclodextrina no requieren una función inmune del hospedero, y más probablemente resultan del efecto anti-angiogénico o del efecto directo de destrucción de las células tumorales por del MDJ portado por ciclodextrina.

Puesto que éste era un experimento a corto plazo, no fue posible evaluar los sistemas defensivos del tumor contra la terapia. Sin embargo, la subregulación de algunos de los genes más notables relacionados con la resistencia contra la quimioterapia, tales como MT, ABCB4 y HSP70 (HSPA1A) (Anticancer Res. 2005; 2661-2668; Mol Cell 2009; 15-27), hace muy probable que los tumores tratados con MDJ portado por ciclodextrina no presenten una resistencia importante contra el tratamiento.

MDJ portado por ciclodextrina y organización del tejido tumoral -se piensa usualmente que los tejidos tumorales son completamente desorganizados, caóticos. Sin embargo, en años recientes, ha surgido el argumento de que los tumores malignos representan biosistemas complejos dinámicos y auto-organizables, capaces de desarrollar patrones colectivos multicelulares que asemejan el comportamiento adaptativo evolucionado conocido de otros sistemas biológicos. Esto incluye la detección colectiva de las condiciones ambientales y la toma de decisiones colectiva, tal como la evidencia creciente de que la migración colectiva de células es común durante la invasión de los tumores malignos (BioEssays 2009; 31 : 190-197). De esta manera, se ha propuesto otra estrategia conceptualmente nueva, que sería engranada hacia la "interrupción" del proceso de información del enjambre de células. Es decir, si la comunicación célula-célula pudiera ser interrumpida o por lo menos severamente impedida terapéuticamente, disputablemente el sistema general sería retardado. Se ha observado que en los controles, las células tumorales, principalmente en el frente de invasión, usualmente se alinean por sí mismas en cordones (tipo líneas), los cuales se comunican con estructuras similares cercanas y alrededor de los vasos sanguíneos, formando redes de cordones anastomosantes (figuras 4F y 4H). De modo interesante, se encontró una "desorganización" del tejido tumoral debido al efecto del MDJ portado por ciclodextrina. En el grupo GT, las células tumorales muy frecuentemente pierden la organización del cordón, y los microvasos son deformados o interrumpidos y presentan fuga de eritrocitos, caracterizando una pérdida importante de organización de las células del tejido (figuras 4G y 41). Se sugirió que el MDJ portado por ciclodextrina puede haber desconectado también el sistema organizacional de señalización del tumor, y esto garantiza más investigación. De modo interesante, el análisis de las microdisposiciones ha mostrado subregulación por el MDJ portado por ciclodextrina, de algunos genes importantes que están relacionados con la organización estructural de los tejidos, tales como claudina-4 (CLDN4), una proteína de transmembrana de estructura de unión apretada que es altamente expresada en algunos cánceres (Cáncer Sci. 2009; 1623-1630); EIF4E, que se ha considerado que es el talón de Aquiles para el cáncer debido a la susceptibilidad de los tejidos tumorales a la inhibición de elF4E (Cáncer Res. 2008; 631-634); DSC2 (proteínas desmosómicas), incluidas recientemente en una nueva serie de moléculas de adhesión celular que podría contribuir a la formación de metástasis (Cáncer Res. 2008; 68: 6092-6099); MMP13, una metaloproteinasa de matriz que desempeña una función en la proliferación e invasión de células tumorales (Oncol Rep. 2010; 1241-1247); y Wnt-5a, cuya expresión incrementada puede servir para inhibir la activación de la vía de señalización canónica de WNT y aumentar el crecimiento del cáncer (Br J Cáncer. 2009; 209-214).

En conclusión, parece claro que los efectos anti-cáncer del MDJ portado por ciclodextrina pueden no ser explicados por el paradigma singular de la terapia objetivo. Para entender los efectos del MDJ portado por ciclodextrina, es necesaria una amplia inspección de los tumores como organismos multicelulares, los cuales adaptan las respuestas de sus genes en una lucha por sobrevivir, como se muestra en la figura 9. Los efectos del MDJ portado por ciclodextrina en esta adaptación pueden arrojar luz sobre un nuevo paradigma en la terapia del cáncer. JA es un regulador genético. Ha sido extraordinariamente conservado en la evolución de las especies vegetales por millones de años, y opera para regular el balance complejo entre las respuestas de defensa y el crecimiento hacia una gama extraordinaria de agresores bióticos, optimizando de esta manera la adecuación de las plantas en ambientes rápidamente cambiantes (Curr Opin Plant Biol. 2008; 11 : 428-435).

En la figura 9, las flechas negras denotan señales dirigidas por la hipoxia; las líneas interrumpidas azules denotan el bloqueo de las señales dirigidas por la hipoxia por el MDJ portado por ciclodextrina; y las flechas azules denotan la inducción del MDJ portado por ciclodextrina. Durante el crecimiento del tumor, una falta de coordinación entre las demandas de un tejido en crecimiento y el suministro vascular causa insuficiencia del suministro de oxígeno en algunas áreas del tumor. Las más afectadas, las cuales se mantienen en un ambiente de anoxia, presentan finalmente necrosis del tejido. En torno a estos focos de necrosis, están las regiones peri-necróticas (PNA), con hipoxia, una falta menos intensiva de oxígeno que puede permitir que las células se adapten y sobrevivan a través de la activación intensa de la señalización de supervivencia. De esta manera, se ha observado que esta región presenta alta expresión de NFKB, HIF-1 , TGFp y COX-2. Los altos niveles de estas moléculas activan a su vez los fenotipos de las células madre que también liberan factores de crecimiento que estimulan el crecimiento del tejido, reducen la apoptosis y promueven la angiogénesis. Por esta razón, se encontró un alto número de células positivas para los marcadores clásicos de las células madre de cáncer (CSCs); CD133, Oct4 y MT, con índices de apoptosis reducidos (mediante TUNEL y CASPASA-3). De esta manera, las PNAs funcionan como fábricas de señalización que estimulan el crecimiento del tumor y la resistencia a la hipoxia y al tratamiento.

Las CSCs se acumulan también en las regiones del frente invasivo (IF), y pueden migrar en estrecha proximidad con los vasos y sustentan la invasión de los tejidos vecinos. La estrecha proximidad de las CSCs y las células endoteliales establece una red de señalización paracrina en el margen del tumor. Esta asociación incrementa la invasividad de las células tumorales como resultado de la estimulación por las CSCs, y el suministro de sangre relativamente fácil provisto por los nuevos vasos del tumor.

En este modelo teórico, en las células tumorales en las regiones normóxicas, el núcleo del tumor permanece en un metabolismo y crecimiento bastante moderado, con una pequeña presencia de células madre y factores de crecimiento del tejido. Estas células proveen de un tipo de ejército de reserva. Algunas de ellas pueden cambiar al fenotipo de CSCs si la hipoxia u otras agresiones las alcanzan, pero la mayoría de ellas pueden sólo cubrir los espacios proliferando lentamente conforme el tumor avanza.

El MDJ portado por ciclodextrina bloquea la angiogénesis y perturba los vasos existentes, lo que incrementa la hipoxia, y esto desencadenaría señales para la supervivencia y el crecimiento de tumores (HIF-1 , NFKB, MT, MAPK, factores de células madre). Sin embargo, esto se evita por el hecho de que el MDJ portado por ciclodextrina inhibe simultáneamente por lo menos la mayoría de estos sistemas de señalización principales. De esta manera, el tumor no es capaz de reaccionar a las condiciones hipóxicas incrementadas, y grandes áreas de necrosis reemplazan progresivamente los tejidos tumorales, proveyendo de condiciones óptimas para la contracción del tumor, hasta que el tumor es virtualmente eliminado.

Cuando el MDJ portado por ciclodextrina se pone en contacto con los tumores, no sólo inhibe la angiogénesis e induce apoptosis y perturbación vascular, sino también inhibe los principales sistemas de señalización de supervivencia que son activados por los tumores cuando presentan hipoxia y daño del tejido. De esta manera, se ha observado que el MDJ portado por ciclodextrina causó impactos directos en la vasculatura del tumor, lo cual causó la formación de vastas áreas de necrosis, y esto se combinó con la inhibición de los sistemas de señalización defensivos del tumor.

La reducción en el número de CSCs da como resultado por lo menos dos resultados principales. Primero, el tumor pierde posiblemente su fuente principal de factores de estimulación. Segundo, conforme las CSCs son mucho más resistentes a los tratamientos del cáncer y la hipoxia, es muy probable que el tumor no pueda recuperarse de los primeros impactos y que desarrolle resistencia contra el tratamiento.

EJEMPLO 6 Prueba de angioqénesis in vitro v prueba de membrana corioalantoíca (CAM) de pollo in vivo Líneas de células usadas: células no neoplásicas derivadas de células endoteliales de cordón umbilical humano (HUVECs) y células neoplásicas de melanoma, tumor de murino B16F10. Las HUVECs fueron provistas por la Dra. Dulcinea Saes Parra Abdalla, del Department of Clinical and Toxicological Analyses, FCF-USP's, y las células de melanoma de murino B16F10, por el Prof. Marcia Cominetti, del Department of Physiology and Molecular Biology de UFSCar. Ambas cepas se cultivaron en RPMI con suero de ternera fetal a 10%. La observación morfológica de los dos tipos de células sugirió mecanismos comunes. La investigación preliminar del efecto sobre la angiogénesis se hizo también in vitro con HUVECs. Las medidas se llevaron a cabo para estudiar el ciclo celular mediante citometría de flujo (yoduro de propidio y anaranjado de acridina), la evaluación de la actividad mitocondrial mediante microscopía confocal (Mitotracker Red), y la medición de la producción de VEGF y PGE2 por HUVEC, y se obtuvieron sobrenadantes de cultivo de células mediante ELISA con anticuerpos comerciales.

Para las pruebas con huevos, se usaron huevos blancos de Gallus gallus incubados en una incubadora con termostato a temperatura y humedad controladas. La incubación se llevó a cabo con y sin giragem ponedoras de huevos. Una marca en la superficie superior de la corteza se usó para controlar este procedimiento. Los huevos se abrieron en el cuarto día de incubación, después de la limpieza cuidadosa de la piel con lana de algodón remojada en alcohol al 70%. La apertura se llevó a cabo en flujo laminar, manteniendo todos los huevos en la misma posición en la cual fueron incubados, sostenidos sobre un soporte de plástico y marcados sobre su superficie superior. El procedimiento experimental se adaptó y se refino para el proyecto, haciendo uso de la primera mitad del siglo XX.

La apertura se hizo con pequeñas tijeras quirúrgicas de punto fino y curvas, pinzas de microcirugía, cinta transparente, un contenedor para desechos, una pipeta Pasteur, agujas y jeringas desechables, y un plástico o cartón para los huevos.

La primera maniobra realizada para abrir los huevos permitió obtener un área bajo la corteza. De esta manera, puede ocurrir la apertura de una ventana en la superficie superior, sin que rebose el contenido del huevo mantenido en la posición de observación. Una aguja BD 25 x 8 acoplada con una jeringa de 3 mL, la cual se introdujo lentamente a través de la cámara de aire del huevo, a un ángulo inicial de 45 grados, se usó hasta aproximadamente la posición en donde, a partir de la succión, se colecta sólo albúmina fina. La perforación se hizo cuidadosamente para evitar el agrietamiento. Se evitó la remoción de albúmina densa, al igual que de la yema o aire, o el retiro de la yema podría descarrilar el embrión, y la remoción del aire permitiría el regreso del mismo, poniendo en riesgo la supervivencia del embrión.

Se removieron aproximadamente 5 ml_ de albúmina de cada huevo en el saco vitelino para mantenerlo bajo y poder abrir los huevos sin que el embrión estuviese unido a la corteza y la visualización de que eso llegara a ser posible. Se desechó la albúmina en el contenedor apropiado, dejando unos cuantos mililitros para el cierre del orificio de la inserción de la aguja. El agujero fue bloqueado con su propia albúmina de huevo, precipitada con goteo de alcohol en el sitio. El cuidado y la atención para prevenir fugas son importantes para reducir al mínimo el riesgo de contaminación de la incubadora. Si es necesario, una gota más de albúmina puede ponerse en el agujero y hacer gotear el alcohol sobre el mismo hasta la observación de una membrana en el sitio.

Mediante el uso de unas tijeras de punta fina y curvas, el cascarón fue pinchado cuidadosamente junto a la marca de grafito, la cual es la parte más alta de la superficie sobre la cual el huevo estaba obteniendo calor. Después de la perforación, la corteza fue cortada lentamente, evitando la ocurrencia de grietas, hasta la formación de un corte en forma de la letra "U". En el extremo, se usó una abrazadera que se introdujo en el punto de partida del corte, completo el retiro y la formación de la ventana. El cuidado en este paso fue la introducción y manipulación de las tijeras para evitar el daño del embrión. Cuando el embrión es muy joven, el cascarón es más duro y la observación es más difícil. Además, los embriones más maduros tienen la CAM más grande y la mayor parte de ella adherida al cascarón, lo cual incrementa el riesgo de lesión durante el procedimiento. El tiempo ideal para la apertura del huevo se estandarizó por 4 días de incubación. Durante este período, se evitó la ocurrencia de pérdida a través de la lesión, y la ventana abierta en el cascarón permitió la fácil observación del embrión y los tejidos extraembrionaríos de la CAM, con su disposición característica de arterias y venas.

La ventana se cerró con una pieza de cinta transparente para proteger al embrión. Se regresaron los huevos a la temperatura de incubación. El tiempo fuera de la incubadora debería ser mínimo, debido a que en esta etapa de vida, los embriones no tienen la capacidad de producir calor por sí mismos. El desarrollo apropiado depende de las condiciones ambientales de temperatura y humedad.

Después de la apertura y el cierre de las ventanas, todos los huevos fueron reemplazados en la incubadora, con las mismas condiciones iniciales y mantenidos por otros siete días, típicamente. En este intervalo, los procedimientos se llevaron a cabo para las pruebas de angiogénesis o para investigar el crecimiento del tumor in vivo. La observación de la angiogénesis en los huevos inoculados con células tumorales siguió virtualmente el mismo modelo de prueba de la angiogénesis. La exposición a MDJ puro (cis/trans 96% puro de Sigma) o MDJ portado por ciclodextrina obtenido en el ejemplo 3 anterior se llevó a cabo en el día 8, con los huevos restantes en la incubadora hasta el día 14. La inoculación con las células de melanoma se llevó a cabo en el día 4, y los huevos recibieron MDJ puro o MDJ portado por ciclodextrina en el octavo día, y permanecieron incubados por hasta 14 días. Durante el desarrollo del protocolo, se ajustaron el tiempo de inoculación y el tratamiento. El cuidado durante la colecta y para obtener las imágenes se estandarizó para todos los experimentos.

Por el término del período estipulado en cada prueba, los huevos se removieron de la incubadora y se enfriaron en el refrigerador por cuando menos media hora hasta que el latido del embrión dejara de ser observado. Después de la verificación de este fenómeno, la cinta se retiró y se hizo gotear la CAM con un pequeño volumen de formaldehído a 4%. El fijador se mantuvo por 20 minutos. Después, las membranas se cosecharon y se procesaron en fresco. La calidad de las imágenes obtenidas dependió de la preservación apropiada del contenido de los vasos que no se usaron, o de la inyección del colorante de contraste.

Después de breve fijación, se hizo una brecha en el cascarón y el embrión se puso inerte sobre una caja de Petri. Los vasos principales se ataron con hilo de algodón, con un nudo triple, cerca del punto de inserción en el abdomen del embrión. La CAM se separó, separada entonces de otros tejidos, se lavó rápidamente con solución salina fría para la remoción de restos de la yema, y se extendió sobre un portaobjetos, con un mínimo de fluido y evitando la formación de burbujas, grietas o pliegues en la membrana. La observación se hizo después de la colocación de un cubreobjetos de microscopio sobre la membrana, previniendo la formación de burbujas en la película líquida formada. La lente de aumento se ajustó para observación bajo campo brillante, sin filtros y pequeño aumento (típicamente 2x, y en algunos casos aumentos de 5 a 10x se usaron para la observación de detalles). Las imágenes se escanearon en archivos TIFF después de la captura en alta definición con el programa ACT-2U para una cámara DS-U1 anexa a una lente de aumento de microscopía estereoscópica Nikon SMZ1800, manteniendo las mismas condiciones e iluminación ajustable, balance de sombra y blanco para cada prueba. En cada prueba, la imagen se capturó del fondo, se mantuvieron los ajustes de iluminación y color para estandarizar las imágenes del material analizado. Se repitieron los ajustes para imágenes de campo oscuro, al mismo aumento.

Cada región de la misma muestra se representó en campo brillante y campo oscuro, para mejor observación de los detalles. El crecimiento de la red vascular se analizó con el programa Image J procesando las imágenes en imágenes binarias de campo brillante. La técnica permitió que la colecta de los resultados cuantitativos no dependiera de los cálculos combinando las imágenes de campo brillante y campo oscuro, aunque esta posibilidad se ha estudiado también. Este estudio fue importante para guiar el refinamiento de la colecta de los inventores y el procesamiento preliminar del material. Se reemplazó entonces con el algoritmo de análisis tan simple como sea posible para la construcción de imágenes binarias. El procedimiento para el procesamiento de imágenes de campo brillante, normalizadas a la imagen de fondo en imágenes binarias, se ha refinado y estandarizado. Se desarrolló un plug-in (unidad conectable) para Image J, el cual permite la observación continua de la imagen resultante durante un ajuste singular del umbral de binarización. Cada prueba completa se analizó, de acuerdo con este procesamiento de algoritmo común, y el umbral de binarización ajustado para cada lote de imágenes se procesó y se analizó en serie.

Para análisis cualitativo y documentación adicional, se obtuvieron imágenes con una cámara Canon PowerShot A640 acoplada con un objetivo de microscopio óptico Jenamed en aumentos de 32 x 250 x.

El inoculo típico fue de 2 x 104 células por huevo, en un volumen de medio de cultivo menor a 10 ml_. El crecimiento del melanoma fue acompañado por la inspección visual de la formación de masas pigmentadas en la CAM, la lente de aumento y el microscopio. Con la lente de aumento, la observación de opacidades en la imagen de campo oscuro definió el sitio de crecimiento de las células tumorales, incluso cuando el pigmento era aún escasamente visible. Bajo el microscopio, se observaron también células después de teñir el material no fijado con tionina o azul de toluidina a 0.1%. Para ambos colorantes, la diferenciación con alcohol ácido mejoró el contraste con el tejido normal, y permitió el registro de los portaobjetos. No se llevó a cabo el análisis cuantitativo del material teñido de esta manera, debido a que la deshidratación del material con alcohol cambia el diámetro de los vasos y el patrón de tinción obtenido no mostró reproducibilidad y calidad del contraste adecuado, hasta ahora.

Las dosis de MDJ y MDJ portado por ciclodextrina, puestas a prueba en cultivos de células, se incorporaron entonces en el modelo de los huevos, considerado el volumen fijo de 60 ml_ por huevo.

Los huevos usados se midieron mediante muestreo, y el volumen promedio de 60 mL se mantuvo a lo largo del período de prueba con una desviación estándar menor al 10%. El tratamiento se hizo de diferentes maneras, de acuerdo con el interés de la prueba. Para estudios de viabilidad, el tratamiento se llevó a cabo en albúmina, removida el tercer día de la incubación, antes de la apertura de los huevos y mantenida a 37°C hasta el día de la preparación de las soluciones y regreso al huevo, por el mismo agujero de la aguja. La reintroducción de la albúmina en el huevo en el séptimo día, fue precedida por un nuevo retiro de volumen para evitar un incremento en la presión del fluido y su extravasación. Las pruebas de viabilidad se monitorearon por hasta 10 días. Para estudios de efectos antitumorales, el tratamiento se hizo en una sola dosis en la CAM, el onceavo día de incubación. La viabilidad del tratamiento en la CAM se comparó con la viabilidad del tratamiento por albúmina.

Los efectos sobre la angiogénesis in vivo revelaron un nuevo perfil en la acción antitumoral del MDJ portado por ciclodextrina.

El MDJ demostró ser tóxico para las células de melanoma y HUVEC en el cultivo. En los cultivos de células, se encontró que la sustancia activa ejerció los efectos anti-angiogénicos y anti-cáncer a concentraciones muy similares. Fue posible identificar muy claramente la concentración tóxica para cada uno de los tipos de célula (figuras 10 y 11). En la prueba de toxicidad (MTT), la reducción del colorante, debida a la actividad mitocondrial preservada, se mantuvo a un valor constante a concentraciones de MDJ menores a 1 mM. Este comportamiento fue muy reproducible en los cultivos de células de HUVEC confluentes. Las curvas de crecimiento mostraron, también a concentraciones menores a 1 mM, una constante de tiempo de dualidad funcional de aproximadamente 20 horas. A mayores concentraciones, la actividad mitocondrial era comprometida, y el tiempo de dualidad funcional tendió hacia el infinito, es decir, las células dejaron de dividirse y murieron. En los cultivos de melanoma de murino, los resultados fueron muy similares, y las concentraciones tóxicas fueron muy cercanas.

En concentraciones tóxicas, el MDJ alteró la morfología de las células de los dos tipos de células, llevando también a la formación de células gigantes multinucleadas y pseudoinclusiones de las vacuolas.

Estos efectos del MDJ sobre la morfología sugirieron que la inducción de apoptosis y autofagia puede ocurrir no sólo en las células tumorales, sino también en el endotelio, y llevó a un estudio más detallado del ciclo celular de las HUVEC mediante citometría de flujo (figura 13). Los nuevos resultados reafirmaron la hipótesis de un objetivo de toxicidad compartido entre las células endoteliales y los tumores (figura 13 y cuadro 3).

Además, se demostró un efecto sobre el factor de crecimiento vascular, VEGF.

CUADRO 3 Efectos del MDJ sobre el ciclo celular y la producción del VEGF en HUVECs Las mitocondrias de las células endoteliales en cultivo mostraron activación en presencia del MDJ. Este efecto fue más evidente en respuesta al MTT en la siembra a baja densidad (figura 14). Bajo estas condiciones (1 x 104 células/mL), no a una siembra a alta densidad (2 x 105 células/mL), no hubo incremento en la producción de PGE2 por las HUVEC. La producción de PGE2 es normalmente la confluencia de estas células, pero podía mediar un efecto indirecto del MDJ.

El efecto tóxico sobre la proliferación de células endoteliales se demostró in vitro e in vivo en el modelo de CAM.

La presencia de células de melanoma disminuyó la supervivencia de los huevos. El MDJ recuperó parcialmente esta supervivencia. Los resultados de la CAM en el modelo confirmaron que los cuerpos de melanoma sufren una involución dependiente de la dosis bajo la acción de la sustancia activa.

Pruebas llevadas a cabo en el MDJ portado por ciclodextrina Las pruebas llevadas a cabo en el MDJ portado por ciclodextrina in vitro, demostraron que se preservó la citotoxicidad del compuesto activo para las HUVEC y B16F10, ocurriendo en dosis mucho menores (figura 22). El vehículo fue inerte a concentraciones equivalentes a las usadas en la formulación. Se puso a prueba también el MDJ portado por ciclodextrina con tejidos y líneas de células de cáncer humanas ME1001. Se observó una citotoxicidad similar.

El MDJ portado por ciclodextrina se puso a prueba entonces en un modelo in vivo. El primer estudio confirmó una reducción de las dosis de la sustancia activa en la estructura vascular, y un efecto protector en presencia de melanoma.

EJEMPLO 7 Prueba de crecimiento anti-células in vitro y experimento de anti- angioqénesis in vivo con el MDJ portado por liposomas del ejemplo 2 El MDJ portado por liposomas preparado en el ejemplo 2 se puso a prueba en nueve líneas de células de cáncer: UACC62 - melanoma, MCF7 - resistencia al cáncer, NCIADR - cáncer de mama resistente a fármacos múltiples, 7860 - cáncer de riñon, NC1460 - cáncer de pulmón, PC03 - resistencia al cáncer de próstata, OVCAR03 - cáncer de ovario, HT29 - cáncer de colon, y K562 - leucemia. Estas líneas de células se trataron con la nanoemulsion preparada en el ejemplo 2 con varias concentraciones de MDJ. Como se muestra en la figura 26, el MDJ portado por CD inhibió el crecimiento tumoral en una forma dependiente de la dosis. La figura 27 muestra el efecto del tamaño del nanoportador sobre las actividades de anti-angiogénesis in vivo. Más específicamente, la nanoemulsion con nanoportadores de 100 nm exhibió mejor actividad que la nanoemulsion con nanoportadores de 50 nm.

Además, como se demuestra mediante la figura 28, el MDJ portado por liposomas mostró actividad mejorada de crecimiento anti-células cuando el tamaño de los liposomas fue menor a 100 nm.

EJEMPLO 8 Prueba de crecimiento anti-células in vítro [Este ejemplo se basa en el manuscrito que describe los estudios de Harvard].

El MDJ nanoportado (en donde los nanoportadores fueron CD, liposoma o LDE) se puso a prueba en las 11 líneas de células siguientes (3 leucemias, 2 cánceres de mama, un macrófago y 5 cánceres de próstata), y todos se adquirieron de la American Type Culture Collection (ATCC). Las células se cultivaron en medio de crecimiento respectivo sugerido por la ATCC (RPMI-1640, DMEM, EMEM o en medio F12-k complementado con suero de bovino fetal al 10% y penicilina/estreptomicina. Los detalles de las líneas de células se presentan en el cuadro 4 siguiente: CUADRO 4 La formulación de MDJ nanoportado se disolvió en agua Milli-Q y se almacenó a temperatura ambiente. Antes del uso, la formulación se purificó usando un filtro de 0.22 mieras para evitar la contaminación.

Tres millones de células de cada línea de células se distribuyeron igualmente en tres cavidades de una placa de seis cavidades, y se cultivaron durante la noche. Al día siguiente, la formulación de MDJ nanoportado que contenía 1 µ? de MDJ se añadió en una cavidad, mientras que la misma concentración de nanoportadores (o nanopartículas) vacíos se añadió en la segunda cavidad, y la tercera cavidad que posee células se mantuvo intacta sin fármaco o nanoportadores vacíos ("control"). El efecto apoptótico de la formulación se observó a 6 horas, 12 horas y 24 horas después del tratamiento bajo un microscopio invertido.

El MDJ nanoportado mostró un gran efecto del fenómeno de apoptosis en las líneas de células de cáncer que se pusieron a prueba. El efecto de apoptosis se observó en cada línea de células puesta a prueba, comenzando después de 6 horas del tratamiento con MDJ, y alcanzó el pico después de 24 horas. Algunas líneas de células de cáncer, tales como TIB-512, CRL-2876 y CRL-2314, fueron completamente o casi completamente muertas después de 24 horas (véase las figuras 38A a 40C), mientras que las otras mostraron un promedio de 60% a 70% de muerte de células (véase las figuras 41A a 41C). El resto de las células estaban en una etapa pre-apoptótica. La molécula tuvo su acción eligiendo como objetivo sólo células cancerosas, sugiriendo a los nanoportadores como un agente de suministro de fármacos efectivo en las células cancerosas. Las células control que tuvieron sólo nanopartículas vacías, mostraron muy poca apoptosis a ninguna apoptosis.

Las células cancerosas tienen diferentes formas de producir energía en comparación con las células sanas, la cual se conoce también como hipótesis de Warburg. En esta hipótesis, la mitocondria que produce la energía para las células cancerosas usa una vía no oxidativa en lugar de la vía oxidativa usada por las células sanas. Se ha reportado que el MJ elige como objetivo esta anomalía en las mitocondrias en las células cancerosas, y provoca la liberación del citocromo C, así como otras proteasas y caspasas. El MJ fue capaz de inducir el hinchamiento en las mitocondrias aisladas de células de hepatoma Hep 3B, pero no en las mitocondrias aisladas de células 3T3 no transformadas o de linfocitos normales. La liberación del citocromo C lleva a transición de la permeabilidad de la membrana mitocondrial, la despolarización de la membrana, el hinchamiento osmótico y de esta manera lleva a la apoptosis. La línea de células macrófagos como se enlista en el cuadro 4 se usó en este estudio como células no transformadas, en donde ningún efecto de apoptosis se observó ampliamente (véase las figuras 42A a 42C).

Los estudios llevados a cabo por el solicitante han sugerido que el MDJ nanoportado ejerce sus efectos citotóxicos independientemente de la transcripción, traducción y p53 (datos no publicados). Estudios previos (datos no publicados) del MDJ sólo mostraron resultados similares in vitro, pero el fármaco se degradó muy rápidamente in vivo y necesitó dosis muy altas para que se viera un efecto. Mediante la encapsulación de la molécula en nanopartículas, se mostró que el MDJ no se degradó in vivo y fue altamente efectivo en el tratamiento de células cancerosas con una dosis muy baja, por ejemplo, mil veces menor que la que se usó con la molécula desnuda.

Equivalentes La invención puede describirse en otras formas específicas sin que se aparte del espíritu o las características esenciales de la misma. Por lo tanto, las modalidades anteriores serán consideradas en todos los respectos como ilustrativas más que limitativas sobre la invención descrita en la presente. El alcance de la invención es indicado de esta manera por las reivindicaciones anexas más que por la descripción anterior, y se pretende que todos los cambios que estén dentro del significado y la gama de equivalencia de las reivindicaciones, sean abarcados en la misma.

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Una composición farmacéutica que comprende un solvente farmacéuticamente aceptable y una pluralidad de nanoportadores o microportadores que contienen dihidrojasmonato de metilo (MDJ), caracterizada porque los nanoportadores o microportadores se forman de una ciclodextrina o un dendrímero, o son partículas de nanoemulsión sintéticas (LDEs) que comprenden un núcleo de éster de colesterilo rodeado por una capa de fosfolípidos; los nanoportadores tienen un tamaño que varía de 1 nanómetro (nm) a 500 nm; o los microportadores tienen un tamaño que varía de 1 miera a 100 mieras; y la composición farmacéutica tiene una concentración de MDJ que varía de 1 nM a 1 M.

2.- La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque los nanoportadores se forman de una ciclodextrina y tienen un tamaño que varía de 3 nm a 100 nm.

3. - La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada además porque los nanoportadores de ciclodextrina tienen un tamaño que varía de 3.5 nm a 11 nm.

4. - La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada además porque los nanoportadores de ciclodextrina tienen un tamaño que varía de 50 nm a 100 nm.

5. - La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación , caracterizada además porque los nanoportadores son LDEs y tienen un tamaño que varía de 30 nm a 500 nm.

6. - La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada además porque las LDEs tienen un tamaño que varía de 50 nm a 110 nm.

7. - La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque los nanoportadores se forman de un dendrímero y tienen un tamaño que varía de 2 nm a 500 nm.

8.- La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada además porque el dendrímero es poliamidoamina (PAMAM).

9. - La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizada además porque la concentración de MDJ varía de 1 nM a 100 µ?.

10. - La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizada además porque la concentración de MDJ varía de 10 µ? a 100 mM.

11. - La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizada además porque la concentración de MDJ varía de 100 mM a 1 M.

12. - La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizada además porque los nanoportadores o microportadores contienen además fosfato diácido de 2-aminoetilo, 3,7-dimetil-2,6-octadienal, salicilato de metilo o ácido abscísico.

13. - La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizada además porque el solvente farmacéuticamente aceptable es agua, un alcohol, o una mezcla de los mismos.

14. - La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizada además porque los nanoportadores o microportadores contienen además un compuesto no de jasmonato.

15. - Una composición farmacéutica que comprende un solvente farmacéuticamente aceptable y una pluralidad de nanoportadores o microportadores que contienen un compuesto de jasmonato, caracterizada porque los nanoportadores o microportadores se forman de una ciclodextrina o un dendrímero, o son partículas de nanoemulsión sintéticas (LDEs) que comprenden un núcleo de éster de colesterilo rodeado por una capa de fosfolípidos; los nanoportadores tienen un tamaño que varía de 1 nanómetro (nm) a 500 nm; o los microportadores tienen un tamaño que varía de 1 miera a 50 mieras; y la composición farmacéutica tiene una concentración del compuesto de jasmonato que varía de 1 nM a 1 M.

16. - La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada además porque el compuesto de jasmonato se selecciona del grupo que consiste de ácido jasmónico, ácido 7-¡so- jasmónico, ácido 9,10-dihidrojasmónico, ácido 9,10-dihidro-isojasmónico, ácido 2,3-didehidrojasmónico, ácido 3,4-didehidrojasmónico, ácido 3,7-didehidrojasmónico, ácido 4,5-didehidrojasmónico, ácido 4,5-didehidro-7-isojasmónico, ácido cucúrbico, ácido 6-epi-cucúrbico, ácido 6-epi-cucúrbico-lactona, ácido 12-hidroxi-jasmónico, ácido 12-hidroxi-jasmónico-lactona, ácido 11-hidroxi-jasmónico, ácido 8-hidroxi-jasmónico, ácido homo-jasmónico, ácido dihomo-jasmónico, ácido 11-hidroxi-dihomo-jasmónico, ácido 8-hidroxi-dihomo-jasmónico, ácido tuberónico, ácido tuberónico-O-p-glucopiranósido, ácido cucúrbico-O- -glucopiranósido, ácido 5,6-didehidro-jasmónico, ácido 6,7-didehidro-jasmónico, ácido 7,8-didehidro-jasmónico, cis-jasmona, dihidrojasmona, y un éster de alquilo inferior de los mismos.

17. - La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada además porque el compuesto de jasmonato es jasmonato de metilo, y tiene una concentración de aproximadamente 1 nM a 1 µ?.

18. - La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada además porque el compuesto de jasmonato es jasmonato de metilo, y tiene una concentración de aproximadamente 1 µ? a 100 mM.

19.- La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada además porque los nanoportadores o microportadores contienen además un compuesto no de jasmonato.

20.- Un método de tratamiento de un trastorno relacionado con angiogénesis, que comprende administrar una cantidad efectiva de una composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, a un sujeto que necesita de la misma.

21.- El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado además porque el trastorno relacionado con angiogénesis es cáncer.

22. - El método de conformidad con la reivindicación 21 , caracterizado además porque el cáncer es leucemia, cáncer de colon, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de páncreas, cáncer de hígado, cáncer de piel, cáncer de ovario, melanoma o un sarcoma.

23. - El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado además porque el trastorno relacionado con angiogénesis es una enfermedad inflamatoria.

24.- El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado además porque la enfermedad inflamatoria es enfermedad inflamatoria del intestino.

25.- Un método de tratamiento de un trastorno relacionado con NF-??, que comprende administrar una cantidad efectiva de una composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, a un sujeto que necesita de la misma.

26.- El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado además porque el trastorno relacionado con NF-?? es una infección viral, bacteriana o micótica.