CN107970213A - 茉莉酮酸酯化合物的组合物和使用方法 - Google Patents

茉莉酮酸酯化合物的组合物和使用方法 Download PDF

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Abstract

本公开描述了纳米负载的和/或微米负载的茉莉酮酸酯化合物和它们的药物组合物，以及其治疗或预防血管生成相关或NF‑κB相关的病症的应用。还公开了制备纳米负载的和/或微米负载的化合物以及它们的组合物的方法。

Description

茉莉酮酸酯化合物的组合物和使用方法
本申请为申请号为CN201280056298.7，发明名称为“茉莉酮酸酯化合物的组合物和使用方法”的专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及对治疗和预防各种疾病和病症有用的茉莉酮酸酯化合物的药物组合物(例如，纳米负载或微米负载的茉莉酮酸酯化合物)。
背景技术
茉莉酮酸酯化合物或茉莉酮酸酯的特征是环戊酮环，并且其已知为面临压力的情况下由植物产生的植物应激激素。茉莉酮酸酯的例子包括但不限于茉莉酸(JA)、茉莉酮酸甲酯(MJ)和顺式/反式-茉莉酮(例如见于美国专利6,469,061和WO 2007/066337)。已经表明，MJ和JA能既有效又有选择性地抗肿瘤细胞(例如见于Flescher，Anti-Cancer Drugs2005，16：901-916和US 2002/0173470)。然而，当体内施用时，茉莉酮酸酯通常会在到达目标癌细胞之前被例如酯酶代谢掉，使得它们作为抗癌剂不那么有吸引力。
发明内容
本发明部分地提供了纳米负载或微米负载的茉莉酮酸酯，尤其是纳米负载或微米负载的二氢茉莉酮酸甲酯(MDJ，也称为2-(3-氧代-2-戊基环戊基)乙酸甲酯)，用于治疗或预防多种病症，如血管生成相关的病症和炎症性疾病的应用。MDJ的化学结构如下所示。
一方面，本发明提供了包含药学上可接受的溶剂和多个含有MDJ的纳米载体和/或微米载体的一种药物组合物。纳米载体和/或微米载体由环糊精或树枝形聚合物或脂质体或者是包含被磷脂外层包围的胆固醇酯核的合成纳米乳液颗粒(LDE)形成；纳米载体的尺寸范围为从1纳米(nm)至1000nm(例如1-900nm、1-800nm、1-700nm、1-600nm、1-500nm、1-400nm、1-300nm、1-200nm、1-100nm、1-90nm、1-80nm、1-70nm、1-50nm、1-30nm或1-10nm)；微米载体的尺寸范围为从1微米至50微米(例如从1微米至约40、30、20、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1.5微米)，该药物组合物含有MDJ的浓度范围为从1nM至1M(例如从1nM至10nM、1nM至100nM、1nM至1μM、1nM至10μM、1nM至100μM、100μM至1mM、100μM至10mM、100μM至100mM或100mM至1M)。
该药物组合物可以具有一个或多个下列特征。
药物组合物的MDJ的浓度范围为从1nM至10-100μM(例如1nM至10nM、10nM至100nM、100nM至1μM、1μM至10μM或10μM至100μM)，或从100μM至1mM(例如从100μM至200μM、300μM、400μM、500μM、600μM、700μM、800μM或至900μM)，或从100μM至10mM(例如从100μM、200μM、300μM、400μM、500μM、600μM、700μM、800μM或从900μM至1mM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM或至10mM)，或从100μM至100mM(例如从100μM、200μM、300μM、400μM、500μM、600μM、700μM、800μM、900μM或从1mM至10mM、20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM或至100mM)，或从10μM至1mM(例如从10μM、20μM、30μM、40μM、50μM、60μM、70μM、80μM或从90μM至0.1mM、0.2mM、0.3mM、0.4mM、0.5mM、0.6mM、0.7mM、0.8mM、0.9mM或至1mM)，或者1-100mM(例如1-10mM、1-20mM、1-30mM、1-40mM、1-50mM、1-60mM、1-70mM、1-80mM或1-90mM)，或从100mM至1M(例如从0.2M、0.3M、0.4M、0.5M、0.6M、0.7M、0.8M、0.9M至1M)。
纳米载体由环糊精形成，尺寸范围为从3nm至100nm，例如3.5-11nm、10-20nm、10-30nm、10-40nm、10-50nm、10-60nm、10-70nm、10-80nm、10-90nm、20-30nm、20-40nm、20-50nm、20-60nm、20-70nm、20-80nm、20-90nm、30-40nm、30-50nm、30-60nm、30-70nm、30-80nm、30-90nm、40-50nm、40-60nm、40-70nm、40-80nm、40-90nm或50-60nm、50-70nm、50-80nm、50-90nm或50-100nm。
纳米载体是脂质体或者LDE，尺寸范围为从30nm至500nm，例如50nm-110nm、30nm至50nm、30nm至100nm、30nm至150nm、30nm至200nm、30nm至250nm、30nm至300nm、30nm至350nm、30nm至400nm或30nm至450nm。
微米载体是脂质体或者LDE，尺寸范围为从约2μm至30μm(例如2-5μm、2-10μm、2-15μm、2-20μm或2-25μm)，约5μm至20μm(例如5-7.5μm、5-10μm、5-12.5μm、5-15μm或5-17.5μm)，或者大约10μm。进一步地，MDJ的浓度范围为从10-100μM至100mM(例如从50-100μM或从100μM、200μM、300μM、400μM、500μM、600μM、700μM、800μM或从900μM至1mM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM或至10mM、20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM或至100mM)或者100mM至1M(例如从0.2M、0.3M、0.4M、0.5M、0.6M、0.7M、0.8M、0.9M至1M)。
纳米载体由树枝形聚合物形成，尺寸范围为从1nm至500nm(例如2-10nm、2-20nm、2-50nm、2-100nm、2-150nm、2-200nm、2-250nm、2-300nm、2-350nm、2-400nm、2-450nm、10-100nm、10-200nm、10-300nm、10-400nm、10-500nm、50-100nm、50-200nm、50-300nm、50-400nm、50-500nm、100-300nm、100-500nm、200-500nm、300-500nm或400-500nm)。
该树枝形聚合物是聚酰胺-胺(PAMAM)。
MDJ的浓度范围为从1nM至10-100μM(例如1nM至10nM、10nM至100nM、100nM至1μM、1μM至10μM或10μM至100μM)、10-100μM至100mM(例如从50-100μM或从100μM、200μM、300μM、400μM、500μM、600μM、700μM、800μM或从900μM至1mM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM或至10mM、20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM或至100mM)，或者100mM至1M(例如从0.2M、0.3M、0.4M、0.5M、0.6M、0.7M、0.8M、0.9M至1M)。例如，MDJ的浓度为从100μM至1mM或50nM至70nM。
纳米载体或微米载体进一步包含2-氨基乙基磷酸二氢(或磷酸乙醇胺)、3,7-二甲基-2,6-辛二烯醛(或柠檬醛)、水杨酸甲酯、脱落酸或它们的衍生物或类似物。3,7-二甲基-2,6-辛二烯醛可以是顺式或反式异构体。
药学上可接受的溶剂是水、醇，或它们的混合物。
另一方面，本发明提供了包含药学上可接受的溶剂和多个含有茉莉酮酸酯化合物的纳米载体和/或微米载体的一种药物组合物。纳米载体和/或微米载体由环糊精或树枝形聚合物或脂质体形成，或者纳米载体和/或微米载体是包含被磷脂层包围的胆固醇酯核的合成纳米乳液颗粒(LDE)。纳米颗粒的尺寸范围为从1nm to 1000nm(例如1-900nm、1-800nm、1-700nm、1-600nm、1-500nm、1-400nm、1-300nm、1-200nm、1-100nm、1-90nm、1-80nm、1-70nm、1-50nm、1-30nm或1-10nm)；微米载体的尺寸范围为从1微米至50微米(例如从1微米至约40、30、20、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1.5微米)，该药物组合物的茉莉酮酸酯化合物的浓度范围为从1nM至1M(例如从1nM至10nM、1nM至100nM、1nM至1μM、1nM至10μM、1nM至100μM、100μM至1mM、100μM至10mM、100μM至100mM或100mM至1M)。
该药物组合物可以具有一个或多个下列特征。
茉莉酮酸酯化合物选自由茉莉酸、7-异茉莉酸、9,10-二氢茉莉酸、9,10-二氢异茉莉酸、2,3-二脱氢茉莉酸、3,4-二脱氢茉莉酸、3,7-二脱氢茉莉酸、4,5-二脱氢茉莉酸、4,5-二脱氢-7-异茉莉酸、南瓜酸、6-表南瓜酸、6-表南瓜酸内酯、12-羟基茉莉酸、12-羟基茉莉酸内酯、11-羟基茉莉酸、8-羟基茉莉酸、同型茉莉酸、二同型茉莉酸、11-羟基二同型茉莉酸、8-羟基二同型茉莉酸、块根油酮酸、块根油酮酸-邻-β-吡喃葡萄糖苷、南瓜酸-邻-β-吡喃葡萄糖苷、5,6-二脱氢茉莉酸、6,7-二脱氢茉莉酸、7,8-二脱氢茉莉酸、顺式茉莉酮、二氢茉莉酮和它们的低级烷基酯的组成的组。
该药物组合物的茉莉酮酸酯化合物的浓度范围为从1nM至1μM(例如从1、2、3、4、5、6、7、8或9nM至10、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900或950nM)，或从1nM至100μM(例如1nM至10nM、10nM至100nM、100nM至1μM、1μM至10μM或10μM至100μM)，或1nM至1mM(例如从50nM、100nM、200nM、500nM、1000nM、50μM或从100μM至200μM、300μM、400μM、500μM、600μM、700μM、800μM或至900μM)，或10μM至100mM(例如从50μM或从90μM至0.1mM、0.2mM、0.3mM、0.4mM、0.5mM、0.6mM、0.7mM、0.8mM、0.9mM、1mM、10mM、20mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM或至90mM)，或100μM至1mM(例如100μM至200μM、300μM、400μM、500μM、600μM、700μM、800μM或至900μM)，或100μM至10mM(例如从100μM、200μM、300μM、400μM、500μM、600μM、700μM、800μM或从900μM至1mM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM或至10mM)，或100μM至100mM(例如从100μM、200μM、300μM、400μM、500μM、600μM、700μM、800μM、900μM或从1mM至10mM、20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM或至100mM)，或10μM至1mM(例如从10μM、20μM、30μM、40μM、50μM、60μM、70μM、80μM或从90μM至0.1mM、0.2mM、0.3mM、0.4mM、0.5mM、0.6mM、0.7mM、0.8mM、0.9mM或至1mM)，或1-100mM(例如1-10mM、1-20mM、1-30mM、1-40mM、1-50mM、1-60mM、1-70mM、1-80mM或1-90mM)，或100mM至1M(例如从0.2M、0.3M、0.4M、0.5M、0.6M、0.7M、0.8M、0.9M至1M)。
纳米载体由环糊精形成，尺寸范围为从3nm至100nm，例如3.5-11nm、10-20nm、10-30nm、10-40nm、10-50nm、10-60nm、10-70nm、10-80nm、10-90nm、20-30nm、20-40nm、20-50nm、20-60nm、20-70nm、20-80nm、20-90nm、30-40nm、30-50nm、30-60nm、30-70nm、30-80nm、30-90nm、40-50nm、40-60nm、40-70nm、40-80nm、40-90nm或50-60nm、50-70nm、50-80nm、50-90nm或50-100nm。
纳米载体是LDE，尺寸范围为从30nm至500nm，例如50nm-110nm、30nm至50nm、30nm至100nm、30nm至150nm、30nm至200nm、30nm至250nm、30nm至300nm、30nm至350nm、30nm至400nm或30nm至450nm。
微米载体是脂质体或LDE，尺寸范围为从约2μm至30μm(例如2-5μm、2-10μm、2-15μm、2-20μm或2-25μm)，约5μm至20μm(例如5-7.5μm、5-10μm、5-12.5μm、5-15μm或5-17.5μm)，或约10μm。进一步，茉莉酮酸酯化合物是MDJ，并且MDJ的浓度范围为从100mM至1M(例如从0.2M、0.3M、0.4M、0.5M、0.6M、0.7M、0.8M、0.9M至1M)。
纳米载体由树枝形聚合物形成，尺寸范围为从2nm至500nm(例如2-10nm、2-20nm、2-50nm、2-100nm、2-150nm、2-200nm、2-250nm、2-300nm、2-350nm、2-400nm、2-450nm、10-100nm、10-200nm、10-300nm、10-400nm、10-500nm、50-100nm、50-200nm、50-300nm、50-400nm、50-500nm、100-300nm、100-500nm、200-500nm、300-500nm或400-500nm)。
该树枝形聚合物是聚酰胺-胺(PAMAM)。
茉莉酮酸酯化合物是MDJ，并且MDJ的浓度范围为从1nM至10-100μM、10-100μM至100mM或100mM至1M，例如100μM至1mM或50nM至70nM。
茉莉酮酸酯化合物是MJ，并且MJ的浓度范围为从1nM至1μM、10-100μM至100mM或100mM至1M，例如100μM至1mM或50nM至70nM。
纳米载体或微米载体进一步包含2-氨基乙基磷酸二氢(或磷酸乙醇胺)、3,7-二甲基-2,6-辛二烯醛(或柠檬醛)、水杨酸甲酯、脱落酸或它们的衍生物或类似物。3,7-二甲基-2,6-辛二烯醛可以是顺式或反式异构体。
药学上可接受的溶剂是水、醇或它们的混合物。此处描述的任何化合物可以另外包括一个或多个非茉莉酮酸酯化合物，例如2-氨基乙基磷酸二氢(或磷酸乙醇胺)、3,7-二甲基-2,6-辛二烯醛(或柠檬醛)、水杨酸甲酯、脱落酸、天然氨基酸、Ca2+、Zn2+或它们的衍生物或类似物。
在又一个方面中，本发明描述了此处描述的纳米负载和/或微米负载的茉莉酮酸酯化合物或它们的药物组合物用于治疗或预防血管生成相关的病症，例如癌症或炎症性病症(例如炎症性肠病症、急性皮炎、骨盆发炎病症或扁桃体炎)的应用。
在另一个方面中，本发明描述了此处描述的纳米负载和/或微米负载的茉莉酮酸酯化合物或它们的药物组合物用于治疗或预防NF-κB相关的病症，例如病毒、细菌或真菌感染的应用。
进一步地，本发明的特征是此处描述的纳米负载和/或微米负载的茉莉酮酸酯化合物或它们的药物组合物用于在体外或体内抑制癌细胞生长的应用。例如，适合用于本发明方法的癌细胞系包括：UACC62-黑素瘤、MCF7-抗药性癌、NCIADR-多药抗药性乳腺癌、7860-肾癌、NC1460-肺癌、PCO3-抗药性***癌、OVCAR03-卵巢癌、HT29-结肠癌、K562-白血病、TCP-1003(三阴性乳腺癌序列3)、Caco-2-结肠癌、都具有类间充质或腔形态的18三阴性乳腺肿瘤细胞系序列；乳腺癌细胞系HCC38(编号：CRL-2314TM)和MCF7(编号：HTB-22TM)；***癌细胞系PC-3(编号：CRL-1435TM)；***癌细胞系VCaP(编号：CRL-2876TM)；***癌细胞系22Rv1(编号：CRL-2505TM)；***癌细胞系DU 145(编号：HTB-81TM)；***癌细胞系LNCaP克隆FGC(编号：CRL-1740TM)；白血病细胞系MOLT-4(编号：CLR-1582TM)；白血病(AML)细胞系KG-1(编号：CCL-246TM)；白血病(CML)细胞系K-562(编号：CCL-243TM)；人类白血病细胞系CCRF-CEM(编号：CCL-119TM)；CLL白血病细胞系Hs 505.T(编号：CRL-7306TM)；Jurkat细胞系(白血病，编号：TIB-156TM)；Molm细胞系(白血病，例如Molm-13、Molm-14、Molm-16、Molm-17和Molm-18)、Nomo细胞系(白血病，例如NOMO-1)和Ras突变细胞。
此处描述的纳米负载和/或微米负载的茉莉酮酸酯化合物(例如MDJ)或它们的药物组合物具有下列优势。在体外和/或体内，它们对一些癌症例如***癌、乳腺癌、黑素瘤、结肠癌、白血病显示抗癌活性，同时对体内健康细胞显示几乎没有或没有毒性。它们新颖的作用机理可以补充其它的已建立的用于***癌症的药物治疗法。例如，对于重度疾病，本发明的组合物可以减少具有副作用的激进治疗法的使用，对于局部疾病，本发明的组合物可以延长激素治疗的灵敏度的有效性，并延缓发展成转移性疾病。
本发明还描述了合成此处叙述的纳米负载和/或微米负载的茉莉酮酸酯化合物或它们的药物组合物的方法。
附图说明
术语"A-14"和"A14"在涉及用来测量的MDJ纳米负载的复合物的图中是可以互换地使用。
图1：(A)LDE中MDJ的色谱图；(B)LDE负载的MDJ的扫描电子显微镜图像(示范的脂质体负载的MDJ)；(C)LDE负载的MDJ和氨基酸的扫描电子显微镜图像。
图2：在用环糊精负载的MDJ处理的小鼠结肠肿瘤中多且均匀分布的CASPASE-3表达(i.p.)。
图3：在MDJ处理的(i.r.)小鼠中不均匀的CASPASE-3表达，表面上局限在结肠癌瘤的上皮细胞。
图4A-4O：(A)在环糊精负载的MDJ处理的小鼠(GT)和对照组(GC)中肿瘤体积变化的示意图。注意所有处理过的动物在肿瘤体积上呈现明显的下降。(B和C)在实验结束时代表性肿瘤的宏观视图。与对照组肿瘤(C)相比，来自环糊精负载的MDJ处理过的动物的肿瘤(B)更小，并且呈现淡色的、坚硬的外层和较软的核心。病理解剖学显示在环糊精负载的MDJ处理过的动物的肿瘤(E)中存在比对照组(D)大的多的坏死区域(N)。注意坏死病灶被高色浓度的胶质母细胞瘤包围，这是所谓的"poi-坏死区域"(PN)。对照组肿瘤细胞是作为被小血管(黑色箭头)紧密伴随的网络线的细胞(在很好的分界线中)组织成的(F和H)。如图4G所示，在环糊精负载的MDJ处理过的动物中，空间组织被严重破坏，存在血细胞渗漏(白色箭头)和微出血性病灶(图4I)。CD34阳性免疫染色细胞以很高数量存在于对照组肿瘤的基质中(图4J)，而GT肿瘤在CD34染色细胞的数量上呈现明显的、统计上显著的降低(图4K和4L)。在对照组肿瘤的肿瘤入侵前沿区域(IF)中VEGF免疫染色显示血管的有组织的网络(图4M)。在GT肿瘤中，IF区域呈现明显的空间组织的破坏和较少的阳性细胞(图4N)。定量分析表明GT组中在IF和PN区域VEGF阳性细胞的数量显著下降(图4O)。Mann-Whitney测试(*p<0.01)
图5A-5D：GT和CG肿瘤中基因表达的变化。如基因芯片分析所发现，与对照组肿瘤相比，在环糊精负载的MDJ肿瘤中最先上调和下调的基因的名单。还显示在两组之间基因的表达方式至少有两倍的变化。
图6A-6E：基因芯片数据的示意图。在图6A中，数据组的散点图显示沿中轴(本征向量)两组的基因分布。被分析的基因是按照最小到最大范围来分布的，包括它们的倍数变化值，并由颜色缺陷显示。在图6B中，聚类算法(K-平均)如分级聚类基于表达谱的相似性显示合并在一起的最相似的实体。表示蛋白质的基因分类的蛋白质相互作用存在于Ingenuity数据库中。它们由颜色符号代表(绿色符号表示在环糊精负载MDJ之后有较小诱导的蛋白质，红色符号表示有较高诱导的蛋白质)。颜色的强度表示组之间诱导强度的差异。空符号代表连接蛋白质。只有几个有色蛋白质不是直接或间接地通过连接蛋白质来连接。涉及血管生成的一些因素在图6C中，整体图片可见于图6D。在图6E中，对一些样品基因用基因芯片数据和qRP-PCR的方法可以观察到一致的结果。
图7A-7T：NFκB、TGFβ、HIF-1和COX-2表达。图7A-7C表明当与GC组相比时，GT组中通过蛋白质印迹，NFκB的两个亚基都有明显的减少。此外，Southwestern印迹杂交组织化学分析证实当与GB组(图7D)相比时，GT组(图7E)中NFκB转录至细胞核几乎消失了。唯一的例外是仅在GT组中的有受损的血管的区域中血管有显著的和高度的NFκB染色(图7F)，见H和E染色。注-血管数量很少，这可能不会影响由WB分析的NFκB的整体量化。当与GT(图7I)相比时，GC组的TGFβ免疫染色更强，主要在PN区域如用黑色箭头划定的界线(图7H)，这已被形态测定法确认(图7J)。此外，当与GT(图7M和7N)相比时，GC组的HIF-1免疫染色强得多，主要在PN区域(图7K和7L)，这已被形态测定法(图7O)和蛋白质印迹分析(图7P和7Q)证实。COX-2染色显示在GC肿瘤中入侵前沿较高浓度的明显的细胞浓度，网络线中有组织的细胞(图7R)，而这在GT组中已消失了，在该肿瘤中还发现了该组织的明显的组织破坏(图7S)。形态测定法(图7T)证实GT组中COX-2的IHC表达下降，该肿瘤的中心核除外。Mann-Whitney测试(*p<0.01)。
图8A-8T：干细胞标记(CD133、Oct4和MT)和细胞凋亡标记(Tunel和CASPASE3)。图8A-8F显示了两个干细胞标记Oct4和CD133的IHC染色的相似模式。当与GT相比时(分别为图B和F/G)，GC组中免疫染色更深，主要在PN区域(分别为图A和D/E)，这已被形态测定法证实(分别为图C和H)。当与GT相比时(图L/M)，GC组中MT免疫染色更深，主要在IF区域(图I/J)，这已被形态测定法证实(图N)。MT染色还显示GT组中细胞索和血管有重要的组织破坏。TUNEL和Caspase-3染色都表明与GC组相比(分别为图O和R)，GT组中评价的所有三个区域都有较高的细胞凋亡水平(分别为图P和S)，这已被形态分析证实(图Q和T)。Mann-Whitney测试(*p<0.01)。
图9：肿瘤组织缺氧在癌症进展中角色和环糊精负载的MDJ在切断肿瘤信号***中角色的提出的模型。
图10：在系列稀释的MDJ存在下，MDJ对96孔板中内皮细胞(HUVEC,2x 105细胞/孔)生长的影响。主轴、空心符号：由MTT减少测量的细胞毒性。每个点代表在独立重复试验中执行的四次测量的四个读数的平均值，对照组除外。未处理的对照组的测量值在图中以相应的误差线表示。副轴、实心符号：从细胞培养计算的折叠时间(folding time)。每个点代表三个独立实验的平均值。
图11：在系列稀释的MDJ存在下，MDJ对96孔板中鼠科黑素瘤细胞(B16-F10，1x 104细胞/孔)生长的影响。主轴、空心符号：由MTT减少测量的细胞毒性。每个点代表在独立重复试验中执行的四次测量的四个读数的平均值，对照组除外。未处理的对照组的测量值在图中以相应的误差线表示。副轴、实心符号：从细胞培养计算的折叠时间。每个点代表三个独立实验的平均值。
图12：在对照条件下(A和C)或暴露于1mM的MDJ 60小时后(B和D)，RPMI介质中载玻片上内皮细胞(A和B)或鼠科黑素瘤B16F10(C和D)生长至汇合的代表性图像。
图13：体外暴露18小时后在HUVEC中MDJ对细胞周期的影响。用于每个试验的浓度在图中显示。用碘化丙啶简单标记后，测量细胞周期在BD FACScalibur设备上实施。用吖啶橙染色作为细胞凋亡进程的对照。
图14：在24孔低密度区域(HUVEC，1x 104细胞/孔)中MDJ对内皮细胞存活率的影响，如同在96孔板中用MTT减少实验所测量的。每个点代表在四个独立实验中实施的八个读数的平均值，实线代表用作对比的未曝光的对照组的测量。对线粒体的影响由线粒体红色荧光探针(Mitotracker Red)染色和共聚焦显微镜观察证实，并且在4小时暴露时已经可以观察到(见图15)。
图15：在24孔板玻璃盖玻片25mm上的低密度区域，4小时暴露后MDJ对内皮细胞的线粒体活性的影响，用线粒体红色荧光探针荧光共聚焦显微镜测量，增加了80x(40x+2x数字放大)。校正参数对所有测量保持。与线粒体的荧光染色相一致的亮度的测量在相关标记区被定量，表示在暴露于低浓度MDJ 24小时时细胞也有数量或线粒体活性的增加。等于或大于1mM的浓度导致标记强度/区域降低。
图16：在24孔板玻璃盖玻片25mm上的低密度区域，24小时暴露后MDJ对内皮细胞的线粒体活性的影响，在共聚焦显微镜中用线粒体红色荧光探针测量，40x放大。校正参数对所有测量保持，每个点是六次独立测量的平均值。当以他们自己的卵清蛋白溶液施用时，卵对MDJ有很好的耐受性。
图17：体内存活研究中MDJ的毒性。受精卵在从卵本身分离的5mL体积的白蛋白中以100、50、10、5μL每卵(n＝5)的剂量暴露于MDJ。对照组暴露于没有MDJ的煤介物。图例中显示的浓度是假定体积为60mL/卵来计算的。
图18：与未暴露的对照组(C)、1uL(B)、5uL(A)每卵相一致，加入MDJ的白蛋白对CAM模型COSES中血管形成的影响。黑素瘤细胞的存在降低了卵的存活率。MDJ部分地恢复了它的存活率。模型中CAM的结果证实在活性物质作用下黑素瘤实体经历剂量依赖性的退化。
图19：在注入有B16F10鼠科黑素瘤、1x 104细胞/孔的卵中存活率的体内研究中MDJ的毒性。受精卵在5ml体积的从卵本身分离的白蛋白中以100、50、10、5μL每卵(n＝5)的剂量暴露于MDJ。对照组暴露于没有MDJ的煤介物。图例中显示的浓度是假定体积为60mL/卵来计算的。
图20：MDJ施用的白蛋白对CAM区域中黑素瘤生长的影响。所有样品都接种有B16F10鼠科黑素瘤，1x 104细胞/孔。A和B为5x放大图像，C和D为同样的区域10x放大图像。A和C是未处理的对照组，B和D是用单个剂量的5uL MDJ处理。肿瘤生长是和血管紧密相关的。黑素瘤诱导血管形成并且生长为接近于CAM的主要血管。
图21：MDJ施用的白蛋白对CAM区域中黑素瘤生长的影响。样品接种有B16F10鼠科黑素瘤，1x 104细胞/孔。A：明视野中数字化图象estereroscópica放大镜和B：同样的区域，暗视野中接收的图像。10X放大。
图22：环糊精负载的MDJ对96孔培养皿中内皮细胞(HUVEC，1x104细胞/孔)或鼠科黑素瘤(B16F10，1x 104细胞/孔)生长的影响。每个点代表在独立的重复试验中运行的三个读数的平均值。
图23：暴露24小时后，环糊精负载的MDJ对96孔培养皿中内皮细胞(HUVEC，1x104细胞/孔)或鼠科黑素瘤(B16F10，1x104细胞/孔)存活力的影响，由MTT试验测量得到。每个点代表在独立重复试验中运行的三个读数的平均值。
图24：在血管形成的CAM模型中，环糊精负载的MDJ对血管生长的影响。A和B：没有染色的新鲜材料上的显微照片。Jena显微镜，并联电容器照明。8x增大。B和D：没有染色的新鲜材料上的显微照片，Jena显微镜，并联电容器照明，32x增大。样品在独立的实验中获得。A和C：未处理的对照组。B和D：相当于1μMMDJ应用于CAM的剂量。
图25：在培育第8天时接种B16F10鼠科黑素瘤，1x104细胞/孔的CAM中，环糊精负载的MDJ对血管形成模型中血管生长的影响。显微照片釆自没有染色的新鲜材料，Jena显微镜，并联电容器照明，32x增大。A：未处理的对照。B：培育11天时应用在CAM的用环糊精负载的MDJ处理的样品，相当于1μM的MDJ。
图26：CD负载的MDJ(尺寸范围为3-30nm)对九个癌细胞系的影响：UACC62、MCF7、NCIADR、7860、NC1460、PCO3、OVCAR03和HT29、K562。X轴是基于总体积样品的MDJ浓度；使用的纳米乳液中MDJ的浓度是1毫摩尔。
图27：纳米载体对血管形成活性的尺寸的影响；使用的纳米负载的MDJ的浓度为从1nM至10-100微摩尔。
图28：大豆磷脂酰胆碱脂质体负载的MDJ(脂质体尺寸为50-120nm)对九个癌细胞系的影响：UACC62、MCF7、NCIADR、7860、NC1460、PCO3、OVCAR03和HT29、K562。X轴是基于总体积的样品的MDJ浓度；使用的纳米乳液中MDJ的浓度是1毫摩尔。
图29：带有MDJ-大豆磷脂酰基脂质体的纳米载体复合物(三个基本单元)的UACC-62细胞培育8小时后，MDJ-大豆磷脂酰基脂质体的纳米载体复合物对UACC-62细胞的线粒体活性的影响，通过线粒体红色荧光探针红色荧光共聚焦显微镜测量。MDJ浓度是10-3M，复合物的尺寸为从25nm至200nm。
图30：暴露24小时后，MDJ-大豆磷脂酰基脂质体的纳米载体复合物对内皮细胞(HUVEC)或鼠科的黑素瘤(B16F10)存活力的影响，通过MTT试验测量。
图31：纳米乳液中MDJ浓度是10-3M的MDJ-PAMAM纳米载体复合物的抗血管形成的影响。顶部区域清楚地显示为了提供营养以使肿瘤生长的鼠科黑素瘤(B16F10)的肿瘤块形成和新血管网的形成，然而如底部区域所示，用该复合物处理后没有血管网形成。
图32：样品中MDJ浓度是10-3M的MDJ-LDE纳米载体复合物对UACC-62细胞的抗血管形成的影响。
图33：样品中MDJ浓度是10-4M的MDJ-大豆磷脂酰胆碱脂质体纳米载体复合物对UACC-62细胞的抗血管形成的影响。
图34：用MDJ-LDE微米载体复合物(尺寸为10微米，MDJ浓度是10-3至10-1M)激活的巨噬细胞对白血病细胞的影响。A：被巨噬细胞(暗的)吞没的癌细胞(亮的)的显微图片；B：巨噬细胞内部被消化的癌细胞的显微图片。
图35：体内纳米负载的MDJ在低剂量时对血管形成的影响：上面两个图像中MDJ的浓度是10μM，下面三个图像中是100nM。
图36：体内MDJ和浓度为30μM的纳米负载的MDJ的血管形成效果。
图37：茉莉酮酸酯作用抗癌细胞的通路(见Flescher,Cancer Lett.2007；245(1-2):1-10.)。
图38：用A：水(对照)、B：空的纳米颗粒和C：负载MDJ的纳米颗粒处理24小时后，Jurkat细胞系(白血病、编号：TIB-156TM)的倒置显微镜图像。在图38C中，处理24小时后几乎所有的细胞死亡。
图39：用A：水(对照)、B：空的纳米颗粒和C：负载MDJ的纳米颗粒处理24小时后，***癌细胞系VCaP(编号：CRL-2876TM)的倒置显微镜图像。在图39C中，处理24小时后几乎所有的细胞死亡。
图40：用A：水(对照)、B：空的纳米颗粒和C：负载MDJ的纳米颗粒处理24小时后，乳癌细胞系HCC38(编号：CRL-2314TM)的倒置显微镜图像。在图40C中，处理24小时后几乎所有的细胞死亡。
图41：A：用水(对照)、B：空的纳米颗粒和C：负载MDJ的纳米颗粒处理24小时后，***癌细胞系22Rv1(编号：CRL-2505TM)的倒置显微镜图像。在图41C中，处理24小时后60％-70％细胞死亡。
图42：用A：水(对照)、B：空的纳米颗粒和C：负载MDJ的纳米颗粒处理24小时后，巨噬细胞的倒置显微镜图像。
图43：当与结合有锌、钙或氨基酸的A-14接触时血管破碎的图像。相对于结合钙或氨基酸的A-14，结合锌的A-14对血管破碎显示最显著的影响。1：有丙氨酸的A-14；2：有银的A-14；0.5：有锌的A-14；5：有钙的A-14和c：对照。载体是脂质体。
图44：左边图像：大量血管，血管生成是在肿瘤细胞周围形成的。为了生长，肿瘤需要接受大量营养物和氧。由于这样一个需求，释放VEGF(血管内皮生长因子)后，该血管复合物在肿瘤内或进入肿瘤形成。右边图像：用与氨基酸共轭的A-14处理后，大部分血管复合物消失了。该现象被称为抗血管生成(血管的破坏)，阻止肿瘤接受其生长需要的营养物和氧。载体是脂质体。
图45：显示结合氨基酸的A-14破坏内皮细胞的图像。载体是脂质体。
图46：显示结合锌的A-14在乳腺癌血管周围抗血管生成作用的图像。载体是脂质体。
具体实施方式
茉莉酮酸酯已被发现是直接地并且选择性地作用人类癌细胞线粒体的有潜力的抗癌剂(例如见Rotem et al.,Cancer Res 2005；65:1984-1993；Costantini et al.,JNCI2000；90:1042-1053)。已有报道称茉莉酮酸酯成员和一些它们的合成衍生物在体外和在体内表现出抗癌活性。例如：茉莉酮酸酯延长了有EL-4淋巴瘤的小鼠的寿命，MJ对化学抗性B-淋巴瘤细胞具有活性，并且初步数据表示MJ通过细胞凋亡途径显示有细胞毒性(例如见Flescher,Cancer Lett.2007；245(1-2):1-10；Fingrut et al.,Br J Pharmacol.2005；146(6):800-808；Fingrut et al.,Leukemia,2002；16:608-616。)。为了解释茉莉酮酸酯的抗癌活性，作用机理已被提出(见id.和图37)。然而，抗癌剂的该新家族面临的主要问题是这些化合物在体内施用的困难。作为酯，在体内施用时，茉莉酮酸酯通常会在到达目标癌细胞之前被例如酯酶代谢掉，使得它们作为抗癌剂不那么有吸引力。
本发明提供纳米负载的和/或微米负载的茉莉酮酸酯的药物组合物。本发明的组合物是"药物"组合物，意思指它们适合于医药用途。相应的，本发明使用的术语"组合物"意图包含药物组合物，即使"药物"没有清楚地表述。本发明组合物优选提供在它们到达体内靶细胞之前抗降解的稳定性。本发明部分地基于意外发现纳米负载和/或微米负载的茉莉酮酸酯，尤其是纳米负载和/或微米负载的MDJ，显示抗血管生成活性。本发明还部分地基于出乎意料地发现纳米负载和/或微米负载的MDJ比纳米负载的MJ在抗肿瘤细胞方面更加有效，例如至少更加有效103倍，并对正常细胞和血管的毒性更小。本发明还部分地基于出乎意料地发现纳米负载和/或微米负载的茉莉酮酸酯，尤其是纳米负载和/或微米负载的MDJ或MJ，基于不同的剂量或浓度显示抗血管生成活性或血管生成活性。例如,在1nM至约10-100μM的低浓度时，纳米负载和/或微米负载的MDJ呈现血管生成效果，而当浓度大于100μM时，纳米负载和/或微米负载的MDJ呈现抗血管生成效果。至于MJ，在1nM至约1μM的低浓度时，纳米负载和/或微米负载的MJ呈现血管生成作用，而当浓度大于1μM(例如大于2μM或大于5μM)时，纳米负载和/或微米负载的MJ呈现抗血管生成效果。
上述出乎意料的发现表示纳米负载的/微米负载的茉莉酮酸酯可用作新的和有希望的靶向抗癌治疗。
如在本说明书和附加的权利要求书中所使用的，单数形式"一"、"一个"和"该"包括复数形式，除非上下文另有明确规定。因此，例如"一个茉莉酮酸酯化合物"或"一种茉莉酮酸酯化合物"可能不仅包括一种茉莉酮酸酯，而且包括两种或多种不同茉莉酮酸酯的组合或混合物，包括它们的前体药物、酯、盐、代谢产物。
本文使用的短语"例如"、"诸如"、"如"或"包括"意在介绍进一步阐明更一般的主体的实施例。提供实施例仅仅是作为对理解本发明的帮助，并不意味着以任何方式进行限定。
在本发明的说明和权利要求中，下列术语将以下文陈述的定义来使用。
本文使用的短语“包含”、“由...形成/组成/构成”、“包括”、“有分子式”或“有结构式”并不意在限定，而是如术语“包括”通常使用的意思一样使用，除非上下文另有明确规定。
本文使用的术语“纳米载体”是指适用于负载和传送活性成分(例如药物)至靶细胞、组织或器官的载体或煤介物，该煤介物尺寸范围为约1纳米(nm)至约1000nm。本文使用的术语“微米载体”是指适用于负载和传送活性成分(例如药物)至靶细胞、组织或器官的载体或煤介物，该煤介物尺寸范围为约1微米至约100微米。在一个实施方式中，微米载体由一簇纳米载体形成，例如LDE微米载体由一簇LDE纳米载体形成。优选的是，纳米载体或微米载体是药学上可接受的载体。
本文使用的术语“纳米负载的/微米负载的化合物”或术语“含有化合物的纳米载体/微米载体”是指伴随或结合化合物的纳米载体/微米载体的复合物。伴随或结合可以通过化学键(例如共价键)、氢键、范德华力、库仑相互作用等产生。在一个实施方式中，化合物是封装在纳米载体/微米载体中的。在另一个实施方式中，化合物部分封装在纳米载体/微米载体中或在纳米载体/微米载体的表面(例如作为纳米载体/微米载体表面的一部分或在外面又接合在表面上)。
术语“乳液”是指分散在第二个液体(连续相)中的第一个液体(分散相)的小球或颗粒的悬浮液，第一个液体与第二个是通常不能融合的。
本文使用的术语“纳米乳液”是指具有分散颗粒的乳液，该分散颗粒的尺寸范围为从约1nm至约50um(例如1nm-50um、1nm-40um、1nm-30um、1nm-20um、1nm-10um、1-5000nm、1-4000nm、1-3000nm、1-2000nm、1-1000nm、1-900nm、1-800nm、1-700nm、1-600nm、1-500nm、1-400nm、1-300nm、1-200nm、1-150nm、1-100nm、1-90nm、1-80nm、1-70nm、1-60nm、1-50nm、1-40nm、1-30nm、1-20nm、1-10nm、1-5nm、50-100nm、3-150nm或3-20nm)。小尺寸的分散相使得纳米乳液趋向呈现为清澈的。
术语“LDE”是指在组成和行为上类似低密度脂蛋白(LDL)的纳米乳液颗粒。例如，一旦被引入循环***，多种血浆蛋白(例如apoE)被吸附在LDE颗粒的表面，接着将LDE引导至表达LDL受体(LDLR)的细胞。LDE是无蛋白的，典型地由被单层磷脂包围的胆固醇酯核心组成。LDE和它们制备的更多详细描述例如见Ginsburg et al.(1982),JBiol Chem 257:8216-8227；Maranhao et al.(1993),Lipids 28:691-696和Favero et al.(2010),BiolRes 43:439-444。本文使用的术语“LDE”是指可与本发明相一致地使用的类脂质体纳米载体或微米载体的一个实施例。其它合适的类脂质体纳米载体和/或微米载体的确定在本领域常规技术水平之内。
术语“胆固醇酯”是指胆固醇的酯。例如，酯键是在脂肪酸的羧基和胆固醇的羟基之间形成的。胆固醇酯的实施例包括但不限于胆固醇油酸酯、胆固醇神经酸酯等。
术语“磷脂”是指一类是细胞膜的主要成分的脂类，它们可以形成脂质双分子层。大多数磷脂含有甘油二酯、磷酸基团和简单的有机分子例如胆碱。这个规则的一个例外是鞘磷脂，它由鞘氨醇而非甘油衍生而来。磷脂的实施例包括但不限于甘油磷脂，例如磷脂酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸和磷酸肌醇(例如磷脂酰肌醇、磷脂酰肌醇磷酸盐、磷脂酰肌醇二磷酸盐和磷脂酰肌醇三磷酸盐)。
本文提到的化合物可以含有非芳香族双键和一个或多个不对称中心。因此，它们可以以外消旋体和外消旋混合物、单个对映体、单个非对映体、非对映体的混合物和顺式或反式异构的形式存在。所有这类同分异构形式都被考虑。例如，本文描述的茉莉酮酸酯化合物包括所有基于不对称碳原子并且是光学纯的任何旋光异构体、各种旋光异构体的任何混合物，或消旋形式。MDJ立体异构体的实施例包括例如(1R,2R)-二氢甲基茉莉酮酸酯、(1R,2S)-二氢甲基茉莉酮酸酯、(1S,2R)-二氢甲基茉莉酮酸酯和(1S,2S)-二氢甲基茉莉酮酸酯。甲基茉莉酮酸酯的异构体的实施例包括顺式或反式-(1R,2R)-甲基茉莉酮酸酯、顺式或反式-(1R,2S)-甲基茉莉酮酸酯、顺式或反式-(1S,2R)-甲基茉莉酮酸酯和顺式或反式-(1S,2S)-甲基茉莉酮酸酯。
本发明意图是包括在现有化合物中存在的所有原子的同位素形式。同位素包括具有同样的原子序数，但是不同质量数的原子。通过一般实施例并且无限制的方式，氢的同位素包括氚和氘，碳的同位素包括C-13和C-14。
本文使用的术语“烷基”是指支链的或无支链的饱和烃基团，通常但不一定必须含有1至约24个碳原子，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、辛基、癸基等，以及环烷基基团例如环戊基、环己基等。通常但不一定，本文的烷基可以含有1至约18个碳原子，并且这些基团可以含有1至约12个碳原子。术语“低级烷基”意思是1至6个碳原子的烷基，例如1、2、3、4、5或6个碳原子。
药物组合物
本发明还提供包含茉莉酮酸酯化合物和至少一个药学上可接受的赋形剂或载体如本文描述的纳米载体/微米载体的药物组合物。
在一个实施方式中，用于本发明的组合物的纳米载体由环糊精形成。环糊精(CD)是由1,4-C-O-C链连接的D-L(+)-葡萄糖单元形成的环状低聚糖。环糊精是由酶转化来从淀粉产生的。天然环糊精由葡萄糖单体的数量定义，例如α-、β-和γ-环糊精分别由6、7和8个葡萄糖单体组成。适用于本发明的环糊精的更多实施例在如WO 2010/006392、US 2008/044364和EP 392608中描述。
在另一个实施方式中，用于本发明的组合物的纳米载体/微米载体是LDE。特别是，用于本发明的LDE包括磷脂酰胆碱、油酸、胆固醇和三油精。其它类脂质体载体也可以使用。
在另一个实施方式中，用于本发明的组合物的纳米载体由树枝形聚合物例如PAMAM形成。下面的表格给出PAMAM树枝形聚合物随代数变化的尺寸。树枝形聚合物的更多实施例在如WO 2010/006392中描述。
在又一个实施方式中，纳米载体/微米载体是脂质体(包括目标为具有对病毒抗原的单克隆抗体的受感染细胞的脂质体)。对于本发明的化合物，脂质体制剂包括至少一种聚合物、油、至少一种表面活性剂和溶剂。本领域的技术人员将发现任何合适的聚合物、油、表面活性剂和/或溶剂可用于该脂质体制剂。本发明使用的合适脂质体制剂的确定在本领域常规技术的范围之内。对于脂质体制剂，典型的聚合物包括例如聚己内酯、PHB-聚羟基丁酸酯、PMMA-聚(甲基丙烯酸甲酯)、壳聚糖和β-环糊精。用于油相的示例性的油包括例如油酸异癸酯、矿物油和EMU油。示例性的表面活性剂包括例如单硬脂酸山梨糖醇酐酯、卵磷脂(例如大豆卵磷脂)和聚山梨醇酯80。卵磷脂可以是任何天然的和/或合成的卵磷脂和/或它们的混合物。用作脂质体制剂的溶剂包括但不限于丙酮、乙醇和超纯水。本发明使用的脂质体的一个非限定性实施例是由大豆或卵磷脂酰胆碱(或卵磷脂)形成的脂质体。它们可根据本领域技术人员已知的方法制备，例如在美国专利No.4,522,811中所述的。因此，使用的具体脂质体制剂的选择将受到被治疗的癌症的影响。对于某些癌症，特定的脂质体制剂比对其它癌症的效果更好。
在一个实施方式中，纳米载体的尺寸范围为从1nm至1000nm，例如900-1000nm、1-900nm、1-800nm、1-700nm、1-600nm、1-500nm、1-400nm、1-300nm、1-200nm、1-150nm、1-100nm、1-90nm、1-80nm、1-70nm、1-60nm、1-50nm、1-40nm、1-30nm、1-20nm、1-10nm、1-5nm、2-300nm、20-200nm、50-150nm或3.5-11nm。
在一个实施方式中，微米载体的尺寸范围为从2μm至50μm，例如2-5μm、2-10μm、2-15μm、2-20μm、2-25μm、2-30μm、2-40μm、2-50μm、5-20μm、5-10μm或7.5-10μm。
在一个实施方式中，药物组合物中的茉莉酮酸酯化合物选自于由下列各项组成的组中：茉莉酸、7-异茉莉酸、9,10-二氢茉莉酸、9,10-二氢异茉莉酸、2,3-二脱氢茉莉酸、3,4-二脱氢茉莉酸、3,7-二脱氢茉莉酸、4,5-二脱氢茉莉酸、4,5-二脱氢-7-异茉莉酸、南瓜酸、6-表南瓜酸、6-表南瓜酸内酯、12-羟基茉莉酸、12-羟基茉莉酸内酯、11-羟基茉莉酸、8-羟基茉莉酸、同型茉莉酸、二同型茉莉酸、11-羟基二同型茉莉酸、8-羟基二同型茉莉酸、块根油酮酸、块根油酮酸-邻-β-吡喃葡萄糖苷、南瓜酸-邻-β-吡喃葡萄糖苷、5,6-二脱氢茉莉酸、6,7-二脱氢茉莉酸、7,8-二脱氢茉莉酸、顺式茉莉酮、二氢茉莉酮和它们的低级烷基酯的基团。优选本发明的组合物包括二氢茉莉酮酸甲酯。适用于本发明的茉莉酮酸酯化合物的其它实施例可见如WO 02/080890和Gfeller et al.Sci.Signal.2010,Vol.3,Issue109,pp.cm3。
在一个实施方式中，本发明的组合物的茉莉酮酸酯化合物(例如MDJ)的浓度范围为从1nM至100mM，例如1nM至99mM、1nM至90mM、1nM至80mM、1nM至70mM、1nM至60mM、1nM至50mM、1nM至40mM、1nM至30mM、1nM至20mM、1nM至10mM、1nM至5mM、1nM至1mM、1nM至900μM、1nM至800μM、1nM至700μM、1nM至600μM、1nM至500μM、1nM至400μM、1nM至300μM、1nM至200μM、1nM至100μM、1nM至90μM、1nM至80μM、1nM至70μM、1nM至60μM、1nM至50μM、1nM至40μM、1nM至30μM、1nM至20μM、1nM至10μM、1nM至5μM、1nM至1μM、1nM至900nM、1nM至800nM、1nM至700nM、1nM至600nM、1nM至500nM、1nM至400nM、1nM至300nM、1nM至200nM、1nM至100nM、1nM至90nM、1nM至80nM、1nM至70nM、1nM至60nM、1nM至50nM、1nM至40nM、1nM至30nM、1nM至20nM、1nM至10nM、1nM至5nM、1nM至1mM、100nM至1mM、100nM至100μM、1-100μM、10-50μM、20-30μM、100μM至10mM、100μM至100mM、1-100mM、1-100nM和59-64nM。
在一个实施方式中，本发明的组合物的茉莉酮酸酯化合物(例如MDJ)的浓度范围为从100mM至1M，例如从0.2M、0.3M、0.4M、0.5M、0.6M、0.7M、0.8M、0.9M至1M、100mM至1M、200mM至750mM或约0.8-1M。
在一个实施方式中，当该组合物用于治疗白血病时，其中包括的茉莉酮酸酯化合物(例如MDJ)的浓度范围为从100μM至5mM、100μM至4mM、100μM至3mM、100μM至2mM、100μM至1mM、100μM至0.5mM、0.01mM至约2mM或约1mM、10μM至5mM、10μM至4mM、10μM至3mM或10μM至2mM。在另一个实施方式中，该组合物用于治疗实体瘤时，其中包括的茉莉酮酸酯化合物(例如MDJ)的浓度范围为从1nM至1M(例如1nM至0.5M、1nM至0.1M、1nM至50mM、1nM至10mM、1nM至5mM、10nM至1M或1nM至约1mM或1μM至1M或1-1000nM、1-500nM、1-250nM、约1-100nM、1-50nM、1-10nM或1-5nM)。
除茉莉酮酸酯化合物外，纳米载体或微米载体可以进一步含有非茉莉酮酸酯分子或离子。例如，2-氨基乙基磷酸二氢(或磷酸乙醇胺)、3,7-二甲基-2,6-辛二烯醛(或柠檬醛)、水杨酸甲酯、脱落酸、天然氨基酸、Ca2+、Zn2+或它们的衍生物或类似物。3,7-二甲基-2,6-辛二烯醛可以是顺式或者反式异构体。这些非茉莉酮酸酯分子或离子可以伴随或结合茉莉酮酸酯化合物或纳米/微米载体。在某些实施方式中，非茉莉酮酸酯化合物可以包含在同茉莉酮酸酯化合物一样的纳米/微米载体中。然而，在其它的实施方式中，非茉莉酮酸酯化合物包含在与茉莉酮酸酯化合物不同的纳米/微米载体中，并且这两个载体可以同时施用。伴随或结合可以通过化学键(例如共价键)、氢键、范德华力、库仑相互作用等产生。在一个实施方式中，非茉莉酮酸酯化合物封装在纳米载体/微米载体中。在另一个实施方式中，该化合物部分封装在纳米载体/微米载体中或在纳米载体/微米载体的表面(例如作为纳米载体/微米载体表面的一部分或在外面又接合在该表面上)。
在一个实施方式中，纳米负载的或微米负载的茉莉酮酸酯化合物(例如MJ或MDJ)可以被合成性地修饰，例如与柠檬醛和/或磷酸乙醇胺分子共价结合。具体地说，这些反应可以在茉莉酮酸酯化合物的任何羰基上进行，例如茉莉酮酸酯化合物(例如MJ或MDJ)环戊基环上的酮(E1)或茉莉酮酸酯化合物的酯的羰基(E2)。茉莉酮酸酯的酮(或酯基)与磷酸乙醇胺的胺基(R1)之间的反应可以导致亚胺或半缩醛胺(或酰胺)的形成。茉莉酮酸酯与柠檬醛之间的反应的产率可以通过首先还原柠檬醛的醛基以形成还原的柠檬醛化合物(“R2”)或水合(C-6)双键以形成R3来得到提高。这些初步步骤在R2或R3上产生了羟基，其可与茉莉酮酸酯化合物的酮(E1)反应形成缩酮或酯，或者与茉莉酮酸酯化合物的酯(E2)基团反应形成新的酯。
这些化合物之间的反应，即茉莉酮酸酯(例如MJ或MDJ)、磷酸乙醇胺R1、柠檬醛、R2和R3，可以生成产物，产物包括但不限于R1-(E1)MJ、R1-(E2)MJ、R1-(E1)MJ(E2)-R1、R2-(E1)MJ、R2-(E2)MJ、R2-(E1)MJ(E2)-R2、R3-(E1)MJ、R3-(E2)MJ、R3-(E1)MJ(E2)-R3以及它们的混合物，如R1-(E1)MJ(E2)-R2、R2-(E1)MJ(E2)-R1、R1-(E1)MJ(E2)-R3、R3-(E1)MJ(E2)-R1、R2-(E1)MJ(E2)-R3、R3-(E1)MJ(E2)-R2。在一个实施方式中，茉莉酮酸甲酯的十五种衍生物分子是由上面描述的方法合成的。
“药物组合物”是包含以适用于对主体施用的形式下的本发明的纳米负载和/或微米负载的化合物的制剂。在一个实施方式中，药物组合物是以体积或单位剂量形式。单位剂量形式可为多种形式中的任意种，包括例如胶囊、静脉注射袋、片剂、气溶胶吸入器上的单个泵或药水瓶。组合物单位剂量中活性成分(例如公开的纳米负载的和/或微米负载的化合物或它们的盐、水合物、溶剂化物或异构体的制剂)的量是有效量，并且根据涉及的具体治疗而变化。本领域技术人员理解根据患者的年龄和病症有时必需对剂量做出常规变化。该剂量还依赖于施用途径。多种途径可以考虑，包括口服、肺部、直肠、肠胃外、透皮、皮下、静脉内、肌内、腹膜内、吸入、口腔、舌下、胸膜内、鞘内、鼻内等。本发明化合物的局部或透皮施用的剂量形式包括粉剂、喷雾剂、软膏剂、糊剂、霜剂、洗剂、凝胶剂、液剂、贴剂和吸入剂。在一个实施方式中，纳米负载的和/或微米负载的活性化合物在无菌条件下与药学上可接受的载体(例如纳米载体/微米载体)以及任何需要的防腐剂、缓冲剂或抛射剂混合。
本文使用的短语“药学上可接受的”是指在合理的医学判断范畴内，适用于与人类和动物的组织接触而又没有过多的毒性、刺激、过敏反应或其它问题或并发症，与合理的利益/风险比相称的那些化合物、材料、组合物、载体和/或剂型。
“药学上可接受的赋形剂或载体或溶剂”是指对制备通常是安全的、无毒的并且没有生物学上和其他方面不适宜的药物组合物有用的赋形剂、载体或溶剂，并且包括对于兽医应用以及人类药物应用来说可接受的赋形剂。本文使用的“药学上可接受的赋形剂”包括一种和多于一种这样的赋形剂。
本发明的药物组合物被配制成与所需的施用途径相适应。施用途径的实例包括肠胃外，例如静脉内、皮内、皮下、口服(例如吸入)、透皮(局部的)和经粘膜施用。用于肠胃外、皮内或皮下应用的溶液或悬浮液可以包括以下组分：无菌稀释剂如注射用水、盐水溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；抗菌剂如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂如乙二胺四乙酸；缓冲剂如醋酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐和用于调节渗透压的试剂如氯化钠或右旋葡萄糖。pH可以用酸或碱如盐酸或氢氧化钠调节。肠胃外制剂可以封装在安瓿瓶、一次性注射器或由玻璃或塑料制成的多剂量小瓶中。
本文使用的术语“治疗有效量”是指治疗、改善或预防所识别的疾病或病症或呈现可检测的治疗或抑制效果的药剂的量。该效果可以用本领域已知的任何实验方法检测。对于主体精确的有效量取决于主体的体重、大小和健康状况、病症的性质和程度以及选择用于施用的疗法的治疗或组合。用于给定情况的治疗有效量可以由在临床医师的技能和判断范围内的常规实验来确定。在一个优选的方面中，治疗的疾病或病症是病毒感染。
对于任何化合物(例如本申请公开的纳米负载的和/或微米负载的化合物)，治疗有效量可以在例如肿瘤细胞的细胞培养实验中或在通常是大鼠、小鼠、兔、狗或猪的动物模型中初步估计。该动物模型还可以用来确定合适的浓度范围和施用途径。然后这些信息可以用来确定用于人类施用的有用的剂量和途径。治疗的/预防的效果和毒性可以通过细胞培养或实验动物中的标准药物程序例如半数有效剂量ED50(对群体的50％能有效治疗的剂量)和半数致死剂量LD50(对群体的50％能致死的剂量)来确定。毒性和治疗效果之间的剂量比是治疗指数，它可以表示为比率LD50/ED50。呈现大的治疗指数的药物组合物是优选的。剂量可以根据所采用的剂型、患者的敏感度和施用途径来在此范围内变化。
调整剂量和施用以提供活性试剂的足够的水平或维持想要的效果。可考虑的因素包括疾病状态的严重程度、主体的一般健康情况、主体的年龄、体重和性别、饮食、施用的时间和频率、药物组合、反应敏感度和对治疗的耐受性/反应。长效药物组合物依据具体制剂的半衰期和清除率可以每3至4天、每周或每两周施用一次。
本发明的包含纳米负载的和/或微米负载的活性化合物的药物组合物可以用通常已知的方法来制造，例如常规的混合、溶解、制粒、制锭、磨细、乳化、密封、包埋或冻干的方法。药物组合物可以以常规的方式使用一个或多个药学上可接受的载体(包括促进纳米负载的和/或微米负载的活性化合物进入到能在药学上使用的制剂中的赋形剂和/或辅助剂)来配制。当然，合适的制剂取决于所选择的施用途径。
适合注射使用的药物组合物包括无菌水溶液(水溶性的)或分散体和用于无菌可注射溶液或分散体的临时制备的无菌粉剂。对于静脉内施用，适宜的载体包括生理盐水、抑菌水、聚氧乙烯蓖麻油ELTM(巴斯夫，帕西帕尼，新泽西州)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。所有情况下，组合物必须是无菌的，并且应该能流动到能容易注射的程度。药物组合物在制造和存储条件下必须是稳定的，并且必须抗微生物如细菌和真菌的污染作用地保存。载体可以是包括例如水、乙醇、多元醇(例如丙三醇、丙二醇和液体聚乙二醇等)和适宜的它们的混合物的溶剂或分散体介质。适当的流动性可以通过例如使用包衣如卵磷脂、就分散相的情况保持所需要的颗粒尺寸和使用表面活性剂来维持。防止微生物的作用可以通过多种抗菌剂和抗真菌剂实现，例如尼泊金、氯代丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等。许多情况下，组合物中优选包括等渗剂例如糖、多元醇如甘露醇和山梨糖醇、氯化钠。可注射组合物的延长吸收可以通过在该组合物中包含延迟吸收试剂例如单硬脂酸铝和明胶来实现。
无菌注射溶液可以通过将合适溶剂中所需量的纳米负载的和/或微米负载的活性化合物与上面列举的成分的一种或组合来按需要合并，然后过滤除菌来制备。通常，分散体通过将纳米负载的和/或微米负载的活性化合物合并进入到那些包含碱性分散介质和上面列举的所需的其它成分的无菌煤介物来制备。对于制备无菌可注射溶液的无菌粉剂，其制备方法是真空干燥和冻干，得到加上来自它们先前无菌滤液的任何其他所需成分的活性成分的粉剂。
口服的组合物通常包括惰性稀释剂或可食用药学上可接受的载体。它们可以被封装在明胶胶囊中或压成片剂。出于口服治的施用的目的，纳米负载的和/或微米负载的活性化合物可以与赋形剂结合，并以片剂、锭剂或胶囊的形式使用。口服的组合物还可以使用用作嗽口水的流动载体来制备，其中流动载体中的化合物经口使用、漱口并吐出或吞咽。药学上可兼容的粘合剂和/或辅助材料可以被包括作为组合物的一部分。片剂、药丸、胶囊、锭剂等等可以包含任何以下成分或相似性质的化合物：粘合剂如微晶纤维素、黄蓍胶或明胶；赋形剂如淀粉或乳糖；***剂如藻酸、淀粉乙醇酸钠或玉米淀粉；润滑剂如硬脂酸镁或Sterotes；助流剂如胶体二氧化硅；甜味剂如蔗糖或糖精或调味剂如胡椒薄荷、水杨酸甲酯或橙味剂。
对于通过吸入施用，纳米负载的和/或微米负载的化合物以从加压容器或分配器以喷射气雾剂的形式传送，分配器包含合适的抛射剂例如气体如二氧化碳或喷雾器。
全身施用还可以通过经粘膜或透皮方式。对于经粘膜或透皮施用，适合于待渗透的屏障的渗透剂被用在制剂中。这样的渗透剂通常是本领域已知的，并且包括例如用于经粘膜施用的清洁剂、胆汁盐和梭链孢酸衍生物。经粘膜施用可以通过使用鼻喷入法或栓剂来完成。对于透皮施用，纳米负载的和/或微米负载的活性化合物配制成通常为本领域已知的软膏剂、油膏剂、凝胶剂或霜剂。
纳米负载的和/或微米负载的活性化合物的药物组合物可以与那些将防止化合物从体内快速消除的药学上可接受的载体如受控释放制剂，包括植入物和微囊密封的运送***一起制备。可使用生物可降解的、生物相容的聚合物，如乙酸乙烯乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。用于制备这些制剂的方法对本领域的技术人员是显而易见的。这些材料也可以从Alza公司和Nova药物公司购买得到。
以单位剂量形式配制口服的或肠胃外的组合物对易于施用和剂量的均匀性是特别有利的。本文使用的单位剂量形式是指作为单一剂量用于待治疗主体的适合的物理上离散的单位，每个单位含有经计算能产生与所需药物载体有关联的期望治疗效果的纳米负载的和/或微米负载的活性化合物的预先决定的量。本发明的剂量单位形式的规格被支配并直接地依赖于纳米负载的和/或微米负载的活性化合物的独特特性和要达到的特定治疗效果。
该药物组合物可以连同施用说明书一起被装在容器、包装或分配器中。
用于本发明的组合物的茉莉酮酸酯化合物包括它们的盐。所有这些形式都考虑在要求保护的发明的范围之内。
本文使用的“药学上可接受的盐”是指本发明的化合物的衍生物，其中母体化合物通过制成它们的酸或碱的盐来修饰。药学上可接受的盐的实施例包括但不限于碱性残基如胺的无机酸或有机酸的盐、酸性残基如羧酸的碱金属盐或有机盐等。药学上可接受的盐包括常规无毒的盐或从例如无毒的无机或有机酸形成的母体化合物的季铵盐。例如，这些常规无毒的盐包括但不限于那些来源于选自2-乙酰氧基苯甲酸、2-羟基乙磺酸、乙酸、抗坏血酸、苯磺酸、苯甲酸、重碳酸、碳酸、柠檬酸、依地酸、乙烷二磺酸、1,2-乙烷磺酸、反丁烯二酸、葡庚糖酸、葡萄糖酸、谷氨酸、乙醇酸、乙醇酰对氨苯基砷酸、己基间苯二酚酸、海巴酸、氢溴酸、盐酸、氢碘酸、羟基马来酸、羟基萘甲酸、羟乙基磺酸、乳酸、乳糖酸、月桂基磺酸、马来酸、苹果酸、扁桃酸、甲烷磺酸、恭璜酸、硝酸、草酸、双羟萘酸、泛酸、苯乙酸、磷酸、聚半乳糖醛酸、丙酸、水杨酸、硬脂酸、碱式乙酸、琥珀酸、氨基磺酸、对氨基苯磺酸、硫酸、丹宁酸、酒石酸、甲苯磺酸和通常出现的胺酸例如甘氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、精氨酸等的无机酸和有机酸。
药学上可接受的盐的其它实施例包括己酸、环戊烷丙酸、丙酮酸、丙二酸、3-(4-羟基苯甲酰基)苯甲酸、肉桂酸、4-氯苯磺酸、2-萘磺酸、4-甲苯磺酸、樟脑磺酸、4-甲基双环-[2.2.2]-辛-2-烯-1-羧酸、3-苯基丙酸、三甲基乙酸、叔丁基乙酸、粘康酸等。本发明还包含当母体化合物中的酸性质子被金属离子如碱金属离子、碱土金属离子或铝离子取代时，或者与有机碱如乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、氨基丁三醇、N-甲基葡糖胺、二乙胺、二乙氨基乙醇、乙二胺、咪唑、赖氨酸、精氨酸、吗啉、2-羟乙基吗啉、二苄基乙二胺、三甲胺、哌啶、吡咯烷、苄胺、四甲基氢氧化铵等配合时形成的盐。
应当理解的是，药学上可接受的盐的所有形式包括相同盐的如本文限定的溶剂加成形式(溶剂化物)或晶体形式(多形体)。
用于本发明的药物组合物的茉莉酮酸酯化合物还可以制备成酯，例如药学上可接受的酯。例如，化合物的羧酸功能团可以被转换成它的相应的酯，例如甲酯、乙酯或其它酯。化合物的醇基团也可以被转换成它的相应的酯，例如醋酸酯、丙酸酯或其它的酯。
用于本发明的药物组合物的茉莉酮酸酯化合物还可以制备成前体药物，例如药学上可接受的前体药物。术语“前体药物(pro-drug)”和“前体药物(prodrug)”在本文中是互换使用的，是指在体内释放活性母体药物的任何化合物。因为已知前体药物能增强药物的许多所希望的性质(例如可溶性、生物利用率、制造等等)，本发明的纳米负载的和/或微米负载的化合物可以以前体药物形式传送。因此，本发明意图覆盖目前要求保护的化合物的前体药物、传送要求保护的化合物和含有要求保护的化合物的组合物的方法。“前体药物”意图包括当它被施用给主体时，在体内释放本发明的活性母体药物的任何共价结合的载体。本发明的前体药物是以在常规操作或在体内能裂解成母体化合物的方式修饰存在于化合物中的官能团来制备的。前体药物包括本发明的化合物，其中羟基、氨基、巯基、羧基或羰基被键合到那些可以在体内裂解，分别形成自由羟基、自由氨基、自由巯基、自由羧基或自由羰基的任何基团上。
前体药物的实施例包括但不限于酯(例如醋酸酯、二烷基氨基乙酸酯、甲酸酯、磷酸酯、硫酸酯和苯甲酸酯衍生物)和羟基官能团的氨基甲酸脂(例如N,N-二甲氨基羰基)、羧基官能团的酯(例如乙酯、吗啉乙醇酯)、N-酰基衍生物(例如N-乙酰基)、氮-曼尼希碱、席夫碱和氨基官能团的烯胺酮、肟、乙缩醛、缩酮和本发明化合物的酮和醛官能团的烯醇酯等，见Bundegaard,H.,Design of Prodrugs,p1-92,Elesevier,New York-Oxford(1985)。
用于本发明药物组合物的茉莉酮酸酯化合物还可以是它们的代谢产物，如从酸性和/或碱性催化反应得到的代谢产物，例如顺式茉莉酸、反式茉莉酸、羟甲基顺式茉莉酮酸酯、羟甲基反式茉莉酮酸酯、羟基顺式茉莉酸、羟基反式茉莉酸、从酯交换获得的内酯等；从氧化反应获得的代谢产物，例如顺式茉莉酮酸酮甲酯、反式茉莉酮酸酮甲酯、顺式茉莉酮酸羟甲酯、反式茉莉酮酸羟甲酯、从氧化反应获得的二醇、从氧化反应获得的立体异构体(例如对映体或非对映异构物)、从氧化反应获得的环氧化物和从氧化反应获得的内酯；茉莉酮酸甲酯、茉莉酸和二氢甲基茉莉酮酸酯的脱水产物；穿过细胞内进程形成的代谢产物，如与受体(如AKR2受体和G-蛋白偶联受体)的磷酸化作用(例如通过激酶)或任何其它反应和与细胞器的相互作用。MDJ代谢产物的实施例包括但不限于茉莉酸甲酯、南瓜酸甲酯、7-异茉莉酸甲酯、2,3-二脱氢-MDJ、3,4-二脱氢-MDJ、3,7-二脱氢-MDJ、4,5-二脱氢-MDJ、12-羟基-MDJ、11-羟基-MDJ、8-羟基-MDJ、块根油酮酸甲酯、12-邻-葡糖基-MDJ、11-邻-葡糖基-MDJ、12-邻-葡糖基-MJ、11-邻-葡糖基-MJ、7,8-二脱氢-MDJ、顺式茉莉酮、二氢茉莉酮、水杨酸甲酯和脱落酸。
另外或替代地，其它茉莉酮酸酯相关的化合物可被用于本发明的药物组合物，如那些由亚麻酸(LA)衍生的环戊酮或基于环戊烯酮的化合物形成的化合物。例如见AnnalsofBotany 100:681-697,2007和Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.1997.48:355-81。
包含纳米负载的和/或微米负载的茉莉酮酸酯化合物的药物组合物，或它们的药学上可接受的盐、酯、前体药物或代谢产物是口服、经鼻、透皮、肺部、吸入、口腔、舌下、腹腔内、皮下、肌内、静脉内、直肠、胸膜内、鞘内和肠胃外施用的。在一个实施方式中，该组合物是可注射的组合物。本领域技术人员公认某些施用途径的优势。
施用方案依据多种因素进行选择，包括患者的类型、品种、年龄、体重、性别和医疗条件、待治疗病症的严重程度、施用途径、患者的肾和肝功能和它们使用的特定的化合物或盐。普通技术的医生或兽医可以容易地确定和开出预防、对抗或阻止病症发展所需的药物的有效量。可用于本发明的方法的施用方案包括但不限于每日、每周三次(间歇的)、每周两次、每周或每14天一次。在某些实施方式中，施用方案包括但不限于每月施用或每6-8周施用。在某些实施方式中，剂量在治疗期间内变化。例如，在较低浓度的(如从100μM至5mM、100μM至4mM、100μM至3mM、100μM至2mM、100μM至1mM、0.01mM至约2mM或约1mM、10μM至5mM、10μM至4mM、10μM至3mM或10μM至2mM)纳米/微米负载的化合物被施用前，纳米/微米载体中的浓度范围为从1mM至1M(如1-1000mM、1-900mM、1-800mM、1-700mM、1-600mM、1-500mM、1-400mM、1-300mM、1-200mM、1-100mM、1-50mM、1-40mM、1-30mM、1-20mM、1-10mM、100mM至1M)的高浓度茉莉酮酸酯化合物(MDJ)可以在开始的3至7天施用。在另一个实施方式中，当组合物用于治疗实体瘤时，用于治疗癌症的本发明包括的茉莉酮酸酯化合物(例如MDJ)的浓度范围为从1nM至1M(如1nM至0.5M、1nM至0.1M、1nM至50mM、1nM至10mM、1nM至5mM、10nM至1M或1nM至约1mM或1μM至1M或1-1000nM、1-500nM、1-250nM、约1-100nM、1-50nM、1-10nM或1-5nM)。这个施用方案在治疗某些种类的癌症(例如白血病)时比其它方案可能更有效。或者，也可以首先施用低剂量的纳米/微米负载的茉莉酮酸酯，然后施用高剂量的纳米/微米负载的茉莉酮酸酯。
用于本发明公开的纳米负载的和/或微米负载的化合物的制剂和施用的技术可以在Remington:the Science and Practice ofPharmacy,19th edition,Mack PublishingCo.,Easton,PA(1995)中找到。在一个实施方式中，本发明描述的纳米负载的和/或微米负载的化合物和它们的药学上可接受的盐、前体药物、代谢产物或酯，与药学上可接受的赋形剂、溶剂或稀释剂共同用于药物制剂。合适的药学上可接受的赋形剂包括惰性实体填料或稀释剂和无菌水的或有机溶液。纳米负载的和/或微米负载的化合物将以足以提供本发明所述的范围内的所需的剂量存在于这些药物组合物中。
合成纳米负载的或微米负载的茉莉酮酸酯的方法
本发明所述的纳米负载的或微米负载的茉莉酮酸酯化合物和它们的组合物可以用本领域内已知的技术或本发明描述的方法来制备。
例如，当环糊精用作纳米载体时，本发明的纳米负载的化合物可以通过在合适的溶液(例如水溶液)中混合感兴趣的茉莉酮酸酯化合物和环糊精来制备，优选在高温下。在本发明的实施方式中，所形成的纳米载体或微米载体每摩尔环糊精中含有约1-100摩尔(例如1-90摩尔、1-80摩尔、1-70摩尔、1-60摩尔、1-50摩尔、1-40摩尔、1-30摩尔、1-20摩尔、1-10摩尔或1-5摩尔)的茉莉酮酸酯化合物。更详细的说明可见例如US 2008/044364、EP392608和WO2007/145663。环糊精微米载体可以由环糊精纳米载体的簇形成。
对于另一个实施例，当LDE(或脂质体)用作纳米载体或微米载体时，本发明的纳米负载的或微米负载的化合物可以通过低于室温的温度(例如约4℃)下在预先形成的LDE(或脂质体)的合适溶液(例如水溶液)中孵育感兴趣的茉莉酮酸酯化合物，然后用合适的缓冲液透析得到的乳液以获得期望的LDE负载的(或脂质体负载的)茉莉酮酸酯化合物来制备。在本发明的实施方式中，所形成的纳米载体或微米载体每摩尔LDE(或脂质体)中含有约1-100摩尔(例如1-90摩尔、1-80摩尔、1-70摩尔、1-60摩尔、1-50摩尔、1-40摩尔、1-30摩尔、1-20摩尔、1-10摩尔或1-5摩尔)的茉莉酮酸酯化合物。
在一个实施方式中，LDE纳米载体的制备如下。包含磷脂酰胆碱(例如40mg)、胆甾醇油酸酯(例如20mg)、三油精(例如1mg)和胆固醇(例如0.5mg)的脂类混合物首先在4℃真空干燥16小时。然后，氮气氛下温度介于51至55℃时在0.01M、pH 8.0的Tris-HCl中通过超声波辐射来制备得到该脂类的乳液，例如使用Branson仪器，型号450A(UltrasoundArruda,圣保罗，巴西)、能量125瓦，照射3小时。为了获得用于封装MDJ所希望的直径范围或粒度范围的LDE，乳液是分两步离心(例如超离心、贝克曼转子SW-41)进行纯化的。第一步中，4℃下以200,000g离心30分钟产生的上面管的部分通过抽吸(1mL)取出并丢弃。然后，溴化钾(KBr)被加入到剩余的悬浮液中，以调节密度至1.21g/mL。第二次离心(4℃下以200,000xg离心2小时)后，在管的顶部通过抽吸回收LDE。过量的KBr通过对两次变化的1000体积的0.01M、pH 8的Tris-HCl缓冲液透析去除。最后，该乳液在层流中通过孔隙为0.22mm的微孔膜过滤灭菌并在4℃下储存至多三十天。悬浮的LDE颗粒的尺寸可以通过光散射和显微测量来确定。悬浮的LDE颗粒的表面电势可以用Zeta Potential Analyzer ZetaPALS仪器(Brookhaven仪器公司)(Lima&Maranhao,2004)来测定。
在一个实施方式中，将茉莉酮酸酯化合物(例如MDJ)结合到LDE载体按照如下步骤进行。将50毫升MDJ的乙醇溶液加入到500毫升LDE乳液(如上述制备的乳液)中，以制成浓度为每毫升3毫克MDJ的混合物。该混合物在室温下搅拌15分钟，然后在4℃下孵育72小时。然后将该孵育的混合物对200毫升无菌缓冲液(例如Tris-HCl，0.01M)透析两次。然后，透析的乳液用气相色谱-质谱联用法分析，以确定封装在LDE载体中或与LDE载体耦合的MDJ的量。
在某些实施方式中，本发明的纳米乳液是由除茉莉酮酸酯化合物之外，一个或多个选自聚合物如聚合物聚(ε-己内酯)或平均分子量为65.000的PCL、柠檬醛、磷酸乙醇胺、单硬脂酸山梨糖醇酐酯(60)和聚山梨醇酯80(80)的组分形成的。该乳液可以通过类似于Fessi et al.Drug Des Deliv 4(4):295-302(1989)描述的方法制备。简言之，油/水(O/W)乳液是通过使用Ultra-Turrax均质器(IKA T10basicIka-Werke，斯陶芬，德国)在例如15,000rpm转速下强烈搅拌油(例如10.0g)和单独的活性化合物(例如MDJ)或0.05g至0.50g(包含在载体中的内部组分)活性化合物在水中(如400mL)的混合物，例如1分钟制成的。然后，例如通过将聚合物(例如PCL，介于0.2g和2.0g之间)溶解在丙酮(400mL)中制得的有机溶液在温和磁力搅拌下使用蠕动泵(PumpPro TPM 60055RPM，Waton-Marlow，威尔明顿，英国)以10％注入该油/水乳液中。搅拌10分钟后，在水(200mL)中溶解1.0g吐温80制得的水溶液也在温和磁力搅拌下注入该乳化相中。再将蠕动泵以例如10％使用。完成加入后，该反应混合物可以进一步搅拌例如10分钟。在最后一步中，减压下(例如使用旋转蒸发仪如R-21，Büchi，瑞士)将有机溶剂被除去，纳米乳液的体积被浓缩至例如500mL。第二步也就是将聚合物溶液加到乳液中是可选的。
表征纳米负载的和/或微米负载的化合物的方法包括使用半经验方法应用HYPERCHEM软件的理论的定性结构分析关系。在这个意义上，QSAR被用来估计由茉莉酸或二氢茉莉酸甲酯和天然环糊精(CD)形成的纳米负载的化合物的稳定性。在一个实施方式中，计算是以使用均方根值为0.1千卡(埃·摩尔)-1的Polak-Rabiere共轭梯度的AM1半经验方法进行的。
定性地，ΔH(＝E结合)的测量反映当纳米负载的和/或微米负载的化合物的形成(即纳米/微米载体和茉莉酮酸酯化合物伴随或结合)发生时体系的最低总能量。
因此，由E结合表示的反应的稳定性可以从形成的纳米负载的和/或微米负载的化合物的能量与纳米/微米载体和化合物的总能量之间的差异来估计。
下列表1给出茉莉酸或二氢茉莉酸甲酯与天然环糊精缔合的E结合计算的结果。
表1：稳定的ΔH的结果。
如表1所示，除α-CD和二氢茉莉酸甲酯之间的复合物以外，所有其它的纳米负载的化合物都是稳定的。并且茉莉酮酸酯化合物和β-CD之间的缔合生成最稳定的纳米负载的化合物。
治疗方法
本发明提供用于治疗其过程受异常血管生成影响的病症(或“血管生成相关的病症”)的方法。该方法包括给需要这种治疗的主体施用治疗有效量的本发明的纳米负载的和/或微米负载的化合物或它们的药学上可接受的盐、前体药物、代谢产物、溶剂化物或立体异构体。
本发明所用的“需要其的主体”是有异常血管生成起一部分作用的病症的主体，或相对于普通群体对发展这样的病症有增大的风险的主体。需要其的主体可以有癌症前期的病症。优选地，需要其的主体有癌症。“主体”包括哺乳动物。该哺乳动物可以是例如任何哺乳动物，例如人类、灵长类、鸟、小鼠、大鼠、禽类、狗、猫、牛、马、山羊、骆驼、羊或猪。优选地，哺乳动物是人类。
血管生成相关病症的一个实施例是癌症。本发明使用的术语“癌症”包括实体瘤以及血液肿瘤和/或恶性肿瘤。典型的癌症包括但不限于肾上腺皮质癌、爱滋病相关的癌症、爱滋病相关的淋巴瘤、***癌、***直肠癌、肛管癌、阑尾癌、童年小脑星形细胞瘤、童年大脑星形细胞瘤、基底细胞癌、皮肤癌(非黑素瘤)、胆道癌、肝外胆管癌、肝内胆管癌、膀胱癌、uringary膀胱癌、骨骼和关节癌、骨肉瘤和恶性纤维组织细胞瘤、脑癌、脑肿瘤、脑干神经胶质瘤、小脑星形细胞瘤、大脑星形细胞瘤/恶性神经胶质瘤、室管膜瘤、成神经管细胞瘤、幕上原始神经外胚层肿瘤、视觉通路和下丘脑神经胶质瘤、乳腺癌、支气管腺瘤/类癌瘤、类癌肿瘤、胃肠肿瘤、神经***癌症、神经***淋巴瘤、中枢神经***癌症、中枢神经***淋巴瘤、颈癌、儿童癌症、慢性淋巴细胞性白血病、慢性粒性白血病、慢性脊髓增生病、结肠癌、结肠直肠癌、皮肤T细胞淋巴瘤、淋巴赘生物、蕈样真菌病、Seziary综合症、子宫内膜癌、食道癌、颅外生殖细胞肿瘤、性腺外生殖细胞肿瘤、肝外胆管癌、眼癌、眼内黑素瘤、成视网膜细胞瘤、胆囊癌、胃的(胃)癌、胃肠道类癌肿瘤、胃肠基质肿瘤(GIST)、生殖细胞肿瘤、卵巢生殖细胞肿瘤、妊娠期滋养叶瘤神经胶质瘤、头和颈癌症、肝细胞的(肝)癌症、Hodgkin淋巴瘤、舌癌、眼内黑素瘤、眼睛的癌症、胰岛细胞瘤(内分泌胰腺)、Kaposi肉瘤、肾脏癌、肾癌、肾脏癌、喉癌、急性淋巴母细胞性白血病、急性骨髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、慢性粒性白血病、毛细胞白血病、唇和口腔癌症、肝癌、肺癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、爱滋病相关的淋巴瘤、非Hodgkin淋巴瘤、原始中枢神经***淋巴瘤、Waldenstram巨球蛋白血症、成神经管细胞瘤、黑素瘤、眼内的(眼睛)黑素瘤、merkel细胞癌、恶性间皮瘤、间皮瘤、转移性鳞状颈癌、口癌、舌的癌症、多发性内分泌瘤综合症、蕈样真菌病、脊髓发育不良综合征、骨髓增生异常/骨髓增生性疾病、慢性粒性白血病、急性骨髓性白血病、多发性骨髓瘤、慢性脊髓增生病、鼻咽癌、成神经细胞瘤、口癌、口腔癌、口咽的癌症、卵巢癌、卵巢上皮癌、卵巢低恶性的潜在肿瘤、胰癌、小岛细胞胰癌、鼻窦和鼻腔癌症、甲状旁腺癌、***癌、咽癌、嗜铬细胞瘤、成松果体细胞瘤和幕上原始神经外胚层肿瘤、垂体瘤、浆细胞赘生物/多发性骨髓瘤、胸膜肺的胚细胞瘤、***癌症(***癌或***腺癌，包括多药抗药性的***癌症)、直肠癌、肾盂和输尿管、移行细胞癌症、成视网膜细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌症、尤文氏肉瘤家族肿瘤、Kaposi肉瘤、软组织肉瘤、子宫癌、子宫的肉瘤、皮肤癌(非黑素瘤)、皮肤癌(黑素瘤)、merkel细胞皮肤癌、小肠癌症、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、胃(胃的)癌症、幕上原始神经外胚层肿瘤、双丸状癌症、咽喉癌、胸腺瘤、胸腺瘤和胸腺的癌、甲状腺癌、肾盂和输尿管及其他泌尿器的移行细胞癌症、妊娠期滋养叶瘤、尿道癌、子宫内膜的子宫癌、子宫肉瘤、子宫体癌、***癌、外阴癌和肾母细胞瘤。
血管生成相关病症的其它实施例包括眼睛疾病(例如年龄相关的黄斑变性或眼睛后段的血管生成相关的病症)、心血管疾病(例如动脉粥样硬化)、慢性炎症(例如类风湿性关节炎或克罗恩氏病)、糖尿病(例如糖尿病性视网膜病)、牛皮癣、子宫内膜异位和肥胖。例如见Pharmacological Reviews 52:237-268,2001。
本发明提供用于治疗NF-κB相关的病症如病毒、细菌或真菌感染的方法。该方法包括给需要这种治疗的主体施用治疗有效量的本发明的纳米负载的和/或微米负载的化合物或它们的药学上可接受的盐、前体药物、代谢产物、溶剂化物或立体异构体。
本发明使用的“治疗(treating)”或“治疗(treat)”描述了为防止疾病、病症或异常对患者的管理和护理，包括施用本发明的纳米负载的和/或微米负载的化合物或它们的药学上可接受的盐、前体药物、代谢产物或溶剂化物，以减轻疾病、病症或异常的症状或并发症，或消除疾病、病症或异常。
本发明的纳米负载的和/或微米负载的化合物或它们的药学上可接受的盐、前体药物、代谢产物或溶剂化物还可以用来预防疾病、病症或异常。本发明使用的“预防(preventing)”或“预防(prevent)”描述的是减少或消除疾病、病症或异常的症状或并发症的发作。
本发明使用的术语“减轻”描述的是降低异常的病征或症状的严重程度的过程。重要的是，病征或症状可以不被消除而减轻。在一个优选的实施方式中，本发明的药物组合物的施用导致病征或症状的消除，但是不要求消除。有效剂量预计将降低病征或症状的严重程度。例如，可以发生在多个位置的病症如癌症的病征或症状得到减轻，如果该癌症的严重程度在多个位置的至少一个内被降低。
本申请提到的所有专利、专利申请和出版物的全部内容通过引用并入本申请中。但是，在包含表达定义的专利、专利申请或出版物通过引用被并入的情况下，那些表达定义应该理解为适用于并入的专利、专利申请或出版物，其中那些表达定义可以被找到，但不是本申请正文的其他部分，特别是本申请权利要求的其余部分。
应该理解的是，虽然本发明已结合其优选的具体实施方式进行了描述，前面描述的以及下述的实施例旨在说明而不是限定本发明的范围。本领域技术人员将理解可以做出多种变化并可用等同物取代而没有脱离本发明的范围，并且进一步地，其它方面、优势和改进对本发明所属技术领域的技术人员是显而易见的。
除非另有说明，本发明使用的所有百分数和比率均是以重量计的。本发明的其它特征和优势从不同的实施例中可明显看到。提供的实施例阐明了对本发明实施有用的不同的组分和工艺。实施例不限制所要求保护的发明。基于本发明，本领域技术人员能够识别和使用对本发明实施有用的其它的组分和工艺。
实施例
实施例1：合成LDE负载的MDJ
首先，含有40毫克磷脂酰胆碱、20毫克胆固醇油酸酯、1毫克三油精和0.5毫克胆固醇的脂类混合物在4℃下真空干燥16小时。然后，在氮气氛下温度介于51到55℃之间用型号为450A(Ultrasound Arruda，圣保罗，巴西)、功率125瓦的Branson仪器在0.01M、pH 8.0的Tris-HCl中对通过超声波辐射3小时，制备得到该脂类的乳液。为了获得用于封装MDJ所希望的直径范围或粒度范围内的LDE，乳液用两步离心(例如超离心、贝克曼转子SW-41)来进行纯化。第一步，4℃下以200,000g离心30分钟产生的上面管的部分通过抽吸(1mL)取出并丢弃。然后，溴化钾(KBr)被加入到剩余的悬浮液中，以调节密度至1.21g/mL。第二次离心(4℃下以200,000xg离心2小时)后，从管的顶部部分通过抽吸收集LDE。过量的KBr通过对两次变化的1000体积的0.01M、pH 8的Tris-HCl透析来去除。最后，该乳液在层流中通过孔隙为0.22mm的微孔膜过滤除菌并在4℃下储存长达三十天。悬浮液中LDE颗粒的尺寸通过光散射和显微测量确定为29-400nm。悬浮液中LDE颗粒的表面电势用ZetaPotential AnalyzerZetaPALS仪器(Brookhaven仪器公司)(Lima&Maranhao,2004)测定为大约介于-5.43mV和-7.42mV之间。
将50毫升MDJ的乙醇溶液加入到500毫升上述制备的LDE乳液中，以制成浓度为每1毫升3毫克MDJ的混合物。该混合物在室温下搅拌15分钟，然后在4℃下孵育72小时。该孵育的混合物对200毫升无菌的0.01M Tri-HCl缓冲液透析两次。透析的乳液用气相色谱-质谱联用法分析，以确定封装在LDE载体中或与LDE载体结合的MDJ的量。经测定，LDE比MDJ的摩尔比在1/10和1/5之间。
实施例2∶合成大豆磷脂酰胆碱脂质体负载的MDJ和聚合物负载的MDJ
脂质体负载的MDJ
在透明带盖的瓶子中，加入足够量的摩尔比为1:1的非离子表面活性剂蓖麻油聚氧乙烯-40-氢化(ORPH)(EUMULGIN40)和大豆磷脂酰胆碱(FS)(Epikuron 200)。然后，基于油酸钠/ORPH的1:5的摩尔比，加入摩尔比为1:1的油酸钠和胆固醇。得到的混合物经0.22μm膜过滤。将滤液加入到无菌的瓶子中，然后加入MDJ(96％，购买自Sigma-Aldrich)，以达到浓度为每毫升得到的纳米乳液10毫克MDJ(此量可以从每1毫升纳米乳液7毫克至21毫克MDJ变化)。通过涡流搅动和静置期间交替得到均匀的纳米乳液。具体地，用Ultrasonic Liquid Processor(型号XL2020TM，220瓦)以间歇的方式在室温下对无菌瓶子中的混合物超声处理20分钟。超声处理后，该纳米乳液在10,000rpm转速下离心15分钟，以除掉从钛棒超声波仪释放的废物。得到的混合物对pH 7.2(水相)的Tris-HCl缓冲液透析。该纳米乳液中的脂质体的尺寸经测量为50-500nm。经测定，脂质体和MDJ的摩尔比也在1/10和1/5之间。
聚合物负载的MDJ/柠檬醛/磷酸乙醇胺
平均分子量为65.000的聚(ε-己内酯)、单硬脂酸山梨糖醇酐酯60)和聚山梨醇酯80(80)从Sigma-Aldrich(圣路易斯，美国)获得。所有使用的有机溶剂是高效液相色谱等级，购买自J.T.Baker(Ecatepec，墨西哥)。超纯水通过Milli-Q体系(18MΩ)(Millipore公司，贝德福德，马萨诸塞州，美国)内部生产。包含柠檬醛(3,7-二甲基-2,6-辛二烯醛)、磷酸乙醇胺和/或茉莉酸甲酯的纳米颗粒按照以下步骤获得。首先，油/水(O/W)乳液是通过使用Ultra-Turrax均质器(IKA T10basicIka-Werke，斯陶芬，德国)在15,000rpm转速下强烈搅拌油(10.0g)和单独的活性化合物或0.05g至0.50g(内部组分)活性化合物在水中(400mL)的混合物1分钟制成的。在第二个步骤中，聚合物(介于0.2g和2.0g之间)溶解在丙酮(400mL)中制得的有机溶液在温和磁力搅拌下使用蠕动泵(PumpProTPM 60055RPM，Waton-Marlow，威尔明顿，英国)以10％注入乳化相中。搅拌10分钟后，在水(200mL)中溶解1.0g 80制得的水溶液也在温和磁力搅拌下注入该乳液中。再一次，蠕动泵以10％使用。完成加入后，该反应混合物进一步搅拌10分钟。在最后一步中，减压下(R-21，Büchi，瑞士)有机溶剂被除去，纳米颗粒分散体的体积被浓缩至500mL。第一步中制得的油/水乳液即使没有聚合物也是稳定的。制备并分析了几种不同的纳米乳液。
没有聚合物的纳米乳液，其仅仅包含柠檬醛、磷酸乙醇胺和茉莉酮酸酯化合物中的一个；
没有聚合物的纳米乳液，其包含柠檬醛、磷酸乙醇胺和茉莉酮酸酯化合物中任意两个的混合物；
没有聚合物的纳米乳液，其包含所有三个化合物，也就是，柠檬醛、磷酸乙醇胺和茉莉酮酸酯化合物；
聚合的纳米颗粒，其仅仅包含柠檬醛、磷酸乙醇胺和茉莉酮酸酯化合物中的一个；
聚合的纳米颗粒，其包含柠檬醛、磷酸乙醇胺和茉莉酮酸酯化合物中任意两个的混合物；
聚合的纳米颗粒，其包含所有三个化合物，也就是，柠檬醛、磷酸乙醇胺和茉莉酮酸酯化合物；
所有纳米乳液表现出高的绝对回收率(>90％)、包载效率(>85％)和对使用的所有活性化合物(柠檬醛、磷酸乙醇胺和茉莉酮酸酯化合物如MJ或MDJ)的胶体稳定性。
实施例3：合成环糊精负载的MDJ
MDJ-环糊精纳米乳液通过混合二氢茉莉酸甲酯的水或醇溶液(1x10-3摩尔至1x10-2摩尔)和有等量环糊精的环糊精溶液来制备。将得到的混合物进行搅拌，直到获得均匀的乳液。
实施例4：用于治疗小鼠中化学诱导的结肠肿瘤的环糊精负载的MDJ的毒性研究和 临床前评价
在小鼠结肠癌的实验模型中研究上述实施例3中环糊精负载的MDJ的效果。研究了细胞凋亡和细胞增殖，和与肿瘤生长有关系的两个最重要的事件。测定了结肠肿瘤、邻近的非癌症组织和正常结肠组织的细胞凋亡和增殖指数。细胞凋亡通过凋亡的细胞核计数和CASPASE-3免疫染色来定量，而增殖通过PCNA免疫染色来确定。
材料和方法
动物的喂养与国家卫生院(美国)的国家研究委员会关于实验动物的护理和使用的委员会的指导保持一致。小鼠在12小时光/黑暗周期下用食物和水任意喂养并保持在硬木床上。在实验期间动物每周称重。所有实验都被美国药典动物伦理委员会批准。
简单地说，Balb/c小鼠通过直肠内滴注致癌物质N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)进行处理，每周两次，持续2周，并于开始处理的24周后被杀死。实验结束前十天，A组(n＝10)的动物以每60克体重每日腹膜内注射环糊精负载的MDJ(10uL有1毫摩尔MDJ的盐水溶液)来进行处理。B组(n＝10)的动物通过每日直肠内滴注相同剂量的环糊精负载的MDJ来进行处理。C组(n＝10)用MNNG处理，并每日腹膜内注射MDJ(在100uL盐水中以10％稀释)。D组的动物用MNNG处理，并每日直肠内滴注相同剂量的MDJ。对照组E仅用MNNG处理。对照组F和G分别在腹膜内和直肠内用盐水和环糊精负载的MDJ进行处理。对照组H和I分别在腹膜内和直肠内接受盐水和MDJ。环糊精负载的MDJ和MDJ的剂量基于前面的动物初步研究。
为了研究化学诱导的肿瘤的组织病理学特征和计算细胞凋亡指数，对于H和E组收集结肠并进行组织学处理。在相同处理组中得到结肠肿瘤(T)、邻近的非肿瘤部位(NT)、来自非肿瘤大鼠(N)的肉眼可见的正常结肠粘膜。进行免疫组织化学处理以通过增殖细胞抗原(PCNA)染色来研究细胞增殖，并通过细胞凋亡个体计数和CASPASE-3染色来分析细胞凋亡。结果以PCNA标记指数(PCNA-Li)、细胞凋亡指数(AI)和CASPASE-3标记指数(CASPASE-3-Li)表示。标准血液学和临床化学参数也被监测。
细胞凋亡指数的测定-细胞凋亡通过凋亡细胞细胞核计数来测定。切片用苏木精和曙红染色以估算每片切片中凋亡细胞的数目。用于识别凋亡的细胞的标准是：尺寸收缩、与围绕组织接触的丧失(有时形成经典描述的晕圈)和如前面所述的细胞核浓缩(Yu etal.,Gut 2002,51:480-484)。至少1000个细胞在五个随机区域进行计数，然后计算有细胞凋亡特征的细胞的百分比(细胞凋亡指数或AI)。将细胞凋亡细胞核计数与在30个随机选择的区域中通过CASPASE-3免疫染色取得的研究结果进行比较。发现细胞凋亡细胞核计数和CASPASE-3结果之间有强相关性(r＝0.83,P<0.001)。
增殖指数的测定-增殖通过如前所述的用于增殖细胞核抗原(PCNA)的免疫过氧化物酶染色进行分析。简单地说，柠檬酸盐缓冲液中微波抗原恢复后，来自每个样品的石蜡包埋切片用PCNA抗体标记。阴性对照组用非免疫性血清代替一抗来进行。载玻片在3,3-二氨基联苯胺四氢盐酸盐(DAB，Dako，丹麦)中培育，并用Mayer苏木精复染。增殖指数(PI)表示为PCNA-阳性细胞核比计数的细胞核总数的比率的百分数。
统计分析-结果表示为平均值±SE。不同处理组间的比较通过有Bonferroni多重比较检验的ANOVA(方差分析)获得。P<0.05被认为是统计学上有显著意义的。所有统计计算使用SPSS统计软件包(版本11.0，SPSS公司)进行。
结果
环糊精负载MDJ的抗癌效果
实验组C和H(腹膜内接受MDJ)由于早期病征或腹膜炎而被排除。所有用MNNG处理的小鼠生长了结肠肿瘤，而对照组中没有小鼠生长结肠癌。对于生长结肠癌的小鼠，每只小鼠肿瘤的平均数量(4.6)各组之间在统计学上没有显著的差异。结肠肿瘤中的细胞凋亡指数通常比它们邻近的非肿瘤和正常结肠组织中的高(P<0.005,ANOVA)。每个处理组中肿瘤的平均大小以及细胞凋亡指数、CAPASE-标记指数和PCNA-标记指数总结于下列表2。
表2-不同处理组的结肠肿瘤中的平均结肠肿瘤大小、PCNA-标记指数、细胞凋亡指数和CASPASE3-标记指数。
*P＝0.03(组A对E)和P＝0.002(组A对D,P＝0.02)–(ANOVA)
**P＝0.03(组A对B,D和E)–(ANOVA)
#P＝0.002(组C对B,P＝0.002；组C对D,P＝0.004)–(ANOVA)
总之，与E组相比，环糊精负载MDJ处理的动物中结肠癌在由PCNA染色评估的有丝***指数上呈现明显的减小(43％)。而且，腹膜内(i.p.)注射的环糊精负载的MDJ导致细胞凋亡指数呈显著的三倍增加(通过凋亡的个体计数和CASPASE-3表达获得)。
此组中，CASPASE-3表达在肿瘤中是强烈、均匀分布的(图2)。然而，直肠内环糊精负载的MDJ和直肠内MDJ的施用与上述肿瘤标记物的温和但明显的减少有关，但是组织病理学分析表明CASPASE-3表达表面上局限于粘膜上皮(图3)。
其它组织学特征表明在组A和B中对抗肿瘤的免疫防御的增加(由于显著增加的肿瘤周围淋巴细胞数量，没有计数)。
在MNNG处理的动物和那些没有接受致癌物质MNNG的动物两者中，用MDJ和环糊精负载的MDJ的处理不与正常结肠粘膜和邻近肿瘤的粘膜中细胞增殖和细胞凋亡的任何显著变化相关。
环糊精负载MDJ没有毒性效果
虽然环糊精负载的MDJ在肿瘤中有强烈影响，除行为焦虑的一些信号之外，在组织病理学分析以及标准血液学和临床化学参数两者中没有观察到脑、肝、脾、肾脏、肠胃和骨髓毒性有任何病征。
研究评价了作为简单的定量技术，caspase-3活性的形态学检测的使用，以在组织样品中测量细胞凋亡。对于内在的和外在的细胞凋亡诱导途径，促凋亡酶caspase-3在会聚点被活化(Nakopoulou et al.,Pathobiology 2001,69:266-273)。本研究旨在为了更深入地了解它们的抗肿瘤效果的机制，表征用环糊精负载的MDJ和MDJ处理后的小鼠的结肠肿瘤和正常粘膜中细胞运动和细胞凋亡变化。本研究已表明用环糊精负载的MDJ而不是MDJ的处理在小鼠中与MNNG诱导的更小的平均结肠肿瘤大小有关。据发现，用环糊精负载的MDJ的治疗(腹膜内)在结肠肿瘤而不是它们邻近的或远离的正常组织中引起增殖的温和抑制。而且，值得注意的是，只有这种治疗与细胞凋亡的显著的诱导有关，也只在肿瘤中而不在远离的结肠粘膜的正常邻近的中。有趣的是，在MDJ处理的动物的肿瘤中得到更高的增殖指数，暗示MDJ可能对该粘膜是发炎的刺激，这可能由于它对上皮细胞的细胞毒性效应。
环糊精负载的MDJ的处理同时导致细胞凋亡的显著的诱导和增殖的抑制。相反，MDJ被发现不能在结肠肿瘤中抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡的温和增大。这些发现暗示环糊精负载的MDJ的抗肿瘤效果的作用机制与它到一个达给定肿瘤的所有部位的能力可能有更大的关系，这在MDJ处理的组和环糊精负载的MDJ(直肠内)处理的组中没有被发现。重要的是，环糊精负载的MDJ在肿瘤细胞中诱导细胞凋亡的同时使非肿瘤细胞未受影响，从这个意义上讲已经证实它的抑制作用是癌症特异性的。
这个研究取得的结果表明全身注射环糊精负载的MDJ能到达结肠肿瘤，并至少在实施的实验条件下减少化学诱导的结肠肿瘤的生长而没有任何明显的副作用。
实施例5：用环糊精负载的MDJ阻断癌症
该实施例描述的研究表明上面实施例3制得的环糊精负载的MDJ在NOD-SCID小鼠中引起异种移植人类Caco2肿瘤的显著收缩。此外,环糊精负载的MDJ诱导血管破裂，抑制血管生成和癌症干细胞。基因芯片分析表明环糊精负载的MDJ同时影响多种重要的信号途径，并对NFkB、HIF-1和金属硫蛋白有主要抑制。结果通过定量实时PCR、蛋白质印迹、southwestern组织化学和免疫组织化学来确认。
雄性NOD-SCID小鼠(6-8周大)被皮下注射Caco2人类结肠癌细胞(1.5x106，在100μL的PBS中)。一周后，小鼠被随机分成两个组。4周后，当明显的肿瘤(20-25mm2)形成时，组GT被腹膜内注射100μL环糊精负载的MDJ，每天一次持续四天，对照组被施用PBS(组GC)。肿瘤体积根据以下公式进行计算：长度2x宽度/2，肿瘤在用环糊精负载的MDJ处理开始后的第5天被除去。获得并定量了来自肿瘤的总的RNA，并如所述，对RNA质量进行了评估。基因表达分析用基因芯片实验方案(Amersham生物科学，Piscataway，新泽西州，美国，包含大约40.000探针)进行(Rizzatti et al.,2005)。对靶基因cyclin D1、HIF-1、金属硫蛋白D3和VEGFA进行定量实时PCR(q-PCR)。倍变化使用2-ΔCt方法计算。对HIF-1a(Novusbiologicals公司)和NF-KB p-50(SantaCruzBiotechnology公司，CA)进行蛋白质印迹分析(WB)。β-微管蛋白(克隆KMX-11:3000，Millipore)被用作上样对照。用于肿瘤组织制剂中NF-kB的原位检测通过southwestern(SW)组织化学分析进行。H和E切片用于组织病理学分析。对PCNA、细胞周期蛋白Dl、CASPASE-3、CD31、VEGF、CD34、COX-2、TGFβ、HIF-1、CD133、Oct4和MT进行免疫组织化学(IHC)分析。还进行了TUNEL分析。两个不知道分组标记的研究者独立地对样品进行评估。计算得到染色的细胞和微血管密度。数据用统计程序GraphPadPrism 5(Graph Pad软件公司，圣地亚哥，加利福尼亚，美国)进行分析，分析工作通过Mann-Whitney试验进行。P<0.05的概率被认为是统计上有显著意义的。
此外，意图证实环糊精负载的MDJ是否能影响肿瘤微环境、血管生成和癌症干细胞(CSC)，它们目前被认为分别与促进肿瘤生长和支配对抗常规癌症治疗的主要对抗***密切相关。统计分析通过Mann Whitney试验进行。
这里给出的本研究最值得注意的发现是由环糊精负载的MDJ诱导的显著的肿瘤收缩效应，而来自对照动物(GC)的肿瘤在实验周期内呈现显著的生长(P<0.01)(图4A)。宏观上与对照肿瘤相比，来自于经环糊精负载的MDJ处理的动物的肿瘤具有暗淡的、坚固的外层和较软的核心(图4B和4C)，暗示环糊精负载的MDJ的处理导致肿瘤血液灌流的降低。
异种移植肿瘤的苏木精和曙红(H和E)分析表明在五类组织中有突出的血管分布和***：(1)具有呈现出分化不良、染色深、有嗜碱的和少细胞质的圆形至卵圆形细胞的群体的肿瘤核心；(2)凝结的出血性坏死的病灶；(3)围绕坏死病灶的肿瘤的假栅栏，被称为“周围坏死区域”(PN)；(4)肿瘤边界处的侵入前沿和(5)通常由梭状细胞组成、在束中分组并在肿瘤核心和***蔓延的基质单元(图4J)。
基因芯片分析表明环糊精负载的MDJ同时影响多种重要的信号通路(图6A和6B)。在芯片中的40,000种基因中，环糊精负载的MDJ处理引起2016种基因的上调和1305种基因的下调(2-26.3倍)。主转录因子以及未知功能的新基因被改变。图2中概括的是与未处理的动物相比，环糊精负载的MDJ处理的动物的肿瘤中上调或下调两倍或更多倍的主要基因。当使用IngenuityPathways Analysis***通过它们的基因产物的相互作用来将改变的表达和它们的分类与最重要的基因关联时，高度连接的网络出现了(图6C和6D)。基因芯片结果和qPCR研究结果之间没有发现差异(图6E)。
有趣的是，已知与抗癌症效果有关的多种基因被发现在环糊精负载的MDJ处理的肿瘤中是上调的，例如PPAR。相反地，与肿瘤生长相关的一些重要基因被发现是下调的，如NFkB、VEGF、AKT、HIF-1和Hox。基因表达的改变包括与血管生成、炎症、细胞凋亡、基质金属蛋白酶、细胞增殖、新陈代谢和抗药性有关联的许多途径。这里不能描述被环糊精负载的MDJ改变的肿瘤基因表达的整个范围，但是与血管生成和癌症干细胞调控机制有关的一些最主要研究结果的重点可能与形态学数据存在关联。
环糊精负载的MDJ的抗血管生成效应——环糊精负载的MDJ处理的组呈现出血性肿瘤坏死的区域，这比对照组GC(p<0.01)中存在的要大284％(分别是图4D和4E)。此外，肿瘤坏死显然主要发生在肿瘤的中心而不是在周边的肿瘤的外部(图4E)，表明不仅血管生成被抑制，而且血管损伤现象也可能发生。实际上，环糊精负载的MDJ削弱了内皮细胞(EC)组装成lumenized和有组织的血管(图4F和4H)，这导致异常的血管生长的形成、形成以死路结束的有许多毛细血管的许多有明显功能障碍的血管(图4G和4I)。这些观察结果与鸡胚中环糊精负载的MDJ的血管密度减少和比正常血管更易漏、更缺少组织的新血管的出现(Braz JBiol.2010；70:443-449)的以前的研究结果是一致的。
SW显示在GT肿瘤中对于NFkB在特异性染色的血管的数量上有令人印象深刻且明确的增加(485％；p<0.01)，这可能仅代表对细胞损坏的反应性信号(图7F)。这与在GT组中为细胞凋亡标记物CASPASE-3阳性染色的大量的微血管的观察结果是一致的。此外，来自环糊精负载的MDJ处理的小鼠的肿瘤比那些来自对照小鼠的肿瘤包含更少的VEGF和CD31阳性染色的微血管，这与环糊精负载的MDJ能够抑制肿瘤血管生成的观点是一致的(图4N、4M和4O)。
此外，GT在对于CD34为阳性的细胞数量上有明显减少，CD34为源自骨髓的内皮前体细胞的标记物(图4J、4K和4L)。这些研究结果证实了与CD34(+)不成熟骨髓细胞(iMC)的恢复有关的CCRI(CCL9/15受体)下调的MA观察结果。Ccr1的缺乏显著地抑制了小鼠肝脏中肿瘤的副产物(Proc Natl Acad Sci U.S.A.2010；13063-13068)。
基因芯片表明环糊精负载的MDJ的处理下调了SAT3和NF-kB途径对p65/RelA(Fc-2,524)的作用，与在细胞核中被mRNA TKB1(NAK)的高表达加强的mRNA IkB(2,599)的上调一致。通过确认NFkB的水平显著地减少(图8)，WB和SW分析都证实了基因芯片结果。NFkB和Stat3都被认为是通过增大VEGF和其它促血管生成因子，在癌症进程中协调炎症和血管生成之间关系的主要的转录因子(Curr Mol Med.2010；10:369-373)。
在这个实验中发现伴随TGFBR1和TGFBR2的上调，TGFβ下调。在MA分析中TGFβ的下调通过qPCR和IHC得到证实(图7H、7I和7J)。TGFR的调控可能涉及SMAD复合物调控的部分变化(SMAD2的激活和SMAD3的抑制)以及E2F7的激活和E2F6与E2F4的抑制。这与细胞周期蛋白B2和CDK2AP1的上调，以及细胞周期蛋白C的下调有关。TGFβ通过刺激血管生成连同其它机制一起致使癌症发展(Tian et al.Transforming growth factor-f3and the hallmarksofcancer.Cell Signal.2010)。
观察到mRNA HIF1a亚基抑制剂的显著的下调(HIF1AN,FC 3.713)，以及缺氧诱导因子1(HIF-1)(缺氧信号通路的关键介体)的下调(Fc-2.464)。APEX1的下调(Fc-2.387)可能与HIF1a的存在较少有关，也可能与基质金属肽酶复合物如MMP2(Fc-3.108)和MMP14(Fc3.890)的降低的转录有关。HIF1的抑制可能与检测不到的mRNA VEGF表达和较少的血管生成诱导(FEBS J.2009:509-518)有关。可以观察到WB和IHC分析(图7K、7L、7N、7M、7O)证实了基因芯片和qPCR研究结果。
发现了可能与细胞核中检测不到的mRNA STAT5的存在有关的PPARa表达的重要的增加(Fc 7.007)。mRNA PPAR-gama表达的缺乏可能与转录因子如c-Fos和c-Jun的缺失有关系，并且可能造成未被检测到的COX-2mRNA的存在，这与由IHC获得的COX-2表达的急剧降低是一致的(图7P、7Q和7R)。PPARα的激活可能与CD36e ABCA1、ABCA2和ABCA 10的上调有关。该信号通路支持环糊精负载的MDJ抑制血管生成的又一个机制，因为PPAR激动剂是抗血管生成反应的有效介体，并且目前在研究中是癌症处理的合理选择(PPARRes.2010；81:4609)。
因此，环糊精负载的MDJ的血管破裂和抗血管生成效应与靶向多重通路在抗血管生成治疗中是一个趋势的提议是一致的，因为阻断单一通路可能不是非常有效的，并且肿瘤细胞可能发展阻力来对抗抗血管生成药物和/或使用其它的血管生成机制(CACancer JClin.2010；60:222-243)。
环糊精负载的MDJ和癌症干细胞——癌症干细胞(CSM)是肿瘤起源的主要来源(JPathol.1999；187:61-81)，与包含大量肿瘤的更加分化的细胞相比，细胞更新并表现增大了对细胞毒素试剂和放射疗法诱导的细胞凋亡的阻力(Curr Med Chem.2008；3171-3184)。因此，CSC指导的治疗途径目前被认为代表了提高临床癌症治疗的相应策略(CurrMed Chem.2008；3171-3184；J Clin Invest.2010；120:41-50)。
本研究中使用与患者的低存活相关的三个经典的肿瘤干细胞标记物：CD133、Oct4和金属硫蛋白(J Pathol.2000；191:306-312；Ann Surg Oncol.2009；16:3488-3498；WorldJ.Surg.2002；26:726-731；Mutat Res.2003；533:201-209)。在对照肿瘤中，已观察到，使用的三个干细胞标记物主要在PN区域和肿瘤的侵入前沿被发现(图8A至8N)。PN区域也是HIF-1染色更强的区域。PN区域可能更倾向于包含含氧量低的环境并且缺氧激活HIF-l alpha，以提高CD133阳性细胞的自我恢复活性，驱动它们转化为癌症干细胞并抑制它们的分化(Oncogene 2009；45:3949-3959)。有趣的是，观察到环糊精负载的MDJ与CSC数量的显著的下降有关，然而这些研究结果的机制仍有待完全地阐明。由于血管改变的直接细胞坏死可能是CSC数量下降的主要机制，这是不太合理的，因为CSC对含氧量低的环境是相当有抵抗力的。
对照肿瘤显示在周边坏死区(PN)有高数量的圆形金属硫蛋白过表达细胞(MTOEC)和有肿瘤边界的梭状MTOEC，它们以相互连接并与新生血管密切相关的索进行组织(图8I、J、L、N和M)。在目前的研究中，基因芯片分析显示在MT表达中有环糊精负载的MDJ相关的下降，这被qPCR和IHC证实。此外，环糊精负载的MDJ也强烈地抑制MTOEC的出现和空间定向(图8I至8N)。这可能重要并负面地影响血管生成，因为MT在血管生成过程中有主要的调节功能(J Cereb Blood Flow Metab.2000；20:1174-1189)。
CSC和内皮细胞之间有主要的信号交换(Nat Rev Cancer 2007；7:733-736)，并且在一些肿瘤中CSC优先存在于邻近肿瘤血管的特定区域(CSCs生态位)，或者源于灌注不充分并且含氧量低的区域，对此他们已经进行了修改(Nature 2006；441:1075-1079)。CSC自身可能生成血管生成因子并且自身依赖于由脉管***生成的因子，以维持自我恢复和长期的生长(Nat Rev Cancer 2010；2:138-146)。为此，考虑到CSC需要含氧量低的生态位以保护它们免受氧化压力，因为活性氧会引起导致CSC耗尽的p38-MAPK介导的增殖，对靶向CSC和它们微环境的新的癌症疗法最近已经被提议(Nat Rev Cancer 2010；2:138-146；Curr.Opin.Hemato1.2008；522-528)。基于这些研究结果，可能暗示环糊精负载的MDJ可能也很适合这类疗法，因为它不只是与结合到血管的CSC数量的下降有关，而且破坏了MTOEC和新生血管的空间组织，干扰CSC生态位。可以推断，这是不难想象的，在多信号分子如环糊精负载的MDJ的作用下CSC的表型和生物学行为可能被反转或关闭。
环糊精负载的MDJ和细胞凋亡诱导——来自环糊精负载的MDJ处理的小鼠的肿瘤含有比对照小鼠多得多的凋亡细胞，如细胞凋亡的两个了解得非常清楚的标示物，即TUNEL技术和CASPASE-3所示(图8O至8T)。这个发现可能与这些区域中的NFkB和HIF-1抑制有关，因为这两个因子是有效的细胞凋亡抑制剂。这个发现也可能与这些区域中CSC数量的下降有关。尽管CyclinD1表达增加，增殖指数(如PCNA染色所反映的)没有显著地受环糊精负载的MDJ处理影响(P＝0.14)。
存活/抗凋亡通路的激活是癌细胞的共同特征，与对细胞毒素试剂的抗性有关。与药物处理的细胞反应有关的存活通路主要是PI3K/Akt和Ras/MAPK，它也介导由生长因子激活的信号，并且在关键过程包括细胞增殖、新陈代谢、细胞凋亡和血管生成的调控中发挥作用。在我们的研究中，mRNA AKT1下调(Fc-2,021)，与AKT复合物的高度下调(Fc-2,021；PKBα,PKBβ,RAC,RACα,PKB/AKT)平行。请填写并与PI3K复合物的温和下调(PIK3AP1-1,856；PIK3C31,549)相关，可能由于GAB复合物(GAB11,511和GAB21,569)的激活驱动对p65/ReIA激活的控制。FGFRL1和FGFR1的上调、PIK3AP1和FGF13的抑制依次与FGFR3和PI4K2A的激活相关。总而言之，这些调控可能与P13K复合物中的下调(PIK3AP1-1,856；PIK3C31,549)相关，下调可能由GAB复合物(GAB11,511和GAB21,569)的激活和caspases 2和9的表达抑制的减少引起，主要被复合物AIFM2和AIFM3刺激。Wnt被WIF1下调，伴随Wnt5A的显著抑制。
此外，也观察到MAPK复合物的重要下调，主要对MAP2K1(Fc-3,155)、MAPKAPK2(Fc-2,501)、MAPK12(Fc-2,245)、MAP4K3(Fc-2,153)、MAP4K5(Fc-2,149)和MAPK14(Fc-2,082)。该细胞周期蛋白复合物呈现可能取决于NF-kB复合物调制的结果。因此，尽管细胞周期蛋白C(Fc-1727)下调，细胞周期蛋白复合物如D3、A1和B2(Fc 3,775；1,528和1,676)是上调的。同时，在对细胞周期蛋白激活的直接平衡中抑制剂复合体被激活，如p19INK4D(Fc 1,871)和p15INK4B(1,523)。这伴随有与tBID和BIM增加相称的13c1XL(Fc-1,601)的降低，以及mRNA BID(Fc 1,505)的上调和最后Caspase 9(2,6343)和Caspase 2(1,530)的高上调，尽管mRNA Caspase 3的计数没有改变。由于SCID小鼠是免疫缺陷的，环糊精负载的MDJ引起的细胞凋亡的诱导和肿瘤生长的抑制不需要宿主的免疫功能，并很可能由环糊精负载的MDJ的抗血管生成或直接的肿瘤细胞杀死作用产生。
由于这是一个短期实验，不可能对反抗治疗的肿瘤防御***进行评估。然而，与抵抗化学疗法的抗性有关的一些最显著基因的下调，如MT、ABCB4和HSP70(HSPA1A)(Anticancer Res.2005；2661-2668；Mol Cell 2009；15-27)，很可能使环糊精负载的MDJ处理的肿瘤不会具有重要的反抗处理的抗性。
环糊精负载的MDJ和肿瘤组织组建——肿瘤组织通常被认为是完全无序的、混乱的。然而，近年来已经开始争论恶性肿瘤代表复杂的动态和自我组织的生物***，能发展与从其它生物***已知的模式类似的进化的适应行为的多细胞集体模式。这包括环境条件和集体决策的集体感觉，如在恶性肿瘤入侵期间，集体细胞迁移是普遍的证据增加(BioEssays 2009；31:190-197)。因此，另一个概念上新颖的策略已被提议，将向“阻断”细胞群的信息过程调整。也就是说，如果细胞-细胞间联系可以被停止或至少被治疗上严重地妨碍，可以说***整体将减慢。已发现在对照组内主要在入侵前沿的肿瘤细胞通常自己排列成条索(像线)，这些条索与血管附近和周围的相似组织联系，形成交织的条索网络(图4F和4H)。有趣的是，由于环糊精负载的MDJ的影响，发现了肿瘤组织“混乱”。GT组中肿瘤细胞非常频繁地丧失条索的组建，微血管被扭曲或阻断的并有血红细胞的渗漏，特征是组织细胞组建的重大损失(图4G和4I)。提议环糊精负载的MDJ还可能关掉组织的肿瘤信号***，这值得进一步研究。有趣的是，基因芯片分析显示环糊精负载的MDJ引起的与组织的结构组织相关的一些重要基因的下调，如Claudin-4(CLDN4)，在一些癌症中高度表达的紧密连接组织的跨膜蛋白(Cancer Sci.2009；1623-1630)；EIF4E，由于对eIF4E抑制的肿瘤组织的易感性，已被认为是癌症的致命弱点(Cancer Res.2008；631-634)；DSC2(桥粒蛋白)，它可能有助于转移形成的一套新的细胞粘附分子中(Cancer Res.2008；68:6092-6099)；MMP13，在肿瘤细胞增殖和入侵中起作用的基质金属蛋白酶(Oncol Rep.2010；1241-1247)；和Wnt-5a，其增加的表达可能用来抑制权威的WNT信号通路的激活并加强癌症生长(Br JCancer.2009；209-214)。
总之，似乎很明显，环糊精负载的MDJ的抗癌症作用不能用单个目标治疗范例来解释。为了解环糊精负载的MDJ的作用，对肿瘤如为存活而战斗中适应其基因反应的多细胞生物的全面了解很有必要，如图9所示。这个适应中环糊精负载的MDJ的作用可能在癌症治疗中阐明新的范例。JA是遗传调节素。它在植物物种进化中被格外保存了数百万年，并且从事调节生长和对特殊范围的生物侵略者的防御反应之间的复杂平衡，从而在快速变化的环境中优化植物健康程度(Curr Opin Plant Biol.2008；11:428-435)。
图9中黑色箭头表示缺氧驱动信号；蓝色切线表示缺氧驱动信号的环糊精负载的MDJ封阻；蓝色箭头表示环糊精负载的MDJ诱导。在肿瘤生长期间，生长组织和血管供给的需求之间协调的缺乏导致一些肿瘤区域供氧的不足。留在有轴型环境中受影响最严重的，最终组织坏死。围绕这些坏死病灶的有缺氧的周边坏死区域(PNA)，所述缺氧的缺乏氧气的程度较弱，其可能允许细胞通过存活信号的强烈激活来适应和生存下来。因此，我们观察到这个区域具有高度表达的NFkB、HIF-1、TGFβ、COX-2。高水平的这些分子依次激活释放刺激组织生长的生长因子的干细胞表型，减少细胞凋亡和促进血管生成。因此，已发现对于经典的癌症干细胞(CSC)标示物：CD133、Oct4和MT，有降低的细胞凋亡指数(通过TUNEL和Caspase-3)的高数量的阳性细胞。所以，PNA作为刺激肿瘤生长和抵抗缺氧和治疗的信号工厂工作。
CSC也在侵入前沿(IF)区域积聚，并可能在血管的紧密临近处迁移和支持邻近组织侵入。CSC的紧密接近处和内皮细胞在肿瘤边缘形成副分泌信号网络。由于CSC和肿瘤新血管提供的相对容易的血液供给的刺激，这种合作关系增加了肿瘤细胞的入侵。
在这个理论模型中，含氧量正常区域的肿瘤细胞其肿瘤核心保持相当温和的新陈代谢和生长，有少量的干细胞和组织生长因子存在。这些细胞提供一种后备军。如果缺氧或其它侵袭到达这些细胞，它们中的一些可能切换到CSC表型，但是它们的大多数可能只有通过慢慢增殖如肿瘤进程来填满空间。
环糊精负载的MDJ阻断血管生成和破坏现存的血管，这增加了缺氧并将触发肿瘤存活和生长(HIF-1、NFkb、MT、MAPK、干细胞因子)的信号。然而，这将通过环糊精负载的MDJ同时抑制至少大部分这些主要的信号***来避免。从而，肿瘤不能对增强的含氧量低的病症作出反应，大面积的坏死逐渐替代肿瘤组织，为肿瘤收缩提供最优条件直到肿瘤几乎被消除。
当环糊精负载的MDJ与肿瘤接触时，它不仅抑制血管生成并诱导细胞凋亡和血管***，而且当有缺氧和组织损伤时抑制被肿瘤激活的主要存活信号***。因此，我们观察到环糊精负载的MDJ在肿瘤脉管***中引起直接冲击，这导致巨大坏死区域的形成，并且与肿瘤防御信号***的抑制相结合。
CSC数量的降低导致至少两个主要结果。第一，肿瘤可能丧失了它的刺激因素的主要来源。第二，因为CSC对癌症治疗和缺氧更加有抵抗力，很可能肿瘤不能从第一次冲击恢复并且发展对治疗的抵抗。
实施例6：体外血管生成分析和体内鸡绒毛***(CAM)分析
使用的细胞系：来源于人类脐带内皮的非赘生性细胞(HUVEC)和黑素瘤的赘生性细胞、B16F10鼠科肿瘤。HUVEC由临床和毒物学分析部门的Dra.Dulcinea Saes ParraAbdalla提供，FCF-USP's和B16F10鼠科黑素瘤细胞由UFSCar生理学和分子生物学部门的Marcia Cominetti教授提供。两个菌株生长于有10％胎牛血清的RPMI。两个类型细胞的形态学观察结果建议共同的机制。影响血管生成的初步研究在有HUVEC的体外获得。采取措施通过流式细胞术(吡啶碘化物和吖啶橙)研究细胞周期、用共聚焦显微镜(线粒体红色荧光探针)评定线粒体活性和测量HUVEC产生的VEGF和PGE2，我们通过有商品抗体的ELISA进行细胞培养上层清液。
对于有卵的试验，卵清用于Gallus，在控制的温度和湿度下培育在恒温细菌培养器中。使用和不使用产下giragem的卵进行培育。壳顶面的标记用来对照此过程。用浸泡在70％醇中的卫生棉小心地清洁皮之后，卵在培育的第四天打开。打开在层流中进行以保持所有的卵在它们孵育的相同位置，支撑在塑料座上并在顶面标记。二十世纪上半期描绘的实验步骤被修改并精炼用于该项目。该方法的描述发展了
用精细并弯曲的小手术剪、微型手术钳、透明胶带、用于丢弃的容器、Pasteur吸量管、一次性针和注射器、用于卵的塑料或纸板进行打开。
打开卵的第一个操作允许获得壳下面的区域。pDesta方式，在表面上打开窗户可以在没有溢出保留在观察位置的卵的内在物的情况下发生。基圆直径25x 8的针与3毫升的注射器结合在一起，以45的起始角慢慢引入通过卵的空气室，直到从吸入只收集到精细白蛋白的大致位置。小心地钻孔以避免裂缝。避免了厚白蛋白像蛋黄或空气的去除，否则蛋黄的抽取会破坏胚胎，除去空气将允许它的返回，危及胚胎的存活。
大约5毫升白蛋白从每个卵中除去进入卵黄囊保持在低水平，能够打开卵而没有胚胎附着在壳上，那些的可视化成为可能。白蛋白丢弃在合适的容器中，留下几毫升用于封闭***针的孔口。该洞用它自己的卵清蛋白封闭，用醇滴在该部位沉淀。为预防渗漏的护理和维护对最小化孵化场的污染风险是重要的。必要时，可以再滴一滴白蛋白在洞上并在上面滴醇，直到在该部位观察到薄膜。
使用细尖的和弯曲的剪刀，紧挨着石墨标号蛋壳被小心刺穿，这是卵得到加热那一面的最高部位。钻孔后，慢慢地切壳以避免裂缝的出现，直到字母“U”形状的切口形成。最后，使用被引入该部位出发点的夹子，完成抽取和窗口的形成。为防止破坏胚胎，此步骤中的护理是引入和剪刀的操作。当胚胎非常年轻时，壳更坚硬，观察更困难。而且，年长的胚胎有最大的和最多的CAM粘附在蛋壳上，这增加该步骤期间伤害的风险。打开卵的理想时间是标准化的4天的孵育。在这期间，伤害引起的损失的出现被避免，在蛋壳上开窗口使得观察有动脉和静脉特征结构的CAM的胚胎和胚胎外组织变得容易。
该窗口用一块透明胶带封闭，以保护胚胎。卵恢复孵育温度。孵卵器的暂停时间应该最小，因为在生命的这个阶段胚胎没有能力自身产生热量。适当的发育依赖于温度和湿度的环境条件。
打开和封闭窗口后，所有卵以相同的初始条件被放回细菌培养器中，一般再保持七天。在此间隔，进行血管生成的试验或活体内肿瘤生长的研究。注射肿瘤细胞的卵中血管生成的观测几乎遵循相同的血管生成试验模型。第8天，将注射肿瘤细胞的卵曝露于上述实施例3中制得的纯MDJ(顺式/反式，纯度96％，购自Sigma)或环糊精负载的MDJ，剩余的卵留在细菌培养器中直到第14天。黑素瘤细胞的注入在第4天进行，第8天卵接受纯MDJ或环糊精负载的MDJ并保持培育长达14天。在方案开展期间，调节注射和治疗的时间。收集期间和为获得图像的护理对所有实验是标准化的。
每个试验中规定的周期结束时，卵从细菌培养器中取出，在冰箱中冷却至少半小时直到不再观察到胚胎的心跳。此现象确认后，胶带被移开，用少量4％甲醛滴注CAM。固定器保持20分钟。此后获得薄膜并为保鲜进行处理。获得图像的质量依赖于血管内物质的妥善保存，它们没被使用或对比染色注射。
简短定影后，薄膜破裂，惰性胚胎放在培养皿上。主要的血管在接近于胚胎腹部中的***点处用棉线打三个结系紧。CAM被分离然后脱离其它组织，用冷的生理盐水快速冲洗以除去废蛋黄，并用最少的液体涂在显微镜用载玻片上，避免气泡、裂缝或薄膜中皱褶的形成。在薄膜上放置显微镜盖玻片后进行观测，防止形成的液膜中气泡的形成。明场下调节放大镜用于观测，没有过滤和小的增强(一般2x，某些情况下5x至10x的增加用于观测细节)。用连接到尼康SMZ1800立体显微镜放大镜的DS-U1照相机以程序ACT-2U进行高分辨捕获后，图像被扫描入TIFF文件，每次试验保持相同的条件和可调节的光、阴影和白色平衡。每次试验中，从fund捕获图像，保持光和色彩调节是为了标准化分析材料的图像。对于暗场图像，以相同的增强重复调节。
为了更好地观察细节，同一样品的每个区域在明场和暗场都被成像。血管网络的生长通过处理明场二元图像中的图像用程序图像J来进行分析。该技术允许定量结果的采集，不依赖于通过结合明场和暗场图像的计算，尽管也研究了这种可能性。本研究对指导自己采集的改进和材料的初步处理是重要的。然后，该技术被用于二元图像构建的尽可能简单的分析算法替代。用于处理在二元图像中归一化成背景图像的明场图像的程序已被精炼和标准化。为图像J开发了插件，这允许在二值化阈值的单一调节期间对结果图像的连续观察。根据这个共同的算法处理和为每批图象处理和一系列分析设置的二值化阈值，分析每个完整的测试。
对于定性分析和其它的文件，用连接到有32x 250x放大物镜的光学显微镜的佳能PowerShot A640照相机获得图像。
典型的细菌培养液是每卵2x 104细胞，培养基体积小于10毫升。通过对CAM上着色量形成的目视观察、放大镜和显微镜对Melamona生长进行研究。即使当着色仍然几乎不可见时，放大镜、暗场图像中不透明区的观察限定肿瘤细胞生长的位置。在显微镜下，染色后对细胞进行观察，材料没有用硫素或0.1％甲苯胺蓝固色。对于这两个染料，用酸性醇分化提高了与正常组织的对比，并允许载玻片的锉平。以这种方法不能进行染色材料的定量分析，因为有醇的材料的脱水改变了血管直径，并且到目前为止获得的染色模式没有重现性和足够的对比度质量。
在细胞培养中试验的MDJ和环糊精负载的MDJ的剂量被合并入卵模型中，考虑每卵固定体积60毫升。
使用的卵被抽样测量，整个试验周期60毫升的平均体积保持不变，有低于10％的标准偏差。根据试验的兴趣，以不同方式进行处理。对于可行性研究，打开卵之前对白蛋白进行治疗并在孵育的第三天除去治疗，保持37℃直到溶液制备和通过相同针孔回到卵的那一天。第7天卵中白蛋白的再次引入之前，抽取新的量以避免流体压力增加和溢出。存活力试验被监测长达10天。对于抗癌作用的研究，孵育的第11天在CAM上以单一剂量进行治疗。在CAM上治疗的可行性与通过白蛋白治疗的存活力相比较。
对活体内血管生成的影响在环糊精负载的MDJ的抗癌作用中展现了一个新侧面。
MDJ被证明对培养的黑素瘤细胞和HUVEC有毒性。在细胞培养中发现活性物质在非常相似的浓度下发挥抗血管生成和抗癌作用。非常清楚地确定每一类细胞的中毒浓度是可能的(图10和11)。在毒性试验(MTT)中，由于保存线粒体活性染色减少，保持在小于1mM MDJ浓度的恒定值。这个行为在融合HUVEC的细胞培养中是非常重现的。生长曲线显示在低于1mM的浓度下也有约20小时的皱褶时间常数。更高浓度下，线粒体活性被损害，皱褶时间趋向于无穷大，也就是说细胞停止***并死亡。在鼠科黑素瘤的培养中，结果非常相似，中毒浓度非常接近。
在中毒浓度下，MDJ改变了两类细胞的细胞形态，还导致多核巨细胞和液胞pseudoinclusoes的形成。
这些对MDJ形态的影响暗示细胞凋亡和自体吞噬的诱导不仅在肿瘤细胞而且在内皮中发生，引起通过流式细胞术对HUVEC细胞周期的更详细研究(图13)。新的结果再次肯定内皮细胞和肿瘤共享毒性对象的假设(图13和表3)。
另外，表明了MDJ对血管生长因子VEGF的影响。
表3：MDJ对HUVEC中细胞周期和VEGF的生产的影响
细胞培养中内皮细胞的线粒体在MDJ存在下表现出激活作用。这个效果在对低密度区域的MTT响应中最明显(图14)。在这些条件下(lx 104细胞/毫升)和高密度区域(2x105细胞/毫升)，由HUVEC产生的PGE2都没有增加。PGE2的产生通常是这些细胞的融合，但是会介导MDJ的间接影响。
CAM模型中对内皮细胞增殖的毒性作用表现在体外和体内。
黑素瘤细胞的存在降低了卵的存活率。MDJ部分地恢复了存活。CAM模型的结果证实在活性物质的作用下黑素瘤主体经历剂量依赖的退化。
关于环糊精负载的MDJ的试验。
体外环糊精负载的MDJ的试验表明活性化合物对HUVEC和B16F10的细胞毒性被保留，发生在低得多的剂量(图22)。在相当于用于制剂的浓度下赋形剂是惰性的。环糊精负载的MDJ还用ME1001人类癌细胞系和组织进行试验。观察到相似的细胞毒性。
然后，环糊精负载的MDJ在体内模型中进行试验。第一个研究证实黑素瘤存在的情况下血管组织上的活性物质剂量减少和保护作用。
实施例7：用实施例2的脂质体负载的MDJ进行的体外抗细胞生长分析和体内抗血 管生成实验
实施例2制备的脂质体负载的MDJ在九个癌细胞系中进行试验：UACC62-黑素瘤、MCF7-抗药性癌症、NCIADR-多药抗药性乳癌、7860-肾癌、NC1460-肺癌、PCO3-抗药性***癌、OVCAR03-卵巢癌、HT29-结肠癌、K562-白血病。这些细胞系用实施例2制得的有不同浓度MDJ的纳米乳液进行处理。如图26所示，环糊精负载的MDJ以剂量依赖的方式抑制肿瘤生长。图27显示纳米载体对体内抗血管生成活性的影响。更具体地说，有100nm纳米载体的纳米乳液呈现比有50nm纳米载体的纳米乳液跟更高的活性。
进一步，如图28所表明的，当脂质体尺寸小于100nm时脂质体负载的MDJ显示提高的抗细胞生长活性。
实施例8：体外抗细胞生长分析
[词实施例基于描述哈佛大学研究的手稿]
纳米负载的MDJ(其中纳米载体是CD、脂质体或LDE)在下面11个细胞系中进行试验(3个白血病、2个乳癌、1个巨噬细胞和5个***癌)，这些细胞从美国典型培养物收集中心(ATCC)购买得到。细胞在由ATCC建议的各自的生长培养基中生长(补充有10％胎牛血清和青霉素/链霉素的RPMI-1640、DMEM、EMEM或F12-k培养基)。细胞系的细节列在下面表4中。
表4
纳米负载的MDJ制剂溶于Milli-Q水中并在室温下储存。使用前，制剂用0.22微米过滤器纯化以避免污染。
来自每个细胞系的三百万细胞均等地分配到6孔板的三个孔中并过夜生长。随后的几天，含有1uM MDJ的纳米负载的MDJ制剂被加入一个孔中，而相同浓度的空纳米载体(或纳米颗粒)被加到第二个孔中，负载细胞的第三个孔保持原封不动，没有药物或空纳米载体(“对照”)。治疗后的6小时、12小时和24小时，在倒置显微镜下观察制剂的凋亡效果。
纳米负载的MDJ在试验的癌细胞系中有显著的细胞凋亡效果。在每个被试验的细胞系中观察细胞凋亡效果，细胞凋亡开始于MDJ治疗的6小时后并在24小时后到达峰值。24小时后，一些癌细胞系如TIB-512、CRL-2876和CRL-2314完全或几乎完全死亡(见图38-40)，而其它的显示平均60％到70％的细胞死亡(见图41)。其余的细胞处于预凋亡阶段。该分子的作用仅针对癌细胞，表示纳米载体作为有效的药物输送试剂进入癌细胞。只有空纳米颗粒的对照细胞表现出非常少到没有细胞凋亡。
相对于健康细胞，癌细胞有不同的产生能量的方式，这也被称为沃伯格假说。在这个假设中，为癌细胞生成能量的线粒体使用非氧化途径代替健康细胞使用的氧化途径。据报道，MJ在癌细胞线粒体中针对这种异常，引起细胞色素C以及其它蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶的释放。MJ能够在从Hep 3B肝癌细胞分离出来的线粒体中引起肿胀，而不是在从3T3非转换细胞或正常淋巴细胞分离出来的线粒体中。细胞色素C的释放导致线粒体膜透过性转变、膜去极化、渗透膨胀，因此引起细胞凋亡。列在表4中的巨噬细胞细胞系作为非转换细胞用于此研究，其中被普遍观察到没有细胞凋亡效果。
申请人进行的研究表明纳米负载的MDJ发挥了它的细胞毒素作用，不依赖于转录、迁移和p53(未发表)。MDJ的早先研究(未发表)仅仅在体外表现出相似的结果，但是在体内该药物很快降解，需要非常高的剂量才能看到效果。将MDJ包封在纳米颗粒中，它在体内就不会降解，非常低的剂量对癌细胞的治疗是卓有成效的，例如比用裸体分子少1000倍。
等效
本发明可以以没有从精神上或本质特征上背离它的其它具体形式体现。因此，上述实施例在所有方面都被认为是说明性的，而不是对此处所述的本发明的限制。本发明的范围从而由附加的权利要求而不是上文描述来表明，权利要求等同意思和范围内的所有改变都被包含于其中。

Claims (26)

1.一种包括药学上可接受的溶剂和多个含有二氢茉莉酮酸甲酯的纳米载体或微米载体的药物组合物，其特征在于：
纳米载体或微米载体由环糊精或树枝形聚合物形成，或者是包括被磷脂层包围的胆固醇酯核的合成的纳米乳液颗粒；
纳米载体的尺寸范围为从1纳米至500纳米；或
微米载体的尺寸范围为从1微米至100微米；以及
药物组合物具有浓度范围为从1nM至1M的二氢茉莉酮酸甲酯。
2.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，纳米载体由环糊精形成，尺寸范围为从3nm至100nm。
3.根据权利要求2所述的药物组合物，其特征在于，环糊精纳米载体的尺寸范围为从3.5nm至11nm。
4.根据权利要求2所述的药物组合物，其特征在于，环糊精纳米载体的尺寸范围为从50nm至100nm。
5.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，纳米载体是合成的纳米乳液颗粒，尺寸范围从30nm至500nm。
6.根据权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，合成的纳米乳液颗粒的尺寸范围为从50nm至110nm。
7.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，纳米载体由树枝形聚合物形成，尺寸范围为从2nm至500nm。
8.根据权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，树枝形聚合物是聚酰胺-胺。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的药物组合物，其特征在于，二氢茉莉酮酸甲酯的浓度范围为从1nM至100μM。
10.根据权利要求1至8中任一项所述的药物组合物，其特征在于，二氢茉莉酮酸甲酯的浓度范围为从10μM至100mM。
11.根据权利要求1至8中任一项所述的药物组合物，其特征在于，二氢茉莉酮酸甲酯的浓度范围为从100mM至1M。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的药物组合物，其特征在于，纳米载体或微米载体进一步包括2-氨基乙基磷酸二氢、3,7-二甲基-2,6-辛二烯醛、水杨酸甲酯或脱落酸。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的药物组合物，其特征在于，药学上可接受的溶剂是水、醇或其混合物。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的药物组合物，其特征在于，纳米载体或微米载体进一步包括非茉莉酮酸酯化合物。
15.一种包括药学上可接受的溶剂和多个含有茉莉酮酸甲酯的纳米载体或微米载体的药物组合物，其特征在于，
纳米载体或微米载体由环糊精或树枝形聚合物形成，或者是包括被磷脂层包围的胆固醇酯核的合成的纳米乳液颗粒；
纳米载体的尺寸范围为从1纳米至500纳米；或
微米载体的尺寸范围为从1微米至50微米；并且
药物组合物具有浓度范围为从1nM至1μM的茉莉酮酸甲酯。
16.根据权利要求15所述的药物组合物，其特征在于，纳米载体或微米载体进一步包括非茉莉酮酸酯化合物。
17.一种包括药学上可接受的溶剂和多个含有选自由茉莉酮酸甲酯和二氢茉莉酮酸甲酯组成的组的茉莉酮酸酯化合物的纳米载体的药物组合物，其特征在于，
纳米载体由环糊精或树枝形聚合物形成，尺寸范围为从1纳米至500纳米，或
纳米载体是包括被磷脂层包围的胆固醇酯核的合成的纳米乳液颗粒，尺寸范围为从300nm至900nm；并且
药物组合物具有浓度范围为从1nM至1M的茉莉酮酸酯化合物。
18.根据权利要求17所述的药物组合物，其特征在于，茉莉酮酸酯化合物是茉莉酮酸甲酯，浓度为约1μM至100mM。
19.根据权利要求17所述的药物组合物，其特征在于，纳米载体是合成的纳米乳液颗粒，尺寸范围为从300nm至500nm。
20.权利要求1至19中任一项所述的一种药物组合物在制备治疗血管生成相关病症的药物中的应用。
21.根据权利要求20所述的应用，其特征在于，血管生成相关病症是癌症，其中，茉莉酮酸酯化合物是浓度为约大于100μM的二氢茉莉酮酸甲酯或浓度为约大于1μM的茉莉酮酸甲酯。
22.根据权利要求21所述的应用，其特征在于，所述癌症是白血病、结肠癌、乳腺癌、***癌、胰腺癌、肝癌、皮肤癌、卵巢癌、黑素瘤或肉瘤。
23.根据权利要求20所述的应用，其特征在于，血管生成相关病症是炎症性疾病。
24.根据权利要求23所述的应用，其特征在于，所述炎症性疾病是炎症性肠病。
25.权利要求1至19中任一项所述的一种药物组合物在制备治疗NF-κB相关病症的药物中的应用。
26.根据权利要求25所述的应用，其特征在于，所述NF-κB相关病症是病毒、细菌或真菌感染。
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