ES2328002B2 - Uso combinado de metil-jasmonato y ciclodextrinas para la produccion de resveratrol. - Google Patents
Uso combinado de metil-jasmonato y ciclodextrinas para la produccion de resveratrol. Download PDFInfo
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- C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
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Abstract
Uso combinado de metil-jasmonato
y ciclodextrinas para la producción de resveratrol.
El uso combinado de
metil-jasmonato y ciclodextrinas para la promover la
producción de resveratrol por parte de células capaces de
sintetizar este compuesto y la acumulación extracelular del
mismo.
Description
Uso combinado de metil-jasmonato
y ciclodextrinas para la producción de resveratrol.
La presente invención se refiere al uso
combinado de metil-jasmonato y ciclodextrinas para
promover la producción de resveratrol por parte de células capaces
de sintetizar este compuesto y la acumulación extracelular del
mismo.
Los estilbenoides son compuestos fenólicos
biológicamente activos con un amplio espectro de actividad
antibiótica y farmacológica. Este tipo de compuestos es sintetizado
por ciertas plantas, entre ellas la vid, como mecanismo adaptativo
en respuesta a un estrés, como la irradiación de rayos
ultravioleta, una infección microbiana, la exposición a metales
pesados o tratamientos con ozono. Dentro de este grupo de
compuestos cabe destacar el t-resveratrol
(trans-3,5,4'-trihidroxiestilbeno),
uno de los principales constituyentes de los estilbenoides
producidos en respuesta al stress. El isómero
cis-resveratrol se suele encontrar en extractos de
plantas que producen t-resveratrol y productos
derivados. Su presencia se debe a la lenta fotoisomerización del
isómero trans por irradiación con luz ultravioleta.
En base a estudios epidemiológicos y de
laboratorio sobre humanos, animales, células animales en cultivo y
ensayos enzimáticos, se ha puesto de manifiesto que los
estilbenoides, y en particular el resveratrol, tienen efectos
favorables para la salud, lo que hace deseable su inclusión en la
dieta humana y animal.
El resveratrol está presente en el vino y puede
estar implicado en los efectos saludables de su consumo moderado de
vino. Se ha propuesto el incremento en el consumo de resveratrol
como una vía para reducir la incidencia de cáncer y enfermedades
cardiovasculares en humanos. El resveratrol y los extractos de
plantas que contienen resveratrol se muestran efectivos en la
prevención y terapia de la arteroesclerosis, como agentes
antiinflamatorios y como agentes
anti-hiperoxidativos. El resveratrol genera una
inhibición significativa de la formación de criptas en colon
aberrante en un modelo de rata tratado con un agente carcinogénico
(azoximetano), sugiriendo su utilidad como inhibidor de generación
de tumores en humanos. El resveratrol actúa como promotor de la
formación de nitróxidos que son agentes vasodilatadores y
anti-agregación plaquetaria.
Tenido en cuenta el papel beneficioso del
resveratrol sobre la salud humana y animal, es importante poder
disponer de una fuente biológica adecuada que permita la obtención
de resveratrol en cantidades suficientes para satisfacer la
demanda. Con esta finalidad se han llevado a cabo diversos
estudios.
En la solicitud internacional WO 0044921 se
utiliza el gen o una porción del gen de la resveratrol sintasa
obtenido de una planta que produce resveratrol y se transfiere a
una planta que no produce resveratrol de forma natural para que lo
exprese constitutivamente y acumule el derivado resveratrol
glucósido en sus tejidos.
En la solicitud internacional WO 9718715 se
describe como plantas enteras de vid son tratadas con cloruro de
aluminio, que actúa como agente inductor de la síntesis de
resveratrol, para aumentar el contenido en resveratrol de la planta
y los productos derivados de ella, como la uva, el mosto y el vino.
En otro estudio, suspensiones de células vegetales procedentes de
plantas que producen resveratrol son estimuladas con trozos de
paredes celulares de hongos para inducir la síntesis de resveratrol
y su acumulación en el medio de cultivo y en las células
(Liswidowati, et al. 1991. "Induction of stilbene
synthase by Botrytis cinerea in cultured grapevine cells"
Planta 183:307-314).
Dentro de los compuestos propuestos como
inductores de la síntesis de resveratrol en plantas potencialmente
productoras del mismo, cabe destacar el grupo de las
ciclodextrinas. Las ciclodextrinas son oligosácaridos cíclicos de 6
a 8 residuos de alfa-D-glucopiranosa
unidos mediante enlaces Alfa-(1-4). Existen
numerosos derivados de este compuesto obtenidos por modificación de
los grupos hidroxilos de las posiciones 2,3 y/o 6 de los restos de
glucosilo de la molécula. A continuación se detallan algunos de los
ensayos llevados acabo en este sentido:
- 1)
- El tratamiento de suspensiones celulares de vid con una ciclodextrina doblemente metilada en las posiciones 2 y 6 de cada uno de los restos de glucosilo de la molécula (DIMEB), produce la inducción de la síntesis de t-resveratrol, el cual se excreta al medio de cultivo (Morales et al. 1998, "Effect of dimethyl-\beta-cyclodextrins on resveratrol metabolism in Gamay grapevine cell cultures before and after inoculation with \underbar{Xylophilus ampelinus}" Plant Cell Tiss. Org. Cult. 53:179-187).
- 2)
- Ciclodextrinas metiladas aleatoriamente en las posiciones 2, 3 y/o 6 de cada uno de los restos de glucosilo de la molécula, con un grado medio de metilación 13, o ciclodextrinas hidroxipropiladas, son capaces de inducir síntesis de t-resveratrol en suspensiones celulares de vid de dos variedades, el cual es excretado en el medio de cultivo durante al menos 96 horas, llegando a acumular hasta 6000 microg/g peso fresco (ES2190771).
- 3)
- Al ser tratadas con ciclodextrinas distintas líneas celulares del género Vitis muestran una acumulación extracelular de estibenos en el medio el cultivo, especialmente de t-resveratrol. Dependiendo de las condiciones de incubación se puede modificar la proporción de trans y cis resveratrol. (Roque Bru et al. 2006 "Modified Cyclodextrins are chemically defined glucan inducers of defense responses in grapevine cell cultures" Journay of Agricultural and food chemistry, 54, 65-71).
\vskip1.000000\baselineskip
Estos estudios demuestran que una ciclodextrina
doblemente metilada en las posiciones 2 y 6 de cada uno de los
restos de glucosilo de la molécula o aleatoriamente metilada, o
hidoxipropilada, inducen la acumulación de forma extracelular de
t-resveratrol en cultivos celulares de células de
vid.
En otros estudios se probó la posibilidad de
estimular la producción de resveratrol mediante el uso de
metiljasmonato (MeJA). El metiljasmonato es un derivado activo del
ácido jasmónico, que junto con éste, se encuentra dentro del los
compuestos que actúan como reguladores de las respuestas de defensa
en plantas sometidas a stress. En este sentido algunos ensayos
relevantes se citan a continuación:
- 1)
- El tratamiento con metil jasmonato de tres líneas celulares de suspensiones de vid, conduce a la acumulación intracelular del resveratrol principalmente (entre el 90-95%) en la forma glicosilada llamada piceida, siendo la cantidad de cualquier forma de resveratrol en el medio extracelular despreciable. Los niveles máximos de piceidas acumuladas son de 228 mg/litro. Según los datos de densidad celular del estudio, esto equivaldría a unos 11 mg/g peso seco u 500 microg/g peso fresco. En los controles la piceida acumulada al cabo de 14 días es 0.05 mg/g peso fresco. (Krisa et al. (1999) Stilbene production by \underbar{Vitis vinifera} cell suspension cultures: methyl jasmonate induction and 13C biolabelling. J. Nat. Prod. 62: 1688-1690).
- 2)
- En otro estudio, se tratan suspensiones celulares de vid con metil jasmonato y se analizan las formas libres cis y trans del resveratrol en extractos celulares y en el medio extracelular. Solo se aprecian incrementos respecto a los controles entre los 6 y los 8 días. Las diferencias están en torno a 0.34 microg/g peso fresco. (Tasoni et al (2005) Jasmonates and Na-orthovanadate promote resveratrol production in \underbar{V. vinifera} cv. Barbera cell cultures. New Phytologist 166: 895-905). Esta cantidad representa aproximadamente un 0.006% de la que se acumula en presencia de ciclodextrinas (ES2190771). Por tanto, la cantidad de resveratrol en el medio extracelular debido al tratamiento con metiljasmonato es significativamente inferior con respecto a la que se acumula debido al tratamiento con ciclodextrinas.
\vskip1.000000\baselineskip
Los estudios realizados hasta la fecha
demuestran que el metiljasmonato induce la acumulación de la forma
glicosilada del resveratrol o piceida en el cultivo de células de
vid de forma intracelular, no afectando de forma significativa a la
acumulación de las formas libres intra o extracelulares.
En la presente invención se combina el
tratamiento de ciclodextrinas (ciclodextrina metilada
aleatoriamente o ciclodextrina hidroxipropilada) con
metiljasmonato, a fin de promover la producción de resveratrol en
células potencialmente productoras del mismo.
Tomando en consideración el estado de la técnica
anteriormente descrito, del tratamiento conjunto de las
suspensiones celulares de vid con ciclodextrinas y Metiljasmonato
cabría esperar que la acumulación global de resveratrol en el
cultivo consistiera en la suma de las cantidades y formas que se
acumulan con los tratamientos individuales, es decir, en torno a 500
microg/g peso fresco de piceida intracelular y en torno a 6000
microg/g peso fresco de resveratrol extracelular.
De forma sorprendente e inesperada, el uso
conjunto de ciclodextrinas y Metiljasmonato descrito en la presente
invención:
- a.
- tiene un efecto sinérgico sobre la producción de resveratrol siendo las concentraciones de t-resveratrol acumuladas extracelularmente obtenidas muy superiores a las esperadas.
- b.
- la acumulación del resveratrol se realiza de forma extracelular únicamente; este hecho resulta ventajoso, al ser mucho más sencilla la extracción y purificación de este compuesto si se acumula en el medio de cultivo en vez de intracelularmente (no es necesaria la tisis y posterior eliminación de los restos celulares).
- c.
- Se genera de forma casi exclusiva t-resveratrol (forma de interés frente al cis-resveratrol), aumentando el ratio de trans/cis.
\vskip1.000000\baselineskip
Este efecto se ejemplifica en una diversidad de
casos, tales como con líneas celulares de vid de distintas
variedades (Gamay, Monastrell, Moscatel de Hamburgo), con
diferentes medios de cultivo minerales (MS, Gamborg), a diferentes
densidades celulares (baja, alta y media).
Por tanto, un primer aspecto de la presente
invención es el método de obtención de resveratrol, que comprende
la adición de ciclodextrinas y metiljasmonato al medio de cultivo,
la adición al medio de cultivo de células potencialmente
productoras de resveratrol, su incubación y la separación del
resveratrol obtenido durante la incubación del medio de cultivo.
Una realización preferida de esta invención
además comprende la purificación del resveratrol obtenido.
En otra realización preferida de la presente
invención la concentración de Metiljasmonato es de entre 5 y 450
micromoles/por litro de medio de cultivo. Más preferiblemente la
concentración de Metiljasmonato es de entre 50 y 150 micromoles/L
medio de cultivo y aun más preferiblemente de entre 75 y 125
micromoles/L medio de cultivo.
En otra realización preferida de la invención
las ciclodextrinas se eligen del grupo que comprende cliclodextrina
metilada aleatoriamente (CDMA) o ciclodextrina hidroxipropilada
(CDHA).
En particular, el grado de sustitución por
metilos por unidad de glucosa (anhidra) de la CDMA es de entre 1 y
3, más preferiblemente de entre 1,5 y 2, y aún más preferiblemente
de entre 1,6 y 1,9.
Por otro lado, el grado de sustitución por
hidroxipropilos por unidad de glucosa (anhidra) de CDHA es de entre
0,3 a 1,5, más preferiblemente de entre 0,5 y 1, y aún más
preferiblemente de entre 0,6 y 0,9.
En otra realización preferida de la invención la
concentración de ciclodextrinas es de entre 6,5 y 130 g/L medio de
cultivo. Más preferiblemente la concentración de ciclodextrinas es
de entre 10 y 100 g/L medio de cultivo y aún más preferiblemente es
de entre 50 y 75 g/L medio de cultivo.
En otra realización preferida de la invención
las células productoras de resveratrol proceden de la especie
Vitis vinifera.
En otra realización preferida de la invención
las células proceden del grupo de especies que comprende Pinus
sibirica, P. sylvestris, Gnetum parviflorum, Vitis vinifera,
Polygonum cuspidatum, Arachis hypogaea, Eucalyptus, Artocarpus
lakoocha, Nothofagus fusca, Phoenix dactylifera, Festuca versuta,
Carex fedia, o Veratrum grandiflorum.
Se entiende por células potencialmente
productoras de resveratrol, cualquier línea celular capaz de
producir resveratrol bien de forma natural o tras modificación
genética.
En otra realización preferida de la invención el
tiempo de incubación es de entre 4 y 288 horas.
Otro aspecto de la invención se refiere a un
medio de cultivo que comprende metiljasmonato y ciclodextrinas.
Otro aspecto de la presente invención es el uso
de un medio de cultivo que comprende Metiljasmonato y
ciclodextrinas para promover la producción de resveratrol en
células productoras del mismo.
Finalmente, un último aspecto de la invención es
el uso combinado de metil-jasmonato y
ciclodextrinas para promover la producción de resveratrol en
células productoras del mismo.
A lo largo de la descripción y las
reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no
pretenden excluir otras características técnicas, aditivos,
componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos,
ventajas y características de la invención se desprenderán en parte
de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los
siguientes ejemplos y dibujos se - proporcionan a modo de
ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente
invención.
Fig 1: Producción de
t-resveratrol por unidad de volumen de medio
extracelular (g/litro de medio) de Vitis vinifera Monastrell
a lo largo de 288 horas de incubación. Se muestra la media y
desviación estandar de cuatro replicas biológicas.
Fig 2: Análisis cromatográfico
(HPLC-UV-MS) de caldos de Vitis
vinifera Monastrell Verde tras 96 horas de incubación. Se
muestra un experimento representativo de cuatro replicas
biológicas.
A y B: Incubado con CDMA a la concentración de
62.5 g/l.
C y D: Incubado con CDMA a la concentración de
62.5 g/l y metiljasmonato 100 micromolar.
A y C son los registros cromatográficos de
absorción a 306 nm.
B y D son registros cromatográficos del ión m/z
= 229 en modo positivo. Los picos correspondientes a las formas
trans y cis están indicados.
Figura 3: Efecto sobre la cinética de
acumulación extracelular de resveratrol de la adición de forma
secuencial de CDMA seguida de MeJa a un cultivo de Vitis vinifera
variedad Gamay. Adición de CDMA al cultivo y posterior adición
de MeJa tras 48 horas (CD+MeJa (48 h)), frente al efecto de su
adición conjunta (CD+MeJa) o el uso de CDMA de forma
exclusiva(CD). Se muestra la media y desviación estandar de
cuatro replicas biológicas.
Figura 4: Efecto sobre la cinética de
acumulación extracelular de resveratrol de la adición de forma
secuencial de MeJa seguida de CDMA a un cultivo de Vitis
vinifera variedad Gamay.
Círculos negros: cultivo preincubado 48 horas en
medio de cultivo y suplementado al cabo de ese tiempo con CDMA a la
concentración final de 62.5 g/l.
Círculos grises: cultivo preincubado 48 horas en
medio de cultivo y suplementado al cabo de ese tiempo con CDMA a la
concentración final de 62.5 g/l y MeJA a la concentración final de
100 micromolar.
Triángulos: cultivo preincubado 48 horas en
medio de cultivo con MeJA 100 micromolar y suplementado al cabo de
ese tiempo con CDMA a la concentración final de 62.5 g/l.
El tiempo 0 indica el momento en que los
cultivos se suplementan con CDMA; anteriormente no hay acumulación
de resveratrol. Se muestra la media y desviación estandar de cuatro
replicas biológicas.
A continuación se ilustrará la invención
mediante unos ensayos realizados por los inventores, que ponen de
manifiesto el efecto sinérgico en el uso conjunto de Metiljasmonato
y diferentes tipos de ciclodextrinas en la producción de
t-resveratrol por parte de distintas variedades de
células productoras de resveratrol.
La línea celular de Vitis vinifera var.
Gamay fue establecida por J. C. Pech en 1978 (ENSAT, Toulouse,
Francia) a partir de frutos inmaduros de vid del cultivar Gamay
Fréaux.
Los callos se mantuvieron a 25ºC bajo un
fotoperiodo de 16 horas de iluminación (6 W/m^{2}) y 8 h de
oscuridad, en matraces de 250 ml de capacidad que contenían 80 ml
del medio G20, consistente en medio basal Gamborg B_{5} (Gamborg y
cols. 1968, Experimental Cell Research 50:151-158)
suplementado con las vitaminas de Morel (Morel, G. 1970. "Le
probléme de la transformation tumorale chez les végétaux".
Physiologie Végétale, 8:189-204), hidrolizado de
caseína (0.25 g/l), sacarosa (20 g/l) como fuente carbonada y ácido
alfa-naftalenacético (0.1 mg/l) y kinetina (0.2
mg/l) como hormonas. Este medio se ajusta a pH 6 y se esteriliza
mediante la aplicación de calor húmedo (autoclave) durante 20 min a
1.2 atm de presión, adquiriendo la consistencia sólida mediante la
adición de agar purificado (8 g/l), cuando el medio se enfría.
Las suspensiones celulares se iniciaron, a
partir de callos friables obtenidos, en matraces de 250 ml de
capacidad que contenían 80 ml de medio G20 sin agar. Las células en
medio líquido se mantuvieron en un agitador orbital a 100 rpm, a
25ºC bajo un fotoperiodo de 16 horas de iluminación (6 W/m^{2}) y
8 h de oscuridad.
Las líneas celulares de Vitis vinifera var.
Monastrell y var. Moscatel de Hamburgo se establecieron a
partir de frutos inmaduros de vid de los cultivares Monastrell y
Moscatel de Hamburgo respectivamente.
Uvas inmaduras de aproximadamente 5 mm de
diámetro se esterilizaron superficialmente por inmersión en una
disolución de hipoclorito cálcico al 7% durante 15 minutos.
Transcurrido ese tiempo y siempre bajo condiciones estériles, las
uvas se lavaron 3 veces con agua bidestilada estéril, se eliminaron
las semillas y se dividieron en 4 porciones. Estas porciones
(explantos) se depositaron en una placa de Petri en oscuridad a 25ºC
hasta la aparición de microcallos. La placa de Petri contenía medio
de cultivo sólido MS2, basado en el descrito por Murashige y Skoog
(Murashige, T y Skoog, F. 1962. "A revised medium for rapid
growth and bioassays with tobacco tissue cultures".
Physiologia Plantarum 15:473-497), suplementado con
la vitaminas de Morel, hidrolizado de caseína (0.25 g/l), sacarosa
(30 g/l) como fuente carbonada, ácido
alfa-naftalenacético (0.2 mg/l) y kinetina (0.4
mg/l) como hormonas, 8 g/l de agar purificado y ajustado a pH
6.
Los microcallos obtenidos se transfirieron a
matraces de 250 ml de capacidad que contenían 80 ml de este mismo
medio de cultivo sólido para el desarrollo de los callos en
oscuridad a 25ºC. Los callos se mantuvieron por subcultivo
periódico en el mismo medio y condiciones.
Las suspensiones celulares se iniciaron, a
partir de callos friables, en matraces de 250 ml de capacidad que
contenían 80 ml del medio G20, o del medio MS2 en ausencia de agar.
Las células en medio líquido se mantuvieron en un agitador orbital
a 100 rpm, a 25ºC en oscuridad.
En cada experiencia de estimulación se tomaron,
en condiciones de esterilidad, entre 20 y 200 g de peso fresco de
células que habían sido previamente lavadas con medio fresco y
filtradas. Estas células se transfirieron a un matraz de entre 250
y 2000 ml de capacidad y se resuspendieron mediante la adición de
entre 100 y 1000 ml de medio fresco estéril suplementado:
- \medcirc
- solo con una \beta-ciclodextrina metilada aleatoriamente con un grado de sustitución por metilos de ente 1,6 y 1,9 (CDMA) a una concentración comprendida entre 6.5 y 130 g/L o
- \medcirc
- hidroxipropilada aleatoriamente con un grado de sustitución por hidroxipropilos de entre 0,6 y 0,9 (CDHA), a una concentración comprendida entre 6.5 y 130 g/L, o
- \medcirc
- con una de las ciclodextrinas anteriormente mencionadas (CDMA) o (CDHA) a una concentración comprendida entre 6.5 y 130 g/L y con metiljasmonato a una concentración comprendida entre 5 y 450 micromolar.
\vskip1.000000\baselineskip
El metiljasmonato se esteriliza aparte del medio
por filtración, disuelto en etanol, y posteriormente se mezcla con
el resto del medio estéril. La concentración final de etanol en el
medio de cultivo es de 0.2% en volumen.
Los matraces se incubaron en las mismas
condiciones descritas anteriormente para su mantenimiento en medio
líquido durante periodos de tiempo comprendidos entre 24 y 256
horas.
De los cultivos incubados con inductores se
extrajeron periódicamente alícuotas para análisis. Las células
fueron separadas del medio por filtración realizando un ligero
vacío, recogiendo por separado las células y el filtrado. El
filtrado se utilizó para análisis por HPLC.
Una alícuota del medio extracelular recuperado
se diluyó en agua, se filtró a través de un filtro Anopore de 0.2
\mum, y 20 \mul del filtrado se analizaron por HPLC inyectados
en una columna LiChrospher 100 RP-18 (250x4 mm,
tamaño de partícula 5 \mum). Como fase móvil se utilizaron dos
clases de disolventes: disolvente A, 0.05% de ácido trifluoroacético
en agua y disolvente B, 0.05% de ácido trifluoroacético en
metanol:acetonitrilo 60:40 vol/vol. La muestra se eluye a un flujo
de 1 ml/min de la siguiente mezcla de los disolventes: 0 min. 10% B;
5 min, 15% B; 40 min, 35% B; 45 min, 65% B; 50 min, 65% B; 55 min
10% B; y a una temperatura de la columna de 35ºC (Dalluge et
al., 1998, J. Chromatogr. A 793:265-274). El
eluido de la columna se pasa por un detector UV-vis
y seguidamente por un espectrómetro de masas con fuente electrospray
de ionización a presión atmosférica.
El tiempo de retención del
t-resveratrol y la respuesta del detector a la
concentración del mismo (curva de calibrado para cuantificación) se
determinó usando t-resveratrol comercial de pureza
>99%. La presencia de resveratrol y otros estilbenoides se
detectó a 306 nm y su identidad se confirmó mediante espectrometría
de masas en línea.
Para análisis rutinario de
t-resveratrol, una alícuota del filtrado fue diluida
con medio fresco y su espectro de absorción ultravioleta fue
registrado usando un espectrofotómetro usando como referencia el
medio fresco. La concentración de t-resveratrol en
el sobrenadante fue estimada utilizando un coeficiente de extinción
molar a 306 nm de 26800 M^{-1}cm^{-1} (Siemann, E.H. and
Creasy, L.L. 1992, "Concentration of the phytoalexin
resveratrol in wine" Am. J. Enol. Vitic.
43:49-52).
\vskip1.000000\baselineskip
La suspensión celular de Vitis vinifera var.
Monastrell se trató:
- a.
- con metiljasmonato a concentraciones comprendidas entre 5 y 450 micromoles por litro de medio de cultivo
- b.
- con beta-ciclodextrina metilada aleatoriamente (CDMA) a una concentración de 62.5 g/litro y metiljasmonato (MeJa) a concentraciones comprendidas entre 5 y 450 micromoles por litro de medio de cultivo,
- c.
- control sin beta-ciclodextrina metilada aleatoriamente (CDMA) ni metiljasmonato (MeJA)
- d.
- Control sin beta-ciclodextrina metilada aleatoriamente (CDMA) ni metiljasmonato (MeJA) pero con etanol 0.2% v/v.
\vskip1.000000\baselineskip
Los experimentos se llevaron a cabo por
triplicado en matraces de 250 ml conteniendo 100 ml de cultivo. Al
cabo de 96 horas, se recolectaron las células y el medio de cada
matraz por separado, las células se pesaron y se determinó la
cantidad total de t-resveratrol en el medio
extracelular.
\newpage
El resultado del experimento se muestra en la
Tabla A. Las pequeñas cantidades de t-resveratrol
extracelular acumuladas en los tratamientos con metiljasmonato solo
no son estadísticamente diferentes a las inducidas por el etanol
solo.
El incremento en acumulación al combinar
ciclodextrinas y metiljasmonato si es estadísticamente
significativo respecto al tratamiento solo con ciclodextrinas y
mucho mayor que la suma de las cantidades acumuladas con los
inductores usados separadamente.
La concentración óptima en estas condiciones es
de 100 micromoles/litro de medio de cultivo.
Control: medio de cultivo sin inductores;
EtOH: medio de cultivo sin inductores con 0.2%
v/v de etanol;
MJ: Tratamiento con metiljasmonato a la
concentración indicada por el número en micromolar
CD: Tratamiento con ciclodextrina CDMA a la
concentración de 62.5 g/l
CDMJ: Tratamiento con ciclodextrina CDMA a la
concentración de 62.5 g/l y metiljasmonato a la concentración
indicada por el número en micromolar.
\vskip1.000000\baselineskip
La densidad celular de las suspensiones de
Vitis vinifera var. Monastrell durante la estimulación se
manejó añadiendo diferentes cantidades de células frescas filtradas
a un volumen constante de medio de cultivo.
Suspensiones de densidades comprendidas entre el
25 y el 75% del volumen de empaquetamiento celular (volumen que
ocupan las células respecto del volumen total del cultivo) se
trataron con:
- a.
- con beta-ciclodextrina metilada aleatoriamente (CDMA) a concentración de 62.5 g/l
- b.
- con beta-ciclodextrina metilada aleatoriamente (CDMA) a concentración de 62.5 g/l y metijasmonato (MeJA) a concentración de 100 micromoles/l.
\vskip1.000000\baselineskip
Los experimentos se llevaron a cabo por
triplicado en matraces de 250 ml conteniendo 100 ml de cultivo.
Al cabo de 96 horas, se recolectaron las células
y el medio de cada matraz por separado, las células se pesaron y se
determinó la cantidad total de t-resveratrol en el
medio extracelular.
El resultado del experimento se muestra en la
Tabla B. Cuando el cultivo se estimuló bien con CDMA solo o
combinado con MeJA, se dió una correlación negativa entre la
acumulación extracelular de t-resveratrol por
unidad de biomasa y la biomasa total, de modo que la densidad
celular óptima es la más baja (25% VEC).
Sin embargo el descenso en producción por unidad
de biomasa fue menos acusado al combinar CDMA con MeJA.
\vskip1.000000\baselineskip
25, 50 y 75: porcentaje de volumen de
empaquetamiento celular
CD: tratadas con CDMA a la concentración de 62.5
g/l.;
CDMJ: tratadas con CDMA (62.5 g/l) y
metiljasmonato 100 micromolar.
\vskip1.000000\baselineskip
Suspensiones de Vitis vinifera var Gamay
de densidad 25% V.E.C. se trataron:
- a.
- con beta-ciclodextrina metilada aleatoriamente (CDMA) a concentración de 62.5 g/litro,
- b.
- con beta-ciclodextrina metilada aleatoriamente (CDMA) a concentración de 62.5 g/litro y 0.2% etanol,
- c.
- con beta-ciclodextrina metilada aleatoriamente (CDMA) a concentración de 62.5 g/litro y metiljasmonato (MeJA) a concentración de 100 micromoles/l
- d.
- control sin beta-ciclodextrina metilada aleatoriamente ni metiljasmonato, ni etanol.
\vskip1.000000\baselineskip
Los experimentos se llevaron a cabo por
triplicado en matraces de 250 ml conteniendo 100 ml de cultivo. Al
cabo de 96 horas, se recolectaron las células y el medio de cada
matraz por separado, las células se pesaron y se determinó la
cantidad total de t-resveratrol en el medio
extracelular.
El resultado del experimento se muestra en la
Tabla C. Cuando el cultivo se estimula solo con CDMA, hay una
acumulación extracelular de tR por unidad de biomasa importante; la
presencia del etanol junto con CDMA tiene un efecto negativo,
reduciendo a prácticamente la mitad el nivel de tR acumulado. Por el
contrario, la combinación de CDMA con MeJA, aunque contiene también
0.2% etanol, se traduce en un incremento de 4.5 veces en la
acumulación extracelular de tR. Por tanto, el efecto sinérgico de
CDMA y MeJA observado en la variedad Monastrell se da
también en Gamay.
\vskip1.000000\baselineskip
CDMA; tratamiento con
beta-ciclodextrina metilada aleatoriamente a la
concentración de 62.5 g/l.;
MJ: tratamiento con metiljasmonato 100
micromolar.
\vskip1.000000\baselineskip
Suspensiones celulares de vid Moscatel de
Hamburgo que habían sido establecidas en diferentes medios
minerales, particularmente Gamborg B5 (G) y
Murashige-Skoog (MS2), fueron estimuladas en los
medios que se indica en diferentes condiciones de densidad celular
y tipo de ciclodextrina (beta-ciclodextrina
metilada aleatoriamente o CDMA y ciclodextrina hidroxipropilada o
CDHA) en ausencia o presencia de metiljasmonato.
Los experimentos se llevaron a cabo por
triplicado en matraces de 250 ml conteniendo 100 ml de cultivo. Al
cabo de 96 horas, se recolectaron las células y el medio de cada
matraz por separado, las células se pesaron y se determinó la
cantidad total de t-resveratrol en el medio
extracelular.
El resultado del experimento se muestra en la
Tabla D.
Independientemente del tipo de ciclodextrina
ensayado, de la densidad celular del cultivo o de la composición
del medio mineral, las ciclodextrinas CDMA y CDHA indujeron la
acumulación de t-resveratrol extracelular ambas a
un nivel similar, el metiljasmonato por si mismo no indujo la
acumulación de t-resveratrol extracelular, mientras
que combinado con CDMA o CDHA la acumulación era entre 1.5 y 9.4
veces respecto a la conseguida con la ciclodextrina sola, aunque en
la mayoría de las condiciones el incremento de acumulación está en
torno a tres veces.
El efecto sinérgico para acumulación de
t-resveratrol extracelular conseguido al combinar
ciclodextrinas CDMA o CDHA con MeJA se da también en la variedad
Moscatel de Hamburgo, e independientemente de la composición
del medio mineral y de la densidad celular.
Densidad baja: 15 g peso fresco/100 ml
suspensión celular;
Densidad alta: 37 g peso fresco/100 ml
suspensión celular;
MeJA: tratamiento con 100 micromoles/l de
Metiljasmonato;
CDMA: tratamiento con 62.5 g/l de
beta-ciclodextrina metilada aleatoriamente;
CDHA: tratamiento con 69 g/l de ciclodextrina
hidroxipropilada;
G: medio Gamborg B5;
MS2: medio Murashige-Skoog;
GMS2: medio Gamborg B5 con la composición
hormonal de MS2.
\vskip1.000000\baselineskip
Las suspensiones celulares de Vitis vinifera
var. Monastrell se trataron
- a.
- con metiljasmonato (MeJA) a concentración de 100 micromoles/litro,
- b.
- solo con beta-ciclodextrina metilada aleatoriamente (CDMA) a concentración de 62.5 g/litro
- c.
- con beta-ciclodextrina metilada aleatoriamente (CDMA) a concentración de 62.5 g/litro y metiljasmonato MeJA a concentración de 100 micromoles/litro
- d.
- controles sin beta-ciclodextrina metilada aleatoriamente (CDMA) ni metiljasmonato (MeJA).
\vskip1.000000\baselineskip
Periódicamente se extrajeron muestras y se
recogieron las células y el medio por separado, las células se
pesaron y se determinó la cantidad total de
t-resveratrol en el medio extracelular. Los
experimentos se llevaron a cabo por triplicado en matraces de 250
ml conteniendo 100 ml de cultivo. El resultado del experimento se
muestra en la Tabla E y Figura 1.
En los controles no llega detectarse la
presencia de t-resveratrol y en el tratamiento con
MeJa, solo se detecta a las 24 horas, para no volver a ser
detectado el resto de tiempo de incubación. En presencia de CDMA el
t-resveratrol se acumula a mayor velocidad durante
las primeras 72 horas, decelerándose la acumulación hasta
prácticamente detenerse a partir de 144 horas. En presencia de
ambos, CDMA y MeJA, la acumulación es rápida y mantenida durante
las primeras 168 horas, para decelerarse a partir de ese momento
hasta prácticamente detenerse. Así pues, la mayor acumulación en
presencia de CDMA y MeJA se debe a dos factores:
- -
- mayor velocidad de acumulación, de 0.16 frente a 0.45 g/litro.día y
- -
- periodo de acumulación mantenida más prolongado de 72 frente a 168 horas.
MeJA: tratamiento con 100 micromoles/l de
MeJA;
CDMA: tratamiento con 62.5 g/l de CDMA.
\vskip1.000000\baselineskip
Se trataron suspensiones de Vitis vinifera
Monastrell verde de densidad alta (48 g peso fresco/100 mL)
con:
- (i)
- con CDMA (62.5 g/litro)
- (ii)
- con CDMA (62.5 g/litro) y MeJA (100 micromoles/l),
- (iii)
- con MeJA (100 micromoles/l)
- (iv)
- controles sin CDMA ni MeJA.
\vskip1.000000\baselineskip
Los experimentos se llevaron a cabo por
triplicado en matraces de 250 ml conteniendo 100 ml de cultivo. Al
cabo de 96 horas, se recolectaron las células y el medio de cada
matraz por separado, las células se pesaron y se determinó la
cantidad total de tR en el medio extracelular.
El resultado del experimento se muestra en la
Tabla F.
Cuando el cultivo se estimuló solo con CDMA, se
observó una acumulación extracelular de tR por unidad de biomasa,
si bien ésta fue inferior a la acumulada por otras variedades
-Gamay, Monastrell Albina, Moscatel = Hamburgo- en
condiciones similares.
Por el contrario, la combinación de CDMA con
MeJA, se tradujo en un incremento en la acumulación extracelular de
tR; dado que la producción solo con CDMA fue muy baja, el
incremento fue de 37 veces.
Por tanto, el efecto sinérgico de CDMA y MeJA
observado en la variedad Monastrell Albina se dió también en
Monastrell Verde.
CDMA a la concentración de 62.5 g/l.;
MJ: metiljasmonato 100 micromolar.
En Bru y Pedreño (ES2190771) se indica que en
cultivos de la variedad Monastrell verde, como la del objeto
de este ejemplo, se acumula también el isomero
cis-resveratrol a niveles próximos a los de
trans-resveratrol cuando se tratan con CDMA. Como
se observa en la Figura 2A y 2B y la tabla F, este resultado se
obtuvo también en el presente ejemplo. Sin embargo, como se muestra
en Figura 2C y 2D y en la tabla F, la inclusión de MeJA en el medio
de estimulación causó un efecto adicional a la mayor producción de
resveratrol que fue el espectacular incremento de la ratio
trans/cis, pasando de casi 2 veces a 16 veces. Dado que en otras
variedades la ratio trans/cis es muy elevada, el efecto no había
sido apreciado hasta utilizar esta variedad.
\vskip1.000000\baselineskip
En los ejemplos anteriores, los inductores se
han aplicado conjuntamente al inicio de la incubación del cultivo
para estimulación. Para determinar si la adición secuencial de los
inductores y el orden tiene alguna influencia sobre el efecto
sinérgico en la producción de tR se llevaron a cabo dos
experiencias.
En la primera, la estimulación se inició solo
con CD y al cabo de un tiempo se añadió el metil jasmonato. Como
controles se utilizó un cultivo tratado con CD y MeJA desde el
principio, y otro cultivo tratado solo con CD.
Como se muestra en la Figura 3, el cultivo en
que se añadió primero CD y luego MeJA mostró el efecto sinérgico a
partir de la adición de MeJA, alcanzando a las 168 horas niveles
iguales de producción que el control tratado con CD y MeJA desde el
principio.
En la segunda experiencia, el cultivo con una
densidad de 50% VEC se trató con 100 micromolar MeJA y al cabo de
un tiempo se añadió CDMA mediante dilución 1:1 del cultivo en un
medio que contenía 125 g/l de CDMA y 100 micromolar MeJA.
De esta forma, las concentraciones finales de
células, CDMA y MeJA eran 25% VEC, 62,5 g/l CDMA y 100 micromolar
MeJA.
Los controles empleados fueron:
a) cultivo con una densidad de 50% VEC que al
tiempo indicado se añadió CDMA y MeJA mediante dilución 1:1 del
cultivo en un medio que contenía 125 g/l de CDMA y 200 micromolar
MeJA
b) cultivo con una densidad de 50% VEC que al
tiempo indicado se añadió CDMA mediante dilución 1:1 del cultivo en
un medio que contenía 125 g/l de CDMA.
No se detectó producción de resveratrol durante
la exposición de 48 horas al MeJA ni en los controles empleados.
Como se muestra en la Figura 4, desde el momento en el que se
adicionaron las CDs (tiempo 0 en el gráfico) se empiezo a acumular
el resveratrol. El efecto sinérgico se observó claramente durante
todo el tiempo de incubación al comparar la acumulación en los
controles (círculos negros) que solo llevaban CD con los cultivos
que llevaban CD y MeJA. En estos últimos, durante las primeras 72
horas de incubación, no se apreciaron diferencias significativas en
los niveles acumulados entre los cultivos
pre-expuestos a MeJA (triángulos) y los no expuestos
(círculos grises). A partir de ese tiempo, los cultivos
preexpuestos sufrieron una deceleración en la acumulación de
resveratrol, mientras que los no expuestos se aceleraron, llegando
casi a duplicar los niveles de los pre-expuestos y
casi cuadruplicar los de controles sin MeJA.
Como conclusión se estableció que el efecto
sinérgico observado era independiente del orden en que se
adicionaron los inductores CD y MeJA.
\vskip1.000000\baselineskip
Con el fin de determinar el efecto del MeJA con
una mezcla de las dos ciclodextrinas, se lleva a cabo una
experiencia de cultivo en presencia de:
- a)
- cultivo con 31,5 g/l CDMA, 34,5 g/l CDHA y 100 micromolar MeJA
- b)
- cultivo con 31,25 g/l CDMA, 34,5 g/l CDHA (control)
- c)
- cultivo sin inductores (control)
- d)
- cultivo con MeJA (control).
\vskip1.000000\baselineskip
Como se muestra en la Tabla G el efecto
sinérgico observado al tratar con CDs individuales y MeJA se dio
también al tratar con una mezcla de las dos CDs y MeJA. Los datos
mostrados son la media de cuatro réplicas biológicas.
\vskip1.000000\baselineskip
CDMA a la concentración de 31.25 g/l.
CDHA a la concentración de 34.5 g/l;
MJ: metiljasmonato 100 micromolar.
Claims (19)
1. Método de obtención de resveratrol, que
comprende:
- a.
- adición de ciclodextrinas y Metiljasmonato a un medio de cultivo
- b.
- adición al medio de cultivo obtenido en el paso a) de células potencialmente productoras de resveratrol
- c.
- incubación del medio de cultivo celular del paso b)
- d.
- separación del resveratrol obtenido en el paso c) del medio de cultivo.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Método según la reivindicación 1 que además
comprende:
- e.
- purificación del resveratrol separado en el paso d).
\vskip1.000000\baselineskip
3. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 2 donde la concentración de Metiljasmonato es
de entre 5 y 450 micromoles/litro de medio de cultivo.
4. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 2 donde la concentración de Metiljasmonato es
de entre 50 y 150 micromoles/L medio de cultivo.
5. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4 donde las ciclodextrinas se seleccionan del
grupo que comprende cliclodextrina metilada aleatoriamente o
ciclodextrina hidroxipropilada.
6. Método según la reivindicación 5 donde la
ciclodextrina metilada aleatoriamente tiene un grado de sustitución
por metilos de entre 1 y 2.
7. Método según la reivindicación 6 donde la
ciclodextrina metilada aleatoriamente tiene un grado de sustitución
por metilos de entre 1,5 y 2.
8. Método según la reivindicación 6 donde la
ciclodextrina metilada aleatoriamente tiene un grado de sustitución
por metilos de entre 1,6 y 1,9.
9. Método según la reivindicación 5 donde la
ciclodextrina hidroxipropilada tiene un grado de sustitución por
hidroxipropilos de entre 0,2 y 1,3.
10. Método según la reivindicación 9 donde la
ciclodextrina hidroxipropilada tiene un grado de sustitución por
hidroxipropilos de entre 0,5 y 1.
11. Método según la reivindicación 10 donde la
ciclodextrina hidroxipropilada tiene un grado de sustitución por
hidroxipropilos de entre 0,6 y 0,9.
12. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 11 donde la concentración de ciclodextrinas es
de entre 6,5 y 130 g/L medio de cultivo.
13. Método según la reivindicación 12 donde la
concentración de ciclodextrinas es de entre 10 y 100 g/L medio de
cultivo.
14. Método según la reivindicación 13 donde la
concentración de ciclodextrinas es de entre 50 y 75 g/L medio de
cultivo.
15. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 14 donde las células productoras proceden de
la especie Vitis vinifera.
16. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 15 donde el tiempo de incubación es de entre 4
y 256 horas.
17. Medio de cultivo que comprende
Metiljasmonato y ciclodextrinas.
18. Uso del medio de cultivo de la
reivindicación 17 para promover la producción de resveratrol en
células productoras del mismo.
19. Uso combinado de
metil-jasmonato y ciclodextrinas para promover la
producción de resveratrol en células productoras del mismo.
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|---|---|---|---|
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| EP2256209A4 (en) | 2011-05-25 |
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