MX2007014269A - Metodo para la purificacion de anticuerpos. - Google Patents

Abstract

Un metodo para la purificacion de inmunoglobulina por la cromatografia de intercambio de iones se describe. El metodo cromatografico usa una resina de intercambio de iones y un proceso de elucion de etapa sencilla para la purificacion de una inmunoglobulina. Adicionalmente un metodo para la determinacion de la concentracion de la sal para la elucion de etapa sencilla de una inmunoglobulina de una resina de intercambio de iones se describe.

Description

MÉTODO PARA LA PURIFICACIÓN DE AOTICUERPOS Campo de la Invención La actual invención se refiere al campo de purificación de polipéptidos. Un nuevo método para la purificación de inmunoglobulinas con una resina de intercambio de iones se describe en la presente. Al mismo tiempo, se da un método para la determinación rápida de condiciones de purificación. Antecedentes de la Invención Las proteínas y especialmente las inmunoglobulinas juegan un papel importante en el portafolio médico actual. Para aplicación humana cada sustancia farmacéutica ha reunido distintos criterios. Para asegurar la seguridad de agentes biof rmacéuticos a ácidos nucleicos humanos, virus, y proteínas de célula hospedera, que causarían daño severo, tienen que ser removidos de forma especial. Para reunir la especificación reguladora, una o más etapas de purificación siguen al proceso de fabricación, entre otros, pureza, rendimiento, y producción juegan un papel importante para determinar un proceso de purificación apropiado . Diferentes métodos están bien establecidos y ampliamente usados para purificación de proteínas, tales como cromatografía de afinidad con proteínas microbiales REF. §136514 (por ejemplo cromatografía de afinidad de proteína A o proteína G) , cromatografía de intercambio de iones (por ejemplo, intercambio de cationes (resinas de carboximetilo), intercambio de aniones (resinas de amino etilo) e intercambio de modo mezclado) , adsorción tiofílica (por ejemplo, con beta-mercaptoetanol y otros ligandos SH) , interacción hidrofóbica o cromatografía de adsorción aromática (por ejemplo, con fenil-sefarosa, resinas aza-arenofílicas , o ácido m-aminofenilborónico) , cromatografía de afinidad de quelato de metal (por ejemplo, con material de afinidad a Ni(ll) y Cu(ll) ) , cromatografía de exclusión de tamaño, y métodos electroforéticos (tales como electroforesis en gel, electroforesis capilar) (Vijayalakshmi , M.A. , Appl. Biochem. Biotech. 75 (1998) 93-102). Necina, R. et al., Biotechnol. Bioeng. 60 (1998) 689-698, reporta la captura de anticuerpos monoclonales humanos directamente de sobrenadantes de cultivo celular por medio de intercambio de iones que exhiben densidad de carga alta. En WO 89/05157 se reporta un método para la purificación de inmunoglobulinas de producto al someter directamente el medio de cultivo celular a un tratamiento de intercambio de cationes. La purificación de una etapa de anticuerpos IgG monoclonales de ascitos de ratón se describe por Danielsson, A., et al., J. Immun . Meth. 115 (1988), 79-88. La combinación de métodos, esto es, una precipitación de ácido caprílico y cromatografía de intercambio de iones, se usó por Raweerith, R. et al. (J. Immun. Meth. 282 (2003) 63-72), como un medio para fraccionar el anticuerpo F(ab')2 de antiveneno de caballo digerida con pepsina. En WO 2003/102132 la combinación de una etapa de purificación no de afinidad y una filtración de flujo tangencial de alto desempeño se reporta para la purificación de proteínas. La combinación de dos etapas de cromatografía de afinidad se reporta en WO 92/19973. Follman, D. K., and Fahrner, R.L., reporta una selección factorial de procesos de purificación de anticuerpos usando tres etapas de cromatografía sin proteína A (J. Chrom. A 1024 (2004) 79-85). Mhatre, R. et al. (J. Chrom. A 707 (1995) 225-231), exploró la purificación de fragmentos Fab de anticuerpo por cromatografía de intercambio de cationes y elución de gradiente pH. La WO 94/00561 reporta anticuerpos anti-rhesus monoclonales humanos y líneas celulares que producen los mismos. Un método para purificar el polipéptido por cromatografía de intercambio de iones se reporta en WO 2004/024866 en la cual un gradiente se usa para resolver un polipéptido de interés de uno o más contaminantes. Schwarz, A. et al. (Laborpraxis 21 (1997) 62-66), reporta la purificación de los anticuerpos monoclonales con una columna CM-HyperD. La WO 2004/076485 reporta un proceso para la purificación del anticuerpo por la proteína A y cromatografía de intercambio de iones. En la EP 0 530 447 un proceso para la purificación de los anticuerpos monoclonales IgG por una combinación de las tres etapas cromatográficas se reporta. El removido de la proteína A de las preparaciones del anticuerpo se reportan en la US 4,983,722. La WO 95/16037 reporta la purificación de los anticuerpos monoclonales biespecíficos anti-EGF-R/anti-CD3 del hibridoma híbrido que se llevan a cabo por la cromatografía de intercambio de cationes de la proteína A. La separación de los monómeros del anticuerpo de sus multímeros por el uso de una cromatografía de intercambio de iones se reporta en la EP 1 084 136. La US 5,429,746 se refiere a la aplicación de la cromatografía de combinación de la cromatografía de interacción hidrofóbica para la purificación de las proteínas de la molécula del anticuerpo . Breve Descripción de la Invención Así, es el objetivo de la invención actual proporcionar otro método para la purificación de inmunoglobulinas producidas recombinantemente y para la separación de especies de inmunoglobulina monomérica y multimérica. La invención actual proporciona un método para purificar una inmunoglobulina, en donde el método comprende las siguientes etapas a) proporcionar una solución que comprende una inmunoglobulina, una sustancia de solución amortiguadora, y opcionalmente una sal ; b) poner la solución y un material de intercambio de iones débil en contacto bajo condiciones por medio del cual la inmunoglobulina se enlaza al material de intercambio de iones débil; c) recuperar la inmunoglobulina del material de intercambio de iones débil en una etapa sencilla al usar una solución que comprende una sustancia de solución amortiguadora y una sal. La invención además proporciona un método para determinar la concentración de una sal para eluir un polipéptido de un material de cromatografía de intercambio de iones en un proceso de purificación de etapa sencilla, que comprende las siguientes dos etapas a) la etapa uno comprende las siguientes sub-etapas al) proporcionar una solución que comprende un polipéptido, una sustancia de solución amortiguadora, y opcionalmente una sal; a2) poner una primer alícuota de la solución que contiene el polipéptido y un material de intercambio de iones en contacto bajo condiciones por las que el polipéptido se enlaza al material de intercambio de iones; a3) recuperar el polipéptido del material de intercambio de iones al usar una solución que comprende una sustancia de solución amortiguadora y una sal por la que la concentración de la sal se aumenta linealmente; a4) determinar la concentración de partida de la sal donde la primera fracción del polipéptido comienza a eluirse a partir de la columna de intercambio de iones; b) la etapa dos comprende las siguientes sub-etapas bl) poner una segunda alícuota de la solución que contiene el polipéptido y un material de intercambio de iones en contacto bajo condiciones por las que el polipéptido enlaza al material de intercambio de iones; b2) recuperar el polipéptido del material de intercambio de iones al usar un método de elución de tres etapas, por el que i) la concentración de sal de la primera etapa de elución se calcula como la suma de el producto de la concentración de partida de la sal como se determina en la etapa a4) y el número total de cationes monovalentes diferentes de hidrógeno denotado en la fórmula molecular de la sal y el producto de la concentración de la sal de solución amortiguadora y el número total de cationes monovalentes diferentes de hidrógeno denotado en la fórmula molecular de la sal de solución amortiguadora; ii) la concentración de sal de la segunda etapa de elución es el producto de la concentración de sal de la primera etapa de elución y un factor entre 1.25 y 1.35; iii) la concentración de sal de la tercera etapa de elución es el producto de la concentración de sal de la primera etapa de elución y un factor entre 1.50 y 1.70; por lo que los factores de la etapa ii) y iii) se determinan como sigue: en una concentración de partida entre 10 mM y 40 mM los factores son 1.35 y 1.70 respectivamente, en una concentración de partida entre 40 mM y 70 mM los factores son 1.30 y 1.60 respectivamente, y en una concentración de partida de más de 70 M los factores son 1.25 y 1.50 respectivamente. b3 ) determinar en que sub-etapa del método de elución de tres etapas de la etapa b2 ) el polipéptido se eluye a partir de la columna de intercambio de iones de tal modo determinando la concentración de una sal para eluir un polipéptido a partir de un material de cromatografía de intercambio de iones en un proceso de purificación de etapa sencilla . Estos términos se usan dentro de esta solicitud de conformidad con la siguiente definición: El término "resina de intercambio de iones" o "material de intercambio de iones" como se usa dentro de esta solicitud, denota una matriz de peso molecular alto inmóvil que porta substituyentes cargados de enlace covalente. Para una neutralidad de carga global, los contraiones no enlazados covalentemente se enlazan a ello. El "material de intercambio de iones" tiene la capacidad para intercambiar sus contraiones de enlace no covalente por iones cargados similarmente de la solución circundante. Dependiendo de la carga de sus contraiones intercambiables la "resina de intercambio de iones" se refiere como resina de intercambio de cationes o como resina de intercambio de aniones. Dependiendo de la naturaleza del grupo cargado (substituyente) la "resina de intercambio de iones" se refiere como, por ejemplo, en el caso de resina de intercambio de cationes, reeina de ácido sulfónico (S) , o resina carboximetilo (CM) . Dependiendo de la naturaleza química del grupo cargado/substituyente la "resina de intercambio de iones" se puede adicionalmente clasificar como resina de intercambio de iones fuerte o débil, dependiendo de la fuerza del substituyente cargado de enlace covalente. Por ejemplo, resinas de intercambio de cationes fuertes tienen un grupo de ácido sulfónico como substituyente cargado, resinas de intercambio de cationes débiles tienen un grupo carboxílico, preferiblemente un grupo carboximetilo, como substituyente cargado, y resinas de intercambio de aniones débiles tienen un grupo dietilaminoetilo como substituyente cargado . Las resinas de intercambio de cationes están disponibles bajo nombres diferentes de una multiplicidad de compañías tal como por ejemplo, Bio-Rex, Macro-Prep CM (disponible de Biorad Laboratories, Hercules, CA, USA) , intercambiador de cationes débil WCX 2 (disponible de Cipher-gen, Fremont, CA, USA), Dowex® MAC-3 (disponible de Dow chemical company - separaciones líquidas, Midland, MI, USA), Mustang C (disponible de Pall Corpora-tion, East Hills, NY, USA), Celulosa CM-23, CM-32, CM-52, hyper-D, y par-tisphere (disponible de Whatman pie, Brentford, UK) , Amberlite® IRC 76, IRC 747, IRC 748, GT 73 (disponible de Tosoh Bioscience GmbH, Stuttgart, Alemania), CM 1500, CM 3000 (disponible de BioChrom Labs, Terre Haute, IN, USA), y CM-Sepharose™ Fast Flow (disponible de GE Healthcare - Amersham Biosciences Europe GmbH, Freiburg, Alemania) . Preferiblemente, los substituyentes cargados del material de intercambio de iones débil son al menos alrededor de 90% grupos de ácido carboxílico, más que 90% grupos de ácido carboxílico, o más que 95% grupos de ácido carboxílico.

Los términos "elución de etapa sencilla" y "elución de gradiente de etapa sencilla", que se usan alternativamente dentro de esta solicitud, denotan un método en donde por ejemplo, la concentración de una sustancia que provoca la elución, esto es, la disolución de un compuesto enlazado a partir de un material, se eleva o disminuye una vez, esto es, directamente a partir de un nivel/valor de inicio hasta un nivel/valor final, esto es, en una etapa sencilla. Un "polipéptido" es un polímero de residuos de aminoácido unido por enlaces de péptido, ya sea producido naturalmente o sintéticamente. Los polipéptidos de menos de alrededor de 20 residuos de aminoácido se refieren como "péptidos . " Una "proteína" es una macromolécula que comprende una o más cadenas de polipéptido o una cadena de polipéptido de más de 100 residuos de aminoácido. Una proteína puede también comprender componentes no peptídicos, tal como grupos de carbohidratos. Los carbohidratos y otros substituyentes no peptídicos se pueden agregar a una proteína por la célula en la cual la proteína se produce, y variará con el tipo de célula. Las proteínas se definen en la presente en términos de sus estructuras de columna del aminoácido; substituyentes tal como grupos de carbohidratos no se especifican generalmente, pero no obstante se pueden presentar. Los términos "anticuerpo" e "inmunoglobulina" que se pueden usar alternativamente dentro de esta solicitud, comprenden al menos dos cadenas de polipéptido ligeras y dos cadenas de polipéptido pesadas. Cada una de las cadenas de polipéptido pesada y ligera contiene una región variable (generalmente la porción de terminal amino de la cadena de polipéptido) que contiene un dominio de enlace por interacción con el antígeno. Cada una de las cadenas de polipéptido pesada y ligera también comprenden una región constante (generalmente la porción de terminal carboxilo) que puede mediar el enlace del anticuerpo a tejidos hospederos o factores que incluyen diversas células del sistema inmune, algunas células fagocíticas y un primer componente (Clq) del sistema de complemento clásico. Típicamente, las cadenas de polipéptido ligeras y pesadas son cadenas completas, cada una consiste esencialmente de una región variable, esto es, VL o VH, y una región constante completa, esto es, de C en el caso de una cadena de polipéptido ligera o de CH1, CH2, CH3 , y opcionalmente CH4 en el caso de una cadena de polipéptido pesada. Las regiones variables del anticuerpo de conformidad con la invención se pueden injertar a regiones constantes de otros isótopos. Por ejemplo, un polinucleótido que codifica la región variable de una cadena pesada del isotipo 1 se puede injertar al polinucleótido que codifica la región constante de otra clase de cadena pesada (o subclase) . Como se usa en la presente, el término "anticuerpo" o "inmunoglobulina" se refiere a una proteína que consiste de uno o más polipéptidos sustancialmente codificados por genes de anticuerpo. Los genes de anticuerpo reconocidos incluyen los diferentes genes de región constante así como los genes de región variable de anticuerpo miríada. Los anticuerpos pueden existir en una variedad de formas, incluyendo, por ejemplo, Fv, Fab, y F(ab)2 así como cadenas sencillas (por ejemplo, Huston, J.S., et al . , PNAS USA 85 (1988) 5879-5883; Bird et al., Science 242 (1988) 423-426; y, en general, Hood et al., Immunology, Benjamín N.Y., 2da edición (1984) y Hunkapiller and Hood, Nature 323 (1986) 15-16) . En una modalidad los anticuerpos de conformidad con la invención comprenden anticuerpos monoclonales y fragmentos del mismo, por ejemplo cadenas pesadas o ligeras aisladas, o cadenas pesadas o ligeras que solamente consisten de regiones constantes así como fragmentos del mismo. Los métodos cromatográficos generales y su uso se conocen por una persona experta en la técnica. Ver por ejemplo, Chromatography, 5th edition, Part A: Fundamentáis and Techniques, Heftmann, E. (ed) , Elsevier Science Publishing Company, New York, (1992); Advanced Chromatographic and Electromigration Methods in Biosciences, Deyl, Z. (ed.) , Elsevier Science BV, Amsterdam, The Netherlands, (1998); Chromatography Today, Poole, C. F., and Poole, S. K., Elsevier Science Publishing Company, New York, (1991); Scopes, Protein Purification: Principies and Practice (1982); Sambrook, J., et al. (ed) , Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989; o Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F. M. , et al. (eds), John Wiley & Sons, Inc., New York. La invención actual proporciona un método para purificar una inmunoglobulina, en donde el método comprende las siguientes etapas a) proporcionar una solución que comprende una inmunoglobulina, una sustancia de solución amortiguadora, y opcionalmente una sal; b) poner la solución y un material de intercambio de iones débil en contacto bajo condiciones por las que la inmunoglobulina se enlaza al material de intercambio de iones débil; c) recuperar la inmunoglobulina a partir del material de intercambio de iones débil en una etapa sencilla al usar una solución que comprende una sustancia de solución amortiguadora y una sal . El proceso de purificación de inmunoglobulinas en general comprende una parte cromatográfica de etapa múltiple. En la primera etapa los polipéptidos no de inmunoglobulina y proteínas se separan a partir de la fracción de inmunoglobulina por una cromatografía de afinidad, por ejemplo, con proteína A. Después una cromatografía de intercambio de iones se puede realizar para desunir las clases de inmunoglobulina individual y para remover las huellas de la proteína A, la cual se ha coeluido a partir de la primer columna. Finalmente una tercera etapa cromatográfica es necesaria para separar monómeros de inmunoglobulina a partir de multímeros y fragmentos de las mismas clases. Algunas veces la cantidad de agregados es alta (5% o más) y no es posible separarlos eficientemente en la tercera etapa de purificación necesariamente en etapas de purificación adicional. Con la producción recombinante de inmunoglobulinas específicas, la etapa de separación para la separación de diferentes clases de inmunoglobulina es prescindible. Así el proceso de purificación total de inmunoglobulinas producidas recombinantemente se puede reducir a dos etapas cromatográficas. El producto de elución de proteína A condicionado es en general procesado cromatográficamente en un material de intercambio de cationes a valores de pH debajo del punto isoeléctrico de la proteína de inmunoglobulina respectiva. El anticuerpo anti IL-1R (WO 2005/023872) y Herceptin®, un anticuerpo anti-HER2 (WO 99/57134) , fueron disponibles en cantidades suficientes en nuestros laboratorios en el tiempo de la invención y por lo tanto la invención actual se ejemplifica con estas dos inmunoglobulinas. Asimismo la invención es practicable en general con inmunoglobulinas . Esta descripción ejemplificada se hace solamente a modo de ejemplo y no por la limitación de la invención. Estos ejemplos se proporcionan para ayudar a la comprensión de la presente invención, el alcance real del cual se dispone en las reivindicaciones añadidas . La invención actual describe un método de purificación para la separación de monómeros de inmunoglobulina a partir de agregados y fragmentos así como la eliminación de otras impurezas de polipéptido. Como se puede ver a partir de los experimentos esta purificación se alcanza por el uso de resinas de intercambio de iones débiles, preferiblemente por el uso de resinas de intercambio de cationes débiles. Como se ejemplifica por la comparación de materiales de intercambio de iones fuertes y débiles el material de intercambio de iones débil proporciona una separación de formas monoméricas y agregadas de las inmunoglobulinas (ver ejemplos 1 y 2 y ejemplos 9 y 12) . En una modalidad de la invención, el valor pH del material de solución amortiguadora (sustancia) es desde pH 3.0 hasta pH 10.0, preferiblemente desde pH 3.0 hasta pH 7.0, más preferido desde pH 4.0 hasta pH 6.0 y más preferido desde pH 4.5 hasta pH 5.5. En una modalidad el valor pH se mantiene constante en la etapa sencilla, esto es, se mantiene en el mismo valor en la etapa sencilla. Otro punto preferido de la invención actual es que el método de la invención actual se aplica a inmunoglobulinas que tienen un punto isoeléctrico (pl) de 6.0 o más (pl > 6.0) y por lo tanto tienen una carga positiva pura en el rango de pH iniciando desde pH 6.0 hasta pH 14. Una modalidad preferida de la invención es la purificación de una inmunoglobulina de la clase IgG o IgE. Un material de intercambio de cationes débil se usa en una modalidad preferida de la invención actual. El material de solución amortiguadora se emplea preferiblemente en un rango de concentración entre 5 mM y 100 mM como se ejemplifica. Para la recuperación de las inmunoglobulinas de enlace a partir del material de intercambio de iones débil la conductividad de la solución/solución amortiguadora se aumenta. Esto se puede realizar ya sea por una concentración de la sal de solución amortiguadora aumentada o por la adición de otras sales, sales de elución supuestas, a la solución amortiguadora. Las sales de elución preferidas son citrato de sodio, cloruro de sodio, sulfato de sodio, fosfato de sodio, cloruro de potasio, sulfato de potasio, fosfato de potasio, así como otras sales de ácido cítrico y fosfórico, y cualquier mezcla de estos componentes. Especialmente preferidos son citrato de sodio, cloruro de sodio, cloruro de potasio y mezclas de los mismos. La concentración de la sal, que provoca la elución, está preferiblemente en el rango de entre 5 mM y 500 mM, más preferido entre 5 mM y 400 M, y especialmente preferido entre 5 M y 250 mM. Otra modalidad preferida de la invención es el uso de la sal, que provoca la elución, al mismo tiempo como sustancia de solución amortiguadora, especialmente con ácido cítrico y sales del mismo o ácido fosfórico y sales del mismo. El método de la invención actual es preferiblemente un método cromatográfico o de lote, especialmente preferido es un método que comprende una elución de lote. Otra modalidad preferida de la invención actual es que la purificación es un proceso de purificación de etapa sencilla. Una "etapa sencilla" denota un proceso en donde una o más condiciones, por ejemplo el pH, la fuerza iónica, concentración de una sal, y/o el flujo de una cromatografía, se cambian todos de una vez desde un valor de inicio hasta un valor final, esto es, las condiciones se cambian incrementadamente, esto es, por etapas, en contraste con un cambio lineal. Todavía una modalidad preferida de la invención actual es que el método comprende la etapa adicional de una purificación de la inmunoglobulina por una cromatografía de afinidad de proteína A antes de la etapa a) del método. La invención actual además proporciona un método para determinar la concentración de una sal para eluir un polipéptido a partir de un material de cromatografía de intercambio de iones en un proceso de purificación de etapa sencilla, que comprende las siguientes dos etapas a) la etapa uno comprende las siguientes sub-etapas al) proporcionar una solución que comprende un polipéptido, una sustancia de solución amortiguadora, y opcionalmente una sal; a2 ) llevar una primer alícuota de la solución que contiene el polipéptido y un material de intercambio de iones en contacto bajo condiciones por ello el polipéptido se enlaza al material de intercambio de iones; a3 ) recuperar el polipéptido del material de intercambio de iones al usar una solución que comprende una sustancia de solución amortiguadora y una sal por ello la concentración de la sal se aumenta linealmente; a4) determinar la concentración de partida de la sal donde la primera fracción del polipéptido comienza aluirse a partir de la columna de intercambio de iones; b) la etapa dos comprende las siguientes sub-etapas bl) llevar una segunda alícuota de la solución que contiene el polipéptido y un material de intercambio de iones en contacto bajo condiciones por ello el polipéptido se enlaza al material de intercambio de iones ; b2) recuperar el polipéptido del material de intercambio de iones al usar un método de elución de tres etapas, por ello i) la concentración de sal de la primera etapa de elución se calcula como la suma del producto de la concentración de partida de la sal como se determina en la etapa a4) y el número total de cationes monovalentes diferentes del hidrógeno denota en la fórmula molecular de la sal y el producto de la concentración de la sal de solución amortiguadora y el número total de cationes monovalentes diferentes de hidrógeno denota en la fórmula molecular de la sal de solución amortiguadora; ii) la concentración de sal de la segunda etapa de elución es el producto de la concentración de sal de la primera etapa de elución y un factor entre 1.25 y 1.35; iii) la concentración de sal de la tercera etapa de elución es el producto de la concentración de sal de la primera etapa de elución y un factor entre 1.50 y 1.70; por ello los factores de la etapa ii) y iii) se determinan como sigue: en una concentración de partida entre 10 mM y 40 mM los factores son 1.35 y 1.70 respectivamente, en una concentración de partida entre 40 mM y 70 mM los factores son 1.30 y 1.60 respectivamente, y en concentraciones de inicio de más de 70 mM los factores son 1.25 y 1.50 respectivamente. b3) determinar en que sub-etapa del método de elución de tres etapas de la etapa b2) el polipéptido se eluye de la columna de intercambio de iones de tal modo determinando la concentración de una sal para eluir un polipéptido de un material de cromatografía de intercambio de iones en un proceso de purificación de etapa sencilla. Los factores de la etapa b2) definen un rango que se ha determinado experimentalmente. Estos valores no son valores absolutos sino meramente un valor objetivo. Una desviación de 10% se mantiene. La invención actual describe un método para determinar la concentración de una sal para eluir un polipéptido de un material de cromatografía de intercambio de iones en un proceso de purificación de etapa sencilla para la purificación de polipéptidos a partir de otro material proteínico. La concentración, en la cual a la elución del polipéptido, preferiblemente de una inmunoglobulina, a partir del inicio de la resina de intercambio de iones, proporciona la base para la segunda etapa b) de optimización, un método de elución de tres etapas . Las concentraciones de sal/solución amortiguadora aproximadas para la etapa de elución se calculan como sigue: - la concentración de sal de la primera etapa de elución es igual a la suma de como un primer sumando el producto de la concentración de la sal, en el cual a la elución del inicio de la columna de intercambio de iones como se determina con el gradiente de sal aumentada lineal, y el número total de cationes monovalentes diferentes de hidrógeno denota en la fórmula molecular de la sal que provoca la elución y como segundo sumando el producto de la concentración de la sal de solución amortiguadora y el número total de cationes monovalentes diferentes de hidrógeno denota en la fórmula molecular de la sal de solución amortiguadora; - la concentración de sal de la segunda etapa de elución es igual al producto de la concentración de sal de la primera etapa de elución y un factor de entre 1.25 y 1.35; - la concentración de sal de la tercera etapa de elución es igual al producto de la concentración de sal de la primera etapa de elución y un factor entre 1.50 y 1.70. El factor incluido en el cálculo de las cuentas de las etapas de concentración por el intervalo entre los niveles de concentración y se ajusta dependiendo de la concentración de partida. En concentraciones de inicio pequeñas, esto es, entre 10 mM y 40 mM, los factores son 1.35 y 1.70 respectivamente, en concentraciones de inicio medias entre 40 mM y 70 mM los factores son 1.30 y 1.60 respectivamente, y en concentraciones de inicio altas de más de 70 mM los factores son 1.25 y 1.50 respectivamente. Estos factores definen un rango que se ha determinado experimentalmente. Estos valores no son valores absolutos pero meramente un valor objetivo. Una desviación de 10% se mantiene . La sal de solución amortiguadora tiene que ser contada para el cálculo porque es posible, como se resume en el ejemplo 3, que la elución de una proteína de una resina de intercambio de iones se puede efectuar por un cambio de la concentración de sal de solución amortiguadora durante la cromatografía. Si la concentración de sal de solución amortiguadora se mantiene constante durante la cromatografía o es pequeña comparada a la concentración de inicio de la sal que provoca la elución se puede desatender durante el cálculo para reducir la complejidad. En una modalidad la eal que provoca la elución no es la sal de solución amortiguadora y la concentración de sal de la etapa b2i) es el producto de la concentración de la sal, en la cual la elución del inicio de la columna de intercambio de iones como se determina con el gradiente de sal aumentada lineal en la etapa a4), y el número total de cationes monovalentes diferentes de hidrógeno denota en la fórmula molecular de la sal que provoca la elución.

El cálculo se ejemplificará con base en el ejemplo 4 con el anticuerpo anti IL-1R. Con una concentración inicial de 15 mM citrato de sodio, como se determina en el ejemplo 3, que consiste de una concentración de solución amortiguadora 10 mM y una contribución 5 M del gradiente lineal, las tres etapas se calculan como sigue: - la concentración objetivo para la etapa uno se calcula para ser 30 mM (5 mM*2 + 10 mM*2) citrato de sodio en detalle: 5 mM (concentración de inicio) multiplicado con dos (ácido cítrico es un ácido trivalente, empleado como sal de di-sodio; por lo tanto dos cationes monovalentes diferentes de hidrógeno se presentan en la fórmula molecular) más 10 mM (concentración de sal de solución amortiguadora) multiplicado con dos (ácido cítrico ee un ácido trivalente, empleado como sal de di-sodio; por lo tanto dos cationes monovalentes diferentes de hidrógeno se presentan en la fórmula molecular) - la concentración objetivo para la etapa dos se calcula para ser 40.5 mM (30 mM * 1.35) citrato de sodio en detalle: 30 mM citrato de sodio es la concentración de la etapa uno multiplicado por 1.35 (la concentración de partida es 15 mM, por lo tanto como factor 1.35 se selecciona) - la concentración objetivo para la etapa tres se calcula para eer 51 mM (30 mM * 1.70) citrato de eodio en detalle: 30 mM citrato de eodio ee la concentración de la etapa uno multiplicado por 1.70 (la concentración de partida es 15 mM, por lo tanto como factor 1.70 se selecciona) Como ee puede ver a partir de los experimentos esta purificación se alcanza en una modalidad preferida por el uso de un material de intercambio de iones débil, especialmente preferido de un material de intercambio de cationes débil. Una modalidad preferida de la invención es que el polipéptido es una inmunoglobulina, especialmente preferido una inmunoglobulina de las clasee IgG o IgE. En una modalidad de la invención, el valor de pH del material de eolución amortiguadora/euetancia ee deede pH 3.0 hasta pH 10.0, preferiblemente desde pH 3.0 hasta pH 7.0, más preferido desde pH 4.0 hasta pH 6.0 y más preferido desde pH 4.5 hasta pH 5.5. Otro artículo preferido de la invención actual es que el método de la invención actual se aplica a inmunoglobulinas que tienen un punto ieoeléctrico (pl) de 6.0 o mae (pl > 6.0) y por lo tanto tiene una carga poeitiva neta en el rango de pH empezando de 6.0 de pH hasta 14 de pH. El material/sustancia amortiguadora es preferiblemente empleado en un rango de entre 5 mM y 100 M eegún lo ejemplificado. Para la recuperación de las inmunoglobulinas de enlace del material de intercambio de iones, la conductividad de la solución amortiguadora/solución aumenta. Así se puede lograr ya sea por un aumento de concentración de eal amortiguadora o por la adición de otrae sales, llamadas sales de elución, para la solución amortiguadora. Sales de elución preferidas son citrato de sodio, cloruro de sodio, sulfato de sodio, fosfato de sodio, cloruro de potasio, sulfato de potasio, fosfato de potasio, así como otras sales de ácido cítrico y fosfórico, y cualquier mezcla de estoe componentes. Especialmente preferidos eon citrato de eodio, cloruro de eodio, cloruro de potaeio y cualquier mezcla de los mismos . La concentración de la sal, que provoca la elución, está preferiblemente en el rango entre 5 mM y 500 mM, más preferido entre 5 mM y 400 mM, y especialmente preferido entre 5 mM y 250 M. Otra modalidad preferida de la invención es el uso de la sal, que provoca la elución, al mismo tiempo como sustancia amortiguadora, especialmente con ácido cítrico y ealee del miemo o ácido fosfórico y salee del miemo. El método de la invención actual, ee preferiblemente un método cromatográfico o de lote, eepecialmente preferido es un método que comprende un lote de elución.

Otra modalidad preferida de la invención actual ee que la purificación ee un proceeo de purificación de etapa eencilla. Aun en una modalidad preferida de la invención actual ee que el método comprende la etapa adicional de una purificación de la inmunoglobulina por una cromatografía de afinidad de la proteína A antee de la etapa a) del método. Los siguientes ejemploe y figurae ee proporcionan para ayudar a la compreneión de la presente invención, el alcance verdadero de la cual se dispone en las reivindicaciones anexas . Se entiende que las modificaciones se pueden hacer en los procedimientos sin salir del espíritu de la invención. Breve descripción de las figuras Figura 1. Elución de etapa sencilla del anticuerpo anti IL-IR de la resina de intercambio de cationes fuerte SP-Sefarosa; las formas monoméricae y agregadae del anticuerpo receptor no se separan y eluyen como un pico. Figura 2. Elución de etapa sencilla del anticuerpo anti IL-IR de la resina de intercambio de cationes débil CM-Toyopearl; lae formae monoméricae y agregadae del anticuerpo receptor eon parcialmente eeparadae y eluidae como un pico principal que comprende la forma monomérica de la inmunoglobulina y como un eegundo pico, comprende formae monoméricae y agregadas de la inmunoglobulina así como la proteína A.

Figura 3. Elución de gradiente lineal del anticuerpo anti IL-IR de la resina de intercambio de cationes débil CM-Toyopearl con citrato de sodio a 5.0 pH; las formas monoméricas y agregadas del anticuerpo receptor son parcialmente separadas y eluidas en una concentración de inicio de citrato de sodio de 15 mM como un pico principal, que comprende la forma monomérica de la inmunoglobulina y como un eegundo pico, comprende una mezcla de forma monomérica, formae agregadae de la inmunoglobulina, y proteína A. El análisis SEC de las dos fracciones se insertan dentro del cromatograma de intercambio de iones . En los agregadoe del pico principal esta ausente. En cambio en el segundo pico las formas agregadas de la inmunoglobulina ee preeentan. Figura 4. Elución de gradiente de tree etapas del anticuerpo anti IL-IR de la resina de intercambio de cationes débil CM-Toyopearl con citrato de sodio a 5.0 pH; las formas monoméricas y agregadas del anticuerpo receptor son parcialmente separadae y eluidae como un pico principal que comprende la forma monomérica de la inmunoglobulina en una concentración de citrato de eodio de 34 mM y como un segundo pico, comprende las formas monoméricas y agregadae de la inmunoglobulina aeí como la proteína A en una concentración de citrato de eodio de 44 mM. Figura 5. Elución de gradiente de etapa sencilla del anticuerpo anti IL-IR de la reeina de intercambio de cationes débil CM-Sefarosa con 150 mM de cloruro de sodio a 5.5pH; las formas monoméricas y agregadas del anticuerpo receptor se separan y eluyen como un pico principal que comprende la forma monomérica de la inmunoglobulina y como un segundo pico, comprenden las formas monoméricas y agregadas de la inmunoglobulina aeí como la proteína A. Figura 6a. Perfil de elución en un flujo rápido de CM- Sefaroea; dos picos se pueden identificar: un pico principal, correspondiendo al anticuerpo monomérico anti IL-IR, y un eegundo pico mae pequeño, que contiene agregadoe principalmente y otrae impurezas . Figura 6b. El perfil de elución del anticuerpo anti IL- IR en un flujo rápido de SP-Sefarosa; un pico se pueden identificar el cual contiene inmunoglobulina monomérica, agregados y otras impurezas los cuales no se han separado en eeta columna. Figura 7a. Elución de gradiente de etapa eencilla del anticuerpo anti IL-IR de la reeina de intercambio de cationes débil CM-Sefarosa con 100 mM de cloruro de sodio a 5.5 pH. Figura 7b. Elución de gradiente de etapa sencilla del anticuerpo anti IL-IR de la resina de intercambio de cationes débil CM-Sefarosa con 150 mM de cloruro de sodio a pH de 5.5.

Figura 7c. Elución de gradiente de etapa sencilla del anticuerpo anti IL-IR de la reeina de intercambio de cationee débil CM-Sefarosa con 200 mM de cloruro de sodio a 5.5 de pH. Figura 8a. Elución de gradiente de etapa sencilla del anticuerpo anti IL-IR de la reeina de intercambio de cationes débil CM-Sefarosa con 150 mM de cloruro de sodio a 4.0 de pH. Figura 8b. Elución de gradiente de etapa sencilla del anticuerpo anti IL-IR de la reeina de intercambio de cationes débil CM-Sefarosa con 150 mM de cloruro de sodio a 6.0 de pH. Figura 9a. Elución de etapa sencilla del anticuerpo anti IL-IR de la resina de intercambio de cationes débil CM-Sefarosa; cromatografía de exclusión de tamaño (SEC) del material de inicio muestra ambas formas monoméricas y agregadas de la inmunoglobulina. Figura 9b. Elución de etapa sencilla del anticuerpo anti IL-IR de la reeina de intercambio de cationee débil CM-Sefarosa; las formas monoméricas y agregadas del anticuerpo receptor son parcialmente separadae y eluidas como un pico principal que comprende la forma monomérica de la inmunoglobulina y como un segundo pico, que comprende las formas monoméricas y agregadas de la inmunoglobulina aeí como otrae proteínae. En esta figura la cromatografía de exclusión de tamaño del primer pico (principal) se mueetra. Solo un pico ee eluye de la columna SEC, que ee la inmunoglobulina monomérica . Figura 9c. Elución de etapa sencilla del anticuerpo anti IL-IR de la resina de intercambio de cationes débil CM-Sefarosa; las formas monoméricas y agregadas del anticuerpo receptor son parcialmente separadas y eluidas como un pico principal que comprende la forma monomérica de la inmunoglobulina y como un segundo pico, comprende las formas monoméricas y agregadas de la inmunoglobulina así como otras proteínas. En esta figura la cromatografía de exclusión de tamaño del segundo pico se muestra. En el cromatograma al menoe tres picos se pueden ver, equivalente a formas monoméricas y agregadas de la inmunoglobulina y otrae proteínae. Figura 10. Elución de etapa eencilla del anticuerpo anti-HER-2 de la resina de intercambio de cationee fuerte SP-Sefaroea; lae formae monoméricae y agregadae del anticuerpo no ee eeparan y eluyen como un pico. Figura 11. Elución de gradiente lineal del anticuerpo anti-HER-2 de la resina de intercambio de cationee débil CM-Sefaroea con cloruro de sodio en amortiguador de citrato de sodio a 5.5 pH; las formas monoméricas y agregadas del anticuerpo son parcialmente separadae y eluidas con concentración inicial de 80 mM de cloruro de sodio como un pico principal que comprende la forma monomérica de la inmunoglobulina; las formas monoméricas y agregadas se eluyen como mezcla en la cola del pico principal junto con la proteína A. Figura 12. Elución de gradiente de tres etapae del anticuerpo anti-HER-2 de la resina de intercambio de cationee débil CM-Sefaroea con cloruro de eodio en amortiguador de citrato de eodio a 5.5 pH; lae formas monoméricas y agregadae del anticuerpo ee eeparan y eluyen como un pico principal que comprende la forma monomérica de la inmunoglobulina a una concentración de cloruro de eodio de 80 mM y como un eegundo pico comprende lae formae monoméricae y agregadas de la inmunoglobulina así como la proteína A en una concentración de cloruro de sodio de 100 mM. Figura 13. Elución de gradiente de etapa sencilla del anticuerpo anti-HER-2 de la resina de intercambio de cationes débil CM-Sefarosa con 80 M de cloruro de sodio a 5.5 pH ; la forma monomérica se eluye libre de formas agregadas; las formas agregadas se eluyen después una segunda etapa de cloruro de sodio a 120 mM como un segundo pico definido. Figura 14. Elución de gradiente de etapa sencilla del anticuerpo anti-HER-2 de la resina de intercambio de cationes fuerte SP-Sefarosa con 80 mM de cloruro de sodio a 5.5 pH; ee obtienen doe picos: el pico 1 contiene eolo Herceptin® monomérico, el pico 2, que ee eluye deepuée de una eegunda etapa de cloruro de eodio a 120 mM, que contiene una cantidad alta de Herceptin® monomérica y agregados; el porcentaje de Herceptin® en su forma monomérica es menoe que 60%.

Descripción Detallada de la Invención Parte Experimental Material : Un anticuerpo anti IL-1R de la inmunoglobulina IgG4 (de aquí en adelante se refiere como inmunoglobulina, WO 2005/023872) ee purificó en una primera etapa con una cromatografía de afinidad de la proteína A. A la elución de la columna de la proteína A ee realizo bajo condiciones acidas (10 mM de amortiguador de citrato de sodio, el valor pH 3.0 ± 0.5) . Deepuée de la etapa de filtración el valor de pH de la fracción que contiene la inmunoglobulina ee ajueto con un concentrado, por ejemplo 1 M, eolución amortiguadora de 9.0 pH(por ejemplo trie-hidroximetil-amino-metano (TRIS) o amortiguador de fosfato) a 5.0 pH . El eluyente de la proteína A es una solución con una concentración de proteína entre 5 mg/ml y 15 mg/ml y se amortiguo con citrato de sodio. Este material se refiere en el siguiente como el producto de elución de la proteína A condicionado, el cual se prepara para cargar en la resina de intercambio catiónico. Ejemplo 1 En este ejemplo comparativo se describe una cromatografía de intercambio de iones con una resina de intercambio de cationes fuerte y elución de etapa sencilla.

Condicionee cromatográficae : Reeina: SP-Sefaroea Relación de flujo: 160 cm/h Equilibrio: 10 mM de solución amortiguadora de citrato de sodio, ajustada a 5.0 pH Carga: max. 20 g de proteína/L gel matriz Etapa de lavado: 10 mM de eolución amortiguadora de citrato de eodio, ajuetada a 5.0 pH Elución: 25 mM de solución amortiguadora de citrato de sodio con 100 mM de cloruro de sodio, ajustada a 5.0 pH El producto de elución de proteína A condicionada se aplicó a una cromatografía de columna que contiene una resina de intercambio de cationes fuerte (SP-Sefarosa) . Despuée de la etapa de carga en una relación de flujo de 160 cm/h la columna ee lavó con solución amortiguadora de equilibrio (10 volúmenee de columnas). Las inmunoglobulinas de enlace se eluyeron con un método de elución de etapa sencilla, por ello el valor de pH ee mantuvo constante y la conductividad se vario (aumentando) por la adición de cloruro de sodio. En la figura 1 se presenta el cromatograma de elución de la cromatografía de intercambio de cationes del anticuerpo anti IL-IR en la resina de intercambio de cationes fuerte SP-Sefaroea. La elución ee una elución de reemplazo de etapa sencilla con cloruro de sodio sin alterar el valor de pH del sietema cromatográfico. Lae moléculas monoméricas y agregadas de la inmunoglobulinas no se separan y así con este método ninguna purificación por reducción del contenido agregado en el producto de elución se comparó al material de carga se puede obtener. Ejemplo 2 En eete ejemplo se describe una cromatografía de intercambio de iones con una resina de intercambio de cationes débil y elución de etapa sencilla. Para alcanzar una separación de formae monoméricas y agregados de una inmunoglobulina, una reeina de intercambio de cationee débil se empleó. Usando esta clase de resina un aumento de la conductividad por una etapa de elución se acompaña por un cambio particular del pH en la resina (aun cuando el pH de la solución amortiguadoraluyente sigue siendo constante) . Este efecto facilita la discriminación por ejemplo entre inmunoglobulinas monoméricas y formas agregadas. Ademáe, otrae impurezas, como rastros de proteínas de célulae hospederas o proteína A, pueden eficientemente separarse de la fracción media monomérica, sin pérdida significativa en la producción.

Condiciones cromatográficas : Resina: CM-Toyopearl Relación de flujo: 160 cm/h Equilibrio: 10 mM de eolución amortiguadora de citrato de eodio, ajuetada a 5.0 pH Carga: max. 20 g proteína/Matrix de gel L Lavado: 10 mM de eolución amortiguadora de citrato de eodio, ajuetada a 5.0 pH Elución: 25 mM de solución amortiguadora de citrato de sodio con 100 mM cloruro de eodio, ajuetada a 5.0 pH El producto de elución de proteína A condicionada se aplicó a una cromatografía de columna que contiene una resina de intercambio de cationee débil (CM-Toyopearl) . Después de la etapa de carga en una relación de flujo de 160 cm/h la columna se lavó con solución amortiguadora de equilibrio (10 volúmenes de columnae) . Lae inmunoglobulinae de enlace ee eluyeron con un método de elución de etapa eencilla, por ello el valor de pH en la faee móvil se mantuvo constante y la conductividad se vario por la adición de cloruro de sodio. En la figura 2 el perfil de elución con las mismas condiciones cromatográficas como en el ejemplo 1 pero esta vez se presente una resina de intercambio de cationes débil, CM-Toyopearl. Aquí un eegundo pico como inclinación del pico principal aparece. Eete comportamiento de la eeparación ee diferente a eee con una reeina de intercambio de cationee fuerte, tal como SP-Sefarosa. Un análieie de fracciones correspondiente al pico principal y al segundo pico de inclinación muestra una cantidad significativa de agregados para ser presente en la fracción de pico de inclinación. No hay agregados detectables en las fracciones de pico principal (ver también lae figuree 9a a c) . Ejemplo 3 Optimización del método cromatográfico-primera etapa: gradiente de concentración lineal. Para optimizar la cromatografía de intercambio de cationee en un material de intercambio de cationee débil un procedimiento de optimización, que consiste de tres etapas, se puso en práctica: La primera etapa es una cromatografía usando un gradiente de concentración lineal de una sal amortiguadora, citrato de sodio. Del miemo modo que es posible guardar la concentración de la sal amortiguadora constante y para mezclar una concentración linealmente en aumento de una sal que provoca la elución de la inmunoglobulina. En ambos casos es la conductividad del aumento de solución sin una alteración del valor de pH de la fase móvil. Las salee adecuadas para a la elución son por ejemplo cloruro de sodio, sulfato de sodio, fosfato de eodio, cloruro de potasio, sulfato de potasio, fosfato de potasio, ácido cítrico y salee del miemo aeí como mezclae de eetos componentes. Las concentraciones de 10 mM haeta 500 mM, que ee aplican, se ajustan de conformidad para fijar conductividad en el rango de alrededor de 1 milli S/cm a alrededor de 50 milli S/cm.

Condiciones cromatográficas : Resina CM-Toyopearl Relación de flujo: 160 cm/h Equilibrio: 10 mM de solución amortiguadora de citrato de sodio, ajuetada a 5.0 pH Carga: max. 20 g proteína/Matrix de gel L Lavado: 10 mM de eolución amortiguadora de citrato de eodio, ajuetada a 5.0 pH Elución: gradiente lineal; de 10 mM de eolución amortiguadora de citrato de sodio, ajustada a 5.0 pH, hasta 100 mM de solución amortiguadora de citrato de sodio, ajustada a 5.0 pH El producto de elución de proteína A condicionada se aplicó a una cromatografía de columna que contiene una reeina de intercambio de cationes débil (CM-Toyopearl) . Después de la etapa de carga en una relación de flujo de 160 cm/h la columna se lavó con solución amortiguadora de equilibrio (10 volúmenes de columnae) . Lae inmunoglobulinas de enlace se eluyeron con un método de elución gradiente lineal, por ello el valor de pH en la fase móvil se mantuvo constante. La concentración de la sal amortiguadora, citrato de sodio, se produce linealmente de 10 mM hasta 100 mM eobre 40 volúmenee de columnas. Deepués la concentración de citrato de sodio final ee alcanzo a la elución ee continuo para 40 volúmenee de columnas adicionales. En la figura 3 el cromatograma de la elución del gradiente de eolución amortiguadora lineal del anticuerpo anti IL-IR se presenta. La forma monomérica y el agregado del producto de elución de inmunoglobulina en un pico semi-separado empezando en una a concentración de 15 mM citrato de sodio y terminando en una concentración de 55 mM citrato de sodio. La recuperación de la inmunoglobulina de enlace de la resina de intercambio de cationes es dependiendo en la conductividad de la solución aplicada. Por lo tanto loe cationee de la eal amortiguadora presenta en la solución eluyente durante la etapa de recuperación tienen que ser considerados para efectuar a la elución de la inmunoglobulina de la resina de intercambio de cationes. La conductividad así como la resistencia iónica de la fase móvil son afectadas por el número total de iones en la eolución. Aeí el número de cationee monovalentes diferentes de hidrógeno en una forma molecular de la sal amortiguadora usada y la sal empleada que provoca la elución tiene que ser considerada por este medio. Ejemplo 4 Optimización del método cromatográfico segunda etapa: elución de gradiente de concentración de tres etapas . La concentración, a la que la elución de la inmunoglobulina de la resina de intercambio de ionee empieza, como se determina en el ejemplo 3, proporciona la base de la eegunda etapa de optimización, un método de elución de tree etapae . Lae concentraciones aproximadas de sal/solución amortiguadora para la etapa de elución se calculan como sigue: -La concentración de sal de la primera etapa de elución ee igual a la suma del primer sumando del producto de la concentración de la sal, en que a la elución de la columna de intercambio de iones empieza como se determina con el gradiente de eal de aumento lineal, y el número total de cationes monovalentes diferentes del hidrógeno denotan en la fórmula molecular de la sal que provoca la elución y como segundo sumando el producto de la concentración de la sal amortiguadora y el número total de cationes monovalentes deferente del hidrógeno denotan en la fórmula molecular de la sal amortiguadora; - La concentración de eal de la eegunda etapa de elución ee igual al producto de la concentración de sal de la primera etapa de elución y un factor de entre 1.25 y 1.35; - La concentración de sal de la tercera etapa de elución es igual al producto de la concentración de sal de la primera etapa de elución y un factor entre 1.50 y 1.70. El factor incluido en el cálculo de las etapas de concentración cuenta para el intervalo entre los nivelee de concentración y ee ajusta dependiendo en la concentración de inicio. En las concentraciones de inicio pequeñas, esto es entre 10 M y 40 mM, los factores son 1.35 y 1.70 respectivamente, en las concentraciones de inicio medias entre 40 mM y 70 mM los factoree son 1.30 y 1.60 respectivamente, y en las concentraciones de inicio altas de más de 70 mM los factores eon 1.25 y 1.50 reepectivamente . Loe factoree definen un rango que se ha determinado experimentalmente. Estoe valores no son valoree absolutos eino meramente un valor objetivo. Una deeviación de 10% ee conserva. La sal amortiguadora tiene que ser considerada para el cálculo porque es posible según lo delineado en el ejemplo 3 que la elución de una proteína de una resina de intercambio de iones pueda ser afectada por un cambio de la concentración de sal amortiguadora durante la cromatografía. Si la concentración de sal amortiguadora se mantiene constante durante la cromatografía o es menor comparado a la concentración de inicio (< 15% de la concentración de sal) puede ser abandonado durante el cálculo para reducir complejidad.

Con una concentración inicial de 15 mM de citrato de eodio, como se determina en el ejemplo 3, que consiste de una concentración amortiguadora de 10 mM y una contribución de 5 mM del gradiente lineal, las tres etapas se pueden calcular como eigue: -La concentración objetivo para la etapa 1 ee calcula para ser 30 mM (5 mM*2 +10 mM*2) de citrato de sodio en detalle: 5 mM (concentración de inicio) multiplicado por dos (ácido cítrico es un ácido trivalente, empleado como bi-sal de eodio; por lo tanto dos cationes monovalentes diferentes del hidrógeno se presenta en la fórmula molecular) más 10 mM (concentración de sal amortiguadora) multiplicado por dos (ácido cítrico es un ácido trivalente, empleado como bi-sal de sodio; por lo tanto dos cationee monovalentes diferentes del hidrógeno se presentan en la fórmula molecular) -La concentración objetivo de la etapa 2 se calcula para eer 40.5 mM (30 mM * 1.35) citrato de eodio en detalle: 30 mM de citrato de sodio es la concentración de la etapa 1 multiplicado por 1.35 (la concentración inicial es 15 mM, por lo tanto se selecciona como factor 1.35) - la concentración objetivo para la etapa 3 se calcula para ser 51 mM (30 mM * 1.70) citrato de sodio en detalle: 30 mM de citrato de eodio ee la concentración de la etapa 1 multiplicado por 1.70 (la concentración inicial ee 15 mM, por lo tanto ee eelecciona como factor 1.70) Condicionee cromatográficae : Reeina: CM-Toyopearl Relación de flujo: 160 cm/h Equilibrio: 10 M de eolución amortiguadora de citrato de sodio, ajustada a 5.0 pH Carga: max. 20 g proteína/Matrix de gel L Lavado: 10 mM de solución amortiguadora de citrato de sodio, ajustada a 5.0 pH Elución: etapa 1: 34 mM de solución amortiguadora de citrato de sodio, ajustada a 5. OpH etapa 2: 44 mM de solución amortiguadora de citrato de sodio, ajuetada a 5. OpH etapa 3 : 54 mM de eolución amortiguadora de citrato de eodio, ajuetada a 5.0 pH El producto de elución de proteína A condicionada se aplicó a una cromatografía de columna que contiene una resina de intercambio de cationes débil (CM-Toyopearl ) . Después de la etapa de carga en una relación de flujo de 160 cm/h la columna se lavó con eolución amortiguadora de equilibrio (10 volúmenes de columnas) . Las inmunoglobulinas de enlace se eluyeron con un método de elución de etapa de gradiente (= un método en donde la concentración de la eal de elución se cambia por etapas de un valor inicial/niveles para un valor final/nivel), por ello el valor de pH en la fase móvil se mantuvo constante. La concentración de la sal amortiguadora, citrato de sodio, se produce de 10 mM como condición inicial haeta 34 mM en la primera etapa, hasta 44 mM en la segunda etapa, y haeta 54 mM en la etapa final. Deepuée cada incremento de la concentración de sal, diez volúmenes de columnas de la elución amortiguadora se pasan a través de la columna anterior al eiguiente paeo. Deepuée la concentración de citrato de eodio final ee alcanzo a la elución ee continuo para 10 volúmenee de columnas adicionales . En la figura 4 el perfil de elución de las tres etapae de elución de gradiente del anticuerpo anti IL-1R ee preeenta. Loe productoe de elución de inmunoglobulina monoméricos en la primera etapa de fracción y el producto de elución agregado en la segunda etapa de fracción. Ejemplo 5 Optimización del método cromatográfico en tres etapas: etapa de elución sencilla con cloruro de sodio. La etapa final del procedimiento de optimización es la adaptación a un método de etapa de elución sencillo (= un método en donde la concentración de la sal de elución se cambia una vez a partir de un valor de inicio hasta un valor final) . Para este propósito el pH de la cromatografía se eleva desde 5.0 haeta 5.5. Eete giro de pH mejora la eeparación de la proteína A, debido a que la proteína A tiene un punto ieoeléctrico debajo de 5.5. Adicionalmente la eal de elución se cambia a partir de citrato de sodio, el cual se usó además como sal amortiguadora, hasta cloruro de eodio. Loe análieie adicionalee ee llevan a cabo (ADN, proteína de célula hoepedera, contenido de la proteína A, y compañero de glicoeilación con CL-EM) con las fracciones despuée de esta corrida cromatográfica.

Condiciones cromatográficae : Resina: CM-Sefarosa Relación de flujo: 160 cm/h Equilibrio: 10 mM citrato de sodio, ajustado a pH 5.5 Carga: max. 20 g proteína/Matriz de gel L Lavado: 10 mM citrato de sodio, ajustado a pH 5.5 Elución: 10 mM citrato de sodio con 150 mM cloruro de sodio, ajustado a pH 5.5 El producto de elución de la proteína A acondicionado se aplicó a una columna de cromatografía que contiene una resina de intercambio de cationes débil (CM-Sefarosa) .

Deepuée de la etapa de cargado a una relación de flujo de 160 cm/h la columna se lavó con solución amortiguadora de equilibrio (10 volúmenes de columna) . Lae inmunoglobulinas enlazadas se eluyeron con un método de elución de gradiente de etapa sencilla (= un método en donde la concentración de la sal de elución se cambia una vez a partir de un valor de inicio hasta un valor final), por ello el valor pH en la fase móvil ee mantiene constante. La concentración de la sal amortiguadora, citrato de sodio, se mantiene constante y 150 mM cloruro de eodio ee mezcló. Después del incremento de la concentración de la sal quince volúmenes de columna de la elución amortiguadora se pasan a través de la columna para eluir la inmunoglobulina enlazada. El cromatograma de elución de la etapa de elución sencilla con cloruro de sodio se presenta en la figura 5. La cromatografía de gradiente de etapa sencilla efectúa la resolución de la fracción monomérica principal y la fracción agregado/proteína A. El rendimiento de la inmunoglobulina monomérica es más de 80 %. Aun más de 95% de rendimiento ee poeible. Ejemplo 6 Comparación entre la eeparación con una reeina de intercambio de cationes fuerte (Flujo rápido de SP-sefarosa) y una resina de intercambio de cationes débil (Flujo rápido de CM-sefaroea) . Una comparación entre el intercambio de SP-Sefaroea ff fuerte y CM-Sefaroea ff ee da. Los experimentos se llevaron a cabo de conformidad al ejemplo 5 en duplicado (solamente uno de cada columna se muestra en la figura 6a y b) y los análisie adicionales se llevan a cabo en (ADN, proteína de célula hospedera, contenido de la proteína A, y compañero de glicoeilación con CL-EM) .

Métodoe analíticos: Cromatografía de exclusión de tamaño: Resina: TSK 3000 (Tosohaae) Columna: 300 x 7.8 mm Relación de flujo: 0.5 ml/min Solución amortiguadora: 200 mM foefato de potasio que contiene 250 mM cloruro de potasio, ajustado a pH 7.0 Sistema umbral de ADN: Ver, por ejemplo, Merrick, H. , and Hawlitechek, G. , Biotech Forum Europe 9 (1992) 398-403.

Proteína A ELISA: Loe pozoe de una placa de micro titulación ee recubrieron con una proteína A-IgG policlonal derivada del pollo. Deepués de enlazar el anticuerpo ein reaccionar se remueve por el lavado con una mueetra de eolución amortiguadora. Para el enlace de la proteína A un volumen de la muestra definida se agrega a los pozos. La proteína A presente en la muestra se enlaza por el anticuerpo de pollo y se retiene en los pozos de la placa. Después de la incubación la eolución de muestra se remueve y los pozos ee lavaron. Para la detección ee agregaron eecuencialmente un conjugado de la A-IgG-biotina de la anti-proteína derivado de pollo y un conjugado de peroxidaea de eetreptavidina. Deepuée de una etapa de lavado adicional la eolución de eubetrato ee agrega resultando en la formación de un producto de reacción de color. La intensidad del color es proporcional al contenido de la proteína A de la mueetra. Después de un tiempo definido la reacción se detuvo y la absorbancia se midió. ELISA de Proteína de célula hospedera (HCP) : Las paredes de los pozos de una placa de microtitulación ee recubrieron con una mezcla de albúmina de euero y estreptavidina. Una gota derivada del anticuerpo policlonal contra HCP se enlaza a las paredes de los pozos de la placa de microtitulación. Después de una etapa de lavado diferentes pozos de la placa de microtitulación se incubaron con una secuencia de calibración HCP de diferentes concentraciones y solución de muestra. Despuée de la incubación no ee enlazó material de muestra, se remueve por el lavado con solución amortiguadora . Para la detección de loe pozoe se incubaron con un conjugado de peroxidasa del anticuerpo para detectar la proteína de la célula hoepedera enlazada . La actividad de la peroxidasa f ij a se detecta por la incubación con ABTS y detección a 405 nm .

Condiciones cromatográficas : Resina : CM-Sefarosa ; SP-Sef arosa Relación de fluj o : 160 cm/h Equilibrio : 10 mM Citrato de sodio solución amortiguadora , ajustado a pH 5 . 5 Carga : max . 20 g proteína/Matriz de gel L Lavado : 10 mM citrato de sodio solución amortiguadora , ajustado a pH 5 . 5 Elución: 10 mM citrato de sodio solución amortiguadora con 150 mM cloruro de sodio, ajustado a pH 5.5 En las figuras 6a y 6b una comparación entre el cromatograma de elución de una resina de intercambio de cationee fuerte y débil se presenta. Usando una resina de intercambio de cationes débil (figura 6a) una separación del anticuerpo anti-IL-lR monomérico de las otrae impurezas ee lleva a cabo. Con la reeina de intercambio de cationee fuerte (figura 6b) no es posible la separación bajo las mismas condiciones . Lae fraccionee que corresponden a los picoe se colectan y analizan. Los resultadoe del análieie, loe cuales se enlietan en la tabla 1, mueetran que con los agregados de resina de intercambio de cationes débil y otras impurezas pueden efectivamente agotarse de la preparación de inmunoglobulina. Los datos presentes en la tabla 1 muestran que es posible separar con un anticuerpo anti-lL-lR monamérico de una reeina de intercambio de cationes débil a partir de formas agregadas del anticuerpo. Además las impurezas del ADN y proteína A pueden eliminarse. Tabla 1 ; Análisis de los productos de elución § Comparación entre SP-Sefarosa y CM-Sefarosa,, resultados de dos separaciones diferentes se presentan o Ejemplo 7 Ejemplo comparativo - elución en conductividades diferentes.

Condiciones cromatográficae : Reeina: CM-Sefarosa Relación de flujo: 160 cm/h Equilibrio: 10 mM citrato de sodio solución amortiguadora, ajustado a pH 5.5 Carga: max. 20 g proteína/Matriz de gel L Lavado: 10 mM citrato de sodio solución amortiguadora, ajustado a pH 5.5 Elución: 10 mM citrato de sodio solución amortiguadora con 100 mM, 150 M o 200 mM cloruro de sodio, ajuetado a pH 5.5 El producto de elución de la proteína A acondicionado ee aplicó a una columna de cromatografía que contiene una reeina de intercambio de cationee débil (CM-Sefarosa) . Después de la etapa de cargado a una relación de flujo de 160 cm/h la columna se lavó con Solución amortiguadora de equilibrio (10 volúmenes de columna) . Lae inmunoglobulinae enlazadae ee eluyeron con un método de elución de etapa sencilla, por ello el valor pH en la fase móvil se mantiene constante. La concentración de la sal amortiguadora, citrato de sodio, se mantiene constante y en tres diferentes corridas 100 mM, 150 mM, y 200 mM cloruro de sodio respectivamente se mezclaron. Después del incremento de la concentración de la sal quince volúmenes de columna de la elución amortiguadora ee pasan a través de la columna para eluir la inmunoglobulina enlazada. Los cromatogramas de elución se exhiben en la figurae 7a-7c. Lae eeparaciones buenas ee han obtenido ueando 150 mM de cloruro de eodio y 200 mM de cloruro de sodio como concentración de la sal de elución. Ejemplo 8 Ejemplo comparativo - Elución en diferentee valoree de pH. Condicionee cromatográficas : Resina: CM-Sefarosa Relación de flujo: 160 cm/h Equilibrio: 10 mM citrato de sodio solución amortiguadora, ajustado a pH 5.5 Carga: max. 20 g proteína/Matriz de gel L Lavado: 10 mM citrato de sodio solución amortiguadora, ajustado a pH 5.5 Elución: 10 mM citrato de sodio solución amortiguadora con 150 mM cloruro de sodio, ajustado a pH 4.0, o 6.0 El producto de elución de la proteína A acondicionado se aplicó a una columna de cromatografía que contiene una reeina de intercambio de cationes débil (CM-Sefarosa) . Despuée de la etapa de cargado a una relación de flujo de 160 cm/h la columna ee lavó con Solución amortiguadora de equilibrio (10 volúmenes de columna) . Las inmunoglobulinas enlazadas se eluyeron con un método de elución de gradiente de etapa sencilla, por ello el valor pH en la faee móvil ee mantiene constante a pH 4.0 ó 6.0 respectivamente. La concentración de la sal amortiguadora, citrato de sodio, se mantiene constante, y 150 mM cloruro de sodio ee mezcló. Deepuée del incremento de la concentración de la eal quince volúmenes de columna de la elución amortiguadora se pasan a través de la columna para eluir la inmunoglobulina enlazada. Los cromatogramas de elución se exhiben en la figuras 8a y b. El pH 4.0 es la tendencia para formar agregadoe de eete incremento de inmunoglobulina. Pero la CM-Sefaroea ee capaz para eeparar esta cantidad alta de agregados en dos picos. Ejemplo 9 Separación cromatográfica de un anticuerpo anti-HER-2 monoclonal (WO 99/57134) con una resina de intercambio de cationes fuerte (SP-Sefaroea) . La invención actual ee ejemplifica ademáe en los siguientes con Herceptina®, un anticuerpo anti-HER-2 monoclonal . La purificación de la Herceptina® con una cromatografía de intercambio de cationes en SP-Sefarosa, una resina de intercambio de cationes fuerte, se llevó a cabo. Bajo condicionee estándar de la invención actual, esto es, etapa de elución con, por ejemplo, cloruro de eodio, una eeparación de formae monoméricae y agregados del anticuerpo no se efectúan (figura 10) .

Condiciones cromatográficas: Resina: SP-Sefarosa Relación de flujo: 160 cm/h Equilibrio: 25 mM ácido 2-morfolinetaneulfónico, 50 mM cloruro de sodio, ajustado a pH 5.6 Carga: max. 20 g proteína/Matriz de gel L Lavado: 25 mM ácido 2-morfolinetansulfónico, 50 mM cloruro de sodio, ajustado a pH 5.6 Elución: 25 mM ácido 2-morfolinetansulfónico, 95 mM cloruro de sodio, ajustado a pH 5.6 El anticuerpo anti-HER-2 monoclonal (de aquí en adelante ee refiere como Herceptina®) ee purificó en una primera etapa con una cromatografía de afinidad de la proteína A. La elución de la columna de la proteína A se llevó a cabo bajo condiciones acidas (10 mM eolución amortiguadora de citrato de sodio, valor pH de 3.0 ± 0.5) . Antes de la etapa de filtración el valor pH de la fracción que contiene el anticuerpo se ajusta con una solución amortiguadora de tris-hidroximetil-amino-metano concentrado (TRIS) hasta pH 5.6. El producto de elución de la proteína A es una solución con una concentración de la proteína entre 5 mg/ml y 15 mg/ml y es amortiguada con citrato de sodio. El producto de elución de la proteína A acondicionado ee aplicó a una columna de cromatografía que contiene una reeina de intercambio de cationee fuerte (SP-Sefaroea) . Deepuée de la etapa de cargado a una relación de flujo de 160 cm/h la columna se lavó con Solución amortiguadora de equilibrio (10 volúmenes de columna) . Las inmunoglobulinas enlazadas se eluyeron con un método de etapa de elución sencillo, por ello el valor pH se mantiene conetante y la conductividad varía por el incremento (en etapae) de la concentración de cloruro de eodio. El cromatograma de elución ee exhibe en la figura 10. No se llevó a cabo la separación de las formas monoméricas y agregadas del anticuerpo. Ejemplo 10 Optimización del método cromatográfico-primera etapa: gradiente de concentración lineal. Para mejorar la separación de las doe fraccionee, lae condicionee de separación se optimizan de conformidad con el procedimiento como se resume con el anticuerpo anti IL-1R. En contraste al proceso de optimización del anticuerpo anti IL-1R un gradiente lineal de una sal (elución) , esto es, de cloruro de sodio, se usó en lugar de un gradiente de la sustancia amortiguadora. El cromatograma de la elución de gradiente de cloruro de sodio lineal, el cual corresponde a la primera etapa del procedimiento de optimización, se presenta en la figura 11. El análisis confirmó que la cola del pico principal se enriquece con agregar formas del anticuerpo.

Condiciones cromatográficae : Resina CM-Sefarosa Relación de flujo: 160 cm/h Equilibrio: 10 raM citrato de sodio eolución amortiguadora, ajuetado a pH 5.5 Carga: max. 20 g proteína/Matriz de gel L Lavado: 10 mM citrato de eodio eolución amortiguadora, ajuetado a pH 5.5 Elución: gradiente lineal; a partir de 10 mM citrato de eodio eolución amortiguadora, ajuetado a pH 5.5, haeta 10 mM citrato de eodio eolución amortiguadora que contiene 400 mM cloruro de eodio, ajustado a pH 5.5 El producto de elución de la proteína A acondicionado como se deecribe en el ejemplo 9 ee aplicó a una columna de cromatografía que contiene una resina de intercambio de cationes débil (CM-Sefarosa) . Despuée de la etapa de cargado a una relación de flujo de 160 cm/h la columna ee lavó con Solución amortiguadora de equilibrio (10 volúmenee de columna) . Lae inmunoglobulinae enlazadae ee eluyeron con un método de elución lineal de gradiente, por ello el valor pH en la faee móvil y la concentración de la eal amortiguadora se mantiene constante. La concentración de la sal de elución, cloruro de eodio, ee enjuagan linealmente a partir de 0 mM haeta 400 mM sobre 40 volúmenes de columna. El cromatograma de elución se exhibe en la figura 11.

El reemplazo de la reeina de intercambio de cationee fuerte por una reeina de intercambio de cationee débil cauea la eeparación de un segundo pico como su inclinación del primer pico principal. Esta obeervación ee eimilar ala obeervación en el caso del anticuerpo anti IL-1R. Las inmunoglobulinas comienzan a eluirse de la columna a una concentración de cloruro de sodio de 80 mM. Ejemplo 11 Optimización del método cromatográfico - segunda etapa: elución de gradiente de concentración de tres etapae . La concentración inicial, en la cual la inmunoglobulina comienza a eluiree, como ee determina en el ejemplo 10 y como se deriva del cromatograma presente en la figura 11, es 80 mM cloruro de sodio. Para el calculó de lae tres etapas de concentración, para la segunda optimización, la concentración amortiguadora puede desatenderse hasta eu mínimo y manteneree conetante durante la cromatografía. La concentración inicial del cloruro de sodio es 80 mM y cloruro de sodio tiene un catión diferente de hidrógeno en su fórmula molecular. En consecuencia las concentraciones para la elución de tres etapas se calculó que ee 80 mM, 100 mM (=80 mM multiplicado con 1.25), y 120 M (= 80 mM multiplicado con 1.50) cloruro de sodio respectivamente . Condicionee cromatográficae : Resina: CM-Sefarosa Relación de flujo: 160 cm/h Equilibrio: 10 mM citrato de sodio solución amortiguadora, ajustado a pH 5.5 Carga: max. 20 g proteína/Matriz de gel L Lavado: 10 mM citrato de sodio solución amortiguadora, ajustado a pH 5.5 Elución: etapa 1: 10 mM citrato de sodio eolución amortiguadora con 80 mM cloruro de sodio, ajustado a pH 5.5 etapa 2: 10 mM citrato de sodio solución amortiguadora con 100 mM cloruro de sodio, ajustado a pH 5.5 etapa 3: 10 mM citrato de sodio solución amortiguadora con 120 mM cloruro de sodio, ajustado a pH 5.5 El producto de elución de la proteína A acondicionado como ee describe en el ejemplo 9 se aplicó a una columna de cromatografía que contiene una resina de intercambio de cationes débil (CM-Sefarosa) . Después de la etapa de cargado a una relación de flujo de 160 cm/h la columna se lavó con Solución amortiguadora de equilibrio (10 volúmenes de columna). Las inmunoglobulinas enlazadas se eluyeron con un método de elución de gradiente de una etapa, por ello el valor pH en la fase móvil y la concentración de la sal amortiguadora, citrato de sodio, se mantiene constante. La concentración de la sal de elución, cloruro de eodio, se enjuagó a partir de 0 mM como condición de partida hasta 80 mM en la primera etapa, hasta 100 mM en la eegunda etapa, y hasta 120 mM en la etapa final. Despuée de cada incremento de la concentración de la sal diez volúmenes de columna de la elución amortiguadora con las concentracionee de cloruro de eodio eepecíficae ee paean a travée de la columna previa a la eiguiente etapa de concentración. Después de la concentración de citrato de sodio final ee alcanzó la elución ee continuó por 10 volúmenes de columna adicional . El cromatograma de elución ee exhibe en la figura 12. En el método de elución de tree etapas el anticuerpo monomérico se eluyó en la etapa con una concentración de cloruro de eodio de 80 mM . El tamaño del análisis de exclusión se confirmó que solamente el anticuerpo monomérico se eluye. Despuée de que la concentración de cloruro de eodio se incremento a 100 mM en la segunda etapa, el agregado forma el diluido (figura 12 ) . Ejemplo 12 Optimización del método cromatográfico en tres etapas: etapa de elución sencilla con cloruro de sodio.

Condiciones cromatográficas: Resina: CM-Sefarosa; SP-Sefarosa Relación de flujo: 160 cm/h Equilibrio: 10 mM citrato de sodio, ajuetado a pH 5.5 Carga: max. 20 g proteína/Matriz de gel L Lavado: 10 mM citrato de eodio, ajuetado a pH 5.5 Elución: 10 mM citrato de eodio con 80 mM cloruro de eodio, ajuetado a pH 5.5 El producto de elución de la proteína A acondicionado como se describe en el ejemplo 9 se aplicó a una columna de cromatografía que contiene una resina de intercambio de cationes débil (CM- Sefaroea) . Deepués de la etapa de cargado a una relación de flujo de 160 cm/h la columna se lavó con Solución amortiguadora de equilibrio (10 volúmenes de columna). Las inmunoglobulinas enlazadas se eluyeron con un método de elución de gradiente de etapa sencilla, por ello el valor pH en la faee móvil y la concentración de la eal amortiguadora se mantiene constante. La concentración de la sal amortiguadora, citrato de sodio, se mantiene constante y 80 mM cloruro de sodio se mezcló. Despuée del incremento de la concentración de la eal quince volúmenes de columna de la elución amortiguadora con cloruro de sodio se pasan a travée de la columna para eluir el anticuerpo anti-HER-2 enlazado en la forma monomérica. Para afirmar la eeparación de lae formae monoméricae y agregadoe del anticuerpo una eegunda etapa, la cual no ee necesaria para la preparación de los anticuerpoe monoméricoe, a una concentración de cloruro de sodio de 120 mM se llevó a cabo. Después de este segundo incremento las formae agregadas del anticuerpo se eluyen a partir de la columna. El cromatograma de elución se exhibe en la figura 13. Si el mismo método se lleva a cabo con una resina de intercambio de cationes fuerte una menor importancia del anticuerpo monomérico se observa (rendimiento de aproximadamente 60 % solamente comparado a 95% y más en una columna de intercambio de cationes débil) , a través de la separación de la forma monomérica y agregado del anticuerpo puede observarse (figura 14) . Aplicando las condiciones adecuadas para la separación de un material de intercambio de cationes débil a una resina de intercambio de cationes fuerte, SP-eefarosa, no se beneficia. No obstante las dos fracciones pueden separar el rendimiento del anticuerpo monomérico reducido a 60% o aun menos.

Tabla 2 ; Análisis de los productos de elucióas Comparación entre SP-Sefarosa y CM-Sefarosa, resultados de dos separaciones diferentes se presentan.

Se hace constar que con relación a eeta fecha, el mejor método conocido por la eolicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (10)

1. Reivindicaciones ; Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en lae eiguientee reivindicacionee : 1. El método para purificar una inmunoglobulina, caracterizado porque comprende a) proporcionar una solución que comprende una inmunoglobulina, una suetancia amortiguadora, y opcionalmente una sal ; b) llevar la solución y un material de intercambio de iones débil en contacto bajo condicionee por lae que la inmunoglobulina ee enlaza al material de intercambio de ionee débil; c) recubrir la inmunoglobulina del material de intercambio de iones débil en una etapa eencilla al uear una eolución que comprende una sustancia amortiguadora y una sal.
2. 2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el material de intercambio de ionee débil es un material de intercambio de cationes débil.
3. 3. El método de conformidad con cualesquiera de las reivindicacionee 1 a 2, caracterizado porque la sustancia amortiguadora es ácido cítrico o una eal del mismo o ácido fosfórico o una sal del mismo.
4. 4. El método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el método es un método cromatográfico o un lote.
5. 5. El método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque la sal en la etapa c) se selecciona del grupo que coneiete de cloruro de eodio, eulfato de eodio, cloruro de potaeio, sulfato de potasio, salee de ácido cítrico, salee de ácido fosfórico, y mezclas de eetoe componente .
6. 6. El método de conformidad con cualeequiera de lae reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque la inmunoglobulina es un miembro de la inmunoglobulina clase G o E.
7. 7. El método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque la solución en la etapa de recuperación c) tiene un valor de pH desde un pH 3.0 haeta pH 7.0.
8. 8. Un método para determinar la concentración de una eal para eluir un polipéptido de un material de cromatografía de intercambio de ionee en un proceeo de purificación de etapa sencilla, caracterizado porque comprende las siguientes dos etapas a) la etapa uno comprende las siguientee eub-etapae al) proporcionar una solución que comprende un polipéptido, una suetancia amortiguadora, y opcionalmente una sal; a2) poner una primer alícuota de la eolución que contiene el polipéptido y un material de intercambio de ionee en contacto bajo condiciones por ello el polipéptido enlaza al material de intercambio de iones; a3) recuperar el polipéptido del material de intercambio de iones al usar una solución que comprende una suetancia amortiguadora y una sal por ello la concentración de la sal ee incrementa linealmente; a4) determinar la concentración inicial de la eal donde la primera fracción del polipéptido comienza a eluiree a partir de la columna de intercambio de iones; b) la etapa doe comprende lae eiguientee eub-etapas bl) poner una segunda alícuota de la eolución que contiene el polipéptido y un material de intercambio de ionee en contacto bajo condicionee en lae que el polipéptido ee enlaza al material de intercambio de iones; b2) recuperar el polipéptido del material de intercambio de iones al usar un método de elución de tres etapae, por el que i) la concentración de la sal de la primera etapa de elución se calcula como la suma del producto de la concentración inicial de la sal como se determina en la etapa a4) y el número total de cationes monovalentes diferentes del hidrógeno denotado en la fórmula molecular de la sal y el producto de la concentración de la sal amortiguadora y el número total de los cationes monovalentee diferentee del hidrógeno denotado en la fórmula molecular de la sal amortiguadora; ii) la concentración de la sal de la eegunda etapa de elución ee el producto de la concentración de la eal de la primera etapa de elución y un factor entre 1.25 y 1.35; iii) la concentración de la eal de la tercera etapa de elución ee el producto de la concentración de la sal de la primera etapa de elución y un factor entre 1.50 y 1.70; Por lo que los factoree de la etapa ii) y iii) ee determinan como sigue: en una concentración inicial de entre 10 mM y 40 mM, los factoree eon 1.35 y 1.70 reepectivamente, en una concentración inicio de entre 40 mM y 70 M, los factores son 1.30 y 1.60 respectivamente, y en una concentración inicial de más de 70 mM los factores son 1.25 y 1.50 respectivamente. b3 ) determinar en cual sub-etapa del método de elución de tres etapas de la etapa b2 ) el polipéptido se eluye de la columna de intercambio de iones por lo que se determina la concentración de una sal para eluir un polipéptido de un material de cromatografía de intercambio de ionee en un proceeo de purificación de etapa eencilla.
9. 9. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el material de cromatografía de intercambio de ionee es un material de cromatografía de intercambio de iones débil.
10. 10. El método de conformidad con cualesquiera de lae reivindicacionee 8 a 9, caracterizado porque el polipéptido ee una inmunoglobulina.