JP4852602B2 - 抗体の精製法 - Google Patents
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Description
本発明は、ポリペプチド精製の分野に関するものである。イオン交換樹脂を用いた免疫グロブリン精製の新規の方法を、本明細書に記載する。同時に、精製条件の迅速な決定法を示す。
タンパク質および特に免疫グロブリンは、今日の医学のポートフォリオ(portfolio)において重要な役割を果たしている。ヒトへの適用のために、すべての薬学的物質は、明確な基準を満たさなければならない。生物学的製剤(biopharmaceutical agent)のヒトに対しての安全性を確かなものにするために、重度の害を引き起こす可能性がある、核酸、ウイルス、および宿主細胞タンパク質は、特に除去しなければならない。規定の水準を満たすために、1つまたは複数の精製段階は、製造工程の後に続かなければならい。とりわけ、純度、スループット、および収率は、適切な精製工程の決定に重要な役割を果たす。
このように、本発明の目的は、組換え生成された免疫グロブリンの精製のための、ならびに単量体および多量体免疫グロブリン種の分離のためのもう1つの方法を提供することである。
a)免疫グロブリン、緩衝物質、および任意で塩を含む溶液を提供する段階;
b)免疫グロブリンが弱イオン交換材料に結合する条件下で、溶液と弱イオン交換材料を接触させる段階;
c)緩衝物質および塩を含む溶液を用いることによって、1段階で弱イオン交換材料から免疫グロブリンを回収する段階。
a)以下の下位段階を含む段階1
a1)ポリペプチド、緩衝物質、および任意で塩を含む溶液を提供する段階;
a2)ポリペプチドがイオン交換材料に結合する条件下で、ポリペプチドを含む溶液の第1のアリコートとイオン交換材料を接触させる段階;
a3)緩衝物質および塩濃度を直線的に増加させる塩を含む溶液を用いることによって、イオン交換材料からポリペプチドを回収する段階;
a4)ポリペプチドの第1の画分がイオン交換カラムから溶出し始める、開始の塩濃度を決定する段階;
b)以下の下位段階を含む段階2
b1)ポリペプチドがイオン交換材料に結合する条件下で、ポリペプチドを含む溶液の第2のアリコートとイオン交換材料を接触させる段階;
b2)3段階溶出法を用いることによってイオン交換材料からポリペプチドを回収する段階であって、
i)第1の溶出段階の塩濃度が、
段階a4)において決定される開始の塩濃度と、塩の分子式中に示される水素とは異なる1価の陽イオンの総数との積と
緩衝塩の濃度と緩衝塩の分子式中に示される水素とは異なる1価の陽イオンの総数との積
との合計として計算され;
ii)第2の溶出段階の塩濃度が、第1の溶出段階の塩濃度と1.25〜1.35の間の因子との積であり;
iii)第3の溶出段階の塩濃度が、第1の溶出段階の塩濃度と1.50〜1.70の間の因子との積であり;
ここで、段階ii)およびiii)の因子は、10mM〜40mMの間の開始濃度においてそれぞれ1.35および1.70であり、40mM〜70mMの間の開始濃度においてそれぞれ1.30および1.60であり、ならびに70mMを超える開始濃度において因子がそれぞれ1.25および1.50であるように計算される段階:
b3) 段階b2)の3段階溶出法のどの下位段階においてポリペプチドがイオン交換カラムから溶出されるかを決定し、これにより1段階精製工程においてイオン交換クロマトグラフィー材料からポリペプチドを溶出するための塩濃度を決定する段階。
これらの用語は、以下の定義に従って本願で用いられる。
a) 免疫グロブリン、緩衝物質、および任意で塩を含む溶液を提供する段階;
b) 免疫グロブリンが弱イオン交換材料に結合する条件下で、溶液と弱イオン交換材料を接触させる段階;
c) 緩衝物質および塩を含む溶液を用いることによって、1段階で免疫グロブリンを弱イオン交換材料から回収する段階。
a) 以下の下位段階を含む段階1
a1) ポリペプチド、緩衝物質、および任意で塩を含む溶液を提供する段階;
a2) ポリペプチドがイオン交換材料へ結合する条件下で、ポリペプチドを含む溶液の第1アリコートとイオン交換材料を接触させる段階;
a3)緩衝物質および塩濃度を直線的に増加させる塩を含む溶液を用いることによって、ポリペプチドをイオン交換材料から回収する段階;
a4) ポリペプチドの第1画分がイオン交換カラムから溶出し始める、開始の塩濃度を決定する段階;
b) 以下の下位段階を含む段階2
b1) ポリペプチドがイオン交換材料に結合する条件下で、ポリペプチドを含む溶液の第2アリコートとイオン交換材料を接触させる段階;
b2) イオン交換材料からポリペプチドを、3段階溶出法を用いて回収する段階であって、
i) 第1溶出段階の塩濃度が、
段階a4)において決定される開始の塩濃度と、塩の分子式中に示される水素とは異なる1価の陽イオンの総数との積と
緩衝塩の濃度と緩衝塩の分子式中に示される水素とは異なる1価の陽イオンの総数との積
との和として計算され;
ii) 第2の溶出段階の塩濃度が、第1の溶出段階の塩濃度と1.25〜1.35の間の因子との積であり;
iii) 第3の溶出段階の塩濃度が、第1の溶出段階の塩濃度と1.50〜1.70の間の因子との積であり;
ここで、段階ii)およびiii)の因子が、10mM〜40mMの間の開始濃度においてそれぞれ1.35および1.70であり、40mM〜70mMの間の開始濃度においてそれぞれ1.30および1.60であり、および70mMを超える開始濃度において因子がそれぞれ1.25および1.50であるように決定される段階、
b3)段階b2)の3段階溶出法のどの下位段階においてポリペプチドがイオン交換カラムから溶出されるかを決定し、それによってポリペプチドをイオン交換材料から、1段階精製工程において溶出する塩濃度を決定する段階。
-第1溶出段階の塩濃度は、
第1の加数として、直線的に増加する塩勾配を用いて決定されるイオン交換カラムからの溶出が開始する塩濃度と、溶出を引き起こす塩の分子式中に示される水素とは異なる一価の陽イオンの総数との積と、
第2の加数として、緩衝塩の濃度と緩衝塩の分子式中に示される水素とは異なる一価の陽イオンの総数との積
との和と等しい。
-第2の溶出段階の塩濃度は、第1の溶出段階の塩濃度と1.25〜1.35の間の因子との積と等しい。
-第3の溶出段階の塩濃度は、第1の溶出段階の塩濃度と1.50〜1.70の間の因子との積と等しい。
- 段階1のための目標となる濃度は、30mM(5mM * 2+10mM * 2)クエン酸ナトリウムであるように計算される。
詳細には:2倍にされる5mM(開始濃度)(クエン酸は、二ナトリウム塩として用いられる三価の酸であり;このため水素とは異なる2つの一価の陽イオンが分子式中に存在する) + 2倍にされる10mM(緩衝塩の濃度)(クエン酸は、二ナトリウム塩として用いられる三価の酸であり;このため水素とは異なる2つの一価の陽イオンが分子式中に存在する)
- 段階2のための目標となる濃度は、40.5mM(30mM * 1.35)クエン酸ナトリウムであるように計算される。
詳細には:30mMクエン酸ナトリウムは、1.35倍にされる段階1の濃度である(開始濃度は15mMであり、このため因子として1.35が選択される)。
- 段階3のための目標となる濃度は、51mM(30mM * 1.70)クエン酸ナトリウムであるように計算される
詳細には:30mMクエン酸ナトリウムは、1.70倍にされる段階1の濃度である(開始濃度は15mMであり、このため因子として1.70が選択される)。
材料
IgG4免疫グロブリン抗IL-1R抗体(以下、免疫グロブリンと呼ぶ、WO 2005/023872)をプロテインAアフィニティークロマトグラフィーによる第1段階において精製した。プロテインAカラムからの溶出は、酸性条件下で行われた(10mM クエン酸ナトリウム緩衝液、pH値3.0±0.5)。ろ過段階前に、免疫グロブリンを含む画分のpH値は、濃縮した、例えば1MのpH9.0の緩衝溶液(例えば、トリス-ヒドロシキメチル-アミノ-メタン(TRIS)またはリン酸緩衝液)によりpH5.0に調整した。プロテインA溶出液は、タンパク質濃度が5mg/ml〜15mg/mlの間である溶液であり、クエン酸ナトリウムで緩衝化される。この材料は、以下において調整されたプロテインA溶出液と呼ばれ、陽イオン交換樹脂へのローディング(loading)のために調製される。
この比較実施例において、強陽イオン交換樹脂および1段階溶出を用いたイオン交換クロマトグラフィーが記載される。
樹脂: SP-Sepharose
流速: 160cm/h
平衡化: pH5.0に調整した、10mM クエン酸ナトリウム緩衝液
ローディング:最大20g タンパク質/L ゲルマトリックス
洗浄段階: pH5.0に調整した、10mM クエン酸ナトリウム緩衝液
溶出: pH5.0に調整した、100mM 塩化ナトリウムを含めた25mMクエン酸ナトリウム緩衝液
本実施例において、弱陽イオン交換樹脂および1段階溶出を用いるイオン交換クロマトグラフィーを記載する。
樹脂: CM-Toyopearl
流速: 160cm/h
平衡化: pH5.0に調整した、10mM クエン酸ナトリウム緩衝液
ローディング:最大20g タンパク質/L ゲルマトリックス
洗浄: pH5.0に調整した、10mM クエン酸ナトリウム緩衝液
溶出: pH5.0に調整した、100mM 塩化ナトリウムを含めた25mMクエン酸ナトリウム緩衝液
クロマトグラフィー法の最適化−第1段階:直線的濃度勾配
弱陽イオン交換材料における陽イオン交換クロマトグラフィーを最適化するために、3段階からなる最適化手段を実施した。
樹脂: CM-Toyopearl
流速: 160cm/h
平衡化: pH5.0に調整した、10mM クエン酸ナトリウム緩衝液
ローディング:最大20g タンパク質/L ゲルマトリックス
洗浄: pH5.0に調整した、10mM クエン酸ナトリウム緩衝液
溶出: 直線勾配;pH5.0に調整した10mM クエン酸ナトリウム緩衝液からpH5.0に調整した100mM クエン酸ナトリウム緩衝液まで
クロマトグラフィー法の最適化−第2段階:3段階濃度勾配溶出
実施例3で決定されるような、イオン交換樹脂から免疫グロブリンの溶出が開始する濃度は、第2の最適化段階、3段階溶出法の基礎を提供する。段階溶出のためのおおよその緩衝液/塩の濃度は以下のように計算される。
- 第1溶出段階の塩濃度は、
第1の加数として、直線的に増加する塩勾配を用いて決定されるようなイオン交換カラムからの溶出が開始する塩濃度と、溶出を引き起こす塩の分子式中に示される水素とは異なる一価の陽イオンの総数との積と、
第2の加数として、緩衝塩の濃度と、緩衝塩の分子式中に示される水素とは異なる一価の陽イオンの総数との積
との和と等しい。
- 第2の溶出段階の塩濃度は、第1の溶出段階の塩濃度と1.25〜1.35の間の因子との積と等しい。
- 第3の溶出段階の塩濃度は、第1の溶出段階の塩濃度と1.50〜1.70の間の因子との積と等しい。
- 段階1のための目標となる濃度は、30mM(5mM * 2+10mM * 2)クエン酸ナトリウムであるように計算される。
詳細には:2倍にされる5mM(開始濃度)(クエン酸は、二ナトリウム塩として用いられる三価の酸であり;このため水素とは異なる2つの一価の陽イオンが分子式中に存在する) + 2倍にされる10mM(緩衝塩の濃度)(クエン酸は、二ナトリウム塩として用いられる三価の酸であり;このため水素とは異なる2つの一価の陽イオンが分子式中に存在する)
- 段階2のための目標となる濃度は、40.5mM(30mM * 1.35)クエン酸ナトリウムであるように計算される。
詳細には:30mMクエン酸ナトリウムは、1.35倍にされる段階1の濃度である(開始濃度は15mMであり、このため因子として1.35が選択される)。
- 段階3のための目標となる濃度は、51mM(30mM * 1.70)クエン酸ナトリウムであるように計算される。
詳細には:30mMクエン酸ナトリウムは、1.70倍にされる段階1の濃度である(開始濃度は15mMであり、このため因子として1.70が選択される)。
樹脂: CM-Toyopearl
流速: 160cm/h
平衡化: pH5.0に調整した、10mM クエン酸ナトリウム緩衝液
ローディング:最大20g タンパク質/L ゲルマトリックス
洗浄: pH5.0に調整した、10mM クエン酸ナトリウム緩衝液
溶出: 段階1:pH5.0に調整した、34mM クエン酸ナトリウム緩衝液
段階2:pH5.0に調整した、44mM クエン酸ナトリウム緩衝液
段階3:pH5.0に調整した、54mM クエン酸ナトリウム緩衝液
クロマトグラフィー法の最適化−第3段階:塩化ナトリウムによる1段階溶出
最適化手段の最終段階は、1段階溶出法への適用である(=溶出塩の濃度が開始値から最終値まで即座に変化する方法)。このため、クロマトグラフィーのpHは5.0から5.5まで上昇する。プロテインAが5.5より低い等電点を有するため、このpHシフトはプロテインAからの分離を向上させる。さらに、溶出塩を、緩衝液塩としてもさらに用いられるクエン酸ナトリウムを塩化ナトリウムへ変更する。このクロマトグラフィー実行の後に、この画分を用いて追加の分析が行われた(DNA、宿主細胞タンパク質、プロテインAの含量、およびLC-MSによるグリコシル化パターン)。
樹脂: CM-Sepharose
流速: 160cm/h
平衡化: pH5.5に調整した、10mM クエン酸ナトリウム
ローディング:最大20g タンパク質/L ゲルマトリックス
洗浄: pH5.5に調整した、10mM クエン酸ナトリウム
溶出: pH5.5に調整した、150mM 塩化ナトリウムを含めた10mM クエン酸ナトリウム
強陽イオン交換樹脂(SP-Sepharose fast flow)を用いた分離と弱陽イオン交換樹脂(CM-Sepharose fast flow)との比較
強SP-Sepharose ff 交換体とCM-Sepharose ffとの比較がなされた。実験は実施例5に従って2回行い(各カラムから1つのみを図6aおよびbに示す)、追加の分析を行った(DNA、宿主細胞タンパク質、プロテインAの含量、およびLC-MSによるグリコシル化パターン)。
サイズ排除クロマトグラフィー:樹脂: TSK 3000(Tosohaas)
カラム: 300x7.8 mm
流速: 0.5 ml/min
緩衝液: pH7.0に調整した、250mM 塩化カリウムを含む200mM リン酸カリウム
DNA閾値システム: 例えば、Merrick, H.およびHawlistschek, G., Biotech Forum Europe 9 (1992) 398-403を参照のこと
プロテインA ELISA: マイクロタイタープレートのウェルを、ヒヨコ由来のポリクローナルプロテインA-IgGでコーティングする。結合後、非反応の抗体はサンプルバッファで洗浄することによって除去する。プロテインAの結合のために、規定のサンプル容量をウェルに添加する。サンプル中に存在するプロテインAは、ヒヨコ抗体によって結合され、プレートのウェルに保持される。インキュベート後、サンプル溶液を除去し、ウェルを洗浄する。その後、検出のために、ヒヨコ由来のポリクローナル抗プロテインA-IgG-ビオチン結合体とストレプトアビジンペルオキシダーゼ結合体を添加する。さらなる洗浄段階の後に、基質溶液を添加し、結果として有色の反応生成物の形成が生じる。色の彩度は、サンプルのプロテインA含量に比例する。規定時間後、反応を止め、吸光度を測定する。
宿主細胞タンパク質(HCP)ELISA:マイクロタイタープレートのウェルの壁を血清アルブミンとストレプトアビジンとの混合物でコーティングする。ヤギ由来のHCPに対するポリクローナル抗体は、マイクロタイタープレートのウェルの壁に結合させる。洗浄段階後、マイクロタイタープレートの異なるウェルを異なる濃度のHCP較正配列およびサンプル溶液とともにインキュベートする。インキュベート後、未結合のサンプル材料を緩衝溶液で洗浄することによって除去する。検出のために、ウェルを抗体ペルオキシダーゼ結合体とともにインキュベートし、結合宿主細胞タンパク質を検出する。固定ペルオキシダーゼの活性を、ABTSとのインキュベーションおよび405nmにおける検出によって検出する。
樹脂: CM-Sepharose;SP-Sepharose
流速: 160cm/h
平衡化: pH5.5に調整した、10mM クエン酸ナトリウム緩衝液
ローディング:最大20g タンパク質/L ゲルマトリックス
洗浄: pH5.5に調整した、10mM クエン酸ナトリウム緩衝液
溶出: pH5.5に調整した、150mM 塩化ナトリウムを含めた10mM クエン酸ナトリウム緩衝液
比較例−異なる伝導度における溶出
クロマトグラフィー条件:
樹脂: CM-Sepharose
流速: 160cm/h
平衡化: pH5.5に調整した、10mM クエン酸ナトリウム緩衝液
ローディング:最大20g タンパク質/L ゲルマトリックス
洗浄: pH5.5に調整した、10mM クエン酸ナトリウム緩衝液
溶出: pH5.5に調整した、100mM、150mMまたは200mM 塩化ナトリウムを含めた10mM クエン酸ナトリウム緩衝液
比較例−異なるpH値における溶出
クロマトグラフィー条件:
樹脂: CM-Sepharose
流速: 160cm/h
平衡化: pH5.5に調整した、10mM クエン酸ナトリウム緩衝液
ローディング:最大20g タンパク質/L ゲルマトリックス
洗浄: pH5.5に調整した、10mM クエン酸ナトリウム緩衝液
溶出: pH4.0または6.0に調整した、150mM 塩化ナトリウムを含めた10mM クエン酸ナトリウム緩衝液
強陽イオン交換樹脂(SP-Sepharose)を用いたモノクローナル抗HER-2抗体(WO 99/57134)のクロマトグラフィー分離
本発明は、Herceptin(登録商標)、モノクローナル抗HER-2抗体を用い、以下にさらに例示する。
樹脂: SP-Sepharose
流速: 160cm/h
平衡化: pH5.6に調整した、25mM 2-モルホリンエタンスルホン酸、50mM 塩化ナトリウム
ローディング:最大20g タンパク質/L ゲルマトリックス
洗浄: pH5.6に調整した、25mM 2-モルホリンエタンスルホン酸、50mM 塩化ナトリウム
溶出: pH5.6に調整した、25mM 2-モルホリンエタンスルホン酸、95mM 塩化ナトリウム
クロマトグラフィー法の最適化−第1段階:直線的濃度勾配
2つの画分の分離を向上するために、分離条件を抗IL-1R抗体を用いて概説した手順に従って最適化した。
樹脂: CM-Sepharose
流速: 160cm/h
平衡化: pH5.5に調整した、10mM クエン酸ナトリウム緩衝液
ローディング:最大20g タンパク質/L ゲルマトリックス
洗浄: pH5.5に調整した、10mM クエン酸ナトリウム緩衝液
溶出: 直線勾配;pH5.5に調整した10mM クエン酸ナトリウム緩衝液からpH5.5に調整した400mM 塩化ナトリウムを含む10mMクエン酸ナトリウム緩衝液
クロマトグラフィー法の最適化−第2段階:3段階濃度勾配溶出
実施例10において決定され、図11に示されるクロマトグラムから得られるような、免疫グロブリンが溶出し始める開始濃度は、80mM 塩化ナトリウムである。第2の最適化段階のための3つの濃度段階の計算について、緩衝液濃度は、クロマトグラフィーの間は低く、かつ一定に保たれるため、それを無視することができる。
樹脂: CM-Sepharose
流速: 160cm/h
平衡化: pH5.5に調整した、10mM クエン酸ナトリウム緩衝液
ローディング:最大20g タンパク質/L ゲルマトリックス
洗浄: pH5.5に調整した、10mM クエン酸ナトリウム緩衝液
溶出: 段階1:pH5.5に調整した、80mM 塩化ナトリウムを含めた10mM クエン酸ナトリウム緩衝液
段階2:pH5.5に調整した、100mM 塩化ナトリウムを含めた10mM クエン酸ナトリウム緩衝液
段階3:pH5.5に調整した、120mM 塩化ナトリウムを含めた10mM クエン酸ナトリウム緩衝液
クロマトグラフィー法の最適化−第3段階:塩化ナトリウムによる1段階溶出
クロマトグラフィー条件:
樹脂: CM-Sepharose;SP-Sepharose
流速: 160cm/h
平衡化: pH5.5に調整した、10mM クエン酸ナトリウム
ローディング:最大20g タンパク質/L ゲルマトリックス
洗浄: pH5.5に調整した、10mM クエン酸ナトリウム
溶出: pH5.5に調整した、80mM 塩化ナトリウムを含めた10mM クエン酸ナトリウム
Claims (7)
- a)免疫グロブリン、緩衝物質を含む溶液を提供する段階;
b)免疫グロブリンが弱陽イオン交換材料に結合する条件下で溶液と弱陽イオン交換材料を接触させる段階;
c)緩衝物質および塩を含む溶液を用いることによって、1段階で単量体免疫グロブリンを弱陽イオン交換材料から回収する段階
を含む、免疫グロブリン凝集体からの免疫グロブリンの精製方法であって、
弱陽イオン交換材料が、カルボキシメチル弱陽イオン交換材料であり、
免疫グロブリンが免疫グロブリンクラスGまたはEのメンバーであり、
回収段階c)における溶液が、pH3.0〜pH7.0のpH値を有し、
段階c)における塩が、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、塩化カリウム、硫酸カリウム、クエン酸塩、リン酸塩、およびこれらの成分の混合物からなる群より選択され、
緩衝物質が、5mMおよび100mMの間の濃度範囲を有する、
方法。 - 緩衝物質が、クエン酸もしくはその塩またはリン酸もしくはその塩であることを特徴とする、請求項1記載の方法。
- クロマトグラフィー法またはバッチ法であることを特徴とする、請求項1〜2のいずれか一項記載の方法。
- 陽イオン交換材料が前記免疫グロブリンの等電点より低いpH値で処理されることを特徴とする、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
- pH値が、1段階において一定に保たれることを特徴とする、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
- 前記免疫グロブリンが、6.0またはそれ以上(pI≧6.0)の等電点(pI)を有することを特徴とする、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
- 段階c)における溶出を引き起こす塩を、緩衝物質と同時に使用することを特徴とする、請求項1〜6のいずれか一項記載の方法。
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