MX2007011218A - Sistema integrado para colectar, procesar y transplantar subconjuntos de celulas, incluyendo celulas madre adultas para medicina regenerativa. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere a un sistema para la extraccion, coleccion, procesamiento y transplante de sub-conjuntos celulares, que incluyen celulas madre adultas y plaquetas, en particular para reparacion de tejido en medicina regenerativa, que comprende un equipo de elementos de transporte de fluido desechables que son pre-conectados o que incluyen conectores asepticos par hacer interconexiones entre los mismos en una manera aseptica o se adaptan para ser asepticamente conectados. El equipo usualmente incluye tres kits de elementos esteriles desechables, un kit de coleccion, un kit de procesamiento, y un kit de transplante envasado en un envase ampolla en un soporte tal como una bandeja, que tiene un compartimiento para recibir cada kit interconectable del equipo. El equipo incluye un dispositivo de extraccion, por ejemplo incluye una aguja para puncion de hueso o puncion de vena, para extraer la medula osea u otras fuentes de sub-conjuntos celulares de un paciente.

Description

SISTEMA INTEGRADO PARA COLECTAR, PROCESAR Y TRANSPLANTAR SUBCONJUNTOS DE CÉLULAS, INCLUYENDO CÉLULAS MADRE ADULTAS PARA MEDICINA REGENERATIVA CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención se refiere a la colección, procesamiento automatizado y transplante de subconjuntos de células como se encuentran en la médula ósea, sangre periférica, sangre de cordón umbilical o tejido adiposo con el objetivo de reinyectar localmente estas células para reparar tejidos. Los sub-conjuntos celulares son típicamente Células Madre Adultas o plaquetas pero más generalmente incluyen cualquiera de las sub-poblaciones celulares similares a glóbulos rojos y glóbulos blancos. Tales procedimientos probablemente serán realizados en un ambiente de hospital o instalación médica que no tiene laboratorio de procesamiento de células, y que probablemente seguirán siendo realizados por técnicos no especializados. La invenció también incluye un nuevo tipo de sensor óptico para monitorear los subconjuntos celulares que pasan a través de un tubo transparente .

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las células madre se definen como células que Ref. 185964 tienen capacidades clonogénicas y de auto-renovación y que se diferencian en múltiples linajes celulares. Mientras que las células madre embriónicas se derivan de embriones de mamíferos en la etapa de blastocistos y tienen la capacidad de generar cualquier célula terminalmente diferenciada en el cuerpo, las células madre adultas son parte de células de tejido específico del organismo post-natal en el cual son confinadas para diferenciarse. Las células madre adultas ofrecen ventajas prácticas sobre las células madre embriónicas. Diferente de las últimas, no erigen algún punto ético, y se pueden extraer del paciente mismo. Existen en suministro abundante y son intrínsecos a varios tejidos del cuerpo humano. Las fuentes más accesibles de células madre adultas son la médula ósea, sangre periférica, sangre del cordón umbilical y posiblemente tejidos adiposos, como se indica por estudios recientes. Estas células son capaces de mantener, generar y reemplazar células terminalmente diferenciadas dentro de su propio tejido específico como una consecuencia del vuelco de célula fisiológico o daño de tejido debido a lesión. Tal capacidad, conocida como plasticidad celular, ha conducido al desarrollo de aplicaciones terapéuticas que se dirigen a la regeneración de tejidos defectuosos, con el objetivo de restaurar la fisiología y funcionalidad del órgano afectado. Las células madre adultas pueden originar células hematopoyéticas como se conocen desde hace muchas décadas, pero como se encontró en años recientes también pueden originar vasos sanguíneos, músculos, hueso, cartílago, piel, neuronas, etc. Tales células son conocidas como células madre mesenquimales . Además , las plaquetas preparadas como concentrado de plaquetas se pueden usar para acelerar la curación de herida, y en consecuencia pueden jugar un papel en la medicina regenerativa para ayudar en la reconstrucción de tejidos como hueso, piel u otros tejidos. Las células madre hematopoyéticas se han usado grandemente para transplantar pacientes que han sufrido quimioterapia para restaurar su hetamopoyesis . Inicialmente extraídas de la médula ósea, se han originado más recientemente de la sangre periférica o sangre umbilical, estás últimas tienen la capacidad de proliferación más alta. Las células para transplante requieren procesamiento especial similar a la separación celular, seguida algunas veces por procesos de selección y/o expansión. Hasta la fecha, tales manipulaciones se han realizado dentro de laboratorios de procesamiento de células bien equipados por personal altamente entrenado que es componente en hematología y biología celular. Tales manipulaciones requieren preparaciones de laboratorio de labor intensivo que involucran centrifugación en tubos, separación por gradiente de densidad, frecuentemente realizada en un sistema abierto con el riesgo de contaminación por bacterias, etc. Las nuevas perspectivas ofrecidas por las células madre en el campo de medicina regenerativa son desafiadas por puntos prácticos de manipulación de estas células en ambientes que no son familiares con estas técnicas. Uno de los puntos principales es la carencia de cuartos limpios que permiten un procesamiento seguro de las células. Se puede citar como ejemplos los campos de cardiología, ortopedia y neurología que están todas experimentando con terapia a base de célula madre, pero sin embargo carecen de facultades de procesamiento de células apropiadas. En consecuencia, hay una necesidad de sistemas simples que puedan procesar células madre adultas o generalmente cualquiera de los sub-conjuntos celulares automáticamente, en un sistema cerrado y rápidamente para proporcionar un sistema de procesamiento de células en línea en la cabecera del paciente.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La invención proporciona un sistema que permite la extracción, colección, procesamiento y transplante de subconjuntos celulares que se dirigen a la reparación de tejido en medicina regenerativa. Tal sistema se puede ofrecer en un soporte similar a una bandeja que incluye kits individuales para realizar el procedimiento. Los kits individuales se pueden pre-conectar o se pueden equipar con conectores asépticos para hacer interconexiones entre los mismos de una manera aséptica, o se pueden conectar usando un dispositivo de conexión estéril como, el SCD de Terumo, que opera por soldadura. La invención proporciona un sistema simple para procesar/concentrar automáticamente los sub-conjuntos celulares en un sistema cerrado que puede proporcionar un sistema de procesamiento de células en línea en la cabecera del paciente, como se describe en la reivindicación 1. Las modalidades de la invención se describen en las reivindicaciones dependientes. En una modalidad, el recipiente de colección usado para recolectar los sub-conjuntos celulares del paciente se pueden diseñar de tal forma para ser usados como cámara de separación también. De manera similar, el receptáculo usado para colectar las células separadas se puede diseñar de tal forma para servir como un recipiente de reinfusión para suministrar las células de nuevo al paciente. La separación de las células puede dirigirse a una colección de capa leucocitaria o se realiza usando un proceso de separación basado en gradiente de densidad, seguido por un lavado celular, basado en el sistema como se describe en EP-B-912 250 (Claude Fell) y PCT/IB99/020523 (Biosafe) . Otra forma de procesar las células es usar microperlas revestidas con anticuerpos monoclonales como se describe en O03/009889 (CellGenix/Biosafe) . El uso combinado de un detector óptico el cual puede medir la absorción y reflexión debido a las células que fluyen en un tubo transparente permite colectar más precisamente un sub-conjunto celular particular similar a plaquetas para producir un concentrado de plaquetas. Tal concentrado de plaquetas se puede obtener en un procedimiento separado o como un sub-producto durante un procedimiento que se dirige a un sub-conjunto celular. La invención también contempla usar el sistema descrito para preparar un concentrado de plaquetas para uso separado. La invención por consiguiente proporciona un sistema completamente integrado para intervención de cabecera que minimiza los riesgos de contaminación usando un sistema cerrado. Ofrece un gran nivel de automatización y no depende de cualquier práctica de procesamiento de células especial. Es adecuado para manejar cualquier fuente de células (tales como células madre Adultas, plaquetas) , pero particularmente para preparación de célula madre de médula ósea, en un ambiente autólogo o alogénico.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La invención será descrita adicionalmente por vía de ejemplo, con referencia a las figuras esquemáticas acompañantes en las cuales: La figura 1 es un diagrama que ilustra el establecimiento general de un kit de procesamiento de médula ósea de acuerdo con la invención; La figura 2 muestra los símbolos usados en las figuras 3-7 para ilustrar los diferentes componentes de los kits ilustrados de acuerdo con la invención; Las figuras 3A y 3B muestran dos modalidades de un kit de colección, uno sin y uno con una unidad de filtro; La figura 4 muestra un kit de procesamiento que se puede conectar por un conector aséptico a un kit de colección como se muestra en la figura 3A o figura 3B o a un kit de transplante como se muestra en las figuras 5A o 5B; La figura 5A muestra elementos individuales de un kit de transplante y la figura 5B muestra una combinación de elementos que integran un kit de transplante; La figura 6 ilustra diferentes combinaciones de kits para integrar un sistema completo; La figura 7 es un diagrama de un equipo de procesamiento de médula ósea todo en uno en el cual una cámara de procesamiento girable constituye una jeringa de separación que se usa también para la colección y trasplante de las células; Las figuras 7A, 7B y 7C muestran las configuraciones operativas de componentes del equipo de la figura 7 para colección, procesamiento y transplante, respectivamente ; Las figuras 8A, 8B y 8C muestran el principio de la detección de las células por un sensor de línea óptico que usa las propiedades de absorción y reflexión de las células; La figura 8D muestra una vista vertical del sensor de línea óptico con la ubicación de dispositivos receptores y LED; y La figura 9 muestra señales de salida típicas del sensor de línea óptico de la figura 8.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La invención se refiere a un sistema integrado que permite la colección de sub-conjuntos celulares, su procesamiento/concentración y reinfusión de un producto rico en sub-conjunto celular particular con el objetivo de reparar o regenerar un tejido lesionado o defectuoso. El proceso será descrito en un ambiente autólogo, significando que las células son extraídas y reinfusionadas desde y al mismo paciente. Tal tratamiento autólogo generalmente es preferido cuando no hay reacción inmunológica o efectos adversos debido a las incompatibilidades entre el donante y receptores. Sin embargo, el principio podría seguir siendo el mismo en un ambiente alogénico. Las células madre, y más específicamente las células madre mesenquimales se encuentran en la médula ósea de acuerdo con el conocimiento actual, aunque estudios indican que las células madre mesenquimales también existen en la sangre de cordón umbilical, sangre periférica o aún en tejidos grasos. Aunque el principio podría también aplicarse a estas diversas fuentes de células madre, el proceso descrito aquí se refiere al procesamiento de médula ósea. El proceso consiste primero de una extracción de médula ósea de la zona pélvica, bajo una anestesia local. El hueso es perforado usando un extractor de médula ósea por ejemplo del tipo Tyco. La médula es aspirada usando una o múltiples jeringas, las cuales son pre-llenadas con algún anticoagulante, usualmente heparina o una solución de citrato/fosfato . Un volumen de 50 ml típicamente se colecta, pero podrá ser un valor diferente. La médula ósea aspirada generalmente se transfiere en una bolsa de colección de PVC, ya sea filtrada o no, y se puede colocar en un agitador. La bolsa de colección de PVC luego se conecta, usando técnicas asépticas, preferiblemente en el sistema descrito en EP-B-912 250 y PCT/IB99/02052, y la separación y concentración de células madre luego se realiza por consiguiente. Otras cámaras de procesamiento centrífugas se pueden usar (por ejemplo, donde el eje de rotación no es paralelo al eje de una cámara de procesamiento cilindrica) o usando recipientes flexibles . La EP-B-0 912 250 (C.FELL), los contenidos de la misma se incorporan en la presente por vía de referencia, describe un sistema para el procesamiento y separación de fluidos biológicos en componentes, que comprende un conjunto de recipientes para recibir el fluido biológico a ser separado y los componentes separados, y opcionalmente uno o más recipientes adicionales para soluciones aditivas. Una cámara de procesamiento centrífuga hueca es girable alrededor de un eje de rotación por acoplamiento de la cámara de procesamiento con una unidad impulsora giratoria. La cámara de procesamiento tiene una entrada/salida axial para que el fluido biológico sea procesado y para los componentes procesados del fluido biológico. Esta entrada/salida conduce a un espacio de separación de volumen variable en donde el procesamiento centrífugo completo del fluido biológico toma lugar. La cámara de procesamiento comprende una pared generalmente cilindrica extendida desde una pared de extremo de la cámara de procesamiento, esta pared generalmente cilindrica define en esta la cámara de procesamiento hueca la cual ocupa un espacio cilindrico abierto hueco coaxial con el eje de rotación, la entrada/salida axial se proporciona e la pared de extremo coaxial con la pared generalmente cilindrica para abrirse en la cámara de procesamiento hueca. La cámara de procesamiento contiene dentro de la pared generalmente cilindrica un miembro axialmente movible tal como un pistón. El espacio de separación de volumen variable se define en una parte superior de la cámara de procesamiento por la pared generalmente cilindrica y por el miembro axialmente movible contenido en la pared generalmente cilindrica de la cámara de procesamiento, en donde el movimiento axial del miembro movible varía el volumen del espacio de separación, el miembro movible es axialmente movible dentro de la cámara de procesamiento para admitir una cantidad seleccionada de fluido biológico a ser procesado en el espacio de separación vía la entrada antes o durante el procesamiento centrífugo y para expresar componentes de fluido biológico procesados del espacio de separación vía la salida durante o después del procesamiento centrífugo. Los medios se proporcionan para monitorear la posición del miembro movible para controlar por esto la cantidad de fluido biológico admitido y la expresión de componentes separados. El sistema adicionalmente comprende un arreglo de válvula de distribución para establecer la comunicación selectiva entre la cámara de procesamiento y los recipientes seleccionados o para colocar la cámara de procesamiento y recipientes fuera de comunicación. De acuerdo con PCT/IB99/02052 , tal sistema se arregla para operar en una separación y en un modo de transferencia sin separación, el cual proporciona posibilidades mayores para el uso del sistema que incluye nuevas aplicaciones las cuales fueron previamente no contempladas, tal como separación de células madre hematopoyéticas y en general procesamiento de laboratorio. Por consiguiente, el sistema se puede arreglar para operar de modo que : en el modo de separación los fluidos pueden ser admitidos en la cámara de procesamiento mientras la cámara está girando o estacionaria, el fluido admitido en la cámara se centrifuga y separa en componentes, y los componentes separados se expresan mientras la cámara está girando u, opcionalmente, para el último componente separado, mientras la cámara está estacionaria; y en el modo de transferencia la cámara de procesamiento admite fluido y expresa fluido con la cámara estacionaria. El arreglo de actuación de válvula es accionabe para la transferencia de cantidades de fluido de un recipiente a otro vía la cámara de procesamiento, moviendo el miembro, sin centrifugación o separación del fluido en componentes, y el medio para monitorear la posición del miembro movible controla las cantidades de fluidos no separados transferidos . En la nueva aplicación de acuerdo con la presente invención, la cual usa ventajosamente la cámara de separación de acuerdo con EP-B-912 250 y PCT/IB99/02052 , la separación puede dirigirse a una colección de capa leucocitaria que permite la más alta recuperación de células madre sin cualquier sub-conjunto celular específico de objetivo. El producto inicial, las fuentes son aquellas descritas anteriormente, se introduce en la cámara de separación bajando el pistón. Una vez que el producto se ha cargado en la cámara de separación - se detecta por el sensor de línea óptico colocado cerca de la entrada de la cámara de separación - un ciclo de sedimentación de típicamente 5-10 minutos, produce una capa de capa leucocitaria entre el plasma y la capa de glóbulos rojos. En la extracción, el plasma se extrae primero moviendo el pistón hacia arriba. Un sensor de línea óptico, por ejemplo que describe con referencia a la figura 8, detecta las células las cuales pertenecen a la capa leucocitaria y adapta los diferentes parámetros (velocidad de extracción, volumen extraído, velocidad de centrifugación) para optimizar la recuperación de células, dependiendo del volumen deseado y el tiempo para procesar las restricciones. Las células de capa leucocitaria se extraen al vial o bolsa especializada (dependiendo de la configuración del kit de procesamiento) . Los glóbulos rojos restantes son ya sea extraídos a una bolsa especializada o se mantienen en la cámara (para ahorrar tiempo de proceso) . Dependiendo de los parámetros optimizados durante la fase de extracción de capa leucocitaria, unos ciclos de sedimentación/extracción sucesivos como uno descrito anteriormente pueden reiniciar. Esto completará el volumen extraído de capa leucocitaria optimizando sus características dependiendo de la aplicación final del producto celular. Para seleccionar una sub-población celular más específica, el principio descrito anteriormente (llenado/sedimentación/extracción) se puede usar por el mismo tipo de sensor de línea óptico el cual detecta por reflexión y absorción un sub-conjunto celular más específico. Durante la extracción de plasma, la absorción y reflexión del líquido son muy lentas. Cuando las células comienzan a fluir en el tubo, tanto la absorción como reflexión del producto efluente incrementa. La reflexión también es dependiente del tipo y tamaño de las células. Esta dependencia permite la selección de un sub-conjunto celular particular. Finalmente cuando la concentración celular es alta, la absorción es al nivel máximo y la reflexión no es posible nunca más. Esto se puede usar para detectar los sub-conjuntos celulares los cuales tienen diferentes tamaños similares a plaquetas y crear un concentrado de plaquetas . Para obtener una selección de sub-conjunto celular, un método preferido es usar un medio de gradiente de densidad el cual se dirige más específicamente a una sub-población de células definida. Esto incrementará la pureza del producto, reduciendo la contaminación en glóbulos rojos y otros sub-conjuntos celulares no deseados. El medio de gradiente de densidad se elige de acuerdo con el sub-conjunto de objetivo. Por ejemplo, para dirigirse al sub-conjunto mononuclear, se puede usar un medio a base de FicollMR. En tal caso, el medio de gradiente de densidad primero se introduce en la cámara de separación. La médula ósea luego se introduce lentamente bajando el pistón, típicamente a una velocidad de 5 ml/min, para depositar las células en la capa de medio de gradiente de densidad. Los glóbulos rojos y granulocitos tenderán a ir a través de la capa de medio de gradiente de densidad, mientras que las células mononucleares y plaquetas permanecerán en frente de la capa. Cuando el volumen completo de médula ósea se introduce, como se detecta por un sensor de línea óptico (figura 8) en la parte superior de la máquina, el pistón se detiene y una etapa de sedimentación de, por ejemplo, 10-20 min se inicia. Una dilución adicional podrá ser automáticamente realizada por el sistema después de la aspiración completa del producto, gracias a una solución isotónica conectada al sistema. La velocidad centrífuga se puede incrementar para reducir este tiempo de sedimentación. La colección luego inicia moviendo el pistón hacia arriba. El líquido sobrenadante contiene solamente plasma. Las primeras células luego siguen, causando que el efluente entubado llegue a ser opaco, como se detecta por el sensor de línea óptico. Esto activa la colección de las células mononucleares, la cual abarca las células madre de objetivo. Después de un volumen predefinido por el menú de operador, o cuando la línea de efluente se aclara de nuevo, la colección de células se detiene, y el contenido restante del volumen de la cámara de separación se colecta en una bolsa de desechos hasta que la cámara se vacía completamente. En esta etapa, la cámara de separación se enjuaga de todos los glóbulos rojos residuales gracias a una solución isotónica. Las células colectadas se reintroducen en la cámara de separación, seguidas, o precedidas, por una solución de lavado similar a solución salina/albúmina (alternativas con solución amortiguada con fosfato u otras también se pueden usar) . Las células y la solución de lavado se mezclan. El pistón se detendrá después de un volumen predeterminado o cuando la cámara se llena completamente. Una nueva etapa de sedimentación luego se realiza, durante la cual, la bolsa de colección se puede lavar usando el sobrenadante producido durante la sedimentación para remover los rastros de medio de gradiente de densidad. El sobrenadante (consistente de la solución de lavado y medio de gradiente de densidad) luego es expresado. El proceso se detiene cuando las primeras células aparecen de nuevo en la línea de efluente, o se puede repetir para obtener un mejor lavado. Las células finalmente se colectan en un recipiente de colección que se puede diseñar especialmente para facilitar adicionalmente el uso de las células colectadas. Cuando se necesita la cámara se enjuaga. Tales células están fácilmente disponibles para la reintroducción en el órgano de objetivo del paciente, o se pueden manipular adicionalmente para propósitos de selección o expansión. Con este efecto, el sistema podrá re-suspender las células directamente en el medio de cultivo deseado. Una separación más refinada que usa medio de gradiente de densidad consiste en la incubación de la médula ósea en un medio que contiene microperlas revestidas con anticuerpos monoclonales. Tal método de separación se describe en la publicación WO03/009889 (CellGenix/Biosafe) . El procedimiento luego es como sigue. Un producto que contiene microperlas enlazadas a un anticuerpo específico se mezcla con el producto sanguíneo que contiene las células de interés. Después de algún tiempo de incubación, las microperlas se adherirán a la superficie de las células de objetivo, causando que su densidad cambie. La mezcla luego se vierte en la cámara de separación y una separación vigorosa de densidad se inicia como se describe en las patentes anteriores. Cuando la sedimentación se completa, el sobrenadante se extrae de la cámara en la bolsa de desechos, y luego los glóbulos rojos también se desechan. Las células de interés, marcadas con las microperlas y por lo tanto tienen la densidad más alta, serán las últimas en salir de la cámara. Se pueden colectar en un recipiente apropiado y, si es necesario, posteriormente se lavan para remover la solución de anticuerpo. En caso de reintroducción inmediata después que el procesamiento se ha realizado, las células colectadas se pueden conectar, usando técnicas asépticas, al dispositivo permitiendo su transplante al paciente. Para aplicaciones de cardiología, tal dispositivo puede ser un catéter balón como se usa en angiografía para reinyectar localmente estas células, similar por ejemplo en asociación con tratamientos de infarto al miocardio agudo. En este caso, una cantidad de 10 ml de las células madre concentradas en etapas de 3 ml se inyecta, inflando el balón a intervalo regular, permitiendo la expansión de las células madre. El método se ha descrito por Zeiher et al en un documento científico (TOPCARE Circulation Octubre 2002) . En caso de una colección de concentrado de plaquetas, las plaquetas recolectadas se pueden usar solar o en combinación con trombina posiblemente obtenida también del plasma del paciente, para formar un gel de plaquetas que facilitará la curación de herida. Tal gel de plaquetas contiene factores de crecimiento que pueden estimular ventajosamente la reparación de tejido ya sea solo o en asociación con células madre. El proceso completo se puede realizar en la cabecera del paciente, y por lo tanto se considera como un proceso en línea, como se ilustra esquemáticamente en la figura 1. Esto proporciona ventajas significativas, en seguridad, tiempo logístico y de respuesta, y no depende de alguna experiencia específica de procesamiento de células. La colección de varios sub-conjuntos celulares de objetivo se puede hacer durante el mismo procedimiento de colección pero con el objetivo de usar tales sub-conjuntos celulares a diferentes intervalos de tiempo durante la misma operación. La invención proporciona un sistema o "paquete habitual" que contiene ya los equipos estériles desechables individuales para realizar la colección, separación y transplante, respectivamente. Tal paquete se puede presentar en un "envase ampolla" que tiene 3 compartimientos cada uno conteniendo un equipo o kit desechable: un equipo para la extracción de médula ósea, un equipo para la separación de médula ósea, preferiblemente de un tipo basado en el sistema descrito en EP-B-912 250 y PCT/IB99/020523 y un equipo para la reinyección de células . Cada equipo puede tener algunas variaciones, uno tiene la versatilidad más alta siendo el equipo de transplante, cuando depende del tejido objetivo a tratar (por ejemplo, hueso, músculo, vaso, etc.). Las configuraciones de equipo individuales se ilustran en las figuras 2 , 3A-3B, , 5A-5B, 6, 7-7C. Posiblemente estos equipos se pueden pre-conectar conjuntamente o dos de los tres se pueden pre-conectar, si por ejemplo uno quiere usar un sistema completamente cerrado. Si no son pre-conectados, una solución práctica consiste de usar conectores asépticos especialmente diseñados, similar al sistema Medlock ofrecido por PALL (referencia ACD) y como se describe en las patentes de los Estados Unidos 3,650,093, 5,868,433, 6,536,805 y 6,655,655, para asegurar que las conexiones se realizan bajo conexiones asépticas, manteniendo así los criterios de un sistema cerrado. Otra posibilidad podría ser conectar el equipo usando un dispositivo de conexión estéril. Cualquiera de las configuraciones anteriores - pre-conectadas, o conectadas con un dispositivo de conexión aséptico o un dispositivo de conexión estéril -proporcionará un sistema funcionalmente cerrado. Tales sistemas funcionalmente cerraos eliminan la necesidad de limpiar cuartos o sistemas de flujo laminar, una ventaja muy importante en ambientes de unidad de intervención o cuarto de operación, los cuales generalmente no están equipados ara cumplir estos requerimientos. Otro refinamiento de la invención consiste de un recipiente de aspiración de médula ósea que actuará como la cámara de separación en la segunda etapa, referida como una cámara de procesamiento. Su diseño es similar a la cámara de separación como se describe en PCT/IB99/020523 , y se puede equipar con una aguja especial para perforar el hueso pélvico. Es pre-llenado con anticoagulante o puede ser imprimado con anticoagulante previo al inicio de la colección. Una vez que el hueso se ha perforado, la médula ósea se aspira moviendo hacia abajo el pistón de la cámara de procesamiento, activado por una fuente de vacío manual o eléctrica. La cámara de procesamiento luego se inserta en la centrífuga de la máquina, y un equipo que consiste de un arreglo de líneas entubadas y bolsas se conecta en la cámara. La separación luego se puede iniciar de acuerdo con el proceso descrito anteriormente, usando por ejemplo un protocolo de centrifugación de capa leucocitaria. Otro refinamiento de la invención consiste en la colección de células separadas en un recipiente especial que fácilmente se puede conectar o fijar al sistema reinfusionando las células de nuevo al paciente. Tal recipiente puede ser una jeringa graduada equipada con un conector en Y que tiene un extremo conectado al conjunto de separación, y el otro extremo equipado con u conector de cierre Luer para la conexión subsiguiente a un catéter. La figura 3A muestra un kit de colección sin filtro y la figura 3B con filtro. El kit de colección incorpora todo lo necesario para realizar la aspiración de médula: a. El punto de entrada, por ejemplo, será un extractor de médula ósea (por ejemplo del tipo TYCO) y típicamente incluye una aguja para punción de hueso o una aguja para punción de vena. Se puede conectar directamente al resto del kit vía una válvula de grifo u otra válvula. b. Una o más jeringas (l...n) como sea necesario para realizar la aspiración, c. Un filtro se puede insertar en el kit de colección para filtrar la colección de médula ósea, como se ilustra en la figura 3B. d. La médula colectada (filtrada o no filtrada) luego se almacena en una bolsa de transferencia previo al procesamiento . e. Una jeringa adicional se puede usar para adicionar un producto de dilución a la médula y/o enjuagar el filtro si es aplicable. f. Un conector aséptico (Pall ACD o similar) se puede usar. El kit de colección, por ejemplo, se puede configurar como sigue: Cll Kit de colección sin filtro c con aguja para hueso a pre-conectada en el kit de procesamiento. Cantidad X de jeringas b. C12 Kit de colección sin filtro con aguja para hueso a no pre-conectada en el kit de procesamiento. Cantidad X de jeringas b. C21 Kit de colección con filtro c con aguja para hueso a pre-conectada en el kit de procesamiento. Cantidad X de jeringas b. C22 Kit de colección con filtro c con aguja para hueso a no pre-conectada en el kit de procesamiento. Cantidad X de jeringas b.

En todas estas configuraciones la aguja para huesos se puede reemplazar con una aguja para la punción de vena. La figura 4 muestra un kit de procesamiento que se adapta para ser conectado al kit de colección previamente descrito vía una conexión aséptica. a. La conexión aséptica se podrá realizar vía un conector aséptico (tal como Pall ACD u otros) o un conector de púas bajo condiciones asépticas. b. Una cámara de goteo opcional se podrá usar para prevenir que las burbujas entren en la trayectoria de procesamiento . c. La dirección de la trayectoria de fluido se puede elegir por una rampa de válvula de grifo que monta tres grifos en este ejemplo, u otro tipo de válvula, por ejemplo una válvula de orificios múltiples. d. Una cámara de separación, por ejemplo como se describe en EP-B-912 250 y PCT/IB99/02052 se usa para el proceso de separación. e. El (los) producto (s) adicional (es) (solución isotónica, medio de cultivo,...) es/son introducidos por una línea equipada con una o más conexiones (conectores de púas, ... -1...n) . f. Una bolsa de desechos o satélite se usa para el producto desechado y entrada de medio de gradiente de densidad. g. Una línea de salida con una bolsa intermedia opcional guía el producto al kit de transplante, h. Un conector aséptico (Pall ACD o similar) se podrá usar en esta línea. Las variantes principales del kit de procesamiento incluyen: Pl kit de procesamiento sin bolsa intermedia P2 kit de procesamiento con bolsa intermedia. La figura 5A muestra posibles elementos individuales de un kit de transplante y la figura 5B muestra una posible combinación de elementos que integran un kit de transplante . El kit de transplante se adapta para ser conectado al kit de procesamiento descrito anteriormente vía una conexión aséptica y contendrá producto final para transplante. La conexión aséptica se podrá realizar vía un conector aséptico (tal como Pall ACD u otros) o un conector de púas bajo condiciones asépticas. El kit de transplante incluye: TI una bolsa T2 un vial de colección T3 una jeringa T4 un dispositivo específico para transplante (por ejemplo, un catéter para infarto al miocardio) T5 una combinación de T1-T4. Generalmente hablando, el kit de transplante como un mínimo incluirá al menos un dispositivo específico para el transplante T4 el cual se puede combinar con varias combinaciones de los otros componentes por ejemplo una bolsa TI o un vial de colección T2, y/o una jeringa T3. La figura 6 ilustra diferentes combinaciones para integrar un sistema completo. El sistema completo por ejemplo puede estar compuesto de cualquier combinación de un kit de colección (Cll a C22), un kit de procesamiento (Pl o P2) y un kit de transplante (Tl-T4 ) , como se describió anteriormente. La figura 7 es un diagrama de un equipo de procesamiento de médula ósea todo en uno en el cual una cámara de procesamiento girable b3 por ejemplo como se describe en EP-B-912 250 y PCT/IB99/020523 constituye una jeringa de separación que se usa también para colección y transplante de las células. El kit de colección a consiste del punto de entrada, por ejemplo un extractor de médula ósea (por ejemplo del tipo TYCO) equipado con un conector aséptico para la conexión a la cámara de procesamiento b3. El kit de procesamiento b comprende una válvula de grifo bl conectada a una bolsa de lavado b2 y a una bolsa de desechos/medio de gradiente de densidad b4, así como la cámara de separación/procesamiento/transplante b3 que se puede conectar por un conector aséptico al grifo bl, o al kit de colección a, o al kit de transplante c. El kit de transplante c consiste de un dispositivo específico para transplante (por ejemplo un catéter para infarto al miocardio) equipado con un conector aséptico para la conexión a la cámara de procesamiento b3. Las figuras 7A, 7B y 7C muestran las configuraciones operativas de los componentes del equipo de la figura 7 para colección, procesamiento y transplante, respectivamente. En la figura 7A, la cámara de colección/procesamiento b3 se conecta por un conector aséptico al punto de entrada del sistema de colección a, de modo que la cámara de procesamiento sirve para la colección de las células madre extraídas. La admisión de las células madre se controla por desplazamiento del pistón de la cámara de procesamiento b3. En la figura 7B, la cámara de colección/procesamiento b3 se conecta por su conector aséptico al grifo bl que la conecta selectivamente a la bolsa de lavado b2 y a la bolsa de desechos/medio de gradiente de densidad b4 para las operaciones de procesamiento descritas anteriormente, las cuales terminan con las células madre procesadas/concentradas siendo regresadas a la cámara de procesamiento b3. Después la cámara de procesamiento b3 sirve como cámara de reinfusión. La figura 7C muestra la cámara de procesamiento b3, después de la desconexión de la válvula de grifo bl del kit de procesamiento, conectado al dispositivo de transplante del kit de transplante c por un conector aséptico. En esta configuración, la reinfusión de las células madre procesadas en el paciente se puede controlar por desplazamiento del pistón de la cámara de procesamiento/reinfusión b3. Esta modalidad depende del uso de los conectores asépticos para conectar la cámara de procesamiento b3 selectivamente al kit de colección a, o al resto del kit de procesamiento vía la válvula de grifo bl, o al kit de transplante c para realizar las operaciones de colección, procesamiento y reinfusión consecutivas. Esto proporciona un sistema particularmente compacto que no incluye algunos elementos no usados y es conveniente de usar. Las figura 8A, 8B y 8C muestran el principio de la detección de las células por un sensor de línea óptico LS usando las propiedades de absorción y reflexión de las células a través de un tubo transparente. La figura 8A es la configuración de un tubo que contiene líquido claro, donde la luz de LS es no reflejada y pasa directamente a un detector delantero R en el eje de luz. La figura 8B es la configuración de un tubo que contiene células en suspensión en un líquido claro; en este caso las células reflejan la luz en direcciones aleatorias y se captura tanto por el detector delantero R como por un detector lateral R colocado a aproximadamente 90° al eje. La figura 8C es la configuración de un tubo que contiene líquido opaco donde no se refleja luz. La figura 8D muestra una vista vertical del sensor de línea óptico con la ubicación de dispositivos receptores y LED, en particular muestra las posiciones de la luz Azul Delantera (Fazul), Azul Lateral (Lazul), Rojo Delantero (Frojo) y Rojo Lateral (Lrojo) . La figura 9 muestra las señales típicas del sensor de línea óptico, que se registran de los sensores "delantero" y "lateral". La información obtenida de las señales reflejadas de "lateral" se puede usar como activadores para iniciar o finalizar la colección. El valor de salida de sensor (eje Y) es el volumen de extracción de capa leucocitaria (CL) en porcentaje del nivel máximo. El eje X contiene la información del volumen que pasa a través del tubo (también en porcentaje del volumen total). Se entenderá que esta invención se puede incluir en diversas formas diferentes sin apartarse de su espíritu o características esenciales. El alcance de la invención se define en las reivindicaciones anexas, antes que en la descripción específica precedente de las mismas. Todas las modalidades que caen dentro del significado e intervalo de equivalencia de las reivindicaciones son por lo tanto propuestas para ser abarcadas por las reivindicaciones. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (19)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. Sistema para la extracción, colección, procesamiento y transplante de sub-conjuntos celulares, incluyendo células madre adultas y plaquetas, en particular para reparación de órgano en medicina regenerativa, caracterizado porque comprende un equipo de elementos de transporte de fluido estériles desechables que son pre-conectados o que incluyen conectores asépticos o se adaptan para hacer interconexiones entre los mismos de una manera aséptica, el equipo incluye: - un dispositivo de extracción, por ejemplo que incluye una aguja para punción de hueso o vena, para extraer médula ósea u otras fuentes de sub-conjuntos celulares de un paciente; al menos una cámara para la colección, procesamiento y reinfusión de los sub-conjuntos celulares extraídos del paciente, que incluye una cámara de colección pre- conectada o que se puede conectar al dispositivo de extracción para recolectar las células extraídas del paciente por el dispositivo de extracción; una cámara de procesamiento adaptada para cooperar con el equipo de 1 procesamiento para realizar las operaciones de procesamiento y transferencia en las células recolectadas; y una cámara de reinfusión para almacenar las células procesadas para ser suministradas de nuevo al paciente; en donde las cámaras de colección, procesamiento y reinfusión se separan y son pre- conectadas o interconectables, o en donde una cámara de procesamiento de propósitos múltiples proporciona las funciones combinadas de una cámara de colección- procesamiento, una cámara de procesamiento-reinfusión o una cámara de colección-procesamiento-reinfusión; y un dispositivo de transplante pre-conectado o que se puede conectar a la cámara de reinfusión para suministrar las células procesadas de nuevo al paciente.

2. Sistema de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el equipo de elementos desechables se envasa en un envase ampolla en un soporte tal como una bandeja, el envase ampolla tiene un compartimiento para recibir el equipo interconectado completo o una pluralidad de compartimientos cada uno recibiendo una parte del equipo que incluye un conector aséptico para la conexión a otra parte del equipo.

3. Sistema de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque el equipo de elementos desechables comprende tres kits de elementos desechables, un kit de colección, un kit de procesamiento, y un kit de transplante.

4. Sistema de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el kit de colección comprende un dispositivo extractor de médula ósea solo o en combinación con: al menos una jeringa; una bolsa de transferencia que forma la cámara de colección, y opcionalmente un conector aséptico para la conexión al kit de procesamiento.

5. Sistema de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque el kit de colección adicionalmente comprende un filtro conectado o que se puede conectar entre una jeringa y una bolsa de transferencia.

6. Sistema de conformidad con la reivindicación 3, 4 ó 5, caracterizado porque el kit de procesamiento comprende una cámara de procesamiento y al menos un recipiente desechable conectado a la cámara de procesamiento vía al menos una válvula de grifo o una válvula de orificios múltiples que permite la transferencia selectiva de fluidos a y desde la cámara de procesamiento y a y/o desde los recipientes desechables, la cámara de procesamiento se conecta al kit de colección o tiene un conector aséptico para la conexión al kit de colección o se adapta para hacer una conexión aséptica, y la cámara de procesamiento también se conecta al kit de transplante o tiene un conector aséptico para la conexión al kit de transplante o se adapta para hacer una conexión aséptica.

7. Sistema de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el kit de procesamiento adicionalmente comprende una línea equipada con uno o más conectores para conectar los recipientes adicionales a la válvula de grifo o válvula de orificios múltiples.

8. Sistema de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 3 a 7, caracterizado porque el kit de transplante comprende al menos un dispositivo de transplante o una combinación de al menos un dispositivo de transplante con al menos uno de: una bolsa de colección; una vial de colección; y una jeringa.

9. Sistema de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizado porque la cámara de procesamiento es una cámara de procesamiento centrífuga hueca que tiene una entrada/salida para las células que se procesan y para las células procesadas, la cámara de procesamiento contiene un miembro movible el cual define un espacio de separación de tamaño variable para recibir las células, el miembro es movible para admitir una cantidad seleccionada de células a ser procesadas en la cámara de separación vía la entrada y para expresar las células procesadas de la cámara de separación vía la salida.

10. Sistema de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque la cámara de procesamiento centrífuga generalmente es cilindrica y es girable alrededor del eje circular, y el miembro movible es un pistón hermético a fluido moviblemente montado en la cámara de procesamiento centrífuga.

11. Sistema de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizado porque comprende: un dispositivo para extraer médula ósea u otras fuentes de sub-conjuntos celulares de un paciente, el dispositivo se puede conectar por una conexión aséptica a la cámara de procesamiento para colectar las células madre extraídas por el dispositivo en la cámara de procesamiento; al menos un recipiente desechable conectado a la cámara de procesamiento vía al menos una válvula de grifo o una válvula de orificios múltiples que permite la transferencia selectiva de fluidos a y desde la cámara de procesamiento y a y/o desde los recipientes desechables, la cámara de procesamiento se puede conectar a la válvula de grifo u orificios múltiples vía un conector aséptico; y - al menos un dispositivo de transplante que se puede conectar a la cámara de procesamiento por una conexión aséptica, para que la cámara de procesamiento actúe como una cámara de reinfusión para el suministro de células procesadas en esta al paciente.

12. Sistema de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizado porque la cámara de procesamiento se arregla para producir un producto enriquecido en sub-conjunto celular particular (incluyendo Células Madre Adultas y plaquetas) .

13. Sistema de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizado porque la cámara de procesamiento se arregla para separar las células madre usando un proceso a base de gradiente de densidad seguido por el lavado de célula.

14. Sistema de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizado porque se arregla para procesar las células madre usando microperlas revestidas con anticuerpos monoclonales.

15. Sistema de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizado porque comprende un sensor de línea óptico para detectar la reflexión diferencial de luz por un sub-conjunto celular que pasa a través de una tubería transparente .

16. Uso del sistema de conformidad con cualquier reivindicación precedente para preparar un concentrado de plaquetas para uso separado.

17. Método para colectar y procesar un sub-conjunto celular extraído de un ser humano para transplante en el ser humano en particular para reparación de órgano en medicina regenerativa, caracterizado porque comprende colectar las células extraídas en una cámara de colección conectada a un dispositivo de extracción a través del cual las células en particular médula ósea que contiene células madre se extraen, procesar las células en una cámara de procesamiento centrífuga la cual es la misma como la cámara de colección o la cual se conecta a la cámara de colección, y colectar las células procesadas en una cámara de reinfusión la cual es la misma como la cámara de procesamiento o se conecta a la cámara de procesamiento, la cámara de reinfusión se conecta a un dispositivo de transplante conectado a la cámara de reinfusión para suministrar los sub-conjuntos celulares procesados de nuevo al paciente.

18. Método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque se realiza usando un sistema de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15.

19. Sensor óptico, caracterizado porque es capaz de medir la absorción y reflexión de un sub-conjunto celular que pasa a través de una tubería transparente .